JP6236209B2

JP6236209B2 - ブタノールの製造方法

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Publication number: JP6236209B2
Application number: JP2013063887A
Authority: JP
Inventors: ▲土▼▲橋▼　幸生; 幸生 ▲土▼▲橋▼; 正治向山; 栄太市毛; 正弘中之庄; 俊一中山
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2017-11-22
Anticipated expiration: 2033-03-26
Also published as: JP2014187892A

Description

本発明は、遺伝子改変微生物を用いてブタノールを製造する方法に関する。

微生物によるブタノール発酵では、ブタノールに加えて、アセトン、エタノールなどの溶媒の他、酪酸、酢酸および乳酸といった有機酸が副生する。これらの副生物はブタノール収率低下の要因となるほか、ブタノールを回収するプロセスを構築する上でも障害となる。

ブタノール発酵において、副生物（アセトン、エタノール、有機酸など）を減らすことは、ブタノールの対グルコース収率を向上させ、分離精製工程を容易にするという意味で非常に有用である。そこで、以前から副生物を減らすための検討が行われてきた。その方法としては、副生物の合成遺伝子の破壊またはブタノール合成遺伝子の強化がよく採用され、相同組換えや突然変異を用いた手法で実施された。例えば、非特許文献１では、相同組換えを用いてｂｕｋ（ブチレートキナーゼ）およびｐｔａ（ホスホトランスアセチラーゼ）の破壊を行っている。しかし、この手法では酪酸生成経路を破壊した際には酢酸が、酢酸生成経路を破壊した際には酪酸が顕著に増大した。また、ａａｄ（アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ）をクローニング後過剰発現させた例もあり（非特許文献２）、溶媒の生成量が高く示された例もある。また、遺伝子の抑制と導入を同時に行う例もあり、非特許文献３ではｃｔｆＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼのＢサブユニット）を抑制しながらｔｈｌ（アセチルＣｏＡ二量化酵素）とａａｄを発現させており、これによりエタノールが約１３ｇ／Ｌ程度まで増大している。

アセトン生成をなくしてエタノール、ブタノールを生成した例として非特許文献４ではａｄｃ（アセトアセテートデカルボキシラーゼ）またはｃｔｆＡＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ）と、ｐｔａの同時破壊を行っている。このときは酪酸が著量蓄積し、ブタノールの生成量は大幅に減少している。特許文献１では、ｂｕｋまたはｐｔｂ（ホスホトランスブチリラーゼ）の遺伝子破壊を実施し、酪酸生成経路を破壊した株に対し、さらにアセトン、乳酸、酢酸、ヒドロゲナーゼの調整を実施したと記載されているが、具体的な数値は示されていない。非特許文献５では、クロストリジウム・アセトブチリカムにおいて、ｐｔｂとｐｔａの破壊およびｂｕｋとｐｔａの破壊を実施しているが、酪酸および酢酸を含め副生物の低減効果は十分とはいえず、ブタノールの収率向上が達成されていない。

したがって、酪酸、酢酸、エタノールといった副生物の生成を抑制しながらブタノールを高効率で生産できる微生物開発が求められている。

WO2008-052596

Green et al., Microbiology., 142:2079, 1996 Nair et al., J. Bacteriol., 176:871, 1994 Sillers et al., Biotechnol Bioeng., 102:38, 2009 Lehmann et al., Appl MicrobiolBiotechnol., 94:743, 2012 Jang et al., mbio 2012., 23:00314, 2012

本発明は、ブタノール発酵において、ブタノール以外の副生物の生成を抑制し、ブタノールの収率を向上させることを目的とする。

本発明者らは、クロストリジウム属微生物において、酪酸と酢酸の生成経路を破壊し、かつ還元力を上昇させて培養することにより、ブタノール発酵において、酪酸および酢酸だけでなく、その他の副生物の生成を抑制し、ブタノール収率を向上させることに成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）ブチリルＣｏＡから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子の機能、およびアセチルＣｏＡから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子の機能を欠損させたクロストリジウム属微生物の形質転換体を、炭素源を含む培地中で、ｐＨが４．６を下回らないようにして培養する工程を含む、ブタノールの製造方法。
（２）培養工程において、還元力を上昇させて培養する、（１）記載の方法。
（３）培養工程において、培養槽内の水素分圧を上昇させて培養する、（２）記載の方法。
（４）培養工程において、培養槽内の水素分圧を０．０６〜１０ａｔｍに維持して培養する、（３）記載の方法。
（５）酪酸生成酵素遺伝子として、ｐｔｂおよび／またはｂｕｋの機能が欠損している、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）酢酸生成酵素遺伝子として、ｐｔａおよび／またはａｃｋの機能が欠損している、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）培養液からブタノールを回収する工程を含む、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）ブタノール回収工程が、溶媒抽出を用いる工程を含む、（７）に記載の方法。

