JP7126403B2 - 遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物に関する。より詳しくは、本発明は、遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物及び該微生物を用いるブタノールの製造方法に関する。
微生物によるブタノール発酵では、ブタノールに加えて、アセトン、エタノールなどの溶媒の他、酪酸、酢酸及び乳酸といった有機酸が副生する（図１）。これらの副生物はブタノール収率低下の要因となるほか、ブタノールを回収するプロセスを構築する上でも障害となる。
ブタノール発酵において、副生物（アセトン、エタノール、有機酸など）を減らすことは、ブタノールの対グルコース収率を向上させ、分離精製工程を容易にするという意味で非常に有用である。そこで、以前から副生物を減らすための検討が行われてきた。
例えば、特許文献１では、酪酸や酢酸、アセトンの生成経路に関与する生成酵素遺伝子に外来遺伝子を挿入して破壊することにより、当該副生物が副生せず、分離精製工程が容易になることが開示されている。
また、特許文献２では、酪酸や酢酸、アセトンの生成経路に関与する生成酵素に対してDNA塩基の塩基変換反応を行うことにより、酵素の機能を欠損して、ブタノールの収率を向上する方法が開示されている。
しかしながら、従来技術の方法においては、得られた微生物が遺伝子組換え微生物となるため安全性確保が必要であったり、ブタノール収率の面で未だ十分でなかったりと、更なる技術が望まれている。
本発明は、新規な遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物及び該微生物を用いるブタノールの製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明の他の目的は、安全性に優れる遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物を提供することである。
また、本発明の他の目的は、ブタノール収率に優れたり、副生物の副生が抑制されたりする遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物を提供することである。
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、副生物の生成酵素遺伝子における特定の塩基改変を生じさせることで、当該酵素の機能が欠損した新規な遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物を産生できることを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明の微生物において、安全性に優れるものであってもよく、ブタノール収率に優れるものであっても、副生物の生成が抑制されるものであってもよい。
即ち、本発明は、下記〔１〕～〔１０〕に関する。
〔１〕 ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子とアセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子の機能をそれぞれ欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まない
クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。
〔２〕 ホスホトランスブチリラーゼのアミノ酸変化が、P148S、P148L、G155E、G155R、G155K及びV251Iからなる群より選ばれる、２種以上のアミノ酸における変化である、前記〔１〕記載の微生物。
〔３〕 ホスホトランスブチリラーゼのアミノ酸変化が、P148S又はP148Lと、G155E、G155R又はG155Kとの組合せを少なくとも含む、前記〔１〕又は〔２〕記載の微生物。
〔４〕 pta遺伝子が、コードするホスホトランスアセチラーゼにR311K及び／又はG312Kのアミノ酸変化を生じる遺伝子改変を含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の微生物。
〔５〕 さらに、アセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子の機能を欠損し、該遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼにアミノ酸変化を生じさせる遺伝子改変を含む、前記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の微生物。
〔６〕 CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットに、P25S、P25L、P85S、P85L、P121S、P121L、P170S及びP170Lからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸変化を生じさせる遺伝子改変を含む、前記〔５〕記載の微生物。
〔７〕 ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子、アセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子及びアセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子のそれぞれの機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、該pta遺伝子が、コードするホスホトランスアセチラーゼに311位及び／又は312位のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、かつ
前記CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットにおいて25位、85位、121位及び170位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含むことを特徴とする、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。
〔８〕 P148S又はP148Lと、G155E、G155R又はG155Kのアミノ酸変化を含むホスホトランスブチリラーゼをコードするptb1遺伝子と、R311K及び／又はG312Kのアミノ酸変化を含むホスホトランスアセチラーゼをコードするpta遺伝子と、P25S、P25L、P85S、P85L、P121S、P121L、P170S及びP170LSからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸変化を含むCoAトランスフェラーゼ遺伝子をコードするctfB遺伝子を含む、前記〔７〕に記載の微生物。
〔９〕 前記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の微生物を、炭素源を含む培地中で培養する工程を含む、ブタノールの製造方法。
〔１０〕 さらに、前記培養液からブタノールを回収する工程を含む、前記〔９〕記載の方法。
〔１〕 ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子とアセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子の機能をそれぞれ欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まない
クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。
〔２〕 ホスホトランスブチリラーゼのアミノ酸変化が、P148S、P148L、G155E、G155R、G155K及びV251Iからなる群より選ばれる、２種以上のアミノ酸における変化である、前記〔１〕記載の微生物。
〔３〕 ホスホトランスブチリラーゼのアミノ酸変化が、P148S又はP148Lと、G155E、G155R又はG155Kとの組合せを少なくとも含む、前記〔１〕又は〔２〕記載の微生物。
〔４〕 pta遺伝子が、コードするホスホトランスアセチラーゼにR311K及び／又はG312Kのアミノ酸変化を生じる遺伝子改変を含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の微生物。
〔５〕 さらに、アセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子の機能を欠損し、該遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼにアミノ酸変化を生じさせる遺伝子改変を含む、前記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の微生物。
〔６〕 CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットに、P25S、P25L、P85S、P85L、P121S、P121L、P170S及びP170Lからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸変化を生じさせる遺伝子改変を含む、前記〔５〕記載の微生物。
〔７〕 ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子、アセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子及びアセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子のそれぞれの機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、該pta遺伝子が、コードするホスホトランスアセチラーゼに311位及び／又は312位のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、かつ
前記CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットにおいて25位、85位、121位及び170位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含むことを特徴とする、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。
〔８〕 P148S又はP148Lと、G155E、G155R又はG155Kのアミノ酸変化を含むホスホトランスブチリラーゼをコードするptb1遺伝子と、R311K及び／又はG312Kのアミノ酸変化を含むホスホトランスアセチラーゼをコードするpta遺伝子と、P25S、P25L、P85S、P85L、P121S、P121L、P170S及びP170LSからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸変化を含むCoAトランスフェラーゼ遺伝子をコードするctfB遺伝子を含む、前記〔７〕に記載の微生物。
〔９〕 前記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の微生物を、炭素源を含む培地中で培養する工程を含む、ブタノールの製造方法。
〔１０〕 さらに、前記培養液からブタノールを回収する工程を含む、前記〔９〕記載の方法。
また、本発明は、下記の態様も含むものである。
〔１１〕 ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子の機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含むことを特徴とする、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。
〔１２〕 ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子の機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記微生物のその他の遺伝子が破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まない
クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。
〔１３〕 ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子とアセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子の機能をそれぞれ欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、
前記ptb1遺伝子以外の遺伝子が破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まない
クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。
〔１４〕 アセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子の機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットにおいて25位、85位、121位及び170位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含む微生物。
〔１１〕 ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子の機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含むことを特徴とする、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。
〔１２〕 ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子の機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記微生物のその他の遺伝子が破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まない
クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。
〔１３〕 ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子とアセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子の機能をそれぞれ欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、
前記ptb1遺伝子以外の遺伝子が破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まない
クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。
〔１４〕 アセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子の機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットにおいて25位、85位、121位及び170位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含む微生物。
本発明のクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物は、新規な遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であり、該微生物を用いることで新規なブタノールの製造方法を提供することができる。
また、本発明のクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物は、他の態様では、改変される遺伝子が破壊を伴う外来遺伝子の挿入によるものではないため、安全性が良好であり、安全性確保のための設備費用や廃棄物処理費用の負担を要せず、製造コストに優れるという効果を奏する。
また、本発明のクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物は、他の態様では、副生物の副生が少ないため分離精製が容易であったり、ブタノールを効率よく産生できるという優れた効果を奏する。
本発明のクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物は、ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子の機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含むことに特徴を有する。クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムのptb1遺伝子のCDS配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。本発明においては、前記特徴を有するのであれば、当該ptb1遺伝子以外に、他の遺伝子の機能も欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物も含まれ、通常、アセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子の機能も欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物が挙げられる。なお、本発明において「遺伝子の機能を欠損」するとは、該遺伝子がコードする酵素そのものが発現されずに機能しないか、あるいは改変された酵素が発現されても酵素として機能しないことを意味し、「遺伝子の機能を欠損」する方法としては、遺伝子を破壊する方法と遺伝子を改変する方法が挙げられる。ここで、「破壊」による機能欠損には、外来遺伝子の挿入によって所望の遺伝子を破壊［例えば、ターゲットロン（ＧｒｏｕｐＩＩイントロン）を用いた破壊；破壊を伴う挿入］する機能欠損、所望の遺伝子を欠失させて破壊（破壊を伴う欠失）する機能欠損、それ以外の破壊［例えば、物理的破壊（例えば、紫外線などの高エネルギー波の照射による破壊）、化学的破壊（例えば、変異原性化学物質の処理による破壊）］による機能欠損があり、一方、「改変」による機能欠損には、前記した破壊による機能欠損以外の機能欠損が含まれ、例えば、遺伝子の置換（置き換わること）、欠失（欠落すること）、付加（付け加えられること）及び／又は挿入（組み入れられること）することによる改変等が挙げられる。
本発明におけるクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum；以下、「C.サッカロパーブチルアセトニカム」ともいう）は、ブタノール生成能を有するものであれば、その株は特に限定されない。具体例として、例えば、ATCC27021株、ATCC13564株などが挙げられる。
本発明の一態様として、具体的に、ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子とアセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子の機能をそれぞれ欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まない
クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物を挙げることができる。
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まない
クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物を挙げることができる。
ptb1遺伝子の遺伝子改変は、ホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる。
本発明における遺伝子改変は、DNAの特定の配列を認識させて任意の部位を標的化し、DNA塩基の塩基変換により標的化されたDNAを特異的に改変することができれば、その方法は特に限定されない。具体的には、例えば、特開２０１７－５１１８５に記載のCRISPR-Casシステム（CRISPR-変異Cas）を用いることができる。前記システムにおいては、改変しようとする遺伝子の標的ヌクレオチド配列の標的鎖と相補的なヌクレオチド配列を含むゲノム特異的CRISPR-RNA（crRNA）に、Casタンパク質をリクルートするためのRNA（trans-activating crRNA：tracrRNA）を連結したgRNA（ガイドRNA、sgRNA）をコードするDNAを作製し、他方で二本鎖DNAの両方の鎖の切断能を失活した変異Casタンパク質をコードするDNA（dCas）とデアミナーゼ遺伝子とを連結したDNAを作製し、これらのDNAを、クロストリジウム属で機能するシャトルベクターを用いて、C.サッカロパーブチルアセトニカム種微生物に挿入することで、所望の塩基を置換してアミノ酸変化を生じさせることができる。そのため、遺伝子改変により機能を欠損させた微生物は、破壊を伴う遺伝子の挿入及び／又は欠失に依らずに得られるため、遺伝子組換え微生物の範疇にないと考えられ、遺伝子組換え微生物取扱いのために高度な設備や廃棄物処理が不要である。
ホスホトランスブチリラーゼの148位、155位及び251位アミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変をptb1遺伝子に挿入することのできるターゲティング配列（標的ヌクレオチド配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖）を下記表１に示す。なお、表には20塩基のターゲティング配列が記載されているが、ターゲティング配列は18～25塩基の任意の長さをとることができる。
前記遺伝子改変により生じるホスホトランスブチリラーゼにおけるアミノ酸変化としては、148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸変化であればよいが、148位、155位及び251位からなる群より選ばれる２種以上のアミノ酸変化であることが好ましく、P148S、P148L、G155E、G155R、G155K及びV251Iからなる群より選ばれる２種以上のアミノ酸変化であることがより好ましく、P148S又はP148Lと、G155E、G155R又はG155Kとの組合せを少なくとも含むことがさらに好ましい。
従来型の人工ヌクレアーゼでは、DNA二重鎖切断（DSB）を伴うため、ゲノム内の配列を標的とすると染色体の無秩序な切断（off-target切断）によると思われる増殖阻害と細胞死とが引き起こされる。この影響は多くの微生物・原核生物において特に致命的であり、応用性を阻んでいる。本発明では、変異を生じさせるにはDNA切断ではなくDNA塩基上の置換基の変換反応（特に脱アミノ化反応）によって行うことができ、毒性の大幅な軽減が実現できる。
このようにして得られる本発明の微生物の酪酸生成酵素遺伝子（ptb1遺伝子）は、標的ヌクレオチド配列の非標的鎖上の特定の塩基が他の塩基（デアミナーゼがシチジンデアミナーゼを用いる場合、CからTへの置換（但し、非標的鎖がアンチセンス鎖である場合、センス鎖上はGからAへの置換）で置換され、その結果、該遺伝子にコードされる酵素の機能が欠損する。
本発明においては、ptb1遺伝子は、前記するホスホトランスブチリラーゼの148位、155位及び251位からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含むのであれば、その他の遺伝子改変を含むものであってもよい。その他の遺伝子改変としては、例えば、P16L、P16S、A21V、V22I、V22M、A23T、V24I、V24M、A25T、E36K、S66L、A83V、A83T、V87I、H91Y、A92V、T104I、S123F、H124I、A126V、A143V、T146I、E149K、V154I、D152N、A160V、T17I、C178Y、V180I、E181K、S186N、M187I、A194V、A194T、A197V、Q204X、A219T、S221F、A224V、A225V、H226Y、A249T、M252I、T257I、S260F、S262F、R280K、A281T、D282N、S282F、H545Yとなるアミノ酸変化を生じさせる遺伝子改変が含まれる。これらは１種単独で又は２種以上組み合わせて含まれていてもよい。なお、本明細書において、アミノ酸Xは終止コドンに置換されたことを意味する。
アセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子の機能を欠損させることとしては、本発明においては、前記酵素遺伝子が破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まないのであれば特に限定されず、前記以外の破壊による機能欠損［例えば、物理的破壊（例えば、紫外線などの高エネルギー波の照射による破壊）、化学的破壊（例えば、変異原性化学物質の処理による破壊）による機能欠損］や破壊を伴わない挿入及び／又は欠失による機能欠損、酵素遺伝子の一部又は全部を改変（例えば、置換、欠失、付加及び／又は挿入）することによる機能欠損等により、該遺伝子の発現産物が当該酵素としての機能を有しないようにする。具体的には、例えば、ptb1遺伝子における遺伝子改変と同様、CRISPR-変異Casとデアミナーゼを組み合わせたゲノム編集により行うことができる。
アセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子としては、pta（ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子）及びack（酢酸キナーゼをコードする遺伝子）が挙げられる。本発明においてはいずれの遺伝子を対象としてもよいが、細胞内のリン酸化化合物濃度を低減させる観点から、pta遺伝子に破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含ませないで、該遺伝子がコードする酵素の機能を欠損させることが好ましい。参考に、クロストリジウム.サッカロパーブチルアセトニカムのpta遺伝子のCDS配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０に示す。
具体的には、例えば、pta遺伝子がコードする酵素において、配列番号１０に示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号8位、9位、10位、11位、13位、27位、30位、31位、32位、41位、43位、50位、51位、54位、56位、83位、90位、92位、111位、112位、113位、115位、118位、123位、128位、129位、138位、143位、150位、151位、156位、158位、160位、164位、166位、183位、185位、186位、188位、190位、192位、194位、195位、206位、212位、217位、219位、236位、242位、243位、259位、260位、266位、268位、274位、279位、282位、290位、292位、293位、294位、305位、311位、312位、313位からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸に変化を生じさせて、酵素の機能を欠損させる。アミノ酸変化の種類としては、例えば、W8X、A9T、A10T、A11T、S13F、R27K、E30K、A31V、A32V、A41V、P43S、D50N、E51K、A54V、A56V、A83V、S90N、G92N、G92S、G92D、M111I、M112I、V113I、P115F、P115S、P115L、A118V、S123F、T128I、T129I、Q138X、A143T、S150L、S151N、Q156X、P158L、P158S、S160F、E164K、G166K、G166R、G166E、Q183X、A185V、A185T、A186V、A186T、A188T、A190T、A192T、T194I、A195V、A206V、T212I、D217N、E219K、P236L、P236S、G242N、G242S、G242D、E243K、A259V、P260L、P260S、G266K、G266R、G266E、A268T、P274L、P274S、G279E、G282N、G282S、G282D、A290V、A292V、E293K、A294V、P305L、P305S、R311K、R311E、G312K、G312R、G312E、C313Yが挙げられる。本発明においては、前記したアミノ酸変化が生じるような遺伝子改変をpta遺伝子が含んでいればよく、なかでも、ホスホトランスアセチラーゼにR311K及び／又はG312Kのアミノ酸変化を生じる遺伝子改変を含むpta遺伝子が好ましい。
ホスホトランスアセチラーゼの311位及び312位アミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変をpta遺伝子に挿入することのできるターゲティング配列（標的ヌクレオチド配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖）を下記表２に示す。なお、表には20塩基のターゲティング配列が記載されているが、ターゲティング配列は18～25塩基の任意の長さをとることができる。
また、本発明の一態様として、前記酪酸生成酵素遺伝子と酢酸生成酵素遺伝子以外に、アセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するアセトアセチルCoA転移酵素遺伝子の機能も欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物が挙げられる。
アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子の機能を欠損させることとしては、本発明においては、前記酵素遺伝子が破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まないことが好ましく、前記以外の破壊による機能欠損［例えば、物理的破壊（例えば、紫外線などの高エネルギー波の照射による破壊）、化学的破壊（例えば、変異原性化学物質の処理による破壊）による機能欠損］や、破壊を伴わない挿入及び／又は欠失による機能欠損、酵素遺伝子の一部又は全部を改変（例えば、置換、欠失、付加及び／又は挿入）することによる機能欠損などにより該遺伝子の発現産物が当該酵素としての機能を有しないようにする。具体的には、例えば、ptb1遺伝子における遺伝子改変と同様、CRISPR-変異Casとデアミナーゼを組み合わせたゲノム編集により行うことができる。
アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子としては、ctfA（CoAトランスフェラーゼのＡサブユニットをコードする遺伝子）、ctfB（CoAトランスフェラーゼのＢサブユニットをコードする遺伝子）が含まれる。CoAトランスフェラーゼは、ＡサブユニットとＢサブユニットを含み、アセトアセチルCoAをアセトアセテートに転化する反応を触媒する酵素である。本発明においてはいずれの遺伝子を対象としてもよいが、酵素の構成アミノ酸の観点から、ctfB遺伝子内に挿入及び／又は欠失を含ませないで、該遺伝子がコードする酵素の機能を欠損させることが好ましい。参考に、クロストリジウム.サッカロパーブチルアセトニカムのctfB遺伝子のCDS配列を配列番号１３に、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。
具体的には、例えば、ctfB遺伝子がコードする酵素において、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号15位、25位、80位、85位、121位及び170位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせて、酵素の機能を欠損させることが好ましく、25位、85位、121位及び170位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせることがより好ましい。アミノ酸変化の種類としては、例えば、A15T、P25S、P25L、P80S、P80L、P85S、P85L、P121S、P121L、P170S、P170Lが挙げられる。本発明においては、前記したアミノ酸変化が生じるような遺伝子改変をctfB遺伝子が含んでいればよく、なかでも、CoAトランスフェラーゼにP25S、P25L、P85S、P85L、P121S、P121L、P170S、P170Lのアミノ酸変化を生じる遺伝子改変を含むctfB遺伝子が好ましく、P85S、P121S、P121Lのアミノ酸変化を生じる遺伝子改変を含むctfB遺伝子がより好ましい。
CoAトランスフェラーゼの15位、25位、80位、85位、121位及び170位アミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変をctfB遺伝子に挿入することのできるターゲティング配列（標的ヌクレオチド配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖）を下記表３に示す。なお、表には20塩基のターゲティング配列が記載されているが、ターゲティング配列は18～25塩基の任意の長さをとることができる。
このようにして、酪酸生成酵素遺伝子及び酢酸生成酵素遺伝子と、必要によりアセトアセチルCoA転移酵素遺伝子の機能がいずれも、前記遺伝子改変により欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物を得ることができる。このような形質転換体として、例えば、
ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子、アセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子及びアセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子のそれぞれの機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、該pta遺伝子が、コードするホスホトランスアセチラーゼに311位及び／又は312位のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、かつ
前記CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットにおいて25位、85位、121位及び170位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含むことを特徴とする、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物
を挙げることができる。前記形質転換体としては、P148S又はP148Lと、G155E、G155R又はG155Kのアミノ酸変化を含むホスホトランスブチリラーゼをコードするptb1遺伝子と、R311K及び／又はG312Kのアミノ酸変化を含むホスホトランスアセチラーゼをコードするpta遺伝子と、P25S、P25L、P85S、P85L、P121S、P121L、P170S及びP170Lからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸変化を含むCoAトランスフェラーゼ遺伝子をコードするctfB遺伝子を含むものが好ましい。
ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子、アセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子及びアセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子のそれぞれの機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、該pta遺伝子が、コードするホスホトランスアセチラーゼに311位及び／又は312位のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、かつ
前記CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットにおいて25位、85位、121位及び170位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含むことを特徴とする、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物
