KR102043381B1 - 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올 및 관련 알코올을 생합성하기 위한 미생물과 방법 - Google Patents

2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올 및 관련 알코올을 생합성하기 위한 미생물과 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 부타디엔 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체를 제공한다. 또한, 본 발명은, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하기 위한 조건과 충분한 기간 동안 본원에 기술된 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 포함하는 비-천연성 미생물을 배양함으로써, 상기한 미생물 유기체를 이용한 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 제조 방법을 제공한다.

Description

2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올 및 관련 알코올을 생합성하기 위한 미생물과 방법 {MICROORGANISMS AND METHODS FOR PRODUCING 2,4-PENTADIENOATE, BUTADIENE, PROPYLENE, 1,3-BUTANEDIOL AND RELATED ALCOHOLS}
본 출원은 2012년 5월 10일자 미국 가출원 번호 61/645,509, 2011년 9월 15일자 미국 가출원 번호 61/535,264, 2011년 9월 2일자 미국 가출원 번호 61/530,885 및 2011년 8월 19일자 미국 가출원 번호 61/525,659에 대한 우선권을 주장하며, 이들 문헌은 각각의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 일반적으로 생합성 공정에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합력을 가진 유기체에 관한 것이다.
부타디엔 (1,3-부타디엔, BD)이 연간 250억 파운드 이상으로 생산되며, 합성 고무 및 ABS 수지 등의 폴리머와 헥사메틸렌디아민 및 1,4-부탄디올 등의 화합물의 제조에 활용되고 있다. 부타디엔은 전형적으로 나프타와 같은 석유 공급원료, 액화된 석유 가스, 에탄 또는 천연 가스를 에틸렌 및 기타 올레핀으로 변환하는 증기 분해 반응(steam cracking)의 부산물로 생성된다. 대체 공급원료 및/또는 재생 원료로부터 부타디엔을 제조하는 역량은 보다 지속가능한 화학적 생산 공정을 탐색하는데 크게 유용할 것이다.
부타디엔을 재생가능한 방식으로 생산할 수 있는 가능성있는 한가지 방법은, 당 또는 기타 공급원료를 발효시켜 1,4-부탄디올 또는 1,3-부탄디올 등의 디디계 화합물을 생산한 다음, 이를 분리 및 정제한 후, 금속계 촉매를 사용하는 2차 단계에서 탈수 반응을 수행하여 부타디엔을 제조하는 공정을 포함한다. 재생 원료로부터 부타디엔을 직접 발효에 의해 생산하는 방법은 탈수 단계가 필요없을 것이며, 부타디엔 가스 (bp -4.4℃)가 발효기에서 계속적으로 방출되어 이를 용이하게 응결시켜 수집할 수 있을 것이다. 발효 생산 공정의 개발로 화석 원료로부터 부타디엔을 제조할 필요가 없어지며, 석유화학적으로 제조되는 부타디엔에 비해 비용, 에너지 및 유해 폐기물과 배기물을 상당히 절감할 수 있을 것이다.
2,4-펜타디에노에이트는 그 자체로도 유용한 치환된 부타디엔 유도체이며, 예를들면, 쿠르티우스 (curtius) 전위 반응을 통해 입수가능한 1-카르바모일-1,3-부타디엔 등의 다른 치환된 1,3-부타디엔 유도체를 제조하는 경로의 중요한 중간산물이다. 제조되는 N-보호된-1,3-부타디엔 유도체는 치환된 아닐린을 제조하기 위해 딜스 알더 (Doels alder) 반응에 이용할 수 있다. 2,4-펜타디에노에이트는 다양한 폴리머들과 코폴리머의 제조에 사용될 수 있다.
1,3-부탄디올 (1,3-BDO)은 전통적으로 아세틸렌으로부터 수화 반응을 통해 제조되는 4 탄소 디올이다. 제조된 아세트알데하이드를 3-하이드록시부티르알데하이드로 변환시킨 후, 환원하여 1,3-BDO를 제조한다. 최근 몇년간, 아세트알데하이드의 원료가 아세틸렌에서 보다 저렴한 에틸렌으로 대체되고 있다. 1,3-BDO는 식품 향미제의 유기 용매로 통상 사용된다. 또한, 이것은 폴리우레탄과 폴리에스테르 수지에 대한 공-단량체로서 사용되며, 저혈당 제제로서 널리 사용되고 있다. 광학적으로 활성이 있는 1,3-BDO는 생물학적 활성 화합물과 액정 합성에 이용가능한 출발 물질이다. 상업적으로는 1,3-부탄디올은 탈수 반응을 통해 합성 고무(예, 타이어), 라텍스 및 수지 제조에 사용되는 1,3-부타디엔을 250 억 lb/yr 석유화학제품으로 공급한다 (Ichikawa et al., J. of Molecular Catalysis A-Chemical, 256:106-112 (2006); Ichikawa et al., J. of Molecular Catalysis A-Chemical, 231:181-189 (2005)). 아세틸렌 또는 에틸렌의 석유계 원료에 대한 의존성은 재생 원료 기반의 1,3-부탄디올 및 부타디엔 제조 경로의 개발을 보장한다.
3-부텐-1-올은 약제, 농화학제, 향료 및 수지에 사용되는 원료이다. 팔라듐 촉매에 의한 3-부텐-1-올과 아릴 할라이드의 커플링은, 예를 들어, 항엽산 화합물인 페메트렉시드 디소듐과 같은 아릴-치환된 알데하이드계 화합물을 제조하는데 있어 중요한 공정이다 (R. C. Larock et al., Tetrahedron Letters, 30, 6629 (1989) 및 미국 특허 6,262,262). 3-부텐-1-올은 촉매의 존재 하에 고온 및 고압에서 프로필렌 및 포름알데하이드로부터 일반적으로 제조된다. 다른 예로, 이것은 3,4-에폭시-1-부텐으로부터 제조된다. 재생 원료로부터 3-부텐-1-올을 제조하는 것에 대해서는 아직까지 개시되지 않았다.
프로필렌은 석유 정제 공정과 탄화수소 원료의 증기 분해 반응에 의한 에틸렌 제조 공정의 부산물로서 주로 생성된다. 프로펜은 분해 반응과 기타 정제 공정으로부터 발생되는 탄화수소 혼합물을 분별 증류함으로써 분리된다. 전형적인 탄화수소 원료는 석유, 천연 가스와 같은 재생할 수 없는 화석 연료로부터 기원된 것이며, 그 수준은 훨씬 낮지만 석탄으로부터도 기원된다. 프로필렌은 연간 750억 파운드 이상 생산되고 있어, 에틸렌 다음으로 2번째로 가장 많이 생산되는 화석 유래 화합물이다. 프로필렌은 매우 다양한 폴리머, 폴리머 중간체 및 화합물들로 변환되는 기본 화합물이다. 화합물 및 폴리머 등급의 프로필렌 중에서 가장 보편적인 유도체는 폴리프로필렌, 아크릴산, 부탄올, 부탄디올, 아크릴로니트릴, 프로필렌 옥사이드, 이소프로판올 및 큐멘이다. 프로필렌 유도체인 폴리프로필렌이 사출 성형과 같은 플라스틱 및 카페트와 같은 섬유의 제조에 사용되는 비중은 미국에서의 이들 유도체 소비량의 1/3을 웃돈다. 또한, 프로필렌은 합성 고무와 에어로졸의 추진체 또는 성분의 제조에도 사용되고 있다.
대체 및/또는 재생 원료로부터 프로필렌을 제조하는 역량은 보다 지속가능한 화학적 생산 공정을 탐색하는데 큰 이점이 될 것이다. 프로필렌을 재생가능한 방식으로 생산할 수 있는 가능한 방법은 당 또는 기타 원료를 발효시켜, 알코올 2-프로판올 (이소프로판올) 또는 1-프로판올을 제조하고, 이를 분리, 정제한 다음 금속계 촉매를 사용하는 2차 단계에서 프로필렌으로 탈수시키는 것이다. 재생 원료로부터 직접 발효를 통해 프로필렌을 제조하는 방법은 탈수 공정이 필요 없을 것이다. 발효 생산 공정에서, 프로필렌 가스를 계속적으로 발효기에서 배출시켜, 용이하게 수집 및 응결시킬 수 있다. 또한, 발효 생산 공정의 개발로 프로필렌을 석유화학공정으로 제조할 필요가 없게 될 것이며, 석유화학적으로 제조되는 프로필렌에 비해 비용, 에너지 및 유해 폐기물과 배기물을 상당히 절감할 수 있을 것이다.
크로틸 알코올은 2-부텐-1올로도 지칭되는 것으로서, 중요한 화학 중간산물이다. 이 화합물은, 단량체, 정제 화학제, 농화학제 및 약제를 제조하는 화학 중간체인, 크로틸 할라이드, 에스테르 및 에테르의 전구체로 사용된다. 정제 화학 제품의 예로는 소르브산, 트리메틸하이드로퀴논, 크로톤산 및 3-메톡시부탄올이 있다. 크로틸 알코올 역시 1,3-부타디엔의 전구체이다. 크로틸 알코올의 제조에는 현재 석유 원료만 사용되고 있다. 예를 들어, 일본 특허 47-013009 및 미국 특허들 제 3,090,815호, 제 3,090,816호 및 제 3,542,883호에 1,2-에폭시부탄의 이성화에 의한 크로틸 알코올 생산 방법이 개시되어 있다. 대체 및/또는 재생 원료로부터 크로틸 알코올을 제조하는 방법은 보다 지속적인 화학 제조 공정을 탐구하는데 중대한 진전이 될 것이다.
이에, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올과 같은 화합물을 상업적인 양으로 효율적으로 생산하는 대안적인 방법들이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고, 관련된 이점들을 아울러 제공한다.
본 발명은, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 부타디엔 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 포함하는 비-천연성 미생물 유기체를 제공한다. 본 발명은, 또한, 본원에 기술된 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 포함하는 비-천연성 미생물 유기체를 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하기 위한 조건 하에 충분한 시간 동안 배양함으로써, 상기한 미생물 유기체를 이용한 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 제조 방법을 제공한다.
도 1은 2-옥소아디페이트, 2-아미노아디페이트, 5-아미노펜타노에이트 및 글루타릴-CoA로부터 3-부텐-1-올, 2,4-펜타디에노에이트 및 부타디엔을 제조하는 경로의 예를 도시한 것이다. 효소들은 다음과 같다: A. 2-아미노아디페이트 데카르복실라제, B. 5-아미노펜타노에이트 리덕타제, C. 5-아미노펜트-2-에노에이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제, D. 2-옥소아디페이트 데카르복실라제, E. 글루타레이트 세미알데하이드 리덕타제, F. 5-하이드록시발레레이트 데하이드로게나제, G. 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 데하이드라타제, H. 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제, I. 5-아미노펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제, J. 5-아미노펜트-2-에노에이트 데아미나제, K. 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 리덕타제, L. 5-하이드록시발레릴-CoA 트랜스퍼라제 및/또는 신테타제, M. 5-하이드록시펜타노일-CoA 데하이드로게나제, N. 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 데하이드라타제, O. 2,4-펜타디에노일-CoA 트랜스퍼라제, 신테타제 또는 하이드롤라제, P. 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 트랜스퍼라제 또는 신테타제, Q. 5-하이드록시발레릴-CoA 데하이드라타제/데하이드로게나제, R. 2-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 2-옥소아디페이트:페리독신 옥시도리덕타제 또는 2-옥소아디페이트 포르메이트 리아제, S. 글루타릴-CoA 리덕타제, T. 2,4-펜타디에노에이트 데카르복실라제, U. 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 데카르복실라제, V. 3-부텐-1-올 데하이드라타제 또는 화학적 변환, W. 5-하이드록시발레레이트 데카르복실라제.
도 2는 아세틸-CoA에서 2,4-펜타디에노에이트 전구체 글루타릴-CoA를 제조하는 예시적인 탄소-활용 경로를 도시한 것이다. 효소는 다음과 같다: A. 아세토아세틸-CoA 티올라제 또는 신타제, B. 아세토아세틸-CoA 리덕타제, C. 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제, D. 글루타릴-CoA 데하이드로게나제.
도 3는 프로피오닐-CoA를 2,4-펜타디에노에이트로 변환하는 경로의 예를 도시한 것이다. 효소는 다음과 같다: A. 3-옥소펜타노일-CoA 티올라제 또는 신타제, B. 3-옥소펜타노일-CoA 리덕타제, C. 3-하이드록시펜타노일-CoA 데하이드라타제, D. 펜트-2-에노일-CoA 이소머라제, E. 펜트-3-에노일-CoA 데하이드로게나제, F. 2,4-펜타디에노일-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제, G. 펜트-2-에노일-CoA 데하이드로게나제.
도 4는 3-하이드록시프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA로부터 1,3-부탄디올을 제조하는 경로의 예를 도시한 것이다. 효소는 다음과 같다: A. 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 티올라제 또는 신타제, B. 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제, C. 3-옥소-5-하이드록시펜타노에이트 데카르복실라제 및 D. 3-옥소부탄올 리덕타제.
도 5는 피루베이트 및 아세트알데하이드로부터 1,3-부탄디올 (13-BDO), 3-부텐-1-올 및 부타디엔을 제조하는 경로의 예를 도시한 것이다. 효소는 다음과 같다: A. 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 알돌라제, B. 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 데하이드라타제, C. 2-옥소펜테노에이트 데카르복실라제, D. 3-부텐-1-알 리덕타제, E. 3-부텐-1-올 데하이드라타제, F. 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 데카르복실라제, G. 3-하이드록시부타날 리덕타제, H. 4-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시-2-옥소펜타노에이트:페레독신 옥시도리덕타제 또는 4-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 포르메이트 리아제, I. 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성), J. 3-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제, K. 3-하이드록시부티레이트 리덕타제, L. 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알코올 형성). 공정 E는 화학적 탈수를 통해 촉매될 수도 있다.
도 6는 2,4-펜타디에노에이트 및 2,4-펜타디에노일-CoA로부터 부타디엔을 제조하는 경로의 예를 도시한 것이다. 효소는 다음과 같다: A. 2,4-펜타디에노에이트 리덕타제 (산 환원), B. 펜타-2,4-디에날데카르보닐라제, C. 2,4-펜타디에노일-CoA 리덕타제 (산 환원), D. 2,4-펜타디에노일-Co포스포트랜스퍼라제, E. 2,4-펜타디에노일-포스페이트 리덕타제, F. 2,4-펜타디에노일-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제, G. 2,4-펜타디에노에이트 데카르복실라제, H. 2,4-펜타디에노에이트 키나제.
도 7은 말로닐-ACP로부터 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 및 프로필렌를 제조하는 경로의 예를 도시한 것이다. 효소는 다음과 같다: A. 3-케토아실-ACP 신타제, B. 아세토아세틸-ACP 리덕타제, C. 3-하이드록시부티릴-ACP 데하이드라타제, D. 아세토아세틸-CoA:ACP 트랜스퍼라제, E. 아세토아세틸-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제, F. 아세토아세테이트 리덕타제 (산 환원), G. 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제 (알데하이드 환원), H. 아세토아세틸-ACP 티오에스테라제, I. 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (CoA-의존성, 알데하이드 형성), J. 아세토아세틸-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성), K. 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (알코올 형성), L. 3-하이드록시부티릴-ACP 티오에스테라제, M. 3-하이드록시부티릴-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성), N. 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성), O. 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알코올 형성), P. 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (케톤 환원), Q. 아세토아세테이트 리덕타제 (케톤 환원), R. 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제 (케톤 환원), S. 4-하이드록시-2-부타논 리덕타제, T. 크로토닐-ACP 티오에스테라제, U. 크로토닐-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성), V. 크로토닐-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성), W. 크로토닐-CoA (알코올 형성), X. 3-하이드록시부티릴-CoA:ACP 트랜스퍼라제, Y. 3-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제, Z. 3-하이드록시부티레이트 리덕타제, AA. 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제, AB. 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제, AC. 3-하이드록시부티레이트 데하이드라타제, AD. 3-하이드록시부티르알데하이드 데하이드라타제, AE. 크로토닐-CoA:ACP 트랜스퍼라제, AF. 크로토닐-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제, AG. 크로토네이트 리덕타제, AH. 크로톤알데하이드 리덕타제, AI. 부트릴-CoA:ACP 트랜스퍼라제, AJ. 부티릴-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 신테타제, AK. 부티레이트 데카르복실라제, AL. 크로토닐-ACP 리덕타제, AM. 크로토닐-CoA 리덕타제, AN. 크로토네이트 리덕타제, AO. 크로톤알데하이드 데카르보닐라제, AP. 부티릴-ACP 티오에스테라제, AQ. 크로토네이트 데카르복실라제, AR. 3-하이드록시부티레이트 데카르복실라제, AS. 아세토아세틸-CoA 신타제. ACP는 아실 캐리어 단백질이다.
도 8은 기질로서 탄수화물에 CO2를 고정하기 위한 리버스(reverse) TCA 사이클을 도시한다. 효소적 변환은 표시된 효소들로 수행한다.
도 9는 합성가스 (syngas)를 아세틸-CoA로 변환하기 위한, 일산화탄소 데하이드로게나제 및 하이드로게나제와 커플링된 리버스 TCA 사이클 경로를 나타낸 것이다.
도 10은 ACS90 (1번 레인), ACS91 (2번 레인), Mta98/99 (3번 레인 및 4번 레인) 세포 추출물 10 ㎍과, 크기 표준 물질 (5번 레인) 및 대조군 무렐라 서모아세티카 (M. thermoacetica) CODH (Moth_1202/1203) 또는 Mtr (Moth_1197) 단백질 (50, 150, 250, 350, 450, 500, 750, 900 및 1000 ng)에 대한 웨스턴 블롯이다.
도 11은 CO 산화 분석 결과를 나타낸 것이다. 세포 (CODH/ACS 오페론을 가진 무렐라 서모아세티카 또는 E. coli; ACS90 또는 ACS91 또는 빈 벡터: pZA33S)를 배양하여 추출물을 준비하였다. 추출물을 준비한 당일 여러 시간대에 55℃에서 분석을 수행하였다. 메틸비올로겐의 환원을 120초 동안 578 nm에서 추적하였다.
도 12는 크로틸 알코올을 부타디엔으로 변환하는 경로를 나타낸 것이다. 효소는 다음과 같다: A. 크로틸 알코올 키나제, B. 2-부테닐-4-포스페이트 키나제, C. 부타디엔 신타제, 및 D. 크로틸 알코올 디포스포키나제. 공정 E는 비-효소적으로 촉매화된다.
본 발명은 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 능력을 가진 세포 및 유기체의 설계와 제조에 관한 것이다. 본 발명은, 특히, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 도입함으로써, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산할 수 있는 미생물 유기체의 설계에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생합성하기 위한 대사적 설계를 확인하는 에스케리키아 콜라이(E. coli) 대사의 인 실리코(in silico) 화학량론적 모델을 이용한다. 본원에 기술된 결과들은, 대사 경로가 에스케리키아 콜라이 및 기타 세포 또는 유기체에서 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 생합성이 달성되도록 설계 및 재조합적으로 조작할 수 있음을 보여준다. 예컨대, 인 실리코 설계에서, 생합성에 의한 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생산은, 설계된 대사관련 유전자형을 가지는 균주를 구축함으로써, 검증할 수 있다. 또한, 대사적으로 조작된 세포 또는 유기체는, 이론적 최대 성장을 달성하는 조건 등의, 부타디엔 생합성을 더욱 증대시키기 위한 적응 진화(adaptive evolution)를 거칠 수 있다.
특정 구현예에서, 설계된 균주의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 특징들은 균주를 유전학적으로 안정하게 만들며, 특히 계속적인 생물학적 제조에 유용하다. 각각의 균주 설계 전략들은, 에스케리키아 콜라이 또는 다른 숙주 유기체에 여러가지 비-천연 또는 이종적인 반응 능력을 병합하여, 2-아미노아디페이트, 5-아미노펜타노에이트, 2-옥소아디페이트, 글루타릴-CoA, 아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 3-하이드록시프로피오닐-CoA 또는 피루베이트로부터 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하는 대사 경로를 구축하여, 동정되었다. 미생물에서 이들 기질 또는 대사 중간체 각각으로부터 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생합성하는 인 실리코 대사 설계가 확인되었다.
플랫폼의 전산 컴포넌트(computational component)를 통해 동정된 균주들은 예상되는 대사적 변이들 중 임의의 변이를 유전학적으로 조작함으로써 실제 생산에 투입시킬 수 있으며, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 기타 중간체 및/또는 하위 산물의 생합성 생산을 유도할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이들 화합물들을 생합성하는 균주는, 추가적으로 산물의 생합성을 증대시키기 위해 적응 진화를 추가로 수행할 수 있다. 또한, 적응 진화를 거친 후 산물의 생합성 수율 수준은 시스템의 전산 컴포넌트를 통해 예측할 수 있다.
글루코스로부터 2,4-펜타디에노에이트를 생산하는 이론적인 최대 수율은 1.09 mol/mol (0.59 g/g)이다:
11 C6H12O6 = 12 C5H6O2 + 6 CO2 + 30 H2O
도 1에 나타낸 경로에서는, 이용되는 글루코스 1 몰 당 2,4-펜타디에노에이트 0.85 몰의 수율이 달성된다. 세포가 환원성 (또는 역) TCA 사이클 또는 Wood-Ljungdahl 경로 등의 경로를 통해 CO2를 고정할 수 있다면, 산물의 수율 증가가 가능하다. 또한, 도 1에 도시된 경로를 가지도록 조작된 유기체는 2,4-펜타디에노에이트의 거의 이론적 최대치에 도달할 수 있다.
글루코스로부터 부타디엔을 생산하는 이론적인 최대 수율은 1.09 mol/mol (0.327g/g)이다.
11 C6H12O6 = 12 C4H6 + 18 CO2 + 30 H2O
도 1에 나타낸 경로에서는, 이용되는 글루코스 1 몰 당 부타디엔 0.85 몰의 수율이 달성된다. 세포가 환원성 (또는 역) TCA 사이클 또는 Wood-Ljungdahl 경로 등의 경로를 통해 CO2를 고정할 수 있다면, 산물의 수율이 거의 이론적 최대치로의 증가가 가능하다. 또한, 도 5, 6 또는 1에 도시된 경로를 도 12에 도시된 경로와 조합하여 가지도록 조작된 유기체는 부타디엔의 거의 이론적 최대치에 도달할 수 있다.
글루코스로부터 1,3-부탄디올을 생산하는 이론적인 최대 수율은 1.09 mol/mol (0.54 g/g)이다.
11 C6H12O6 = 12 C4H10O2 + 18 CO2 + 6 H2O
도 5에 나타낸 경로에서는, 이용되는 글루코스 1 몰 당 1,3-부탄디올 1 몰의 수율이 달성된다. 세포가 환원성 (또는 역) TCA 사이클 또는 Wood-Ljungdahl 경로 등의 경로를 통해 CO2를 고정할 수 있다면, 산물의 수율이 거의 이론적 최대치로의 증가가 가능하다. 또한, 도 7에 도시된 경로를 가지도록 조작된 유기체는 1,3-부탄디올의 거의 이론적 최대치에 도달할 수 있다.
글루코스로부터 3-부텐-1-올을 생산하는 이론적인 최대 수율은 1.09 mol/mol (0.437 g/g)이다.
11 C6H12O6 = 12 C4H8O + 18 CO2 + 18 H2O
도 1에 나타낸 경로에서는, 이용되는 글루코스 1 몰 당 3-부텐-1-올 0.85 몰의 수율이 달성된다. 세포가 환원성 (또는 역) TCA 사이클 또는 Wood-Ljungdahl 경로 등의 경로를 통해 CO2를 고정할 수 있다면, 산물의 수율이 거의 이론적 최대치로의 증가가 가능하다. 또한, 도 5에 도시된 경로를 가지도록 조작된 유기체는 부타디엔의 거의 이론적 최대치에 도달할 수 있다.
글루코스로부터 크로틸 알코올을 생산하는 이론적인 최대 수율은 1.09 mol/mol (0.436 g/g)이다.
11 C6H12O6 = 12 C4H8O + 18 CO2 + 18 H2O
도 7에 나타낸 경로에서는, 이용되는 글루코스 1 몰 당 크로틸 알코올 1.08 몰의 수율이 달성된다. 세포가 환원성 (또는 역) TCA 사이클 또는 Wood-Ljungdahl 경로 등의 경로를 통해 CO2를 고정할 수 있다면, 산물의 수율이 거의 이론적 최대치로의 증가가 가능하다.
글루코스로부터 프로필렌을 생산하는 이론적인 최대 수율은 1.33 mol/mol (0.31 g/g)이다.
3 C6H12O6 = 4 C4H8O + 6 CO2 + 6 H2O
도 7에 나타낸 경로에서는, 이용되는 글루코스 1 몰 당 프로필렌 1.2 몰의 수율이 달성된다. 세포가 환원성 (또는 역) TCA 사이클 또는 Wood-Ljungdahl 경로 등의 경로를 통해 CO2를 고정할 수 있다면, 산물의 수율이 거의 이론적 최대치로의 증가가 가능하다.
본원에서, 용어 "비천연(non-naturally occurring)"은, 본 발명의 미생물 유기체 또는 미생물에 대해 사용되는 경우, 언급된 종의 야생형 균주를 비롯하여, 언급된 종의 천연 균주에서는 정상적으로는 발견되지 않는 하나 이상의 유전자 변형을 포함한다는 의미이다. 유전자 변형은, 예를 들어, 대사 폴리펩타이드를 코딩하는 발현 가능한 핵산의 도입, 다른 핵산의 부가, 핵산의 결손 및/또는 미생물 유기체의 유전 물질의 기타 기능적 파괴를 포함한다. 이러한 변형은, 예컨대, 언급된 종에 대해 이종, 상동, 또는 이종 및 상동의 폴리펩타이드에 대한 코딩 영역 및 이의 기능성 단편을 포함한다. 다른 변형으로는, 예컨대 상기 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변형시키는 비-코딩 조절 영역을 포함한다. 예시적인 대사 폴리펩타이드는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로의 효소 또는 단백질을 포함한다.
대사 변형은 이의 본래의 상태에서 변형된 생화학적 반응을 지칭한다. 따라서, 비-천연성 미생물은 대사 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편을 코딩하는 핵산에 대한 유전자 변형을 포함할 수 있다. 대사 변형의 예는 본원에 기술되어 있다.
본원에서, 용어 "분리된"은 미생물 유기체에 대해 사용되는 경우, 이는 언급된 미생물 유기체가 자연 상태에서 발견될 때의 성분들 중 하나 이상이 실질적으로 결여된 유기체를 의미한다. 이 용어는 자연 환경에서 발견될 때의 성분들 일부 또는 전체가 제거된 미생물 유기체를 포함한다. 또한, 이 용어는 미생물 유기체가 비천연 환경에서 발견될 때의 성분들이 부분적으로 또는 전체가 제거된 미생물 유기체를 포함한다. 즉, 분리된 미생물 유기체는 유기체가 자연에서 발견되거나 또는 비천연 환경에서 증식, 보관 또는 유지될 때의 기타 성분들로부터 일부 또는 완전히 분리된다. 분리된 미생물 유기체의 구체적인 예로는 부분적으로 순수한 미생물, 실질적으로 순수한 미생물 및 비천연성 배지에서 배양된 미생물을 포함한다.
본원에서, 용어 "미생물(microbial)", "미생물 유기체" 또는 "미생물(microorganism)"은 고세균, 박테리아 또는 진핵생물류에 속하는 미시 세포로서 존재하는 모든 유기체를 의미한다. 즉, 이 용어는 미시적인 크기의 원핵 또는 진핵 세포 또는 유기체를 포괄하며, 모든 종의 박테리아, 고세균류 및 유박테리아(eubacteria) 뿐만 아니라 효모 및 진균과 같은 진핵 미생물을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 이 용어는 생화학적으로 생산하기 위해 배양할 수 있는 임의 종의 세포 배양물을 포함한다.
본원에서, 용어 "CoA" 또는 "코엔자임 A"는, 활성 효소 시스템을 만들기 위해 다수 효소(주효소(apoenzyme))의 활성에 필요한 유기 조인자 또는 보결기(효소의 비단백질 영역)를 의미한다. 코엔자임 A는 특정 축합 효소에 작용하며, 아세틸 또는 기타 아실기를 전달시키는 작용을 하며, 지방산 합성 및 산화, 피루베이트 산화 및 기타 아세틸화에 관여한다.
본원에서, 용어 "ACP" 또는 "아실 캐리어 단백질"은 박테리아에서 식물에 이르는 다수 유기체들의 지방산 신타제 시스템과 조합된 비교적 작은 임의의 산성 단백질을 지칭한다. ACP는 세린 잔기의 하이드록시기와 포스페이트 에스테르 결합함으로써 공유적으로 결합된 4'-포스포판테테인 보결기를 하나 포함할 수 있다. 4'-포스포판테테인 모이어티의 설프하이드릴 기는 지방산 합성시 아실 중간체가 (티오)에스테르화되는 앵커 (anchor)로서 이용된다. ACP의 예는 포스포판테테인기가 세린 36에 연결된 아미노산 잔기 77개 (8.85 kDa)를 포함하는 개별 단일 단백질인 Escherichia coli ACP이다.
본원에서, 용어 "부타디엔"은 분자식이 C4H6이고 분자량이 54.09 g/mol (도 1, 5, 6 및 12) (IUPAC 명칭 부타-1,3-디엔)로서, 1,3-부타디엔, 바이에틸렌, 에리트렌, 디비닐, 비닐에틸렌과 상호 호환적으로 사용된다. 부타디엔은 약학 아로마 또는 가솔린과 비슷한 냄새를 가진 무색의 비-부식성 액화 가스이다. 부타디엔은 낮은 인화점으로 인해 폭발성이고 가연성이다.
본원에서, 용어 "실질적으로 혐기성"은 배양 또는 생장 조건에 대해 사용되는 경우, 산소의 양이 액체 매질내 용해 산소 포화도 약 10% 미만임을 의미한다. 또한, 이 용어는 약 1% 미만의 산소 분위기로 유지되는 액체 또는 고체 배지가 들어있는 밀폐된 챔버를 포괄하는 의미이다.
본원에서 "외인성"은 언급된 분자 또는 활성이 숙주 미생물 유기체에 도입되는 것을 의미한다. 상기 분자는, 예컨대, 플라스미드와 같은 숙주 염색체 또는 비-염색체성 유전 물질내로의 삽입에 의해서와 같이, 코딩 핵산을 숙주 유전 물질에 도입함으로써, 도입될 수 있다. 따라서, 이 용어는, 코딩 핵산의 발현에 대해 사용되는 바와 같이, 발현가능한 형태로 코딩 핵산을 미생물 유기체에 도입하는 것을 의미한다. 생합성 활성에 대해 사용되는 경우, 이 용어는 숙주 참조 유기체에 도입되는 활성을 지칭한다. 그 소스는, 예컨대 숙주 미생물 유기체로 도입되어 언급된 활성을 발현하는 동종의 또는 이종의 코딩 핵산일 수 있다. 따라서, 용어 "내인성"은 숙주에 존재하는 언급된 분자 또는 활성에 대해 사용된다. 마찬가지로, 이 용어는, 코딩 핵산의 발현에 대해 사용되는 경우, 미생물 유기체에 함유된 코딩 핵산의 발현을 지칭한다. 용어 "이종"은 언급된 종 이외의 소스로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭하며, "동종"은 숙주 미생물 유기체로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭한다. 즉, 본 발명의 코딩 핵산의 외인성 발현시 이종 또는 동종의 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘다를 이용할 수 있다.
2종 이상의 외인성 핵산이 미생물 유기체에 포함되는 경우, 2종 이상의 외인성 핵산은 전술한 바와 같이 언급된 코딩 핵산 또는 생합성 활성을 지칭하는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 기술된 바와 같이, 이러한 2종 이상의 외인성 핵산은 숙주 미생물 유기체에 별개의 핵산 분자로, 폴리시스트론 핵산 분자로 또는 이의 조합으로 도입될 수 있으며, 여전히 2종 이상의 외인성 핵산으로서 간주될 수 있는 것으로 또한 이해된다. 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이, 미생물 유기체는 원하는 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 2종 이상의 외인성 핵산을 발현하도록 조작할 수 있다. 원하는 활성을 코딩하는 2개의 외인성 핵산이 숙주 미생물 유기체로 도입되는 경우, 상기 2개의 외인성 핵산은 단일 핵산으로서, 예컨대 단일 플라스미드 형태로 또는 분리된 플라스미드 형태로 도입될 수 있으며, 숙주 염색체에서 단일 부위 또는 복수의 부위에 통합될 수 있으며, 여전히 2개의 외인성 핵산으로 간주되는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 3개 이상의 외인성 핵산을, 숙주 유기체에 임의의 바람직한 조합으로, 예컨대 단일 플라스미드로, 각각의 개별 플라스미드로 도입할 수 있으며, 숙주 염색체에서 단일 위치 또는 복수 위치로 삽입할 수 있으며, 여전히 2종 이상의 외인성 핵산, 예컨대 3개의 외인성 핵산으로 간주되는 것으로 이해된다. 따라서, 언급되는 외인성 핵산 또는 생합성 활성의 수는 숙주 유기체로 도입되는 개별 핵산의 수를 지칭하는 것이 아니라, 코딩 핵산의 수 또는 생합성 활성의 수를 지칭한다.
