CN103703123B - 用于产生有用代谢物的重组微生物 - Google Patents

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Abstract

描述了特征如下的重组微生物：具有磷酸转酮酶活性、与未修饰的微生物相比通过失活编码磷酸果糖激酶的基因或通过减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱或失活的Embden‑Meyerhof‑Parnas途径(EMPP)和与未修饰的微生物相比通过失活编码葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶的基因或通过减少葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶活性而具有削弱或失活的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路。这些微生物可以用于产生有用代谢物如丙酮、异丁烯或丙烯。

Description

用于产生有用代谢物的重组微生物
本发明涉及特征如下的重组微生物：具有磷酸转酮酶活性、与未修饰的微生物相比通过失活编码磷酸果糖激酶的基因或通过减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)或不具有磷酸果糖激酶活性，和与未修饰的微生物相比通过失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因或通过减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有削弱或失活的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路或不具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。这种微生物可以用于产生有用代谢物如丙酮、异丁烯或丙烯。
对于过去的数十年，代谢工程实践者已经致力于为生产化学品提供生物解决方案，由此为较传统的化学方法提供替代方法。通常而言，生物解决方案允许利用可再生原料(例如糖)并且与基于现有石油化学的方法竞争。一种用于生产化学品的多步骤生物解决方案一般包含微生物作为将原料转化成靶分子的催化剂。用于产生特定靶分子的全套酶反应可以划分成属于中心碳途径的那些酶反应和属于产物特异性途径的那些酶反应。属于中心碳途径和产物特异性途径的反应是关联的，原因在于必须在有助于该方法的竞争力总体权衡下考虑每种酶反应反应的氧化还原约束条件(一般是NAD(P)H)和能量学约束条件(一般是ATP)。历史上，已经将依赖糖生长的异养生物的中心碳途径描述为Embden-Meyerhoff-Parnas途径(EMPP)、戊糖磷酸途径(PPP)、Entner-Doudoroff途径(EDP)和磷酸转酮酶途径(PKP)(见Gottschalk(1986),Bacterial Metabolism,第2版，Springer-Verlag,NewYork)。每个中心途径或中心途径组合相对于特定靶分子提供优点和缺点。为了提供有竞争力的生物方法，已经描述了具有涉及EMPP，PPP和EDP的修饰的重组微生物(M.Emmerling等人,Metab.Eng.1:117(1999)；L.O.Ingram等人,Appl.Environ.Microbiol.53:2420(1987)；C.T.Trinh等人,Appl.Environ.Microbiol.74:3634(2008))。最近，已经描述了具有涉及PKP的修饰的重组微生物(见Sonderegger等人,Appl.Environ.Microbiol.70(2004),2892-2897，美国专利7,253,001，Chinen等人,J.Biosci.Bioeng.103(2007),262-269，美国专利7,785,858；Fleige等人，Appl.Microbiol.Cell Physiol.91(2011),769-776)。
EMPP将1mol葡萄糖转化成2mol丙酮酸(PYR)。当需要乙酰-CoA时，1mol PYR可以转化成1mol乙酰-CoA，同时生成1mol CO2和1mol NADH。在方程式1中给出总反应。
葡萄糖+2ADP+2H3PO4+2CoA+4NAD+→
2乙酰-CoA+2CO2+2ATP+2H2O+4NADH+4H+
(方程式1)
PPP提供将1mol葡萄糖转化成1mol CO2和2mol NADPH的手段，同时产生0.67mol果糖-6-磷酸(F6P)和0.33mol甘油醛-3-磷酸(GAP)。如此形成的F6P和GAP必须由其他反应途径代谢，例如由EMPP代谢。EDP将1mol葡萄糖转化成1mol GAP和1mol PYR，同时产生1molNADPH。与PPP同样地，如此形成的GAP必须由其他反应途径代谢。PKP提供将1mol葡萄糖转化成1mol GAP和1.5mol乙酰磷酸(AcP)的手段。当需要乙酰-CoA时，1当量AcP加上1当量辅酶A(CoA)可以由磷酸转乙酰酶的作用转化成1当量乙酰-CoA和1当量无机磷酸(Pi)。
对于从借助PKP和相对于AcCoA部分在氧化还原中性附近产生的AcCoA部分所衍生的特定靶分子，存在总体能量平衡的缺乏。PKP(和类似地，PPP和EDP)不产生用于将葡萄糖转化成葡萄糖-6-磷酸的ATP。在磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依赖性葡萄糖摄取的情况下，必须通过其他手段(例如借助EMPP)产生PEP。借助PKP再循环GAP恶化这种情况，特别在产物特异性途径提供少量ATP时。
Sonderegger(见上述引文)和美国专利7,253,001公开了重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，所述菌株包含天然或过量表达的磷酸转酮酶活性，连同过量表达的磷酸转乙酰酶以增加葡萄糖/木糖混合物转化成乙醇的产率。这些菌株特征在于EMPP和PPP均运行的PEP非依赖性葡萄糖摄入。
Chinen(见上述引文)和美国专利7,785,858公开了选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、棒状细菌和芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的重组细菌，所述重组细菌包含增加的磷酸转酮酶活性用于将葡萄糖转化成借助中间体乙酰-CoA产生的靶分子，所述靶分子包括由L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、琥珀酸和聚羟丁酸组成的组。这些菌株特征在于EMPP可操作的PEP依赖性葡萄糖摄入。值得注意地，与野生型或未修饰的菌株相比，美国专利7,785,858的细菌中磷酸果糖激酶的活性减少(见第33页)。
特定微生物是否利用PEP非依赖性葡萄糖摄入或PEP依赖性葡萄糖摄入影响一个过程的总体能量学平衡。例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株天然地利用PEP非依赖性葡萄糖摄入，而大肠杆菌菌株天然地利用PEP依赖性葡萄糖摄入。Flores等人(MetabolicEngineering(2005)7,70-87)和美国专利7,371,558已经公开了PEP依赖性葡萄糖摄取已被替换为PEP非依赖性葡萄糖摄取的大肠杆菌菌株。具体而言，美国专利7,371,558公开了增加葡萄糖转化成1,3-丙二醇的产率的葡萄糖摄取修饰。这些菌株特征在于EMPP和PPP均运行的PEP非依赖性葡萄糖摄入，值得注意的是不存在磷酸转酮酶活性。
存在开发重组微生物的需求，所述重组微生物包含通过最佳容忍酶反应的氧化还原约束条件和能量学约束条件而使原料最大限度转化成产物的中央碳途径和产物特异性途径。申请人已经通过提供如权利要求书中定义的实施方案满足这种需求。
因而，本发明涉及特征如下的重组微生物：
a)具有磷酸转酮酶活性；
b)(i)与未修饰的微生物相比通过失活编码磷酸果糖激酶的基因或通过减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)；或
(ii)不具有磷酸果糖激酶活性
和
c)(i)与未修饰的微生物相比通过失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因或通过减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有削弱或失活的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路；或
(ii)不具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性；
本发明的微生物以具有磷酸转酮酶活性为特征，从而增加产生的乙酰-CoA的通量(flux)。通常，微生物借助Embden-Meyerhof-Parnas途径将葡萄糖转化成丙酮酸，所述丙酮酸随后可以由丙酮酸脱氢酶转化成乙酰-CoA。然而，这种转化伴随着CO2的释放，并且因此，损失可能用于产生有用代谢物的一个碳原子。为了增加微生物中乙酰-CoA的量，因此合乎需要的是借助不同途径形成乙酰-CoA以避免碳原子损失。通过使用具有磷酸转酮酶活性的微生物，磷酸和果糖-6-磷酸转化成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸，并且磷酸转乙酰酶进一步将乙酰磷酸转化成乙酰-CoA，而不损失碳原子。因此，最终，可以通过使用具有磷酸转酮酶活性的微生物增加乙酰-CoA的产率。这种微生物能够在不损失碳原子的情况下将葡萄糖转化成乙酰-CoA。US7,785,858和US7,253,001中公开了磷酸转酮酶天然或异源表达的重组微生物。
如本发明中所用，术语“磷酸转酮酶活性”意指能够根据以下反应将D-木酮糖-5-磷酸转化成D-甘油醛-3-磷酸的酶活性：
D-木酮糖-5-磷酸+磷酸根→D-甘油醛-3-磷酸+乙酰-磷酸+水
或者能够催化上文所示反应并且也能够根据以下反应将D-果糖-6-磷酸转化成D-赤藓糖-4-磷酸的酶活性：
D-果糖6-磷酸+磷酸根→乙酰磷酸+D-赤藓糖4-磷酸+水
前者磷酸转酮酶通常分类为EC4.1.2.9并且后者分类为EC4.1.2.22。两种类型的磷酸转酮酶均可以在本发明的范围内使用。图1显示使用两种选项的如本文所述的磷酸转酮酶的总体反应的方案。
可以通过本领域已知的测定法测量这种酶活性。这种测定法的例子在下文实施例部分中给出。
在本发明的上下文中，具有磷酸转酮酶活性的微生物可以例如是天然具有磷酸转酮酶活性的微生物或不天然具有磷酸转酮酶活性并且已经被遗传修饰以表达磷酸转酮酶的微生物或天然具有磷酸转酮酶活性并且已经被遗传修饰(例如用编码磷酸转酮酶的核酸(例如载体)转化)以便增加所述微生物中磷酸转酮酶活性的微生物。
内在地即天然地具有磷酸转酮酶活性的微生物是本领域已知的，并且它们的任一种可以用于本发明的上下文中。
在本发明的上下文中该微生物也可能是不天然具有磷酸转酮酶活性，但经遗传修饰从而包含允许磷酸转酮酶表达的核苷酸序列的微生物。类似地，该微生物也可以是天然具有磷酸转酮酶活性，但是经遗传修饰从而增强磷酸转酮酶活性(例如通过引入编码磷酸转酮酶的外源核苷酸序列)的微生物。
下文将详细描述为表达目的酶对微生物的遗传修饰。
在本发明微生物中表达的磷酸转酮酶可以是任何磷酸转酮酶，特别是来自原核或真核生物的磷酸转酮酶。描述了例如来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的原核磷酸转酮酶并且在下文实施例部分中给出例子。
在本发明的一个优选实施方案中，磷酸转酮酶是这样的酶，所述酶包含如实施例部分中所示的SQ0005编码的氨基酸序列或与这种氨基酸序列至少n%同一的序列并且具有磷酸转酮酶活性，其中n是10和100之间的整数，优选地是10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。
优选地，通过将各自序列与上述SEQ ID NOs任一个的氨基酸序列比较，确定同一性的程度。当比较的序列不具有相同的长度时，同一性程度优选地指较短序列中与较长序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数或指较长序列中与较短序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。可以根据本领域熟知的方法，优选地使用合适的计算机算法(如CLUSTAL)确定序列同一性程度。
当使用Clustal分析方法来确定特定序列是否与参考序列例如80%同一时，对于氨基酸序列的比较，可以使用默认设置或者优选地使用如下设置：矩阵：blosum30；开口空位罚分：10.0；延伸空位罚分：0.05；延迟发散(Delay divergent)：40；空位分隔距离：8。对于核苷酸序列比较，延伸空位罚分优选地设置为5.0。
优选地，在序列的整个长度范围内计算同一性的程度。
在本发明微生物中表达的磷酸转酮酶可以是天然存在的磷酸转酮酶或它可以是例如通过引入例如改变或改善酶活性、稳定性等的突变或其他改变而从天然存在的磷酸转酮酶衍生的磷酸转酮酶。
用于修饰和/或改善蛋白质的所需酶活性的测定法是本领域技术人员熟知的并且包括例如随机诱变或位点定向诱变并随后选择具有所需特性的酶，或所谓“定向进化”方案。
例如，对于原核细胞中的遗传修饰，可以将编码磷酸转酮酶的核酸分子引入质粒中，所述质粒允许通过DNA序列重组诱变或序列修饰。标准方法(见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用与片段互补的衔接头和接头连接DNA片段。另外，可以使用提供合适限制性位点或除去多余DNA或限制性位点的工程化方案。在可能插入，缺失或置换的那些情况下，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制酶作用或连接。通常而言，实施序列分析、限制酶分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。随后用如上文所述的测定法，对所产生的磷酸转酮酶变体测试所需的活性，例如，酶活性，并且特别是它们增加的酶活性。
如上文所述的，本发明的微生物可以是已经通过导入编码磷酸转酮酶的核酸分子进行了遗传修饰的微生物。因而，在一个优选的实施方案中，重组微生物是已经被遗传修饰以具有增加的磷酸转酮酶活性的重组微生物。这可以例如通过用编码磷酸转酮酶的核酸转化该微生物来实现。下文将进一步详细描述对微生物的遗传修饰。优选地，引入微生物中的核酸分子是相对于该生物是异源的核酸分子，即，它不天然地存在于所述微生物中。
在本发明的上下文中，“增加的活性”意指遗传修饰的微生物中酶的、尤其式磷酸转酮酶的表达和/或活性比相应未修饰的微生物高至少10%、优选地至少20%、更优选地至少30%或50%、甚至更优选地至少70%或80%并且特别优选至少90%或100%高。在甚至更优选的实施方案中，表达和/或活性的增加可以是至少150%、至少200%或至少500%。在特别优选的实施方案中，表达比相应未修饰的微生物高至少10倍、更优选地至少100倍和甚至更优选至少1000倍。
术语“增加的”表达/活性也涵盖如下情况，其中相应未修饰的微生物不表达相应的酶，例如磷酸转酮酶，从而未修饰的微生物中的相应表达/活性是零。
用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，通过测量相应蛋白质的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括蛋白质印迹法、ELISA等。在另一个实施方案中，通过测量相应RNA的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括例如RNA印迹。
用于测量磷酸转酮酶的酶活性的测定法是本领域已知的并且已经在上文描述。
本发明的微生物进一步以如下为特征：与未修饰的微生物相比通过失活编码磷酸果糖激酶的基因或通过减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)或不具有磷酸果糖激酶活性。因而，该微生物是这样的微生物，所述微生物天然具有包括磷酸果糖激酶活性的EMPP，但是已经被修饰，特别地被遗传修饰，从而与相应未修饰的微生物相比磷酸果糖激酶活性被完全消除，或从而该活性减少，或者该微生物是天然不具有磷酸果糖激酶活性的微生物。
如上文已经提到，在葡萄糖经EMPP加工成乙酰-CoA时，一个碳原子因最后步骤中CO2的释放而损耗。通过引入磷酸转酮酶，可以避免这种损耗。由于果糖-6-磷酸是磷酸转酮酶的底物，因此需要果糖-6-磷酸汇集物在微生物中以高水平维持，以便增加乙酰-CoA的产率。由于果糖-6-磷酸也是Embden-Meyerhof-Parnas途径的酶(即，磷酸果糖激酶)的底物，与未修饰的微生物相比，本发明的重组微生物具有减少的磷酸果糖激酶活性或编码磷酸果糖激酶的基因已经失活。这确保了果糖-6-磷酸的通量指向磷酸转酮酶并指向乙酰-CoA的产生，而无CO2损耗，因为果糖-6-磷酸或大部分果糖-6-磷酸可以不再经Embden-Meyerhof-Parnas途径加工。US7,785,858中公开了其中磷酸转酮酶天然或异源表达的且具有降低的磷酸果糖激酶活性的重组微生物。
“磷酸果糖激酶活性”意指将ATP和果糖-6-磷酸转化成ADP和果糖-1,6-二磷酸的酶活性(EC2.7.1.11)。可以通过本领域已知(例如，由Kotlarz等人(Methods Enzymol.(1982)90,60-70)描述)的测定法测量这种酶活性。
术语“特征在于与未修饰的微生物相比通过失活编码磷酸果糖激酶的基因或通过减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)的微生物”优选地指这样的微生物，其中与未修饰的微生物相比编码磷酸果糖激酶的基因的失活或磷酸果糖激酶活性减少由导致所述失活或减少的微生物遗传修饰实现。
在一个优选实施方案中，本发明的重组微生物是通过失活编码磷酸果糖激酶的基因而具有失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)的重组微生物。在本发明的上下文中，编码磷酸果糖激酶的基因的失活意指微生物中存在的编码磷酸果糖激酶的基因失活，从而它们不再表达有功能的磷酸果糖激酶和/或不导致其合成。可以通过本领域已知的许多不同方式实现失活。失活可以例如通过破坏编码磷酸果糖激酶的基因或由导入选择标记通过彻底缺失所述基因来实现。备选地，编码磷酸果糖激酶的基因的启动子可以按基因不再转录成mRNA的方式突变。本领域已知的失活编码磷酸果糖激酶的基因的其他方式是：表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有与磷酸果糖激酶基因的转录物互补的核苷酸序列，从而该mRNA不再可被翻译成蛋白质；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过RNAi效应阻抑所述基因表达；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有特异性切割所述基因的转录物的活性；或表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过共抑制作用抑制所述基因的表达。可以将这些多核苷酸并入载体中，其中可以通过转化将所述载体引入微生物中以实现编码磷酸果糖激酶的基因的失活。
在本发明的上下文中，术语“失活”优选地意指完全失活，即，微生物不显示磷酸果糖激酶活性。这特别意指该微生物不显示磷酸果糖激酶活性，这与所用的生长条件无关。
优选地，“失活”意指微生物中存在的编码磷酸果糖激酶的基因被遗传修饰，从而防止该酶的表达。这可以例如通过缺失基因或基因部分来实现，其中基因部分的缺失防止该酶表达，或通过在编码区中或在启动子区中破坏基因，其中所述破坏具有无蛋白质表达或表达功能异常蛋白质的作用。
在一个优选实施方案中，本发明的重组微生物是与未修饰的微生物相比通过减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)的重组微生物。优选地，通过微生物的遗传修饰实现这种减少。这可以例如通过随机诱变或位点定向诱变启动子和/或酶并后续选择具有所需特性的启动子和/或酶或通过如上文所述的互补性核苷酸序列或RNAi效应来实现。下文将进一步详细描述对微生物的遗传修饰。
