CN102690774A - 重组微生物、重组载体及制备3-羟基丙酸的方法 - Google Patents

重组微生物、重组载体及制备3-羟基丙酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102690774A
CN102690774A CN2012100821894A CN201210082189A CN102690774A CN 102690774 A CN102690774 A CN 102690774A CN 2012100821894 A CN2012100821894 A CN 2012100821894A CN 201210082189 A CN201210082189 A CN 201210082189A CN 102690774 A CN102690774 A CN 102690774A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
recombinant microorganism
activity
enzyme
coa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012100821894A
Other languages
English (en)
Inventor
朴成敏
具贤旼
金在瑛
俞柄兆
赵化英
朴永璟
朴在钻
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Samsung Electronics Co Ltd
Original Assignee
Samsung Electronics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Samsung Electronics Co Ltd filed Critical Samsung Electronics Co Ltd
Publication of CN102690774A publication Critical patent/CN102690774A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01075—Malonyl CoA reductase (malonate semialdehyde-forming)(1.2.1.75)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及重组微生物、重组载体及制备3-羟基丙酸的方法。提供利用具有将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的活性和将丙二酸半醛还原成3-HP的活性和/或NADPH再生活性的重组微生物以高收率制备3-羟基丙酸(“3-HP”)的方法。

Description

重组微生物、重组载体及制备3-羟基丙酸的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年3月24日提交的韩国专利申请No.10-2011-0026531的优先权以及由其产生的所有权益，该申请的公开内容在此通过引用全部引入如同在本文中完全阐述一样。
技术领域
本公开内容涉及代谢修饰的微生物和制备该代谢修饰的微生物的方法，并涉及通过将合适的碳底物与该代谢修饰的微生物接触来制备3-羟基丙酸(“3-HP”)的方法。
背景技术
近来，由于石油价格的快速上涨以及严重的环境污染，制造生物基燃料正变得迫切。生物柴油(一种生物基燃料)通过来自植物油或动物脂肪的甘油三酯的酯交换制造。
生物柴油的大量生产已导致作为副产物的甘油的大规模生产，约77亿磅/10亿加仑生物柴油。甘油的生产增长非常迅速，且估计在美国为每年约32亿磅和在全世界为每年80亿磅。结果，甘油的价格在过去的2年里下降几乎10倍。粗甘油市场价格在2004年为5～15美分/磅，但据报道现在为低于2.5美分/磅。
比较而言，葡萄糖的价格目前为约5美分/磅并且正在逐渐提高。如果目前的趋势继续，甘油价格的持续下降可被认为是不可避免的。
微生物可利用甘油作为碳源以产生多种发酵产物。例如，3-羟基丙酸(3-HP；C3H6O3-MW 90.08)(可应用于多种化学工艺的化合物)可由可再生资源如甘油制备。
3-HP可通过多种化学合成方法或生物方法制备。
制备3-HP的化学方法可包括使用钯作为催化剂由1，3-丙二醇制备3-HP的方法，在作为催化剂的钯和铂的存在下由3-羟基丙醛制备3-HP的方法，和通过丙烯酸与作为固体酸催化剂的离子交换树脂(
Figure BDA0000146785470000021
15)在100℃下在高压反应容器中反应40小时以91％的选择性和34％的收率制备3-HP的方法。
3-HP的生物制备可例如通过光异养微生物如橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)进行。微生物自养地或光异养地生长，由此产生作为中间产物的3-HP。其它已知的由甘油制备3-HP的微生物包括Desulfovibrio carbinolicus、食果糖脱硫弧菌(Desulfovibrio fructosovorans)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、威尼斯暗杆菌(Pelobacter venetianus)、和多营养泥杆菌(Ilyobacterpolytropus)。
发明内容
常规的制备3-HP的生物工艺通过复杂的代谢途径进行。因此，难以有效地控制该工艺，导致低的制备收率和生产力。为此，必须设计出不存在于体内的3-HP制备途径。
示例的实施方案提供使用重组微生物制备3-羟基丙酸(“3-HP”)的方法。不同于常规的代谢途径，本发明的方法可利用“丙二酸半醛还原途径”，其将乙酰基CoA以乙酰基CoA、丙二酰基CoA、丙二酸半醛和3-HP的顺序还原成3-HP，以及利用再利用的NADPH活性以解决氧化还原失衡，从而以显著高的收率获得3-HP。
一方面，提供用于制备3-HP的重组微生物，其具有将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的活性和将丙二酸半醛还原成3-HP的活性。
这里，将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的活性可为丙二酰基CoA还原酶(“mcr”)的活性，并且将丙二酸半醛还原成3-HP的活性可为丙二酸半醛还原酶(“msr”)的活性。
所述mcr活性和所述msr活性可为外源的。所述mcr活性和所述msr活性都可源自勤奋金属球菌(M.sedula)。
为了解决微生物代谢过程中氧化和还原之间的失衡，可进一步包括NADPH再生活性。
这里，NADPH再生活性可为转氢酶活性或甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性。
转氢酶活性可为吡啶核苷酸转氢酶(“pntAB”)活性或可溶性吡啶核苷酸转氢酶(“udhA”)活性。pntAB活性可源自大肠杆菌(E.coli)。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性可为非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶(“gapN”)活性，其可源自变异链球菌(S.mutans)。
可用的宿主微生物属可为选自以下的一种：发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养菌属(Oligotropha)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、毕赤酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，并且优选埃希氏菌属、酵母属和克鲁维酵母属，但不限于此。
例如，所述宿主微生物可为大肠杆菌(Escherichia coli)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、或酿酒酵母(Sccharomyces cerevisiae)。在一种示例性实施方案中，使用大肠杆菌。
在实例中，重组微生物可为从其缺失adhE、posB、pta、ack、frd和/或ldhA基因以有效地进行所需的代谢途径的微生物。
另一方面，提供选自含有mcr-msr基因的载体、含有mcr-msr-pntAB基因的载体、含有mcr-msr-gapN基因的载体和含有mcr-msr-pntAB-gapN基因的载体的至少一种重组载体以构建用于制备3-HP的重组微生物。
再一方面，提供利用进行代谢途径的微生物工艺制备3-HP的方法，所述代谢途径包括：将乙酰基CoA还原成丙二酰基CoA；将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛；和将丙二酸半醛还原成3-HP。
如上所述，乙酰基CoA到丙二酰基CoA的还原可通过乙酰基CoA羧化酶的活性进行，丙二酰基CoA到丙二酸半醛的还原可通过mcr的活性进行，且丙二酸半醛到3-HP的还原可通过msr的活性进行。
这里，还可包括利用通过转氢酶活性或甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的NADPH再生活性提供还原力的代谢途径。
为此，所述方法可通过在适当条件下在含有碳底物的培养基中培养具有将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的活性和将丙二酸半醛还原成3-HP的活性的重组微生物和/或进一步具有NADPH再生活性的微生物进行。
这样的方法增加重组微生物细胞中的丙二酰基CoA库(pool)、以及NADPH和NADH库。
可用的碳底物可为，但不限于，糖、寡糖、多糖、C1底物或它们的组合。例如，可用的碳底物可为葡萄糖、蔗糖、纤维素或甘油。
根据所述制备3-HP的方法，每克可用的碳源例如葡萄糖可获得0.97g的3-HP。这表明最大收率为97％(w/w)或更多。