本発明により、ブタノール発酵におけるブタノール収率が向上し、発酵液からのブタノールの分離精製が簡易になり、経済的に有利なブタノール生産が可能となる。

ブタノール発酵の代謝経路を、中間体化合物、および関与する酵素遺伝子とともに示す。ｐＮＳ４７プラスミドのプラスミドマップを示す。ｐＮＳ７８プラスミドのプラスミドマップを示す。ｐＫＮＴ１９−ＦＬＰプラスミドのプラスミドマップを示す。

本発明のブタノール製造方法に用いる形質転換体は、クロストリジウム属微生物において、酢酸生成酵素遺伝子および酪酸生成酵素遺伝子の機能を欠損させることにより得られる。クロストリジウム属微生物は、ブタノール生成能を有するものであれば特に制限されないが、Ｃ．サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、例えば、ＡＴＣＣ２７０２１株、ＡＴＣＣ１３５６４株；Ｃ．ベイジェリンキ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、例えば、ＡＴＣＣ５１７４３株、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、例えば、ＡＴＣＣ８２４株およびＣ．ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）などが挙げられる。Ｃ．サッカロパーブチルアセトニカム、Ｃ．ベイジェリンキ、およびＣ．アセトブチリカムが好ましく、Ｃ．サッカロパーブチルアセトニカムが特に好ましい。

一般的にクロストリジウム属微生物は、プラスミドの導入が困難であるが、Ｃ.サッカロパーブチルアセトニカムはプラスミドの導入を比較的容易に行うことができる。また、Ｃ．アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４株などでは、プラスミドがＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されるためにそのまま導入することができず、メチル化処理をする必要があるが、Ｃ．サッカロパーブチルアセトニカムではその必要がない。

酪酸生成酵素遺伝子は、ブチリルＣｏＡから酪酸が生成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子である。酪酸生成酵素遺伝子には、ｐｔｂ（ホスホトランスブチリラーゼをコードする遺伝子）およびｂｕｋ（酪酸キナーゼをコードする遺伝子）が含まれる。ホスホトランスブチリラーゼは、ブチリルＣｏＡからブチリルリン酸を形成する反応を触媒する酵素である。酪酸キナーゼは、ブチリルリン酸を酪酸に転化する反応を触媒する酵素である。酪酸生成酵素遺伝子の機能を欠損させることには、これらの遺伝子のうち単独の遺伝子の機能を欠損させること、および複数の遺伝子の機能を欠損させることが包含され、酵素サブユニットをコードする遺伝子の１つまたは複数の機能を欠損させることも包含される。

酢酸生成酵素遺伝子は、アセチルＣｏＡから酢酸が生成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子である。酢酸生成酵素遺伝子には、ｐｔａ（ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子）およびａｃｋ（酢酸キナーゼをコードする遺伝子）が含まれる。ホスホトランスアセチラーゼは、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸を形成する反応を触媒する酵素である。アセテートキナーゼは、アセチルリン酸を酢酸に転化する反応を触媒する酵素である。酢酸生成酵素遺伝子の機能を欠損させることには、これらの遺伝子のうち単独の遺伝子の機能を欠損させること、および複数の遺伝子の機能を欠損させることが包含され、酵素サブユニットをコードする遺伝子の１つまたは複数の機能を欠損させることも包含される。

本発明において遺伝子には、ＤＮＡおよびＲＮＡが包含され、ＤＮＡには一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡが包含される。

