CN105431520A - 利用表达昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的重组酵母的3-羟基丙酸生产 - Google Patents

利用表达昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的重组酵母的3-羟基丙酸生产 Download PDF

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Abstract

在此提供了重组酵母细胞，这些重组酵母细胞具有主动3-羟基丙酸(3-HP)途径并且进一步包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸编码以下纲的天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)：昆虫纲、双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲。还描述了使用这些重组酵母细胞生产3-HP和丙烯酸的方法。

Description

利用表达昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的重组酵母的3-羟基丙酸生产
参照序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。
背景
涉及到石油的未来供应的忧虑已经推进了在其他原料的可再生能源和可再生资源的领域中的研究。生物燃料(例如，乙醇)和生物塑料(例如，聚乳酸)是可以使用微生物直接从农业来源制造的产品的实例。然后可以使用非酶促化学转化得到另外的希望的产品，例如将乙醇脱水为乙烯。
3-羟基丙酸(3-HP)是一种由美国能源部鉴定为可以通过发酵制造的排名前12的高潜力结构单元化学品之一的三碳羧酸。作为乳酸(2-羟基丙酸)的异构体的3-HP的替代名称包括乙烯乳酸和3-羟基丙酸化物。3-HP是一种有吸引力的可再生平台化学品，来自葡萄糖的理论产量为100％，具有允许它参与不同种化学反应的多种官能团，以及低的毒性。可以将3-HP用作底物来形成若干日用化学品，例如1,3-丙二醇、丙二酸、丙烯酰胺、以及丙烯酸。丙烯酸是一种用来生产丙烯酸酯和超强吸收能力聚合物的大量化学品(>70亿磅/年)，并且目前来源于丙烯的催化氧化。3-HP的发酵性生产将为作为这些商业上有意义的化学品的原料的石油化学产品提供可持续的替代物，从而减少能量消耗、U.S.对外国石油的依赖以及温室气体的产生。
可以使用细菌将糖发酵为有机酸。然而，对于大规模有机酸生产而言，细菌显示出某些缺陷。随着产生有机酸，发酵培养基变得越来越酸性。较低的pH条件实际是优选的，因为所得产物部分地或完全地处于酸形式。然而，大部分产生有机酸的细菌在强酸环境中表现不佳，并且因此当培养基变得更具酸性时，它们死亡或开始产生地如此慢，以至于变得经济上不可行。为了防止这一情况，缓冲培养基以维持较高的pH成为必要。然而，这使得回收有机酸产物更加困难且昂贵。
近年来，围绕使用酵母将糖发酵为有机酸的兴趣已经越来越多。酵母在多种工业发酵中被用作生物催化剂，并且显示出优于细菌的若干优势。虽然许多细菌不能合成它们生长和有效代谢糖所需的某些氨基酸或蛋白质，但是大部分酵母物种可以从无机氮化合物合成它们必需的氨基酸或蛋白质。酵母还不易受噬菌体感染的影响，噬菌体感染可以导致细菌的生产力或整个发酵运行的丧失。
尽管酵母是有机酸生产的有吸引力的候选物，但是它们显示出若干困难。首先，酵母中的途径工程典型地难于细菌。酵母中的酶被分隔在细胞质、线粒体或过氧化物酶体中，而细菌中的酶被合并在细胞质中。这意味着可能需要除去靶向信号，以保证生物合成途径的酶共存于单个细胞内的同一区室中。可能还需要控制途径中间体在这些区室之间的运送，以使至希望的产物的碳流最大化。其次，并不是所有酵母物种都满足大规模经济发酵所必需的标准。事实上，仅有一小部分的酵母具有足够高的体积和特定糖利用率与在较低pH条件下有力生长的能力的组合。美国能源部估计，约2.5g/L/小时的生产率对于若干有机酸(包括，例如，3-HP)的经济发酵而言是必需的(http://www1.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf)。
尽管许多酵母物种天然地将己糖发酵为乙醇，但是即使有也极少数天然地产生显著产量的有机酸。这已导致努力在遗传上修饰各种酵母物种，以产生有机酸。先前已经通过破坏内源性丙酮酸脱羧酶(PDC)基因并插入乳酸脱氢酶(LDH)基因以消除乙醇产生而研发了产生乳酸的遗传修饰的酵母菌株(参见，例如，WO99/14335、WO00/71738、WO02/42471、WO03/049525、WO03/102152、以及WO03/102201)。这一改变将糖代谢从产生乙醇转移至产生乳酸。酵母的发酵产物和途径不同于细菌的发酵产物和途径，并且因此需要不同的工程方法使产量最大化。可能需要消除或减少以便增强有机酸产物产量或纯度的其他天然产品是甘油、乙酸盐(酯)和二醇。遗传改变的酵母菌株中的甘油的减少描述于例如WO07/106524中。
不同于乳酸，3-HP不是在自然界中已知的任何途径的主要终产物，仅仅在一些细菌和真菌中发现了痕量。因此，需要更大量的遗传工程产生生产3-HP的酵母。先前将酿酒酵母菌株工程化为通过乳酸中间体产生非常低水平的3-HP(参见WO02/042418)。然而，野生型酿酒酵母的耐受水平使得它不足以成为3-HP生产的最优宿主。对3-HP高度耐受的酵母细胞描述于WO2012/074818中。然而，在本领域中仍需要进一步以一种更成本有效的方式改进工业规模的3-HP生产。
概述
本申请已经惊人地发现在酵母宿主中表达昆虫纲的天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)导致显著改进的代谢性3-HP生产。因此，在一方面，是包含昆虫天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)的重组酵母细胞，该昆虫天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)如SEQIDNO:162的埃及伊蚊ADC，SEQIDNO:163的五带淡色库蚊ADC、SEQIDNO:164的冈比亚按蚊ADC、SEQIDNO:165的赤拟谷盗ADC、SEQIDNO:166的斯氏毛皮蠹(Attagenussmirnovi)ADC、SEQIDNO:167的豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)ADC、SEQIDNO:168的瑟车利亚果蝇(Drosophilasechellia)ADC、SEQIDNO:169的黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)ADC、SEQIDNO:170的大斑蝶(Danausplexippus)ADC、SEQIDNO:171的亚库巴果蝇(Drosophilayakuba)ADC、SEQIDNO:172的埃瑞克塔果蝇(Drosophilaerecta)ADC、SEQIDNO:173的柑橘凤蝶(Papilioxuthus)ADC、SEQIDNO:174的黑翅果蝇(Drosophilapersimilis)ADC、SEQIDNO:175的家蚕ADC、SEQIDNO:176的嗜凤梨果蝇(Drosophilaananassae)ADC、SEQIDNO:177的漠海威果蝇(Drosophilamojavensis)ADC、SEQIDNO:178的格瑞姆肖果蝇(Drosophilagrimshawi)ADC、SEQIDNO:179的桦尺蠖(Bistonbetularia)ADC、SEQIDNO:180的威尔斯托尼果蝇(Drosophilawillistoni)ADC、SEQIDNO:181的西方蜜蜂ADC、SEQIDNO:182的维尔利斯果蝇(Drosophilavirilis)ADC、SEQIDNO:183的丽蝇蛹集金小蜂(Nasoniavitripennis)ADC、SEQIDNO:184的偏瞳蔽眼蝶(Bicyclusanynana)ADC、SEQIDNO:185的印度跳蚁(Harpegnathossaltator)ADC、SEQIDNO:186的切叶蚁(Acromyrmexechinatior)ADC、SEQIDNO:187的佛罗里达弓背蚁(Camponotusfloridanus)ADC、SEQIDNO:188的人虱ADC、SEQIDNO:189的大头美切叶蚁(Attacephalotes)ADC、SEQIDNO:190的油菜花露尾甲(Meligethesaeneus)ADC、或SEQIDNO:191的红火蚁ADC。在另一方面，是包含双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲(Leptocardii)的天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)的重组酵母细胞，该天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)如SEQIDNO:192的蚤状溞(Daphniapulex)ADC、SEQIDNO:193的霸王莲花青螺(Lottiagigantea)ADC、SEQIDNO:194的佛罗里达文昌鱼(Branchiostomafloridae)ADC、或SEQIDNO:195的太平洋牡蛎(Crassostreagigas)ADC。在另一方面，是包含天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)的重组酵母细胞，该天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)与SEQIDNO:162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、或195具有至少60％序列一致性，其中该细胞能够产生3-HP。在另一方面，是包含天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)的重组酵母细胞，该天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)在与SEQIDNO:162的氨基酸序列的位置377处相对应的位置处包含谷氨酰胺，并且包含与SEQIDNO:162的氨基酸382-516具有至少60％序列一致性的部分氨基酸序列，其中该细胞能够产生3-HP。
在一些方面，当在相同条件下培养时，与不具有编码天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)的该异源多核苷酸的细胞相比，这些重组酵母细胞产生更大量的3-HP。
在一些方面，这些重组酵母细胞进一步包含一种或多种(例如，两种、若干种)选自以下各项的异源多核苷酸：编码PPC的异源多核苷酸、编码PYC的异源多核苷酸、编码AAT的异源多核苷酸、编码BAAT或gabT的异源多核苷酸以及编码3-HPDH的异源多核苷酸。
在一些方面，这些重组酵母细胞包括对编码PDC、ADH、GAL6、CYB2A、CYB2B、GPD、GPP、ALD或PCK的一种或多种内源基因的破坏。在一些实施例中，这些重组酵母细胞包括对编码PDC的内源基因和编码GPD的内源基因中的一个或两个的破坏。
在一些方面，该酵母细胞是假丝酵母属、伊萨酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、有孢圆酵母属、或接合酵母属酵母细胞。在一些实施例中，该酵母细胞是东方伊萨酵母酵母细胞，例如，东方伊萨酵母CNB1酵母细胞。在一些实施例中，该重组酵母细胞是一种3-HP耐受酵母细胞。在一些实施例中，该细胞不能发酵戊糖。
还描述了生产3-HP以及相关化合物的方法。在一方面，是一种产生3-HP的方法，该方法包括：(a)在适合生产3-HP的条件下，在培养基中培养在此描述的重组酵母细胞；并且(b)回收3-HP。在另一方面，是一种生产丙烯酸或其盐的方法，该方法包括：(a)在适合生产3-HP的条件下，在培养基中培养在此描述的重组酵母细胞；(b)回收3-HP；(c)在适合生产丙烯酸或其盐的条件下，将3-HP脱水；并且(d)回收丙烯酸或其盐。
附图简要说明
图1示出了从葡萄糖的选择性3-HP途径的概述。
图2示出了SEQIDNO:162-195的高度同源区的多重序列比对。
图3示出了pMlBa192的质粒图。
图4示出了pMeJi363的质粒图。
图5示出了pMlBa193的质粒图。
图6示出了pMlBa112的质粒图。
图7示出了pMeJi364的质粒图。
图8示出了pMBin245的质粒图。
图9示出了pMBin244的质粒图。
图10示出了在不同时间点处的3-HP的发酵曲线图。
图11示出了在不同时间点处的3-HP的发酵曲线图。
图12示出了在30℃，pH6以及40℃，pH6和pH7.6下，菌株东方伊萨酵母MeJi523、MeJi524、MBin608、和MlBa351的ADC比活。
图13示出了pMHCT238的质粒图。
图14示出了pMHCT239的质粒图。
图15示出了pMHCT240的质粒图。
图16示出了pMHCT241的质粒图。
图17示出了pMBin249的质粒图。
图18示出了pMBin250的质粒图。
图19示出了pMcTs152的质粒图。
图20示出了pMcTs149的质粒图。
图21示出了在不同时间点处的3-HP的发酵曲线图。
图22示出了SEQIDNO:162(埃及伊蚊)、SEQIDNO:169(黑腹果蝇)、SEQIDNO:170(大斑蝶)、以及SEQIDNO:181(西方蜜蜂)的昆虫ADC的多重序列比对。
图23示出了pCKLE100的质粒图。
图24示出了pMHCT259a的质粒图。
图25示出了pCKLE107的质粒图。
图26示出了pMHCT260a的质粒图。
图27示出了pMHCT246的质粒图。
图28示出了pMHCT267的质粒图。
图29示出了pMHCT268的质粒图。
定义
缩写：3-HPA，3-羟基丙醛；3-HPDH，3-羟基丙酸脱氢酶；AAM，丙氨酸2,3氨基变位酶；AAT，天冬氨酸转氨酶；ACC，乙酰辅酶A羧化酶；ADC，天冬氨酸1-脱羧酶；AKG，α-酮戊二酸；ALD，醛脱氢酶；BAAT，β-丙氨酸转氨酶；BCKA，支链α-酮酸脱羧酶；bp，碱基对；CYB2，L-(+)-乳酸-细胞色素c氧化还原酶；CYC，异-2-细胞色素c；EMS，乙烷甲基磺化酶(sulfonase)；ENO，烯醇酶；gabT，4-氨基丁酸转氨酶；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；GPD，甘油3-磷酸脱氢酶；GPP，甘油3-磷酸磷酸酶；HIBADH，3-羟基异丁酸脱氢酶；IPDA，吲哚丙酮酸脱羧酶；KGD，α-酮戊二酸脱羧酶；LDH，乳酸脱氢酶；MAE，苹果酸酶；MDHB，苹果酸脱氢酶B；OAA，草酰乙酸；PCK，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；PDC，丙酮酸脱羧酶；PDH，丙酮酸脱氢酶；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；PGK，磷酸甘油酸激酶；PPC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；PYC，丙酮酸羧化酶；RKI，核糖5-磷酸-酮醇异构酶；TAL，转醛醇酶；TEF1，翻译延长因子-1；TEF2，翻译延长因子-2；TKL，转酮醇酶；XDH，木糖醇脱氢酶；XR，木糖还原酶；YP，酵母提取物/蛋白胨。
主动3-HP途径：如在此使用，具有“主动3-HP途径”的宿主细胞以一种量产生催化代谢途径的每个反应所必需的活性酶，该量足以从可发酵糖产生3-HP，并且因此当在至少一种可发酵糖的存在下在发酵条件下培养时，该宿主细胞能够以可测量的产量产生3-HP。具有主动3-HP途径的宿主细胞包括一个或多个3-HP途径基因。如在此使用，“3-HP途径基因”是指一种编码在主动3-HP途径中涉及的酶的基因。
催化主动3-HP途径中的每个反应所必需的活性酶可以来自内源基因表达的活性、异源基因表达的活性、或来自内源基因和异源基因表达的活性的组合，如在此更加详细地描述。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)：在此使用的术语“天冬氨酸脱羧酶”或“ADC”是一种酶，该酶催化将天冬氨酸转化为β-丙氨酸的化学反应(例如，EC4.1.1.11)。例如，可以如在本领域中、或如在此的实例中描述的，从无细胞提取物中测定ADC活性。例如，在含有29μL的100mM乙酸铵缓冲液(pH6或7.6)、160μL的25mM天冬氨酸(在用NaOH中和后)、以及1μL的30mM吡哆醛-5-磷酸盐的反应混合物中，在40℃、30℃、或25℃下，可以使用LC/MS/MS来监控在不同时间间隔所产生的β-丙氨酸来测量ADC活性。
ADC基因可以源于细菌来源或昆虫纲、双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲来源。术语“昆虫天冬氨酸1-脱羧酶”或“昆虫ADC”是源于昆虫来源(纲：“昆虫纲”)的ADC并且包括基于亲本ADC的天然和人造的变体。
双壳纲：术语“双壳纲”在此意指在软体动物门中的一个分类学类别并且包括真牡蛎。
鳃足纲：术语“鳃足纲”在此意指在甲壳亚门中的一个分类学类别并且包括小型水生甲壳动物，例如，水蚤和仙女虾(fairyshrimp)。
昆虫纲：术语“昆虫纲”在此意指在节肢动物门中的一个分类学类别并且包括以下各目的昆虫：蜚蠊目、鞘翅目、革翅目、双翅目、纺足目、蜉蝣目、半翅目、膜翅目、鳞翅目、螳螂目、长翅目、广翅目、石蛃目、脉翅目、蛩蠊目、蜻蜓目、直翅目、竹节虫目、襀翅目、啮虫目、蛇蛉目、蚤目、捻翅目、缨翅目、毛翅目、缺翅目、和衣鱼目。
腹足纲：术语“腹足纲”在此意指在软体动物门中的一个分类学类别并且包括所有种类以及所有从微观到大型的大小的螺和蛞蝓。
头索纲：术语“头索纲”在此意指在脊索动物门的头索动物亚门中的一个分类学类别并且包括文昌鱼和蛞蝓鱼。
编码序列：术语“编码序列”或“编码区”意指指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的多核苷酸(例如，密码子优化的多核苷酸)、和/或重组多核苷酸的一个序列。
控制序列：术语“控制序列”意指多肽表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，并且彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于，前导子序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列及转录终止子序列。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
破坏：术语“破坏”意指参照基因的编码区和/或控制序列被部分或完全修饰(例如通过缺失、插入和/或取代一个或多个核苷酸)，从而使得编码的多肽的表达不存在(失活)或降低，和/或编码的多肽的酶活性不存在或降低。可以使用本领域已知的技术测量破坏效果，如从在此参照的无细胞提取物中的测量值来检测酶活性的不存在或降低；或通过对应的mRNA的不存在或降低(例如，至少25％降低、至少50％降低、至少60％降低、至少70％降低、至少80％降低或至少90％降低)；具有酶活性的对应多肽的量的不存在或降低(例如，至少25％降低、至少50％降低、至少60％降低、至少70％降低、至少80％降低或至少90％降低)；或具有酶活性的对应多肽的比活的不存在或降低(例如，至少25％降低、至少50％降低、至少60％降低、至少70％降低、至少80％降低或至少90％降低)。可以通过本领域已知的方法破坏感兴趣的具体基因，例如通过定向同源重组(directedhomologousrecombination)(参见酵母遗传学方法(MethodsinYeastGenetics)(1997版)，亚当斯(Adams)，戈特斯科林(Gottschling)，凯泽(Kaiser)及施特姆斯(Stems)，冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress)(1998))。
内源基因：术语“内源基因”意指对参照宿主细胞而言天然的基因。“内源基因表达”意指内源基因的表达。
表达：术语“表达”包括在多肽的产生中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。可以对表达进行测量—例如，来检测增加的表达—通过本领域已知的技术，例如测量mRNA和/或翻译的多肽的水平。
表达载体：术语“表达载体”意指一种线性或环形的DNA分子，该分子包括编码一种多肽的多核苷酸并且被可操作地连接至控制序列，其中这些控制序列提供编码该多肽的多核苷酸的表达。最低限度上，该表达载体包括启动子序列，以及转录和翻译终止信号序列。
可发酵的培养基：术语“可发酵的培养基”或“发酵培养基”是指包括一种或多种(例如，两种、若干种)糖的培养基，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性低聚糖，其中该培养基能够部分地被宿主细胞转化(发酵)为希望的产物，例如3-HP。在一些情况下，这种发酵培养基来源于天然来源，例如甘蔗、淀粉、或纤维素；并且可以来自这种来源的酶水解(糖化作用)的预处理。
异源多核苷酸：在此将术语“异源多核苷酸”定义为以下多核苷酸：对该宿主细胞而言不是天然的多核苷酸；已经对编码区做出结构修饰的天然多核苷酸；由于通过重组DNA技术(例如，一种不同的(外源的)启动子)对DNA的操作而定量改变其表达的天然多核苷酸；或具有该多核苷酸的一个或多个额外的拷贝以定量改变表达的宿主细胞中的天然多核苷酸。“异源基因”是包括异源多核苷酸的基因。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2XSSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
3-HP：术语“3-HP”包括“3-羟基丙酸”的盐和酸形式。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对用核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。在此将术语“重组酵母细胞”定义为包括一种或多种(例如，两种、若干种)异源多核苷酸的非天然存在的酵母宿主细胞。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2XSSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2XSSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2XSSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指一种包括一个或多个(例如，两个、若干个)控制序列的多核苷酸。多核苷酸可以是单-链的或双链的，并且可以分离自天然存在的基因、可以被修饰成以另外的不会在自然界中存在的方式包含核酸的区段，或可以是合成的。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下配置，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列放置在适当位置处，以使得控制序列指导编码序列的表达。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。
出于在此所述的目的，两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)48:443-453)测定，如在EMBOSS包的尼德尔(Needle)程序(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，莱斯(Rice)等人，2000，《遗传学趋势》(TrendsGenet.)16:276-277)，优选地3.0.0版或更高版本中所实施。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X100)/(参照序列的长度-比对中的空位总数)
出于在此所述的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度，该算法是如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸X100)/(参照序列的长度-比对中的空位总数)
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2XSSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2XSSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
体积生产力：术语“体积生产力”是指每单位时间使用的每体积系统(例如，培养基和其中的内容物的总体积)产生的参照产物的量(例如，产生的3-HP的量)。
在此提及“约”一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。当与测量值组合使用时，“约”包括涵盖至少与测量该具体数值的方法相关的不确定性的范围，并且可以包括在给定的数值附近正或负两个标准差的范围。
如在此和所附权利要求书中所使用，单数形式“一种/个”、“或”以及“该”包括复数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应该理解的是在此描述的这些方面包括“由……方面组成”和/或“基本由……方面组成”。
除非由上下文以另外的方式定义或清楚表明，在此使用的所有技术术语和科学术语具有如本领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。
详细说明
在此描述的尤其是重组酵母细胞，这些重组酵母细胞包含编码昆虫纲的天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)的异源多核苷酸。
该天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)可以是昆虫纲的任何昆虫ADC，该昆虫ADC适用于在此描述的宿主细胞以及其使用方法，例如保留ADC活性的天然存在的ADC或其变体。与自切割以产生丙酮酰部分用于催化的细菌ADC不同，与细菌ADC相比，昆虫ADC使用吡哆醛-5’-磷酸盐(PLP)作为辅因子并且与谷氨酸脱羧酶(GDC)共享显著更高的序列一致性(参见刘(Liu)等人，昆虫生物化学和分子生物学(InsectBiochem.Mol.Bio.)42:396-403)。
除天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)活性之外，酵母细胞已经显示出在通过PEP或丙酮酸、OAA、天冬氨酸、β-丙氨酸、以及丙二酸半醛中间体进行的3-HP途径中所必须的所有的酶的内源活性(参见图1)。已经在酵母细胞表达来自细菌来源的异源ADC，以完成3-HP途径并且产生3-HP(参见WO2012/074818)。
本申请已经惊人地发现，与其他异源ADC酶相比，在重组酵母宿主细胞中，表达昆虫天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)，例如SEQIDNO:162的埃及伊蚊ADC、SEQIDNO:169的黑腹果蝇ADC、SEQIDNO:170的大斑蝶ADC、SEQIDNO:181的西方蜜蜂ADC，显著增强代谢性3-HP的生产。
因此，在一方面重组酵母细胞，其中该细胞包含编码昆虫纲的天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)的异源多核苷酸，并且其中该细胞能够产生3-HP。在另一方面是重组酵母细胞，其中该细胞包含编码双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)的异源多核苷酸，并且其中该细胞能够产生3-HP。
在另一方面，该ADC是吡哆醛-5’-磷酸盐(PLP)依赖型的。在另一方面，该ADC存在于宿主细胞的胞液中。
在其他方面，当在相同条件下培养时，与不具有编码ADC的异源多核苷酸的宿主细胞相比，包含编码昆虫纲、双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC的异源多核苷酸的重组酵母细胞具有增加的ADC活性的水平。在其他方面，当在相同条件下培养时，与不具有编码昆虫纲、双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC的异源多核苷酸的宿主细胞相比，这些酵母细胞具有至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的增加的ADC活性水平。
可以与在此描述的宿主细胞和使用方法一起使用的潜在ADC包括但不限于表1中描述的昆虫纲的多肽。表2中描述了来自双壳纲、鳃足纲、腹足纲、和头索纲的其他ADC。
表1.
表2.