を挙げることができる。前記形質転換体としては、P148S又はP148Lと、G155E、G155R又はG155Kのアミノ酸変化を含むホスホトランスブチリラーゼをコードするptb1遺伝子と、R311K及び／又はG312Kのアミノ酸変化を含むホスホトランスアセチラーゼをコードするpta遺伝子と、P25S、P25L、P85S、P85L、P121S、P121L、P170S及びP170Lからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸変化を含むCoAトランスフェラーゼ遺伝子をコードするctfB遺伝子を含むものが好ましい。
また、本発明は、前記３種の遺伝子が改変した形質転換体以外に、前記遺伝子のいずれか１つの遺伝子が改変したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物として、例えば、
アセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子の機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットにおいて25位、85位、121位及び170位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含む微生物
を挙げることができる。該形質転換体は、副生物のアセトン生成を抑制することができ、本発明の一態様として提供することができる。なお、ここでの遺伝子改変は前述と同じである。
アセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子の機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットにおいて25位、85位、121位及び170位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含む微生物
を挙げることができる。該形質転換体は、副生物のアセトン生成を抑制することができ、本発明の一態様として提供することができる。なお、ここでの遺伝子改変は前述と同じである。
またさらに、本発明の微生物として、ptb1遺伝子が前記した遺伝子改変を含むのであれば、前記したpta遺伝子やctfB遺伝子に遺伝子改変を含むもの以外に、ptb1以外の遺伝子が破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まないクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物や、酪酸生成酵素遺伝子及び酢酸生成酵素遺伝子の両機能を欠損している場合には、ptb1以外の遺伝子であって、酢酸生成酵素遺伝子ptaを含む他の遺伝子が、破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まないクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物もまた、本発明に含まれる。
かくして得られた遺伝子改変C.サッカロパーブチルアセトニカム種微生物を、ブタノール生産用の培地で培養し、ブタノール発酵を行うことによりブタノールを製造する。本発明の培養に用いる培地及び培養条件は、ブタノール発酵の分野で公知のものを使用できる。培養培地は、通常、炭素源、窒素源及び無機イオンを含む。
炭素源としては、好ましくは糖類、例えば、単糖類、オリゴ糖類、多糖類を用いる。好ましくは単糖類、特にグルコースを用いる。グルコースとともに、ラクトース、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物等のその他糖類；ソルビトール等のアルコール類；又はフマル酸、クエン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を、併用してもよい。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物等の有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が添加される。また、公知のその他の添加剤を用いてもよく、例えば、有機微量栄養素を用いることができる。具体的には、例えば、チアミン、p-アミノ安息香酸、ビタミンB1、ビオチンなどの微生物が要求する物質又は酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
本発明においては、好ましくは還元力を上昇させた条件で形質転換体の培養を実施することにより、アセトン、エタノール、酢酸、酪酸及び乳酸といった副生物の生成を抑制しながらブタノールを高効率で生産することができる。ブタノールの絶対生成量も増大させることができる。還元力を上昇させた条件での培養とは、培養中に生じる酵素反応が、還元力が上昇した条件で行われることをさす。還元力の上昇は、例えば、NADHを添加することにより、水素を添加することにより、または培養槽内の水素分圧を上昇させることにより実施できる。培養槽内の水素分圧を上昇させることにより、培養液が接する気相における水素分圧が上昇し、培養液に接する気相中の水素は、ヒドロゲナーゼによって即座に取り込まれると考えられる。
培養槽内の水素分圧は、例えば、密閉状態で培養することにより、上昇させることができる。密閉状態とすることにより、微生物から排出される水素の外部放出を制限することができ、結果として培養槽内の水素分圧を上昇させることができる。また、外部から水素を添加してもよい。例えば、培養液に水素をバブリングすることにより水素を添加してもよいし、培養槽の気相部に水素を添加してもよいし、培養液に接するように水素を添加してもよい。具体的には、培養槽内の水素分圧を20～40℃の範囲で、好ましくは0.06atm以上、より好ましく0.08atm以上、さらに好ましくは0.10atm以上、さらにより好ましくは0.12atm以上、最も好ましくは0.15atm以上で、好ましくは10atm以下とする。
水素分圧の測定は、公知の方法で実施でき、特に制限されないが、例えば、発生した気体をアルミニウムバッグに捕集し、バッグ内の気体の水素濃度をガスクロマトグラフィーで検出し、濃度と体積を掛け合わせることで発生した水素の量を定量し、発生した水素の量と培養槽中の気相部の体積から、水素分圧を算出できる。
本発明においては、pHを調整して培養を実施することにより、さらに、副生物に対するブタノールの生成量を向上させることができる。培地のpHは、好ましくは4.6以上、4.7以上、4.8以上、4.9以上、5.0以上又は5.5以上であり、好ましくは8以下、7.5以下、7.0以下、6.9以下、6.8以下、6.7以下、6.6以下又は6.5以下になるよう、必要であれば制御する。pH調整には、無機又は有機の酸性又はアルカリ性物質、例えば、炭酸カルシウム、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸カリウムなどを使用できる。pH調整には、上記のようなアルカリ性物質等を加えなくても、培地が目的のpHに保たれている場合も包含される。例えば、窒素源として硫酸アンモニウムを用いている場合、それを緩衝能の高い酢酸アンモニウムに代替すれば、pHの低下が抑えられ、生育が改善される場合がある。
その他の培養条件は、特に制限されず、当技術分野で慣用の条件を採用することができる。例えば、バッチ培養を行う場合、培養時間は通常5～100時間、好ましくは12～100時間である。連続培養又は流加培養を行う場合には、培養時間は通常200時間以上、好ましくは500時間以上、より好ましくは1000時間以上である。培養温度は通常20～55℃、好ましくは25～40℃、例えば約30℃に調整する。
本発明の製造方法において、副生物に対するブタノールの生成比は、生成したブタノールのモル数を、生成したアセトン、エタノール、酢酸及び酪酸の合計モル数で割った数値として、好ましくは2.5以上、3.0以上、4.0以上又は5.0以上である。
培養中又は培養終了後の培養液からの発酵生成物、すなわちブタノールの回収には、特別な方法は必要ではなく、公知の方法でブタノールを回収できる。当技術分野で周知のイオン交換樹脂法、蒸留、ガスストリッピング、溶媒抽出その他の方法を組み合わせることにより、培養中又は培養終了後に実施できる。好ましくは培養中に、ブタノールをガスストリッピング又は溶媒抽出により回収し、さらに蒸留により精製する。本発明の方法では、副生物の生成量に対するブタノールの生成量が多いことから、ブタノールの収率が高く、またブタノールの分離精製工程を簡略化することができるため、コストの観点からも有利である。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１（グループIIイントロンによる破壊株）
Perutka et al., J. Mol. Biol. 13;336(2):421-39(2004)を参照にして、標的とする遺伝子の塩基配列を入力することにより、その遺伝子へのグループIIイントロンの挿入箇所とターゲッティング配列の改変方法が出力されるようなエクセルマクロのプログラミングを行った。次に、実際に遺伝子破壊を実施するptb1遺伝子、pta遺伝子の塩基配列をそれぞれ、これに入力し、ターゲッティング配列の改変箇所を出力させた。
Perutka et al., J. Mol. Biol. 13;336(2):421-39(2004)を参照にして、標的とする遺伝子の塩基配列を入力することにより、その遺伝子へのグループIIイントロンの挿入箇所とターゲッティング配列の改変方法が出力されるようなエクセルマクロのプログラミングを行った。次に、実際に遺伝子破壊を実施するptb1遺伝子、pta遺伝子の塩基配列をそれぞれ、これに入力し、ターゲッティング配列の改変箇所を出力させた。
この情報をもとに、ptb1遺伝子、pta遺伝子の破壊ベクターであるpNS78プラスミド、pNS47プラスミドを設計した。構築には、ＤＮＡ合成を利用した。また、FLPリコンビナーゼを含むpKNT19-FLPプラスミドを設計し、同様にＤＮＡ合成により構築した。
作製したpNS78をC.サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021株に形質転換した。具体的には、まず前培養として、C.サッカロパーブチルアセトニカムのグリセロールストック0.5mLをTYA培地5mLに接種し、30℃、24時間培養した。この前培養液をTYA培地10mLにOD＝0.1となるよう接種、15mL容ファルコンチューブで37℃にてインキュベートした。OD＝0.6となった段階で発酵液を遠心分離して上清を除去し、氷冷しておいた65mM MOPSバッファー（pH6.5）10mLを加えピペッティングにより再懸濁し、遠心分離を行った。MOPSバッファーによる洗浄は２回繰り返した。遠心分離によりMOPSバッファーを除去した後、氷冷しておいた0.3Mスクロース100μLで菌体ペレットを再懸濁し、コンピテントセルとした。コンピテントセル50μLをエッペンドルフチューブに取り、プラスミド1μgと混合した。氷冷したエレクトロポレーション用セルに入れ、Exponential decayモード、2.5ｋV/cm、25μF、350Ωで印加した。用いたエレクトロポレーション装置は、Gene Pulser Xcell（登録商標、Bio-rad社）であった。その後、5mL TYA培地に全量を接種し、30℃で2時間程度回復培養した。その後、回復培養液を、クロラムフェニコール10ppmを含有するMASS固体培地に塗布し、30℃で数日間培養を行って出現したコロニーからの選抜を行い、プラスミドが挿入されクロラムフェニコール耐性となった株を取得した。さらにpNS78保持株を複数回継代培養した後、エリスロマイシン200ppmを含有するMASS固体培地に植菌することにより、グループIIイントロンが機能し、標的遺伝子中にDNA配列が挿入され、酪酸生成酵素遺伝子ptb1が破壊され、エリスロマイシン耐性を取得した株であるC.サッカロパーブチルアセトニカムＧIIｉΔptb1株を取得した。