如本文中所公开的，具有将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的活性、将丙二酸半醛还原成3-HP的活性和NADPH再生活性的重组微生物作为以高收率制备3-HP的菌株可为非常有用的。
因此，该重组微生物对于通过经由碳的中心代谢途径的额外操作组合丙二酸半醛还原途径以及通过解决氧化还原失衡而改善3-HP的生产力可为有用的。
附图说明
本发明构思的以上和其它方面将通过参照附图进一步详细地描述其示例实施方案而变得更容易明晰，在附图中：
图1是说明制备3-HP的多种代谢途径的图；
图2是根据本发明的示例性实施方案的制备3-HP的代谢途径的图；
图3a显示说明野生型代谢途径的图；
图3b显示说明根据本发明的示例性实施方案的遗传工程改造的代谢途径的图；
图4说明根据实施例2构建的重组载体；
图5呈现对于本文中公开的两种示例性重组微生物的作为时间的函数的显示葡萄糖利用的图(上部)和3-HP收率的图(下部)；和
图6呈现对于三种示例性重组微生物的作为时间的函数的显示葡萄糖利用的图(上部)和3-HP收率的图(下部)。
具体实施方式
本文使用的术语的定义如下。
术语“核酸”是本领域公知的。本文使用的“核酸”是DNA、RNA、或其衍生物或类似物的分子，包括核碱基。例如，核碱基包括天然存在的或修饰的嘌呤或嘧啶碱基。例如在DNA中，天然存在的核碱基为腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”、和胞嘧啶“C”，并且在RNA中，天然存在的核碱基为A、G、尿嘧啶“U”和C。
“多肽”是通过肽键键合在一起的氨基酸的单直链。“多肽”还包括翻译后修饰的多肽。本文中的术语“多肽”和“蛋白质”可包括单一的多肽链或两个或更多个多肽链的复合物。
术语“蛋白质”包括给定蛋白质的具有与该给定蛋白质基本相同的生物活性或功能的片段、类似物、或衍生物。
术语“酶活性”是指在没有破坏或修饰的情况下刺激不同材料的化学反应直到该反应结束的功能。
表述“由...编码”或“编码”用于说明核酸序列编码多肽序列。这里，由核酸序列编码的多肽序列包括由至少3～5个氨基酸、至少8～10个氨基酸、或15～20个氨基酸组成的氨基酸序列。
术语“基因”是指与遗传功能相关的核酸分子(染色体、质粒等)的核苷酸序列。基因是生物体的遗传单位，包括，例如，在生物体的基因组中占据特定物理位置(“遗传基因座”)的多核苷酸序列(例如，哺乳动物的DNA序列)。基因可编码表达产物如多肽或多核苷酸。通常，基因包括编码序列如多肽编码序列，并且还可包括非编码序列如启动子序列、多腺苷酸化的序列、或转录控制序列(例如，增强子序列)。各种真核生物体的基因具有其间插入“内含子(非编码序列)”的“外显子(编码序列)”。
术语“转化”和“转染”是指外源DNA引入宿主细胞的过程。术语“转染的细胞”是指具有引入细胞的外源DNA的细胞。当DNA被引入细胞时，核酸可插入染色体中或作为染色体外的物质复制。
术语“载体”是指包含有能力的(competent)核苷酸序列的任意核酸，其插入宿主细胞中以与宿主细胞的基因组重组或在宿主细胞内作为附加体自主地复制。这样的载体可为线性核酸、质粒、粘粒、RNA载体、或病毒载体。
术语“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其用于接收和携带任意重组载体或分离的多核苷酸。宿主细胞可为单一宿主细胞的后代，并且该后代可由于天然的、偶然的或人工的诱变和/或变异(在其表型或全部DNA补体方面)而不与亲本细胞完全相同。宿主细胞可通过重组载体或多核苷酸体内地或体外地转染、转化、或感染。包含重组载体的宿主细胞在本文中可互换地称作重组宿主细胞、重组细胞、或重组微生物。
术语“酶反应的条件”是指提供容许酶起催化作用的环境的任意条件(例如，温度、pH、非抑制性材料)。酶反应的条件可为体外或体内条件，如在试管中或在细胞中的条件。
术语“代谢工程改造的”或“代谢工程”涉及生物合成基因、与操纵子相关的基因、和这样的多核苷酸的控制元件的合理途径设计和组装，以由微生物制备所需的代谢物或使由微生物制备所需的代谢物增加。“代谢工程改造的”可进一步包括通过利用遗传工程和合适的培养条件(包括为竞争导致所需途径的中间体的竞争代谢途径的减少、破坏、或敲除)对转录、翻译、蛋白质稳定性、和/或蛋白质功能性进行调节和优化而优化代谢通量。基因可为对于宿主微生物来说是外源的，由于对于宿主来说是外来的，或通过在宿主细胞中诱变、重组、和/或与外源表达调控序列接合而修饰。一方面，当基因对于宿主生物体来说是异基因的时，该基因可为密码子优化的以在宿主生物体中进行表达。
术语“底物”是指通过酶的作用转化或意图转化成另外的化合物的任何物质或化合物。该术语不仅包括单一的化合物，而且还包括多种化合物的组合，如溶液、混合物、和其他材料，其含有至少一种底物或其衍生物。底物包括微生物通常使用的合适碳源。此外，术语“底物”不仅涵盖提供适于用作起始材料的碳源的化合物如任何源自生物质的糖，而且还包括如本文中所述的代谢工程改造的微生物途径中使用的中间体和最终产物代谢物。
术语“功能”和“功能性”是指生物学功能或酶功能。
表述“提高的”或“提高”给定产物或分子(例如，来自宽范围的化学品、生物燃料或其中间体)的量用于表示，与对照微生物如未修饰的或不同修饰的微生物相比，重组微生物可以更大的量产生所述给定产物或分子。
术语“由...获得的”或“源自”当关于样品或多核苷酸或多肽使用时是指该样品如核苷酸提取物或多肽提取物、或该多核苷酸或多肽从特定来源如预定的生物体(典型地为微生物)分离或诱导(induced)。
术语“重组微生物”是指在质粒或载体中典型地包含至少一个外源核苷酸序列的微生物。
术语“大约”和“约”在本文中可互换地使用，并且是指从参比量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、重量或长度改变30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、重量或长度。
除非在本文中另有说明，值的范围的列举仅意图用作单独地指出落入该范围内的各单独数值的简写方法，并且各单独数值引入本说明书中，如同其在本文中单独地列举一样。所有范围的端点包含于该范围内并是独立地可组合的。
进一步理解，术语“包括”和/或“包含”当用于本说明书中时，表示存在步骤或要素、或其集合，但不排除存在或加入一种或多种其它步骤或要素、或其集合。
除非另有定义，本文中使用的所有术语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。此外，方法或样品描述于本说明书中，但与上述那些类似或相同的方法或样品也包括在本发明的范围内。所描述的全部出版物的内容在本文中通过引用引入。
在本发明的一方面中，提供使用重组微生物制备3-HP的方法。将在用于以乙酰基CoA、丙二酰基CoA、丙二酸半醛、和3-HP的顺序依次将乙酰基CoA还原成3-HP的“丙二酸半醛还原途径”中的基因引入宿主中以获得重组微生物。培养本文中公开的重组微生物容许经由丙二酸半醛还原途径以高收率有效地制备3-HP。
通过使用本领域技术人员已知的标准克隆技术和常规方法，重组微生物可通过如下获得：将感兴趣的基因插入载体中以转化宿主微生物，和培养该转化的重组微生物。因此，本发明提供制备3-HP的方法，即表达相关酶的方法，和重组微生物。
在实施方案中，提供使用微生物制备3-HP的方法。
3-HP是在25℃具有4.51pKa的弱的三碳非手性有机酸，其为2-羟基丙酸(乳酸)的异构体。此外，3-HP是非晶的粘性黄色液体，其比重为1.25且折射率为1.45。
3-HP在水中是极易溶解的，且3-HP的钙盐在水中的可溶性是柠檬酸或苹果酸的100倍。因此，3-HP可用于例如在煮器中或在工业设备中防止结垢。此外，3-HP在一些化学工艺中是关键的合成中间体。特别地，3-HP对于一些化学品和聚合物的制备来说是重要的，包括例如通过氧化制备苹果酸，通过用醇酯化来制备可生物降解的聚酯(称为聚(3-羟基丙酸))，以及通过还原制备1，3-丙二醇。
3-HP是多种化学工艺中的关键合成中间体，并且用作产生1，3-丙二醇(C3H8O2-MW 76.09)、丙烯酸(C3H4O2-MW 72.06)、丙烯酸甲酯(C4H6O2-MW 86.09)、丙烯酰胺(C3H5NO-MW 71.08)、3-羟基丙酸乙酯(C5H10O3-MW118.13)、丙二酸(C3H4O4-MW 104.06)、丙内酯(C3H4O2-MW 72.06)、或丙烯腈(C3H4N-MW 53.06)的来源。
3-HP的生物合成途径
在一种实施方案中，包括利用产生生物体的内源能的途径代谢工程改造的3-HP的生物合成途径。
通过制备生物燃料的生物合成途径提供利用生物体的内源代谢产物的更宿主友好的生物燃料体系。
术语“生物合成途径”，也称为“代谢途径”，是用于将一种化学物质变成另一种的一组合成代谢或分解代谢生物化学反应。如果基因产物平行地或系列地作用于相同的底物，产生相同的产物，或在相同的底物和代谢物最终产物之间作用于或产生代谢中间体(即代谢物)，则它们属于相同的“代谢途径”。
3-HP的生物合成途径使用碳源作为底物。例如，碳源可选自单糖、寡糖、多糖、C1底物、和它们的混合物。特别地，碳源可包括，但不限于，藻酸盐(酯)、琼脂、角叉菜胶、墨角藻聚糖、果胶、葡萄糖酸盐(酯)、甘露糖醛酸盐(酯)、甘露醇、来苏糖、纤维素、半纤维素、甘油、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、半乳糖、木糖、木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸盐(酯)、半乳糖醛酸盐(酯)(如二或三半乳糖醛酸盐(酯))、和鼠李糖。在示例性实施方案中，碳源为葡萄糖、蔗糖、甘油、和/或纤维素。
为了描述制备3-HP的生物合成途径，作为示例性实施方案，使用葡萄糖作为碳源的“到3-HP的生物合成途径”示于图2。
参考图2，用于产生能量的重要代谢途径与本领域中公知的普通的途径相同，例如，糖酵解、将葡萄糖转化成丙酮酸、以及三羧酸(“TCA”)循环、将糖酵解中产生的丙酮酸经由乙酰基CoA氧化成CO2和H2O。