该ADC可以从选自下组的目的昆虫获得，该组由以下各项组成：蜚蠊目、鞘翅目、革翅目、双翅目、纺足目、蜉蝣目、半翅目、膜翅目、鳞翅目、螳螂目、长翅目、广翅目、石蛃目、脉翅目、蛩蠊目、蜻蜓目、直翅目、竹节虫目、襀翅目、啮虫目、蛇蛉目、蚤目、捻翅目、缨翅目、毛翅目、缺翅目、和衣鱼目。
在一方面，该ADC是从昆虫纲的生物体(昆虫)中获得的。在另一方面，该ADC是从蜚蠊目的昆虫(例如，蟑螂和白蚁)中获得的。在另一方面，该ADC是从鞘翅目的昆虫(例如，甲虫)中获得的。在另一方面，该ADC是从革翅目的昆虫(例如，蠷螋)中获得的。在另一方面，该ADC是从双翅目的昆虫(例如，蝇和蚊)中获得的。在另一方面，该ADC是从纺足目的昆虫(例如，足丝蚁)中获得的。在另一方面，该ADC是从蜉蝣目的昆虫(例如，蜉蝣)中获得的。在另一方面，该ADC是从半翅目的昆虫(例如，椿象、蝉、跳虫和蚜虫)中获得的。在另一方面，该ADC是从膜翅目的昆虫(例如，蚂蚁、蜜蜂、黄蜂、和叶蜂)中获得的。在另一方面，该ADC是从鳞翅目的昆虫(例如，蝴蝶和蛾)中获得的。在另一方面，该ADC是从螳螂目的昆虫(例如，螳螂)中获得的。在另一方面，该ADC是从长翅目的昆虫(例如，举尾虫和Hangingfly)中获得的。在另一方面，该ADC是从广翅目的昆虫(例如，鱼蛉(Alderfly)、蛇蜻蜓、和Fishfly)中获得的。在另一方面，该ADC是从石蛃目的昆虫(例如，蛀虫)中获得的。在另一方面，该ADC是从脉翅目的昆虫(例如，蚁蛉和草蛉)中获得的。在另一方面，该ADC是从蛩蠊目的昆虫(例如，岩石爬虫)中获得的。在另一方面，该ADC是从蜻蜒目的昆虫(例如，蜻蜓和豆娘)中获得的。在另一方面，该ADC是从直翅目的昆虫(例如，蝗虫、蟋蟀、和螽斯)中获得的。在另一方面，该ADC是从竹节虫目的昆虫(例如，竹节虫)中获得的。在另一方面，该ADC是从襀翅目的昆虫(例如，石蝇和羽虱(ChewingLice))中获得的。在另一方面，该ADC是从啮虫目的昆虫(例如，树皮虱、书虱、和寄生虱)中获得的。在另一方面，该ADC是从蛇蛉目的昆虫(例如，蛇蛉)中获得的。在另一方面，该ADC是从蚤目的昆虫(例如，蚤)中获得的。在另一方面，该ADC是从捻翅目的昆虫(例如，捻翅虫)中获得的。在另一方面，该ADC是从缨翅目的昆虫(例如，蓟马)中获得的。在另一方面，该ADC是从毛翅目的昆虫(例如，石蚕蛾)中获得的。在另一方面，该ADC是从缺翅目的昆虫(例如，Zorapteran)中获得的。在另一方面，该ADC是从衣鱼目的昆虫(例如，蠹虫)中获得的。
编码适合的昆虫ADC的另外的多核苷酸可以从任何适合的属或种中获得，包括在UniProtKB数据库(www.uniprot.org)内可容易获得的那些。
在另一方面，该昆虫ADC是伊蚊属ADC，如SEQIDNO:162的埃及伊蚊ADC。在另一方面，该昆虫ADC是库蚊属ADC，如SEQIDNO:163的五带淡色库蚊ADC。在另一方面，该昆虫ADC是按蚊属ADC，如SEQIDNO:164的冈比亚按蚊ADC。在另一方面，该昆虫ADC是拟谷盗属ADC，如SEQIDNO:165的赤拟谷盗ADC。在另一方面，该昆虫ADC是毛皮蠹属ADC，如SEQIDNO:166的斯氏毛皮蠹ADC。在另一方面，该昆虫ADC是无网蚜属ADC，如SEQIDNO:167的豌豆蚜ADC。在另一方面，该昆虫ADC是果蝇属ADC，如SEQIDNO:168的瑟车利亚果蝇(Drosophilasechellia)ADC、SEQIDNO:169的黑腹果蝇ADC、SEQIDNO:171的亚库巴果蝇(Drosophilayakuba)ADC、SEQIDNO:172的埃瑞克塔果蝇(Drosophilapersimilis)ADC、SEQIDNO:174的黑翅果蝇(Drosophilapersimilis)ADC、SEQIDNO:176的嗜凤梨果蝇ADC、SEQIDNO:177的漠海威果蝇(Drosophilamojavensis)ADC、SEQIDNO:178的格瑞姆肖果蝇(Drosophilagrimshawi)ADC、SEQIDNO:180的威尔斯托尼果蝇(Drosophilawillistoni)ADC、或SEQIDNO:182的维尔利斯果蝇(Drosophilavirilis)ADC。在另一方面，该昆虫ADC是斑蝶属ADC，如SEQIDNO:170的大斑蝶ADC。在另一方面，该昆虫ADC是凤蝶属ADC，如SEQIDNO:173的柑橘凤蝶ADC。在另一方面，该昆虫ADC是蚕属ADC，如SEQIDNO:175的家蚕ADC。在另一方面，该昆虫ADC是尺蛾属(Biston)ADC，如SEQIDNO:179的桦尺蠖ADC。在另一方面，该昆虫ADC是蜜蜂属ADC，如SEQIDNO:181的西方蜜蜂ADC。在另一方面，该昆虫ADC是金小蜂属(Nasonia)ADC，如SEQIDNO:183的丽蝇蛹集金小蜂ADC。在另一方面，该昆虫ADC是蔽眼蝶属ADC，如SEQIDNO:184的偏瞳蔽眼蝶ADC。在另一方面，该昆虫ADC是掠猛蚁属ADC，如SEQIDNO:185的印度跳蚁ADC。在另一方面，该昆虫ADC是切叶蚁ADC，如SEQIDNO:186的切叶蚁ADC。在另一方面，该昆虫ADC是弓背蚁属ADC，如SEQIDNO:187的佛罗里达弓背蚁ADC。在另一方面，该昆虫ADC是虱属ADC，如SEQIDNO:188的人虱ADC。在另一方面，该昆虫ADC是切叶蚁属ADC，如SEQIDNO:189的大头美切叶蚁ADC。在另一方面，该昆虫ADC是油菜花露尾甲属(Meligethes)ADC，如SEQIDNO:190的油菜花露尾甲ADC。在另一方面，该昆虫ADC是火蚁属ADC，如SEQIDNO:191的红火蚁ADC。
该ADC还可以从选自下组的纲的生物体中获得，该组由以下各项组成：双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲。
在另一方面，该昆虫ADC是水蚤属ADC，如SEQIDNO:192的蚤状溞DC。在另一方面，该昆虫ADC是莲花青螺属ADC，如SEQIDNO:193的霸王莲花青螺DC。在另一方面，该昆虫ADC是文昌鱼属ADC，如SEQIDNO:194的佛罗里达文昌鱼DC。在另一方面，该昆虫ADC是重牡蛎属ADC，如SEQIDNO:195的太平洋牡蛎DC。
可以使用在此描述的ADC编码序列或其子序列、连同对应的氨基酸序列或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆来自不同属或种的ADC。具体地说，这类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因。这样的探针可以大大短于整个序列，例如至少14个核苷酸、至少25个核苷酸、至少35个核苷酸、至少70个核苷酸长度。该探针可以更长，例如至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸长度。可以使用甚至更长的探针，例如至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸长度。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。
可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有ADC活性的多肽的DNA对由这类其他属或种制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自此类其他属或种的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与ADC编码序列或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印迹法中可以使用载体材料。
出于上述探针的目的，杂交是指，在非常低至非常高严格条件下，多核苷酸杂交至标记的核酸探针或其全长互补链或前述各项的子序列。在这些条件下，核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线胶片而进行检测。对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，非常低至非常高严格条件和洗涤条件是如在此所述定义的。对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言，严格和洗涤条件被定义为最佳地，遵循标准DNA印迹程序，在比使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390(1962))的计算所计算的Tm低约5℃至约10℃下，在0.9MNaCl、0.09MTris-HCl(pH7.6)、6mMEDTA、0.5％NP-40、1X登哈特氏溶液(Denhardt’ssolution)、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mMATP、以及每ml0.2mg的酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后，将载体材料在比所计算的Tm低5℃至10℃下，在6XSCC加0.1％SDS中洗涤1次(持续15分钟)并且使用6XSSC洗涤2次(每次15分钟)。
也可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮等)获得的DNA样品鉴定并获得昆虫样ADC。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合DNA样品衍生编码ADC的多核苷酸。在此应理解的是，术语“昆虫样ADC”涵盖在术语“昆虫ADC”中。
一旦已经用如在此描述的适合的探针检测到编码ADC的一种多核苷酸，则可以通过利用本领域的普通技术人员已知的技术来分离或克隆该序列(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验手册(MolecularCloning,ALaboratoryManual)，第2版，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约)。用来分离或克隆编码ADC的多核苷酸的技术包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从这样的基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:AGuidetoMethodsandApplication)，学术出版社(AcademicPress)，纽约。还可以使用其他核酸扩增程序，诸如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)、和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。
在一方面，该异源多核苷酸：(a)编码与SEQIDNO:162-191中任一项具有至少60％的序列一致性的昆虫ADC；(b)包括一种编码序列，该编码序列在至少低严格条件下，与SEQIDNO:162-191中任一项的编码序列的全长互补链杂交；或(c)包括一种编码序列，该编码序列与SEQIDNO:162-191中任一项的编码序列具有至少60％的序列一致性。
在另一方面，该异源多核苷酸：(a)编码与SEQIDNO:192-195中任一项具有至少60％的序列一致性的ADC；(b)包括一种编码序列，该编码序列在至少低严格条件下，与SEQIDNO:192-195中任一项的编码序列的全长互补链杂交；或(c)包括一种编码序列，该编码序列与SEQIDNO:192-195中任一项的编码序列具有至少60％的序列一致性。
如本领域技术人员可认识到的，在一些情况下，可以按以上所指出的对应选项(a)、(b)和(c)中的多于一个，使这些异源多核苷酸具有资格。
在另一方面，该异源多核苷酸编码与SEQIDNO:162-191中任一项具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的昆虫ADC。在另一方面，该异源多核苷酸编码ADC，该ADC具有一种与SEQIDNO:162-191中任一项相差不多于十个氨基酸，例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于两个氨基酸、或相差一个氨基酸的序列。在另一方面，该异源多核苷酸编码一种昆虫ADC，该昆虫ADC包括SEQIDNO:162-191中任一项氨基酸序列、或其等位基因变体、或前述的具有ADC活性的片段或由其组成。
在另一方面，该异源多核苷酸编码与SEQIDNO:192-195中任一项具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的ADC。在另一方面，该异源多核苷酸编码ADC，该ADC具有一种与SEQIDNO:192-195中任一项相差不多于十个氨基酸，例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于两个氨基酸、或相差一个氨基酸的序列。在另一方面，该异源多核苷酸编码一种ADC，该ADC包括SEQIDNO:192-195中任一项氨基酸序列、或其等位基因变体、或前述的具有ADC活性的片段或由其组成。
在另一方面，该ADC具有以上描述的ADC中的任一项的一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些方面，氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于9、8、7、6、5、4、3、2或1。
该氨基酸改变的性质通常较小，也就是说不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地是1个至大约30个氨基酸的小段缺失；小段氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小段接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而协助纯化的小段延伸，例如多组氨酸区段、抗原表位、或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(TheProteins)，学术出版社(AcademicPress)，纽约中描述。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改善ADC的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域已知的程序来鉴定必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的ADC活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可以结合假定接触位点氨基酸的突变，通过如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记等技术进行测定，来对结构进行物理学分析，从而确定ADC的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如德·沃斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与参照ADC相关的其他ADC的一致性分析推断必需氨基酸的一致性。
可以使用本领域所熟知的多重序列比对(MSA)技术来确定另外的有关在此的昆虫ADC的结构-活性关系的指导。例如，图22示出了SEQIDNO:162(埃及伊蚊)、169(黑腹果蝇)、170(大斑蝶)、以及181(西方蜜蜂)的昆虫ADC的多重序列比对。基于在此的教导，本领域的技术人员可以与在此描述的或本领域已知的许多昆虫ACD做相似的比对。此类比对帮助本领域的技术人员测定潜在相关地结构域(例如，结合域或催化结构域)，并且在不同的昆虫ADC序列中测定哪些氨基酸残基是保守的和不是保守的。本领域中应理解的是，改变在所披露的ADC之间的特定位置处是保守的氨基酸将更有可能导致生物活性的改变(鲍伊(Bowie)等人，1990，科学(Science)247:1306-1310：“直接涉及到蛋白功能如结合或催化的残基将一定是在最保守的残基中(Residuesthataredirectlyinvolvedinproteinfunctionssuchasbindingorcatalysiswillcertainlybeamongthemostconserved)”)。相比之下，取代在ADC之间不是高度保守的氨基酸将不可能或不明显地改变生物活性。
刘(Liu)等人，2012，昆虫生物化学和分子生物学(InsectBiochem.Mol.Bio.)42:396-403，基于同源性模型、底物对接、以及定位诱变，使用SEQIDNO:162的埃及伊蚊ADC，已经提供了具体有关昆虫ADC结构-活性关系的指导。针对活性和底物特异性，这项工作识别出关键的残基(例如残基Q377在昆虫ADC的天冬氨酸选择性的作用)。因此，在一方面，异源多核苷酸编码一种ADC，该ADC在与SEQIDNO:162的位置377的残基处具有谷氨酰胺。
进一步更多的对结构-活性关系的指导是由(Agnello)等人，2013，ACS化学生物学(ACSChem.Biol.)8:2264-2271所教导的，其显示出F1aa19S2aaY3或Y1aa19S2aaY3的识别基序是具有天冬氨酸脱羧酶活性的这些蛋白质的“结构指纹”，其中F1是苯丙氨酸，Y1是酪氨酸，aa19是具有十九个氨基酸的插入序列，S2是丝氨酸，aa是单个氨基酸，并且Y3是酪氨酸。这些结构指纹可以发现于昆虫纲、双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC，如SEQIDNO:162-195的ADC，表1和2，以及图2中。因此，在一些实施例中，该异源多核苷酸编码具有基序F1aa19S2aaY3或基序Y1aa19S2aaY3的ADC。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利5,223,409、WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性ADC的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
在一些方面，在相同条件下，ADC具有在此所述的任何多肽(例如，SEQIDNO:162-195中任一项)的至少20％，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的ADC活性。
该ADC可以是一种融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽融合在该ADC的N-末端或C-末端处。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与编码ADC的多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合蛋白还可以使用内含肽技术构建，其中融合在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
在另一方面，该异源多核苷酸包括一种编码序列，该编码序列在至少低严格条件，例如，中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下，与SEQIDNO:162-195的多肽中的任一项的编码序列(如示于SEQIDNO:157-161、212-215、219-222、223-226、和232-233中的编码序列中的任一项)的全长互补链杂交(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，同上)。在另一方面，该异源多核苷酸包括一种编码序列，该编码序列与SEQIDNO:162-195的多肽中任一项的编码序列(如示于SEQIDNO:157-161、212-215、219-222、223-226、和232-233中的编码序列中任一项)具有至少65％，例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
在另一方面，编码ADC的异源多核苷酸包括SEQIDNO:162-195的多肽中任何一项的编码序列，如示于SEQIDNO:157-161、212-215、219-222、223-226、和232-233中的编码序列中任一项。在另一方面，编码ADC的异源多核苷酸包括在此描述的多肽中的任一项的编码序列的子序列，其中该子序列编码具有ADC活性的多肽。在一个实施例中，该编码子序列中的核苷酸残基的数目是参照编码序列中核苷酸数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％、或95％。
在另一方面，该异源多核苷酸编码SEQIDNO:162-195的多肽中任一项的片段，其中该片段具有ADC活性。在一个实施例中，在该片段中的氨基酸残基的数目是参照序列的氨基酸残基的数目的至少75％，例如，至少80％、85％、90％、或95％。
除非另外说明，在此描述的任何相关方面的参照编码序列可以是天然编码序列(例如，由熟练的技术人员使用可获得的序列数据库容易确定的序列)或简并序列，例如针对具体宿主细胞设计的密码子优化的编码序列。例如，SEQIDNO:162的埃及伊蚊ADC的编码序列可以是SEQIDNO:157的天然的埃及伊蚊ADC编码序列、或密码子优化版本，如示于SEQIDNO:158-161中的编码序列中的任一项。类似地，SEQIDNO:169的黑腹果蝇ADC的编码序列可以是天然的黑腹果蝇ADC编码序列、或密码子优化版本，如示于SEQIDNO:223-226中的编码序列中的任一项。类似地，SEQIDNO:170的大斑蝶ADC的编码序列可以是天然的大斑蝶ADC编码序列、或密码子优化版本，如示于SEQIDNO:212-215中的编码序列中的任一项。类似地，SEQIDNO:181的西方蜜蜂ADC的编码序列可以是天然的西方蜜蜂ADC编码序列、或密码子优化版本，如示于SEQIDNO:219-222中的编码序列中的任一项。
如在上文所述，刘等人，2012，同上，证实了与SEQIDNO:162的位置377对应的谷氨酰胺残基在来自蚊和果蝇的ADC的天冬氨酸选择性中发挥了主要作用。在位置377处含有保守的谷氨酰胺残基的、与SEQIDNO:162的埃及伊蚊ADC最近的100种同源物的搜索产生30种描述于表1的昆虫序列和4种描述于表2中的非昆虫序列。这34种序列的多重序列比对提供了如图2所示的在氨基酸382和516之间的高度同源区域。例如，基于与若干以上所示的昆虫ADC的SEQIDNO:162的氨基酸382至516对应的区域，一种同源性矩阵示于下表3中。
表3
因此，在另一方面，该异源多核苷酸编码ADC，例如，昆虫ADC，该ADC在与SEQIDNO:162的氨基酸序列的位置377对应的位置处包含谷氨酰胺，并且包含与SEQIDNO:162的氨基酸382-516具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的序列一致性的部分氨基酸序列。在另一方面，该异源多核苷酸编码ADC，例如，昆虫ADC，该昆虫ADC在与SEQIDNO:162的氨基酸序列的位置377处对应的位置处包含谷氨酰胺，并且包含与SEQIDNO:162的氨基酸382-516相差不多于十个氨基酸，例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于两个氨基酸、或相差一个氨基酸的部分氨基酸序列。
在另一方面，该异源多核苷酸编码ADC，例如，昆虫ADC，该ADC在与SEQIDNO:162的氨基酸序列的位置377对应的位置处包含谷氨酰胺，并且包含一种部分氨基酸序列，该部分氨基酸序列包括SEQIDNO:162的氨基酸382-516的氨基酸序列。在另一方面，该部分氨基酸序列具有SEQIDNO:162的氨基酸382-516的序列中的一个或多个(例如，两个，若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失、和/或插入。在一些方面，氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于9、8、7、6、5、4、3、2或1。
主动3-HP途径
在此描述的酵母细胞可以具有主动3-HP途径和/或包含一种或多种(例如，两种，若干种)3-HP途径基因的一种或多种异源多核苷酸。如在此描述的，酵母细胞已经显示出从ADC(如本发明的昆虫ADC)的异源基因表达与3-HP途径的剩余基因的内源基因表达一起来产生3-HP。在某些实施例中，这些酵母细胞进一步包括来自使用ADC和/或另一种3-HP途径的途径的一种或多种3-HP途径基因的异源基因表达。例如，在一些实施例中，这些酵母细胞包括编码昆虫ADC的异源多核苷酸，和编码3-HP途径的一种或多种3-HP途径基因的一种或多种异源多核苷酸，该3-HP途径通过PEP或丙酮酸、OAA、天冬氨酸、β-丙氨酸、以及丙二酸半醛中间体来进行(如以下更详细描述的)。在其他实施例中，这些酵母细胞包括编码昆虫ADC或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC的异源多核苷酸，和编码另外的3-HP途径的一种或多种3-HP途径基因的一种或多种异源多核苷酸，该3-HP途径如通过丙酮酸、酰辅酶A、或丙二酰辅酶A进行的3-HP途径；或通过甘油和3-HP中间体进行的3-HP途径(如以下更详细描述的)。
任何适合的3-HP途径可以与具有异源多核苷酸的重组酵母细胞一起使用，该异源多核苷酸编码昆虫ADC或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC。用于发酵3-HP的3-HP途径、3-HP途径基因、和对应的工程化转化体在本领域是已知的(例如，U.S.2012/0135481；美国专利6,852,517；美国专利7,309,597；U.S.2001/0021978；U.S.2008/0199926；WO02/42418；以及WO10/031083；将它们的内容以其全部内容的形式结合在此)。若干已知的3-HP途径的综述示于图1中。
在某些实施例中，在此提供的酵母细胞具有以下主动3-HP途径，该主动3-HP途径通过PEP或丙酮酸、OAA、天冬氨酸、β-丙氨酸以及丙二酸半醛中间体而进行(参见，例如，U.S.2010/0021978，图1)。在这些实施例中，这些酵母细胞包括一套3-HP途径基因，这些基因包括丙酮酸羧化酶(PYC)、PEP羧化酶(PPC)、天冬氨酸转氨酶(AAT)、天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)、β-丙氨酸转氨酶(BAAT)、氨基丁酸转氨酶(gabT)、3-HP脱氢酶(3-HPDH)、3-羟基异丁酸脱氢酶(HIBADH)以及4-羟基丁酸脱氢酶基因中的一种或多种。这些3-HP途径基因还可以包括PEP羧激酶(PCK)基因，该基因已被修饰为产生以下多肽，该多肽优选地催化PEP转化为OAA(天然的PCK基因通常产生以下多肽，该多肽优选地催化OAA至PEP的逆反应)。
在某些实施例中，在此提供的酵母细胞具有以下主动3-HP途径，该主动3-HP途径通过PEP或丙酮酸、OAA和苹果酸中间体而进行(参见，例如，U.S.2010/0021978，图4)。在这些实施例中，这些酵母细胞包括一套3-HP途径基因，这些基因包括PPC、PYC、苹果酸脱氢酶以及苹果酸脱羧酶基因中的一种或多种。这些3-HP途径基因还可以包括一种PCK基因，该基因已被修饰为产生以下多肽，该多肽优选地催化PEP转化为OAA。
在某些实施例中，在此提供的酵母细胞具有以下主动3-HP途径，该主动3-HP途径通过PEP或丙酮酸、OAA和丙二酸半醛中间体而进行(参见，例如，U.S.2010/0021978，图1)。在这些实施例中，这些酵母细胞包括一套3-HP途径基因，这些基因包括PPC、PYC、2-酮酸脱羧酶、α-酮戊二酸(AKG)脱羧酶(KGD)、支链α-酮酸脱羧酶(BCKA)、吲哚丙酮酸脱羧酶(IPDA)、3-HPDH、HIBADH以及4-羟基丁酸脱氢酶基因中的一种或多种。这些3-HP途径基因还可以包括一种PCK基因，该基因已被修饰为产生以下多肽，该多肽优选地催化PEP转化为OAA。另外，这些3-HP途径基因包括一种PDC基因和/或苯甲酰甲酸脱羧酶基因，该基因已被修饰为编码以下多肽，该多肽能够催化OAA转化为丙二酸半醛。
在某些实施例中，在此提供的酵母细胞具有以下主动3-HP途径，该主动3-HP途径通过PEP或丙酮酸、OAA、丙二酰辅酶A以及丙二酸半醛中间体而进行，其中该丙二酸半醛中间体是任选的(参见，例如，U.S.2010/0021978，图2)。在这些实施例中，这些酵母细胞包括一套3-HP途径基因，这些基因包括PPC、PYC、OAA甲酸裂解酶、丙二酰辅酶A还原酶、辅酶A酰化丙二酸半醛脱氢酶、3-HPDH、HIBADH以及4-羟基丁酸脱氢酶基因中的一种或多种。这些3-HP途径基因还可以包括一种PCK基因，该基因已被修饰为产生以下多肽，该多肽优选地催化PEP转化为OAA。另外，这些3-HP途径基因可以包括一种OAA脱氢酶基因，该基因是通过将2-酮酸脱氢酶基因修饰以产生一种多肽而得到，该多肽催化OAA转化为丙二酰辅酶A。
在某些实施例中，在此提供的酵母细胞具有以下主动3-HP途径，该主动3-HP途径通过丙酮酸、乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A以及丙二酸半醛中间体而进行，其中该丙二酸半醛中间体是任选的(参见，例如，WO02/042418，图44)。在这些实施例中，这些酵母细胞包括一套3-HP途径基因，这些基因包括丙酮酸脱氢酶(PDH)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、丙二酰辅酶A还原酶、辅酶A酰化丙二酸半醛脱氢酶、3-HPDH、HIBADH以及4-羟基丁酸脱氢酶基因中的一种或多种。
在某些实施例中，在此提供的酵母细胞具有以下主动3-HP途径，该主动3-HP途径通过丙酮酸、丙氨酸、β-丙氨酸、β-丙氨酰辅酶A、丙烯酰辅酶A、3-HP辅酶A以及丙二酸半醛中间体而进行，其中β-丙氨酰辅酶A、丙烯酰辅酶A、3-HP辅酶A以及丙二酸半醛中间体是任选的(可以经由丙二酸半醛中间体或经由β-丙氨酰辅酶A、丙烯酰辅酶A和3-HP辅酶A中间体将β-丙氨酸转化为3-HP)(参见例如，美国专利7,309,597，图1)。在这些实施例中，这些酵母细胞包括一套3-HP途径基因，这些基因包括丙氨酸脱氢酶、丙酮酸/丙氨酸转氨酶、丙氨酸2,3氨基变位酶、辅酶A转移酶、辅酶A合成酶、β-丙氨酰辅酶A解氨酶、3-HP辅酶A脱水酶、3-HP辅酶A水解酶、3-羟基异丁酰辅酶A水解酶、BAAT、3-HPDH、HIBADH以及4-羟基丁酸脱氢酶基因中的一种或多种。
在某些实施例中，在此提供的酵母细胞具有以下主动3-HP途径，该主动3-HP途径通过丙酮酸、乳酸、乳酰辅酶A、丙烯酰辅酶A以及3-HP辅酶A中间体而进行(参见例如，WO2010/042418，图1)。在这些实施例中，这些酵母细胞包括一套3-HP途径基因，这些基因包括LDH、辅酶A转移酶、辅酶A合成酶、乳酰辅酶A脱水酶、3-HP辅酶A脱水酶、3-HP辅酶A水解酶以及3-羟基异丁酰辅酶A水解酶基因中的一种或多种。
在某些实施例中，在此提供的酵母细胞具有以下主动3-HP途径，该主动3-HP途径通过甘油和3-HPA中间体而进行(参见例如，美国专利6,852,517)。在这些实施例中，这些酵母细胞包括一套3-HP途径基因，这些基因包括甘油脱水酶和醛脱氢酶基因中的一种或多种。
在某些实施例中，在此提供的酵母细胞具有以下主动3-HP途径，该主动3-HP途径通过PEP或丙酮酸、OAA、天冬氨酸、β-丙氨酸、β-丙氨酰辅酶A、丙烯酰辅酶A、3-HP辅酶A以及丙氨酸中间体而进行，其中OAA、天冬氨酸和丙氨酸中间体是任选的(可以经由OAA和天冬氨酸或经由丙氨酸将PEP或丙酮酸转化为β-丙氨酸)(参见WO02/042418，图54；美国专利7,309,597，图1)。在这些实施例中，这些酵母细胞包括一套3-HP途径基因，这些基因包括PPC、PYC、AAT、ADC、辅酶A转移酶、辅酶合成酶、β-丙氨酰辅酶A解氨酶、3-HP-辅酶A脱水酶、3-HP-辅酶A水解酶、3-羟基异丁酰辅酶A水解酶、丙氨酸脱氢酶、丙酮酸/丙氨酸转氨酶以及AAM基因中的一种或多种。这些3-HP途径基因还可以包括一种PCK基因，该基因已被修饰为产生以下多肽，该多肽优选地催化PEP转化为OAA。
在某些实施例中，在此提供的酵母细胞表达一种或多种编码选自下组的酶的3-HP途径基因，该组由以下各项组成：ACC(催化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A)，丙氨酸2,3氨基变位酶(AAM，催化丙氨酸转化为β-丙氨酸)，丙氨酸脱氢酶(催化丙酮酸转化为丙氨酸)，醛脱氢酶(催化3-HPA转化为3-HP)，KGD(催化OAA转化为丙二酸半醛)，AAT(催化OAA转化为天冬氨酸)，ADC(催化天冬氨酸转化为β-丙氨酸)，BCKA(催化OAA转化为丙二酸半醛)，BAAT(催化β-丙氨酸转化为丙二酸半醛)，4-氨基丁酸转氨酶(gabT，催化β-丙氨酸转化为丙二酸半醛)，β-丙氨酰辅酶A解氨酶(催化β-丙氨酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A)，辅酶A酰化丙二酸半醛脱氢酶(催化丙二酰辅酶A转化为丙二酸半醛)，辅酶A合成酶(催化β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶A或将乳酸转化为乳酰辅酶A)，辅酶A转移酶(催化β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶A和/或将乳酸转化为乳酰辅酶A)，甘油脱水酶(催化甘油转化为3-HPA)，IPDA(催化OAA转化为丙二酸半醛)，LDH(催化丙酮酸转化为乳酸)，乳酰辅酶A脱水酶(催化乳酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A)，苹果酸脱羧酶(催化苹果酸转化为3-HP)，苹果酸脱氢酶(催化OAA转化为苹果酸)，丙二酰辅酶A还原酶(催化丙二酰辅酶A转化为丙二酸半醛或3-HP)，OAA甲酸裂解酶(亦称丙酮酸-甲酸裂解酶和酮酸甲酸裂解酶，催化OAA转化为丙二酰辅酶A)，OAA脱氢酶(催化OAA转化为丙二酰辅酶A)；PPC(催化PEP转化为OAA)，丙酮酸/丙氨酸转氨酶(催化丙酮酸转化为丙氨酸)，PYC(催化丙酮酸转化为OAA)，PDH(催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A)，2-酮酸脱羧酶(催化OAA转化为丙二酸半醛)，3-HP辅酶A脱水酶(亦称丙烯酰辅酶A水合酶，催化丙烯酰辅酶A转化为3-HP辅酶A)，3-HPDH(催化丙二酸半醛转化为3-HP)，3-HP辅酶A水解酶(催化3-HP辅酶A转化为3-HP)，HIBADH(催化丙二酸半醛转化为3-HP)，3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(催化3-HP辅酶A转化为3-HP)以及4-羟基丁酸脱氢酶(催化丙二酸半醛转化为3-HP)。对于这些酶活性中的每种酶活性而言，感兴趣的反应(括号中)可以是内源或异源活性的结果。
可以使用任何适合的3-HP途径基因(内源的或异源的)并以足以产生在所选的主动3-HP途径中涉及的酶的量表达。伴随现在多于550个物种可获得的全基因组序列(其中多于一半的这些序列可在公共数据库(例如NCBI)中获得)(包括395个微生物基因组以及多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组)，对于所选的宿主而言，编码在此教导的所选3-HP途径的酶活性的基因的鉴定在本领域是常规且熟知的。例如，已知基因的适合的同源物、直向同源物、旁系同源物和非直向同源物基因替代，和在生物之间的遗传改变的互换可以在与选择的宿主相关的或远缘的宿主中来鉴定。
对于没有已知基因组序列的酵母而言，可以典型地使用本领域已知的技术获得感兴趣的基因的序列(作为过表达候选物或作为插入位点)。可以利用常规实验设计测试各种基因的表达和各种酶的活性，包括在3-HP途径中起作用的基因和酶。可以进行实验，其中单独地在酵母中和在酶区块(直至并优选包括所有途径酶，针对改善3-HP生产的需要(或希望)而建立)中表达每种酶。一种说明性实验设计测试了每种单独的酶以及每个独特的酶对的表达，并且可以进一步测试所有需要的酶或每个独特的酶组合的表达。如应该领会的，可以采取多种方法。
可以通过引入编码一种或多种参与3-HP途径的酶的异源多核苷酸而产生本发明的重组宿主细胞，如下所述。如本领域的普通技术人员应该领会的，在一些情况下(例如，取决于宿主的选择)，鉴于宿主细胞可以具有来自一个或多个途径基因的内源酶活性，示于3-HP途径中的每个基因的异源表达可能并不为3-HP生产所需要。例如，如果选择的宿主缺乏3-HP途径的一种或多种酶，则将一种或多种缺陷酶的异源多核苷酸引入该宿主中，用于进行随后的表达。可替代地，如果选择的宿主展现出一些途径基因的内源表达，但是缺乏其他基因的内源表达，则需要缺乏的一种或多种酶的编码多核苷酸，以实现生物合成3-HP。因此，可以通过引入异源多核苷酸而产生重组宿主细胞，以获得希望的生物合成途径的酶活性，或可以通过引入一种或多种异源多核苷酸(例如，编码昆虫ADC的多核苷酸)而获得希望的生物合成途径，这些希望的异源多核苷酸与一种或多种内源酶一起产生3-HP。
取决于所选重组宿主生物的3-HP途径成分，本发明的宿主细胞将包括至少一种编码昆虫ADC或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC的异源多核苷酸，以及直到包括ADC3-HP途径和/或另一种3-HP途径的所有编码的异源多核苷酸。在缺乏3-HP途径的所有酶的宿主中，可以包括异源表达该途径中的所有酶，尽管应该理解的是即使该宿主包括至少一种途径酶，仍可以表达途径的所有酶。
如在此使用，“丙酮酸羧化酶基因”或“PYC基因”是指编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸、CO2和ATP转化为OAA、ADP和磷酸。在某些实施例中，PYC基因可以来自酵母来源。例如，该PYC基因可以来自东方伊萨酵母PYC基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:2中的氨基酸序列。在其他实施例中，该基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自东方伊萨酵母的PYC基因可以包括阐述于SEQIDNO:1中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:1中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在其他实施例中，该PYC基因可以来自细菌来源。例如，该PYC基因可以来自仅使用PYC而不使用PPC(参见下文)用于进行回补的几种细菌物种之一(例如球形红假单胞菌)或来自具有PYC和PPC两者的细菌物种(例如依特利红假单胞菌(R.etli))。由球形红假单胞菌和依特利红假单胞菌的PYC基因编码的氨基酸序列分别阐述于SEQIDNO:3和4中。PYC基因可以来自编码SEQIDNO:3或4的氨基酸序列的基因或来自编码以下氨基酸序列的基因，该氨基酸序列与SEQIDNO:3或4的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。可替代地，该PYC基因可以来自编码不依赖乙酰辅酶A进行活化的酶的PYC基因，例如编码阐述于SEQIDNO:5(羧基转移酶亚单位)或SEQIDNO:6(生物素羧化酶亚单位)中的氨基酸序列的荧光假单胞菌PYC基因、编码阐述于SEQIDNO:7中的氨基酸序列的谷氨酸棒状杆菌PYC基因或编码以下氨基酸序列的基因，该氨基酸序列与SEQIDNO:5、6或7的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。PYC基因还可以来自编码不被天冬氨酸抑制的酶的PYC基因，例如编码阐述于SEQIDNO:8中的氨基酸序列的苜蓿中华根瘤菌PYC基因(萨奥尔FEMS微生物学评论(FEMSMicrobiolRev)29:765(2005))，或来自编码以下氨基酸序列的基因，该氨基酸序列与SEQIDNO:8的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