본 발명의 비-천연성 미생물 유기체는 안정적인 유전자 변형을 포함할 수 있는데, 이는 상기한 변형을 유지하면서 5 세대 이상 배양할 수 있는 미생물을 지칭한다. 일반적으로, 안정적인 유전자 변형은 10 세대 이상 유지되는 변형을 포함하며, 특히 안정적인 변형은 약 25 세대 이상 유지될 것이며, 보다 구체적으로는 안정적인 유전자 변형은 무한정을 비롯하여 50 세대 이상 유지될 것이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 예시된 대사적 변이를 포함한 유전자 변형이, 에스케리키아 콜라이와 같은 적정 숙주 유기체와 이의 해당 대사 반응 또는 원하는 대사 경로에 관여하는 유전자 등의 바람직한 유전 물질에 대해 적합한 소스 유기체를 참조하여 기술됨을 알 것이다. 그러나, 매우 다양한 유기체의 전체 게놈 서열 분석과 게놈학 분야의 높은 기술 수준을 감안하면, 당해 기술 분야의 당업자는 본원에 기술된 내용 및 설명을 다른 모든 유기체들에도 적용할 수 있음을 쉽게 알 것이다. 예를 들어, 본원에 예시된 에스케리키아 콜라이의 대사 변형은 언급된 종이 아닌 다른 종 유래의 동일 또는 유사 코딩 핵산을 병합함으로써, 다른 종에도 쉽게 적용할 수 있다. 이러한 유전자 변형으로는, 예컨대 일반적으로 종 상동체들의 유전자 변형이 있으며, 구체적으로 오르소로그(ortholog), 파라로그(paralog) 또는 비-오르소로그형 유전자 치환(non-orthologous gene displacement)을 포함한다.
오르소로그는 수직 직계(vertical descent) 관계이며, 여러가지 유기체들에서 실질적으로 동일하거나 상동한 기능을 담당하는 유전자 또는 유전자들이다. 예를 들어, 마우스 에폭사이드 하이드롤라제와 인간 에폭사이드 하이드롤라제는 에폭사이드의 가수분해라는 생물학적 기능상 오르소로그로 간주할 수 있다. 유전자들은, 예컨대 유전자들이 상동적이거나 또는 공통 조상으로부터 진화적으로 관련있는 것으로 지칭되기에 충분한 서열 유사성을 공유하는 경우, 수직 직계 관계이다. 또한, 유전자는, 3차 구조를 공유하지만, 1차 서열 유사성이 확인불가한 수준으로 공통 조상으로부터 진화된 것임을 의미하는 충분한 수준의 서열 유사성을 반드시 가지고 있지 않은 경우에도, 오르소로그로 간주할 수 있다. 오르소로그인 유전자들은 아미노산 서열 동일성이 약 25% 내지 100%인 서열 유사성을 가진 단백질을 코딩할 수 있다. 25% 미만의 아미노산 유사성을 공유하는 단백질을 코딩하는 유전자들 역시, 이들의 3차원 구조에 유사성이 있다면, 수직 직계에 의해 생겨난 것으로 간주할 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성자 및 엘라스타제 등의 세린 프로테아제 유형의 효소의 구성원들은 공통 조상의 수직 직계에서 생겨난 것으로 간주된다.
오르소로그는, 예를 들어, 진화를 통해 구조적으로 또는 전체 활성 측면에서 분화된 유전자, 또는 이로 코딩되는 유전자 산물을 포함한다. 예를 들어, 어떤 종이 2가지 기능을 나타내는 유전자 산물을 코딩하고 있으며 이 기능들이 제2의 종에서는 별개의 유전자로 분리되어 있는 경우, 이들 3종의 유전자와 이의 대응 산물들은 오르소로그로 간주된다. 생화학적 산물의 제조시, 당해 기술 분야의 당업자들은, 비-천연성 미생물을 구축하기 위해, 도입 또는 파괴할 대사 활성을 가지고 있는 오르소로그형 유전자를 선택해야 함을 알 것이다. 분리가능한 활성을 나타내는 오르소로그의 예는, 개개 활성이 2종 이상의 종들에서 또는 하나의 종에서 개별 유전자 산물로 분리되어 있는 경우이다. 구체적인 예는, 세린 프로테아제의 2가지 활성인 엘라스타제 단백질 분해 활성과 플라스미노겐 단백질 분해 활성이, 플라스미노겐 활성자 및 엘라스타제로서 개별 분자로 분리되는 경우이다. 두 번째 예는, 마이코플라스마 5'-3' 엑소뉴클레아제와 드로소필라 DNA 폴리머라제 III 활성이 분리되는 경우이다. 상기 첫 번째 종 유래의 DNA 폴리머라제는, 2번째 종 유래의 엑소뉴클레아제 또는 폴리머라제 중 어느 하나 또는 이들 둘다에 대해 오르소로그인 것으로 간주할 수 있으며, 그 역도 성립된다.
이와는 반대로, 파라로그는 예를 들어 복제와 이후 진화적 분화 관계에 있는 상동체이며, 유사하거나 공통되지만, 기능이 동일하진 않은 것이다. 파라로그는, 예컨대, 동일 종 또는 다른 종으로부터 기원하거나 유래될 수 있다. 예를 들어, 마이크로솜 에폭사이드 하이드롤라제(에폭사이드 하이드롤라제 I)와 가용성 에폭사이드 하이드롤라제(에폭사이드 하이드롤라제 II)는, 이들이 별개의 반응을 촉매하고, 동일 종에서 다른 기능을 가지고 있는, 공통 조상으로부터 함께 진화된 2개 별개의 효소이기 때문에, 파라로그로 간주될 수 있다. 파라로그는 서로 유의한 서열 유사성을 보이는 동일한 종으로부터 유래된 단백질들이므로, 이들은 상동적이거나 또는 공통 조상으로부터 함께 진화된 관계임을 시사한다. 파라로그 패밀리 그룹으로는 HipA 상동체, 루시퍼라제 유전자, 펩티다제 등이 있다.
비-오르소로그 유전자 치환(nonorthologous gene displacement)은 다른 종에서 언급된 유전자의 기능을 치환할 수 있는 어떤 종 유래의 비-오르소로그 유전자이다. 치환은, 예를 들어 다른 종들에서 언급된 기능과 비교하여, 기원 종에서 실질적으로 동일하거나 유사한 작용을 수행할 수 있음을 포함한다. 일반적으로, 비-오르소로그 유전자 치환은 언급된 기능을 코딩하는 공지된 유전자와 구조적으로 관련있는 것으로 구분할 수 있지만, 구조적으로는 관련성이 낮지만 기능적으로는 유사한 유전자 및 이의 유전자 산물도 그럼에도 불구하고 여전히 본 발명에서 사용되는 용어의 의미에 포함될 것이다. 기능 유사성에는, 예를 들어 치환하고자 하는 기능을 코딩하는 유전자에 대해, 비-오르소로그 유전자 산물의 활성부 또는 결합부에서의 어느 정도 이상의 구조 유사성이 요구된다. 따라서, 비-오르소로그 유전자는 예를 들어 파라로그 또는 비관련 유전자를 포함한다.
따라서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 능력을 갖춘 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체를 동정하고 구축함에 있어, 당해 기술 분야의 당업자들은, 본 발명에 제공된 교시 및 지침을 특정 종들에 적용하여, 대사 변형 확인에 오르소로그의 동정 및 이의 함유 또는 불활성화가 포함될 수 있음을 인지할 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 또한, 파라로그 및/또는 비-오르소로그 유전자 치환이, 유사하거나 또는 실질적으로 유사한 대사 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 참조 미생물에 존재하는 한, 진화적으로 관련성 있는 유전자들을 사용할 수 있다.
오르소로그, 파라로그 및 비-오르소로그 유전자 치환은 당해 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 2개의 폴리펩타이드에 대해 핵산 또는 아미노산 서열을 검사하여, 상기 비교되는 서열들 간의 서열 동일성과 유사성을 확인한다. 이러한 유사성을 토대로, 당해 기술 분야의 당업자는 상기 유사성이 상기 단백질들이 공통 조상으로부터 진화된 관계임을 의미할 만큼 충분히 높은지를 결정할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자들에게 널리 공지된 알고리즘, 예컨대 Align, BLAST, Clustal W 등으로 원(raw) 서열의 유사성 또는 동일성을 비교 및 확인하며, 또한, 웨이트 또는 스코어를 할당할 수 있는 서열내 갭의 존재나 유의 수준을 정할 수 있다. 이러한 알고리즘들은 또한 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 뉴클레오타이드 서열 유사성 또는 동일성 결정에 마찬가지로 적용가능하다. 관계(relatedness)를 정할 만큼 충분한 유사성에 대한 매개변수들은, 널리 공지된 통계학적 유사성 계산법, 또는 랜덤 폴리펩타이드내에서 유사한 매칭을 발견할 확률, 그리고 확인된 매칭의 유의 수준을 근거로 산정된다. 2개 이상 서열들의 컴퓨터 비교는, 또한, 필요한 경우, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 가시적으로 최적화할 수 있다. 관련 유전자 산물 또는 단백질은 높은 유사성, 예를 들어 25% 내지 100%의 서열 동일성을 가지는 것으로 볼 수 있다. 비관련 단백질은, 충분한 크기의 데이터베이스 검색시 우연히 발생할 수 있는 수준과 기본적으로 동일한 동일성(약 5%)을 가질 수 있다. 5% 내지 24%의 서열이, 비교 서열들과 관련성 있다고 판단할 만큼 충분한 상동성을 보이거나 그렇지 않을 수 있다. 데이터 세트의 크기를 제시하는 이러한 매칭 유의 수준을 결정하기 위한 추가적인 통계학적 분석을 수행하여, 이들 서열들의 관련성을 결정할 수 있다.
BLAST 알고리즘을 이용하여 2종 이상의 서열의 관계를 측정하기 위한 매개변수의 예는, 다음과 같을 수 있다. 간략하게는, 아미노산 서열 정렬은 BLASTP 버전 2.0.8(1999년 1월 5일) 및 하기의 매개변수들을 사용하여 수행할 수 있다: 매트릭스: 0 BLOSUM62; 갭 오픈(gap open): 11; 갭 연장(gap extension): 1; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드크기: 3; 필터: 온(on). 핵산 서열 정렬은 BLASTN 버전 2.0.6(1998년 9월 16일) 및 하기의 매개변수들을 사용하여 수행할 수 있다: 매치: 1; 미스매치: -2; 갭 오픈: 5; 갭 연장: 2; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드크기: 11; 필터: 오프. 당해 기술 분야의 당업자는, 상기 매개변수들에 대해 예를 들어 상기 비교의 엄격성을 높이거나 낮추고, 2종 이상 서열의 관계를 정하기 위한 변형을 가할 수 있음을 알 것이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 2,4-펜타디에노에이트를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 2,4-펜타디에노에이트 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 2,4-펜타디에노에이트 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함하여, 비-천연성 미생물 유기체를 제공하며, 상기 경로는 (1) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K 및 1G; (2) 1D, 1E, 1F 및 1G; (3) 1D, 1E, 1L, 1M, 1P 및 1G; (4) 1D, 1I, 1B 및 1J; (5) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N 및 1O; (6) 1D, 1E, 1F, 1P, 1N 및 1O; (7) 1D, 1E, 1L, 1M, 1N 및 1O; (8) 1D, 1E, 1L, 1Q 및 1O; (9) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K 및 1G; (10) 1S, 1E, 1F 및 1G; (11) 1S, 1I, 1B 및 1J; (12) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N 및 1O; (13) 1S, 1E, 1F, 1P, 1N 및 1O; (14) 1S, 1E, 1L, 1M, 1N 및 1O; (15) 1S, 1E, 1L, 1Q 및 1O; (16) 1B, 1C, 1K 및 1G; (17) 1I, 1E, 1F 및 1G; (18) 1I, 1E, 1L, 1M, 1P 및 1G; (19) 1B 및 1J; (20) 1I, 1E, 1F, 1P, 1N 및 1O; (21) 1I, 1E, 1L, 1M, 1N 및 1O; (22) 1I, 1E, 1L, 1Q 및 1O; (23) 3A, 3B, 3C, 3D, 3E 및 3F; 및 (24) 3A, 3B, 3C, 3G 및 3F로부터 선택되는 도 1 및/또는 3에 도시된 경로를 포함하며, 여기서 1B는 5-아미노펜타노에이트 리덕타제이고, 1C는 5-아미노펜트-2-에노에이트 아미노트랜스퍼라제, 5-아미노펜트-2-에노에이트 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제이고, 1D는 2-옥소아디페이트 데카르복실라제이고, 1E는 글루타레이트 세미알데하이드 리덕타제이고, 1F는 5-하이드록시발레레이트 데하이드로게나제이고, 1G는 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 데하이드라타제이고, 1I는 5-아미노펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제, 5-아미노펜타노에이트 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제이고, 1J는 5-아미노펜트-2-에노에이트 데아미나제이고, 1K는 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 리덕타제이고, 1L은 5-하이드록시발레릴-CoA 트랜스퍼라제 또는 5-하이드록시발레릴-CoA 신테타제이고, 1M은 5-하이드록시펜타노일-CoA 데하이드로게나제이고, 1N은 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 데하이드라타제이고, 1O는 2,4-펜타디에노일-CoA 트랜스퍼라제, 2,4-펜타디에노일-CoA 신테타제 또는 2,4-펜타디에노일-CoA 하이드롤라제이고, 1P는 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 트랜스퍼라제 또는 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 신테타제이고, 1Q는 5-하이드록시발레릴-CoA 데하이드라타제/데하이드로게나제이고, 1S는 글루타릴-CoA 리덕타제이고, 3A는 3-옥소펜타노일-CoA 티올라제 또는 3-옥소펜타노일-CoA 신타제이고, 3B는 3-옥소펜타노일-CoA 리덕타제이고, 3C는 3-하이드록시펜타노일-CoA 데하이드라타제이고, 3D는 펜트-2-에노일-CoA 이소머라제이고, 3E는 펜트-3-에노일-CoA 데하이드로게나제이고, 3F는 2,4-펜타디에노일-CoA 하이드롤라제, 2,4-펜타디에노일-CoA 트랜스퍼라제 또는 2,4-펜타디에노일-CoA 신테타제이고, 3G는 펜트-2-에노일-CoA 데하이드로게나제이다.
본 발명의 일부 측면들에서, 미생물 유기체는 2,4-펜타디에노에이트 경로 효소를 각각 코딩하는 외인성 핵산을 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 측면들에서, 미생물 유기체는 전술한 바와 같이 (1)-(24)로부터 선택되는 한가지 이상의 경로의 효소들 각각을 코딩하는 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 하나 이상의 외인성 핵산은 이종 핵산이다. 일부 측면들에서, 비-천연성 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 존재한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 전술한 바와 같이 (9)-(15)로부터 선택되는 2,4-펜타디에노에이트 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체가 글루타릴-CoA를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 글루타릴-CoA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 글루타릴-CoA 경로를 추가로 포함하는, 본원에 기술된 비-천연성 미생물 유기제를 제공하며, 여기서 글루타릴-CoA 경로는 아세토아세틸-CoA 티올라제 또는 아세토아세틸-CoA 신타제; 아세토아세틸-CoA 리덕타제; 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제; 및 글루타릴-CoA 데하이드로게나제; 또는 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제 또는 2-아미노아디페이트 아민 옥시다제; 및 2-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 2-옥소아디페이트:페리독신 옥시도리덕타제 또는 2-옥소아디페이트 포르메이트 리아제로부터 선택되는 경로를 가진다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 전술한 바와 같이 (16)-(22)로부터 선택되는 2,4-펜타디에노에이트 경로를 구비한 비천연성 미생물 유기체가 5-아미노펜타노에이트를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 5-아미노펜타노에이트 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 5-아미노펜타노에이트 경로를 추가로 포함하는, 본원에 기술된 비-천연성 미생물 유기체를 제공하며, 여기서 5-아미노펜타노에이트 경로는 2-아미노아디페이트 데카르복실라제; 또는 2-아미노아디페이트 데카르복실라제 및 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제 또는 2-아미노아디페이트 아민 옥시다제를 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 전술한 바와 같이 (1)-(8)로부터 선택되는 2,4-펜타디에노에이트 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체가 2-옥소아디페이트를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 2-옥소아디페이트 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 2-옥소아디페이트 경로를 더 포함하는, 본원에 기술된 비-천연성 미생물 유기체를 제공하며, 여기서 2-옥소아디페이트 경로는 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제 또는 2-아미노아디페이트 아민 옥시다제를 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 2,4-펜타디에노에이트를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 2,4-펜타디에노에이트 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 2,4-펜타디에노에이트 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체를 제공하며, 여기서 2,4-펜타디에노에이트 경로는 전술한 경로를 포함하며, 추가적으로, (i) 환원적 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 환원적 TCA 경로로서, 하나 이상의 외인성 핵산이 ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제로부터 선택되는 것인 환원적 RCA 경로; (ii) 환원적 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 환원적 TCA 경로로서, 상기 하나 이상의 외인성 핵산이 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제로부터 선택되는 것인, 환원적 TCA 경로; 또는 (iii) CO 데하이드로게나제, H2 하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진다.
일부 측면들에서, 전술한 (i)를 구비한 미생물 유기체는, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 아세틸-CoA 신테타제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 페레독신 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 일부 측면들에서, (ii)를 구비한 미생물 유기체는, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 일부 측면들에서, 전술한 (i)를 구비한 미생물 유기체는, ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제를 코딩하는 4개의 외인성 핵산을 포함하거나; (ii)를 구비한 미생물 유기체는, 전술한 바와 같이, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제, 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 5종의 외인성 핵산을 포함하거나; 또는 (iii)를 구비한 전술한 미생물 유기체는 CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 2종의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 2,4-펜타디에노에이트를 생산하는 조건과 충분한 시간 동안 본원에 기술된 비-천연성 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는, 2,4-펜타디에노에이트의 생산 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 부타디엔을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 부타디엔 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 부타디엔 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함하여, 이때 부타디엔 경로는, (1) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1G 및 1T; (2) 1D, 1E, 1F, 1G 및 1T; (3) 1D, 1E, 1L, 1M, 1P, 1G 및 1T; (4) 1D, 1I, 1B, 1J 및 1T; (5) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N, 1O 및 1T; (6) 1D, 1E, 1F, 1P, 1N, 1O 및 1T; (7) 1D, 1E, 1L, 1M, 1N, 1O 및 1T; (8) 1D, 1E, 1L, 1Q, 1O 및 1T; (9) 1D, 1E, 1F, 1U 및 1V; (10) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1U 및 1V; (11) 1D, 1E, 1L, 1M, 1P, 1U 및 1V; (12) 1D, 1E, 1W 및 1V; (13) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1G, 6A 및 6B; (14) 1D, 1E, 1F, 1G, 6A 및 6B; (15) 1D, 1E, 1L, 1M, 1P, 1G, 6A 및 6B; (16) 1D, 1I, 1B, 1J, 6A 및 6B; (17) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N, 1O, 6A 및 6B; (18) 1D, 1E, 1F, 1P, 1N, 1O, 6A 및 6B; (19) 1D, 1E, 1L, 1M, 1N, 1O, 6A 및 6B; (20) 1D, 1E, 1L, 1Q, 1O, 6A 및 6B; (21) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1G, 6H, 6E 및 6B; (22) 1D, 1E, 1F, 1G, 6H, 6E 및 6B; (23) 1D, 1E, 1L, 1M, 1P, 1G, 6H, 6E 및 6B; (24) 1D, 1I, 1B, 1J, 6H, 6E 및 6B; (25) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N, 1O, 6H, 6E 및 6B; (26) 1D, 1E, 1F, 1P, 1N, 1O, 6H, 6E 및 6B; (27) 1D, 1E, 1L, 1M, 1N, 1O, 6H, 6E 및 6B; (28) 1D, 1E, 1L, 1Q, 1O, 6H, 6E 및 6B; (29) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N, 6C 및 6B; (30) 1D, 1E, 1F, 1P, 1N, 6C 및 6B; (31) 1D, 1E, 1L, 1M, 1N, 6C 및 6B; (32) 1D, 1E, 1L, 1Q, 6C 및 6B; (33) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N, 6D, 6E 및 6B; (34) 1D, 1E, 1F, 1P, 1N, 6D, 6E 및 6B; (35) 1D, 1E, 1L, 1M, 1N, 6D, 6E 및 6B; (36) 1D, 1E, 1L, 1Q, 6D, 6E 및 6B; (37) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1G, 6F, 6C 및 6B; (38) 1D, 1E, 1F, 1G, 6F, 6C 및 6B; (39) 1D, 1E, 1L, 1M, 1P, 1G, 6F, 6C 및 6B; (40) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K, 1G, 6F, 6D, 6E 및 6B; (41) 1D, 1E, 1F, 1G, 6F, 6D, 6E 및 6B; (42) 1D, 1E, 1L, 1M, 1P, 1G, 6F, 6D, 6E 및 6B; (43) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1G 및 1T; (44) 1S, 1E, 1F, 1G 및 1T; (45) 1S, 1I, 1B, 1J 및 1T; (46) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N, 1O 및 1T; (47) 1S, 1E, 1F, 1P, 1N, 1O 및 1T; (48) 1S, 1E, 1L, 1M, 1N, 1O 및 1T; (49) 1S, 1E, 1L, 1Q, 1O 및 1T; (50) 1S, 1E, 1F, 1U 및 1V; (51) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1U 및 1V; (52) 1S, 1E, 1L, 1M, 1P, 1U 및 1V; (53) 1S, 1E, 1W 및 1V; (54) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1G, 6A 및 6B; (55) 1S, 1E, 1F, 1G, 6A 및 6B; (56) 1S, 1I, 1B, 1J, 6A 및 6B; (57) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N, 1O, 6A 및 6B; (58) 1S, 1E, 1F, 1P, 1N, 1O, 6A 및 6B; (59) 1S, 1E, 1L, 1M, 1N, 1O, 6A 및 6B; (60) 1S, 1E, 1L, 1Q, 1O, 6A 및 6B; (61) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1G, 6H, 6E 및 6B; (62) 1S, 1E, 1F, 1G, 6H, 6E 및 6B; (63) 1S, 1I, 1B, 1J, 6H, 6E 및 6B; (64) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N, 1O, 6H, 6E 및 6B; (65) 1S, 1E, 1F, 1P, 1N, 1O, 6H, 6E 및 6B; (66) 1S, 1E, 1L, 1M, 1N, 1O, 6H, 6E 및 6B; (67) 1S, 1E, 1L, 1Q, 1O, 6H, 6E 및 6B; (68) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N, 6C 및 6B; (69) 1S, 1E, 1F, 1P, 1N, 6C 및 6B; (70) 1S, 1E, 1L, 1M, 1N, 6C 및 6B; (71) 1S, 1E, 1L, 1Q, 6C 및 6B; (72) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1P, 1N, 6D, 6E 및 6B; (73) 1S, 1E, 1F, 1P, 1N, 6D, 6E 및 6B; (74) 1S, 1E, 1L, 1M, 1N, 6D, 6E 및 6B; (75) 1S, 1E, 1L, 1Q, 6D, 6E 및 6B; (76) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1G, 6F, 6C 및 6B; (77) 1S, 1E, 1F, 1G, 6F, 6C 및 6B; (78) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K, 1G, 6F, 6D, 6E 및 6B; (79) 1S, 1E, 1F, 1G, 6F, 6D, 6E 및 6B; (80) 1B, 1C, 1K, 1G 및 1T; (81) 1I, 1E, 1F, 1G 및 1T; (82) 1I, 1E, 1L, 1M, 1P, 1G 및 1T; (83) 1B, 1J 및 1T; (84) 1I, 1E, 1F, 1P, 1N, 1O 및 1T; (85) 1I, 1E, 1L, 1M, 1N, 1O 및 1T; (86) 1I, 1E, 1L, 1Q, 1O 및 1T; (87) 1B, 1C, 1K, 1U 및 1V; (88) 1I, 1E, 1F, 1U 및 1V; (89) 1I, 1E, 1L, 1M, 1P, 1U 및 1V; (90) 1I, 1E, 1W 및 1V; (91) 1B, 1C, 1K, 1G, 6A 및 6B; (92) 1I, 1E, 1F, 1G, 6A 및 6B; (93) 1I, 1E, 1L, 1M, 1P, 1G, 6A 및 6B; (94) 1B, 1J, 6A 및 6B; (95) 1I, 1E, 1F, 1P, 1N, 1O, 6A 및 6B; (96) 1I, 1E, 1L, 1M, 1N, 1O, 6A 및 6B; (97) 1I, 1E, 1L, 1Q, 1O, 6A 및 6B; (98) 1B, 1C, 1K, 1G, 6H, 6E 및 6B; (99) 1I, 1E, 1F, 1G, 6H, 6E 및 6B; (100) 1I, 1E, 1L, 1M, 1P, 1G, 6H, 6E 및 6B; (101) 1B, 1J, 6H, 6E 및 6B; (102) 1I, 1E, 1F, 1P, 1N, 1O, 6H, 6E 및 6B; (103) 1I, 1E, 1L, 1M, 1N, 1O, 6H, 6E 및 6B; (104) 1I, 1E, 1L, 1Q, 1O, 6H, 6E 및 6B; (105) 1I, 1E, 1F, 1P, 1N, 6C 및 6B; (106) 1I, 1E, 1L, 1M, 1N, 6C 및 6B; (107) 1I, 1E, 1L, 1Q, 6C 및 6B; (108) 1I, 1E, 1F, 1P, 1N, 6D, 6E 및 6B; (109) 1I, 1E, 1L, 1M, 1N, 6D, 6E 및 6B; (110) 1I, 1E, 1L, 1Q, 6D, 6E 및 6B; (111) 1B, 1C, 1K, 1G, 6F, 6C 및 6B; (112) 1I, 1E, 1F, 1G, 6F, 6C 및 6B; (113) 1I, 1E, 1L, 1M, 1P, 1G, 6F, 6C 및 6B; (114) 1B, 1C, 1K, 1G, 6F, 6D, 6E 및 6B; (115) 1I, 1E, 1F, 1G, 6F, 6D, 6E 및 6B; (116) 1I, 1E, 1L, 1M, 1P, 1G, 6F, 6D, 6E 및 6B; (117) 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F 및 1T; (118) 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 6A 및 6B; (119) 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 6H, 6E 및 6B; (120) 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 6C 및 6B; (121) 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 6D, 6E 및 6B; 및 (122) 3A, 3B, 3C, 3G, 3F 및 1T; (123) 3A, 3B, 3C, 3G, 3F, 6A 및 6B; (124) 3A, 3B, 3C, 3G, 3F, 6H, 6E 및 6B; (125) 3A, 3B, 3C, 3G, 6C 및 6B; (126) 3A, 3B, 3C, 3G, 6D, 6E 및 6B; (127) 5A, 5B, 5C, 5D 및 5E; (128) 7A, 7J, 7R, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (129) 7A, 7H, 7F, 7R, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (130) 7A, 7H, 7Q, 7Z, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (131) 7A, 7H, 7Q, 7AC, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (132) 7A, 7D, 7I, 7R, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (133) 7A, 7D, 7E, 7F, 7R, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (134) 7A, 7D, 7E, 7Q, 7Z, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (135) 7A, 7D, 7E, 7Q, 7AC, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (136) 7A, 7D, 7P, 7N, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (137) 7A, 7D, 7P, 7Y, 7Z, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (138) 7A, 7D, 7P, 7Y, 7AC, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (139) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7V, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (140) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7AF, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (141) 7A, 7B, 7M, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (142) 7A, 7B, 7L, 7Z, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (143) 7A, 7B, 7L, 7AC, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (144) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7Z, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (145) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7AC, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (146) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7V, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (147) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7AF, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (148) 7A, 7B, 7C, 7U, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (149) 7A, 7B, 7C, 7T, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (150) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7AF, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (151) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7W, 12A, 12B 및 12C; (152) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7W, 12A, 12B 및 12C; (153) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7W, 12A, 12B 및 12C; (154) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7V, 7AH; , 12A, 12B 및 12C (155) 7A, 7J, 7R, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (156) 7A, 7H, 7F, 7R, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (157) 7A, 7H, 7Q, 7Z, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (158) 7A, 7H, 7Q, 7AC, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (159) 7A, 7D, 7I, 7R, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (160) 7A, 7D, 7E, 7F, 7R, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (161) 7A, 7D, 7E, 7Q, 7Z, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (164) 7A, 7D, 7E, 7Q, 7AC, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (163) 7A, 7D, 7P, 7N, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (164) 7A, 7D, 7P, 7Y, 7Z, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (165) 7A, 7D, 7P, 7Y, 7AC, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (166) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7V, 7AH, 12D 및 12C; (167) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7AF, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (168) 7A, 7B, 7M, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (169) 7A, 7B, 7L, 7Z, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (170) 7A, 7B, 7L, 7AC, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (171) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7Z, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (172) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7AC, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (173) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7V, 7AH, 12D 및 12C; (174) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7AF, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (175) 7A, 7B, 7C, 7U, 7AH, 12D 및 12C; (176) 7A, 7B, 7C, 7T, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (177) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7AF, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (178) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7W, 12D 및 12C; (179) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7W, 12D 및 12C; (180) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7W, 12D 및 12C; (181) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7V, 7AH, 12D 및 12C; (182) 7I, 7R, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (183) 7E, 7F, 7R, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (184) 7E, 7Q, 7Z, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (185) 7E, 7Q, 7AC, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (186) 7P, 7N, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (187) 7P, 7Y, 7Z, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (188) 7P, 7Y, 7AC, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (189) 7P, 7AB, 7V, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (190) 7P, 7AB, 7AF, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (191) 7P, 7AB, 7W, 12A, 12B 및 12C; (192) 7I, 7R, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (193) 7E, 7F, 7R, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (194) 7E, 7Q, 7Z, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (195) 7E, 7Q, 7AC, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (196) 7P, 7N, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (197) 7P, 7Y, 7Z, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (198) 7P, 7Y, 7AC, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (199) 7P, 7AB, 7V, 7AH, 12D 및 12C; (200) 7P, 7AB, 7AF, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (201) 7P, 7AB, 7W, 12D 및 12C, (202) 7AS, 7I, 7R, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (203) 7AS, 7E, 7F, 7R, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (204) 7AS, 7E, 7Q, 7Z, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (205) 7AS, 7E, 7Q, 7AC, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (206) 7AS, 7P, 7N, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (207) 7AS, 7P, 7Y, 7Z, 7AD, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (208) 7AS, 7P, 7Y, 7AC, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (209) 7AS, 7P, 7AB, 7V, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (210) 7AS, 7P, 7AB, 7AF, 7AG, 7AH, 12A, 12B 및 12C; (211) 7AS, 7P, 7AB, 7W, 12A, 12B 및 12C; (212) 7AS, 7I, 7R, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (213) 7AS, 7E, 7F, 7R, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (214) 7AS, 7E, 7Q, 7Z, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (215) 7AS, 7E, 7Q, 7AC, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (216) 7AS, 7P, 7N, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (217) 7AS, 7P, 7Y, 7Z, 7AD, 7AH, 12D 및 12C; (218) 7AS, 7P, 7Y, 7AC, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; (219) 7AS, 7P, 7AB, 7V, 7AH, 12D 및 12C; (220) 7AS, 7P, 7AB, 7AF, 7AG, 7AH, 12D 및 12C; 및 (221) 7AS, 7P, 7AB, 7W, 12D 및 12C로부터 선택되는 도 1, 3, 5, 6 및/또는 12에 도시된 경로를 포함하며, 여기서 1B는 5-아미노펜타노에이트 리덕타제, 5-아미노펜트-2-에노에이트 아미노트랜스퍼라제, 5-아미노펜트-2-에노에이트 데하이드로게나제 또는 5-아미노펜트-2-에노에이트 아민 옥시다제이고, 1D는 2-옥소아디페이트 데카르복실라제이고, 1E는 글루타레이트 세미알데하이드 리덕타제이고, 1F는 5-하이드록시발레레이트 리덕타제이고, 1G는 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 데하이드라타제이고, 1I는 5-아미노펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제, 5-아미노펜타노에이트 데하이드로게나제 또는 5-아미노펜타노에이트 아민 옥시다제이고, 1J는 5-아미노펜트-4-에노에이트 데아미나제이고, 1K는 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 리덕타제이고, 1L은 5-하이드록시발레릴-CoA 트랜스퍼라제 또는 5-하이드록시발레릴-CoA 신테타제이고, 1M은 5-하이드록시펜타노일-CoA 데하이드로게나제이고, 1N은 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 데하이드라타제이고, 1O는 2,4-펜타디에노일-CoA 트랜스퍼라제, 2,4-펜타디에노일-CoA 신테타제 또는 2,4-펜타디에노일-CoA 하이드롤라제이고, 1P는 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 트랜스퍼라제 또는 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 신테타제이고, 1Q는 5-하이드록시발레릴-CoA 데하이드라타제/데하이드로게나제이고, 1S는 글루타릴-CoA 리덕타제이고, 1T는 2,4-펜타디에노에이트 데카르복실라제이고, 1U는 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 데카르복실라제이고, 1V는 3-부텐-1-올 데하이드라타제이고, 1W는 5-하이드록시발레레이트 데카르복실라제, 3A는 3-옥소펜타노일-CoA 티올라제 또는 3-옥소펜타노일-CoA 신타제이고, 3B는 3-옥소펜타노일-CoA 리덕타제이고, 3C는 3-하이드록시펜타노일-CoA 데하이드라타제이고, 3D는 펜트-2-에노일-CoA 이소머라제이고, 3E는 펜트-3-에노일-CoA 데하이드로게나제이고, 3F는 2,4-펜타디에노일-CoA 하이드롤라제, 2,4-펜타디에노일-CoA 트랜스퍼라제 또는 2,4-펜타디에노일-CoA 신테타제이고, 3G는 펜트-2-에노일-CoA 데하이드로게나제이고, 5A는 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 알돌라제이고, 5B는 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 데하이드라타제이고, 5C는 2-옥소펜테노에이트 데카르복실라제이고, 5D는 3-부텐-1-알 리덕타제이고, 5E는 3-부텐-1-올 데하이드라타제이고, 6A는 2,4-펜타디에노에이트 리덕타제 (산 환원)이고, 6B는 펜타-2,4-디에날데카르보닐라제이고, 6C는 2,4-펜타디에노일-CoA 리덕타제 (산 환원)이고, 6D는 2,4-펜타디에노일-Co포스포트랜스퍼라제이고, 6E는 2,4-펜타디에노일-포스페이트 리덕타제이고, 6F는 2,4-펜타디에노일-CoA 하이드롤라제, 2,4-펜타디에노일-CoA 트랜스퍼라제 또는 2,4-펜타디에노일-CoA 신테타제이고, 6H는 2,4-펜타디에노에이트 키나제이고, 7A는 3-케토아실-ACP 신타제이고, 7B는 아세토아세틸-ACP 리덕타제이고, 7C는 3-하이드록시부티릴-ACP 데하이드라타제이고, 7D는 아세토아세틸-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7E는 아세토아세틸-CoA 하이드롤라제, 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제 또는 아세토아세틸-CoA 신테타제이고, 7F는 아세토아세테이트 리덕타제 (산 환원)이고, 7H는 아세토아세틸-ACP 티오에스테라제이고, 7I는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (CoA-의존성, 알데하이드 형성)이고, 7J는 아세토아세틸-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7K는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (알코올 형성)이고, 7L은 3-하이드록시부티릴-ACP 티오에스테라제이고, 7M은 3-하이드록시부티릴-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7N은 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7O는 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알코올 형성)이고, 7P는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7Q는 아세토아세테이트 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7R은 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7T는 크로토닐-ACP 티오에스테라제이고, 7U는 크로토닐-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7V는 크로토닐-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7W는 크로토닐-CoA (알코올 형성)이고, 7X는 3-하이드록시부티릴-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7Y는 3-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 3-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제 또는 3-하이드록시부티릴-CoA 신테타제이고, 7Z는 3-하이드록시부티레이트 리덕타제이고, 7AB는 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제이고, 7AC는 3-하이드록시부티레이트 데하이드라타제이고, 7AD는 3-하이드록시부티르알데하이드 데하이드라타제이고, 7AE는 크로토닐-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7AF는 크로토닐-CoA 하이드롤라제, 크로토닐-CoA 트랜스퍼라제 또는 크로토닐-CoA 신테타제이고, 7AG는 크로토네이트 리덕타제이고, 7AH는 크로톤알데하이드 리덕타제이고, 7AS는 아세토아세틸-CoA 신타제이고, 12A는 크로틸 알코올 키나제이고, 12B는 2-부테닐-4-포스페이트 키나제이고, 12C는 부타디엔 신타제이고, 12D는 크로틸 알코올 디포스포키나제이다.