糖酵解
葡萄糖是许多活生物体的主要碳源。葡萄糖在细胞中的降解以糖酵解开始。糖酵解，也称为Embden-Meyerhof-Parnas(“EMP”)途径，是将葡萄糖转化成丙酮酸并顺带地每摩尔葡萄糖产生2摩尔ATP和2摩尔NADH的一系列反应。在糖酵解的整个过程中，葡萄糖的6碳环由于从两个ATP分子获得的能量而变得不稳定，然后降解成两个丙糖(“C3”)分子。之后，丙糖(“C3”)通过释放能量而变得稳定，从而获得丙酮酸。糖酵解在细胞质中进行。在糖酵解的第一步中，一个ATP用于通过由己糖激酶催化的葡萄糖的磷酸化产生葡萄糖6-磷酸。葡萄糖6-磷酸在由磷酸葡萄糖异构酶催化的反应中转化成果糖6-磷酸。果糖6-磷酸在由磷酸果糖激酶催化的反应中通过利用ATP的磷酸化转化成果糖1，6-二磷酸。然后，果糖1，6-二磷酸通过由醛缩酶催化的反应转化成二羟基丙酮磷酸(“DHAP”)和甘油醛-3-磷酸(“GA-3P”)，从而将一个己糖(“C6”)分子降解成两个丙糖(“C3”)分子。DHAP和GA-3P处于平衡。甘油醛3-磷酸可直接在糖酵解途径中继续。但是，DHAP必须转化成甘油醛3-磷酸以在该途径中继续。该异构化通过丙糖磷酸异构酶催化。随着GA-3P被消耗，DHAP持续地转化成GA-3P。在由甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的反应中将无机磷酸(“Pi”)加入GA-3P以产生1，3-二磷酸甘油酸。1，3-二磷酸甘油酸释放一个磷酸基团以产生3-磷酸甘油酸，并且在由磷酸甘油酸激酶催化以产生3-磷酸甘油酸的反应中由ADP产生ATP。3-磷酸甘油酸通过磷酸甘油变位酶催化转化成2-磷酸甘油酸，然后2-磷酸甘油酸在由烯醇化酶催化的反应中脱氢以产生磷酸烯醇式丙酮酸(“PEP”)。PEP在丙酮酸激酶催化的脱磷酸化反应中转化成丙酮酸，并产生ATP。
TCA循环
三羧酸(“TCA”)循环，也称为Krebs循环，是其中通过糖酵解产生的丙酮酸可转化成二氧化碳和氢气的过程。经由TCA循环，通过糖酵解产生的丙酮酸在线粒体中被完全氧化，并且还原能力被传给NAD+，并产生CO2。TCA循环的主要作用是(1)产生生物合成所需的电子(NADH)和电子传递链，(2)为氨基酸合成供应基于碳的骨架材料，和(3)产生能量。
通过糖酵解产生的丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶催化转化成乙酰基CoA。该酰化步骤用于将糖酵解与TCA循环连接。
丙酮酸+CoA+NAD+→乙酰基CoA+CO2+NADH+H+
乙酰基CoA被传递通过膜进入线粒体，并且传递乙酰基CoA所需的能量通过将糖酵解产生的两个NADH转化成两个FADH获得。乙酰基CoA是中间体，其在氨基酸和脂肪酸的代谢中起主要作用。TCA循环是氧化燃料分子如氨基酸、脂肪酸和碳水化合物的最终共同途径。
将详细描述TCA循环的顺序：柠檬酸(“C6”)在乙酰基CoA(“C2”)和草酰乙酸(“C4”)之间的缩合反应中产生，然后转化成异柠檬酸(“C6”)。随后，异柠檬酸(“C6”)转化成α-酮戊二酸(“C5”)，并产生一个CO2和一个NADH。α-酮戊二酸通过脱羧化和氧化转化成琥珀酰基CoA(“C4”)，并产生另一个CO2和一个NADH。琥珀酰基CoA(“C4”)转化成琥珀酸(“C4”)，并产生具有高能磷酸键的GTP。琥珀酸被氧化成富马酸(“C4”)，并产生一个1，5-二氢-黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)分子。TCA循环的最后两个步骤包括通过富马酸的水合产生苹果酸(“C4”)和通过苹果酸的氧化产生草酰乙酸(“C4”)。
在TCA循环中发生的四个氧化-还原反应中，三对电子转移到NAD+，且一对电子转移到黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。还原的电子载体将在电子传递链中被氧化，产生9摩尔ATP。此外，当琥珀酰基CoA转化成琥珀酸时，直接形成一个高能磷酸键。因此，每一摩尔完全氧化成H2O和CO2的乙酰基CoA，产生10摩尔高能磷酸键。
糖酵解和TCA循环是本领域通常已知的。根据一种实施方案的制备3-HP的方法采用这样的途径，其中乙酰基CoA转化成丙二酰基CoA并还原成丙二酸半醛，其随后转化成3-HP。即，采用“丙二酸半醛还原途径”。
因此，本文中公开的制备3-HP的方法包括以下步骤：将乙酰基CoA还原成丙二酰基CoA，将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛；以及将丙二酸半醛还原成3-HP。
首先，本文中公开的3-HP制备途径包括将乙酰基CoA还原成丙二酰基CoA，如以下反应方程中所示。
Figure BDA0000146785470000101
乙酰基CoA通过羧化转化成丙二酰基CoA。例如，羧化是不可逆的关键步骤，其可通过乙酰基CoA羧化酶(“ACC”)催化。该酶与丙酮酸羧化酶非常类似。这些酶含有生物素作为辅基，并且它们的反应机理彼此类似。碳酸氢盐形式的二氧化碳(“CO2”)通过攻击ATP的磷酸基形成羰基磷酸，其为CO2的活化形式。生物素与羰基磷酸反应以形成N-羧基生物素并释放磷酸(Pi)，然后羧基转移到乙酰基CoA，从而产生丙二酰基CoA。
原核生物和植物具有由不同基因编码的若干多肽组成的多亚单位ACC。为了提高乙酰基CoA羧化酶在大肠杆菌(E.coli)中的内源活性，可进行用编码乙酰基CoA羧化酶的源自大肠杆菌的accABCD基因的过表达载体转化大肠杆菌宿主。
在该步骤中，丙二酰基CoA库在重组微生物中增加。
3-HP制备途径还包括将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛和然后将丙二酸半醛还原成3-HP的步骤，如以下反应方案中所示。
Figure BDA0000146785470000111
这里，丙二酰基CoA的还原利用还原丙二酰基CoA的酶活性，并且丙二酸半醛的还原利用还原丙二酸半醛的酶活性。为此，这些酶活性可在代谢修饰以表达或过表达这些酶活性的重组微生物中表达和/或从其获得。
将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的活性可为丙二酰基CoA还原酶(形成丙二酸半醛)(mcr)活性。丙二酸半醛是通过还原获得的代谢产物，其可用于产生3-HP。将丙二酸半醛还原成3-羟基丙酸(“3-HP”)的活性可为丙二酸半醛还原酶(msr)活性。
对于本文中公开的3-HP生物合成途径来说，可进行宿主生物体的进一步代谢修饰以表达或过表达具有NADPH再生活性的酶，以解决氧化还原失衡。
还原能力与能量一起在活细胞中起主要作用。产生还原能力的氢原子通常通过核苷酸衍生物传递，所述核苷酸衍生物包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(“NAD+”)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(“NADP+”)。连接有氢的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原形式)(“NADH”)起到为活细胞提供还原能力和产生ATP两个作用。即，NADH向生物合成反应例如通过自养生物体(植物和光合细菌)的CO2固定提供氢。由NADH传递的电子(或氢原子)依次通过若干中间体化合物并最终传递到电子传递链中的氧。通过上述电子传递链中释放的能量产生最多3个ATP分子。
再生NADPH以提高NADPH和NADH的水平的活性可为吡啶核苷酸转氢酶活性(例如，来自大肠杆菌(E.coli)的pntAB)和/或甘油醛3-HP脱氢酶活性(例如，来自变异链球菌的gapN)。
Figure BDA0000146785470000121
对于本文中公开的3-HP生物合成途径来说，使用多种酶。除了用于糖酵解和TCA循环中的已知酶外，还使用额外的外源酶，例如在丙二酸半醛还原途径中使用的酶或NADPH再生酶。这些多种酶产生多种上述代谢产物。
编码所需酶的合适多核苷酸或其亚单位之一可源自提供其的一些生物源，并且其同源物可参考本领域已知的各种数据库来确定。
编码上述生物合成酶的天然DNA序列在此引用仅为了说明示例性实施方案。本发明包括编码在所述方法中使用的酶的多肽的氨基酸序列的任何序列的DNA分子。以类似的方式，多肽可典型地耐受在其氨基酸序列中至少一个氨基酸取代、缺失、或插入，而不损失或不显著损失所需活性。本发明涵盖具有野生型多肽的酶合成代谢或分解代谢活性的修饰多肽或变体多肽。此外，由本文中所示的DNA序列编码的氨基酸序列仅说明示例性实施方案。
上述基因和多肽/酶的序列可参考互联网上的可用数据库而容易地确定，所述数据库例如大肠杆菌(E.coli)蛋白质数据库(EcoProDB)，KAIST，373-1Guseong-dong，Yuseong-gu Daejeon 305-701，韩国。此外，这些氨基酸和核酸序列可利用本领域中常用的算法(例如，BLAST)容易地比较同一性。
重组微生物
提供包括由合适的底物制备3-HP的生物化学途径的代谢工程改造的微生物(重组微生物)。
代谢工程改造的微生物的一种实施方案包括该微生物的基因组之内或之外的至少一种重组多核苷酸。这样的微生物具有内源基因表达的减少，内源基因表达的破坏，或内源基因的敲除，和/或外源多核苷酸的引入。
在实施方案中，提供具有将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的活性和将丙二酸半醛还原成3-HP的活性的用于产生3-HP的重组微生物。