在本发明的上下文中，“减少的活性”意指遗传修饰的微生物中酶的、尤其磷酸果糖激酶的表达和/或活性比相应未修饰的微生物低至少10%、优选地至少20%、更优选地至少30%或50%、甚至更优选地至少70%或80%并且特别优选至少90%或100%。用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。用于测量磷酸果糖激酶的减少的酶活性的测定法是本领域已知的。
在另一个实施方案中，本发明的微生物是不具有磷酸果糖激酶活性的微生物。这优选地意指这种微生物天然地不具有磷酸果糖激酶活性。这意指这种微生物在其基因组中天然地不含有编码具有磷酸果糖激酶活性的酶的核苷酸序列。这类微生物的例子是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(J.S.Suo等人,Nat.Biotechnol.23:63(2005))和真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)(C.fleige等人,Appl.Microb.Cell Physiol.91:769(2011)。
本发明的微生物进一步以如下为特征：与未修饰的微生物相比通过失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因或通过减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有削弱或失活的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路或不具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。因而，该微生物是这样的微生物，所述微生物天然具有包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的PPP，但是已经被修饰，特别地被遗传修饰，从而与相应未修饰的微生物相比，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性被完全消除，或从而该活性减少，或者该微生物是天然不具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的微生物。
削弱或失活戊糖磷酸途径氧化支路进一步增加乙酰-CoA的产率，因为葡萄糖-6-磷酸将不再因戊糖磷酸循环而抽出。微生物中的全部或几乎全部葡萄糖-6-磷酸将转化成果糖-6-磷酸，后者随后将进一步转化成乙酰-CoA。
“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性”意指将葡萄糖-6-磷酸和NADP+转化成6-磷酸葡萄糖酸-δ-内酯和NADPH的酶活性(EC1.1.1.49)。可以通过本领域已知(例如，由Noltmann等人(J.Biol.Chem.(1961)236,1225-1230)描述)的测定法测量这种酶活性。
术语“特征在于与未修饰的微生物相比通过失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因或通过减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有削弱或失活的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路的微生物”优选地指这样的微生物，其中与未修饰的微生物相比编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因的失活或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性减少由导致所述失活或减少的微生物遗传修饰实现。
在一个优选实施方案中，本发明的重组微生物是通过失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因而具有失活的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路的重组微生物。在本发明的上下文中，编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因的失活意指微生物中存在的编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因失活，从而它们不再表达有功能的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或不导致其合成。可以通过本领域已知的许多不同方式实现失活。失活可以例如通过破坏编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因或由导入选择标记通过彻底缺失所述基因来实现。备选地，编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因的启动子可以按该基因不再转录成mRNA的方式突变。本领域已知的失活编码磷酸果糖激酶的基因的其他方式是：表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的转录物互补的核苷酸序列，从而该mRNA不再可被翻译成蛋白质；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过RNAi效应阻抑所述基因表达；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有特异性切割所述基因的转录物的活性；或表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过共抑制作用抑制所述基因的表达。可以将这些多核苷酸并入载体中，其中可以通过转化将所述载体引入微生物中以实现编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因的失活。
在本发明的上下文中，术语“失活”优选地意指完全失活，即，微生物不显示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。这特别意指该微生物不显示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，这与所用的生长条件无关。
优选地，“失活”意指微生物中存在的编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因被遗传修饰，从而防止该酶的表达。这可以例如通过缺失基因或基因部分来实现，其中基因部分的缺失防止该酶表达，或通过在编码区中或在启动子区中破坏基因，其中所述破坏具有无蛋白质表达或表达功能异常蛋白质的作用。
在一个优选实施方案中，本发明的重组微生物是与未修饰的微生物相比通过减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有削弱的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路的重组微生物。优选地，通过微生物的遗传修饰实现这种减少。这可以例如通过随机诱变或位点定向诱变启动子和/或酶并后续选择具有所需特性的启动子和/或酶或通过如上文所述的互补性核苷酸序列或RNAi效应来实现。下文将进一步详细描述对微生物的遗传修饰。
在本发明的上下文中，“减少的活性”意指遗传修饰的微生物中酶的、尤其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达和/或活性比相应未修饰的微生物低至少10%、优选地至少20%、更优选地至少30%或50%、甚至更优选地至少70%或80%并且特别优选至少90%或100%低。用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。用于测量葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的减少的酶活性的测定法是本领域已知的。
在另一个实施方案中，本发明的微生物是不具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的微生物。这优选地意指这种微生物天然地不具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。这意指这种微生物在其基因组中天然地不含有编码具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的酶的核苷酸序列。这类微生物的例子是贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)(Barbe等人,Nucl.AcidsRes.32(2004),5766-5779)、极端嗜热门古细菌如硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)(Nunn等人,J.Biol.Chem.285(2010),33701-33709)、附着热变形菌(Thermoproteus tenax)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)和干热嗜酸菌(Picrophilus torridus)(Reher和FEBS Lett.580(2006),1198-1204)。
在又一个实施方案中，本发明的微生物进一步的特征在于，具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性，优选地在葡萄糖上生长时，具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性。果糖-1,6-二磷酸磷酸酶是参与葡糖异生的将果糖-1,6-二磷酸水解成果糖-6-磷酸和游离磷酸的酶。然而，在基本上全部生物中，在葡萄糖存在下，果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性被阻遏并且通过EMPP加工葡萄糖(糖酵解)。对于具有磷酸转酮酶活性并且不具有磷酸果糖激酶活性或其中磷酸果糖激酶活性减少或其编码磷酸果糖激酶的基因失活的本发明微生物，可以通过确保果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性的存在，例如通过在葡萄糖存在下去阻抑果糖-1,6-二磷酸磷酸酶，用磷酸转酮酶(EC4.1.2.9或EC4.1.2.22)转化果糖-6-磷酸来增强乙酰-CoA的产率。果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性的存在导致通过果糖-1,6-二磷酸醛缩酶所产生的果糖-1,6-二磷酸再循环成为果糖-6-磷酸，所述果糖-6-磷酸随后可以经磷酸转酮酶途径再次转化成乙酰-CoA。确实地，磷酸转酮酶的产物乙酰磷酸因磷酸乙酰转移酶EC2.3.1.8的作用互变成乙酰-CoA。因此，本发明的重组微生物能够从葡萄糖以接近3:1的化学计量产生乙酰-CoA。在方程式2中给出总反应：
葡萄糖+ATP+3CoA→3乙酰-CoA+ADP+H3PO4+2H2O
(方程式2)
术语“果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性”意指将果糖-1,6-二磷酸和H2O转化成果糖-6-磷酸和磷酸的酶活性(EC3.1.3.11)。可以通过本领域已知(例如，由Hines等人(J.Biol.Chem.(2007)282,11696-11704)描述)的测定法测量这种酶活性。术语“果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性”和“果糖-1,6-二磷酸磷酸酶”也涵盖在这种意思上具有双官能的酶，所述酶显示果糖-1-6-二磷酸醛缩酶/磷酸酶活性。这类双官能酶在大部分古细菌和深度分支的细菌谱系中表达并且在大多数情况下是热稳定的。例如对Thermococcuskodakaraensis、东大硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)、Ignicoccus hospitalis、Cenarchaeum symbiosum、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricas)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜中性热变形菌(Thermoproteus neutrophilus)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)和许多其他细菌报道了这类酶(见例如，Say和Fuchs(Nature464(2010),1077)；Fushinobu等人,(Nature478(2011),538；Du等人,(Nature478(2011),534)。
术语“当在葡萄糖上生长时的果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性”意指当微生物在葡萄糖上生长时，微生物表达具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性的酶。“在葡萄糖上生长”意指在尤其含有葡萄糖作为碳源的培养基中生长微生物。优选地，该术语意指在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基中生长微生物。
在本发明的上下文中，具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性、特别地当在葡萄糖上生长时具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性的微生物可以例如是天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性、特别在葡萄糖上生长时天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性的微生物，或不天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性、特别在葡萄糖上生长时不天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性的微生物，和已经被遗传修饰以表达果糖-1,6-二磷酸磷酸酶、特别在葡萄糖上生长时表达果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的微生物。它也可以是天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性，特别地当在葡萄糖上生长时天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性的微生物且已经被遗传修饰(例如用编码果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的核酸(例如载体)转化)以便增加所述微生物中磷酸转酮酶活性的微生物。
内在即天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性、特别在葡萄糖上生长时天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性的微生物是本领域已知的，并且它们的任一种可以用于本发明的上下文中。
在本发明的上下文中该微生物也可能是不天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性，特别在葡萄糖上生长时不天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性，但经遗传修饰从而能够表达果糖-1,6-二磷酸磷酸酶、特别在葡萄糖上生长时能够表达果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的微生物。这可以例如通过以下方式实现：将编码果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的基因的启动子以如此方式突变，从而当在葡萄糖上生长微生物时，该基因不再受阻遏，或启动子可以由在葡萄糖上生长微生物时不受调节的另一个启动(例如组成型启动子)替换。
类似地，该微生物也可以是天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性，特别在葡萄糖上生长时天然具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性，但是经遗传修饰从而增强/增加果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性、特别在葡萄糖上生长时增强/增加果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性(例如通过引入编码果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的外源核苷酸序列)的微生物。
下文将详细描述为表达目的酶对微生物的遗传修饰。
本发明的果糖-1,6-二磷酸磷酸酶可以是天然存在的果糖-1,6-二磷酸磷酸酶或它可以是(例如通过引入例如改变或改善酶活性、稳定性等的突变或其他改变)从天然存在的果糖-1,6-二磷酸磷酸酶衍生的果糖-1,6-二磷酸磷酸酶。用于修饰和/或改善蛋白质的所需酶活性的测定法是本领域技术人员熟知的并且已经在上文描述。随后对所产生的果糖-1,6-二磷酸磷酸酶变体测试它们的特性，例如酶活性或调节作用。用于测量果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的酶活性的测定法是本领域已知的。在一个实施方案中，果糖-1,6-二磷酸磷酸酶是不受反馈抑制调节的酶。
在一个优选的实施方案中，重组微生物已经被遗传修饰以具有增加的果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性。这可以例如通过用编码果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的核酸转化该微生物来实现。下文将进一步详细描述对微生物的遗传修饰。
在本发明的上下文中，“增加的活性”意指当在葡萄糖上生长时，遗传修饰的微生物中酶的、尤其果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的表达和/或活性比在葡萄糖上生长时相应未修饰的微生物高至少10%、优选地至少20%、更优选地至少30%或50%、甚至更优选地至少70%或80%并且特别优选至少90%或100%。在甚至更优选的实施方案中，表达和/或活性的增加可以是至少150%、至少200%或至少500%。在特别优选的实施方案中，表达比相应未修饰的微生物高至少10倍、更优选地至少100倍和甚至更优选至少1000倍，特别地当在葡萄糖上生长时如此。
用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，通过测量相应蛋白质的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括蛋白质印迹法、ELISA等。在另一个实施方案中，通过测量相应RNA的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括例如RNA印迹。
用于测量果糖-1,6-二磷酸酶的酶活性的测定法是本领域已知的。
