BRPI0709607B1 - cédulas de levedura tendo via rompida de diidroxi acetona fosfato para glicerol e processo de fermentação" - Google Patents

Abstract

células de levedura tendo caminho interrompido a partir de diidroxi acetona fosfato para glicerol. células de levedura são geneticamente modificadas para interromper um caminho metabólico nativo a partir de diidroxi acetona para glicerol. em certos aspectos, a célula de levedura é do gênero kluyveromyces candida ou issatchenkia. em outros aspectos, a célula de levedura é capaz de produzir pelo menos um ácido orgânico, tal como lactato. as células levedura produzem significantemente menos glicerol que as linhagens tipo selvagem, e usualmente produzem maiores rendimentos de desejados produtos de fermentação. células de levedura da invenção freqúentemente crescem bem quando cultivadas, à despeito de sua reduzida produção de glicerol.

Description

(54) Título: CÉDULAS DE LEVEDURA TENDO VIA ROMPIDA DE DIIDROXI ACETONA FOSFATO PARA GLICEROL E PROCESSO DE FERMENTAÇÃO (51) Int.CI.: C12N 1/19; C12N 15/01; C12N 15/09; C12P 7/56; C12P 7/06; C12R 1/645 (30) Prioridade Unionista: 13/03/2006 US 60/781,674 (73) Titular(es): CARGILL, INC.

(72) Inventor(es): CATHERINE ASLESON DUNDON; PIRKKO SUOMINEN; ARISTOS ARISTIDOU; BRIAN J. RUSH; KARI KOIVURANTA; BENJAMIN MATTHEW HAUSE; THOMAS WILLIAN MCMULLIN; KEVIN ROBERG-PEREZ

1/53 “CÉLULAS DE LEVEDURA TENDO VIA ROMPIDA DE DIIDROXI

ACETONA FOSFATO PARA GLICEROL E PROCESSO DE FERMENTAÇÃO” [001]Esta invenção foi realizada sob contrato N°- DE-FC36-03GO13145 com o United States Department of Energy. O governo dos Estados Unidos tem certos direitos desta invenção.

[002]Este pedido reivindica prioridade de United States Provisional Application No. 60/781 674, depositado em 13 de março de 2006.

[003]Esta invenção refere-se a certa levedura geneticamente modificada, e processos de fermentação para produção de ácido lático usando aquelas leveduras geneticamente modificadas.

[004]Leveduras são usadas como biocatalisadores em um número de fermentações industriais. Há um crescente interesse em uso de levedura para fermentar açúcares a ácidos orgânicos como ácido lático. Na medida em que mais ácido orgânico é produzido nestas fermentações, o meio de fermentação se torna crescentemente ácido. Maioria de bactérias que produzem estes ácidos orgânicos não desempenham bem em ambientes fortemente ácidos - elas também não sobrevivem sob aquelas condições ou também produzem tão lentamente que o processo se torna economicamente inviável. Como um resultado, torna-se necessário tamponar o meio para manter um pH alto. Isto causa dificuldade na recuperação de produto em forma ácida. É preferido conduzir a fermentação em um menor pH no qual o produto está parcial ou inteiramente na forma ácida.

[005]Espécies de levedura têm sido consideradas como candidatas para tais fermentações de baixo pH. Muitas espécies de levedura fermentam naturalmente açúcares hexose a etanol, mas poucas se alguma produz naturalmente rendimentos significantes de ácidos orgânicos como ácido lático. Da mesma maneira, foram feitos esforços para modificar geneticamente várias espécies de leveduras para inserção de um ou mais genes que permitirão a célula produzir ácido lático. De modo a desviPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 18/87

2/53 ar metabolismo de açúcar de produção de etanol para produção de ácido lático, estas células também foram geneticamente modificadas para romper ou deletar o gene piruvato descarboxilase (PDC) nativo. Este trabalho é descrito, por exemplo, em WO

99/14335, WO 00/71738 A1, WO 02/42471 A2, WO 03/049525 A2, WO 03/102152

A2 e WO 03/102201 A2.

[006]Glicerol é produzido em significante rendimento em muitas destas fermentações de levedura. Glicerol pode servir como um osmo-protetor para a célula. Formação de glicerol pode auxiliar regeneração de co-fatores de redox sob condições de fermentação.

[007]Glicerol é produzido em muitas células de levedura através de metabolização de diidroxi acetona fosfato (DHAP). Em maior parte de espécies de levedura, DHAP é reduzido por uma glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD, nome sistemático enzima sn-glicerol-3-fosfato:NAD+ 2-óxido redutase, EC 1.1.1.8) para formar glicerol-3-fosfato (G3P). G3P serve como um precursor para biossíntese de lipídeo assim como um precursor de glicerol. G3P é desfosforilado a glicerol por uma enzima glicerol-3-fosfatase (GPP, nome sistemático glicerol-1-fosfato fosfoidrolase, EC 3.1.3.21).

[008]Existe um caminho alternativo para produção de glicerol, que é importante para algumas leveduras, como S. pombe. Neste caminho, diidroxi acetona fosfato é desfosforilado em diidroxi acetona através de diidroxi acetona fosfato fosfatase. Diidroxi acetona é então convertida em glicerol em conjunção com oxidação NADH por glicerol desidrogenase dependente de NADH⁺ (nome sistemático glicerol:NAD+ 2-óxido redutase, EC 1.1.1.6).

[009]Devido produção de glicerol consumir carbono que de outro modo pode ser usado para produção de um produto de fermentação mais desejável, esta produção de glicerol representa uma significante fonte de perda de rendimento. Em adição, produção de glicerol surge às custas de ambos, ATP e NADH. Isto direciona energia afastando-se da produção de biomassa ou o produto desejado. Por ambas

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3/53 razões, pode ser desejado reduzir-se ou eliminar-se produção de glicerol pela célula.

Ainda uma consideração é que a redução ou eliminação de produção de glicerol pode simplificar recuperação e purificação do produto desejado.

[0010]Uma linhagem Saccharomyces cerevisiae foi geneticamente engenheirada para deletar seus genes GPD nativos, assim privando a célula da enzima GPD e prevenindo produção de glicerol. Ver Nissen et al., “Anaerobic and aerobic batch cultivations of Saccharomyces cerevisiae mutants impaired in glycerol synthesis”, Yeast, 2000:16:463-474. Nissen et al. relatam que as células de mutação cresceram muito pobremente sob ambas condições anaeróbicas e aeróbicas quando ambos dos genes GPD nativos foram rompidos. De acordo com Nissen et al., as células de mutação produziram muito menos glicerol que as células tipo selvagem. Nissen et al. fizeram a hipótese de que o pobre crescimento visto nas linhagens deletantes duplas foi devido a um esgotamento de coleção de NAD⁺ de célula, porque produção de glicerol não foi disponível para oxidar NADH na célula.

[0011]Pode ser desejável prover uma célula de levedura que produza um desejado produto orgânico, que produz pouco ou nenhum glicerol, e que também cresça bem sob condições aeróbicas, condições anaeróbicas ou ambas condições aeróbica e anaeróbica.

[0012]Em um aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante de uma espécie de levedura pré-duplicação de genoma total, tendo uma deleção ou ruptura de uma via metabólica nativa a partir de diidroxi acetona fosfato para glicerol. A deleção ou ruptura da via metabólica nativa pode incluir uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) nativo. A deleção ou ruptura da via metabólica nativa pode incluir uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase (GPP) nativo. Ela pode incluir uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) nativo e pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase (GPP) nativo. A deleção ou ruptura da via metabólica

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4/53 nativa pode incluir uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene diidroxi acetona fosfato fosfatase nativo, gene glicerol desidrogenase nativo, ou ambos.

[0013]Em um outro aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante de uma espécie de levedura pré-duplicação de genoma total, cuja célula mutante produz menos que 2,0 g/L de glicerol quando cultivada sob as seguintes condições micro-aeróbicas padrões:

A. meio aquoso definido contendo, no início de cultura, 5 g/L de sulfato de amônio, 3 g/L de diidrogeno fosfato de potássio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio, elementos em traços, vitaminas, 150 g/L de glicose;

B. pH no início de cultura de 3,5, com meio de fermentação sendo tamponado se necessário para prevenir queda do pH abaixo de 3,0 ou elevação acima de 7,0 durante a cultura;

C. Cultura inoculada com a célula de levedura para uma OD600 de 1,0;

D. Temperatura de cultura de 30^oC;

E. Cultura continuada até concentração de glicose ser reduzida para 10 g/L, mas não é continuada por mais de 120 horas;

F. Aeração e agitação suficientes para produzir uma taxa de tomada de oxigênio de 5,0+/-1,0 mmoles/L/h.

[0014]Em um outro aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante de uma espécie de levedura pré-duplicação de genoma total, que carece de habilidade para produzir uma enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase (GDP) ativa. Para propósitos desta invenção, uma célula é considerada carecer de habilidade para produzir uma enzima ativa se a atividade de tal enzima na célula é reduzida por pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 90%, comparada à atividade daquela enzima na linhagem tipo selvagem. Atividade de enzima de qualquer enzima particular pode ser determinada usando apropriados processos de ensaio. Kits de ensaio comerciais são disponíveis para determinação de atividade de glicerol-3-fosfato desiPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 21/87

5/53 drogenase. Um exemplo de um tal produto é designado como MK426 por Takara

Bio, Inc. e é disponível através de Fisher Scientific, Pennsylvania.

[0015]Em um outro aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante de uma espécie de levedura pré-duplicação de genoma total, que carece de habilidade para produzir uma enzima glicerol-3-fosfatase ativa.

[0016]Em um outro aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante que carece de habilidade para produzir uma enzima diidroxi acetona fosfato fosfatase ativa que é nativamente produzida por células tipo selvagem das espécies de levedura, carece de habilidade para produzir uma enzima glicerol desidrogenase dependente de NADH+ ativa que é nativamente produzida por células tipo selvagem das espécies de levedura, ou ambas.

[0017]Em um outro aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante que é geneticamente modificada para produzir um produto ácido orgânico, a dita célula de levedura tendo uma deleção ou ruptura de uma via metabólica nativa a partir de diisroxi acetona fosfato para glicerol e uma deleção ou ruptura de uma via metabólica nativa a partir de piruvato para etanol. A deleção ou ruptura da via metabólica nativa pode incluir uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene glicerol-3fosfato desidrogenase nativo. A deleção ou ruptura da via metabólica nativa pode incluir uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase nativo. Ela pode incluir uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo e pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase nativo.

[0018]Células de acordo com a invenção foram verificadas produzirem níveis muito baixos de glicerol quando cultivadas sob condições de fermentação. Produção de glicerol foi verificada estar abaixo de 0,2 g/L sob uma faixa de condições de fermentação. Surpreendentemente, as células da invenção crescem bem sob condições de fermentação, à despeito de falta de produção de glicerol e em algumas realizações à despeito de falta de produção de glicerol-3-fosfato. As células da invenção

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6/53 também foram verificadas terem aperfeiçoada tolerância a ácido em alguns exemplos. Da mesma maneira, a invenção é também um processo de fermentação onde uma célula de qualquer um dos aspectos anteriores da invenção é cultivada sob condições de fermentação para produzir um produto de fermentação, onde o rendimento de fonte de carbono para glicerol é de menos que 2% em peso.

[0019]A Figura 1 é um diagrama mostrando o plasmídeo pBH158.

[0020]A Figura 2 é um diagrama mostrando o plasmídeo pBH159.

[0021]A Figura 3 é um diagrama mostrando o plasmídeo pBH160.

[0022]A Figura 4 é um diagrama mostrando o plasmídeo pBH161.

[0023]A Figura 5 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMM28.

[0024]A Figura 6 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI318.

[0025]A Figura 7 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI321.

[0026]A Figura 8 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI355.

[0027]A Figura 9 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI357.

[0028]A Figura 10 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI433.

[0029]A Figura 11 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI449.

[0030]A Figura 12 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI454.

[0031]A Figura 13 é um diagrama mostrando o plasmídeo pBH165.

[0032]A Figura 14 é um diagrama mostrando o plasmídeo pTMC61.

[0033]As células de levedura da invenção são obtidas através de realização de certas modificações genéticas para uma célula de levedura hospedeira. A célula de levedura hospedeira é uma que, como uma linhagem tipo selvagem, é nativamente capaz de metabolizar pelo menos um açúcar a glicerol. A via metabólica nativa pode envolver uma via metabólica a partir de diidroxi acetona fosfato para glicerol-3-fosfato para glicerol. O caminho nativo pode envolver uma via metabólica de diidroxi acetona fosfato para diidroxi acetona para glicerol. Células hospedeiras podem conter ambos daqueles caminhos metabólicos nativos.

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7/53 [0034]O termo “nativo”, quando usado aqui com relação a materiais genéticos (por exemplo, um gene, promotor, terminador ou outra seqüência de ADN), refere-se a materiais genéticos que são encontrados (à parte de mutações de indivíduopara-indivíduo que não afetam função) dentro do genoma de células tipo selvagem daquelas espécies de levedura. “capacidade nativa” (e suas variações tal como “nativamente capaz” indica a habilidade de células tipo selvagem para realizar a função indicada. Por exemplo, uma célula é nativamente capaz de metabolizar um açúcar a glicerol se células tipo selvagem daquelas espécies que possuem esta capacidade antes de quaisquer modificações genéticas. Um gene é considerado ser “funcional” dentro de uma célula se ele funciona dentro da célula para produzir uma proteína ativa. Uma “via nativa” ou “via metabólica nativa” refere-se a uma via metabólica que existe e é ativo em células tipo selvagem daquelas espécies de levedura. Uma enzima é “nativamente produzida” por uma espécie de levedura se a enzima é produzida em forma ativa por células tipo selvagem daquela espécie de levedura.

[0035]Nesta invenção, “exógeno” significa com relação a qualquer material genético que ele não é nativo para a célula hospedeira.