如在此使用，“PEP羧化酶基因”或“PPC基因”是指编码具有PEP羧化酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化PEP和CO2转化为OAA和磷酸。在某些实施例中，PPC基因可以来自细菌PPC基因。例如，该PPC基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:10中的氨基酸序列或以下氨基酸序列的大肠杆菌PPC基因，该氨基酸序列与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自大肠杆菌的PPC基因可以包括阐述于SEQIDNO:9中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:9中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在其他实施例中，PPC基因可以来自“A”型PPC，发现于许多古细菌和数目有限的细菌中，不被乙酰辅酶A激活且较不受天冬氨酸的抑制。例如，PPC基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:11中的氨基酸序列的嗜热自养甲烷杆菌PPCA基因、编码阐述于SEQIDNO:12中的氨基酸序列的产气荚膜梭菌PPCA基因或编码以下氨基酸序列的基因，该氨基酸序列与SEQIDNO:11或12的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在这些实施例的某些实施例中，该基因可以已经经历对天然基因的一个或多个突变，以便产生具有改进的特征的酶。例如，该基因可以被突变为编码以下PPC多肽，该多肽与天然多肽相比对天冬氨酸反馈抑制具有增加的耐受性。在其他实施例中，该PPC基因可以来自植物来源。
如在此使用，“天冬氨酸转氨酶基因”或“AAT基因”是指编码具有天冬氨酸转氨酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化OAA转化为天冬氨酸。具有天冬氨酸转氨酶活性的酶被分类为EC2.6.1.1。在某些实施例中，AAT基因可以来自酵母来源，例如东方伊萨酵母或酿酒酵母。例如，该AAT基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:14中的氨基酸序列的东方伊萨酵母AAT基因或编码阐述于SEQIDNO:15中的氨基酸序列的酿酒酵母AAT2基因。在其他实施例中，该基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:14或15的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自东方伊萨酵母的AAT基因可以包括阐述于SEQIDNO:13中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:13中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在其他实施例中，该AAT基因可以来自细菌来源。例如，该AAT基因可以来自大肠杆菌aspC基因，该基因编码包括阐述于SEQIDNO:16中的氨基酸序列的多肽。在其他实施例中，该基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:16的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
除本发明的昆虫ADC基因或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC基因之外，该酵母细胞可以包括另一中ADC基因(昆虫ADC基因、非昆虫ADC基因、或二者)。在一些实施例中，该ADC基因可以来自阿维链霉菌panD基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:17中的氨基酸序列。在一些实施例中，该ADC基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:17的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自阿维链霉菌的ADC基因可以包括阐述于SEQIDNO:130、145、146、和147的任一项中的核苷酸序列；或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:130、145、146、和147的任一项中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在其他实施例中，该ADC基因可以来自丙酮丁醇梭菌panD基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:18中的氨基酸序列。在一些实施例中，该ADC基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:18的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自丙酮丁醇梭菌的ADC基因可以包括阐述于SEQIDNO:131中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:131中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在其他实施例中，该ADC基因可以来自幽门螺杆菌ADC基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:133中的氨基酸序列。在一些实施例中，该ADC基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:133的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自幽门螺杆菌的ADC基因可以包括阐述于SEQIDNO:132中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:132中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在其他实施例中，该ADC基因可以来自芽孢杆菌属TS25ADC基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:135中的氨基酸序列。在一些实施例中，该ADC基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:135的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自芽胞杆菌属TS25的ADC基因可以包括阐述于SEQIDNO:134中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:134中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在其他实施例中，该ADC基因可以来自谷氨酸棒状杆菌ADC基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:137中的氨基酸序列。在一些实施例中，该ADC基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:137的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自谷氨酸棒状杆菌的ADC基因可以包括阐述于SEQIDNO:136中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:136中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在其他实施例中，该ADC基因可以来自地衣芽孢杆菌ADC基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:139中的氨基酸序列。在一些实施例中，该ADC基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:139的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自地衣芽孢杆菌的ADC基因可以包括阐述于SEQIDNO:138、148、149、150、和151的任一项中的核苷酸序列；或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:138、148、149、150、和151的任一项中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
如在此使用，“β-丙氨酸转氨酶基因”或“BAAT基因”是指编码具有β-丙氨酸转氨酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化β-丙氨酸转化为丙二酸半醛。具有β-丙氨酸转氨酶活性的酶被分类为EC2.6.1.19。在某些实施例中，BAAT基因可以来自酵母来源。例如，BAAT基因可以来自pyd4基因的东方伊萨酵母同系物，其编码阐述于SEQIDNO:20中的氨基酸序列。在一些实施例中，该BAAT基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自东方伊萨酵母的BAAT基因可以包括阐述于SEQIDNO:19中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:19中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在其他实施例中，该BAAT基因可以来自克鲁维毕赤酵母pyd4基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:21中的氨基酸序列。在一些实施例中，该BAAT基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:21的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自克鲁维毕赤酵母的BAAT基因可以包括阐述于SEQIDNO:142中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:142中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在其他实施例中，该BAAT基因可以来自细菌来源。例如，BAAT基因可以来自阿维链霉菌BAAT基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:22中的氨基酸序列。在一些实施例中，该BAAT基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:22的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自阿维链霉菌的BAAT基因可以包括阐述于SEQIDNO:140中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:140中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
BAAT基因还可以是“4-氨基丁酸转氨酶”或“gabT基因”，意指它对4-氨基丁酸以及β-丙氨酸具有天然活性。可替代地，可以通过随机或定向工程化来自细菌或酵母来源的天然gabT基因而得到BAAT基因，以编码具有BAAT活性的多肽。例如，BAAT基因可以来自阿维链霉菌gabT基因，该gabT基因编码阐述于SEQIDNO:23中的氨基酸序列。在一些实施例中，该来自阿维链霉菌的BAAT基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:23的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在其他实施例中，BAAT基因可以来自酿酒酵母gabT基因UGA1，该基因编码阐述于SEQIDNO:24中的氨基酸序列。在一些实施例中，该来自酿酒酵母的BAAT基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:24的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自酿酒酵母的BAAT基因可以包括阐述于SEQIDNO:141中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:141中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
如在此使用，“3-HP脱氢酶基因”或“3-HPDH基因”是指编码具有3-HP脱氢酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙二酸半醛转化为3-HP。具有3-HP脱氢酶活性的酶类被分类为EC1.1.1.59(如果它们利用NAD(H)辅因子)，和EC1.1.1.298(如果它们利用NADP(H)辅因子)。被分类为EC1.1.1.298的酶类可替代地被称为丙二酸半醛还原酶。
在某些实施例中，3-HPDH基因可以来自酵母来源。例如，3-HPDH基因可以来自YMR226C基因的东方伊萨酵母同系物(例如，编码阐述于SEQIDNO:26中的氨基酸序列的东方伊萨酵母序列)。在一些实施例中，该3-HPDH基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:26的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自东方伊萨酵母的3-HPDH基因可以包括阐述于SEQIDNO:25中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:25中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在其他实施例中，3-HPDH基因可以来自酿酒酵母YMR226C基因，该YMR226C基因编码阐述于SEQIDNO:129中的氨基酸序列。在一些实施例中，该3-HPDH基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:129的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自酿酒酵母的3-HPDH基因可以包括阐述于SEQIDNO:144中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:144中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在其他实施例中，该3-HPDH基因可以来自细菌来源。例如，3-HPDH基因可以来自大肠杆菌ydfG基因，该基因编码SEQIDNO:27中的氨基酸序列。在一些实施例中，该基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:27的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自大肠杆菌的3-HPDH基因可以包括阐述于SEQIDNO:143中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:143中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在其他实施例中，3-HPDH基因可以来自勤奋金属球菌(M.sedula)丙二酸半醛还原酶基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:29中的氨基酸序列。在一些实施例中，该3-HPDH基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与阐述于SEQIDNO:29中的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自勤奋金属球菌的3-HPDH基因可以包括阐述于SEQIDNO:152中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:152中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在某些实施例中，与NADP(H)相比，3-HPDH基因可以是具有针对NAD(H)的增加的特异性的天然的或工程化基因。具有针对NAD(H)的增加的特异性的3-HPDA变体描述于WO/2013/049073(其内容在此通过引用并入本文)中。
如在此使用，“3-羟基异丁酸脱氢酶基因”或“HIBADH基因”是指编码具有3-羟基异丁酸脱氢酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化3-羟基异丁酸转化为甲基丙二酸半醛。具有3-羟基异丁酸脱氢酶活性的酶被分类为EC1.1.1.31。一些3-羟基异丁酸脱氢酶还具有3-HPDH活性。在某些实施例中，HIBADH基因可以来自细菌来源。例如，HIBADH基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:28中的氨基酸序列的粪产碱菌(A.faecalis)M3A基因、分别编码阐述于SEQIDNO:30或SEQIDNO:31中的氨基酸序列的恶臭假单胞菌KT2440或E23440mmsB基因或编码阐述于SEQIDNO:32中的氨基酸序列的铜绿假单胞菌PAO1mmsB基因。在某些实施例中，HIBADH基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与阐述于SEQIDNO:28、30、31、或32中的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
如在此使用，“4-羟基丁酸脱氢酶基因”是指编码具有4-羟基丁酸脱氢酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化4-羟基丁酸转化为丁二酸半醛。具有4-羟基丁酸脱氢酶活性的酶被分类为EC1.1.1.61。一些4-羟基丁酸脱氢酶还具有3-HPDH活性。在某些实施例中，4-羟基丁酸脱氢酶基因可以来自细菌来源。例如，4-羟基丁酸脱氢酶基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:33中的氨基酸序列的真氧产碱杆菌(R.eutropha)H164hbd基因或编码阐述于SEQIDNO:34中的氨基酸序列的克氏梭菌(C.kluyveri)DSM555hbd基因。在其他实施例中，该基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与阐述于SEQIDNO:33或34中的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
如在此使用，“PEP羧激酶基因”或“PCK基因”是指编码具有PEP羧激酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化PEP、CO2、和ADP或GDP转化为OAA和ATP或GTP，或反之亦然。具有PEP羧激酶活性的酶被分类为EC4.1.1.32(利用GTP/GDP)和EC4.1.1.49(利用ATP/ADP)。在某些实施例中，PCK基因可以来自酵母来源。在其他实施例中，PCK基因可以来自细菌来源，并且在这些实例的某些实施例中，该基因可以来自以下细菌，在该细菌体内PCK反应有利于OAA的产生而非其中脱羧作用是优势的更常见形式的反应。例如，PCK基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:35中的氨基酸序列的产琥拍酸曼氏杆菌(M.succiniciproducens)PCK基因、编码阐述于SEQIDNO:36中的氨基酸序列的产琥珀酸厌氧螺菌(A.succiniciproducens)PCK基因、编码阐述于SEQIDNO:37中的氨基酸序列的产琥珀酸放线杆菌(A.succinogenes)PCK基因或编码阐述于SEQIDNO:38中的氨基酸序列的真氧产碱杆菌PCK基因。在其他实施例中，PCK基因已经经历对它来自其中的天然基因的一个或多个突变，这样使得所得基因编码以下多肽，该多肽优选地催化PEP转化为OAA。例如，PCK基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:39中的氨基酸序列的大肠杆菌K12菌株PCK基因，其中该基因已被突变为优选地催化PEP转化为OAA。在其他实施例中，通过PEP羧基转磷酸酶催化PEP至OAA的转化，例如发现于丙酸细菌(例如，谢氏丙酸杆菌(P.shermanii)、伍氏醋酸杆菌(A.woodii))中的，这些丙酸细菌使用无机磷酸和二磷酸而非ATP/ADP或GTP/GDP。
如在此使用，“苹果酸脱氢酶基因”是指编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化OAA转化为苹果酸。在某些实施例中，苹果酸脱氢酶基因可以来自细菌或酵母来源。
如在此使用，“苹果酸脱羧酶基因”是指编码具有苹果酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化苹果酸转化为3-HP。已知苹果酸脱羧酶活性不天然地发生。因此，可以通过将一个或多个突变掺入天然来源基因中而得到苹果酸脱羧酶基因，该天然来源基因编码具有乙酰乳酸脱羧酶活性的多肽。具有乙酰乳酸脱羧酶活性的多肽催化2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸转化为2-乙偶姻，并被分类为EC4.1.1.5。在某些实施例中，苹果酸脱羧酶基因可以来自细菌来源。例如，苹果酸脱羧酶基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:40中的氨基酸序列的乳酸乳球菌aldB基因、编码阐述于SEQIDNO:41中的氨基酸序列的嗜热链球菌aldB基因、编码阐述于SEQIDNO:42中的氨基酸序列的短芽孢杆菌aldB基因或编码阐述于SEQIDNO:43中的氨基酸序列的产气肠杆菌budA基因。
如在此使用，“α-酮戊二酸(AKG)脱羧酶基因”或“KGD基因”是指编码具有α-酮戊二酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化α-酮戊二酸(2-氧化戊二酸)转化为丁二酸半醛。具有AKG脱羧酶活性的酶被分类为EC4.1.1.71。可以使用KGD基因得到以下基因，该基因编码能够催化OAA转化为丙二酸半醛的多肽。这一活性可以发现于天然KGD基因中，或可以通过将一个或多个突变掺入天然KGD基因中而得到该活性。在某些实施例中，KGD基因可以来自细菌来源。例如，KGD基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:44中的氨基酸序列的结核分枝杆菌KGD基因、编码阐述于SEQIDNO:45中的氨基酸序列的慢生型大豆根瘤菌KGD基因或编码阐述于SEQIDNO:46中的氨基酸序列的洛蒂分枝杆菌(M.loti)(又称洛蒂根瘤菌(Rhizobiumloti))KGD基因。
如在此使用，“支链α-酮酸脱羧酶基因”或“BCKA基因”是指编码具有支链α-酮酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，该活性可用于使一系列长度为三至六个碳的α-酮酸脱羧。具有BCKA活性的酶被分类为EC4.1.1.72。可以使用BCKA基因得到以下基因，该基因编码能够催化OAA转化为丙二酸半醛的多肽。这一活性可以发现于天然BCKA基因中，或可以通过将一个或多个突变掺入天然BCKA基因中而得到该活性。在某些实施例中，BCKA基因可以来自细菌来源。例如，BCKA基因可以来自乳酸乳球菌kdcA基因，该kdcA基因编码阐述于SEQIDNO:47中的氨基酸序列。
如在此使用，“吲哚丙酮酸脱羧酶基因”或“IPDA基因”是指编码具有吲哚丙酮酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化吲哚丙酮酸转化为吲哚乙醛。具有IPDA活性的酶被分类为EC4.1.1.74。可以使用IPDA基因得到以下基因，该基因编码能够催化OAA转化为丙二酸半醛的多肽。这一活性可以发现于天然IPDA基因中，或可以通过将一个或多个突变掺入天然IPDA基因中而得到该活性。在某些实施例中，吲哚丙酮酸脱羧酶基因可以来自酵母、细菌或植物来源。
如在此使用，“丙酮酸脱羧酶基因”或“PDC基因”是指编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸转化为乙醛。具有PDC活性的酶被分类为EC4.1.1.1。在优选实施例中，被掺入如在此提供的修饰的酵母细胞中的PDC基因已经经历对它来自其中的天然基因的一个或多个突变，这样使得所得基因编码能够催化OAA转化为丙二酸半醛的多肽。在某些实施例中，PDC基因可以来自酵母来源。例如，PDC基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:49中的氨基酸序列的东方伊萨酵母PDC基因、编码阐述于SEQIDNO:50中的氨基酸序列的酿酒酵母PDC1基因或编码阐述于SEQIDNO:51中的氨基酸序列的乳酸克鲁维酵母PDC基因。在某些实施例中，来自东方伊萨酵母PDC基因的PDC基因可以包括阐述于SEQIDNO:48中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于SEQIDNO:48中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在其他实施例中，PDC基因可以来自细菌来源。例如，PDC基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:52中的氨基酸序列的运动发酵单胞菌PDC基因或编码阐述于SEQIDNO:53中的氨基酸序列的巴氏醋酸杆菌PDC基因。
如在此使用，“苯甲酰甲酸脱羧酶”基因是指编码具有苯甲酰甲酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化苯甲酰甲酸转化为苯甲醛。具有苯甲酰甲酸脱羧酶活性的酶被分类为EC4.1.1.7。在优选实施例中，被掺入如在此提供的修饰的酵母细胞中的苯甲酰甲酸脱羧酶基因已经经历对它来自其中的天然基因的一个或多个突变，这样使得所得基因编码能够催化OAA转化为丙二酸半醛的多肽。在某些实施例中，苯甲酰甲酸脱羧酶基因可以来自细菌来源。例如，苯甲酰甲酸脱羧酶基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:54中的氨基酸序列的恶臭假单胞菌mdlC基因、编码阐述于SEQIDNO:55中的氨基酸序列的铜绿假单胞菌mdlC基因、编码阐述于SEQIDNO:56中的氨基酸序列的施氏假单胞菌dpgB基因或编码阐述于SEQIDNO:57中的氨基酸序列的荧光假单胞菌ilvB-1基因。
如在此使用，“OAA甲酸裂解酶基因”是指编码具有OAA甲酸裂解酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化酰化物酮酸转化为其对应的辅酶A衍生物。由OAA甲酸裂解酶基因编码的多肽对丙酮酸或对另一种酮酸可以具有活性。在某些实施例中，OAA甲酸裂解酶基因编码一种将OAA转化为丙二酰辅酶A的多肽。
如在此使用，“丙二酰辅酶A还原酶基因”是指编码具有丙二酰辅酶A还原酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙二酰辅酶A转化为丙二酸半醛(亦称辅酶A酰化丙二酸半醛脱氢酶活性)。在某些实施例中，丙二酰辅酶A还原酶基因可以来自双功能丙二酰辅酶A还原酶基因，该双功能丙二酰辅酶A还原酶基因还具有催化丙二酸半醛转化为3-HP的能力。在这些实施例的某些实施例中，丙二酰辅酶A还原酶基因可以来自细菌来源。例如，丙二酰辅酶A还原酶基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:58中的氨基酸序列的橙色绿屈挠菌(C.aurantiacus)丙二酰辅酶A还原酶基因、编码阐述于SEQIDNO:59中的氨基酸序列的卡氏玫瑰弯菌(R.castenholzii)丙二酰辅酶A还原酶基因或编码阐述于SEQIDNO:60中的氨基酸序列的赤杆菌属NAP1丙二酰辅酶A还原酶基因。在其他实施例中，丙二酰辅酶A还原酶基因可以来自以下丙二酰辅酶A还原酶基因，该基因编码仅催化丙二酰辅酶A转化为丙二酸半醛的多肽。例如，丙二酰辅酶A还原酶基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:61中的氨基酸序列的勤奋金属球菌Msed_0709基因或编码阐述于SEQIDNO:62中的氨基酸序列的嗜热古菌(S.tokodaii)丙二酰辅酶A还原酶基因。
如在此使用，“丙酮酸脱氢酶基因”或“PDH基因”是指编码具有丙酮酸脱氢酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A。在某些实施例中，PDH基因可以来自酵母来源。例如，PDH基因可以来自酿酒酵母LAT1、PDA1、PDB1或LPD基因，这些基因分别编码阐述于SEQIDNO:63-66中的氨基酸序列。在其他实施例中，PDH基因可以来自细菌来源。例如，PDH基因可以来自大肠杆菌菌株K12亚株MG1655aceE、aceF或lpd基因，这些基因分别编码阐述于SEQIDNO:67-69中的氨基酸序列，或枯草芽孢杆菌pdhA、pdhB、pdhC或pdhD基因，这些基因分别编码阐述于SEQIDNO:70-73中的氨基酸序列。
如在此使用，“乙酰辅酶A羧化酶基因”或“ACC基因”是指编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A。具有乙酰辅酶A羧化酶活性的酶被分类为EC6.4.1.2。在某些实施例中，乙酰辅酶A羧化酶基因可以来自酵母来源。例如，乙酰辅酶A羧化酶基因可以来自酿酒酵母ACC1基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:74中的氨基酸序列。在其他实施例中，乙酰辅酶A羧化酶基因可以来自细菌来源。例如，乙酰辅酶A羧化酶基因可以来自分别编码阐述于SEQIDNO:75-78中的氨基酸序列的大肠杆菌accA、accB、accC或accD基因或分别编码阐述于SEQIDNO:79-82中的氨基酸序列的橙色绿屈挠菌accA、accB、accC或accD基因。
如在此使用，“丙氨酸脱氢酶基因”是指编码具有丙氨酸脱氢酶基因活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸NAD依赖性还原氨化为丙氨酸。具有丙氨酸脱氢酶活性的酶被分类为EC1.4.1.1。在某些实施例中，丙氨酸脱氢酶基因可以来自细菌来源。例如，丙氨酸脱氢酶基因可以来自枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶基因，该枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶基因编码阐述于SEQIDNO:83中的氨基酸序列。
如在此使用，“丙酮酸/丙氨酸转氨酶基因”是指编码具有丙酮酸/丙氨酸转氨酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸和L-谷氨酸转化为丙氨酸和2-氧化戊二酸。在某些实施例中，丙酮酸/丙氨酸转氨酶基因来自酵母来源。例如，丙酮酸/丙氨酸转氨酶基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:84中的氨基酸序列的粟酒裂殖酵母丙酮酸/丙氨酸转氨酶基因或编码阐述于SEQIDNO:85中的氨基酸序列的酿酒酵母ALT2基因。
如在此使用，“丙氨酸2,3-氨基变位酶基因”或“AAM基因”是指编码具有丙氨酸2,3-氨基变位酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙氨酸转化为β-丙氨酸。已知丙氨酸2,3氨基变位酶活性不天然地发生。因此，可通过将一个或多个突变掺入天然来源基因中而得到丙氨酸2,3氨基变位酶基因，该天然来源基因编码具有类似活性(例如赖氨酸2,3氨基变位酶活性)的多肽(参见例如，美国专利7,309,597)。在某些实施例中，该天然来源基因可以是编码阐述于SEQIDNO:86中的氨基酸序列的枯草芽孢杆菌赖氨酸2,3氨基变位酶基因、编码阐述于SEQIDNO:87中的氨基酸序列的牙龈卟啉单胞菌赖氨酸2,3氨基变位酶基因或编码阐述于SEQIDNO:88中的氨基酸序列的核梭杆菌(F.nucleatum)(ATCC10953)赖氨酸2,3氨基变位酶基因。
如在此使用，“辅酶A转移酶基因”是指编码具有辅酶A转移酶活性的多肽的任何基因，在一个实例中，该活性包括催化β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶A和/或催化乳酸转化为乳酰辅酶A的能力。在某些实施例中，辅酶A转移酶基因可以来自酵母来源。在其他实施例中，辅酶A转移酶基因可以来自细菌来源。例如，辅酶A转移酶基因可以来自埃氏巨球形菌辅酶A转移酶基因，该埃氏巨球形菌辅酶A转移酶基因编码阐述于SEQIDNO:89中的氨基酸序列。
如在此使用，“辅酶A合成酶基因”是指编码具有辅酶A合成酶活性的多肽的任何基因。在一个实例中，这一活性包括催化β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶A的能力。在另一个实例中，这一活性包括催化乳酸转化为乳酰辅酶A的能力。在某些实施例中，辅酶A合成酶基因可以来自酵母来源。例如，辅酶A合成酶基因可以来自酿酒酵母辅酶A合成酶基因。在其他实施例中，辅酶A合成酶基因可以来自细菌来源。例如，辅酶A合成酶基因可以来自大肠杆菌、球形红假单胞菌、或肠道沙门菌辅酶A合成酶基因。
如在此使用，“β-丙氨酰辅酶A解氨酶基因”是指编码具有β-丙氨酰辅酶A解氨酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化β-丙氨酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A。在某些实施例中，β-丙氨酰辅酶A解氨酶基因可以来自细菌来源，例如丙酸杆菌(C.propionicum)β-丙氨酰辅酶A解氨酶基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:90中的氨基酸序列。
如在此使用，“3-HP辅酶A脱水酶基因”或“丙烯酰辅酶A水合酶基因”是指编码具有3-HP辅酶A脱水酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙烯酰辅酶A转化为3-HP辅酶A。具有3-HP辅酶A脱水酶活性的酶被分类为EC4.2.1.116。在某些实施例中，3-HP辅酶A脱水酶基因可以来自酵母或真菌来源，例如大豆疫霉菌(P.sojae)3-HP辅酶A脱水酶基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:91中的氨基酸序列。在其他实施例中，3-HP辅酶A脱水酶基因可以来自细菌来源。例如，3-HP辅酶A脱水酶基因可以来自编码阐述于SEQIDNO:92中的氨基酸序列的橙色绿屈挠菌3-HP辅酶A脱水酶基因、编码阐述于SEQIDNO:93中的氨基酸序列的深红红螺菌(R.rubrum)3-HP辅酶A脱水酶基因或编码阐述于SEQIDNO:94中的氨基酸序列的有蒴红螺菌(R.capsulates)3-HP辅酶A脱水酶基因。在仍其他实施例中，3-HP辅酶A脱水酶基因可以来自哺乳动物来源。例如，3-HP辅酶A脱水酶基因可以来自智人3-HP辅酶A脱水酶基因，该智人3-HP辅酶A脱水酶基因编码阐述于SEQIDNO:95中的氨基酸序列。
如在此使用，“3-HP辅酶A水解酶基因”是指编码具有3-HP辅酶A水解酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化3-HP辅酶A转化为3-HP。在某些实施例中，3-HP辅酶A水解酶基因可以来自酵母或真菌来源。在其他实施例中，3-HP辅酶A水解酶基因可以来自细菌来源。
如在此使用，“3-羟基异丁酰辅酶A水解酶基因”是指编码具有3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性的多肽的任何基因，在一个实例中，该活性包括催化3-HP辅酶A转化为3-HP的能力。在某些实施例中，3-羟基异丁酰辅酶A水解酶基因可以来自细菌来源，例如编码阐述于SEQIDNO:96中的氨基酸序列的荧光假单胞菌3-羟基异丁酰辅酶A水解酶基因或编码阐述于SEQIDNO:97中的氨基酸序列的蜡状芽孢杆菌3-羟基异丁酰辅酶A水解酶基因。在其他实施例中，3-羟基异丁酰辅酶A水解酶基因可以来自哺乳动物来源，例如智人3-羟基异丁酰辅酶A水解酶基因，该基因编码阐述于SEQIDNO:98中的氨基酸序列。
如在此使用，“乳酸脱氢酶基因”或“LDH基因”是指编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸转化为乳酸。在某些实施例中，LDH基因可以来自真菌、细菌或哺乳动物来源。
如在此使用，“乳酰辅酶A脱水酶基因”是指编码具有乳酰辅酶A脱水酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化乳酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A。在某些实施例中，乳酰辅酶A脱水酶基因可以来自细菌来源。例如乳酰辅酶A脱水酶基因可以来自埃氏巨球形菌乳酰辅酶A脱水酶E1、EIIa或EIIb亚单位基因，这些基因编码阐述于SEQIDNO:99-101中的氨基酸序列。
如在此使用，“醛脱氢酶基因”是指编码具有醛脱氢酶活性的多肽的任何基因，在一个实例中，该活性包括催化3-HPA转化为3-HP的能力(反之亦然)。在某些实施例中，醛脱氢酶基因可以来自酵母来源，例如编码阐述于SEQIDNO:102中的氨基酸序列的酿酒酵母醛脱氢酶基因或编码阐述于SEQIDNO:122、124或126中的氨基酸序列的东方伊萨酵母醛脱氢酶基因。SEQIDNO:121、123、和125分别是SEQIDNO122、124、和126的编码序列。在其他实施例中，醛脱氢酶基因可以来自细菌来源，例如编码阐述于SEQIDNO:103中的氨基酸序列的大肠杆菌aldH基因或编码阐述于SEQIDNO:104中的氨基酸序列的肺炎克雷伯菌醛脱氢酶基因。
如在此使用，“甘油脱水酶基因”是指编码具有甘油脱水酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化甘油转化为3-HPA。在某些实施例中，甘油脱水酶基因可以来自细菌来源，例如肺炎克雷伯菌或弗氏柠檬酸杆菌甘油脱水酶基因。
可以使用本领域已知的方法或如在此描述检测所选主动3-HP途径的酶及其活性。这些检测方法可包括使用特异抗体、形成酶产物、或酶底物的消失。参见，例如萨拉布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验指南(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第三版，冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory)，纽约(2001)；奥苏贝尔(Ausubel)等人，当前分子生物学(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，约翰威利父子公司(JohnWileyandSons)，巴尔的摩，马里兰州(1999)；以及哈奈(Hanai)等人，2007，应用及环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)73:7814-7818)。
宿主、表达载体与核酸构建体
重组酵母细胞可以是当表达编码昆虫ADC或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC的异源多核苷酸时能够产生3-HP的任何酵母细胞。本领域的普通技术人员应该理解，遗传改变(包括在此示例的代谢修饰)可以参考适合的宿主生物(例如东方伊萨酵母)及其相应的代谢反应或用于希望的遗传材料(例如希望的代谢途径的基因)的适合的来源生物加以描述。然而，考虑到多种多样的生物的全基因组测序以及基因组学领域中的较高水平的技能，本领域的普通技术人员可以将在此提供的教导和指导应用于其他酵母生物中。例如，可以通过掺入相同的或来自不同于参考物种的物种的类似编码核酸而容易地将在此示例的东方伊萨酵母代谢改变应用于其他物种中。