在另一个实施方案中，本发明的微生物进一步特征在于：与未修饰的微生物相比通过失活编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因或通过减少甘油醛3-磷酸脱氢酶活性而进一步削弱或失活EMPP。在进一步下游的某步骤通过削弱或失活甘油醛3-磷酸脱氢酶进一步削弱EMPP确保可能在微生物中产生的甘油醛3-磷酸将均不或几乎均不通过糖酵解加工成乙酰-CoA，其中通过糖酵解加工成乙酰-CoA导致在丙酮酸脱氢酶催化的最末步骤中通过释放CO2而损耗一个碳原子。因此，通过削弱或失活甘油醛3-磷酸脱氢酶活性阻断EMPP进一步确保总通量指向磷酸转酮酶。
“甘油醛3-磷酸脱氢酶活性”意指将甘油醛3-磷酸、磷酸和NAD+转化成3-磷酸-D-甘油酰磷酸和NADH+H+的酶活性(EC1.2.1.12)。可以通过本领域已知(例如，由D'Alessio等人(J.Biol.Chem.(1971)246,4326-4333)描述)的测定法测量这种活性。
术语“特征在于与未修饰的微生物相比通过失活编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因或通过减少甘油醛3-磷酸脱氢酶活性而具有进一步削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)的微生物”优选地指这样的微生物，其中与未修饰的微生物相比编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的失活或甘油醛3-磷酸脱氢酶活性减少由导致所述失活或减少的微生物遗传修饰实现。
在一个优选实施方案中，本发明的重组微生物是这样的重组微生物，其中与未修饰的微生物相比通过失活编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因或通过减少甘油醛3-磷酸脱氢酶活性而进一步削弱或失活EMPP。在本发明的上下文中，编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的失活意指微生物中存在的编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因失活，从而它们不再表达有功能的甘油醛3-磷酸脱氢酶和/或不导致其合成。可以通过本领域已知的许多不同方式实现失活。失活可以例如通过破坏编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因或由导入选择标记通过彻底缺失所述基因来实现。备选地，编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的启动子可以按该基因不再转录成mRNA的方式突变。本领域已知的失活编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的其他方式是：表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有与甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的转录物互补的核苷酸序列，从而该mRNA不再可被翻译成蛋白质；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过RNAi效应阻抑所述基因表达；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有特异性切割所述基因的转录物的活性；或表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过共抑制作用抑制所述基因的表达。可以将这些多核苷酸并入载体中，其中可以通过转化将所述载体引入微生物中以实现编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的失活。
在本发明的上下文中，术语“失活”优选地意指完全失活，即，微生物不显示甘油醛3-磷酸脱氢酶活性。这特别意指该微生物不显示甘油醛3-磷酸脱氢酶活性，这与所用的生长条件无关。
优选地，“失活”意指微生物中存在的编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因被遗传修饰，从而防止该酶的表达。这可以例如通过缺失基因或基因部分来实现，其中基因部分的缺失防止该酶表达，或通过在编码区中或在启动子区中破坏基因，其中所述破坏具有无蛋白质表达或表达功能异常蛋白质的作用。
在一个优选实施方案中，本发明的重组微生物是与未修饰的微生物相比通过减少甘油醛3-磷酸脱氢酶活性而具有削弱的EMPP的重组微生物。优选地，通过微生物的遗传修饰实现这种减少。这可以例如通过随机诱变或位点定向诱变启动子和/或酶并后续选择具有所需特性的启动子和/或酶或通过如上文所述的互补性核苷酸序列或RNAi效应来实现。下文将进一步详细描述对微生物的遗传修饰。
在本发明的上下文中，“减少的活性”意指遗传修饰的微生物中酶的、尤其甘油醛3-磷酸脱氢酶的表达和/或活性比相应未修饰的微生物低至少10%、优选地至少20%、更优选地至少30%或50%、甚至更优选地至少70%或80%并且特别优选至少90%或100%。用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。用于测量甘油醛3-磷酸脱氢酶的减少的酶活性的测定法是本领域已知的。
在本发明的上下文中，术语“微生物”指细菌，以及指真菌，如酵母，并且也指藻类和古细菌。在一个优选的实施方案中，微生物是细菌。原则上可以使用任何细菌。在本发明方法中待使用的优选细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在一个特别优选的实施方案中，细菌属于埃希氏菌属并且甚至更优选地属于大肠杆菌物种。在另一个优选实施方案中，细菌属于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)物种，或属于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)物种，或属于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)物种。
在另一个优选实施方案中，微生物是真菌，更优选地是酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyce)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或毕赤酵母属(Pichia)的真菌，并且甚至更优选地是以下物种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、Pichia torula或Pichia utilis。
在重组微生物是细菌的一个更优选实施方案中，编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因已经失活。在本发明的上下文中，失活意指微生物中存在的编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因失活，从而它们不再表达有功能的PEP依赖性PTS转运蛋白和/或不导致其合成。编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因失活应当是细菌不再能够通过PEP依赖性PTS转运蛋白运输葡萄糖。
PEP依赖性PTS转运蛋白(例如来自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))是本领域已知的。在下文实施例部分中显示失活PEP依赖性PTS转运蛋白的例子。
可以通过本领域已知的许多不同方式实现失活。失活可以例如通过破坏编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因或由导入选择标记通过彻底缺失所述基因来实现。备选地，编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因的启动子可以按该基因不再转录成mRNA的方式突变。本领域已知的失活编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因的其他方式是：表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有与PEP依赖性PTS转运蛋白基因的转录物互补的核苷酸序列，从而该mRNA不再可被翻译成蛋白质；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过RNAi效应阻抑所述基因表达；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有特异性切割所述基因的转录物的活性；或表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过共抑制作用抑制所述基因的表达。可以将这些多核苷酸并入载体中，其中可以通过转化将所述载体引入微生物中以实现编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因的失活。
术语“重组”意指本发明的微生物经遗传修饰，从而与野生型或未修饰的微生物相比含有编码如上文定义的酶的核酸分子；或从而与野生型或未修饰的微生物相比，编码如上文定义的酶的基因已经缺失。
编码如上文定义的酶的核酸分子可以单独使用或作为载体的部分使用。
所述核酸分子还可以包含与包含于该核酸分子中的多核苷酸有效连接的表达控制序列。如本说明书自始至终使用，术语“有效连接的”或“有效连接”指在一个或多个表达控制序列和多核苷酸中待表达的编码区之间以如此方式连接，从而在与表达控制序列相容的条件下实现表达。
表达包括异源DNA序列的转录，优选地，转录成可翻译的mRNA。在真菌中以及在细菌中确保表达的调节元件是本领域技术人员熟知的。它们涵盖启动子、增强子、终止信号、靶向信号等。在下文与相关载体相联系解释时进一步给出实例。
相对于核酸分子的来源和/或相对于待表达的基因，与核酸分子连接的启动子可以是同源或异源的。合适的启动子是例如自身导致组成型表达的启动子。然而，也可以使用仅在由外部影响所决定的时间点激活的启动子。在这种情况下，可以使用人工和/或化学诱导型启动子。
载体还可以包含表达控制序列，所述表达控制序列与包含于该载体中的所述多核苷酸有效连接。这些表达控制序列可以适用于确保可翻译的RNA在细菌或真菌中的转录和合成。
此外，可以通过分子生物学中常规的方法将不同突变插入多核苷酸(见例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,ColdSpring Harbor,NY,USA)，导致合成可能具有修饰的生物学特性的多肽。可构思在对氨基酸序列的修饰例如影响多肽生物学活性或其调节作用的位置处导入点突变。
另外，可以制备具有修饰的底物或产物特异性的突变体。优选地，这类突变体显示增加的活性。备选地，可以制备在不丧失底物结合活性的情况下消除其催化活性的突变体。
另外，将突变引入编码如上文定义的酶的多核苷酸中允许减少或增加所述多核苷酸编码的酶的基因表达速率和/或活性。
为了遗传地修饰细菌或真菌，可以将编码如上文定义的酶的多核苷酸或这些分子的部分引入质粒中，所述质粒允许通过DNA序列重组诱变或序列修饰。标准方法(见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,ColdSpring Harbor,NY,USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用针对片段的衔接头和接头连接DNA片段。另外，可以使用提供合适限制性位点或除去多余DNA或限制性位点的工程化措施。在其中可能插入，缺失或置换的那些情况下，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制酶作用或连接。通常而言，实施序列分析、限制酶分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。
因而，根据本发明，重组微生物可以通过遗传地修饰真菌或细菌来产生，包括将上述多核苷酸、核酸分子或载体转化至真菌或细菌中。
本发明涉及用上述多核苷酸、核酸分子或载体遗传修饰的或通过用于产生遗传修饰细菌或真菌的上述方法可获得的重组微生物，特别是细菌和真菌，并且涉及源自这类转化的细菌或真菌并且含有如上文定义的多核苷酸、核酸分子或载体的细胞。在一个优选实施方案中，将宿主细胞以它含有稳定整合至基因组中的多核苷酸的方式进行遗传修饰。
所述多核苷酸表达，从而以导致具有上文描述的任一种活性的多肽产生。不同表达系统的综述例如含于Methods in Enzymology153(1987),385-516中，引自Bitter等人(Methods in Enzymology153(1987)，516-544)并含于Sawers等人,(AppliedMicrobiology and Biotechnology46(1996),1-9)、Billman-Jacobe(Current Opinion inBiotechnology7(1996),500-4)、Hockney(Trends in Biotechnology12(1994),456-463)、Griffiths等人(Methods in Molecular Biology75(1997),427-440)中。酵母表达系统的综述例如由Hensing等人(Antonie van Leuwenhoek67(1995),261-279),Bussineau等人(Developments in Biological Standardization83(1994),13-19)、Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek62(1992),79-93)、Fleer(Current Opinion inBiotechnology3(1992),486-496)、Vedvick(Current Opinion in Biotechnology2(1991),742-745)和Buckholz(Bio/Technology9(1991),1067-1072)给出。
已经在文献中广泛描述表达载体。作为原则，它们不仅含有选择标记基因和确保在选择的宿主中复制的复制起点，还含有细菌启动子或病毒启动子，和在大多数情况下转录终止信号。在启动子和终止信号之间通常存在至少一个使得插入编码性DNA序列成为可能的限制性位点或多接头。如果在选择的宿主生物中有活性，则天然控制相应基因的转录的DNA序列可以用作启动子序列。然而，这种序列也可以交换为其他启动子序列。可以使用确保基因组成型表达的启动子和允许人为控制基因表达的诱导型启动子。文献中详述了具有这些特性的细菌启动子和病毒启动子序列。文献中充分描述了用于微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)中表达的调节序列。允许特别高地表达下游序列的启动子例如是T7启动子(Studier等人,Methods in Enzymology185(1990),60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等人,引自Rodriguez和Chamberlin(编著),Promoters,Structure andfunction;Praeger,New York,(1982),462-481;DeBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983),21-25)、lp1、rac(Boros等人,Gene42(1986),97-100)。诱导型启动子优选地用于多肽的合成。这些启动子经常导致比组成型启动子更高的多肽产量。为了获得最佳多肽量，经常使用一种两阶段方法。首先，将宿主细胞在最佳条件下培养直至相对高的细胞密度。在第二步骤中，根据使用的启动子的类型，诱导转录。在这个方面，tac启动子是特别合适的，所述tac启动子可以由乳糖或IPTG(=异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导(deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80(1983),21-25)。文献中也描述了转录的终止信号。
可以通过(例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A LaboratoryManual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA；Methods in Yeast Genetics,ALaboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990中描述的)标准方法，实施用本发明的多核苷酸或载体转化或基因工程化的宿主细胞。宿主细胞在满足所用具体宿主细胞要求(尤其在pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等方面)的营养培养基中培养。
在本发明的另一个方面，重组微生物进一步的特征在于它能够将乙酰-CoA转化成丙酮。用于提供这种重组微生物的方法例如在EP2295593中公开。在本发明的上下文中，术语“能够将乙酰-CoA转化成丙酮”意指生物/微生物因存在下述酶而具有在细胞内部产生丙酮的能力，所述酶提供允许从乙酰-CoA产生丙酮的酶活性。
丙酮由某些微生物产生，如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)，解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、多粘芽胞杆菌(Bacillus polymyxa)和恶臭假单胞菌。在丙酮丁醇梭菌中最佳地表征丙酮的合成。它始于其中两分子乙酰-CoA缩合成乙酰乙酰-CoA的反应(反应步骤1)。该反应由乙酰-CoA乙酰转移酶(EC2.3.1.9)催化。随后通过其中乙酸或丁酸也导致乙酰-CoA或丁酰-CoA产生的反应(反应步骤2)，乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸。该反应由例如乙酰乙酰CoA转移酶(EC2.8.3.8)催化。乙酰乙酰CoA转移酶已知来自各种生物，例如来自其中该酶由atoAD基因编码的大肠杆菌或来自其中该酶由ctfAB基因编码的丙酮丁醇梭菌。然而，其他酶也可以催化这个反应，例如3-含氧酸CoA转移酶(EC2.8.3.5)或琥珀酸CoA连接酶(EC6.2.1.5)。
最后，乙酰乙酸通过乙酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.4)催化的脱羧步骤(反应步骤3)转化成丙酮。
上述反应步骤1和2和催化它们的酶不是丙酮合成特有的，并且可以存在于多种生物中。相反地，由乙酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.4)催化的反应步骤3仅存在于能够产生丙酮的那些生物中。
在一个优选实施方案中，本发明的重组微生物是天然具有产生丙酮能力的微生物。因此，优选地，该微生物属于梭菌属、芽孢杆菌属或假单胞菌属，更优选地属于以下物种：丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽胞杆菌或恶臭假单胞菌。
