KR20130037608A - 카프로산 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용하여 카프로산을 대량 생산하는 방법 - Google Patents

카프로산 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용하여 카프로산을 대량 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카프로산 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용하여 카프로산을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 야생형 미생물에 베타-케토티오라아제(β-keto-thiolases) 활성이 도입되어 카프로산 생산능이 향상된 재조합 미생물, 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배양액으로부터 카프로산을 회수하는 단계를 포함하는 카프로산의 대량 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 미생물은 야생형 미생물에 베타-케토티오라아제(β-keto-thiolases) 활성을 도입하여 카프로산 생산능을 발현하므로, 고수율 및 고효율로 카프로산을 대량 생산할 수 있으며, 이와 같이 생성된 카프로산은 바이오 플라스틱 생산 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

카프로산 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용하여 카프로산을 대량 생산하는 방법{Recombinant microorganism for use in producing caproic acid and method of producing caproic acid using the same}
본 발명은 카프로산 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용하여 카프로산을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 야생형 미생물에 베타-케토티오라아제(β-keto-thiolases) 활성이 도입되어 카프로산 생산능이 향상된 재조합 미생물, 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배양액으로부터 카프로산을 회수하는 단계를 포함하는 카프로산의 대량 생산방법에 관한 것이다.
식물에서 유래되거나 생분해 가능한 바이오 플라스틱의 2013년 세계수요는 현재보다 4배 증가한 90만톤, 가격으로는 26억 달러에 이를 것으로 예상된다. 소비자의 친환경 제품에 대한 선호도 증가, 난분해성 플라스틱에 대한 사용 규제 증대, 석유 기반 제품의 가격 상승 등으로 인해 바이오 플라스틱의 가격 경쟁력이 향상 되고 있다. 또한, 이산화탄소 배출 등과 관련한 제제 등으로 인하여 서유럽은 이미 바이오 기반 제품을 사용하도록 하는 제도적인 환경 그리고 광범위한 퇴비화 설비 등을 구비하고 있다. 바이오 플라스틱은 2015년 전체 플라스틱 시장의 1.5-4.8%를 차지하고 시장규모가 400만~1,250만 톤에 달할 것으로 예상한다.
바이오 플라스틱이란, 미생물 대사-발효 공정을 이용하여 생산되는 C3, C4, C5, C6 등의 플라스틱 단량체 및 이로부터 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 생산되는 중합체 물질을 통칭하는 것으로서, 토양 중의 세균에 의해서 분해되므로 생물분해성 플라스틱이라고도 한다. 생체에 쉽게 융합하는 특징이 있으므로 수술이나 골절 고정제 등에 응용되고, 토양 중에서 서서히 분해되는 성질이 있어 지연 발산성 농약의 이용에도 적절하다.
어떤 종류의 미생물은 에너지원으로서 고분자 폴리에스터류를 체내에 과립상으로 저장하고 있는데, poly-β-hydroxybutyrate (PHB), poly-β-hydrolyvalerate (PHV), 그리고 이들의 공중합체인 PHB/PHV 등의 polyalkanoates가 여기에 해당된다. 상기 폴리에스터를 이용하여 바이오플라스틱을 생산할 수 있다. 한편, 지방족 폴리에스터, polycaprolactone (PCL), poly-(glycolic acid) (PGA) 등은 단량체를 화학 합성하여 얻을 수 있다.
기존의 C3, C4 기반 플라스틱 생산에서, C5, C6 단량체를 이용한 바이오 플라스틱 생산으로 관심을 증대되고 있는데, 바이오 플라스틱은 전 세계 화학소재 산업의 중요한 한 부분을 이루고 있으며, C5, C6 기반 바이오 플라스틱의 시장성은 국내의 경우 4조원 이상으로 평가되고 있다. 다만, C3, C4, C5, C6 단량체 기반 바이오플라스틱 생산은 기술적 성숙도가 높지만, 원료가 되는 C5, C6 단량체 대량 생산 기술은 현재 낮은 단계에 머물러 있어 전략적으로 기술 개발이 필요한 실정이다.