如在此使用，“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母以及属于半知菌类(芽生菌)的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，出于在此描述的目的，酵母应如在酵母生物学与活性(BiologyandActivitiesofYeast)(斯金纳(Skinner)，F.A.，帕斯莫尔(Passmore)，S.M.和达文波特(Davenport)，R.R.编著，应用细菌学研讨会系列第9期(Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9)，1980)中所述进行定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如萨纳瑞西斯假丝酵母、甲醇山梨糖假丝酵母、嗜酒假丝酵母、东方伊萨酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、发酵毕赤酵母、格雷弗密斯毕赤酵母(Pichiagaleiformis)、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranifaciens)、沙漠毕赤酵母(Pichiadeserticola)、卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、布拉迪酵母(Saccharomycesbulderi)、道格拉斯酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁维酵母、诺地酵母、卵形酵母、解脂耶氏酵母细胞。
该酵母宿主细胞可以是工程化自或来自一个细胞，这样使得该细胞已经被遗传修饰为产生较高的乳酸滴度，对酸性pH展现出增加的耐受性，对乙醇或丙醇展现出增加的耐受性和/或展示出发酵戊糖的增加的能力(然而，在一些实施例中，该酵母细胞不能发酵戊糖)。示例性遗传修饰的酵母细胞描述于WO00/071738、WO03/049525、WO03/102201、WO03/102152、WO02/42471、WO07/032792、WO07/106524、和WO07/117282中，将其内容相对于所述细胞通过引用结合在此。将描述于前述申请中的任何酵母细胞的修饰与如在此描述的主动3-HP途径一起考虑。
该酵母宿主细胞可以是克拉布特里(Crabtree)阳性表型或克拉布特里阴性表型。克拉布特里阴性生物由被诱导为增加的发酵性状态的能力表征。天然存在的生物和重组生物两者都可以被表征为克拉布特里阴性的。将克拉布特里效应定义为当在高浓度的葡萄糖(例如>5mM葡萄糖)的存在下在需氧条件下培养微生物时，该微生物中的耗氧抑制。不论氧利用率如何，克拉布特里阳性生物在葡萄糖的存在下继续发酵(而非呼吸)，而克拉布特里阴性生物未展示出葡萄糖介导的耗氧抑制。这一特征对于有机产品合成而言是有用的，因为它允许细胞在较高的底物浓度下生长，但保留氧化磷酸化的有益的高能作用。在另一方面，该酵母具有克拉布特里阴性表型。
在某些实施例中，在此提供的酵母细胞是3-HP耐受的酵母细胞，如描述于WO2012/074818中。如在此使用，“3-HP耐受的酵母细胞”是指在包含75g/L或更多3-HP的培养基中，在小于4.0的pH下，展现出至少2.5g/L/hr的平均糖分解速度的酵母细胞。这样的速度和条件代表用于生产3-HP的经济过程。在这些实施例的某些实施例中，这些酵母细胞能以其天然形式展现出3-HP耐受性。在其他实施例中，在引入与主动3-HP途径相关的遗传修饰前、中或后，这些细胞可以已经经历突变和/或选择(例如，恒化器选择或重复的系列传代培养)，这样使得这些突变的和/或选择的细胞具有比同一物种的野生型细胞对3-HP的更高程度的耐受性。例如，在一些实施例中，在用一个或多个异源3-HP途径基因遗传修饰之前，这些细胞已经在3-HP或乳酸的存在下经历了突变和/或选择。在某些实施例中，可以在以其天然形式展示出3-HP抗性的细胞上进行突变和/或选择。可以在不同水平的3-HP的存在下，针对糖消耗以及其他特征对经历突变和/或选择的细胞进行测试，以便确定它们作为用于生产3-HP的工业化宿主的可能性。除了3-HP耐受性以外，在此提供的酵母细胞可以经历用于抵抗一种或多种另外的有机酸(例如，乳酸)或抵抗其他发酵产物、副产物或培养基组分的突变和/或选择。
可以使用本领域熟知的方法完成选择，例如对3-HP或对其他化合物的耐受性的选择。例如，如在上文提及的，选择可以是恒化器选择。恒化器选择使用以下恒化器，该恒化器允许连续培养微生物(例如，酵母)，其中可以独立控制比生长速率和细胞数目。连续培养实质上是一种定容的流动系统，向其中连续添加培养基并且从其中可以发生任何溢流的连续去除。一旦这样的一个系统处于平衡状态，则细胞数目和营养素状态保持不变，并且该系统处于稳态。恒化器允许通过一种限制性营养素(例如碳源或氮源)的稀释率和浓度的改变来控制培养物的群体密度和比生长速率两者。通过改变培养物生长时的条件(例如，在其他之中，减少接种物菌株的生长必需的次级碳源的浓度)，将在该群体中选择能够在改变的条件下长得更快的微生物并且这些微生物将比在新的条件下作用得不同样好的微生物长得快。典型地，这样的选择需要在恒化培养物的生长过程中至少一种培养物组分的递增或递减。恒化器的操作以及它们在微生物的定向进化中的用途在本领域是熟知的(参见，例如诺维克(Novick)，1950，美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)36:708-719，哈德(Harder)，1977，应用细菌学杂志(JApplBacteriol)43:1-24)。其他选择方法包括但不限于在选择条件下进行重复的系列传代培养，如描述于例如美国专利号7,629,162中。可以使用此类方法代替使用以上描述的葡萄糖受限的恒化器方法或除其之外，可以使用此类方法。
在3-HP培养基中展现出生长和葡萄糖消耗的最佳组合的酵母菌株(如描述于例如WO2012/074818中)对于与3-HP途径相关的各种遗传修饰而言是优选的宿主细胞。具有相对较高水平的3-HP耐受性的潜力(如通过在75g/L3-HP或更高的3-HP的存在下，在低于4的pH下的生长所指示的)的酵母属包括例如假丝酵母属、伊萨酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、有孢圆酵母属、以及接合酵母属。展现出3-HP耐受性的物种包括东方伊萨酵母(亦称克柔假丝酵母(C.krusei))、郎比可假丝酵母(C.lambica)(亦称发酵毕赤酵母)和布拉迪酵母(S.bulderi)(亦称Kazachstaniabulderi)。东方伊萨酵母和郎比可假丝酵母来自东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝，而布拉迪酵母来自酵母属进化枝。展现出3-HP耐受性的具体菌株包括东方伊萨酵母菌株24210、PTA-6658、60585和CD1822，布拉迪酵母菌株MYA-402和MYA-40以及郎比可假丝酵母菌株ATCC38617。
可以按类似方式测试其他野生型酵母或真菌并且鉴定在较高水平的3-HP的存在下具有可接受水平的生长和葡萄糖利用率的酵母或真菌，如在此描述。例如，格罗斯(Gross)和罗宾斯(Robbins)，2000，水生生物学(Hydrobiologia)433(103):91-109，已经编辑了在较低的pH(<4)环境中鉴定的81种真菌物种的一个列表，该列表可以作为潜在生产宿主与测试相关。
在某些实施例中，通过将一个或多个遗传修饰掺入克拉布特里阴性宿主酵母细胞中产生在此提供的修饰的酵母细胞。在这些实施例的某些实施例中，该宿主酵母细胞属于假丝酵母属、伊萨酵母属、或酵母属，并且在这些实施例的某些实施例中，该宿主细胞属于东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母或酵母属进化枝。在某些实施例中，该宿主细胞是东方伊萨酵母、郎比可假丝酵母、或布拉迪酵母。
东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝是最末端进化枝，该进化枝至少包含物种东方伊萨酵母、格雷弗密斯毕赤酵母(P.galeiformis)、毕赤酵母属YB-4149(NRRL指定)、嗜酒假丝酵母、沙漠毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、以及发酵毕赤酵母。使用如库兹曼(Kurtzman)和罗伯尼特(Robnett)描述于“从核大亚基(26S)核糖体DNA部分序列的分析中鉴定子囊菌纲酵母及其系统发育(IdentificationandPhylogenyofAscomycetousYeastsfromAnalysisofNuclearLargeSubunit(26S)RibosomalDNAPartialSequences)”，安东尼·范·列文虎克(AntonievanLeeuwenhoek)73:331-371,1998中的方法，通过分析酵母物种的26S核糖体DNA的可变D1/D2结构域鉴定东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝的成员(尤其参见第349页)。从数以百计的子囊菌中分析26S核糖体DNA的可变D1/D2结构域揭示，东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝包含非常密切相关的物种。与位于该进化枝外的酵母物种相比，东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝的成员与该进化枝的其他物种在26S核糖体DNA的可变D1/D2结构域中展现出较大的相似性。因此，可以使用库兹曼(Kurtzman)和罗伯尼特(Robnett)的方法，通过比较其对应的核糖体DNA的D1/D2结构域并且与该进化枝的其他成员和该进化枝外的密切相关物种相比较而鉴定东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝的其他成员。
在某些实施例中，在此提供的重组酵母细胞属于伊萨酵母属，并且在这些实施例的某些实施例中，这些酵母细胞是东方伊萨酵母。当第一次被表征时，物种东方伊萨酵母被指定的名称是库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。东方伊萨酵母的无性型(无性形式)被称为克柔假丝酵母。已经在别处列举了物种东方伊萨酵母的多种另外的异名(库兹曼(Kurtzman)和费尔(Fell)，酵母分类研究(TheYeasts,aTaxonomicStudy).第35节.库德里亚夫采夫伊萨酵母(IssatchenkiaKudryavtsev)，第222-223页(1998))。
在某些实施例中，这些酵母细胞是东方伊萨酵母CNB1酵母细胞。东方伊萨酵母CNB1酵母细胞描述于WO2012/074818(将其内容通过引用结合在此)中并且包括在此描述的东方伊萨酵母CNB1酵母细胞以及来自在此描述的东方伊萨酵母CNB1酵母细胞的任何酵母细胞。
可以被用作东方伊萨酵母整合座位的基因包括，但不限于：编码SEQIDNO:106的多肽的醇脱氢酶基因(adh2556，SEQIDNO:105)、编码SEQIDNO:108的多肽的替代的醇脱氢酶基因(adh9091，SEQIDNO:107)、编码SEQIDNO:110的多肽的第二替代的醇脱氢酶基因(adh1202，SEQIDNO:109)、编码SEQIDNO:112的多肽的半胱氨酸胺肽酶基因(gal6，SEQIDNO:111)、编码SEQIDNO:114的多肽的L-乳酸细胞色素-c氧化还原酶基因(cyb2A，SEQIDNO:113)、编码SEQIDNO:116的多肽的替代的L-乳酸细胞色素-c氧化还原酶基因(cyb2B，SEQIDNO:115)、编码SEQIDNO:118的多肽的甘油3-磷酸脱氢酶基因(gpd，SEQIDNO:117)、编码SEQIDNO:120的多肽的醛脱氢酶基因(ald5680，SEQIDNO:119)、编码SEQIDNO:122的多肽的替代的醛脱氢酶基因(SEQIDNO:121)、编码SEQIDNO:124的多肽的替代的醛脱氢酶基因(SEQIDNO:123)、编码SEQIDNO:126的多肽的替代的醛脱氢酶基因(SEQIDNO:125)、或编码SEQIDNO:128的多肽的磷酸烯醇丙酮酸羧基酶基因(pck1，SEQIDNO:127)。
3-HP生产的理想酵母细胞能够在较低的pH水平下生长。在较低的pH下进行发酵的能力降低了下游的回收成本，从而使得生产更经济。因此，在某些实施例中，该酵母宿主细胞能够在较低的pH水平下(例如，在低于7、6、5、4或3的pH水平下)生长。
除3-HP耐受性和/或较低pH生长能力之外，适合的宿主细胞可以具有一种或多种有利的特征。例如，可以基于糖分解速度、比生长速率、耐热性、对生物质水解产物抑制剂的耐受性、整体流程稳健性等对展现出3-HP耐受性的潜在的宿主细胞进行进一步选择。可以在进行与3-HP途径相关的任何遗传修饰之前评估这些标准，或可以在已经发现一种或多种此类修饰之后对其进行评估。
因为大部分酵母天然地产生乙醇，所以在从丙酮酸(PDC)生产乙醇中，消除或严重减少催化第一步的酶对于替代产物的足够产量而言是有利的。在克拉布特里阳性酵母(例如酵母属)中，破坏的PDC基因导致宿主需要用于二碳化合物(例如乙醇或乙酸)的营养缺陷型，并且在包含葡萄糖的培养基中导致缺乏生长。可以使用对乙酸依赖和葡萄糖耐受的渐进选择而获得能够克服这些局限的突变体(参见例如，范马里斯(vanMaris)应用与环境微生物学(ApplEnvironMicrobiol)ApplEnvironMicrobiol70:159(2004))。因此，在某些实施例中，优选的酵母宿主细胞是克拉布特里阴性酵母细胞，其中PDC被破坏的菌株能够在葡萄糖上生长并保留C2原养型。下文提供了对基因破坏的更加详细的讨论。
在一些方面中，该酵母细胞包括在此描述的主动3-HP途径的一种或多种(例如，两种、若干种)异源多核苷酸(例如，一种编码PPC的异源多核苷酸；一种编码PYC的异源多核苷酸；一种编码AAT的异源多核苷酸；一种编码ADC的异源多核苷酸；一种编码BAAT或gabT的异源多核苷酸；和/或一种编码3-HPDH的异源多核苷酸)，其中当在相同条件下培养时，与没有主动3-HP途径的这一种或多种异源多核苷酸的宿主细胞相比，该酵母细胞分泌(和/或能够分泌)增加水平的3-HP。在一些方面，当在相同条件下培养时，与没有主动3-HP途径的这一种或多种异源多核苷酸的宿主细胞相比，该酵母细胞分泌和/或能够分泌增加至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的水平的3-HP。适合的培养条件的实例在下面进行了描述并且鉴于在此传授的内容，对本领域的普通技术人员而言将是容易地显而易见的。
在这些方面的任何方面中，该重组酵母细胞产生(和/或能够产生)产量为理论产量的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、或至少90％的3-HP。
在这些方面的任何方面中，该重组酵母细胞具有大于约0.1g/L/小时的3-HP体积生产力，例如大于约0.2g/L/小时、0.5g/L/小时、0.6g/L/小时、0.7g/L/小时、0.8g/L/小时、0.9g/L/小时、1.0g/L/小时、1.1g/L/小时、1.2g/L/小时、1.3g/L/小时、1.5g/L/小时、1.75g/L/小时、2.0g/L/小时、2.25g/L/小时、2.5g/L/小时或3.0g/L/小时；或约0.1g/L/小时与约2.0g/L/小时之间，例如约0.3g/L/小时与约1.7g/L/小时之间、约0.5g/L/小时与约1.5g/L/小时之间、约0.7g/L/小时与约1.3g/L/小时之间、约0.8g/L/小时与约1.2g/L/小时之间或约0.9g/L/小时与约1.1g/L/小时之间。
在这些方面的任何方面中，在相同条件下培养时，与没有编码昆虫ADC或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC的异源多核苷酸的酵母细胞相比，该重组酵母细胞产生(和/或能够产生)更大量的3-HP。在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码昆虫ADC或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC的异源多核苷酸的细胞相比，该酵母细胞产生(和/或能够产生)多至少10％(例如，多至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、至少200％、至少300％、或至少500％)的3-HP。
在这些方面的任何方面中，在相同条件下培养时，与第二重组酵母细胞相比，编码昆虫ADC或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC的重组酵母细胞产生(和/或能够产生)更大量的3-HP；其中该第二酵母细胞与编码昆虫ADC或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC的酵母细胞相同，其条件是该第二酵母细胞编码SEQIDNO:139的地衣芽孢杆菌ADC代替昆虫ADC或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC。在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与第二重组酵母细胞相比，该酵母细胞产生(和/或能够产生)多至少10％(例如，多至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、至少200％、至少300％、或至少500％)的3-HP。
可以使用本领域熟知的方法，在适合产生主动3-HP途径的一种或多种多肽的营养培养基中培养这些重组酵母细胞。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离所希望的多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。如在此所述，该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳源和氮源及无机盐。合适的培养基从商业供应商处可获得或者可根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心目录中)来制备，或可以从可商购的成分制备。
在此描述的重组酵母细胞还可以经受适应进化，以进一步增加3-HP生物合成，包括在接近理论最大生长的条件下。
在此描述的重组酵母细胞可以进一步包含脂肪酶或酯酶活性，例如归因于表达一种编码脂肪酶或酯酶(EC3.1.1.-)的异源多核苷酸。可以使用此类细胞生产3-HP的酯，例如3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙酸乙酯、3-羟基丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁酯或2-乙基己基3-羟基丙酸酯。这些细胞可以进一步包含酯酶活性，例如归因于表达一种编码酯酶的异源多核苷酸。可以使用此类细胞生产聚合的3-HP。这些细胞可以进一步包含醇脱氢酶(EC1.1.1.1)活性、醛脱氢酶(EC1.2.1.-)活性或两者，例如归因于表达一种编码醇脱氢酶、醛脱氢酶或两者的异源多核苷酸。可以使用此类细胞生产1,3-丙二醇。
在此描述的重组酵母细胞可以利用以下表达载体，这些表达载体包括一个或多个(例如，两个、若干个)异源3-HP途径基因的编码序列(例如，在此描述的PPC、PYC、AAT、ADC、BAAT、gabT和/或3-HPDH的编码序列)，这些编码序列被连接至一个或多个控制序列，这一个或多个控制序列指导在与这一个或多个控制序列相容的条件下在适合的酵母细胞中的表达。可以在任何于此描述的酵母细胞和方法中使用此类表达载体。在此描述的多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供希望的多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
可以将一个构建体或载体(或多个构建体或载体)引入酵母细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述；该构建体或载体(或这些构建体或载体)包括一个或多个(例如，两个、若干个)异源3-HP途径基因。
各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个(例如，两个、若干个)合宜的限制性位点以允许在此类位点插入或取代该多核苷酸。可替代地，可以通过将这种或这些多核苷酸或者包括该序列的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达这种或这些多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。
在一方面，每种异源多核苷酸都被包含在独立的载体上。在另一方面，这些异源多核苷酸中的至少两种被包含在单一的载体上。在另一方面，这些异源多核苷酸中的至少三种被包含在单一的载体上。在另一方面，这些异源多核苷酸中的至少四种被包含在单一的载体上。在另一方面，所有这些异源多核苷酸都被包含在单一的载体上。编码蛋白复合体的异聚亚基的多核苷酸可以被包含在单一载体的单一异源多核苷酸中或可替代地，被包含在分开的载体的分开的异源多核苷酸中。
该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到酵母细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该表达载体可以包含任何适合的启动子序列，该启动子序列可被酵母细胞识别，以表达昆虫ADC基因或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC基因或在此描述的任何3-HP途径基因。启动子序列包括介导多肽表达的转录控制序列。该启动子可以是在选择的酵母细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
在此描述的每种异源多核苷酸都可以被可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。例如，在一方面，编码ADC的异源多核苷酸被可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。在另一方面，编码在此描述的3-HP途径的多肽(例如，PPC、PYC、AAT、ADC、BAAT、gabT、或3-HPDH)的异源多核苷酸被可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。这些启动子可以与所选的天然启动子相同或与其具有较高水平的序列一致性(例如，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％)。
用于指导核酸构建体在酵母细胞中的转录的适合的启动子的实例包括但不限于获得自以下各项的基因的启动子：烯醇酶(例如，酿酒酵母烯醇酶或东方伊萨酵母烯醇酶(ENO1))、半乳糖激酶(例如，酿酒酵母半乳糖激酶或东方伊萨酵母半乳糖激酶(GAL1))、醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶或东方伊萨酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP))、磷酸甘油醛异构酶(例如，酿酒酵母磷酸甘油醛异构酶或东方伊萨酵母磷酸甘油醛异构酶(TPI))、金属硫蛋白(例如，酿酒酵母金属硫蛋白或东方伊萨酵母金属硫蛋白(CUP1))、3-磷酸甘油酸激酶(例如，酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶或东方伊萨酵母3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、PDC1、木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)、L-(+)-乳酸-细胞色素C氧化还原酶(CYB2)、翻译延长因子-1(TEF1)、翻译延长因子-2(TEF2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、和乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶(URA3)基因。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的合适转录终止子序列。该终止子序列被可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3’-末端。可以使用在所选的酵母细胞中具有功能的任何终止子。该终止子可以与所选的天然终止子相同或与其具有较高水平的序列一致性(例如，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％)。在某些实施例中，3-HP途径基因被连接至一种终止子，该终止子包括对于该宿主细胞而言天然的天然GAL10基因的功能部分或与天然GAL10终止子具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列一致性的序列。
酵母宿主细胞的适合的终止子获得自以下各项的基因：烯醇酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母烯醇酶)、细胞色素C(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母细胞色素(CYC1))、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd))、PDC1、XR、XDH、转醛醇酶(TAL)、转酮醇酶(TKL)、核糖5-磷酸-酮醇异构酶(RKI)、CYB2、以及半乳糖基因家族(尤其是GAL10终止子)。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。
控制序列也可以是适合的前导子序列，其中转录时，所述前导子序列是对由宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。该前导子序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在选择的酵母细胞中具有功能的任何前导子序列。
酵母宿主细胞的适合的前导子获得自以下各项的基因：烯醇酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母烯醇酶(ENO-1))、3-磷酸甘油酸激酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母3-磷酸甘油酸激酶)、α-因子(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母α-因子)、以及醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP))。
控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列。有用于酵母细胞的聚腺苷酸化序列由郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.CellularBiol.)15:5983-5990描述。
也可能令人希望的是添加调节序列，该调节序列允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达。调节系统的实例是引起将响应于化学或物理刺激(包含调节性化合物的存在)而开启或关闭的基因表达的那些系统。原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
这些载体可以包含一个或多个(例如，两个、若干个)允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。酵母宿主细胞的适合的标记包括ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1以及URA3。
这些载体可以包含一个或多个(例如，两个、若干个)允许将该载体整合进宿主细胞的基因组中或在该细胞中独立于基因组而自主复制的元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的酵母细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(originofreplication)”或“质粒复制子(plasmidreplicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
可以将在此描述的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到酵母细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建在此描述的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
本领域已知的用于制备包括一个或多个3-HP途径基因的酵母细胞的另外的程序和技术描述于例如WO2012/074818中，将其内容通过引用结合在此。
基因破坏
该重组酵母细胞还可以包括一个或多个(例如，两个、若干个)基因破坏，以例如将糖代谢从不希望的产物转移至3-HP。在一些方面，当在相同条件下培养时，与没有这一个或多个破坏的细胞相比，这些重组宿主细胞产生更大量的3-HP。在一些方面中，使这些被破坏的内源基因中的一个或多个失活。
在某些实施例中，在此提供的重组酵母细胞包括编码在乙醇生产中涉及的酶的一个或多个内源基因的破坏，包括例如丙酮酸脱羧酶(PDC，将丙酮酸转化为乙醛)和/或醇脱氢酶(ADH，将乙醛转化为乙醇)基因。这些修饰降低了酵母细胞生产乙醇的能力，从而使3-HP生产最大化。然而，在某些实施例中，在此提供的重组酵母细胞可以被工程化为同时生产3-HP和乙醇。在那些实施例中，优选地不破坏编码在乙醇发酵中涉及的酶的内源基因，并且在某些实施例中，这些酵母细胞可以包括一个或多个增加乙醇产生的异源基因。
在一些实施例中，这些重组酵母细胞可以包括对编码PDC的内源基因的破坏，该PDC与SEQIDNO:154具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一些实施例中，该内源基因编码具有以下氨基酸序列的PDC，该氨基酸序列包括SEQIDNO:154或由其组成。在一些实施例中，编码PDC的内源基因的编码序列与SEQIDNO:153具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一些实施例中，编码PDC的内源基因的编码序列包括SEQIDNO:153或由其组成。在一些实施例中，使编码PDC的内源基因失活。
在某些实施例中，在此提供的重组酵母细胞包括一个或多个内源基因的破坏，这一个或多个内源基因编码在生产替代发酵产物(例如甘油)或其他副产物(例如乙酸或二醇)中涉及的酶。例如，在此提供的细胞可以包括以下一个或多个的基因中的破坏：甘油3-磷酸脱氢酶(GPD，催化二羟丙酮磷酸反应为甘油3-磷酸)，甘油3-磷酸酶(GPP，催化甘油-3磷酸转化为甘油)，甘油激酶(催化甘油3-磷酸转化为甘油)，二羟丙酮激酶(催化二羟丙酮磷酸转化为二羟丙酮)，甘油脱氢酶(催化二羟丙酮转化为甘油)，醛脱氢酶(ALD，例如，将乙醛转化为乙酸或将3-HP转化为3-HPA)、以及丁二醇脱氢酶(催化丁二醇转化为乙偶姻，反之亦然)。
在一些实施例中，这些重组酵母细胞可以包括对编码GPD的内源基因的破坏，该PDC与SEQIDNO:156具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一些实施例中，该内源基因编码具有以下氨基酸序列的GPD，该氨基酸序列包括SEQIDNO:156或由其组成。在一些实施例中，编码GPD的内源基因的编码序列与SEQIDNO:155具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一些实施例中，编码GPD的内源基因的编码序列包括SEQIDNO:155或由其组成。在一些实施例中，使编码GPD的内源基因失活。
在某些实施例中，在此提供的重组酵母细胞包括一个或多个内源基因的破坏，这一个或多个内源基因编码催化3-HP途径中的逆反应的酶，包括例如PEP羧激酶(PCK)、具有OAA脱羧酶活性的酶或CYB2A或CYB2B(催化乳酸转化为丙酮酸)。PCK催化PEP转化为OAA，反之亦然，但是对OAA至PEP的反应展现出偏好。为了减少OAA至PEP的转化，可以破坏天然PCK基因的一个或多个拷贝。在某些实施例中，其中的一个或多个天然PCK基因已经被破坏的酵母细胞可以表达一个或多个异源PCK基因，这一个或多个异源PCK基因已被突变为编码以下多肽，该多肽有利于将PEP转化为OAA。OAA脱羧酶催化OAA转化为丙酮酸。已经鉴定了具有OAA脱羧酶活性的酶，例如由大肠杆菌中的恩纳-杜道夫醛缩酶(Entner-Doudoroffaldolase，eda)基因编码的酶以及酵母和真菌中的苹果酸酶(MAE)。为了减少OAA脱羧酶活性，可以破坏编码具有OAA脱羧酶活性的酶的天然基因的一个或多个拷贝。在某些实施例中，其中的一个或多个天然OAA脱羧基因已经被破坏的酵母细胞可以表达一个或多个异源OAA脱羧基因，这一个或多个异源OAA脱羧基因已被突变为编码以下多肽，该多肽催化丙酮酸转化为OAA。
在某些实施例中，在此提供的重组酵母细胞包括一个或多个内源基因的破坏，这一个或多个内源基因编码在与3-HP途径产物或中间体进行的不希望的反应中涉及的酶。此类基因的实例包括编码将3-HP转化为3-HP的醛的酶的那些基因，已知这些醛对某些细胞而言是有毒的。
在某些实施例中，在此提供的重组酵母细胞包括一个或多个内源基因的破坏，这一个或多个内源基因编码对3-HP途径具有中性作用的酶，包括例如GAL6(将半乳糖转化为葡萄糖的GAL系统的负调节物)。中性基因的破坏允许在不影响天然途径的情况下插入一个或多个异源基因。
还可以使用建模设计基因破坏,这些基因破坏另外地优化途径的利用(参见，例如，U.S.2002/0012939、U.S.2003/0224363、U.S.2004/0029149、U.S.2004/0072723、U.S.2003/0059792、U.S.2002/0168654、U.S.2004/0009466、以及美国专利7,127,379)。建模分析允许可靠地预测将代谢移向更有效地生产3-HP对细胞生长的影响。用于鉴定并设计有利于生物合成希望的产物的代谢改变的一种示例性计算方法是OptKnock计算框架(OptKnockcomputationalframework)，伯加德(Burgard)等人，2003，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)84:647-657。
可以使用本领域熟知的方法(包括在此描述的那些方法)构建包括基因破坏的重组酵母细胞。可以破坏该基因的一部分，例如编码区或为编码区的表达所需的控制序列。该基因的这样一种控制序列可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该基因的表达的部分。例如，可以将启动子序列失活从而无表达或可以将天然启动子替换为较弱的启动子以减少编码序列的表达。可修饰的其他控制序列包括但不限于前导子、前肽序列、信号序列、转录终止子以及转录激活因子。
可以通过基因缺失技术来构建包括基因破坏的重组酵母细胞，以消除或减少该基因的表达。基因缺失技术使得可以部分或完全除去该基因，从而消除其表达。在此类方法中，使用已经构建为邻接地包含侧翼于该基因的5'和3'区的质粒，通过同源重组完成该基因的缺失。
还可以通过引入、取代和/或除去该基因中的或为其转录或翻译所需的其控制序列中的一个或多个(若干个)核苷酸来构建包括基因破坏的重组酵母细胞。例如，可以插入或除去核苷酸，用于引入终止密码子、除去起始密码子或移码开放阅读框。可以根据本领域已知的方法，通过定点诱变或PCR产生的诱变完成这样的修饰。参见，例如波特斯坦(Botstein)和绍特勒(Shortle)，1985，科学(Science)229:4719；洛(Lo)等人，1985，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)81:2285；樋口(Higuchi)等人，1988，核酸研究(NucleicAcidsRes)16:7351；岛田(Shimada)，1996，分子生物学方法(Meth.Mol.Biol.)57:157；霍(Ho)等人，1989，基因(Gene)77:61；霍尔顿(Horton)等人，1989，基因(Gene)77:61；以及萨卡尔(Sarkar)和松梅尔(Sommer)，1990，生物技术(BioTechniques)8:404。
还可以通过将破坏性核酸构建体插入该基因中而构建包括基因破坏的重组酵母细胞，该破坏性核酸构建体包括与该基因同源的核酸片段，该片段将产生具有同源性的区域的重复并且在重复的区域之间掺入构建体DNA。这样的一种基因破坏可以消除基因表达，如果插入的构建体将该基因的启动子与编码区分离或打断编码序列，这样使得产生无功能性基因产物。破坏构建体可以简单地是伴有与该基因同源的5’和3’区的选择性标记基因。该选择性标记使得可以鉴定包含破坏的基因的转化株。
还可以通过基因转化过程构建包括基因破坏的重组酵母细胞(参见，例如，伊格莱西亚斯(Iglesias)和特劳特勒(Trautner)，1983，分子普通遗传学(MolecularGeneralGenetics)189:73-76)。例如，在基因转化方法中，将对应于该基因的核苷酸序列体外诱变，以产生缺陷核苷酸序列，然后将其转化进重组菌株中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷核苷酸序列替换该内源基因。该缺陷核苷酸序列还包括一种用于选择含有缺陷基因的转化株的标记可以是令人希望的。
可以使用本领域熟知的方法(包括但不限于化学诱变)，通过随机或特异诱变进一步构建包括基因破坏的重组酵母细胞(参见，例如，霍普伍德(Hopwood)，微生物学方法中的突变体分离(TheIsolationofMutantsinMethodsinMicrobiology(J.R.诺里斯(Norris)和D.W.里本(Ribbons)，编辑))第363-433页，学术出版社(AcademicPress)，纽约，1970)。可以通过使亲本菌株经受诱变并筛选其中该基因的表达已经被减少或失活的突变体菌株来修饰该基因。诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适合的物理或化学诱变剂、使用适合的寡核苷酸或使DNA序列经受PCR产生的诱变来进行。此外，诱变可以通过使用这些诱变方法的任何组合来进行。
适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)邻甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用此类试剂时，诱变典型地是在适合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本菌株并选择展现出该基因的减少表达或无表达的突变体来进行的。
可以使用来自其他微生物来源的与在此描述的基因同源或互补的核苷酸序列来破坏所选的重组体菌株中的对应基因。
在另一方面，重组酵母细胞中的基因修饰未用选择性标记加以标记。可以通过将突变体在反向选择培养基中进行培养来除去选择性标记基因。在该选择性标记基因包含侧翼于其5'和3'端的重复序列的情况下，当该突变体菌株经受反向选择时，这些重复序列将有助于该选择性标记基因通过同源重组而环出。还可以通过向该突变体菌株中引入一个核酸片段，该核酸片段包括缺陷基因的5'和3'区但是缺乏该选择性标记基因，随后在反向选择培养基上进行选择，通过同源重组来除去该选择性标记基因。通过同源重组，包含该选择性标记基因的缺陷基因被缺乏该选择性标记基因的核酸片段替换。还可以使用本领域已知的其他方法。
生产3-HP以及相关化合物的方法
可以使用在此描述的重组酵母细胞生产3-HP。在另一方面，是一种产生3-HP的方法，该方法包括：(a)在适合生产3-HP的条件下，在培养基中培养在此描述的重组酵母细胞中的任一重组酵母细胞(例如，包括编码昆虫ADC的异源多核苷酸的重组宿主细胞)；并且(b)回收3-HP。
可以使用本领域熟知的方法，在适合生产3-HP的营养培养基中培养包括主动3-HP途径的重组酵母细胞。例如，可以通过在适合的发酵培养基中和在允许产生3-HP的条件下，进行摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料或固态发酵)来培养这些细胞。