この株は、このままではエリスロマイシン耐性を保持しており、複数遺伝子の破壊が行えないため、エリスロマイシン耐性遺伝子をpKNT19-FLPプラスミド中のFLPリコンビナーゼにより除去した。まず、C.サッカロパーブチルアセトニカムΔptb1の継代培養を繰り返し、pNS78を自然に欠落した株を取得した。その株に対し、先ほどと同様にエレクトロポレーション法によりpKNT19-FLPプラスミドを挿入し、クロラムフェニコール耐性で選抜した。pKNT19-FLPプラスミド挿入株の継代培養を繰り返し、FLPの作用によりエリスロマイシン耐性遺伝子が除去され、エリスロマイシン感受性となった株をレプリカプレート法により選抜した。これを継代培養することにより、pKNT19-FLPプラスミド自身をも欠損したC.サッカロパーブチルアセトニカムＧIIｉΔptb1（エリスロマイシン耐性なし）を取得した。このエリスロマイシン耐性のないC.サッカロパーブチルアセトニカムＧIIｉΔptb1に対し、上述と同様の手法を繰り返してpNS47を挿入することにより、pta遺伝子の破壊も行ったC.サッカロパーブチルアセトニカムＧIIｉΔptaΔptb1株の取得に成功した。上記で用いた培地及びバッファーの組成を以下に示す。
実施例１
（１）改変ベクタープラスミドの構築－pKNT19への改変CRISPRの挿入
大腸菌とクロストリジウム属微生物で複製可能なプラスミドpKNT19の制限酵素BamHIとKpnIで切断される間に下記の遺伝子配列を挿入して改変ベクタープラスミドを構築した。具体的には、双方向プロモーター領域を含むStreptococcus pyogens Cas9遺伝子に、D10A及びH840Aのアミノ酸変異を挿入し（dCas9）、リンカー配列を介してPmCDA1との融合タンパク質として発現するコンストラクトを構築し、さらにC.サッカロパーブチルアセトニカムのpta遺伝子、ptb1遺伝子又はctfB遺伝子内の各標的ヌクレオチド配列に相補的な配列をコードしたキメラgRNAを同時に載せた各プラスミド（全長ヌクレオチド配列：配列番号７３、配列中のヌクレオチド番号5560～5579の部分に各ターゲッティング配列が挿入される）を作製した（図２）。
（１）改変ベクタープラスミドの構築－pKNT19への改変CRISPRの挿入
大腸菌とクロストリジウム属微生物で複製可能なプラスミドpKNT19の制限酵素BamHIとKpnIで切断される間に下記の遺伝子配列を挿入して改変ベクタープラスミドを構築した。具体的には、双方向プロモーター領域を含むStreptococcus pyogens Cas9遺伝子に、D10A及びH840Aのアミノ酸変異を挿入し（dCas9）、リンカー配列を介してPmCDA1との融合タンパク質として発現するコンストラクトを構築し、さらにC.サッカロパーブチルアセトニカムのpta遺伝子、ptb1遺伝子又はctfB遺伝子内の各標的ヌクレオチド配列に相補的な配列をコードしたキメラgRNAを同時に載せた各プラスミド（全長ヌクレオチド配列：配列番号７３、配列中のヌクレオチド番号5560～5579の部分に各ターゲッティング配列が挿入される）を作製した（図２）。
（２）改変ベクタープラスミドのブタノール発酵菌への挿入
実施例１－（１）で作成した改変ベクタープラスミドのうち、11757をC.サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021株に挿入した。なお、菌を扱う操作はすべて嫌気条件下で行った。
実施例１－（１）で作成した改変ベクタープラスミドのうち、11757をC.サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021株に挿入した。なお、菌を扱う操作はすべて嫌気条件下で行った。
〔方法〕
プラスミドの挿入は、参考例１と同様にして行った。TYA培地による30℃で2時間程度の回復培養後、回復培養液を、エリスロマイシン10ppmを含有するMASS固体培地に塗布し、30℃で数日間培養を行って出現したコロニーからの選抜を行い、プラスミドが挿入されエリスロマイシン耐性となった株を取得した。次に、得られた株にプラスミドが保持されていることを確認することとした。各4コロニーずつ、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA培地に植菌し、生育した形質転換体コロニー由来の培養液を鋳型に、プラスミド特有の領域を下記組成、条件におけるPCRで増幅し、電気泳動による増幅物の解析からプラスミド保持の有無を確認した。
＜PCR組成（１サンプル分）＞
2×KODFX buffer 25μL
2mM dNTPS 10μL
20μM F primer 0.75μL （NS-150410-i01）
20μM R primer 0.75μL （NS-150410-i02）
D.W. 11.5μL
KODFX 1μL
NS-150410-i01の配列：5’-CCGATAGCTAAGCCTATTGAG-3’（配列番号５３）
NS-150410-i02の配列：5’-TCATCCTGTGGAGCTTAGTAG-3’（配列番号５４）
＜PCR条件＞
94℃ 2min
98℃ 10sec → 50℃ 30sec → 68℃ 2min × 30cycles
10℃ hold
プラスミドの挿入は、参考例１と同様にして行った。TYA培地による30℃で2時間程度の回復培養後、回復培養液を、エリスロマイシン10ppmを含有するMASS固体培地に塗布し、30℃で数日間培養を行って出現したコロニーからの選抜を行い、プラスミドが挿入されエリスロマイシン耐性となった株を取得した。次に、得られた株にプラスミドが保持されていることを確認することとした。各4コロニーずつ、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA培地に植菌し、生育した形質転換体コロニー由来の培養液を鋳型に、プラスミド特有の領域を下記組成、条件におけるPCRで増幅し、電気泳動による増幅物の解析からプラスミド保持の有無を確認した。
＜PCR組成（１サンプル分）＞
2×KODFX buffer 25μL
2mM dNTPS 10μL
20μM F primer 0.75μL （NS-150410-i01）
20μM R primer 0.75μL （NS-150410-i02）
D.W. 11.5μL
KODFX 1μL
NS-150410-i01の配列：5’-CCGATAGCTAAGCCTATTGAG-3’（配列番号５３）
NS-150410-i02の配列：5’-TCATCCTGTGGAGCTTAGTAG-3’（配列番号５４）
＜PCR条件＞
94℃ 2min
98℃ 10sec → 50℃ 30sec → 68℃ 2min × 30cycles
10℃ hold
〔結果〕
全てのサンプルにおいて、プラスミド特有の領域の増幅物が得られた。従ってブタノール発酵菌内で改変ベクタープラスミドが保持されていることが明らかとなった。
全てのサンプルにおいて、プラスミド特有の領域の増幅物が得られた。従ってブタノール発酵菌内で改変ベクタープラスミドが保持されていることが明らかとなった。
（３）改変ベクタープラスミドを用いたブタノール発酵菌pta遺伝子配列変換
改変ベクタープラスミドを用い、ブタノール発酵菌のpta遺伝子のDNA配列変換を行った。改変ベクタープラスミドは改変ツールに制御機構を有しないため、単純に世代を重ねるのみで機能する。
改変ベクタープラスミドを用い、ブタノール発酵菌のpta遺伝子のDNA配列変換を行った。改変ベクタープラスミドは改変ツールに制御機構を有しないため、単純に世代を重ねるのみで機能する。
〔方法〕
上記（２）で作成した11757保持株である11757/ATCC27021株を、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA培地に植菌し培養した後、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA固体培地に希釈塗布し、シングルコロニーとした。このシングルコロニーを8コロニー取り、これを鋳型にゲノム上のpta遺伝子全長の増幅を行った。PCRは、下記に示すPCR組成49μLずつを分注後、鋳型としてシングルコロニーの懸濁液を1μL加え、下記条件にて行った。
＜PCR組成（１サンプル分）＞
2×KODFX buffer 25μL
2mM dNTPS 10μL
20μM F primer 0.75μL （NS-150414-i02）
20μM R primer 0.75μL （NS-150304-i04）
D.W. 11.5μL
KODFX 1μL
NS-150414-i02の配列：5’-GCCCTTTATGAAAGGGATTATATTCAG-3’（配列番号５５）
NS-150304-i04の配列：5’-GCTTGTACAGCAGTTAATGCAAC-3’（配列番号５６）
＜PCR条件＞
94℃ 2min
98℃ 10sec → 50℃ 30sec → 68℃ 2min × 30cycles
10℃ hold
上記（２）で作成した11757保持株である11757/ATCC27021株を、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA培地に植菌し培養した後、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA固体培地に希釈塗布し、シングルコロニーとした。このシングルコロニーを8コロニー取り、これを鋳型にゲノム上のpta遺伝子全長の増幅を行った。PCRは、下記に示すPCR組成49μLずつを分注後、鋳型としてシングルコロニーの懸濁液を1μL加え、下記条件にて行った。
＜PCR組成（１サンプル分）＞
2×KODFX buffer 25μL
2mM dNTPS 10μL
20μM F primer 0.75μL （NS-150414-i02）
20μM R primer 0.75μL （NS-150304-i04）
D.W. 11.5μL
KODFX 1μL
NS-150414-i02の配列：5’-GCCCTTTATGAAAGGGATTATATTCAG-3’（配列番号５５）
NS-150304-i04の配列：5’-GCTTGTACAGCAGTTAATGCAAC-3’（配列番号５６）
＜PCR条件＞
94℃ 2min
98℃ 10sec → 50℃ 30sec → 68℃ 2min × 30cycles
10℃ hold
次にPCR産物をWizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up Systemで精製し、該精製物を鋳型にシーケンス反応（PCR反応）を行った。反応終了後に反応物の配列をDNAシーケンサーPRISM3101（ABI社）にて解析した。
＜シーケンス反応組成（１サンプル分）＞
Terminator Ready Reaction Mix 1μL
5×Sequencing buffer 3.5μL
3.2pmol primer 1μL
Template DNA(PCR産物) 0.35μL
D.W. 14.15μL
Template DNAとprimerは下記の組み合わせとした。
11757保持株
F側NS-150525-i01 / R側NS-150304-i04
NS-150525-i01の配列：5’-GGTGTTACAGGAAATGTTGCAG-3’（配列番号５７）
＜PCR条件＞
96℃ 1min
96℃ 10sec → 50℃ 5sec → 60℃ 4min × 25cycles
10℃ hold
＜シーケンス反応組成（１サンプル分）＞
Terminator Ready Reaction Mix 1μL
5×Sequencing buffer 3.5μL
3.2pmol primer 1μL
Template DNA(PCR産物) 0.35μL
D.W. 14.15μL
Template DNAとprimerは下記の組み合わせとした。
11757保持株
F側NS-150525-i01 / R側NS-150304-i04
NS-150525-i01の配列：5’-GGTGTTACAGGAAATGTTGCAG-3’（配列番号５７）
＜PCR条件＞
96℃ 1min
96℃ 10sec → 50℃ 5sec → 60℃ 4min × 25cycles
10℃ hold
〔結果〕
11757/ATCC27021由来コロニーの配列解析結果のうち、pta遺伝子のDNA配列の916～935番目の結果を表８に示した。
11757/ATCC27021由来コロニーの配列解析結果のうち、pta遺伝子のDNA配列の916～935番目の結果を表８に示した。