본 발명의 일부 측면들에서, 미생물 유기체는 부타디엔 경로 효소를 각각 코딩하는 외인성 핵산 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 미생물 유기체는 (1)-(221)로부터 선택되는 하나 이상의 경로의 효소 각각을 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 측면들에서, 하나 이상의 외인성 핵산은 이종 핵산이다. 일부 측면들에서, 비-천연성 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성인 배양 배지에 존재한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 전술한 바와 같이 (43)-(79)로부터 선택되는 부타디엔 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체가 글루타릴-CoA를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 글루타릴-CoA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 글루타릴-CoA 경로를 더 포함하는, 본원에 기술된 비-천연성 미생물 유기체를 제공하며, 여기서 글루타릴-CoA 경로는 아세토아세틸-CoA 티올라제 또는 아세토아세틸-CoA 신타제; 아세토아세틸-CoA 리덕타제; 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제; 및 글루타릴-CoA 데하이드로게나제; 또는 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제 또는 2-아미노아디페이트 아민 옥시다제; 및 2-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 2-옥소아디페이트:페리독신 옥시도리덕타제 또는 2-옥소아디페이트 포르메이트 리아제를 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 전술한 바와 같이 (80)-(116)로부터 선택되는 부타디엔 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체가 5-아미노펜타노에이트를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 5-아미노펜타노에이트 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 5-아미노펜타노에이트 경로를 더 포함하는, 본원에 기술된 비-천연성 미생물 유기체를 제공하며, 상기 5-아미노펜타노에이트 경로는 2-아미노아디페이트 데카르복실라제; 또는 2-아미노아디페이트 데카르복실라제 및 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제 또는 2-아미노아디페이트 아민 옥시다제를 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 전술한 바와 같이 (1)-(42)로부터 선택되는 부타디엔 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체가 2-옥소아디페이트를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 2-옥소아디페이트 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 2-옥소아디페이트 경로를 더 포함하는, 본원에 기술된 비-천연성 미생물 유기체를 제공하며, 상기 2-옥소아디페이트 경로는 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제 또는 2-아미노아디페이트 아민 옥시다제를 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 부타디엔을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 부타디엔 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 부타디엔 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체를 제공하되, 상기 부타디엔 경로는 전술한 바와 같은 경로를 포함하며, (i) 환원적 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 환원적 TCA 경로로서, 하나 이상의 외인성 핵산이 ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제로부터 선택되는 것인 환원적 RCA 경로; (ii) 환원적 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 환원적 TCA 경로로서, 상기 하나 이상의 외인성 핵산이 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제로부터 선택되는 것인, 환원적 TCA 경로; 또는 (iii) CO 데하이드로게나제, H2 하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 추가로 포함한다.
일부 측면들에서, 전술한 (i)를 구비한 미생물 유기체는, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 아세틸-CoA 신테타제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 페레독신 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, (ii)를 구비한 미생물 유기체는, 전술한 바와 같이, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 일부 측면들에서, 전술한 (i)를 구비한 미생물 유기체는, ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제를 코딩하는 4개의 외인성 핵산을 포함하거나; (ii)를 구비한 전술한 미생물 유기체는 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제, 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 5종의 외인성 핵산을 포함하거나; 또는 (iii)를 구비한 전술한 미생물 유기체는 CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 2종의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 부타디엔을 생산하는 조건과 충분한 시간 동안 본원에 기술된 비-천연성 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는 부타디엔 제조 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 1,3-부탄디올을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 1,3-부탄디올 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 1,3-부탄디올 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함하여, 비-천연성 미생물 유기체를 제공하되, 상기 1,3-부탄디올 경로는 (1) 4A, 4B, 4C 및 4D; (2) 5A, 5H, 5J, 5K 및 5G; (3) 5A, 5H, 5I 및 5G; (4) 5A, 5H 및 5L; (5) 5A, 5F 및 5G; (6) 7A, 7D, 7E, 7F, 7G 및 7S; (7) 7A, 7D, 7I, 7G 및 7S; (8) 7A, 7D, 7K, 및 7S; (9) 7A, 7H, 7F, 7G 및 7S; (10) 7A, 7J, 7G 및 7S; (11) 7A, 7J, 7R 및 7AA; (12) 7A, 7H, 7F, 7R 및 7AA; (13) 7A, 7H, 7Q, 7Z 및 7AA; (14) 7A, 7D, 7I, 7R 및 7AA; (15) 7A, 7D, 7E, 7F, 7R 및 7AA; (16) 7A, 7D, 7E, 7Q, 7Z 및 7AA; (17) 7A, 7D, 7P, 7N 및 7AA; (18) 7A, 7D, 7P, 7Y, 7Z 및 7AA; (19) 7A, 7B, 7M 및 7AA; (20) 7A, 7B, 7L, 7Z 및 7AA; (21) 7A, 7B, 7X, 7N 및 7AA; (22) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7Z 및 7AA; (23) 7A, 7D, 7P 및 7O; (24) 7A, 7B, 7X 및 7O; (25) 7A, 7D, 7E, 7F, 7R, 7AA; (26) 7A, 7D, 7E, 7F, 7G, 7S, (27) 7AS, 7E, 7F, 7G 및 7S; (28) 7AS, 7I, 7G 및 7S; (29) 7AS, 7K, 및 7S; (30) 7AS, 7I, 7R 및 7AA; (31) 7AS, 7E, 7F, 7R 및 7AA; (32) 7AS, 7E, 7Q, 7Z 및 7AA; (33) 7AS, 7P, 7N 및 7AA; (34) 7AS, 7P, 7Y, 7Z 및 7AA; (35) 7AS, 7P 및 7O; (36) 7AS, 7E, 7F, 7R, 및 7AA; 및 (37) 7AS, 7E, 7F, 7G, 및 7S로부터 선택되는 도 4, 5 및/또는 7에 도시된 경로를 포함하며, 여기서 4A는 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 티올라제 또는 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 신타제이고, 4B는 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 하이드롤라제, 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 트랜스퍼라제 또는 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 신테타제이고, 4C는 3-옥소-5-하이드록시펜타노에이트 데카르복실라제이고, 4D는 3-옥소부탄올 리덕타제이고, 5A는 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 알돌라제이고, 5F는 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 데카르복실라제이고, 5G는 3-하이드록시부타날 리덕타제이고, 5H는 4-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시-2-옥소펜타노에이트:페레독신 옥시도리덕타제 또는 4-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 포르메이트 리아제이고, 5I는 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 5J는 3-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 3-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제 또는 3-하이드록시부티릴-CoA 신테타제이고, 5K는 3-하이드록시부티레이트 리덕타제이고, 5L은 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알코올 형성)이고, 7A는 3-케토아실-ACP 신타제이고, 7B는 아세토아세틸-ACP 리덕타제이고, 7D는 아세토아세틸-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7E는 아세토아세틸-CoA 하이드롤라제, 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제 또는 아세토아세틸-CoA 신테타제이고, 7F는 아세토아세테이트 리덕타제 (산 환원)이고, 7G는 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제 (알데하이드 환원)이고, 7H는 아세토아세틸-ACP 티오에스테라제이고, 7I는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (CoA-의존성, 알데하이드 형성)이고, 7J는 아세토아세틸-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7K는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (알코올 형성)이고, 7L은 3-하이드록시부티릴-ACP 티오에스테라제이고, 7M은 3-하이드록시부티릴-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7N은 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7O는 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알코올 형성)이고, 7P는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7Q는 아세토아세테이트 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7R은 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7S는 4-하이드록시-2-부타논 리덕타제이고, 7X는 3-하이드록시부티릴-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7Y는 3-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 3-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제 또는 3-하이드록시부티릴-CoA 신테타제이고, 7Z는 3-하이드록시부티레이트 리덕타제이고, 7AA는 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제이고, 7AS는 아세토아세틸-CoA 신타제이다.
일부 측면들에서, 미생물 유기체는 1,3-부탄디올 경로 효소를 각각 코딩하는 외인성 핵산 2, 3, 4 또는 5종을 포함한다. 일부 측면들에서, 미생물 유기체는 전술한 바와 같이 (1)-(37)로부터 선택되는 하나 이상의 경로의 효소 각각을 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 측면들에서, 하나 이상의 외인성 핵산은 이종 핵산이다. 일부 측면들에서, 비-천연성 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성인 배양 배지에 존재한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 1,3-부탄디올을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 1,3-부탄디올 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 1,3-부탄디올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체를 제공하되, 상기 1,3-부탄디올 경로는 전술한 경로를 포함하며, 추가적으로 (i) 환원적 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 환원적 TCA 경로로서, 하나 이상의 외인성 핵산이 ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제로부터 선택되는 것인 환원적 RCA 경로; (ii) 환원적 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 환원적 TCA 경로로서, 상기 하나 이상의 외인성 핵산이 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제로부터 선택되는 것인, 환원적 TCA 경로; 또는 (iii) CO 데하이드로게나제, H2 하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 측면들에서, 전술한 (i)를 구비한 미생물 유기체는, 추가적으로, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 아세틸-CoA 신테타제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 페레독신 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 측면들에서, (ii)를 구비한 전술한 미생물 유기체는, 추가적으로, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 일부 측면들에서, 전술한 바와 같이 (i)를 구비한 미생물 유기체는, ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제를 코딩하는 4개의 외인성 핵산을 포함하거나; (ii)를 구비한 미생물 유기체는, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제, 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 5종의 외인성 핵산을 포함하거나; 또는 (iii)를 구비한 미생물 유기체는 CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 2종의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 1,3-부탄디올을 생산하는 조건과 충분한 시간 동안 본원에 기술된 비-천연성 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는, 1,3-부탄디올 제조 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 3-부텐-1-올을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 3-부텐-1-올 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 3-부텐-1-올 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함하여, 비-천연성 미생물 유기체를 제공하되, 상기 3-부텐-1-올 경로는 (1) 1D, 1E, 1F 및 1U; (2) 1D, 1I, 1B, 1C, 1K 및 1U; (3) 1D, 1E, 1L, 1M, 1P 및 1U; (4) 1D, 1E 및 1W; (5) 1S, 1E, 1F 및 1U; (6) 1S, 1I, 1B, 1C, 1K 및 1U; (7) 1S, 1E, 1L, 1M, 1P 및 1U; (8) 1S, 1E 및 1W; (9) 1B, 1C, 1K 및 1U; (10) 1I, 1E, 1F 및 1U; (11) 1I, 1E, 1L, 1M, 1P 및 1U; (12) 1I, 1E 및 1W; 및 (13) 5A, 5B, 5C 및 5D로부터 선택되는 도 1 및/또는 5에 도시된 경로를 포함하며; 여기서 1B는 5-아미노펜타노에이트 리덕타제이고, 1C는 5-아미노펜트-2-에노에이트 아미노트랜스퍼라제, 5-아미노펜트-2-에노에이트 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제이고, 1D는 2-옥소아디페이트 데카르복실라제이고, 1E는 글루타레이트 세미알데하이드 리덕타제이고, 1F는 5-하이드록시발레레이트 데하이드로게나제이고, 1I는 5-아미노펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제, 5-아미노펜타노에이트 데하이드로게나제 또는 5-아미노펜타노에이트 아민 옥시다제이고, 1K는 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 리덕타제이고, 1L은 5-하이드록시발레릴-CoA 트랜스퍼라제 또는 5-하이드록시발레릴-CoA 신테타제이고, 1M은 5-하이드록시펜타노일-CoA 데하이드로게나제이고, 1P는 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 트랜스퍼라제 또는 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 신테타제이고, 1S는 글루타릴-CoA 리덕타제이고, 1U는 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 데카르복실라제이고, 1W는 5-하이드록시발레레이트 데카르복실라제이고, 5A는 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 알돌라제이고, 5B는 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 데하이드라타제이고, 5C는 2-옥소펜테노에이트 데카르복실라제이고, 5D는 3-부텐-1-알 리덕타제이다.
일부 측면들에서, 미생물 유기체는 3-부텐-1-올 경로 효소를 각각 코딩하는 외인성 핵산 2, 3, 4, 5 또는 6종을 포함한다. 일부 측면들에서, 미생물 유기체는 전술한 바와 같이 (1)-(13)으로부터 선택되는 하나 이상의 경로의 효소 각각을 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 측면들에서, 하나 이상의 외인성 핵산은 이종 핵산이다. 일부 측면들에서, 비-천연성 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성인 배양 배지에 존재한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 3-부텐-1-올을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 3-부텐-1-올 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체를 제공하되, 상기 3-부텐-1-올 경로는 전술한 바와 같은 경로를 포함하며, 추가적으로, (i) 환원적 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 환원적 TCA 경로로서, 하나 이상의 외인성 핵산이 ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제로부터 선택되는 것인 환원적 RCA 경로; (ii) 환원적 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 환원적 TCA 경로로서, 상기 하나 이상의 외인성 핵산이 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제로부터 선택되는 것인, 환원적 TCA 경로; 또는 (iii) CO 데하이드로게나제, H2 하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 측면들에서, 전술한 (i)를 구비한 미생물 유기체는, 추가적으로, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 아세틸-CoA 신테타제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 페레독신 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 측면들에서, 전술한 바와 같이 (ii)를 구비한 미생물 유기체는, 추가적으로, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 일부 측면들에서 전술한 (i)를 구비한 미생물 유기체는, ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제를 코딩하는 4개의 외인성 핵산을 포함하거나; 전술한 바와 같이 (ii)를 구비한 미생물 유기체는피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제, 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 5종의 외인성 핵산을 포함하거나; 또는 (iii)를 구비한 전술한 미생물 유기체는 CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 2종의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 3-부텐-1-올을 생산하는 조건과 충분한 시간 동안 전술한 비-천연성 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는, 3-부텐-1-올 제조 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 3-부텐-1-올을 생산하는 조건과 충분한 시간 동안 전술한 비-천연성 미생물 유기체를 배양하는 단계 및 3-부텐-1-올을 화학적으로 탈수시켜 부타디엔을 제조하는 단계를 포함하는, 부타디엔 제조 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 크로틸 알코올을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 크로틸 알코올 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 크로틸 알코올 경로를 구비한 미생물 유기체를 비롯한, 비-천연성 미생물 유기체를 제공하되, 상기 크로틸 알코올 경로는 (1) 7A, 7J, 7R, 7AD 및 7AH; (2) 7A, 7H, 7F, 7R, 7AD 및 7AH; (3) 7A, 7H, 7Q, 7Z, 7AD 및 7AH; (4) 7A, 7H, 7Q, 7AC, 7AG 및 7AH; (5) 7A, 7D, 7I, 7R, 7AD 및 7AH; (6) 7A, 7D, 7E, 7F, 7R, 7AD 및 7AH; (7) 7A, 7D, 7E, 7Q, 7Z, 7AD 및 7AH; (8) 7A, 7D, 7E, 7Q, 7AC, 7AG 및 7AH; (9) 7A, 7D, 7P, 7N, 7AD 및 7AH; (10) 7A, 7D, 7P, 7Y, 7Z, 7AD 및 7AH; (11) 7A, 7D, 7P, 7Y, 7AC, 7AG 및 7AH; (12) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7V 및 7AH; (13) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7AF, 7AG 및 7AH (14) 7A, 7B, 7M, 7AD 및 7AH; (15) 7A, 7B, 7L, 7Z, 7AD 및 7AH; (16) 7A, 7B, 7L, 7AC, 7AG 및 7AH; (17) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7Z, 7AD 및 7AH; (18) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7AC, 7AG 및 7AH; (19) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7V 및 7AH; (20) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7AF, 7AG 및 7AH; (21) 7A, 7B, 7C, 7U 및 7AH; (22) 7A, 7B, 7C, 7T, 7AG 및 7AH; (23) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7AF, 7AG 및 7AH; (24) 7A, 7D, 7P, 7AB 및 7W; (25) 7A, 7B, 7X, 7AB 및 7W; (26) 7A, 7B, 7C, 7AE 및 7W; (27) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7V 및 7AH; (28) 7I, 7R, 7AD 및 7AH; (29) 7E, 7F, 7R, 7AD 및 7AH; (30) 7E, 7Q, 7Z, 7AD 및 7AH; (31) 7E, 7Q, 7AC, 7AG 및 7AH; (32) 7P, 7N, 7AD 및 7AH; (33) 7P, 7Y, 7Z, 7AD 및 7AH; (34) 7P, 7Y, 7AC, 7AG 및 7AH; (35) 7P, 7AB, 7V 및 7AH; (36) 7P, 7AB, 7AF, 7AG 및 7AH; (37) 7P, 7AB 및 7W, (38) 7AS, 7I, 7R, 7AD 및 7AH; (39) 7AS, 7E, 7F, 7R, 7AD 및 7AH; (40) 7AS, 7E, 7Q, 7Z, 7AD 및 7AH; (41) 7AS, 7E, 7Q, 7AC, 7AG 및 7AH; (42) 7AS, 7P, 7N, 7AD 및 7AH; (43) 7AS, 7P, 7Y, 7Z, 7AD 및 7AH; (44) 7AS, 7P, 7Y, 7AC, 7AG 및 7AH; (45) 7AS, 7P, 7AB, 7V 및 7AH; (46) 7AS, 7P, 7AB, 7AF, 7AG 및 7AH; 및 (47) 7AS, 7P, 7AB 및 7W로부터 선택되는 도 7에 도시된 경로를 포함하며, 여기서 7A는 3-케토아실-ACP 신타제이고, 7B는 아세토아세틸-ACP 리덕타제이고, 7C는 3-하이드록시부티릴-ACP 데하이드라타제이고, 7D는 아세토아세틸-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7E는 아세토아세틸-CoA 하이드롤라제, 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제 또는 아세토아세틸-CoA 신테타제이고, 7F는 아세토아세테이트 리덕타제 (산 환원)이고, 7H는 아세토아세틸-ACP 티오에스테라제이고, 7I는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (CoA-의존성, 알데하이드 형성)이고, 7J는 아세토아세틸-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7K는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (알코올 형성)이고, 7L은 3-하이드록시부티릴-ACP 티오에스테라제이고, 7M은 3-하이드록시부티릴-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7N은 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7O는 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알코올 형성)이고, 7P는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7Q는 아세토아세테이트 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7R은 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7T는 크로토닐-ACP 티오에스테라제이고, 7U는 크로토닐-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7V는 크로토닐-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7W는 크로토닐-CoA (알코올 형성)이고, 7X는 3-하이드록시부티릴-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7Y는 3-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 3-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제 또는 3-하이드록시부티릴-CoA 신테타제이고, 7Z는 3-하이드록시부티레이트 리덕타제이고, 7AB는 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제이고, 7AC는 3-하이드록시부티레이트 데하이드라타제이고, 7AD는 3-하이드록시부티르알데하이드 데하이드라타제이고, 7AE는 크로토닐-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7AF는 크로토닐-CoA 하이드롤라제, 크로토닐-CoA 트랜스퍼라제 또는 크로토닐-CoA 신테타제이고, 7AG는 크로토네이트 리덕타제이고, 7AH는 크로톤알데하이드 리덕타제이고, 7AS는 아세토아세틸-CoA 신타제이다.
일부 측면들에서, 본 발명은, 미생물 유기체가 크로틸 알코올 경로 효소를 각각 코딩하는 외인성 핵산 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종을 포함하는, 전술한 크로틸 알코올 경로를 구비한 미생물 유기체를 제공한다. 일부 측면들에서, 미생물 유기체는 전술한 바와 같이 (1)-(47)로부터 선택되는 하나 이상의 크로틸 알코올 경로의 효소를 각각 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 측면들에서, 하나 이상의 외인성 핵산은 이종 핵산이다. 일부 측면들에서, 비-천연성 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성인 배양 배지에 존재한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 크로틸 알코올을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 크로틸 알코올 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 크로틸 알코올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체를 제공하되, 상기 크로틸 알코올 경로는 전술한 바와 같이 경로를 포함하며, 추가적으로, (i) 환원성 TCA 경로 효소를 코딩하는, ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는, 환원성 TCA 경로; (ii) 환원성 TCA 경로 효소를 코딩하는, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는, 환원성 TCA 경로; 또는 (iii) CO 데하이드로게나제, H2 하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 측면들에서, 전술한 바와 같이 (i)을 구비한 미생물 유기체는, 추가적으로, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 아세틸-CoA 신테타제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 페레독신 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 측면들에서, 전술한 바와 같이 (ii)을 구비한 미생물 유기체는, 추가적으로, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 일부 측면들에서, 전술한 바와 같이 (i)을 구비한 미생물 유기체는, ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제를 코딩하는 4종의 외인성 핵산을 포함하거나; (ii)을 구비한 미생물 유기체는, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제, 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 5종의 외인성 핵산을 포함하거나; 또는 (iii)을 구비한 미생물 유기체는, CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 2종의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 크로틸 알코올을 생산하는 조건과 충분한 기간 동안 전술한 비-천연성 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는, 크로틸 알코올 제조 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 부타디엔으로의 접근은 크로틸 알코올의 생합성 생산 및 후속적인 부타디엔으로의 화학적 탈수에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 발명은, (a) 충분량의 영양 및 배지에서 크로틸 알코올을 생산하는 전술한 비-천연성 미생물 유기체를 발효시켜 배양하는 단계, 및 (b) 상기 비-천연성 미생물 유기체를 배양하여 생산되는 크로틸 알코올을 부타디엔으로 변환하는 단계를 포함하는, 부타디엔 제조 방법을 제공한다.
알코올의 탈수는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 촉매화된 및 비-촉매화된 다양한 열적 프로세스를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 촉매화된 열적 탈수는 금속 산화물 촉매 또는 실리카를 활용한다. 일부 구현예들에서, 상기 방법의 단계 (b)는 촉매의 존재 하에서의 화학적 탈수에 의해 수행된다. 예를 들어, 크로틸 알코올은 비스무스 몰리브데이트를 통해 탈수되어, 1,3-부타디엔이 만들어질 수 있는 것으로 기술되어 있다 (Adams, C.R. J. Catal. 10:355-361, 1968).
탈수는 알코올기의 활성화와 이후의 E1 또는 E2 소거 등의 표준 소거 기전에 의한 소거를 통해 달성될 수 있다. 활성화는 알코올기를 요오드화물, 염화물 또는 브롬화물 등의 할로겐으로 변환하는 방식으로 달성될 수 있다. 또한, 활성화는 알코올을 양호한 이탈기로 변환하는 설포닐, 포스페이트 또는 기타 활성화 관능기를 통해 달성될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 활성화 기는 설페이트, 또는 토실레이트, 메실레이트, 노실레이트, 브로실레이트 및 트리플레이트로부터 선택되는 설페이트 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 이탈기는 포스페이트 또는 포스페이트 에스테르이다. 이러한 일부 구현예들에서, 탈수 제제는 포스포러스 펜톡사이드이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 프로필렌을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 비롯한, 미생물 유기체를 제공하되, 상기 프로필렌 경로는 (1) 7A, 7J, 7R, 7AD 및 7AO; (2) 7A, 7H, 7F, 7R, 7AD 및 7AO; (3) 7A, 7D, 7I, 7R, 7AD 및 7AO; (4) 7A, 7D, 7E, 7F, 7R, 7AD 및 7AO; (5) 7A, 7H, 7Q, 7Z, 7AD 및 7AO; (6) 7A, 7D, 7E, 7Q, 7AD 및 7AO; (7) 7A, 7D, 7P, 7Y, 7Z, 7AD 및 7AO; (8) 7A, 7D, 7P, 7N, 7AD 및 7AO; (9) 7A, 7B, 7X, 7N, 7AD 및 7AO; (10) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7Z, 7AD 및 7AO; (11) 7A, 7H, 7Q, 7V, 7AG 및 7AO; (12) 7A, 7D, 7E, 7Q, 7AC, 7AG 및 7AO; (13) 7A, 7D, 7P, 7Y, 7AC, 7AG 및 7AO; (14) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7AF, 7AG 및 AO; (15) 7A, 7P, 7AB, 7V 및 7AO; (16) 7A, 7B, 7M, 7AD 및 7AO; (17) 7A, 7B, 7L, 7Z, 7AD 및 7AO; (18) 7A, 7B, 7X, 7N, 7AD 및 7AO; (19) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7Z, 7AD 및 7AO; (20) 7A, 7B, 7C, 7U 및 7AO; (21) 7A, 7B, 7C, 7T, 7AG 및 7AO; (22) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7V 및 7AO; (23) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7AF, 7AG 및 7AO; (24) 7A, 7H, 7Q 및 7AR; (25) 7A, 7D, 7E, 7Q 및 7AR; (26) 7A, 7D, 7P, 7Y 및 7AR; (27) 7A, 7B, 7X, 7Y 및 7AR; (28) 7A, 7B, 7L 및 7AR; (29) 7A, 7H, 7Q, 7AC 및 7AQ; (30) 7A, 7D, 7E, 7Q, 7AC 및 7AQ;(31) 7A, 7D, 7P, 7Y, 7AC 및 7AQ; (32) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7AF 및 7AQ; (33) 7A, 7B, 7L, 7AC 및 7AQ; (34) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7AC 및 7AQ; (35) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7AF 및 7AQ; (36) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7AF 및 7AQ; (37) 7A, 7B, 7C, 7T 및 7AQ; (38) 7A, 7H, 7Q, 7AC, 7AN 및 7AK; (39) 7A, 7D, 7E, 7Q, 7AC, 7AN 및 7AK; (40) 7A, 7D, 7P, 7Y, 7AC, 7AN 및 7AK; (41) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7AF, 7AN 및 7AK; (42) 7A, 7D, 7P, 7AB, 7AM, 7AJ 및 7AK; (43) 7A, 7B, 7L, 7AC, 7AN 및 7AK; (44) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7AC, 7AN 및 7AK; (45) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7AF, 7AN 및 7AK; (46) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7AM, 7AJ 및 7AK; (47) 7A, 7B, 7C, 7T, 7AN 및 7AK; (48) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7AF, 7AN 및 7AK; (49) 7A, 7B, 7C, 7AE, 7AM, 7AJ 및 7AK; (50) 7A, 7B, 7C, 7AL, 7AP 및 7AK; (51) 7A, 7B, 7C, 7AL, 7AI, 7AJ 및 7AK; (52) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7V 및 7AO; (53) 7A 7B, 7L, 7AC, 7AG 및 7AO; (54) 7A, 7B, 7X, 7Y, 7AC, 7AC, 7AG 및 7AO; (55) 7A, 7B, 7X, 7AB, 7AF, 7AG 및 7AO; 및 (56) 7A, 7H, 7Q, 7AC, 7AG 및 7AO; (57) 7I, 7R, 7AD 및 7AO; (58) 7E, 7F, 7R, 7AD 및 7AO; (59) 7E, 7Q, 7Z, 7AD 및 7AO; (60) 7P, 7Y, 7Z, 7AD 및 7AO; (61) 7P, 7N, 7AD 및 7AO; (62) 7E, 7Q, 7AC, 7AG 및 7AO; (63) 7P, 7Y, 7AC, 7AG 및 7AO; (64) 7P, 7AB, 7AF, 7AG 및 7AO; (65) 7P, 7AB, 7V 및 7AO; (66) 7E, 7Q 및 7AR; (67) 7P, 7Y 및 7AR; (68) 7E, 7Q, 7AC 및 7AQ; (69) 7P, 7Y, 7AC 및 7AQ; (70) 7P, 7AB, 7AF 및 7AQ; (71) 7E, 7Q, 7AC, 7AN 및 7AK; (72) 7P, 7Y, 7AC, 7AN 및 7AK; (73) 7P, 7AB, 7AF, 7AN 및 7AK; (74) 7P, 7AB, 7AM, 7AJ 및 7AK, (75) 7AS, 7I, 7R, 7AD 및 7AO; (76) 7AS, 7E, 7F, 7R, 7AD 및 7AO; (77) 7AS, 7E, 7Q, 7AD 및 7AO; (78) 7AS, 7P, 7Y, 7Z, 7AD 및 7AO; (79) 7AS, 7P, 7N, 7AD 및 7AO; (80) 7AS, 7E, 7Q, 7AC, 7AG 및 7AO; (81) 7AS, 7P, 7Y, 7AC, 7AG 및 7AO; (82) 7AS, 7P, 7AB, 7AF, 7AG 및 7AO; (83) 7AS, 7E, 7Q 및 7AR; (84) 7AS, 7P, 7Y 및 7AR; (85) 7AS, 7E, 7Q, 7AC 및 7AQ; (86) 7AS, 7P, 7Y, 7AC 및 7AQ; (87) 7AS, 7P, 7AB, 7AF 및 7AQ; (88) 7AS, 7E, 7Q, 7AC, 7AN 및 7AK; (89) 7AS, 7P, 7Y, 7AC, 7AN 및 7AK; (90) 7AS, 7P, 7AB, 7AF, 7AN 및 7AK; 및 (91) 7AS, 7P, 7AB, 7AM, 7AJ 및 7AK로부터 선택되는 도 7에 도시된 경로를 포함하며, 여기서 7A는 3-케토아실-ACP 신타제이고, 7B는 아세토아세틸-ACP 리덕타제이고, 7C는 3-하이드록시부티릴-ACP 데하이드라타제이고, 7D는 아세토아세틸-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7E는 아세토아세틸-CoA 하이드롤라제, 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제 또는 아세토아세틸-CoA 신테타제이고, 7F는 아세토아세테이트 리덕타제 (산 환원)이고, 7H는 아세토아세틸-ACP 티오에스테라제이고, 7I는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (CoA-의존성, 알데하이드 형성)이고, 7J는 아세토아세틸-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7L은 3-하이드록시부티릴-ACP 티오에스테라제이고, 7M은 3-하이드록시부티릴-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7N은 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7P는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7Q는 아세토아세테이트 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7R은 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7S는 4-하이드록시-2-부타논 리덕타제이고, 7T는 크로토닐-ACP 티오에스테라제이고, 7U는 크로토닐-ACP 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7V는 크로토닐-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7X는 3-하이드록시부티릴-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7Y는 3-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 3-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제 또는 3-하이드록시부티릴-CoA 신테타제이고, 7Z는 3-하이드록시부티레이트 리덕타제이고, 7AB는 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제이고, 7AC는 3-하이드록시부티레이트 데하이드라타제이고, 7AD는 3-하이드록시부티르알데하이드 데하이드라타제이고, 7AE는 크로토닐-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7AF는 크로토닐-CoA 하이드롤라제, 크로토닐-CoA 트랜스퍼라제 또는 크로토닐-CoA 신테타제이고, 7AG는 크로토네이트 리덕타제이고, 7AI는 부트릴-CoA:ACP 트랜스퍼라제이고, 7AJ는 부티릴-CoA 트랜스퍼라제, 부티릴-CoA 하이드롤라제 또는 부티릴-CoA 신테타제이고, 7AK는 부티레이트 데카르복실라제이고, 7AL은 크로토닐-ACP 리덕타제이고, 7AM은 크로토닐-CoA 리덕타제이고, 7AN은 크로토네이트 리덕타제이고, 7AO는 크로톤알데하이드 데카르보닐라제이고, 7AP는 부티릴-ACP 티오에스테라제이고, 7AQ는 크로토네이트 데카르복실라제이고, 7AR은 3-하이드록시부티레이트 데카르복실라제이고, 7AS는 아세토아세틸-CoA 신타제이다.
