CN108350469A - 从3-甲基巴豆酸生产异丁烯的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于生产异丁烯的方法，其包括将3‑甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中通过将3‑甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3‑甲基巴豆酸获得所述3‑甲基巴豆酸或其中通过将3‑羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3‑甲基巴豆酸获得所述3‑甲基巴豆酸。描述了可以例如通过利用3‑甲基巴豆酸脱羧酶，优选与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶，乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)，甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)或香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)实现3‑甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化。

Description

从3-甲基巴豆酸生产异丁烯的方法
本发明涉及生产异丁烯的方法，其包括将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯，其中所述3-甲基巴豆酸通过将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酸而获得或其中所述3－甲基巴豆酸通过将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸而获得。3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化可以例如通过利用3-甲基巴豆酸脱羧酶，优选与FMN异戊烯转移酶，乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)，甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)或香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)相关的FMN依赖性脱羧酶来实现。此外，所述3-甲基巴豆酰辅酶A可通过将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A而获得。
许多的化学化合物目前源自石油化学品。烯类(如乙烯、丙烯、不同的丁烯或例如其他戊烯)在例如用于产生聚丙烯或聚乙烯的塑料工业和在化学工业其他领域和燃料领域中使用。
丁烯以四种形式存在，其中之一，异丁烯(又称作异丁烯)，进入甲基叔丁基醚(MTBE)(汽车燃料用抗爆添加剂)的组合物中。异丁烯也可以用来产生异辛烯，所述异辛烯转而可以还原成异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；异辛烷的极高辛烷值使其成为所谓“汽油”发动机的最佳燃料。烯类如异丁烯目前通过催化性裂解石油产物(或在己烯的情况下从煤炭或天然气中通过Fischer-Tropsch法的衍生物)产生。生产成本因此与油价紧密相关。另外，催化性裂解有时与增加工艺复杂性和生产成本的巨大技术难题相关。
在与地球化学循环和谐相处的可持续工业运营背景下，需要通过生物途径生产烯类如异丁烯。由于发酵和蒸馏过程已经在食品加工产业中存在，第一代生物燃料由乙醇的发酵生产组成。第二代生物燃料的生产处于探索期，尤其包括生产长链醇(丁醇和戊醇)、萜烯、直链链烷和脂肪酸。两份最新综述提供了这个领域中研究的总体概述：Ladygina等人(Process Biochemistry 41(2006),1001)和Wackett(Current Opinions in ChemicalBiology 21(2008),187)。已经描述异戊酸由小红酵母(Rhodotorula minuta)转化成异丁烯(Fujii等人(Appl.Environ.Microbiol.54(1988),583))，但是但是这种反应的效率，小于每分钟百万分之一或每天约1/1000，远未允许工业应用。反应机理由Fukuda H等人(BBRC201(1994),516)阐明并且涉及通过还原氧代铁基(oxoferryl)FeV＝O，使异戊酸脱羧的细胞色素P450酶。通过该途径的异丁烯的大规模生物合成似乎是非常不利的，因为它需要合成和降解一个亮氨酸分子以形成一个异丁烯分子。此外，催化反应的酶使用血红素作为辅因子，其本身不利于细菌中的重组表达和改善酶参数。出于全部这些原因，似乎很不可能的是，这种途径可以充当工业利用的基础。已经将其他微生物描述为能够略微地从异戊酸盐天然产生异丁烯；获得的产率甚至低于用小红酵母获得的那些产率(Fukuda等人(Agric.Biol.Chem.48(1984),1679))。
Gogerty等人(Appl.Environm.Microbiol.76(2010),8004-8010)和van Leeuwen等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.93(2012),1377-1387)描述通过酶促转化从乙酰乙酰辅酶A产生异丁烯，其中所提出途径的最后步骤是通过利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化3-羟基-3-甲基丁酸(也称作3-羟异戊酸(HIV))。WO 2010/001078中也描述了从3-羟基-3-甲基丁酸产生异丁烯的这种反应。在Gogerty等人(上述引文)和van Leeuwen等人(见上述引文)中，提出3-羟基-3-甲基丁酸的生产是通过3-甲基巴豆酰辅酶A经3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A的转化来实现的。为了进一步提高由可再生资源生产异丁烯的方法的效率和可变性，需要提供异丁烯及其前体的备选途径。
本发明通过提供一种生产异丁烯的方法来满足这一要求，该方法包括将3-甲基巴豆酸(也称为3-甲基-2-丁烯酸)酶促转化为异丁烯。
3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化是脱羧反应。脱羧是去除羧基并释放二氧化碳(CO2)的化学反应。
US-A1-2009/0092975中已经提出了3-甲基巴豆酸的脱羧，但没有关于该转化的实验证据。在US-A1-2009/0092975中，描述了来自酿酒酵母的称为PAD1的核酸序列，并且公开其编码脱羧酶。该酶被认为可用作重组生物中的选择性标记，而它被描述为可使用“弱酸”作为选择剂。3-甲基巴豆酸等许多其他酸被称为潜在的“弱酸”。
然而，后来才发现上述PAD1实际上不提供脱羧酶活性。
事实上，细菌ubiD和ubiX或同源真核生物fdc1和pad1基因已经涉及非氧化性可逆脱羧。苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)和阿魏酸脱羧酶(FDC)的联合作用被认为对于酿酒酵母中苯基丙烯酸的脱羧是必不可少的(J.Biosci.Bioeng.109,(2010),564-569；AMB Express,5:12(2015)1-5；ACS Chem.Biol.10(2015),1137-1144)。
最近，被描述为苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)的上述酶家族被表征为FMN异戊烯转移酶并且不再是脱羧酶。已经表明，Fdc1(但不是PAD)完全负责可逆的脱羧酶活性，并且它需要一种新型辅因子，即由相关的UbiX(或Pad1)蛋白合成的异戊烯化黄素。因此，该PAD酶的真正酶活性已被鉴定为具有异戊二烯部分(来自二甲基烯丙基磷酸或焦磷酸，称为DMAP或DMAPP)的黄素单核苷酸(FMN)辅因子的转化。
因此，与现有技术的观点相反，真正的脱羧酶是与修饰的FMN(异戊二烯化的FMN)结合的阿魏酸脱羧酶(FDC)。最近描述了阿魏酸脱羧酶(FDC)与修饰的FMN(异戊二烯化-FMN)(后者由PAD酶提供)相关的这种机制，并涉及令人惊讶的酶促机制，即通过1,3-偶极环加成进行α，β-不饱和酸脱羧。此外，该FDC脱羧酶的结构最近已被阐明(Nature 522(2015),497-501；Nature,522(2015),502-505；Appl.Environ.Microbiol.81(2015),4216-4223)。
上述US-A1-2009/0092975中描述了用于将α-β不饱和羧酸转化成末端链烯烃的上述酶家族的应用，而WO2012/018624涉及生物合成芳族化合物2,4-戊二烯酸和1,3-丁二烯的微生物和方法，WO2013/028519涉及用于生产2,4-戊二烯酸，丁二烯，丙烯，1,3-丁二醇和相关醇的微生物和方法。
此外，WO2013/186215描述了用于制备单不饱和烯烃的方法，其包括使脂族单不饱和羧酸与Fdc1多肽和Pad1多肽接触。然而，在WO2013/186215中，Fdc1多肽和Pad1多肽均被分类为具有脱羧酶活性的酶。
相反，在本发明中，上述酶是以最终导致产生异丁烯的途径人工实施的。因此，在一个主要方面，本发明涉及一种生产异丁烯的方法，其包括将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯(步骤I，如图1所示)，
其中所述方法进一步包括
(a)通过将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸(如图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)来提供3-甲基巴豆酸，或
(b)通过将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供3-甲基巴豆酸(步骤II，如图1所示)。
优选地，3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化通过利用3-甲基巴豆酸脱羧酶来实现。
从3-甲基巴豆酰辅酶A经由3-甲基巴豆酸或从3-羟基异戊酸(HIV)经由3-甲基巴豆酸生产异丁烯的方法可以嵌入用于从乙酰辅酶A开始生产异丁烯的途径中，所述乙酰辅酶A是许多生化反应中使用的代谢中的中心成分和重要的关键分子。相应的反应如图1所示。
因此，本发明还涉及从乙酰辅酶A开始的途径并通过图1中示意性显示的两种备选途径导致3-甲基巴豆酸(其然后最终转化为异丁烯)，并且将在下面进一步更详细地解释。
通过乙酰乙酰辅酶A和3-甲基巴豆酸从乙酰辅酶A酶促转化为异丁烯的途径
3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化：如图1所示的步骤I
图2B中示意性地显示了3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化。
根据本发明，3-甲基巴豆酸(也称为3-甲基-2-丁烯酸或3,3-二甲基丙烯酸)到异丁烯(也称为异丁烯或2-甲基丙烯)的酶促转化可以通过脱羧实现。“脱羧”通常是一种去除羧基并释放二氧化碳(CO2)的化学反应。
3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化可以优选通过使用3-甲基巴豆酸脱羧酶来实现。根据本发明，3-甲基巴豆酸脱羧酶是能够在脱羧反应中将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的酶。
在优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸脱羧酶选自：
(i)与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶；或
(ii)乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)；或
(iii)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或
(iv)香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)。
因此，根据一个方面，3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化优选可以通过利用3-甲基巴豆酸脱羧酶实现，其中所述3-甲基巴豆酸脱羧酶是与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶。
利用与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯依赖于由两种酶催化的两个连续步骤的反应，所述两种酶即FMN依赖性脱羧酶(催化3-甲基巴豆酸到异丁烯的实际脱羧)与提供修饰的黄素辅因子的相关FMN异戊烯转移酶。黄素辅因子可以优选为FMN或FAD。FMN(黄素单核苷酸；也称为核黄素-5'-磷酸)是由核黄素(维生素B2)通过核黄素激酶产生的生物分子，并用作各种反应的辅基。FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)是一种氧化还原辅因子，更具体地说是一种辅基，参与代谢中的几个重要反应。
因此，在将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯中，在第一步，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成(修饰的)黄素衍生的辅因子。该修饰由所述FMN异戊烯转移酶催化。FMN异戊烯转移酶将黄素辅因子(FMN或FAD)的黄素环异戊二烯化成(修饰的)异戊二烯化的黄素辅因子。该反应在图2A中示意性地示出。
在第二步中，3-甲基巴豆酸到异丁烯的实际转化由所述FMN依赖性脱羧酶经由基于1,3-偶极环加成的机理催化，其中所述FMN依赖性脱羧酶使用通过相关的FMN异戊烯转移酶提供的异戊二烯基化黄素辅因子(FMN或FAD)。该反应在图2B中示意性地示出。
在一个优选的实施方案中，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成(经修饰的)黄素衍生辅因子的所述FMN异戊烯转移酶是苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白或紧密相关的原核生物酶UbiX，其是涉及原核生物中的泛醌生物合成的酶。
在大肠杆菌中，UbiX蛋白(也称为3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸羧基裂合酶)已被证明参与泛醌生物合成的第三步。
它催化反应
此外，酵母中同源蛋白的敲除(Pad1)已显示赋予对苯基丙烯酸的敏感性，表明该酶起到苯基丙烯酸脱羧酶的功能。除UbiX之外，大肠杆菌菌株还含有名为Pad1的第二个旁系同源物。其氨基酸序列与UbiX显示52％的同一性，并且与酿酒酵母苯基丙烯酸脱羧酶Pad1显示略高的序列同一性。尽管与酵母Pad1具有较高的序列相似性，但大肠杆菌Pad1似乎不具有苯基丙烯酸脱羧酶活性。它的功能是未知的，Pad1可以从苯甲酸的衍生物中除去羧酸基团，但不能从取代的酚酸中除去。
因此，在优选的实施方案中，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应的(修饰的)黄素衍生辅因子是由含FMN的蛋白质苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)催化的。涉及将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应的修饰的黄素衍生辅因子的酶最初被注释为脱羧酶(EC 4.1.1.-)。一些苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)现在被注释为黄素异戊烯转移酶EC 2.5.1.-。
在更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯使用苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白作为FMN异戊烯转移酶，其将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子，其中所述苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白质来源于白假丝酵母(Uniprot登录号Q5A8L8)，黑曲霉(Uniprot登录号A3F715)，酿酒酵母(Uniprot登录号P33751)或加特隐球酵母(Cryptococcus gattii)(Uniprot登录号E6R9Z0)。
在一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白质是来源于白假丝酵母(Uniprot登录号Q5A8L8；SEQ ID NO:40)，黑曲霉(Uniprot登录号A3F715；SEQ ID NO:41)，酿酒酵母(Uniprot登录号P33751；SEQ ID NO:42)或加特隐球酵母(Uniprot登录号E6R9Z0；SEQ ID NO:43)的苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白质，具有如分别在SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列。
在本发明的优选实施方案中，苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白质是包含选自SEQID NO:40-43的氨基酸序列或与SEQ ID NO:40-43任一个具有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选为10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，其中所述酶具有将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子的酶促活性。
关于序列同一性的确定，应该适用以下内容：当被比较的序列不具有相同的长度时，同一性程度或者是指较短序列中与在较长序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比或指较长序列中与较短序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。优选地，它指较短序列中与较长序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。序列同一性程度可以根据本领域众所周知的方法使用优选合适的计算机算法如CLUSTAL来确定。
例如，当使用Clustal分析方法确定特定序列是否与参考序列至少60％同一时，可以使用默认设置或者设置优选如下：矩阵：blosum 30；打开空位罚分：10.0；延长空位罚分：0.05；延迟发散：40；用于比较氨基酸序列的空位间隔距离：8。对于核苷酸序列比较，扩展空位罚分优选设定为5.0。
在一个优选的实施方案中，ClustalW2用于比较氨基酸序列。在逐对比较/比对的情况下，优选选择以下设置：蛋白质权矩阵：BLOSUM 62；空位打开：10；空位延伸：0.1。在多重比较/比对的情况下，优选选择以下设置：蛋白质权矩阵：BLOSUM 62；空位打开：10；空位延伸：0.2；空位距离：5；没有末尾空位。
优选地，在序列的整个长度上计算同一性程度。
本领域技术人员可以通过本领域已知的方法鉴定位于与SEQ ID NO:40至43中任一项所示氨基酸序列中下文所示位置相对应位置的氨基酸残基。例如，可以通过将所述序列与SEQ ID NO:40至43中任一个中所示的序列比对，并通过鉴定与SEQ ID NO:40至43中任一个的上述位置相对应的位置来鉴定此类氨基酸残基。该比对可以用本领域技术人员已知的手段和方法完成，例如，通过使用已知的计算机算法，例如Lipman-Pearson方法(Science227(1985)，1435)或CLUSTAL算法。优选的是，在这种比对中，最大同源性归属于氨基酸序列中存在的保守氨基酸残基。
在一个优选的实施方案中，ClustalW2用于比较氨基酸序列。在逐对比较/比对的情况下，优选选择以下设置：蛋白质权矩阵：BLOSUM 62；空位打开：10；空位延伸：0.1。在多重比较/比对的情况下，优选选择以下设置：蛋白质权矩阵：BLOSUM 62；空位打开：10；空位延伸：0.2；空位距离：5；没有末尾空位。
优选地，在序列的整个长度上计算同一性程度。
在另一个优选的实施方案中，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子由含FMN的蛋白质3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸羧基裂合酶(也称为UbiX(最初注释EC 4.1.1.-))催化。如上所述，涉及将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应的修饰的黄素衍生辅因子的酶最初被注释为脱羧酶。一些苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)现在被注释为黄素异戊烯转移酶EC 2.5.1.-。
在更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化为异丁烯使用3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸羧基裂合酶(也称为UbiX)作为FMN异戊烯转移酶，其将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰为相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子，其中所述3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸羧基裂合酶(也称为UbiX)源自大肠杆菌(Uniprot登录号P0AG03)，枯草芽孢杆菌(Uniprot登录号A0A086WXG4)，铜绿假单胞菌(Uniprot登录号A0A072ZCW8)或肠杆菌属DC4(Uniprot登录号W7P6B1)。
在甚至更优选的实施方案中，用于本发明方法的3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸羧基裂合酶((也称为UbiX)是来源于大肠杆菌(Uniprot登录号P0AG03；SEQ ID NO:44)，枯草芽孢杆菌(Uniprot登录号A0A086WXG4；SEQ ID NO:45)，铜绿假单胞菌(Uniprot登录号A0A072ZCW8；SEQ ID NO:46)或肠杆菌属DC4(Uniprot登录号W7P6B1；SEQ ID NO:47)的3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸羧基裂合酶(也称为UbiX),具有分别如SEQ ID NO:44，SEQ IDNO:45，SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在本发明的优选实施方案中，3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸羧基裂合酶是包含选自SEQ ID NO:44至47的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44至47中的任一个有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
在另一个优选的实施方案中，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子是由黄素异戊烯转移酶催化的。
如上所述，实际的脱羧即3-甲基巴豆酸转化为异丁烯由FMN-依赖性脱羧酶通过基于1,3-偶极环加成的机理催化，其中所述FMN依赖性脱羧酶使用由任何上述相关的FMN异戊烯转移酶提供的异戊二烯化的黄素辅因子(FMN或FAD)。
在一个优选的实施方案中，催化3-甲基巴豆酸脱羧为异丁烯的所述FMN依赖性脱羧酶由阿魏酸脱羧酶(FDC)催化。阿魏酸脱羧酶(FDC)属于酶类EC 4.1.1.-。
在甚至更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯使用源自酿酒酵母(Uniprot登录号Q03034)，肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)(Uniprot登录号V3P7U0),短小芽孢杆菌(Uniprot登录号Q45361)，黑曲霉(Uniprot登录号A2R0P7)或杜氏假丝酵母(Candida dubliniensis)(Uniprot登录号B9WJ66)的阿魏酸脱羧酶(FDC)。
在一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的阿魏酸脱羧酶(FDC)是来源于酿酒酵母(Uniprot登录号Q03034；SEQ ID NO:48)，肠杆菌属物种(Uniprot登录号V3P7U0；SEQID NO:49)，短小芽孢杆菌(Uniprot登录号Q45361；SEQ ID NO:50)，黑曲霉(Uniprot登录号A2R0P7；SEQ ID NO:51)或杜氏假丝酵母(Uniprot登录号B9WJ66；SEQ ID NO:52)的阿魏酸脱羧酶(FDC)，分别具有SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51和SEQID NO:52中所示的氨基酸序列。
在另一个更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化为异丁烯利用原儿茶酸脱羧酶(EC 4.1.1.63)。
因此，在一个优选实施方案中，3-甲基巴豆酸向异丁烯的转化由原儿茶酸(PCA)脱羧酶(EC 4.1.1.63)催化。已知PCA脱羧酶(也称为AroY)催化下述反应，即原儿茶酸(PCA)向儿茶酚的酶促转化(Johnson et al.,Metabolic Engineering Communications 3(2016),111):
这种酶存在于多种生物中，并且例如在产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，红假单胞菌属物种(Rhodopseudomonas sp.)，和Sedimentibacter hydroxybenzoicus中描述。
在本发明的一个优选实施方案中，用于本发明方法的PCA脱羧酶是PCA脱羧酶，其来源于肺炎克雷伯氏菌(Uniprot登录号B9AM6)，Leptolyngbya sp.(Uniprot登录号A0A0S3U6D8)或者Phascolarctobacterium sp.(Uniprot登录号R6IIV6)。
在一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的PCA脱羧酶是来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)(SEQ ID NO:78)，Leptolyngbya sp.(SEQ ID NO:80)或Phascolarctobacterium sp.(SEQ ID NO:81)的酶。
在本发明的优选实施方案中，PCA脱羧酶是包含选自SEQ ID NO:78,80和81的氨基酸序列或与SEQ ID NO:78,80和81中的任一个有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
在本发明的优选实施方案中，阿魏酸脱羧酶(FDC)是包含选自SEQ ID NO:48至52的氨基酸序列或与SEQ ID NO:48至52中的任一个有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
在另一个优选的实施方案中，催化3-甲基巴豆酸脱羧为异丁烯的所述FMN依赖性脱羧酶是与上述阿魏酸脱羧酶(FDC)密切相关的酶，即3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶(也称为UbiD)。3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶属于分类为EC：4.1.1.-的UbiD脱羧酶家族。
在一个更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化为异丁烯利用3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶(UbiD)，所述酶源自Hypocrea atroviridis(UniProt登录号G9NLP8)，Sphaerulina musiva(UniProt登录号M3DF95)，Penecillinum requeforti(UniProt登录号W6QKP7)，Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici(UniProt登录号W9LTH3)，库德里酵母(Saccharomyces kudriavzevii)(UniProt登录号J8TRN5)，酿酒酵母，寄生曲霉，白假丝酵母，Grosmannia clavigera，大肠杆菌(Uniprot登录号P0AAB4)，巨大芽孢杆菌(Uniprot登录号D5DTL4)，Methanothermobacter sp.CaT2(Uniprot登录号T2GKK5)，龟亚科分枝杆菌1518(Uniprot登录号X8EX86)或阴沟肠杆菌(Uniprot登录号V3DX94)。
在甚至更优选的实施方案中，用于本发明方法的3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶(UbiD)是3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶(UbiD)，所述酶来自大肠杆菌(Uniprot登录号P0AAB4；SEQ ID NO:53)，巨大芽孢杆菌(Uniprot登录号D5DTL4；SEQ ID NO:54)，Methanothermobacter sp.CaT2(Uniprot登录号T2GKK5；SEQ ID NO:55),龟亚科分枝杆菌1518(Uniprot登录号X8EX86；SEQ ID NO:56)，Atroviridis Hypocrea(SEQ ID NO:57)，Sphaerulina musiva(SEQ ID NO:58)，Penecillinum requeforti(SEQ ID NO:59)，Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici(SEQ ID NO:61)，库德里夫氏酵母(Saccharomyces kudriavzevii)(SEQ ID NO:62)，酿酒酵母(SEQ ID NO:63)，白假丝酵母(SEQ ID NO:64)，Grosmannia clavigera(SEQ ID NO:65)或阴沟肠杆菌(SEQ ID NO:79)，分别具有SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQID NO:64,SEQ ID NO:65,和SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
在本发明的优选实施方案中，3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶(UbiD)是包含选自SEQ ID NO:53-65的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53至65和SEQ ID NO:79中的任何一个有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
如上所述，另一方面，3-甲基巴豆酸脱羧酶可优选为乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)。这种脱羧酶不需要与FMN异戊烯转移酶结合，如对上述脱羧酶所述，因此不需要提供异戊二烯化辅因子。
因此，在一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸向异丁烯的转化由乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)催化。乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)已被描述为催化下列反应：
这种酶存在于各种生物中，例如已经描述在Aspergillus itaconicus，土曲霉，智人和小鼠中。在一个优选实施方案中，本发明方法中用于将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)是源自土曲霉(UniProt登录号B3IUN8)，智人(UniProt登录号A6NK06)或小鼠(UniProt登录号P54987)的乌头酸脱羧酶。
在一个优选的实施方案中，在本发明的方法中用于将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)是源自土曲霉的乌头酸脱羧酶(SEQ ID NO:66)。
在本发明的优选实施方案中，乌头酸脱羧酶是包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或与SEQ ID NO:66具有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
如上所述，另一方面，3-甲基巴豆酸脱羧酶可优选为甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.4)。这种脱羧酶不需要与FMN异戊烯转移酶结合，如为上述脱羧酶所述，因此不需要提供异戊二烯化辅因子。
因此，在一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化为异丁烯由甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)催化。甲基巴豆酰辅酶A羧化酶已被描述为催化下列反应：
即羧化，但它们也可以用于催化脱羧反应。甲基巴豆酰辅酶A羧化酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物，动物，真菌和细菌。例如，已经在野胡萝卜(Daucuscarota)，大豆(Glycine max)，大麦(Hordeum vulgare)，豌豆(Pisum sativum)，番茄(Solanum lycopersicum)，马铃薯，玉米，拟南芥属，兵豆(Lens culinaris)，智人，欧洲牛(Bos taurus)，褐家鼠，小鼠(Mus musculus)，真鲷(Pagrus major),构巢裸孢壳(Emericella nidulans)，铜绿假单胞菌，香矛醇假单胞菌，扁桃假单胞菌，发酵氨基酸球菌，大肠杆菌，分枝杆菌属种和无色杆菌属物种中描述了所述酶。
在一个优选的实施方案中，在本发明的方法中用于将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的甲基巴豆基辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)是来源于扁桃假单胞菌的甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(SEQ ID NO:67)。
在本发明的优选实施方案中，甲基巴豆基辅酶A羧化酶是包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列或与SEQ ID NO:67有至少n％同一性的序列的酶，其中n是10到100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
在另一个优选的实施方案中，在本发明的方法中用于将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的甲基巴豆基辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)是源自黄色粘球菌(Myxcoxoccus xanthus)的甲基巴豆酰辅酶A羧化酶。在黄色粘球菌中，liuB基因编码具有两个亚基AibA和AibB的酶(Li et al.,Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)。衍生自黄色粘球菌的甲基巴豆酰辅酶A羧化酶是被注释为戊烯二酰辅酶A转移酶亚基A和B(SEQ ID NO:100和101)的异二聚酶。
在本发明的一个优选实施方案中，甲基巴豆酰辅酶A羧化酶是包含SEQ ID NO:100或101的氨基酸序列或与SEQ ID NO:100或101有至少n％同一性的序列的酶，其中n是10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
如上所述，另一方面，3-甲基巴豆酸脱羧酶可以优选为香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)。这种脱羧酶不需要与FMN异戊烯转移酶结合，如对上述脱羧酶所述，因此不需要提供异戊二烯化辅因子。
因此，在另一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸经脱羧转化成异丁烯由香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)催化。香叶酰辅酶A羧化酶天然地催化下列反应：
酶在真核生物和原核生物，如植物和细菌中发生。该酶例如在野胡萝卜，大豆，玉米，假单胞菌属，铜绿假单胞菌，香矛醇假单胞菌和门多萨假单胞菌中有描述。
另一方面，3-甲基巴豆酸脱羧酶可优选为6-甲基水杨酸脱羧酶(EC 4.1.1.52)。
因此，在另一个优选的实施方案中，6-甲基水杨酸脱羧酶(EC 4.1.1.52)催化3-甲基巴豆酸经由脱羧转化为异丁烯。6-甲基水杨酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.52)天然地催化下列反应：
该酶在多种生物中发生，特别是在真核生物和原核生物如细菌和真菌中。该酶例如描述于棒曲霉(UniProt登录号T1PRE6)，灰黄青霉和弗氏黑腐皮壳(Valsa friesii)中。
在一个优选的实施方案中，本发明方法中用于将3-甲基巴豆酸经脱羧转化成异丁烯的6-甲基水杨酸脱羧酶(EC 4.1.1.52)是源自棒曲霉(Aspergillus clavatus)的6-甲基水杨酸脱羧酶(SEQ ID NO:68)。
在本发明的优选实施方案中，6-甲基水杨酸脱羧酶是包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或与SEQ ID NO:68有至少n％同一性的序列的酶，其中n是10到100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有通过脱羧将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
另一方面，3-甲基巴豆酸脱羧酶可优选为2-氧代-3-己烯二酸脱羧酶(EC4.1.1.77)。
因此，在另一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸经由脱羧转化为异丁烯由2-氧代-3-己烯二酸脱羧酶(EC 4.1.1.77)催化。2-氧代-3-己烯二酸脱羧酶(EC 4.1.1.77)天然地催化下列反应：
该酶在各种生物中发生，特别是在原核生物如细菌中。例如，该酶已在博德特菌属，Cupriavidus nexator，嗜热脂肪地芽孢杆菌(UniProt登录号B0VXM8)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)中描述。
在一个优选的实施方案中，用于本发明方法中的将3-甲基巴豆酸通过脱羧转化为异丁烯的2-氧代-3-己烯二酸脱羧酶(EC 4.1.1.77)是来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的2-氧代-3-己烯二酸脱羧酶(SEQ ID NO:69)。
在本发明的优选实施方案中，2-氧代-3-己烯二酸脱羧酶是包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与SEQ ID NO:69具有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有通过脱羧将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