[0036]Apropriadas células hospedeiras para certas realizações da invenção incluem células de levedura que não descendem de uma linha que sofreu o antigo evento de duplicação de genoma total (~100 milhões de anos atrás) descrito por Wolf et al., “Molecular evidence for na ancient duplication of the entire yeast genome”, Nature 387, 708-713 (1997) (daqui por diante “Wolf et al. 1997”), Langkjaer et al., et al., “Yeast genome duplication was followed by asynchronous differentiation of duplicated genes”, Nature 421,848-852 (2003) e Merico et al., “Fermentative lifestyle in yeasts belonging to the Saccharomyces complex”, FEBS Journal 274, 967-989 (2007) (daqui por diante “Merico 2007”). Tais células de levedura ao invés descendem de uma ou mais outras linhas de células de leveduras que existiram no momento do evento de duplicação de genoma total, e são aqui referidas como “levedura

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8/53 pré-duplicação de genoma total”. O evento de duplicação de genoma total é visto como crítico para a evolução das capacidades de fermentação de Sacchaeomyces cerevisiae e outras espécies descendentes do ancestral comum no qual a duplicação de genoma ocorreu (Merico 2007). Incluídos no conjunto de genes duplicados na duplicação de genoma estão aqueles codificando glicerol-3-fosfato desidrogenase e glicerol-3-fosfatase, como são genes codificando fumarato redutase que também está envolvida em manutenção de equilíbrio redox (Wolfe et al 1997).

[0037]Entre as apropriadas células de levedura pré-duplicação de genoma total estão células de levedura hemiascomicetosas. Levedura hemiascomicetosa são leveduras de célula simples classificadas dentro da ordem Saccharomycetales.

[0038]Outras células de leveduras apropriadas incluem aquelas caindo dentro de qualquer uma das clades 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 do complexo Saccharomyces, como descrito na Figura 9 (p. 430) de Kurtzman and Robnett, “Phylogenetic relationships among yeasts of the ‘Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analyses”, FEMS Yeast Res. Vol. 4, pp. 417-432 (2003), aqui incorporado por referência. Aquelas clades são designadas pelos nomes Zygosaccharomyces, Zygotorulaspora, Torulaspora, Lachancea, Kluyveromyces, Eremothecium, Hanseniaspora, e Saccharomycodes, respectivamente, em Merico 2007 supra, e em Kurtzmann, “Phylogenetic circumscription of Saccharomyces, Kluyveromyces and other members of the Saccharomycetaceae...” FEMS Yeast. Res. Vol. 4, pp. 233245 (2003) (daqui por diante “Kurtzman 2003”).

[0039]Outras células de levedura apropriadas incluem (mas não são limitadas a) células de leveduras classificadas sob os gêneros Candida, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Issatchenkia, e Hansenula.

[0040]Uma classe de células hospedeiras que são de particular interesse inclui qualquer uma daquelas de uma espécie contida em clade I. orientalis / I. terrícola. Membros da clade I. orientalis / I. terrícola são identificados por análises do doPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 25/87

9/53 mínio D1/D2 variável do ADN ribossômico 26S de espécies de leveduras, usando o processo descrito por Kurtzmanand Robnett em “Identification and Phylogeny of Ascomycetous Yeasts from Analysisof Nuclear Large Subunit (26S) Ribosomal DNA Partial Sequences”, Antonie van Leeuwenhoek 73:331-371, 1998, aqui incorporado por referência (daqui por diante “Kurtzman and Robnett 1998”). Ver especialmente, p. 349 e 361. Análise do domínio D1/D2 variável do ADN ribossômico 26S de centenas de ascomicetes revelou que a clade I. orientali / I. terrícola contém espécies relacionadas de perto. Membros da clade I. orientalis / I. terrícola exibem maior similaridade no domínio D1/D2 variável do ADN ribossômico 26S para aquele de outros membros da clade do que para aquela de espécies de leveduras fora da clade. Por isso, outro membros da clade L. orientalis / I. terrícola podem ser identificados através de comparação dos domínios D1/D2 de seu respectivo ADN ribossômico e comparando àquele de outros membros da clade e espécies relacionadas de perto fora da clade, usando processos de Kurtzman and Robnett. Espécies de leveduras dentro de clade I. orientalis / I. terrícola são todas as leveduras hemiascomicetosas dentro da clade Pichia / Issatchenkia / Saturnispora / Dekkera mais ampla. Uma outra classe de células hospedeiras de interesse é a clade I. orientalis / P. fermentans como descrita por Kurtzman and Robnett 1998. Esta clade é a clade mais importante que contém pelo menos as espécies Issatchenkia orientalis, Pichia galeiformis, Pichia sp. YB-4149 (designação NRRL), Candida ethanolica, P. deserticola, P. membranifaciens e P. fermentans.

[0041]Outras células hospedeiras de particular interesse são quaisquer daquelas de espécies contidas na clade Kluyveromyces de complexo Saccharomyces, como descrito (como Clade 11) na Figura 9 (p. 430) de Kurtzman and Robnett, “Phylogenetic relationships among yeasts of the ‘Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analyses”. FEMS Yeast Res. Vol. 4, pp. 417-432 (2003), aqui incorporado por referência, e na Figura 1 de Kurtzmann, “Phylogenetic

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10/53 circumscription of Saccharomyces, Kluyveromyces and other membrs of the Saccharomycetaceae...” FEMS Yeast. Res., Vol. 4, pp. 233-245 (2003) (daqui por diante “Kurtzman 2003”), aqui incorporado por referência. A clade Kluyveromyces inclui pelo menos as espécies S. kluyveri, K. aestuaryii, K. nonfermentans, K. lactic, K. marxianus e K. dobzhanskii, e pode incluir adicionais espécies classificáveis dentro desta clade usando os processos de análise de seqüência de multi-genes descritos em Kurtzman 2003.

[0042]Tais células de leveduras são de particular interesse quando geneticamente modificadas para produção de um ácido orgânico, especialmente lactato. Células hospedeiras dos gêneros Candida, Kluyveromyces and Ittatchenkia são genericamente preferidas. Células hospedeiras das clades Kluyveromyces e I. orientalis / P. fermentans descritas anteriormente são particularmente preferidas, naquelas realizações onde a célula mutante produz um ácido orgânico, assim como em casos onde a célula mutante produz um outro produto de fermentação (tal como, por exemplo, etanol) em adição a ou ao invés de um ácido orgânico. Células hospedeiras especialmente preferidas são C. sonorensis, K. marxianus, K. thermotolerans, C. methanosorbosa, e I. orientalis. Células mais preferidas são K. marxianus, C. sonorensis, e I. orientalis. Quando primeiro caracterizada, a espécie I. orientalis recebeu o nome Pichia kudriavzevii. O anamorfo (forma assexual) de I. orientalis é conhecida como Candida krusei. Apropriadas linhagens de K. marxianus e C. sonorensis incluem aquelas descritas em WO 00/71738 A1, WO 02/42471 A2, WO 03/049525 A2, WO 03/102152 A2, e WO 03/102201 A2. Linhagens apropriadas de I. orientalis são linhagem ATCC 32196 e linhagem ATCC PTA-6648.

[0043]Por “deleção ou ruptura” de uma via metabólica, é pretendido que o caminho é tanto feito completamente inoperante, como também sua atividade é reduzida por pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 90%, em relação à célula tipo selvagem. Atividade de um caminho pode ser reduzida através de redução de

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11/53 quantidade de enzima ativa que é produzida, através de redução de atividade da enzima que é produzida, ou alguma combinação de ambas. Por “deleção ou ruptura” de um gene é pretendido que a inteira região codificante do gene seja eliminada (deleção), ou a região dificante do gene, seu promotor, e/ou região terminadora é modificada (tal como por deleção, inserção, ou mutação) de modo que o gene não mais produz uma enzima ativa, o gene produz uma quantidade severamente reduzida (redução de pelo menos 75%, preferivelmente redução de pelo menos 90%) da enzima ativa, ou o gene produz uma enzima com atividade severamente reduzida (pelo menos 75% reduzida, preferivelmente pelo menos 90% reduzida).

[0044]Na maioria dos casos, a deleção ou ruptura da via metabólica nativa envolverá uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene GPD, pelo menos um gene GPP, ou ambos. Em células como S. pombe, que têm uma via metabólica alternativa baseado em diidroxi acetona fosfato fosfatase e glicerol desidrogenase, a deleção ou ruptura da via metabólica nativa usualmente inclui'ra uma deleção ou ruptura do gene diidroxi acetona fosfato fosfatase, gene glicerol desidrogenase, ou ambos. Em células tendo ambos caminhos, supressões ou interrupções de ambos caminhos podem ser realizadas.

[0045]Os termos “gene glicerol-3-fosfato desidrogenase” e “gene GPD” são aqui usados para referirem-se a (a) qualquer gene que codifica uma proteína com atividade glicerol-3-fosfato desidrogenase e/ou (b) qualquer seqüência de ADN cromossômico que codifica uma enzima que é pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60% e mais preferivelmente pelo menos 65% idêntica a qualquer uma das seqüências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7. “Atividade glicerol-3-fosfato desidrogenase” refere-se à habilidade de uma proteína catalisar a reação de DHAP a glicerol-3-fosfato. Para propósitos desta invenção, porcentagem de identidade de seqüências de aminoácidos de ADN, ARN ou proteínas podem ser convenientemente computadorizadas usando BLAST (NCBI Basic

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Local Alignment Search Tool) version software 2.2.1 com parâmetros default. Seqüências tendo um escore de identidade de pelo menos XX%, usando o algoritmo

BLAST version 2.2.13 com parâmetros default, são consideradas pelo menos XX% idênticas. O software BLAST é disponível do National Center for Biological Information, Bethesda, Maryland.

[0046]Similarmente, “gene glicerol-3-fosfatase” e “gene GPP” são aqui usados para designarem (a) qualquer gene que codifica uma proteína com atividade glicerol-3-fosfatase e/ou (b) qualquer seqüência de ADN cromossômico que codifica uma proteína que é pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, e mais preferivelmente pelo menos 65% idêntica a qualquer uma das seqüências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11 ou 12. “Atividade glicerol-3fosfatase” refere-se à habilidade de uma proteína catalisar a desfosforilação de glicerol-3-fosfato para formar glicerol.

[0047]O termo gene “diidroxi acetona fosfato fosfatase” é aqui usado para representar qualquer gene que codifica uma proteína com atividade diidroxi acetona fosfato fosfatase. Gene “glicerol desidrogenase” é aqui usado para representar (a) qualquer gene codificando uma proteína com atividade glicerol desidrogenase e/ou (b) qualquer seqüência de ADN cromossômico que codifica uma proteína que é pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60% e mais preferivelmente pelo menos 65% idêntica à seqüência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:13. “Atividade diidroxi acetona fosfato fosfatase” refere-se à habilidade de uma proteína catalisar a reação de diidroxi acetona fosfato e diidroxi acetona. “Atividade glicerol desidrogenase” refere-se à habilidade de uma proteína catalisar a redução de diidroxi acetona a glicerol.

[0048]A deleção ou ruptura de qualquer um dos genes anteriores pode ser realizada através de evolução forçada, mutagênese, ou processos de engenharia genética, seguido por apropriada seleção ou peneiramento para identificar os desePetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 29/87

13/53 jados mutantes.

[0049]Em processos de mutagênese células são expostas a radiação ultravioleta ou uma substância mutagênica, sob condições suficientes para obter uma alta taxa de eliminação (60-99,9%, preferivelmente 90-99,9%) das células. Células sobreviventes são então revestidas e selecionadas ou peneiradas para células tendo a atividade metabólica deletada ou rompida. Células tendo a desejada mutação podem ser selecionadas nas bases de sua reduzida habilidade para produzir glicerol. Ruptura ou deleção de qualquer um dos genes anteriores pode ser confirmada através de processos de análises de PCR ou Southern.

[0050]Engenharia genética para deletar ou romper a via metabólica para glicerol é convenientemente realizada em uma ou mais etapas via o desenho e construção de apropriadas construções de deleção e transformação da célula hospedeira com aquelas construções. O termo “construção” é aqui usado para representar uma seqüência de ADN que é usada para transformar uma célula. A construção pode ser, por exemplo, na forma de um plasmídeo circular ou vetor, na forma de um plasmídeo linearizado ou vetor, pode ser uma porção de um plasmídeo circular ou vetor (tal como é obtido através de digestão de plasmídeo ou vetor com uma ou mais enzimas de restrição), ou pode ser um produto PCR preparado usando um plasmídeo ou vetor como um molde. Seleção ou peneiramento se segue para identificar transformantes bem sucedidos. Processos de eletroporação e/ou de transformação química (tal como baseado em cloreto de cálcio - ou acetato de lítio) podem ser usados.

[0051]A seguinte discussão de construção de deleção é igualmente aplicável à deleção ou ruptura de qualquer um dos genes glicerol-3-fosfato desidrogenase, glicerol-3-fosfatase, diidroxi acetona fosfato fosfatase ou glicerol desidrogenase.

[0052]Uma construção de deleção é convenientemente montada através de primeiro clonagem de duas seqüências de ADN do gene alvo e/ou suas regiões flanqueantes à montante (5') ou à jusante (3'). As seqüências são preferivelmente

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14/53 não-contíguas, mas podem ser contíguas se adicional material genético (tal como um cassete marcador de seleção) é para ser interposto entre as mesmas na construção. Neste contexto, “não-contígua” significa que as seqüências de ADN não são imediatamente adjacentes umas às outras no genoma tipo selvagem, mas ao invés são separadas umas das outras no genoma tipo selvagem por uma área que é para ser deletada de modo a deletar ou romper o gene. Seqüências “contíguas” são diretamente adjacentes umas às outras no genoma tipo selvagem. Uma das seqüências pode incluir uma região 5' para o promotor do gene alvo, toda ou uma porção da região promotora, toda ou uma porção da região de codificação de gene alvo, ou alguma combinação das mesmas. A outra seqüência pode incluir uma região 3' para o terminador do gene alvo, toda ou uma porção da região terminadora, e/ou toda ou uma porção da região codificante de gene alvo. Uma construção de deleção é então produzida contendo as duas seqüências orientadas na mesma direção em relação uma à outra como elas aparecem nativamente sobre o cromossoma da célula hospedeira. Tipicamente um marcador de seleção é clonado entre as seqüências para permitir seleção de transformantes, como descrito mais inteiramente abaixo. Esta construção é usada para transformar a célula hospedeira. Processos de transformação química (tal como baseados em cloreto de cálcio ou acetato de lítio) e/ou eletroporação podem ser usados.