将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的活性是丙二酰基CoA还原酶(形成丙二酸半醛)(mcr)活性。在实施方案中，mcr活性可源自，但不限于，布氏酸菌(Acidianus brierleyi)、皱落念珠菌(Candida rugosa)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)、克鲁弗梭菌(Clostridium kluyveri)、食酸丛毛单胞菌(Comamonasacidororans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)、皱落念珠菌(Candida rugosa)、埃氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulates)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、金属硫化叶菌(Sulfolobus metacillus)或勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)。将丙二酸半醛还原成3-HP的活性可为丙二酸半醛还原酶(msr)活性。在实施方案中，msr活性可源自勤奋金属球菌(M.sedula)、超嗜热古菌(Sulfolubus tokodaii)、玫瑰弯菌属菌种RS-1(Roseiflexus sp.RS-1)、Roseiflexus castenholzii、或聚集绿曲挠菌(Chloroflexus aggregans)。
所述mcr和msr基因可为它们的变体，其分别编码与野生型酶相比具有基本相同或优异的还原活性的丙二酰基CoA还原酶和丙二酸半醛还原酶。在示例性实施方案中，所述mcr基因编码酶，所述酶可为，但不限于，EC1.2.1.75，并且所述msr基因可为，但不限于，Msed_1993，3-羟基酰基-CoA脱氢酶(参见United States National Center for Biotechnology Information GeneID：5103380；Kochelkorn和Fuchs，Journal of Bacteriology，2009，191(20)，p.6352-6362)。
重组微生物可进一步具有NADPH再生活性以解决氧化还原失衡。
NADPH再生活性可为吡啶核苷酸转氢酶活性和/或甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性。
因此，重组微生物例如可进一步具有吡啶核苷酸转氢酶(“pntAB”)活性和/或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(“gapN”)活性。pntAB活性可源自，但不限于，大肠杆菌，并且gapN活性可源自，但不限于，大肠杆菌、酿酒酵母、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)或变异链球菌。
NADPH和/或NADH库在含有上述基因的重组微生物中增加。
即，在一种实施方案中，当在重组微生物中进一步提供NADPH再生活性时，NADPH和/或NADH库增加，由此解决氧化还原失衡。因此，3-HP可以显著较高的收率获得。
将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的活性、将丙二酸半醛还原成3-HP的活性、和NADPH再生活性(例如，pntAB活性和/或gapN活性)可通过本领域已知的方法引入微生物中。例如，所述方法可包括制造包括用于表达所需活性的基因的载体和用该重组载体转化微生物。
重组载体
载体是指包含DNA序列的DNA构建体，所述DNA序列可操作地连接到能够在合适的宿主微生物中表达该DNA的合适调控序列。
载体可为质粒、噬菌体颗粒、或潜在的简单基因组插入物。当合适的宿主微生物用载体转化时，该载体可与宿主基因组无关地复制自身和操作，或者在一些情况下，该载体与宿主基因组重组。质粒目前最常用作载体，因此本文中的“质粒”可互换地用于指载体。但是，可使用本领域公知的任何载体或各种类型的具有与本领域熟知的那些相同的功能的载体。
如本领域技术人员已知的，为了提高引入宿主细胞中的基因的表达水平，该基因应可操作地连接到在所选择的表达宿主中起作用的用于调控转录和翻译的表达调控序列。例如，该表达调控序列和该基因与选择标记和复制起点一起包含于一个表达载体中。当表达宿主为真核细胞时，表达载体应进一步包括可用于真核表达宿主中的表达标记。
术语“可操作地连接”是指元件布置成容许所述元件的通常功能。因此，可操作地连接到编码序列(例如，编码感兴趣的多肽的序列)的某启动子可使得能够在调控蛋白质和合适的酶的存在下进行该编码序列的表达。在一些情况中，这样的启动子不必与所述编码序列相邻，只要特定的调控元件可引导该编码序列的表达。
术语“表达调控序列”是指在特定宿主生物体中可操作地连接的编码序列的表达所必需的DNA序列。表达调控序列包括进行转录的启动子、用于调控转录的任意操纵基因序列、编码核糖体结合位点的序列、以及调控转录和翻译的终止的序列。除了转录起始和调控位点，表达载体还可包括转录终止序列、以及用于在转录区中转录的核糖体结合位点。例如，聚腺苷酸化信号可包含在用于适于转录物的聚腺苷酸化的表达构建体中。不认为聚腺苷酸化信号的性质对成功的性能是重要的，因此可使用聚腺苷酸化信号的任意序列。此外，本领域技术人员可了解可用于表达载体的各种调控序列。所述载体还可包括选择标记，其可选择含有重组载体产物的一小组细胞。所述标记可包含于与含有本文中公开的克隆的基因序列的载体相同的载体中，或可存在于另外(单独)的载体上。选择标记是赋予细胞可追踪的特性以在表达期间从不含该选择标记的细胞容易地鉴定、分离、或选择具有该选择标记的细胞的核酸序列。本领域已知的任意选择标记可用作所述核酸中的选择标记。在实施方案中，所述选择标记为抗生素抗性基因。
在实例中，为了表达所需DNA序列(例如，编码酶的序列)，本领域已知的各种表达调控序列中的任一种可用在载体中。有用的表达调控序列的实例可包括SV40启动子或腺病毒的早期和晚期启动子，lac操纵子体系，trp操纵子体系，TAC或TRC体系，T3和T7启动子，噬菌体λ的主要操纵基因和启动子域，fd外壳蛋白质的调控区，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，磷酸酶的启动子(例如，Pho5)，酵母α-交配体系的启动子和已知用于调控原核生物、真核生物、或其病毒的基因表达的构建体的序列，和它们的各种组合。
在示例性实施方案中，在形成重组载体中，可使用多种载体如质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、或酵母人工染色体(“YAC”)载体。在一种实施方案中，使用质粒载体。
可用于这些目的的典型质粒载体具有(a)复制起点，使得其导致有效的复制以得到每个宿主细胞几百拷贝的质粒载体，(b)抗生素抗性基因，使得可选择用该质粒载体转化的宿主细胞，和(c)包含其中可插入外源DNA片段的限制酶位点的序列。即使在没有合适的限制酶位点的情况下，载体和外源DNA也可以根据本领域已知的常规方法通过使用合成低聚核苷酸衔接体或接头容易地连接。
常规地，DNA序列和载体用至少一种限制酶消化，然后彼此连接，以将待表达的DNA序列连接到所述载体。通过限制酶的消化和连接是本领域技术人员公知的。
因此，在另一方面，本公开内容提供含有以下的一种或多种的重组载体：编码将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的酶的多核苷酸和编码将丙二酸半醛还原成3-HP的酶的多核苷酸。该重组载体还可包括编码NADPH再生酶例如pntAB和/或gapN的多核苷酸。示例性的重组载体的示意图示于图4。
微生物宿主
根据示例性实施方案的重组载体可通过常规方法转化入合适的微生物宿主细胞。制备3-HP的微生物宿主可选自细菌、蓝细菌、霉菌、和酵母。
选择用于制备3-HP的微生物宿主耐受3-HP并应能够将碳水化合物转化为3-HP。选择合适的微生物宿主的标准包括以下：对3-HP的固有耐受性，高的葡萄糖利用率，用于基因操作的遗传工具的可用性，和产生稳定的染色体改变的能力。
具有对3-HP耐受性的合适的宿主菌株可通过基于该菌株的固有耐受性的筛选鉴定。微生物对3-HP的固有耐受性可通过确定当在基本培养基中生长时对于生长速率的50％抑制(IC50)负责的3-HP浓度来测量。该IC50值可使用本领域已知的方法确定。例如，感兴趣的微生物可在各种量的3-HP的存在下生长和在通过测量在600纳米的光学密度监控生长速率。倍增时间可由生长曲线的对数部分计算并用作生长速率的量度。产生生长的50％抑制的3-HP的浓度可从生长抑制百分比对3-HP浓度的图确定。宿主菌株应具有大于约0.5％的对于3-HP的IC50。
用于3-HP制备的微生物宿主还应以高比率利用葡萄糖。大多数微生物能够利用碳水化合物。但是，一些环境微生物不能高效地利用碳水化合物，因此不是合适的宿主。
宿主还需要用外源核酸转化以产生重组微生物的能力。基因转移可通过本领域已知的技术如电穿孔、接合、转导、或天然转化来实现。可使用具有宽的宿主范围和药物抗性标记的接合质粒。基于可在宿主内起作用的抗生素抗性标记的性质，可使克隆载体适应宿主。
此外，微生物宿主还可操作以通过各种基因的缺失或失活、或本领域已知的另外方法使碳流的竞争途径失活。例如，在微生物宿主中，基因可通过直接失活或在染色体整合(chromosome-integrated)的载体中转座子的可用性而失活。此外，制备宿主经历化学诱变以获得改善该宿主的先天异丁醇抗性的突变体。
基于上述标准，用于制备3-HP的合适的微生物宿主可包括，但不限于，来自选自以下的菌属的至少一种微生物：发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养菌属(Oligotropha)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、毕赤酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。
宿主微生物可为来自埃希氏菌属、克鲁维酵母属、或酵母属的微生物。例如，可使用大肠杆菌(Escherichia coli)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、酿酒酵母(Sccharomyces cerevisiae)。更具体地，可使用大肠杆菌、马克斯克鲁维酵母、或酿酒酵母。再更具体地，在示例性实施方案中，使用大肠杆菌。
