CN104204206B - 一种用于生产丁醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包含一种通过微生物将可发酵碳源生物转化为正丁醇的方法，其中所述微生物在参与四碳化合物通路调节的至少一个基因或蛋白上是缺陷的，从而改善四碳化合物通路，尤其是通过转录阻抑物rex的失活进行。

Description

一种用于生产丁醇的方法
发明领域
本发明包含一种通过微生物将可发酵碳源生物转化为正丁醇的方法，其中所述微生物在参与四碳化合物通路调节的至少一个基因或蛋白上是缺陷的，从而改善四碳化合物通路，尤其是通过转录阻抑物rex的失活进行。
发明背景
正丁醇是一种无色、中等挥发性的中性液体，在水中的混溶性有限(约7-8％)，但是与所有常规溶剂如二醇、酮、醇、醛、醚和芳香族及脂族族烃可自由混溶。正丁醇用于i)制备其它化学品，ii)作为溶剂和iii)作为配方产品(formulated products)如化妆品中的成分。正丁醇作为原料的主要用途是在丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯、丁二醇醚、乙酸正丁酯、氨基树脂和正丁胺的合成中。尤其是乙酸正丁酯常用作漆行业的溶剂，以及食品、饮料、化妆品和药品行业的风味剂。目前世界上每年消耗超过350万吨的正丁醇，并且它具有捕捉生物燃料市场重要份额的潜质。因此，低成本的大量生产正丁醇的兴趣正在增加。
正丁醇可以通过产溶剂梭菌属(solventogenic Clostridia)的碳水化合物发酵作用作为丙酮/正丁醇/乙醇(ABE)混合物产生。正丁醇生产的另一方法记载于专利申请WO2008/052596中。该申请公开了一种通过修饰为消除了丁酸通路、丙酮通路、乳酸通路的重组丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)菌株将葡萄糖转化为正丁醇的方法。
发明人观察到，在丁酸、乳酸和丙酮合成通路失活的菌株中，二碳化合物的生产(乙醇和/或乙酸)增加，因此正丁醇的产量没有显著增加。
这些二碳化合物的生产意味着参与四碳化合物通路的基因表达的调节。参与四碳化合物通路的基因位于编码硫解酶的thl基因下游，并组织在包含编码巴豆酸酯(crotonase)的crt基因、编码丁酰CoA脱氢酶的bcd基因，编码电子转移蛋白的etfAB基因和编码β-羟丁酰CoA脱氢酶的hbd基因的操纵子内。转录阻抑物在crt-bcd-etfAB-hbd操纵子下游编码。该阻抑物由名为代表“氧化还原感测转录阻抑物(redox-sensingtranscriptional repressor)”的rex的基因(CAC2713)编码，与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中的rex基因同源(Gyan等人,2006)。本研究中已显示，取决于NADH/NAD+比率，yjlC-ndh操纵子(编码NADH脱氢酶)由Rex负调节。在存在高浓度的NAD+时，阻抑物Rex结合至位于启动子不远处的Rex盒，抑制yjlC-ndh操纵子，也更主要地抑制NADH消耗通路。NAD+促进Rex的结合活性，同时NADH似乎在DNA结合活性上具有可以忽略的或部分负性的作用。
本发明要解决的问题是通过修饰的微生物改进正丁醇的生产。发明人发现rex基因的缺失通过降低二碳化合物生成而导致正丁醇生产的改进。
发明概述
本发明是关于在包含碳源的合适培养基中培养梭菌物种的经过修饰的微生物来生产正丁醇的方法，其中所述的微生物在参与四碳化合物通路调节的至少一个基因或蛋白上是缺陷的。
参与四碳化合物通路调节的至少一个基因或蛋白的缺陷会提供微生物中碳通量定向到四碳化合物通路。
在本发明的一个优选方面中，参与调节四碳化合物通路的至少一个基因或蛋白的缺陷包括将编码氧化还原转录阻抑物的基因(rex)失活或缺失。
本发明的另一方面，经修饰的梭菌物种进一步不能将丁酰基CoA代谢为丁酸，和/或不能产生丙酮，和/或不能产生乳酸，和/或不能产生乙酸。
不能将丁酰基CoA代谢为丁酸的经修饰的梭菌物种尤其是通过缺失编码丁酸激酶(buk)和/或磷酸丁酰基转移酶(ptb)的基因而获得的。
不能生产丙酮的重组梭菌物种尤其是通过缺失编码CoA转移酶(ctfAB)和/或乙酰乙酸脱羧酶(adc)的基因而获得的。
不能生产乳酸的重组梭菌物种尤其是通过缺失编码乳酸脱氢酶(ldhA)的基因而获得的。
不能生产乙酸的重组梭菌物种尤其是通过缺失编码磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶(pta和ack)的基因而构建的。
本发明的另一方面，经修饰的梭菌物种中的氢生成流量较未修饰的微生物而言是减少的，还原性等同物的流量通过减弱编码氢化酶(hydA)的基因而重新指向正丁醇生产。