[0053]Em transformantes bem sucedidos, um evento de recombinação homóloga no local do gene alvo resulta na ruptura ou a deleção do gene funcional. Todo ou uma porção do gene alvo nativo, seu promotor e/ou terminador é deletado durante este evento de recombinação. Se a construção de deleção contém material genético entre as duas seqüências tomadas do local alvo (tal como um cassete marcador de seleção ou cassete de gene estrutural), este material genético é inserido no genoma de célula hospedeira no local do material deletado. Análises por PCR ou análises Southern podem ser realizadas para confirmar que a desejada deleção

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15/53 ocorreu.

[0054]É usualmente desejável que a construção de deleção também possa incluir um cassete marcador de seleção funcional. Quando uma construção de deleção simples é usada, o cassete marcador reside sobre o vetor à jusante (isto é, na direção 3') da seqüência 5' a partir de local alvo e à montante (isto é, na direção 5') da seqüência 3'a partir do local alvo. Transformantes bem sucedidos conterão o cassete marcador de seleção, que proporciona à célula transformada com sucesso alguma característica que provê uma base para seleção. Um “gene marcador de seleção” é um que codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e/ou crescimento da célula transformada em um meio de cultura seletivo. Genes marcadores de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, (tais como, por exemplo, zeocina (gene de resistência a bleomicina ble de Streptoalloteichus huindustanus), G418 (gene de resistência a canamicina de Tn903) ou higromicina (gene de resistência a antibiótico aminoglicosídeo de E. coli)), (b) deficiências auxotróficas de complemento da célula (como, por exemplo, deficiência de aminoácido leucina (gene LEU2 K. marxianus) ou deficiência de uracila (por exemplo, gene URA3 de K. marxianus ou S. cerevisiae)); (c) permitem a célula sintetizar nutrientes críticos indisponíveis de meios simples, ou (d) conferem habilidade para a célula crescer sobre uma particular fonte de carbono, (tal como um gene MEL5 de S. cerevisiae, que codifica a enzima alfa galactosidase (melibiase) e confere a habilidade para crescer sobre melibiose como a única fonte de carbono). Marcadores de seleção preferidos incluem o gene de resistência a zeocina, gene de resistência a G418, um gene MEL5 e gene de resistência a higromicina. Um outro marcador de seleção preferido é um cassete de gene L-lactato:ferricitocromo c óxido redutase (CYB2), contanto que a célula hospedeira tanto nativamente careça de um tal gene como que seu gene(s) CYB2 nativo seja primeiro deletado ou rompido.

[0055]O cassete marcador de seleção ainda incluirá seqüências promotoras

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16/53 e terminadoras, ligadas operativamente ao gene marcador de seleção, e que são operáveis na célula hospedeira. Um tipo apropriado de promotor é pelo menos 50%, 70%, 90%, 95% ou 99% idêntico a um promotor que é nativo para um gene de levedura. Um tipo mais apropriado de promotor é pelo menos 50%, 70%, 90%, 95% ou 99% idêntico a um promotor para um gene que é nativo para a célula hospedeira. Promotores particularmente úteis incluem promotores para genes piruvato descarboxilase (PDC1), fosfoglicerato cinase (PGK), xilose redutase ((XR), xilitol desidrogenase (XDH), L-(+)-lactato citocromo c óxido redutase (CYB2), fator de elongação de tradução-1 (TEF-1) e fator de elongação de tradução-2 ((TEF-2), especialmente a partir dos respectivos genes da célula hospedeira. Um promotor especialmente útil inclui a porção funcional de um promotor para um gene nativo PDC1, PGK, TEF1, ou TEF2 para a célula hospdeira, ou uma seqüência que é pelo menos 80, 85, 90 ou 95% idêntica a um tal promotor PDC1, PGK, TEF1 ou TEF2.

[0056]Um tipo apropriado de terminador é pelo menos 50%, 70%, 90%, 95% ou 99% idêntico a um terminador para um gene que é nativo para um célula de levedura. O terminador pode ser pelo menos 50%, 70%, 90%, 95% ou 99% idêntico a um terminador para um gene que é nativo para a célula hospedeira. Terminadores particularmente úteis para genes piruvato descarboxilase (PDC1), xilose redutase (XR), xilitol desidrogenase (XDH), L-lactato:ferricitocromo c óxido redutase (CYB2) ou isso-2-citocromo c (CYC), ou um terminador da família galactose de genes em levedura, particularmente o assim chamado terminador GQAL10. Um terminador especialmente preferido inclui uma porção funcional de um terminador para um gene GAL10 nativo para a célula hospedeira, ou uma seqüência que é pelo menos 80, 85, 90 ou 95% idêntica a um tal terminador.

[0057]A construção de deleção pode ser desenhada de modo que o cassete marcador de seleção possa tornar-se espontaneamente deletado como um resultado de um subseqüente evento de recombinação homóloga. Um meio conveniente de

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17/53 realizar isto é desenhar o vetor de modo que o cassete de gene estrutural seja flanqueado por seqüências de repetição direta. Seqüências de repetição direta são seqüências de ADN idênticas, nativas ou não nativas para a célula hospedeira, e orientadas sobre a construção na mesma direção com relação umas às outras. As seqüências de repetição diretas são vantajosamente de cerca de 50-1500 pb em comprimento. Não é necessário que as seqüências de repetição diretas codifiquem algo. Esta construção permite a ocorrência de um evento de recombinação homóloga. Este evento ocorre com alguma baixa freqüência, resultando em células contendo uma deleção do gene marcador de seleção e uma das seqüências de repetição direta. Pode ser necessário desenvolver transformantes para vários ciclos sobre meios não-seletivos para permitir a espontânea recombinação homóloga ocorrer em algumas das células. Células nas quais o gene marcador de seleção tornou-se espontaneamente deletado podem ser selecionadas ou peneiradas nas bases de sua perda da característica de seleção proporcionada pelo gene marcador de seleção.

[0058]A construção de deleção de gene alvo também pode conter um cassete de gene estrutural, novamente localizado à jusante da região flanqueante 5' e à montante da região flanqueante 3', mas preferivelmente não dentro de qualquer cassete marcador de seleção que possa estar presente. Uma tal construção permite a simultânea deleção do gene alvo e inserção de um gene estrutural. Por “gene estrutural”, é pretendido qualquer gene que codifica uma proteína, outro que não o gene alvo ou um gene marcador de seleção como descrito acima. Uma ampla variedade de genes estruturais pode ser usada, mas aqueles de particular interesse para esta invenção são um gene que confere à célula a habilidade para produzir um ácido orgânico, ou um gene que confere à célula a habilidade de consumir uma particular fonte de carbono, tal como um açúcar pentose.

[0059]Em casos onde um marcador de seleção é usado, a transformação pode ser realizada com par de construções de deleção ao invés de uma única consPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 34/87

18/53 trução de deleção. Uma do par conterá a primeira seqüência a partir do local do gene alvo e uma parte não-funcional do cassete de gene marcador. A outra do par conterá a segunda seqüência a partir do local do gene alvo e uma outra parte nãofuncional do cassete de gene marcador. As duas partes do cassete de gene marcador são selecionadas de modo que juntas elas formam um cassete completo. As extremidades de cada uma das duas partes do cassete de gene marcador compartilham uma seqüência comum, isto é, uma porção do cassete é duplicada nas extremidades de cada uma das duas partes. A célula é transformada simultaneamente com estes para realização de desejada deleção ou ruptura, com a formação de um cassete de gene estrutural ou marcador funcional, completo. Uma proporção das células integrará homogeneamente ambas construções de deleção no local alvo, e serão presas ainda em um evento de recombinação homóloga para reconstituição de um cassete de gene de seleção funcional a partir de dois fragmentos nãofuncionais. Transformantes bem sucedidos podem ser selecionados nas bases da característica proporcionada pelo marcador de seleção.

[0060]Quando a via metabólica nativa da célula inclui a via diidroxi acetona fosfato para glicerol-3-fosfato para glicerol (via enzimas GDP e GPP), tanto o gene(s) GDP como gene(s) GPP pode ser deletado ou rompido. Ambos genes GDP e GPP podem ser deletados. Em tal caso, a deleção ou ruptura de ambos genes GDP e GPP pode ser feita simultânea ou seqüencialmente em qualquer ordem. Se a célula contém múltiplos genes GDP ou GPP, ou múltiplos alelos de tais genes, é preferido deletar todos aqueles que são funcionais na célula. Em casos onde a via metabólica nativa de célula inclui o caminho diidroxi acetona fosfato para diidroxi acetona para glicerol (via diidroxi acetona fosfato fosfatase e glicerol desidrogenase), tanto o gene diidroxi acetona fosfato fosfatase como glicerol desidrogenase pode ser deletado ou rompido. Ambos genes diidroxi acetona fosfato fosfatase ou glicerol desidrogenase podem ser deletados ou rompidos, o que pode ser feito simultânea ou sePetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 35/87

19/53 qüencialmente, em cujo caso isto pode ser feito em qualquer ordem. Como antes, múltiplas cópias funcionais ou alelos de tais genes são preferivelmente todas deletadas.

[0061]Em certos aspectos da invenção, a célula é capaz de produzir um desejado ácido orgânico (ou seu sal). Esta capacidade é manifestada através de uma habilidade para converter pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%, em peso de uma fonte de carbono ao desejado ácido orgânico quando cultivada sob pelo menos um conjunto de condições de fermentação. Na medida em que poucas células de levedura têm a habilidade nativa para produzir tais ácidos, a célula da invenção na maioria dos casos conterá pelo menos um gene exógeno, funcional, que permite à mesma produzir o ácido.

[0062]Células de particular interesse produzem lactato, pelo que é pretendido ácido lático ou um seu sal. Em tal caso, a célula da invenção contém pelo menos um gene lactato desidrogenase (LDH) exógeno funcional integrado em seu genoma. Um gene LDH é um que codifica uma enzima lactato desidrogenase funcional. Uma enzima LDH funcional é uma que catalisa a redução de piruvato a lactato. Genes LDH são específicos para a produção der L-LDH ou D-LDH, que respectivamente permite a célula produzir o enantiômero L- ou D-ácido lático (ou seus sais). É possível que a célula modificada da invenção contenha ambos genes L- e D-LDH, e assim seja capaz de produzir ambos enantiômeros de ácido lático. Entretanto, é preferido que somente genes L- ou somente D-LDH estejam presentes, de modo que a célula produza um produto ácido lático mais oticamente puro.

[0063]Apropriados genes LDH incluem aqueles obtidos de fontes bacterianas, fungos, levedura ou mamífero. Exemplos de específicos genes L-LDH são aqueles obtidos de L. helveticus, L. casei, B. megaterium, P. acidilactici e fontes bovinas. Exemplos de específicos genes D-LDH são aqueles obtidos de L. helveticus,

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L. johnsonii, L. bulgaricus, L. delbrueckii, L. plantarum, e L. pentosus. Genes funcionais que são idênticos ou pelo menos 80% idênticos a quaisquer destes genes LLDH ou D-LDH são apropriados. Os genes nativos obtidos a partir de qualquer uma destas fontes pode ser submetida a mutagênese se necessário para prover uma seqüência codificante partindo com o usual códon de partida eucariótico (ATG), ou para outros propósitos. Um gene L-LDH preferido é aquele obtido de L. helveticus ou um que é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a tal gene. Um outro gene LLDH preferido é aquele obtido de B. megaterium ou um que é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a tal gene. Um gene D-LDH preferido é aquele obtido de L. helveticus ou um que é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a tal gene.

[0064]Genes LDH particularmente apropriados incluem aqueles que codificam uma enzima com uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 60%, especialmente pelo menos 80%, 85% ou 95%, idêntica a SEQ ID NO: 45 de WO 03/049525 ou comparada com SEQ ID NO: 49 de WO 03/049525. Genes LDH particularmente apropriados também incluem aqueles que codificam uma enzima tendo uma seqüência de proteína que é pelo menos 60%, 80%, 85% ou 95% idêntica a SEQ ID NO: 46 ou 50 de WO 03/049525.

[0065]A célula transformada pode conter um gene LDH simples ou múltiplos genes LDH, tal como de 1 a 10 genes LDH, especialmente de 1 a 5 genes LDH. Quando a célula transformada contém múltiplos genes LDH, os genes individuais podem ser copias do mesmo gene, ou incluem cópias de dois ou mais diferentes genes LDH. Múltiplas cópias do gene LDH exógeno podem ser integradas em um locus simples (assim são adjacentes umas às outras), ou em vários loci dentro do genoma de célula hospedeira.

[0066]O gene LDH exógeno está sob controle transcricional de um ou mais promotores e um ou mais terminadores, ambos os quais são funcionais na célula de levedura modificada. Apropriados promotores e terminadores são como descritos

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21/53 antes com relação ao cassete de gene marcador de seleção, e também são descritos em WO 99/14335, WO 00/71738, WO 02/42471, WO 03/102201, WO 03/102152 e WO 03/049525. Um promotor especialmente útil inclui a porção funcional de um promotor para um gene PDC1, PGK, TEF1 ou TEF2 da célula hospedeira ou é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a um tal promotor. Um terminador especialmente preferido inclui uma porção funcional de um terminador para um gene PDC1 da célula hospedeira ou é pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% idêntico ao mesmo.

[0067]Quando múltiplos genes LDHexógenos são introduzidos na célula hospedeira, é possível para os diferentes genes LDH estarem sob o controle de diferentes tipos de promotores e/ou terminadores.

[0068]O gene LDH exógeno pode ser integrado randomicamente no genoma da célula hospedeira ou inserido em uma ou mais localizações alvejadas. Exemplos de localizações alvejadas incluem o locus de um gene que é desejavelmente deletado ou rompido, tal como aquele de um gene PDC1, um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase, um gene glicerol-3-fosfatase, um gene diidroxi acetona fosfato fosfatase ou um gene glicerol desidrogenase. O cassete de gene LDH exógeno pode residir sobre uma construção para a deleção ou ruptura de um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase, glicerol-3-fosfatase, diidroxi acetona fosfato fosfatase ou glicerol desidrogenase, e desta maneira ser inserido no locus de um tal gene simultaneamente com a deleção ou ruptura do mesmo.