この結果、配列が解析できた8株全てに何らかの変異が挿入されていた。変異の位置としては、932G>A（pta遺伝子の932番目の塩基GがAに改変）変異株が6株、934G>Aが1株、932G>A、934G>A及び935G>Aの変異株が1株であった。c.932G>Aの変異によりPTAタンパク質としては311番目のアミノ酸アルギニン（AGAでコードされる）がリジン（AAAでコードされる）となり、同様に、c.934G>Aの変異によりG312R、c.934G>A及びc.935G>Aの変異によりG312Kとなる。特にR311はPTAの活性中心と推定されており、c.932G>Aの変異により大幅な酵素活性の低下が期待された。
（４）11757/ATCC27021#1株からのプラスミド除去
上記（３）で得られた11757/ATCC27021#1株からプラスミドを除去した。
上記（３）で得られた11757/ATCC27021#1株からプラスミドを除去した。
〔方法〕
11757/ATCC27021#1株を、抗生物質を含まないTYA培地で培養した後、TYA固形培地に希釈塗布し、生育したシングルコロニーを鋳型に上記（２）に示した方法でプラスミド保持の有無を確認し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを選抜した。PCRは、上記（２）に示すPCR組成49μLずつを分注後、シングルコロニーの懸濁液を1μL加え、上記（２）と同じ条件にて行った。
11757/ATCC27021#1株を、抗生物質を含まないTYA培地で培養した後、TYA固形培地に希釈塗布し、生育したシングルコロニーを鋳型に上記（２）に示した方法でプラスミド保持の有無を確認し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを選抜した。PCRは、上記（２）に示すPCR組成49μLずつを分注後、シングルコロニーの懸濁液を1μL加え、上記（２）と同じ条件にて行った。
〔結果〕
得られたPCR産物を電気泳動し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを11757脱落株ATCC27021Δpta#1株（pta改変ブタノール発酵菌；R311K株）とした。
得られたPCR産物を電気泳動し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを11757脱落株ATCC27021Δpta#1株（pta改変ブタノール発酵菌；R311K株）とした。
（５）pta遺伝子配列変換ブタノール発酵菌の培養評価
上記で得られたATCC27021Δpta#1株を培養しその性能の評価を行った。培養は、TYA培地に植菌し、試験管内で30℃で96時間程度行った。培養は開放条件で実施した。
上記で得られたATCC27021Δpta#1株を培養しその性能の評価を行った。培養は、TYA培地に植菌し、試験管内で30℃で96時間程度行った。培養は開放条件で実施した。
培養終了後、培養液を取得し、液体クロマトグラフィーを用いてブタノール及び他のアルコール、ケトン、有機酸類の定量分析を実施した。カラムにはAminex HPX-87H Column（Bio-Rad）を使用した。ブタノールの収率結果を表９に示す。表中、消費されたグルコースに対する収率をmol％として算出した。
R311Kに改変された株は特開２０１７－５１１８５に記載のようにpta活性中心が改変されたことによって、ブタノールの産生が向上していることが分かる。
（６）ptb1改変ベクタープラスミドのpta改変ブタノール発酵菌への挿入
上記（１）で作製した改変ベクタープラスミドのうち、ptb1遺伝子への変異挿入を行うプラスミド11753、11754、442、460、655、745を、上記（４）において得られたC.サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021Δpta#1株に挿入した。11753は上記（２）で使用したプラスミド11757と同様に、標的遺伝子ptb1の活性中心R280をKに変異させたり、A281TやV275Tの改変を行う改変ベクターであり、11754はアミノ酸を指定するコドンを終止コドンに変異させる改変ベクターである。また442はP148L、P148Sの改変を、460はG155R、G155E、G155K、V154Iの改変を、655はA219Tの改変を、745はV251I、A249Tの改変を行うベクターである。
上記（１）で作製した改変ベクタープラスミドのうち、ptb1遺伝子への変異挿入を行うプラスミド11753、11754、442、460、655、745を、上記（４）において得られたC.サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021Δpta#1株に挿入した。11753は上記（２）で使用したプラスミド11757と同様に、標的遺伝子ptb1の活性中心R280をKに変異させたり、A281TやV275Tの改変を行う改変ベクターであり、11754はアミノ酸を指定するコドンを終止コドンに変異させる改変ベクターである。また442はP148L、P148Sの改変を、460はG155R、G155E、G155K、V154Iの改変を、655はA219Tの改変を、745はV251I、A249Tの改変を行うベクターである。
〔方法〕
ptb1改変ベクタープラスミドのブタノール発酵菌への挿入とプラスミド保持の確認は、上記（２）に示した方法で行った。宿主はC.サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021Δpta#1株とした。
ptb1改変ベクタープラスミドのブタノール発酵菌への挿入とプラスミド保持の確認は、上記（２）に示した方法で行った。宿主はC.サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021Δpta#1株とした。
〔結果〕
得られた株を鋳型にしたプラスミド保持確認PCRの結果、いずれの宿主においてもプラスミド特有の領域の増幅物が得られ、形質転換体と確認された。
得られた株を鋳型にしたプラスミド保持確認PCRの結果、いずれの宿主においてもプラスミド特有の領域の増幅物が得られ、形質転換体と確認された。
（７）pta改変ブタノール発酵菌のptb1遺伝子配列変換
改変ベクタープラスミドを用い、pta改変ブタノール発酵菌のptb1遺伝子のDNA配列変換を行った。
改変ベクタープラスミドを用い、pta改変ブタノール発酵菌のptb1遺伝子のDNA配列変換を行った。
〔方法〕
上記（６）で作成した11753保持株である11753/ATCC27021Δpta#1株、11754保持株である11754/ATCC27021Δpta#1株、442保持株である442/ATCC27021Δpta#1、460保持株である460/ATCC27021Δpta#1、655保持株である655/ATCC27021Δpta#1、745保持株である745/ATCC27021Δpta#1をそれぞれ、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA培地に植菌し培養した後、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA固体培地に希釈塗布し、シングルコロニーとした。このシングルコロニーを取り、これを鋳型にゲノム上のptb1遺伝子全長の増幅を行った。PCR組成、条件は上記（３）に従い、プライマーのみptb1用のNS-150819-i01及びNS-150819-i02を用いた。
NS-150819-i01：5’-GCAAGAAATGAGCAAAAACTTTGACG-3’（配列番号６７）
NS-150819-i02：5’-GCTGCAACTAATGCTGCTAAAGC-3’ （配列番号６８）
上記（６）で作成した11753保持株である11753/ATCC27021Δpta#1株、11754保持株である11754/ATCC27021Δpta#1株、442保持株である442/ATCC27021Δpta#1、460保持株である460/ATCC27021Δpta#1、655保持株である655/ATCC27021Δpta#1、745保持株である745/ATCC27021Δpta#1をそれぞれ、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA培地に植菌し培養した後、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA固体培地に希釈塗布し、シングルコロニーとした。このシングルコロニーを取り、これを鋳型にゲノム上のptb1遺伝子全長の増幅を行った。PCR組成、条件は上記（３）に従い、プライマーのみptb1用のNS-150819-i01及びNS-150819-i02を用いた。
NS-150819-i01：5’-GCAAGAAATGAGCAAAAACTTTGACG-3’（配列番号６７）
NS-150819-i02：5’-GCTGCAACTAATGCTGCTAAAGC-3’ （配列番号６８）
次にPCR産物をWizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up Systemで精製し、該生成物を鋳型にシーケンス反応を行った。シーケンス反応組成、条件は上記（３）に従い、プライマーのみF側NS-150324-i01／R側NS-150819-i02を用いた。
NS-150324-i01：5’- CTCTGACTGTGCAGTTAACC-3’（配列番号６９）
NS-150324-i01：5’- CTCTGACTGTGCAGTTAACC-3’（配列番号６９）
〔結果〕
11753保持11753/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、841G>Aの変異のある株を得られた。841G>Aの変異によりPTB1タンパク質としては281番目のアミノ酸アラニン（GCAでコードされる）がスレオニン（ACAでコードされる）となった。また、11754保持11754/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、64G>A及び／又は67G>Aの変異のある株を得られた。64G>A及び／又は67G>Aの変異によりPTB1タンパク質としてV22M及び／又はA23Tとなった株が得られた。V22Iの変異がある株は今回の解析では無かった。442保持442/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、442C>T及び／又は443C>Tの変異のある株を得られた。442C>T及び／又は443C>Tの変異によりPTB1タンパク質としてP148L及び／又はP148Sとなった株が得られた。460保持460/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、460G>A、463G>A及び／又は464G>Aの変異挿入のある株を得られた。460G>A、463G>A及び／又は464G>Aの変異によりPTB1タンパク質としてV154I、G155R又はG155E、G155Kとなった株が得られた。655保持655/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、655G>Aの変異のある株を得られた。655G>Aの変異によりPTB1タンパク質としてA219Tとなった株が得られた。745保持745/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、745G>A及び／又は751G>Aの変異のある株を得られた。745G>A及び／又は751G>Aの変異によりPTB1タンパク質としてA249T及び／又はV251Iとなった株が得られた。