本发明可广泛应用于包括任何很容易转化为乙酰CoA的碳基质。因此，本发明的一个目的是提供可用于生产正丁醇的重组生物体，其包含至少一个参与四碳化合物通路的碳流量调节的基因的缺失。本发明中的微生物进一步包含以下缺失：(a)参与丁酰基CoA向丁酸转化中的两个基因中的至少一个，和(b)至少缺失编码CoA转移酶活性的两个基因中的一个。所述重组微生物任选地可以包含i)选自下组的内源基因的失活修饰：(a)编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的基因,(b)编码具有磷酸转乙酰酶或乙酸激酶的多肽的基因，和ii)编码具有氢化酶活性多肽的基因的减弱。
本发明提供用于从重组生物体高产率产生正丁醇的稳定方法，其包括(a)用至少一种选自下组的碳源培养本发明的重组生物体，由此产生正丁醇：单糖、寡糖、多糖和单碳底物；任选地(b)通过蒸馏回收正丁醇。
在本发明的一个备选实施方案中，在发酵步骤过程或纯化过程中通过与乙酸缩合将通过发酵本发明的重组微生物所获得的正丁醇进一步转化为乙酸正丁酯。
附图简述
图1显示了梭菌物种中二碳和四碳化合物的生物合成通路。二碳化合物在灰色矩形中，四碳化合物在带黑色轮廓的灰色矩形中。基因ldhA编码乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase)；alsD：乙酰乳酸脱羧酶(acetolactate decarboxylase)；pta：磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase)；ack：乙酸激酶(acetate kinase)；adc：乙酰乙酸脱羧酶(aceto-acetate decarboxylase)；ctfAB：CoA转移酶(CoA-transferase)；hbd：β-羟丁酰CoA脱氢酶(beta-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase)；crt：巴豆酸酶(crotonase)；bcd：丁酰CoA脱氢酶(butyryl CoA dehydrogenase)；etfAB：电子转移蛋白(electron transferprotein)；ptb：磷酸丁酰基转移酶(phosphate-butyryl transferase)；buk：丁酸激酶(butyrate kinase)。
发明详述
在对本发明进行细节上的公开前，必须理解的是本发明并不限于特定的实施方式，当然是可以变化的。还需要被理解的是，本文中所用的术语只是为了描述本发明中特定实施例的目的，并不是为了限定随附的权利要求书。
本文中所引用的全部出版物、专利、专利申请，无论之前或之后，都以整体引用并入本文中。但是本文中所提到的出版物是出于记载和公开出版物中报道的并且可以应用于与本发明相关的实验方案、试剂和载体的目的而被引用。本文中未构建关于本发明由于在先发明无权领先类似公开的准许。
进一步，本发明的实施除非另有指示，采用本领域内的传统微生物和分子生物学技术。这类技术对于本领域技术人员是熟知的，并且在文献中是完全得到解释的，参见例如Prescott等人，(1999)和Sambrook等人，(1989)(2001)。
必须指出的是，在本文中和随附的权利要求书中，单数形式的“一个”、“一种”以及“所述/该”除非上下文中另有明确指示是包含复数指示物。因此例如“一个/种微生物”包括多个/种这类微生物，以及“一个/种内源基因”是指一个或多个内源基因，等等。除非另有定义，本文中所用的所有技术和科学术语与由本发明所属的本领域常规技术人员所通常理解的一样具有相同含义。虽然在本文中所记载的这些任意材料和方法的类似物或等同物可以用于实施或验证本发明，但是优选的材料和方法现在被描述。正如本文中所用的，以下术语可以用于解释权利要求书和说明书。
在后面的权利要求书和前面的发明说明书中，除了上下文由于表达语言或必须启示的需要外，词语“包括”或其变体，例如“包含”、“含有”是用于包含的含义，例如用于指定所声称的特征的存在但是并不排除在本发明各个实施例中进一步特征的存在或加入。
本文中所用的以下术语用于解释权利要求和说明书。
定义
术语“丁醇(butanol)”与正丁醇(n-butanol)可互换使用，指定为正丁醇(butan-1-ol)
术语“醋酸丁酯(butyl acetate)”与醋酸正丁酯(n-butyl acetate)或丁基乙醇酸酯(butyl ethanoate)可互换使用，是指丁醇和乙酸的酯。
术语“改善的丁醇生产”指丁醇产量的改善，丁醇滴度的改善，或四碳化合物/二碳化合物比例的改善。
本文中所使用的术语“微生物”是指不进行人工修饰的细菌、酵母或真菌。