[0069]Processos para transformação de uma célula de levedura para introdução de um cassete de gene LDH exógeno são descritos em WO 99/14335, WO 00/71738, WO 02/42471, WO 03/102201, WO 03/102152, e WO 03/049525. Tais processos são aplicáveis a esta invenção.

[0070]A célula também pode ser modificada para permitir que a mesma produza um ou mais outros ácidos orgânicos. Por exemplo, a célula pode ser transformada com um cassete de gene exógeno que codifica uma enzima beta alanina / piPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 38/87

22/53 ruvato amino transferase funcional, assim permitindo a célula produzir ácido 3hidroxi propiônico. Processos para realização disto são descritos em WO

2005/118719.

[0071]A célula de levedura geneticamente modificada da invenção pode incluir adicionais modificações genéticas que proporcionam um ou mais atributos desejados às células.

[0072]Uma modificação adicional de particular interesse em algumas realizações inclui uma deleção ou ruptura de gene(s) piruvato descarboxilase. Isto reduz a habilidade de célula produzir etanol, o que é particularmente desejável em casos nos quais um ácido orgânico tal como lactato é o produto desejado. Se a célula hospedeira contém múltiplos genes PDC, é especialmente preferido deletar ou romper todos os genes PDC, embora seja possível deletar menos que todos tais genes PDC. Deleção de PDC pode ser realizada usando-se processos análogos àqueles descritos em WO 99/14335, WO 02/42471, WO 03/049525, WO 03/102152 e WO 03/102201. Deleção de PDC também pode ser realizada com simultânea inserção de um cassete de gene LDH ou outro cassete de gene marcador de seleção ou estrutural. Em um processo de particular interesse, (1) seqüências não-contíguas a partir do locus do gene(s) PDC são clonadas, (2) uma construção contendo as seqüências não-contíguas é produzida, e (3) a célula hospedeira é transformada com a construção. Um evento recombinante homólogo resulta em uma deleção ou ruptura do gene PDC funcional em uma porção dos transformantes. Isto pode ser repetido se necessário para deletar ou romper múltiplos genes PDC ou alelos. Em algumas espécies de levedura, como I. orientalis, genes PDC múltiplos ou alelos existem que são homólogos de perto. Foi verificado que em pelo menos alguns exemplos seqüências não-contíguas tomadas do locus de gene ou alelo podem ser usadas na construção para deletar ou romper ambos genes PDC ou alelos. A construção usada para interromper o gene(s) PDC pode incluir um ou mais cassetes de gene estrutural

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23/53 ou marcador funcionais inseridos à jusante da porção flanqueante 5' do gene PDC nativo e à montante das porções flanqueantes 3' do gene PDC nativo. Esta abordagem permite a deleção do gene PDC e inserção do cassete de gene funcional em uma etapa de transformação simples.

[0073]Uma outra modificação adicional de particular interesse é uma (ou mais) que individual ou coletivamente confere à célula a habilidade para fermentar açúcares pentose para desejáveis produtos de fermentação. Entre o último tipo de modificações estão (1) inserção de um gene xilose isomerase funcional, (2) uma deleção ou ruptura de um gene nativo que produz uma enzima que catalisa a conversão de xilose a xilitol, (3) uma deleção ou ruptura de um gene xilitol desidrogenase funcional e/ou (4) modificações que fazem a célula superexpressar uma xilulo cinase funcional. Processos para introdução daquelas modificações em células de levedura são descritos, por exemplo, em WO 04/099381, aqui incorporado por referência. Processos apropriados para inserção de um gene xilose isomerase funcional, deleção ou ruptura de um gene nativo que produz uma enzima que catalisa a conversão de xilose a xilitol, deleção ou ruptura de um gene xilitol desidrogenase funcional modificando a célula para superexpressão de uma xilulo cinase funcional são descritos, por exemplo, em WO 04/099381, aqui incorporado por referência.

[0074]Uma outra modificação adicional de particular interesse em células produzindo lactato da invenção inclui uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene L- ou D-lactato:ferricitocromo c óxido redutase.

[0075]Em geral, a célula da invenção é caracterizada por uma habilidade reduzida para sintetizar glicerol. Um processo útil para avaliação de uma habilidade de célula para sintetizar glicerol é através de cultura da célula sob as condições microaeróbicas padrões descritas anteriormente. Um meio de fermentação definido é usado, que contém no início de cultura 5 g/L de sulfato de amônio, 3 g/L de diidrogeno fosfato de potássio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio, elementos em traços, viPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 40/87

24/53 taminas e 150 g/L de glicose. O pH é ajustado para 3,5 no início de cultura. O pH é permitido variar livremente durante a cultura, exceto que o meio é tamponado se necessário para evitar que o pH caia abaixo de 3,0 ou eleve-se acima de 7,0 durante a cultura. O meio de fermentação é inoculado com células de levedura suficientes que são o objeto da avaliação para produzir uma OD600 de 1.0. A temperatura de cultura é de 30^oC. A cultura é continuada até a concentração de glicose ser reduzida para 5 g/L, mas não é continuada por mais que 120 horas. Durante a cultura, condições de aeração e agitação são selecionadas para produzirem uma taxa de tomada de oxigênio de 5,0 ± 1,0 mmol/L/h. Sob estas condições padrões, células da invenção tipicamente produzem não mais que 2,0 g/L de glicerol. Mais tipicamente, elas produzem não mais que 0,6 g/L de glicerol sob estas condições e na maioria dos casos produzem não mais que 0,2 g/L de glicerol sob estas condições. Células preferidas também produzem, sob estas condições micro-aeróbicas padrões, pelo menos 10 g/L de pelo menos um produto de fermentação desejável, tal como etanol, ou um ácido orgânico como lactato. As células mais preferivelmente produzem pelo menos 40 e especialmente pelo menos 50 g/L do desejado produto de fermentação sob estas condições.

[0076]A célula da invenção pode ser cultivada, sob as condições microaeróbicas padrões descritas anteriormente ou qualquer outro conjunto útil de condições de fermentação, para produzir um ou mais desejáveis produtos de fermentação. Etanol é um exemplo de um produto de fermentação que muitas espécies de leveduras produzem naturalmente. Como discutido anteriormente, as células podem ser modificadas para permitir que as mesmas produzam outros produtos de fermentação desejáveis, incluindo ácidos orgânicos como lactato ou ácido 3-hidroxi propiônico. As células podem ser modificadas para produzirem também outros produtos de fermentação, incluindo outros ácidos ou outros produtos que não são ácidos.

[0077]No processo de fermentação da invenção, a célula da invenção é culPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 41/87

25/53 tivada em um meio de fermentação que inclui uma fonte de carbono que é fermentável pela célula transformada. A fonte de carbono pode ser um açúcar hexose tal como glicose, ou um oligômero ou outro polímero de glicose tal como glicano, maltose, maltotriose ou isomaltotriose. A fonte de carbono pode ser um outro açúcar hexose, do qual panose, frutose e seus respectivos oligômeros e polímeros são exemplos. Se a célula nativamente tem ou é modificada para proporcionar uma habilidade para fermentar açúcares pentose, a fonte de carbono pode incluir um açúcar pentose tal como xilose, ou um oligômero ou polímero de xilose como xilano. Tais açúcares pentose são apropriadamente hidrolisados de uma biomassa contendo hemicelulose. Em caso de açúcares oligoméricos, pode ser necessário adicionar enzimas ao caldo de fermentação de modo a digerir estes ao correspondente açúcar monomérico para fermentação pela célula.

[0078]O meio tipicamente conterá nutrientes como requeridos pela particular célula, incluindo uma fonte de nitrogênio (como aminoácidos, proteínas, fontes de nitrogênio inorgânicas como amônia ou sais de amônio, e semelhantes), e várias vitaminas, minerais e semelhantes. Um assim chamado meio “complexo” ou um assim chamado meio “definido” pode ser usado.

[0079]Outras condições de fermentação, como temperatura, densidade de célula, seleção de substrato(s), seleção de nutrientes, e semelhantes não são consideradas serem críticas para a invenção e são genericamente selecionadas para provimento de um processo econômico. Temperaturas durante cada uma da fase de crescimento e a fase de produção pode variar de acima de temperatura de congelamento do meio a cerca de 50^oC, embora isto dependa em alguma extensão da habilidade da linhagem tolerar temperaturas elevadas. Uma temperatura preferida, particularmente durante a fase de produção, é de cerca de 30-45^oC.

[0080]Durante a fase de produção, a concentração de células no meio de fermentação está tipicamente na faixa de 0,1 a 20, preferivelmente de 0,1 a 5, mesPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 42/87

26/53 mo mais preferivelmente de 1 a 3 g de células secas / litro de meio de fermentação. A fermentação pode ser conduzida aerobicamente, micro-aerobicamente, ou anaerobicamente. Se desejado, taxa de tomada de oxigênio pode ser usada como um controle de processo, como descrito em WO 03/102200. Células da invenção podem desempenhar especialmente bem quando cultivadas sob condições micro-aeróbicas caracterizadas por uma taxa de tomada de oxigênio de 4 a 12, especialmente de 5 a 10, mmoles/L/h.

[0081]Em casos preferidos nos quais a célula produz um ácido orgânico tal como lactato, o meio pode er tamponado durante a fase de produção da fermentação de modo que o pH seja mantido em uma faixa de cerca de 3,5 a cerca de 9,0, ou de cerca de 4,5 a cerca de 7,0. Apropriados agentes tamponantes são materiais básicos que neutralizam o ácido na medida em que ele é formado, e incluem, por exemplo, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, carbonato de sódio, carbonato de amônio, amônia, hidróxido de amônio e semelhantes. Em geral, aqueles agentes tamponantes que têm sido usados em processos de fermentação convencionais também são apropriados aqui.

[0082]Em uma fermentação tamponada, produtos de fermentação ácidos são neutralizados ao correspondente sal quando eles são formados. Recuperação do ácido por isso envolve regeneração do ácido livre. Isto é tipicamente feito através de remoção de células e acidulação de caldo de fermentação com um ácido forte tal como ácido sulfúrico. Um subproduto sal é formado (gypsum no caso onde um sal de cálcio é o agente neutralizante e ácido sulfúrico é o agente acidulante), que é separado do caldo. O ácido é então recuperado do caldo através de técnicas tais como extração líquido - líquido, destilação, absorção, etc., como são descritas em T. B. Vickroy, Vol. 3, Chapter 38 of Comprehensive Biotechnology, (ed. M. Môo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta, et al., FEMS Microbiol. Rev., 1995, 16:221-231;

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27/53 patentes U.S. Nos. 4 275 234, 4 771 001, 5 132 456, 5 420 304, 5 510 526, 5 641 406 e 5 831 122, e WO 93/00440.

[0083]Alternativamente, o pH do meio de fermentação pode ser deixado cair durante a cultura a partir de um pH de partida que está acima de pKa do ácido produto, tipicamente 5,5 ou maior, para ou abaixo de pKa do produto de fermentação ácido, tal como na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 3,5, na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 3,0, ou na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 2,5.

[0084]Também é possível conduzir-se a fermentação para produzir um produto ácido através de ajuste de pH do caldo de fermentação para ou abaixo de pKa do ácido produto antes de ou no início do processo de fermentação. O pH a seguir pode ser mantido no ou abaixo do pKa do ácido produto por toda cultura, ou pode ser deixado aumentar acima de pKa do ácido quando a fermentação procede. No caso anterior, o pH é preferivelmente mantido dentro de faixa de cerca de 1,5 a cerca de 3,5, na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 3,2, ou na faixa de cerca de 2,0 a cerca de 3,0.

[0085]A célula da invenção tem uma habilidade agudamente reduzida de produzir glicerol sob muitas condições de fermentação. A reduzida habilidade da célula de produzir glicerol é manifestada por baixos rendimentos de glicerol. As células da invenção tipicamente metabolizam menos que 2% em peso da fonte de carbono que é consumida a glicerol. Na maioria dos casos, o rendimento de glicerol é menos que 1% ou mesmo menos que 0,1%, baseado no peso de fonte de carbono que é consumido na cultura. Preferivelmente, a célula metaboliza pelo menos 40%, tal como pelo menos 50, 60, 70, 80 ou 85%, da fonte de carbono que é consumida para o desejado produto de fermentação.

[0086]Foi verificado que as células da invenção exibem boa habilidade para crescimento sob condições de fermentação. Isto é surpreendente, devido aos vários usos da célula para glicerol e o papel de glicerol ser acreditado desempenhar no baPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 44/87

28/53 lanço de NADFH/NAD+ em células de levedura tipo selvagem. Está dentro do escopo da invenção adicionar glicerol ao meio de fermentação para compensar a diminuída capacidade de célula produzir glicerol por si própria. Entretanto, os requerentes verificaram que assim fazendo rende pequeno benefício, pelo menos em alguns processos de fermentação.

[0087]Os exemplos que se seguem são providos para ilustrarem a invenção, mas não são pretendidos limitarem seu escopo. Todas as partes e porcentagens são em peso a menos que de outro modo indicado.

Exemplo 1A:Mutagênese de K. marxianus linhagem CD607 e seleção de linhagem mutante (CD853) tendo resistência a ácido glicólico [0088]K. marxianus linhagem CD607 é descrita no exemplo 3D de WO 03/102152. Esta linhagem tem uma deleção de seu gene piruvato descarboxilase e uma inserção de um gene lactato desidrogenase exógeno naquele locus. Células de linhagem CD607 são submetidas a mutagênese via exposição a luz ultravioleta.

[0089]Células de uma placa de YP fresco (extrato de levedura plus peptona) + 20 g/L glicose são re-suspensas em 2 mL de peptona levedura + 50 g/L glicose para uma ODecra aproximada de 6. Dez alíquotas de 125 11L desta suspensão de células são pipetadas em dez cavidades de uma placa de micro - titulação de 96 cavidades de 300 pL. A placa de micro - titulação é exposta a 12500 pJoule/cm² de luz UV para matar 90-99% das células. A placa de micro - titulação é então incubada no escuro por toda noite a 30^oC com agitação (225 rpm) para permitir que as células se recuperem antes de revestimento sobre placas de seleção.