酵素遺伝子の機能を欠損させることには、酵素遺伝子の一部または全部を改変（例えば、置換、欠失、付加および／または挿入）または破壊することによって、該遺伝子の発現産物が当該酵素としての機能を有しないようにすること、ならびに酵素タンパク質が発現しないようにすることが包含される。例えば、酵素遺伝子のゲノムＤＮＡの一部に欠失、置換、付加または挿入を生じさせることによって、該酵素遺伝子の機能を全くまたは実質的に不全とするかまたは欠損させることができる。酵素遺伝子のプロモーターの一部または全部を改変（例えば、置換、欠失、付加および／または挿入）または破壊することによって、酵素タンパク質が発現しないようにすることも包含される。ここで、遺伝子が破壊されているとは、その遺伝子配列の一部またはすべてが欠失するか、遺伝子配列中に別のＤＮＡ配列が挿入されているか、または遺伝子配列中の一部配列が他の配列と置換されることにより、該酵素遺伝子の機能を全くまたは実質的に不全とした状態のことをさす。

本発明において、酢酸生成酵素遺伝子の機能および酪酸生成酵素遺伝子の機能を欠損させたクロストリジウム属微生物の形質転換体は、そのゲノム上の各酵素遺伝子が機能不全にされたノックアウト微生物である。このような形質転換体は、一般に、公知の標的遺伝子組換え法（ジーンターゲティング法：例えばMethods in Enzymology 225:803-890, 1993）を使用することにより、例えば相同組換えにより作製することができる。相同組換えによる方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的のＤＮＡを挿入し、このＤＮＡ断片を細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的のＤＮＡと薬剤耐性遺伝子を連結したＤＮＡ断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を連結したＤＮＡ断片をゲノム上に相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で導入することもできる。また、乳酸菌で発見されたグループIIイントロンを用いた手法（Guo et. al., Science 21;289(5478):452-7(2000))も知られている。グループIIイントロンは、乳酸菌のＬｔｒＡというタンパク質と複合体を形成し、ゲノム中の特定の領域に挿入される機能を持つイントロンである。このイントロンのターゲッティング領域と呼ばれる個所を適切に変更することにより、微生物ゲノム中の狙った場所にＤＮＡ配列を挿入することができる。ＤＮＡが挿入された場所が遺伝子の内部であった場合、その遺伝子の機能はほとんどの場合消失するため、遺伝子破壊の手法として利用することができる。この際、グループIIイントロン内部に適切な薬剤耐性遺伝子を挿入し、さらにその薬剤耐性遺伝子の内部にｔｄイントロンと呼ばれる自己離脱性（セルフ-スプライシング）ＤＮＡ領域を挿入することにより、ベクターの状態では薬剤耐性遺伝子が発現できないが、グループIIイントロンとなりｔｄイントロンが自己離脱した状態でＤＮＡ配列が挿入されると、薬剤耐性遺伝子が機能を持つ状態となる。この手法で得た遺伝子破壊株は、ゲノム中に挿入された薬剤耐性遺伝子によって獲得される薬剤耐性をマーカーとすることにより容易に選抜することができる。

ターゲッティング配列と呼ばれる個所に関しては、Perutkaらによって大腸菌を用いた解析が行われており(Perutka et al., J. Mol. Biol. 13;336(2):421-39(2004))、どの個所をどう改変すれば目的とするＤＮＡ配列に挿入されるのか予測することが可能となっている。この参考文献をもとにすれば、たとえばエクセルのマクロのプログラミングを行い、このマクロに対して破壊対象とする遺伝子の塩基配列を入力することによって、対象とする遺伝子へのＤＮＡ挿入部位とターゲッティング配列の改変方法を出力させることができる。

一般的に遺伝子破壊株の選抜のために薬剤耐性遺伝子を用いる場合、複数遺伝子の破壊には別の薬剤耐性遺伝子を用いる必要がある。しかし、ＦＬＰ−ＦＲＴ法(Schweizer HP, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 5(2):67-77(2003))やＣｒｅ−ｌｏｘＰ法(Hoess et al. Nucleic Acids Res. 11;14(5):2287-300(1986))などを用いて薬剤耐性遺伝子を切り出すことにより、薬剤耐性をなくすことができる。ＦＬＰ、ＣｒｅはそれぞれＦＲＴ、ｌｏｘＰという２５塩基前後の短いＤＮＡを認識し、ＦＲＴまたはｌｏｘＰに挟まれた領域を切り出すはたらきを持つ。すなわち、遺伝子破壊用ベクターの薬剤耐性遺伝子の側部にＦＲＴ配列またはｌｏｘＰ配列を配して遺伝子破壊を行い、その後薬剤耐性となった遺伝子破壊株に対してＦＬＰまたはＣｒｅ遺伝子をクローニングした別のベクターを導入して作用させることにより、薬剤感受性の遺伝子破壊株が取得できる。その後、同様の手法で再度遺伝子破壊を実施することができる。