기존의 연구 결과를 보면 장내세균인 Megasphaera elsdenii의 C5/C6 카르복실산의 생산능이 보고된 이후, 고정화 세포를 이용하여 직접적으로 상기 물질들을 생산한 논문이 보고되었다. 그러나 아직까지 재조합 효모 등을 이용하여 카프로산(헥사노익산, C6)의 대량 생산이 성공적으로 보고된 바가 없다. 기존의 연구 결과에 따르면, 200시간 후 약 20mM의 헥사노익산이 생산되나 이의 50% 수준으로 부티르산(butyric acid) 또한 생산된다고 알려져 있다.
이러한 배경 하에서 본 발명자들은 카프로산을 고효율로 수득하기 위한 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 기존의 야생형 미생물에 베타-케토티오라아제(β-keto-thiolases) 활성, 구체적으로 베타-케토티오라아제 I(phbA) 및 II(bktB) 활성을 도입하면 현저히 우수한 카프로산 생산능이 발현된다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 야생형 미생물에 베타-케토티오라아제(β-keto-thiolases) 활성이 도입되어 카프로산 생산용 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배양액으로부터 카프로산을 회수하는 단계를 포함하는 카프로산의 대량 생산방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 야생형 미생물에 베타-케토티오라아제(β-keto-thiolases) 활성이 도입되어 카프로산 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에서, 카프로산(caproic acid)은 사슬내의 총탄소수가 6개이고 사슬내 이중결합이 없는 저급포화지방산으로서, 헥사노익산(hexanoic acid)이라고도 불린다.
본 발명에서, 베타-케토티오라아제(β-keto-thiolases)는 여러 탄소수를 가진 분자에 아세틸-CoA를 붙여줌으로써 탄소수를 2개씩 늘려주는 작용을 한다. Ralstonia eutropha (그람 음성 토양 박테리아)로부터 유래된 베타-케토티오라아제로서, 베타-케토티오라아제 I(phbA) 및 II(bktB) 2가지 종류가 보고되어 있다.
본 발명에서는 E. coli , K. lactis , S. cerevisiae , K. marxianus, 특히 고온성 균주인 Kluyveromyces marxianus 에서 발현가능한 벡터와 형질전환 시스템을 구축하고 Ralstonia eutropha로부터 유래된 phbA 및 bktB를 도입, 배양하여 카프로산(caproic acid)을 생산하였다. 베타-케토티오라아제 I은 phbA 유전자로부터 코딩되며, 베타-케토티오라아제 II는 bktB 유전자로부터 코딩된다.
본 발명에서, "발현 벡터"란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. phbA 및 bktB 유전자는 다양한 미생물 종들로부터 얻어질 수 있고, 그 예로, 이에 제한은 없지만, Ralstonia eutropha로부터 얻어질 수 있다.
본 발명에서, 발현 벡터를 도입하는 모균주로는 부티르산을 생산할 수 있는 균주로서, E. coli , K. lactis , S. cerevisiae , K. marxianus, 특히 고온성 균주인 Kluyveromyces marxianus 을 포함한다.