在另一种可能性中，3-甲基巴豆酸脱羧酶可优选为5-氧代戊-3-烯-1,2,5-三羧酸脱羧酶(EC 4.1.1.68)。
因此，在另一个优选实施方案中，通过5-氧代戊-3-烯-1,2,5-三羧酸脱羧酶(EC4.1.1.68)催化3-甲基巴豆酸经脱羧转化为异丁烯。5-氧代戊-3-烯-1,2,5-三羧酸脱羧酶(EC 4.1.1.68)天然地催化下列反应：
该酶已被描述为在诸如细菌的原核生物中发生。该酶已经在例如大肠杆菌和都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)中有描述。
在一个优选的实施方案中，用于本发明方法中的将3-甲基巴豆酸通过脱羧转化成异丁烯的5-氧代戊-3-烯-1,2,5-三羧酸脱羧酶(EC 4.1.1.68)为来自都柏林沙门氏菌的5-氧代戊-3-烯-1,2,5-三羧酸脱羧酶(SEQ ID NO:70)。
在本发明的优选实施方案中，5-氧代戊-3-烯-1,2,5-三羧酸脱羧酶是包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列或与SEQ ID NO:70具有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酸经由脱羧转化为异丁烯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸：如图1所示步骤II
根据本发明的方法转化成异丁烯的3-甲基巴豆酸本身可以通过酶促反应来提供。
根据本发明，3-甲基巴豆酸可以通过图1中示意性显示的不同途径提供。
因此，根据一种选择，3-甲基巴豆酸本身可通过将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供。图3中示意性说明3-羟基异戊酸(HIV)向3-甲基巴豆酸的酶促转化(图1所示的步骤II)。
根据本发明，3-羟基异戊酸(HIV)向所述3-甲基巴豆酸的酶促转化优选利用催化β-羟酸(即，例如3-羟基异戊酸(HIV))脱水成α，β-不饱和酸(即，例如3-甲基巴豆酸)的酶。术语“脱水”通常是指涉及去除H2O的反应。催化3-羟基异戊酸(HIV)脱水的酶是催化如图3所示的反应的酶。优选地，这种酶属于水解酶家族(EC 4.2.-.-)。
分类为EC 4.2.-.-(即，水解酶)的这类酶的优选实例是：
乌头酸酶(EC 4.2.1.3)；
延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)；和
烯酰辅酶A水合酶/脱水酶(EC 4.2.1.17)。
因此，在一个优选实施方案中，通过使用乌头酸酶(EC 4.2.1.3)实现3-羟基异戊酸(HIV)到3-甲基巴豆酸的酶促转化。乌头酸酶(EC 4.2.1.3)(也称为乌头酸酶水合酶)是催化下列反应的酶：
该酶从多种生物中已知，包括真核生物和原核生物，如植物，动物，真菌和细菌。该酶例如描述于假挪威槭(Acer pseudoplatanus)，Advenella kashmirensis，拟南芥，黑曲霉，蜡样芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，脆弱拟杆菌，欧洲牛(Bos taurus)，秀丽隐杆线虫，柑橘(Citrus elementina)，Canis lupus familiaris，谷氨酸棒状杆菌，黑腹果蝇，大肠杆菌，大豆，幽门螺杆菌，智人，小鼠，结核分枝杆菌，本氏烟草，恶性疟原虫，铜绿假单胞菌，褐家鼠，黑鼠(Rattus rattus)，酿酒酵母，解脂复膜孢酵母(Saccharomycopsis lipolytica)，肠沙门氏菌，白芥(Sinapis alba)，苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)，马铃薯，金色链霉菌(Streptomyces aureus)，产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)，酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)，硫矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)，野猪(Sus scorfa)，血红色陀螺孔菌(Trametes sanguinea)，布氏锥虫，野油菜黄单胞菌，Xanthomonas euvesicatoria，解脂耶氏酵母和玉米。
在一个优选的实施方案中，乌头酸酶(EC 4.2.1.3)来自Advenella kashmirensis(TrEMBL登录号B3TZE0)，脆弱拟杆菌(SwissProt登录号Q8RP87)，秀丽隐杆线虫(SwissProt登录号Q23500)，Citrus elementina(UniProt登录号D3GQL0，D3GQL1或D3GQL2)，黑腹果蝇(SwissProt登录号Q9NFX3或Q9NFX2)，大肠杆菌(SwissProt登录号P36683或UniProt登录号P25516)，智人(UniProt登录号P21399或Q99798)，小鼠(UniProt登录号P28271)，褐家鼠(UniProt登录号Q9ER34或Q63270)，野猪(UniProt登录号P16276)或布氏锥虫(SwissProt登录号Q9NJQ8或Q9NJQ9)。
在一个优选的实施方案中，在本发明的方法中用于将3-羟基异戊酸(HIV)转化成3-甲基巴豆酸的乌头酸酶(EC 4.2.1.3)是来源于大肠杆菌的乌头酸酶(SEQ ID NO:71)。
在本发明的优选实施方案中，乌头酸酶是包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列或与SEQ ID NO:71具有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99并且其中所述酶具有将3-羟基异戊酸(HIV)转化成3-甲基巴豆酸的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
在另一个优选的实施方案中，通过使用延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)实现3-羟基异戊酸(HIV)到3-甲基巴豆酸的酶促转化。延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)(也称为延胡索酸酶水合酶)是催化下列反应的酶：
该酶从多种生物中已知，包括真核生物和原核生物，如植物，动物，真菌和细菌。该酶，例如，已经描述于拟南芥，猪蛔虫，维涅兰德固氮菌，黄色短杆菌，结肠弯曲杆菌，胎儿弯曲杆菌，空肠弯曲杆菌，产氨棒杆菌，谷氨酸棒杆菌，欧文氏菌属菌种，大肠杆菌，小眼虫，嗜热脂肪土芽孢杆菌，Gluconacetobacter diazotrophicus，幽门螺杆菌，智人，硕大利什曼原虫，冰叶日中花，结核杆菌，Pelotomaculum thermopropionicum，豌豆，铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌，Pycobaculum neutrophilum，褐家鼠，米根霉，普氏立克次体，贝酵母，酿酒酵母，番茄，马铃薯，天蓝色链霉菌，浅青紫链霉菌，Streptomyces thermovulgaris，硫矿硫化叶菌,野猪,栖热菌属物种(Thermus sp.),嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)和玉米。
在一个优选的实施方案中，延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)来自拟南芥(UniProt登录号P93033或Q9FI53)，猪蛔虫(SwissProt登录号Q8NRN8)，谷氨酸棒状杆菌(UniProt登录号P28271)，大肠杆菌(P05042)，智人(SwissProt登录号P07954)，结核分枝杆菌(P9WN93)，Pycobaculum neutrophilum(UniProt登录号B1Y931或B1Y932)，米根霉(UniProt登录号P55250)，普氏立克次体(UniProt登录号Q9ZCQ4)，酿酒酵母(SwissProt登录号P08417)，Streptomyces thermovulgaris(SwissProt登录号A5Y6J1)或硫矿硫化叶菌(UniProt登录号P39461)。
在一个优选的实施方案中，用于将3-羟基异戊酸(HIV)转化成3-甲基巴豆酸的本发明方法中所用的延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)是来源于大肠杆菌的延胡索酸酶(SEQ ID NO:72)。
在本发明的优选实施方案中，延胡索酸酶是包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列或与SEQ ID NO:72有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选为10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99并且其中所述酶具有将3-羟基异戊酸(HIV)转化成3-甲基巴豆酸的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
在另一个优选的实施方案中，通过使用烯酰辅酶A水合酶/脱水酶(EC4.2.1.17)实现3-羟基异戊酸(HIV)到3-甲基巴豆酸的酶促转化。烯酰辅酶A水合酶/脱水酶(EC4.2.1.17)催化下列反应：
烯酰辅酶A水合酶是通常水合酰基辅酶A上第二个和第三个碳原子之间的双键的酶。但是，它也可以用于催化反向反应。
烯酰辅酶A水合酶/脱水酶(EC 4.2.1.17)也称为3-羟酰基辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A水合酶。两种酶催化相同的反应，而这些酶中的一种的名称表示相应反应的一个方向，而另一种名称表示逆反应。由于反应是可逆的，因此可以使用两种酶名称。
这种酶也称为巴豆酸酶，天然参与代谢脂肪酸以产生乙酰辅酶A和能量。已经描述了属于这一类的酶存在于，例如大鼠(褐家鼠)，人(智人)，小鼠(Mus musculus)，野猪(Susscrofa)，欧洲牛(Bos taurus)，大肠杆菌，丙酮丁醇梭菌和氨基丁酸梭菌(Clostridiumaminobutyricum)。已经例如，对于大鼠，人类和枯草芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌确定了这些酶的核苷酸和/或氨基酸序列。原则上，任何能够催化3-羟基异戊酸(HIV)转化为3-甲基巴豆酸的烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)都可用于本发明的上下文中。在优选的实施方案中，烯酰辅酶A水合酶是Galactomyces reessii的烯酰辅酶A水合酶(Dhar et al.,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.28(2002),81-87)，枯草芽孢杆菌的烯酰辅酶A水合酶(Uniprot G4PBC3；SEQ ID NO:38)或炭疽芽孢杆菌的烯酰辅酶A水合酶(Uniprot Q81YG6；SEQ ID NO:39)。
在一个优选的实施方案中，用于本发明方法中的烯酰辅酶A水合酶具有如SEQ IDNO:38或39中任一个所示的氨基酸序列，或显示与SEQ ID NO:38或39中任一个具有至少x％同源性的氨基酸序列，并且具有烯酰辅酶A水合酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，其中这种酶能够如上所述将3-羟基异戊酸(HIV)转化成3-甲基巴豆酸。关于同一性的程度的确定，上文所述同样适用。
丙酮和乙酰辅酶A向3-羟基异戊酸(HIV)的酶促缩合：如图1所示步骤III
根据本发明的方法转化成3-甲基巴豆酸的3-羟基异戊酸(HIV)本身可以通过酶促反应，即丙酮和乙酰辅酶A向所述3-羟基异戊酸(HIV)的酶促缩合来提供。丙酮和乙酰辅酶A向所述3-羟基异戊酸(HIV)的缩合(如图1所示步骤III)在图4中示意性地示出。
因此，本发明还涉及由丙酮制备异丁烯的方法，其中丙酮首先与乙酰辅酶A缩合成3-羟基异戊酸(HIV)，然后将其转化为3-甲基巴豆酸。此外，如上所述，然后将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯。
根据本发明，丙酮和乙酰辅酶A缩合成3-羟基异戊酸(HIV)优选利用能够催化丙酮的氧代碳原子(即C＝O)和乙酰辅酶A，特别是乙酰辅酶A的甲基之间形成共价键的酶。根据该反应方案，丙酮的氧代基团作为亲电体反应并且乙酰辅酶A的甲基基团作为亲核体反应。丙酮和乙酰辅酶A转化的一般反应显示在图4中。能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)的酶是本领域已知的并且已经描述于例如WO 2011/032934。
优选地，用于丙酮和乙酰辅酶A到3-羟基异戊酸(HIV)的酶促缩合的酶是具有HMGCoA合酶(EC2.3.3.10)和/或PksG蛋白的活性的酶和/或具有C-C键裂解/缩合裂合酶如HMGCoA裂合酶(EC 4.1.3.4)的活性的酶。
HMG CoA合酶已被描述用于各种生物。
SEQ ID NO:1至16给出了来自不同生物的HMG CoA合酶的实例。SEQ ID NO:1显示秀丽隐杆线虫的细胞质HMG CoA合酶的序列(P54871，gene bank F25B4.6)，SEQ ID NO:2显示粟酒裂殖酵母的细胞质HMG CoA合酶的序列(裂殖酵母；P54874)，SEQ ID NO:3显示酿酒酵母的细胞质HMG CoA合酶的序列(面包酵母；P54839，gene bank CAA65437.1)，SEQ IDNO:4显示拟南芥的细胞质HMG CoA合酶的序列(Mouse-ear cress；P54873)，SEQ ID NO:5显示盘基网柄菌的细胞质HMG CoA合酶的序列(粘菌；P54872，gene bank L2114)，SEQ ID NO:6显示德国小蠊细胞质HMG CoA合酶的序列(德国小蠊；P54961，gene bank X73679)，SEQ IDNO:7显示原鸡的细胞质HMG CoA合酶的序列(鸡；P23228，gene bank CHKHMGCOAS)，SEQ IDNO:8显示智人的细胞质HMG CoA合酶的序列(人；Q01581，gene bank X66435)，SEQ ID NO:9显示智人的线粒体HMG CoA合酶的序列(人；P54868，gene bank X83618)，SEQ ID NO:10显示盘基网柄菌的线粒体HMG CoA合酶的序列(粘菌；Q86HL5，gene bank XM_638984)，SEQ IDNO:11显示表皮葡萄球菌的HMG CoA合酶的序列(Q9FD76)，SEQ ID NO:12显示发酵乳杆菌的HMG CoA合酶的序列(B2GBL1)，SEQ ID NO:13显示热水银丝球菌的HMG CoA合酶的序列(A2BMY8)，SEQ ID NO:14显示Chloroflexus aggregans的HMG CoA合酶的序列(B8G795)，SEQ ID NO:15显示德氏乳杆菌的HMG CoA合酶的序列(Q1GAH5)，SEQ ID NO:16显示溶血葡萄球菌Q4L958的HMG CoA合酶的序列(与野生型蛋白相比I98>V差异)。
在本发明的优选实施方案中，HMG CoA合酶是包含选自SEQ ID NO:1至16的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至16有至少n％同一性的序列并且具有HMG CoA合酶的活性的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99。
关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
可用于丙酮和乙酰辅酶A缩合成3-羟基异戊酸的蛋白质的另一个例子是PksG蛋白质。在本申请的上下文中，术语“PksG蛋白质”或“具有PksG蛋白质活性的蛋白质/酶”是指能够催化由PksG蛋白质天然催化的反应的任何酶，即将来自乙酰-S-AcpK(Ac-S-AcpK)的-CH2COO-转移至连接至PksL蛋白的一个硫醇化结构域的β-酮硫酯聚酮化合物中间体。这是类似于HMG CoA合酶催化的反应，不同之处在于磷酸泛酰基部分的乙酰硫酯与载体蛋白而不是部分辅酶A连接。虽然PksG蛋白在它自然催化的反应中将乙酰基从乙酰-S-AcpK转移到受体，先前已经显示PksG蛋白也可以实现通常由HMG CoA合酶催化的反应，即从乙酰乙酰CoA和乙酰CoA开始合成HMG CoA。
PksG蛋白的实例在SEQ ID NO:17和18中给出。优选地，PksG蛋白是包含与SEQ IDNO:17或18具有至少n％同一性的氨基酸序列并具有PksG蛋白质活性的酶，n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99。
SEQ ID NO:17显示枯草芽孢杆菌(P40830)的PksG蛋白的氨基酸序列，SEQ ID NO:18显示海分枝杆菌(B2HGT6)的PksG蛋白的氨基酸序列。
关于序列同一性程度的确定，上面关于HMG CoA合酶所阐述的同样适用。
“C-C键断裂/缩合裂合酶”的实例尤其包括分类为异丙基苹果酸合酶(EC2.3.3.13)，高柠檬酸合酶(EC2.3.3.14)或4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶(EC 4.1.3.39)的酶。异丙基苹果酸合酶催化下列反应： 这些酶的实例是来自流产布鲁杆菌(菌株2308；Q2YRT1)的相应酶和来自Hahella chejuensis(菌株KCTC 2396；Q2SFA7)的相应酶。
高柠檬酸合酶(EC 2.3.3.14)是催化化学反应 4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶催化化学反应
在EC号EC 4.1.3.4中分类为“HMG CoA裂合酶”或“具有HMG CoA裂合酶活性的蛋白质/酶”的酶的实例在SEQ ID NO:19至25中给出。SEQ ID NO:19显示了玉米HMG CoA裂合酶的序列(登录号B6U7B9，gene bank ACG45252)，SEQ ID NO:20显示了鮐(Danio rerio)的HMG CoA裂合酶的序列(Brachydanio rerio；A8WG57，gene bank BC154587)，SEQ ID NO:NO：21显示欧洲牛的HMG CoA裂合酶的序列(Uniprot登录号Q29448)，SEQ ID NO:22显示智人的HMG CoA裂合酶的序列(线粒体，Uniprot登录号P35914，gene bank HUMHYMEGLA)，SEQID NO:23显示恶臭假单胞菌的HMG CoA裂合酶的序列(Q88H25)，SEQ ID NO:24显示鲍氏不动杆菌的HMG CoA裂合酶的序列(B7H4C6)，SEQ ID NO:25显示嗜热栖热菌的HMG CoA裂合酶的序列(Q72IH0)。
在本发明的优选实施方案中，HMG CoA裂合酶是包含选自SEQ ID NO:19至25的氨基酸序列的酶或与SEQ ID NO:19至25至少有n％同一性的序列并且具有HMG CoA裂合酶活性的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99。
关于序列同一性程度的确定，上面关于HMG CoA合酶所阐述的同样适用。
将乙酰乙酸酶促转化为丙酮：如图1所示的步骤IV
根据本发明的方法转化成3-羟基异戊酸(HIV)的丙酮本身可以通过酶促反应提供，即乙酰乙酸转化为丙酮。乙酰乙酸转化成丙酮(图1所示的步骤IV)在图5中示意性地示出。该反应是脱羧反应并且是在能够产生丙酮的生物即梭状芽孢杆菌属的生物中天然发生的反应。
因此，本发明还涉及由乙酰乙酸生产异丁烯的方法，其中首先将乙酰乙酸转化为丙酮，然后将其与乙酰辅酶A缩合成3-羟基异戊酸(HIV)，然后如上文所述将其转化为3-甲基巴豆酸。此外，如上所述，所述3-甲基巴豆酸然后转化为异丁烯。
根据本发明，乙酰乙酸转化成所述丙酮优选使用乙酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.4)。来自编码该酶的几种生物的核苷酸序列是本领域已知的，例如，来自丙酮丁醇梭菌(Uniprot登录号P23670和P23673)，拜季林斯基梭菌(Clostridium beijerinckii)(Clostridium MP；Q9RPK1)，巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)(Uniprot登录号P81336)，短根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)(菌株BTAi1/ATCC BAA-1182；Uniprot登录号A5EBU7)，鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)(ATCC 10399 A9LBS0)，鼻疽伯克霍尔德氏菌(Uniprot登录号A3MAE3)，鼻疽伯克霍尔德氏菌FMH A5XJB2，Burkholderiacenocepacia(Uniprot登录号A0B471)，Burkholderia ambifaria(Uniprot登录号Q0b5P1)，Burkholderia phytofirmans(Uniprot登录号B2T319)，伯霍尔德杆菌属种(Burkholderiaspec.)(Uniprot登录号Q38ZU0)，肉毒梭菌(Uniprot登录号B2TLN8)，皮氏罗尔斯顿菌(Uniprot登录号B2UIG7)，黑胡桃链霉菌(Streptomyces nogalater)(Uniprot登录号Q9EYI7)，阿维链霉菌(Uniprot登录号Q82NF4)，嗜肺军团病杆菌(Legionellapneumophila)(Uniprot登录号Q5ZXQ9)，唾液乳杆菌(Uniprot登录号Q1WVG5)，红球菌属(Uniprot登录号Q0S7W4)，植物乳杆菌(Uniprot登录号Q890G0)，豌豆根瘤菌(Uniprot 登录号Q1M911)，干酪乳杆菌(Uniprot登录号Q03B66)，土拉热弗朗西丝菌(Uniprot登录号Q0BLC9)，红色糖多孢菌(Uniprot登录号A4FKR9)，Korarchaeum cryptofilum(Uniprot登录号B1L3N6)，解淀粉芽孢杆菌(Uniprot登录号A7Z8K8)，异旋腔孢菌(Cochliobolusheterostrophus)(Uniprot登录号Q8NJQ3)，Sulfolobus islandicus(Uniprot登录号C3ML22)和土拉热弗朗西丝氏菌全北区亚种(Francisella tularensissubsp.Holarctica)(菌株OSU18)的adc基因。
在一个优选的实施方案中，用于本发明方法中的将乙酰乙酸转化成丙酮的乙酰乙酸脱羧酶是来自丙酮丁醇梭菌(Uniprot登录号P23670和P23673)的乙酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.4)。
乙酰乙酰辅酶A到乙酰乙酸的酶促转化：如图1所示的步骤Va和步骤Vb
根据本发明的方法转化成丙酮的乙酰乙酸本身可以通过酶促反应提供，即乙酰乙酰辅酶A到乙酰乙酸的酶促转化。乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸可以通过两种不同途径来实现。一种可能性是通过将乙酰乙酰辅酶A的CoA硫酯水解为乙酰乙酸将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸。该反应(图1所示的步骤Va)在图6中示意性地示出。在另一个更优选的方面，将乙酰乙酰辅酶A的CoA基团转移到乙酸上，导致形成乙酰乙酸和乙酰辅酶A。该反应(图1中所示的步骤Vb)在图7中示意性地示出。
因此，本发明还涉及由乙酰乙酰辅酶A生产异丁烯的方法，其中乙酰乙酰辅酶A首先转化为乙酰乙酸，然后转化成丙酮，然后丙酮与乙酰辅酶A缩合成为3-羟基异戊酸(HIV)，其然后如上所述转化成3-甲基巴豆酸。此外，如上所述，所述3-甲基巴豆酸然后转化为异丁烯。
如所提及的，一方面，乙酰乙酰辅酶A的CoA硫酯被水解以产生乙酰乙酸。根据本发明的这个方面，通过优选利用天然催化该反应的乙酰乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.11)实现乙酰乙酰辅酶A到乙酰乙酸的酶促转化。
乙酰乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.11)催化下列反应：
这种酶从各种生物中已知并且例如已经在真核生物中被描述。该酶例如在欧洲牛，野鸽(Columba livia)，原鸡，智人，小鼠，裂喉大麻哈鱼(Oncorhynchus mykiss)，日本大耳白兔(Oryctolagus cuniculus)或褐家鼠中已有描述。因此，在优选的实施方案中，酶来自选自牛属(Bos)，鸽属(Columba)，鸡属(Gallus)，小鼠属(Mus)，大麻哈鱼属(Oncorhynchus)，穴兔属(Oryctolagus)和鼠属(Rattus)的属。在一个更优选的实施方案中，所述酶来自选自欧洲牛，野鸽(Columba livia)，原鸡，智人，小鼠，裂喉大麻哈鱼(Oncorhynchus mykiss)，日本大耳白兔(Oryctolagus cuniculus)或褐家鼠的物种。
如上所述，在另一种更优选的可能性中，将乙酰乙酰辅酶A的CoA基团转移至乙酸上，导致形成乙酰乙酸和乙酰辅酶A。根据本发明的这种可能性，通过优选利用能够将乙酰乙酰辅酶A的CoA基团转移到乙酸上的酶来实现乙酰乙酰辅酶A到乙酰乙酸的酶促转化。
优选地，能够将乙酰乙酰辅酶A上的CoA基团转移到乙酸上的这种酶属于辅酶A转移酶家族(EC 2.8.3.-)。
因此，本发明涉及一种通过利用能够将乙酰乙酰辅酶A的CoA基团转移到乙酸上的酶，优选辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)将乙酰乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酸的方法。可以用于本发明的方法中的催化乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸的酶的优选实例为分类为乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.8)的酶。
乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)催化下列反应：
乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)已知来自各种生物，例如来自大肠杆菌，其中它由atoD基因atoA基因编码(UniProt登录号P76458和P76459)。乙酸辅酶A转移酶也从丙酮丁醇梭菌已知，其中它由ctfAB基因编码。因此，在本发明的一个优选实施方案中，乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.8)用于将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸，其来自大肠杆菌并由atoD基因atoA基因编码(UniProt登录号P76458和P76459)或来自丙酮丁醇梭菌(Clostrtidiumacetobutylicum)并且由ctfAB基因编码。
3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的酶促转化：如图1所示的步骤VI
3-甲基丁烯酸可以通过以下描述的另一种可能的途径提供。
因此，在另一个实施方案中，转化成异丁烯的3-甲基巴豆酸本身可以通过另一个酶促反应提供，即3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶促转化。图8中示意性地示出了3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸(如图1所示步骤VI)。
3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的转化可以例如以不同的方式实现，例如通过以下描述的并且如图1所示的三种备选的酶途径(如图1所示的步骤VIa，步骤VIb或步骤VIc)。
因此，3-甲基巴豆酰辅酶A到3-甲基巴豆酸的酶促转化可以通过以下方式实现
(a)将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化为3-甲基巴豆酸的单个酶促反应，优选通过使用辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)，优选丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC2.8.3.1)，乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)或琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.18)(如图1所示步骤VIa)；
(b)将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化为3-甲基巴豆酸的单个酶促反应，优选通过利用硫酯水解酶(EC 3.1.2.-)，优选乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)，ADP依赖性短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)或酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)(如图1所示步骤VIb)；或
(c)两个酶促步骤，包含
(i)首先将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酰磷酸酯；和
(ii)然后将由此获得的3-甲基巴豆酰磷酸酯酶促转化成所述3-甲基巴豆酸(如图1所示步骤VIc)。
因此，一种可能性是从3-甲基巴豆酰辅酶A通过3-甲基巴豆酰磷酸酯转化为3-甲基巴豆酸的两步转化。其他两个选项涉及将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化为3-甲基巴豆酸。这三个选项将在下面讨论。
因此，在一个实施方案中，通过两个酶促步骤实现3-甲基巴豆酰辅酶A到3-甲基巴豆酸的酶促转化，所述两个酶步骤包括(i)首先将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酰磷酸酯；(ii)然后将如此获得的3-甲基巴豆酰磷酸酯酶促转化成所述3-甲基巴豆酸(如图1的步骤VIc所示)。相应的反应如图11所示。
例如，可以通过使用磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC2.3.1.8)实现3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酰磷酸酯的转化。
磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)天然地催化下列反应
Wiesenborn等人(Appl.Environ.Microbiol.55(1989),317-322)和Ward等人(J.Bacteriol.181(1999),5433-5442)已经描述了除了丁酰辅酶A(丁酰辅酶A)以外，磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)可以使用许多底物，特别是乙酰辅酶A，丙酰辅酶A，异丁酰辅酶A，戊酰辅酶A和异戊酰辅酶A。
已经描述了该酶在许多生物中发生，特别是在细菌和原生动物中。在一个实施方案中，酶来自原生动物Dasytricha ruminantium。在一个优选的实施方案中，磷酸丁酰转移酶是来自细菌的磷酸丁酰转移酶，优选来自芽孢杆菌属，丁酸弧菌属，肠球菌属或梭菌属的细菌，更优选肠球菌属或梭菌属，甚至更优选来自巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)，丙酮丁醇梭菌，拜季林斯基梭菌，酪酸梭菌，克鲁维氏梭菌，Clostridium saccharoacetobutylicum，产孢梭菌或粪肠球菌。最优选地，酶来自丙酮丁醇梭菌，特别是由ptb基因(Uniprot登录号F0K6W0；Wiesenborn等(Appl.Environ.Microbiol.55(1989)，317-322))编码的酶或来自粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(Uniprot登录号K4YRE8；Ward等(J.Bacteriol.181(1999)，5433-5442))。
在一个优选的实施方案中，通过使用来自丙酮丁醇梭菌，优选来自丙酮丁醇梭菌菌株ATCC 824的磷酸丁酰基转移酶实现3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酰磷酸酯的转化。所述蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:26。
当然，不仅可以使用精确显示SEQ ID NO:26的该氨基酸的酶。也可以使用包含与SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列有至少60％同一性的序列的酶。优选地，与SEQ ID NO:26的序列同一性为至少70％，更优选至少80％，85％或90％，甚至更优选91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％和特别优选至少99％并且该酶具有将3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酰磷酸酯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
在另一个优选的实施方案中，通过使用来自枯草芽孢杆菌的磷酸丁酰转移酶，优选来自枯草芽孢杆菌的具有UniProt登录号P54530的磷酸丁酰转移酶，实现3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酰磷酸酯的转化。所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:73所示。
在本发明的优选实施方案中，磷酸丁酰转移酶是包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与SEQ ID NO:73至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酰磷酸酯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
在另一个优选的实施方案中，通过使用来自粪肠球菌，优选来自粪肠球菌的具有UniProt登录号S4BZL5的磷酸丁酰基转移酶，实现3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酰磷酸酯的转化。所述蛋白质的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:74中。
在本发明的优选实施方案中，磷酸丁酰转移酶是包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与SEQ ID NO:74有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酰磷酸酯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)自然催化下列反应
Veit等人(J.Biotechnol.140(2009),75-83)已经描述磷酸乙酰转移酶也可用作底物丁酰辅酶A或丙酰辅酶A。
InterPro数据库中该酶家族的登录号是IPR012147和IPR002505，"http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002505"_
(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR012147
http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002505)
另见http://pfam.sanger.ac.uk/family/PF01515
该酶已被描述于各种生物中，特别是细菌和真菌。因此，在一个优选的实施方案中，所述酶是来自细菌，优选埃希氏菌属，氯菌属(Chlorogonium)，梭菌属，韦荣球菌属，甲烷八叠球菌属，棒杆菌属，瑞格氏菌属，沙门氏菌属，固氮菌属，布拉多根瘤菌属，乳杆菌属，莫雷拉菌属，红假单胞菌属，大豆根瘤菌属，链球菌属，栖热袍菌属或芽孢杆菌属，更优选大肠杆菌，Chlorogonium elongatum，克鲁佛梭菌，丙酮丁醇梭菌，尿酸梭菌，小韦荣球菌，嗜热甲烷八叠球菌(嗜热甲烷八叠球菌)，谷氨酸棒状杆菌，Ruegeria pomeroyi，肠沙门氏菌，维涅兰德固氮菌，大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，发酵乳杆菌，Lactobacillussanfranciscensis，热乙酸穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)，沼泽红假单胞菌，苜蓿中华根瘤菌，酿脓链球菌，喜温海洋杆菌或枯草芽孢杆菌的酶。在另一个优选的实施方案中，酶是来自真菌的酶，优选来自酵母属，更优选来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)种的酶。
在一个优选的实施方案中，通过使用来自谷氨酸棒杆菌，优选谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 13032的磷酸乙酰转移酶实现3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酰磷酸酯的转化。所述蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:27。
当然，不仅可以使用精确显示SEQ ID NO:27的该氨基酸的酶。也可以使用包含与SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列有至少60％同一性的序列的酶。优选地，与SEQ ID NO:27的序列同一性为至少70％，更优选至少80％，85％或90％，甚至更优选91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％和特别优选至少99％，并且该酶具有将3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酰磷酸酯的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
3-甲基巴豆酰磷酸酯向3-甲基巴豆酸的转化可以例如通过利用分类为EC2.7.2.-的酶，即磷酸转移酶来实现。这种酶使用羧基作为受体。因此，例如可以通过使用具有羧基作为受体的酶(EC 2.7.2.-)来实现3-甲基巴豆酰磷酸酯向3-甲基巴豆酸的转化。在一个优选的实施方案中，通过使用丙酸激酶(EC 2.7.2.15)，乙酸激酶(EC2.7.2.1)，丁酸激酶(EC2.7.2.7)或支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)，将3-甲基巴豆酰磷酸酯转化为3-甲基巴豆酸。
丁酸激酶(EC 2.7.2.7)自然催化下列反应
Hartmanis(J.Biol.Chem.262(1987),617-621)已经描述了丁酸激酶除了丁酸之外还可以使用许多底物，例如戊酸，异丁酸，异戊酸和乙酸乙烯酯。该酶已被描述于多种生物中，特别是细菌。在一个优选的实施方案中，酶来自细菌，优选来自梭菌属，丁酸弧菌属，栖热袍菌属或肠球菌属的细菌。优选的是梭菌属。更优选地，酶来自丙酮丁醇梭菌，Clostridium proteoclasticum，酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)，破伤风形梭菌(Clostridium tetanomorphum)，Butyrivibrio firbrosolvens，Butyrivibrio hungatei，海栖热袍菌或耐久肠球菌的细菌。优选丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。对于这种生物，已经描述了两种丁酸激酶：丁酸激酶1(Uniprot登录号：Q45829)和丁酸激酶II(Uniprot登录号：Q97II19)。