这些重组酵母细胞可以在一种可发酵的培养基中产生3-HP，该可发酵培养基包括一种或多种(例如，两种、若干种)糖，这些糖是例如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的低聚糖。碳源可以是十二碳糖(例如蔗糖)、己糖(例如葡萄糖或果糖)、多糖或葡萄糖的其他聚合物、葡萄糖寡聚物(例如麦芽糖、麦芽三糖和异麦芽三糖)、潘糖以及果糖寡聚物。如果该细胞被修饰为赋予发酵戊糖的能力，则该发酵培养基可以包括戊糖，例如木糖、木聚糖或木糖的其它寡聚物和/或阿拉伯糖。此类戊糖可以适合地是包含半纤维素的生物质的水解产物。在一些实施例中，该细胞不能发酵戊糖和/或该可发酵的培养基包括低于1％的戊糖。在一些情况下，该可发酵的培养基来自天然来源，例如甘蔗、淀粉、或纤维素；并且可以是通过酶水解(糖化作用)对这种来源进行预处理的结果。在一些方面中，该可发酵的培养基包括甘蔗汁。合适的培养基从商业供应商处可获得或者可根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心目录中)来制备，或可以从可商购的成分制备。
除了来自一种或多种(例如，两种、若干种)糖的适当的碳源之外，该可发酵的培养基可以包含本领域的普通技术人员已知的其他营养素或刺激物，例如大量营养素(如，氮源)以及微量营养素(如，维生素、矿物盐、以及金属辅因子)。在一些方面，碳源优先地可以补充有至少一种碳源，例如酵母提取物、N2、蛋白胨(例如，BactoTM蛋白胨)、或大豆蛋白胨(例如，BactoTM大豆蛋白胨)。维生素的非限制性实例包括多种维生素、生物素、泛酸盐、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、维生素B、维生素C、维生素D和维生素E。矿物盐和金属辅因子的实例包括但不限于Na、P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn、Co、以及Cu。
在一些实施例中，可以在化学成分确定的培养基中培养本发明的重组酵母细胞。在一个实例中，该培养基包含大约5g/L硫酸铵，大约3g/L磷酸二氢钾，大约0.5g/L硫酸镁、痕量元素和维生素以及大约150g/L葡萄糖。在培养过程中可以允许pH自由变化，或必要的话，可以缓冲，以防止pH跌至预定的水平之下或升至预定的水平之上。在某些实施例中，用足够的酵母细胞接种该发酵培养基，这些酵母细胞是产生约1.0的OD600的评估对象。除非另外明确指明，如在此使用，OD600是指使用型号DU600分光光度计(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))在600nm的波长下以1cm路长测量的光密度。
用于生产3-HP的方法的具体条件可以由本领域的普通技术人员根据在此的教导确定。在这些方法的一些方面中，将这些酵母细胞培养约12小时至约216小时，例如约24小时至约144小时、或约36小时至约96小时。温度典型地在约26℃至约60℃之间，例如约34℃至约50℃。
视情况而定，可以在厌氧、基本上厌氧(微好氧)、或好氧条件下进行培养。简言之，厌氧的是指一种缺少氧气的环境，基本上厌氧的(微好氧的)是指一种其中氧气的浓度比空气低的环境，并且好氧是指一种其中氧气浓度大致等于或大于空气的氧气浓度的环境。基本上缺氧条件包括例如使得在培养基中的溶氧浓度保持在小于10％的饱和度的培养、分批发酵或连续发酵。基本上缺氧条件还包括使细胞在维持有小于1％氧气的气氛的密封室内的液体培养基中或固体琼脂上生长或静止。例如可以通过向培养物鼓吹N2/CO2混合物或其他一种或多种适合的非氧气体来维持氧气的百分比。在一些实施例中，在缺氧条件或基本上缺氧条件下进行培养。
在一个实例中，在生产期过程中，发酵培养基中的细胞浓度典型地在约0.1至20，优选从0.1至5，甚至更优选从1至3g干细胞/升发酵培养基的范围内。希望的话，摄氧率(OUR)可以贯穿整个发酵变化作为过程控制(参见，例如，WO03/102200)。在一些实施例中，在微好氧条件下培养在此提供的重组酵母细胞，这些微好氧条件由从2至45mmol/L/hr，例如2至25、2至20、2至15、2至10、10至45、15至40、20至35或25至35mmol/L/hr的摄氧率表征。在某些实施例中，当在由从2至25mmol/L/hr的摄氧率表征的微好氧条件下培养时，在此提供的重组酵母细胞表现尤其好。可以在生产期过程中缓冲培养基，这样使得将pH维持在约3.0至约7.0或从约4.0至约6.0的范围内。适合的缓冲剂是当酸形成时中和它的碱性材料，并且包括例如氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、氨、氢氧化铵等。通常，在常规的发酵过程中使用的缓冲剂在此也是适合的。
在利用缓冲发酵的那些实施例中，当酸性发酵产物形成时，可以将它们中和成对应的盐。在这些实施例中，回收酸包括再生游离酸。这可以通过以下方式完成：移除细胞并用强酸(例如硫酸)酸化发酵液。这导致形成盐副产物。例如，在将钙盐用作中和剂并且将硫酸用作酸化剂的情况下，将石膏产生为盐副产物。将这一副产物与发酵液分离，并且使用例如液液提取、蒸馏、吸收以及其他技术回收酸(参见例如，T.B.维克罗伊(Vickroy)，综合生物技术(ComprehensiveBiotechnology)的第3卷，第38章(编辑M.武-杨(Moo-Young))，帕加马(Pergamon)，牛津，1985；达塔(Datta)等人，1995，FEMS微生物学评论(FEMSMicrobiol.Rev.)，16:221-231；美国专利4,275,234、4,771,001、5,132,456、5,420,304、5,510,526、5,641,406和5,831,122以及WO93/00440)。
在其他实施例中，在培养过程中，可以允许发酵培养基的pH从处于或高于3-HP的pKa的起始pH(典型地是4.5或更高)降至处于或低于酸发酵产物的pKa，例如低于4.5或4.0，如在约1.5至约4.5的范围内、在从约2.0至约4.0的范围内或在从约2.0至约3.5的范围内。
在仍其他实施例中，可以通过在发酵过程之前或开始时，将发酵液的pH调节为处于或低于产物酸的pKa而进行发酵，以产生该产物酸。之后，贯穿整个培养，可以将pH维持为处于或低于该产物酸的pKa。在某些实施例中，可以将pH维持为低于4.5或4.0，例如在约1.5至约4.5的范围内、在约2.0至约4.0的范围内或在约2.0至约3.5的范围内。
在此描述的这些方法可以利用任何适合的发酵操作模式。例如，分批模式发酵可以与一个封闭系统一起使用，其中培养基和重组酵母(在发酵的开始设置的)除了某些试剂(例如用于pH控制、泡沫控制,或过程支持所需的其他试剂)之外，没有另外的投入。在此描述的过程还可以在补料分批-模式或连续模式中利用，如上所提及。
可以在若干生物反应器构型中实践在此描述的这些方法，例如搅拌槽、鼓泡塔、气升式反应器以及本领域的普通技术人员已知的其他反应器。视情况而定，能以游离细胞培养或固定化细胞培养的方式执行这些方法。可以使用任何用于支持固定化细胞培养的材料，例如藻酸盐、纤维床、或菱形材料，例如温石棉、蒙脱石KSF和蒙脱石K-10。
在这些方法的另一方面中，生产的3-HP的滴度大于约5g/L，例如大于约10g/L、25g/L、50g/L、75g/L、100g/L、125g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L、200g/L、210g/L、225g/L、250g/L、275g/L、300g/L、325g/L、350g/L、400g/L或500g/L；或在约10g/L与约500g/L之间，例如约50g/L与约350g/L之间、约100g/L与约300g/L之间、约150g/L与约250g/L之间、约175g/L与约225g/L之间或约190g/L与约210g/L之间。在一个实施例中，以大于约0.01克/克碳水化合物的滴度生产3-HP，例如大于约0.02、0.05、0.75、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0克/克碳水化合物。
在这些方法的另一方面中，当在相同条件下培养时，与培养不具有编码昆虫ADC或双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲的ADC的异源多核苷酸的重组酵母细胞相比，生产的3-HP的量多至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少50％或至少100％。
在于此提供的这些方法的某些实施例中，这些重组酵母细胞产生相对较低水平的乙醇。在某些实施例中，可以按10％或更少的产量，优选按2％或更少的产量生产乙醇。在这些实施例的某些实施例中，产生的乙醇检测不出。然而，在其他实施例中，可以同时生产3-HP和乙醇。在这些实施例中，可以按大于10％、大于25％或大于50％的产量生产乙醇。
可以使用本领域已知的任何程序从发酵培养基中任选地回收3-HP，这些程序包括但不限于色谱法(例如，尺寸排阻色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法)、电泳程序、溶解度差异、渗透、蒸馏、提取(例如，液液提取)、渗透蒸发、萃取过滤、膜过滤、膜分离、反渗透或超滤。在一个方面中，从其他发酵材料中分离3-HP并通过蒸馏的常规方法加以纯化。因此，在另一方面，该方法进一步包括通过蒸馏纯化回收的3-HP。
还可以通过上述程序(例如，色谱法、电泳程序、溶解度差异、蒸馏或提取)将杂质(污染物)化学转化为更易于从3-HP中除去的产物和/或通过将杂质直接化学转化为3-HP而纯化重组3-HP。例如，在另一方面，该方法进一步包括通过使用本领域已知的化学技术将β-丙氨酸污染物转化为3-HP而纯化回收的3-HP。
在这些方法的一些方面中，在可任选地纯化之前和/或之后的重组3-HP制剂是基本上纯的。关于生产3-HP的方法，“基本上纯的”意指回收的制剂包含不多于15％的杂质，其中杂质意指除3-HP以外的化合物。在一种变体中，提供了一种基本上纯的制剂，其中该制剂包含至多25％杂质、或至多20％杂质、或至多10％杂质、或至多5％杂质、或至多3％杂质、或至多1％杂质、或至多0.5％杂质。
应该理解的是，可以将通过β-丙氨酸中间体进行的3-HP途径应用于生产β-丙氨酸(例如，如果破坏将β-丙氨酸转化为丙二酸半醛的下游基因；参见图1)。在这种情况下，该重组酵母细胞将产生β-丙氨酸而非3-HP或产生β-丙氨酸和3-HP的混合物。应该进一步理解的是，如果希望的话，可以通过本领域已知的方法将在此描述的重组酵母细胞产生的β-丙氨酸用化学方法转化为3-HP，如上文所提及。
可以用化学方法将使用在此披露的方法生产的3-HP转化为其他有机化合物。例如，可以将3-HP氢化以形成1,3-丙二醇(一种有价值的聚酯单体)。也可以使用在体外或在体内具有氧化还原酶活性的多肽从3-HP生产丙二醇。可以使用任何方法氢化有机酸(例如3-HP)，例如用于氢化丁二酸和/或乳酸的那些方法。例如，可以使用金属催化剂氢化3-HP。
可以将通过任何在此描述的方法生产的3-HP转化为丙烯酸。可以使用本领域已知的技术通过将3-HP化学脱水而产生丙烯酸，例如在催化剂(例如，固体氧化物脱水催化剂，如二氧化钛或氧化铝)的存在下加热。
在另一方面，是一种生产丙烯酸或其盐的方法，该方法包括：(a)在适合生产3-HP的条件下，在培养基中培养在此描述的重组酵母细胞(例如，包括编码昆虫ADC的异源多核苷酸的重组宿主细胞)；(b)回收3-HP；(c)在适合生产丙烯酸或其盐的条件下，将3-HP脱水；并且(d)回收丙烯酸或其盐。
可以使用本领域已知的方法进行适合的测定,这些测定用于测试在此描述的生产方法和酵母细胞的3-HP和丙烯酸的产生。例如，可以通过多种方法(例如HPLC(高效液相色谱)、GC-MS(气相色谱-质谱法)和LC-MS(液相色谱-质谱法))或使用本领域熟知的常规程序的其他适合的分析方法对终产物3-HP和中间体(例如，β-丙氨酸)以及其他有机化合物进行分析。还可以用培养上清液测试发酵液中的3-HP的释放。可以使用例如针对葡萄糖和醇类的折光率检测器、以及针对有机酸的UV检测器通过HPLC(林(Lin)等人，2005，生物技术与生物工程(BiotechnolBioeng)90:775-779)，或使用本领域熟知的其他适合的测定和检测方法量化在发酵培养基中的副产品和残余的糖(例如，葡萄糖)。
通过说明提供了以下实例，并且并不旨在使限制本发明。
实例
用作缓沖液和底物的化学品至少是试剂等级的商品。
菌株
东方伊萨酵母CNB1酵母菌株，构建自描述于WO2012/074818中的东方伊萨酵母CD1822，其内容在此通过引用并入本文。
培养基和溶液
CNB1摇瓶培养基是由2.3g的尿素、0.5g的七水硫酸镁、3.0g的磷酸二氢钾、1ml的痕量元素溶液、1ml的维生素溶液、120g的葡萄糖、97.6g的2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、以及补足至1升的去离子水构成。在溶解所有培养基组分后，使用适当的碱(例如，KOH)将培养基的pH调节至初始pH5.8，并且过滤灭菌。
DM2培养基是由N源(5.0g的硫酸铵或2.3g的尿素)、0.5g的七水硫酸镁、3.0g的磷酸二氢钾、1ml的痕量元素溶液、1ml的维生素溶液、50-120g的葡萄糖、以及补足至1升的去离子水构成。在溶解所有培养基组分后，使用适当的酸或碱(例如HCl或KOH)将培养基的pH调节至希望的初始pH，并且然后通过过滤进行灭菌。
LiOAc/TE溶液是由8份无菌水、1份1MLiOAc、以及1份10XTE构成。
2X诺布尔琼脂板培养基是由10g的蒂福科琼脂诺布尔(贝迪公司(Becton,DickinsonandCompany))和250ml的去离子水构成，并且然后通过高压灭菌器进行灭菌。
PEG/LiOAc/TE溶液是由8份50％PEG3350、1份1MLiOAc、以及1份10XTE构成。
50％PEG3350是通过将100g的PEG3350添加至150mL的水中并且进行加热和搅拌直至溶解来制备的。然后将体积用水加至200mL，并且然后通过高压灭菌器进行灭菌。
2XSDura-培养基是由6.66g的没有氨基酸的酵母氮源、1.54g的ura-DO补充物(克隆技术实验室公司(ClontechLaboratories,Inc.))、20g的右旋糖、以及补足至1升的去离子水构成。将所得溶液进行过滤灭菌。
通过将250mL的2X-Ura选择培养基和2X诺布尔琼脂板培养基(在高压灭菌后，冷却至65℃)混合，并且然后将熔化的培养基倒入皮氏培养皿并且允许冷却至室温来制备SDura-板。
TAE缓冲液由4.84g的Tris碱、1.14mL的冰醋酸、以及2mL的0.5MEDTA(pH8.0)、以及加至1升的去离子水构成。
TBE缓冲液由：10.8g的Tris碱、5.5g的硼酸、4mL的0.5MEDTA(pH8.0)、以及补足至1升的去离子水构成。
10XTE(200mL)是由2.42g的Tris碱、以及4mL的0.5MEDTA(pH8.0)构成。使用5MHCl将pH调节至7.5，并且将溶液通过高压灭菌器进行灭菌。
痕量元素溶液是由15.0g的EDTA、4.5g的七水硫酸锌、1.0g的脱水二氯化锰、0.3g的六水氯化钴(II)、0.3g的五水硫酸铜(II)、0.4g的脱水钼二钠、4.5g的脱水氯化钙、3g的七水硫酸铁、1.0g的硼酸、0.1g的碘化钾、以及补足至1升的去离子水构成。将溶液进行过滤灭菌。
维生素溶液是由14.4g的D-生物素、1g的泛酸钙、5g的烟酸、25g的肌醇、1g的盐酸毗多辛、0.2g的对氨基苯甲酸、1g的盐酸硫胺素、以及补足至1升的去离子水构成。将溶液进行过滤灭菌。
YP+10％葡萄糖培养基是由500mL的YP肉汤和100mL的无菌50％葡萄糖构成。
YP肉汤由以下各项构成：10g的酵母提取物、20g的蛋白胨、以及补足至1升的去离子水。通过高压灭菌器灭菌该溶液。
2XYT+amp板由16g的胰蛋白胨、10g的酵母萃取物、5g的NaCl、15g的细菌培养用琼脂(Bactoagar)、以及加至1升的去离子水构成。在高压灭菌后，每升添加100mg的氨比西林并且倒平板。
表4：在实例中使用的引物序列。
实例1：用于将DNA转化进酵母基因组中的程序
基于以下具体程序，进行以下实例中描述的将DNA转化进酵母宿主基因组中以产生重组酵母菌株。
将3mL的YP+10％葡萄糖培养基添加至14mL法尔肯管(Falcontube)中，并且使用无菌环将希望的菌株接种进该培养基中。培养物在37℃下以250rpm振荡生长过夜(约16小时)。将0.5mL体积的过夜培养物添加至125mL带挡板的包含25mL液体YP+10％葡萄糖培养基的摇瓶中。在以250rpm振荡下，将烧瓶在37℃下进行孵育。以约以小时计的间隔抽取培养物的小等分部分，并且测量OD600。使培养物生长直到OD600为0.6-1.0。
通过以2279xg，在室温下离心收获细胞。将沉淀物再悬浮于25mL的无菌水中，并且然后以2279xg在室温下离心。将沉淀物再悬浮于1mL无菌水中，并且将再悬浮的细胞转移至1.5mL试管，并且然后以16,100xg进行沉淀。将细胞重悬浮于1mL的LiOAc/TE溶液中，并且然后以16,100xg进行沉淀。然后将细胞沉淀物重悬浮在250μL的LiOAc/TE溶液中。
将以下组分添加至1.5mL试管中：100μL的以上细胞，10μL的新鲜煮沸的然后冰冻的鲑鱼精DNA(安捷伦科技)，以及10μL的所希望的、线性化的转化DNA。还制备了用水代替DNA的对照反应。向各转化反应物中依次添加600μL的PEG/LiOAc/TE溶液、40μL的DMSO，并且将反应物倒置数次以混合。将转化反应物孵育于42℃水浴中持续15分钟，并且将细胞在5,400xg沉淀1分钟。将细胞重悬浮在水中，分为两部分，并且将转化反应物的各一半分散到SDura-板上。在37℃下孵育这些平板。在生长2天后菌落是可见的。
实例2：构建在adh2556基因座处表达异源昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的酵母菌株
该实例描述了酵母细胞的构建，该酵母细胞在adh2556基因座处含有编码SEQIDNO:162的埃及伊蚊ADC的多核苷酸的四个拷贝，两个拷贝在东方伊萨酵母PDC启动子控制之下，两个拷贝在东方伊萨酵母TDH3启动子控制之下。将左侧构建体和右侧构建体设计为在东方伊萨酵母CNB1adh2556基因座处允许同源重组。为了防止重组在编码相同ADC序列的核苷酸序列的多个拷贝之间发生，将密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的四个不同的核苷酸序列设计为编码相同ADC序列。此外，由于构建体的初始集被设计为靶向东方伊萨酵母的gal6基因座，因此将adh2556靶向序列掺入这些载体中。
左侧片段的构建
左侧构建体的第一克隆步骤是用adh25565’同源区替代存在于pMlBa192中的gal65’同源区(图3)。用引物1204010和1204011对PCR产物进行扩增，该PCR产物含有adh2556ORF的5’序列连同用于克隆的所希望的附加的限制位点和侧翼DNA。根据厂商的说明书，使用pfxDNA聚合酶(英杰公司(InvitrogenCorp.))进行扩增反应。该PCR由3μl的东方伊萨酵母MBin500基因组制剂(WO2012/074818)、25pM引物1204010、25pM引物1204011、1Xpfx扩增缓冲液(英杰公司)、2mMMgSO4、以及1.25单位的pfxDNA聚合酶构成，最终体积为50μl。将该反应物在(艾本德科技公司(EppendorfScientificInc.))中进行孵育，其被编程为：1个循环，在95℃持续2分钟；25个循环，每个在95℃持续1分钟，55℃持续1分钟，和72℃持续1分钟；和1个循环，在72℃持续3分钟。热循环后，在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，其中从凝胶切下约950bpPCR产物，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒(凯杰公司(QIAGENInc.))进行纯化。
为了产生以上PCR产物的受体载体，将质粒pMlBa192(图3)用HpaI和NotI-HF在37℃下消化1小时，并且在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，其中从凝胶切下约7.4kbp带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。在由105ng的HpaI/NotIpMlBa192片段、33ng的含有PCR产物的adh25565’同源物、1XIN-FUSIONTM反应缓冲液(克隆技术实验室公司)、以及1μL的IN-FUSIONTM酶(克隆技术实验室公司)构成的10μL的总反应体积中，使用IN-FUSIONTM优越PCR克隆试剂盒(克隆技术实验室公司)，将PCR产物和7.4kbpHpaI/NotIpMlBa192片段连接在一起。将该反应物在50℃下孵育15分钟并且然后置于冰上。根据厂商的说明书，该反应物被用于转化ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司)。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600(凯杰公司)从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的PCR产物的适当插入通过SmaI和NheI消化来进行筛选。由DNA测序和指定的质粒pMeJi359，验证产生所希望带大小的质粒为正确的。
质粒pMeJi359是左侧东方伊萨酵母adh2556靶向构建体，该构建体含有以下各项：PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母(YMR226c*)中表达的东方伊萨酵母ymr226c变体基因的表达)、东方伊萨酵母TAL终止子、东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母(YMR226c*r2)中表达的第二东方伊萨酵母ymr226c变体基因的表达)、东方伊萨酵母RKI终止子、东方伊萨酵母URA3启动子、以及东方伊萨酵母URA3ORF的5’片段。
将第一东方伊萨酵母yrm226c变体ORF(YMR226c*)用密码子优化的以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADC编码序列r3(编码SEQIDNO:162的ADC的SEQIDNO:160)来替代，并且通过质粒pMA-T中的来合成。将具有埃及伊蚊ADC编码序列r3的的质粒pMA-T用NheI-HF和AscI进行消化，并且在TBE缓冲液中将生成的片段通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中从凝胶切下约1.7kbp带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。将共计15μg的pMeJi359的小量制剂用NheI-HF和AscI消化，在37℃下用10单位小牛肠磷酸酶(新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs,Inc.))处理一小时，并且在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中从凝胶切下约7.5kbp带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。在连接反应物(10μL)中将NheI-HF/AscIpMeJi359片段和NheI-HF/AscI埃及伊蚊ADCr3插入片段连接在一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液(新英格兰生物实验室公司)、1μL的NheI-HF/AscIpMeJi359片段、5μL的NheI-HF/AscI埃及伊蚊ADCr3插入片段，以及1μL的快速T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室公司)构成。将连接反应物在室温下孵育15分钟，并且然后置于冰上。根据厂商的说明书，3μL的反应物被用于转化ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的ADCr3ORF的适当插入通过NcoI和BamHI消化来进行筛选。由DNA测序和指定的质粒pMeJi361，验证产生所希望带大小的质粒为正确的。
质粒pMeJi361是左侧东方伊萨酵母adh2556靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADCr3编码序列(SEQIDNO:160)的表达)、东方伊萨酵母TAL终止子、东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母(YMR226c*r2)中表达的第二东方伊萨酵母ymr226c变体基因的表达)、东方伊萨酵母RKI终止子、东方伊萨酵母URA3启动子、以及东方伊萨酵母URA3ORF的5’片段。
将第二东方伊萨酵母yrm226c变体ORF(YMR226c*r2)用密码子优化的以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADC编码序列r4(编码SEQIDNO:162的ADC的SEQIDNO:161)来替代，并且通过质粒pMA-T中的来合成。将具有埃及伊蚊ADCr4的的质粒pMA-T用SpeI进行消化，并且在TBE缓冲液中将生成的片段通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中从凝胶切下约1.7kbp带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。将8μg的pMeJi361的小量制剂用SpeI在37℃下消化一小时，并且在TBE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中从凝胶切下约8.4kbp带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。在连接反应物(10μL)中，将SpeIpMeJi361片段和SpeI埃及伊蚊ADCr4插入片段连接在一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、1μL的SpeIpMeJi361片段、5μL的SpeI埃及伊蚊ADCr4插入片段、以及1μL的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育15分钟，并且然后置于冰上。根据厂商的说明书，3μL的反应物被用于转化ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的ADCr3ORF的适当插入通过SpeI消化来进行筛选。通过PacIandHindIII消化来确认正确取向。由DNA测序和指定的质粒pMeJi363(图4；SEQIDNO:210)，验证产生所希望带大小的质粒为正确的。
质粒pMeJi363是左侧东方伊萨酵母adh2556靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADCr3编码序列(SEQIDNO:160)的表达)、东方伊萨酵母TAL终止子、东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的第二埃及伊蚊ADCr4编码序列(SEQIDNO:161)的表达)、东方伊萨酵母RKI终止子、东方伊萨酵母URA3启动子、以及东方伊萨酵母URA3ORF的5’片段。
右侧片段的构建
右侧构建体的第一克隆步骤是用adh25563’同源区替代存在于pMlBa193中的gal63’同源区(图5)。用引物1204012和1204013对PCR产物进行扩增，该PCR产物含有adh2556ORF的3’序列连同用于克隆的所希望的附加的限制位点和侧翼DNA。根据厂商的说明书，使用pfxDNA聚合酶进行扩增反应。该PCR由3μl的东方伊萨酵母MBin500基因组制剂(WO2012/074818)、25pM引物1204012、25pM引物1204013、1Xpfx扩增缓冲液、2mMMgSO4、以及1.25单位的pfxDNA聚合酶构成，最终体积为50μl。将该反应物在 中进行孵育，其被编程为：1个循环，在95℃持续2分钟；25个循环，每个在95℃持续1分钟，55℃持续1分钟，和72℃持续1分钟；和1个循环，在72℃持续3分钟。热循环后，在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，其中从凝胶切下约1kbpPCR产物，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
为了产生以上PCR产物的受体载体，将质粒pMlBa193(图5)用SacII和NotI-HF在37℃下消化1小时，并且在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，其中从凝胶切下约8.1kbp带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。在由161ng的SacII/NotI-HFpMlBa193片段、68ng的含有PCR产物的adh25563’同源物、1XIN-FUSIONTM反应缓冲液、以及1μL的IN-FUSIONTM酶构成的10μL的总反应体积中，使用IN-FUSIONTM优越PCR克隆试剂盒，将PCR产物和SacII/NotI-HFpMlBa193片段连接在一起。将该反应物在50℃下孵育15分钟并且然后置于冰上。根据厂商的说明书，该反应物被用于转化ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的PCR产物的适当插入通过用XmaI和XbaI消化来进行筛选。由DNA测序和指定的质粒pMeJi360，验证产生所希望带大小的质粒为正确的。
质粒pMeJi360是右侧东方伊萨酵母adh2556靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母URA3ORF的3’片段、东方伊萨酵母URA3启动子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母(YMR226c*r5)中表达的东方伊萨酵母ymr226c变体基因的表达)、东方伊萨酵母TKL终止子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母(YMR226c*r10)中表达的第二东方伊萨酵母ymr226c变体基因的表达)、以及东方伊萨酵母PDC终止子。
将第一东方伊萨酵母yrm226c变体ORF(YMR226c*r10)用密码子优化的以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADC编码序列r10(编码SEQIDNO:162的ADC的SEQIDNO:159)来替代，并且通过质粒pMA-T中的来合成。将具有埃及伊蚊ADC编码序列r10的的质粒pMA-T用NheI-HF和AscI进行消化，并且在TBE缓冲液中将生成的片段通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中从凝胶切下约1.7kbp带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。将五μg的pMeJi360的小量制剂用NheI-HF和AscI消化，在37℃下用10单位小牛肠磷酸酶(新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs,Inc.))处理一小时，并且在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中从凝胶切下约7.5kbp带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。在连接反应物(10μL)中，将NheI-HF/AscIpMeJi360片段和NheI-HF/AscI埃及伊蚊ADCr10插入片段连接在一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、1μL的NheI-HF/AscIpMeJi360片段、5μL的NheI-HF/AscI埃及伊蚊ADCr10插入片段，以及1μL的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育15分钟并且然后置于冰上。根据厂商的说明书，3μL的反应物被用于转化ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的ADCr10ORF的适当插入通过NcoI和XbaI消化来进行筛选。由DNA测序和指定的质粒pMeJi362，验证产生所希望带大小的质粒为正确的。
质粒pMeJi362是右侧东方伊萨酵母adh2556靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母URA3ORF的3’片段、东方伊萨酵母URA3启动子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADCr10编码序列(SEQIDNO:159)的表达)、东方伊萨酵母TKL终止子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母(YMR226c*r10)中表达的第二东方伊萨酵母ymr226c变体基因的表达)、以及东方伊萨酵母PDC终止子。
将第二东方伊萨酵母ymr226c变体ORF(YMR226c*r10)用密码子优化的以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADC编码序列(编码SEQIDNO:162的ADC的SEQIDNO:157)来替代，并且通过质粒pMA-T中的来合成。首先，将含有埃及伊蚊ADC编码序列的pMAT质粒用XbaI和PacI进行消化，并且在TBE缓冲液中将生成的片段通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中从凝胶切下约1.7kbp的带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。将质粒pMlBa112(图6)用XbaI和PacI进行消化，并且在TBE缓冲液中将生成的片段通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中从凝胶切下约7.9kbp的带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。除pMlBa121含有针对东方伊萨酵母密码子优化的阿维链霉菌BAAT序列，同时pMlBa112含有针对大肠杆菌密码子优化的阿维链霉菌BAAT序列之外，质粒pMlBa112是与质粒pMlBa121(WO2012/074818)是相同的。在连接反应物(10μL)中，将XbaI/PacIpMlBa112片段和XbaI/PacI埃及伊蚊ADC插入片段连接在一起，该连接反应物由1X连接缓冲液、1μL的XbaI/PacIpMlBa112片段、5μL的XbaI/PacI埃及伊蚊ADC插入片段、以及1μL的T4DNA连接酶。将连接反应物在16℃下孵育过夜。根据厂商的说明书，3μL的反应物被用于转化ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的ADCORF的适当插入通过XbaI和PacI消化来进行筛选。由如在此描述的DNA测序和指定的质粒pMeJi338，验证产生所希望带大小的质粒为正确的。
将质粒pMeJi338用XbaI和PacI进行消化，并且在TBE缓冲液中将生成的片段通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中从凝胶切下约1.7kbp的带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。将总计3.5μg的pMeJi361的小量制剂用XbaI和PacI在37℃下消化一小时，并且在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中从凝胶切下约9.1kbp带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。在连接反应物(10μL)中，将pMeJi362片段和埃及伊蚊ADC插入片段连接在一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、1μL的XbaI/PacIpMeJi362片段、5μL的XbaI/PacI埃及伊蚊ADC插入片段、以及1μL的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育15分钟，并且然后置于冰上。根据厂商的说明书，3μL的反应物被用于转化ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的ADCORF的适当插入通过XbaI和PacI消化来进行筛选。由DNA测序和指定的质粒pMeJi364(图7；SEQIDNO:211)，验证产生所希望带大小的质粒为正确的。
质粒pMeJi364是右侧东方伊萨酵母adh2556靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母URA3ORF的3’片段、东方伊萨酵母URA3启动子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADCr10编码序列(SEQIDNO:159)的表达)、东方伊萨酵母TKL终止子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的第二埃及伊蚊ADC编码序列(SEQIDNO:158)的表达)、以及东方伊萨酵母PDC终止子。
酵母菌株从在adh2556基因座的四个核苷酸序列表达天冬氨酸1-脱羧酶(ADC)
以上实例描述了产生左侧和右侧构建体用于埃及伊蚊ADC基因的四个核苷酸变体的靶向表达，这些变体进行密码子优化以用于在东方伊萨酵母中在adh2556基因座处的表达。转化进东方伊萨酵母中之前，将16μg的pMeJi363用HpaI和SacII进行消化，以从pUC19主链载体中释放所希望的转化DNA。类似地，将3.2μg的pMeJi364用PfoI和SacII进行消化，以从pUC19骨架载体中释放所希望的转化DNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳，在TBE缓冲液中，将含有带的约7.5kbp(含有所希望的表达盒)从pMeJi363DNA中分离，从凝胶切下，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。通过1％琼脂糖凝胶电泳，在TBE缓冲液中，将约8.4kbp的带(含有所希望的表达盒)从pMeJi364DNA中分离，从凝胶切下，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。然后如实例1所描述的，将270ng的HpaI/SacIIpMeJi363片段和105ng的PfoI/SacIIpMeJi364片段用来转化东方伊萨酵母CNB1。
在SDura-板上选择转化体并且在37℃下孵育生长。第二天挑出转化体并且在SDura-板(缺乏尿嘧啶的平板)上针对单菌落重新划线并且在37℃下生长过夜，并且然后从由每个初始转化体产生的条纹中的每个挑出单菌落并且在SDura-板上重新划线。
在单菌落纯化和生长后，进行PCR以检验如在此描述的发生的所希望的靶向整合。使用引物1204049和0615362、1204065和1204050、以及1204060和1204061来检验pMeJi363和pMeJi364片段对adh2556基因座的正确靶向。引物1204049结合至所靶向的区域的adh2556基因座DNA5’，同时引物0615362结合至TAL终止子并且以反义方向扩增。从PCR用这些引物产生约3.5kbp带指明在adh2556基因座处所希望的整合事件的发生。引物1204065结合至ADCr10，同时引物1204050结合至所靶向的区域的adh2556基因座DNA3’，并且以反义方向扩增。来自具有这些引物的PCR中的约4.8kbp带的产生指明在adh2556基因座处所希望的整合事件的发生。引物1204060结合至ADCr4，同时引物1204061结合至ADCr10，并且以反义方向扩增。从PCR用这些引物产生约3.5kbp带指明在adh2556基因座处两个整合事件的协同定位。
PCR(25μL)是由有待筛选的菌株的1μLDNA(悬浮于30μL的水中的一个菌落)构成，该菌株根据厂商的说明书，使用植物直接PCR试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific,Inc.))来筛选。用进行PCR，其被编程为：1个循环，在98℃下持续5分钟；随后40个循环，每个循环在95℃下持续7秒、62℃下持续7秒、以及72℃下持续3分钟；以及最终延长，在98℃下持续1分钟。热循环后，在TBE缓冲液中，将该PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳来分离，并且如以上所描述的将带的大小可视化并进行解释。将具有所希望带的两个独立分离的转化体指定为东方伊萨酵母MeJi523和MeJi524。东方伊萨酵母菌株MeJi523和MeJi524的转化体基因型示于表5中。
表5.