일부 측면들에서, 본 발명은, 미생물 유기체가 프로필렌 경로 효소를 각각 코딩하는 외인성 핵산 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종을 포함하는, 전술한 프로필렌 경로를 구비한, 미생물 유기체를 제공한다. 일부 측면들에서, 미생물 유기체는 전술한 바와 같이 (1)-(91)로부터 선택되는 하나 이상의 경로의 효소 각각을 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 측면들에서, 하나 이상의 외인성 핵산은 이종 핵산이다. 일부 측면들에서, 비-천연성 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성인 배양 배지에 존재한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 프로필렌을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 프로필렌 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체를 제공하되, 상기 프로필렌 경로는 전술한 바와 같은 경로를 포함하며, 추가적으로, (i) 환원적 TCA 경로 효소를 코딩하는, ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는, 환원적 TCA 경로; (ii) 환원적 TCA 경로 효소를 코딩하는, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제, 및 H2 하이드로게나제로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는, 환원적 TCA 경로; 또는 (iii) CO 데하이드로게나제, H2 하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 측면들에서, 전술한 바와 같이 (i)을 구비한 미생물 유기체는, 추가적으로, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 아세틸-CoA 신테타제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 페레독신 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 측면들에서, 전술한 바와 같이 (ii)을 구비한 미생물 유기체는, 추가적으로, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 일부 측면들에서, 전술한 바와 같이 (i)을 구비한 미생물 유기체는, ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제를 코딩하는 4개의 외인성 핵산을 포함하거나; 전술한 바와 같이 (ii)을 구비한 미생물 유기체는, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제, 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 5종의 외인성 핵산을 포함하거나; 또는 (iii)을 구비한 미생물 유기체는, 전술한 바와 같이, CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 2종의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 프로필렌을 생산하기 위한 조건과 충분한 기간 동안 전술한 비-천연성 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는, 프로필렌 제조 방법을 제공한다.
부가적인 구현예에 있어서, 본 발명은, 2-아미노아디페이트를 5-아미노펜타노에이트로, 2-아미노아디페이트를 2-옥소아디페이트로, 5-아미노펜타노에이트를 글루타레이트 세미알데하이드로, 2-옥소아디페이트를 글루타레이트 세미알데하이드로, 2-옥소아디페이트를 글루타릴-CoA로, 글루타릴-CoA를 글루타레이트 세미알데하이드로, 글루타레이트 세미알데하이드를 5-하이드록시발레레이트로, 5-아미노펜타노에이트를 5-아미노펜트-2에노에이트로, 5-아미노펜트-2에노에이트를 5-하이드록시펜트-2-에노에이트로, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트를 5-하이드록시펜트-2-에노에이트로, 5-하이드록시발레레이트를 5-하이드록시펜트-2-에노에이트로, 5-하이드록시발레레이트를 5-하이드록시발레릴-CoA로, 5-하이드록시발레레이트를 3-부텐-1-올로, 5-아미노펜트-2-에노에이트를 2,4-펜타디에노에이트로, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트를 3-부텐-1-올로, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트를 2,4-펜타디에노에이트로, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트를 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA로, 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA를 5-하이드록시펜트-2-에노에이트로, 글루타레이트 세미알데하이드를 5-아미노펜타노에이트로, 2-옥소아디페이트를 2-아미노아디페이트로, 5-하이드록시발레릴-CoA를 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA로, 5-하이드록시발레릴-CoA를 2,4-펜타디에노일-CoA로, 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA를 2,4-펜타디에노일-CoA로, 2,4-펜타디에노일-CoA를 2,4-펜타디에노에이트로, 2,4-펜타디에노에이트를 부타디엔으로, 3-부텐-1-올을 부타디엔으로, 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로, 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로, 3-하이드록시부티릴-CoA를 크로토닐-CoA로, 크로토닐-CoA, 글루타릴-CoA, 프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA를 3-옥소펜타노일-CoA로, 프로피오닐-CoA 및 말로닐-CoA를 3-옥소펜타노일-CoA로, 3-옥소펜타노일-CoA를 3-하이드록시펜타노일-CoA로, 3-하이드록시펜타노일-CoA를 펜트-2-o노일-CoA로, 펜트-2-o노일-CoA를 펜트-3-에노일-CoA로, 펜트-3-에노일-CoA를 2,4-펜타디에노일-CoA로, 3-하이드록시프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA를 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA로, 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA를 3-옥소-5-하이드록시펜타노에이트로, 3-옥소-5-하이드록시펜타노에이트를 3-옥소부탄올로, 3-옥소부탄올을 1,3-부탄디올로, 피루베이트 및 아세트알데하이드를 4-하이드록시-2-옥소발레레이트로, 4-하이드록시-2-옥소발레레이트를 2-옥소펜테노에이트로, 2-옥소펜테노에이트를 3-부텐-1-알로, 3-부텐-1-알을 3-부텐-1-올로, 4-하이드록시-2-옥소발레레이트를 3-하이드록시부티릴-CoA로, 4-하이드록시-2-옥소발레레이트를 3-하이드록시부타날로, 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부타날로, 3-하이드록시부타날을 1,3-부탄디올로, 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티레이트로, 3-하이드록시부티레이트를 3-하이드록시부타날로, 3-하이드록시부티릴-CoA를 1,3-부탄디올로, 2,4-펜타디에노에이트를 2,4-펜타디에노일-CoA로, 2,4-펜타디에노에이트를 펜타-2,4-디에날로, 펜타-2,4-디에날을 부타디엔로, 2,4-펜타디에노에이트를 2,4-펜타디에노일-포스페이트로, 2,4-펜타디에노일-포스페이트를 펜타-2,4-디에날로, 2,4-펜타디에노일-CoA를 2,4-펜타디에노일-포스페이트로, 2,4-펜타디에노일-CoA를 펜타-2,4-디에날로, 말로닐-ACP 및 아세틸-CoA 또는 아세틸-ACP를 아세토아세틸-ACP로, 아세토아세틸-ACP를 3-하이드록시부티릴-ACP로, 3-하이드록시부티릴-ACP를 크로토닐-ACP로, 아세토아세틸-ACP를 아세토아세틸-CoA로, 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로, 아세토아세틸-CoA를 아세토아세테이트로, 아세토아세테이트를 3-옥소부티르알데하이드로, 3-옥소부티르알데하이드를 4-하이드록시-2-부타논으로, 아세토아세틸-ACP를 아세토아세테이트로, 아세토아세틸-CoA를 3-옥소부티르알데하이드로, 아세토아세틸-ACP를 3-옥소부티르알데하이드로, 아세토아세틸-CoA를 4-하이드록시-2-부타논으로, 3-하이드록시부티릴-ACP를 3-하이드록시부티레이트로, 3-하이드록시부티릴-ACP를 3-하이드록시부티르알데하이드로, 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티르알데하이드로, 3-하이드록시부티릴-CoA를 1,3-부탄디올로, 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로, 아세토아세테이트를 3-하이드록시부티레이트로, 3-옥소부티르알데하이드를 3-하이드록시부티르알데하이드로, 4-하이드록시-2-부타논을 1,3-부탄디올로, 크로토닐-ACP를 크로토네이트로, 크로토닐-ACP를 크로톤알데하이드로, 크로토닐-CoA를 크로톤알데하이드로, 크로토닐-CoA를 크로틸 알코올로, 3-하이드록시부티릴-ACP를 3-하이드록시부티릴-CoA로, 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티레이트로, 3-하이드록시부티레이트를 3-하이드록시부티르알데하이드로, 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-부탄디올로, 3-하이드록시부티릴-CoA를 크로토닐-CoA로, 3-하이드록시부티레이트를 크로토네이트로, 3-하이드록시부티르알데하이드를 크로톤알데하이드로, 크로토닐-ACP를 크로토닐-CoA로, 크로토닐-CoA를 크로토네이트로, 크로토네이트를 크로톤알데하이드로, 크로톤알데하이드를 크로틸 알코올로, 부티릴-ACP를 부티릴-CoA로, 부티릴-CoA를 부티레이트로, 부티레이트를 프로필렌으로, 크로토닐-ACP를 부티릴-ACP로, 크로토닐-CoA를 부티릴-CoA로, 크로토네이트를 부티레이트로, 크로톤알데하이드를 프로필렌으로, 부티릴-ACP를 부티레이트로, 크로토네이트를 프로필렌으로, 3-하이드록시부티레이트를 프로필렌으로, 크로틸 알코올을 2-부테닐-4-포스페이트로, 2-부테닐-4-포스페이트를 2-부테닐-4-디포스페이트로, 크로틸 알코올을 2-부테닐-4-디포스페이트 및 2-부테닐-4-디포스페이트를 부타디엔으로 변환하는 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기질을 산물로 변환하는 효소 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체를 제공한다. 당해 기술 분야의 당업자는, 이는 예에 불과하며, 바람직한 산물을 생산하는데 적합하며 적정 활성을 기질을 산물로 변환하는데 이용가능한, 본원에 기술된 기질-산물의 임의 쌍을, 본원에 기술된 내용을 기초로 당해 기술 분야의 당업자라면 쉽게 결정할 수 있을 것으로 이해될 것이다. 즉, 본 발명은, 효소 또는 단백질이 도 1-7 및 12에 나타낸 바와 같이, 기질을 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 산물을 변환하는, 상기 효소 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연성 미생물 유기체를 제공한다.
본원에 일반적으로 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 포함하는 미생물 유기체로서 기술되지만, 본 발명은, 부가적으로, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체를 제공하는 것으로 이해된다. 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로는 도 1-7 및 12에 예시된다. 따라서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 포함하는 미생물 유기체와 더불어, 본 발명은 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연성 미생물 유기체를 제공하되, 이 미생물 유기체는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물, 예컨대, 5-아미노펜트-2-에노에이트, 글루타레이트 세미알데하이드, 5-하이드록시발레레이트, 5-하이드록시발레릴-CoA, 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA, 2,4-펜타디에노일-CoA, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트, 아세토아세틸-CoA, 3-하이드록시부티릴-CoA, 크로토일-CoA, 글루타릴-CoA, 3-옥소펜타노일-CoA, 3-하이드록시펜타노일-CoA, 펜트-2-에노일-CoA, 펜트-3-에노일-CoA, 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA, 3-옥소-5-하이드록시펜타노에이트, 3-옥소부탄올, 4-하이드록시-2-옥소발레레이트, 2-옥소펜테노에이트, 3-부텐-1-알, 3-하이드록시부티릴-CoA, 3-하이드록시부티레이트, 3-하이드록시부타날, 2,4-펜타디에노일-포스페이트, 펜타-2,4-디에날, 아세토아세틸-ACP, 아세토아세틸-CoA, 아세토아세테이트, 3-옥소부티르알데하이드, 4-하이드록시-2-부타논, 3-하이드록시부티릴-ACP, 3-하이드록시부티릴-CoA, 3-하이드록시부티레이트, 3-하이드록시부티르알데하이드, 크로토닐-ACP, 크로토닐-CoA, 크로토네이트, 크로톤알데하이드, 부티릴-ACP, 부티릴-CoA, 부티레이트, 2-부테닐-4-포스페이트, or 2-부테닐-4-디포스페이트를 생산한다.
실시예에 기술되고, 도 1-9 및 12의 경로 등의 도면들에서 예시된 바와 같이, 본원에 기술된 임의의 경로를 활용하여, 원하는 임의의 경로 중간 산물 또는 산물을 생산하는 비-천연성 미생물 유기체를 제조할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 중간 산물을 생산하는 그러한 미생물 유기체는 원하는 산물을 생산하기 위해 하류 경로 효소를 발현하는 다른 미생물 유기체와 조합하여 사용할 수 있다. 그러나, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로 중간 산물을 생산하는 비-천연성 미생물 유기체를 이용하여, 원하는 산물로서 상기 중간 산물을 생산할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명은, 대사 반응, 반응체 또는 그 산물을 일반적으로 참조하거나, 또는 언급된 대사 반응, 반응체 또는 산물과 연관된 효소, 촉매하는 효소, 또는 연관된 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 유전자를 구체적으로 참조하여 기술된다. 본원에 명확하게 언급되어 있지 않은 한, 당해 기술 분야의 당업자는 반응에 대한 언급이 반응체 및 반응의 산물에 대한 언급으로 구성됨을 이해할 것이다. 마찬가지로, 본원에서 명확하게 언급되지 않은 한, 반응체 또는 산물에 대한 언급은 또한 반응을 지칭하며, 이들 대사적 구성 요소들 중 임의의 것에 대한 언급 역시 언급된 반응, 반응체 또는 산물을 촉매하는 효소 또는 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자들을 지칭한다. 이와 같이, 잘 알려진 대사적 생화학, 효소학 및 게놈학 분야에서 본다면, 유전자 또는 코딩 핵산에 대한 본원의 언급은 대응되는 코딩된 효소와 이를 촉매하는 반응 또는 반응과 관련된 단백질 뿐만 아니라 반응의 반응체 및 산물에 대한 언급을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 산물, 2,4-펜타디에노에이트와 중간 산물, 5-아미노펜타노에이트, 5-아미노펜트-2-에노에이트, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트, 5-하이드록시발레레이트, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트, 3-옥소-5-하이드록시펜타노에이트, 3-하이드록시부티레이트, 4-하이드록시-2-엑소발레레이트, 2-옥소펜테노에이트, 아세토아세테이트, 크로토네이트, 부티레이트, 뿐만 아니라 기타 중간 산물은, 카르복시산이며, 완전히 양성자화된 형태, 부분 양성자화된 형태 및 완전히 탈양성자화된 형태 등의 다양한 이온화된 형태로 발생할 수 있다. 이에, 접미사 "-에이트" 또는 산 형태는 호환적으로 사용되며, 이온화된 형태는 화합물이 발견되는 pH에 따라 결정되는 것으로 알려져 있어, 유리 산 형태와 특히 임의의 탈양성자화된 형태 둘다를 나타낼 수 있다. 카르복실레이트 산물 또는 중간 산물은 O-카르복실레이트 및 S-카르복실레이트 에스테르와 같은 카르복실레이트 산물의 에스테르 형태 또는 경로 중간 산물을 포함하는 것으로 이해된다. O-카르복실레이트 및 S-카르복실레이트는, C1 - C6의 분지쇄 또는 직쇄 카르복실레이트인 저급 알킬을 포함할 수 있다. 이러한 O-카르복실레이트 또는 S-카르복실레이트의 일부로는, 비제한적인 예로, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, i-프로필, sec-부틸 및 tert-부틸, 펜틸, 헥실 O- 또는 S-카르복실레이트를 포함하며, 이들 모두 추가로 불포화될 수 있으며, 예로, 프로페닐, 부테닐, 펜틸 및 헥세닐 O- 또는 S-카르복실레이트를 포함한다. O-카르복실레이트는 생합성 경로의 산물일 수 있다. 생합성 경로를 통해 입수되는 O-카르복실레이트로는, 비제한적인 예로, 메틸 2,4-펜타디에노에이트, 에틸 2,4-펜타디에노에이트, 및 n-프로필 2,4-펜타디에노에이트를 포함할 수 있다. 그외 생합성에 의해 입수가능한 O-카르복실레이트로는, C7-C22인 중쇄 - 장쇄기, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 라우릴, 트리데실, 미리스틸, 펜타데실, 세틸, 팔미톨릴, 헵타데실, 스테아릴, 노나데실, 아라키딜, 헤네이코실 및 베헤닐 알코올과 같은 지방 알코올로부터 유래된 O-카르복실레이트 에스테르를 포함할 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 선택적으로 분지화되거나 및/또는 불포화를 포함할 수 있다. O-카르복실레이트 에스테르는, 또한, 유리 카르복시산 산물의 에스테르화 또는 O- 또는 S-카르복실레이트의 트랜스에스테르화 등의, 생화학적 과정 또는 화학적 과정을 통해 입수할 수 있다. S-카르복실레이트는 CoA S-에스테르, 시스테이닐 S-에스테르, 알킬티오에스테르 및 다양한 아릴 및 헤테로아릴 티오에스테르로 예시된다. 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체는, 하나 이상의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로에 참여하는 하나 이상의 효소 또는 단백질을 코딩하는 발현가능한 핵산을 도입함으로써, 제조할 수 있다. 생합성용으로 선택된 숙주 미생물 유기체에 따라, 특정 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로의 일부 또는 전체에 대한 핵산들을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 선택한 숙주에 원하는 생합성 경로에서 하나 이상의 효소 또는 단백질이 결핍된 경우, 결핍된 효소(들) 또는 단백질(들)에 대한 발현가능한 핵산을 이후 외인성 발현을 위해 숙주에 도입한다. 다른 예로서, 선택한 숙주가 일부 경로 유전자들을 내인성 발현하지만 다른 유전자들은 결핍된 경우, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성을 달성하기 위해서는 결핍된 효소(들) 또는 단백질(들)에 대한 코딩 핵산이 필요하다. 따라서, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체는 원하는 생합성 경로를 획득하기 위해 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입함으로써 제조하거나, 또는 원하는 생합성 경로는, 하나 이상의 내인성 효소 또는 단백질과 함께, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올과 같은 원하는 산물을 생산하는, 하나 이상의 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입함으로써, 획득할 수 있다.
숙주 미생물 유기체는, 예컨대 세균, 효모, 진균 또는 발효 공정이 적용가능한 기타 다양한 미생물들 중 임의의 미생물로부터 선택할 수 있으며, 비천연 미생물 유기체는 이들로부터 제조될 수 있다. 세균의 예로는, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 안에어로비오스피릴룸 숙시니시프로두센스 (Anaerobiospirillum succiniciproducens), 액티노바실러스 숙시노게네스 (Actinobacillus succinogenes), 만하이미아 숙시니시프로두센스 (Mannheimia succiniciproducens), 리조비움 에틀리 (Rhizobium etli), 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum), 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator), 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans), 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 락토바실러스 플라타룸 (Lactobacillus plantarum), 스트렙토마이세스 코엘리콜러 (Streptomyces coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리컴 (Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) 및 슈도모나스 푸티타 (Pseudomonas putida)로부터 선택되는 종을 포함한다. 효모 또는 진균의 예로는, 사카로마이세스 세레비지애, 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 클루베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus) 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 피키아 패스토리스 (Pichia pastoris), 리조푸스 아리주스 (Rhizopus arrhizus), 리조부스 오리제 (Rhizobus oryzae), 야오이와 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 등으로부터 선택되는 종을 포함한다. 에스케리키아 콜라이는 유전자 조작에 적합한 잘 특정화된 미생물이기 때문에, 특히 유용한 숙주 미생물이다. 그외 특히 유용한 숙주 유기체는 사카로마이세스 세레비지애와 같은 효모이다. 임의의 적합한 미생물 숙주 유기체를 사용하여, 원하는 산물을 생산하도록 대사성 및/또는 유전자 변형을 도입할 수 있는 것으로 이해된다.
선택된 숙주 미생물 유기체의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로의 구성 요소들에 따라, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체는, 하나 이상의 외인성으로 발현되는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 코딩하는 핵산, 최대 하나 이상의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로를 코딩하는 전체 핵산들을 포함할 것이다. 예컨대, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성은, 대응되는 코딩 핵산의 외인성 발현을 통해 경로 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에서 확립할 수 있다. 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 효소 또는 단백질들이 모두 결핍된 숙주인 경우, 상기 경로의 전체 효소 또는 단백질의 외인성 발현이 포함될 수 있지만, 경로의 전체 효소 또는 단백질을 숙주가 하나 이상의 경로 효소 또는 단백질을 포함하더라도 발현시킬 수 있는 것으로 이해된다. 예컨대, 부타디엔을 생산하는 경로의 전체 효소 또는 단백질, 예를 들면, 글루타릴-CoA 리덕타제, 글루타레이트 세미알데하이드 리덕타제, 5-하이드록시발레릴-CoA 트랜스퍼라제 및/또는 신테타제, 5-하이드록시발레릴-CoA 데하이드라타제/데하이드로게나제, 2,4-펜타디에노일-CoA 트랜스퍼라제, 신테타제 또는 하이드롤라제 및 2,4-펜타디에노에이트 데카르복실라제 등의, 외인성 발현도 포함될 수 있다. 다른 예로, 1,3-부탄디올을 생산하는 경로의 전체 효소 또는 단백질, 예를 들어, 3-케토아실-ACP 신타제, 아세토아세틸-ACP 리덕타제, 3-하이드록시부티릴-CoA:ACP 트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제, 3-하이드록시부티레이트 리덕타제 및 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제의 외인성 발현도 포함될 수 있다. 또 다른 예로, 크로틸-알코올을 생산하는 경로의 전체 효소 또는 단백질, 예를 들어, 3-케토아실-ACP 신타제, 아세토아세틸-ACP 리덕타제, 3-하이드록시부티릴-ACP 데하이드라타제, 크로토닐-CoA:ACP 트랜스퍼라제, 크로토닐-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제, 크로토네이트 리덕타제 및 크로톤알데하이드 리덕타제의 외인성 발현도 포함될 수 있다.
본원에 제공되는 교시 및 지침 하에, 당해 기술 분야의 당업자라면, 발현가능한 형태로 도입되는 코딩 핵산의 수가, 적어도, 선택된 숙주 미생물 유기체의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 결핍과 대응됨을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체는, 본원에 기술된 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로를 구성하는 효소 또는 단백질을 코딩하는 핵산을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11종, 최대 전부를 구비할 수 있다. 일부 구현예에서, 또한, 비-천연성 미생물 유기체는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성을 촉진시키거나 최적화하는, 또는 숙주 미생물 유기체에 다른 유용한 기능을 부여하는, 다른 유전적 변형을 포함할 수도 있다. 이러한 다른 기능성으로, 예컨대, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 하나 이상의 전구체, 예컨대 2-아미노아디페이트, 5-아미노펜타노에이트, 2-옥소아디페이트, 글루타릴-CoA, 프로피오닐-CoA, 아세틸-CoA, 말로닐-CoA, 3-하이드록시프로피오닐-CoA, 말로닐-ACP 또는 피루베이트의 합성 증대를 포함할 수 있다.
일반적으로, 숙주 미생물 유기체는, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 전구체를, 자연적으로 생산되는 분자로서 또는 숙주 미생물 유기체에 의해 자연적으로 생산되는 전구체의 생산 증가 또는 원하는 전구체의 데 노보 생산을 제공하는 조작된 산물로서 생산하도록, 선택된다. 예를 들어, 2-아미노아디페이트, 5-아미노펜타노에이트, 2-옥소아디페이트, 글루타릴-CoA, 프로피오닐-CoA, 아세틸-CoA, 말로닐-CoA, 3-하이드록시프로피오닐-CoA, 피루베이트 또는 말로닐-ACP는 에스케리키아 콜라이와 같은 숙주 유기체에서 천연적으로 생산된다. 숙주 유기체는, 본원에 기술된 바와 같이, 전구체의 생산을 증가시키도록 조작될 수 있다. 또한, 원하는 전구체를 생산하도록 조작된 미생물 유기체를 숙주 유기체로 사용할 수 있으며, 또한 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 효소 또는 단백질을 발현하도록 추가로 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체는, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 합성하기 위한 효소적 역량을 포함하는 숙주로부터 제조된다. 이러한 구체적인 구현예에서, 이 유기체는, 예컨대 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하는 방향으로 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로 반응을 진행시키도록, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로 산물의 합성 또는 축적을 높이는데 유용할 수 있다. 합성 또는 축적의 증가는, 예컨대, 전술한 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 효소 또는 단백질들 중 하나 이상을 코딩하는 핵산의 과다발현에 의해 달성될 수 있다. 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 효소 또는 효소들 및/또는 단백질 또는 단백질들의 과다 발현은, 예컨대 내인성 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해, 또는 이종의 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해, 이루어질 수 있다. 따라서, 천연 유기체는, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11종, 즉 최대 전체 핵산의 과다 발현을 통해, 예컨대 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하는 비-천연성 미생물 유기체로, 쉽게 제조할 수 있다. 또한, 비-천연성 유기체는, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로에서 효소의 활성을 증가시키게 되는, 내인성 유전자의 돌연변이 유발에 의해, 제조할 수 있다.
특히 유용한 구현예에서, 코딩 핵산의 외인성 발현이 적용된한다. 외인성 발현은 숙주 및 용도에 맞게, 사용자에 의해 조절되는 바람직한 발현 수준을 달성하도록 발현 및/또는 조절 인자를 맞춤식으로 조절하는 능력을 부여한다. 그러나, 또한, 내인성 발현은, 다른 구현예에서, 유도성 프로모터나 다른 조절 인자에 연결되었을 때, 부정적인 조절 작동자의 제거 또는 유전자의 프로모터 도입 등에 의해서와 같이, 이용할 수 있다. 따라서, 천연적인 유도성 프로모터를 가진 내인성 유전자는, 적정 유도제를 제공함으로써, 상향-조절시킬 수 있거나, 또는 내인성 유전자의 조절 부위를 유도성 조절 인자가 병합되도록 조작하여, 원하는 시기에 내인성 유전자의 발현이 증가되도록 조절할 수 있다. 마찬가지로, 유도성 프로모터를 비-천연성 미생물 유기체에 도입되는 외인성 유전자에 대한 조절 요소로서 포함시킬 수 있다.
본 발명의 방법에서, 하나 이상의 외인성 핵산들 중 임의의 핵산을 미생물 유기체에 도입하여 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체를 제조할 수 있는 것으로 이해된다. 핵산을, 미생물 유기체에, 예컨대 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로를 부여하도록 도입시킬 수 있다. 다른 예로서, 코딩 핵산을 도입하여, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 능력을 부여하는데 필요한 반응들 중 일부를 촉매하는 생합성 능력을 가진 중간 미생물 유기체를 제조할 수 있다. 예컨대, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는, 바람직한 효소 또는 단백질을 코딩하는 2 이상의 외인성 핵산을 포함할 수 있으며, 예를 들어 5-하이드록시펜타노일-CoA 데하이드로게나제와 2,4-펜타디에노일-CoA 트랜스퍼라제의 조합, 또는 다른 예로서 5-아미노펜타노에이트 리덕타제와 5-아미노펜트-2-에노에이트 데아미나제의 조합, 또는 다른 예로서 2,4-펜타디에노에이트 데카르복실라제와 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제의 조합, 또는 다른 예로서 3-옥소펜타노일-CoA 리덕타제와 2,4-펜타디에노일-CoA 하이드롤라제의 조합, 또는 다른 예로서 4-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제와 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알코올 형성)의 조합, 또는 다른 예로서 3-하이드록시부티레이트 리덕타제와 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제의 조합 등을 포함할 수 있다. 따라서, 생합성 경로의 2 이상의 효소 또는 단백질의 임의 조합이 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 생합성 경로의 3개 이상의 효소 또는 단백질의 임의 조합이, 원하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 대응되는 원하는 산물의 생산으로 귀결되는 한, 예컨대, 필요에 따라, 5-하이드록시발레레이트 데하이드로게나제, 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 트랜스퍼라제 및 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 데하이드라타제, 또는 다른 예로 펜타-2,4-디에날데카르보닐라제, 2,4-펜타디에노일-CoA 리덕타제 (산 환원) 및 5-하이드록시발레릴-CoA 데하이드라타제/데하이드로게나제, 또는 다른 예로서 2-옥소펜테노에이트 데카르복실라제, 3-부텐-1-알 리덕타제 및 3-부텐-1-올 데하이드라타제, 또는 다른 예로서 크로톤알데하이드 리덕타제, 크로토네이트 리덕타제 및 크로토닐-CoA 하이드롤라제 등의 조합이, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 생합성 경로의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11종 이상의 효소 또는 단백질의 임의 조합이, 원하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 대응되는 원하는 산물의 생산으로 귀결되는 한, 필요에 따라, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체에 포함될 수 있다.
본원에 기술된 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 생합성 외에도, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체 및 방법은, 또한, 다른 경로들에 의한 산물의 생합성을 달성하기 위해, 서로간의 다양한 조합으로, 그리고 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 다른 미생물 유기체 및 방법들과의 다양한 조합으로 이용할 수 있다. 예를 들어, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생산체를 이용하는 것 이외의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하는 다른 방법은, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물을 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올로 변환시킬 수 있는 다른 미생물 유기체를 추가하는 것이다. 이러한 방법으로는, 예컨대 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물을 생산하는 미생물 유기체의 발효를 포함한다. 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물은 그런 후 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물을 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올로 변환하는 2번째 미생물에 대한 기질로서 사용할 수 있다. 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물은, 제2 유기체의 다른 배양물에 직접 첨가할 수 있거나, 또는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물 생산체의 오리지날 배양물을, 예컨대 세포 분리에 의해 이들 미생물 유기체를 제거한 다음, 발효 브로스에 제2 유기체를 첨가하여, 중간 정제 단계 없이 최종 산물을 생산할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체 및 방법은, 예컨대, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 생합성을 달성하기 위해, 매우 다양한 서브경로들로 조합될 수 있다. 이들 구현예에서, 본 발명의 바람직한 산물의 생합성 경로들을 여러가지 미생물 유기체들에 분산시키고, 이 여러가지 미생물 유기체를 공-배양하여 최종 산물을 생산할 수 있다. 이러한 생합성 공정에서, 한가지 미생물 유기체의 산물은 최종 산물이 합성될 때 까지 2번째 유기체의 기질이다. 예컨대, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 생합성은, 한가지 경로의 중간 산물을 다른 경로의 중간 산물 또는 산물로의 변환시키기 위한 생합성 경로를 구비한 미생물 유기체를 구축함으로써 달성할 수 있다. 다른 예로서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올은, 또한, 동일 용기에서 2가지 유기체, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 중간 산물을 생산하는 1번째 미생물 유기체와 상기 중간 산물을 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올로 변환시키는 2번째 미생물 유기체를 이용하여 공-배양 또는 공-발효시킴으로써, 미생물 유기체로부터 생합성 방법으로 생산할 수 있다.