본 발명의 구체적 실시예에서, E. coli에서는 두 유전자 phbA와 bktB는 Ralstonia eutropha 유래의 유전자를 사용하였으며 발현 시스템을 구축하기 위해 사용한 벡터는 pETduet-1을 사용하였다(도 3, 실시예 1). K. lactis에서는 두 유전자 phbA와 bktB는 Ralstonia eutropha 유래의 유전자를 사용하였으며 발현 시스템을 구축하기 위해 사용한 벡터는 pKLAC2을 사용하였다(도 4, 실시예 2). S. cerevisiae 에서는 두 유전자 phbA와 bktB는 Ralstonia eutropha 유래의 유전자를 사용하였으며 발현 시스템을 구축하기 위해 사용한 벡터는 다중 카피 플라스미드, 강한 프로모터(GPD promoter) 및 각각의 영양요구성(URA3, LEU2, TRP1)을 가지는 발현벡터 pRS426를 사용하였다(도 5, 실시예 3). K. marxianus에서는 두 유전자 phbA와 bktB는 Ralstonia eutropha 유래의 유전자를 사용하였으며 발현 시스템을 구축하기 위해 사용한 벡터는 K. marxianus 와 E. coli 발현 셔틀 벡터인 pJSKM316 벡터에 강한 프로모터인 GPD 프로모터를 포함하는 pJSKM316GPD 벡터를 이용하였다(도 6, 실시예 4). URA3 영양 요구성 균주를 선별하여 형질전환 하였다.
세포 내 대사 경로는 복잡한 네트워크로 이루어져있어, 어떤 하나의 효소 활성의 조절이 전체 대사 경로에 미치는 효과를 예측하는 것은 용이하지 않다. 본 발명자들은 카프로산 생합성 경로에서의 phbA와 bktB 효소 활성의 역할을 이해하고 상기 균주들 내에서 부티르산을 생산하는 생합성 경로를 바탕으로 외부로부터 도입된 phbA와 bktB 효소 활성이 글루코스, 유기산으로부터 카프로산을 우수한 효율로 생산할 수 있도록 한다는 것을 밝혔다. 구체적으로 글루코스로부터 전환된 탄소수 2개의 아세틸-CoA가 베타-케토티오라아제 phbA의 작용으로 탄소수 4개의 부티릭-CoA가 되고 또다른 베타-케토티오라아제 bktB의 작용으로 탄소수 6개의 카프로산이 생산될 수 있다는 것을 밝혔다.
본 발명의 구체적 실시예에서, 본 발명자들은 재조합 발현 벡터가 삽입된 형질 전환체를 소디움 프로피오네이트 첨가조건에서 발효하며, 생산되는 지방산과 잔존하는 소디움 프로피오네이트 변화량을 확인하였다. 시간별 분석한 결과 8시간째 샘플에서 C4가 약1.8g/L, C6 (카프로산)가 약 2.4g/L 검출되는 것을 확인하였다. 즉, 기존의 야생형 효모 등에서 200시간 만에 생산되던 카프로산(C6)을 8시간 만에 생산함으로써 약 25배 생산성이 증대됨을 알 수 있었다(도 7, 도 8, 실시예 5).
본 발명에서 "카프로산 생산성"이란, 단위 시간동안 카프로산 생산 미생물이 생합성하는 카프로산의 농도 (카프로산 생산 속도(g g-1 h-1))를 의미한다.
또 하나의 양태로서 본 발명은, 1) 상기 카프로산 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 2) 배양액으로부터 카프로산을 회수하는 단계를 포함하는 카프로산의 대량 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 카프로산 생산 미생물을 이용하여 카프로산을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. E. coli , K. lactis , S. cerevisiae , K. marxianus에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 카프로산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 카프로산은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다. 상기 배지는 바람직하게는 카프로산 생산의 기질이 될 수 있는 글루코스 또는 유기산, 특히 프로피온산을 포함할 수 있다.
본 발명의 카프로산을 생산하는 방법은, 세포 또는 배양 배지로부터 카프로산을 회수하는 단계를 포함한다. 세포 또는 배양 배지로부터 카프로산을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 카프로산 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 미생물은 야생형 미생물에 베타-케토티오라아제(β-keto-thiolases) 활성을 도입하여 카프로산 생산능을 발현하므로, 고수율 및 고효율로 카프로산을 대량 생산할 수 있으며, 이와 같이 생성된 카프로산은 바이오 플라스틱 생산 등에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 C6 카프로산 생합성 경로의 모식도이다.