本文中所使用的术语“重组微生物”或“遗传修饰微生物”，是指经遗传修饰或遗传工程化的微生物。根据这些术语的通常含义，其是指本发明的微生物不是自然界中所发现的，而是通过导入、缺失或修饰来自于自然界中所发现的等同微生物的遗传元件而进行修饰。它也可以通过在组合定向诱变和在特定选择压力下进化中迫使新代谢途径的发展和进化而转化(例如参见WO2004/076659)。
术语“参与四碳化合物通路调节的至少一个基因或蛋白的缺陷”是指如下的微生物，其中至少一个参与四碳化合物通路调节的基因与未经修饰的微生物中比较是减弱的，和/或至少一个参与四碳化合物通路调节的蛋白与在未经修饰的微生物中比较活性更小。
基因减弱可以由本领域技术人员所知晓的方法和手段获得，尤其包括通过同源重组进行基因缺失、通过向基因中插入外部元件实现基因失活、基因突变或弱启动子下的基因表达。本领域技术人员知晓展示不同长度的各种启动子以及那些用于弱遗传表达的启动子。术语“缺失的基因”意即至少50％遗传材料已经被消除或由抗生素盒替换。
术语“失活”或“失活的蛋白”是指使蛋白不能发挥功能。这可以通过缺失整个或部分的编码该蛋白的基因实现，或向编码该蛋白的基因中导入一个或多个突变实现，从而导致与未经修饰的蛋白比较具有更低的活性。在调节蛋白的情况中，该蛋白作用的消除可以通过缺失其靶基因的结合序列而实现。
在本申请中，所有的基因参考它们的常用名称和网页http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gene中给出它们的核苷酸序列的登录号。
酶活性与术语“功能”可互换使用，在本发明中是指酶催化发生的反应。
术语“编码(encoding)”或“编码(coding)”是指多核苷酸通过转录和翻译机制产生氨基酸序列的过程。
编码酶的基因可以是外源性或内源性的。
发酵通常在发酵罐中进行，发酵罐中含有适应于微生物所用的适合培养基，其包含至少一种单一碳源，以及(如果有必要的话)共底物。
一种“合适的培养基”是指一种包含对细胞维持和/或生长必需或有益的营养物的培养基(例如无菌液体培养基)，所述营养物例如碳源或碳基质(carbon substrates)、氮源(如蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，尿素，硫酸铵，氯化铵，硝酸铵和磷酸铵)，磷源(例如，磷酸单钾盐或磷酸二钾盐)；微量元素(例如金属盐)，例如镁盐，钴盐和/或锰盐；以及如氨基酸和维生素等生长因子。
本领域技术人员能够根据本发明定义微生物的培养环境。特别地，梭菌是在20℃-55℃，优先为25C-40C，更具体地大约35℃(针对丙酮丁醇梭菌)的温度发酵。
根据本发明，术语“碳源”或“碳基质”或“碳来源”是指本领域技术人员可采用的支持微生物正常生长的任何碳来源，包括已糖(如葡萄糖，半乳糖或乳糖)，戊糖，单糖，寡糖，双糖(如蔗糖，麦芽糖或纤维二糖)，糖蜜，淀粉或其衍生物，半纤维素，纤维素以及其组合。
术语“阻抑物”或“转录弱化子”是指调节一个或多个基因表达的DNA结合蛋白。阻抑物蛋白与名为“操纵子”的DNA片段结合。通过结合操纵子，阻抑物阻断RNA聚合酶与启动子的结合，由此阻止了基因转录。另外，在将DNA转录为RNA时，阻抑物阻止结合的RNA聚合酶。
术语“抑制”是指阻抑物下调一个或多个基因表达的作用。
术语“回收”是指利用本领技术人员所知晓的常规实验室技术从培养基中分离生物合成的正丁醇。
术语“二碳通路”是指乙酸和乙醇的生物合成通路。
术语“四碳通路”是指丁醇和丁酸的生物合成通路。
术语“四碳化合物/二碳化合物比”是指丁醇和丁酸的滴度比上乙酸和乙醇的滴度。
正丁醇生产的提高
本发明提供了一种用于发酵生产正丁醇的方法，其通过在包含碳源的合适培养基中培养经修饰的微生物，以及从培养基中回收正丁醇进行，其中微生物在参与四碳化合物通路调节的至少一个基因方面是缺陷的。
优选地，正丁醇的产量是改善的。更优选地，四碳化合物/二碳化合物比率是增加的。
本发明的一个特定实施例提供了一种如下的方法，其中微生物修饰为由于crt-bcd-etfAB-hbd操纵子的去阻遏而改善乙酰乙酰基CoA转化为正丁醇。在本发明的一个优选方面中，微生物经过修饰从而无法产生氧化还原感测性转录阻抑物。这可以通过失活或删除编码氧化还原转录感测性阻抑物的基因rex实现。优选地，基因rex被删除。
本发明的另一方面，Rex蛋白的作用降低。优选地，此降低是通过在rex基因中插入突变，导致更少的蛋白而实施的。更优选的是，Rex蛋白的作用通过突变或删除Rex蛋白中其靶基因(尤其是crt-bcd-etfAB-hbd操纵子)的命名为“rex盒”的结合序列而消除。
梭菌中基因的删除可以使用专利申请WO2008/040387中记载的方法实施，该申请公开了梭菌属中通过同源重组进行目标DNA序列取代的方法，其容许以下步骤：
i)用含有下列各项的复制型载体转化梭菌菌株，
-允许其在梭菌中进行复制的复制起始子