[0090]100 11L das suspensões de células tratadas com UV são então revestidos sobre uma placa de agar de dextrose de batata (PDA) + 15 g/L de ácido glicólico para selecionar linhagens resistentes a ácido glicólico. Estas placas são incubadas a 30^oC por vários dias até aparecimento de colônias. Uma colônia simples é isolada para ainda análises.

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29/53 [0091]Aproximadamente 2 x 10⁸ células mutagenizadas são revestidas sobre placas PDA contendo 15 g/L de ácido glicólico e incubadas a 30^oC. Colônias que crescem sobre estas placas são desenvolvidas por toda noite em frascos de agitação defletidos a 30^oC e 225 rpm, de agitação em YP (peptona levedura) + 100 g/L glicose sem tampão. Frascos de produção são então inoculados com 2 g/L de peso seco de células a partir destes frascos de agitação. Os frascos de produção são cultivados a 30^oC e 70 rpm de agitação em YP + 50 g/L de glicose. Amostras são periodicamente retiradas para medição de glicose, lactato, etanol e piruvato por HPLC usando processos tais como descrito no Exemplo 1M de WO 03/102201. Uma linhagem que produz cerca de 26 g/L de lactato após 88 horas é designada como linhagem CD635. Linhagem CD635 é capaz de crescer sobre lactato como a única fonte de carbono.

[0092]Células de linhagem CD635 são submetidas a uma adicional etapa de mutagênese como descrito acima. As resultantes células mutagenizadas são selecionadas para colônias que são capazes de crescerem sobre PDA contendo 25 g/L de ácido glicólico. Colônias que são resistentes a ácido glicólico são desenvolvidas separadamente por toda noite em YP + 100 g/L de glicose em frascos de agitação a 30^oC e 250 rpm de agitação. Biomassa é coletada por centrifugação e 2 g/L em peso de células secas são inoculados em 50 mL de YP + 50 g/L de glicose em um frasco de agitação defletido. Os frascos são cultivados a 30^oC e 250 rpm de agitação por aproximadamente 92 horas. Um mutante que produz títulos finais significantemente maiores de lactato, comparado a linhagens parentes CD607 e CD635, é designado como linhagem CD853.

[0093]Linhagem CD853 é incapaz de crescer sobre lactato como a única fonte de carbono, sugerindo que o gene L-lactato:ferricitocromo c óxido redutase (KmCYB2) tornou-se não-funcional neste mutante. Por isso, a região codificando

KmCYB2 plus ~500 pb e à jusante da região codificante KmCYB2 é amplificada a

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30/53 partir desta linhagem, usando PCR com enzima FailSafe de alta fidelidade e ADN genômico como o molde. O resultante produto de PCR de ~2,75 kbp é purificado via purificação em coluna Qiagen e seqüenciado sobre a inteira região codificante KmCYB2. Linhagem CD853 é verificada ter uma inserção de quatro bases em posição de aminoácido 62 do gene KmCYB2, que causa uma mutação de desvio de quadro, resultando em um códon de ruptura na posição de aminoácido 76 e truncando a proteína.

Exemplo 1B:Construção de vetores de deleção GPD1F pBH158 (Fig. 1) e pBH159 (Fig. 2) [0094]Um plasmídeo designado pVR29 (descrito no Exemplo 1C e Figura 4 de WO 03/102152) contém o gene de resistência canamicina de Tn903 (gene G418) sob o controle de um promotor piruvato descarboxilase e um terminador GAL10. Plasmídeo pVR29 é digerido com MluI e PstI e um fragmento de 5,1 kbp contendo o cassete de gene G418 assim obtido é purificado em gel e desfosforilado. Uma região de 1,2 kbp de ADN à montnate do gene GPD de K. marxianus (KmGDP1F) é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 14 e SEQ ID NO. 15, com ADN genômico de K. marxianus como um molde. O produto de PCR é purificado em gel, digerido com MluI e PstI, e ligado ao fragmento de 5,1 kbp de plasmídeo pVR29 para produzir um plasmídeo designado como pBH158 (Fig. 1). Plasmídeo pBH158 contém, em ordem de transcrição, o flanco à montante de 1,2 kbp do gene KmGPD1F e o cassete de expressão G418.

[0095]Para o segundo vetor de deleção, plasmídeo pVR29 é digerido com NgoMIV e AatII e um fragmento de 4,7 kbp contendo o cassete de expressão G418 é purificado em gel e desfosforilado. Uma região de 0,7 kbp de ADN à jusante do gene KmGPD1F é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 16 e SEQ ID NO. 17, novamente usando ADN genômico de K. marxianus como um molde. O produto de PCR é purificado com gel, digerido com NgoMIV e

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AatII, e ligado ao fragmento de 4,7 kbp de pVR29 para produzir um plasmídeo designado como pBH159 (Fig. 2). Plasmídeo pBH159 contém, em ordem de transcrição, o cassete de expressão G418 e o flanco à jusante de 0,7 kbp do gene

KmGPD1F.

Exemplo 1C:Transformação de linagem CD853 (Ex. 1A) com plasmídeos pBH158 e pBH159 (Ex. 1B, Figs. 1 e 2) para produzir um transformante (linhagem CD1606) tendo um gene LDH exógeno, uma deleção de um gene PDC nativo, um gene CYB2 nativo interrompido e um gene GPD1F nativo deletado.

[0096]Plasmídeo pBH158 é digerido com Mlul e Hindlll. Estas enzimas de restrição cortam o plasmídeo para produção de um fragmento de 2,6 kbp que contém o flanco à montante de 1,2 kbp do gene KmGPD1F e parte do cassete de expressão G418. Este fragmento é isolado a partir de um gel agarose. Plasmídeo pBH159 é digerido com Xhol e NgoMlV. Estas enzimas de restrição cortam o plasmídeo para produção de um fragmento de 2,0 kbp que contém uma porção do cassete de expressão G418 e o flanco à jusante de 0,7 kbp do gene KmGPD1F. Este fragmento é isolado a partir de um gel agarose. Os dois fragmentos isolados juntos contêm o inteiro cassete de expressão G418 com alguma duplicação nas extremidades dos fragmentos.

[0097]Linhagem CD853 é crescida por toda noite em YP + 60 g/L de glicose + MES 0,2 M + etanol 1%, pH 6,5, e é eletroporada simultaneamente com o fragmento de 2,6 kbp de plasmídeo pBH158 e o fragmento de 2,0 kbp de pBH159. Transformantes são selecionados sobre placas de YP + 20 g/L de glicose + 300 pg/mL de G418 a 30^oC seguindo 2 dias de crescimento. 15 transformantes são colhidos, novamente feitos listras para placas de YP + 20 g/L de glicose + G418 e crescidos por toda noite. Somente células que foram co-transformadas com ambos fragmentos e nas quais ambos fragmentos tornaram-se homologamente integrados no locus KmGPD1F serão resistentes a G418.

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32/53 [0098]Deleção do gene KmGPD1F é verificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 18 e SEQ ID NO. 19. Sete transformantes exibem uma banda simples de 3,4 kbp através de PCR, indicando que o gene KmGPD1 F é deletado naqueles transformantes. Um destes transformantes é designado como linhagem CD1606.

Exemplo 2A:Construção de vetores de deleção de gene GPP pBH160 (Fig. 3) e pBH161 (Fig. 4).

[0099]Plasmídeo pVR29 é digerido com MluI e KpnI e um fragmento de 5,1 kbp contendo o cassete de gene G418 assim obtido é purificado com gel e desfosforilado. Uma região de 0,9 kbp de ADN imediatamente à montante do gene GPP nativo (gene KmHOR2) é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 20 e SEQ ID NO. 21, usando ADN genômico de K. marxianus como o molde. O produto de PCR é é purificado com gel, digerido com MluI e KpnI, e ligado ao fragmento de 5,1 kbp de plasmídeo pVR29 para produzir um plasmídeo designado como pBH160 (Fig. 3). Plasmídeo pBH160 contém, em ordem de transcrição, o flanco à montante de 0,9 kbp do gene KmHOR2 e o cassete de expressão de G418.

[00100]Plasmídeo pVR29 é digerido com NgoMIV e SpeI e um fragmento de 4,7 kbp contendo o cassete de expressão G418 é purificado em gel e desfosforilado. Uma região de 0,8 kbp de ADN imediatamente à jusante do gene KmHOR2 é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23, usando ADN genômico de K. marxianus como o molde. O produto de PCR é purificado com gel, digerido com NgoMIV e SpeI, e ligado ao fragmento de 4,7 kbp de pVR29 para produzir um plasmídeo designado como pBH161 (Fig. 4). Plasmídeo pBH161 contém, em ordem de transcrição, o cassete de expressão G418 e o flanco à jusante de 0,8 kbp do gene KmHOR2.

Exemplo 2B:Transformação de linhagem CD853 (Ex. 1A) com plasmídeos pBH160 e pBH161 (Ex. 2A, Figs. 3 e 4) para produzir um transformante (linhagem

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CD1608) tendo um gene LDH exógeno, uma deleção de um gene PDC nativo, um gene CYB2 nativo interrompido e um gene GPP nativo deletado.

[00101]Plasmídeo pBH160 é digerido com MluI e HindIII. Estas enzimas de restrição cortam o plasmídeo para produção de um fragmento de 2,3 kbp que contém o flanco à montante de 0,9 kbp do gene GPP de K. marxianus ((KmHOR2) e parte do cassete de expressão G418. Este fragmento é isolado a partir de um gel agarose. Plasmídeo pBH161 é digerido com XhoI e NgoMIV. Estas enzimas de restrição cortam o plasmídeo para produção de um fragmento de 2,0 kbp que contém o flanco à montante de 0,8 kbp do gene KmHOR2 e parte do cassete de expressão G418. Este fragmento é isolado de um gel agarose. Os dois fragmentos isolados contêm juntos o inteiro cassete de expressão G418 com alguma duplicação nas extremidades dos fragmentos.

[00102]Linhagem CD853 é crescida por toda noite em YP + 60 g/L de glicose + MES 0,2 M + etanol 1%, pH 6,5, e é então eletroporada com ambos, o fragmento de 2,3 kbp de plasmídeo pBH160 e o fragmento de 2,0 kbp de plasmídeo pBH161. Transformantes são selecionados sobre placas de YP + 20 g/L glicose + 300 pg/mL G418 a 30^oC seguindo 2 dias de crescimento. 15 transformantes são feitos novamente listras para placas de YP + 20 g/L glicose + 300 pg/mL G418 e crescidos por toda noite. Todos os transformantes crescem sobre este meio. Somente células que foram co-transformadas com ambos fragmentos e nas quais ambos fragmentos tornaram-se homologamente integrados no locus KmHOR2 serão resistentes a G418.

[00103]Deleção do gene KmHOR2 é verificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 20 e SEQ ID NO. 21. Três transformantes renderam uma banda de 3,8 kbp simples que é indicativa da deleção do gene KmHOR2. Um destes transformantes é designado linhagem CD1608.

Exemplo 3:Cultivo de cultura em batelada micro - aeróbica de linhagens

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CD853 (Ex. 1A), CD1606 (Ex. 1C) e CD1608 (Ex. 2B).

[00104]Linhagens CD853, CD1606 e CD1608 são separadamente cultivadas sob condições micro - aeróbicas. Fermentações em duplicata são realizadas nos casos de linhagens CD1606 e CD1608. Em cada caso, um reator de cultura de batelada de estágio simples é usado. O meio de fermentação é um meio definido que inclui sulfato de amônio, diidrogeno fosfato de potássio, e sulfato de magnésio, elementos em traços, vitaminas, agente antiespumante, e cerca de 90 g/L de glicose. O pH do meio é ajustado para cerca de 3,0 através de adição de hidróxido de potássio. O meio é ajustado para 30^oC e inoculado com 1 mL de células. As células são cultivadas a 30^oC sob condições de agitação e aeração que conduzem a uma taxa de tomada de oxigênio de 5-6 mmoles/L/h. Taxa de tomada de oxigênio é determinada de acordo com os processos descritos em WO 03/102200.

[00105]Amostras do caldo de fermentação são periodicamente removidas e ensaiadas para lactato, acetato, glicerol e piruvato. Produção de dióxido de carbono é medida através de determinação de teor de dióxido de carbono de gases ventilados do reator.

[00106]Linhagem CD853 (não um exemplo da invenção) produz lactato em uma taxa de 0,85 g/L-h através de estágios iniciais da fermentação, até o título de lactato ser aproximadamente 20 g/L. Rendimento de lactato através deste ponto é cerca de 70%. Após este, produção de lactato diminui para cerca de 0,76 g/L-h e rendimento de lactato cai levemente. Produção para esta linhagem é interrompida após 86 horas, em cujo tempo o caldo de fermentação contém g/L de glucose. Título de lactato é 59 g/L. Taxa de produção de lactato total é 0,65 g/L-h, e rendimento total de lactato é 70%. Rendimentos para piruvato, acetato, glicerol e dióxido de carbono para linhagem CD853 são 0,6%, 0%, 5,1% e 14%, respectivamente. Rendimento para biomassa é de 6,4%.

[00107]Linhagem CD1606 produz lactato em uma taxa de 0,77-0,84 g/L-h

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35/53 através de estágios iniciais da fermentação, até o título de lactato ser aproximadamente 20 g/L. Rendimento de lactato através daquele ponto é cerca de 72-80%. Após isto, produção de lactato diminui para cerca de 0,39-0,41 g/L-h e rendimento de lactato cai levemente. Produção para esta linhagem é interrompida após 137 horas, em cujo momento o caldo de fermentação contém 14-19 g/L de glicose. Título de lactato é 43-45 g/L. Taxa de produção de lactato total é 0,32-0,34 g/L-h, e rendimento total para lactato é de 60-63%. Rendimentos para piruvato, acetato, glicerol e dióxido de carbono para linhagem CD1606 são 0,1%, 0,5%, 0% e 26-29%, respectivamente. Rendimento para biomassa é de 7,9%. Estes resultados mostram que deleção do gene KmGPD1F nativo é efetiva para interromper a capacidade de célula produzir glicerol. Surpreendentemente, a deleção deste gene (e a resultante falta de produção de glicerol) tem pequeno ou nenhum efeito sobre crescimento de célula.