实例3：构建在adh1202基因座处表达异源昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的酵母菌株
该实例描述了酵母细胞的构建，该酵母细胞在adh1202基因座处含有编码SEQIDNO:162(SEQIDNO:158、159、160和161的密码子优化的编码序列)的埃及伊蚊ADC的多核苷酸的四个拷贝，两个拷贝在东方伊萨酵母PDC启动子控制之下，两个拷贝在东方伊萨酵母TDH3启动子控制之下。将左侧构建体和右侧构建体设计为在东方伊萨酵母CNB1adh1202基因座处允许同源重组。
左侧片段的构建
将质粒pMeJi363(实例2)用NheI和PacI进行消化，并且在TBE缓冲液中将含有两个埃及伊蚊ADC编码序列的片段通过1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中从凝胶切下约4.5kbp的带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
将质粒pMlBa137(WO2012/074818)用NheI和PacI进行消化，并且在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中从凝胶切下约5.5kbp、含有adh1202的同源物的5’区域的带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
在10μL的总反应体积中，使用T4连接酶(新英格兰生物实验室公司)，将4.5kbpNheI/PacIpMeJi363片段与5.5kbpNheI/PacIpMlBa137片段连接，该10μL的总反应体积由2μL的55.5kbpNheI/PacIpMlBa137片段、6μL的NheI/PacIpMeJi363片段、1μL的具有10mMATP的10X连接缓冲液(新英格兰生物实验室公司)、以及1μL的T4连接酶构成。将反应物在16℃下孵育过夜，并且根据厂商说明书，将反应物的4μL等分部分转化进ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞中。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的PCR产物的适当插入通过用NcoI和PstI的限制酶切消化来进行筛选。将产生正确消化带大小的质粒指定为质粒pMBin245(参见图8)。
右侧片段的构建
将质粒pMeJi364(实例2)用NheI和PacI来消化并且在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳来纯化。将约4.8kbp、含有两个埃及伊蚊ADC编码序列的片段从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
将质粒pMlBa136(WO2012/074818)用NheI和PacI来消化并且在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳来纯化。将约5.7kbp、含有adh1202同源物的3’区域的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
在10μL的总反应体积中，将4.8kbpNheI/PacIpMeJi364片段与5.7kbpNheI/PacIpMlBa136片段连接，该10μL的总反应体积由2μL的NheI/PacIpMlBa136片段、6μL的NheI/PacIpMeJi364片段、1μL的具有10mMATP的10X连接缓冲液、以及1μL的T4连接酶构成。将反应物在16℃下孵育过夜，并且根据厂商说明书，将反应物的4μL等分部分转化进ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞中。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的PCR产物的适当插入通过用NcoI和PstI的限制酶切消化来进行筛选。将产生正确消化带大小的质粒指定为质粒pMBin244(参见图9)。
左侧和右侧片段的整合
将质粒pMBin245用HpaI和SacII进行消化，并且将质粒pMBin244用KasI和SacII进行消化。在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化这些消化物，其中从凝胶切下约7.3kbp(来自pMBin245)和7.9kbp(来自pMBin244)带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
将东方伊萨酵母CNB1用HpaI/SacIIpMBin245片段和KasI/SacIIpMBin244片段进行转化，并且根据厂商的说明书，使用植物直接PCR试剂盒，对正确的基因座靶向与转化进行验证。引物0611631和0611245产生约6.1kbp的带，并且引物0611632和0611317产生约7.9kbp的带。将具有预期带(针对表达盒的合适整合)的菌株指定为东方伊萨酵母MBin608。不同的整合位点显示出并不重要(参见实例5)。东方伊萨酵母MBin608的基因型示于表6中。
表6.
实例4：在表达异源昆虫天冬氨酸1-脱羧酶或异源地衣芽孢杆菌天冬氨酸1-脱羧酶的重组酵母菌株中的3-HP的生产
该实例描述了与在adh1202基因座处表达编码地衣芽孢杆菌ADC(SEQIDNO:139)的多核苷酸的四个拷贝的酵母菌株(东方伊萨酵母MlBa351；参见WO2012/074818)相比，在adh2556基因座表达编码昆虫ADC的多核苷酸的四个拷贝的酵母菌株(菌株MeJi523和Meji524，实例2)中的3-HP生产特征。东方伊萨酵母MBin351的基因型示于表7中。
表7.
将重组酵母菌株东方伊萨酵母MlBa351、MeJi523和Meji524使用种子繁殖阶段进行培养，随后在3L生物反应器(欧谱(Applikon)，福斯特市(FosterCity)，加利福尼亚州，美国)中进行单一阶段发酵。
对于种子阶段制备，将25mL的DM2培养基(该DM2培养基具有0.1MMES的终浓度)添加至125mL带挡板的烧瓶中，随后使用无菌环用感兴趣菌株进行接种。在以250rpm振荡下，将培养物在所希望的温度下过夜持续约16小时用以生长。然后将培养物的小等分部分以约小时计的间隔进行抽取，以测量OD600直至达到OD600为4-6。
使用试纸(拜耳医药保健公司)对存在的残留葡萄糖进行测量。然后将12mL的培养物添加至4mL的无菌冷却的75％甘油中，充分混合，并且孵育在冰上持续十分钟。然后将培养物和甘油混合物再混合，并且将1.0mL各自等分到10个1.8mL冷冻管(赛默飞世尔科技公司)中，并且储存于-80℃。
在发酵前一天，将冷冻管在室温下解冻。针对每个菌株，使用80μl的对应冷冻管溶液来接种于含有30mL的DM2培养基的摇瓶中，该DM2培养基具有0.07MMES的终浓度。在以250rpm振荡下，将培养物在所希望的温度下过夜持续约16小时用以生长。然后使用该培养物来接种于含有30mL的DM2培养基的125m摇瓶中，该DM2培养基在OD600为0.2下具有0.07MMES的终浓度。在约8小时的培养后，使用25mL的种子摇瓶培养物来接种于含有1.5升DM2培养基和1mL止泡剂A(西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))的3L生物反应器中。发酵是在约30℃-40℃的温度下进行，其中pH被控制在约2.0-7.0的范围内，并且在导致摄氧率(OUR)范围为2-45mmol/L/hr的搅拌和通气条件下。在此处呈现的实例中，在生物反应器中用于培养的温度、pH和OUR分别是30℃、4.0和10-30。当需要时，用60％葡萄糖溶液进料罐中，以便避免葡萄糖限制。
对于3-HP和β-丙氨酸的分析，将培养样品移除并且通过0.45μm96-孔滤板进行过滤，并且进一步于0.2％NH4OH中稀释10X。在水中的进一步稀释取决于样品中的分析物浓度。进一步的10X稀释是在样品缓冲液中进行，该样品缓冲液具有20％甲醇、1mM乙酸铵、0.1％氨水、和15mg/L的13C均一标记的3-HP(作为针对3-HP的内标)，或20％甲醇、1％甲酸、以及3mg/L的13C均一标记的β-丙氨酸(作为针对β-丙氨酸的内标)。总稀释倍数是大约100至1000倍，这取决于β-丙氨酸或3-HP的浓度。
将2μL样品注射入由MassHunter程序(安捷伦科技公司(AgilentTechnologies,Inc.))控制的安捷伦1200HPLC(安捷伦科技公司)中，该HPLC采用安捷伦6410三重四极杆MS/MS检测器(TripleQuadMS/MSdetector)，使用表8中列出的仪器设置和柱子。使用定量离子片段峰面积与其稳定的同位素对应物(来自内标)的比率来定量，以消除离子抑制效应和仪器漂移。日测定与日测定之间的标准差是低于5％。
表8.
依据可商购试剂盒的方案：“液体葡萄糖氧化酶试剂盒(LiquidGlucoseOxidaseReagentSet)”(PointeScientific公司)，来测量消耗的葡萄糖。
东方伊萨酵母MlBa351、MeJi523和MeJi524的得到的发酵物示于图10(在不同的时间点的3-HP浓度)和表9(在46小时的发酵后3-HP浓度和产率)中。与对应的菌株东方伊萨酵母MlBa351(其表达SEQIDNO:139的地衣芽孢杆菌ADC)相比，东方伊萨酵母MeJi523和MeJi524(其表达SEQIDNO:162的埃及伊蚊昆虫ADC)显示出在3-HP生产和3-HP产率方面的显著改进。
表9.
菌株 [3-HP](g/L) 3-HP(产率)
MlBa351 6.8 2.4％
MeJi523 21.9 8.3％
MeJi524 22.8 8.4％
实例5：在不同基因座处表达异源昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的重组酵母菌株中的3-HP的生产
该实例描述了在adh2556基因座(菌株Meji524，实例2)或adh1202基因座(菌株MBin608，实例3)处表达编码昆虫ADC的多核苷酸的四个拷贝的酵母菌株中的3-HP生产特征。
培养基和培养条件连同分析方法与实例4相同。菌株东方伊萨酵母MeJi524和MBin608的得到的发酵物示于图11(在不同的时间点的3-HP浓度)和表10(在48小时的发酵后3HP浓度和产率)中。菌株东方伊萨酵母MeJi524和MBin608表现相同，表明昆虫ADC编码序列的插入片段的基因座对3-HP生产和产率没有影响。
表10.
菌株 [3-HP](g/L) 3-HP(产率)
MeJi524 21.1 11.9％
MBin608 21.7 10.6％
实例6：表达异源昆虫天冬氨酸1-脱羧酶基因的重组酵母菌株的酶活性
无细胞提取物的培养物的制备
根据以下程序，将东方伊萨酵母菌株MeJi523、MeJi524、MlBa351、和MBin608在摇瓶中生长。将菌株在SDura-板上针对单菌落划线，并且在30℃下孵育1-2天。种子培养物在含有50mL的CNB1培养基的250ml挡板烧瓶中进行制备，该CNB1培养基被来自SDura-板的1-2个菌落接种的。种子培养物在30℃下以200rpm振荡生长约18小时。然后将培养物的小等分部分进行抽取，以测量OD600直至达到OD600为4-6。将种子烧瓶培养物稀释至OD600＝0.125并且用来接种于含有50mL的CNB1培养基的125ml挡板烧瓶(baffledflasks)中。将培养物在30℃下以140rpm振荡孵育20小时。
制备用于酶测定的粗无细胞提取物(CFE)：
这些重组酵母菌株各自通过离心收集，将上清液弃去，并且将细胞沉淀物用等体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行洗涤。针对酶活性测定摇瓶。为了制备粗的无细胞的提取物(CFE)，将细胞沉淀用含1％蛋白酶抑制剂混合物(罗氏诊断公司(RocheDiagnostics))和10mM磷酸钾(pH7)的PBS重悬浮至相当于OD600为25。将每一细胞悬浮液转移至具有2.4g的裂解基质(LysingMatrix)Y(0.5mm氧化钇-稳定的锆球；MP生物医学(MPBiomedicals))的2.0mL微量离心管，并且使用disruptor(MP生物医学)，在6.5/50秒的设定下进行3轮细胞裂解。在每轮之间将样品试管在冰上冷却3分钟。在裂解后，将样品在微量离心机中以最大速度在4℃离心10分钟。将上清液转移至新管中，并且保持在冰上或储存于-20℃直到使用。使用BCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)并且以牛血清白蛋白作为标准品，根据厂商提供的说明书来确定裂解物中的总蛋白浓度。
天冬氨酸1-脱羧酶活性测定：
如下来确定在此指示的细胞的CFE中ADC活性：向恒温在30℃或40℃下的96-孔微量滴定板的每个孔中添加29μL的100mM乙酸铵缓冲液(pH6或7.6)、160μL的25mM天冬氨酸(用NaOH将pH调节至6或7.6)、以及1μL的30mM吡哆醛-5-磷酸盐。通过添加10μL的CFE来引发反应。在不同时间间隔(2、4、6、8、10分钟)，从反应混合物中抽取20μL的样品，并且向180μL的淬灭缓冲液(2.5％甲酸)中添加并且然后1:10转移至20％甲醇/80％水中，以2mg/L的13C标记的β-丙氨酸作为内标。在过滤后，通过LC/MS/MS(具有安捷伦6410三重四极杆MS/MS检测器的安捷伦1200系列HPLC)分析样品中β-丙氨酸。从β-丙氨酸与实践曲线获得斜率。通过将斜率除以反应中总细胞蛋白浓度计算活性。ADC活性表示为所形成的微摩尔β-丙氨酸/分钟/mg蛋白。
将菌株东方伊萨酵母MlBa351、MeJi523和MeJi524以及MBin608的得到的ADC活性示于图12中(体外产生的β-丙氨酸的速率)。与东方伊萨酵母MlBa351(其表达SEQIDNO:139的地衣芽孢杆菌ADC)相比，东方伊萨酵母MeJi523、MeJi524和MBin608(其表达SEQIDNO:162的埃及伊蚊昆虫ADC)显示出在比活方面的显著改进。由于不同酶家族的不同最优条件，图中包括了最小化比活差异的条件(pH和温度)的范围。
实例7：构建靶向pdc位点的质粒
该实例描述了质粒pMHCT111和pMHCT112，左侧和右侧构建体对的构建，该构建允许通过在东方伊萨酵母CNB1pdc位点处同源重组地衣芽孢杆菌ADC编码序列的四个拷贝来整合。如以下实施例中所描述的，这些质粒作为受体载体用于在pdc基因座处测试昆虫ADC。
将质粒pMHCT082(WO2012/074818)用NheI和PacI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约4.7kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒(Macherey-Nagel公司)来纯化。将质粒pMlBa137(WO2012/074818)用NheI和PacI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约1.9kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将以上描述的纯化的片段连接到一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、1μl的NheI/PacIpMhCT082片段、3μl的NheI/PacIpMlBa137插入片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化Gold感受态细胞(安捷伦科技公司)。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在室温下孵育约72小时。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对来自pMlBa137的所希望的片段的适当插入使用ApaLI来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有pMlBa137片段的适当插入，并且该质粒指定为pMHCT111。
将质粒pMHCT071(WO2012/074818)用PmeI和PacI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约4.7kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。将质粒pMlBa136(WO2012/074818)用PmeI和PacI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约3.2kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将以上描述的纯化的片段连接到一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、1μl的PmeI/PacIpMhCT071片段、3μl的PmeI/PacIpMlBa136插入片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化Gold感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在室温下孵育约72小时。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对来自pMlBa136的所希望的片段的适当插入使用ApaLI消化来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有pMlBa136片段的适当插入，并且该质粒指定为pMHCT112。
实例8：构建在pdc基因座处表达来自大斑蝶的异源昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的酵母菌株
该实例描述了酵母细胞的构建，该酵母细胞在pdc基因座处含有编码SEQIDNO:170(SEQIDNO:212、213、214和215的密码子优化的编码序列)的大斑蝶ADC的多核苷酸的四个拷贝，两个拷贝在东方伊萨酵母PDC启动子控制之下，两个拷贝在东方伊萨酵母TDH3启动子控制之下。将左侧构建体和右侧构建体设计为在东方伊萨酵母CNB1pdc基因座处允许同源重组。为了防止重组在编码相同ADC序列的核苷酸序列的多个拷贝之间发生，将密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的四个不同的核苷酸序列设计为编码相同ADC序列。
左侧片段的构建
左侧构建体的第一克隆步骤是用密码子优化的以用于在东方伊萨酵母中表达的大斑蝶ADC编码序列r2(DpADCr2；编码SEQIDNO:170的ADC的SEQIDNO:212)替代pMBin249中5’埃及伊蚊ADC编码序列(实例10)，并且在质粒pMK-RQ中通过来合成。将DpADCr2质粒用NheI和AscI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约1.5kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。将质粒pMBin249用NheI-HF和AscI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约7.5kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将以上描述的纯化的片段连接到一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、0.5μl的NheI/AscIpMBin249片段、5μl的NheI/AscIDpADCr2插入片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞(克隆技术实验室有限公司)。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的r2片段的适当插入通过EcoRI和BglII消化来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有所希望的r2片段的适当插入，并且该质粒指定为pMHCT235。
左侧构建体的下一克隆步骤是去除剩余的埃及伊蚊ADC编码序列并且用另一种大斑蝶ADC编码序列对其替代。在质粒pMK-RQ中通过合成密码子优化的用于在东方伊萨酵母中表达的大斑蝶ADC编码序列r3(DpADCr3；编码SEQIDNO:170的ADC的SEQIDNO:213)。将DpADCr3质粒用SpeI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约1.5kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。用SpeI来消化质粒pMHCT235。通过添加1μl的小牛肠磷酸酶(新英格兰生物实验室公司)来去除5′-磷酸基团并且在37℃下孵育20分钟。将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约7.3kbp的带，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将以上描述的纯化的片段连接到一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、2μl的SpeIpMHCT235片段、5μl的SpeIDpADCr3插入片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的r3片段的适当插入通过BglII消化来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有所希望的r3片段的适当插入，并且该质粒指定为pMHCT238。
质粒pMHCT238(图13)是左侧东方伊萨酵母PDC靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的大斑蝶ADCr2编码序列(SEQIDNO:212)的表达)、东方伊萨酵母TAL终止子、东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的第二大斑蝶ADCr3编码序列(SEQIDNO:213)的表达)、东方伊萨酵母RKI终止子、东方伊萨酵母URA3启动子、以及东方伊萨酵母URA3ORF的5’片段。
右侧片段的构建
右侧构建体的第一克隆步骤是用密码子优化的以用于在东方伊萨酵母中表达的大斑蝶ADC编码序列r5(DpADCr5；编码SEQIDNO:170的ADC的SEQIDNO:215)替代pMBin250中3’埃及伊蚊ADC编码序列(实例10)，并且在质粒pMK-RQ中通过来合成。将DpADCr5质粒用XbaI和PacI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约1.5kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。将质粒pMBin250(实例10)用XbaI和PacI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约8.8kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将以上描述的纯化的片段连接到一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、0.5μl的XbaI/PacIpMBin250片段、5μl的XbaI/PacIDpADCr5插入片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的r5片段的适当插入通过EcoRI和BglII消化来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有所希望的r5片段的适当插入，并且该质粒指定为pMHCT237。
右侧构建体的下一克隆步骤是去除剩余的埃及伊蚊ADC编码序列并且用另一种大斑蝶ADC编码序列对其替代。在质粒pMK-RQ中通过合成密码子优化的用于在东方伊萨酵母中表达的大斑蝶ADC编码序列r4(DpADCr4；编码SEQIDNO:170的ADC的SEQIDNO:214)。将DpADCr4质粒用NheI和AscI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约1.5kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。将质粒pMHCT237用NheI和AscI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约8.6kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将以上描述的纯化的片段连接到一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、2μl的NheI/AscIpMHCT237片段、5μl的NheI/AscIDpADCr4插入片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的r4片段的适当插入通过BglII消化来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有所希望的r4片段并且被指定为pMHCT239。
质粒pMHCT239(图14)是右侧东方伊萨酵母PDC靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母URA3ORF的3’片段、东方伊萨酵母URA3启动子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的大斑蝶ADCr4编码序列(SEQIDNO:214)的表达)、东方伊萨酵母TKL终止子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的第二大斑蝶ADCr5编码序列(SEQIDNO:215)的表达)、以及东方伊萨酵母PDC终止子。
左侧和右侧片段的整合
转化之前，将30μg的pMHCT238用NotI进行消化，以从pUC19骨架载体中释放所希望的转化DNA。类似地，将30μg的pMHCT239用NotI进行消化，以从pUC19骨架载体中释放所希望的转化DNA。针对pMHCT238，通过0.9％琼脂糖凝胶电泳，在TAE缓冲液中，将约6.3kbp的带(含有所希望的表达盒)从载体DNA中分离，从凝胶切下，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒进行纯化。针对pMHCT239，通过0.9％琼脂糖凝胶电泳，在TAE缓冲液中，将约7.5kbp的带(含有所希望的表达盒)从载体DNA中分离，从凝胶切下，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒进行纯化。然后如实例1所描述的，将1255ng的NotIpMHCT238片段和1880ng的NotIpMHCT239片段用来转化东方伊萨酵母CNB1。
在37℃下，在SDura-板上选择转化体。在第二天，挑出十八个转化体，并且针对单菌落在SDura-板(缺乏尿嘧啶的平板)上重新划线，并且在37℃下生长过夜。然后从由每个初始转化体产生的条纹中的每个挑出单菌落并且在SDura-板上重新划线。
在单菌落纯化和生长一轮后，进行PCR以检验如在此描述的发生的所希望的靶向整合。使用引物0615988和0611245连同引物0612908和0615989来检验pMHCT238和pMHCT239片段对adh2556基因座的正确靶向。引物0615988结合到所靶向的区域的pdc基因座5’中，同时引物0611245结合至RKI终止子并且以反义方向扩增。通过PCR用这些引物产生约5.1kbp带指明在pdc基因座处所希望的整合事件的发生。引物0612908结合到URA3编码区中，同时引物0615989结合到所靶向的区域的pdc基因座3’中，并且以反义方向扩增。通过PCR用这些引物产生约7.2kbp带指明在pdc基因座处所希望的整合事件的发生。
通过将小量的酵母再悬浮与10μL的水中来制备PCR的模板DNA。然后添加40μL的Y-裂解缓冲液(ZYMO研究公司(ZymoResearchCorp.))和2μL的酶解酶(ZYMO研究公司)，并且将再悬浮的酵母细胞在37℃下孵育30分钟。然后将这些管转移到4℃直到PCR。
这些PCR(25μL)是由有待筛选的菌株的1μL模板DNA(如以上所描述的)、1XTaq反应缓冲液(新英格兰生物实验室公司)、0.4μM的正义引物、0.4μM的反义引物、各300μM的dATP、dCTP、dGTP、以及dTTP、和2.5单位的TaqDNA聚合酶(新英格兰生物实验室)的构成。用 进行PCR，其被编程为：1个循环，在94℃下持续4分钟；随后32个循环，每个循环在94℃下持续20秒、60℃下持续20秒、以及65℃下持续6分钟45秒；以及最终延长，在65℃下持续10分钟。热循环后，在TBE缓冲液中，将该PCR产物通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，并且如以上所描述的将带的大小可视化并进行解释。将具有所希望带的两个独立分离的转化体指定为东方伊萨酵母yMhCt184和yMhCt185。东方伊萨酵母yMhCt184和yMhCt185的转化体基因型示于表11中。
表11.