-置换盒，其包含第一标记基因，该标记基因由两个与靶DNA序列周围的选择区同源的序列包围，所述序列允许盒的重组，
-第二标记基因，
ii)选择其基因组中已经整合所述盒并且由此表达第一标记基因的菌株。
iii)选择已经消除所述载体并且由此不表达第二标记基因的菌株。
第二选择标记基因是一种抗生素抗性标记，选择标记基因或可反选择的标记基因(counter-selectable marker gene)。
缺失梭菌中基因的另一种方法包括使用在专利申请EP 2267126中记载的方法，其允许了以下步骤：
i)用包括下列各项的复制型载体转化梭菌菌株
-在梭菌中有功能的复制起点
-第一标记基因,
-第二标记基因,
-一个或多个II组内含子序列,
-逆转录酶编码基因；
ii)选择已经整合入所述复制型载体并且如此表达第二标记基因的菌株；
iii)选择在将内含子序列整合到所述基因中后具有中断基因的菌株。
第一选择标记基因是抗生素抗性标记，而第二选择标记基因是可反选择的标记基因(a counter-selectable marker gene)。
优选地，使用专利申请WO2008/040387中公开的方法。
在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中微生物经过进一步修饰，由于至少一个编码磷酸丁酰基转移酶(pta)或丁酸激酶(buk)的基因的缺失而不能将丁酰CoA转化为丁酸。这些基因中一个的缺失可以使用记载于专利申请WO2008/040387或EP2267126中的方法进行。优选地，基因buk缺失。
在本发明的进一步实施例中，微生物由于参与丙酮形成中的至少一个基因的减弱或缺失导致无法生产丙酮。优选地，该基因是选自编码CoA转移酶的ctfAB或编码乙酰乙酸脱羧酶的adc。这些基因中一个的缺失可以采用专利申请WO2008/040387或EP2267126中公开的方法进行。优选地，基因ctfAB是缺失的。
在本发明的另一个实施例中，本发明方法中所使用的微生物不能生产乳酸。尤其是这可以由于缺失编码乳酸脱氢酶的ldhA基因所致。缺失ldhA可以采用专利申请WO2008/040387或EP2267126中公开的方法实现。
在进一步实施例中，微生物以如下的方式修饰，使得不能产生乙酸。该结果可以是通过缺失参与乙酸形成的至少一个基因而获得的。优选地，该基因是选自于由编码磷酸转乙酰基酶(pta)或乙酸激酶(ack)的基因构成的组。这些基因中一个的缺失可以采用专利申请WO2008/040387或EP2267126中公开的方法进行。优选地，pta和ack这两个基因是缺失的。
本发明的一个实施例还提供了氢产生通量(flux of hydrogen production)降低以及由此使还原性等同物通量(flux of reducing equivalent)重新定位于正丁醇的产生。这可以通过减弱编码氢化酶(hydA)的基因来完成，所述氢化酶(hydA)是一种以氢产生形式提供还原性等同物的池(sink)的酶。基因hydA的减弱可以通过低强度启动子替换天然启动子或通过使相应的信使RNA或蛋白质去稳定化的元件来完成。如有需要，基因的完全减弱也可以通过缺失相应的DNA序列来实现。
优选地，使用的微生物选自下组：丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖多丁醇乙酸梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、或糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)，更优选地，使用丙酮丁醇梭菌。
尤其优选的简单碳源是葡萄糖。另一个优选的简单碳源是蔗糖。
在本发明的另一个实施例中，培养基是连续且稳定的。
发酵过程中正丁醇的回收可以通过气体剥离(gas stripping)完成。优选地，剥离气体选自于二氧化碳，氮气，空气，氢气，或其混合物。在一个优选的实施例中，剥离气体是二氧化碳。更优选地，用于剥离的惰性气体是由发酵自身所产生的。在该情况中，由发酵过程中产生的二氧化碳、氢气、或其混合物可以用于例如剥离步骤。
在本发明的一个更优选实施例中，所产生的正丁醇是通过连续蒸馏进行回收，所述连续蒸馏容许消除具有蒸汽压力高于丁醇的压力的产品或蒸汽压力低于丁醇压力的产品。这些蒸馏过程是通过采用本领域技术人员所知晓的常规技术实施的。
在另一个实施例中，根据本申请的方法包括以下步骤：
(a)使微生物与选自由葡萄糖，木糖，阿拉伯糖，蔗糖，单糖，寡糖，多糖，纤维素，木聚糖，淀粉或其衍生物、和甘油组成的组中的至少一种碳源接触，由此生成正丁醇，
(b)通过蒸馏回收发酵期间的正丁醇。
发酵通常在含有无机培养基的发酵罐中进行，所述无机培养基具有已知的确定的、适合于所用细菌的组成，其含有至少一种简单碳源，并且如有必要还含有产生所述代谢物所必需的共底物。