在另一个优选实施方案中，本发明的重组微生物是源自下述生物/微生物的微生物，所述生物/微生物天然地不产生丙酮，但是已经被遗传修饰，从而产生丙酮，即，通过引入允许在微生物中产生丙酮所必需的基因。原则上，任何微生物可以按这种方式进行遗传修饰。上文已经描述了负责合成丙酮的酶。编码相应酶的基因是本领域已知的并且可以用遗传修饰给定的微生物来产生丙酮。如上文描述，丙酮合成的反应步骤1和2天然地存于大多数生物中。然而，反应步骤3是特征性的并且对于丙酮合成至关重要。因此，在一个优选的实施方案中，源自天然不产生丙酮的微生物的遗传修饰微生物经修饰，从而含有编码酶(例如，乙酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.4))的核苷酸序列，所述酶催化乙酰乙酸通过脱羧转化成丙酮。来自编码这种酶的几种生物的核苷酸序列是本领域已知的，例如adc基因来自丙酮丁醇梭菌(Uniprot登录号P23670和P23673)、拜氏梭菌(梭菌MP；Q9RPK1)、巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)(Uniprot登录号P81336)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)(菌株BTAi1/ATCCBAA-1182；Uniprot登录号A5EBU7)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)(ATCC10399A9LBS0)、鼻疽伯克霍尔德菌(Uniprot登录号A3MAE3)、鼻疽伯克霍尔德菌FMH A5XJB2，洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)(Uniprot登录号A0B471)、Burkholderia ambifaria(Uniprot登录号Q0b5P1)、Burkholderiaphytofirmans(Uniprot登录号B2T319)、伯克霍尔德菌属物种(Burkholderia spec.)(Uniprot登录号Q38ZU0)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)(Uniprot登录号B2TLN8)、皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)(Uniprot登录号B2UIG7)、黑胡桃链霉菌(Streptomyces nogalater)(Uniprot登录号Q9EYI7)、阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)(Uniprot登录号Q82NF4)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)(Uniprot登录号Q5ZXQ9)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)(Uniprot登录号Q1WVG5)、红球菌属物种(Rhodococcus spec.)(Uniprot登录号Q0S7W4)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)(Uniprot 登录号Q890G0)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(Uniprot登录号Q1M911)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(Uniprot登录号Q03B66)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)(Uniprot登录号Q0BLC9)、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythreae)(Uniprot登录号A4FKR9)、Korarchaeum cryptofilum(Uniprot登录号B1L3N6)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacins)(Uniprot登录号A7Z8K8)、异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)(Uniprot登录号Q8NJQ3)、冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)(Uniprot登录号C3ML22)和土拉热弗朗西丝氏菌全北区亚种(Francisella tularensis subsp.holarctica)(菌株OSU18)。
更优选地，微生物经遗传修饰，从而用编码酶的核酸分子转化，所述酶能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤2，即乙酰乙酰CoA转化成乙酰乙酸。
甚至更优选地，微生物经遗传修饰，从而用编码酶的核酸分子转化，所述酶能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤1，即两分子乙酰CoA缩合成乙酰乙酰CoA。
在一个特别优选的实施方案中，微生物经遗传修饰，从而用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤1的酶的核酸分子并且用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤2的酶的核酸分子或者用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤1的酶的核酸分子转化，并且用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤3的酶的核酸分子转化，或者用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤2的酶的核酸分子转化，并且用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤3的酶的核酸分子转化，或用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤1的酶的核酸分子转化以及用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤2的酶的核酸分子转化以及用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤3的酶的核酸分子转化。
用于制备文提到的遗传修饰微生物的方法是本领域熟知的。因而，通常，微生物用允许相应酶在微生物中表达的DNA构建体转化。这种构建体通常包含与允许在相应宿主细胞中转录和翻译的调节序列(例如启动子和/或增强子和/或转录终止子和/或核糖体结合位点等)连接的所讨论编码序列。现有技术已经描述了已经被遗传修饰从而能够产生丙酮的微生物。具体而言，已经将来自例如丙酮丁醇梭菌的基因引入大肠杆菌中，因而允许在大肠杆菌(天然不产生丙酮的细菌)中合成丙酮(Bermejo等人,Appl.Environ.Microbiol.64(1998);1079-1085；Hanai等人,Appl.Environ.Microbiol.73(2007),7814-7818)。具体而言，Hanai等人(见上述引文)显示引入编码乙酰乙酸脱羧酶(如来自丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脱羧酶)的核酸序列足以在大肠杆菌中实现丙酮产生，表明大肠杆菌中催化上述反应步骤1和2的内源酶(即，大肠杆菌atoB和atoAD基因的表达产物)足以为丙酮产生提供底物。
在本发明的另一个方面，重组微生物进一步的特征在于它能够将乙酰-CoA转化成丙酮和将丙酮转化成异丁烯。用于提供这种重组微生物的方法例如在EP-A2295593(EP09170312)、WO2010/001078和EP10188001公开。
在本发明的另一个方面，重组微生物的特征在于它能够将乙酰-CoA转化成丙酮和将丙酮转化成丙烯。用于提供这种重组微生物的方法例如在Hanai等人,Appl.Environ.Microbiol.73(2007),7814-7818中公开。
本领域技术人员将认识到，进一步对本发明微生物的遗传修饰可能导致改善本发明的微生物将原料转化成产物的功效。例如，天然微生物常产生产物如甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、乙醇、丙三醇、2,3-丁二醇、甲基乙二醛和氢；它们均将损害从糖产生例如丙酮、异丁烯或丙烯。可以通过消除或减少导致这类不想要的副产物产生的关键酶活性实现消除或相当程度地减少它们。这类活性包括但不限于由以下组成的组：
-乙酰-CoA+甲酸=CoA+丙酮酸(例如，由甲酸C-乙酰转移酶催化，也称作丙酮酸甲酸裂合酶(EC2.3.1.54)；对于大肠杆菌-pflB，NCBI-GeneID：945514)；
-ATP+乙酸=ADP+乙酰磷酸(例如，由乙酸激酶(EC2.7.2.1)催化；对于大肠杆菌-ackA，NCBI-GeneID：946775)；
-(R)-乳酸+NAD+=丙酮酸+NADH+H+(例如，由L-乳酸脱氢酶(EC1.1.1.28)催化；对于大肠杆菌-ldhA，NCBI-GeneID：946315)；
-磷酸+草酰乙酸=磷酸烯醇式丙酮酸+HCO3 -(例如，由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EC4.1.1.31)催化；对于大肠杆菌-ppc，NCBI-GeneID：948457)；
-ATP+草酰乙酸=ADP+磷酸烯醇式丙酮酸+CO2(例如，由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(ATP)(EC4.1.1.49)催化；对于大肠杆菌-pck，NCBI-GeneID：945667)；
-琥珀酸+接纳体=延胡索酸+还原型接纳体(例如，由琥珀酸脱氢酶(EC1.3.99.1)催化；对于大肠杆菌-包含frdA和frdB，NCBI-GeneID分别为：948667和948666)；
-2-氧代羧酸(例如丙酮酸)=醛(例如乙醛+CO2(例如，由丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.1)催化)；
-乙醛+CoA+NAD+=乙酰-CoA+NADH+H+(例如，由乙醛脱氢酶(乙酰化)(EC1.2.1.10)催化；对于大肠杆菌-adhE，NCBI-GeneID：945837)；
-sn-甘油3-磷酸+NAD(P)+=磷酸甘油酮+NAD(P)H+H+(例如，由甘油-3-磷酸脱氢酶催化[NAD(P)+](EC1.1.1.94)催化；对于大肠杆菌-gpsA，NCBI-GeneID：948125)；
-2丙酮酸=2-乙酰乳酸+CO2(例如，由乙酰乳酸合酶(EC2.2.1.6)催化；对于大肠杆菌-ilvH和ilvI，NCBI-GeneID分别为：947267和948793)；
-磷酸甘油酮=甲基乙二醛+磷酸(例如，由甲基乙二醛合酶(EC4.2.3.3)催化；对于大肠杆菌-mgsA，NCBI-GeneID：945574)；和
-甲酸+H+=CO2+H2(例如，由甲酸氢解酶催化(EC1.2.1.2与EC1.12.1.2一起)；对于大肠杆菌-fdhF(EC1.2.1.2)，NCBI-GeneID：948584)。
因而，在一个优选实施方案中，本发明微生物的特征在于消除或减少上文所列的一种或多种酶活性。
本领域技术人员还将认识到，对本发明微生物中调节元件的遗传修饰可能导致改善本发明的微生物将原料转化成产物的功效。在大肠杆菌内部，这类遗传修饰包括但不限于由以下组成的组：
-缺失fnr基因(NCBI-GeneID：945908)，厌氧生长的总体调节物；和
-缺失rpoS基因(NCBI-GeneID：947210)，RNA聚合酶，sigma S(sigma38)因子。
因而，在另一个优选实施方案中，本发明的微生物显示这些缺失的至少一个。
本发明的又一个方面是本发明的重组微生物用于将葡萄糖转化成乙酰-CoA的用途。乙酰CoA(也称作乙酰辅酶A)在化学结构上是辅酶A(巯基)和乙酸之间的硫酯并且是产生有用代谢物的重要前体分子。乙酰-CoA随后可以由重组微生物进一步转化成有用代谢物如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、琥珀酸和聚羟丁酸。
本发明的另一个方面是本发明重组微生物的用途，所述重组微生物能够将乙酰-CoA转化成丙酮，用于将葡萄糖转化成丙酮。
本发明的又一个方面是本发明重组微生物的用途，所述重组微生物能够将乙酰-CoA转化成丙酮并将丙酮转化成异丁烯，用于将葡萄糖转化成异丁烯。
再次，本发明的又一个方面是本发明重组微生物的用途，所述重组微生物能够将乙酰-CoA转化成丙酮并将丙酮转化成丙烯，用于将葡萄糖转化成丙烯。
因此，本发明也涉及从葡萄糖产生丙酮和/或异丁烯和/或丙烯的方法，其中在允许产生丙酮和/或异丁烯和/或丙烯的条件下培育上述重组微生物并且其中分离丙酮和/或异丁烯和/或丙烯。微生物在允许酶促反应发生的合适培养条件下培育。特定培养条件取决于所用的特定微生物，但是这为本领域技术人员熟知。通常以如此方式选择培养条件，所述方式允许编码用于相应反应的酶的基因的表达。多种方法是本领域技术人员已知的，以便在某些培养阶段改善和细微调节某些基因的表达，如通过化学诱导物或通过温度变动诱导基因表达。
在另一个优选实施方案中，本发明的方法还包括步骤：收集气态产物，特别地异丁烯或丙烯，从反应中脱气，即回收例如从培养物中脱气的产物。因此在一个优选的实施方案中，在反应期间收集气体形式的异丁烯或丙烯的系统存在下实施该方法。
作为事实，短链烯如异丁烯和丙烯在室温和大气压呈气态。本发明的方法因此不需要从液体培养基提取产物，所述提取是一个以工业规模进行时总是非常昂贵的步骤。可以根据本领域技术人员已知的何方法进行气体烃的抽取和储存以及它们可能的后续物理分离和化学转化。
本发明参考以下非限制性图和实施例进一步描述。
图1显示利用一种或两种磷酸转酮酶活性EC4.1.2.9和EC4.1.2.22，通过磷酸转酮酶途径从葡萄糖-6-磷酸产生乙酰-CoA的两种方案。
实施例
一般方法和材料
连接和转化的方法是本领域熟知的。适用于以下实施例中的技术可以在SambrookJ.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989,和Sambrook J.,上文中找到。
适于维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域熟知的。适用于以下实施例中的技术可以在Manual of Methods for General Bacteriology (Philipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Krieg和G.Briggs Philips编著)中找到。
除非另外说明，否则用于细菌细胞生长和维持的全部试剂和材料均从Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO)获得。
表1：所用的和构建的质粒
表2：所用的和构建的菌株
FRT：FLP识别靶
表3：细菌染色体区域、所用基因、质粒区域的序列
表4：引物序列
用于基因敲除的染色体整合
为了整合DNA至染色体的特定区域内，要求插入的DNA与所靶向的染色体位点具有同源性并要求具有选择标记。如果可以在整合后容易地移除该标记，则这是有利的。FRT/Flp重组酶系统提供移除标记的机制。FRT位点是Flp重组酶的识别位点。Flp是位点特异性重组酶，其从同向重复识别位点切除间插DNA。
将含有所靶向染色体位点的同源臂并编码旁侧分布有FRT位点的选择标记的整合盒(Datsenko KA.和Wanner BL,Proceedings of the National Academy of Sciences,2000,第97卷，第12期，第6640-6645页)转化至携带pKD46的靶细胞中(Datsenko KA.和Wanner BL,Proceedings of the National Academy of Sciences,2000,第97卷，第12期，第6640-6645页)。通过在抗生素存在下培育细胞选择成功的整合子。随后，从细胞消除pKD46并且随后将重组酶质粒引入整合子以便移除抗生素基因。含有FRT盒的菌株用编码Flp重组酶的pCP20质粒转化(Datsenko KA.和Wanner BL,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2000,第97卷，第12期，第6640-6645页)。在移除整合的标记后，从菌株消除重组酶质粒。
实施例1:菌株GBE1014的构建
该章节的目的是描述命名为GBE1014的大肠杆菌菌株的构建，对于所述菌株，通过缺失PTS转运基因使PEP依赖性葡萄糖摄入失活，使得ATP依赖性葡萄糖摄入成为可能，通过缺失磷酸果糖激酶基因使Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)失活，并且通过缺失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因使戊糖磷酸途径(PPP)失活。
构建始于菌株GBE0901。GBE0901是大肠杆菌(Migula)Castellani和Chalmers，菌株MG1655(ATCC#700926)，其中从bp2531736至2533865(NCBI基因组数据库)的原始核苷酸序列包括ptsH和ptsI基因，由SEQ SQ0001替换。这种缺失影响PEP依赖性磷酸转移酶系统(PTS)，导致菌株GBE0901中PEP依赖性葡萄糖摄入失活。通过PCR证实ptsHI基因的缺失，并且使用寡核苷酸0635和0638(分别作为SEQ RC0001和RC0002给出)作为引物。使用相同引物，对所产生的0.4Kbp PCR产物测序。
在LB培养基中培育菌株GBE0901并且使GBE0901细胞变成电感受态。电感受态GBE0901细胞用命名为pKD46(Datsenko KA.和Wanner BL,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2000,第97卷，第12期，第6640-6645页)的质粒转化并随后铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。平板在30℃温育过夜。用质粒pKD46转化GBE0901细胞产生了菌株GBE0902。
质粒pGBE0688提供置于其自身启动子控制下的壮观霉素抗性基因。在表3中显示这个抗性盒的序列(SEQ SQ0002)。
使用质粒pGBE0688作为模板，用引物0633和0634(分别作为SEQ RC0003和RC0004给出)产生1.3Kbp PCR产物。将这个1.3Kbp PCR产物转化至电感受态GBE0902细菌中并且随后将转化混合物铺种在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上并在37℃温育过夜以产生菌株GBE0903。在菌株GBE0903中，缺失包含zwf、edd和eda基因的DNA序列。这些基因分别编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶。包括zwf、edd和eda基因的这个缺失的DNA序列由壮观霉素抗性盒替换。为了检验zwf、edd和eda基因的有效缺失，用引物1036和1037(分别作为SEQ RC0005和RC0006给出)进行PCR扩增。获得最终的1.9Kbp PCR产物。用相同引物1036和1037对这种1.9Kbp PCR产物测序。
将菌株GBE0903随后铺种在LB平板上，在37℃温育并且在葡萄糖作为碳源(2g/L)的MS平板(Richaud C.,Mengin-Leucreulx D.,Pochet S.,Johnson EJ.,Cohen GN.和Marlière P;The Journal of Biological Chemistry;1993；第268卷；第36期；第26827-26835页)上筛选分离的菌落。在37℃温育48小时后，菌落变得可见并且将菌落转移至供给葡萄糖(2g/L)的MS液体培养基。这种37℃温育过夜引起pKD46质粒的丢失。一个分离株具有7小时的倍增时间并且命名为GBE1000。
使菌株GBE1000成为电感受态。GBE1000电感受态细胞用质粒pKD46转化，并且随后铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。平板在30℃温育过夜。用质粒pKD46转化GBE1000细胞产生了菌株GBE1001。
质粒pGBE0687提供置于其自身启动子控制下的阿泊拉霉素抗性基因。在表3中显示这个抗性盒的序列(SEQ SQ0003)。