酢酸生成酵素遺伝子および酪酸生成酵素遺伝子をコードするＤＮＡの各配列として、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている公知の配列を利用してもよい。今回用いた、ＡＴＣＣ２７０２１株のｐｔａの塩基配列を配列番号１に、ｐｔｂの塩基配列を配列番号２に示す。

上記の塩基配列でコードされる酵素遺伝子と機能的に同等の遺伝子もまた、各酵素遺伝子に包含される。ある塩基配列からなる酵素遺伝子と機能的に同等の遺伝子としては、当該塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上相同な塩基配列からなり、同じ酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。例えば、配列番号１からなるｐｔａと機能的に同等の遺伝子としては、配列番号１と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上相同な塩基配列からなり、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、当業者であれば既知の遺伝子に関してＧｅｎＢａｎｋで得られた参照番号を用い、他の微生物において等価な遺伝子を決定することもできる。

公知の配列に基づいてプローブ（例えば約３０〜１５０塩基）を作製し、放射性または蛍光ラベルで標識し、各酵素遺伝子のゲノムＤＮＡを検出または単離するために使用することができる。微生物細胞から定法に従いゲノムＤＮＡを取り出したのち、制限酵素で切断後、サザンハイブリダイゼーション、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション法によって上記プローブを用いて、目的の酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を探索することができる。必要に応じて制限酵素地図を作成し、相同組換えを行うための任意のターゲット部位を決定し、ターゲティングベクターを設計する。

組換えＤＮＡを挿入してターゲティングベクターを作製するためのベクターは、クロストリジウム属微生物で複製可能なベクターであれば特に限定されない。大腸菌とクロストリジウム属微生物のシャトルベクターであれば都合がよくｐＩＭ１３由来のｐＫＮＴ１９（Journal of General Microbiology, 138, 1371-1378 (1992)）などのシャトルベクターが特に好ましい。

形質転換により遺伝子の破壊された株を取得するためのベクターは、必要な配列を、微生物ゲノムＤＮＡを鋳型にしてクローニングすることにより取得するか、または合成し、必要であればそれらを適切に連結することによって取得できる。微生物ゲノムＤＮＡから所望の遺伝子またはプロモーターをクローニングにより取得する方法は、分子生物学の分野において周知である。例えば遺伝子の配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第4,683,202号）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換に適した量のＤＮＡを得ることができる。なお、クローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等の方法は、Sambrook, J., Fritsch,E.F., Maniatis,T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21(1989)に記載されている。ＤＮＡ配列については、直接合成することも可能であるし、または、ＰＣＲ等で取得したＤＮＡ配列を、制限酵素処理を行ってライゲーションを行うか、もしくはＤＮＡ配列の両端に相補的なプローブ（プライマー）に１５ｂｐ分の別のＤＮＡ配列の相同領域を付加したものを用いてＰＣＲ反応を実施して増幅し、インフュージョン反応（米国特許第7,575,860号）を行うことにより、連結してより長鎖のＤＮＡ配列を取得することもできる。

ターゲティングベクターの微生物への導入は、公知の方法で実施できる。導入方法は、特に制限されないが、例えば、ミクロセル法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、プロトプラスト法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法等を挙げることができ、エレクトロポレーション法が好ましく用いられる。

得られた形質転換体をブタノール生産用の培地で培養しブタノール発酵を行うことによりブタノールを製造する。培養に用いる培地および培養条件は、ブタノール発酵の分野で公知のものを使用できる。培養培地は、通常、炭素源、窒素源および無機イオンを含む。

炭素源としては、好ましくは糖類、例えば、単糖類、オリゴ糖類、多糖類を用いる。好ましくは単糖類、特にグルコースを用いる。グルコースとともに、ラクトース、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物などのその他糖類、ソルビトールなどのアルコール類、またはフマル酸、クエン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を、併用してもよい。

窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。

無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が添加される。有機微量栄養素としては、チアミン、ｐ−アミノ安息香酸、ビタミンＢ１、ビオチンなどの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。