在另一个优选的实施方案中，通过利用来自乳杆菌的丁酸激酶，优选来自干酪乳杆菌(UniProt登录号K0N529)或来自地芽孢杆菌属的丁酸激酶，优选来自地芽孢杆菌属种的(UniProt登录号L8A0E1)丁酸激酶，实现3-甲基巴豆酰磷酸向3-甲基巴豆酸的转化。这些蛋白质的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76中。
在本发明的优选实施方案中，丁酸激酶是包含SEQ ID NO:75或76的氨基酸序列或与SEQ ID NO:75或76有至少n％同一性的序列的酶，其中n是在10到100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酰磷酸转化为3-甲基巴豆酸的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)天然催化下列反应
其中“烷基羧酸”可以是2-甲基丁酸，丁酸，异丁酸，戊酸或丙酸。对于来自螺旋体的支链脂肪酸激酶已描述了与丙酸的后一反应(J.Bacteriol.152(1982),246-54)。
这种酶已被描述为发生在许多细菌中。因此，在一个优选的实施方案中，酶是来自细菌的酶，优选螺旋体属或栖热袍菌属的酶，更优选为海栖热袍菌(Thermotoga maritime)的酶。
丙酸激酶(EC 2.7.2.15)自然催化下列反应
已经描述了这种酶在许多细菌，特别是肠杆菌科细菌中发生。因此，在一个优选的实施方案中，酶是来自细菌，优选沙门氏菌属或埃希氏菌属，更优选肠沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌的酶。
在一个优选的实施方案中，通过使用来自鼠伤寒沙门氏菌，优选来自鼠伤寒沙门氏菌菌株ATCC 700720的丙酸激酶，实现3-甲基巴豆酰磷酸转化为3-甲基巴豆酸。所述蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:28。
当然，不仅可以使用精确显示SEQ ID NO:28的该氨基酸的酶。还可以使用包含与SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列有至少60％同一性的序列的酶。优选地，与SEQ ID NO:28的序列同一性为至少70％，更优选至少80％，85％或90％，甚至更优选91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％和特别优选至少99％并且该酶具有将3-甲基巴豆酰磷酸转化为3-甲基巴豆酸的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
在另一个优选的实施方案中，通过使用来自大肠杆菌，优选来自大肠杆菌菌株K12的丙酸激酶，实现3-甲基巴豆酰磷酸向3-甲基巴豆酸的转化。所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示。
当然，不仅可以使用精确显示SEQ ID NO:29的该氨基酸的酶。还可以使用包含与SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列至少60％同一性的序列的酶。优选地，与SEQ ID NO:29的序列同一性为至少70％，更优选至少80％，85％或90％，甚至更优选91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％和特别优选至少99％并且该酶具有将3-甲基巴豆酰磷酸转化为3-甲基巴豆酸的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
乙酸激酶(EC 2.7.2.1)自然催化下列反应
已经描述这种酶发生在许多生物中，特别是细菌和真核生物。在一个优选实施方案中，所述酶来自细菌，优选来自甲烷八叠球菌属，隐球菌属，Ethanoligenens，丙酸杆菌属，Roseovarius，链球菌属，沙门氏菌属，无胆甾支原体属，不动杆菌属，阿耶罗菌属，芽孢杆菌属，疏螺旋体属，黑毛菌属，梭菌属，球孢菌属，Coprinopsis，隐球菌属，Cupriavidus，脱硫弧菌属，肠球菌属，埃希氏菌属，Ethanoligenes，土芽孢杆菌属，螺杆菌属，乳杆菌属，乳球菌属，李斯特菌属，中间原体属，穆尔氏菌属，支原体属，Oceanobacillus，丙酸杆菌属，Rhodospeudomonas，Roseovarius，沙门氏菌，葡萄球菌，栖热袍菌属或韦荣球菌属，更优选来自嗜热甲烷八叠球菌，新型隐球菌，Ethanoligenens harbinense，丙酸丙酸杆菌，肺炎链球菌，肠道链球菌，酿脓链球菌，拉氏无胆甾支原体(Acholeplasma laylawii)，醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)，荚膜阿耶罗菌(Ajellomyces capsulatus)，枯草芽孢杆菌，布氏疏螺旋体，球毛壳菌，丙酮丁醇梭菌，热纤梭菌，粗球孢子菌，Coprinopsiscinerea，新型隐球酵母，钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)，普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，大肠杆菌，Ethanoligenes harbinense，嗜热脂肪地芽孢杆菌，幽门螺杆菌，德氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌，Lactobacillus sanfranciscensis，乳乳球菌，单核细胞增生利斯特菌，Meshanma florum，噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)，马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)，热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)，肺炎支原体，Oceanobacillus iheyensis，费氏丙酸杆菌，丙酸丙酸杆菌，沼泽红假单胞菌(Rhodospeudomonas palustris)，肠沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，海栖热袍菌或小韦荣球菌的细菌。
在另一个优选的实施方案中，酶是来自真菌，优选来自曲霉属，赤霉菌属，肉座菌属，稻温病菌，Phaeosphaeria，白腐真菌，疫霉属，核盘菌属，Uncinocarpus，黑粉菌属或脉孢菌属的真菌的酶，甚至更优选来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，构巢曲霉，玉米赤霉，红褐肉座菌，Magnaporthe grisea，Phaeosphaeria nodorum，Phaneosporicchrysosporium，Phytophthora ramorum，大豆疫霉，Sclerotinia sclerotiorum，Uncinocarpus reesii，Ustilago maydis或粗糙脉孢菌种的真菌。
在进一步优选的实施方案中，所述酶是来自植物或藻类的酶，优选来自衣藻属，甚至更优选来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
在另一个实施方案中，酶来自内阿米巴属的生物，更优选来自溶组织内阿米巴种。
已经证明上述适合将3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酰磷酸的酶家族与进化有关并含有共同的序列特征。这些特征在Prosite数据库中被引用和描述：
http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/nicedoc.pl？PS01075
Gao et al.(FEMS Microbiol.Lett.213(2002),59-65)已经描述了基因修饰的大肠杆菌细胞，所述基因修饰的大肠杆菌细胞特别是用来自丙酮丁醇梭菌的分别编码磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和丁酸激酶(EC 2.7.2.7)的ptb基因和buk基因进行了转化。已显示这些大肠杆菌细胞能够产生D-(-)-3-羟基丁酸(3HB)。
如上所述，3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的转化也可以通过两种替代转化来实现，其中3-甲基巴豆酰辅酶A被直接转化为3-甲基巴豆酸。
优选地，在一个实施方案中，通过利用属于硫酯水解酶(在下文中称为硫酯酶(EC3.1.2.-))家族的酶将3-甲基巴豆酰辅酶A的硫酯键水解为3-甲基巴豆酸，将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化为3-甲基巴豆酸。该反应如图10所示。
优选的硫酯水解酶(EC 3.1.2.-)的实例是乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)，ADP依赖性短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)和酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)(如图1所示步骤VIb)。
在备选实施方案中，优选通过利用属于辅酶A转移酶家族(EC 2.8.3.-)的酶将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化为3-甲基巴豆酸。该反应在图9中示意性地示出。
优选的辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)的实例是丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC2.8.3.1)，乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)和琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.18)(如图1所示的步骤VIa)。
硫酯酶(TEs；也被称为硫酯水解酶)是分类为EC 3.1.2的酶。目前，硫酯酶分类为EC 3.1.2.1至EC 3.1.2.30，而尚未分类/未分类的TE被分组为属于EC 3.1.2.-的酶。Cantuet al.(Protein Science 19(2010),1281-1295)描述了存在23个家族的硫酯酶，其关于一级结构彼此无关。但是，假设同一家族的所有成员基本上具有相同的三级结构。硫酯酶水解羰基和硫原子之间的硫酯键。
在优选的实施方案中，用于将3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸的根据本发明的方法中使用的硫酯酶选自：
-乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)；
-棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)；
-3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.4)；
-油酰基-[酰基-载体-蛋白]水解酶(EC 3.1.2.14)；
-依赖ADP的短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)；
-ADP依赖性中链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.19)；和
-酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)。
因此，在一个优选实施方案中，通过利用乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)实现3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的直接转化。乙酰辅酶A水解酶是催化下列反应的酶：
乙酰辅酶A+H2O→乙酸+CoA
该酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物，动物，真菌和细菌。所述酶例如已在褐家鼠(Uniprot登录号：Q99NB7)，小鼠，野猪，欧洲牛，原鸡，Platyrrhini，绵羊，金仓鼠，猪蛔虫，智人(Uniprot登录号：Q8WYK0)，豌豆，黄瓜，Panicus sp.，蓖麻，马铃薯，菠菜，玉米，大豆，酿酒酵母，粗糙脉孢菌，白假丝酵母，布氏锥虫，克氏锥虫，Trypanosoma dionisii，Trypanosoma vespertilionis，Clitidia fasciculate，氨基戊酸梭菌(Clostridium aminovalericum)，Acidaminococcus fermaentans，大豆根瘤菌和Methanosarcina barkeri中描述。
在另一个优选的实施方案中，通过使用棕榈酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.2)实现3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的直接转化。棕榈酰辅酶A水解酶是催化下列反应的酶：
棕榈酰辅酶A+H2O→棕榈酸+CoA
该酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物，动物，真菌和细菌。例如，该酶已经描述于拟南芥(Uniprot登录号：Q8GYW7)，豌豆，菠菜，Bumilleriopsisfiliformis，Eremosphaera viridis，Mougeotia scalaris，Euglena gracilis，Rhodotorula aurantiaca，酿酒酵母，皱褶假丝酵母，秀丽隐杆线虫，小鼠(Uniprot登录号：P58137)，智人，阔鼻类(Platyrrhini)，欧洲牛，家犬(Canis lupus familiaris)，野猪，豚鼠，鸽属种，灰仓鼠，金仓鼠，黑腹果蝇，褐家鼠，日本大耳白兔，原鸡，Anas platyrhynchos，结核分枝杆菌，草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)，耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)，Acinetobacter colcaceticus，流感嗜血杆菌，幽门螺杆菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌，Rhodobacter shpaeroides，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)和大肠杆菌。
在进一步优选的实施方案中，通过使用3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.4)实现3-甲基巴豆酰辅酶A到3-甲基巴豆酸的直接转化。3-羟基异丁酰辅酶A水解酶是催化下列反应的酶：
3-羟基异丁酰辅酶A+H2O→3-羟基异丁酸+CoA
这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物，动物，真菌和细菌。该酶例如在拟南芥，智人，狗，褐家鼠，蜡状芽孢杆菌，荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌中有描述。
在又一个优选实施方案中，通过使用油酰基-[酰基-载体-蛋白]水解酶(EC3.1.2.14)实现3-甲基巴豆酰辅酶A到3-甲基巴豆酸的直接转化。油酰基-[酰基-载体-蛋白]水解酶是催化下列反应的酶：
油酰基-[酰基-载体-蛋白]+H2O→油酸+[酰基-载体-蛋白]
这种酶在各种植物和细菌中发生。该酶例如已在拟南芥，南欧蒜，南瓜，葫芦(Cuphea calophylla)，萼距花(Cuphea hookeriana)，披碱草(Cuphea lanceolata)，灰树花(Cuphea wrightii)，加州猪苓(Umbellularia californica),芫荽,菠菜,油茶属(Elaeis sp.),油椰(Elaeis guineensis),大豆,鳄梨(Persea americana),豌豆，白芥(Sinapis alba)，美国榆(Ulmus americana)，玉米，芥菜(Brassica juncea)，欧洲油菜，Brassica rapa subsp.campestris,麻疯树，蓖麻，樟树(Cinnamomum camphorum)，四叶澳洲坚果(Macadamia tetraphylla)，马钱子(Magnifera indica)，长叶马府油树(Madhucalongifolia)，毛白杨(Populus tomentosa)，蜡梅(Chimonanthus praecox)，陆地棉(Gossypium hirsutum)，藏榄(Diploknema butyracea)，向日葵和酿脓链球菌中描述。
在又一个优选实施方案中，3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的直接转化通过利用依赖ADP的短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)实现。依赖于ADP的短链酰基辅酶A水解酶是催化下列反应的酶：
酰基辅酶A+H2O→羧酸+CoA
这种酶存在于多种动物中，例如在小鼠(Mus musculus)，褐家鼠和金仓鼠(Mesocricetus auratus)中有描述。
在又一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的直接转化通过利用ADP依赖性中链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.19)实现。依赖于ADP的中链酰基辅酶A水解酶是催化下列反应的酶：
酰基辅酶A+H2O→羧酸+CoA
这种酶存在于各种动物中，例如已在褐家鼠和金仓鼠中描述过。
在进一步优选的实施方案中，通过利用酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)实现3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的直接转化。酰基辅酶A水解酶是催化下列反应的酶：
酰基辅酶A+H2O→羧酸+CoA
该酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物，动物，真菌和细菌。例如，该酶已经描述于拟南芥，橙黄红酵母(Rhodotorulaaurantiaca)，Bumilleriopsisfiliformis，绿色蜘蛛(Eremosphaera viridis)，小眼虫(Euglena gracilis)，小鼠(Musmusculus)，褐家鼠，智人，野猪(Susscrofa)，欧洲牛(Bos taurus)，Cais lupusfamiliaris，家豚鼠(Cavia porcellus)，灰仓鼠(Cricetus griseus)，黑腹果蝇，扁头鸭(Anas platyrhynchos)，原鸡(Gallus gallus)，秀丽隐杆线虫，酿酒酵母，皱褶假丝酵母，大肠杆菌，流感嗜血杆菌，野油菜黄单胞菌，链霉菌属，天蓝色链霉菌，粪产碱杆菌，铜绿假单胞菌,恶臭假单胞菌，地中海拟无枝酸菌，醋酸钙不动杆菌，幽门螺杆菌，红假单胞菌和草分枝杆菌。在一个优选的实施方案中，酰基辅酶A水解酶是来自大肠杆菌，来自恶臭假单胞菌或来自流感嗜血杆菌的酶，更优选来自大肠杆菌的YciA酶或来自流感嗜血杆菌的密切相关的同源物HI0827(Zhuang et al.,Biochemistry 47(2008),2789-2796)。描述了来自流感嗜血杆菌的YciA酶催化丙酰辅酶A水解成丙酸(Zhuang et al.,Biochemistry 47(2008),2789-2796)。在另一个优选的实施方案中，乙酰辅酶A水解酶是来自智人的酶(UniProt：Q9NPJ3)，其被描述为水解丙酰辅酶A(Cao等人，Biochemistry 48(2009)，1293-1304)。
特别优选的酶是来自流感嗜血杆菌菌株R2866的上述酰基辅酶A水解酶YciA酶(SEQ ID NO:30)和来自智人的乙酰辅酶A水解酶(UniProt：Q9NPJ3；SEQ ID NO:31)。特别优选的还有来自大肠杆菌的酰基辅酶A硫酯水解酶(Uniprot P0A8Z0；SEQ ID NO:32)，来自大肠杆菌的酰基辅酶A硫酯酶2(Uniprot P0AGG2；SEQ ID NO:33)和来自恶臭假单胞菌的酰基辅酶A硫酯酶II(Uniprot Q88DR1；SEQ ID NO:34)。特别优选的是来自大肠杆菌K12的硫酯酶TesB(uniprot：P0AGG2)，因为已经描述该酶在大肠杆菌中有效地催化该反应以生物合成丙酸(Tseng和Prather，PNAS 2012,109(44)，p17925-17930)。
在另一个优选的实施方案中，酰基辅酶A水解酶是衍生自1,4-二羟基-2-萘甲酰基辅酶A水解酶家族的酶。已知1,4-二羟基-2-萘甲酰基辅酶A水解酶家族的这些酶催化下列反应：
1,4-二羟基-2-萘甲酰基辅酶A+H2O→1,4-二羟基-2-萘甲酸+CoA
这些酶通常也被称为Ydil硫酯酶。这个家族的酶存在于多种生物中，例如在大肠杆菌和肠沙门氏菌中有描述。
因此，用于将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成本发明的3-甲基巴豆酸的特别优选的酰基辅酶A水解酶是属于1,4-二羟基-2-萘甲酰基辅酶A水解酶家族的酶，更优选来源于大肠杆菌的1,4-二羟基-2-萘甲酰基辅酶A水解酶(SEQ ID NO:82)或来源于肠沙门氏菌的1,4-二羟基-2-萘甲酰基辅酶A水解酶(SEQ ID NO:83)。
在特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的酰基辅酶A水解酶具有如SEQ IDNO:30至34和SEQ ID NO:82和83中任一个所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:30至34和SEQ ID NO:82和83中的任何一个至少x％同源的氨基酸序列并且具有酰基辅酶A水解酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，其中所述酶能够催化3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
如上所述，3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的直接转化也可以通过利用分类为辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)的酶实现，所述酶能够将3-甲基巴豆酰辅酶A的CoA基团转移到羧酸。
辅酶A转移酶存在于来自所有家系的生物中。大多数辅酶A转移酶属于两个熟知的酶家族(在下文中被称为家族I和II)并且存在已经在细菌的无氧代谢途径中鉴定的第三家族。在(FEBS Letters 509(2001),345-349)中可以找到描述不同家族的综述。
家族I包含例如以下辅酶A转移酶：
对于3-氧代酸：分类在EC 2.8.3.5或EC 2.8.3.6中的酶；
对于短链脂肪酸：分类在EC 2.8.3.8或EC 2.8.3.9中的酶；
对于琥珀酸：琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶，即分类在EC 2.8.3.18中的酶(还参见Mullins et al.,Biochemistry 51(2012),8422-34；Mullins et al.,J.Bacteriol.190(2006),4933-4940)。
家族I的大多数酶天然使用琥珀酰辅酶A或乙酰辅酶A作为CoA供体。这些酶在不同的聚集状态中含有两个不同的亚基。已经鉴定了两个保守的氨基酸序列基序：
Prosites条目PS01273(http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/prosite-search-ac？PDOC00980)
COA_TRANSF_1,PS01273；Coenzyme A transferases signature 1(PATTERN)
共有序列模式:
[DN]-[GN]-x(2)-[LIVMFA](3)-G-G-F-x(3)-G-x-P
和
Prosites条目PS01273(http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/prosite-search-ac？PDOC00980)
COA_TRANSF_2,PS01274；Coenzyme A transferases signature 2(PATTERN)
共有序列模式:
[LF]-[HQ]-S-E-N-G-[LIVF](2)-[GA]
E(谷氨酸)是活性位点残基。
辅酶A转移酶家族II由柠檬酸裂合酶(EC 2.8.3.10)和柠苹酸裂合酶(EC2.8.3.11)的同型二聚体α亚基组成。这些酶催化含有共价结合的CoA-衍生物的酰基载体蛋白(ACP)的转移。已经表明，在柠檬酸裂合酶的情况下，这些酶在体外也接受游离的CoA-硫酯，例如乙酰辅酶A，丙酰辅酶A，丁酰辅酶A(Dimroth et al.,Eur.J.Biochem.80(1977),479-488)，在柠苹酸裂合酶的情况下接受乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A(Dimroth et al.,Eur.J.Biochem.80(1977),469-477)。
根据Heider(上述引文)，辅酶A转移酶家族III由甲酰基辅酶A：草酸辅酶A转移酶，琥珀酰辅酶A：(R)-苯甲基琥珀酸辅酶A转移酶，(E)-肉桂酰基辅酶A：(R)-苯基乳酸辅酶A转移酶和丁酸甜菜碱基-CoA:(R)-肉碱辅酶A转移酶组成。家族III的另一个成员是琥珀酰辅酶A：L-苹果酸辅酶A转移酶，其在橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的自养CO2固定中的功能是用琥珀酰辅酶A作为CoA供体将L-苹果酸活化为其CoA硫酯(Friedman S.etal.J.Bacteriol.188(2006),2646-2655)。该家族的辅酶A转移酶的氨基酸序列仅显示与家族I和II家族的氨基酸序列低程度的序列同一性。这些辅酶A转移酶存在于原核生物和真核生物中。
在一个优选的实施方案中，用于根据本发明的方法中的辅酶A转移酶是属于如上文所述的家族I或II的辅酶A转移酶。
优选地，用于将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化为3-甲基巴豆酸的根据本发明的方法中使用的辅酶A转移酶选自：
-丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)；
-乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)；和
-丁酸-乙酰乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.9)。
因此，在一个优选的实施方案中，通过使用乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.8)实现3-甲基巴豆酰辅酶A到3-甲基巴豆酸的直接转化。乙酸辅酶A转移酶是催化下列反应的酶：
这种酶存在于各种细菌中，例如在Anaerostipes caccae，霍氏真杆菌(Eubacterium hallii),Faecalibacterium prausnitzii，Roseburia hominis，Roseburiaintestinalis,粪球菌属和大肠杆菌中描述。
在另一个优选的实施方案中，通过使用丁酸-乙酰乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.9)实现3-甲基巴豆酰辅酶A到3-甲基巴豆酸的直接转化。丁酸-乙酰乙酸辅酶A转移酶是催化下列反应的酶：
这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如动物和细菌。该酶例如已在欧洲牛(Bos taurus)，梭菌属(Clostridium sp.)和大肠杆菌中描述。
在另一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化成3-甲基巴豆酸是通过使用丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)实现的。丙酸：乙酸-辅酶A转移酶是催化下列反应的酶：
这种酶存在于包括原核生物在内的多种生物中，并且该酶例如描述于克氏梭菌(Clostridium kluyveri)，丙酸梭菌(Clostridium propionicum)，丙酸梭菌JCM1430，钩虫贪铜菌和构巢裸孢壳(Emericella nidulans)中。
在另一个优选的实施方案中，通过使用琥珀酰辅酶A：乙酸-辅酶A转移酶(EC2.8.3.18)实现3-甲基巴豆酰辅酶A到3-甲基巴豆酸的直接转化。琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶是催化下列反应的酶：
这种酶存在于多种生物中，包括原核生物，并且该酶例如描述于醋酸杆菌(Acetobacter aceti)，阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)，胎儿毛滴虫(Tritrichomonas foetus)，胎儿毛滴虫ATCC 30924和布氏锥虫(Trypanosoma brucei)。
在另一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的直接转化通过利用源自巨球菌属的辅酶A转移酶(Uniprot登录号S7HFR5)来实现，这是一种属于上文定义的辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)的酶。
在一个优选的实施方案中，用于本发明方法中的辅酶A转移酶是来源于巨球菌属的辅酶A转移酶(Uniprot登录号S7HFR5；SEQ ID NO:84)。
在本发明的一个优选实施方案中，辅酶A转移酶是包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列或与SEQ ID NO:84有至少n％同一性的序列的酶，其中n是10到100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化成3-甲基巴豆酸的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的酶促转化：上述步骤VI的备选途径
在另一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基巴豆酸的转化通过备选途径实现，其中3-甲基巴豆酰辅酶A首先酶促转化成3-甲基丁酰辅酶A，其然后酶促转化成3-甲基丁酸，3-甲基丁酸然后最终转化为3-甲基巴豆酸。图32中示意性说明3-甲基巴豆酰辅酶A经由3-甲基丁酰辅酶A和3-甲基丁酸向3-甲基巴豆酸的这种备选转化。
因此，本发明涉及由3-甲基巴豆酰辅酶A制备异丁烯的方法，其中3-甲基巴豆酰辅酶A首先被酶促转化成3-甲基丁酰辅酶A，然后将其酶促转化成3-甲基丁酸，然后将3-甲基丁酸转化成3-甲基巴豆酸，然后如上所述将3-甲基巴豆酸进一步转化成异丁烯。
第一种酶转化，即3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基丁酰辅酶A的转化是去饱和反应，即将3-甲基巴豆酰辅酶A的双键C＝C还原成3-甲基丁酰辅酶A。3-甲基巴豆酰辅酶A向3-甲基丁酰辅酶A的酶促转化，即3-甲基巴豆酰辅酶A中双键的还原可以例如通过使用分类为EC1.3._._.的酶来实现。分类为EC 1.3._._的酶是作用于供体分子的CH-CH基团的氧化还原酶。这个亚类含有可逆催化两个碳原子之间碳-碳单键转化成碳-碳双键的酶。依赖于接纳体，将EC 1.3的亚类分类。在一个优选的实施方案中，该酶是分类为EC 1.3._._并使用NADH或NADPH作为辅因子的酶。
在一个特别优选的实施方案中，该酶是使用NADPH作为辅因子的酶。在优选的实施方案中，酶选自：
-酰基辅酶A脱氢酶(NADP+)(EC 1.3.1.8)；
-烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Si-特异性)(EC 1.3.1.10)；
-顺-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)(EC 1.3.1.37)；
-反-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)(EC 1.3.1.38)；
-烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Re-特异性)(EC 1.3.1.39)；和
-巴豆酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.86)。
因此，在一个优选的实施方案中，通过利用酰基辅酶A脱氢酶(NADP+)(EC1.3.1.8)，实现3-甲基巴豆酰辅酶A转化成3-甲基丁酰辅酶A。酰基辅酶A脱氢酶是催化以下反应的酶：
这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物、真菌和细菌。例如已经在欧洲牛(Bos taurus)、褐家鼠(Rattus novegicus)、小鼠(Mus musculus)、鸽属物种(Columba sp.)、拟南芥(拟南芥)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、韭葱(南欧蒜)、纤细裸藻(Euglena gracilis)、白假丝酵母(Candida albicans)、Streptococcuscollinus、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)和耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)中描述该酶。
在又一个优选的实施方案中，通过利用烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Si-特异性)(EC 1.3.1.10)，实现3-甲基巴豆酰辅酶A转化成3-甲基丁酰辅酶A。烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Si-特异性)是催化以下反应的酶：
这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、真菌和细菌。例如，已经在红花(Carthamus tinctorius)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Streptococcus collinus，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽孢杆菌(蜡状芽孢杆菌)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)和肠沙门氏菌(Salmonella enterica)中描述该酶。
在又一个优选的实施方案中，通过利用顺-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)(EC1.3.1.37)，实现3-甲基巴豆酰辅酶A转化成3-甲基丁酰辅酶A。顺-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)是催化以下反应的酶：
已经据称这种酶出现在大肠杆菌(Escherichia coli)中。
在又一个优选的实施方案中，通过利用反-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)(EC1.3.1.38)，实现3-甲基巴豆酰辅酶A转化成3-甲基丁酰辅酶A。反-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)是催化以下反应的酶：
这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物和细菌。例如已经在智人(Homo sapien)、褐家鼠、小鼠、豚鼠(Cavia porcellus)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、Streptococcus collinu和大肠杆菌中描述该酶。
在又一个优选的实施方案中，通过利用烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Re-特异性)(EC 1.3.1.39)，实现3-甲基巴豆酰辅酶A转化成3-甲基丁酰辅酶A。烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Re-特异性)是催化以下反应的酶：
这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如动物和细菌。例如已经在原鸡(Gallus gallus)、鸽、褐家鼠、豚鼠(Cavia porcellus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和牙龈卟啉单胞菌中描述该酶。
在又一个优选的实施方案中，通过利用巴豆酰辅酶A还原酶(EC1.3.1.86)，实现3-甲基巴豆酰辅酶A转化成3-甲基丁酰辅酶A。巴豆酰辅酶A还原酶是催化以下反应的酶：
这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如动物、真菌和细菌。例如已经在欧洲牛(Bos taurus)、Salinospora tropica、艰难梭菌(Clostridium difficile)、Streptomyces collinus、肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中描述该酶。
第二酶促转化，即3-甲基丁酰辅酶A转化成3-甲基丁酸可以通过不同的酶促转化来实现。一种可能性是通过水解反应的直接转化。另一种可能性是通过辅酶A转移酶催化的反应的直接转化，第三种可能性是通过3-甲基丁酰磷酸的两步转化。
因此，根据本发明，3-甲基丁酰辅酶A到3-甲基丁酸的酶促转化通过以下实现：
(a)单个酶促反应，其中优选通过使用辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)，优选丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC)，乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)或琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.18)将3-甲基丁酰辅酶A直接转化为3-甲基丁酸；
(b)单个酶促反应，其中优选通过利用硫酯水解酶(EC 3.1.2.-)，优选乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)，依赖ADP的短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)或酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)将3-甲基丁酰辅酶A直接转化为3-甲基丁酸；或
(c)包含以下的两个酶促步骤
(i)首先将3-甲基丁酰辅酶A酶促转化成3-甲基丁酰磷酸；和
(ii)然后将由此获得的3-甲基丁酰磷酸酶促转化成所述3-甲基丁酸。
关于辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)，丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)，乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)或琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.18)，硫酯水解酶(EC3.1.2.-)，乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)，ADP依赖性短链酰基辅酶A水解酶(EC3.1.2.18)，酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)，能够将3-甲基丁酰辅酶A转化为3-甲基丁酰磷酸的酶和能够将3-甲基丁酰磷酸转化为所述3-甲基丁酸的酶的优选实施方案，如以上关于根据本发明的步骤VIa，步骤VIb和步骤VIc的酶促转化所阐述的同样适用。