本申请还涉及先前描述的微生物。
乙酸正丁醇的生产
在本发明的一个具体实施例中，重组微生物仍产生转化为乙酸丁酯的丁醇和乙酸。
在发酵步骤或回收步骤中两种化合物可以转化为乙酸丁酯。为了将乙酸盐转化为乙酸，该转化可需要对发酵液酸化的预先步骤。该酸化通过在发酵液中加入酸或通过双电极电渗析实现。
在第一个方面中，转化通过展现脂肪酶活性的酶介导。优选地，该酶选自于南极洲假丝酵母，褶皱假丝酵母，米黑根毛霉，米根霉，根霉属菌种，日本根霉，溶血性葡萄球菌，沃氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌(Candida antartica,Candida rugosa,Rhizomucor miehei,Rhizopus oryzae,Rhizopus sp.,Rhizopus japonicus,Staphylococcus simulans,Staphylococcus warneri and Staphylococcus xylosus)的脂肪酶。
本发明的一个优选实施例中，在本发明的微生物中生成脂肪酶，其通过表达选自编码来自下组的脂肪酶的基因的相应基因进行：南极洲假丝酵母，褶皱假丝酵母，米黑根毛霉，米根霉，根霉属菌种，日本根霉，溶血性葡萄球菌，沃氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌，并且向丁酸乙酯的转化发生在发酵步骤期间。
在本发明的另一个优选实施例中，为了改善其效率，脂肪酶是固定化的。本领域技术人员知晓进行酶固定化的不同支持物和溶剂，也知晓如何使固定化过程适应于被固定的酶，如在Salah等人(2007),Kosugi等人(1992),Montero等人(1993),Sun等人(2010)的研究中展示。例如，脂肪酶的固定可以在如异辛烷或戊二醛的溶剂的存在下大孔阴离子交换树脂、多微孔聚丙烯(microporous polypropylene)、丙烯酸树脂、纺织膜或硅藻土上进行。
在本发明的这个方面中，转化优选以乙酸/丁醇摩尔比为3/1至1/5实现，更优选地乙酸/丁醇摩尔比为1:1。
在第二个方面中，转化是在含有硫酸作为催化剂的发酵液中直接通过化学酯化进行。优选地，反应性的蒸馏柱按照Wang等人(2003)所公开的使用。
实施例
本发明在以下实施例中进一步定义。应该理解的是这些实施例在表示本发明较优选实施例的同时，仅只是通过示例方式给出。从以上所公开的以及这些实施例，除了不修改本发明中的重要方法外，本领域技术人员能够做出各种改变以适应各种用途和环境。
特别地，实施例中展示了经修饰的丙酮丁醇梭菌菌株，但是这些修饰能在如拜氏梭菌，丁酸梭菌，糖多丁醇乙酸梭菌或糖丁酸梭菌的相同家族的其他微生物中很容易地实施。
丙酮丁醇梭菌属于梭菌科(Clostridiaceae)，其包含为革兰氏阳性、厌氧孢子形成杆菌、大多数为严格厌氧菌、并通常是通过鞭毛活动的成员。梭菌属包含很多种，有些是对人类高致病性的。其他对人类安全的种则被用于工业发酵。很多物种参与有机垃圾的腐败，并存在于作为其自然栖息地的土壤中。它们也被发现位于尤其是食草动物但也包括人类中的共生肠道菌群中。丙酮丁醇梭菌是一种重要的模式生物，但梭菌科中的其他重要成员包括拜氏梭菌，丁酸梭菌，糖多丁醇乙酸梭菌或糖丁酸梭菌。
实施例1：质粒构建以及染色体修饰方案
下面记载的方案用于构建遗传不同的丙酮丁醇梭菌菌株ATCC824，该菌株如下述实施例中所提及的那样缺失rex基因或pta-ack基因。
1.1pUC18-FRT-Pptb-catP载体的构建
该质粒含有在梭菌属中有功能并且侧翼有两个FRT位点的新CM/TH抗生素标记“catP”，并且对于构建置换盒是有用的。“catP”基因在专利申请WO2009/137778中记载。使用pSOS94-catP作为模板质粒(WO2009/137778)和寡核苷酸FRT-CM F和FRT-CM R作为引物用Pwo DNA聚合酶扩增“catP”序列，其侧翼有两个FRT位点(两个StuI位点)并位于丙酮丁醇梭菌磷酸转丁酰酶(ptb)启动子控制下的。通过T4多核苷酸激酶磷酸化PCR产物，并将其克隆到经SmaI消化的pUC18中以产生pUC18-FRT-Pptb-catP质粒。
1.2pSOS95-MLSr-upp载体的构建
将具有其自身核糖体结合位点(RBS)的upp基因刚好在MLSr基因下游的ClaI位点处克隆到pSOS95-MLSr中，以构建含有位于MLSr启动子控制下的MLSr和upp的人工操纵子。pSOS95-MLSr质粒通过SalI消化pSOS95质粒(Tumala等人,1999)以消除丙酮操纵子Pthl-ctfA-ctfB-adc而获得。
使用寡核苷酸REP-UPP F和REP-UPP R作为引物从丙酮丁醇梭菌基因组DNA PCR扩增(Pfu)具有其RBS的upp基因。将664bp的PCR产物用PvuII消化并克隆到用ClaI消化并用T4DNA聚合酶处理成平末端的pSOS95-MLSr中。这样，获得了pSOS95-MLSr-upp载体。