도 2는 베타-케토티오라아제에 속하는 두 가지 효소인 phbA와 bktB의 아미노산 서열과 단백질 무게를 나타내는 그림이다.
도 3은 E. coli에서의 pETduet-1/bktB와 pETduet-1/phbA 발현 벡터 모식도이다.
도 4는 K. lactis 에서의 bktB와 phbA 발현 벡터 모식도이다.
도 5는 S. cerevisiae 에서의 bktB와 phbA 발현 벡터 모식도이다.
도 6은 K. marxianus에서의 bktB와 phbA 발현 벡터 모식도이다.
도 7은 생산된 C6 카프로산의 GC 분석 결과를 나타내는 그림이다.
도 8은 K. marxianus 재조합 미생물의 YP+소디움 프로피오네이트 10g/L 조건에서의 발효 및 C6 카프로산 생산 정도를 분석한 그림이다.
이하 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] E. coli 의 pETduet-1/bktB와 pETduet-1/phbA 발현 벡터 구축
두 유전자 phbA 와 bktB 는 Ralstonia eutropha 유래의 유전자를 사용하였으며 발현 시스템을 구축하기 위해 사용한 벡터는 pETduet-1을 사용하였다. 상기 벡터는 삽입된 유전자가 T7 프로모터 하에서 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalacto-p yranoside)에 의해 발현이 유도되며 두 개의 MCS(Multi cloning site) 및 T7 프로모터를 가지고 있어 두 유전자를 동시에 도입할 수 있는 시스템이다.
상기 두 유전자는 Polymerase Chain Reaction (PCR) 방법으로 각각 증폭하였다. 사용한 프라이머 및 반응 조건은 다음과 같다. phbA 유전자는 pETduet-1 벡터의 NcoI과 HindIII에 삽입될 수 있도록, bktB 유전자는 pETduet-1 벡터의 NdeI과 XhoI 제한효소 위치 내에 삽입될 수 있도록 프라이머를 각각 제작하였다.
PhbA-F : 5'-CATGCCCATGGGCACTGACGTTGTCATCGTATC-3' (서열번호 1)
PhbA-R : 5'-CCCGAAGCTTTTATTTGCGCTCGACTGCC-3' (서열번호 2)
BktB-F : 5'-GGAATTCCATATGACGCGTGAAGTGGTAGTGG-3' (서열번호 3)
BktB-R : 5'-CCGGCTCGAGTCAGATACGCTCGAAGATGG-3' (서열번호 4)
PCR 산물은 아가로스 젤상에서 전기영동을 수행하여 각각 1.2 kb 의 사이즈로 증폭이 되었음을 확인하였다. 확인된 증폭 산물은 PCR 정제 과정을 수행하여 순수한 DNA 형태로 추출하였다. 추출된 phbA 와 pETduet-1 벡터는 각각 NcoI과 HindⅢ의 제한 효소 처리를 하였고 bktB 와 pETduet-1 벡터는 각각 NdeI과 XhoI의 제한 효소로 처리하였다. 각각 제한 효소 반응 후 벡터인 pETduet-1에 calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP) 추가 효소 반응을 하여 벡터내의 self ligation을 방지하였다. 각각 효소 처리된 DNA를 gel extraction 방법으로 정제를 수행하였고 정제된 각각의 인서트(insert)와 벡터를 Quick ligation kit을 이용하여 ligation 반응을 하였다. 각각의 ligation 반응물은 CaCl2 방법으로 만들어진 E. coli TOP10 competent cell에 형질전환 하였다. 선별된 플라스미드는 DNA sequencing을 수행하여 최종적으로 phbA 와 bktB 가 제대로 삽입된 재조합 플라스미드를 선택하였다. phbA와 bktB 가 각각 도입된 발현 벡터를 pETduet-1/phbA, pETduet-1/bktB라 명명하였다. β-ketothiolase I과 II (PhbA, BktB)의 동시 발현벡터 구축은 기존 확보된 phbA가 삽입된 pETduet-1/phbA에 bktB를 삽입하기 위해 pETduet-1/phbA 와 pETduet-1/bktB 를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 동시에 처리하였다. gel extraction 방법에 의해 각각의 DNA를 정제하였고 TAKARA Quick ligation kit을 이용하여 ligation을 수행하였다. ligation 반응 산물을 E. coli TOP10 competent cell에 형질전환 하였고 LB ampicillin 배지에 도말하여 형질전환체를 선별하였다. 이렇게 하여 완성된 두 유전자 phbA 와 bktB 가 각각 삽입된 발현 벡터를 pETduet-1/phbA/bktB라 명명하였다.