[00108]Linhagem CD1608 produz lactato em uma taxa de 0,66 g/L-h através de estágios iniciais da fermentação, até o título de lactato ser aproximadamente 20 g/L. Rendimento de lactato através deste ponto é cerca de 70-75%. Após isto, produção de lactato diminui para cerca de 0,37 g/L-h e rendimento de lactato cai levemente. Produção para esta linhagem é interrompida após 137 horas, em cujo momento o caldo de fermentação contém 19 g/L de glicose. Título de lactato é de 42 g/L. Taxa de produção total de lactato é de 0,31 g/L-h, e rendimento total para lactato é 59-60%. Rendimentos para piruvato, acetato, glicerol e dióxido de carbono para linhagem CD1608 são 0,0-0,1%, 0,8%, 0% e 26-28%, respectivamente. Rendimento para biomassa é 7,9-8,2%. Estes resultados mostram que deleção do gene KmHOR2 nativo também é efetiva para interromper a capacidade de célula produzir glicerol. Novamente, a deleção deste gene (e a resultante falta de produção de glicerol) não tem efeito sobre crescimento de célula.

Exemplo 4A:Clonagem de gene GPD1 nativo de I. orientalis junto com região flanqueante à montante e à jusante

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36/53 [00109]Genes glicerol-3-fosfato desidrogenase conhecidos de várias espécies de leveduras (S. cerevisiae, K. Marxianus, Y. lipolytica, P. jadinii, D. hansenii e C. glabrata) são alinhados e regiões que são altamente conservadas entre os vários genes são identificadas. Dois conjuntos de iniciadores degenerados foram desenhados nestas regiões de alta homologia. Estes conjuntos são identificados como SEQ ID NO. 24 e SEQ ID NO. 25, e SEQ ID NO. 26 e SEQ ID NO. 27, respectivamente. PCR é realizada usando o primeiro conjunto de iniciadores e ADN genômico de L. orientalis como o molde, e um produto de ~200 pb é obtido como esperado. PCR é novamente realizada usando o segundo conjunto de iniciadores e ADN genômico de I. orientalis como o molde, e um produto de ~400 pb é obtido como esperado. Os dois produtos de PCR são purificados com gel e seqüenciados usando os mesmos iniciadores. Usando a seqüência parcial assim obtida, iniciadores são desenhados para caminhada de genoma. Caminhada de genoma é realizada usando o BD Clontech Genome Walking Kit de acordo com as instruções do fabricante, usando iniciadores de PCR primários identificados como SEQ ID NO. 28 e SEQ ID NO. 29 e iniciadores de PCR aninhados identificados como SEQ ID NO. 30 e SEQ ID NO. 31. Seqüências obtidas de ambas caminhadas de genoma à montante e à jusante são linhadas e fundidas com a seqüência parcial previamente obtida para construir o gene glicerol-3-fosfato desidrogenase de I. orientalis.

Exemplo 4B:Construção de um plasmídeo (pMM28, Fig. 5) contendo o cassete de gene KmCYB2 entre seqüências de repetição direta de K. thermotolerans.

[00110]O inteiro cassete de gene CYB2 (KmCYB2) de K. marxianus, incluindo regiões promotoras e terminadoras, é amplificado PCR a partir de ADN genômico de um K. marxianus tipo selvagem linhagem designada como CD21, com introdução de sítios de restrição BamHI e SalI, através de PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33. O produto de PCR é ligado a um vetor comercial designado como pUC18 (de Invitrogen Corp., Carlsbad, Ca, USA) que é diPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 53/87

37/53 gerido com BamHI e SalI. O plasmídeo resultante é designado como pMM25.

[00111]Uma seqüência de 705 pb identificada como SEQ ID NO. 34 é amplificada por PCR a partir de ADN genômico de K. thermotolerans, com introdução de sítios de restrição SphI e SalI, usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 35 e SEQ ID NO. 36. Esta seqüência de K. thermotolerans não codifica qualquer proteína ativa. Plasmídeo pMM25 é digerido com SphI e SalI e a seqüência de K. thermotolerans é ligada ao mesmo à montante (5') do cassete KmCYB2 para formar um plasmídeo designado como pMM27.

[00112]Uma seqüência de K. thermotolerans idêntica é amplificada por PCR com adição de sítios de restrição BamHI e XmaI, usando primers identificados como SEQ ID NO. 37 e SEQ ID NO. 38. Plasmídeo pMM27 é digerido com BamHI e XmaI e a seqüência de K. thermotolerans é ligada ao mesmo à jusante (3') a partir do cassete KmCYB2 para formar um plasmídeo designado como pMM28 (Fig. 5). Plasmídeo pMM28 contém o cassete KmCYB2 flanqueado por seqüências de repetição direta de K. thermotolerans, ambas orientadas na mesma direção.

Exemplo 4C:Construção de um plasmídeo (pMI321, Fig. 7) contendo um cassete de gene higromicina e um cassete de gene LDH de L. helveticus [00113]Um fragmento de sonda de 920 pb do gene PGK1 de C. sonorensis é obtido de ADN genômico de C. sonorensis na mesma maneira como descrito no Exemplo 22 de WO 02/042471, usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 39 e SEQ ID NO. 40. ADN genômico é isolado de uma linhagem de I. orientalis em crescimento e re-suspenso em Tris-HCl 10 mM + EDTA 1 mM (pH 8) (TE). O ADN genômico de I. orientalis é cortado com HindIII e um Southern blot é prpearado e hibridizado usando processos padrões com o gene PGK1 de C. sonorensis como uma sonda. Fragmentos de tamanho de ~2 kb são isolados de gel agarose e clonados em um plasmídeo de corte HindIIIpara gerar uma biblioteca fracionada em tamanho, que é transformada em E. coli. Hibridização de col'^Aonia da biblioteca fraciPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 54/87

38/53 onada em tamanho com a sonda PGK1 resulta em isolamento de um plasmídeo contendo um fragmento HindIII com maioria das seqüências codificando proteína

PGK1 (IoPGK1) de I. orientalis mas nenhuma seqüência promotora, como verificado através de seqüenciamento.

[00114]Fragmentos genômicos contendo a região promotora IoPGK1 são obtidos com amplificação PCR mediada por ligação (Mueller, P.R. e Wold, B. 1989, “In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR”. Science 246:780-786). Uma mistura de um ligador identificado como SEQ ID NO. 41 e um ligador identificado como SEQ ID NO. 42 é ligada a ADN genômico de I. orientalis digerido com HaeIII com T4 ADN ligase (New England BioLabs). Amostras das misturas de ligação são usadas como moldes para reações PCR de 50 gL contendo 0,1 gM de um iniciador identificado como SEQ ID NO. 43 e 1 gM de um iniciador identificado como SEQ ID NO. 44. A mistura de reação é aquecida a 94^oC por 3 minutos após 2 U de Dynazyme EXT serem adicionadas. As reações são são feitas ciclos 30 vezes como se segue: 1 minuto a 94^oC, 2 minutos a 68^o e 2 minutos a 72^oC, com uma extensão final de 10 minutos a 72^oC. Uma amostra diluída desta primeira amplificação PCR é usada como o molde em uma reação PCR aninhada (50 gL) contendo 0,05 gM de um iniciador identificado como SEQ ID NO. 45 e 0,5 gM de um iniciador identificado como SEQ ID NO. 46. A mistura de reação é aquecida a 94^oC por 3 minutos após 2 U de Dynazyme EXT serem adicionadas. As reações são feitas ciclos 30 vezes como se segue: 1 minuto a 94^oC, 2 minutos a 67^oC e 2 minutos em 72^oC, com uma extensão final de 10 minutos a 72^oC.

[00115]Um fragmento de PCR de ~600 pb é isolado e seqüenciado. Iniciadores aninhados identificados como SEQ ID NO. 47 e SEQ ID NO. 48 são desenhados e usados em uma amplificação PCR mediada com ligação junto com oligonucleotídeos identificados como SEQ ID NO. 49 e SEQ ID NO. 50 similarmente como acima, exceto que ADN de I. orientalis digerido com SspI é usado e a PCR é realizada

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39/53 usando uma temperatura de anelamento de 65^oC.

[00116]A região promotora PGK1 de I. orientalis é amplificada por PCR usando primers identificados como SEQ ID NO. 51 e SEQ ID NO. 52 e o ADN genômico de I. orientalis como o molde. O fragmento é enchido usando a enzima Klenow e então cortado com XbaI. Um fragmento de 633 pb é isolado com gel e ligado a um fragmento de 4428 pb obtido por digestão de um plasmídeo designado como pMI270 (descrito em Fig. 4 de WO 03/049525) com XhoI, enchendo o fragmento usando a enzima Klenow e dNTP 0,1 mM, e digerindo com XbaI. Plasmídeo pMI270 contém o gene higromicina de E. coli ligado a um promotor PGK1 de C. sonorensis e um terminador GAL10 de S. cerevisiae. O resultante plasmídeo é designado pMI318 (Fig. 6). Plasmídeo pMI318 contém o gene higromicina de E. coli sob o controle do promotor PGK1 de I. orientalis e o terminador GAL10 de S. cerevisiae.

[00117]O promotor PGK1 de I. orientalis é amplificado por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 53 e SEQ ID NO. 54 e ADN genômico de I. orientalis como o molde. O fragmento é enchido usando a enzima Klenow e dNTP 0,1 mM, e então corte com NcoI. Um fragmento de 633 pb é isolado com gel. Plasmídeo pVR1 (descrito em WO 03/102152, Figura 7) contém o gene LDH de L. helveticus sob o controle do promotor TEF1 de S. cerevisiae e o terminador CYC1 de S. cerevisiae. Plasmídeo pVR1 é digerido com XhoI, enchido usando a enzima Klenow, e corte com NcoI. Um fragmento de 7386 pb de plasmídeo pVR1 é ligado ao fragmento de promotor IoPGK1 de 633 pb. O plasmídeo resultante é designado pMI320. Plasmídeo pMI320 contém o gene LDH de L. helveticus sob o controle do promotor IoPGK1 e terminador CYC1 de S. cerevisiae.

[00118]Plasmídeos pMI318 e pMI320 são digeridos com ApaI e NotI. Um fragmento de 5008 pb de plasmídeo pMI318 é ligado a um fragmento de 1995 pb de plasmídeo pMI320 para formar plasmídeo pMI321 (Fig. 7).

[00119]O gene higromicina (e seu terminador) é posicionado sobre plasmíPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 56/87

40/53 deo pMI321 entre duas cópias do promotor IoPGK1, que servem como seqüências de repetição direta.

Exemplo 4D:Construção de um plasmídeo (pMI355, Fig. 8) tendo o cassete de gene higromicina de E. coli, o cassete de gene LDH de L. heleticus, e a região flanqueante 5' IoPDC1A [00120]Uma biblioteca genômica de I. orientalis tipo selvagem linhagem ATCC PTA-6658 é construída no vetor cosmídeo SuperCos1 (Stratagene) de acordo com instruções providas pelo fabricante. Seqüências semelhantes PDC são amplificadas por PCR a partir de ADN genômico da linhagem com iniciadores designados como SEQ ID NO. 55 e SEQ ID NO. 56. Um fragmento de 700 pb de um gene PDC é amplificado. A biblioteca genômica é separada usando técnicas de hibridização com fragmentos de PCR marcados como a sonda como descrito em WO 03/049525 e clones cosmídeos contendo o gene PDC são isolados e seqüenciados. A região 5' PDC1A de I. orientalis a partir de 1000 pb para 167 pb à montante do início do quadro de leitura aberto é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 57 e SEQ ID NO. 58 e o ADN cosmídeo PDC1A de I. orientalis como o molde. O fragmento é cortado com SalI e SacI. Um fragmento de 836 pb é isolado com gel e ligado a um fragmento de 6992 pb obtido por digestão de plasmídeo pMI321 ((Fig. 7, Exemplo 4C) com SalI e SacI. O resultante plasmídeo é chamado pMI355 (Fig. 8).

Exemplo 4E:Construção de plasmídeos (pMI356 e pMI357 (Fig. 9)) contendo a região flanqueante 5' IoPDC1A, o cassete de gene higromicina de E. coli, o cassete de gene LDH de L. helveticus, e uma região flanqueante 3' IoPDC1A.

[00121]A região 3' PDC1A de I. orientalis correspondendo a seqüências de

524 pb à montante para 217 pb à jusante do códon de ruptura de tradução PDC é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 59 e SEQ

ID NO. 60 e o ADN cosmídeo PDC1A de I. orientalis (Exemplo 4D) como o molde. O

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41/53 fragmento é cortado com Apal e Smal. Um fragmento de 630 pb é isolado com gel e ligado a um fragmento de 7809 pb obtido por digestão de plasmídeo pMI355 (Fi. 8,

Ex. 4D) com ApaI e SmaI. O resultante plasmídeo é chamado pMI357 (Fig. 9). Ele contém cassetes higromicina e LDH de plasmídeo pMI355 entre o flanco 5' e uma porção do flanco 3' do gene IoPDC1A.

[00122]Plasmídeo pMI356 é construído da mesma maneira, exceto uma diferente seção da região 3' PDC1A de I. orientalis é usada.

Exemplo 4F:Construção de plasmídeo pMI433 (Fig. 10 contendo a região flanqueante 5' IoPDC1A, um cassete de gene ScMEL5, o cassete de gene LDH de L. helveticus e a região flanqueante 3' IoPDC1A.