本発明においては、還元力を上昇させた条件で培養を実施することにより、アセトン、エタノール、酢酸および酪酸といった副生物の生成を抑制しながらブタノールを高効率で生産することができる。ブタノールの絶対生成量も増大させることができる。還元力を上昇させた条件での培養とは、培養中に生じる酵素反応が、還元力が上昇した条件で行われることをさす。還元力の上昇は、例えば、ＮＡＤＨを添加することにより、水素を導入することにより、または培養槽内の水素分圧を上昇させることにより実施できる。培養槽内の水素分圧を上昇させることにより、培養液が接する気相における水素分圧が上昇し、培養液に接する気相中の水素は、ヒドロゲナーゼによって即座に取り込まれると考えられる。

培養槽内の水素分圧は、例えば、密閉状態で培養することにより、上昇させることができる。密閉状態とすることにより、微生物から排出される水素の外部放出を制限することができ、結果として培養槽内の水素分圧を上昇させることができる。また、外部から水素を導入してもよい。例えば、培養液に水素をバブリングすることにより水素を導入してもよいし、培養槽の気相部に水素を導入してもよいし、培養液に接するように水素を導入してもよい。具体的には、培養槽内の水素分圧を２０〜４０℃の範囲で、好ましくは０．０６ａｔｍ以上、０．０８ａｔｍ以上、０．１０ａｔｍ以上、好ましくは０．１２ａｔｍ以上または０．１５ａｔｍ以上で、好ましくは１０ａｔｍ以下、５．０ａｔｍ以下、４．０ａｔｍ以下、３．０ａｔｍ以下、２．０ａｔｍ以下または１．０ａｔｍ以下とする。

水素分圧の測定は、公知の方法で実施でき、特に制限されないが、例えば、発生した気体をアルミニウムバッグに捕集し、バッグ内の気体の水素濃度をガスクロマトグラフィーで検出し、濃度と体積を掛け合わせることで発生した水素の量を定量し、発生した水素の量と培養槽中の気相部の体積から、水素分圧を算出できる。

本発明においては、ｐＨを調整して培養を実施することにより、副生物に対するブタノールの生成量を向上させることができる。ｐＨは、好ましくは４．６以上、４．７以上、４．８以上、４．９以上、５以上または５．５以上であり、好ましくは８以下、７．５以下、７．０以下、６．９以下、６．８以下、６．７以下、６．６以下または６．５以下になるよう、必要であれば制御する。ｐＨ調整には、無機または有機の酸性またはアルカリ性物質、例えば、炭酸カルシウム、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを使用できる。ｐＨ調整には、上記のようなアルカリ性物質等を加えなくても、培地が目的のｐＨに保たれている場合も包含される。

その他の培養条件は、特に制限されず、当技術分野で慣用の条件を採用することができる。例えば、バッチ培養を行う場合、培養時間は通常５〜１００時間、好ましくは１２〜４８時間である。連続培養または流加培養を行う場合には、培養時間は通常２００時間以上、好ましくは５００時間以上、より好ましくは１０００時間以上である。培養温度は通常２０〜５５℃、好ましくは２５〜４０℃、例えば約３０℃に調整する。

本発明の製造方法において、副生物に対するブタノールの生成比は、好ましくは１．０以上、１．５以上、２．０以上、２．５以上、３．０以上、４．０以上または５．０以上である。ここで、副生物に対するブタノールの生成比は、生成したブタノールのモル数を、生成したアセトン、エタノール、酢酸および酪酸の合計モル数で割った数値をさす。

培養中または培養終了後の培養液から、発酵生成物、すなわちブタノールを製品として取得する工程は、大きく以下の２つの工程に分ける事ができる。まず、希薄な培養液から粗ブタノールを濃縮・回収する回収工程、ついで、粗ブタノールから副生物や、水といった不純物を除去する精製工程を行う必要がある。

培養中または培養終了後の希薄な培養液から粗ブタノールを濃縮・回収する工程では、特別な方法は必要ではなく、公知の方法でブタノールを回収できる。当技術分野で周知の蒸留、ガスストリッピング、パーベーパレーション、ベーパーパーミエーション、イオン交換樹脂、シリカライト膜などを使用した膜分離、ＭＦ膜による菌体分離、逆浸透膜、活性炭などによる吸着、または溶媒抽出を用いる工程、これらの組み合わせ、およびその他の工程との組み合わせにより、培養中または培養終了後に実施できる。好ましくは、蒸留、ガスストリッピング、溶媒抽出である。