본원에 제시된 교시 및 지침을 감안하여, 당해 기술 분야의 당업자라면, 다른 미생물 유기체, 서브경로를 구비한 다른 비-천연성 미생물 유기체들의 공-배양, 및 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하기 위한 당해 기술 분야에 잘 공지된 다른 화학 공정 및/또는 생화학 공정의 조합과 더불어, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체 및 방법에 대해, 매우 다양한 조합 및 변경이 존재함을 이해할 것이다.
2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로 효소 또는 단백질의 코딩 핵산의 소스는, 예컨대, 상기 코딩된 유전자 산물이 언급된 반응을 촉매할 수 있는 임의의 종을 포함할 수 있다. 이러한 종으로는, 비제한적으로, 고세균 및 유박테리아를 비롯한 박테리아, 및 효모, 식물, 곤충, 동물 및 인간을 포함한 포유류를 비롯한 진핵생물 등의, 원핵 생물 및 진핵 생물 둘다를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 이러한 소스의 예시적인 종으로는, 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 아세토박터 아세티 (Acetobacter aceti), 아세토박터 파스페리안스 (Acetobacter pasteurians), 아크로모박터 데니트리피칸스 (Achromobacter denitrificans), 액시드아미노코커스 퍼멘탄스 (Acidaminococcus fermentans), 액시네토박터 바우마니이 (Acinetobacter baumanii), 액시네토박터 베일리이 (Acinetobacter baylyi), 액시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus), 액시네토박터 sp. ADP1 액시네토박터 sp. Strain M-1, 액티노바실러스 숙시노게네스 (Actinobacillus Succinogenes), 아시르토시폰 피숨 (Acyrthosiphon pisum), 에어로피룸 퍼닉스 (Aeropyrum pernix), 아그로박테리움 투메팩시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 알로크로마티움 비노숨 (Allochromatium vinosum) DSM 180, 아나바에나 베리어빌리스 (Anabaena variabilis), 안에어로바이오스피릴룸 숙시니시프로두센스 (Anaerobiospirillum Succinciproducens), 안에어로스티페스 카카이 (Anaerostipes caccae) DSM 14662, 안에어로트룬쿠스 콜리호미니스 (Anaerotruncus colihominis), 안테라이아 야마마이 (Antheraea yamamai), 에퀴펙스 에어올리쿠스 (Aquifex aeolicus), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 아르카에글로부스 풀기두스(Archaeglobus fulgidus), 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 아로마톨레움 아로마티쿰 (Aromatoleum aromaticum) EbN1, 아스카리 숨 (Ascaris suum), 아스카리우스 숨 (Ascarius suum), 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리제 (Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus) NIH2624, 아조아르쿠스 (Azoarcus) sp. CIB, 아조아르쿠스 sp. T, 아조토박터 비넬란디이 (Azotobacter vinelandii) DJ, 아나바에나 베리어빌리스 (Anabaena variabilis), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실러스 아밀로리퀘팩시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 코아후일렌시스 (Bacillus coahuilensis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 슈도피르무스 (Bacillus pseudofirmus), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실러스 스페어리쿠스 (Bacillus sphaericus), 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 박테로이데스 카필로수스 (Bacteroides capillosus), 발네아리움 리소트로피쿰 (Balnearium lithotrophicum), 보스 타우루스 (Bos taurus), 브래디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum), 브래디리조비움 자포니쿰 USDA110, 브라시카 나프수스 (Brassica napsus), 버크홀데리아 암비파리아 (Burkholderia ambifaria) AMMD, 버크홀데리아 피마툼 (Burkholderia phymatum), 버크홀데리아 제노보란스 (Burkholderia xenovorans), 부티레이트 생산 세균 L2-50, 부티레이트 생산 세균 L2-50, 부티레이트 생산 세균 SS3/4, 캄필로박터 쿠르부스 (Campylobacter curvus) 525.92, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 파랍실로시스 (Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스 (Carboxydothermus hydrgenoformans), 클라미도모나스 라인하르드티이 (Chlamydomonas reinhardtii), 클로로비움 리미콜라 (chlorobium limicola), 클로로비움 페어오박테로이데스 (chlorobium phaeobacteroides) DSM 266, 클로로비움 테피둠 (chlorobium tepidum), 클로로비움 테피둠 (chlorobium tepidum), 클로로플렉수스 아우란티아쿠스 (chloroflexus aurantiacus), 시트로박터 아말로나티쿠스 (Citrobacter amalonaticus), 시트로박터 윤게이 (Citrobacter youngae) ATCC 29220, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 아미노부티리쿰 (Clostridium aminobutyricum), 클로스트리듐 베이예린스키 (Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 베이예린스키 NRRL B593, 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리듐 보툴리눔 A3 str, 클로스트리듐 보툴리눔 C str. Eklund, 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) P7, 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7, 클로스트리듐 셀룰롤리티쿰 (Clostridium cellulolyticum) H10, 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 클루이베리 DSM 555, 클로스트리듐 노비이(Clostridium novyi) NT, 클로스트리듐 파스테우리아눔 (Clostridium pasteurianum), 클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 (Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 sp. SS2/1, 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 클로스트리듐 테타노모르품 (Clostridium tetanomorphum), 클로스트리듐 티로부티리쿰 (Clostridium tyrobutyricum), 코마모나스 (Comamonas) sp. CNB-1, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 글루타니쿰 (Corynebacterium glutanicum), 쿠쿠미스 사티부스 (Cucumis sativus), 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator), 쿠프리아비두스 타이바넨시스 (Cupriavidus taiwanensis), 시아노비움 (Cyanobium) PCC7001, 데설포비브리오 아프리카누스 (Desulfovibrio africanus), 데설포비브리오 데설푸리칸스 (DesulfoVibrio desulfuricans) G20, 데설포비브리오 데설푸리칸스 subsp. 데설푸리칸스 str. ATCC 27774, 데설포비브리오 프럭토소보란스 (Desulfovibrio fructosovorans) JJ, 데설포비브리오 불가리스 str. 힐덴보러프 ( Desulfovibrio vulgaris str. Hildenborough), 딕티오스텔리움 디스코이데움 (Dictyostelium discoideum) AX4, 드로소필라 멜라노가스테르 (Drosophila melanogaster), 엘리자베스킹기아 메닌고셉티카 (Elizabethkingia meningoseptica), 에리트로박터 (Erythrobacter) sp. NAP1, 에스케리키아 콜라이 C, 에스케리키아 콜라이 K12, 에스케리키아 콜라이 K12 subsp. MG1655, 에스케리키아 콜라이 O157:H7 str. Sakai, 에스케리키아 콜라이 str. K-12 substr. MG1655, 에스케리키아 콜라이 W, 유박테리움 바르케리 (Eubacterium barkeri), 유박테리움 렉탈 (Eubacterium rectale) ATCC 33656, 유박테리움 유리이 (Eubacterium yurii), 유글레나 그라실리스 (Euglena gracilis), 플라보박테리움 루테스센스 (Flavobacterium lutescens), 푸조박테리움 고니디아포르만스 (Fusobacterium gonidiaformans), 푸조박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 지오바실러스 스테아로서모필루스 (Geobacillus stearothermophilus), 지오바실러스 서모글루코시다시우스 (Geobacillus thermoglucosidasius), 지오박터 메탈리레두센스 (Geobacter metallireducens) GS-15, 지오박터 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens), 지베렐라 지에이 (Gibberella zeae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 할로아르쿨라 마리스모르투이 (Haloarcula marismortui), 할로바실러스 다바넨시스 (Halobacillus dabanensis), 할로박테리움 살리나룸 (Halobacterium salinarum), 할로페락스 메디테라네이 (Haloferax mediterranei), 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori), 헬리코박터 필로리 26695, 헬리코베르파 지아 (Helicoverpa zea), 헬리코박터 필로리, 호모사피엔스 (Homo sapiens), 하이드로게노박터 서포밀루스 (Hydrogenobacter thermophilus), 제오트갈리코커스 (Jeotgalicoccus) sp. ATCC8456 , 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia,) 클렙시엘라 뉴모니아, 클루베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 코쿠리아 로지아 (Kocuria rosea), 락토바실러스 플라나룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 sp. 30a, 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 루코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides), 마크로코커스 카세올리티쿠스 (Macrococcus caseolyticus), 만하이미아 숙시니시프로두센스 (Mannheimia succiniciproducens), 마린 감마 프로테오박테리움 (marine gamma proteobacterium) HTCC2080, 마리노코커스 할로필러스 (Marinococcus Halophilus), 마리노모나스 메디테라니아 (Marinomonas mediterranea), 메디카고 트룬카툴라 (Medicago truncatula), 메조리조비움 로티 (Mesorhizobium loti), 메탈로스페라 세둘라 (Metallosphaera sedula), 메타노칼도코커스 야나치이 (Methanocaldococcus jannaschii), 메타노사르시나 서모필라 (Methanosarcina thermophila), 메타노서모박터 서마우토트로피쿠스 (Methanothermobacter thermautotropicus), 메틸박테리움 엑스토르쿠엔스 (methylobacterium extorquens), 모렐라 서모아세티카 (Moorella thermoacetica), 무스 무스쿨루스 (Mus musculus), 무스카 도메스티카 (Musca domestica), 미코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 미코박테리움 아비움 subsp. 파라투베르쿨로시스 (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) K-10, 미코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 (Mycobacterium avium subsp. Pratuberculosis), 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis) BCG, 미코박테리움 마리눔 (Mycobacterium marinum) M, 미코박테리움 스메그마티스 (Mycobacterium smegmatis), 미코박테리움 스미그마티스 MC2 155, 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 나트란에이로비우스 서모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 네오사르토르야 피셰리 (Neosartorya fischeri), 니코티아나 글루티노사 (Nicotiana glutinosa), 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum), 노크리디아 파르시니아 (Nocardia farcinica) IFM 10152, 노카르디아 아이오웬시스 (Nocardia iowensis), 노스톡 (Nostoc) sp. PCC 7120, 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 (Oryctolagus cuniculus), 오리자 사티바 (Oryza sativa), 파라코커스 데니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans), 페디코커스 펜토사세우스 (Pedicoccus pentosaceus), 펠로박터 카르비놀리쿠스 (Pelobacter carbinolicus) DSM 2380, 펠로토마쿨룸 서모프로피오니쿰 (Pelotomaculum thermopropionicum), 페니실리움 크리소게눔 (Penicillium chrysogenum), 펩토니필루스 하레이 (Peptoniphilus harei), 피키아 스티피티스 (Pichia stipitis), 포르피로모나스 깅기발리스 (Porphyromonas gingivalis), 슈도알테로마노사 투니카트 (Pseudoalteromonas tunicate), 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) PAO1, 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 플루오레센스 KU-7, 슈도모나스 플루오레센스 Pf-5, 슈도모나스 크낙쿠시이 (Pseudomonas knackmussii) (B13), 슈도모나스 멘도시나 (Pseudomonas mendocina), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 슈도모나스 푸티다 KT2440, 슈도모나스 레이네케이 (Pseudomonas reinekei) MT1, 슈도모나스 sp, 슈도모나스 sp. CF600, 슈도모나스 sp. CF600, 슈도모나스 sp. CF600, 슈도모나스 sp. strain B13, 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri), 슈도라미박터 알락톨리티쿠스 (Pseudoramibacter alactolyticus), 피크로플렉수스 토르퀴스 (Psychroflexus torquis) ATCC 700755, 피로바쿨럼 에어로필룸 (Pyrobaculum aerophilum) str. IM2, 피로코커스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus), 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha), 랄스토니아 유트로파 H16, 랄스토니아 유트로파 JMP134, 랄스토니아 메탈리두란스 (Ralstonia metallidurans), 랄스토니아 픽케티이 (Ralstonia pickettii), 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus), 리조비움 레구미노사룸 (Rhizobium leguminosarum), 로도박터 캡술라테스 (Rhodobacter capsulates), 로도박터 캐술라투스 (Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스페어로이데스 (Rhodobacter sphaeroides), 로도코커스 오파쿠스 (Rhodococcus opacus), 로도코커스 루버 (Rhodococcus ruber), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 로도슈도모나스 팔루스트리스 CGA009, 포로스피릴룸 루브룸 (Rhodospirillum rubrum), 로세부리아 인테스티날리스 (Roseburia intestinalis) L1-82, 로세부리아 이눌리니보란스 (Roseburia inulinivorans), 로세부리아 (Roseburia) sp. A2-183, 로세이플렉스스 카스텐홀지이 (Roseiflexus castenholzii), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisae), 살리니스포라 아레니콜라 (Salinispora arenicola), 살모넬라 엔테릭 (Salmonella enteric), 살모넬라 엔테리카 아종 아리조네어 세로바르 (Salmonella enterica subsp. arizonae serovar), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 티피무리움 LT2, 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 셀레노모나스 루미난티움 (Selenomonas ruminantium), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 시몬드시아 치넨시스 (Simmondsia chinensis), 솔리바실러스 실베스트리스 (Solibacillus silvestris), 소르다리아 마크로스포라 (Sordaria macrospora), 스포로사르시나 유오르켄시스 (Sporosarcina newyorkensis), 스타필로코커스 슈드인테르메디우스 (Staphylococcus pseudintermedius), 스트렙토코커스 무탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 올리고퍼멘탄스 (Streptococcus oligofermentans,), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) ATCC 10782, 스트렙토마이세스 클라불리게누스 (Streptomyces clavuligenus), 스트렙토마이세스 코엘리콜러 (Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 그리세우스 아종 그리세우스 (Streptomyces griseus subsp. griseus) NBRC 13350, 설폴로부스 액시도칼라리우스 (Sulfolobus acidocalarius), 설폴로부스 sp. strain 7, 설폴로부스 토코다이 (Sulfolobus tokodaii), 설폴로부스 토코다이 7, 설푸리하이드로게니비움 섭테라네움 (Sulfurihydrogenibium subterraneum), 설푸리모나스 데니트리피칸스 (Sulfurimonas denitrificans), 수스 스크로파 (Sus scrofa), 시네코사이스티스 (Synechocystis) str. PCC 6803, 신트로푸스 액시트로피쿠스 (Syntrophus aciditrophicus), 타우에라 아로마틱 (Thauera aromatic), 타우에라 아로마틱, 서모안에어로박터 브록키이 (Thermoanaerobacter brockii) HTD4, 서모크리니스 알부스 (Thermocrinis albus), 서모프로테우스 뉴트로필러스 (Thermoproteus neutrophilus), 서모토가 마리타임 (Thermotoga maritime), 서무스 서모필러스 (Thermus thermophilus), 티오바실러스 데니트리피칸스 (Thiobacillus denitrificans), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 트리코모나스 바기날리스 (Trichomonas vaginalis) G3, 트리파노소마 브루세이 (Trypanosoma brucei), 츠카무렐라 파우로메타볼라 (Tsukamurella paurometabola) DSM 20162, 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 비브리오 파라헤모라이티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus), 비티스 비니페라 (Vitis vinifera), 야로이와 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 예르시니아 인터메디아 (Yersinia intermedia) ATCC 29909, 지아 메이스 (Zea mays), 주글로에아 라미게라 (Zoogloea ramigera), 자이모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 카르타무스 틴크토리우스 (Carthamus tinctorius), 쿠페아 후케리아나 (Cuphea hookeriana), 쿠페아 팔루스트리스 (Cuphea palustris), 시아노테세 (Cyanothece) sp. PCC 7425, 엘리자베스킹기아 메닌고셉티카 (Elizabethkingia meningoseptica), 링비아 (Lyngbya) sp. PCC 8106, 노둘라리아 스푸미게나 (Nodularia spumigena) CCY9414, 노스톡 아졸레어 (Nostoc azollae), 플라스모디윰 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 프로클로로코커스 마리누스 (Prochlorococcus marinus), 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) ATCC 10782, 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitillis), 시네코코커스 엘롱가투스 (Synechococcus elongatus), 시네코커스 엘롱가투스 PCC7942, 서모마이세스 라누기노수스 (Thermomyces lanuginosus), 움벨루라리아 칼리포르니카 (Umbellularia californica), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) col, 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 미코플라스마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) M129, 포풀루스 알바 (Populus alba), 포풀루스 트레물라 (Populus tremula), 푸에라리아 몬타나 (Pueraria montana), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토마이세스 sp. ACT-1, 서모토가 마리타임 (Thermotoga maritime) MSB8, 스트렙토마이세스 sp CL190, 스트렙토마이세스 sp. KO-3988, 스트렙토마이세스 시나모넨시스 (Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 아눌라투스 (Streptomyces anulatus), 노카르디아 브라실리엔시스 (Nocardia brasiliensis) 뿐만 아니라 본원에 기술된 기타 예시적인 종들을 포함하며, 해당 유전자에 대한 소스 유기체로서 이용가능하다. 그러나, 395종의 미생물 게놈 및 다양한 효모, 진균, 식물 및 포유류 게놈을 비롯하여, 현재 550 종 이상에 대해 이용가능한 전체 게놈 서열을 이용하여 (NCBI 등의 공공 데이타베이스에 이용가능한 것의 절반 이상), 예컨대 공지 유전자의 상동체, 오르소로그, 파라로그 및 비-오르소로그 유전자 치환, 및 유기체들 간의 유전자 변이의 상호교환을 비롯하여, 관련 또는 비관련 종들에서의 하나 이상의 유전자에 대한 필수적인 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 활성을 코딩하는 유전자의 동정은, 일상적이며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 즉, 에스케리키아 콜라이 등의 특정 유기체에 대해, 본원에 기술된 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 생합성이 가능한 대사적 변이는, 원핵 및 진핵 유기체 등의, 다른 미생물들에도 쉽게 적용할 수 있다. 본원에 제시된 교시 내용과 지침을 감안하여, 당해 기술 분야의 당업자라면, 한가지 유기체에서 예시된 대사적 변이를 다른 유기체에도 동일하게 적용할 수 있다는 것을 알 것이다.
비관련 종들에 대안적인 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로가 존재하는 경우 등의 일부 경우들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성은, 예컨대 언급된 반응을 대체하기 위해 유사하지만 동일하진 않은 대사 반응을 촉매하는 비관련 종들로부터 파라로그 또는 파라로그들을 외인적으로 발현시킴으로써, 숙주 종에 부여할 수 있다. 여러가지 유기체들 간에 대사 네트워크에 대한 일정한 차이가 존재하기 때문에, 당해 기술 분야의 당업자라면, 상이한 유기체들간의 실제 유전자 용법은 상이할 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 본원에 제시된 교시 및 지침 하에, 당해 기술 분야의 당업자라면, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 합성할 대상 종에서 미생물 유기체를 구축하기 위해, 본 발명의 내용과 방법들을 본원에 예시된 내용에 동족의 대사 변이를 이용하여 모든 미생물 유기체에 적용할 수 있음을 이해할 것이다.
비천연성 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생산 숙주의 구축 방법 및 발현 수준을 테스트하는 방법은, 예컨대 당해 기술 분야에 공지된 재조합 및 검출 방법에 의해 수행할 수 있다. 이러한 방법은, 예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)에 언급된 내용에서 볼 수 있다.
2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 생산 경로에 참여하는 외인성 핵산 서열은, 비제한적인 예로서, 접합, 전기충격, 화학적 형질전환, 형질전이, 형질감염 및 초음파 형질전환 등의 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 숙주 세포로 안정적으로 또는 일시적으로 도입할 수 있다. 에스케리키아 콜라이 또는 다른 원핵 생물 세포에서의 외인성 발현을 위해서는, 진핵 생물의 핵산의 유전자 또는 cDNA내 일부 핵산 서열은 N-말단 미토콘드리아 신호 또는 다른 타겟팅 신호와 같은 타겟팅 신호를 코딩할 수 있으며, 상기 신호는 필요에 따라 원핵 생물 숙주 세포에 형질전환시키기 전에 제거될 수 있다. 예컨대, 미토콘드리아 리더 서열을 제거하면, 에스케리키아 콜라이에서의 발현 증가로 이어진다 (Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)). 효모 또는 다른 진핵 생물 세포에서의 외인성 발현을 위해서는, 유전자를 리더 서열을 첨가하지 않고, 세포질에서 발현시키거나, 또는 숙주 세포에 적합한 미토콘드리아 표적 또는 분비 신호 등의 적합한 표적 신호를 부가함으로써, 미토콘드리아 또는 다른 기관으로 타겟팅하거나 또는 분비되도록 타겟화할 수 있다. 즉, 타겟팅 서열을 제거하거나 포함시키기 위한 핵산 서열에서의 적절한 변형이 바람직한 특성을 부여하기 위해 외인성 핵산 서열에 통합시킬 수 있는 것으로 이해된다. 아울러, 유전자는 단백질의 발현 최적화를 달성하기 위해, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법으로 코돈 최적화를 수행할 수 있다.
발현 벡터 또는 벡터들은, 숙주 유기체에서 기능하는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 예시된 바와 같은 하나 이상의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로를 코딩하는 핵산을 포함하도록 구축할 수 있다. 본 발명의 미생물 숙주 유기체에서 이용하기 위해 적용가능한 발현 벡터는, 예컨대, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 숙주 염색체내로의 안정적인 삽입을 위해 작동가능한 벡터 및 선택 서열 또는 마커를 포함하는 인공 염색체를 포함한다. 또한, 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커 유전자와 적합한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항생제 또는 독소에 대한 내성, 보완적인 영양요구성 결핍, 또는 배양 배지에 없는 주요 영양원의 공급을 제공하는, 선택성 마커 유전자도 포함시킬 수 있다. 발현 조절 서열은 당해 기술 분야에 널리 공지된 구성적인 프로모터, 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결자 등을 포함할 수 있다. 2 이상의 외인성 코딩 핵산을 공동으로 발현시켜야 하는 경우, 이들 핵산 둘다를 예를 들어 하나의 발현 벡터 또는 각각의 발현 벡터에 삽입시킬 수 있다. 하나의 벡터에서 발현시키는 경우, 코딩 핵산을 하나의 공통 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결시키거나 또는 하나의 유도성 프로모터 및 하나의 구성적 프로모터와 같은 다른 발현 조절 서열에 연결시킬 수 있다. 대사 또는 합성 경로에 관여하는 외인성 핵산 서열의 형질전환은 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법으로 검증할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 핵산 분석, 예를 들어 mRNA의 노던 블럿 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 유전자 산물의 발현에 대한 면역블럿팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 이의 상응하는 유전자 산물의 발현을 테스트하기 위한 기타 적합한 분석 방법을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 외인성 핵산이 바람직한 산물을 생산하기에 충분한 양으로 발현됨을 알 것이며, 발현 수준을 당해 기술 분야에 널리 공지되고 본원에 개시된 방법을 이용하여 충분한 발현이 이루어지도록 최적화할 수 있음을 또한 알 것이다.
2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 생산을 테스트하기 위한 적합한 정제 및/또는 분석은 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 테스트할 조작된 각 균주에 대해 3세트 배양물 등의 적정 레플리케이트로 증식시킬 수 있다. 예를 들어, 조작된 생산 숙주에서의 산물 및 부산물의 생성을 모니터링할 수 있다. 최종 산물 및 중간산물, 및 기타 유기 화합물은 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), GC-MS(기체 크로마토그래피-질량 분광학) 및 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광학) 또는 당해 기술 분야에 널리 공지된 통상적인 절차를 이용하는 그외 적정 분석 방법으로 분석할 수 있다. 발효 브로스내 산물의 분비는, 또한, 배양 상층액을 이용하여 테스트할 수 있다. 부산물 및 잔류 글루코스는, 예컨대 글루코스 및 알코올의 경우 굴절률 검출기, 유기산의 경우 UV 검출기(Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005))를 이용하여 HPLC로, 또는 당해 기술 분야에 널리 공지된 그외 적합한 분석 및 검출 방법으로 정량할 수 있다. 또한, 외인성 DNA 서열로부터 유래된 각 효소 또는 단백질의 활성은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 분석할 수 있다.
2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올은 당해 기술 분야에 잘 알려진 다양한 방법을 이용하여 배양물내 다른 성분들로부터 분리할 수 있다. 이러한 분리 방법으로는, 예컨대 추출 방법 뿐만 아니라, 연속적인 액체-액체 추출, 투석증발(pervaporation), 막 여과, 막 분리, 역삼투압, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과(extractive filtration), 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 및 한외여과를 비롯한 방법들을 포함한다. 상기 방법들 모두 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
본원에 기술된 임의의 비-천연성 미생물 유기체는 배양하여, 본 발명의 생합성 산물을 생산 및/또는 분리할 수 있다. 예컨대, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생산체를 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 생합성 생산을 위해 배양할 수 있다.
2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하기 위해, 재조합 균주를 탄소원과 기타 필수 영양원이 첨가된 배지에서 배양한다. 전 공정의 단가를 낮추기 위해, 발효기를 혐기성 조건으로 유지하는 것이 때로는 바람직하며, 매우 바람직할 수 있다. 이러한 조건은, 예컨대, 배지에 질소를 일차 분사한 다음, 격막(septum)과 크림프-캡으로 플라스크를 밀봉함으로써 달성할 수 있다. 혐기 조건에서는 증식이 관찰되지 않는 균주의 경우, 제한된 호기를 위해 격막에 작은 구멍을 뚫어 미세호기 조건 또는 실질적으로 혐기 조건을 적용할 수 있다. 혐기 조건의 예들은 종래에 개시되어 있으며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 호기 조건 및 혐기 조건의 예들은 2007년 8월 10일자 미국 공개 공보 2009/0047719에 기술되어 있다. 발효는 본원에 개시된 바와 같이 배치, 피드-배치 또는 연속적인 방식으로 수행할 수 있다. 또한, 발효는 필요에 따라 2개의 단계로 수행할 수 있다. 제1 단계는 고증식과 그에 따른 고 생산성을 위한 호기 조건일 수 있으며, 그런 후, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 고수율을 위한 혐기 조건이 후속될 수 있다.
적절한 경우, 배지의 pH는, 배양 배지를 원하는 pH로 유지하기 위해, 필요에 따라, NaOH 또는 기타 염기, 또는 산을 첨가함으로써, 바람직한 pH, 특히 pH 약 7과 같은 중성 pH로 유지시킬 수 있다. 증식율은 분광광도계(600 nm)를 이용하여 광학 밀도를 측정함으로써 결정할 수 있으며, 글루코스 흡수율(uptake rate)은 시간에 따른 탄소원 고갈을 모니터링함으로써 결정할 수 있다.
배양 배지는, 예컨대 비-천연성 미생물에 탄소원을 공급할 수 있는 임의의 탄수화물원을 포함할 수 있다. 이러한 탄수화물원으로는, 예컨대 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스, 슈크로스 및 스타치와 같은 당을 포함한다. 기타 탄수화물원으로는, 예컨대 재생 원료 및 바이오매스를 포함한다. 본 발명의 방법에 공급 원료로서 이용될 수 있는 타입의 바이오매스의 예로는, 셀룰로직 바이오매스, 헤미셀룰로직 바이오매스 및 리그닌 공급원료 또는 공급원료의 일부를 포함한다. 이러한 바이오매스 공급원료로는, 예컨대 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스 및 스타치와 같이 탄소원으로서 이용가능한 탄수화물 기질을 포함한다. 본원에 제시된 교시 및 지침을 고려하여, 당해 기술 분야의 당업자라면, 상기에 예시된 것 이외의 재생 원료 및 바이오매스가 또한 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하기 위한 발명의 미생물 유기체 배양에 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
상기 예시된 바와 같은 재생 원료 외에도, 본 발명의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 미생물 유기체는 또한 탄소원으로서 합성가스(syngas)에서도 생장하도록 변형될 수 있다. 이러한 구체적인 구현예에서, 합성 가스 또는 기타 가스상 탄소원을 이용하는 대사 경로를 제공하기 위해, 하나 이상의 단백질 또는 효소를 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생산 유기체에서 발현시킨다.
합성 가스(syngas) 또는 발생로 가스(producer gas)라고도 하는 합성 가스(synthesis gas)는, 석탄의 기체화와, 농업 작물 및 잔류물 등의 바이오매스 물질과 같은 탄소질 물질의 주요 산물이다. 합성 가스는 주로 H2 및 CO로 구성된 혼합물이며, 비제한적인 예로, 석탄, 석탄 오일, 천연 가스, 바이오매스 및 폐 유기 물질 등의 임의의 유기 공급원의 기체화로부터 수득할 수 있다. 기체화는 일반적으로 높은 연료 대 산소 비율 하에 수행된다. 주로 H2 및 CO이지만, 합성 가스는 CO2 및 다른 기체도 소량 포함할 수 있다. 따라서, 합성 가스는 CO, 추가적으로 CO2 등의 가스상 탄소에 대한 비용 효율적인 소스로 제공된다.
Wood-Ljungdahl 경로는 CO와 H2의 아세틸-CoA와 아세테이트 등의 기타 산물로의 변환을 촉매한다. 또한, CO 및 합성가스를 이용할 수 있는 유기체는, 일반적으로, Wood-Ljungdahl 경로에 포함된 효소 및 변환(transformation)의 동일한 기본적인 세트를 통해, CO2 및 CO2/H2 혼합물을 이용하는 능력을 가진다. 또한, 동일 유기체에 의해 CO가 이용될 수 있으며 동일한 경로가 관여된다는 것이 밝혀지기 전까지는, 오랜동안 미생물이 이산화탄소를 H2-의존적인 방식으로 아세테이트로 변환시키는 것으로 인식되었다. 수소가 필수 환원 당량(reducing equivalent)의 공급원으로서 제공되는 한, 다수의 초산 생성균들을 이산화탄소의 존재 하에 증식시킬 수 있으며 아세테이트와 같은 화합물이 생산된다는 것이 확인되었다 (예, Drake, Acetogenesis, pp. 3-60 Chapman and Hall, New York, (1994)). 이를 아래 등식으로 정리할 수 있다:
2 CO2 + 4 H2 + n ADP + n Pi -> CH3COOH + 2 H2O + n ATP
이때, Wood-Ljungdah 경로를 가지고 있는 비-천연성 미생물은 CO2 및 H2 혼합물을 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 아세틸-CoA와 기타 원하는 산물을 만들 수 있다.
Wood-Ljungdahl 경로는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 2가지의 분지로 분류될 수 있는 12가지의 반응으로 구성되어 있다: (1) 메틸 분지와 (2) 카르보닐 분지. 메틸 분지는 합성 가스를 메틸-테트라하이드로폴레이트 (메틸-THF)로 변환시키고, 카르보닐 분지는 메틸-THF를 아세틸-CoA로 변환시킨다. 메틸 분지에서의 반응들은 다음과 같은 효소 또는 단백질에 의해 순차적으로 촉매된다: 페레독신 옥시도리덕타제, 포르메이트 데하이드로게나제, 포르밀테트라하이드로폴레이트 신테타제, 메테닐테트라하이드로폴레이트 사이클로데하이트라타제, 메틸렌테트라하이드로폴레이트 데하이드로게나제 및 메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제. 카르보닐 분지에서의 반응들은 다음과 같은 효소 또는 단백질에 의해 순차적으로 촉매된다: 메틸테트라하이드로폴레이트:코리노이드 단백질 메틸트랜스퍼라제 (예, AcsE), 코리노이드 철-황 단백질, 니켈-단백질 어셈블리 단백질 (예, AcsF), 페레독신, 아세틸-CoA 신타제, 카본 모노옥사이드 데하이드로게나제 및 니켈-단백질 어셈블리 단백질 (예, CooC). 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구현하기 위해 충분한 수의 코딩 핵산을 도입하는 것에 대한 본원에 제공된 내용 및 지침에 따라, 당해 기술 분야의 당업자는, 숙주 유기체에 존재하지 않는 Wood-Ljungdahl 효소 또는 단백질을 코딩하는 핵산을 적어도 도입하는 측면에 대해, 동일한 조작 설계를 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 변형된 유기체에 Wood-Ljungdah의 전 경로가 포함되도록, 하나 이상의 코딩 핵산을 본 발명의 미생물에 도입함으로써, 합성 가스의 이용 능력이 부여될 것이다.
부가적으로, 일산화탄소 데하이드로게나제 및/또는 하이드로게나제 활성과 커플링된 환원성 (리버스) 트리카르복실산 사이클도 CO, CO2 및/또는 H2의 아세틸-CoA 및 아세테이트와 같은 기타 산물로의 변환에 사용될 수 있다. 환원성 TCA 경로를 경유하여 탄소를 고정할 수 있는 유기체들은 다음과 같은 효소들 하나 이상을 이용할 수 있다: ATP 시트레이트-리아제, 시트레이트 리아제, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 알파-?노글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마레이트 리덕타제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 일산화탄소 데하이드로게나제 및 하이드로게나제. 특히, 일산화탄소 데하이드로게나제와 하이드로게나제에 의해 CO 및/또는 H2로부터 추출된 환원 당량은 환원성 TCA 사이틀을 통해 CO2를 아세틸-CoA 또는 아세테이트로 고정하는데 사용된다. 아세테이트는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제, 아세테이트 키나제/포스포트랜스아세틸라제 및 아세틸-CoA 신테타제 등의 효소에 의해 아세틸-CoA로 변환될 수 있다. 아세틸-CoA는, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제와 글로코스신합성 효소에 의해, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 전구체, 글리세르알데하이드-3-포스페이트, 포스포에놀피루베이트 및 피루베이트로 변환될 수 있다. 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구축하기 위해 충분한 수의 코딩 핵산을 도입하는 본원에 제시된 교시와 지침에 따라, 당해 기술 분야의 당업자는, 숙주 유기체에 없는 환원성 TCA 경로 효소들 또는 단백질들을 코딩하는 핵산을 적어도 도입하는 것과 관련하여, 동일한 조작 설계를 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 변형된 유기체가 환원성 TCA 경로를 구비하도록 본 발명의 미생물 유기체에 하나 이상의 코딩 핵산을 도입함으로써, 합성가능 이용력을 부여할 수 있다.