使用质粒pGBE0687作为模板，用引物0629和0630(分别作为SEQ RC0007和RC0008给出)产生1.2Kbp PCR产物。将所产生的1.2Kbp PCR产物转化至电感受态GBE1001细菌中并且将转化混合物铺种在含有阿泊拉霉素(50μg/ml)的LB平板上。平板随后在37℃温育过夜以产生命名为GBE1005_pKD46的新菌株。在菌株GB1005_pKD46中，磷酸果糖激酶基因pfkA缺失并且由阿泊拉霉素抗性盒替换。为了检验pfkA基因的缺失发生，用引物0619和0620(分别作为SEQ RC0009和RC0010给出)进行PCR扩增。用相同引物0619和0620对这种1.7 Kbp PCR产物测序。为了检验质粒pKD46的丢失，将菌株GBE1005_pKD46铺种在LB平板上并且在42℃温育过夜。通过将分离的菌落铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜并在LB平板上于37℃温育过夜，验证质粒pKD46的丢失。所产生的菌株在37℃温育的LB平板上生长并且命名为GBE1005。GBE1005细胞不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
壮观霉素盒位于zwf_edd_eda基因的相应基因座处并且阿泊拉霉素盒位于pfkA基因的相应基因座处。为了切除含有壮观霉素抗性基因和阿泊拉霉素抗性基因的抗性盒，菌株GBE1005用质粒pCP20(Datsenko KA.和Wanner BL,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2000,第97卷，第12期，第6640-6645页)转化以获得菌株GBE1005_p。在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜后，将分离的菌落在供给氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上再划线并在30℃温育过夜。随后将分离的菌落铺种在LB平板上并且在42℃温育过夜，这导致pCP20质粒的丢失。随后，为了检验两个抗性盒的有效切除和pCP20质粒的丢失，将分离的菌落在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上划线，在37℃温育过夜；在含有阿泊拉霉素(50μg/mL)的LB平板上划线，在37℃温育过夜；在含有氨苄青霉素(100μg/m)的LB平板上划线，在30℃温育过夜；并且在LB平板上划线，在37℃温育过夜。所产生的菌株在37℃温育的LB平板上生长并且命名为GBE1006。GBE1006细胞不在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上、不在含有阿泊拉霉素(50μg/mL)的LB平板上和不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
使菌株GBE1006成为电感受态，并且GBE1006电感受态细胞用质粒pKD46转化。随后将转化体细胞铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上并且将平板在30℃温育过夜以获得命名为GBE1010的新菌株。通过使用质粒pGBE0688作为模板并使用寡核苷酸0631和0632(分别作为SEQ RC0011和RC0012给出)作为引物产生PCR产物。将所产生的1.3Kbp PCR产物转化至电感受态GBE1010细菌中并且将转化混合物铺种在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上。平板在37℃温育过夜以产生菌株GBE1014_pKD46。在菌株GBE1014_pKD46中，磷酸果糖激酶基因pfkB缺失并且缺失的DNA序列由含有壮观霉素抗性基因的盒替换。为了检验pfkB基因的缺失发生，用引物0621和0622(分别作为SEQ RC0013和RC0014给出)进行PCR扩增。通过使用相同引物0621和0622对这种最终2.2Kbp PCR产物测序。
为了引起质粒pKD46的丢失，将菌株GBE1014_pKD46铺种在LB平板上并且将平板在42℃温育过夜。通过将分离的菌落铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜并在LB平板上于37℃温育过夜，检验质粒pKD46的丢失。所产生的在37℃温育的LB平板上生长的菌株命名为GBE1014。GBE1014细胞不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
实施例2：菌株GBE0929的构建
将菌株GBE0901在37℃铺种在LB平板上并且在葡萄糖(2g/L)作为碳源的MS平板上筛选分离的菌落。在37℃温育48小时后，菌落变得可见。一个分离株具有5小时的倍增时间并且命名为GBE0929。
实施例3：菌株GBE1344的构建
构建始于命名为GBE0129的菌株。GBE0129是MG1655大肠杆菌细菌(ATCC#700926)。
在LB培养基中培育菌株GBE0129并且使GBE0129细胞变成电感受态。电感受态GBE0129细胞用质粒pKD46转化，并且随后将转化体铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。平板随后在30℃温育过夜以产生命名为GBE0170的新菌株。
通过使用质粒pGBE0687作为模板并使用寡核苷酸0633和0634(分别作为SEQRC0003和RC0004给出)作为引物产生PCR产物。将所产生的1.2Kbp PCR产物转化至电感受态GBE0170细菌中并且将转化混合物铺种在含有阿泊拉霉素(50μg/ml)的LB平板上。平板在37℃温育过夜。这种温育触发pKD46质粒的丢失并导致产生命名为GBE1339的新菌株。在菌株GBE1339中，由zwf基因编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、由edd基因编码的6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和由eda基因编码的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶无活性。zwf、edd和eda基因依次缺失并且由含有阿泊拉霉素抗性基因的盒替换。为了检验zwf、edd和eda基因的缺失是有效的，用引物1036和1037(分别作为SEQ RC0005和RC0006给出)进行PCR扩增。用相同引物1036和1037对这种1.8Kbp PCR产物测序。
使菌株GBE1339成为电感受态，并且GBE1339电感受态细胞用质粒pKD46转化。转化体随后铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。平板在30℃温育过夜以产生菌株GBE1340。通过使用质粒pGBE0688作为模板并使用寡核苷酸0629和0630(分别作为SEQRC0007和RC0008给出)作为引物，产生PCR产物。将所产生的1.3Kbp PCR产物转化至电感受态GBE1340细菌中并且将转化混合物铺种在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上。平板在37℃温育过夜以产生菌株GBE1341_pKD46。在菌株GB1341_pKD46中，编码磷酸果糖激酶的pfka基因由壮观霉素抗性基因替换。为了检验pfkA基因的缺失是有效的，用引物0619和0620(分别作为SEQ RC0009和RC0010给出)进行PCR扩增。用相同引物0619和0620对这种1.8Kbp PCR产物测序。为了引起菌株GBE1341_pKD46丢失质粒pKD46，将GBE1341_pKD46细胞铺种在LB平板上并且在42℃温育。通过将分离的菌落铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜并在LB平板上于37℃温育过夜，验证质粒pKD46的丢失。所产生的在37℃温育的LB平板上生长的菌株是GBE1341。GBE1341不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
为了切除含有阿泊拉霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因的抗性盒(分别位于前述zwf_edd_eda和pfkA基因的基因座内)，菌株GBE1341用质粒pCP20转化以获得命名为GBE1341_p的新菌株。在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜后，将分离的菌落在供给氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上再划线以便在30℃另外温育过夜。随后将分离的菌落铺种在LB平板上并且在42℃温育过夜。这种42℃温育触发pCP20质粒的丢失。最终为了检验两个抗性盒的有效切除和pCP20质粒的丢失，将分离的菌落在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上划线并且在37℃温育过夜；在供给有阿泊拉霉素(50μg/ml)的LB平板上划线并且在37℃温育过夜；在含有氨苄青霉素(100μg/m)的LB平板上划线并且在30℃温育过夜；和在LB平板上划线并且在37℃温育过夜。产生的在37℃温育的LB平板上生长的菌株命名为GBE1342。GBE1342细胞不在供给有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上、不在供给有阿泊拉霉素(50μg/mL)的LB平板上和不在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
使菌株GBE1342成为电感受态，并且GBE1342细胞用质粒pKD46转化。转化体随后铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上并且在30℃温育过夜以获得菌株GBE1343。通过使用质粒pGBE0688作为模板并使用寡核苷酸0631和0632(分别作为SEQ RC0011和RC0012给出)作为引物，产生PCR产物。将所产生的1.3Kbp PCR产物转化至电感受态GBE1343细菌中并且将转化混合物铺种在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上，随后在37℃温育过夜。产生一个新菌株并将其命名为GBE1344_pKD46。在菌株GBE1344_pKD46中，编码磷酸果糖激酶的pfkb基因缺失并且由壮观霉素抗性盒替换。为了检验pfkB基因的缺失是有效的，用引物0621和0622(分别作为SEQ RC0013和RC0014给出)进行PCR扩增。对获得的2.2Kbp PCR产物用相同引物0621和0622测序。
为了引起质粒pKD46的丢失，将菌株GBE1344_pKD46铺种在LB平板上并且在42℃温育过夜。通过将分离的菌落铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜并在LB平板上于37℃温育过夜，检验质粒pKD46的丢失。产生的在37℃温育的LB平板上生长的菌株命名为GBE1344。GBE1344细胞不在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
实施例4：质粒pGBE0457的构建
该章节的目的是描述构建允许在大肠杆菌菌株中表达来自乳酸乳球菌的磷酸转酮酶YP_003354041.1的质粒。
质粒pGBE0123是质粒pUC18(New England Biolabs)的修饰形式并且含有修饰的多克隆位点(MCS)。来自pUC18的原始MCS(从HindIII限制性位点至EcoRI限制性位点)由序列SQ0004替换(表3)。质粒pGB0123允许在Plac启动子的控制下表达两种重组蛋白。
乳酸乳球菌磷酸转酮酶基因由(Invitrogen)进行密码子优化以便在大肠杆菌中最佳表达。此外，在基因的5'位置处添加His标签并且在基因的3'位置处添加额外的终止密码子(SQ0005)。该基因构建体旁侧分布有PacI和NotI限制性位点并且在质粒pGBE0421内部提供。
为了克隆实验，使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)，凝胶纯化PCR产物和限制性片段。根据制造商的推荐使用限制性酶和T4DNA连接酶(New England Biolabs,Beverly,MA)。
质粒pGBE0421用限制性酶PacI和NotI消化以产生2.6Kbp产物。pGB0123质粒也用限制性酶PacI和NotI消化并且连接至2.6Kbp限制性片段。对所产生的质粒(pGBE0457)用引物1061、1062、1063，1064和1065测序(分别作为SEQ RC0015、RC0016、RC0017，RC0018和RC0019给出)。
在使用His捕获(Protino Ni-IDA1000试剂盒，Macherey Nagel)纯化重组蛋白后，在蛋白质凝胶上检验来自乳酸乳球菌的磷酸转酮酶的表达。根据制造商的推荐进行纯化。采用纯化酶，还进行酶测定法以便在两种不同底物上(木酮糖-5-磷酸和果糖-6-磷酸)检测磷酸转酮酶活性。实验方法与Leo Meile等人的那种方法相同(Journal of Bacteriology,2001年5月,第2929-2936页)，除了溶液的pH是7.5并且添加1mM MgCl2之外。对于这种酶测定法，将10μg纯化的蛋白质添加至75μl反应。对于D-木酮糖-5-磷酸和D-果糖-6-磷酸，比活性(μmol形成的乙酰-P/分钟/mg蛋白质)分别是2815μmol/分钟/mg蛋白质和1941μmol/分钟/mg蛋白质。
实施例5：质粒pGBE0096的构建
负责在大肠杆菌中产生丙酮的质粒的构建基于Bermejo LL.,Welker NE.和Papoutsakis ET.,Applied and Environmental Microbiology,1998,第64卷，第3期，第1076-1085页中描述的质粒构建。
订购菌株丙酮丁醇梭菌(ATCC824)。来自这个菌株的基因组DNA由细菌染色体和命名为pSOL1的质粒构成。
从pSOL1质粒用引物0070和0071(分别作为SEQ RC0020和RC0021给出)PCR扩增出ctfA和ctfB基因。在PCR产物的5'末端引入BamHI限制性位点并且在PCR产物的3'末端引入EcoRV限制性位点。所产生的1.3Kbp PCR产物用限制性酶BamHI和EcoRV消化，随后与也用限制性酶BamHI和EcoRV消化的pGB0689(pBluescript II噬菌粒，Agilent Technologies)连接。对所产生的质粒(pGBE0690)用引物1066和1067测序(分别作为SEQ RC0022和RC0023给出)。
从pSOL1质粒用引物0072和0073(分别作为SEQ RC0024和RC0025给出)PCR扩增出adc基因和基因终止子。PCR扩增导致在5'末端插入EcoRV限制性位点并在3'末端插入Sal I限制性位点。所产生的0.8Kbp PCR产物用限制性酶EcoRV和SalI消化。PGBE0690质粒也用限制性酶EcoRV和SalI消化并且随后与0.8Kbp PCR产物连接。对所产生的质粒(pGBE0691)用引物1066、1067、1068和1069(分别作为SEQ RC0022、RC0023、RC0026和RC0027给出)测序。
质粒pGBE0691用限制性酶BamHI和SalI消化以产生2.2Kbp产物。2.2Kbp限制性片段含有ctfA、ctfB和adc基因。pGBE0051质粒(pUC19，New England Biolabs)也用限制性酶BamHI和Sal I消化并且随后与2.2Kbp限制性片段连接。对所产生的质粒(pGBE0692)用引物1066、1067、1068和1069(分别作为SEQ RC0022、RC0023、RC0026和RC0027给出)测序。
用引物0074和0075(分别作为SEQ RC0028和RC0029给出)PCR扩增来自丙酮丁醇梭菌(ATCC824)的thl基因和其相应的thl启动子。PCR扩增导致在5'末端插入KpnI限制性位点并在3'末端插入BamHI限制性位点。所产生的1.4Kbp PCR产物用限制性酶KpnI和BamHI消化，质粒pGBE0692同样用限制性酶KpnI和BamHI消化。将消化的pGBE0692质粒与1.4Kbp PCR产物连接。对所产生的质粒pGBE0693用引物1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073和1074(分别作为SEQ RC0022、RC0023、RC0026、RC0027、RC0030、RC0031、RC0032、RC0033和RC0034给出)测序。
质粒pGBE0124是质粒pSU18的修饰形式(Borja Bartolomé,Yolanda Jubete,Eduardo Martinez和Fernando de la Cruz,Gene,1991,第102卷,第1期,第75-78页)并且它含有修饰的多克隆位点(MCS)。来自pSU18的原始MCS(从EcoRI限制性位点至HindIII限制性位点)由序列SEQ SQ0006替换(表3)。质粒pGB0124允许在Plac启动子的控制下两种重组蛋白的表达。
质粒pGBE0693用限制性酶KpnI和SalI消化以产生3.5Kbp产物。pGBE0124质粒也用限制性酶KpnI和SalI消化并且随后连接至3.5Kbp限制性片段。对所产生的质粒(pGBE0096)用引物1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073和1074(分别作为SEQ RC0022、RC0023、RC0026、RC0027、RC0030、RC0031、RC0032、RC0033和RC0034给出)测序。
实施例6：通过菌株GBE1346和GBE1347产生丙酮
对质粒转化入有关菌株的描述
使菌株GBE0129成为电感受态，并且GBE0129电感受态细胞用质粒pGBE0096转化。随后将转化体铺种在含有氯霉素(25μg/ml)的LB平板上并且将平板在30℃温育过夜以产生菌株GBE0329。
使菌株GBE1344成为电感受态，并且GBE1344电感受态细胞用质粒pGBE0457和pGBE0096这两种质粒转化。转化体随后铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(25μg/ml)的LB平板上。平板在30℃温育过夜以获得菌株GBE1345。
在含有葡萄糖作为碳源(2g/L)和氯霉素(25μg/ml)的MS平板上筛选来自菌株GBE0329和GBE1345的分离的菌落。这些平板在30℃温育以分别获得菌株GBE1346和GBE1347。在30℃温育4日后，将菌落转移至含有葡萄糖(2g/L)和氯霉素(25μg/ml)的MS液体培养基并在30℃温育3日。
烧瓶条件的描述
对于发酵实验，使用含有200mM磷酸氢二钾(替代50mM磷酸氢二钾)的MS培养基。产生的培养基命名为MSP。
400ml含有葡萄糖(10g/L)和氯霉素(25μg/ml)的MSP液体培养基用菌株GBE1346的预培养物或用菌株GBE1347的预培养物接种。初始OD600是0.1。在螺盖密封的500ml瓶中在30℃，速度170转/分钟温育400ml培养物。在1日、2日、3日、6日、7日和8日后取得2ml等分试样。对于每份等分试样样品，在10秒期间打开所述瓶。
分析方法的描述
过滤等分试样，并且用葡萄糖(HK)分析试剂盒(GAHK20-1KT，Sigma)根据制造商的推荐，确定葡萄糖浓度。使用气相色谱仪450-GC(Bruker)和以下程序，通过气相色谱确定丙酮浓度：
-柱：DB-WAX(123-7033，Agilent Technologies)
-注射器分流/不分流：T°=250℃
-炉：
○80℃持续6分钟
○每分钟10℃直至220℃
○220℃持续7分钟
○柱流速：1.5ml/分钟(氮气)
-检测器FID：T°=300℃
结果
菌株GBE1347产生的[丙酮](mM)/消耗的[葡萄糖](mM)比菌株GBE1346高。