1.3pSOS95-MLSr-upp-flp载体的构建
将编码FLP重组酶的酿酒酵母flp基因克隆到上文描述的pSOS95-MLSr-upp载体中，处于丙酮丁醇梭菌硫解酶(thl)基因的RBS和启动子下，以允许在这种生物体中的高水平表达。包含FLP表达盒的SalI片段从pCLF1载体中获得(记载于专利申请WO2008/040387中)，并克隆到经SalI消化的pSOS95-MLSr-upp中以产生pSOS95-MLSr-upp-flp质粒。
1.4方案1:染色体修饰方案
特定染色体位点的基因中断以专利申请WO2008/040387中记载的同源重组技术实施。两翼为Flp识别位点的甲砜氯霉素(thiamphenicol)抗性盒(catP)，用pUC18-FRT-Pptb-catP质粒为模板进行PCR扩增。使用由此产生的PCR产物转化受体丙酮丁醇梭菌菌株，其使用含有具有与基因座特异性的同源区的“上游同源区-catP-下游同源区”片段的pSOS95-MLSr-upp质粒修饰。然后，在培养板(Petri plate)上选择抗生素抗性转化子以得到对甲砜氯霉素(5μg/mL)(Tm)有抗性的克隆。将一个菌落在含有甲砜氯霉素(5μg/mL)的液体合成培养基中培养24小时，并且100μL未经稀释的培养物涂布在含有甲砜氯霉素(5μg/mL)和5-FU(400μM)的2YTG上。对甲砜氯霉素和5-FU二者均有抗性的菌落影印铺板到含有5μg/mL甲砜氯霉素的2YTG和含有75μg/mL克拉霉素(clarithromycine)的2YTG两者上，以选择5-FU抗性还结合克拉霉素敏感性的克隆。使用实施例中列出的引物通过PCR检查对甲砜氯霉素有抗性且对克拉霉素敏感的克隆的基因型。
catP抗性盒利用表达编码酿酒酵母Flp重组酶的flp1基因的pSOS95-MLSr-upp-flp质粒转化菌株而去除。将克拉霉素抗性克隆中的一个菌落培养于无克拉霉素的合成液体培养基中，培养物涂布在含有400μM5-FU的2YTG上。对5-FU有抗性的菌落影印铺板到含有75μg/mL克拉霉素的2YTG上、含有5μg/mL甲砜氯霉素的2YTG上、和不含有抗生素的2YTG上，以选择克隆。5-FU抗性与pSOS95-MLSr-upp-flp载体丢失相关，而甲砜氯霉素敏感性与catP标记去除相关。敏感克隆的基因型通过使用实施例中所列出的引物采用PCR检测。
实施例2:编码丙酮丁醇梭菌ATCC824氧化还原感测性转录阻抑物REX的CAC_2713基因的缺失
为了缺失rex调节因子(CAC_2713)，除了使用引物对Rex 1-Rex 2和Rex3-Rex 4分别扩增rex位点的1135bp上游同源区和1138bp下游同源区外，使用方案1。引物Rex 1和Rex4二者均引入NotI位点，而引物Rex 2和Rex 3具有引入NruI位点的互补区。将DNA片段Rex1-Rex 2和Rex 3-Rex 4在PCR融合实验中连接，该实验使用引物Rex 1和Rex 4，并且将所得到的片段克隆入pCR4-TOPO-Blunt(Invitrogen)中以产生pTOPO:Rex。在pTOPO:Rex的唯一NruI位点处，将两侧均具有FRT序列的抗生素抗性catP基因(Cm/Tm)由pUC18-FRT-Pptb-catP的1230bp StuI片段导入。将用NotI消化所得质粒后获得的Rex缺失盒在NotI位点处克隆入pSOS95-MLSr-upp中以产生pSOS95-MLSr-upp-rex-catP质粒。
使用pSOS95-MLSr-upp-Drex-catP质粒通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌ATCC824菌株。对甲砜氯霉素有抗性且对克拉霉素敏感的克隆的基因型通过PCR分析(使用位于Rex缺失盒外侧的引物Rex 0和Rex 5进行)检测。分离已经丢失pSOS95-MLSr-upp-rex-catP载体的ATCC824△rex-catPR菌株。
根据方案1消除上述菌株的甲砜氯霉素抗性。已经丢失pSOS95-MLSr-upp-flp质粒的ATCC824△rex菌株的基因型用引物Rex 0和Rex 5通过PCR分析检验。
实施例3：编码丙酮丁醇梭菌ATCC824△cac15△upp△buk△ldhA氧化还原感测性转录阻抑物REX的CAC_2713基因的缺失