[ 실시예 2] K. lactis 의 bktB 와 phbA 발현 벡터 구축
두 유전자 phbA 와 bktB는 Ralstonia eutropha 유래의 유전자를 사용하였으며 발현 시스템을 구축하기 위해 사용한 벡터는 pKLAC2 을 사용하였다. 이 벡터는 삽입된 단백질이 LAC4 promoter 하에서 galactose 및 lactose 에 의해 발현이 유도 되며 유전자가 K. lactis genome으로 integration 되어 복합배지에서 장시간에 배양에도 안정적으로 발현이 가능한 시스템이다. 두 유전자는 Polymerase Chain Reaction (PCR) 방법으로 각각 증폭하였다. phbA 유전자와 bktB 유전자는 pKLAC2 vector의 HindIII와 EcoRI에 삽입되도록 제작하였다. 하기 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
PhbA-F : 5'-AAGCTTATGG GCACTGACGTTGTCATCGTATC-3', (서열번호 5)
PhbA-R :5'-GAATTCTTATTTGCGCTCGACTGCC-3' (서열번호 6)
BktB-F : 5'-AAGCTTATGAC GCGTGAAGTGGTAGTGG-3'(서열번호 7)
BktB-R : 5'-GAATTCTCAGATACGCTCGAAGATGG-3'(서열번호 8)
증폭된 각각의 유전자와 pKLAC2 vector를 HindIII와 EcoRI 제한효소 처리하였고 이를 gel extraction 방법으로 정제하였다. 제한효소 처리된 두 벡터 및 인서트는 ligation 반응을 수행한 후 E. coli TOP10에 형질 전환하였다. ampicillin이 포함된 LB배지에서 형질전환체를 선별하였으며 이를 액체배지에 배양하여 플라스미드를 추출하였다. 추출한 플라스미드는 제한효소 처리하여 벡터 내에 인서트의 삽입 여부를 확인하였고 확인된 플라스미드는 최종적으로 DNA sequencing을 통하여 클로닝이 제대로 되었음을 확인하였다. 이렇게 하여 완성된 벡터는 pKLAC2/phbA와 pKLAC2/bktB로 명명하였다.
[ 실시예 3] S. cerevisiae 의 phbA 와 bktB 발현 벡터 구축
S. cerevisiae 에서 두 유전자 phbA와 bktB는 Ralstonia eutropha 유래의 유전자를 사용하였으며 발현 시스템을 구축하기 위해 사용한 벡터는 다중 카피 플라스미드, 강한 프로모터(GPD promoter) 및 각각의 영양요구성(URA3, LEU2, TRP1)을 가지는 발현벡터 pRS426를 사용하였다. 도입되어진 각각의 유전자들은 S. cerevisiae CEN . PK 2-1D 라는 실험용 균주에 형질 전환 되었다. 또한, 동시 형질전환 방법을 통하여 두 개의 유전자를 동시에 S. cerevisiae CEN . PK 2-1D 에 형질 전환 하였다. 이렇게 하여 완성된 두 유전자 phbA 와 bktB 가 각각 삽입된 발현 벡터를 pRS426 GPD bktB와 pRS425 GPD phbA 로 명명 하였다.