[00123]O promotor PGK1 de I. orientalis é amplificado por PCR usando primers identificados como SEQ ID NO. 61 e SEQ ID NO. 62 e o ADN genômico de I. orientalis como o molde. O fragmento é enchido usando a enzima Klenow e dNTP 0,1 mM, e então cortado com SphI. Um fragmento de 669 pb é isolado com gel. Um plasmídeo designado como pMI233 (descrito na Fig. 23C de WO 03/049525) é cortado com XhoI. O fragmento é enchido com a enzima Klenow e cortado com SphI. Os fragmentos de 4534 pb e 669 pb são ligados e o resultante plasmídeo é chamado pMI319. Plasmídeo pMI319 contém o gene MEL5 (ScMEL5) de S. cerevisiae e a região promotora IoPGK1.

[00124]Plasmídeo pMI319 é cortado com ApaI, tornado de extremidade embotada com T4 polimerase, e cortado com NotI. Um fragmento de 2317 pb é isolado com gel. Ele é ligado a um fragmento de 6498 pb obtido através de digestão de plasmídeo pMI357 (Exemplo 4E) com SalI, tornando o mesmo embotado na extremidade com a enzima Klenow e então cortando com NotI. O resultante plasmídeo contém o gene ScMEL5 (com seu terminador nativo) no lugar do gene higromicina de plasmídeo pMI357. O resultante plasmídeo é designado pMI433 (Fig. 10).

Exemplo 4G:Construção de plasmídeos pMI449 (Fig. 11) e pMI454 (Fig. 12)

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42/53 contendo região flanqueante 5' CYB2 de I. orientalis, cassete de gene ScMEL5 entre seqüências de reptição direta de K. thermotolerans e região flanqueante 3' CYB2 de

I. orientalis.

[00125]Plasmídeo pMM28 (Fig. 5, Ex. 4B) é digerido com BamHI, enchido com a enzima Klenow, e digerido com SalI. O fragmento de 4077 pb assim obtido é ligado a um fragmento NotI (enchido com enzima Klenow)-SalI de 2317 pb de pMI433 (Fig. 10, Ex. 4F). O resultante plasmídeo é designado pMI445.

[00126]A região flanqueante 3' do gene L-lactato:ferricitocromo c óxido redutase (IoCYB2A) de I. orientalis (correspondendo a seqüências 90 a 676 pb à jusante do início do quadro de leitura aberto previsto) é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 63 e SEQ ID NO. 64, usando um clone cosmídeo CYB2-2 como um molde. O produto de PCR é digerido com SacI e SmaI e o fragmento de 607 pb é ligado ao fragmento SacI-SmaI de 6386 pb de plasmídeo pMI445. O resultante plasmídeo é designado pMI448.

[00127]A região flanqueante 5' IoCYB2A (correspondendo a seqüências de 913 a 487 pb à montante do início do quadro de leitura aberto previsto) é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 65 e SEQ ID NO. 66, novamente usando o clone cosmídeo CYB2-2 como um molde. O produto de PCR é digerido com SphI e o fragmento de 454 pb é ligado ao fragmento de 6993 pb SphI obtido através de digestão parcial de pMI448. O resultante plasmídeo é designado pMI449 (Fig. 11).

[00128]A região flanqueante 5' IoCYB2A (correspondendo a seqüências de 466 a 7 pb à montante do quadro de leitura aberto previsto) é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 67 e SEQ ID NO. 68, novamente usando o clone cosmídeo CYB2-2 como o molde. O produto de PCR é digerido com SphI e o fragmento de 493 pb é ligado ao fragmento SphI de 6993 pb obtido através de digestão parcial de plasmídeo pMI448. O resultante plamídeo é designado

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43/53 pMI453.

[00129]A região flanqueante 3' IoCYB2A (correspondendo a seqüências de 402 pb à montante a 77 pb à jusante do códon de ruptura previsto) é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 69 e SEQ ID NO. 70, usando o cosmídeo CYB2-2 como um molde. O produto de PCR é digerido com ApaI e SmaI e o fragmento de 506 pb é ligado ao fragmento ApaI-SmaI de 6886 pb de plasmídeo pMI453. O resultante plasmídeo é designado pMI454 (Fig. 12).

Exemplo 4H:Construção de um plasmídeo (pBH165, Fig. 13) contendo um fragmento à montante do gene IoGPD1, uma primeira seção de repetição direta de

K. thermotolerans, um cassete de gene MEL5, uma segunda seção de repetição direta de K. thermotolerans, e um fragmento à jusante do gene IoGPD1.

[00130]Plasmídeo pMI449 é digerido com NdeI e SbfI para excisar a homologia flanqueante CYB2A. Um fragmento de 6,8 kbp é purificado com gel e desfosforilado. Um fragmento de 302 pb do gene IoGPD1 de Exemplo 4A (correspondendo a pares de bases 1-302 a partir de códon de inicíco do gene) é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 71 e SEQ ID NO. 72. O produto de PCR é purificado com gel, digerido com NdeI e SbfI, e ligado ao fragmento de 6,8 kbp de plasmídeo pMI449 para produzir plasmídeo pBH164. Plasmídeo pBH164 é então digerido com XmaI e EcoRI para excisar a homologia flanqueante CYB2A 3'. Um fragmento de 6,5 kbp é purificado com gel e desfosforilado. Um fragmento de 346 pb do gene IoGPD1 de Exemplo 4A (correspondendo a pares de bases 322-668 a partir do códon de partida) é amplificado por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 73 e SEQ ID NO. 74. O produto de PCR é purificado com gel, digerido com XmaI e EcoRI, e ligado ao fragmento de 6,5 kbp obtido de pBH164 para produzir pBH165 (Fig. 13).

[00131]Plasmídeo pBH165 contém, em ordem de transcrição, o fragmento de 302 pb do gene IoGPD1, uma primeira seção de repetição direta de K. thermotoPetição 870170049022, de 13/07/2017, pág. 60/87

44/53 lerans, um cassete de gene MEL5, uma segunda seção de repetição direta de K.

thermotolerans, e o fragmento de 346 pb do gene IoGPD1. Ele é desenhado para inserção no locus do gene IoGPD1 nativo (com ruptura do gene), seguido por um loop-out do cassete de gene MEL5.

Exemplo 4I:Geração de um mutante de I. orientalis (CD1184) com genes IoPDC1A e IoPDC1B deletados e gene LhLDH integrado em uma etapa através de transformação de linhagem de I. orientalis tipo selvagem com plasmídeo pMI356 (Ex. 4F).

[00132] I. orientalis tipo selvagem linhagem ATCC PTA-6658 é transformada com plasmídeo pMI356 usando processos padrões. Linhagens transformadas que crescem sobre placas de higromicina são cultivadas. Um transformante que não produz etanol é selecionado para Southern analysis, que confirma a deleção de ambos alelos IoPDC1A e inserção de pelo menos uma cópia do gene LhLDH. Esta linhagem é designada CD1184.

Exemplo 4J:Geração de linhagem mutante de I. orientalis (CD1496) através de transformação sucessiva de linhagem CD1184 (Ex. 4I) com plasmpMI449 (Ex. 4G, Fig. 11) e pMI454 (Ex. 4G, Fig. 12), seguido por mutagênese.

[00133]Linhagem CD1184 é transformada com plasmídeo pM449 usando o processo de acetato de lítio e transformantes (colônias azuis) são selecionados baseado em atividade melibiase sobre placas YPD X-a-gal. A substituição do gene IoCYB2A de linhagem CD1184 é confirmada por PCR de colônia e análise Southern em alguns dos transformantes. O marcador MEL5 é looped out de um daqueles transformantes via um evento de recombinação homóloga através de seqüências de repetição de K. thermotolerans, como confirmado por análise Southern. O segundo alelo CYB2A é então deletado deste transformante usando plasmídeo pMI454. Transformantes são analisados por PCR de colônia para a ausência de um produto de PCR específico de CYB2A de 1000 pb. O marcador MEL5 de plasmídeo pMI454

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45/53 é looped out de um transformante tendo uma deleção do segundo alelo CYB2A via recombinação como antes. Este transformante é designado linhagem CD1436. Linhagem CD1436 tem uma deleção de ambos genes PDC1 (com substituição através de um cassete de gene L-LDH funcional), e uma deleção de cada um de seus dois genes IoCYB2 nativos.

[00134]Linhagem CD1436 é submetida a mutagênese SEM usando as condições mostradas no Exemplo 1A, exceto que as condições de exposição são 8 pL por 1 hora. Células mutagenizadas são deixadas em recuperação por 6 horas em 200 pL de meio YP + 20 g/L glicose e então revestidas sobre placas de PDA + 35 g/L de ácido lático e incubadas por uma semana a 30^oC. Uma linhagem que produz mais lactato e menos glicerol que linhagem CD1436 é designada linhagem CD1496.

Exemplo 4K:Transformação de linhagens CD1184 (Ex. 4I) e CD1496 (Ex. 4J) com plasmídeo pBH165 (Ex. 4H, Fig. 13), seguido por loop-out do marcador de seleção para produzir linhagens transformantes CD1667 e CD1671, respectivamente, que têm um alelo GPD1 simples deletado.

[00135]Linhagem CD1184 é crescida e transformada com 5 pg do fragmento de 4,4 kbp obtido através de digestão de plasmídeo pBH165 com NdeI e EcoRI. Transformantes são selecionados sobre placas de base nitrogênio levedura (YNB) + 2% melibiose revestidas com x-a-gal(--4-cloro-3-indolil-aD-galacto piranosídeo). Transformantes de cor azul são visíveis após ~4 dias de crescimento a 30^oC. Oito transformantes são retirados e revestidos para colônias simples sobre placas de YP + 20 g/L de glicose contendo x-a-gal. Uma colônia azul simples para cada transformante é retirada e novamente feita tira para placas de YP + 20 g/L de glicose. ADN genômico é isolado dos transformantes. Ruptura de um alelo do gene IoGPD1 é verificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 75 e SEQ ID NO. 76. Cinco transformantes exibem o esperado produto de ~2 kb. Um daqueles transformantes é designado como linhagem CD1655. Ruptura de uma cópia do gene

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IoGPD1 nativo é ainda verificada por PCR usando iniciadores designados como

SEQ ID NO. 77 e SEQ ID NO. 78.

[00136]Linhagem CD1655 é crescida por vários rounds em YP + 100 g/L glicose a 30^oC. Uma série de diluições é revestida sobre placas YP + 20 g/L (??) revestidas com x-a-gal, e crescidas por toda noite a 30^oC. Uma colônia branca (indicativa do loop-out do cassete marcador MEL 5) é selecionada e novamente feita listra para placas de YP + 20 g/L glicose + x-a-gal. Uma colônia branca é selecionada. Ruptura de um alelo do gene IoGPD1 nativo é verificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 69 e SEQ ID NO. 80. Este transformante é designado como linhagem CD1667.

[00137]Linhagem CD1496 é transformada da mesma maneira. Um transformante exibindo a esperada banda de ~2 kbp em PCR é designada como linhagem CD1657. Ruptura de um alelo do gene IoGPD1 nativo é verificada por PCR como descrito para linhagem CD1655. Linhagem CD1657 é ainda crescida por vários rounds, e uma colônia mostrando uma deleção do cassete de gene marcador MEL5 é selecionada e designada como linhagem CD1671. Ruptura 9 de um alelo do gene IoGPD1 nativo é verificada por PCR como antes.

Exemplo 4L:Transformação de linhagens CD1667 (Ex. 4K) e CD1671 (Ex. 4K) com plasmídeo pBH165 (Ex. 4H, Fig. 13) para produzir linhagens transformantes CD1688 e CD1690, respectivamente, com ambos alelos IoGPD1 deletados.

[00138]Linhagem CD1667 é transformada com 5 ,ug de um fragmento de 4,4 kbp obtido através de digestão de plasmídeo pBH165 com NdeI e EcoRI. Transformantes são selecionados sobre placas de YNB + 2% melibiose revestidas com x-agal. Transformantes de cor azul são visíveis após ~4 dias de crescimento a 30^oC. Dez transformantes são retirados e revestidos para colônias simples sobre placas de YP + 20 g/L de glicose contendo x-a-gal. Uma colônia azul simples para cada transformante é retirada e novamente feita listra para placas de YP + 20 g/L glicose. ADN

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47/53 genômico é isolado dos transformantes. Ruptura do segundo alelo do gene IoGPD1 é verificada em três transformantes por PCR usando iniciadores identificados como

SEQ ID NO. 81 e SEQ ID NO. 82. Um destes transformantes é designado como linhagem CD1688.

[00139]Linhagem CD1671 é transformada da mesma maneira. PCR mostra que o segundo alelo do gene IoGPD1 é interrompido em um transformante, que é designado linhagem CD1690.

Exemplo 5:Cultivação de cultura de batelada micro-aeróbica de linhagens CD1184 (Ex. 4I) e CD1688 (Ex. 4L) em uma OUR de 5,5-5,6.

[00140]Um reator de cultura de batelada de estágio simples contendo um meio definido que inclui sulfato de amônio, diidrogeno fosfato de potássio, e sulfato de magnésio, elementos em traços, vitaminas, agente antiespumante, e cerca de 50 g/L de glicose é inoculado com 1 mL de linhagem CD1688. O pH do meio é ajustado para cerca de 3,5 antes de adição das células. O pH da cultura é deixado cair para 3,0 quando células crescem e começam a produzir ácido lático. A seguir, pH é mantido em cerca de 3,0 através de adição de hidróxido de potássio. Glicose é alimentada para a fermentação em cerca de 1-2 g/L/h até um total de 136,1 g/L de glicose terem sido adicionados. Células são cultivadas a 30oC sob condições de aeração que conduzem a uma taxa de tomada de oxigênio de cerca de 5,5-5,6 mmoles/L/h. Linhagem CD1688 produz lactato em uma taxa de 1,02 g/L-h até o título de lactato ser aproximadamente 70 g/L. Rendimento de lactato através deste ponto é cerca de 74%. Produção para esta linhagem é interrompida após 77 horas, em cujo momento o caldo de fermentação contém 15,3 g/L de glicose. Taxa de produção total de lactato é de 1,06 g/L-h, e rendimento total para lactato é de 70%. Rendimentos para piruvato, glicerol e dióxido de carbono para linhagem CD1688 são 1,9%, 0% e 23,7%, respectivamente. Rendimento para biomassa é de 3,5%.