本発明の形質転換体を用いれば、ブタノールの生成量に比して副生物の量を少なく抑えることができることから、上記の回収工程も効率的に実施することができる。例えば、蒸留、ガスストリッピング、パーベーパレーション、ベーパーパーミエーションによる回収を実施する場合、揮発性のある副生成物量が低減される事で、蒸発させる成分量が少なくなるので、エネルギーが削減される。ＭＦ膜、逆浸透膜を用いた膜分離手法を用いる場合には、非透過成分である副生成物量の低減により、浸透圧が低減されるのでエネルギーが削減される。溶媒抽出を用いる場合には、溶媒側（油層側）に抽出される副生成物量の低減により、使用する抽出溶媒が削減される。

ブタノール回収工程は、培養中、培養終了後いずれに行う事も可能だが、培養中に行う事で、ブタノールや副生成物による生育阻害を回避して効率的に発酵を実施する事ができるので好ましい。

ブタノール回収工程により得られる粗ブタノールから、副生成物や水といった不純物を除去する精製工程には、特別な方法は必要ではなく、公知の方法で精製できる。当技術分野で周知の蒸留、パーベーパレーション、逆浸透膜法を用いる工程、これらの組み合わせ、およびその他の工程との組み合わせにより、精製できる。好ましくは、蒸留、パーベーパレーション及び、これらを組み合わせた方法である。

本発明の形質転換体を用いれば、ブタノールの生成量に比して副生物の量を少なく抑えることができる。すなわち、上記の精製工程において除去すべき副生成物の量が抑えられるために、効率的に精製工程を行うことができるという点も、本発明の効果の一つである。

本発明において、ブタノール回収工程及び、精製工程を行うに当たり、ブタノールと水が相分離する性質を利用する事で、これらの工程の効率を著しく向上させる事が可能である。すなわち、ブタノールと水を相分離させて、ブタノール相のみを取得する事で、効率的に水を除去する事が可能となる。この際、アセトン、エタノールなどの副生成物は、ブタノール、水両方に可溶なため、これらの副生成物が多く含まれる場合、ブタノールと水が相分離する組成範囲が非常に小さくなり、効果的ではなくなる。しかし、本発明においては、これらの副生成物の生成量が抑えられるために、広い組成範囲でブタノールと水が相分離するために、ブタノール回収、精製工程の効率を著しく向上させる事が可能となる。この点も本発明の有用な点となる。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。

実施例１形質転換微生物の作製
まず、Perutka et al., J. Mol. Biol. 13;336(2):421-39(2004)をもとにして、標的とする遺伝子の塩基配列を入力することにより、その遺伝子へのグループIIイントロンの挿入箇所とターゲッティング配列の改変方法が出力されるようなエクセルマクロのプログラミングを行った。次に、実際に遺伝子破壊を実施するｐｔａ遺伝子およびｐｔｂ遺伝子の塩基配列をこれに入力し、ターゲッティング配列の改変箇所を出力させた。ｐｔａ遺伝子の塩基配列を配列番号１に、ｐｔｂ遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。

この情報をもとに、ｐｔａ遺伝子およびｐｔｂ遺伝子の破壊ベクターであるｐＮＳ４７プラスミドおよびｐＮＳ７８プラスミドを設計した。構築には、ＤＮＡ合成を利用した。その塩基配列をそれぞれ配列番号３および４に示す。プラスミドマップを図２および図３に示す。また、ＦＬＰリコンビナーゼを含むｐＫＮＴ１９−ＦＬＰプラスミドを設計し、同様にＤＮＡ合成により構築した。その塩基配列を配列番号５に、プラスミドマップを図４に示す。