[ 실시예 4] K. marxianus 의 phbA 와 bktB 발현 벡터 구축
K. marxianus 에서 형질전환이 가능하도록 URA3 유전자가 파쇄된 URA3 영양 요구성 균주를 선별하고, K. marxianus 와 E. coli에서 동시 발현 가능한 발현 셔틀 벡터(pJSKM316 vector)에 강한 프로모터인 GPD 를 가지는 pJSKM316GPD vector에 phbA 와 bktB를 Ralstonia eutropha 로부터 분리하여 클로닝 하였다. 구축된 벡터는 이스트 일렉트로포레이션 방법에 의해 KM5△URA3에 형질전환 하였다. 이렇게 하여 완성된 두 유전자 phbA 와 bktB 가 각각 삽입된 발현 벡터를 pJSKM316GPD phbA 와 pJSKM316GPD bktB 로 명명 하였다.
[ 실시예 5] K. marxianus 재조합 미생물의 YP + 소디움 프로피오네이트 10g/L 조건에서의 발효 및 C6 생성 결과 분석
발현 벡터가 삽입된 형질전환체를 5 ml의 YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) 에 전배양 하였고 이를 500 ml의 YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) 배지에 전배양 균을 1% 접종하여 균을 고농도로 농축하였다. 농축된 균은 OD 600에서 10정도로 맞추어 50ml의 YP(1% yeast extract, 2% peptone) 배지에서 pH4.5로 맞추고 소디움 프로피오네이트를 10g/L 첨가한 조건에서 발효 하였다. 이를 30℃, 100rpm 의 배양조건에서 배양하였고 생산되는 지방산과 소디움 프로피오네이트 변화량을 확인하기 위해 시간마다 샘플을 채취 하였다. 생성되는 카프로산 분석은 GC로 하였고 장비는 YL 6100 series 기계를 사용하여 컬럼은 DB-FFAP(30m x 0.25 mm ID, 0.25μm)를 사용하였으며 운반기체로는 헬륨가스를 사용하였다. 오븐은 초기에 100℃로 5분간 유지하였으며 100℃부터 250℃까지 분당 10℃도씩 증가시켰으며 250℃에서 12분간 유지하였다. 주입기는 1:50 분할모드로 검출기는 300℃로 설정하였다. 각각 부티르산, 발레르산, 카프로산(헥사노익산)은 10분, 11분, 12분의 retention time을 보였다. 시간마다 채취한 샘플을 분석한 결과 8시간째 샘플에서 C4가 약1.8g/L, C6 (카프로산)가 약 2.4g/L 검출되는 것을 확인 하였고 이후 샘플들은 생산되는 양이 8시간째에 비해 줄어들거나 검출되지 않았다. 결과적으로, 기존의 야생 효모에서 200시간에 만에 생산되던 C6 카프로산을 8시간 만에 생산함으로써 약 25배 생산성이 증대됨을 알 수 있었다.
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Claims (7)

  1. 베타-케토티오라아제(β-keto-thiolases) 활성이 강화된, 카프로산 생산용 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 베타-케토티오라아제 활성은 외래의 phbA 유전자, bktB 유전자, 또는 상기 유전자 모두를 도입함으로써 강화된 것인 카프로산 생산용 재조합 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 phbA 유전자 또는 bktB 유전자는 Ralstonia eutropha 로부터 유래된 것인 카프로산 생산용 재조합 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 E. coli, K. lactis, S. cerevisiae 또는 K. marxianus인 카프로산 생산용 재조합 미생물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 베타-케토티오라아제 활성 도입은 도 3 내지 도 6의 개열지도로 표시되는 발현 벡터 도입에 의해 이루어지는 것인 카프로산 생산용 재조합 미생물.
  6. 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 카프로산 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계: 및
    2) 배양된 세포 또는 배양액으로부터 카프로산을 회수하는 단계를 포함하는, 카프로산의 대량 생산방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배양은 글루코스 및 프로피온산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행되는 것인 방법.
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