第三酶促转化，即3-甲基丁酸转化成3-甲基巴豆酸可以例如通过2-烯酸还原酶(EC1.3.1.31)来实现。2-烯酸还原酶是天然催化以下反应的酶：
这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如动物、真菌和细菌。例如已经在菊苣(Cichorium intybus)、地钱(Marchantia polymorpha)、番茄(Solanumlycopersicum)、灰绿犁头霉(Absidia glauca)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、桔青霉(Penicillium citrinum)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、酿酒酵母、科氏梭菌、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌病、戈氏梭菌(Clostridium ghonii)、芒氏梭菌(Clostridium mangenotii)、海洋梭菌(Clostridium oceanicum)、索氏梭梭菌(Clostridium sordellii)、生孢梭菌、斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)、酪丁酸梭菌、无色杆菌属物种(Achromobacter sp.)、伯克霍尔德菌属物种(Burkholderia sp.)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、干酪乳杆菌、恶臭假单胞菌、希瓦氏菌属物种(Shewanella sp.)、伯氏耶尔森菌(Yersiniabercovieri)、枯草芽孢杆菌、热醋穆尔氏菌和厌氧消化链球菌(Peptostreptococcusanaerobius)中描述该酶。已经例如在Tischler等人(Eur.J.Bioche.97(1979),103-112)中描述梭菌科(Clostridiae)的烯醇还原酶。
3-甲基戊烯二酰辅酶A到3-甲基巴豆酰辅酶A的酶促转化：如图1所示步骤VII
3-甲基巴豆酰辅酶A本身可以通过酶促反应提供，即3-甲基戊烯二酰辅酶A到3-甲基巴豆酰辅酶A的酶促转化，3-甲基巴豆酰辅酶A按照上述任一方法根据本发明的方法转化为3-甲基巴豆酸(并且根据本发明的方法进一步转化为根据上述任一方法的异丁烯)。图12中示意性说明3-甲基戊烯二酰辅酶A到3-甲基巴豆酰辅酶A的转化。
因此，本发明涉及由3-甲基戊烯二酰辅酶A制备异丁烯的方法，其中3-甲基戊烯二酰辅酶A首先转化为3-甲基巴豆酰辅酶A，然后将3-甲基巴豆酰辅酶A进一步转化成3-甲基巴豆酸，然后将3-甲基巴豆酸进一步转化成如上所述的异丁烯。
3-甲基戊烯二酰辅酶A到3-甲基巴豆酰辅酶A的转化可以由不同的酶催化。根据本发明，3-甲基戊烯二酰辅酶A到所述3-甲基巴豆酰辅酶A的转化优选使用(i)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或(ii)香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)(如图1的步骤VII所示)。
甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.4)和香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)以及这些酶类的优选酶已在上文中描述。因此，关于这些酶，如上所述同样适用于3-甲基戊烯二酰辅酶A到3-甲基巴豆酰辅酶A的转化。
在一个优选的实施方案中，3-甲基戊烯二酰辅酶A借助脱羧转化成3-甲基巴豆酰辅酶A由3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶(例如liuB基因编码的黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)的3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶)催化。这个基因编码具有两个亚基AibA和AibB的酶(Li等人,Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)。
在3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的情况下，该酶已经在上文中描述为源自黄色粘球菌(Myxcoxoccus xanthus)的甲基巴豆酰辅酶A羧化酶。
上面已经关于SEQ ID NOs:100和101描述了由liuB基因编码的具有两个亚基AibA和AibB的源自黄色粘球菌的相同酶(Li et al.,Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)，并且所述酶还可以用于通过脱羧将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酰辅酶A。
在本发明的优选实施方案中，3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶是包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列或与SEQ ID NO:100有至少n％同一性的序列的酶，其中n是在10到100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。在本发明的另一个优选实施方案中，3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶是包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列或与SEQ ID NO:101有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
在本发明的另一个优选实施方案中，3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶是包含SEQ IDNO:100和101的氨基酸序列或与SEQ ID NO:100和101有至少n％同一性的序列的组合的异二聚体酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化：如图1所示的步 骤VIII
转化为3-甲基巴豆酰辅酶A的3-甲基戊烯二酰辅酶A本身可通过酶促反应提供，即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A；见图13。
因此，本发明还涉及由3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A制备异丁烯的方法，其中首先将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为3-甲基戊烯二酰辅酶A，然后将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酰辅酶A，然后将3-甲基巴豆酰辅酶A进一步转化为3-甲基巴豆酸，然后如上所述的将3-甲基巴豆酸进一步转化为异丁烯。
根据本发明，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化是天然存在的酶促脱水反应，并且其例如通过分类为3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC4.2.1.18)催化。因此，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化优选使用3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)(如图1的步骤VIII所示)。
3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶是催化下列反应的酶：
这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物，动物和细菌。该酶例如在Catharantus roseus，智人，牛(Bos taurus)，绵羊(Ovis aries)，不动杆菌属(Acinetobacter sp.)，粘球菌属和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中描述。在一个优选的实施方案中，3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶是来自粘球菌属的酶，并且甚至更优选具有如SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列，或显示与SEQ ID NO:35至少x％同源的氨基酸序列的酶并且具有3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，其中这样的酶能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A，如前所述。关于确定同一性的程度，上文所述同样适用。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到3-甲基戊烯二酰辅酶A的转化还可以通过利用已经鉴定的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A脱水酶活性来实现，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A脱水酶例如在黄色粘球菌中鉴定并且其由liuC基因编码(Li et al.,Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)。衍生自黄色粘球菌的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A脱水酶具有Uniprot登录号Q1D5Y4。
因此，在一个优选的实施方案中，用于本发明方法的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A脱水酶是来源于黄色粘球菌的酶(Uniprot登录号Q1D5Y4；SEQ ID NO:98)。
在本发明的优选实施方案中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A脱水酶是包含SEQ IDNO:98的氨基酸序列或与SEQ ID NO:98有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化还可以通过使用3-羟基酰基辅酶A脱水酶或烯酰辅酶A水合酶来实现。3-羟酰基辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A水合酶催化相同的反应，而这些酶之一的名称表示相应反应的一个方向，而另一名称表示逆反应。由于反应是可逆的，因此可以使用两种酶名称。
3-羟酰基辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A水合酶属于分类为EC 4.2.1.-的酶。
3-羟基酰基辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A水合酶例如已经在假单胞菌属，鲍氏不动杆菌(Uniprot登录号A0A0D5YDD4)，铜绿假单胞菌(Uniprot登录号Q9HZV7)，Marinobactersantoriniensis(Uniprot登录号M7CV63)，Pseudomonas knackmussii，假产碱假单胞菌(Uniprot登录号L8MQT6)，弯曲假单胞菌和Alcanivorax dieselolei以及玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)(Uniprot登录号Q4PEN0)，芽孢杆菌GeD10(Uniprot登录号N1LWG2)和Labilithrix luteola(Uniprot登录号A0A0K1PN19)中鉴定。
在一个优选的实施方案中，用于将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为3-甲基戊烯二酰辅酶A的本发明方法中使用的3-羟基酰基辅酶A脱水酶/烯酰辅酶A水合酶是来源于假单胞菌属物种(SEQ ID NO:85)，鲍曼不动杆菌(Uniprot登录号A0A0D5YDD4；SEQ ID NO:86)，铜绿假单胞菌(Uniprot登录号Q9HZV7；SEQ ID NO:87)，Marinobactersantoriniensis(Uniprot登录号Q9HZV7；SEQ ID NO:88)，Pseudomonas knackmussii(SEQID NO:89)，假产碱假单胞菌(Uniprot登录号L8MQT6；SEQ ID NO:90)，柔弯假单胞菌(SEQID NO:91)，Alcanivorax dieselolei(SEQ ID NO:92)，玉蜀黍黑粉菌(Uniprot登录号编号Q4PEN0；SEQ ID NO:95)，芽孢杆菌属GeD10(Uniprot登录号N1LWG2；SEQ ID NO:96)或Labilithrix luteola(Uniprot登录号A0A0K1PN19；SEQ ID NO:97)的酶。
在本发明的优选实施方案中，3-羟酰基辅酶A脱水酶/烯酰辅酶A水合酶是包含选自SEQ ID NO:85至92和SEQ ID NO:95至97的氨基酸序列或与SEQ ID NO:85至92和SEQ IDNO:95至97中的任何一个有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中该酶具有将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
乙酰乙酰辅酶A到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶促转化：如图1所示的步骤IX
转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A本身可通过酶促反应提供，即乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A的酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A；见图14。
因此，本发明还涉及由乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A制备异丁烯的方法，其中乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A首先缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，然后将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为3-甲基戊烯二酰辅酶A，然后将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酰辅酶A，然后将3-甲基巴豆酰辅酶A进一步转化为3-甲基巴豆酸，然后如上文所述的将3-甲基巴豆酸进一步转化为异丁烯。
根据本发明，乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶促缩合优选使用3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(参见图1的步骤IX)。
乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A的缩合是由酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(也称为HMG-CoA合酶)天然催化的反应。因此，优选地，乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A使用3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(也称为HMG-CoA合酶)。HMG-CoA合酶按EC 2.3.3.10分类(以前，HMG-CoA合酶已经分类为EC 4.1.3.5，但已经转移至EC2.3.3.10)。术语“HMG-CoA合酶”指能够催化其中乙酰辅酶A与乙酰乙酰辅酶A缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)的反应的任何酶(参见图14)。HMG-CoA合酶是甲羟戊酸途径的部分。已经鉴定到合成异戊烯基焦磷酸(IPP)的两条途径，即甲羟戊酸途径和甘油醛3-磷酸-丙酮酸途径。HMG-CoA合酶催化乙酰辅酶A与乙酰乙酰辅酶A的生物Claisen缩合并且是包括β-酮硫解酶、脂肪酸合酶(β-酮酰载体蛋白合酶)和聚酮化合物合酶的酰基缩合酶超家族的成员。
已经描述各种生物的HMG-CoA合酶。来自众多来源的HMG-CoA合酶的氨基酸序列和及编码这些酶的核酸序列也是可获得的。通常，这些序列仅共有低程度的总体序列同一性。例如，来自葡萄球菌或链球菌的酶仅与人和鸟类HMG-CoA合酶显示约20％同一性。在某些来源中，据报道，细菌HMG-CoA合酶及其动物对应物仅显示约10％的总体序列同一性(Sutherlin等人,J.Bacteriol.184(2002),4065-4070)。然而，涉及乙酰化反应和缩合反应的氨基酸残基在细菌HMG-CoA合酶和真核HMG-CoA合酶之间保守(Campobasso等人,J.Biol.Chem.279(2004),44883-44888)。已经测定三种HMG-CoA合酶的三维结构并且对酶促反应至关重要的氨基酸原则上充分表征(Campobasso等人,参见上述引文；Chun等人,J.Biol.Chem.275(2000),17946-17953；Nagegowda等人,Biochem.J.383(2004),517-527；Hegardt,Biochem.J.338(1999),569-582)。在真核生物中存在两种形式的HMG-CoA合酶，即胞质形式和线粒体形式。胞质形式在胆固醇和其他类异戊二烯的产生中发挥关键作用并且线粒体形式涉及酮体产生。
原则上，任何HMG-CoA合酶可以在本发明背景下使用，尤其来自原核或真核生物的那些酶。
描述了例如来自金黄色葡萄球菌(Campobasso等人，参见上述引文；Uniprot登录号Q9FD87)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(Uniprot登录号Q9FD76)，溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)(Uniprot登录号Q9FD82)、粪肠球菌(Sutherlin等人，参见上述引文；Unirprot登录号Q9FD71；SEQ ID NO:99))、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)(Uniprot登录号Q9FD66)、肺炎链球菌(Uniprot登录号Q9FD56)、化脓性链球菌(Uniprot登录号Q9FD61)和嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(登录号AE000857)、伯氏包柔氏螺旋体(NCBI登录号BB0683)的原核HMG-CoA合酶。例如WO2011/032934中描述了其他HMG-CoA合酶。优选的HMG-CoA合酶是来自栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的酶(Uniprot P54874)。在特别优选的实施方案中，用于本发明方法中的HMG-CoA合酶具有如SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:99至少x％同源的氨基酸序列并且具有HMG-CoA合酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，其中这种酶能够催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A。关于确定同一性的程度，如上文所述同样适用。
乙酰辅酶A到乙酰乙酰辅酶A的酶促转化：如图1所示的步骤XIII，XIV和XV
转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A或转化为乙酰乙酸的乙酰乙酰辅酶A本身可以通过酶促反应，即乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酰辅酶A来提供。
根据本发明，乙酰辅酶A到所述乙酰乙酰辅酶A的转化可以通过不同途径来实现。一种可能性是首先将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A(如图1所示的步骤XIV)，然后将所述丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A进一步缩合成乙酰乙酰辅酶A(如图1所示的步骤XV)。另一种可能性是在单个酶促反应中将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A(如图1所示步骤XIII)。这些反应分别在图15(步骤XIII)，图16(步骤XIV)和图17(步骤XV)中示意性地示出。
因此，本发明还涉及由乙酰辅酶A制备异丁烯的方法，其中乙酰辅酶A首先通过任何上述途径转化为乙酰乙酰辅酶A，然后与乙酰辅酶A缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，然后将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A，然后将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酰辅酶A，然后将3-甲基巴豆酰辅酶A进一步转化成3-甲基巴豆酸，然后如上文所述将3-甲基巴豆酸进一步转化为异丁烯。
此外，本发明还涉及由乙酰辅酶A制备异丁烯的方法，其中乙酰辅酶A首先通过任何上述途径转化为乙酰乙酰辅酶A，然后转化成乙酰乙酸，然后将乙酰乙酸转化为丙酮，然后丙酮与乙酰辅酶A缩合成3-羟基异戊酸(HIV)，然后如上所述将3-羟基异戊酸转化成3-甲基巴豆酸。此外，如上所述，所述3-甲基巴豆酸然后进一步转化为异丁烯。
根据本发明，乙酰辅酶A至丙二酰辅酶A的酶促转化优选使用乙酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.2)(如图1所示的步骤XIV)。这种天然存在的反应利用ATP将CO2固定在乙酰辅酶A上，产生丙二酰辅酶A。分类为乙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)的酶催化下列反应：
乙酰辅酶A+ATP+CO2→丙二酰辅酶A+ADP
此外，根据本发明，丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A到所述乙酰乙酰辅酶A的酶促缩合优选使用乙酰乙酰辅酶A合酶(EC 2.3.1.194)(如图1所示的步骤XV)。这是一种天然反应，在脱羧反应中将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合。根据以下反应，分类为乙酰乙酰辅酶A合酶(EC 2.3.1.194)的酶催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A到乙酰乙酰辅酶A的酶促转化。
乙酰辅酶A+丙二酰辅酶A→乙酰乙酰辅酶A+CoA+CO2
该反应由称为乙酰乙酰辅酶A合酶(EC 2.3.1.194)的酶催化。编码该酶的基因在甲羟戊酸途径基因簇中被鉴定为在土壤分离的革兰氏阳性链霉菌菌株CL190中用于萜类化合物生产(Okamura et al.,PNAS USA 107(2010),11265-11270,2010)。此外，最近在大肠杆菌中开发了使用该酶进行乙酰乙酰辅酶A生产的生物合成途径(Matsumoto K et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem,75(2011),364-366)。
或者，乙酰辅酶A到所述乙酰乙酰辅酶A的酶促转化由单个酶促反应组成，其中通过两分子乙酰辅酶A酶促缩合成乙酰乙酰辅酶A而将乙酰辅酶A直接转化为乙酰乙酰辅酶A。优选地，通过利用乙酰辅酶A乙酰转移酶(EC2.3.1.9)实现乙酰辅酶A到乙酰乙酰辅酶A的酶促转化。
因此，例如如WO 2013/057194中所述，乙酰乙酰辅酶A可由乙酰辅酶A产生。因此，根据本发明，乙酰辅酶A可以例如通过以下反应转化成乙酰乙酰辅酶A：
该反应是天然存在的反应，并被称为乙酰辅酶A C-乙酰转移酶的酶催化，所述酶被分类为EC 2.3.1.9。属于该类并催化上述两分子乙酰辅酶A分子转化成乙酰乙酰辅酶A和CoA的酶在所有界的生物，即植物，动物，真菌，细菌等中存在并且在文献中已有广泛描述。这些酶的核苷酸和/或氨基酸序列已经针对多种生物如智人，拟南芥，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，丙酮丁醇梭菌和假丝酵母等进行了测定，仅举几例。原则上，任何乙酰辅酶A C-乙酰转移酶(EC 2.3.1.9)都可用于本发明的上下文中。在一个优选的实施方案中，该酶是来自丙酮丁醇梭菌(Uniprot P45359)的乙酰辅酶A乙酰转移酶。在特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的乙酰辅酶A乙酰转移酶具有如SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:37至少x％同源的氨基酸序列并具有乙酰辅酶A乙酰转移酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，其中所述酶能够将乙酰辅酶A转化为如上文所述的乙酰乙酰辅酶A。
关于确定同一性的程度，上文所述同样适用。
在本发明途径中发生的代谢物的酶循环：如图1所示的步骤Xa，Xb，XI和XII
用于从乙酰辅酶A生产异丁烯的本发明的上述方法可以通过如图18的步骤Xa，步骤Xb，步骤XI和步骤XII中所示的一个或多个以下反应来补充。
这些步骤涉及可能伴随任何上述生产异丁烯的方法而发生的备选生物转化。
因此，本发明涉及任何上述由3-甲基巴豆酸(或从所描述的从乙酰辅酶A到异丁烯的途径中的任何上述中间体)制备异丁烯的方法，其中另外
a)将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸，同时从3-羟基异戊酸(HIV)上的3-甲基巴豆酰辅酶A转移CoA以产生3-羟基异戊酰辅酶A(步骤Xa，如图19示意性所示)；和/或
b)将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-羟基异戊酰辅酶A(步骤Xb，如图20示意性所示)；和/或
c)将3-羟基异戊酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酰辅酶A(步骤XI，如图21示意性所示)；和/或
d)将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-羟基异戊酰辅酶A(步骤XII，如图22所示)。
下文将更详细描述的这些反应可伴随任何上述生产异丁烯的方法而发生，由于若干原因是有利的。首先，已知烯酰辅酶A(例如3-甲基巴豆酰辅酶A)的水合是在水性介质中体内的有利反应。因此，甚至在途径“渗漏”到3-羟基异戊酸(HIV)和/或3-羟基异戊酰辅酶A的方向的情况下，上述反应代表允许驱动代谢流向异丁烯前体即3-甲基巴豆酸的可能性。其次，上述转化有利地涉及通过转移硫酯基团将能量保存到硫酯CoA键。
如图18的步骤Xa所示，将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸，伴随将 CoA从3-甲基巴豆酰辅酶A转移到3-羟基异戊酸(HIV)以得到3-羟基异戊酰辅酶A
因此，第一方面，转化为异丁烯的3-甲基巴豆酸可以通过酶促反应来提供，其中3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸，同时CoA从3-甲基巴豆酰辅酶A转移到3-羟基异戊酸(HIV)以产生3-羟基异戊酰辅酶A(步骤Xa，如图18所示)。该反应在图19中示意性地示出。
因此，本发明还涉及由3-羟基异戊酸(HIV)制备异丁烯的方法，其中3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸，同时从3-甲基巴豆酰辅酶A转移CoA到3-羟基异戊酸(HIV)以产生3-羟基异戊酰辅酶A。此外，如此产生的3-甲基巴豆酸然后如上文所述酶促转化为异丁烯。
此外，本发明还涉及由3-羟基异戊酸(HIV)和3-甲基巴豆酰辅酶A制备3-甲基巴豆酸和3-羟基异戊酰辅酶A的方法，其中3-羟基异戊酸(HIV)被酶促转化成3-甲基巴豆酸伴随将3-甲基巴豆酰辅酶A上的CoA伴随转移到3-羟基异戊酸(HIV)上以产生3-羟基异戊酰辅酶A。
根据本发明，将3-羟基异戊酸(HIV)和3-甲基巴豆酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酸和3-羟基异戊酰辅酶A(其中3-羟基异戊酸(HIV)被酶促转化为3-甲基巴豆酸，伴随CoA从3-甲基巴豆酰辅酶A转移到3-羟基异戊酸(HIV)上以产生3-羟基异戊酰辅酶A)优选地使用被分类为辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)的酶，所述酶能够将3-甲基巴豆酰辅酶A的CoA基团转移至羧酸，即3-羟基异戊酸(HIV)。
上文已经描述了辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)以及该酶类的优选酶。因此，关于这些酶，如上所述，同样适用于3-羟基异戊酸(HIV)和3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸和3-羟基异戊酰辅酶A。
优选地，本发明方法中用于将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸伴随将CoA从3-甲基巴豆酰辅酶A转移到3-羟基异戊酸(HIV)上导致3-羟基异戊酰辅酶A的酶促反应中的辅酶A转移酶是选自以下的辅酶A转移酶：
-丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)；
-乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)；和
-丁酸-乙酰乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.9)。
丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC2.8.3.1)，乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.8)和丁酸-乙酰乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.9)以及这些酶类的优选酶已经在上文中描述。因此，关于这些酶，如上所述同样适用于3-羟基异戊酸(HIV)和3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸和3-羟基异戊酰辅酶A。
如图18的步骤Xb所示，将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-羟基异戊酰辅酶A
除了上述方法(步骤Xa)之外或作为替代，3-羟基异戊酰辅酶A也可以通过将3-羟基异戊酸酶促转化成所述3-羟基异戊酰辅酶A来提供(步骤Xb，如图18所示)。在该反应中，3-羟基异戊酸与酰基辅酶A反应生成3-羟基异戊酰辅酶A和酸。该反应在图19中示意性地示出。
优选地，所述酰基辅酶A是乙酰辅酶A。
因此，本发明还涉及由3-羟基异戊酸(HIV)制备3-羟基异戊酰辅酶A的方法，其中3-羟基异戊酸与酰基辅酶A，优选与乙酰辅酶A反应，得到3-羟基异戊酰辅酶A和各自的酸。
优选地，该转化通过利用被分类为辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)的酶来实现。关于在步骤Xb的上下文中所述辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)的优选实施方案，加以必要的修改同样适用于上文关于辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)在将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸，伴随将CoA从3-甲基巴豆酰辅酶A转移到3-羟基异戊酸(HIV)上得到3-羟基异戊酰辅酶A(如图18所示步骤Xa)所述的。
如图18的步骤XI所示，将3-羟基异戊酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A
除上述方法(或步骤VII)之外或作为备选，3-甲基巴豆酰辅酶A可通过酶促反应提供，其中3-羟基异戊酰辅酶A被酶促转化为3-甲基巴豆酰辅酶A(如图18所示的步骤XI)。该可逆反应是脱水反应，其中3-羟基异戊酰辅酶A脱水成3-甲基巴豆酰辅酶A并且在图21中示意性说明。
因此，本发明还涉及由3-羟基异戊酰辅酶A生产异丁烯的方法，其中3-羟基异戊酰辅酶A首先被酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A，其中根据任何上述方法3-甲基巴豆酰辅酶A被进一步酶促转化成3-甲基巴豆酸。此外，如此产生的3-甲基巴豆酸然后如上文所述酶促转化为异丁烯。
根据本发明，3-羟基异戊酰辅酶A到3-甲基巴豆酰辅酶A的酶促转化优选利用
(i)烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)；
(ii)长链-烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.74)；
(iii)3-羟基丙酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.116)；
(iv)3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)；
(v)3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.59)；
(vi)巴豆酰基-[酰基-载体-蛋白]水合酶(EC 4.2.1.58)；
(vii)3-羟基癸酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.60)；
(viii)3-羟基棕榈酰-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.61)；或
(ix)3-甲基戊烯二酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)。
在根据本发明的方法的优选实施方案中，通过使用烯酰辅酶A水合酶(EC4.2.1.17)实现3-羟基异戊酰辅酶A到3-甲基巴豆酰辅酶A的转化。上文已经描述了烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)以及该酶类的优选酶。因此，关于这些酶，如上所述同样适用于将3-羟基异戊酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酰辅酶A。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，通过使用长链烯酰辅酶A水合酶(EC4.2.1.74)实现3-羟基异戊酰辅酶A到3-甲基巴豆酰辅酶A的转化。长链-烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.74)催化下列反应：
该酶属于裂合酶家族，特别是水解酶，其切割碳－氧键。这种酶类的系统名称是长链-(3S)-3-羟基酰基辅酶A水解酶。该酶也称为长链烯酰辅酶A水合酶，它参与在线粒体和脂肪酸代谢中脂肪酸的延伸。这种酶存在于许多生物中，例如在褐家鼠((Wu et al.,Org.Lett.10(2008),2235-2238)，野猪和豚鼠(Fong and Schulz,J.Biol.Chem.252(1977),542-547；Schulz,Biol.Chem.249(1974),2704-2709)，并且原则上任何能够催化3-羟基异戊酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的长链-烯酰辅酶A水合酶都可用于本发明的方法中。
如图18的步骤XII所示，将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A
除了上述方法(步骤Xa或步骤Xb)之外或作为替代，3-羟基异戊酰辅酶A还可以通过将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成所述3-羟基异戊酰辅酶A来提供(如图18所示步骤XII)。在图22中示意性地示出这种一般反应，其中辅酶A(CoASH)被固定。
因此，本发明还涉及由3-羟基异戊酸(HIV)制备异丁烯的方法，其中3-羟基异戊酸(HIV)首先被转化成3-羟基异戊酰辅酶A，其中3-羟基异戊酰辅酶A然后被酶促转化为3-甲基巴豆酰辅酶A，其中根据任何上述方法将3-甲基巴豆酰辅酶A进一步酶促转化成3-甲基巴豆酸。此外，如此产生的3-甲基巴豆酸然后如上文所述酶促转化为异丁烯。
此外，本发明还涉及由3-羟基异戊酸(HIV)制备3-羟基异戊酰辅酶A的方法。
根据本发明，3-羟基异戊酸(HIV)向3-羟基异戊酰辅酶A的酶促转化优选使用属于形成碳-硫键的连接酶家族的酶(EC 6.2.1.-)。将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A(其中辅酶A(CoASH)被固定)的一般反应可以由属于形成碳-硫键的连接酶家族(EC 6.2.1.-)的酶通过两种替代机制催化。在第一种替代反应中，如图23示意性说明的，在辅酶A固定之前，将酰基-AMP生成为中间体。
在第二种替代反应中，如图24示意性说明的，在辅酶A固定之前，产生酰基磷酸酯作为中间体。
属于形成碳-硫键的连接酶家族(EC 6.2.1.-)的酶能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-羟基异戊酰辅酶A，其中酰基-AMP中间体(即，酰基腺苷酸中间体3-羟基异戊酰腺苷单磷酸酯)在辅酶A是固定的辅酶A(CoASH)之前产生，所述酶具有共同的结构基序，其在InterPro(InterPro44.0；2013年9月25日发布)中被引用为InterPro IPR020845，AMP-结合，保守位点(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR020845)和IPR000873(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873)。Pfam数据库中这些酶的登录号是PF00501。
关于第一种替代反应(其中如如图23中示意性说明的，在固定辅酶A之前酰基-AMP作为中间体产生)，属于上述形成碳-硫键的连接酶家族(EC6.2.1.-)的酶能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A，其中在辅酶A是固定的辅酶A(CoASH)之前产生酰基-AMP中间体(即，酰基腺苷酸中间体3-羟基异戊酰基-腺苷单磷酸)并且其可用于由3-羟基异戊酸(HIV)生产3-羟基异戊酰辅酶A的方法中，所述属于上述形成碳-硫键的连接酶家族(EC 6.2.1.-)的酶的实例总结于下表A中：
表A：涉及作为中间体的能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为酰基-腺苷酸的3-羟基异戊酰辅酶A的辅酶A连接酶(EC 6.2.1.-)
在一个优选的实施方案中，例如可以通过使用丁酸：辅酶A连接酶(AMP形成)(EC6.2.1.2)，通过酰基腺苷酸中间体将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A。丁酸：辅酶A连接酶是催化下列反应的酶：
ATP+羧酸+CoA→AMP+二磷酸+酰基辅酶A
这些酶参与丁酸代谢。已经描述了大量生物存在这些酶，所述生物包括原核生物和真核生物，特别是细菌，藻类，真菌，植物和动物，例如甲酸甲烷杆菌(Methanobacteriumformicum)，天蓝色链霉菌，鸟分枝杆菌，产黄青霉，宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)，铜绿假单胞菌，盘基网柄菌，豚鼠，Ovis aries，野猪，绵羊，小鼠，褐家鼠和智人。