实施例7：通过菌株GBE1350和GBE1351产生丙酮
对质粒转化入有关菌株的描述
使菌株GBE0929成为电感受态，并且GBE0929电感受态细胞用命名为pGBE0096的质粒转化。随后将转化体铺种在供给有氯霉素(25μg/ml)的LB平板上并且将平板在30℃温育过夜以获得菌株GBE1348。
使菌株GBE1014成为电感受态，用质粒pGBE0457和pGBE0096这两种质粒转化。随后将转化体铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(25μg/ml)的LB平板上并且将平板在30℃温育过夜以获得菌株GBE1349。
在含有葡萄糖作为碳源(2g/L)和氯霉素(25μg/ml)的MS平板上筛选来自菌株GBE1348和GBE1349的分离的菌落。这些平板在30℃温育4日以分别获得菌株菌株GBE1350和GBE1351。将分离的菌落转移至含有葡萄糖(2g/L)和氯霉素(25μg/ml)的MS液体培养基。将GBE1350和GBE1351细胞在30℃孵育。
烧瓶条件的描述
400ml含有葡萄糖(10g/L)和氯霉素(25μg/ml)的MSP培养基用菌株GBE1350的预培养物或用菌株GBE1351的预培养物接种。初始OD600是0.1。在螺盖密封的500ml瓶中在30℃，速度170转/分钟温育400ml培养物。在1日、2日、3日、6日、7日和8日后取得2ml等分试样。对于每份等分试样样品，在10秒期间打开所述瓶。
分析方法的描述
过滤等分试样，并且用葡萄糖(HK)分析试剂盒(GAHK20-1KT，Sigma)根据制造商的推荐，确定葡萄糖浓度。使用气相色谱仪450-GC(Bruker)和以下程序，通过气相色谱确定丙酮浓度：
‐柱：DB-WAX(123-7033，Agilent Technologies)
‐注射器分流/不分流：T°=250℃
‐炉：
○80℃持续6分钟
○每分钟10℃直至220℃
○220℃持续7分钟
○柱流速：1.5ml/分钟(氮气)
‐检测器FID：T°=300℃
结果
菌株GBE1351产生的[丙酮](mM)/消耗的[葡萄糖](mM)比菌株GBE1350高。
结果I的表
实施例8：质粒pGBE1020的构建
该章节的目的是描述构建允许在大肠杆菌菌株中表达来自乳酸乳球菌的磷酸转酮酶YP_003354041.1并还允许产生丙酮的质粒。
从pGBE0421质粒用引物1516和1517(分别作为SEQ RC0035和RC0036给出)PCR扩增出乳酸乳球菌磷酸转酮酶基因。
PCR扩增导致在5'末端插入EcoRI限制性位点和核糖体结合位点(RBS)并在3'末端插入KpnI限制性位点。所产生的2.5Kbp PCR产物用限制性酶EcoRI和KpnI消化。pGBE0123质粒也用限制性酶EcoRI和KpnI消化并且随后与2.5Kbp PCR产物连接。对所产生的质粒(pGBE0928)用引物1061、1062、1063，1064和1065(分别作为SEQ RC0015、RC0016、RC0017，RC0018和RC0019给出)测序。
质粒pGBE0096用限制性酶KpnI和NotI消化以产生3.6Kbp产物。pGBE0928质粒也用限制性酶KpnI和NotI消化并且连接至3.6Kbp限制性片段。对所产生的质粒(pGBE1020)用引物1994、1995、1996、1997、1998、1999、2000、2001、2002和2003(分别作为SEQ RC0037、RC0038、RC0039、RC0040、RC0041、RC0042、RC0043、RC0044、RC0045和RC0046给出)测序。
实施例9：质粒pGBE1021的构建
该章节的目的是描述构建允许在大肠杆菌菌株中产生丙酮的质粒。
质粒pGBE0096用限制性酶KpnI和NotI消化以产生3.6Kbp产物。
pGBE0123质粒也用限制性酶KpnI和NotI消化并且随后与3.6Kbp PCR产物连接。对所产生的质粒(pGBE1021)用引物1994、1995、1996、1997、1998、1999、2000、2001、2002和2003(分别作为SEQ RC0037、RC0038、RC0039、RC0040、RC0041、RC0042、RC0043、RC0044、RC0045和RC0046给出)测序。
实施例10：通过菌株GBE2264和GBE2265产生丙酮
对质粒转化入有关菌株的描述
使菌株GBE0129成为电感受态，并且GBE0129电感受态细胞用质粒pGB1021转化。随后将转化体铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上并且将平板在30℃温育过夜以产生菌株GBE2262。
使菌株GBE1344成为电感受态，并且GBE1344电感受态细胞用质粒pGBE1020转化。转化体随后铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。平板在30℃温育过夜以获得菌株GBE2263。
在含有葡萄糖作为碳源(2g/L)和氨苄青霉素(100μg/ml)的MS平板上筛选来自菌株GBE2262和GBE2263的分离的菌落。这些平板在30℃温育以分别获得菌株GBE2264和GBE2265。在30℃后温育4日，将菌落转移至含有葡萄糖(2g/L)、酵母提取物(0.1g/L)和氨苄青霉素(100μg/ml)的MS液体培养基并在30℃温育3日。
烧瓶条件的描述
含有葡萄糖(10g/L)、酵母提取物(0.1g/L)和氨苄青霉素(100μg/ml)的MSP液体培养基(200ml)用菌株GBE2264的预培养物或用菌株GBE2265的预培养物接种。初始OD600是0.1。在螺盖密封的250ml瓶中在30℃，速度170转/分钟温育200ml培养物。在1日、2日、4日、5日和6日后取得等分试样(2ml)。对于每份等分试样样品，所述瓶打开10秒。
分析方法的描述
过滤等分试样，并且使用Agilent HPLC(1260Infinity)和带有保护柱(Agilent，PL Hi-Plex H保护柱，PL1170-1830)的Hi-Plex柱(Agilent，PL1170-6830)，通过HPLC分析确定葡萄糖浓度。
‐注射体积：20μl
‐溶剂组成：[H2SO4]：5.5mM
‐柱温度：65℃
‐RID(G1362A)：设定的温度：35℃
通过与乙酸甲酯混合(对于2体积过滤的等分试样，用1体积乙酸甲酯)，从过滤的等分试样提取丙酮。使用气相色谱仪450-GC(Bruker)和以下程序，通过气相色谱确定丙酮浓度：
-柱：DB-WAX(123-7033，Agilent Technologies)
-注射器：
○分流比：10
○T°=250℃
-炉：
○50℃持续9分钟
○每分钟20℃直至180℃
○180℃持续5分钟
○柱流速：1.5ml/分钟(氮气)
-检测器FID：T°=300℃
结果
菌株GBE2265产生的[丙酮](mM)/消耗的[葡萄糖](mM)比菌株GBE2264高。
实施例11：菌株GBE1283的构建
将菌株GBE0929铺种在葡萄糖作为碳源(2g/L)的MS平板上。将分离的菌落转移至含有葡萄糖(2g/L)的MS液体培养基并在30℃温育3日。含有葡萄糖(2g/L)的MS液体培养基(100ml)用菌株GBE0929的预培养物接种。初始OD600是0.1。在1L锥形瓶中在30℃，速度170转/分钟温育100ml培养物。当OD600超过1时，取出培养物的等分试样并且用作新鲜培养物的接种物接种于1L锥形瓶中的100ml培养物，于30℃，速度170转/分钟培养。将菌株GBE0929传代培养10次以获得菌株GBE1283。
实施例12：菌株GBE2256的构建
在LB培养基中培育菌株GBE1283并且使GBE1283细胞变成电感受态。电感受态GBE1283细胞用pKD46质粒转化，并且随后铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。平板在30℃温育过夜。用质粒pKD46转化GBE1283细胞产生了菌株GBE1284。
使用质粒pGBE0688作为模板，用引物0629和0630(分别作为SEQ RC0007和RC0008给出)产生1.2Kbp PCR产物。将所产生的1.2Kbp PCR产物转化至电感受态GBE1284细菌中并且将转化混合物铺种在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上。平板随后在37℃温育过夜以产生命名为GBE2252_pKD46的新菌株。在菌株GB2252_pKD46中，磷酸果糖激酶基因pfkA缺失并且由壮观霉素抗性盒替换。为了检验pfkA基因的缺失发生，用引物0619和0620(分别作为SEQ RC0009和RC0010给出)进行PCR扩增。用相同引物0619和0620对这种1.7Kbp PCR产物测序。为了检验质粒pKD46的丢失，将菌株GBE2252_pKD46铺种在LB平板上并且在42℃温育过夜。通过将分离的菌落铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜并在LB平板上于37℃温育过夜，验证质粒pKD46的丢失。所产生的菌株在37℃温育的LB平板上生长并且命名为GBE2252。GBE2252细胞不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
使菌株GBE2252成为电感受态，并且GBE2252电感受态细胞用质粒pKD46转化。随后将转化体细胞铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上并且将平板在30℃温育过夜以获得命名为GBE2253的新菌株。
通过使用质粒pGBE0687作为模板并使用寡核苷酸0631和0632(分别作为SEQRC0011和RC0012给出)作为引物产生PCR产物。将所产生的1.3Kbp PCR产物转化至电感受态GBE2253细菌中并且将转化混合物铺种在含有阿泊拉霉素(50μg/ml)的LB平板上。平板在37℃温育过夜以产生菌株GBE2256_pKD46。在菌株GBE2256_pKD46中，磷酸果糖激酶基因pfkB缺失并且缺失的DNA序列由含有阿泊拉霉素抗性基因的盒替换。为了检验pfkB基因的缺失发生，用引物0621和0622(分别作为SEQ RC0013和RC0014给出)进行PCR扩增。通过使用相同引物0621和0622对这种最终2.2Kbp PCR产物测序。
为了引起质粒pKD46的丢失，将菌株GBE2256_pKD46铺种在LB平板上并且将平板在42℃温育过夜。通过将分离的菌落铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜并在LB平板上于37℃温育过夜，检验质粒pKD46的丢失。所产生的在37℃温育的LB平板上生长的菌株命名为GBE2256。GBE2256细胞不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
实施例13：菌株GBE1518的构建
使用质粒pGBE0688作为模板，用引物0633和1109(分别作为SEQ RC0003和RC0047给出)产生1.3Kbp PCR产物。将这个1.3Kbp PCR产物转化至电感受态GBE1284细菌中并且随后将转化混合物铺种在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上并在37℃温育过夜以产生菌株GBE1433。在菌株GBE1433中，缺失包含zwf基因的DNA序列。包含zwf基因的这个缺失的DNA序列由壮观霉素抗性盒替换。为了检验zwf基因的有效缺失，用引物1036和1110(分别作为SEQRC0005和RC0048给出)进行PCR扩增。获得最终的1.5Kbp PCR产物。用相同引物1036和1110对这种1.5Kbp PCR产物测序。
使菌株GBE1433成为电感受态。GBE1433电感受态细胞用质粒pKD46转化，并且随后铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。平板在30℃温育过夜。用质粒pKD46转化GBE1433细胞产生了菌株GBE1436。
使用质粒pGBE0687作为模板，用引物0629和0630(分别作为SEQ RC0007和RC0008给出)产生1.2Kbp PCR产物。将所产生的1.2Kbp PCR产物转化至电感受态GBE1436细菌中并且将转化混合物铺种在含有阿泊拉霉素(50μg/ml)的LB平板上。平板随后在37℃温育过夜以产生命名为GBE1441_pKD46的新菌株。在菌株GB1441_pKD46中，磷酸果糖激酶基因pfkA缺失并且由阿泊拉霉素抗性盒替换。为了检验pfkA基因的缺失发生，用引物0619和0620(分别作为SEQ RC0009和RC0010给出)进行PCR扩增。用相同引物0619和0620对这种1.7Kbp PCR产物测序。为了检验质粒pKD46的丢失，将菌株GBE1441_pKD46铺种在LB平板上并且在42℃温育过夜。通过将分离的菌落铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜并在LB平板上于37℃温育过夜，验证质粒pKD46的丢失。所产生的菌株在37℃温育的LB平板上生长并且命名为GBE1441。GBE1441细胞不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
壮观霉素盒位于zwf基因的相应基因座处并且阿泊拉霉素盒位于pfkA基因的相应基因座处。为了切除含有壮观霉素和阿泊拉霉素抗性基因的抗性盒，菌株GBE1441用质粒pCP20转化以获得菌株GBE1441_p。在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜后，将分离的菌落在供给氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上再划线并在30℃温育过夜。随后将分离的菌落铺种在LB平板上并且在42℃温育过夜，这导致pCP20质粒的丢失。随后，为了检验两个抗性盒的有效切除和pCP20质粒的丢失，将分离的菌落在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上划线，在37℃温育过夜；在含有阿泊拉霉素(50μg/mL)的LB平板上划线，在37℃温育过夜；在含有氨苄青霉素(100μg/m)的LB平板上划线，在30℃温育过夜；并且在LB平板上划线，在37℃温育过夜。所产生的菌株在37℃温育的LB平板上生长并且命名为GBE1448。GBE1448细胞不在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上、不在含有阿泊拉霉素(50μg/mL)的LB平板上和不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
使菌株GBE1448成为电感受态，并且GBE1448电感受态细胞用质粒pKD46转化。随后将转化体细胞铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上并且将平板在30℃温育过夜以获得命名为GBE1449的新菌株。通过使用质粒pGBE0688作为模板并使用寡核苷酸0631和0632(分别作为SEQ RC0011和RC0012给出)作为引物产生PCR产物。将所产生的1.3Kbp PCR产物转化至电感受态GBE1449细菌中并且将转化混合物铺种在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上。平板在37℃温育过夜以产生菌株GBE1518_pKD46。在菌株GBE1518_pKD46中，磷酸果糖激酶基因pfkB缺失并且缺失的DNA序列由含有壮观霉素抗性基因的盒替换。为了检验pfkB基因的缺失发生，用引物0621和0622(分别作为SEQ RC0013和RC0014给出)进行PCR扩增。通过使用相同引物0621和0622对这种最终的2.2Kbp PCR产物测序。
为了引起质粒pKD46的丢失，将菌株GBE1518_pKD46铺种在LB平板上并且将平板在42℃温育过夜。通过将分离的菌落铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜并在LB平板上于37℃温育过夜，检验质粒pKD46的丢失。所产生的在37℃温育的LB平板上生长的菌株命名为GBE1518。GBE1518细胞不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
实施例14：菌株GBE1420的构建
使用质粒pGBE0688作为模板，用引物0633和0634(分别作为SEQ RC0003和RC0004给出)产生1.3Kbp PCR产物。将这个1.3Kbp PCR产物转化至电感受态GBE1284细菌中并且随后将转化混合物铺种在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上并在37℃温育过夜以产生菌株GBE1287。在菌株GBE1287中，缺失包含zwf、edd和eda基因的DNA序列。包含zwf、edd和eda基因的这个缺失的DNA序列由壮观霉素抗性盒替换。为了检验zwf、edd和eda基因的有效缺失，用引物1036和1037(分别作为SEQ RC0005和RC0006给出)进行PCR扩增。获得最终的1.9KbpPCR产物。用相同引物1036和1037对这种1.9Kbp PCR产物测序。
使菌株GBE1287成为电感受态。GBE1287电感受态细胞用质粒pKD46转化，并且随后铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。平板在30℃温育过夜。用质粒pKD46转化GBE1287细胞产生了菌株GBE1337。
使用质粒pGBE0687作为模板，用引物0629和0630(分别作为SEQ RC0007和RC0008给出)产生1.2Kbp PCR产物。将所产生的1.2Kbp PCR产物转化至电感受态GBE1337细菌中并且将转化混合物铺种在含有阿泊拉霉素(50μg/ml)的LB平板上。平板随后在37℃温育过夜以产生命名为GBE1353_pKD46的新菌株。在菌株GBE1353_pKD46中，磷酸果糖激酶基因pfkA缺失并且由阿泊拉霉素抗性盒替换。为了检验pfkA基因的缺失发生，用引物0619和0620(分别作为SEQ RC0009和RC0010给出)进行PCR扩增。用相同引物0619和0620对这种1.7Kbp PCR产物测序。为了检验质粒pKD46的丢失，将菌株GBE1353_pKD46铺种在LB平板上并且在42℃温育过夜。通过将分离的菌落铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜并在LB平板上于37℃温育过夜，验证质粒pKD46的丢失。所产生的菌株在37℃温育的LB平板上生长并且命名为GBE1353。GBE1353细胞不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
壮观霉素盒位于zwf_edd_eda基因的相应基因座处并且阿泊拉霉素盒位于pfkA基因的相应基因座处。为了切除含有壮观霉素和阿泊拉霉素抗性基因的抗性盒，菌株GBE1353用质粒pCP20转化以获得菌株GBE1353_p。在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜后，将分离的菌落在供给氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上再划线并在30℃温育过夜。随后将分离的菌落铺种在LB平板上并且在42℃温育过夜，这导致pCP20质粒的丢失。随后，为了检验两个抗性盒的有效切除和pCP20质粒的丢失，将分离的菌落在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上划线，在37℃温育过夜；在含有阿泊拉霉素(50μg/mL)的LB平板上划线，在37℃温育过夜；在含有氨苄青霉素(100μg/m)的LB平板上划线，在30℃温育过夜；并且在LB平板上划线，在37℃温育过夜。所产生的菌株在37℃温育的LB平板上生长并且命名为GBE1368。GBE1368细胞不在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上、不在含有阿泊拉霉素(50μg/mL)的LB平板上和不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