作製したｐＮＳ４７をＣ．サッカロパーブチルアセトニカムＡＴＣＣ２７０２１株に形質転換した。具体的には、まず前培養として、Ｃ．サッカロパーブチルアセトニカムのグリセロールストック０．５ｍＬをＴＹＡ培地５ｍＬに接種し、３０℃、２４時間培養した。この前培養液をＴＹＡ培地１０ｍＬにＯＤ＝０．１となるよう接種、１５ｍＬ容ファルコンチューブで３７℃にてインキュベートした。ＯＤ＝０．６となった段階で発酵液を遠心分離して上清を除去、氷冷しておいた６５ｍＭＭＯＰＳバッファー（ｐＨ６．５）１０ｍＬを加えピペッティングにより再懸濁し、遠心分離を行った。ＭＯＰＳバッファーによる洗浄は２回繰り返した。遠心分離によりＭＯＰＳバッファーを除去した後、氷冷しておいた０．３Ｍスクロース１００μＬで菌体ペレットを再懸濁し、コンピテントセルとした。コンピテントセル５０μＬをエッペンドルフチューブに取り、プラスミド１μｇと混合した。氷冷したエレクトロポレーション用セルに入れ、Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｄｃａｙモード、２．５ｋＶ／ｃｍ、２５ｕＦ、３５０Ωで印加した。用いたエレクトロポレーション装置はＧｅｎｅｐｕｌｓｅｒｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）である。その後５ｍＬＴＹＡ培地に全量を接種し、３０℃で２時間程度回復培養した。その後、回復培養液を、クロラムフェニコール１０ｐｐｍを含有するＭＡＳＳ固体培地に塗布し、３０℃で数日間培養を行って出現したコロニーからの選抜を行い、プラスミドが導入されクロラムフェニコール耐性となった株を取得した。さらにｐＮＳ４７保持株を複数回継代培養した後、エリスロマイシン２００ｐｐｍを含有するＭＡＳＳ固体培地に植菌することにより、グループIIイントロンが機能し、標的遺伝子中にＤＮＡ配列が挿入され、酢酸生成遺伝子ｐｔａが破壊され、エリスロマイシン耐性を取得した株であるＣ．サッカロパーブチルアセトニカムΔｐｔａ株の取得ができた。

この株は、このままではエリスロマイシン耐性を保持しており、複数遺伝子の破壊が行えないため、エリスロマイシン耐性遺伝子をｐＫＮＴ１９−ＦＬＰプラスミド中のＦＬＰリコンビナーゼにより除去した。まず、Ｃ．サッカロパーブチルアセトニカムΔｐｔａの継代培養を繰り返し、ｐＮＳ４７を自然に欠落した株を取得した。その株に対し、先ほどと同様にエレクトロポレーション法によりｐＫＮＴ１９−ＦＬＰプラスミドを導入し、クロラムフェニコール耐性で選抜した。ｐＫＮＴ１９−ＦＬＰプラスミド導入株の継代培養を繰り返し、ＦＬＰの作用によりエリスロマイシン耐性遺伝子が除去され、エリスロマイシン感受性となった株をレプリカプレート法により選抜した。これを継代培養することによりｐＫＮＴ１９−ＦＬＰプラスミド自身をも欠損したＣ．サッカロパーブチルアセトニカムΔｐｔａ（エリスロマイシン耐性なし）を取得した。このエリスロマイシン耐性のないＣ．サッカロパーブチルアセトニカムΔｐｔａに対し、上述と同様の手法を繰り返してｐＮＳ７８を導入することにより、ｐｔｂ遺伝子の破壊も行ったＣ．サッカロパーブチルアセトニカムΔｐｔａΔｐｔｂ株の取得に成功した。上記で用いた培地およびバッファーの組成を以下に示す。

実施例２ ΔｐｔａΔｐｔｂ株を用いたブタノール発酵
実施例１で作製した形質転換微生物（ΔｐｔａΔｐｔｂ株）を培養して、その性能を評価した。形質転換微生物のグリセロールストックを５００μｌ分、ＴＹＡ培地５ｍｌに植菌し、試験管内で３０℃にて培養を２４時間行った。取得した前培養液を、新たなＴＹＡ、ＴＹＳまたはＴＹＳ−ＣａＣＯ_３培地５ｍｌに５０μｌ分植菌し、試験管内で３０℃にて培養を行った。ＴＹＳ培地の組成を以下に示す。なお、ＴＹＳ−ＣａＣＯ_３培地とは、ＴＹＳ培地にＣａＣＯ_３を５ｇ／Ｌ添加した培地のことを指す。

培養は、９６時間程度行った。培養は開放条件または密閉条件で実施した。ＴＹＳ−ＣａＣＯ_３培地では、ＣａＣＯ_３の作用によりｐＨが５を下回らないように保たれる。野生株についても同様に培養を行った。

培養終了後、培養液を取得し、液体クロマトグラフィーを用いてブタノールおよび他のアルコール、ケトン、有機酸類の定量分析を実施した。カラムにはＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７ＨＣｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。結果を表５および６に示す。表中、「Ｂ／（Ａ＋Ｅ＋酢＋酪）」は、ブタノール（ｍＭ）を、アセトン（ｍＭ）とエタノール（ｍＭ）と酢酸（ｍＭ）と酪酸（ｍＭ）の合計で割った数値を表し、これを副生物パラメータと呼ぶ。