在一个优选的实施方案中，3-羟基异戊酸(HIV)通过酰基腺苷酸中间体酶促转化为3-羟基异戊酰辅酶A是通过使用来源于甲酸甲烷杆菌的丁酸：辅酶A连接酶(AMP形成)(EC6.2.1.2)实现的。所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:77所示。
在本发明的优选实施方案中，所述丁酸：辅酶A连接酶(AMP形成)是包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列或与SEQ ID NO:77有至少n％同一性的序列的酶，其中n为10至100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有将3-羟基异戊酸(HIV)转化成3-羟基异戊酰辅酶A的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
关于第二种替代反应(其中如图24示意性说明的，在辅酶A固定之前，酰基磷酸作为中间体产生)，属于上述形成碳-硫键的连接酶(EC 6.2.1.-)家族的酶的实例总结在下表B中，所述酶能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A，其中在辅酶A是固定的辅酶A(CoASH)之前产生酰基磷酸中间体(即酰基磷酸中间体3-羟基异戊酰磷酸)并且其可以用于从3-羟基异戊酸(HIV)生产3-羟基异戊酰辅酶A的方法。
表B：涉及酰基磷酸作为中间体的能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-羟基异戊酰辅酶A的辅酶A连接酶(EC 6.2.1.-)
通过3-甲基-3-丁烯酰辅酶A和3-甲基-3-丁烯酸将乙酰辅酶A酶促转化为异丁烯 的备选途径
在上述的备选方案中，本发明还涉及通过备选途径生产异丁烯的方法，也如图1所示，其中异丁烯是通过将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯生产的。因此，本发明提供了一种生产异丁烯的方法，该方法包括将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯。优选地，3-甲基-3-丁烯酸到异丁烯的酶促转化通过使用3-甲基-3-丁烯酸脱羧酶来实现。
根据该替代途径，本发明不仅涉及由3-甲基-3-丁烯酸生产异丁烯的方法。相反，如下文将进一步详述的那样，该转化优选嵌入用于从乙酰辅酶A开始生产异丁烯的途径中，乙酰辅酶A是许多生物化学反应中使用的核心组分和代谢中的重要关键分子。
因此，本发明还涉及从乙酰辅酶A开始的途径，其中两个乙酰辅酶A分子被酶促缩合成乙酰乙酰辅酶A。或者，将乙酰辅酶A酶促转化为丙二酰辅酶A，其然后可通过丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A的酶促缩合为所述乙酰乙酰辅酶A而转化为所述乙酰乙酰辅酶A。
此外，由此产生的乙酰乙酰辅酶A可通过以下简要总结的途径酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸(然后最终转化为异丁烯)。
在该途径中，由此产生的乙酰乙酰辅酶A可以进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A。而且，由此产生的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A可以进一步酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A。此外，由此产生的3-甲基戊烯二酰辅酶A可以酶促转化为3-甲基-3-丁烯酰辅酶A。此外，由此产生的3-甲基-3-丁烯酰辅酶A可以在随后的酶促反应中进一步转化为3-甲基-3-丁烯酸(其然后可以如上文和进一步在下文所述中最终转化为异丁烯)。
3-甲基-3-丁烯酸到异丁烯的酶促转化：如图1所示的步骤XVI
根据本发明，3-甲基-3-丁烯酸到异丁烯的酶促转化可以通过脱羧来实现。“脱羧”通常是一种去除羧基并释放二氧化碳(CO2)的化学反应；见图25。
3-甲基-3-丁烯酸到异丁烯的酶促转化可以优选通过使用3-甲基-3-丁烯酸脱羧酶来实现。根据本发明，3-甲基-3-丁烯酸脱羧酶是能够将3-甲基-3-丁烯酸转化成异丁烯的酶。
在优选的实施方案中，3-甲基-3-丁烯酸脱羧酶选自：
(i)与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶；或
(ii)乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)；或
(iii)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或
(iv)香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)；或
(v)原儿茶酸(PCA)脱羧酶(EC 4.1.1.63)。
在其他优选的实施方案中，3-甲基-3-丁烯酸脱羧酶选自：6-甲基水杨酸脱羧酶(EC 4.1.1.52)，2-氧代-3-己烯二酸脱羧酶(EC 4.1.1.77)和5-氧代戊-3-烯-1,2,5-三羧酸脱羧酶(EC 4.1.1.68)。
关于上述实施方案，对于与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶，乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)，甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)，香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)，原儿茶酸(PCA)脱羧酶(EC 4.1.1.63)，6-甲基水杨酸脱羧酶(EC 4.1.1.52)，2-氧代-3-己烯二酸脱羧酶(EC 4.1.1.77)和5-氧代戊-3-烯-1,2,5-三羧酸脱羧酶(EC4.1.1.68)，上面结合本发明的其他方法阐述的内容同样适用。
3-甲基-3-丁烯酰辅酶A到3-甲基-3-丁烯酸的酶促转化：如图1所示的步骤XVIIa， XVIIb或XVIIc
3-甲基-3-丁烯酸本身可通过酶促反应提供，即3-甲基-3-丁烯酰辅酶A到3-甲基-3-丁烯酸的酶促转化；见图26。
因此，本发明涉及由3-甲基-3-丁烯酰辅酶A制备异丁烯的方法，其中3-甲基-3-丁烯酰辅酶A首先转化为3-甲基-3-丁烯酸，然后如上所述将其进一步转化为异丁烯。
根据本发明，3-甲基-3-丁烯酰辅酶A到3-甲基-3-丁烯酸的转化可以例如通过三种不同的备选酶途径来实现，即通过：
(a)单个酶促反应(参见图27)，其中3-甲基-3-丁烯酰辅酶A直接转化为3-甲基-3-丁烯酸，优选通过使用辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)，优选丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC2.8.3.1)，乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)或琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.18)；
(b)单个酶促反应(参见图28)，其中3-甲基-3-丁烯酰辅酶A被直接转化为3-甲基-3-丁烯酸，优选通过利用硫酯水解酶(EC 3.1.2.-),优选乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)，ADP依赖性短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)或酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)；或
(c)包含以下的两个酶促步骤(参见图29)
(i)首先优选通过使用磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC2.3.1.8)，将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化为3-甲基-3-丁烯酰磷酸；和
(ii)然后优选通过使用用羧基作为受体的磷酸转移酶(EC2.7.2.-)，优选丙酸激酶(EC 2.7.2.15)，乙酸激酶(EC 2.7.2.1)，丁酸激酶(EC 2.7.2.7)或支链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)，将由此获得的3-甲基-3-丁烯酰磷酸酶促转化为所述3-甲基-3-丁烯酸。
关于上述实施方案，对于辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)，丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC2.8.3.1)，乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)，琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.18)，硫酯水解酶(EC 3.1.2.-)，乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)，ADP-依赖性短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)，酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)，磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)，磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)，用羧基作为受体的磷酸转移酶(EC 2.7.2.-)，丙酸激酶(EC2.7.2.15)，乙酸激酶(EC 2.7.2.1)，丁酸激酶(EC 2.7.2.7)和支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14),已经在上面结合本发明的其他方法阐述的内容同样适用。
3-甲基戊烯二酰辅酶A到3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶促转化：如图1所示的步骤 XVIII
3-甲基-3-丁烯酰辅酶A本身可以通过酶促反应提供，即3-甲基戊烯二酰辅酶A到3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶促转化；见图30。
因此，本发明涉及由3-甲基-3-丁烯酰辅酶A制备异丁烯的方法，其中3-甲基戊烯二酰辅酶A首先转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A，然后将其进一步转化为3-甲基-3-丁烯酸，然后如上所述将甲基-3-丁烯酸进一步转化为异丁烯。
此外，本发明涉及通过将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化为3-甲基-3-丁烯酰辅酶A来生产3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的方法。
根据本发明，3-甲基戊烯二酰辅酶A向3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的转化优选可以通过利用如下实现：
(a)(i)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或(ii)香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)，
(b)来自巨大鞘丝蓝细菌(Lynbya majuscula)多功能蛋白的CurF的N末端结构域或3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶，优选由liuB基因编码的黄色粘球菌的3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶；或
(c)4-草酰巴豆酸脱羧酶家族的酶。
就上述实施方案而言，对于甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.4)，香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)和3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶，优选地由liuB基因编码的黄色粘球菌的3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶，上面结合本发明的其他方法所阐述的内容同样适用。
在一个优选的实施方案中，3-甲基戊烯二酰辅酶A经脱羧转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A由来自巨大鞘丝蓝细菌多功能蛋白质的CurF的N-末端结构域催化。来自巨大鞘丝蓝细菌多功能蛋白质的CurF的N-末端结构域是来自巨大鞘丝蓝细菌的CurF多功能蛋白质的聚酮化合物合酶(PKS)/非核糖体肽合酶(NRPS)的结构域。通过研究晶体结构，CurF的这种N-末端结构域已被分类为属于巴豆酸酶超家族的蛋白质，并且其自然催化3-甲基戊烯二酰-ACP(酰基载体蛋白)脱羧成3-甲基巴豆酰-ACP。ACP与CoA相似，因为两个分子都具有共同的磷酸泛酰巯基乙胺部分(如图31所示)。此外，ACP和CoA都可以用生物酸形成硫酯(J.Biol.Chem.289:35957-35963(2007)和Chemistry&Biology 11:817-833(2004))。
在另一个优选的实施方案中，3-甲基戊烯二酰辅酶A通过脱羧向3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的转化是由4-草酰巴豆酸脱羧酶家族(EC 4.1.1.77)的酶催化的。
4-草酰巴豆酸脱羧酶(EC 4.1.1.77)催化下列反应：
这种酶可从各种生物中得知，例如在Bortetella sp.，Cupriavidus nector，嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)和皮氏罗尔斯顿菌中已有描述。因此，在一个优选的实施方案中，用于将3-甲基戊烯二酰辅酶A经脱羧转化为3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的4-草酰巴豆酸脱羧酶是来自Bortetella，Cupriavidus，地芽孢杆菌(Geobacillus)，Pseudomonas pr Ralstonia，更优选来自物种Bortetella sp.，Cupriavidus nector，嗜热脂肪地芽孢杆菌，恶臭假单胞菌或皮氏罗尔斯顿菌的4-草酰巴豆酸脱羧酶。在甚至更优选的实施方案中，用于通过脱羧将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的4-草酰巴豆酸脱羧酶是嗜热脂肪地芽孢杆菌的4-草酰巴豆酸脱羧酶(UniProt登录号B0VXM8)。
在一个优选的实施方案中，本发明方法中3-甲基戊烯二酰辅酶A通过脱羧转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A使用的4-草酰巴豆酸脱羧酶来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)并具有如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
在本发明的优选实施方案中，4-草酰巴豆酸脱羧酶是包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与SEQ ID NO:69有至少n％同一性的序列的酶，其中n是10到100之间的整数，优选10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99，并且其中所述酶具有通过脱羧将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶活性。关于序列同一性的确定，如上所述同样适用。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化：如图1所示步骤 VIII
根据任何上述方法可以转化为3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的3-甲基戊烯二酰辅酶A本身可以通过酶促反应提供，即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A。
因此，本发明还涉及由3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A制备异丁烯的方法，其中首先将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为3-甲基戊烯二酰辅酶A，然后将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A，然后将其进一步转化为3-甲基-3-丁烯酸，然后如上文所述的将其进一步转化为异丁烯。
根据本发明，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化是天然存在的酶促脱水反应，并且其例如通过分类为3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC4.2.1.18)的酶催化。因此，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化优选使用3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)。
关于上述实施方案，对于分类为3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC4.2.1.18)的酶，上面结合本发明的其他方法阐述的内容相同适用。
乙酰乙酰辅酶A到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶促转化：如图1所示的步骤IX
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A本身可以通过酶促反应提供，即乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A的酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，这已在上文中详细描述。
因此，本发明还涉及由乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A制备异丁烯的方法，其中乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A首先缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，然后将其转化为3-甲基戊烯二酰辅酶A，然后将3-甲基戊烯二酰辅酶A转化为3-甲基-3-丁烯酰辅酶A，然后将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A进一步转化为3-甲基-3-丁烯酸，然后如上文所述将3-甲基-3-丁烯酸进一步转化为异丁烯。
乙酰辅酶A到乙酰乙酰辅酶A的酶促转化：如图1所示的步骤XIII，步骤XIV和步骤 XV
乙酰乙酰辅酶A本身可以通过酶促反应来提供，即通过几种不同的途径将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A，这已经在上文中详细描述。
因此，本发明还涉及由乙酰辅酶A制备异丁烯的方法，其中乙酰辅酶A首先通过任何上述途径转化为乙酰乙酰辅酶A，然后与乙酰辅酶A缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，其然后转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A，然后将其转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A，然后将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A进一步转化为3-甲基-3-丁烯酸，然后其如上所述进一步转化为异丁烯。
总结如上所述通过3-甲基-3-丁烯酰辅酶A和3-甲基-3-丁烯酸将乙酰辅酶A转化为异丁烯的替代途径，本发明还涉及以下实施方案，其特征在于以下项目1至26：
1.一种生产异丁烯的方法，其包括将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯。
2.项目1的方法，其中3-甲基-3-丁烯酸到异丁烯的酶促转化通过使用3-甲基-3-丁烯酸脱羧酶来实现。
3.项目2的方法，其中所述3-甲基-3-丁烯酸脱羧酶是：
(i)与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶；或
(ii)乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)；或
(iii)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或
(iv)香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)；或
(v)原儿茶酸(PCA)脱羧酶(EC 4.1.1.63)。
4.项目1或2的方法，其进一步包括通过将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸来提供3-甲基-3-丁烯酸。
5.项目4的方法，其中3-甲基-3-丁烯酰辅酶A到3-甲基-3-丁烯酸的酶促转化通过以下实现
(a)单个酶促反应，其中通过使用辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)，优选丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)，乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)或琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.18)，将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A直接转化为3-甲基-3-丁烯酸；
(b)单个酶促反应，其中通过利用硫酯水解酶(EC 3.1.2.-)，优选乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)，ADP依赖性短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)或酰基辅酶A水解酶(EC3.1.2.20)将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A直接转化为3-甲基-3-丁烯酸；
(c)两个酶促步骤，其包括
(i)首先将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化为3-甲基-3-丁烯酰磷酸；和
(ii)然后将如此获得的3-甲基-3-丁烯酰磷酸酶促转化成所述3-甲基-3-丁烯酸。
6.项目5(c)的方法，其中所述3-甲基-3-丁烯酰辅酶A到3-甲基-3-丁烯酰磷酸的酶促转化通过使用磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC2.3.1.8)实现，并且通过使用用羧基作为受体的磷酸转移酶(EC 2.7.2.-),优选丙酸激酶(EC 2.7.2.15)，乙酸激酶(EC 2.7.2.1)，丁酸激酶(EC 2.7.2.7)或支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)来实现所述3-甲基-3-丁烯酰磷酸向所述3-甲基-3-丁烯酸的酶促转化。
7.项目1至4中任一项所述的方法，还包括通过将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A来提供3-甲基-3-丁烯酰辅酶A。
8.项目7的方法，其中3-甲基戊烯二酰辅酶A到3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶促转化通过利用如下实现
(a)(i)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或(ii)香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)，
(b)来自巨大鞘丝蓝细菌多功能蛋白的CurF的N末端结构域或3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶，优选由liuB基因编码的黄色粘球菌的3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶；或
(c)4-草酰巴豆酸脱羧酶家族的酶。
9.项目1至8中任一项所述的方法，所述方法还包括通过将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A来提供所述3-甲基戊烯二酰辅酶A。
10.项目9的方法，其中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化通过使用3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)，3-羟酰基辅酶A脱水酶(EC4.2.1.-)或烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.-)实现。
11.项目1至10中任一项的方法，所述方法还包括通过乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A的酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A提供3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A。
12.项目11的方法，其中通过使用3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶实现乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A向3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶促缩合。
13.项目1至12中任一项所述的方法，所述方法还包括通过将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A来提供乙酰乙酰辅酶A，所述方法包括：
(a)包含以下的两个酶促步骤
(i)首先将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A；和
(ii)然后将由此获得的丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成所述乙酰乙酰辅酶A；或
(b)单个酶促反应，其中两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A。
14.项目13(a)(i)的方法，其中通过利用乙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)实现乙酰辅酶A到丙二酰辅酶A的酶促转化。
15.项目13(a)(ii)的方法，其中通过利用乙酰乙酰辅酶A合酶(EC2.3.1.194)实现丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A到所述乙酰乙酰辅酶A中的酶促缩合。
16.项目13(b)的方法，其中通过使用乙酰辅酶A C-乙酰转移酶(EC2.3.1.9)实现两个乙酰辅酶A分子直接酶促缩合成乙酰乙酰辅酶A。
17.重组生物或微生物，其表达
(i)如项目1至3中任一项所定义的酶；和
(ii)如项目4至6中任一项所定义的酶。
18.项目17的重组生物或微生物，其进一步表达如项目7或8中定义的酶。
19.项目18的重组生物或微生物，其进一步表达如项目9或10中定义的酶。
20.项目19的重组生物或微生物，其进一步表达如项目11或12中定义的酶。
21.项目20的重组生物或微生物，其进一步表达权利要求13中定义的酶。
22.项目21的重组生物或微生物，其进一步表达权利要求14至16中任一项所定义的酶。
23.项目17至22中任一项所定义的重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。
24.项目23的重组生物或微生物的用途，其中所述重组生物或微生物表达催化3-甲基-3-丁烯酸到异丁烯的酶促转化的酶。
25.催化3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯的酶用于从3-甲基-3-丁烯酸生产异丁烯的用途。
26.一种组合物，其包含3-甲基-3-丁烯酸和如项目17至22中任一项所定义的重组生物或微生物；或3-甲基-3-丁烯酸和如项目1-16中任一项所定义的酶。
本发明的方法可以在体外或在体内实施。体外反应理解为其中不使用细胞的反应，即无细胞反应。因此，体外优选地意指在无细胞系统中。在一个实施方案中，术语“在体外”意指在分离的酶(或酶系统，任选地包含可能要求的辅因子)存在下。在一个实施方案中，该方法中所用的酶以纯化形式使用。
为了体外实施该方法，将反应的底物和酶在允许酶有活性并允许酶促转化发生的条件下(缓冲液、温度、协同底物、辅因子等)温育。允许该反应推进足以产生相应产物的时间。可以通过本领域已知的方法，如可能与质谱法检测连接的气相色谱，测量各自产物的产生。酶可以处于允许酶促反应发生的任何合适形式。它们可以是纯化或部分纯化的或处于细胞粗提物或部分纯化的提取物形式。酶还可能固定在合适的载体上。
在另一个实施方案中，本发明的方法在生物，优选微生物存在下以培养方式实施，所述生物产生对如上文所述的本发明转化方法所述的酶。利用微生物实施本发明方法的方法称作“体内”方法。可以使用天然产生上文对本发明转化方法所述的酶的微生物或已经过基因修饰从而它表达(包括过量表达)这类酶中一者或多者的微生物。因此，微生物可以是这样的工程化微生物，所述工程化微生物表达上述用于本发明方法转化的酶，即在其基因组中具有编码这类酶的核苷酸序列并且已经过修饰以过量表达它们。表达可以按组成型方式或按诱导或受调节的方式发生。
在另一个实施方案中，微生物可以是这样的微生物，所述微生物已经通过引入一个或多个核酸分子被基因修饰，所述核酸分子含有编码上述用于本发明方法转化的一种或多种酶的核苷酸序列。该核酸分子可以稳定地整合到该微生物的基因组中或可以按染色体外方式例如在质粒上存在。
这种基因修饰微生物可以是例如这样的微生物，所述微生物不天然地表达上述用于本发明方法转化的酶并且已经过基因修饰以表达这类酶，或所述微生物天然地表达这类酶并且已经过基因修饰，例如用核酸(例如编码相应酶的载体)转化和/或在编码该酶的内源核苷酸序列前方插入启动子以增加所述微生物中的相应活性。
然而，本发明优选地排除如自然界中所存在那样的天然存在的微生物，所述微生物按照自然界中存在的水平表达如上文所述的酶。相反，本发明的和在本发明方法中使用的微生物优选地是非天然存在的微生物，无论它是否已经过基因修饰以表达(包括过量表达)正常情况下不存在于其基因组中的本发明外源酶或无论它是否已经过工程化以过量表达外源酶。
因此，本发明使用的酶和(微)生物优选地是非天然存在的酶或(微生物)，即它们是与天然存在的酶或微生物显著不同并且在自然界中不存在的酶或(微)生物。就这些酶而言，它们优选地是天然存在酶的变体，所述变体本身不存在于自然界中。这类变体例如包括突变体，尤其通过分子生物学方法制备的突变体，其显示改善的特性，如更高酶活性、更高底物专一性、更高耐温性等。就((微)生物而言，它们优选地是因基因修饰而不同于天然存在生物的如上文所述的基因修饰生物。基因修饰生物是不天然存在的，即，不能在自然界中存在并且因引入外来核酸分子而与天然存在生物明显不同的生物。
通过过量表达如上文所述的外源酶或内源酶，酶浓度大幅度高于自然界中存在的浓度，这随后可以出乎意料地迫使利用相应非天然酶的本发明反应进行。优选地，过量表达的酶的浓度是宿主细胞总蛋白的至少5％、10％、20％、30％或40％。
将“非天然”底物理解为这样的分子，所述分子在自然界中不受相应的酶作用，甚至它可以实际上与内源酶一起共存于微生物中。这种个“非天然”底物在自然界中不被微生物转化，因为其他底物是优选的(例如“天然底物”)。因此，本发明构思用上文描述的酶在自然界中不存在的环境下利用非天然底物。
因此，在本发明的上下文中，该微生物也可能是不天然具有相应酶活性，但经基因修饰从而包含允许相应酶表达的核苷酸序列的微生物。类似地，该微生物也可以是天然具有相应酶活性，但是经基因修饰从而增强这种酶活性(例如通过引入编码相应酶的外源核苷酸序列或通过引入针对编码该酶的内源性基因的启动子以增加内源产量至过量表达(非天然)水平)的微生物。
如果使用天然表达相应酶的微生物，可以如此修饰这种微生物，从而在微生物中过量表达相应的活性。可以例如通过以下方式实现这一点：在相应基因的启动子区中实施突变或引入高表达性启动子，从而导致确保基因的更高表达的启动子。备选地，还可能是基因如此突变，从而导致显示更高活性的酶。
通过使用表达上文对本发明转化方法所述的酶的微生物，可以在不需要分离或纯化酶的情况下，在培养基中直接实施本发明的方法。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的生物是这样的微生物，所述微生物已经过基因修饰以含有编码上述用于本发明方法转化的至少一种酶的外来核酸分子。在这种语境下，术语“外来”或“外源”意指核酸分子不天然地存在于所述微生物中。这意味着它不出现在微生物中的相同结构内或在相同位置处。在一个优选的实施方案中，外来核酸分子是包含启动子和编码相应酶的编码序列的重组分子，其中驱动编码序列表达的启动子相对于编码序列是异源的。在这种语境下，“异源”意指该启动子不是天然驱动所述编码序列表达的启动子，而是天然驱动不同编码序列表达的启动子，即，它衍生自另一个基因，或是合成性启动子或嵌合启动子。优选地，启动子是微生物异源的启动子，即在相应的微生物中不天然存在的启动子。甚至更优选地，启动子是诱导型启动子。在不同类型的生物中、尤其在微生物中驱动表达的启动子是本领域技术人员熟知的。
在又一个实施方案中，核酸分子相对于微生物是外来的，在于编码的酶相对于微生物不是内源的，即当微生物未经基因修饰时不由该微生物天然表述。换句话说，编码的酶相对于微生物是异源的。外来核酸分子可以在微生物中以染色体外形式存在，例如作为质粒，或稳定整合在染色体中。优选稳定整合。因此，基因修饰可以例如在于整合编码酶的相应基因至染色体中，或在于从含有酶编码序列上游的启动子的质粒表达所述酶，所述启动子和编码序列优选地源自不同生物；或本领域技术人员已知的任何其他方法。
在本发明的上下文中，术语“微生物”指细菌，以及指真菌，如酵母，并且也指藻类和古细菌。在一个优选的实施方案中，微生物是细菌。原则上可以使用任何细菌。在本发明方法中待使用的优选细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在一个特别优选的实施方案中，细菌属于埃希氏菌属并且甚至更优选地属于大肠杆菌种。在另一个优选实施方案中，细菌属于恶臭假单胞菌物种，或属于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)物种，或属于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)物种或属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)物种。
还可能使用极端嗜热性细菌如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)或来自梭菌科(Clostridiae)的厌氧细菌。
在另一个优选实施方案中，微生物是真菌，更优选地是的酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyce)、曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)、克鲁维酵母属或毕赤酵母属的真菌，并且甚至更优选地是以下物种：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillusniger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、Pichia torula或Pichia utilis。
在另一个实施方案中，本发明的方法利用光合微生物，所述光合微生物表达至少一种用于如上文所述的本发明转化的酶。优选地，微生物是光合细菌或微藻。在又一个实施方案中，微生物是藻类，更优选地属于硅藻类的藻类。
还可构思在本发明方法中使用微生物的组合，其中不同微生物表达如上文所述的不同酶。下文还将进一步详细描述为表达目的酶对微生物的基因修饰。
在优选的实施方案中，本发明的方法利用遗传修饰的生物，优选微生物，以避免乙酰辅酶A泄漏，从而增加细胞内乙酰辅酶A的浓度。导致乙酰辅酶A的细胞内浓度增加的遗传修饰是本领域已知的。不受理论束缚，这样的生物，优选微生物可以优选通过缺失或失活以下基因进行遗传修饰：
ΔackA(乙酸激酶)，Δldh(乳酸脱氢酶)，ΔadhE(醇脱氢酶)，ΔfrdB和/或ΔfrdC(延胡索酸还原酶和延胡索酸脱氢酶)。
备选地，或者除了任何上述缺失之外，可以通过过表达编码泛酸激酶的基因panK/coaA来遗传修饰生物或微生物，从而增加CoA/乙酰辅酶A细胞内库。
避免乙酰辅酶A泄漏的这些修饰是本领域已知的，并且相应的修饰的生物已经用于通过表达ATF2的大肠杆菌菌株将外源异戊醇生物转化成乙酸异戊酯的方法(Metab.Eng.6(2004),294-309)。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括步骤：提供生物，优选地携带相应酶活性或(细胞)培养物形式、优选液态细胞培养物形式的微生物，后续步骤是在发酵罐(经常也称作生物反应器)中允许相应酶表达的合适条件下培育所述生物，优选地微生物，并且还包括步骤：实现如本文上述的本发明方法的酶促转化。合适的发酵罐或生物反应器装置和发酵条件是本领域技术人员已知的。生物反应器或发酵罐指支持生物学活性环境的本领域已知的任何制造或工程化装置或系统。因此，生物反应器或发酵罐可以是其中实施化学/生物化学过程(如本发明方法)的容器，所述化学/生物化学过程涉及生物、优选地微生物和/或生物化学活性物质，即，从携带上述酶的这类生物或生物衍生的上述酶。在生物反应器或发酵罐中，这种过程可以是需氧的或厌氧的。这些生物反应器常见是圆柱状，并且可以具有从数升至若干立方米的一系列尺寸，并经常由不锈钢制成。在这个方面，不受理论约束，发酵罐或生物反应器可以按照这样的方式设计，从而它适合以分批培养、补料分批培养、灌注培养或恒化培养培养生物，优选地微生物，全部培养方法通常均是本领域已知的。
培养基可以是适于培养相应生物或微生物的任何培养基。
在一个优选实施方案中，本发明的方法还包括步骤：回收通过该方法产生的异丁烯。例如，如果本发明的方法通过发酵表达必需酶的相应微生物在体内实施，则可以通过本领域技术人员已知的方法从发酵废气回收异丁烯。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及如上所述的方法，其中使用上文所述的微生物，其中所述微生物能够将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中所述方法包括将所述微生物在培养基中培养。
本发明方法中使用的酶可以是天然存在的酶或是这样的酶，所述酶可以(例如通过引入例如改变或改善酶活性、稳定性等的突变或其他改变)从天然存在的酶衍生。
用于修饰和/或改善蛋白质的所需酶活性的方法是本领域技术人员熟知的并且包括，例如随机诱变或位点定向诱变并随后选择具有所需特性的酶，或所谓“定向进化”方案。
例如，对于原核细胞中的基因修饰，可以将编码相应酶的核酸分子引入质粒，所述质粒允许通过DNA序列重组诱变或序列修饰。标准方法(见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用与片段互补的衔接头和接头连接DNA片段。另外，可以使用提供合适限制性位点或除去多余DNA或限制性位点的工程化措施。在其中可能插入，缺失或置换的那些些情况下，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制作用或连接。通常而言，实施序列分析、限制分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。随后用如上文所述的测定法，对所产生的酶变体测试所需的活性，例如，酶活性，并且特别是它们增加的酶活性。