이에, 본 발명은 또한 부분적으로 중요한 대사 중간 산물에서 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올로의 경로를 통한 탄소 플럭스를 개선시키도록 조작된 생합성 경로에 관한 것이다. 본 발명은, 다양한 효소적 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 변환 경로를 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 가진 비-천연성 미생물 유기체를 제공한다. 일부 구현예들에서, 이들 효소적 변환은 환원성 트리카르복실산 (RTCA)의 일부이며, 이를 사용하여 비제한적인 예로 탄수화물-기반의 탄소 공급원료로부터의 생산 수율을 개선시킨다.
다양한 조작된 경로에서, 환원 당량 부족 또는 환원 당량 및/또는 탄소의 부산물로의 소실은 탄수화물 공급원료를 기반으로 한 최대 생산 수율 실현을 저해한다. 일부 구현예들에 따라, 본 발명은 (i) 환원성 TCA 사이클을 통한 탄소 고정을 강화하거나 및/또는 (ii) CO, CO2 및/또는 H2와 같은 기체상 탄소원 및/또는 합성가스 성분으로부터 추가적인 환원 당량을 입수함으로써, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 수율을 높인다. 합성가스 외에도, 이러한 가스의 다른 소스로, 비제한적인 예로, 천연 또는 인공 대기를 포함한다.
CO2를 고정하는 환원성 트리카르복실산 (RTCA) 사이클은 환원 당량과 ATP를 이용하여 CO2를 동화하는 내인성 동화 경로이다 (도 8). RTCA 사이클 1회 작동으로, CO2 2몰이 아세틸-CoA 1몰로 또는 CO2 4몰이 옥살로아세테이트 1몰로 동화된다. 이러한 추가적인 아세틸-CoA 이용성은 탄수화물-기반의 탄소 공급원료로부터 유래되는 생산 분자들의 이론적인 최대 수율을 개선시킨다. 탄수화물의 예로는 글루코스, 슈크로스, 자일로스, 아라비노스 및 글리세롤을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 환원성 TCA 사이클은, 일산화탄소 데하이드로게나제 및/또는 하이드로게나제 효소들과 함께 사용하여, 미생물에 의한 합성가스, CO2, CO, H2 및/또는 기타 기체성 탄소원 활용을 가능하게 할 수 있다. 합성가스 (synthesis gas, syngas)는, 임의의 유기 공급원료, 예를 들면 석탄, 석유, 천연 가스, 바이오매스, 또는 폐 유기물의 기체화를 통해 수득할 수 있는, 특히 주로 H2 및 CO의 혼합물이며, 때로는 일정량의 CO2를 포함한다. 수많은 기체화 공정들이 개발되었으며, 대부분의 설계는 부분 산화를 기반으로 하며, 이 경우 산소 제한은 고온 (500-1500℃)에서 유기물의 완전 연소를 방지하여 합성가스를 0.5:1-3:1 H2/CO 혼합물로서 수득되게 한다. 석탄 외에도, 많은 유형의 바이오매스들이 합성가스 생산에 사용되고 있으며, 재생가능한 화학물질과 연료를 생물학적으로 생산하기 위한 저렴하고 유연한 공급원료이다. 이산화탄소는 대기로부터 또는 예를들면, 탱크 실린더로부터 압축된 형태로, 또는 고체 CO2의 승화를 통해 제공될 수 있다. 마찬가지로, CO 및 수소 가스는 시약 형태로 및/또는 임의의 원하는 비율로 혼합된 형태로 제공될 수 있다. 기타 기체성 탄소 형태로는, 예를 들면, 메탄올 또는 유사한 휘발성 유기 용매를 포함할 수 있다.
합성가스 및/또는 기타 탄소원 성분들은 환원성 TCA 사이클을 작동시키기 위한 충분한 CO2, 환원 당량 및 ATP를 제공할 수 있다. RTCA 사이클 1회 작동시, CO2 2몰이 아세틸-CoA 1몰로 동화되며, 이때 ATP 2개와 및 환원 당량 4개가 필요하다. CO 및/또는 H2는 각각 일산화탄소 데하이드로게나제 및 하이드로게나제 효소를 이용함으로써 환원 당량을 제공할 수 있다. 환원 당량은 NADH, NADPH, FADH, 환원된 퀴논, 환원된 페레독신, 환원된 플라보독신 및 티오레독신 형태로 유입될 수 있다. 환원 당량들, 특히 NADH, NADPH 및 환원된 페레독신은, RTCA 사이클 효소들, 예를들면, 말레이트 데하이드로게나제, 푸마레이트 리덕타제, 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제 (2-옥소글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제, 알파-케토글루타레이트 신타제, 또는 2-옥소글루타레이트 신타제라고도 함), 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 및 이소시트레이트 데하이드로게나제의 조인자로 사용할 수 있다. 이들 환원 당량으로부터 유래된 전자는, 대안적으로는, 이온-농도구배를 형성하는 전자 전달 체인을 통해 흐를 수 있으며, 이때 전자는 어셉터, 예를 들면 산소, 질산염, 산화된 금속 이온, 양성자 또는 전극으로 전달된다. ATP 신타제 또는 유사 효소를 통한 ATP 생성에 이온-농도구배가 이용될 수 있다.
환원성 TCA 사이클은 녹황 광합성 박테리아인 클로로븀 리미콜라 (Chlorobium limicola)에서 처음으로 보고되었다 (Evans et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 55:928-934 (1966)). 일부 원핵생물 (프로테오박테리아, 녹황 세균 및 호열성 크날가스 (Knallgas) 세균) 및 황-의존성 고세균에서도 유사한 경로들이 특정화되었다 (Hugler et al., J. Bacteriol. 187:3020-3027 (2005); Hugler et al., Environ. Microbiol. 9:81-92 (2007)). 일부 사례들에서는, 환원적 및 산화적 (크랩) TCA 사이클들이 동일한 유기체에 존재하고 있다 (Hugler et al., supra (2007); Siebers et al., J. Bacteriol. 186:2179-2194 (2004)). 일부 메탄생성 및 편성 혐기성균들은 생합성 중간산물을 합성하는 기능을 할 수 있는 불완전한 산화적 또는 환원성 TCA 사이클을 가지고 있다 (Ekiel et al., J. Bacteriol. 162:905-908 (1985); Wood et al., FEMS Microbiol. Rev. 28:335-352 (2004)).
환원성 TCA 사이클의 주된 탄소-고정 효소는 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 및 이소시트레이트 데하이드로게나제이다. 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 또는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제에 의한 포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 변환, 또는 말릭 효소에 의한 피루베이트의 말레이트로의 변환이 이루어지는 동안, 추가적인 탄소가 고정될 수도 있다.
TCA 사이클에서 다수의 효소들이 가역적이며, 환원 방향과 산화 방향으로 반응을 촉매할 수 있다. 그러나, 일부 TCA 사이클 반응들은 생체내에서 비가역적이어서, 리버스 TCA 사이클에 필요한 방향으로 이들 반응들을 촉매하기 위해서는 다른 효소들이 사용된다. 이러한 반응으로는, (1) 시트레이트의 옥살로아세테이트 및 아세틸-CoA로의 변환, (2) 푸마레이트의 숙시네이트로의 변환, 및 (3) 숙시닐-CoA의 알파-케토글루타레이트로의 변환이 있다. TCA 사이클에서, 시트레이트는 옥살로아세테이트와 아세틸-CoA의 축합으로 생성된다. 역방향 반응, 즉 시트레이트를 옥살로아세테이트 및 아세틸-CoA로 절단하는 반응은 ATP-의존적이며, ATP-시트레이트 리아제, 또는 사이트릴-CoA 신테타제 및 사이트릴-CoA 리아제에 의해 촉매된다. 다른 예로, 시트레이트 리아제는 아세틸-CoA 신테타제, 아세틸-CoA 트랜스퍼라제 또는 포스포트랜스아세틸라제 및 아세테이트 키나제와 커플링되어, 시트레이트로부터 아세틸-CoA와 옥살로아세테이트를 만들어 낼 수 있다. 숙시네이트를 푸마레이트로 변환하는 반응은 숙시네이트 데하이드로게나제에 의해 촉매되며, 역방향 반응은 푸마레이트 리덕타제에 의해 촉매된다. TCA 사이클에서, 숙시닐-CoA는 알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제 복합체에 의해, 알파-케토글루타레이트의 NAD(P)+ 의존적인 탈카르복시화로부터 만들어진다. 역방향 반응은 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제에 의해 촉매된다.
1) CO, 2) CO2 및 H2, 3) CO 및 CO2, 4) CO 및 H2를 포함하는 합성 기체, 및 5) CO, CO2 및 H2를 포함하는 합성 기체 또는 다른 기체성 탄소원에서 아세틸-CoA 유래 산물을 생산할 수 있도록 역방향 트리카르복실산 사이클을 이용할 수 있는 유기체는, 다음과 같은 임의의 효소 활성을 포함할 수 있다: ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마레이트 리덕타제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 아세틸-CoA 신테타제, 아세틸-CoA 트랜스퍼라제, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 일산화탄소 데하이드로게나제, 하이드로게나제, 및 페레독신 (도 9 참조). 이러한 활성에 필요한 효소와 해당 유전자들은 본원에 기술되어 있다.
합성가스 또는 기타 기체성 탄소원으로부터 유래된 탄소는 리버스 TCA 사이클 및 이의 구성원을 경유하여 고정할 수 있다. 구체적으로, 특정 탄소 기체-활용 경로 구성요소들을, 아세틸-CoA로부터 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 제조하는 경로와 조합하는 경우, 외부에서 제공되거나 또는 CO로부터 내부적으로 생성되는 이산화탄소에 존재하는 탄소를 아세틸-CoA로 고정하기 위한 효율적인 기전을 제공함으로써 이들 산물의 고수율이 달성된다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체에서는, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로가, (1) CO, (2) CO2, (3) H2, 또는 이들의 혼합물 중 임의 조합을 이용함으로써, 환원성 TCA 사이클 운영을 비롯하여, 환원에 참여하는 생합성 공정들의 수율을 높일 수 있다.
일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는 환원성 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 상기 하나 이상의 외인성 핵산은 ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니타제, 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제; 및 (1) CO, (2) CO2, (3) H2, (4) CO2 + H2, (5) CO + CO2, (6) CO + H2, 또는 (7) CO + CO2 + H2를 이용할 수 있을 만큼 충분한 양으로 발현되는, 일산화탄소 데하이드로게나제, 하이드로게나제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제 및 페레독신으로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 효소로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 방법은, 환원성 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 또한 포함하는, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 하나 이상의 외인성 핵산은 ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니타제, 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제로부터 선택된다. 부가적으로, 이러한 유기체는 또한 산물을 생산하기 위해, (1) CO, (2) CO2, (3) H2, (4) CO2 + H2, (5) CO + CO2, (6) CO + H2, 또는 (7) CO + CO2 + H2를 이용할 수 있을 만큼 충분한 양으로 발현되는, 일산화탄소 데하이드로게나제,하이드로게나제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제 및 페레독신으로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 효소를 포함할 수 있다.
일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는, 일산화탄소 및/또는 수소의 존재 하에 환원 당량의 이용성을 강화함으로써 탄수화물-기반의 탄소 공급원료를 통해 레독스-제한된 산물의 수율을 높이기 위해, 충분한 양으로 발현되는 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는, 아세틸-CoA를 경유한 탄소 흐름을 강화하기 위해 충분한 양으로 발현되는 환원성 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 하나 이상의 외인성 핵산은 ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는, 일산화탄소 및/또는 수소의 존재 하에 환원 당량의 이용성을 강화함으로써 탄수화물-기반의 탄소 공급원료를 통해 레독스-제한된 산물의 수율을 높이기 위해, 충분한 양으로 발현되는 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 상기 하나 이상의 외인성 핵산은 일산화탄소 데하이드로게나제, 하이드로게나제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제 및 페레독신으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 본 발명은, 이러한 비-천연성 미생물 유기체를 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하는 조건과 충분한 기간 동안 배양하는 단계를 포함하는, 일산화탄소 및/또는 수소의 존재 하에 환원 당량의 이용성을 강화함으로써 당 또는 기체상 탄소 소스 등의 탄수화물-기반의 탄소 공급원료를 통한 레독스-제한된 산물의 수율을 높이는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는 환원성 TCA 경로 효소를 각각 코딩하는 2종의 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는 환원성 TCA 경로 효소를 각각 코딩하는 3종의 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 비-천연성 미생물 유기체는 ATP-시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제를 코딩하는 3종의 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 비-천연성 미생물 유기체는 시트레이트 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제를 코딩하는 3종의 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 비-천연성 미생물 유기체는 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제; 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 또는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제; 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 4종의 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 비-천연성 미생물 유기체는 CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제를 코딩하는 2종의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 아세틸-CoA 신테타제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는 일산화탄소 데하이드로게나제, 아세틸-CoA 신타제, 페레독신, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는, (1) CO, (2) CO2, (3) CO2 + H2, (4) CO + H2, 또는 (5) CO + CO2 + H2로부터 선택되는 탄소 공급원료를 이용한다. 일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는 환원 당량을 위해 수소를 이용한다. 일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는 환원 당량을 위해 CO를 이용한다. 일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는 환원 당량을 위해 CO와 수소의 조합을 이용한다.
일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 피루베이트 카르복실라제 및 말릭 효소 (malic enzyme)로부터 선택되는 효소를 코딩하는 1종 이상의 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는 말레이트 데하이드로게나제, 푸마라제, 푸마레이트 리덕타제, 숙시닐-CoA 신테타제, 및 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제로부터 선택되는 효소를 코딩하는 1종 이상의 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체는 시트레이트 리아제, ATP-시트레이트 리아제, 사이트릴-CoA 신테타제, 사이트릴-CoA 리아제, 아코니타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마라제, 말레이트 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 아세틸-CoA 신테타제, 및 페레독신을 코딩하는 1종 이상의 외인성 핵산을 추가적으로 포함한다.
이에, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 기술된 교시 및 지침을 참조하여, 탄수화물 등의 탄소원에서 배양하였을 때 본 발명의 생합성한 화합물을 분비하는 비-천연성 미생물 유기체를 생산할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 화합물로는 예를 들어 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올과, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 임의의 중간 대사산물을 포함한다. 예를 들어 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생합성 경로들 일부 또는 전체를 포함하는 등의, 원하는 화합물 또는 중간 산물의 생합성을 달성하기 위해 한가지 이상의 필수 효소 또는 단백질 활성 중 한가지 이상을 조작하는 것이 필요한 전부이다. 이에, 본 발명은, 탄수화물 또는 기타 탄소원에서 배양하였을 때 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산 및/또는 분비하고, 탄수화물 또는 기타 탄소원에서 배양하였을 때 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로에서 보여지는 임의의 중간 대사산물을 생산 및/또는 분비하는 비-천연성 미생물 유기체를 제공한다. 본 발명의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하는 미생물 유기체는 중간 산물, 예컨대, 5-아미노펜트-2-에노에이트, 글루타레이트 세미알데하이드, 5-하이드록시발레레이트, 5-하이드록시발레릴-CoA, 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA, 2,4-펜타디에노일-CoA, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트, 아세토아세틸-CoA, 3-하이드록시부티릴-CoA, 크로토일-CoA, 글루타릴-CoA, 3-옥소펜타노일-CoA, 3-하이드록시펜타노일-CoA, 펜트-2-에노일-CoA, 펜트-3-에노일-CoA, 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA, 3-옥소-5-하이드록시펜타노에이트, 3-옥소부탄올, 4-하이드록시-2-옥소발레레이트, 2-옥소펜테노에이트, 3-부텐-1-알, 3-하이드록시부티릴-CoA, 3-하이드록시부티레이트, 3-하이드록시부타날, 2,4-펜타디에노일-포스페이트 또는 펜타-2,4-디에날로부터의 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 비-천연성 미생물 유기체는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하기에 충분한 양으로 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 외인적으로 발현하도록 본원에 예시된 바와 같이 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 구축한다. 본 발명의 미생물 유기체는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하기에 충분한 조건 하에서 배양하는 것으로 이해된다. 본원에 제시된 교시 내용 및 지침에 따라, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체는, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 세포내 농도 약 0.1-200 mM 또는 그 이상이 되도록 생합성을 달성할 수 있다. 일반적으로, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 세포내 농도는 약 3-150 mM, 특히 약 5-125 mM, 보다 구체적으로 약 8-100 mM이며, 예로 약 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM 또는 그 이상이다. 이들 예시된 범위들 사이의 범위, 그리고 그 이상의 세포내 농도도 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체로부터 달성할 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 조건은 혐기적 또는 실질적으로 혐기적 배양 또는 유지 조건을 포함한다. 예시적인 혐기 조건은 종래에 개시되어 있으며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 발효 공정에 대한 예시적인 혐기 조건은 본원에 기술되어 있으며, 예컨대 2007년 8월 10일자 미국 공개공보 2009/0047719에 기술되어 있다. 이러한 조건들 중 임의의 조건을 비-천연성 미생물 유기체와 함께 이용할 수 있으며, 뿐만 아니라 당해 기술 분야에 잘 알려진 다른 혐기 조건을 이용할 수 있다. 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 생산체들은, 상기한 혐기 또는 실질적인 혐기 조건 하에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 세포내 농도 5-10 mM 또는 그 이상으로, 뿐만 아니라 본원에 예시된 다른 모든 농도들로 합성할 수 있다. 전술한 내용이 세포내 농도를 언급하는 것이더라도, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하는 미생물 유기체가 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 세포내에서 생산할 수 있으며, 및/또는 배양 배지로 산물을 분비할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 기술된 배양 및 발효 조건 외에도, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 생합성을 달성하기 위한 생육 조건은, 배양 조건에 내삼투압제(osmoprotectant)의 첨가를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체는 내삼투압제가 존재하는 조건에서 유지, 증식 및 발효시킬 수 있다. 간략하게는, 내삼투압제는 삼투 물질 (osmolyte)로서 작용하며 본원에 기술된 미생물 유기체를 삼투 스트레스로부터 생존하는데 일조하는 화합물을 지칭한다. 내삼투압제로는, 베타인, 아미노산 및 당 트레할로스를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 것에 대한 비제한적인 예로는 글리신 베타인, 프랄린 베타인, 디메틸테틴, 디메틸설포니오프로피오네이트, 3-디메틸설포니오-2-메틸프로피오네이트, 피페콜산, 디메틸설포니오아세테이트, 콜린, L-카르니틴 및 엑토인이 있다. 일 측면에서, 상기 내삼투압제는 글리신 베타인이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 기술된 미생물 유기체를 삼투 스트레스로부터 보호하기에 적합한 내삼투압제의 양과 타입이, 사용되는 미생물 유기체에 따라 결정됨을 알 것이다. 배양 조건에서의 내삼투압제의 양은, 예컨대 약 0.1 mM 이하, 약 0.5 mM 이하, 약 1.0 mM 이하, 약 1.5 mM 이하, 약 2.0 mM 이하, 약 2.5 mM 이하, 약 3.0 mM 이하, 약 5.0 mM 이하, 약 7.0 mM 이하, 약 10 mM 이하, 약 50 mM 이하, 약 100 mM 이하, 또는 약 500 mM 이하일 수 있다.
일부 구현예들에서, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 임의의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물에 존재하는 원자의 동위원소 분포 (isotopic distribution)를 바꾸기 위해, 탄소 공급 원료 및 기타 세포 흡수원, 예를 들어 포스페이트, 암모니아, 설페이트, 클로라이드 및 기타 할로겐 화합물들을 선택할 수 있다. 상기에 열거된 다양한 탄소 공급 원료 및 기타 흡수원들은 총체적으로 "흡수원 (uptake sourcce)"로서 본원에 지칭될 것이다. 흡수원은 산물, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 중간 산물에 존재하는 임의의 원소, 또는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로로부터 분기된 반응들에서 제조되는 부산물에 대해 동원원소 농화를 제공할 수 있다. 동위원소 농화는 예를 들어 탄소, 수소, 산소, 질소, 황, 인, 염소 또는 기타 할로겐 화합물을 비롯한 임의의 타겟 원소에서 달성될 수 있다.
일부 구현예들에서, 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14의 비율이 바뀌도록 흡수원을 선택할 수 있다. 일부 구현예들에서, 흡수원은 산소-16, 산소-17 및 산소-18의 비율이 바뀌도록 선택될 수 있다. 일부 구현예들에서, 흡수원은 수소, 중수소 및 삼중수소의 비율이 바뀌도록 선택될 수 있다. 일부 구현예들에서, 흡수원은 질소-14 및 질소-15의 비율이 바뀌도록 선택될 수 있다. 일부 구현예들에서, 흡수원은 황-32, 황-33, 황-34 및 황-35의 비율이 바뀌도록 선택될 수 있다. 일부 구현예들에서, 흡수원은 인-31, 인-32 및 인-33의 비율이 바뀌도록 선택될 수 있다. 일부 구현예들에서, 흡수원은 염소-35, 염소-36 및 염소-37의 비율이 바뀌도록 선택될 수 있다.
일부 구현예들에서, 타겟 원소의 동위원소 비율은 하나 이상의 흡수원을 선택함으로써 원하는 비율로 바꿀 수 있다. 흡수원은 자연에서 발견되는 천연 소스나 인간이 제조한 소스로부터 유래될 수 있으며, 당해 기술 분야의 당업자는, 타겟 원소의 바람직한 동원원소 비율을 달성하기 위해, 천연 소스, 인간이 제조한 소스 또는 이들의 조합을 선택할 수 있다. 인간이 만든 소스의 예로는, 예를 들어, 화학 합성 반응으로부터 적어도 부분적으로 유래되는 흡수원을 포함한다. 이러한 동위원소 농화된 흡수원은 상업적으로 구입하거나 또는 실험실에서 제조하거나, 및/또는 선택적으로 상기 흡수원들의 천연 소스를 혼합하여 원하는 동위원소 비율을 달성할 수 있다. 일부 구현예들에서, 흡수원의 타겟 동위원소 비율은 자연에서 발견되는 흡수원의 바람직한 오리진을 선택함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 천연 소스는 생물학적 유기체로부터 유래되거나 이에 의해 합성되는 바이오베이스(biobase)이거나 또는 석유계 산물 또는 대기 등의 소스일 수 있다. 이러한 일부 구현예들에서, 탄소원은, 예를 들어, 탄소-14가 고갈될 수 있는 화석 연료-유래 탄소원, 또는 석유 유래 카운터파트 보다 탄소-14를 더 많이 포함할 수 있는 이산화탄소 등의 환경 또는 대기 탄소원으로부터 선택할 수 있다.
불안정한 탄소 동위원소인 탄소-14 또는 방사성 탄소 (radiocarbon)는 지구의 대기에서 탄소 원자 1012개 중 거의 1개이며, 반감기가 약 5700년이다. 탄소 스톡 (stock)은 우주선과 일반 질소 (14N)가 참여하는 핵 반응에 의해 대기 상층에 풍부하다. 화석 연료는 오래전에 부패되어 탄소-14가 없다. 화석 연료의 연소는 대기 중의 탄소-14의 비율 (fraction)을 낮출 것이며, 이를 '수스 효과(Suess effect)'라고 한다.
화합물에서 원소의 동원원소 비율을 확인하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 동위원소 농화는 AMS (accelerated mass spectrometry), SIRMS (Stable Isotope Ratio Mass Spectrometry) 및 SNIF-NMR (Site-Specific Natural Isotopic Fractionation by Nuclear Magnetic Resonance) 등의 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용한 질량 분광측정으로 쉽게 분석한다. 이러한 질량 분광 기법들은 액체 크로마토그래피 (LC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및/또는 기체 크로마토그래피 등의 분리 기법과 통합될 수 있다.
탄소의 경우, 미국에서는 국제 ASTM (the American Society for Testing and Materials)의 방사성탄소 연대 측정법을 이용하여 고체, 액체 및 기체 샘플의 바이오베이스 함량(biobased content)을 측정하기 위한 표준화된 분석 방법으로서 ASTM D6866을 개발하였다. 이 표준법은 제품의 바이오베이스 함량을 측정하기 위한 방사성탄소 연대 측정법을 이용하는데 근간이 된다. ASTM D6866은 2004년에 최초로 공개되었으며, 현재 사용되는 버전은 ASTM D6866-11 (2011년 4월 1일 발효됨)이다. 방사성탄소 연대 측정 기법들은 본원에 기술된 바 등의 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
화합물의 바이오베이스 함량은 탄소-14 (14C) 대 탄소-12 (12C)의 비를 통해 추정한다. 구체적으로, 프렉션 모던 (Fm: Fraction Modern)은 식: Fm = (S-B)/(M-B)으로부터 계산되며, 이때 B, S 및 M은 각각 블랭크, 샘플 및 모던 레퍼런스 (modern reference)의 14C/12C 비율이다. 프렉션 모던은 "모던"에 대한 샘플 14C/12C 비율의 편차 값이다. 모던은 mil 당 δ13CVPDB=-19에 대해 정규화한 NBS (National Bureau of Standard) 옥살산 I (즉, 표준 레퍼런스 물질 (SRM) 4990b)의 방사성 탄소 농도(AD 1950)의 95%로서 정의된다 (Olsson, The use of Oxalic acid as a Standard. In, Radiocarbon Variations and Absolute Chronology, Nobel Symposium, 12th Proc., John Wiley & Sons, New York (1970)). 예를 들어, AMS로 측정한 질량 분광측정 결과는 mil 당 δ13CVPDB=-19에 대해 정규화한 NBS 옥살산 I (즉, SRM 4990b)의 비활성 * 0.95라는 국제적으로 합의된 정의를 이용하여 계산한다. 이는 절대 (AD 1950) 14C/12C 비율 1.176 ± 0.010 x 10-12와 등가이다 (Karlen et al., Arkiv Geofysik, 4:465-471 (1968)). 표준 계산은 서로 간에 하나의 동위원소 흡수 차이, 예를 들어, 생물 시스템의 C12 대비 C13 대비 C14의 선호적인 흡수성 (preferential uptake)를 계산에 참작하며, 이들 보정은 δ13에 대해 보정된 Fm으로서 반영된다.
옥살산 표준물질 (SRM 4990b 또는 HOx 1)은 1955년 사탕무 작물로부터 제조되었다. 1000 lbs가 제조되었지만, 이 옥살산 표준물질은 더 이상 시판되지 않는다. 옥살산 II 표준물질 (HOx 2; N.I.S.T designation SRM 4990 C)은 1977년 프랑스 사탕무 당밀로부터 제조되었다. 1980년대 초반에, 12곳의 실험실 그룹이 2가지 표준물질의 비를 측정하였다. 옥살산 II / I의 활성 비율은 1.2933 ± 0.001 (중량 기준)이었다. HOx II의 동위원소 비율은 -17.8 / mille이다. ASTM D6866-11은 모던 표준물질로 이용가능한 옥살산 II 표준물질 SRM 4990 C (Hox2)를 사용할 것을 권고한다 (Mann, Radiocarbon, 25(2):519-527 (1983)에서의, 오리지날 대 현재 시판되는 옥살산 표준물질을 비교한 내용 참조). Fm = 0%는 물질에 탄소-14가 전혀 없으며, 즉 화석 (예, 석유계) 탄소원임을 의미한다. 1950년대 이후 핵 폭발 실험을 통해 대기로 탄소-14가 발산된 것을 보정한 다음, Fm = 100%은 전체가 모던 탄소원임을 나타낸다. 본원에서, "모던" 소스는 바이오베이스 소스를 포함한다.
ASTM D6866에 기술된 바와 같이, 모던 탄소의 퍼센트 (pMC)는 1950년대 핵 실험 프로그램의 효력이 지속되고 있고 소멸되지 않았기 때문에 100% 보다 클 수 있으며, 그 결과 ASTM D6866-11에 기술된 바와 같이 대기에 탄소-14가 상당히 농화되었다. 모든 샘플의 탄소-14 활성이 "pre-bomb" 표준물을 참조하고, 거의 모든 새로운 바이오베이스 제품들은 post-bomb 환경에서 만들어지기 때문에, 모든 pMC 값들은 (동위원소 분획에 대해 보정 후) 샘플의 진성의 바이오베이스의 함량을 더 잘 반영하도록 0.95 (2010 현재)를 곱해야 한다. 바이오베이스의 함량이 103% 보다 높다는 것은 분석 에러가 발생하였거나 또는 바이오베이스의 탄소 소스가 수년 이상 오래되었다는 것을 의미한다.
ASTM D6866은 물질의 총 유기 함량에 대해 바이오베이스 함량을 정량하며, 존재하는 무기 탄소와 기타 비-탄소 함유 물질은 고려하지 않는다. 예를 들어, 50%가 전분-기재 물질이고 50%가 물인 제품은, ASTM D6866을 기반으로, 바이오베이스 함량 = 100%인 것으로 간주된다 (유기 탄소 함량이 50%이고, 그 분획의 100%가 바이오베이스임). 다른 예로, 전분-기재 물질 50%, 석유계 물질 25% 및 물 25%로 구성된 제품은, 바이오베이스 함량 = 66.7% (유기 탄소 함량이 75%이나, 제품의 50%만 바이오베이스임)이다. 다른 예로, 유기 탄소가 50%인 제품과 석유계 제품은 바이오베이스 함량 = 0% (유기 탄소 함량이 50%이나, 화석 소스로부터 유래됨)이다. 즉, 화합물 또는 물질에서 바이오베이스 함량을 측정하는 잘 알려져 있는 방법 및 공지된 표준물질을 기반으로, 당해 기술 분야의 당업자는, 쉽게 바이오베이스 함량을 측정할 수 있거나, 또는 본원에서 이용하여 원하는 바이오베이스 함량을 가진 하위 제품 (downstream product)을 제조할 수 있다.
탄소-14를 이용한 연대 측정 기법을 사용하여 물질의 바이오베이스 함량을 정량하는 것은 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (Currie et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B, 172:281-287 (2000)). 예를 들어, 탄소-14 연대 측정법은 테레프탈레이트 함유 물질에서 바이오베이스 함량을 정량하는데 사용되고 있다 (Colonna et al., Green Chemistry, 13:2543-2548 (2011)). 특히, 재생가능한 1,3-프로판디올로부터 유래된 폴리프로필렌 테레프탈레이트 (PPT) 폴리머와 석유계 테레프탈산은 Fm 값이 거의 30%이었다 (즉, 폴리머 탄소의 3/11은 재생가능한 1,3-프로판디올로부터 유래되며, 8/11은 화석 최종 멤버 테레프탈산으로부터 유래됨) (Currie et al., supra, 2000). 반면, 재생가능한 1,4-부타디올과 재생가능한 테레프탈산으로부터 유래된 폴리부틸렌 테레프탈레이트 폴리머는 바이오베이스 함량이 90%를 초과하였다 (Colonna et al., supra, 2011).
이에, 일부 구현예에서, 본 발명은, 환경 탄소 흡수원으로 지칭되는, 대기 탄소 흡수원(atmospheric carbon uptake source)을 반영하는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비율을 가지는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간산물을 제공한다. 예를 들어, 일부 측면들에서, 상기 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간산물은 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 많게는 100%의 Fm 값을 가질 수 있다. 일부 구현예들에서, 흡수원은 CO2이다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 석유계 탄소 흡수원 (petroleum-based carbon uptake source)을 반영하는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비율을 가지는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 중간산물을 제공한다. 이러한 측면에서, 상기 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간산물은 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 Fm 값을 가질 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 대기 탄소 흡수원과 석유계 탄소 흡수원의 조합에 의해 달성되는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비율을 가지는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 중간산물을 제공한다. 이러한 흡수원들의 조합을 이용하는 것은 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비율을 다변화할 수 있는 한가지 수단이며, 해당 비율들은 흡수원들의 비율을 반영할 것이다.