[00141]Para comparação, linhagem CD1184 (não um exemplo da invenção)

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48/53 é cultivada sob condições similares. Linhagem CD1184 produz lactato em uma taxa de 1,24 g/L-h até o título de lactato ser aproximadamente 70 g/L. Rendimento de lactato através deste ponto é de cerca de 74%. Produção para esta linhagem é interrompida após 77 horas, em cujo momento o caldo de fermentação contém 15,3 g/L de glicose. Taxa de produção total de lactato é de 1,06 g/L-h, e rendimento total para lactato é de 70%. Rendimentos para piruvato, glicerol e dióxido de carbono para linhagem CD1184 são 2,1%, 9,3% e 15,9%, respectivamente. Rendimento para biomassa é de 3,2%.

[00142]Estes resultados mostram que sob estas condições de fermentação, deleção dos genes IoGPD1 nativos evita que a célula produza quantidades mensuráveis de glicerol. Como antes, a deleção deste gene (e a resultante falta de produção de glicerol) tem pequeno ou nenhum efeito sobre crescimento de célula.

Exemplo 6:Cultivo de cultura de batelada micro - aeróbica de linhagens CD1184 (Ex. 4I) e CD1688 (Ex. 4L) em uma OUR de 9,9-10.

[00143]Linhagens CD1688 e CD1184 são cultivadas separadamente na maneira genérica descrita no exemplo 5, exceto que condições de aeração são selecionadas para conduzirem a uma taxa de tomada de oxigênio de 9,9-10,0 mmoles/L/h, e nenhuma glicose é alimentada para o sistema durante a cultura. Cascas de levedura são adicionadas à cultura de linhagem CD1688.

[00144]Sob estas condições, linhagem CD1184 produz lactato em uma taxa de 1,87 g/L-h até o título de lactato ser aproximadamente70 g/L. Rendimento de lactato através deste ponto é de cerca de 73%. Produção para esta linhagem é interrompida após 67,5 horas, em cujo momento a concentração de glicose no caldo de fermentação foi reduzida de 60 g/L para 2,1 g/L. Taxa de produção total de lactato é de 1,43 g/L-h, e rendimento total para lactato é de 70%. Rendimentos para piruvato, glicerol e dióxido de carbono para linhagem CD1184 são 2,1%, 5,7% e 21,5%, respectivamente. Rendimento para biomassa é de 4,4%.

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49/53 [00145]Linhagem CD1688 produz lactato em uma taxa de 1,68 g/L-h até o título de lactato ser aproximadamente 70 g/L. Rendimento de lactato através deste ponto é cerca de 80%. Produção para esta linhagem é interrompida após 78 horas, em cujo momento a concentração de glicose no caldo de fermentação foi reduzida de 53,5 g/L para 4,8 g/L. Taxa de produção total de lactato é de 1,26 g/L-h, e rendimento total para lactato é de 77%. Rendimentos para piruvato, glicerol e dióxido de carbono para linhagem CD1688 são 1,2%, 0% e 23,2%, respectivamente. Rendimento para biomassa é de 5,9%. Como antes, estes resultados mostram que sob estas condições de fermentação, deleção dos genes IoGPD1 nativos evita que a célula produza quantidades mensuráveis de glicerol e que a deleção deste gene (e a resultante falta de produção de glicerol) não tem efeito sobre crescimento de célula. Em adição, deleção de IoGPD1 aperfeiçoa rendimento total de lactato.

Exemplo 7:Cultivos de cultura em batelada micro - aeróbica de linhagem CD1690 (Ex. 4L) em uma OUR de 5-6.

[00146]Linhagem CD1690 é cultivada na maneira genérica descrita no exemplo 5, exceto que condições de aeração são selecionadas para conduzirem a uma taxa de tomada de oxigênio de 5,75 mmoles/L/h, e o meio de fermentação é YP + 70 g/L glicose.

[00147]Sob estas condições, linhagem CD1690 produz lactato em uma taxa de 0,66 g/L-h até o título de lactato ser aproximadamente 70 g/L. Rendimento de lactato através deste ponto é de cerca de 78%. Produção para esta linhagem é interrompida após 121 horas, em cujo momento a concentração de glicose no caldo de fermentação foi reduzida para 23,8 g/L (fora de 127,9 g/L providos para a cultura). Taxa de produção total de lactato é de 0,61 g/L-h, e rendimento total para lactato é de 77%. Rendimentos para piruvato, glicerol, e dióxido de carbono são 0%, 0% e 31,1%, respectivamente. Rendimento para biomassa é de 2,4%. Novamente, estes resultados mostram que sob estas condições de fermentação, deleção de ambos

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50/53 alelos IoGPD1 nativos evita que a célula produza quantidades mensuráveis de glicerol, e tem pequeno ou nenhum efeito sobre crescimento de célula.

[00148]A linhagem CD1690 é cultivada mais duas vezes na maneira genérica descrita no Exemplo 5 (usando o meio definido ali descrito), exceto que a OUR é de 5,2 mmoles/L/h e glicerol é adicionado ao caldo de fermentação. Na primeira corrida, 0,1 g/L de glicerol é adicionado e 1,0 g/L de glicerol é adicionado na segunda corrida.

[00149]Quando 0,1 g/L de glicerol é adicionado, linhagem CD1690 produz lactato em uma taxa de 0,74 g/L-h até o título de lactato ser aproximadamente 70 g/L. Rendimento de lactato através deste ponto é de cerca de 78%. Produção para esta linhagem é interrompida após 121 horas, em cujo momento a concentração de glicose no caldo de fermentação foi reduzida para 10,2 g (fora de 117,8 g/L providos para a cultura). Taxa de produção total de lactato é de 0,68 g/L-h, e rendimento total para lactato é de 76%. Rendimentos para piruvato, glicerol e dióxido de carbono são 0,2%, 0% e 25,3%, respectivamente. Rendimento para biomassa é de 4,1%.

[00150]Resultados muito similares são obtidos quando 1,0 g/L de glicerol é adicionado.

[00151]Estes resultados mostram inesperadamente que a adição de glicerol ao meio de fermentação tem pequeno ou nenhum efeito sobre a habilidade destes transformantes crescerem e produzirem lactato, à despeito de ruptura da habilidade nativa da célula para produzir glicerol.

Exemplo 8A:Construção de um plasmídeo (pTMC61 (Fig. 14)) contendo a região flanqueante 5' IoGPD1, o cassete de gene higromicina de E. coli entre repetições diretas, e a região flanqueante 3' IoGPD1.

[00152]O cassete de gene higromicina é amplificado por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 83 e SEQ ID NO. 84, com plasmídeo pMI356 (Ex. 4E, ver Fig. 9) como o molde. Condições de PCR são 95^oC por 5 minutos (uma

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51/53 vez), 30 ciclos de 95^oC (30 segundos), 56^oC (30 segundos) e 72^oC (2 minutos), seguido por um ciclo de 72^oC por 10 minutos. O resultante produto de PCR é digerido com SpeI e SalI, e ligado sobre plasmídeo pBH165 (Ex. 4H, Fig. 13), que foi similarmente digerido, para produzir plasmídeo pTMC61 (Fig. 14).

Exemplo 8B:Transformação de linhagem de I. orientalis tipo selvagem selecionada com plasmídeo pBH165 (Ex. 4H, Fig. 13), seguido por loop-out do marcador de seleção para produzir linhagem transformante CD2624, que tem um alelo GPD1 simples deletado.

[00153] I. orientalis tipo selvagem linhagem ATCC PTA-6658 é crescida por muitas gerações em cultura contínua em um meio contendo uma baixa concentração de glicose e uma alta concentração de ácido lático. Uma célula que cresce bem sob estas condições é isolada e designada como linhagem CD1822. Linhagem CD1822 produz etanol e glicerol quando cultivada em um meio contendo glicose como a fonte de carbono. A linhagem CD1822 é desenvolvida e transformada com plasmídeo pBH165 da mesma maneira como descrito no Exemplo 4K. Transformantes são selecionados sobre placas de base nitrogênio levedura (YNB) + 2% melibiose revestidas com x-a-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galacto piranosídeo), como descrito no exemplo 4K, com uma colônia azul sendo retirada e feita novamente listra para placas de YP + 20 g/L de glicose. ADN genômico é isolado do transformante, e analisado para integração da construção de deleção através de dois conjuntos de reações PCR. O primeiro destes usou iniciadores designados como SEQ ID NO. 85 e SEQ ID NO. 86, e o segundo destes foi realizado com iniciadores designados como SEQ ID NO. 87 e SEQ ID NO. 88. Estes produziram produtos de PCR de 2,0 kbp e 1,4 kbp, respectivamente, indicando que um dos alelos GPD1 foi rompido. Uma terceira reação PCR é realizada, usando iniciadores designados como SEQ ID NO. 85 e SEQ ID NO. 88; isto produz um produto de 0,8 kbp indicando que um alelo GPD1 não-rompido está ainda presente no transformante. O transformante é designado

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52/53 como linhagem CD2624.

Exemplo 8C:Transformação de linhagem CD2624 (Ex. 8B) com plasmídeo pTMC61 (Ex. 8A, Fig. 14) para produzir linhagens transformantes CD2627, tendo ambos alelos IoGPD1 deletados [00154]PCR é realizada usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 89 e SEQ ID NO. 90, com plasmídeo pTMC61 como o molde. Um fragmento de 4,1 kbp é obtido, e é usado para transformar linhagem CD2624. Transformantes são selecionados sobre YPD + 300 pg/mL de higromicina. ADN genômico é isolado de 100 dos transformantes, e usado como um molde em três conjuntos de reações PCR. O primeiro usa iniciadores identificados como SEQ ID NO. 91 e SEQ ID NO. 88, e produz um produto de 1,5 kbp em 30 dos transformantes. Uma segunda reação PCR é conduzida sobre ADN genômico daqueles 30 transformantes, usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 85 e SEQ ID NO. 92. Dez linhagens exibiram o esperado produto de 2,5 kbp. ADN genômico daquelas dez linhagens é então analisado usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 85 e SEQ ID NO. 88. Duas linhagens que não produzem um fragmento de 0,8 kbp têm ambos alelos GPD1 rompidos. Estas são testadas para crescimento sobre placas de YNB + 2,0% melibiose. Uma linhagem é capaz de crescer, e é designada como linhagem CD2627.

Exemplo 8D:Cultivo micro - aeróbico de linhagem CD1822, linhagem CD2624 (Exemplo 8B) e linhagem CD2627 (Exemplo 8C).

[00155]Linhagens CD1822, CD2624 e CD2627 são cultivadas em fermentações em frasco de agitação micro - aeróbica em duplicata. As linhagens são crescidas por toda noite em 25 mL de um meio definido contendo ~100 g/mL de glicose, a 30^oC e agitação de 250 rpm em frascos defletidos de 250 mL. O meio definido é como descrito em Peter M. Bruinenberg, Johannes P. Van Dijken and W. Alexander Schefferes, 1983, An Enzymatic Analysis of NADPH Production and Consumption in

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Candida utilis, J. General Microbiology vol. 129, pp. 965-971, exceto para a presença de adicional glicose como indicado e um aumento em ácido nicotínico para 5 mg/L.

[00156]As resultantes culturas são usadas para inoculação de 50 mL do meio definido contendo 100 g/L de glicose em frascos defletidos de 250 mL para uma OD600 de 0,2. Estes frascos são então incubados em 100 rpm por 22 horas a 30^oC. O meio é então analisado por HPLC para glicose, glicerol e etanol. Rendimento para biomassa também é determinado.

[00157]Linhagem CD1822 consome toda glicose durante a cultura de 22 horas, produzindo 6,0 g/kg de glicerol, 34,54 g/kg de etanol e biomassa para uma OD600 de 14,8.

[00158]Linhagem CD2624, que tem uma ruptura de um alelo GPD1, consome toda glicose, produzindo 5,88 g/kg de glicerol e 35,25 g/kg de etanol. Biomassa é produzida para uma OD600 de 14,5.

[00159]Linhagem CD2627, que tem uma ruptura de ambos alelos GPD1, consome 12,39 g/kg da glicose durante 22 horas. Produção de glicerol é de 0,34 g/kg. Produção de etanol é de 23,06 g/kg e biomassa é produzida para uma OD600 de 11,5. Estes resultados indicam que rupturas dos alelos GPD1 em I. orientalis resulta em uma pequena redução em taxas de consumo de glicose, e uma pequena redução em produção de etanol e produção de biomassa, sob estas condições. Entretanto, linhagem CD2627 cresce bem e produz etanol bem, com mínima produção de glicerol. Os resultados ainda indicam que a habilidade dos supressores GPD1 crescerem e produzirem não é dependente da ruptura de atividade PDC ou a adição de um caminho a partir de piruvato para lactato.

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Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Célula de levedura CARACTERIZADA pelo fato de ser selecionada a partir de I. orientalis, K. marxianus, Pichia galeiformis, Pichis sp. YB-4149 (designação NRRL), Candida ethanolica, P. deserticola, P. membranifaciens, P. fermentans, S. kluyveri, K. aestuaryii, K. nonfermentans, K. lactic, K. dobzhanskii, C. sonorensis, K. thermotolerans e C. methanosorbosa, tendo uma deleção ou ruptura de uma via metabólica nativa de diidróxi acetona fosfato para glicerol, em que a deleção ou ruptura da via metabólica nativa inclui (i) uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo, (ii) uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase nativo, ou (iii) uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo e de pelo menos um gene glicerol3-fosfatase nativo.
2. 2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato que contém um cassete de gene LDH funcional e que produz lactato.
3. 3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que contém uma deleção ou ruptura de uma via metabólica nativa de piruvato para etanol.
4. 4. Processo de fermentação CARACTERIZADO pelo fato de que uma célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, é cultivada sob condições de fermentação e na presença de uma fonte de carbono para produzir ácido orgânico ou etanol, em que o rendimento de glicerol é menor que 2% com base no peso da fonte de carbono que é consumida pela célula.
5. 5. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula é cultivada sob condições de fermentação e na presença de uma fonte de carbono para produzir lactato.
6. 6. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que glicerol é adicionado ao meio de fermentação.

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