如上文所述，本发明方法中所用或本发明组合物中所含的微生物可以是已经通过引入编码相应酶的核酸分子进行基因修饰的微生物。因此，在优选的实施方案中，微生物是这样的重组微生物，所述重组微生物已经过基因修饰以具有上述用于本发明方法转化的至少一种酶的增加的活性。这可以例如通过用编码相应酶的核酸转化该微生物来实现。下文将进一步详细描述对微生物的基因修饰。优选地，引入微生物中的核酸分子是相对于微生物是异源的核酸分子，即，它不天然地存在于所述微生物中。
在本发明的上下文中，“增加的活性”意指基因修饰的微生物中酶的表达和/或活性比相应未修饰的微生物中高至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％或50％、甚至更优选地至少70％或80％并且特别优选至少90％或100％。在甚至更优选的实施方案中，表达和/或活性的增加可以是至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，表达比相应未修饰的微生物中高至少10倍、更优选地至少100倍和甚至更优选至少1000倍。
术语“增加的”表达/活性也涵盖如下情况，其中相应未修饰的微生物不表达相应的酶，从而未修饰的微生物中的相应表达/活性是零。优选地，过量表达的酶的浓度是总宿主细胞蛋白的至少5％、10％、20％、30％或40％。
用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，通过测量相应蛋白质的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括蛋白质印迹法、ELISA等。在另一个实施方案中，通过测量相应RNA的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括例如RNA印迹。
在本发明的上下文中，术语“重组”意指微生物经基因修饰，从而与野生型或未修饰的微生物相比，含有编码如上文定义的酶的核酸分子。编码如上文定义的酶的核酸分子可以单独使用或作为载体的部分使用。
所述核酸分子还可以包含与包含于该核酸分子中的多核苷酸有效连接的表达控制序列。如本说明书自始至终使用，术语“有效连接的”或“有效连接”指在一个或多个表达控制序列和待表达的多核苷酸中编码区之间以如此方式连接，从而在与表达控制序列相容的条件下实现表达。
表达包括异源DNA序列的转录，优选地，转录成可翻译的mRNA。确保在真菌中以及在细菌中表达的调节元件是本领域技术人员熟知的。它们涵盖启动子、增强子、终止信号、靶向信号等。在下文与相关载体相联系解释时进一步给出实例。
相对于其来源和/或相对于待表达的基因，关于核酸分子使用的启动子可以是同源或异源的。合适的启动子是例如自身导致组成型表达的启动子。然而，也可以使用仅在由外部影响所决定的时间点激活的启动子。在这种情况下，可以使用人工和/或化学诱导型启动子。
所述载体还可以包含与包含于该载体中的所述多核苷酸有效连接的表达控制序列。这些表达控制序列可以适用于确保可翻译性RNA在细菌或真菌中的转录和合成。
此外，可以通过分子生物学中常规的方法将不同突变插入多核苷酸(见例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,ColdSpring Harbor,NY,USA)，导致合成可能具有修饰的生物学特性的多肽。可构思在氨基酸序列修饰例如影响多肽生物学活性或其调节作用的位置引入点突变。
另外，可以制备拥有修饰的底物或产物特异性的突变体。优选地，这类突变体显示增加的活性。备选地，可以制备在不丧失底物结合活性的情况下消除其催化活性的突变体。
另外，将突变引入编码如上文定义的酶的多核苷酸中允许增加或减少所述多核苷酸编码的酶的基因表达速率和/或活性。
为了遗传地修饰细菌或真菌，可以将编码如上文定义的酶的多核苷酸或这些分子的部分引入质粒中，所述质粒允许通过DNA序列重组诱变或序列修饰。标准方法(见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,ColdSpring Harbor,NY,USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用针对片段的衔接头和接头连接DNA片段。另外，可以使用提供合适限制性位点或除去多余DNA或限制性位点的工程化措施。在其中可能插入，缺失或置换的那些情况下，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制作用或连接。通常而言，实施序列分析、限制分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。
因而，根据本发明，重组微生物可以通过遗传修饰真菌或细菌来产生，包括将上述多核苷酸、核酸分子或载体引入真菌或细菌中。
表达编码相应酶的多核苷酸，从而以导致具有上文描述的任一种活性的多肽产生。不同表达系统的综述例如含于Methods in Enzymology 153(1987),385-516中，Bitter等人(Methods in Enzymology153(1987)，516-544)并含于Sawers等人,(AppliedMicrobiology and Biotechnology 46(1996),1-9)、Billman-Jacobe(Current Opinionin Biotechnology 7(1996),500-4)、Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994),456-463)、Griffiths等人,(Methods in Molecular Biology 75(1997),427-440)中。酵母表达系统的综述例如由Hensing等人(Antonie van Leuwenhoek 67(1995),261-279),Bussineau等人(Developments in Biological Standardization 83(1994),13-19)、Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62(1992),79-93)、Fleer(Current Opinion inBiotechnology 3(1992),486-496)、Vedvick(Current Opinion in Biotechnology 2(1991),742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991),1067-1072)给出。
已经在文献中广泛描述表达载体。通常，它们不仅含有选择标记基因和确保在选择的宿主中复制的复制起点，还含有细菌启动子或病毒启动子，和在大多数情况下转录终止信号。在启动子和终止信号之间通常存至少一个使得插入编码性DNA序列成为可能的限制性位点或多接头。如果在选择的宿主生物中有活性，则天然控制相应基因的转录的DNA序列可以用作启动子序列。然而，这种序列也可以交换为其他启动子序列。可以使用确保基因组成型表达的启动子和允许人为控制基因表达的诱导型启动子。文献中详述了拥有这些特性的细菌启动子和病毒启动子序列。文献中充分描述了用于微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)中表达的调节序列。允许特别高地表达下游序列的启动子例如是T7启动子(Studier等人,Methods in Enzymology 185(1990),60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等人,引自Rodriguez和Chamberlin(编著),Promoters,Structure and Function；Praeger,NewYork,(1982),462-481；DeBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983),21-25)、lp1、rac(Boros等人,Gene 42(1986),97-100)。诱导型启动子优选地用于多肽的合成。这些启动子经常导致比组成型启动子更高的多肽产量。为了获得最佳多肽量，经常使用一种两阶段方法。首先，将宿主细胞在最佳条件下培养直至相对高的细胞密度。在第二步骤中，根据使用的启动子的类型诱导转录。在这个方面，tac启动子是特别合适的，所述tac启动子可以由乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导(deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983),21-25)。文献中也描述了转录的终止信号。
可以通过例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A LaboratoryManual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA；Methods in Yeast Genetics,ALaboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990中描述的标准方法，用如上所述的多核苷酸或载体实施宿主细胞的转化。宿主细胞在满足所用具体宿主细胞要求(尤其在pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等方面)的营养培养基中培养。
表达步骤I和步骤II的酶并任选地进一步表达步骤III，步骤IV和步骤V的酶以及 任选地进一步表达步骤XIII，XIV和XV的酶的重组生物或微生物
本发明还涉及一种重组生物或微生物，其表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤II)。
在一个优选的实施方案中，能够将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的酶是上文定义的3-甲基巴豆酸脱羧酶。
更优选地，3-甲基巴豆酸脱羧酶是如上文所定义的
(i)与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶；或
(ii)乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)；或
(iii)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或
(iv)香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)；或
(v)原儿茶酸(PCA)脱羧酶(EC 4.1.1.63)。
在另一个优选的实施方案中，该重组生物或微生物是重组生物或微生物，其中3-甲基巴豆酸脱羧酶选自：6-甲基水杨酸脱羧酶(EC 4.1.1.52)，2-氧代-3-己烯二酸脱羧酶(EC 4.1.1.77)和5-氧代戊-3-烯-1,2,5-三羧酸脱羧酶(EC 4.1.1.68)。
关于3-甲基巴豆酸脱羧酶，FMN依赖性脱羧酶，相关的FMN异戊烯转移酶，乌头酸脱羧酶(EC4.1.1.6)，甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.4)和香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)以及所述3-甲基巴豆酸脱羧酶，所述原儿茶酸(PCA)脱羧酶(EC 4.1.1.63)，所述FMN依赖性脱羧酶，所述相关的FMN异戊烯转移酶，所述乌头酸脱羧酶((EC 4.1.1.6)，所述甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)和所述香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)，以及所述6-甲基水杨酸脱羧酶(EC 4.1.1.52)，2-氧代-3-己烯二酸脱羧酶(EC 4.1.1.77)和5-氧代戊-3-烯-1,2,5-三羧酸脱羧酶(EC 4.1.1.68)的优选实施方案，对于根据本发明的方法所述的同样适用于重组生物或微生物。
在一个优选的实施方案中，表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸(图1所示的步骤II)的重组生物或微生物是这样的重组生物或微生物，其中能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶是如上文定义的水解酶(EC 4.2.-.-)，优选如上文定义的乌头酸酶(EC 4.2.1.3)，延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)或烯酰辅酶A水合酶/脱水酶(EC4.2.1.17)。
关于水解酶(EC 4.2.-.-)，乌头酸酶(EC 4.2.1.3)，延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)和烯酰辅酶A水合酶/脱水酶(EC 4.2.1.17)以及所述水解酶(EC 4.2.-.-)，所述乌头酸酶(EC4.2.1.3)，所述延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)和所述烯酰辅酶A水合酶/脱水酶(EC 4.2.1.17)的优选实施方式，对于根据本发明的方法所述的同样适用于重组生物或微生物。
另一方面，上述重组生物或微生物是进一步表达能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)(图1所示的步骤III)的酶的生物或微生物。在一个优选的实施方案中，能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)的酶是HMG CoA合酶(EC2.3.3.10)或PksG蛋白或具有C-C键裂解/缩合裂解酶活性的酶，如上文定义的HMG CoA裂解酶(EC 4.1.3.4)。
关于HMG CoA合酶(EC 2.3.3.10)，PksG蛋白质，具有C-C键裂解/缩合裂合酶活性的酶和HMG CoA裂合酶(EC 4.1.3.4)以及所述酶的优选实施方案，对于根据本发明的方法所述的同样适用于重组生物或微生物。
另一方面，上述重组生物或微生物是进一步表达能够将乙酰乙酸酶促转化成丙酮的酶(图1所示的步骤IV)，优选如上所述的乙酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.4)的生物或微生物。
关于能够将乙酰乙酸酶促转化成丙酮的所述酶和所述乙酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.4)以及所述酶的优选实施方案，对于根据本发明的方法所述的同样适用于重组生物或微生物。
另一方面，上述重组生物或微生物是进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸的酶(图1所示的步骤Va或Vb)的生物或微生物，优选如上文定义的
(i)乙酰乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.11)；或
(ii)能够在乙酸上转移乙酰乙酰辅酶A的CoA基团的酶。
在一个优选的实施方案中，能够在乙酸上转移乙酰乙酰辅酶A的CoA基团的酶是辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)，优选如上文所述的乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。
关于能够将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸的所述酶，所述乙酰乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.11)，所述能够转移乙酰乙酰辅酶A的CoA基团的酶，辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)和所述乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)以及所述酶的优选实施方案，对于根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
另一方面，上述重组生物或微生物是进一步表达能够将乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酰辅酶A的酶的生物或微生物，其包含
(a)(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIV)；和
(ii)能将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或
(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XIII)。
在一个优选的实施方案中，能够将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A的酶是如上文所述的乙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)。
在另一个优选的实施方案中，能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶是如上文所述的乙酰乙酰辅酶A合成酶(EC 2.3.1.194)。
在一个优选的实施方案中，能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶是如上文所述的乙酰辅酶A C-乙酰转移酶(EC 2.3.1.9)。
关于能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶，能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶，乙酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.2)，乙酰乙酰辅酶A合成酶(EC2.3.1.194)，能够将两个乙酰辅酶A分子直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶和乙酰辅酶A C-乙酰转移酶(EC 2.3.1.9)以及所述酶的优选实施方案，对于根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
表达步骤I和步骤VI的酶，并任选地进一步表达步骤VII，步骤VIII和步骤IX的酶 以及任选地进一步表达步骤XIII，XIV和XV的酶的重组生物或微生物
本发明还涉及一种重组生物或微生物，其表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)。
在一个优选的实施方案中，能够将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的酶是3-甲基巴豆酸脱羧酶，优选如上文所定义的
(i)与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶；或
(ii)乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)；或
(iii)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或
(iv)香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)；或
(v)原儿茶酸(PCA)脱羧酶(EC 4.1.1.63)。
关于3-甲基巴豆酸脱羧酶，FMN依赖性脱羧酶，相关的FMN异戊烯转移酶，乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)，甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)，原儿茶酸(PCA)脱羧酶(EC4.1.1.63)和香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)以及所述酶的优选实施方案，对于根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
在一个优选的实施方案中，能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶是
(a)能够直接将3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸的酶，其中所述能够直接将3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸的酶是如上所述辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)，优选丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)，乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.8)或琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.18)(如图1所示的步骤V1a)；或
(b)如上所述能够直接将3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸的酶，其中所述能够直接将3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸的酶是硫酯水解酶(EC 3.1.2.-)，优选乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)，ADP依赖性短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)或酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)(如图1所示的步骤VIb)。
在另一个优选的实施方案中，重组生物或微生物是表达以下两种酶的重组生物或微生物，即，
(c)(i)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成如上所述的3-甲基巴豆酰磷酸的酶；和
(ii)能够将3-甲基巴豆酰磷酸转化成如上文所述3-甲基巴豆酸的酶(如图1所示的步骤VIc)。
在一个优选的实施方案中，能够将3-甲基巴豆酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸磷酸的酶是磷酸丁酰基转移酶(EC2.3.1.19)或磷酸乙酰基转移酶(EC2.3.1.8)，并且能够将3-甲基巴豆酸磷酸转化为3-甲基巴豆酸的酶是如上文所述的用羧基作为受体的磷酸转移酶(EC 2.7.2.-)，优选丙酸激酶(EC 2.7.2.15)，乙酸激酶(EC 2.7.2.1)，丁酸激酶(EC2.7.2.7)或支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)。
关于上述酶，对于根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
另一方面，上述重组生物或微生物是进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A(图1所示的步骤VII)的酶，优选(i)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或(ii)如上文所述的香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)的生物或微生物。
关于所述酶以及所述酶的优选实施方案，对于根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
另一方面，上述重组生物或微生物是进一步表达能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化为3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(图1所示的步骤VIII)，优选3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)，3-羟基酰基辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.-)或烯酰辅酶A水合酶(EC4.2.1.-)的生物或微生物。
关于所述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
另一方面，上述重组生物或微生物是进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤IX)，优选3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶的生物或微生物。
关于所述酶以及所述酶的优选实施方案，对于根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
在进一步的方面，表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(如图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)(并且任选地进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A并任选地进一步表达能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化为3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶并且任选地进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基甲戊二酰辅酶A的酶)的上述重组生物或微生物优选是进一步表达能够将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A的酶的生物或微生物，其包含
能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XIII)。
在另一个优选的实施方案中，重组生物或微生物是表达以下两种酶的重组生物或微生物，即，
(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIV)；和
(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)。
在一个优选的实施方案中，能够将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A的酶是如上文所述的乙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)。
在另一个优选的实施方案中，能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶是如上文所述的乙酰乙酰辅酶A合成酶(EC2.3.1.194)。
在一个优选的实施方案中，能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶是如上文所述的乙酰辅酶A C-乙酰转移酶(EC 2.3.1.9)。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
用于通过3-甲基-3-丁烯酰辅酶A和3-甲基-3-丁烯酸将乙酰辅酶A酶促转化为异 丁烯的替代途径的重组生物或微生物：表达步骤XVI和步骤XVII的酶并且任选地进一步表 达步骤XVIII，步骤VIII和步骤IX的酶以及任选地进一步表达步骤XIII，XIV和XV的酶的重 组生物或微生物
如上所述，作为用于通过3-甲基巴豆酸生产异丁烯的上述第一路线的替代方案，本发明还涉及一种通过替代路线制备异丁烯的方法，其中通过将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯产生异丁烯。在下文中，描述了用于通过3-甲基-3-丁烯酰辅酶A和3-甲基-3-丁烯酸从乙酰辅酶A酶促转化为异丁烯的该替代途径的重组生物或微生物。
本发明还涉及表达(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤XVI)和(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化为3-甲基-3-丁烯酸的酶(如图1所示步骤XVII)的重组生物或微生物。
在一个优选的实施方案中，能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯的酶是上文所述的3-甲基-3-丁烯酸脱羧酶，更优选如上所述的
(i)与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶；或
(ii)乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)；或
(iii)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或
(iv)香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)；或
(v)原儿茶酸(PCA)脱羧酶(EC 4.1.1.63)。
在另一个优选的实施方案中，3-甲基-3-丁烯酸脱羧酶选自如上文所述的6-甲基水杨酸脱羧酶(EC 4.1.1.52)，2-氧代-3-己烯二酸脱羧酶(EC4.1.1.77)和5-氧代戊-3-烯-1,2,5-三羧酸脱羧酶(EC 4.1.1.68)。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
在一个优选的实施方案中，能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的酶是
(a)如上文所述的能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A直接转化为3-甲基-3-丁烯酸的酶，其中所述能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A直接转化成3-甲基-3-丁烯酸的酶是辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)，优选丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)，乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.8)或琥珀酰辅酶A：乙酸CoA转移酶(EC 2.8.3.18)(如图1所示的步骤XVIIa)。
在另一个优选的实施方案中，重组生物或微生物是表达以下两种酶的重组生物或微生物，即，
(b)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A直接转化成3-甲基-3-丁烯酸的酶，其中所述能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A直接转化为3-甲基-3-丁烯酸的酶是硫酯水解酶(EC3.1.2.-)，优选如上文所述的乙酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.1)，ADP-依赖性短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)或酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)(如图1所示的步骤XVIIb)；或
(c)(i)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰磷酸的酶；和
(ii)如上文所述能够将3-甲基-3-丁烯酰磷酸酶促转化成所述3-甲基-3-丁烯酸(如图1所示的步骤XVIIc)的酶。
在一个优选的实施方案中，能够将所述3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰磷酸的酶是磷酸丁酰基转移酶(EC2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC2.3.1.8)并且能够将3-甲基-3-丁烯酰磷酸酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的酶是用羧基作为受体的磷酸转移酶(EC 2.7.2.-)，优选如上文所述的丙酸激酶(EC 2.7.2.15)，乙酸激酶(EC2.7.2.1)，丁酸激酶(EC 2.7.2.7)或支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
另一方面，上述重组生物或微生物是进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A(图1所示的步骤XVIII)的酶的生物或微生物，优选如上所述的
(a)(i)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或(ii)香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)，或
(b)来自巨大鞘丝蓝细菌多功能蛋白的CurF的N末端结构域或3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶，优选由liuB基因编码的黄色粘球菌的3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶；或
(c)4-草酰巴豆酸脱羧酶家族的酶。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
另一方面，上述重组生物或微生物是进一步表达能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化为3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(图1所示的步骤VIII)，优选3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)，3-羟基酰基辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.-)或烯酰辅酶A水合酶(EC4.2.1.-)的生物或微生物。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
另一方面，上述重组生物或微生物是进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(如图1所示步骤IX)的酶的生物或微生物。
在一个优选的实施方案中，能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
另一方面，上述重组生物或微生物是进一步表达能够将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A的酶或几种酶的生物或微生物。
在一个优选的实施方案中，重组生物或微生物表达酶的组合，即，
(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIV)；和
(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)。
在备选实施方案中，重组生物或微生物表达能够将两个乙酰辅酶A分子直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)。
关于上述第一个实施方案，能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶优选为如上文所述的乙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)。
此外，能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶是如上文所述的乙酰乙酰辅酶A合成酶(EC 2.3.1.194)。
关于第二个上述实施方案，能够将两个乙酰辅酶A分子直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶优选为如上文所述的乙酰辅酶A C-乙酰转移酶(EC2.3.1.9)。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
表达步骤Xa，Xb，XI和XII的额外/补充途径的酶的重组生物或微生物
如上所述，用于由乙酰辅酶A生产异丁烯的本发明的上述方法可以通过如图18的步骤Xa，步骤Xb，步骤XI和步骤XII中所示并且如上面详细说明的一个或多个反应来补充。
因此，另一方面，本发明涉及任何上述重组生物或微生物，其中所述生物或微生物另外进一步表达如上述的
a)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸并伴随转移来自3-羟基巴豆酰CoA的CoA到3-羟基异戊酸(HIV)以产生3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图19所示步骤Xa)；和/或
b)能够酶促转化3-羟基异戊酸(HIV)为3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图20所示的步骤Xb)；和/或
c)能够将3-羟基异戊酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶(如图21所示的步骤XI)；和/或
d)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图22中示意性显示的步骤XII)。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
上述微生物优选为细菌，酵母或真菌。在另一个优选的实施方案中，生物是植物或非人类动物。关于细菌，重组生物或微生物的其它优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
本发明还涉及任何上述重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。因此，本发明还涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤II)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤II)，其进一步表达能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸的酶(如图1所示的步骤III)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤II)，其进一步表达能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)的酶(如图1所示的步骤III)，并进一步表达能够将乙酰乙酸酶促转化为丙酮的酶(如图1所示的步骤IV)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸(图1所示的步骤II)的酶，其进一步表达能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)的酶(如图1所示的步骤III)，其进一步表达能够将乙酰乙酸酶促转化为丙酮的酶(图1所示的步骤IV)，并进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸的酶(图1所示的步骤Va或Vb)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸(图1所示的步骤II)的酶，其进一步表达能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸的酶(如图1所示步骤III)，进一步表达能够将乙酰乙酸酶促转化为丙酮的酶(图1所示的步骤IV)，其进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸的酶(如图1所示步骤Va或Vb)并且其进一步表达能够将乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酰辅酶A的酶，包含(a)(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)。