나아가, 본 발명은, 본원에 기술된 생물학적으로 생산된 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물, 및 이로부터 유래된 산물에 관한 것으로서, 이때 상기 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물은 환경에 형성된 CO2에서와 대략 동일한 수치의 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 동위원소 비율을 가진다. 예를 들어, 일부 측면들에서, 본 발명은, 환경에 형성된 CO2에서와 대략 동일한 수치의 탄소-12 대 탄소-13 대 탄소-14 동위원소 비율을 가진, 또는 본원에 기술된 다른 임의의 비율을 가진, 생물 유래 (bioderived) 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이, 산물은 환경에 형성된 CO2에서와 대략 동일한 수치의 탄소-12 대 탄소-13 대 탄소-14 동위원소 비율, 또는 본원에 기술된 다른 임의의 비율을 가질 수 있는 것으로 이해되며, 여기서 상기 산물은, 본원에 기술된 바와 같이, 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 중간 산물로부터 제조되며, 상기 생물 유래 산물은 화학적으로 변형되어 최종 산물로 제조된다. 원하는 산물을 제조하기 위해, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 이의 중간 산물의 생물 유래 산물을 화학적으로 변형시키는 방법은, 본원에 기술된 바와 같이, 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명은, 환경에 형성된 CO2에서와 대략 동일한 수치의 탄소-12 대 탄소-13 대 탄소-14 동위원소 비율을 가진, 폴리우레탄, 폴리머, 코폴리머, 합성 고무, 수지, 화학적, 폴리머 중간산물, 유기 용매, 저혈당제, 폴리에스테르 수지, 라텍스, 단량체, 정제 화학, 농화학제, 약제 또는 향제를 추가로 제공하며, 여기서 상기 폴리우레탄, 폴리머, 코폴리머, 합성 고무, 수지, 화학제, 폴리머 중간 산물, 유기 용매, 저혈당제, 폴리에스테르 수지, 라텍스, 단량체, 정제 화학제, 농화학제, 약제 또는 향제는, 본원에 기술된 바와 같이, 직접 제조되거나, 또는 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 또는 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 중간 산물과 조합되어 제조된다.
2,4-펜타디에노에이트는, 유용한 치환된 부타디엔 유도체로서, 예를들면, 1-카르바모일-1,3-부타디엔 등의 다른 치환된 1,3-부타디엔 유도체를 제조하는 경로의 중요한 중간산물이다. 2,4-펜타디에노에이트가 활용되는 비제한적인 예로는, 폴리우레탄 등의 다수의 공업 화학제의 전구체인 아닐린의 제조와 다양한 폴리머 및 코폴리머의 제조에 사용될 수 있는 N-보호된-1,3-부타디엔 유도체의 생산을 포함한다. 즉, 일부 구현예들에서, 본 발명은, 본 발명의 비-천연성 미생물에 의해 생산되거나 본원에 기술된 방법을 이용하여 제조되는 하나 이상의 생물 유래의 2,4-펜타디에노에이트 또는 생물 유래의 2,4-펜타디에노에이트 중간산물을 포함하는, 바이오베이스의 폴리우레탄, 폴리머 또는 코폴리머를 제공한다.
부타디엔은 다수의 상업적인 공업적인 용도로 널리 사용되는 화합물이다. 이러한 용도에 대한 비제한적인 예로는 합성 고무 및 ABS 수지 등의 폴리머와 헥사메틸렌디아민 및 1,4-부탄디올 등의 화합물의 제조를 포함한다. 이에, 일부 구현예들에서, 본 발명은, 본 발명의 비-천연성 미생물에 의해 생산되거나 본원에 기술된 방법을 이용하여 제조되는 하나 이상의 생물 유래의 부타디엔 또는 생물 유래의 부타디엔 중간산물을 포함하는, 바이오베이스의 폴리머, 합성 고무, 수지 또는 화합물을 제공한다.
프로필렌은 다수의 상업적인 공업적인 용도로 널리 사용되는 화합물이다. 이러한 용도에 대한 비제한적인 예로는 폴리머, 폴리머 중간 산물 및 화합물, 예를 들어 폴리프로필렌, 아크릴산, 부탄올, 부탄디올, 아크릴로니트릴, 프로필렌 옥사이드, 이소프로판올 및 쿠멘의 제조를 포함한다. 아울러, 폴리프로필렌 등의 이러한 프로필렌 유도체들은 사출 성형과 같은 플라스틱 및 카페트와 같은 섬유를 비롯한 매우 다양한 제품을 제조하는데 사용된다. 이에, 일부 구현예들에서, 본 발명은, 본 발명의 비-천연성 미생물에 의해 생산되거나 본원에 기술된 방법을 이용하여 제조되는 하나 이상의 생물 유래의 프로필렌 또는 생물 유래의 프로필렌 중간산물을 포함하는, 바이오베이스의 폴리머, 폴리머 중간 산물 또는 화합물을 제공한다.
1,3-부탄디올은 다수의 상업적인 공업적인 용도로 널리 사용되는 화합물이다. 이러한 용도에 대한 비제한적인 예로는 식품 향미제의 유기용매로서 또는 저혈당제로서의 용도와 폴리우레탄 및 폴리에스테르 수지의 제조에서의 용도를 포함한다. 아울러, 광학 활성의 1,3-부탄디올은 또한 생물 활성 화합물의 합성과 액정에 사용된다. 또한, 1,3-부탄디올은 합성 고무 제품 (예, 타이어), 라텍스 및 수지를 제조하는데 사용되는 화합물인 1,3-부타디엔을 공업적으로 제조하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 발명은, 본 발명의 비-천연성 미생물에 의해 생산되거나 본원에 기술된 방법을 이용하여 제조되는 하나 이상의 생물 유래의 1,3-부탄디올 또는 생물 유래의 1,3-부탄디올 중간산물을 포함하는, 바이오베이스의 유기 용매, 저혈당제, 폴리우레탄, 폴리에스테르 수지, 합성 고무, 라텍스 또는 수지를 제공한다.
크로틸 알코올은 다수의 상업적인 공업적인 용도로 널리 사용되는 화합물이다. 이러한 용도에 대한 비제한적인 예로는 단량체, 정제 화학제, 예컨대 소르브산, 트리메틸하이드로퀴논, 크로톤산 및 3-메톡시부탄올, 농화학제 및 약제를 제조하는 화학 중간체인, 크로틸 할라이드, 에스테르 및 에테르의 제조를 포함한다. 크로틸 알코올은 또한 1,3-부타디엔을 제조하는 전구체로도 사용될 수 있다. 이에, 일부 구현예들에서, 본 발명은, 본 발명의 비-천연성 미생물에 의해 생산되거나 본원에 기술된 방법을 이용하여 제조되는 하나 이상의 생물 유래의 크로틸 알코올 또는 생물 유래의 크로틸 알코올 중간산물을 포함하는, 바이오베이스의 단량체, 정제 화합물, 농화학물, 또는 약제를 제공한다.
3-부텐-1-올은 다수의 상업적인 공업적인 용도로 널리 사용되는 화합물이다. 이러한 용도에 대한 비제한적인 예로는 약제, 농화학제, 향료 및 수지의 제조를 포함한다. 이에, 일부 구현예들에서, 본 발명은, 본 발명의 비-천연성 미생물에 의해 생산되거나 본원에 기술된 방법을 이용하여 제조되는 하나 이상의 생물 유래의 3-부텐-1-올 또는 생물 유래의 3-부텐-1-올 중간산물을 포함하는, 바이오베이스의 약제, 농화학제, 향료 및 수지를 제공한다.
본원에서, 용어 "생물 유래"는 생물 유기체로부터 유래되거나 합성되는 것을 의미하며, 생물 유기체에 의해 제조가능하므로 재생가능한 자원으로 간주될 수 있다. 이러한 생물 유기체는, 특히 본원에 기술된 본 발명의 미생물 유기체는, 공급 원료 또는 바이오매스, 예컨대 농작물, 식물, 세균 또는 동물 소스로부터 수득되는 당 또는 탄수화물을 활용할 수 있다. 다른 예로, 생물 유기체는 대기 탄소를 이용할 수 있다. 본원에서, 용어 "바이오베이스"는 전술한 바와 같이 본 발명의 생물 유래 화합물로 전체가 또는 일부분이 구성된 산물을 의미한다. 바이오베이스 또는 생물 유래 산물은 석유 또는 석유화학 공급 원료로부터 유래되거나 합성되는 석유 유래 산물과는 반대된다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트 또는 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트 경로의 중간산물을 포함하는 폴리우레탄, 폴리머 또는 코폴리머를 제공하며, 여기서 상기 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트 또는 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트 경로의 중간산물은 폴리우레탄, 폴리머 또는 코폴리머의 제조에 사용되는 2,4-펜타디에노에이트 또는 2,4-펜타디에노에이트 경로의 중간 산물의 전체 또는 일부이다. 즉, 일부 측면들에서, 본 발명은, 본원에 기술된 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트 또는 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트 경로의 중간산물을 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%로 포함하는, 바이오베이스의 폴리우레탄, 폴리머 또는 코폴리머를 제공한다. 부가적으로, 일부 측면들에서, 본 발명은, 제조에 사용되는 2,4-펜타디에노에이트 또는 2,4-펜타디에노에이트 경로의 중간 산물이 2,4-펜타디에노에이트 또는 2,4-펜타디에노에이트 경로의 중간 산물들의 생물 유래의 것과 석유 유래의 것의 조합인, 바이오베이스의 폴리우레탄, 폴리머 또는 코폴리머를 제공한다. 예컨대, 바이오베이스의 폴리우레탄, 폴리머 또는 코폴리머는 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트 50%와 석유 유래 2,4-펜타디에노에이트 50%를 이용하거나, 또는 상기 산물의 적어도 일부분이 본원에 기술된 미생물 유기체에 의해 생산되는 생물 유래 산물을 포함하는 한, 생물 유래/석유 유래 전구체들을 60%/40%, 70%/30%, 80%/20%, 90%/10%, 95%/5%, 100%/0%, 40%/60%, 30%/70%, 20%/80%, 10%/90% 등의 다른 적정 비율로 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트 또는 생물 유래 2,4-펜타디에노에이트 경로의 중간산물을 이용하여 폴리우레탄, 폴리머 또는 코폴리머를 제조하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있는 것으로 이해된다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 생물 유래 부타디엔 또는 생물 유래 부타디엔 경로의 중간 산물이 폴리머, 합성 고무, 수지 또는 화합물의 제조에 사용되는 부타디엔 또는 부타디엔 경로의 중간 산물의 일부 또는 전체인, 생물 유래 부타디엔 또는 생물 유래 부타디엔 경로의 중간 산물을 포함하는 폴리머, 합성 고무, 수지 또는 화합물을 제공한다. 이에, 일부 측면들에서, 본 발명은, 본원에 기술된 생물 유래 부타디엔 또는 생물 유래 부타디엔 경로의 중간 산물을 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%로 포함하는 바이오베이스의 폴리머, 합성 고무, 수지 또는 화합물을 제공한다. 부가적으로, 일부 측면들에서, 본 발명은, 제조에 사용되는 부타디엔 또는 부타디엔 경로의 중간 산물이 부타디엔 또는 부타디엔 경로의 중간 산물의 생물 유래와 석유 유래의 조합인, 바이오베이스의 폴리머, 합성 고무, 수지 또는 화합물을 제공한다. 예컨대, 바이오베이스의 폴리머, 합성 고무, 수지 또는 화합물은 생물 유래 부타디엔 50%와 석유 유래 부타디엔 50%를 이용하거나, 또는 상기 산물의 적어도 일부분이 본원에 기술된 미생물 유기체에 의해 생산되는 생물 유래 산물을 포함하는 한, 생물 유래/석유 유래 전구체들을 60%/40%, 70%/30%, 80%/20%, 90%/10%, 95%/5%, 100%/0%, 40%/60%, 30%/70%, 20%/80%, 10%/90% 등의 다른 적정 비율로 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 생물 유래 부타디엔 또는 생물 유래 부타디엔 경로의 중간산물을 이용하여 폴리머, 합성 고무, 수지 또는 화합물을 제조하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있는 것으로 이해된다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 생물 유래 프로필렌 또는 생물 유래 프로필렌 경로의 중간 산물이 폴리머, 폴리머 중간 산물 또는 화합물의 제조에 사용되는 프로필렌 또는 프로필렌 경로의 중간 산물의 일부 또는 전부인, 생물 유래 프로필렌 또는 생물 유래 프로필렌 경로의 중간 산물을 포함하는 폴리머, 폴리머 중간 산물 또는 화합물을 제공한다. 이에, 일부 측면들에서, 본 발명은, 본원에 기술된 생물 유래 프로필렌 또는 생물 유래 프로필렌 경로의 중간 산물을 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%로 포함하는 바이오베이스의 폴리머, 폴리머 중간 산물 또는 화합물을 제공한다. 부가적으로, 일부 측면들에서, 본 발명은, 제조에 사용되는 프로필렌 또는 프로필렌 경로의 중간 산물이 프로필렌 또는 프로필렌 경로의 중간 산물의 생물 유래와 석유 유래의 조합인, 바이오베이스의 폴리머, 폴리머 중간 산물 또는 화합물을 제공한다. 예컨대, 바이오베이스의 폴리머, 폴리머 중간 산물 또는 화합물은 생물 유래 프로필렌 50% 및 석유 유래 프로필렌 50%를 이용하거나, 또는 상기 산물의 적어도 일부분이 본원에 기술된 미생물 유기체에 의해 생산되는 생물 유래 산물을 포함하는 한, 생물 유래/석유 유래 전구체들을 60%/40%, 70%/30%, 80%/20%, 90%/10%, 95%/5%, 100%/0%, 40%/60%, 30%/70%, 20%/80%, 10%/90% 등의 다른 적정 비율로 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 생물 유래 프로필렌 또는 생물 유래 프로필렌 경로의 중간산물을 이용하여 폴리머, 폴리머 중간 산물 또는 화합물을 제조하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있는 것으로 이해된다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 생물 유래 1,3-부탄디올 또는 생물 유래 1,3-부탄디올 경로의 중간 산물이 유기 용매, 저혈당제, 폴리우레탄, 폴리에스테르 수지, 합성 고무, 라텍스, 또는 수지의 제조에 사용되는 1,3-부탄디올 또는 1,3-부탄디올 경로의 중간 산물의 일부 또는 전부인, 생물 유래 1,3-부탄디올 또는 생물 유래 1,3-부탄디올 경로의 중간 산물을 포함하는 유기 용매, 저혈당제, 폴리우레탄, 폴리에스테르 수지, 합성 고무, 라텍스, 또는 수지를 제공한다. 이에, 일부 측면들에서, 본 발명은, 본원에 기술된 생물 유래 1,3-부탄디올 또는 생물 유래 1,3-부탄디올 경로의 중간 산물을 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%로 포함하는 바이오베이스의 유기 용매, 저혈당제, 폴리우레탄, 폴리에스테르 수지, 합성 고무, 라텍스, 또는 수지를 제공한다. 부가적으로, 일부 측면들에서, 본 발명은, 제조에 사용되는 1,3-부탄디올 또는 1,3-부탄디올 경로의 중간 산물이 1,3-부탄디올 또는 1,3-부탄디올 경로의 중간 산물의 생물 유래와 석유 유래의 것의 조합인, 바이오베이스의 유기 용매, 저혈당제, 폴리우레탄, 폴리에스테르 수지, 합성 고무, 라텍스, 또는 수지를 제공한다. 예컨대, 바이오베이스의 유기 용매, 저혈당제, 폴리우레탄, 폴리에스테르 수지, 합성 고무, 라텍스, 또는 수지는 생물 유래 1,3-부탄디올 50% 및 석유 유래 1,3-부탄디올 50%를 이용하거나, 또는 상기 산물의 적어도 일부분이 본원에 기술된 미생물 유기체에 의해 생산되는 생물 유래 산물을 포함하는 한, 생물 유래/석유 유래 전구체들을 60%/40%, 70%/30%, 80%/20%, 90%/10%, 95%/5%, 100%/0%, 40%/60%, 30%/70%, 20%/80%, 10%/90% 등의 다른 적정 비율로 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 생물 유래 1,3-부탄디올 또는 생물 유래 1,3-부탄디올 경로의 중간산물을 이용하여 유기 용매, 저혈당제, 폴리우레탄, 폴리에스테르 수지, 합성 고무, 라텍스, 또는 수지를 제조하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있는 것으로 이해된다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 생물 유래 크로틸 알코올 또는 생물 유래 크로틸 알코올 경로의 중간 산물이 단량체, 정제 화학제, 농화학제 또는 약제의 제조에 사용되는 크로틸 알코올 또는 크로틸 알코올 경로의 중간 산물의 일부 또는 전체인, 생물 유래 크로틸 알코올 또는 생물 유래 크로틸 알코올 경로의 중간 산물을 포함하는 단량체, 정제 화학제, 농화학제 또는 약제를 제공한다. 이에, 일부 측면들에서, 본 발명은, 본원에 기술된 생물 유래 크로틸 알코올 또는 생물 유래 크로틸 알코올 경로의 중간 산물을 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%로 포함하는 바이오베이스의 단량체, 정제 화학제, 농화학제 또는 약제를 제공한다. 부가적으로, 일부 측면들에서, 본 발명은, 제조에 사용되는 크로틸 알코올 또는 크로틸 알코올 경로의 중간 산물이 크로틸 알코올 또는 크로틸 알코올 경로의 중간 산물의 생물 유래와 석유 유래의 것들의 조합인, 바이오베이스의 단량체, 정제 화학제, 농화학제 또는 약제를 제공한다. 예컨대, 바이오베이스의 단량체, 정제 화학제, 농화학제 또는 약제는 생물 유래 크로틸 알코올 50% 및 석유 유래 크로틸 알코올 50%를 이용하거나, 또는 상기 산물의 적어도 일부분이 본원에 기술된 미생물 유기체에 의해 생산되는 생물 유래 산물을 포함하는 한, 생물 유래/석유 유래 전구체들을 60%/40%, 70%/30%, 80%/20%, 90%/10%, 95%/5%, 100%/0%, 40%/60%, 30%/70%, 20%/80%, 10%/90% 등의 다른 적정 비율로 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 생물 유래 크로틸 알코올 또는 생물 유래 크로틸 알코올 경로의 중간산물을 이용하여 단량체, 정제 화학제, 농화학제 또는 약제를 제조하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있는 것으로 이해된다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 생물 유래 3-부텐-1-올 또는 생물 유래 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물이 약제, 농화학제, 향제 또는 수지의 제조에 사용되는 3-부텐-1-올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물의 일부 또는 전부인, 생물 유래 3-부텐-1-올 또는 생물 유래 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물을 포함하는 약제, 농화학제, 향제 또는 수지를 제공한다. 이에, 일부 측면들에서, 본 발명은, 본원에 기술된 생물 유래 3-부텐-1-올 또는 생물 유래 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물을 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%로 포함하는 바이오베이스의 약제, 농화학제, 향제 또는 수지를 제공한다. 부가적으로, 일부 측면들에서, 본 발명은, 제조에 사용되는 3-부텐-1-올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물이 3-부텐-1-올 또는 3-부텐-1-올 경로의 중간 산물의 생물 유래의 것과 석유 유래의 것의 조합인, 바이오베이스의 약제, 농화학제, 향제 또는 수지를 제공한다. 예컨대, 바이오베이스의 약제, 농화학제, 향제 또는 수지는 생물 유래 3-부텐-1-올 50% 및 석유 유래 크로틸 3-부텐-1-올 50%를 이용하거나, 또는 상기 산물의 적어도 일부분이 본원에 기술된 미생물 유기체에 의해 생산되는 생물 유래 산물을 포함하는 한, 생물 유래/석유 유래 전구체들을 60%/40%, 70%/30%, 80%/20%, 90%/10%, 95%/5%, 100%/0%, 40%/60%, 30%/70%, 20%/80%, 10%/90% 등의 다른 적정 비율로 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 생물 유래 3-부텐-1-올 또는 생물 유래 3-부텐-1-올 경로의 중간산물을 이용하여 약제, 농화학제, 향제 또는 수지를 제조하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있는 것으로 이해된다.
배양 조건은, 예컨대 액체 배양 과정 뿐만 아니라 발효 및 그외 대규모 배양 과정을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 생합성 산물에 대해 특히 유효한 수율은 혐기 또는 실질적으로 혐기적 배양 조건에서 달성될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 생합성을 달성하기 위한 배양 조건의 일 예는 혐기성 배양 또는 발효 조건을 포함한다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 비-천연성 미생물 유기체는 혐기 또는 실질적인 혐기 조건에서 유지, 배양 또는 발효시킬 수 있다. 간략하게는, 혐기 조건은 산소가 없는 환경을 지칭한다. 실질적인 혐기 조건은, 예를 들어, 배지내 용해된 산소 농도가 0 내지 10%의 포화율로 존재하는, 배양, 배치 발효 또는 연속 발효를 포함한다. 실질적인 혐기 조건은 또한 산소 1% 미만의 분위기로 유지되는 밀폐된 챔버 안에서 액체 배지내에서 또는 고체 한천 배지 상에서의 세포의 증식 또는 휴지를 포함한다. 상기 산소 비율은, 예컨대 상기 배양물에 N2/CO2 혼합물 또는 그외 적절한 산소 이외의 기체 또는 기체들을 투입함으로써 유지시킬 수 있다.
본원에 기술된 배양 조건은 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하기 위한 규모 확대 및 연속 배양일 수 있다. 배양 공정의 예는, 피드-배치 발효 (fed-batch fermentation) 및 배치 분리 (batch separation); 피드-배치 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리를 들 수 있다. 이러한 공정들 모두 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 상업적인 양으로 생합성에 의해 생산하는데에는 발효 공정이 특히 유용하다. 일반적으로, 그리고 비-연속식 배양 공정을 이용하는 경우와 같이, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올의 연속 및/또는 거의 연속적인 생산은, 본 발명의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생산하는 비-천연성 유기체를 지수기 (exponential phase)로의 증식을 유지 및/또는 거의 유지시키기에 충분한 영양분 및 배지에서 배양하는 단계를 포함할 것이다. 이러한 조건에서의 연속 배양은, 예컨대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 이상의 기간 동안의 배양을 포함할 수 있다. 추가적으로, 연속 배양은 1주일, 2주일, 3주일, 4주일 또는 5주일 이상에서, 최대 수 개월까지의 장기간을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 본 발명의 유기체는 특정 용도에서 적합하다면, 수시간 배양할 수 있다. 상기 연속 및/또는 거의 연속 배양 조건은 이러한 예시적인 기간에 포함된 모든 시간 간격을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 아울러, 본 발명의 미생물 유기체의 배양 시간은 원하는 목적을 위해 산물을 충분한 양으로 생산하기에 충분한 기간인 것으로 이해된다.
발효 공정은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 간략하게는, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 생합성 생산하기 위한 발효는, 예컨대 피드-배치 발효 및 배치 분리; 피드-배치 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리로 실시할 수 있다. 배치 및 연속 발효 공정의 예는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다.
상당량의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 연속 생산하기 위해, 본 발명의 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생산체를 이용한 전술한 발효 공정 외에도, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생산체는, 또한, 예컨대, 산물을 다른 화합물로 변환시키는 화학적 합성 공정에 동시에 투입하거나, 또는 산물을 발효 배양물로부터 분리한 다음 순차적으로 이를 필요에 따라 산물을 다른 화합물로 변환시키는 화학적 또는 효소적 변환 공정을 진행할 수 있다.
보다 우수한 생산체를 제조하기 위해, 대사 모델 연구를 이용하여 생장 조건을 최적화할 수 있다. 모델 연구를 통해 또한 경로의 이용성을 추가적으로 최적화하는 유전자 낫아웃을 설계할 수 있다 (예, 미국 특허 공개번호 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466, 미국 특허 7,127,379). 모델 분석을 통해 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올을 보다 효율적으로 생산하는 방향으로 대사를 이동시키는 세포 생육에 대한 효과들을 신뢰성있게 예견할 수 있다.
원하는 산물의 생합성에 유익한 대사 변이를 동정 및 설계하기 위한 한가지 컴퓨터 작업 방식은 OptKnock 전산 프래임워크이다 (Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)). OptKnock는 표적 산물을 과생산하는 유전적으로 안정한 미생물을 만드는, 유전자 결손 또는 파괴 전략을 제시하는 대사 모델링 및 시뮬레이션 프로그램이다. 구체적으로, 상기 프래임워크에서 원하는 생화학물질이 세포 생육의 필수 부산물이 되도록 강제하는 유전자 조작을 제안하기 위해, 미생물의 전체 대사 및/또는 생화학적 네트워크를 조사한다. 전략적으로 배치시킨 유전자 결손 또는 그외 기능성 유전자의 파괴를 통해, 생화학적 생산을 세포 생육과 커플링시킴으로써, 생물반응기에서의 장시간 경과 후 상기 조작된 균주에 부과되는 생육 선택압은 강제적인 생육과 커플링된 생화학적 생산의 결과로서 성능을 개선시킨다. 마지막으로, 유전자 결손의 구축시, OptKnock에서 선택된 유전자들은 게놈에서 완전히 제거되기 때문에, 설계된 균주는 야생형 형태로 되돌아갈 가능성이 거의 없다. 따라서, 상기 컴퓨터를 통한 계산 방법을 이용하여, 원하는 산물의 생합성을 도출하는 대안적인 경로를 동정하거나, 또는 원하는 산물의 생합성을 추가로 최적화하기 위해 비-천연성 미생물 유기체와 조합하여 사용할 수 있다.
간략하게 설명하면, OptKnock는 본원에서 세포 대사를 모델링하기 위한 계산 방법 및 시스템을 지칭하는 용어이다. OptKnock 프로그램은 특정 제한(particular constraint)을 플럭스 밸런스 분석(FBA) 모델과 통합시킨 방법 및 모델 프래임워크와 관련있다. 이러한 제한으로는, 예컨대 정성적인 동역학 정보(qualitative kinetic information), 정성적인 조절 정보, 및/또는 DNA 마이크로어레이 실험 데이터를 포함한다. 또한, OptKnock는, 예를 들어, 플럭스 밸런스 모델로부터 나오는 플럭스 바운더리를 엄격하게 하고 후속적으로 유전자 추가 또는 결손시의 대사 네트워크의 성능 한계를 탐지함으로써, 다양한 대사 문제들에 대한 해법을 도출한다. OptKnock 전산 프래임워크는 대사 네트워크의 성능 한계의 유효 쿼리를 허용하는 모델 포뮬레이션을 구축할 수 있으며, 구해지는 혼성-정수 선형 프로그래밍 문제점을 해결하는 방법을 제공할 수 있다. 본원에서 OptKnock로 지칭되는 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법들은, 예를 들어 2002년 1월 10일자로 출원된 미국 공개공보 2002/016854, 2002년 1월 10일자로 출원된 국제 특허 제 PCT/US02/00660, 및 2007년 8월 10일자로 출원된 미국 공개공보 2009/0047719에 개시되어 있다.
산물의 생합성 생산에 유리한 대사 변이를 동정 및 설계하기 위한 또 다른 계산법은, SimPheny®로 칭하는 대사 모델링 및 시뮬레이션 시스템이다. 이 계산법 및 시스템은 예컨대 2002년 6월 14일자로 출원된 미국 공개공보 2003/0233218 및 2003년 6월 13일자로 출원된 국제 특허 출원 PCT/US03/18838에 개시되어 있다. SimPheny®는 인 실리코(in silico) 네트워크 모델을 만들고, 생물 시스템의 화학 반응들을 통해 매스, 에너지 또는 전하의 흐름을 시뮬레이션하여 상기 시스템에서의 화학 반응의 임의의 및 모든 가능한 작용기를 포괄하는 해결 영역을 규정함으로써, 상기 생물 시스템에서 허용되는 다양한 활성들을 결정하기 위해 사용될 수 있는 전산 시스템이다. 이러한 방식은, 상기 해결 영역이 포함된 반응들의 공지된 화학량론 뿐만 아니라 반응을 통한 최대 플럭스와 조합된 반응 열역학적 한계 및 용량 한계 등의 한계로 규정되기 때문에, 제한 조건 기반의 모델링(constraints-based modeling)으로 지칭된다. 이러한 제한에 의해 규정되는 영역을 조사하여, 상기 생물 시스템 또는 그것의 생화학적 성분들의 표현형적 역량 및 행태를 결정할 수 있다.
이러한 계산법은, 생물 시스템들이 유연하고 다수의 다른 방식으로도 동일한 결과에 도달할 수 있기 때문에, 생물학적 현실에 부합된다. 생물 시스템은 모든 살아있는 시스템들이 직면해야 하는 기본적인 제약들에 의해 제한되는 진화 기전을 통해 설계된다. 따라서, 제한 조건 기반의 모델링 전략은 이러한 일반적인 현실을 포괄한다. 더욱이, 제한 조건의 엄격화를 통해 네트워크 모델에 추가적인 제한을 계속적으로 부과하는 능력은 상기 해결 영역의 크기를 줄이게 되고, 그래서 생리학적 성능 또는 표현형을 예견할 수 있는 정확도가 향상된다.
본 발명의 교시 및 지침을 감안하여, 당해 기술 분야의 당업자는 숙주 미생물 유기체에서 원하는 화합물의 생합성을 설계 및 구현하기 위해 대사 모델링 및 시뮬레이션에 다양한 계산 프래임워크를 적용할 수 있을 것이다. 이러한 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법은, 예를 들어 SimPheny® 및 OptKnock로 상기에 예시된 전산 시스템을 포함한다. 본 발명을 예시하기 위해, 모델링 및 시뮬레이션을 위한 OptKnock 계산 프래임워크 체계와 관련하여 일부 방법들을 본원에서 기술한다. 당해 기술 분야의 당업자들은, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 임의의 이러한 다른 대사 모델링 및 시뮬레이션 계산 프래임워크 및 방법에, OptKnock를 이용한 대사 변이의 동정, 설계 및 구현을 적용하는 방법을 알 것이다.
전술한 방법들은 파괴할 한가지 이상의 대사 반응 세트를 제공할 것이다. 상기 세트 또는 대사 변이에서 각 반응의 제거시, 원하는 산물은 유기체의 증식기 동안에 필수 산물로서 생산될 수 있다. 반응들은 공지되어 있으므로, bilevel OptKnock 문제에 대한 해법은, 또한, 반응 세트의 각 반응을 촉매하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 관련 유전자 또는 유전자들을 제공해 줄 것이다. 반응 세트와, 각 반응에 참여하는 효소를 코딩하는 해당 유전자를 동정하는 것은, 일반적으로 효소와 코딩 유전자 간의 관련성이 포함된 반응 데이타베이스를 이용한 반응들의 상관 관계를 통해 달성되는 자동화된 과정이다.
일단 동정되면, 원하는 산물의 생산을 달성하기 위해 파괴시켜야 하는 반응 세트는, 세트에 포함된 각 대사 반응을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 기능적 파괴에 의해, 타겟 세포 또는 유기체에서 구현된다. 상기 반응의 기능적 파괴를 달성하는데 특히 유용한 한가지 수단은, 각 코딩 유전자의 결손이다. 그러나, 일부 경우에, 예컨대 프로모터 또는 조절 인자에 대한 cis 결합 부위와 같은 조절 영역의 돌연변이, 결손 등의 기타 유전적 이상에 의해, 또는 다수 위치들 중 임의 위치에서의 코딩 서열의 절단(truncation)에 의해, 상기 반응을 파괴하는 것이 유익할 수 있다. 유전자 세트의 전체 결손까지는 아닌 그 미만의 수준의 결손을 발생시키는 상기한 이상은, 예컨대 산물의 커플링의 신속한 평가가 필요할 때 또는 유전자 복원이 이루어질 가능성이 거의 없을 경우에, 유용할 수 있다.
추가적인 반응 세트의 파괴 또는 생육과 커플링된 원하는 산물의 생합성 등의 생합성을 달성할 수 있는 대사 변이를 유도하는, 전술한 bilevel OptKnock 문제에 대한 추가적인 생산적인 해법을 동정하기 위해, 정수 컷(integer cut)으로 칭해지는 최적화 방법을 실행할 수 있다. 상기 방법은, 상기 예시된 OptKnock 문제를, 각 반복시 정수 컷으로 지칭되는 추가적인 제한을 통합하여, 반복적으로 해결함으로써, 진행된다. 정수 컷 제한은, 상기 해결 과정이, 산물 생합성과 생육을 필수적으로 조합시킨 임의의 이전 반복에서 동정된 반응의 실제 동일한 세트가 선택되지 않게 방지한다. 예컨대, 앞서 동정된 생육과 결합된 대사 변이에서 파괴시킬 반응들 1, 2 및 3가지가 확인된다면, 하기 제한으로 동일 반응이 후속 해법에서 동시에 고려되지 않도록 한다. 정수 컷 방법은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 Burgard et al., Biotechnol. Prog. 17:791-797 (2001)에서 찾아 볼 수 있다. 대사 모델링 및 시뮬레이션을 위해 OptKnock 계산 프래임워크와의 조합 사용에 대한 본원에 기술된 모든 방법들에서와 같이, 반복적인 계산 분석에서 쓸데없는 반복을 줄이는 정수 컷 방법을, 또한, 예컨대, SimPheny® 등의 당해 기술 분야에 널리 공지된 그외 계산 프래임워크와 함께 적용할 수 있다.