实例9：构建在pdc基因座处表达来自西方蜜蜂的异源昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的酵母菌株
该实例描述了酵母细胞的构建，该酵母细胞在pdc基因座处含有编码SEQIDNO:181(SEQIDNO:219、220、221和222的密码子优化的编码序列)的西方蜜蜂ADC的多核苷酸的四个拷贝，两个拷贝在东方伊萨酵母PDC启动子控制之下，两个拷贝在东方伊萨酵母TDH3启动子控制之下。将左侧构建体和右侧构建体设计为在东方伊萨酵母CNB1pdc基因座处允许同源重组。为了防止重组在编码相同ADC序列的核苷酸序列的多个拷贝之间发生，将密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的四个不同的核苷酸序列设计为编码相同ADC序列。
左侧片段的构建
左侧构建体的第一克隆步骤是用密码子优化的以用于在东方伊萨酵母中表达的西方蜜蜂ADC编码序列r2(AmADCr2；编码SEQIDNO:181的ADC的SEQIDNO:219)替代pMBin249中5’埃及伊蚊ADC编码序列(实例10)，并且在质粒pMK-RQ中通过来合成。将AmADCr2质粒用NheI和AscI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约1.6kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。将质粒pMBin249用NheI-HF和AscI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约7.5kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将以上描述的纯化的片段连接到一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、0.5μl的NheI/AscIpMBin249片段、5μl的NheI/AscIAmADCr2插入片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的r2片段的适当插入通过EcoRI和BglII消化来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有所希望的r2片段的适当插入，并且该质粒指定为pMHCT234。
左侧构建体的下一克隆步骤是去除剩余的埃及伊蚊ADC编码序列并且用另一种西方蜜蜂ADC编码序列对其替代。在质粒pMK-RQ中通过合成密码子优化的用于在东方伊萨酵母中表达的西方蜜蜂ADC编码序列r9(AmADCr9；编码SEQIDNO:181的ADC的SEQIDNO:220)。将AmADCr9质粒用SpeI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约1.6kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。用SpeI来消化质粒pMHCT234。通过添加1μl的小牛肠磷酸酶(新英格兰生物实验室公司)来去除5′-磷酸基团并且在37℃下孵育20分钟。将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约7.4kbp的带，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将以上描述的纯化的片段连接到一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、2μl的SpeIpMHCT234片段、2μl的SpeIAmADCr9插入片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的r9片段的适当插入头发HpaI消化来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有所希望的r9片段的适当插入，并且该质粒指定为pMHCT240。
质粒pMHCT240(图15)是左侧东方伊萨酵母PDC靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的西方蜜蜂ADCr2编码序列(SEQIDNO:219)的表达)、东方伊萨酵母TAL终止子、东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的第二西方蜜蜂ADCr9编码序列(SEQIDNO:220)的表达)、东方伊萨酵母RKI终止子、东方伊萨酵母URA3启动子、以及东方伊萨酵母URA3ORF的5’片段。
右侧片段的构建
右侧构建体的第一克隆步骤是用密码子优化的以用于在东方伊萨酵母中表达的西方蜜蜂ADC编码序列r7(AmADCr7；编码SEQIDNO:181的ADC的SEQIDNO:221)替代pMBin250中3’埃及伊蚊ADC编码序列(实例10)，并且在质粒pMK-RQ中通过来合成。将AmADCr7质粒用XbaI和PacI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约1.6kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。将质粒pMBin250(实例10)用XbaI和PacI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约8.8kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将以上描述的纯化的片段连接到一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、0.5μl的XbaI/PacIpMBin250片段、5μl的XbaI/PacIAmADCr7插入片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的r7片段的适当插入通过EcoRI和BglII消化来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有所希望的r9片段的适当插入，并且该质粒指定为pMHCT236。
右侧构建体的下一克隆步骤是去除剩余的埃及伊蚊ADC编码序列并且用另一种西方蜜蜂ADC编码序列对其替代。在质粒pMK-RQ中通过合成密码子优化的用于在东方伊萨酵母中表达的西方蜜蜂ADC编码序列r10(AmADCr10；编码SEQIDNO:181的ADC的SEQIDNO:222)。将AmADCr10质粒用NheI和和AscI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约1.6kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。将质粒pMHCT236用NheI和AscI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约8.7kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将以上描述的纯化的片段连接到一起，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、2μl的NheI/AscIpMHCT236片段、5μl的NheI/AscIAmADCr10插入片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对所希望的r10片段的适当插入通过BglII消化来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有所希望的r10片段的适当插入，并且该质粒指定为pMHCT241。
质粒pMHCT241(图16)是右侧东方伊萨酵母PDC靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母URA3ORF的3’片段、东方伊萨酵母URA3启动子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的西方蜜蜂ADCr10编码序列(SEQIDNO:222)的表达)、东方伊萨酵母TKL终止子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的第二西方蜜蜂ADCr7编码序列(SEQIDNO:221)的表达)、以及东方伊萨酵母PDC终止子。
左侧和右侧片段的整合
以上实例描述了产生左侧和右侧构建体用于埃及伊蚊ADC基因的四个核苷酸变体的靶向表达，这些变体进行密码子优化以用于在东方伊萨酵母中在pdc基因座处的表达。转化进东方伊萨酵母中之前，将30μg的pMHCT240用NotI进行消化，以从pUC19骨架载体中释放所希望的转化DNA。类似地，将30μg的pMHCT241用NotI进行消化，以从pUC19骨架载体中释放所希望的转化DNA。针对pMHCT240，通过0.9％琼脂糖凝胶电泳，在TAE缓冲液中，将含有带的约6.5kbp(含有所希望的表达盒)从载体DNA中分离，从凝胶切下，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒进行纯化。针对pMHCT241，通过0.9％琼脂糖凝胶电泳，在TAE缓冲液中，将约7.7kbp的带(含有所希望的表达盒)从载体DNA中分离，从凝胶切下，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒进行纯化。然后如实例1所描述的，将613ng的NotIpMHCT240片段和532ng的NotIpMHCT241片段用来转化东方伊萨酵母CNB1。
在SDura-板上选择转化体，在37℃下孵育生长。在第二天，挑出十八个转化体，并且针对单菌落在SDura-板上重新划线，并且在37℃下生长过夜。然后从由每个初始转化体产生的条纹中的每个挑出单菌落并且在SDura-板上重新划线。
在单菌落纯化和生长一轮后，进行PCR以检验如在此描述的发生的所希望的靶向整合。使用引物0615988和0611245连同引物0612908和0615989来检验pMHCT240和pMHCT241片段对adh2556基因座的正确靶向。引物0615988结合到所靶向的区域的pdc基因座5’中，同时引物0611245结合至RKI终止子并且以反义方向扩增。通过PCR用这些引物产生约5.6kbp带指明在pdc基因座处所希望的整合事件的发生。引物0612908结合到URA3编码区中，同时引物0615989结合到所靶向的区域的pdc基因座3’中，并且以反义方向扩增。通过PCR用这些引物产生约7.5kbp带指明在pdc基因座处所希望的整合事件的发生。
通过将小量的酵母再悬浮与10μL的水中来制备PCR的模板DNA。然后添加40μL的Y-裂解缓冲液和2μL的酶解酶，并且将再悬浮的酵母细胞在37℃下孵育30分钟。然后将这些管转移到4℃直到PCR。
这些PCR(25μL)是由有待筛选的菌株的1μL模板DNA(如以上所描述的)、1XTaq反应缓冲液、0.4μM的正义引物、0.4μM的反义引物、各300μM的dATP、dCTP、dGTP、以及dTTP、和2.5单位的TaqDNA聚合酶的构成。用 进行PCR，其被编程为：1个循环，在94℃下持续4分钟；随后32个循环，每个循环在94℃下持续20秒、60℃下持续20秒、以及65℃下持续6分钟45秒；以及最终延长，在65℃下持续10分钟。热循环后，在TBE缓冲液中，将该PCR产物通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，并且如以上所描述的将带的大小可视化并进行解释。将具有所希望带的两个独立分离的转化体指定为东方伊萨酵母yMhCt186和yMhCt187。东方伊萨酵母yMhCt186和yMhCt187的转化体基因型示于表12中。
表12.
实例10：构建在pdc基因座处表达来自埃及伊蚊的异源昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的酵母菌株
该实例描述了酵母细胞的构建，该酵母细胞在pdc基因座处含有编码SEQIDNO:162(SEQIDNO:158、159、160和161的密码子优化的编码序列)的埃及伊蚊ADC的多核苷酸的四个拷贝，两个拷贝在东方伊萨酵母PDC启动子控制之下，两个拷贝在东方伊萨酵母TDH3启动子控制之下。
左侧片段的构建
将质粒pMeJi363(实例2)用NheI和PacI来消化并且在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳来分离。将大约4.5kbp的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。该片段含有ADCr3和ADCr4，其中每个由东方伊萨酵母PDC启动子来驱动，并且含有URA3选择性标记的5’部分。将PDC靶向质粒pMHCT111(实例7)用NheI和PacI来消化并且在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳来分离。将大约4.7kbp的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。该片段含有载体主链，连同pdc基因座同源物的5’区域。在10μL的总反应体积中，将含有两个ADC编码序列的4.5kbpNheI/PacI插入片段与4.7kbpNheI/PacIpMHCT111片段连接，该10μL的总反应体积是由2μL的NheI/PacIpMHCT111片段、6μL的4.5kbpNheI/PacI插入片段、1μL的具有10mMATP的10X连接缓冲液、以及1μL的T4连接酶构成。将反应物在22℃下孵育18小时，并且根据厂商说明书，将反应物的4μL等分部分转化进ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞中。在回收期之后，将来自转化反应的两个100μL等分部分分散在150mm2XYT+amp平板上。将该板在37℃下孵育过夜。从选择板中选择推定的重组克隆并且使用9600从每种中制备质粒DNA。通过用NcoI加HindIII限制酶切消化来分析克隆，并且具有正确限制酶切消化模式的质粒指定为质粒pMBin249。
质粒pMBin249(图17)是左侧东方伊萨酵母PDC靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADCr3编码序列(SEQIDNO:160)的表达)、东方伊萨酵母TAL终止子、东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的第二埃及伊蚊ADCr4编码序列(SEQIDNO:161)的表达)、东方伊萨酵母RKI终止子、东方伊萨酵母URA3启动子、以及东方伊萨酵母URA3ORF的5’片段。
右侧片段的构建
将质粒pMeJi364(实例2)用NheI、PacI、和ScaI来消化(切入载体主链)并且在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳来分离。将大约4.8kbp的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。该片段含有埃及伊蚊ADCr10和ADC编码序列，其中每个由东方伊萨酵母CNB1PDC启动子来驱动，并且含有URA3选择性标记的5’部分。将PDC靶向质粒pMHCT112(实例7)用NheI和PacI来消化并且在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳来分离。将大约4.8kbp的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。该片段含有载体主链，连同pdc基因座同源物的3’区域。在10μL的总反应体积中，将含有两个ADC编码序列的4.8kbpNheI/PacI片段与4.8kbppMHCT112线性化载体连接，该10μL的总反应体积是由1μL的4.8kbp载体、7μL的4.8kbp插入片段、1μL的具有10mMATP的10X连接缓冲液、以及1μL的T4连接酶构成。将反应物在22℃下孵育18小时，并且根据厂商说明书，将反应物的4μL等分部分转化进ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞中。在回收期之后，将来自转化反应的两个100μL等分部分分散到每ml补充有100μg氨比西林的2XYT平板上。将该板在37℃下孵育过夜。从平板中选择推定的重组克隆并且使用9600从每种中制备质粒DNA。通过用ApaI加PacI限制酶切消化来分析克隆，并且具有正确限制酶切消化模式的质粒指定为质粒pMBin250。
质粒pMBin250(图18)是右侧东方伊萨酵母pdc靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母URA3ORF的3’片段、东方伊萨酵母URA3启动子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADCr10编码序列(SEQIDNO:159)的表达)、东方伊萨酵母TKL终止子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的第二埃及伊蚊ADC编码序列(SEQIDNO:158)的表达)、以及东方伊萨酵母PDC终止子。
左侧和右侧片段的整合
将质粒pMBin249用NotI进行消化，并且将质粒pMBin250用ApaI和KasI进行消化。在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳分离这些消化的质粒，其中从凝胶切下约6.6kbp(来自pMBin249)和7.9kbp(来自pMBin250)的带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
如实例1所描述的，将东方伊萨酵母CNB1用NotIpMBin249片段和ApaI/KasIpMBin250片段进行转化，并且根据厂商的说明书，通过使用植物直接PCR试剂盒，对正确的基因座靶向与转化进行验证。引物0615988和0611245产生约5.4kbp的带，并且引物0615989和0611317产生约7.9kbp的带。将具有预期带(针对表达盒的合适整合)的转化体指定为东方伊萨酵母MBin612和MBin613。东方伊萨酵母MBin612和MBin613的转化体基因型示于表13中。
表13.
实例11：构建在pdc基因座处表达来自黑腹果蝇的异源昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的酵母菌株
该实例描述了酵母细胞的构建，该酵母细胞在pdc基因座处含有编码SEQIDNO:169(SEQIDNO:223、224、225和226的密码子优化的编码序列)的黑腹果蝇ADC的多核苷酸的四个拷贝，两个拷贝在东方伊萨酵母PDC启动子控制之下，两个拷贝在东方伊萨酵母TDH3启动子控制之下。
左侧片段的构建
左侧构建体的第一克隆步骤是用密码子优化的以用于在东方伊萨酵母中表达的黑腹果蝇ADC编码序列ADCr2(编码SEQIDNO:169的ADC的SEQIDNO:223)替代pMBin250中5’埃及伊蚊ADC编码序列(实例10)，并且在质粒p13AAZDUP_1363232_DmADCr2中通过来合成。将质粒pMBin249用NheI和AscI来消化并且将该消化物在TBE缓冲液中通过0.7％琼脂糖凝胶电泳来纯化。将大约7.5kbp的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒(Macherey-Nagel公司)进行纯化。将质粒3AAZDUP_1363232_DmADCr2用NheI、AscI、和BspHI来消化并且将该消化物在TBE缓冲液中通过0.7％琼脂糖凝胶电泳来纯化。将约1.74kbp、含有黑腹果蝇ADCr2的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
在20μL的总反应体积中，将7.5kbp纯化的pMBin249片段与1.74kbpDmADCr2片段连接，该20μL的总反应体积由1μL的7.5kbppMBin249片段、5μL的1.74kbpDmADCr2片段、2μL的具有10mMATP的10X连接缓冲液、以及1μL的T4连接酶构成。将反应物在室温下孵育1小时，并且根据厂商说明书，将反应物的10μL等分部分转化进StellarTM感受态细胞中。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。用KpnI，通过限制酶切消化，针对适合的插入筛选得到的转化体中的若干。将产生正确消化带大小的分离的质粒指定为质粒pMcTs150。
质粒pMcTs150含有一个黑腹果蝇ADC编码序列和一个埃及伊蚊ADC编码序列，这两个编码序列各自具有东方伊萨酵母PDC启动子靶向pdc基因座。通过用SpeI消化pMcTs150来去除埃及伊蚊ADC编码序列。将大约7.5kbp的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
在质粒p13AAZDTP_1363231_DmADCr4中通过合成密码子优化的用于在东方伊萨酵母中表达的黑腹果蝇ADC编码序列ADCr4(编码SEQIDNO:169的ADC的SEQIDNO:224)。将质粒p13AAZDTP_1363231_DmADCr4用SpeI和BspHI来消化并且将该消化物在TBE缓冲液中通过0.7％琼脂糖凝胶电泳来纯化。将约1.75kbp、含有黑腹果蝇ADCr4的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
为了产生具有在东方伊萨酵母PDC启动子的控制之下的两个黑腹果蝇ADC编码序列的质粒，在20μL的总反应体积中，将7.5kbppMcTs150片段与1.75kbpDmADCr4片段连接，该20μL的总反应体积由1μL的7.5kbppMcTs150片段、10μL的1.75kbpDmADCr4片段、2μL的具有10mMATP的10X连接缓冲液、以及1μL的T4连接酶构成。将反应物在室温下孵育1小时，并且根据厂商说明书，将反应物的10μL等分部分转化进StellarTM感受态细胞中。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。用KpnI和PacI加EcoRI，通过限制酶切消化，针对适合的插入筛选得到的转化体中的若干。将产生正确消化带大小的分离的质粒指定为质粒pMcTs152。
质粒pMcTs152(图9)是左侧东方伊萨酵母PDC靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的黑腹果蝇ADC编码序列ADCr2(SEQIDNO:223)的表达)、东方伊萨酵母TAL终止子、东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的第二黑腹果蝇ADC编码序列ADCr4(SEQIDNO:224)的表达)、东方伊萨酵母RKI终止子、东方伊萨酵母URA3启动子、以及东方伊萨酵母URA3ORF的5’片段。
右侧片段的构建
右侧构建体的第一克隆步骤是用密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的黑腹果蝇ADC编码序列ADCr8(编码SEQIDNO:169的ADC的SEQIDNO:225)替代pMBin249中3’埃及伊蚊ADC编码序列(实例10)，并且在质粒p13AAZDRP_1363229_DmADCr8中通过来合成。
将质粒pMBin250(实例10)用NheI和AscI来消化并且将该消化的质粒在TBE缓冲液中通过0.7％琼脂糖凝胶电泳来纯化。将大约8.76kbp的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。将质粒13AAZDRP_1363229_DmADCr8用NheI、AscI、和BspHI来消化并且将该消化的质粒在TBE缓冲液中通过0.7％琼脂糖凝胶电泳来纯化。将约1.74kbp、含有黑腹果蝇ADCr8的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
在20μL的总反应体积中，将8.76kbppMBin250片段与1.74kbpDmADCr8片段连接，该20μL的总反应体积由1μL的7.5kbppMBin249片段、10μL的1.74kbpDmADCr8片段、2μL的具有10mMATP的10X连接缓冲液、以及1μL的T4连接酶构成。将反应物在室温下孵育1小时，并且根据厂商说明书，将反应物的10μL等分部分转化进StellarTM感受态细胞中。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。用KpnI加SpeI和NotI加PstI，通过限制酶切消化，针对适合的插入筛选得到的转化体中的若干。将产生正确消化带大小的分离的质粒指定为质粒pMcTs148。
质粒pMcTs148含有一个黑腹果蝇ADC编码序列和一个埃及伊蚊ADC编码序列，这两个编码序列各自具有东方伊萨酵母TDH3启动子靶向pdc基因座。通过用XbaI和PacI消化pMcTs148来去除埃及伊蚊ADC编码序列，并且然后在TBE缓冲液中通过0.7％琼脂糖凝胶电泳来纯化片段。将大约8.8kbp的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
在质粒p13AAZDSP_1363230_DmADCr6中通过合成密码子优化的用于在东方伊萨酵母中表达的黑腹果蝇ADC编码序列ADCr6(编码SEQIDNO:169的ADC的SEQIDNO:226)。用XbaI、PacI、和BspHI消化质粒13AAZDSP_1363230_DmADCr6。将约1.74kbp、含有黑腹果蝇ADC编码序列ADCr6的条带从凝胶切除，并且根据厂商说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
为了产生具有在东方伊萨酵母TDH3启动子的控制之下的两个黑腹果蝇ADC编码序列的质粒，在20μL的总反应体积中，将8.8kbppMcTs148片段与1.74kbpDmADCr6片段连接，该20μL的总反应体积由1μL的7.5kbppMcTs150片段、5μL的1.74kbpDmADCr6片段、2μL的具有10mMATP的10X连接缓冲液、以及1μL的T4连接酶构成。将反应物在室温下孵育1小时，并且根据厂商说明书，将反应物的10μL等分部分转化进StellarTM感受态细胞中。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在37℃下孵育过夜。用KpnI，通过限制酶切消化，针对适合的插入筛选得到的转化体中的若干。将产生正确消化带大小的分离的质粒指定为质粒pMcTs149。
质粒pMcTs149(图20)是右侧东方伊萨酵母pdc靶向构建体，该构建体含有以下各项：东方伊萨酵母URA3ORF的3’片段、东方伊萨酵母URA3启动子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的黑腹果蝇ADC编码序列ADCr8(SEQIDNO:225)的表达)、东方伊萨酵母TKL终止子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的第二黑腹果蝇ADC编码序列ADCr6(SEQIDNO:226)的表达)、以及东方伊萨酵母PDC终止子。
左侧和右侧片段的整合
将质粒pMcTs152用NotI进行消化，并且将质粒pMcTs149用NotI和SacII进行消化。在TBE缓冲液中通过0.7％琼脂糖凝胶电泳纯化这些消化物，其中从凝胶切下约6.6kbp(来自pMcTs152)和7.9kbp(来自pMcTs149)的带，并且根据厂商的说明书，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
如实例1所描述的，将东方伊萨酵母CNB1用消化的pMcTs152和pMcTs149片段进行转化，并且根据厂商的说明书，使用植物直接PCR试剂盒，对正确的基因座靶向与转化进行验证。引物0615988和0611245产生约5.5kbp的带，并且引物0615989和0612908产生约7.6kbp的带。将给出预期带(针对表达盒的合适整合)的菌株指定为东方伊萨酵母McTs510。
东方伊萨酵母McTs510的转化体基因型示于表14中。
表14.
实例12：在表达不同异源昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的重组酵母菌株中的3-HP生产
该实例描述了在相同基因座(pdc)处表达编码不同昆虫ADC的多核苷酸的四个拷贝的酵母菌株中3-HP生产特征：ADC埃及伊蚊(东方伊萨酵母MBin612和MBin613；二者编码SEQIDNO:162的ADC)、ADC黑腹果蝇(东方伊萨酵母McTs510；编码SEQIDNO:169的ADC)、或ADC大斑蝶(东方伊萨酵母yMhCt184；编码SEQIDNO:170的ADC)。
培养基和培养条件连同分析方法与实例5相同。东方伊萨酵母MBin612、MBin613、McTs510、和yMhCt184的得到的发酵物示于图21(在不同的时间点的3-HP浓度)和表15(在44小时的发酵后3HP浓度和产率)中。东方伊萨酵母MBin612、MBin613、和yMhCt184表现类似，然而东方伊萨酵母McTs510表现略微更低。然而，与表达SEQIDNO:139的地衣芽孢杆菌ADC的东方伊萨酵母MlBa351(参见实例5)相比，表达异源昆虫ADC的所有测试的菌株都显示出更高3-HP浓度和产率。
表15.
菌株 发酵次数 表达的ADC [3-HP](g/L) 3-HP(产率)
MBin612 4 SEQ ID NO:162 15.2 7.6
MBin613 1 SEQ ID NO:162 15.3 8.1
McTs510 2 SEQ ID NO:169 9.8 4.3
yMhCt184 2 SEQ ID NO:170 15.0 6.4
实例13：构建在mdhB基因座处表达异源埃及伊蚊天冬氨酸1-脱羧酶的酵母菌株
该实例描述了酵母细胞的构建，该酵母细胞在mdhB基因座处含有编码SEQIDNO:162(SEQIDNO:161和158的密码子优化的编码序列)的埃及伊蚊ADC的多核苷酸的两个拷贝，一个拷贝在东方伊萨酵母PDC启动子控制之下，一个拷贝在东方伊萨酵母TDH3启动子控制之下。
左侧片段的构建
除了将在pMeJi363中的HpaI和NotI限制位点之间的左侧adh2556同源区被苹果酸脱氢酶B(mdhB)基因座(SEQIDNO:230)的同源物替代以外，质粒pCKLE100(图23)与pMeJi363(实例2)是类似的。
为了产生具有单个埃及伊蚊ADC编码序列左侧质粒，将pCKLE100用BlpI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约7.4kbp的带，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将纯化的片段连接到其自身，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、0.2μl的BlpIpCKLE100片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在室温下孵育约72小时。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对具有由SalI消化去除的BlpI片段的pCKLE100的适当重新连接来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有pCKLE100的适当重新连接，并且该质粒指定为pMHCT259a(图24)。
质粒pMHCT259a是左侧东方伊萨酵母mdhB靶向构建体，该构建体含有东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADCr4编码序列(SEQIDNO:161的表达)、东方伊萨酵母RKI终止子、东方伊萨酵母URA3启动子、以及东方伊萨酵母URA3ORF的5’片段。
右侧片段的构建
除了将在pMeJi3643中的NotI和SacII限制位点之间的右侧adh2556同源区被苹果酸脱氢酶B(mdhB)基因座(SEQIDNO:231)的同源物替代以外，质粒pCKLE107(图25)与pMeJi364(实例2)是类似的。
为了产生具有单个埃及伊蚊ADC编码序列右侧质粒，将pCKLE107用NheI和XbaI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约7.8kbp的带，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在连接反应物(20μl)中，将纯化的片段连接到其自身，该连接反应物由1X快速连接缓冲液、0.5μl的NheI/XbaIpCKLE107片段、以及1μl的快速T4DNA连接酶构成。将连接反应物在室温下孵育5分钟并且然后在冰上冷却。根据制造厂商的指南，用5μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在室温下孵育约72小时。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备DNA质粒，并且针对具有使用SalI和HindIII双重消化去除的NheI和XbaI片段的pCKLE107的适当重新连接来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有pCKLE107的适当重新连接，并且该质粒指定为pMHCT260a(图26)。
质粒pMHCT260a是右侧东方伊萨酵母adh2556靶向构建体，该构建体含有东方伊萨酵母URA3ORF的3’片段、东方伊萨酵母URA3启动子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的埃及伊蚊ADC编码序列(SEQIDNO:158)的表达)、以及东方伊萨酵母PDC终止子。
左侧和右侧片段的整合
以上实例描述了产生左侧和右侧构建体用于埃及伊蚊ADC基因的两个核苷酸变体的靶向表达，这些变体进行密码子优化以用于在东方伊萨酵母中在mdhB基因座处的表达。转化进东方伊萨酵母中之前，将30μg的pMHCT259a用HpaI和SacII进行消化，以从pUC19主链载体中释放所希望的转化DNA。类似地，将30μg的pMHCT260a用PfoI和SacII进行消化，以从pUC19骨架载体中释放所希望的转化DNA。针对pMHCT259a，通过0.9％琼脂糖凝胶电泳，在TAE缓冲液中，将含有带的约4.8kbp(含有所希望的表达盒)从载体DNA中分离，从凝胶切下，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒进行纯化。针对pMHCT260a，通过0.9％琼脂糖凝胶电泳，在TAE缓冲液中，将约5.5kbp的带(含有所希望的表达盒)从载体DNA中分离，从凝胶切下，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒进行纯化。然后如实例1所描述的，将约800ng的HpaI/SacIIpMHCT259a片段和约800ng的PfoI/SacIIpMHCT260a片段用来转化东方伊萨酵母CNB1。
在37℃下，在SDura-板上选择转化体。在第二天，挑出六个转化体，并且针对单菌落在SDura-板上重新划线，并且在37℃下生长过夜。然后从由每个初始转化体产生的条纹中的每个挑出单菌落并且在SDura-板上重新划线。
在单菌落纯化和生长一轮后，进行PCR以检验如在此描述的发生的所希望的靶向整合。使用引物1206368和0613109连同引物0612908和1206369来检验pMHCT259a和pMHCT260a片段对mdhB基因座的正确靶向。引物1206368结合到所靶向的区域的mdhB基因座5’中，同时引物0613109结合至RKI终止子并且以反义方向扩增。通过PCR用这些引物产生约3.3kbp带指明在mdhB基因座处所希望的整合事件的发生。引物0612908结合到URA3编码区中，同时引物1206369结合到所靶向的区域的mdhB基因座3’中，并且以反义方向扩增。通过PCR用这些引物产生约4.6kbp带指明在mdhB基因座处所希望的整合事件的发生。
通过将小量的酵母再悬浮与10μL的水中来制备PCR的模板DNA。然后添加40μL的Y-裂解缓冲液和2μL的酶解酶，并且将再悬浮的酵母细胞在37℃下孵育30分钟。然后将这些管转移到4℃直到PCR。
这些PCR(25μL)是由有待筛选的菌株的1μL模板DNA(如以上所描述的)、1XTaq反应缓冲液、0.4μM的正义引物、0.4μM的反义引物、各300μM的dATP、dCTP、dGTP、以及dTTP、和2.5单位的TaqDNA聚合酶的构成。用 进行PCR，其被编程为：1个循环，在94℃下持续4分钟；随后32个循环，每个循环在94℃下持续20秒、60℃下持续20秒、以及65℃下持续5分钟；以及最终延长，在65℃下持续10分钟。热循环后，在TBE缓冲液中，将该PCR产物通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，并且如以上所描述的将带的大小可视化并进行解释。将具有所希望的带的分离转化体指定为东方伊萨酵母yMhCt212。东方伊萨酵母yMhCt212的转化体基因型示于表16中。
表16.