在更优选的实施方案中，本发明涉及用于生产异丁烯的重组生物或微生物的任何上述用途，其中所述重组生物或微生物表达催化3-甲基巴豆酸至异丁烯的酶促转化的酶。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，如上文针对本发明的所述方法和重组生物或微生物所述同样适用于重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。
本发明还涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的酶(如图1所示步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(如图1所示步骤VIa，VIb或VIc)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)并且进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A(如图1所示步骤VII)的酶。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酸(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)的酶，其进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化为3－甲基巴豆酰CoA的酶(如图1所示步骤VII)，并进一步表达能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(图1所示的步骤VIII)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)的酶，其进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化为3－甲基巴豆酰CoA的酶(如图1所示步骤VII)，其进一步表达能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤VIII)，并进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤IX)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)的酶，其进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶转化为3－甲基巴豆酰CoA的酶(如图1所示步骤VII)，其进一步表达能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(图1所示的步骤VIII)，其进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤IX)，并且其进一步表达能够将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A的酶，包含(a)(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)。
在更优选的实施方案中，本发明涉及用于生产异丁烯的重组生物或微生物的任何上述用途，其中所述重组生物或微生物表达催化3-甲基巴豆酸至异丁烯的酶促转化的酶。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，如上所述为本发明方法和重组生物或微生物所述的同样适用于重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。
本发明还涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化成异丁烯的酶(如图1所示步骤XVI)和(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的酶(如图1所示的步骤XVII)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化成异丁烯的酶(如图1所示步骤XVI)和(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的酶(如图1所示的步骤XVII)并且其进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶(图1所示步骤XVIII)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化成异丁烯的酶(如图1所示步骤XVI)和(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的酶(如图1所示的步骤XVII)并且其进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶(图1所示步骤XVIII)并且其进一步表达能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤VIII)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化成异丁烯的酶(如图1所示步骤XVI)和(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的酶(如图1所示的步骤XVII)并且其进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶(图1所示步骤XVIII)并且其进一步表达能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤VIII)并且其进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤IX)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化成异丁烯的酶(如图1所示步骤XVI)和(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的酶(如图1所示的步骤XVII)并且其进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶(图1所示步骤XVIII)并且其进一步表达能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤VIII)并且其进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤IX)并且其进一步表达能够将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A的酶，包含(a)(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)。
在更优选的实施方案中，本发明涉及用于生产异丁烯的重组生物或微生物的任何上述用途，其中所述重组生物或微生物表达催化3-甲基-3-丁烯酸酶促转化成异丁烯的酶。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，如上对根据本发明方法和重组生物或微生物所述同样适用于重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。
另一方面，本发明涉及任何上述重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途，其中生物或微生物是另外进一步表达如上述的以下酶的生物或微生物
a)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸并伴随转移来自3-羟基异戊酰CoA的CoA到3-羟基异戊酸(HIV)以产生3-羟基异戊酰辅酶A(如图19所示步骤Xa)；和/或
b)能够酶促转化3-羟基异戊酸(HIV)为3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图20所示的步骤Xb)；和/或
c)能够将3-羟基异戊酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶(如图21所示的步骤XI)；和/或
d)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图22中示意性显示的步骤XII)。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
本发明还涉及催化将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯以从3-甲基巴豆酸生产异丁烯的酶的用途。
本发明还涉及(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤II)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤II)和能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)的酶(图1所示的步骤III)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤II)和能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)的酶(图1所示的步骤III)和能够将乙酰乙酸酶转化成丙酮的酶(图1所示的步骤IV)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤II)和能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)的酶(图1所示的步骤III)和能够将乙酰乙酸酶转化成丙酮的酶(图1所示的步骤IV)和能够将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸的酶(如图1所示的步骤Va或Vb)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤II)和能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)的酶(图1所示的步骤III)和能够将乙酰乙酸酶促转化成丙酮的酶(图1所示的步骤IV)和能够将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸的酶(如图1所示的步骤Va或Vb)和能够将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A的酶，包含(a)(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)，用于生产异丁烯的用途。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，如上为本发明方法和重组生物或微生物所述的同样适用于重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。
本发明还涉及(i)能够将3-甲基巴豆酸酶转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)和能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶(图1所示的步骤VII)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)和能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶(图1所示的步骤VII)和能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤VIII)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)；能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶(图1所示的步骤VII)；能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤VIII)和能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤IX)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤I)；和(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)；能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶(图1所示的步骤VII)；能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤VIII)；能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤IX)和能够将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A的酶，包含(a)(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)用于生产异丁烯的用途。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，如上为本发明方法和重组生物或微生物所述的同样适用于重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。
本发明还涉及催化3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯以从3-甲基-3-丁烯酸生产异丁烯的酶的用途。
本发明还涉及(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤XVI)和(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化为3-甲基-3-丁烯酸的酶(如图1所示步骤XVII)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤XVI)和(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化为3-甲基-3-丁烯酸的酶(如图1所示步骤XVII)和能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XVIII)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤XVI)和(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化为3-甲基-3-丁烯酸的酶(如图1所示步骤XVII)，能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XVIII)和能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤VIII)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤XVI)和(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化为3-甲基-3-丁烯酸的酶(如图1所示步骤XVII)和能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XVIII)；能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤VIII)和能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤IX)用于生产异丁烯的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯的酶(图1所示的步骤XVI)和(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化为3-甲基-3-丁烯酸的酶(如图1所示步骤XVII)；能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XVIII)；能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤VIII)；能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤IX)和能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤IX)和能够将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A的酶，包含(a)(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)用于生产异丁烯的用途。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，如上为本发明方法和重组生物或微生物所述的同样适用于重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。
另一方面，本发明涉及用于生产异丁烯的酶的任何上述用途，其中另外地使用如上述的：
a)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸并伴随转移来自3-羟基异戊酰CoA的CoA到3-羟基异戊酸(HIV)以产生3-羟基异戊酰辅酶A(如图19所示步骤Xa)的酶；和/或
b)能够酶促转化3-羟基异戊酸(HIV)为3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图20所示的步骤Xb)；和/或
c)能够将3-羟基异戊酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶(如图21所示的步骤XI)；和/或
d)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图22中示意性显示的步骤XII)。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物.
此外，本发明涉及包含3-甲基巴豆酸和重组生物或微生物的组合物，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示步骤I)；和/或(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸(图1所示的步骤II)的酶，和/或其进一步表达能够使丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)的酶(如图1所示步骤III)，和/或其进一步表达能够将乙酰乙酸酶促转化为丙酮的酶(如图1所示的步骤IV)，和/或进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸的酶(如图1所示步骤Va或Vb)和/或进一步表达能够将乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酰辅酶A的酶，所述酶包含(a)(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)。
此外，本发明涉及组合物，其包含3-甲基巴豆酸和(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示步骤I)；和/或(ii)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸(图1所示的步骤II)的酶，和/或能够使丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)的酶(如图1所示步骤III)，和/或能够将乙酰乙酸酶促转化为丙酮的酶(如图1所示的步骤IV)，和/或能够将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸的酶(如图1所示步骤Va或Vb)和/或能够将乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酰辅酶A的酶，所述酶包含(a)(i)能够转化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，如上为本发明方法和重组生物或微生物所述的同样适用于重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。
此外，本发明涉及包含3-甲基巴豆酸和重组生物或微生物的组合物，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示的步骤I)；和/或(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酸(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)的酶，和/或其进一步表达能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶(图1所示的步骤VII)，和/或其进一步表达能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤VIII)和/或其进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤IX)和/或其进一步表达能够将乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酰辅酶A的酶，所述酶包含(a)(i)能够转化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)。
此外，本发明涉及组合物，其包含3-甲基巴豆酸和(i)能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示步骤I)；和/或(ii)能够将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酸的酶(图1所示的步骤VIa，VIb或VIc)；和/或能够将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶(图1所示的步骤VII)，和/或能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤VIII)和/或能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤IX)和/或能够将乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酰辅酶A的酶，所述酶包含(a)(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，如上为本发明方法和重组生物或微生物所述的同样适用于重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。
此外，本发明涉及包含3-甲基-3-丁烯酸和重组生物或微生物的组合物，其中所述重组生物或微生物表达(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示的步骤XVI)；和/或(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的酶(图1所示的步骤XVII)，和/或其进一步表达能够将3-甲基-戊烯二酰辅酶A酶促转化为3-甲基-3-丁烯酰辅酶A(如图1所示步骤XVIII)的酶，和/或其进一步表达能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤VIII)和/或其进一步表达能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤IX)和/或其进一步表达能够将乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酰辅酶A的酶，所述酶包含(a)(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)。
此外，本发明涉及用于生产异丁烯的组合物，其包含3-甲基-3-丁烯酸和(i)能够将3-甲基-3-丁烯酸酶促转化为异丁烯的酶(如图1所示的步骤XVI)；和/或(ii)能够将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的酶(图1所示的步骤XVII)，和/或能够将3-甲基-戊烯二酰辅酶A酶促转化为3-甲基-3-丁烯酰辅酶A(如图1所示步骤XVIII)的酶，和/或能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤VIII)和/或能够将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤IX)和/或能够将乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酰辅酶A的酶，所述酶包含(a)(i)能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的酶(如图1所示步骤XIV)；和(ii)能够将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(图1所示的步骤XV)；或(b)能够将两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A的酶(如图1所示的步骤XIII)。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，如上为本发明方法和重组生物或微生物所述的同样适用于重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。
另一方面，本发明涉及任何上述组合物，其中所述生物或微生物是另外进一步表达以下酶的生物或微生物
a)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸并伴随转移来自3-羟基巴豆酰CoA的CoA到3-羟基异戊酸(HIV)以产生3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图19所示步骤Xa)；和/或
b)能够酶促转化3-羟基异戊酸(HIV)为3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图20所示的步骤Xb)；和/或
c)能够将3-羟基异戊酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶(如图21所示的步骤XI)；和/或
d)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图22中示意性显示的步骤XII)。
另一方面，本发明涉及任何上述组合物，其进一步额外包含如上述的
a)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸并伴随转移来自3-甲基巴豆酰CoA的CoA到3-羟基异戊酸(HIV)以产生3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图19所示步骤Xa)；和/或
b)能够酶促转化3-羟基异戊酸(HIV)为3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图20所示的步骤Xb)；和/或
c)能够将3-羟基异戊酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的酶(如图21所示的步骤XI)；和/或
d)能够将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A的酶(如图22中示意性显示的步骤XII)。
关于上述酶以及所述酶的优选实施方案，对于上文根据本发明的方法所述的同样适用于所述重组生物或微生物。
图1：显示了通过3-甲基巴豆酸从乙酰辅酶A生产异丁烯的人工途径。此外，在步骤Xa，Xb，XI和XII中显示了途径期间可能发生的代谢物的酶循环。
图2A：黄素单核苷酸(FMN)的酶促异戊二烯化作用为相应的修饰(异戊二烯化)黄素辅因子的示意性反应。
图2B：3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化的示意反应。
图3：将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸的示意反应。
图4：乙酰辅酶A和丙酮的酶促缩合成3-羟基异戊酸的示意反应。
图5：乙酰乙酸向丙酮的酶促转化的示意反应。
图6：通过水解乙酰乙酰辅酶A的CoA硫酯生成乙酰乙酸，将乙酰乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酸的示意反应。
图7：通过将乙酰乙酰辅酶A的CoA基团转移到乙酸上，导致形成乙酰乙酸和乙酰辅酶A，将乙酰乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酸的示意反应。
图8：3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的示意反应。
图9：通过如图1所示步骤VIa将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的示意反应。
图10：通过如图1所示步骤VIb将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的示意反应。
图11：通过如图1所示步骤VIc将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的示意反应。
图12：3-甲基戊烯二酰辅酶A到3-甲基巴豆酰辅酶A的酶促转化的示意反应。
图13：将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A的示意反应。
图14：乙酰CoA和乙酰乙酰辅酶A到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶促缩合的示意反应。
图15：两分子乙酰辅酶A到乙酰乙酰辅酶A的酶促缩合的示意反应。
图16：乙酰辅酶A酶促转化成丙二酰辅酶A的示意性反应。
图17：丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A到乙酰乙酰辅酶A的酶促缩合的示意反应。
图18：示出了在经由3-甲基巴豆酸从乙酰辅酶A生产异丁烯的途径期间可能发生的代谢物的酶循环步骤(也如图1所示的步骤Xa，Xb，XI和XII)。
图19：将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸并伴随转移来自3-甲基巴豆酰辅酶A的CoA到3-羟基异戊酸(HIV)上以产生3-羟基异戊酰辅酶A的示意反应。
图20：将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A的示意反应。
图21：3-羟基异戊酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A的示意反应。
图22：将3-羟基异戊酸(HIV)一般酶促转化成3-羟基异戊酰辅酶A的示意反应。
图23：通过3-羟基异戊酰基-腺苷单磷酸将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-羟基异戊酰辅酶A的示意反应。
图24：通过3-羟基异戊酰磷酸将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-羟基异戊酰辅酶A的示意反应。
图25：3-甲基-3-丁烯酸到异丁烯的酶促转化的示意反应。
图26：将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的示意反应。
图27：通过利用辅酶A转移酶将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的示意性反应。
图28：通过利用硫酯水解酶将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的示意反应。
图29：通过3-甲基-3-丁烯酰磷酸在两步反应中将3-甲基-3-丁烯酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酸的示意性反应。
图30：3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基-3-丁烯酰辅酶A的示意反应。
图31：磷酸泛酰巯基乙胺部分的结构。
图32：通过3-甲基丁酰辅酶A和3-甲基丁酸将3-甲基巴豆酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酸的示意图。
图33：显示了对酿酒酵母UbiD蛋白进行催化测定所获得的典型GC色谱图与实施例2中概述的相应对照的重叠图。
图34a：显示了“酶测定”(测定A，实施例3)和“无酶测定”(测定H，实施例3)获得的典型HPLC-色谱图(分析3-甲基巴豆酰辅酶A，3-甲基巴豆酸和CoA-SH)的重叠图。在磷酸丁酰转移酶与丁酸激酶组合的酶测定中观察到3-甲基巴豆酰辅酶A的消耗和同时产生CoA-SH和3-甲基巴豆酸。
图34b：显示了对于“酶测定”(测定A，实施例3)和“无酶测定”(测定H，实施例3)获得的典型HPLC-色谱图(ADP和ATP的分析)的重叠图。在磷酸丁酰转移酶与丁酸激酶组合的酶促测定中观察到ADP的消耗和同时产生ATP。
图35：显示酶测定中3-甲基巴豆酸和ATP的产生结果，其包含与不同丁酸激酶组合的来自枯草芽孢杆菌的磷酸丁酰转移酶。此外，显示了在对照测定中3-甲基巴豆酸和ATP的产生。
图36：显示酶促测定中3-甲基巴豆酸和ATP的产生结果，其包含与不同丁酸激酶组合的来自粪肠球菌的磷酸丁酰转移酶。此外，显示了在不同的对照测定中产生3-甲基巴豆酸和ATP。
图37：显示用实施例5中概述的来自恶臭假单胞菌的酰基辅酶A硫酯酶II进行酶促测定获得的典型HPLC-色谱图的实例。
图38：显示了过表达来自酿酒酵母的UbiD蛋白和来自大肠杆菌的UbiX蛋白的重组大肠杆菌菌株(菌株A)或仅过表达来自酿酒酵母的UbiD蛋白的重组大肠杆菌菌株(菌株B)或携带空载体的重组大肠杆菌菌株(阴性对照，菌株C)中从3－甲基巴豆酸生产异丁烯获得的典型色谱图的重叠图。
图39：显示了在实施例7中列出的一锅法酶促测定法中从3-甲基巴豆酰辅酶A生产异丁烯所获得的典型色谱图以及相应的对照的重叠图。
图40：显示了酶促测定(a)和对照测定(b)的色谱图。在存在Co-A转移酶(a)的情况下从乙酸和3-甲基巴豆酰辅酶A产生显著量的乙酰辅酶A和3-甲基巴豆酸，而在没有酶的对照测定中没有观察到产物(b)。
图41：显示从基于HPLC的分析获得的3-甲基戊烯二酰辅酶A(MG-CoA)峰面积。
图42：在大肠杆菌中实施的通过3-甲基巴豆酸从乙酰辅酶A生物合成异丁烯的代谢途径。
在本说明书中，引用了包含专利申请的众多文件。这些文献的公开内容(尽管不认为与本发明可专利性相关)通过引用的方式完整并入本文。更具体地，参考的全部文献通过引用的方式以相同的程度并入，如同专门且个别地指出通过引用的方式并入每份单独的文献。
现在将参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅是示意性的并且不得解释为限制本发明的范围。
实施例
一般方法和材料
除非另外说明，否则实验中所用的全部试剂和材料均从Sigma-Aldrich Company(St.Luis,MO)获得。适用于细菌培养物生长和蛋白质表达的材料和方法在本领域中是公知的。
实施例1：重组蛋白的基因合成，克隆和表达
所研究的酶的序列通过寡核苷酸连接产生以适应大肠杆菌的密码子选择(基因由商业合成)。在甲硫氨酸起始密码子之后插入一段6个组氨酸密码子以提供用于纯化的亲和标签。将如此合成的基因克隆到pET-25b(+)表达载体中(载体由构建)。含有编码来自大肠杆菌的UbiX蛋白(3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸羧基裂合酶配偶体蛋白)基因(Uniprot登录号：P0AG03)的载体pCAN购自NAIST(Nara Institute ofScience and Technology,Japan,ASKA collection)。提供的载体在甲硫氨酸起始密码子后含有一段6个组氨酸密码子。
根据标准热休克程序用这些载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)。使用ZYM-5052自动诱导培养基(Studier FW，Prot.Exp.Pur.41，(2005)，207-234)在30℃下摇动(160rpm)6小时使转化的细胞生长，并在18℃继续蛋白质表达过夜(约16小时)。对于过量表达来自大肠杆菌的UbiX的重组菌株，将500μM黄素单核苷酸(FMN)加入到生长培养基中。通过在4℃，10,000rpm离心20分钟来收集细胞，并将沉淀物储存在-80℃。
蛋白质纯化和浓缩
将200ml培养细胞的沉淀物在冰上解冻并重悬于6ml含有100mM NaCl的50mMTris-HCl缓冲液pH7.5中(在过量表达UbiX蛋白质的重组菌株的情况下)和6ml 50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5,10mM MgCl2,10mM咪唑和5mM DTT中(在过量表达UbiD蛋白的重组菌株的情况下)。加入20微升溶菌酶(lysonase)(Novagen)。然后将细胞在室温下温育10分钟，返回到冰上20分钟，通过超声处理3×15秒完成裂解。含有UbiX蛋白的细胞裂解液在冰上保存。然后通过在4℃，4000rpm离心40分钟使含有UbiD蛋白的细菌提取物澄清。将澄清的细菌裂解物上样到PROTINO-2000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)上，使其吸附6-His标记的蛋白质。洗涤柱子并用6ml含有100mM NaCl和250mM咪唑的100mM Tris-HCl缓冲液pH7.5洗脱目的酶。然后浓缩洗脱液，在Amicon Ultra-4 10kDa过滤器单元(Millipore)上脱盐，并将酶重悬浮于含有50mM NaCl和5mM DTT的50mM Tris-HCl缓冲液pH7.5中。
如通过SDS-PAGE分析估计的，由此纯化的蛋白质的纯度在80％至90％之间变化。通过在NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)上直接UV 280nm测量和通过Bradford测定法(BioRad)来测定蛋白质浓度。
实施例2：通过含有UbiX蛋白的裂解物与纯化的UbiD蛋白的结合催化的3-甲基巴豆酸体外脱羧为异丁烯
在水中制备0.5M的3-甲基巴豆酸储备液并用10M NaOH溶液调节至pH7.0。
根据实施例1中所述的程序纯化两种UbiD蛋白(表C)。
在以下条件下在2ml玻璃瓶(Interchim)中进行酶测定：
50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5
20mM NaCl
10mM MgCl2
5mM DTT
50mM 3-甲基巴豆酸
1mg/ml纯化的UbiD蛋白
50μl含有UbiX蛋白的裂解物
测定的总体积为300μl。
平行进行一系列对照测定(表C)。
将小瓶密封并在30℃温育120分钟。通过在80℃温育2分钟来停止测定，并且通过配备有火焰离子化检测器(FID)的气相色谱(GC)分析反应顶部空间中形成的异丁烯。
对于GC分析，在配备有GS-氧化铝柱(30m×0.53mm)(Agilent)的Bruker GC-450系统中使用等温模式在130℃下分离1ml顶空气体。使用氮气作为载气，流速为6毫升/分钟。
通过与异丁烯标准品比较来鉴定酶促反应产物。在这些GC条件下，异丁烯的保留时间为2.42分钟。
在组合测定中观察到来自3-甲基巴豆酸的异丁烯的显著产生(UbiD蛋白+UbiX蛋白)。单独温育含有UbIX蛋白的裂解物不会导致异丁烯生成。这些数据表明，测定中存在的两种酶合作进行3-甲基巴豆酸脱羧生成异丁烯。在图33中显示了用来自酿酒酵母的UbiD蛋白的测定中获得的典型色谱图。
表C.