使用实施例2中记载的pSOS95-MLSr-upp-rex-catP质粒通过电穿孔转化专利申请WO2008/052596中所公开的丙酮丁醇梭菌△cac15△upp△buk△ldhA菌株。对甲砜氯霉素有抗性且对克拉霉素敏感的克隆的基因型通过PCR分析检测(使用位于Rex缺失盒外侧的引物Rex 0和Rex 5)。分离已经丢失pSOS95-MLSr-upp-rex-catP载体的△cac15△upp△buk△ldhA△rex-catPR菌株。根据方案1消除上述菌株的甲砜氯霉素抗性。已经丢失pSOS95-MLSr-upp-flp质粒的△cac15△upp△buk△ldhA△rex菌株的基因型用引物Rex 0和Rex 5通过PCR分析检验。
实施例4：编码丙酮丁醇梭菌ATCC824△cac15△upp△buk△ldhA△ctfAB氧化还原感测性转录阻抑物REX的CAC_2713基因的缺失
使用实施例2中记载的pSOS95-MLSr-upp-rex-catP质粒通过电穿孔转化专利申请WO2008/052596中所描述的丙酮丁醇梭菌△cac15△upp△buk△ldhA△ctfAB菌株。对甲砜氯霉素有抗性且对克拉霉素敏感的克隆的基因型通过PCR分析(使用位于Rex缺失盒外侧的引物Rex 0和Rex 5)检测。分离已经丢失pSOS95-MLSr-upp-rex-catP载体的△cac15△upp△buk△ldhA△ctfAB△rex-catPR菌株。根据方案1消除上述菌株的甲砜氯霉素抗性。已经丢失pSOS95-MLSr-upp-flp质粒的△cac15△upp△buk△ldhA△ctfAB△rex菌株的基因型用引物Rex 0和Rex 5通过PCR分析检验。
实施例5:丙酮丁醇梭菌ATCC824△cac15△upp△buk△ldhA△ctfAB△rex中PTA和ACK基因的缺失
为了缺失pta和ack基因，我们使用专利申请WO2008/052596中记载的pta-ack缺失盒。我们使用pTOPO:PA的唯一StuI位点以导入来自于pUC18-FRT-Pptb-catP载体的两侧均有FRT序列的抗生素抗性CM/TH基因。BamHI消化所获得的质粒后所得到的pta-ack缺失盒在BamHI位点克隆到pSOS95-MLSr-upp中以产生pSOS95-MLSr-upp-DPA-catP质粒。
使用pSOS95-MLSr-upp-DPA-catP质粒通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌△cac15△upp△buk△ldhA△ctfAB△rex菌株。对甲砜氯霉素有抗性且对克拉霉素敏感的克隆基因型通过PCR分析检测(使用位于pta-ack缺失盒外侧的引物PA0和PA 5)。分离已经丢失pSOS95-MLSr-upp-△rex-catP载体的△cac15△upp△buk△ldhA△ctfAB△rex△pta-ack-catPR菌株。根据方案1消除上述菌株的甲砜氯霉素抗性。已经丢失pSOS95-MLSr-upp-flp质粒的△cac15△upp△buk△ldhA△ctfAB△rex△pta-ack菌株的基因型用引物PA0和PA 5通过PCR分析检验。
实施例6:生产正丁醇的rex+和REX-菌株的分批发酵
在厌氧瓶培养中在由Soni等人(1987)描述的合成培养基中分析菌株，所述培养基在针对丙酮丁醇梭菌ATCC824菌株和丙酮丁醇梭菌ATCC824△rex菌株时添加20g/L MES，在针对丙酮丁醇梭菌ATCC824△cac15△uppDbuk△ldhA△ctfAB和丙酮丁醇梭菌ATCC824△cac15△upp△buk△ldhA △ctfAB△rex菌株时添加2.2g/l乙酸。使用37℃以及150RPM条件下的过夜培养物接种30ml培养物至OD620为0.2。将培养物在37℃、150RPM下孵育24h,48h和72h后，使用分离用的Biorad HPX 87H柱和检测用的折光计(refracometer)通过HPLC分析葡萄糖、有机酸和溶剂。
HPLC分析显示缺失Rex蛋白的菌株较表达Rex蛋白的菌株而言具有更高的四碳化合物/二碳化合物比率(丁醇+丁酯比乙酸+乙醇)。
与未经修饰的微生物比较，无论遗传背景(ATCC824△rex或ATCC824△cac15△upp△buk△ldhA△ctfAB△rex)和通过改进生产丁醇的滴度和产量，Rex基因的缺失通过增加四碳/二碳化合物的比例提高丁醇的生产。
甚至，rex基因的缺失导致丁醇(Mm:72g/mol)和乙酸(Mm:59g/mol)以近乎等摩尔比生产，由此促进乙酸丁酯的生产。
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Claims (22)

1.一种用于生产正丁醇的方法，其通过在包含碳源的合适培养基中培养梭菌(Clostridium)物种的经修饰的微生物进行，其中在所述经修饰的微生物中
a.至少编码氧化还原感测性转录阻抑物的rex基因是失活或缺失的，或
b.Rex蛋白的作用通过突变或缺失其靶基因的结合序列来降低，其中所述靶基因由crt-bcd-etfAB-hbd操纵子组成。