实例14：构建在mdhB基因座处表达异源赤拟谷盗天冬氨酸1-脱羧酶的酵母菌株
该实例描述了酵母细胞的构建，该酵母细胞在mdhB基因座处含有编码SEQIDNO:165(SEQIDNO:232和233的密码子优化的编码序列)的赤拟谷盗ADC的多核苷酸的两个拷贝，一个拷贝在东方伊萨酵母PDC启动子控制之下，一个拷贝在东方伊萨酵母TDH3启动子控制之下。
左侧片段的构建
为了产生具有单个赤拟谷盗ADC编码序列的左侧质粒，编码针对东方伊萨酵母密码子优化的赤拟谷盗ADCr7的5’区域(SEQIDNO:232的核苷酸1-840)的合成DNA片段(具有以下所示序列的5’延长)被合成为StringTM(生命科技公司)。
5’-CACAGCAAAACACAAAAAGCTAGCTAAA-3’(SEQIDNO:234)
从(生命科技公司)合成编码PstI位点、针对东方伊萨酵母密码子优化的赤拟谷盗ADCr7的3’区域(SEQIDNO:232的核苷酸781-1623)、以第二PstI位点结束的3’延长(以下显示的该3’延长的序列)的第二合成DNA片段。
5’-TTAATTAATTTATTTTACTAGTCTGCAG-3’(SEQIDNO:235)
该3’赤拟谷盗ADCr7基因片段经PstI消化从合成基因载体释放。将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下871bp的带，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。
除了用与苹果酸脱氢酶B(mdhB)基因座的5’DNA同源的DNA片段(SEQIDNO:230)插入pMHCT238中的第一PDC启动子的5’以允许靶向mdhB基因座之外，质粒pMHCT246(图27)与pMHCT238(实例8)是类似的。将质粒pMHCT246用NheI和PacI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约5.7kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。在反应物(10μl)中，根据厂商的说明书，使用IN-FUSIONTMHD克隆试剂盒(克隆技术实验室有限公司)，将以上所述纯化片段连接到一起，该反应物是由1XHD预混物(克隆技术实验室有限公司)、3.8μl的NheI/PacIpMHCT246片段、0.5μl的5’赤拟谷盗ADC基因片段串、以及经PstI消化的1.1μl的3’赤拟谷盗ADC基因片段构成。根据制造厂商的指南，用2μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在室温下孵育约72小时。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用9600从每种中制备质粒DNA，并且针对赤拟谷盗ADC基因片段的二者的所希望的整合经由NheI和PacI双重消化来进行筛选。一种转化体被鉴定为含有具有赤拟谷盗ADCr7编码区域的质粒，并且被指定为质粒pMHCT267(图28)。
质粒pMHCT267是左侧东方伊萨酵母mdhB靶向构建体，该构建体含有东方伊萨酵母PDC启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的赤拟谷盗ADCr7编码序列(SEQIDNO:232的表达)、东方伊萨酵母RKI终止子、东方伊萨酵母URA3启动子、以及东方伊萨酵母URA3ORF的5’片段。
右侧片段的构建
为了产生具有单个赤拟谷盗ADC编码序列的右侧质粒，编码针对东方伊萨酵母密码子优化的赤拟谷盗ADCr3的5’区域(SEQIDNO:233的核苷酸1-840)的合成DNA片段(具有以下所示序列的5’延长)被合成为StringTM(生命科技公司)。
5’-CACACAAACAAACACAGCTAGCTAAA-3’(SEQIDNO:236)
从(生命科技公司)订购编码PstI位点、针对东方伊萨酵母密码子优化的赤拟谷盗ADCr3的3’区域(SEQIDNO:233的核苷酸781-1623)、以第二PstI位点结束的3’延长(以下显示的该3’延长的序列)的第二合成DNA片段。
5’-TTAATTAACATCTGAATGTAAAATGCTGCAG-3’(SEQIDNO:237)
该3’赤拟谷盗ADC基因片段经PstI消化从合成基因载体释放。将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下871bp的带，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。
将质粒pCKLE107(实例13)用NheI和PacI进行消化，并且将得到的片段在TAE缓冲液中通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中从凝胶切下约6.1kbp的带并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒来纯化。
在反应物(10μl)中，根据厂商的说明书，使用IN-FUSIONTMHD克隆试剂盒，将以上所述纯化片段连接到一起，该反应物是由1XHD预混物、5μl的NheI/PacIpCKLE107片段、0.1μl的5’赤拟谷盗ADCr3基因片段串、以及经PstI消化的0.2μl的3’赤拟谷盗ADCr3基因片段构成。根据制造厂商的指南，用2μl的反应物来转化StellarTM感受态细胞。将转化反应物分散到2XYT+amp平板上并在室温下孵育约72小时。针对赤拟谷盗ADCr3基因片段的适当整合使用NheI和PacI双重消化来对得到的转化体中的若干进行筛选。针对一个转化体，通过DNA测序来确认赤拟谷盗ADCr3编码区，并且将该确认的质粒指定为pMHCT268(图29)。
质粒pMHCT268是右侧东方伊萨酵母mdhB靶向构建体，该构建体含有东方伊萨酵母URA3ORF的3’片段、东方伊萨酵母URA3启动子、东方伊萨酵母TDH3启动子(驱动密码子优化以用于在东方伊萨酵母中表达的赤拟谷盗ADCr3编码序列(SEQIDNO:233)的表达)、以及东方伊萨酵母PDC终止子。
左侧和右侧片段的整合
以上实例描述了产生左侧和右侧构建体用于赤拟谷盗ADC基因的两个核苷酸变体的靶向表达，这些变体进行密码子优化以用于在东方伊萨酵母中在mdhB基因座处的表达。转化进东方伊萨酵母中之前，将12.6μg的pMHCT267用HpaI和SacII进行消化，以从pUC19主链载体中释放所希望的转化DNA。类似地，将12.9μg的pMHCT268用EcoRI和SacII进行消化，以从pUC19骨架载体中释放所希望的转化DNA。针对pMHCT267，通过0.9％琼脂糖凝胶电泳，在TAE缓冲液中，将含有带的约4.7kbp(含有所希望的表达盒)从载体DNA中分离，从凝胶切下，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒进行纯化。针对pMHCT268，通过0.9％琼脂糖凝胶电泳，在TAE缓冲液中，将约5.1kbp的带(含有所希望的表达盒)从载体DNA中分离，从凝胶切下，并且根据厂商的说明书，使用提取II试剂盒进行纯化。然后如实例1所描述的，将约430ng的HpaI/SacIIpMHCT267片段和约175ng的EcoRI/SacIIpMHCT268片段用来转化东方伊萨酵母CNB1。
在SDura-板上选择转化体，在37℃下孵育生长。在第二天，挑出六个转化体，并且针对单菌落在SDura-板(缺乏尿嘧啶的平板)上重新划线，并且在37℃下生长过夜。然后从由每个初始转化体产生的条纹中的每个挑出单菌落并且在SDura-板上重新划线。
在单菌落纯化和生长一轮后，进行PCR以检验如在此描述的发生的所希望的靶向整合。使用引物1206368和0613109连同引物0612908和1206369来检验pMHCT267和pMHCT268片段对mdhB基因座的正确靶向。引物1206368结合到所靶向的区域的mdhB基因座5’中，同时引物0613109结合至RKI终止子并且以反义方向扩增。通过PCR用这些引物产生约3.2kbp带指明在mdhB基因座处所希望的整合事件的发生。引物0612908结合到URA3编码区中，同时引物1206369结合到所靶向的区域的mdhB基因座3’中，并且以反义方向扩增。通过PCR用这些引物产生约4.5kbp带指明在mdhB基因座处所希望的整合事件的发生。
通过将小量的酵母再悬浮与10μL的水中来制备PCR的模板DNA。然后添加40μL的Y-裂解缓冲液和2μL的酶解酶，并且将再悬浮的酵母细胞在37℃下孵育30分钟。然后将这些管转移到4℃直到PCR。
这些PCR(25μL)是由有待筛选的菌株的1μL模板DNA(如以上所描述的)、1XTaq反应缓冲液、0.4μM的正义引物、0.4μM的反义引物、各300μM的dATP、dCTP、dGTP、以及dTTP、和2.5单位的TaqDNA聚合酶的构成。用 进行PCR，其被编程为：1个循环，在94℃下持续4分钟；随后32个循环，每个循环在94℃下持续20秒、60℃下持续20秒、以及65℃下持续5分钟；以及最终延长，在65℃下持续10分钟。热循环后，在TBE缓冲液中，将该PCR产物通过0.9％琼脂糖凝胶电泳来分离，并且如以上所描述的将带的大小可视化并进行解释。将具有所希望带的两个独立分离的转化体指定为东方伊萨酵母yMhCt244和yMhCt245。东方伊萨酵母yMhCt244和yMhCt245的转化体基因型示于表17中。
表17.
实例15：在mdhB基因座处表达异源昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的重组酵母菌株中的3-HP的生产
该实例描述了与在mdhB基因座处表达编码赤拟谷盗ADC的多核苷酸的两个拷贝的酵母菌株(东方伊萨酵母yMhCt244和yMhCt245，实例14)相比，在mdhB基因座处表达编码埃及伊蚊ADC的多核苷酸的两个拷贝的酵母菌株(东方伊萨酵母yMhCt212，实例13)中的3-HP生产特征。
根据以下程序，将东方伊萨酵母菌株yMhCt212、yMhCt244、和yMhCt245在摇瓶中生长。将菌株在SDura-板上针对单菌落划线，并且在30℃下孵育1-2天。种子培养物在含有25ml的CNB1培养基的125ml挡板烧瓶中进行制备，该CNB1培养基被来自SDura-板的1-2个菌落接种的。种子培养物在30℃下以200rpm振荡生长约18小时。然后将培养物的小等分部分进行抽取，以测量OD600直至达到OD600为4-8。将种子烧瓶培养物稀释至OD600＝0.16并且用来接种于含有50mL的CNB1培养基的125ml挡板烧瓶中。将摇瓶在30℃下以140rpm振荡孵育18小时。然后抽取培养物的样品来测量培养物的OD600和3-HP生产。针对3-HP生产，离心样品并且根据实例5，将上清液用于3-HP分析。
表18中的结果显示了由菌株生产的3-HPg/L除以菌株的光密度(OD600)。每个菌株一式两份生长，并且所显示的(3-HPg/L)/OD是每组中两份的平均值。数据显示出埃及伊蚊ADC产生比赤拟谷盗ADC明显更多的3-HP生产。
表18
菌株 表达的ADC (3-HP g/L)/OD77 -->
yMhCt212 SEQ ID NO:162 0.369
yMhCt244 SEQ ID NO:165 0.129
yMhCt245 SEQ ID NO:165 0.136
虽然出于清楚理解的目的，已经通过说明以及实例的方式相当详细描述了上文，本领域的普通技术人员将清楚的是，可以实施任何等效方面或修饰。因此，该说明和实例不应当解释为限制本发明的范围。
通过以下编号的段落进一步说明本发明：
[1]一种重组酵母细胞，该重组酵母细胞包含编码以下纲的天冬氨酸1-脱羧酶的异源多核苷酸：昆虫纲、双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲，其中该细胞能够生产3-羟基丙酸(3-HP)。
[2]如段落1所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶是昆虫纲的天冬氨酸1-脱羧酶。
[3]如段落1或2所述的重组酵母细胞，其中该昆虫纲的天冬氨酸1-脱羧酶是选自下组的目的昆虫天冬氨酸1-脱羧酶，该组由以下各项组成：蜚蠊目、鞘翅目、革翅目、双翅目、纺足目、蜉蝣目、半翅目、膜翅目、鳞翅目、螳螂目、长翅目、广翅目、石蛃目、脉翅目、蛩蠊目、蜻蜓目、直翅目、竹节虫目、襀翅目、啮虫目、蛇蛉目、蚤目、捻翅目、缨翅目、毛翅目、缺翅目、和衣鱼目。
[4]如段落1-3中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶与SEQIDNO:162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、或191的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[5]如段落1-4中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、或191或由其组成。
[6]如段落1所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶是鳃足纲的天冬氨酸1-脱羧酶。
[7]如段落6所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶与SEQIDNO:192的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[8]如段落6或7所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:192或者由其组成。
[9]如段落1所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶是腹足纲的天冬氨酸1-脱羧酶。
[10]如段落9所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶与SEQIDNO:193的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[11]如段落9或10所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:193或者由其组成。
[12]如段落1所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶是头索纲的天冬氨酸1-脱羧酶。
[13]如段落12所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶与SEQIDNO:194的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[14]如段落12或13所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:194或者由其组成。
[15]如段落1所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶是双壳纲的天冬氨酸1-脱羧酶。
[16]如段落15所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶与SEQIDNO:195的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[17]如段落15或16所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:195或者由其组成。
[18]如段落1-17中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶在与SEQIDNO:162的氨基酸序列的位置377对应的残基处包括谷氨酰胺。
[19]如段落18所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶在与SEQIDNO:162的氨基酸序列的位置377对应的位置处包含谷氨酰胺，并且包含与SEQIDNO:162的氨基酸382-516具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％序列一致性的部分氨基酸序列。
[20]如段落1-19中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶包括F1aa19S2aaY3基序或Y1aa19S2aaY3基序，其中F1是苯丙氨酸，Y1是酪氨酸，aa19是具有十九个氨基酸的插入序列，S2是丝氨酸，aa是单个氨基酸，并且Y3是酪氨酸。
[21]如段落1-20中的任一项所述的重组酵母细胞，其中编码天冬氨酸1-脱羧酶的异源多核苷酸包括对于编码天冬氨酸1-脱羧酶的多核苷酸而言外源的启动子。
[22]如段落1-21中的任一项所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，与不具有编码天冬氨酸1-脱羧酶的该异源多核苷酸的细胞相比，该重组酵母细胞产生更大量的3-HP(例如，多出至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、或至少500％)。
[23]如段落1-22中的任一项所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，该细胞与第二重组酵母细胞相比产生更大量的3-HP(例如，多出至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、至少200％至少300％、或至少500％)；其中该第二酵母细胞与编码昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的酵母细胞相同，其条件是该第二酵母细胞编码SEQIDNO:139的地衣芽孢杆菌天冬氨酸1-脱羧酶代替昆虫天冬氨酸1-脱羧酶。
[24]如段落1-23中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞进一步包括选自以下各项的一种或多种异源多核苷酸：编码PYC的异源多核苷酸、编码AAT的异源多核苷酸、编码BAAT或gabT的异源多核苷酸、编码3-HPDH的异源多核苷酸、以及编码PPC的异源多核苷酸。
[25]如段落24所述的重组酵母细胞，其中该细胞进一步包括编码PYC的异源多核苷酸。
[26]如段落24所述的重组酵母细胞，其中该PYC与SEQIDNO:2、3、4、5、6、7、或8的氨基酸序列具有至少50％，例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[27]如段落24所述的重组酵母细胞，其中该PYC具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:2、3、4、5、6、7或8或者由其组成。
[28]如段落24-27中任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞进一步包括编码AAT的异源多核苷酸。
[29]如段落28所述的重组酵母细胞，其中该AAT与SEQIDNO:14、15、或16的氨基酸序列具有至少50％，例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[30]如段落28所述的重组酵母细胞，其中该AAT具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:14、15或16或由者其组成。
[31]如段落24-30中任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞进一步包括编码BAAT或gabT的异源多核苷酸。
[32]如段落31所述的重组酵母细胞，其中该BAAT或gabT与SEQIDNO:20、21、22、23、或24的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[33]如段落31所述的重组酵母细胞，其中该BAAT或gabT具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:20、21、22、23或24或者由其组成。
[34]如段落31-33中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述BAAT或gabT是一种还作为gabT的BAAT。
[35]如段落24-34中任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞进一步包括编码3-HPDH(例如，相比于NADP(H)，针对NAD(H)具有增加的特异性的3-HPDH)的异源多核苷酸。
[36]如段落35所述的重组酵母细胞，其中该3-HPDH与SEQIDNO:26、27、28、29、30、31、32、33、34、或129的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[37]如段落35所述的重组酵母细胞，其中该3-HPDH具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:26、27、28、29、30、31、32、33、34或129或由者其组成。
[38]如段落35-37中任一项所述的重组酵母细胞，其中该3-HPDH还是HIBADH。
[39]如段落35-37中任一项所述的重组酵母细胞，其中该3-HPDH还是4-羟基丁酸脱氢酶。
[40]如段落24-39中任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞进一步包括编码PPC的异源多核苷酸。
[41]如段落40所述的重组酵母细胞，其中该PPC与SEQIDNO:10、11、或12的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[42]如段落40所述的重组酵母细胞，其中该PPC具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:10、11或12或由者其组成。
[43]如段落1-42中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞是克拉布特里阴性的。
[44]如段落1-42中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞属于选自以下的属：假丝酵母属、伊萨酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、有孢圆酵母属、以及接合酵母属。
[45]如段落44所述的重组酵母细胞，其中该细胞属于选自以下的进化枝：东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝和酵母属进化枝。
[46]如段落44所述的重组酵母细胞，其中该细胞选自东方伊萨酵母、郎比可假丝酵母和布拉迪酵母。
[47]如段落43所述的重组酵母细胞，其中该细胞是东方伊萨酵母酵母细胞，例如，东方伊萨酵母CNB1酵母细胞。
[48]如段落1-47中任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞进一步包括对一个或多个内源基因的破坏，该一个或多个内源基因编码PDC、ADH、GAL6、CYB2A、CYB2B、GPD、GPP、ALD或PCK。
[49]如段落48所述的重组酵母细胞，其中该细胞进一步包括对编码PDC的内源基因的破坏。
[50]如段落49所述的重组酵母细胞，其中该细胞包括对编码PDC的内源基因的破坏，该PDC与SEQIDNO:154具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
[51]如段落49所述的重组酵母细胞，其中该细胞包括对编码PDC的内源基因的破坏，该PDC具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:154或由其组成。
[52]如段落49-51中任一项所述的重组酵母细胞，其中编码PDC的该基因的编码序列与SEQIDNO:153具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
[53]如段落49-51中任一项所述的重组酵母细胞，其中编码PDC的该内源基因的编码序列包括SEQIDNO:153或由其组成。
[54]如段落49-53中任一项所述的重组酵母细胞，其中对编码PDC的该内源基因的破坏发生在编码PDC的该基因的编码序列中。
[55]如段落49-53中任一项所述的重组酵母细胞，其中对编码PDC的该内源基因的破坏发生在编码PDC的该基因的启动子序列中。
[56]如段落49-55中任一项所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，与没有该破坏的细胞相比，该重组酵母细胞产生少至少25％(例如，少至少50％、少至少60％、少至少70％、少至少80％或少至少90％)的PDC和/或PDC活性。
[57]如段落49-56中任一项所述的重组酵母细胞，其中将编码PDC的该内源基因失活。
[58]如段落49-57中任一项所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，与没有对编码PDC的该内源基因破坏的细胞相比，该重组酵母细胞产生减少量的乙醇(例如，少至少25％、少至少50％、少至少60％、少至少70％、少至少80％或少至少90％)。
[59]如段落49-58中任一项所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，与没有对编码PDC的该内源基因的破坏的细胞相比，该重组酵母细胞产生更大量的3-HP。
[60]如段落49-59中任一项所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，与没有对编码PDC的该内源基因破坏的细胞相比，该重组酵母细胞能够产生多至少10％(例如，多至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、至少200％、至少300％或至少500％)的3-HP。
[61]如段落48-60中任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞进一步包括对编码GPD的内源基因的破坏。
[62]如段落61所述的重组酵母细胞，其中该细胞包括对编码GPD的内源基因的破坏，该GPD与SEQIDNO:156具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
[63]如段落61所述的重组酵母细胞，其中该细胞包括对编码GPD的内源基因的破坏，该GPD具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO:156或由其组成。
[64]如段落61-63中任一项所述的重组酵母细胞，其中编码GPD的该基因的编码序列与SEQIDNO:155具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
[65]如段落61-63中任一项所述的重组酵母细胞，其中编码GPD的该内源基因的编码序列包括SEQIDNO:155或由其组成。
[66]如段落61-65中任一项所述的重组酵母细胞，其中对编码GPD的该内源基因的破坏发生在编码GPD的该基因的编码序列中。
[67]如段落61-65中任一项所述的重组酵母细胞，其中对编码GPD的该内源基因的破坏发生在编码GPD的该基因的启动子序列中。
[68]如段落61-67中任一项所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，与没有该破坏的细胞相比，该重组酵母细胞产生少至少25％(例如，少至少50％、少至少60％、少至少70％、少至少80％或少至少90％)的GPD。
[69]如段落61-68中任一项所述的重组酵母细胞，其中将编码GPD的该内源基因失活。
[70]如段落61-69中任一项所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，与没有对编码GPD的该内源基因破坏的细胞相比，该重组酵母细胞产生减少量的甘油(例如，少至少25％、少至少50％、少至少60％、少至少70％、少至少80％或少至少90％)。
[71]如段落61-70中任一项所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，与没有对编码GPD的该内源基因的破坏的细胞相比，该重组酵母细胞产生更大量的3-HP。
[72]如段落61-71所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，与没有对编码GPD的该内源基因破坏的细胞相比，该重组酵母细胞能够产生多至少10％(例如，多至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、或至少200％、至少300％或至少500％)的3-HP。
[73]如段落1-72中任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞能够在包含75g/L或更多3-HP的培养基中在低于4的pH下生长。
[74]如段落1-73中任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞是3-HP耐受的酵母细胞。
[75]如段落1-74中任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞已经经历突变和/或选择，这样使得与同一物种的野生型细胞相比，该突变的和/或选择的细胞对3-HP具有更高程度的耐受性。
[76]如段落75所述的重组酵母细胞，其中在用编码昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的该异源多核苷酸进行遗传修饰之前，该细胞已经经历突变和/或选择。
[77]如段落75或76所述的重组酵母细胞，其中该细胞已经在乳酸或3-HP的存在下经历选择。
[78]如段落77所述的重组酵母细胞，其中该选择是恒化器选择。
[79]如段落1-78中任一项所述的重组酵母细胞，其中该酵母细胞不能发酵戊糖。
[80]一种组合物，包括如段落1-79中任一项所述的重组宿主细胞。
[81]如段落80所述的组合物，其中该组合物包括可发酵的培养基。
[82]如段落81所述的组合物，其中该可发酵的培养基包括蔗糖、葡萄糖和/或果糖。
[83]如段落80-82中任一项所述的组合物，进一步包括3-HP。
[84]如段落83所述的组合物，其中该3-HP的滴度大于约1g/L，例如大于约2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、125g/L、150g/L、200g/L或250g/L。
[85]如段落81-84中任一项所述的组合物，其中该培养基的pH低于5，例如在约1.5至约4.5、约2.0至约4.0或约2.0至约3.5的范围内。
[86]如段落81-85中任一项所述的组合物，其中该可发酵的培养基包括少于1％的戊糖。
[87]一种生产3-HP的方法，包括：(a)在适合生产3-HP的条件下，在可发酵的培养基中培养如段落1-79中任一项所述的重组酵母细胞；并且(b)回收3-HP。
[88]如段落87所述的方法，其中该可发酵的培养基包括蔗糖、葡萄糖和/或果糖。
[89]如段落87或88所述的方法，其中该产生的3-HP的滴度大于约1g/L，例如大于约2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、125g/L、150g/L、200g/L或250g/L。
[90]如段落87-89中任一项所述的方法，其中所得3-HP是基本上纯的。
[91]如段落87-90中任一项所述的方法，其中该可发酵的培养基包括蔗糖、葡萄糖和/或果糖。
[92]如段落87-91中任一项所述的方法，其中该酵母细胞是东方伊萨酵母酵母细胞，并且该可发酵的培养基包括少于1％戊糖。
[93]如段落87-92中任一项所述的方法，其中该可发酵的培养基的pH低于5，例如在约1.5至约4.5、约2.0至约4.0或约2.0至约3.5的范围内。
[94]一种生产丙烯酸或其盐的方法，包括：(a)在适合生产3-HP的条件下，在可发酵的培养基中培养如段落1-79中任一项所述的重组酵母细胞；(b)回收该3-HP；(c)在适合生产丙烯酸或其盐的条件下，将3-HP脱水；并且(d)回收该丙烯酸或其盐。
[95]如任何段落94所述的方法，其中该重组酵母细胞是东方伊萨酵母酵母细胞，该东方伊萨酵母酵母细胞被培养在包括少于1％戊糖的可发酵的培养基中。

Claims (24)

1.一种重组酵母细胞，该重组酵母细胞包含对以下纲的天冬氨酸1-脱羧酶进行编码的异源多核苷酸：昆虫纲、双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲，其中该细胞能够产生3-羟基丙酸(3-HP)。
2.如权利要求1所述的重组酵母细胞，其中该昆虫纲的天冬氨酸1-脱羧酶是选自下组的目的昆虫天冬氨酸1-脱羧酶，该组由以下各项组成：蜚蠊目、鞘翅目、革翅目、双翅目、纺足目、蜉蝣目、半翅目、膜翅目、鳞翅目、螳螂目、长翅目、广翅目、石蛃目、脉翅目、蛩蠊目、蜻蜓目、直翅目、竹节虫目、襀翅目、啮虫目、蛇蛉目、蚤目、捻翅目、缨翅目、毛翅目、缺翅目、和衣鱼目。
3.如权利要求1或2中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该昆虫纲的天冬氨酸1-脱羧酶与SEQIDNO:162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、或191的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
4.如权利要求1所述的重组酵母细胞，其中该鳃足纲的天冬氨酸1-脱羧酶与SEQIDNO:192的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
5.如权利要求1所述的重组酵母细胞，其中该腹足纲的天冬氨酸1-脱羧酶与SEQIDNO:193的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
6.如权利要求1所述的重组酵母细胞，其中该头索纲的天冬氨酸1-脱羧酶与SEQIDNO:194的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
7.如权利要求1所述的重组酵母细胞，其中该双壳纲的天冬氨酸1-脱羧酶与SEQIDNO:195的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
8.如权利要求1-7中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶在与SEQIDNO:162的氨基酸序列的位置377对应的残基处包含谷氨酰胺。
9.如权利要求8所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶在与SEQIDNO:162的氨基酸序列的位置377对应的位置处包含谷氨酰胺，并且包含与SEQIDNO:162的氨基酸382-516具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％序列一致性的部分氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该天冬氨酸1-脱羧酶包含F1aa19S2aaY3基序或Y1aa19S2aaY3基序，其中F1是苯丙氨酸，Y1是酪氨酸，aa19是具有十九个氨基酸的插入序列，S2是丝氨酸，aa是单个氨基酸，并且Y3是酪氨酸。
11.如权利要求1-10中的任一项所述的重组酵母细胞，其中编码天冬氨酸1-脱羧酶的该异源多核苷酸包含对于编码天冬氨酸1-脱羧酶的多核苷酸而言外源的启动子。
12.如权利要求1-11中的任一项所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，与不具有编码天冬氨酸1-脱羧酶的该异源多核苷酸的细胞相比，该重组酵母细胞产生更大量的3-HP(例如，多出至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、或至少500％)。
13.如权利要求1-12中的任一项所述的重组酵母细胞，其中当在相同条件下培养时，该细胞与第二重组酵母细胞相比产生更大量的3-HP(例如，多出至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、至少200％至少300％、或至少500％)；其中该第二酵母细胞与编码昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的酵母细胞相同，其条件是该第二酵母细胞编码SEQIDNO:139的地衣芽孢杆菌天冬氨酸1-脱羧酶代替昆虫天冬氨酸1-脱羧酶。
14.如权利要求1-13中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞进一步包含一种或多种选自以下的异源多核苷酸：
编码PYC的异源多核苷酸；
编码AAT的异源多核苷酸；
编码BAAT或gabT的异源多核苷酸；
编码3-HPDH的异源多核苷酸；以及
编码PPC的异源多核苷酸。
15.如权利要求1-14中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞是克拉布特里阴性的。
16.如权利要求1-14中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞属于选自以下的属：假丝酵母属、伊萨酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、有孢圆酵母属、以及接合酵母属。
17.如权利要求16所述的重组酵母细胞，其中该细胞属于选自以下的进化枝：东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝和酵母属进化枝。
18.如权利要求16所述的重组酵母细胞，其中该细胞选自东方伊萨酵母、郎比可假丝酵母和布拉迪酵母。
19.如权利要求1-18中任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞进一步包含对一个或多个内源基因的破坏，该一个或多个内源基因编码PDC、ADH、GAL6、CYB2A、CYB2B、GPD、GPP、ALD或PCK。
20.如权利要求1-19中任一项所述的重组酵母细胞，其中该细胞能够在含有75g/L或更多3-HP的培养基中在低于4的pH下生长。
21.一种组合物，包含如权利要求1-20中任一项所述的重组宿主细胞。
22.一种生产3-HP的方法，包括：
(a)在适合生产3-HP的条件下，在可发酵的培养基中培养如权利要求1-20中任一项所述的重组酵母细胞；并且
(b)回收该3-HP。
23.如权利要求22所述的方法，其中该可发酵的培养基的pH低于5，例如在约1.5至约4.5、约2.0至约4.0或约2.0至约3.5的范围内。
24.一种生产丙烯酸或其盐的方法，包括：
(a)在适合生产3-HP的条件下，在可发酵的培养基中培养如权利要求1-20中任一项所述的重组酵母细胞；
(b)回收该3-HP；
(c)在适合生产丙烯酸或其盐的条件下，将该3-HP脱水；并且
(d)回收该丙烯酸或其盐。
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