JP6404575B2 - 遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム - Google Patents
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Description
(2)酪酸生成酵素遺伝子として、ptbおよび/またはbukの機能を欠損させた、(1)記載の微生物。
(3)さらに、アセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子の機能を欠損させた、(1)または(2)記載の微生物。
(4)酢酸生成酵素遺伝子として、ptaおよび/またはackの機能を欠損させた、(3)記載の微生物。
(5)さらに、アセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するアセトン生成酵素遺伝子の機能を欠損させた、(1)〜(4)のいずれかに記載の微生物。
(6)アセトン生成酵素遺伝子として、adcおよび/またはctfABの機能を欠損させた、(5)記載の微生物。
(7)さらに、ピルビン酸から乳酸が生成する経路に関与する乳酸生成酵素遺伝子の機能を欠損させた、(1)〜(6)のいずれかに記載の微生物。
(8)乳酸生成酵素遺伝子として、ldh1の機能を欠損させた、(7)記載の微生物。
(9)(1)〜(8)のいずれかに記載の微生物を、炭素源を含む培地中で培養する工程を含む、ブタノールの製造方法。
(10)培養液からブタノールを回収する工程を含む、(9)記載の方法。
Perutka et al., J. Mol. Biol. 13;336(2):421-39(2004)をもとにして、標的とする遺伝子の塩基配列を入力することにより、その遺伝子へのグループIIイントロンの挿入箇所とターゲッティング配列の改変方法が出力されるようなエクセルマクロのプログラミングを行った。次に、実際に遺伝子破壊を実施するptb遺伝子、pta遺伝子、ctfB遺伝子、ldh1遺伝子の塩基配列をこれに入力し、ターゲッティング配列の改変箇所を出力させた。ptb遺伝子の塩基配列を配列番号1に、pta遺伝子の塩基配列を配列番号2に、ctfB遺伝子の塩基配列を配列番号3に、ldh1遺伝子の塩基配列を配列番号8に示す。
実施例1で作製したC.サッカロパーブチルアセトニカムの形質転換微生物(Δptb株)を培養しその性能の評価を行った。形質転換微生物のグリセロールストックを500μl分、TYA培地に植菌し、試験管内で30℃にて培養を24時間行った。取得した前培養液を、新たなTYS培地5mlに50μl分植菌し、試験管内で30℃にて培養を行った。培養は、24時間程度行った。培養は開放条件で実施した。
実施例1で作製したC.サッカロパーブチルアセトニカムの形質転換微生物(ΔptaΔptb株)を培養して、その性能を評価した。形質転換微生物のグリセロールストックを500μl分、TYA培地5mlに植菌し、試験管内で30℃にて培養を24時間行った。取得した前培養液を、新たなTYA、TYSまたはTYS−CaCO3培地5mlに50μl分植菌し、試験管内で30℃にて培養を行った。TYS培地の組成を以下に示す。なお、TYS−CaCO3培地とは、TYS培地にCaCO3を5g/L添加した培地のことを指す。
実施例1で作製したC.サッカロパーブチルアセトニカムの形質転換微生物(ΔptaΔptb株)を、種々の水素分圧下で培養した。形質転換微生物のグリセロールストックを500μl分、TYS−CaCO3培地に植菌し、試験管内で30℃にて培養を24時間行った。取得した前培養液を、新たなTYS−CaCO3培地5mlに50μl分植菌し、試験管内で30℃にて培養を行った。CaCO3を5g/L添加することにより、pHは5.0を下回らないように調整した。
実施例1で作製したC.サッカロパーブチルアセトニカムの形質転換微生物(ΔctfBΔptaΔptb株)を培養しその性能の評価を行った。形質転換微生物のグリセロールストックを500μl分、TYS−CaCO3培地に植菌し、試験管内で30℃にて培養を24時間行った。取得した前培養液を、新たなTYS−CaCO3培地5mlに50μl分植菌し、試験管内で30℃にて培養を行った。
実施例1で作製したC.サッカロパーブチルアセトニカムの形質転換微生物(ΔptaΔptbΔldh1株)と野生株を培養しその性能の評価を行った。形質転換微生物のグリセロールストックを500μl分、TYS−CaCO3培地に植菌し、試験管内で30℃にて培養を24時間行った。取得した前培養液を、新たなTYS−CaCO3培地5mlに50μl分植菌し、試験管内で30℃にて培養を行った。
実施例1で作製したC.サッカロパーブチルアセトニカムの形質転換微生物(Δpta株、Δptb株、ΔptaΔptb株、ΔptaΔptbΔldh1株)を培養して、その性能を評価した。形質転換微生物のグリセロールストックを500μl分、TYS培地5mlに植菌し、試験管内で30℃にて培養を24時間行った。取得した前培養液を、新たなTYS−KH2PO4培地5mlに50μl分植菌し、試験管内で30℃にて培養を行った。TYS−KH2PO4培地の組成を以下に示す。
Claims (5)
- クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021株において、ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子であるptbの機能、並びに、アセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子であるptaの機能を欠損させたクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。
- さらに、アセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するアセトン生成酵素遺伝子であるadcおよび/またはctfABの機能を欠損させた、請求項1記載の微生物。
- さらに、ピルビン酸から乳酸が生成する経路に関与する乳酸生成酵素遺伝子であるldh1の機能を欠損させた、請求項1又は2記載の微生物。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の微生物を、炭素源を含む培地中で培養する工程を含む、ブタノールの製造方法。
- 培養液からブタノールを回収する工程を含む、請求項4記載の方法。
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