2.权利要求1的方法，其中在所述经修饰的微生物中，至少一个参与丁酸形成的以下基因是进一步缺失的：
-编码丁酸激酶的buk，和/或
-编码磷酸丁酰基转移酶的ptb。
3.根据权利要求1的方法，其中在所述经修饰的微生物中，至少一个参与丙酮形成的以下基因是进一步缺失的或减弱的：
-编码CoA转移酶的ctfAB，和/或
-编码乙酰乙酸脱羧酶的adc。
4.根据权利要求1的方法，其中在所述经修饰的微生物中，至少一个参与乙酸形成的以下基因是进一步缺失的：
-编码磷酸转乙酰酶的pta，和/或
-编码乙酸激酶的ack。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在所述经修饰的微生物中，参与乳酸形成的ldhA基因是进一步缺失的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在所述经修饰的微生物中，氢通量通过减弱或缺失hydA基因来进一步降低。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在所述经修饰的微生物中，hydA基因是进一步减弱的，和/或至少一个选自下述的基因是进一步缺失的：ptb,buk,ctfAB,adc,pta,ack,ldhA。
8.根据权利要求7所述的方法，其中以下基因是缺失的：buk，ldhA和ctfAB。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在所述经修饰的微生物中，以下基因是进一步缺失的：cac15和upp。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是选自下组：丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖多丁醇乙酸梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)和糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳源选自下组：单糖，寡糖，多糖和甘油。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳源选自下组：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、纤维素、木聚糖、淀粉或其衍生物和甘油。
13.根据权利要求1所述的方法，进一步包括从所述培养基中回收正丁醇的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中正丁醇通过连续蒸馏或通过气体剥离从所述培养基中回收。
15.根据权利要求14所述的方法，其中用于通过气体剥离回收的气体选自下组：二氧化碳，氮气，空气，氢气或其混合物。
16.一种用于从正丁醇生产乙酸正丁酯的方法，包括步骤：
a)根据权利要求1-15任一项所述的方法生产正丁醇；和
b)其中在步骤a)的发酵步骤过程中或回收步骤过程中在乙酸存在的条件下，将所述正丁醇转化为乙酸正丁酯。
17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤b)是在乙酸/丁醇摩尔比为3:1至1:5的条件下进行的。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述转化是通过脂肪酶介导的，或在含硫酸的发酵液中通过化学酯化进行的。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述脂肪酶是选自下组的菌种的脂肪酶：南极假丝酵母(Candida antartica)、褶皱假丝酵母(Candida rugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、根霉属菌种(Rhizopus sp.)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述脂肪酶是选自下组的菌种的脂肪酶：南极假丝酵母(Candida antartica)、褶皱假丝酵母(Candida rugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、米根霉(Rhizopus oryzae)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)。
21.权利要求1-20中任一项中所定义的梭菌物种的经修饰的微生物，其能从碳源生产正丁醇。
22.权利要求21所述的微生物，其中所述微生物的特征在于rex基因的缺失。
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