在可能的宿主微生物(特别是大肠杆菌)中，一些具有形成乙酸的多种途径，乙酸的形成通过丙酮酸加氧酶(“POXB”)由丙酮酸介导，或通过磷酸转乙酰酶(“PTA”)和乙酰基磷酸激酶(“ACKA”)由乙酰基-CoA介导。
因此，在实施方案中，重组微生物可包括缺失或失活以下基因的一种或多种的微生物：adhE、posB、pta、ack、frd和/或ldhA基因。
重组微生物的构建
包含编码用于将能发酵的碳底物转化成3-HP的酶途径的必需基因的重组生物体可使用本领域已知的技术构建。所述基因可独立地或同时转化到微生物中，或使用一种或多种表达载体插入重组微生物的染色体上。
在实施方案中，编码在3-HP生物合成途径中所用的酶(例如，丙二酰基-CoA还原酶、丙二酸半醛还原酶、吡啶核苷酸转氢酶或甘油醛-3-磷酸脱氢酶)之一的基因可从与如上所述相同的多种来源分离。
从细菌基因组获得所需基因的方法是分子生物技术领域中普通和公知的。例如，当基因的序列是已知的时，合适的基因组文库可通过限制核酸内切酶消化产生，并且可用与所需基因序列互补的探针筛选。一旦分离出该序列，DNA可使用标准引物-诱导扩增方法如聚合酶链反应(“PCR”)扩增，以获得适于使用合适的载体转化宿主的量的DNA。容易地使用密码子优化工具以确定用于优化在异源宿主中基因的表达的基因的变体序列。一些密码子优化工具可基于宿主生物体的GC含量使用。用于产生所需的密码子-优化的变体多核苷酸序列的方法是本领域已知的。
一旦所需的途径基因被鉴定和分离，该基因可通过本领域已知的方式转化合适的表达宿主。转化、转导、或转染可通过各种方式的任一种实现，包括，但不限于，电穿孔、显微注射、生物射弹(biolistics)(或颗粒轰击介导的递送)、或土壤杆菌介导的转化。
可用于各种宿主细胞的转化的载体或盒(cassette)是普通的。典型地，所述载体或盒包括指导所需基因的转录和翻译的序列、可选择的标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括携带转录起始调控的基因的5’区，和调控转录终止的基因的3’区。应理解，两种调控区都可源自与转化的宿主细胞同源的基因，但该调控区不需要源自对于选作3-HP制备宿主的物种天然的基因。
可用于在所需宿主细胞中驱动所需途径基因的编码区的表达的起始控制区或启动子是众多的并且是本领域技术人员熟悉的。基本上，能够驱动这些基因的任何启动子是合适的，且包括，但不限于，CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在酵母属中表达)；和lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、和trc(可用于在大肠杆菌、产碱杆菌属和假单胞菌属中表达)启动子。
此外，终止调控区还可源自对于宿主天然的各种基因。任选地，可不包含终止位点，但也可包含终止位点。
术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”在本文中是可互换使用的，并且是指经遗传修饰以过表达内源多核苷酸或减少内源多核苷酸的表达、或表达非内源多核苷酸序列(如包含于载体中的那些)的微生物。多核苷酸通常编码如上所述在制备所需代谢物的代谢途径中涉及的酶。因此，本文中所述的重组微生物经遗传工程改造以表达或过表达先前没有通过亲本微生物表达或过表达的目标酶。应理解，术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”不仅指特定的原始重组微生物，而且指这样的微生物的后代或潜在后代。
而且，将理解，不是所有的载体和表达调控序列在表达本文中公开的本发明的DNA序列中同等地起作用。同样地，不是所有的宿主对于相同的表达体系同等地起作用。但是，本领域技术人员能够从各种载体、表达调控序列、和宿主进行合适的选择，而不脱离本发明的范围。例如，可考虑所选择的宿主细胞来选择载体，因为该载体应在该宿主细胞中复制。在选择合适的载体时应考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力、和由该载体编码的其它蛋白质(例如，抗生素标记)的表达。而且，适用于本发明的各种载体/表达调控序列/宿主组合可通过本领域技术人员考虑若干因素来选择。
在另一实例中，提供保藏的重组微生物。保藏的微生物仅是示例性的，且基于发明构思，不同菌种或基因型的其它亲本生物体可通过本领域技术人员修饰以实现本文中所述的用于制备3-HP的微生物。
制备3-HP的方法
在再一方面中，提供制备3-HP的方法。在实施方案中，所述方法包括培养本文中公开的重组微生物。
在实施方案中，制备3-HP的方法包括在含有碳源的培养基中培养重组微生物和从培养的微生物收集3-HP。这里，培养重组微生物和收集3-HP可通过本领域已知的用于培养微生物、以及用于分离和纯化3-HP的常规方法进行。
如上所述，在3-HP生物合成途径中，mcr和msr涉及到以高收率从丙二酰基CoA经由丙二酸半醛生物合成3-HP的途径中。此外，pntAB或gapN提高细胞中NADPH和NADH的水平，从而解决与工程改造的3-HP生物合成途径相关的氧化还原失衡。
发酵培养基
发酵培养基必须包含合适的碳底物。合适的底物可为，但不限于，选自单糖、寡糖、多糖、C1底物、或它们的混合物的碳源。
底物可为，但不限于，单糖如葡萄糖或果糖，寡糖如乳糖或蔗糖，多糖如淀粉或纤维素或它们的混合物，和可再生碳源原料的未纯化混合物。此外，碳底物可为C1底物如二氧化碳或甲醇，对于其已展示出向关键的生物化学中间体的代谢转化。除了C1和C2底物，已知甲基营养的底物(methylotrophics)利用许多其它含碳化合物如各种氨基酸、葡糖胺和甲胺用于代谢活性。例如，已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或甘油(Bellion等，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32.(eds)：Murrell，J.Collin Kelly，Don P.Publisher：Intercept，Andover，UK)。同样地，念珠菌属的各种菌种可使丙氨酸或油酸代谢(Suiter等，Arch.Microbiol.153：485-489(1990))。因此，本文中使用的碳源可选自多种含碳底物，并且仅受所述微生物的代谢限制。
虽然认为所有的上述碳底物和其混合物在它们可产生本文中公开的酶途径可起作用的条件时是合适的，但在示例性实施方案中使用的碳底物可为葡萄糖、蔗糖、纤维素、或甘油。
除了合适的碳源，发酵培养基还可包括合适的矿物质、盐、酶辅因子、缓冲液、和本领域技术人员已知的适合刺激制备3-HP和/或细胞培养物生长所需的公开的酶途径的其它组分。
培养条件
典型地，细胞在合适的培养基中在约25℃～约40℃范围的温度下生长。合适的生长培养基可为商业制备的培养基如Luria Bertani(“LB”)培养液，Sabouraud Dextrose(“SD”)肉汤，或Yeast Medium(“YM”)培养液。
还可使用其它限定的或合成的生长培养基，并且用于特定微生物生长的合适的培养基是微生物学或发酵科学领域的技术人员已知的。
对于发酵合适的pH为约pH 5.0～约pH 9.0。更具体地，用于培养和发酵的初始pH可为约pH 6.0～约pH 8.0。发酵可在需氧或厌氧条件下进行。在实施方案中，发酵在厌氧或微需氧(microaerobic)条件下进行。
工业的分批和连续发酵
可使用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭体系，其中培养基的组成在发酵开始时建立，并且在发酵期间不经历人工改变。因此，在发酵开始时，培养基用所需生物体接种，并且允许发酵进行，而不向体系加入任何东西。但是，“分批”发酵经常是相对于碳源的加入而言的分批型发酵，同时在发酵期间在控制例如pH和氧浓度的因素方面经常进行尝试。在分批体系中，体系的代谢物和生物质组成不断的变化直到发酵停止的时间。在分批培养物内，细胞生长经由静止的迟滞期进行到指数生长(log)期并最终到其中生长速率下降或停止的稳定期。稳定期中的完整细胞将最终死亡。通常，指数期中的细胞涉及到最终产物和/或中间体的大量形成(bulk-formation)。
标准分批工艺的修饰型式是补料-分批工艺。补料-分批发酵工艺是典型的分批工艺，除了随着发酵进行，增量地加入生长限制底物以外。补料-分批工艺可用于各种情况，例如当分解代谢物易于抑制细胞中的代谢作用时，或当期望在培养基中具有有限量的底物例如以控制反应速率时。在补料-分批体系中，实际的底物浓度难以测量，且因此基于可测量的因素如pH、溶解的氧、或废气如CO2的分压来计算。分批和补料-分批发酵是本领域中普通和公知的(Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA或Desphande，Mukund(Appl.Biochem.Biotechnol.36(3)：227-234(1992))。
认为3-HP的制备不仅通过分批发酵是可能的，而且通过连续发酵是可能的。连续发酵是开放体系，其中限定的发酵培养基连续地加入生物反应器，且等量的条件培养基被同时除去以进行加工。连续发酵允许细胞保持在细胞主要处于指数期生长的恒定高密度下。
连续发酵允许调节影响细胞生长或最终产物制备的一个因素或任意数量的因素。例如，一种方法将有限的营养物如碳源或氮水平保持在固定浓度和允许所有其它参数适中(moderate)。在其它体系中，影响生长的许多因素可持续改变，同时通过培养基混浊度测得的细胞浓度保持恒定。连续体系努力保持稳态的生长条件，因此在发酵期间，由于培养基排出造成的细胞损失必须与细胞生长速率保持平衡。调节连续发酵工艺的营养物和生长因素的方法，以及最大化细胞形成速率的的技术，是工业微生物学领域公知的，并且许多方法在Brock的教科书中详述。
示例性实施方案可使用分批、补料-分批和连续工艺的任一种进行。
通过上述方法使用本文中公开的重组微生物制备的3-HP的最大收率为约97％(w/w)或更多。例如，每摩尔可制备97摩尔％的3-HP。