表５の結果より、ＣａＣＯ_３によるｐＨ調整がなされていない場合、ΔｐｔａΔｐｔｂ株はほとんど生育しなかった。この際のｐＨは４．５程度まで低下しており、ｐＨをある程度以上に維持することが生育には必要であることが判明した。なお、ΔｐｔａΔｐｔｂ株は、ＴＹＡ培地で培養した場合はｐＨは５以上に保たれて生育し、ＣａＣＯ_３によるｐＨ調整は不要であった。

また、ＴＹＳ−ＣａＣＯ_３培地で培養を実施した場合、野生株では最大でブタノール濃度は１５６ｍＭにとどまったのに対し、ΔｐｔａΔｐｔｂ株ではブタノール濃度が、開放系で１７５ｍＭ、密閉系では１８４ｍＭまで蓄積した。また、ΔｐｔａΔｐｔｂ株では酪酸・酢酸の生成は確認できなかった。さらに、密閉系ではアセトン濃度が３ｍＭ、エタノール濃度が１０ｍＭと低く抑えられ、結果として副生物パラメータは１３．９２まで上昇した。野生株でも密閉培養を実施することにより、副生物パラメータは２．０８まで上昇したが、ΔｐｔａΔｐｔｂ株と比較すると低水準にとどまった。

ＣａＣＯ_３によるｐＨ調整がなされている場合、開放系においても密閉系においても、ΔｐｔａΔｐｔｂ株の結果は、野生株の結果に比べて、副生物に対するブタノールの収率が高かった。

実施例３溶媒抽出培養を用いたΔｐｔａΔｐｔｂ株のブタノール発酵
実施例１で作製した形質転換微生物（ΔｐｔａΔｐｔｂ株）を溶媒抽出培養し、評価した。形質転換微生物のグリセロールストックを５００μｌ分、ＴＹＡ培地５ｍｌに植菌し、試験管内で３０℃にて培養を２４時間行った。取得した前培養液を、新たなＴＹＳ−ＣａＣＯ_３培地５ｍｌに５０μｌ分植菌し、さらに培養液層（水層）の上部に抽出溶媒としてオレイルアルコールを５ｍｌ重層し、試験管内で３０℃にて培養を行った。抽出溶媒としてオレイルアルコールを重層することにより、ブタノールなどの生成物が溶媒層に移動し、生成物による生育阻害が防止されることが考えられたため、２４時間ごとに５０％グルコース溶液を一定量添加し、グルコースの消費ができなくなるまで培養を続けた。培養は９６時間実施した。野生株についても上記と同様に培養評価を行った。

培養終了後、培養液を取得し、液体クロマトグラフィーを用いてブタノールおよび他のアルコール、ケトン、有機酸類の定量分析を実施した。カラムにはＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７ＨＣｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。オレイルアルコール層の分析には気体クロマトグラフィーを用いてアルコール、ケトン類の定量分析を実施した。結果を表７に示す。

表７の結果より、ΔｐｔａΔｐｔｂ株では油層に５６７ｍＭという高濃度のブタノールが蓄積でき、また油層中の不純物濃度も低く抑えられた。一方、野生株では、油層のブタノール濃度は２５１ｍＭにとどまった。野生株ではアセトンなどの副生物が水層に高濃度で蓄積しており、早い段階で生育が停止したため、その影響によるものと考えられた。

Claims

ブチリルＣｏＡから酪酸が生成する経路に関与する酪酸生成酵素遺伝子であるｐｔｂの機能、およびアセチルＣｏＡから酢酸が生成する経路に関与する酢酸生成酵素遺伝子であるｐｔａの機能を欠損させたクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムの形質転換体を、炭素源を含む培地中でｐＨが４．６を下回らないようにして培養する工程を含む、ブタノールの製造方法。
培養工程において、還元力を上昇させて培養する、請求項１項記載の方法。
培養工程において、培養槽内の水素分圧を上昇させて培養する、請求項２記載の方法。
培養工程において、培養槽内の水素分圧を０．０６〜１０ａｔｍに維持して培養する、請求項３記載の方法。
培養液からブタノールを回収する工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
ブタノール回収工程が、溶媒抽出を用いる工程を含む、請求項５に記載の方法。