11753保持11753/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、841G>Aの変異のある株を得られた。841G>Aの変異によりPTB1タンパク質としては281番目のアミノ酸アラニン（GCAでコードされる）がスレオニン（ACAでコードされる）となった。また、11754保持11754/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、64G>A及び／又は67G>Aの変異のある株を得られた。64G>A及び／又は67G>Aの変異によりPTB1タンパク質としてV22M及び／又はA23Tとなった株が得られた。V22Iの変異がある株は今回の解析では無かった。442保持442/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、442C>T及び／又は443C>Tの変異のある株を得られた。442C>T及び／又は443C>Tの変異によりPTB1タンパク質としてP148L及び／又はP148Sとなった株が得られた。460保持460/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、460G>A、463G>A及び／又は464G>Aの変異挿入のある株を得られた。460G>A、463G>A及び／又は464G>Aの変異によりPTB1タンパク質としてV154I、G155R又はG155E、G155Kとなった株が得られた。655保持655/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、655G>Aの変異のある株を得られた。655G>Aの変異によりPTB1タンパク質としてA219Tとなった株が得られた。745保持745/ATCC27021Δpta#1株由来コロニーの配列解析の結果、745G>A及び／又は751G>Aの変異のある株を得られた。745G>A及び／又は751G>Aの変異によりPTB1タンパク質としてA249T及び／又はV251Iとなった株が得られた。
（８）ptb1プラスミド/ATCC27021Δpta#1株からのプラスミド除去
上記（７）で得られた株からプラスミドを除去した。
上記（７）で得られた株からプラスミドを除去した。
〔方法〕
上記（７）で得られた株を、抗生物質を含まないTYA培地で培養した後、TYA固形培地に希釈塗布し、生育したシングルコロニーを鋳型に上記（２）に示した方法でプラスミド保持の有無を確認し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを選抜した。PCRは、上記（２）に示すPCR組成49μLずつを分注後、シングルコロニーの懸濁液を1μL加え、上記（２）に条件にて行った。
上記（７）で得られた株を、抗生物質を含まないTYA培地で培養した後、TYA固形培地に希釈塗布し、生育したシングルコロニーを鋳型に上記（２）に示した方法でプラスミド保持の有無を確認し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを選抜した。PCRは、上記（２）に示すPCR組成49μLずつを分注後、シングルコロニーの懸濁液を1μL加え、上記（２）に条件にて行った。
〔結果〕
得られたPCR産物を電気泳動し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーをptb1プラスミド脱落株ATCC27021Δpta#1Δptb1株とした。
得られたPCR産物を電気泳動し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーをptb1プラスミド脱落株ATCC27021Δpta#1Δptb1株とした。
（９）ptb1遺伝子配列変換ブタノール発酵菌の培養評価
上記（８）で得られた株から、ATCC27021Δpta#1Δptb1株（pta－ptb1改変ブタノール発酵菌；R311K－A281T株、R311K－V275T株、R311K－V22M株、R311K－P148S株、R311K－G155R株、R311K－G155E株、R311K－G155K株、R311K－G155K/V154I株、R311K－A219T株、R311K－V251I株）選択して培養しその性能評価を行った。これらの株は、ptaを改変した宿主ATCC27021Δpta#1をもとに作製されており、これらの株を培養してグルコースからのブタノール収率を確認すれば、ptb1遺伝子改変のPTBタンパク質への影響が確認できる。培養は、上記（５）と同様にして行った。
上記（８）で得られた株から、ATCC27021Δpta#1Δptb1株（pta－ptb1改変ブタノール発酵菌；R311K－A281T株、R311K－V275T株、R311K－V22M株、R311K－P148S株、R311K－G155R株、R311K－G155E株、R311K－G155K株、R311K－G155K/V154I株、R311K－A219T株、R311K－V251I株）選択して培養しその性能評価を行った。これらの株は、ptaを改変した宿主ATCC27021Δpta#1をもとに作製されており、これらの株を培養してグルコースからのブタノール収率を確認すれば、ptb1遺伝子改変のPTBタンパク質への影響が確認できる。培養は、上記（５）と同様にして行った。
〔方法〕
上記で得られた株をTYA培地に植菌し、ねじ口試験管内で30℃にて前培養を24時間行った。比較としてATCC27021野生株（単に、野生株という）も同時に前培養した。取得した前培養液を、TYS-CaCO3培地5mLに50μL分植菌し、同じくねじ口試験管内で30℃にて培養を行った。TYS-CaCO3培地の組成を表１０に示す。培養は、96時間程度行った。培養はねじ口の蓋を緩めた開放条件で実施した。
上記で得られた株をTYA培地に植菌し、ねじ口試験管内で30℃にて前培養を24時間行った。比較としてATCC27021野生株（単に、野生株という）も同時に前培養した。取得した前培養液を、TYS-CaCO3培地5mLに50μL分植菌し、同じくねじ口試験管内で30℃にて培養を行った。TYS-CaCO3培地の組成を表１０に示す。培養は、96時間程度行った。培養はねじ口の蓋を緩めた開放条件で実施した。
培養終了後、培養液を取得し、液体クロマトグラフィーを用いてブタノール及び他のアルコール、ケトン、有機酸類の定量分析を実施した。カラムにはAminex HPX-87H Column（Bio-Rad）を使用した。ブタノールの収率を対比した結果を表１１に示す。
表１１より、R311K改変株（表９参照）に対してptb1の改変を入れた株で、P148、G155、V251の改変は優れたブタノール収率向上効果が認められた。
実施例２
（１）ptb1改変ベクタープラスミドのpta－ptb1改変ブタノール発酵菌への挿入
〔方法〕
ptb1改変ベクタープラスミド（プラスミド460）のブタノール発酵菌への挿入とプラスミド保持の確認は、上記実施例１－（６）に示した方法で行った。宿主はC.サッカロパーブチルアセトニカム ATCC27021Δpta#1Δptb1株（pta－ptb1改変ブタノール発酵菌；R311K－P148S株）とした。
（１）ptb1改変ベクタープラスミドのpta－ptb1改変ブタノール発酵菌への挿入
〔方法〕
ptb1改変ベクタープラスミド（プラスミド460）のブタノール発酵菌への挿入とプラスミド保持の確認は、上記実施例１－（６）に示した方法で行った。宿主はC.サッカロパーブチルアセトニカム ATCC27021Δpta#1Δptb1株（pta－ptb1改変ブタノール発酵菌；R311K－P148S株）とした。
〔結果〕
得られた株を鋳型にしたプラスミド保持確認PCRの結果、宿主においてプラスミド特有の領域の増幅物が得られ、形質転換体と確認された。
得られた株を鋳型にしたプラスミド保持確認PCRの結果、宿主においてプラスミド特有の領域の増幅物が得られ、形質転換体と確認された。
（２）pta－ptb1改変ブタノール発酵菌のptb1遺伝子配列変換
改変ベクタープラスミドを用い、pta－ptb1改変ブタノール発酵菌のptb1遺伝子のDNA配列変換を行った。
改変ベクタープラスミドを用い、pta－ptb1改変ブタノール発酵菌のptb1遺伝子のDNA配列変換を行った。
〔方法〕
上記で作成した460保持株である460/R311K－P148S株を、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA培地に植菌し培養した後、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA固体培地に希釈塗布し、シングルコロニーとした。このシングルコロニーを取り、これを鋳型に、実施例１－（７）と同様にして、ゲノム上のptb1遺伝子全長の増幅を行い、シーケンス反応を行った。
上記で作成した460保持株である460/R311K－P148S株を、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA培地に植菌し培養した後、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA固体培地に希釈塗布し、シングルコロニーとした。このシングルコロニーを取り、これを鋳型に、実施例１－（７）と同様にして、ゲノム上のptb1遺伝子全長の増幅を行い、シーケンス反応を行った。
〔結果〕
460/R311K－P148S株由来コロニーの配列解析の結果、155G>Rの変異がさらにある株を得た。
460/R311K－P148S株由来コロニーの配列解析の結果、155G>Rの変異がさらにある株を得た。
（３）ptb1プラスミド/ATCC27021Δpta#1Δptb1株からのプラスミド除去
上記（２）で得られた株からプラスミドを除去した。
上記（２）で得られた株からプラスミドを除去した。
〔方法〕
上記（２）で得られた株を、抗生物質を含まないTYA培地で培養した後、MASS固形培地に希釈塗布し、生育したシングルコロニーを鋳型に上記実施例１－（２）に示した方法でプラスミド保持の有無を確認し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを選抜した。PCRは、上記実施例１－（２）に示すPCR組成49μLずつを分注後、シングルコロニーの懸濁液を1μL加え、上記実施例１－（２）条件にて行った。
上記（２）で得られた株を、抗生物質を含まないTYA培地で培養した後、MASS固形培地に希釈塗布し、生育したシングルコロニーを鋳型に上記実施例１－（２）に示した方法でプラスミド保持の有無を確認し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを選抜した。PCRは、上記実施例１－（２）に示すPCR組成49μLずつを分注後、シングルコロニーの懸濁液を1μL加え、上記実施例１－（２）条件にて行った。
〔結果〕
得られたPCR産物を電気泳動し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーをptb1プラスミド脱落株ATCC27021Δpta#1Δptb1株（pta－ptb1/ptb1改変ブタノール発酵菌；R311K－G155R/P148S株）とした。
得られたPCR産物を電気泳動し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーをptb1プラスミド脱落株ATCC27021Δpta#1Δptb1株（pta－ptb1/ptb1改変ブタノール発酵菌；R311K－G155R/P148S株）とした。
（４）ptb1遺伝子配列変換ブタノール発酵菌の培養評価
上記で得られた株をTYA培地に植菌し、実施例１－（９）と同様にして培養を行った。比較としてATCC27021野生株（野生株）、pta遺伝子とptb1遺伝子を破壊した株（参考例１参照；以下ＧIIｉΔptaΔptb1という）も同時に培養した。
上記で得られた株をTYA培地に植菌し、実施例１－（９）と同様にして培養を行った。比較としてATCC27021野生株（野生株）、pta遺伝子とptb1遺伝子を破壊した株（参考例１参照；以下ＧIIｉΔptaΔptb1という）も同時に培養した。
培養終了後、培養液を取得し、液体クロマトグラフィーを用いてブタノール及び他のアルコール、ケトン、有機酸類の定量分析を実施した。カラムにはAminex HPX-87H Column（Bio-Rad）を使用した。結果を表１２に示す。
ptb1に関して、２箇所の特定のアミノ酸にアミノ酸変異を生じさせた株は、１箇所のアミノ酸変異を生じさせた株に比べて、ブタノール収率がより向上しており、GroupIIイントロンで破壊した株と同等にブタノール収率を高めることができると期待される。また、酢酸などの副生物については、１箇所のアミノ酸変異を生じさせた株と同様に、２箇所の特定のアミノ酸にアミノ酸変異を生じさせた株でも副生の低減が認められた。
実施例３
（１）ctfB改変ベクタープラスミドのpta－ptb1/ptb1改変ブタノール発酵菌への挿入
実施例１－（１）で作製した改変ベクタープラスミドのうち、ctfB遺伝子への変異挿入を行うプラスミド85、121を、実施例２－（３）において得られたC.サッカロパーブチルアセトニカムのR311K－G155R/P148S株に形質転換した。