野生型微生物和重组微生物中由葡萄糖到3-HP的理论收率分别示于图3A和3B中。野生型微生物中的理论收率为83％(166摩尔3-HP/100摩尔葡萄糖)，而重组微生物中的理论收率为97％(194摩尔3-HP/100摩尔葡萄糖)。因此，3-HP的生产力显著提高，这使得可在工业规模上大量制备3-HP。
作为代谢工程改造的结果，通过使用与亲本微生物中的常规代谢途径不同的代谢途径和通过伴随引入新的3-HP生物合成途径的解决氧化还原失衡，本文中公开的基因重组微生物在3-HP的生产力方面显著提高。
下文中，将参照实施例进一步详细描述本发明的实施方案。这些实施例仅详细地描述实施方案，并且本发明不限于这些实施例。
特别地，虽然在以下实施例中举例说明特定的表达载体和大肠杆菌宿主细胞以表达根据本发明的基因，但本领域技术人员清楚地理解，还使用各种表达载体和宿主细胞。
总体方法
实施例中所用的克隆标准的重组DNA和分子的程序是本领域已知的。适用于以下实施例的技术可参见Sambrook等[Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，1989]，Silhavy等[Silhavy等，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.1984]，和Ausubel等[Ausubel等，Current Protocols in MolecularBioglogy，pub.by Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience，1987]。
适于细菌培养物的保持和生长的材料和方法是本领域已知的。以下实施例中使用的合适的技术可以参见以下：Manual of Methods for GeneralBacteriology，Phillipp等，eds.，American Society for Microbiology，Washington，DC.，1994和Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，Second Edition，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。
除非另有说明，用于生长和保持细菌细胞的所有试剂、限制酶和材料从Sigma Chemical Company(St.Louis，MO.，USA)获得。
实施例1.基因克隆
(1)源自勤奋金属球菌的mcr和msr基因的克隆
勤奋金属球菌mcr和msr(“mm”)基因各自的多核苷酸由Bioneer(KR)用密码子优化的序列合成以允许在大肠杆菌中优化的酶表达。
所述mcr和msr基因分别是来自勤奋金属球菌的丙二酰基CoA还原酶和丙二酸半醛还原酶的经密码子优化的基因。
(2)源自大肠杆菌的pntAB和源自变异链球菌的gapN基因的克隆
大肠杆菌pntAB多核苷酸序列通过大肠杆菌基因组聚合酶链反应(PCR)获得(引物：5’-AATT CCA TGG GA CGA ATT GGC ATA CCA AGA GAA C-3’和5’-AATT GGA TTC TTA CAG AGC TTT CAG GAT TGC ATC-3’，退火温度：52℃)。变异链球菌gapN基因的多核苷酸由Bioneer(KR)用密码子优化的序列合成以在大肠杆菌中表达。
所述gapN基因是来自变异链球菌的非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶的经密码子优化的基因。
实施例2重组载体的构建
A.pJYmm01
使用表达载体pCDFDuet-1(EMD Chemical)构建用于表达具有密码子优化的mcr和msr(“mm”)基因的多核苷酸的重组载体。pCDFDuet-1用NcoI和HindIII限制酶消化，并且用相同的限制酶消化的mm序列连接到该载体，从而获得称作pJYmm01的质粒。
B.pBJmcr01
使用表达载体pCDFDuet-1(EMD Chemical)构建用于表达橙色绿屈挠菌的mcr基因的重组载体。橙色绿屈挠菌mcr基因通过橙色绿屈挠菌基因组PCR获得。mcr基因扩增子用NcoI和HindIII限制酶消化，然后与用相同的限制酶消化的pCDFDuet-1连接，以获得称作pBJmcr01的质粒。
C.pJYacc01
使用表达载体pRSFDuet-1(EMD Chemical)构建表达大肠杆菌乙酰基CoA羧化酶的重组载体。乙酰基CoA羧化酶A(“accA”)基因的多核苷酸通过大肠杆菌基因组PCR获得(引物：5’-AATT CAT ATG AGT CTG AAT TTC CTTGAT TTT GAA-3’和5’-AATT CAA TTG TTA CGC GTA ACC GTA GCT CATCAG-3’，退火温度：52℃)。accA多核苷酸序列用NdeI和MfeI限制酶消化，然后连接到通过相同的限制消化方法制备的pRSFDuet-1中，从而获得称作pJYaccA的质粒。
此外，accD多核苷酸序列通过大肠杆菌基因组PCR获得(引物：5’-AATTCAA TTG AAGGAG ATATACC ATG AGC TGG ATT GAA CGA ATT AAAAG-3’和5’-AATT GCC GGC TCA GGC CTC AGG TTC CTG ATC-3’，退火温度：52℃)，然后用MfeI和NaeI限制酶消化。限制的accD序列然后连接到用相同的限制酶消化的pJYaccA中，以获得称作pJYaccAD的质粒。
类似地，accBC多核苷酸序列通过大肠杆菌基因组PCR获得(引物：5’-AATT GCC GGC AAGGAG ATATACC ATG GAT ATT CGT AAG ATT AAAAAA CTG-3’和5’-AATT CTC GAG TTA TTT TTC CTG AAG ACC GCG TTTTTT-3’，退火温度：52℃)，并用NaeI和XhoI限制酶消化。得到的accBC序列连接到用相同的限制酶消化的pJYaccAD中以获得称作pJYacc01的质粒。
D.pJYpnt01
使用表达载体pRSFDuet-1(EMD CHEMICAL)构建表达大肠杆菌pntAB的重组载体。pntAB多核苷酸序列通过大肠杆菌基因组PCR获得。pntAB多核苷酸用NcoI和BamHI限制酶消化，然后连接到通过相同的限制消化方法制备的pRSFDuet-1以获得称作pJYpnt01的质粒。
E.pJYgapN01
使用表达载体pRSFDuet-1(EMD CHEMICAL)构建重组载体以表达变异链球菌gapN基因，并且gapN使用密码子优化的序列(Bioneer，Korea)以在大肠杆菌中表达。pRSFDuet-1和密码子优化的gapN多核苷酸序列各自用NcoI和EcoRI限制酶消化。然后将两种多核苷酸连接在一起，从而获得质粒pJYgapN01。
F.pJYpa01
C中获得的质粒pJYacc01用NotI和XhoI限制酶消化以获得acc序列。acc序列连接到通过相同的限制酶部分消化的pJYpnt01中，从而获得质粒pJYpa01。
G.pJYgNa01
C中获得的质粒pJYacc01用NotI和XhoI限制酶消化以获得acc序列。acc序列与通过相同的限制酶部分消化的pJYgapN01连接，从而获得质粒pJYgNa01。
本文中公开的重组载体各自的图谱示于图4中：
(1)含有mcr-msr(勤奋金属球菌)基因的载体；
(2)含有mcr(橙色绿屈挠菌)基因的载体；
(3)含有acc基因的载体；
(4)含有pntAB基因的载体；
(5)含有gapN基因的载体；
(6)含有pntAB-acc基因的载体；和
(7)含有gapN-acc基因的载体。
实施例3.用于制备3-HP的重组大肠杆菌的制备
(1)重组菌株
将实施例2中构建的重组载体引入大肠杆菌中以制备多个重组菌株。如上制造的载体通过电穿孔转化到大肠杆菌中。
(2)mcr酶活性的测量
在Journal of Bacteriology，Dec 2006，vol.188，no.24，p8551-8559(p8552)中，当NADPH用作mcr的底物时，由于酶反应的NADPH到NADP的量的变化通过分光光度测定法来分析。
使用细胞提取物或纯化的酶。将预定量的NADPH加入缓冲液，并加入准备好的细胞提取物或酶。将所得细胞在65℃温育5分钟。加入丙二酰基-CoA以使反应开始，并测量反应之前和之后样品在365nm的吸光度(A365)。1单位的mcr酶代表每分钟氧化1微摩尔NADPH的mcr酶的量(与每分钟还原1微摩尔丙二酰基CoA的mcr酶的量相同)。
在其它宿主微生物中基因的表达需要与这里给出的类似的程序。
实施例4.使用转化大肠杆菌制备3-HP
将实施例3中构建的重组菌株在5-L生物反应器(KO Biotech，Seoul，Korea)中在含有100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、20g/L葡萄糖和合适的抗生素(50μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素)的2L M9培养基中温育。在过夜培养物中获得的重组菌株以0.2的OD600接种到培养基中。
在零星地加入葡萄糖(15g/L)的同时，以补料-分批模式进行需氧发酵。温度和旋转速度分别保持在37℃和500rpm。在发酵期间，无菌空气的流速恒定保持在0.35vvm的通气速率。除非另有说明，pH用5N NaOH和5N HCl保持在7.0。
将重组细胞以1.3的OD600引入0.1mM IPTG中，并每12小时向其加入0.1mM IPTG。每12小时加入含有抗生素的培养基组合物。
葡萄糖和3-HP的浓度通过HPLC使用折射率(“RI”)测量。
将在10000xg温育5分钟的样品离心。得到的上清液使用0.2mMTuffryn膜过滤，并以300mmx7.8mm Aminex HPX-87H(Bio-Rad，USA)柱使用5.41mM H2SO4在50℃分离。流速为0.6ml/分钟。
(1)当用mcr-msr基因转化时
结果示于图5。
可以确认，基于酶活性将丙二酰基CoA转化成3-HP的最有效途径为将乙酰基CoA以乙酰基CoA、丙二酰基CoA、丙二酸半醛和3-HP的顺序还原成3-HP的“丙二酸半醛还原途径”。