使菌株GBE1368成为电感受态，并且GBE1368电感受态细胞用质粒pKD46转化。随后将转化体细胞铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上并且将平板在30℃温育过夜以获得命名为GBE1371的新菌株。通过使用质粒pGBE0688作为模板并使用寡核苷酸0631和0632(分别作为SEQ RC0011和RC0012给出)作为引物产生PCR产物。将所产生的1.3Kbp PCR产物转化至电感受态GBE1371细菌中并且将转化混合物铺种在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB平板上。平板在37℃温育过夜以产生菌株GBE1420_pKD46。在菌株GBE1420_pKD46中，磷酸果糖激酶基因pfkB缺失并且缺失的DNA序列由含有壮观霉素抗性基因的盒替换。为了检验pfkB基因的缺失发生，用引物0621和0622(分别作为SEQ RC0013和RC0014给出)进行PCR扩增。通过使用相同引物0621和0622对这种最终2.2Kbp PCR产物测序。
为了引起质粒pKD46的丢失，将菌株GBE1420_pKD46铺种在LB平板上并且将平板在42℃温育过夜。通过将分离的菌落铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上于30℃温育过夜并在LB平板上于37℃温育过夜，检验质粒pKD46的丢失。所产生的在37℃温育的LB平板上生长的菌株命名为GBE1420。GBE1420细胞不在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长。
实施例15：通过菌株GBE2268和GBE2269产生丙酮
对质粒转化入有关菌株的描述
使菌株GBE1283成为电感受态，并且GBE1283电感受态细胞用质粒pGB1021转化。随后将转化体铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上并且将平板在30℃温育过夜以产生菌株GBE2266。
使菌株GBE1420成为电感受态，并且GBE1420电感受态细胞用质粒pGBE1020转化。转化体随后铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。平板在30℃温育过夜以获得菌株GBE2267。
在含有葡萄糖作为碳源(2g/L)和氨苄青霉素(100μg/ml)的MS平板上筛选来自菌株GBE2266和GBE2267的分离的菌落。这些平板在30℃温育以分别获得菌株GBE2268和GBE2269。在30℃后温育4日，将菌落转移至含有葡萄糖(2g/L)、酵母提取物(0.1g/L)和氨苄青霉素(100μg/ml)的MS液体培养基并在30℃温育3日。
烧瓶条件的描述
含有葡萄糖(10g/L)、酵母提取物(0.1g/L)和氨苄青霉素(100μg/ml)的MSP液体培养基(200ml)用菌株GBE2268的预培养物或用菌株GBE2269的预培养物接种。初始OD600是0.1。在螺盖密封的250ml瓶中在30℃，速度170转/分钟温育200ml培养物。在1日、2日、4日、5日、6日、7日和8日后取得等分试样(2ml)。对于每份等分试样样品，所述瓶打开10秒。
分析方法的描述
过滤等分试样，并且使用Agilent HPLC(1260Infinity)和带有保护柱(Agilent，PL Hi-Plex H保护柱，PL1170-1830)的Hi-Plex柱(Agilent，PL1170-6830)，通过HPLC分析确定葡萄糖浓度。
‐注射体积：20μl
‐溶剂组成：[H2SO4]：5.5mM
‐柱温度：65℃
‐RID(G1362A)：设定的温度：35℃
通过与乙酸甲酯混合(对于2体积过滤的等分试样，用1体积乙酸甲酯)，从过滤的等分试样提取丙酮。使用气相色谱仪450-GC(Bruker)和以下程序，通过气相色谱确定丙酮浓度：
-柱：DB-WAX(123-7033，Agilent Technologies)
-注射器：
○分流比：10
○T°=250℃
-炉：
○50℃持续9分钟
○每分钟20℃直至180℃
○180℃持续5分钟
○柱流速：1.5ml/分钟(氮气)
-检测器FID：T°=300℃
结果
菌株GBE2269产生的[丙酮](mM)/消耗的[葡萄糖](mM)比菌株GBE2268高。
实施例16：通过菌株GBE2272和GBE2273产生丙酮
对质粒转化入有关菌株的描述
使菌株GBE2256成为电感受态，并且GBE2256电感受态细胞用质粒pGB1020转化。随后将转化体铺种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上并且将平板在30℃温育过夜以产生菌株GBE2270。
使菌株GBE1518成为电感受态，并且GBE1518电感受态细胞用质粒pGBE1020转化。转化体随后铺种在供给有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。平板在30℃温育过夜以获得菌株GBE2271。
在含有葡萄糖作为碳源(2g/L)和氨苄青霉素(100μg/ml)的MS平板上筛选来自菌株GBE2270和GBE2271的分离的菌落。这些平板在30℃温育以分别获得菌株GBE2272和GBE2273。在30℃后温育4日，将菌落转移至含有葡萄糖(2g/L)、酵母提取物(0.1g/L)和氨苄青霉素(100μg/ml)的MS液体培养基并在30℃温育3日。
烧瓶条件的描述
含有葡萄糖(10g/L)、酵母提取物(0.1g/L)和氨苄青霉素(100μg/ml)的MSP液体培养基(200ml)用菌株GBE2272的预培养物或用菌株GBE2273的预培养物接种。初始OD600是0.1。在螺盖密封的250ml瓶中在30℃，速度170转/分钟温育200ml培养物。在1日、2日、4日、5日和6日后取得等分试样(2ml)。对于每份等分试样样品，所述瓶打开10秒。
分析方法的描述
过滤等分试样，并且使用Agilent HPLC(1260Infinity)和带有保护柱(Agilent，PL Hi-Plex H保护柱，PL1170-1830)的Hi-Plex柱(Agilent，PL1170-6830)，通过HPLC分析确定葡萄糖浓度。
‐注射体积：20μl
‐溶剂组成：[H2SO4]：5.5mM
‐柱温度：65℃
‐RID(G1362A)：设定的温度：35℃
通过与乙酸甲酯混合(对于2体积过滤的等分试样，用1体积乙酸甲酯)，从过滤的等分试样提取丙酮。使用气相色谱仪450-GC(Bruker)和以下程序，通过气相色谱确定丙酮浓度：
-柱：DB-WAX(123-7033，Agilent Technologies)
-注射器：
○分流比：10
○T°=250℃
-炉：
○50℃持续9分钟
○每分钟20℃直至180℃
○180℃持续5分钟
○柱流速：1.5ml/分钟(氮气)
-检测器FID：T°=300℃
结果
菌株GBE2273产生的[丙酮](mM)/消耗的[葡萄糖](mM)比菌株GBE2272高。

Claims (40)

1.重组微生物，其特征在于：
a)具有磷酸转酮酶活性；
b)(i)与非遗传修饰微生物相比通过失活编码磷酸果糖激酶的基因从而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)，其中所述微生物经历了失活所述磷酸果糖激酶活性的遗传修饰；或通过遗传修饰以减少磷酸果糖激酶活性从而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)，所述遗传修饰是通过将突变导入编码所述磷酸果糖激酶的基因的启动子或导入编码所述磷酸果糖激酶的多核苷酸、或通过导入与编码所述磷酸果糖激酶的基因互补的核苷酸序列、或通过表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA阻抑编码所述磷酸果糖激酶的基因表达；或
(ii)不具有磷酸果糖激酶活性，其中所述微生物在其基因组中天然地不含有编码具有磷酸果糖激酶活性的酶的核苷酸序列；和
c)(i)与非遗传修饰微生物相比通过失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因从而具有削弱或失活的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路，其中所述微生物经历了失活所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的遗传修饰；或通过遗传修饰以减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性从而具有削弱或失活的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路，所述遗传修饰是通过将突变导入编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因的启动子或导入编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多核苷酸、或通过导入与编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因互补的核苷酸序列、或通过表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA阻抑编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因表达；或
(ii)不具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，其中所述微生物在其基因组中天然地不含有编码具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的酶的核苷酸序列。
2.权利要求1的重组微生物，其中与非遗传修饰微生物相比通过失活编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因从而进一步削弱或失活EMPP，其中所述微生物经历了失活所述甘油醛3-磷酸脱氢酶活性的遗传修饰；或通过遗传修饰以减少甘油醛3-磷酸脱氢酶活性从而进一步削弱或失活EMPP，所述遗传修饰是通过将突变导入编码所述甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的启动子或导入编码所述甘油醛3-磷酸脱氢酶的多核苷酸、或通过导入与编码所述甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因互补的核苷酸序列、或通过表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA阻抑编码所述甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因表达。
3.权利要求1的重组微生物，所述重组微生物已经被遗传修饰以具有增加的磷酸转酮酶活性。
4.权利要求2的重组微生物，所述重组微生物已经被遗传修饰以具有增加的磷酸转酮酶活性。
5.权利要求1的重组微生物，其中所述微生物是真菌。
6.权利要求2的重组微生物，其中所述微生物是真菌。
7.权利要求1的重组微生物，其中所述微生物是细菌。
8.权利要求2的重组微生物，其中所述微生物是细菌。
9.权利要求7的重组微生物，其中编码磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统转运蛋白的基因已经被失活。
10.权利要求8的重组微生物，其中编码磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统转运蛋白的基因已经被失活。
11.权利要求1至10中任一项所述的重组微生物，其特征还在于：
e)它能够将乙酰-CoA转化成丙酮。
12.权利要求11的重组微生物，其特征还在于：
f)它能够将丙酮转化成异丁烯。
13.权利要求11的重组微生物，其特征还在于：
f)它能够将丙酮转化成丙烯。
14.权利要求1至13中任一项所述的重组微生物的用途，用于将葡萄糖转化成乙酰-CoA。
15.权利要求11的重组微生物的用途，用于将葡萄糖转化成丙酮。
16.权利要求12所述的重组微生物的用途，用于将葡萄糖转化成异丁烯。
17.权利要求13所述的重组微生物的用途，用于将葡萄糖转化成丙烯。
18.用于从葡萄糖产生丙酮的方法，包括步骤：在合适的培养基中培养权利要求11所述的重组微生物；和任选地从培养基回收所述丙酮。
19.用于从葡萄糖产生异丁烯的方法，包括步骤：在合适的培养基中培养权利要求12所述的重组微生物；和任选地回收所述异丁烯。
20.用于从葡萄糖产生丙烯的方法，包括步骤：在合适的培养基中培养权利要求13所述的重组微生物；和任选地回收所述丙烯。
21.重组微生物，其特征在于：
a)具有磷酸转酮酶活性；
b)(i)与非遗传修饰微生物相比通过失活编码磷酸果糖激酶的基因从而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)，其中所述微生物经历了失活所述磷酸果糖激酶活性的遗传修饰；或通过遗传修饰以减少磷酸果糖激酶活性从而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)，所述遗传修饰是通过将突变导入编码所述磷酸果糖激酶的基因的启动子或导入编码所述磷酸果糖激酶的多核苷酸、或通过导入与编码所述磷酸果糖激酶的基因互补的核苷酸序列、或通过表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA阻抑编码所述磷酸果糖激酶的基因表达；或
(ii)不具有磷酸果糖激酶活性，其中所述微生物在其基因组中天然地不含有编码具有磷酸果糖激酶活性的酶的核苷酸序列；
c)(i)与非遗传修饰微生物相比通过失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因从而具有削弱或失活的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路，其中所述微生物经历了失活所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的遗传修饰；或通过遗传修饰以减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性从而具有削弱或失活的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路，所述遗传修饰是通过将突变导入编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因的启动子或导入编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多核苷酸、或通过导入与编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因互补的核苷酸序列、或通过表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA阻抑编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因表达；或
(ii)不具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，其中所述微生物在其基因组中天然地不含有编码具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的酶的核苷酸序列；和
d)具有果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性，其中所述果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性是将果糖-1,6-二磷酸和H2O转化成果糖-6-磷酸和磷酸的酶活性。
22.权利要求21的重组微生物，其中与非遗传修饰微生物相比通过失活编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因从而进一步削弱或失活EMPP，其中所述微生物经历了失活所述甘油醛3-磷酸脱氢酶活性的遗传修饰；或通过遗传修饰以减少甘油醛3-磷酸脱氢酶活性从而进一步削弱或失活EMPP，所述遗传修饰是通过将突变导入编码所述甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的启动子或导入编码所述甘油醛3-磷酸脱氢酶的多核苷酸、或通过导入与编码所述甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因互补的核苷酸序列、或通过表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA阻抑编码所述甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因表达。
23.权利要求21的重组微生物，所述重组微生物已经被遗传修饰以具有增加的磷酸转酮酶活性。
24.权利要求22的重组微生物，所述重组微生物已经被遗传修饰以具有增加的磷酸转酮酶活性。
25.权利要求21的重组微生物，其中所述微生物是真菌。
26.权利要求22的重组微生物，其中所述微生物是真菌。
27.权利要求21的重组微生物，其中所述微生物是细菌。
28.权利要求22的重组微生物，其中所述微生物是细菌。
29.权利要求27的重组微生物，其中编码磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统转运蛋白的基因已经被失活。
30.权利要求28的重组微生物，其中编码磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统转运蛋白的基因已经被失活。
31.权利要求21至30中任一项所述的重组微生物，其特征还在于：
e)它能够将乙酰-CoA转化成丙酮。
32.权利要求31的重组微生物，其特征还在于：
f)它能够将丙酮转化成异丁烯。
33.权利要求31的重组微生物，其特征还在于：
f)它能够将丙酮转化成丙烯。
34.权利要求21至33中任一项所述的重组微生物的用途，用于将葡萄糖转化成乙酰-CoA。
35.权利要求31的重组微生物的用途，用于将葡萄糖转化成丙酮。
36.权利要求32所述的重组微生物的用途，用于将葡萄糖转化成异丁烯。
37.权利要求33所述的重组微生物的用途，用于将葡萄糖转化成丙烯。
38.用于从葡萄糖产生丙酮的方法，包括步骤：在合适的培养基中培养权利要求31所述的重组微生物；和任选地从培养基回收所述丙酮。
39.用于从葡萄糖产生异丁烯的方法，包括步骤：在合适的培养基中培养权利要求32所述的重组微生物；和任选地回收所述异丁烯。
40.用于从葡萄糖产生丙烯的方法，包括步骤：在合适的培养基中培养权利要求33所述的重组微生物；和任选地回收所述丙烯。
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Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
EP2666855B1 (en) * 2011-01-20 2017-11-22 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Recombinant yeast and method for producing substance using same
US9422578B2 (en) 2011-06-17 2016-08-23 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene
BR112013032516A2 (pt) 2011-06-17 2017-03-01 Invista Tech Sarl método de biosintetizar butadieno e método para produzir butadieno
EP3031911B1 (en) 2011-07-12 2018-12-05 Scientist of Fortune S.A. Recombinant microorganism for the production of useful metabolites
DK3339426T3 (da) 2011-10-07 2022-09-12 Danisco Us Inc Anvendelse af phosphoketolase i fremstillingen af mevalonat, isoprenoid-udgangsstoffer og isopren
WO2013181647A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Danisco Us Inc. Compositions and methods of producing isoprene and/or industrrial bio-products using anaerobic microorganisms
WO2014085612A1 (en) 2012-11-28 2014-06-05 INVISTA North America S.á r.l. Methods for biosynthesis of isobutene
US10006033B2 (en) * 2013-03-14 2018-06-26 The Regents Of The University Of California Recombinant microorganisms having a methanol elongation cycle (MEC)
WO2014153207A2 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 The Regents Of The University Of California Recombinant microorganisms having a methanol elongation cycle (mec)
CN105555952A (zh) 2013-04-10 2016-05-04 丹尼斯科美国公司 用于乙酰辅酶a-衍生代谢物、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的改善生产的磷酸解酮酶
US10294496B2 (en) 2013-07-19 2019-05-21 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene
CN105683384A (zh) 2013-08-05 2016-06-15 英威达技术有限责任公司 用于生物合成异丁烯的方法
BR112016002625A2 (pt) 2013-08-05 2017-09-12 Invista Tech Sarl método para sintetizar enzimaticamente isopreno e hospedeiro recombinante produtor de isopreno
WO2015084633A1 (en) 2013-12-03 2015-06-11 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for improving product yields on methanol using acetyl-coa synthesis
JP2016538871A (ja) 2013-12-03 2016-12-15 グローバル・バイオエナジーズ ３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジル酸類を経由した３−ヒドロキシカルボン酸類からのアルケン類の生産
BR112016029471A2 (pt) 2014-06-16 2017-10-24 Invista Tech Sarl método para biosintetizar éster de metil glutarato em um hospedeiro recombinante, método para preparar glutarato, célula hospedeira recombinante, hospedeiro recombinante, produto bioderivado, produto de base biológica ou produto derivado de fermentação e método para aumentar a atividade de um polipeptídeo tendo atividade carboxilato reductase sobre um ácido dicarboxílico c4-c8 substituído ou não-substituído
BR112017003733A2 (pt) * 2014-09-03 2017-12-05 Global Bioenergies ?micro-organismo recombinante que produz alcenos a partir de acetil-coa?.
EP3240886A4 (en) * 2014-12-30 2018-11-14 Novogy Inc. Enhanced production of core lipids in oleaginous yeasts
US10301653B2 (en) 2015-07-06 2019-05-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Microorganisms that co-consume glucose with non-glucose carbohydrates and methods of use
CN108350469A (zh) 2015-11-17 2018-07-31 环球生物能源公司 从3-甲基巴豆酸生产异丁烯的方法
WO2017193010A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Microbial platform for production of glycosylated compounds
EP3315610B1 (en) * 2016-10-29 2020-12-16 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for the production of fucosylated oligosaccharides
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
FR3062395B1 (fr) * 2017-01-27 2021-04-16 Enobraq Microorganisme genetiquement optimise pour la production de molecules d'interet
KR20190113800A (ko) * 2017-02-15 2019-10-08 지머젠 인코포레이티드 생물도달가능 예측 도구
US11162115B2 (en) 2017-06-30 2021-11-02 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Methods, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons
US11634733B2 (en) 2017-06-30 2023-04-25 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Methods, materials, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons and derivatives thereof
US11505809B2 (en) 2017-09-28 2022-11-22 Inv Nylon Chemicals Americas Llc Organisms and biosynthetic processes for hydrocarbon synthesis
EP3550000A1 (en) 2018-04-04 2019-10-09 Global Bioenergies Gasoline composition enabling reduced particulate emissions
EP3830281A1 (en) 2018-07-27 2021-06-09 Global Bioenergies Method for producing fructose-6-phosphate from dihydroxyacetone phosphate and glyceraldehyde-3-phosphate
CN109207373B (zh) * 2018-09-21 2021-07-23 天津科技大学 一株高产柠檬酸的微生物菌株及其发酵淀粉糖质生产柠檬酸的方法
US20220090027A1 (en) * 2018-12-10 2022-03-24 The Regents Of The University Of California Engineered polypeptides that exhibit increased catalytic efficiency for unnatural cofactors and uses thereof
EP3880807A2 (en) * 2018-12-28 2021-09-22 Braskem S.A. Modulation of carbon flux through the meg and c3 pathways for the improved production of monoethylene glycol and c3 compounds
WO2020188033A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 Global Bioenergies Improved means and methods for producing isobutene from acetyl-coa
CN111411093B (zh) * 2019-04-30 2021-10-22 中国科学院天津工业生物技术研究所 活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用
WO2021063958A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Global Bioenergies Improved means and methods for increasing the yield of acetyl-coa from glucose
FR3113068A1 (fr) 2020-07-31 2022-02-04 Suez Groupe Procede de production d’un sirop de sucres a partir d’une biomasse lignocellulosique residuaire
EP4263844A1 (en) 2020-12-21 2023-10-25 Global Bioenergies Improved means and methods for producing isobutene from 3-methylcrotonic acid
CN117980473A (zh) 2021-09-06 2024-05-03 环球生物能源公司 产生较少巴豆酸的生物体

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101090964A (zh) * 2004-08-10 2007-12-19 味之素株式会社 磷酸转酮酶用于生产有用的代谢物的用途

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2994926B2 (ja) 1993-10-29 1999-12-27 松下電器産業株式会社 有限状態機械作成方法とパターン照合機械作成方法とこれらを変形する方法および駆動方法
JP2000201022A (ja) 1999-01-06 2000-07-18 Alps Electric Co Ltd 局部発振回路
US7253001B2 (en) * 2002-03-19 2007-08-07 Forskarpatent I Syd Ab Metabolic engineering for improved xylose utilisation of Saccharomyces cerevisiae
US20050079617A1 (en) * 2003-10-03 2005-04-14 Cervin Marguerite A. Glucose transport mutants for production of biomaterial
BRPI0314498B1 (pt) 2002-10-04 2019-08-20 E.I. Du Pont De Nemours And Company Escherichia coli transgênica e método para a bioprodução de 1,3-propanodiol
JP5596902B2 (ja) * 2004-08-10 2014-09-24 味の素株式会社 有用な代謝産物を製造するためのホスホケトラーゼの使用
RU2322496C2 (ru) * 2005-08-09 2008-04-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Использование фосфокетолазы для продукции полезных метаболитов
US7517680B2 (en) * 2005-09-09 2009-04-14 Johns Hopkins University Production of clavulanic acid by genetic engineering of Streptomyces clavuligerus
BRPI0817754A2 (pt) * 2007-10-04 2014-11-25 Bio Architecture Lab Inc Produção de biocombustível
SI2262901T1 (sl) * 2008-03-05 2019-02-28 Genomatica, Inc. Primarni alkohol producirajoči organizmi
JP2011519561A (ja) * 2008-05-01 2011-07-14 ジェノマティカ， インコーポレイテッド メタクリル酸の産生のための微生物
ES2647785T3 (es) * 2008-07-04 2017-12-26 Scientist Of Fortune S.A. Producción de alquenos mediante descarboxilación enzimática de ácidos 3-hidroxi-alcanoicos
US20100120105A1 (en) * 2008-10-27 2010-05-13 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Carbon pathway optimized production hosts for the production of isobutanol
US8377680B2 (en) * 2009-05-07 2013-02-19 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of adipate, hexamethylenediamine and 6-aminocaproic acid
US20110144377A1 (en) * 2009-06-16 2011-06-16 E. I. Du Pont Nemours And Company Process for the biological production of 3-hydroxypropionic acid with high yield
NZ712586A (en) * 2009-08-21 2017-06-30 Lallemand Hungary Liquidity Man Llc Production of propanols, alcohols, and polyols in consolidated bioprocessing organisms
EP2295593A1 (en) 2009-09-15 2011-03-16 Philippe Marliere Method for the enymatic production of 3-hydroxy-3-methylbutyric acid from acetone and acetyl-CoA
JP5998130B2 (ja) * 2010-07-12 2016-09-28 ユニヴェルシテイト ヘントＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｇｅｎｔ 付加価値バイオ生成物の生成のための代謝操作された生物
EP2666855B1 (en) * 2011-01-20 2017-11-22 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Recombinant yeast and method for producing substance using same
EP3031911B1 (en) 2011-07-12 2018-12-05 Scientist of Fortune S.A. Recombinant microorganism for the production of useful metabolites
CA2841461C (en) * 2011-07-22 2020-05-26 Myriant Corporation Fermentation of glycerol to succinic acid by recombinant e. coli
DK3339426T3 (da) * 2011-10-07 2022-09-12 Danisco Us Inc Anvendelse af phosphoketolase i fremstillingen af mevalonat, isoprenoid-udgangsstoffer og isopren
KR101272393B1 (ko) 2012-02-10 2013-06-07 엘에스산전 주식회사 인버터 제어방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101090964A (zh) * 2004-08-10 2007-12-19 味之素株式会社 磷酸转酮酶用于生产有用的代谢物的用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Reduced Oxidative Pentose Phosphate Pathway Flux in Recombinant Xylose-Utilizing Saccharomyces Cerevisiae Strains Improves the Ethanol Yield from Xylose;Marie Jeppsson 等;《Applied and Environmental Microbiology》;20020430;第68卷(第4期);第1604-1609页 *

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