实施例3：通过来自枯草芽孢杆菌的磷酸丁酰转移酶和来自干酪乳杆菌或土芽孢杆菌属的丁酸激酶的联合作用催化的3-甲基巴豆酰辅酶A和ADP转化为3-甲基巴豆酸和ATP
根据实施例1中所述的程序获得并纯化相应的酶。
酶测定在0.2ml的总反应体积中进行
标准反应混合物含有：
50mM磷酸钾缓冲液pH7.5
4mM 3-甲基巴豆酰辅酶A
4mM ADP
10mM MgCl2
10mM NaCl
来自枯草芽孢杆菌的0.2mg/ml纯化的磷酸丁酰转移酶(Uniprot登录号：P54530)
来自干酪乳杆菌(Uniprot登录号：K0N529)或土芽孢杆菌(Uniprot登录号：L8A0E1)的0.2mg/ml纯化的丁酸激酶。
平行进行一系列对照(测定C-H表D)。
表D
测定在30℃下振荡温育20分钟。
在温育期后，通过在90℃加热反应介质4分钟停止反应。将样品离心，通过0.22μm过滤器过滤，并将澄清的上清液转移到干净的小瓶中用于进一步分析。ADP和3-甲基巴豆酰辅酶A的消耗以及ATP，3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成随后使用基于HPLC的方法。
ADP和ATP的基于HPLC的分析
使用配备有柱加热模块和RI检测器的1260Inifinity LC系统(Agilent)进行HPLC分析。在Polaris C18-A柱(150x 4.6mm，5μm粒径，柱温30℃)上分离2μl样品，流动相流速为1.5ml/min。使用8.4mM硫酸在H2O/MeOH混合溶液(99/1)(V/V)中进行分离。在这些条件下，ADP和ATP的保留时间分别为2.13分钟和2.33分钟。
3-甲基巴豆酰辅酶A，3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的基于HPLC的分析
HPLC分析使用配备有柱加热模块和UV检测器(260nm)的1260Inifinity LC系统(Agilent)进行。在Zorbax SB-Aq柱(250x 4.6mm，5μm粒径，柱温30℃)上分离1μl样品，流动相流速为1.5ml/min。使用混合的A(含有8.4mM硫酸的H2O)和B(乙腈)溶液以线性梯度(初始时间0分钟0％B→8分钟70％B)进行分离。在这些条件下，3-甲基巴豆酰辅酶A，3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的保留时间分别为5.38分钟，5.73分钟和4.07分钟。
在图34a和34b中显示了对酶测定A和无酶测定H获得的典型色谱图。
HPLC分析的结果总结在图35中。
获得的数据表明3-甲基巴豆酰辅酶A在分别由两种酶催化的两步反应中(测定A和B)转化成3-甲基巴豆酸，伴随从ADP产生ATP。因此，通过形成中间体3-甲基巴豆酰磷酸发生转化，随后从该中间体转移磷酸基团到ADP，由此释放ATP。
当单独使用磷酸丁酰转移酶(测定E)时，产生一定量的3-甲基巴豆酸而不同时产生ATP。这种产生是由于磷酸丁酰转移酶作用产生的3-甲基巴豆酰磷酸的自发水解。
对于没有ADP的对照测定(测定C和D)，以相同的方式观察3-甲基巴豆酸的产生。这种产生也是由于磷酸丁酰转移酶作用产生的3-甲基巴豆酰磷酸的水解。
实施例4：通过来自粪肠球菌的磷酸丁酰转移酶和来自干酪乳杆菌或土芽孢杆菌属的丁酸激酶的联合作用催化的3-甲基巴豆酰辅酶A和ADP转化为3-甲基巴豆酸和ATP
根据实施例1中所述的程序获得并纯化相应的酶。
酶测定在0.2ml的总反应体积中进行
标准反应混合物含有：
50mM磷酸钾缓冲液pH7.5
4mM 3-甲基巴豆酰辅酶A
4mM ADP
10mM MgCl2
10mM NaCl
来自粪肠球菌的0.2mg/ml纯化的磷酸丁酰转移酶(Uniprot登录号：S4BZL5)
来自干酪乳杆菌(Uniprot登录号：K0N529)或土芽孢杆菌(Uniprot登录号：L8A0E1)的0.2mg/ml纯化的丁酸激酶
平行进行一系列对照(测定C-H表E)。
表E
将测定在30℃下振荡温育20分钟。
在温育期后，通过在90℃加热反应介质4分钟停止反应。将样品离心，通过0.22μm过滤器过滤，并将澄清的上清液转移到干净的小瓶中用于进一步分析。ADP和3-甲基巴豆酰辅酶A的消耗以及ATP和3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成后，根据实施例3中所述的方法进行HPLC分析。
HPLC分析的结果总结在图36中。
所获得的数据表明3-甲基巴豆酰辅酶A在分别由两种酶催化的两步反应中(测定A和B)转化成3-甲基巴豆酸，伴随从ADP产生ATP。因此，通过形成中间体3-甲基巴豆酰磷酸发生转化，随后从该中间体转移磷酸基团到ADP，由此释放ATP。
当单独使用磷酸丁酰转移酶(测定E)时，观察到显著产生3-甲基巴豆酸而不同时产生ATP。这种产生是由于磷酸丁酰转移酶作用产生的3-甲基巴豆酰磷酸的水解。
对于没有ADP的对照测定(测定C和D)，以相同的方式观察3-甲基巴豆酸的产生。这种产生也是由于磷酸丁酰转移酶作用产生的3-甲基巴豆酰磷酸的水解。
实施例5：将3-甲基巴豆酰辅酶A酶催化水解成3-甲基巴豆酸和游离辅酶A
根据实施例1中描述的步骤合成编码来自恶臭假单胞菌的酰基辅酶A硫酯酶II的基因。
含有编码来自大肠杆菌的酰基辅酶A硫酯酶2(TesB)的基因的载体pCAN购自NAIST(Nara Institute of Science and Technology,Japan,ASKA collection)。提供的载体在甲硫氨酸起始密码子后含有一段6个组氨酸密码子。根据实施例1中所述的程序生产相应的酶。
酶测定在0.2ml的总反应体积中进行。
标准反应混合物含有：
50mM HEPES pH 7.0
10mM 3-甲基巴豆酰辅酶A
20mM MgCl2
20mM NaCl
1mg/ml纯化的重组硫酯酶。
进行对照测定，其中或者不添加酶，或者不添加底物。
将测定在30℃振荡温育30分钟，通过加入0.1ml乙腈使反应停止，然后通过基于HPLC的程序分析样品。
3-甲基巴豆酰辅酶A的消耗和3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成的基于HPLC的分析
HPLC分析使用配备有柱加热模块和UV检测器(210nm)的1260Inifinity LC系统(Agilent)进行。在Zorbax SB-Aq柱(250x 4.6mm，5μm粒径，柱温30℃)上分离5μl样品，流动相流速为1.5ml/min。使用混合的A(含有8.4mM硫酸的H2O)和B(乙腈)溶液以线性梯度(初始时间0分钟0％B→8分钟70％B)进行分离。使用市售3-甲基巴豆酰辅酶A，3-甲基巴豆酸(Sigma-Aldrich)和CoA-SH(Sigma-Aldrich)作为参考。在这些条件下，游离辅酶A(CoA-SH)，3-甲基巴豆酰辅酶A和3-甲基巴豆酸的保留时间分别为4.05,5.38和5.83分钟。
在对照测定中没有观察到3-甲基巴豆酸信号。
所研究的两种硫酯酶均催化3-甲基巴豆酰辅酶A的水解，形成3-甲基巴豆酸。在图37中显示了用来自恶臭假单胞菌的酰基辅酶A硫酯酶II获得的色谱图的实例。
表F中显示了在酶测定中观察到的3-甲基巴豆酸的产生。
表F
实施例6：通过来自大肠杆菌的UbiX蛋白和来自酿酒酵母的UbiD蛋白的缔合催化的3-甲基巴豆酸体内脱羧成异丁烯
编码来自酿酒酵母的UbiD蛋白的基因(Uniprot登录号：Q03034)经密码子优化用于在大肠杆菌中表达并由(Life Technologies)合成。然后使用含有NcoI限制性位点的正向引物和含有BamHI限制性位点的反向引物从pMK-RQ载体(GeneArt提供的主要质粒)PCR扩增该研究的基因。使用含有NdeI限制性位点的正向引物和含有KpnI限制性位点的反向引物通过PCR扩增编码来自大肠杆菌的UbiX蛋白的基因(Uniprot登录号：P0AG03)。先前描述的pCAN载体(实施例1)用作该PCR步骤的模板。将这两个获得的PCR产物(UbiD蛋白和UbiX蛋白)克隆到pETDuetTM-1共表达载体(Novagen)中。通过测序验证构建的重组质粒。根据标准热休克程序用该载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)，并铺板到补充有氨苄青霉素(0.1mg/ml)(称为“菌株A”)的LB琼脂平板上。
在本研究中也使用仅携带来自酿酒酵母的UbiD蛋白质基因的pET-25b(+)载体转化的BL21(DE3)菌株(称为“菌株B”)。在随后的测定中(称为“菌株C”)，将用空pET-25b(+)载体转化的BL21(DE3)菌株用作阴性对照。
使用单一转化体接种补充氨苄青霉素的LB培养基，然后在30℃温育过夜。将1ml该过夜培养物用于接种300ml ZYM-5052自诱导培养基(Studier FW(2005)，localcitation)。培养物在30℃和160rpm摇动下生长20小时。
取出和离心一定体积的与30的OD600相对应的培养物。将沉淀物重悬于30ml含有葡萄糖(45g/L)和MgSO4(1mM)并补充有10mM 3－甲基巴豆酸的MS培养基(Richaud C.,Mengin-Leucreulx D.,Pochet S.,Johnson EJ.,Cohen GN.and Marlière P,The Journalof Biological Chemistry,268,(1993),26827-26835)中。随后将这些培养物在螺旋帽密封的160ml瓶中在30℃振摇下温育22小时。在8小时温育后，通过使用30％NH4OH调节培养物的pH值至8.5。
在温育时间后，通过配备火焰离子化检测器(FID)的气相色谱(GC)分析反应顶空中产生的异丁烯。根据实施例2中描述的方法分离和分析1ml顶空气相。
用携带空载体的对照菌株C没有形成异丁烯。对过表达两种基因——来自酿酒酵母的UbiD蛋白和来自大肠杆菌的UbiX蛋白——的菌株A观察到异丁烯的最高产量。观察到仅过表达UbiD蛋白的菌株B的异丁烯的显著产生。因此，大肠杆菌的内源性UbiX可能有助于激活酿酒酵母的UbiD蛋白(图38)。
实施例7：通过来自枯草芽孢杆菌的磷酸转丁酰酶，来自土芽孢杆菌属的丁酸激酶和来自酿酒酵母的UbiD蛋白的结合催化的从3-甲基巴豆酰辅酶A的一锅法酶促合成异丁烯
根据实施例1中描述的方案，携带来自酿酒酵母(Uniprot登录号Q03034)的UbiD基因和来自大肠杆菌(Uniprot登录号P0AG03)的UbiX基因(实施例6)的pETDuetTM-1共表达载体被用于生产和纯化UbiD蛋白。如实施例4所述纯化来自枯草芽孢杆菌的磷酸转丁酰酶和来自土芽孢杆菌属的丁酸激酶。
酶测定在0.3ml的总反应体积中进行。
标准反应混合物含有：
50mM Tris-HCl pH 7.5
10mM 3-甲基巴豆酰辅酶A
10mM MgCl2
10mM NaCl
10mM磷酸钾缓冲液pH7.5
10mM ADP
来自枯草芽孢杆菌的0.02mg/ml纯化的磷酸转丁酰酶
来自土芽孢杆菌属的0.02mg/ml纯化的丁酸激酶
来自酿酒酵母的1mg/ml纯化的UbiD
在30℃下进行催化18小时。
平行进行一系列对照测定，其中或者不添加UbiD蛋白(对照A)或者磷酸转丁酰酶(对照B)或者丁酸激酶(对照C)或者不添加底物(对照D)。在温育期后，通过配备有火焰离子化检测器(FID)的气相色谱(GC)分析顶空中产生的异丁烯。根据实施例2中描述的方法分离并分析1ml顶空气相。图39显示了对于整个酶测定和相应对照获得的典型色谱图的叠加。
在包含磷酸转丁酰酶，丁酸激酶和UbiD蛋白的测定中观察到异丁烯的最高产量。不含磷酸转丁酰酶的对照测定(对照B)和不含丁酸激酶的对照测定(对照C)也显示异丁烯的显著产生。这些结果可以通过将3-甲基巴豆酰辅酶A自发水解成3-甲基巴豆酸来解释。从3-甲基巴豆酰辅酶A酶促生产异丁烯的可以通过三个连续步骤，通过形成3-甲基巴豆酰磷酸和3-甲基巴豆酸作为中间体来实现。
实施例8：体外筛选用于将3-甲基巴豆酸脱羧成异丁烯的UbiD蛋白质
编码UbiD蛋白的几种基因针对大肠杆菌中的表达进行密码子优化，并由(Thermofisher)合成。根据实施例1中描述的程序纯化相应的酶。所研究的酶的列表显示在表G中。
在以下条件下在2ml玻璃瓶(Interchim)中进行酶测定：
50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5
20mM NaCl
10mM MgCl2
1mM DTT
50mM 3-甲基巴豆酸
1mg/ml纯化的UbiD蛋白
100μl裂解物含有来自大肠杆菌的UbiX蛋白
测定的总体积为300μl。
平行进行一系列对照测定，其中或者不添加UbiD蛋白，或者不添加酶(表G)。
将小瓶密封并在30℃温育60分钟。根据实施例2中所述的程序，通过在80℃温育2分钟来停止测定，并且通过配备有火焰离子化检测器(FID)的气相色谱(GC)分析在反应顶部空间中形成的异丁烯。
表G中显示了GC分析的结果。在对照反应中没有观察到异丁烯生成。这些结果表明，在该筛选测定的条件下研究的所有UbiD蛋白能够在含有UbiX蛋白的大肠杆菌细胞裂解物存在下将3-甲基巴豆酸脱羧成异丁烯。
表G.
实施例9：3-甲基巴豆酰辅酶A和乙酸转化成由巨球菌属(Megasphaera sp.)的辅酶A转移酶催化的3-甲基巴豆酸和乙酰辅酶A
根据实施例1中所述的程序生产和纯化该酶。
酶测定在0.2ml的总反应体积中进行
标准反应混合物含有：
50mM Tris-HCl缓冲液pH7.5
5mM 3-甲基巴豆酰辅酶A
10mM乙酸钠
10mM MgCl2
10mM NaCl
来自巨球菌属的3mg/ml纯化的辅酶A转移酶(Uniprot登录号：S7HFR5)。
进行对照测定，其中或者不添加酶，或者不添加3-甲基巴豆酰辅酶A。测定在30℃温育6小时。通过在培养基中加入100μl MeCN终止测定。将样品离心，通过0.22μm过滤器过滤，并将澄清的上清液转移到干净的小瓶中用于基于HPLC的分析。
HPLC分析使用配备有柱加热模块和UV检测器(260nm)的1260Inifinity LC系统(Agilent)进行。在Zorbax SB-Aq柱(250x 4.6mm,5μm粒径，柱温30℃)上分离5μl样品，流动相流速为1.5ml/min。使用混合的A(含有8.4mM硫酸的H2O)和B(乙腈)溶液以线性梯度(初始时间0分钟0％B→8分钟70％B)进行分离。在这些条件下，3-甲基巴豆酰辅酶A，3-甲基巴豆酸和乙酰辅酶A的保留时间分别为5.22分钟，5.70分钟和4.25分钟。
在酶测定中观察到显著量的乙酰辅酶A和3-甲基巴豆酸，而在对照中没有观察到两种化合物中的任何一种。在酶测定中观察到显著量的乙酰辅酶A和3-甲基巴豆酸，而这两种化合物中没有一种在对照测定中形成。酶促和对照测定的典型色谱图见图40。
实施例10：在含有UbiX蛋白的裂解物和纯化的脱羧酶存在下催化的3-甲基巴豆酸酶促脱羧为异丁烯
在水中制备0.5M的3-甲基巴豆酸储备溶液并用10M NaOH溶液调节至pH7.0。
根据实施例1中所述的程序产生由aroY基因编码的蛋白质和一种注释为UbiD蛋白质的蛋白质。
在以下条件下在2ml玻璃瓶(Interchim)中进行酶测定：
50mM磷酸钾缓冲液pH7.5
20mM NaCl
10mM MgCl2
5mM DTT
50mM 3-甲基巴豆酸
1mg/ml纯化的AroY或UbiD蛋白
50μl含有UbiX蛋白的裂解物
测定的总体积为300μl。
平行进行一系列对照测定(表H)。
将小瓶密封并在30℃温育120分钟。通过在80℃温育2分钟来停止测定，并且通过配备有火焰离子化检测器(FID)的气相色谱(GC)分析反应顶部空间中形成的异丁烯。
对于GC分析，在配备有GS-氧化铝柱(30m×0.53mm)(Agilent)的Bruker GC-450系统中使用等温模式在130℃下分离1ml顶空气体。使用氮气作为载气，流速为6毫升/分钟。
通过与异丁烯标准比较来鉴定酶促反应产物。在这些GC条件下，异丁烯的保留时间为2.42分钟。
在组合测定中(AroY或UbiD蛋白+UbiX蛋白)观察到来自3-甲基巴豆酸的异丁烯的显著产生。温育仅含有UbiX蛋白的裂解物不会导致异丁烯生成。这些数据表明由aroY基因编码的蛋白质与UbiX蛋白结合可以催化3-甲基巴豆酸脱羧成异丁烯。
表H.
实施例11：3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶催化脱水成3-甲基戊烯二酰辅酶A
合成编码3-羟基酰基辅酶A脱水酶(也称为烯酰辅酶A水合酶，在下文中缩写为ECH)的基因(表I)，并根据实施例1中所述的程序进一步生成相应的酶。在水中制备20mM 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)的储备液。在以下条件下以0.2ml的总体积进行酶分析：
-50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5
-100mM NaCl
-2mM的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)
-0.1mg/ml纯化的3-羟基酰基辅酶A脱水酶。
通过加入20μl 20mM底物开始酶测定，在30℃下运行10分钟，并在反应介质中加入100μL乙腈终止。所有的酶测定都是一式两份进行。然后将样品离心，通过0.22μm过滤器过滤，并将澄清的上清液转移到干净的小瓶中用于基于HPLC的分析。
使用配备有柱加热模块和UV检测器(260nm)的1260Inifinity LC系统(Agilent)进行分析。在Zorbax SB-Aq柱(250x 4.6mm，5μm粒径，柱温30℃)上分离5μl样品，流动相流速为1.5ml/min。使用混合的A(含有8.4mM硫酸的H2O)和B(乙腈)溶液以线性梯度(初始时间0分钟0％B→8分钟70％B)进行分离。在这些条件下，HMG-CoA，3-甲基戊烯二酰辅酶A(MG-CoA)和游离辅酶A的保留时间分别为4.26分钟，4.76分钟和3.96分钟。图41显示了从基于HPLC的分析获得的3-甲基戊烯二酰辅酶A(MG-CoA)峰面积。
表I.
实施例12：通过3-甲基巴豆酸从乙酰辅酶A生产异丁烯的微生物
该实施例显示通过表达外源基因的重组大肠杆菌菌株直接生产异丁烯，由此构成异丁烯途径。
像大多数生物一样，大肠杆菌将葡萄糖转化为乙酰辅酶A。本研究中用于通过3-甲基巴豆酸将乙酰辅酶A转化成异丁烯的酶(图42)总结在表J中。
表J
在大肠杆菌中异丁烯生物合成途径的表达
除了从大肠杆菌MG1655的基因组DNA直接扩增的编码UbiX蛋白质的基因外，所有相应的基因都针对大肠杆菌中的表达进行了密码子优化，并由(LifeTechnologies)合成。含有修饰的多克隆位点(pUC18MCS)(WO 2013/007786)的修饰版本的pUC18(New England Biolabs)用于ubiX基因的过表达。该质粒赋予重组菌株氨苄青霉素抗性。构建的载体命名为pGB 5796，相应的核苷酸序列见表K。
表K
使用含有复制起点的表达载体pSC来表达基因：thlA,MvaS,ppKF707_3831,MXAN_4264/MXAN_4265,FDC1。该质粒赋予重组菌株壮观霉素抗性。构建载体命名为pGB 5771，相应的核苷酸序列见表L。
表L
这些重组pGBE 5771和pGBE5796质粒通过测序验证。
使MG1655大肠杆菌菌株具有电感受态，并用pGBE5771和pGBE5796转化或用相应的空载体(pUC18 MCS和pGB2021)转化以产生阴性对照。由此产生的菌株概述于表M中。
表M
然后将转化的细胞涂布在提供氨苄青霉素(100μg/ml)和壮观霉素(100μg/ml)的LB平板上。平板在30℃温育过夜。使用分离的菌落接种补充有氨苄青霉素，壮观霉素和0.5mM黄素单核苷酸的1.4ml ZYM-5052自诱导培养基(Studier FW,Prot.Exp.Pur.41,(2005),207-234)。这些培养物在30℃和96孔深孔微量培养板中700rpm摇动培养16小时。然后离心培养物并将沉淀重悬于含有葡萄糖(45g/L)和MgSO4(1mM)的0.4ml MS培养基(Richaud C.,Mengin-Leucreulx D.,Pochet S.,Johnson EJ.,Cohen GN.and MarlièreP,The Journal of Biological Chemistry,268,(1993),26827-26835)。将培养物在96孔深孔密封微量培养板中30℃，700rpm摇动下进一步温育24小时。通过在80℃温育微量培养板温育5分钟来终止异丁烯的生产并且通过配备有火焰离子化检测器(FID)的气相色谱(GC)分析反应顶空中形成的异丁烯。在装有火焰离子化检测器(FID)的Brucker GC-450系统中注射来自每种酶反应的100μL顶空气体。存在于样品中的化合物通过色谱法使用GS-氧化铝柱(30m×0.53mm)(Agilent)在130℃下使用等温模式分离。使用氮气作为载气，流速为6毫升/分钟。注射后，计算异丁烯的峰面积；表N。
表N

Claims (36)

1.一种生产异丁烯的方法，其包括将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯，
其中所述方法进一步包括
(a)通过将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供3-甲基巴豆酸，或
(b)通过将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供3-甲基巴豆酸。
2.权利要求1的方法，其中通过使用3-甲基巴豆酸脱羧酶实现3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化。
3.权利要求2的方法，其中所述3-甲基巴豆酸脱羧酶是：
(i)与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶；或
(ii)乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)；或
(iii)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或
(iv)香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)；或
(v)原儿茶酸(PCA)脱羧酶(EC 4.1.1.63)。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中3-甲基巴豆酰辅酶A到3-甲基巴豆酸的酶促转化通过如下实现
(a)单个酶促反应，其中通过利用辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)，优选丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)，乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)或琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.18)将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化成3-甲基巴豆酸；
(b)单个酶促反应，其中通过利用硫酯水解酶(EC 3.1.2.-)，优选乙酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.1)，依赖于ADP的短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)或酰基辅酶A水解酶(EC3.1.2.20)将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化为3-甲基巴豆酸；或
(c)两个酶促步骤，其包含
(i)首先将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酰磷酸；和
(ii)然后将由此获得的3-甲基巴豆酰磷酸酶促转化成所述3-甲基巴豆酸。
5.权利要求4(c)所述的方法，其中通过利用磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC2.3.1.8)实现所述3-甲基巴豆酰辅酶A到3-甲基巴豆酰磷酸的酶促转化，并且通过利用用羧基作为受体的磷酸转移酶(EC2.7.2.-)，优选丙酸激酶(EC2.7.2.15)，乙酸激酶(EC 2.7.2.1)，丁酸激酶(EC 2.7.2.7)或支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)实现所述3-甲基巴豆酰磷酸向所述3-甲基巴豆酸的酶促转化。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，所述方法还包括通过将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A来提供所述3-甲基巴豆酰辅酶A。
7.权利要求6所述的方法，其中3-甲基戊烯二酰辅酶A到3-甲基巴豆酰辅酶A的酶促转化通过利用以下酶实现：
(i)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)；或
(ii)香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法还包括通过将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A来提供所述3-甲基戊烯二酰辅酶A。
9.权利要求8的方法，其中通过利用3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)，3-羟酰基辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.-)或烯酰辅酶A水合酶(EC4.2.1.-)实现3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法还包括通过乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A来提供3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A。
11.权利要求10的方法，其中通过使用3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶实现乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A。
12.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过利用水解酶(EC4.2.-.-)实现3-羟基异戊酸(HIV)向3-甲基巴豆酸的酶促转化。
13.权利要求1至3和12中任一项所述的方法，所述方法还包括通过丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合为3-羟基异戊酸(HIV)来提供3-羟基异戊酸(HIV)。
14.权利要求13所述的方法，其中通过利用能够催化在丙酮的氧代(即C＝O)基团的碳原子和提供活化乙酰基的化合物的甲基之间形成共价键的酶实现丙酮和乙酰辅酶A到3-羟基异戊酸(HIV)的酶促缩合。
15.权利要求1至3和12至14中任一项所述的方法，还包括通过将乙酰乙酸酶促转化为丙酮来提供所述丙酮。
16.权利要求15的方法，其中通过使用乙酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.4)实现乙酰乙酸向丙酮的酶促转化。
17.权利要求1至3和12至16中任一项所述的方法，还包括通过将乙酰乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酸来提供乙酰乙酸。
18.权利要求17的方法，其中乙酰乙酰辅酶A到乙酰乙酸的酶促转化通过利用以下酶实现：
(i)乙酰乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.11)；或
(ii)能够转移乙酰乙酰辅酶A的CoA基团到乙酸上的酶。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，所述方法还包括通过将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A来提供所述乙酰乙酰辅酶A，所述方法包括：
(a)两个酶促步骤，其包含
(i)首先将乙酰辅酶A酶促转化成丙二酰辅酶A；和
(ii)然后将由此获得的丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成所述乙酰乙酰辅酶A；或
(b)单个酶促反应，其中两分子乙酰辅酶A直接缩合成乙酰乙酰辅酶A。
20.根据权利要求19(a)(i)的方法，其中通过利用乙酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.2)实现乙酰辅酶A到丙二酰辅酶A的酶促转化。
21.权利要求19(a)(ii)的方法，其中通过利用乙酰乙酰辅酶A合酶(EC2.3.1.194)实现到丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A到所述乙酰乙酰辅酶A的酶促缩合。
22.权利要求19(b)的方法，其中通过利用乙酰辅酶A C-乙酰转移酶(EC2.3.1.9)实现两分子乙酰辅酶A直接酶促缩合成乙酰乙酰辅酶A。
23.重组生物或微生物，其表达
(i)如权利要求1至3中任一项所定义的酶；和
(ii)权利要求1(a)，4或5中任一项所定义的酶。
24.权利要求23的重组生物或微生物，其进一步表达权利要求6或7中定义的酶。
25.权利要求24的重组生物或微生物，其进一步表达权利要求8或9中定义的酶。
26.权利要求25的重组生物或微生物，其进一步表达如权利要求10或11所定义的酶。
27.重组生物或微生物，其表达
(i)如权利要求1至3中任一项所定义的酶；和
(ii)权利要求1(b)或12中定义的酶。
28.权利要求27的重组生物或微生物，其进一步表达权利要求13或14中定义的酶。
29.权利要求28的重组生物或微生物，其进一步表达权利要求15或16中定义的酶。
30.权利要求29的重组生物或微生物，其进一步表达权利要求17或18中定义的酶。
31.权利要求26或30的重组生物或微生物，其进一步表达权利要求19中定义的酶。
32.权利要求31所述的重组生物或微生物，其进一步表达权利要求20至22中任一项所定义的酶。
33.权利要求23至32中任一项所定义的重组生物或微生物用于生产异丁烯的用途。
34.权利要求33的重组生物或微生物的用途，其中所述重组生物或微生物表达催化3-甲基巴豆酸向异丁烯的酶促转化的酶。
35.催化3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯的酶的用途，用于由3-甲基巴豆酸生产异丁烯。
36.组合物，其包含3-甲基巴豆酸和权利要求23至32中任一项所定义的重组生物或微生物；或3-甲基巴豆酸和权利要求1至22中任一项所定义的酶。
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