(2)当用mcr-msr-pntAB基因或mcr-msr-gapN基因转化时
结果示于图6和表1。
表1.发酵中存在的葡萄糖(g/L)
Figure BDA0000146785470000261
参考表1，可以确认，当NADPH再生酶引入细胞中以提高NADPH和NADH水平时，解决氧化还原失衡，因此3-HP收率显著提高(参见图5)。
特别地，与当细胞用pntAB基因(编码吡啶核苷酸转氢酶)转化时相比，当细胞用gapN基因(编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶)转化时，即当转化用甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性进行时，制备3-HP的能力进一步提高(参见图6的下图)。
因此，从所述结果可看出，当“丙二酸半醛还原途径”与NADPH再生酶例如gapN或pntAB和gapN一起使用时，可以高收率制备在工业规模上可用的3-HP。
虽然在本文中已公开了示例性实施方案，但应理解，其它变型可为可能的。这样的变型不被认为脱离本申请的示例性实施方案的范围，并且所有的对本领域技术人员来说显而易见的这样的改变意图包括所附权利要求的范围内。

Claims (16)

1.重组微生物，包含：
将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的酶，和
将丙二酸半醛还原成3-羟基丙酸(3-HP)的酶，使得该重组微生物能够由乙酰基CoA制备3-HP。
2.权利要求1的重组微生物，其中所述将丙二酰基CoA还原成丙二酸半醛的酶具有丙二酰基CoA还原酶(“mcr”)活性，和所述将丙二酸半醛还原成3-HP的酶具有丙二酸半醛还原酶(“msr”)活性。
3.权利要求2的重组微生物，其中所述mcr酶和msr酶是外源的。
4.权利要求3的重组微生物，其中所述mcr酶和所述msr酶源自勤奋金属球菌(M.sedula)。
5.权利要求1的重组微生物，进一步包含NADPH再生活性。
6.权利要求5的重组微生物，其中所述NADPH再生活性是转氢酶活性或甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性。
7.权利要求6的重组微生物，其中所述转氢酶活性是吡啶核苷酸转氢酶(“pntAB”)活性或可溶性吡啶核苷酸转氢酶(“udhA”)活性。
8.权利要求7的重组微生物，其中所述pntAB活性源自大肠杆菌(E.coli)。
9.权利要求6的重组微生物，其中所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性是gapN活性，且该gapN活性源自变异链球菌(S.mutans)。
10.权利要求1的重组微生物，其中所述重组微生物为选自以下的至少一种：发酵单胞菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、产碱杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、伯克霍尔德氏菌属、寡养菌属、克雷伯氏菌属、毕赤酵母属、念珠菌属、汉逊酵母属、酵母属和克鲁维酵母属。
11.权利要求10的重组微生物，其中所述重组微生物为大肠杆菌、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或酿酒酵母(Sccharomycescerevisiae)。
12.权利要求10的重组微生物，其中adhE、posB、pta、ack、frd和/或ldhA基因在该重组微生物中缺失。
13.重组表达载体，其为选自以下的至少一种：
包含mcr-msr基因的载体，
包含mcr-msr基因和pntAB基因的载体，
包含mcr-msr基因和gapN基因的载体，和
包含mcr-msr基因、pntAB基因、和gapN基因的载体。
14.制备3-羟基丙酸(3-HP)的方法，所述方法包括：
在产生3-羟基丙酸(3-HP)的条件下培养权利要求1-12任一项的的重组微生物。
15.根据权利要求14所述的所述方法，其中将所述微生物在包含选自葡萄糖、蔗糖、纤维素和甘油的至少一种碳底物的培养基上培养。
16.根据权利要求14所述的所述方法，进一步包括
分离所述3-HP。
CN2012100821894A 2011-03-24 2012-03-26 重组微生物、重组载体及制备3-羟基丙酸的方法 Pending CN102690774A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110026531A KR20120108538A (ko) 2011-03-24 2011-03-24 말로닉 세미알데히드 환원 경로를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생산방법
KR10-2011-0026531 2011-03-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102690774A true CN102690774A (zh) 2012-09-26

Family

ID=45888035

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012100821894A Pending CN102690774A (zh) 2011-03-24 2012-03-26 重组微生物、重组载体及制备3-羟基丙酸的方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20120244588A1 (zh)
EP (1) EP2505656A1 (zh)
KR (1) KR20120108538A (zh)
CN (1) CN102690774A (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103497922A (zh) * 2013-09-10 2014-01-08 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种联产3-hp和p3hp的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用
CN103710396A (zh) * 2013-12-30 2014-04-09 南京工业大学 一种提高厌氧发酵目标产物转化率的方法
CN104450807A (zh) * 2014-12-10 2015-03-25 燃点科技（天津）有限公司 一种应用大肠杆菌高效合成聚3-羟基丙酸的方法
CN104531786A (zh) * 2014-12-10 2015-04-22 燃点科技（天津）有限公司 一种应用乙酰辅酶a合成聚3-羟基丙酸的方法
CN105209626A (zh) * 2012-11-30 2015-12-30 诺维信股份有限公司 通过重组酵母生产3-羟基丙酸
CN105695499A (zh) * 2016-03-18 2016-06-22 黑龙江大学 BudAB基因过表达的产酸克雷伯氏菌基因工程菌株的构建方法及其发酵方法
CN114806984A (zh) * 2022-02-28 2022-07-29 江苏大学 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌ec01 s7、构建方法和应用
CN115948264A (zh) * 2022-01-29 2023-04-11 北京化工大学 产3-羟基丙酸的基因工程菌及其应用
CN118165906A (zh) * 2024-05-14 2024-06-11 北京大学深圳研究生院 一种直接利用废弃二氧化碳产3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法与应用

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013043758A2 (en) * 2011-09-19 2013-03-28 Opx Biotechnologies, Inc. Compositions and methods regarding direct nadh utilization to produce 3-hydroxypropionic acid, derived chemicals and further derived products
KR20140015998A (ko) * 2012-07-27 2014-02-07 삼성전자주식회사 게놈 수준에서의 클루이베로마이세스 마르시아누스의 대사 네트워크 모델 및 이를 이용한 3ｈｐ 생산에 대한 대사특성분석 방법
CN104718282A (zh) 2012-08-10 2015-06-17 Opx生物工艺学公司 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
US20150044746A1 (en) * 2013-03-15 2015-02-12 Opx Biotechnologies, Inc. Method of enhanced bioproduction
KR20150129007A (ko) * 2013-03-15 2015-11-18 카아길, 인코포레이팃드 단일 기능성 mcr + 3-hp 탈수소효소
US20150057465A1 (en) 2013-03-15 2015-02-26 Opx Biotechnologies, Inc. Control of growth-induction-production phases
US10077455B2 (en) 2013-06-14 2018-09-18 Technical University Of Denmark 3HP tolerance
WO2014198831A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Technical University Of Denmark Microbial production of 3-hydroxypropionic acid