（１）ctfB改変ベクタープラスミドのpta－ptb1/ptb1改変ブタノール発酵菌への挿入
実施例１－（１）で作製した改変ベクタープラスミドのうち、ctfB遺伝子への変異挿入を行うプラスミド85、121を、実施例２－（３）において得られたC.サッカロパーブチルアセトニカムのR311K－G155R/P148S株に形質転換した。
〔方法〕
ctfB改変ベクタープラスミドのブタノール発酵菌への挿入とプラスミド保持の確認は、実施例１－（２）に示した方法で行った。宿主はC.サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021のΔpta#1Δptb1/ptb1株（pta－ptb1/ptb1改変ブタノール発酵菌；R311K－G155R/P148S株）とした。
ctfB改変ベクタープラスミドのブタノール発酵菌への挿入とプラスミド保持の確認は、実施例１－（２）に示した方法で行った。宿主はC.サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021のΔpta#1Δptb1/ptb1株（pta－ptb1/ptb1改変ブタノール発酵菌；R311K－G155R/P148S株）とした。
〔結果〕
得られた株を鋳型にしたプラスミド保持確認PCRの結果、宿主においてプラスミド特有の領域の増幅物が得られ、形質転換体と確認された。
得られた株を鋳型にしたプラスミド保持確認PCRの結果、宿主においてプラスミド特有の領域の増幅物が得られ、形質転換体と確認された。
（２）pta－ptb1/ptb1改変ブタノール発酵菌のctfB遺伝子配列変換
改変ベクタープラスミドを用い、pta－ptb1/ptb1改変ブタノール発酵菌のctfB遺伝子のDNA配列変換を行った。
改変ベクタープラスミドを用い、pta－ptb1/ptb1改変ブタノール発酵菌のctfB遺伝子のDNA配列変換を行った。
〔方法〕
上記（１）で作成したプラスミド85、121の保持株であるATCC27021のpta－ptb1/ptb1をそれぞれ、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA培地に植菌し培養した後、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA固体培地に希釈塗布し、シングルコロニーとした。このシングルコロニーを取り、これを鋳型にゲノム上のctfB遺伝子全長の増幅を行った。PCR組成、条件は実施例１－（３）に従い、プライマーのみctfB用の下記に示すものを用いた。
NS-ctfB-F11：5’- GGCCAACTCGTAAACCTTGGAATAG-3’（配列番号７０）
NS-ctfB-R1：5’- GAATGATTCAGATATCCATAATTTTTAAGTTATCTGGAATAATTAAATCTg-3’ （配列番号７１）
上記（１）で作成したプラスミド85、121の保持株であるATCC27021のpta－ptb1/ptb1をそれぞれ、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA培地に植菌し培養した後、エリスロマイシン10ppmを含有するTYA固体培地に希釈塗布し、シングルコロニーとした。このシングルコロニーを取り、これを鋳型にゲノム上のctfB遺伝子全長の増幅を行った。PCR組成、条件は実施例１－（３）に従い、プライマーのみctfB用の下記に示すものを用いた。
NS-ctfB-F11：5’- GGCCAACTCGTAAACCTTGGAATAG-3’（配列番号７０）
NS-ctfB-R1：5’- GAATGATTCAGATATCCATAATTTTTAAGTTATCTGGAATAATTAAATCTg-3’ （配列番号７１）
次にPCR産物をWizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up Systemで精製し、該生成物を鋳型にシーケンス反応を行った。シーケンス反応組成、条件は実施例１－（３）に従い、プライマーのみF側NS-ctfB-F1／R側NS-ctfB-R1を用いた。
NS-ctfB-F1：5’- GGCCAACTCGTAAACCTTGGAATAG-3’（配列番号７２）
NS-ctfB-F1：5’- GGCCAACTCGTAAACCTTGGAATAG-3’（配列番号７２）
〔結果〕
コロニーの配列解析の結果から、85P>S、121P>L、121P>Sの変異のある株が得られた。
コロニーの配列解析の結果から、85P>S、121P>L、121P>Sの変異のある株が得られた。
（３）ctfBプラスミド/ATCC27021Δpta#1Δptb1/ptb1改変株からのプラスミド除去
上記（２）で得られた株からプラスミドを除去した。
上記（２）で得られた株からプラスミドを除去した。
〔方法〕
上記（２）で得られた株を、抗生物質を含まないTYA培地で培養した後、TYA固形培地に希釈塗布し、生育したシングルコロニーを鋳型に上記実施例１－（２）に示した方法でプラスミド保持の有無を確認し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを選抜した。PCRは、上記実施例１－（２）に示すPCR組成49μLずつを分注後、シングルコロニーの懸濁液を1μL加え、上記実施例１－（２）条件にて行った。
上記（２）で得られた株を、抗生物質を含まないTYA培地で培養した後、TYA固形培地に希釈塗布し、生育したシングルコロニーを鋳型に上記実施例１－（２）に示した方法でプラスミド保持の有無を確認し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを選抜した。PCRは、上記実施例１－（２）に示すPCR組成49μLずつを分注後、シングルコロニーの懸濁液を1μL加え、上記実施例１－（２）条件にて行った。
〔結果〕
得られたPCR産物を電気泳動し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーをctfBプラスミド脱落株ATCC27021Δpta#1Δptb1/ptb1ΔctfB株とした。
得られたPCR産物を電気泳動し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーをctfBプラスミド脱落株ATCC27021Δpta#1Δptb1/ptb1ΔctfB株とした。
（４）ATCC27021Δpta#1Δptb1/ptb1ΔctfB株ブタノール発酵菌の培養評価
上記で得られた株を、実施例１－（１０）と同様にして培養し、液体クロマトグラフィーを用いて定量分析を実施した。結果を表１３に示す。
上記で得られた株を、実施例１－（１０）と同様にして培養し、液体クロマトグラフィーを用いて定量分析を実施した。結果を表１３に示す。
ctfB遺伝子改変することで、アセトンの生成が大きく低減又は消失することが分かる。
本発明のC.サッカロパーブチルアセトニカム種微生物は、新規な株であり、ブタノール製造において好適に用いることができる。特に、本発明のゲノム編集により得られた、遺伝子の挿入及び／又は欠失に依らずに酪酸生成酵素遺伝子等の機能を欠損したC.サッカロパーブチルアセトニカム種微生物は、安全性に優れ、設備費用や廃棄物処理費用の低減が期待できるので、工業的なブタノール生産において極めて有用である。
Claims (11)
- ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子とアセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子の機能をそれぞれ欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記ホスホトランスブチリラーゼのアミノ酸変化が、P148S又はP148Lと、G155E、G155R又はG155Kとの組合せを少なくとも含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、破壊を伴う挿入及び／又は欠失を含まない
クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。 - ホスホトランスブチリラーゼのアミノ酸変化が、P148S、P148L、G155E、G155R、G155K及びV251Iからなる群より選ばれる、２種以上のアミノ酸における変化である、請求項１記載の微生物。
- ホスホトランスブチリラーゼのアミノ酸変化が、P148Sと、G155Rとの組合せを少なくとも含む、請求項１又は２記載の微生物。
- pta遺伝子が、コードするホスホトランスアセチラーゼにR311K及び／又はG312Kのアミノ酸変化を生じる遺伝子改変を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物。
- さらに、アセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子の機能を欠損し、該遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼにアミノ酸変化を生じさせる遺伝子改変を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の微生物。
- CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットに、P25S、P25L、P85S、P85L、P121S、P121L、P170S及びP170Lからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸変化を生じさせる遺伝子改変を含む、請求項５記載の微生物。
- ブチリルCoAから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子、アセチルCoAから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子及びアセトアセチルCoAからアセトンが生成する経路に関与するCoAトランスフェラーゼ遺伝子のそれぞれの機能を欠損したクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物であって、
前記酪酸生成酵素遺伝子がptb1であり、該ptb1遺伝子が、コードするホスホトランスブチリラーゼにおいて148位、155位及び251位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、
前記ホスホトランスブチリラーゼのアミノ酸変化が、P148S又はP148Lと、G155E、G155R又はG155Kとの組合せを少なくとも含み、
前記酢酸生成酵素遺伝子がptaであり、該pta遺伝子が、コードするホスホトランスアセチラーゼに311位及び／又は312位のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含み、かつ
前記CoAトランスフェラーゼ遺伝子がctfBであり、該ctfB遺伝子が、コードするCoAトランスフェラーゼのBサブユニットにおいて25位、85位、121位及び170位からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸に変化を生じさせる遺伝子改変を含むことを特徴とする、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物。 - P148S又はP148Lと、G155E、G155R又はG155Kのアミノ酸変化を含むホスホトランスブチリラーゼをコードするptb1遺伝子と、R311K及び／又はG312Kのアミノ酸変化を含むホスホトランスアセチラーゼをコードするpta遺伝子と、P25S、P25L、P85S、P85L、P121S、P121L、P170S及びP170LSからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸変化を含むCoAトランスフェラーゼ遺伝子をコードするctfB遺伝子を含む、請求項７に記載の微生物。
- 請求項１～８のいずれか１項に記載の微生物を、ブタノール生産用の培地で培養し、ブタノール発酵を行う、ブタノールの製造方法。
- 炭素源を含む培地中で培養する、請求項９記載の方法。
- さらに、培養中又は培養終了後の培養液からブタノールを回収する、請求項９又は１０記載の方法。
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