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
BR112016001026A2 (pt) 2013-07-19 2017-10-24 Cargill Inc organismo geneticamente modificado
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
KR101828551B1 (ko) * 2016-01-11 2018-02-13 한국과학기술원 말론산 생성능을 가지는 재조합 변이미생물 및 이를 이용한 말론산의 제조방법
JP2020506702A (ja) 2017-02-02 2020-03-05 カーギル インコーポレイテッド Ｃ６−ｃ１０脂肪酸誘導体を生成する遺伝子組み換え細胞
KR102140596B1 (ko) * 2018-04-17 2020-08-04 에스케이이노베이션 주식회사 유기산 내성 효모 유래 신규 프로모터 및 이를 이용한 목적유전자의 발현방법
CN110713962B (zh) * 2019-09-06 2022-06-21 南京农业大学 一株高产丙二酰辅酶a的基因工程菌及其构建方法和应用
EP4208554A4 (en) 2021-02-08 2024-03-20 Lanzatech, Inc. RECOMBINANT MICROORGANISMS AND THEIR USES

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7186541B2 (en) * 2000-11-20 2007-03-06 Cargill, Incorporated 3-hydroxypropionic acid and other organic compounds
FR2862068B1 (fr) * 2003-11-06 2007-10-12 Metabolic Explorer Sa Souches de microorganismes optimisees pour des voies de biosyntheses consommatrices de nadph
DE102006025821A1 (de) * 2006-06-02 2007-12-06 Degussa Gmbh Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd
WO2008028002A1 (en) * 2006-08-29 2008-03-06 Rice University Increasing nadph-dependent products
CA2728285A1 (en) * 2008-03-03 2009-09-11 Joule Unlimited, Inc. Engineered co2 fixing microorganisms producing carbon-based products of interest
US20110125118A1 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 Opx Biotechnologies, Inc. Production of an Organic Acid and/or Related Chemicals
KR101860442B1 (ko) * 2011-06-27 2018-05-24 삼성전자주식회사 3-하이드록시프로피온산의 생산을 위한 유전자 조작

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105209626A (zh) * 2012-11-30 2015-12-30 诺维信股份有限公司 通过重组酵母生产3-羟基丙酸
CN105209626B (zh) * 2012-11-30 2019-09-03 诺维信股份有限公司 通过重组酵母生产3-羟基丙酸
CN103497922A (zh) * 2013-09-10 2014-01-08 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种联产3-hp和p3hp的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用
CN103710396A (zh) * 2013-12-30 2014-04-09 南京工业大学 一种提高厌氧发酵目标产物转化率的方法
CN104450807A (zh) * 2014-12-10 2015-03-25 燃点科技（天津）有限公司 一种应用大肠杆菌高效合成聚3-羟基丙酸的方法
CN104531786A (zh) * 2014-12-10 2015-04-22 燃点科技（天津）有限公司 一种应用乙酰辅酶a合成聚3-羟基丙酸的方法
CN105695499A (zh) * 2016-03-18 2016-06-22 黑龙江大学 BudAB基因过表达的产酸克雷伯氏菌基因工程菌株的构建方法及其发酵方法
CN115948264A (zh) * 2022-01-29 2023-04-11 北京化工大学 产3-羟基丙酸的基因工程菌及其应用
CN114806984A (zh) * 2022-02-28 2022-07-29 江苏大学 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌ec01 s7、构建方法和应用
CN114806984B (zh) * 2022-02-28 2024-04-09 江苏大学 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌ec01 s7、构建方法和应用
CN118165906A (zh) * 2024-05-14 2024-06-11 北京大学深圳研究生院 一种直接利用废弃二氧化碳产3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2505656A1 (en) 2012-10-03
KR20120108538A (ko) 2012-10-05
US20120244588A1 (en) 2012-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102690774A (zh) 重组微生物、重组载体及制备3-羟基丙酸的方法
JP6898365B2 (ja) 組換え微生物およびその使用方法
US8158391B2 (en) Production of an α-carboxyl-ω-hydroxy fatty acid using a genetically modified Candida strain
Park et al. Microbial formation of esters
KR101229525B1 (ko) 1,2-프로판디올을 생산하기 위한 개량형 미생물
CN103703123B (zh) 用于产生有用代谢物的重组微生物
CN104508136A (zh) 重组微生物及其用途
CN105051179B (zh) 重组微生物和其用途
EP4421181A2 (en) Non-natural microbial organisms with improved energetic efficiency
US8541212B2 (en) Genetic modification for production of 3-hydroxypropionic acid
AU2010241185B2 (en) Cells and method for producing acetone
US10246726B2 (en) Photosynthetic production of 3-hydroxybutyrate from carbon dioxide
CN104718282A (zh) 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
WO2009089457A1 (en) Methods for producing 3-hydroxypropionic acid and compounds thereof
US20160289708A1 (en) Methods and compositions for production of acetaldehyde
JP2012506716A (ja) グリセロールを化学物質に変換するための微好気性培養
CN105209626B (zh) 通过重组酵母生产3-羟基丙酸
KR20120099315A (ko) 3-하이드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올 동시 생산용 재조합미생물
TWI824995B (zh) 用於改良氣體醱酵產乙酸菌之效率的精胺酸增補
JP2020506722A (ja) 目的分子を産生するための遺伝的に最適化された微生物
CN106133132A (zh) 重组微生物和其使用方法
CN106062178B (zh) 具有增加的碳通量效率的方法和生物
CA2737429C (en) Method for producing lactic acid from plant-derived raw material, and lactic-acid-producing bacterium
WO2010050231A1 (ja) シロ－イノシトール産生細胞および当該細胞を用いたシロ－イノシトール製造方法
US20230126375A1 (en) Engineered bacteria and methods of producing sustainable biomolecules

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120926