타겟 생화학 산물의 생산을 동정된 유전자 변이를 가지도록 조작된 세포 또는 유기체의 생육과 필연적으로 커플링시키는 방법을 비롯하여, 본원에 예시된 방법들로, 원하는 산물을 생합성으로 생산하는 세포 및 유기체를 구축할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 계산법으로 OptKnock 및 SimPheny® 중에서 선택되는 인 실리코(in silico) 방법으로 확인되는 대사 변이를 동정 및 구현할 수 있다. 대사 변이 세트는, 예컨대 하나 이상의 생합성 경로 효소들의 부가 및/또는 유전자 결손에 의한 파괴 등의 한가지 이상의 대사 반응의 기능적 파괴를 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, OptKnock 방법은 오랜 기간의 생육 선택을 거쳤을 때 미생물 돌연변이 네트워크가 계산적으로 예측되는 최대-증식 표현형을 나타내는 방향으로 진화할 수 있다는 전제에서 개발되었다. 즉, 이러한 방법은 선택압 하에서 유기체의 자기 최적화 능력을 활용한다. OptKnock 프래임워크는 네트워크 화학량론에 근거하여 생화학적 생산과 세포 증식을 강제로 커플링시키는 유전자 결손의 조합을 철저하게 조사할 수 있다. 최적 유전자/반응 낫아웃을 확인하는데에는, 형성되는 네트워크에 대한 최적 증식 해법이 대상 생화학적 산물을 과생산하도록, 활성 반응 세트를 선택하는 2단식 최적화 문제의 해법이 요구된다(Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)).
에스케리키아 콜라이 대사의 인 실리코 화학량론 모델을 채택하여, 기존에 예시되고, 예를 들어 미국 특허 공개공보 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466, 및 미국 특허 7,127,379에 기술된 바와 같이, 대사 경로의 필수 유전자들을 동정할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, OptKnock의 수리적 프래임워크를 적용하여, 원하는 산물을 증식과 조합하여 생산가능하게 하는, 유전자 결손을 정확하게 파악할 수 있다. 나아가, 상기 이단식 OptKnock 문제 해법은 오직 하나의 결손 세트만을 제공한다. 모든 의미 있는 해법들, 즉 증식과 조합되어 생산되게 하는 낫아웃 세트들을 모두 열거하기 위해, 정수 컷으로 지칭되는 최적화 기법을 구현할 수 있다. 이는, 전술한 바와 같이, 각 반복에서 정수 컷으로 지칭되는 추가적인 제한을 추가하면서 OptKonck 문제를 반복적으로 해결하는 과정을 수반한다.
본원에 기술된 바와 같이, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로의 원하는 활성을 코딩하는 핵산을 숙주 유기체에 도입할 수 있다. 일부 경우에, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로 효소 또는 단백질의 활성을 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 생산을 증가시키도록 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대, 단백질 또는 효소의 활성을 증가시키는 공지된 돌연변이는 코딩 핵산 분자에 도입시킬 수 있다. 아울러, 효소 또는 단백질의 활성을 높이거나 및/또는 저해 활성을 낮추기 위해, 예컨대 네거티브 조절자의 활성을 낮추기 위해, 최적화 방법을 적용할 수 있다.
이러한 최적화 방법의 한가지가 방향성 진화(directed evolution)이다. 방향성 진화는, 효소의 특성을 개선 및/또는 변이시키기 위해, 특정 유전자로 표적화된 돌연변이를 도입하는 과정을 포함하는, 강력한 방법이다. 향상된 및/또는 변이된 효소는 다수의 (예, >104) 효소 변이체를 자동으로 스크리닝할 수 있는 민감성 고성능 스크리닝 분석을 개발 및 구현하여 동정할 수 있다. 돌연변이 유발 및 스크리닝의 반복 라운드를 전형적으로 수행하여 효소에 최적화된 특성을 부여할 수 있다. 돌연변이를 유발하기 위한 유전자의 영역들을 동정하는데 도움이 될 수 있는 수리적 알고리즘들도 또한 개발되었고, 제조 및 스크리닝할 필요가 있는 효소 변이체들의 수를 현저하게 줄일 수 있다. 다양한 변이체 라이브러리 제조에 유효한 다수의 방향성 진화 기법들이 개발되었고 (Hibbert et al., Biomol.Eng 22:11-19 (2005); Huisman and Lalonde, In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs. 717-742 (2007), Patel (ed.), CRC Press; Otten and Quax. Biomol.Eng 22:1-9 (2005).; 및 Sen et al., Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223 (2007)), 많은 효소 클래스들에서의 매우 다양한 특성을 개선시키기 위해, 이러한 방법들이 성공적으로 적용되었다. 방향적 진화 기법에 의해 향상 및/또는 변이시킨 효소 특징들로는, 예컨대 비-천연성 기질의 변환을 위한, 선택성/특이성; 확실한 고온 처리를 위한 온도 안정성; 높거나 낮은 pH 조건에서의 생물학적 처리를 위한 pH 안정성; 기질 또는 산물 관용성, 이로써 높은 생산 역가를 달성할 수 있음; 비-천연성 기질들을 포괄하기 위한 광범위한 기질 결합성 등의, 결합성 (Km); 산물, 기질 또는 주요 중간산물에 의한 저해를 없애기 위한, 저해성 (Ki); 원하는 플럭스를 달성하기 위해 효소적 반응 속도를 높이기 위한, 활성 (kcat); 단백질 수율 및 전체 경로 플럭스를 높이기 위한, 발현 수준; 호기 조건에서 공기 민감성 효소 작동을 위한, 산소 안정성; 및 산소가 존재하지 않는 조건에서 호기성 효소의 작동을 위한, 혐기 활성을 포함한다.
특정 효소의 원하는 특징을 표적하기 위한 유전자의 돌연변이 유발 및 다양화를 위해 다수의 예시적인 방법들이 개발되었다. 이러한 방법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법들 중 임의 방법을 이용하여 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-1-올 경로 효소 또는 단백질의 활성을 변형 및/또는 최적화할 수 있다. 그러한 방법으로는, 비제한적인 예로서, PCR 반응에 DNA 중합효소의 피델리티(fidelity)를 낮춤으로써 랜덤 포인트 돌연변이를 도입하는 EpPCR (Pritchard et al., J Theor.Biol. 234:497-509 (2005)); 완전한 환형 플라스미드를 주형으로 사용하고, 마지막 뉴클레오티드 2개에 엑소뉴클레아제 내성 티오포스페이트 결합을 구비한 랜덤 6 mer를 이용하여 플라스미드를 증폭시킨 다음, 세포로 형질전환시키고, 세포내에서 플라스미드는 탠덤 리피트에서 다시 환화되는 것을 제외하고는, epPCR과 동일한 에러-유발 롤링 서클 증폭(Error-prone Rolling Circle Amplification) (epRCA) (Fujii et al., Nucleic Acids Res. 32:e145 (2004); 및 Fujii et al., Nat. Protoc. 1:2493-2497 (2006)); 전형적으로 Dnase I 또는 Endo V와 같은 뉴클레아제로 2개 이상의 변이체 유전자를 절단하여, DNA 중합효소의 존재 중에서 어닐링 및 연장 사이클에 의해 재조립되는 랜덤 단편 풀을 제조함으로써, 키메라 유전자 라이브러리를 구축하는 과정을 수반하는, DNA 또는 패밀리 셔플링 (Stemmer, Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751 (1994); 및 Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)); 주형을 프라이밍한 후 변성과 매우 짧은 시간 기간(약 5초)의 어닐링/연장으로 이루어진 2단계 PCR 사이클을 반복하는 과정을 수반하는 스테거드 연장(Staggered Extension) (StEP) (Zhao et al., Nat. Biotechnol. 16:258-261 (1998)); 랜덤 서열 프라이머를 사용하여 주형의 여러가지 세그먼트에 대해 상보적인 다수의 짧은 DNA 단편을 제조하는 랜덤 프라이밍 재조합 (Random Priming Recombination, RPR) (Shao et al., Nucleic Acids Res 26:681-683 (1998))을 포함한다.
추가적인 방법으로, 선형화된 플라스미드 DNA를 사용하여 미스매치 복원에 의해 복원되는 헤테로두플렉스를 형성하는 헤테로두플렉스 재조합(Heteroduplex Recombination) (Volkov et al, Nucleic Acids Res. 27:e18 (1999); 및 Volkov et al., Methods Enzymol. 328:456-463 (2000)); Dnase I 단편화와 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 크기 분획화를 이용한 RACHITT (Random Chimeragenesis on Transient Templates) (Coco et al., Nat. Biotechnol. 19:354-359 (2001)); 주형의 풀로서 사용되는 단방향성 ssDNA 단편의 존재 중에서 프라이머로부터 한쪽 방향으로 자라는 가닥들의 주형 스위칭을 수반하는 RETT (Recombined Extension on Truncated templates) (Lee et al., J. Molec. Catalysis 26:119-129 (2003)); 축중 프라이머를 사용하여 분자들 간의 재조합을 제어하는 DOGS (Degenerate Oligonucleotide Gene Shuffling) (Bergquist and Gibbs, Methods Mol.Biol 352:191-204 (2007); Bergquist et al., Biomol.Eng 22:63-72 (2005); Gibbs et al., Gene 271:13-20 (2001)); 대상 유전자 또는 유전자 단편에서 1 bp가 결손된 조합 라이브러리(combinatorial library)를 구축하는 ITCHY(Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzyme) (Ostermeier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562-3567 (1999); 및 Ostermeier et al., Nat. Biotechnol. 17:1205-1209 (1999)); 포스포티오에이트 dNTA를 이용하여 절단체(truncation)를 제조하는 것을 제외하고는 ITCHY와 유사한 THIO-ITCHY(Thio-Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzyme) (Lutz et al., Nucleic Acids Res 29:E16 (2001)); 재조합 유전자에 대한 ITCHY와 DNA 셔플링 방법 2가지를 조합한 SCRATCHY (Lutz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11248-11253 (2001)); epPCR로 제작한 후, 유용한 활성을 보유한 것을 스크리닝/선별하는 RNDM (Random Drift Mutagenesis) (Bergquist et al., Biomol. Eng. 22:63-72 (2005)); 포스포티오에이트 뉴클레오티드의 랜덤 병합 및 절단을 이용하여 랜덤 길이의 단편들의 풀을 제조하고, 이러한 풀을 주형으로 사용하여 이노신 등의 "유니버셜" 염기들의 존재 하에 연장시키고, 이노신-함유 상보체의 복제로 랜덤 염기 병합이 이루어지고, 결과적으로 돌연변이가 유발되는, 랜덤 돌연변이 유발 방법인, SeSaM (Sequence Saturation Mutagenesis) (Wong et al., Biotechnol. J. 3:74-82 (2008); Wong et al., Nucleic Acids Res. 32:e26 (2004); 및 Wong et al., Anal. Biochem. 341:187-189 (2005)); "타겟에서 모든 유전자 다양성"을 코딩하고 셔플링된 후대(shuffled progeny)에 대해 매우 다양한 다양성을 허용할 수 있도록 설계된 중첩되는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 합성 셔플링(Synthetic Shuffling) (Ness et al., Nat. Biotechnol. 20:1251-1255 (2002)); dUTP를 병합 후 우라실 DN글리코실라제 처리한 다음 피페리딘 처리을 처리하여 엔드포인트 DNA 단편화를 수행하는, 뉴클레오티드 교환 및 절개 기법(Nucleotide Exchange and Excision Technology) NexT (Muller et al., Nucleic Acids Res. 33:e117 (2005))를 포함한다.
추가적인 방법으로, 링커를 사용하여 2개의 관련성이 멀거나 관련성이 없는 유전자들이 융합되게 촉진시키고, 2종의 유전자들 간에 다양한 키메라를 제조함으로써 단일-교차 하이브리드 라이브러리를 제조하는, 서열 상동성-독립적인 단백질 재조합(SHIPREC) (Sieber et al., Nat. Biotechnol. 19:456-460 (2001)); 출발 물질이 삽입체를 포함하는 슈퍼코일형의 dsDNA 플라스미드와 원하는 돌연변이 부위에 대해 축중인 2개의 프라이머를 포함하는, 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(Gene Site Saturation Mutagenesis, GSSM™) (Kretz et al., Methods Enzymol. 388:3-11 (2004)); 제한된 영역을 다수의 가능한 아미노산 서열 변이로 치환시키는 짧은 올리고뉴클레오티드 카세트를 사용하는, 조합 카세트 돌연변이 유발(Combinatorial Cassette Mutagenesis, CCM) (Reidhaar-Olson et al. Methods Enzymol. 208:564-586 (1991); 및 Reidhaar-Olson et al. Science 241:53-57 (1988)); 기본적으로 CCM과 비슷하지만, 높은 돌연변이 유발율로 epPCR을 이용하여 핫 스팟과 핫 영역을 동정한 다음 CMCM으로 연장하여 단백질 서열 스페이스의 한정된 영역을 포괄(cover)하는, 조합형 다중 카세트 돌연변이 유발(Combinatorial Multiple Cassette Mutagenesis, CMCM) (Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591 (2001)); DNA 중합효소 III의 돌연변이 서브유닛을 코딩하는 플라스미드-유래의 mutD5 유전자를 이용하여 조건부 ts 돌연변이 유발 플라스미드가 선택 과정 중에 랜덤 및 천연 돌연변이 빈도를 20에서 4000 X로 증가시키며, 선택 과정이 필요없을 때에는 유해한 돌연변이가 축적되는 것을 차단할 수 있는 돌연변이 유발 균주 기법(Mutator Strains technique) (Selifonova et al., Appl. Environ. Microbiol. 67:3645-3649 (2001)); Low et al., J. Mol. Biol. 260:359-3680 (1996))을 포함한다.
추가적인 방법의 예로는, 선택된 아미노산의 조합 돌연변이(combinatorial mutation)를 분석 및 최적화하는 다향성 돌연변이를 유발하는, LTM (Look-Through Mutagenesis) (Rajpal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:8466-8471 (2005)); 한번에 복수의 유전자에 적용할 수 있거나, 또는 단일 유전자의 대규모 키메라(복수의 돌연변이) 라이브러리를 제조할 수 있는 DNA 셔플링 방법인, 유전자 어셈블리 (Tunable GeneReassembly™ (TGR™) Technology supplied by Verenium Corporation); 특정 폴드를 가지고 있는 구조적으로 정의된 단백질 백본을 고정하고, 폴드와 전체 단백질 에너제틱스를 안정화시킬 수 있는 아미노산 치환에 대해 서열 스페이스를 검색하며, 일반적으로 공지된 3차원 구조를 가진 단백질에 대해 가장 효과적으로 작용하는 최적화 알고리즘인, PDA (in Silico Protein Design Automation) (Hayes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:15926-15931 (2002)); 및 구조/기능에 대한 지식을 이용하여 효소 개선이 가능한 부위를 선택하는 단계, Stratagene QuikChange (Stratagene; San Diego CA)와 같은 돌연변이 유발 방법을 이용하여 선택한 부위에서의 포화 돌연변이 유발(saturation mutagenesis)을 수행하는 단계, 원하는 특징을 스크리닝/선별하는 단계, 및 개선된 클론(들)을 이용하여 다른 부위에 대해서도 다시 시작하여 원하는 활성이 달성될 때까지 계속 반복하는 단계를 포함하는, ISM (Iterative Saturation Mutagenesis) (Reetz et al., Nat. Protoc. 2:891-903 (2007); 및 Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751 (2006))을 포함한다.
돌연변이를 유발하기 위한 임의의 전술한 방법들은 단독으로 또는 임의 조합하여 사용할 수 있다. 아울러, 방향성 진화 방법들 중 임의의 한가지 방법 또는 조합을 본원에 기술된 후천적인 진화 기법과 더불어 사용할 수 있다.
본원에 제공된 본 발명의 내용에는 본 발명의 다양한 구현예들의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않은 변형이 포함되는 것으로 이해된다. 따라서, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 I
2-아미노펜타노에이트, 2-옥소아디페이트 및 글루타릴-CoA로부터 2,4-펜타디에노에이트, 3-부텐-1-올 및 부타디엔의 생산 경로
2,4-펜타디에노에이트, 3-부텐-1-올 및 부타디엔까지의 몇몇 경로를 도 1에 도시한다. 출발 대사산물은 2-옥소아디페이트, 글루타릴-CoA 및 5-아미노펜타노에이트를 포함한다. 이들 경로는, 다음과 같은 효소 하나 이상에 의해 촉매된다: 2-아미노아디페이트 데카르복실라제, 5-아미노펜타노에이트 리덕타제, 5-아미노펜트-2-에노에이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제, 2-옥소아디페이트 데카르복실라제, 글루타레이트 세미알데하이드 리덕타제, 5-하이드록시발레레이트 데하이드로게나제, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 데하이드라타제, 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제, 5-아미노펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제, 5-아미노펜트-2-에노에이트 데아미나제, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 리덕타제, 5-하이드록시발레릴-CoA 트랜스퍼라제 및/또는 신테타제, 5-하이드록시펜타노일-CoA 데하이드로게나제, 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 데하이드라타제, 2,4-펜타디에노일-CoA 트랜스퍼라제, 신테타제 또는 하이드롤라제, 5-하이드록시펜트-2-에노일-CoA 트랜스퍼라제 또는 신테타제, 5-하이드록시발레릴-CoA 데하이드라타제/데하이드로게나제, 2-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 2-옥소아디페이트:페리독신 옥시도리덕타제, 2-옥소아디페이트 포르메이트 리아제, 글루타릴-CoA 리덕타제, 2,4-펜타디에노에이트 데카르복실라제, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트 데카르복실라제, 3-부텐-1-올 데하이드라타제 및 5-하이드록시발레레이트 데카르복실라제.
글루타릴-CoA는 벤조일-CoA, 라이신 및 트립토판 등의 수많은 대사산물들의 분해에 있어 중간 산물이다. 또한, 글루타릴-CoA는 예를 들어 도 2에 도시된 경로를 이용하여 생합성할 수도 있다. 글루타릴-CoA는 5가지 이상의 효소 단계들에서 2,4-펜타디에노에이트로 변환될 수 있다. 제1 단계에서는, 글루타릴-CoA가 글루타레이트 세미알데하이드로 글루타릴-CoA 리덕타제에 의해 환원된다 (단계 S). 알데하이드 리덕타제 효소에 의해 다시 5-하이드록시발레레이트로의 환원이 촉매된다 (단계 E). 5-하이드록시발레레이트는 그런 후 단계 L에서 CoA 트랜스퍼라제 또는 신테타제에 의해 5-하이드록시발레릴-CoA로 활성화된다. 데하이드라타제 및 데하이드로게나제 활성을 가진 2가지 기능의 효소에 의해 5-하이드록시발레릴-CoA는 2,4-펜타디에노일-CoA로의 변환이 촉매된다 (단계 Q). 다른 예로, 이 반응은 개별 효소들에 의해 2 단계로 촉매된다 (단계 M, N). 2,4-펜타디에노에이트는 CoA 트랜스퍼라제, 신테타제 또는 하이드롤라제에 의해 CoA 모이어티가 제거되어 형성된다 (단계 O). 2,4-펜타디에노에이트 또는 2,4-펜타디에노일-CoA는 도 6에 도시된 다수의 경로들에 의해 부타디엔으로 추가로 변환될 수 있다. 5-하이드록시발레레이트를 2,4-펜타디에노에이트 및 부타디엔로 변환하는 다른 경로들도 알려져 있다. 또한, 5-하이드록시발레레이트 중간 산물은 하나 이상의 효소 단계에서 3-부텐-1-올로 변환될 수 있다. 5-하이드록시발레레이트에서 3-부텐-1-올로의 직접 변환은 알켄을 형성하는 데카르복실라제에 의해 촉매된다 (단계 W). 간접 변환은 5-하이드록시발레레이트에서 5-하이드록시펜트-2-에노에이트로의 산화 및 이후 3-부텐-1-올로의 탈카르복시화 (단계 F 및 U)를 수반한다. 3-부텐-1-올을 산물로서 분리하거나, 또는 추가로 탈수시켜 부타디엔을 제조할 수 있다. 탈수는 효소 또는 촉매 반응을 통해 진행된다.
도 1에 도시된 경로의 다른 출발 물질은 5-아미노펜타노에이트이다. 5-아미노펜타노에이트는 라이신, 오르니틴 및 프롤린 분해시 형성되는 중간산물이다. 5-아미노펜타노에이트를 글루타레이트 세미알데하이드로 변환시키는데에는 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제가 필요하다. 그런 후, 글루타레이트 세미알데하이드는 전술한 바와 같이 2,4-펜타디에노에이트, 3-부텐-1-올 또는 부타디엔으로 변환된다. 다른 예로, 5-아미노펜타노에이트는 에노익산 리덕타제에 의해 5-아미노펜트-2-에노에이트로 산화된다 (단계 B). 5-아미노펜트-2-에노에이트는 탈아민화되어 2,4-펜타디에노에이트가 된다. 또 다른 구현예로, 5-아미노펜트-2-에노에이트가 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제에 의해 먼저 이의 대응되는 알데하이드인, 5-하이드록시펜트-2-에노에이트로 변환된다. 5-하이드록시펜트-2-에노에이트는 그런 후 직접 (단계 G) 또는 CoA 중간 산물 (단계 P, N, Q)을 경유하여 2,4-펜타디에노에이트로 탈수된다.
2-아미노아디페이트 및 2-옥소아디페이트 (알파-케토아디페이트로도 지칭됨)는 사카로마이세스 세레비지애 등의 유기체에서 라이신 대사의 중간산물이다. 2-옥소아디페이트는 또한 효소 호모시트레이트 신타제, 호모아코니타제 및 호모이소시트레이트 데하이드로게나제에 의해 알파-케토글루타레이트 및 아세틸-CoA로부터 생성되는, 코엔자임 B 생합성의 중간산물이다. 2-옥소아디페이트 및 2-아미노아디페이트는 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 또는 아민 옥시다제 효소에 의해 상호 변환된다. 케토-산 데카르복실라제에 의한 2-옥소아디페이트의 탈카르복시화로 글루타레이트 세미알데하이드가 수득된다 (단계 D). 다른 예로, 알파-케토아디페이트 데하이드로게나제 활성을 가진 아실화 데카르복실라제는 2-옥소아디페이트로부터 글루타릴-CoA를 형성한다 (단계 R). 아미노산 데카르복실라제에 의해 2-아미노아디페이트가 탈카르복시화되어 5-아미노펜타노에이트가 된다. 글루타릴-CoA, 글루타레이트 세미알데하이드 또는 5-아미노펜타노에이트 중간 산물의 2,4-펜타디에노에이트, 3-부텐-1-올 또는 부타디엔로의 추가적인 변환은 도 1에 도시된 바와 같이, 종래에 개시된 바와 같이 진행된다.
도 1에 도시된 반응의 후보 효소는 실시예 VII에 기술되어 있다.
실시예 II.
아세틸-CoA로부터 글루타릴-CoA를 제조하는 경로
도 2는 아세틸-CoA 2 분자를 글루타릴-CoA로 변환하는 효율적인 탄소 경로를 나타낸다. 제1 단계에서는, 아세토아세틸-CoA 티올라제, 베타-케토티올라제 효소에 의해 아세틸-CoA 2 분자가 축합되어 아세토아세틸-CoA가 형성된다. 아세토아세틸-CoA는 다른 예로 아세토아세틸-CoA 신타제에 의해 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA로부터 형성될 수도 있다. 그런 후, 아세토아세틸-CoA의 3-케토기가 환원 및 탈수되어 크로토닐-CoA가 된다. 크로토닐-CoA가 환원성 카르복시화에 의해 글루타릴-CoA가 된다. 아세토아세틸-CoA를 글루타릴-CoA로 변환하는 후보 효소들과 유전자들이 실시예 VII에 보다 상세하게 기술되어 있다.
실시예 III.
프로피오닐-CoA로부터 2,4-펜타디에노에이트를 생성하는 경로
본 실시예는 도 3에 도시된 프로피오닐-CoA를 2,4-펜타디에노에이트로 변환하는 경로를 기술한다. 효소로는 3-옥소펜타노일-CoA 티올라제 또는 신타제, 3-옥소펜타노일-CoA 리덕타제, 3-하이드록시펜타노일-CoA 데하이드라타제, 펜트-2-에노일-CoA 이소머라제, 펜트-3-에노일-CoA 데하이드로게나제; 2,4-펜타디에노일-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제 중 하나 이상; 및 펜트-2-에노일-CoA 데하이드로게나제를 포함한다.
프로피오닐-CoA는 CO2 고정, 숙시네이트 또는 피루베이트의 프로피오네이트로의 변환, 글리옥실레이트 동화 및 아미노산 분해에 대한 3-하이드록시프로피오네이트/4-하이드록시부티레이트 및 3-하이드록시프로피오네이트 사이클들을 비롯한 수많은 생물학적 경로들에서 대사 중간 산물로서 형성된다. 도 3의 경로들에서, 프로피오닐-CoA는 2,4-펜타디에노에이트로 추가로 변환된다. 경로의 제1 단계에서, 프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA가 3-옥소펜타노일-CoA 티올라제에 의해 3-옥소펜타노일-CoA로 축합된다. 다른 예로, 프로피오닐-CoA 및 말로닐-CoA는 3-옥소펜타노일-CoA 신타제 활성을 가진 효소에 의해 축합된다. 다른 예로, 먼저 프로피오닐-CoA 및 말로닐-ACP를 3-옥소펜타노일-ACP로 변환한 다음, ACP가 CoA로 변환되는 2 단계로, 3-옥소펜타노일-CoA 중간 산물이 형성될 수 있다. 3-옥소펜타노일-CoA는 그런 후 3-옥소아실-CoA 리덕타제 및 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제에 의해 3-하이드록시펜타노일-CoA로 환원된 다음, 펜트-2-에노일-CoA로 탈수된다 (단계 B, C). 델타-이소머라제는 이중 결합을 2-위치에서 3-위치로 이동시켜 펜트-3-에노일-CoA 데하이드로게나제의 기질인 펜트-3-에노일-CoA를 형성한다 (단계 D 및 E). 아울러, 효소 촉매 단계 B, C, D 및 E는 클로스트리듐 아미노발레리쿰과 같은 5-아미노발레레이트 이용 유기체에서 역 방향으로 참여한다. 다른 예로, 펜트-2-에노일-CoA 중간 산물은 펜트-2-에노일-CoA 데하이드로게나제에 의해 2,4-펜타디에노일-CoA로 산화된다. 경로의 최종 단계에서, 2,4-펜타디에노일-CoA는 CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제에 의해 해당 산으로 변환된다 (단계 F). 2,4-펜타디엔은 산물로서 분리되거나, 또는 도 6에 도시된 바와 같이 2,4-펜타디에노에이트 또는 2,4-펜타디에노일-CoA가 부타디엔으로 추가로 변환될 수 있다. 프로피오닐-CoA를 2,4-펜타디에노에이트로 변환하는 후보 효소들과 유전자들은 실시예 VII에 보다 상세하게 기술되어 있다.
실시예 IV.
3-하이드록시프로피오닐-CoA로부터 1,3-부탄디올을 합성하는 경로
본 실시예는 도 4에 도시된 3-하이드록시프로피오닐-CoA를 1,3-부탄디올로 변환하는 경로를 기술한다. 효소들로는 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 티올라제 또는 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 신타제, 3-옥소-5-하이드록시펜타노에이트 데카르복실라제, 3-옥소부탄올 리덕타제 및 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제 중 하나 이상을 포함한다.
3-하이드록시프로피오닐-CoA는 독립 영양 생물의 -하이드록시프로피오네이트/4-하이드록시부티레이트 CO2 고정 사이클과 광영양 세균에서 발견된 관련된 3-하이드록시프로피오네이트 사이클의 중간 산물이다 (Berg et al, Science 318(5857):1782-6 (2007); Strauss and Fuchs, Eur J Biochem 215(3):633-43 (1993)). 1,3-부탄디올 경로에서, 3-하이드록시프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA는 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 티올라제에 의해 축합되어, 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA가 된다 (단계 A). 다른 예로, 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 중간 산물은 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 신타제에 의해 3-HP-CoA 및 말로닐-CoA로부터 형성된다. CoA 신테타제, 트랜스퍼라제 또는 하이드롤라제에 의해 CoA 모이어티가 제거되어, 3-옥소-5-하이드록시펜타노에이트가 된다 (단계 B). 3-옥소-5-하이드록시펜타노에이트의 3-옥소부탄올로의 탈카르복시화는 케토-산 데카르복실라제에 의해 촉매된다 (단계 C). 경로의 최종 단계에서, 3-옥소부탄올이 알코올 데하이드로게나제 또는 케톤 리덕타제에 의해 1,3-부탄올로 환원된다. 후보 효소들과 유전자들은 실시예 VII에서 보다 상세하게 설명된다.
실시예 V.
피루베이트 및 아세트알데하이드로부터 1,3-부탄디올, 3-부텐-1-올 및 부타디엔을 생성하는 경로들
본 실시예는 피루베이트 및 아세트알데하이드의 1,3-부탄디올, 3-부텐-1-올 및 부타디엔으로의 변환 경로를 기술한다. 경로들은 도 5에 도시되어 있다. 관련 효소들로는 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 알돌라제, 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 데하이드라타제, 2-옥소펜테노에이트 데카르복실라제, 3-부텐-1-알 리덕타제, 3-부텐-1-올 데하이드라타제, 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 데카르복실라제, 3-하이드록시부타날 리덕타제, 4-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시-2-옥소펜타노에이트:페레독신 옥시도리덕타제, 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성), 3-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 3-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제 또는 3-하이드록시부티릴-CoA 신테타제, 3-하이드록시부티레이트 리덕타제 및 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알코올 형성)를 포함한다. 또한, 단계 E는 화학적 탈수를 통해서도 촉매될 수 있다.
피루베이트 및 아세트알데하이드의 3-부텐-1-올로의 변환은 효소적 4 단계로 이루어진다. 먼저, 피루베이트 및 아세트알데하이드가 4-하이드록시-2-케토발레레이트 알돌라제에 의해 4-하이드록시-2-옥소발레레이트로 축합된다 (도 5의 단계 A). 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 산물은 이후 2-옥소펜테노에이트로 탈수된다 (도 5의 단계 B). 2-옥소펜테노에이트가 탈카르복시화되어 3-부텐-1-알이되며 (단계 C), 추가로 알코올 데하이드로게나제에 의해 3-부텐-1-올로 환원된다 (단계 D). 3-부텐-1-올 산물의 부타디엔로의 추가적인 탈수가 효소 또는 화학 촉매에 의해 수행된다.
또한, 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 중간 산물은 2 단계 이상의 효소 단계를 통해 1,3-부탄디올로 변환될 수 있다. 일 구현예에서, 4-하이드록시-2-옥소발레레이트가 3-하이드록시부타날로 탈카르복시화되고 (단계 F), 환원되어 1,3-부탄디올을 형성한다 (단계 G). 다른 예로, 4-하이드록시-2-옥소발레레이트가 아실화 및 탈카르복시화 옥시도리덕타제 또는 포르메이트 리아제에 의해 3-하이드록시부티릴-CoA로 변환된다 (단계 H). 3-하이드록시부티릴-CoA 중간 산물은 알데하이드-형성 아실-CoA 리덕타제 (단계 I) 또는 3-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제 및 3-하이드록시부티레이트 리덕타제의 조합 반응 (단계 J, K)을 통해 1 또는 2 단계 효소 단계를 통해 3-하이드록시부타날로 더욱 환원된다. 3-하이드록시부타날은 다시 3-하이드록시부타날 리덕타제에 의해 1,3-부탄디올로 환원된다 (단계 G). 다른 구현예에서, 3-하이드록시부티릴-CoA 중간 산물은 알코올을 형성하는 2가지 기능의 알데하이드/알코올 데하이드로게나제에 의해 바로 1,3-부탄디올로 환원된다 (단계 L). 후보 효소들과 유전자들은 실시예 VII에서 보다 상세하게 설명된다.
실시예 VI.
2,4-펜타디에노에이트 또는 2,4-펜타디에노일-CoA의 부타디엔으로의 별환 경로.
도 1 및 3은 공통적인 대사 전구체들로부터 2,4-펜타디에노에이트 또는 2,4-펜타디에노일-CoA를 형성하는 경로들을 도시한다. 도 6은 2,4-펜타디에노에이트 또는 2,4-펜타디에노일-CoA를 부타디엔으로 다시 변환하는 경로들을 도시한다. 2,4-펜타디에노에이트는 몇가지 대안적인 경로들에 의해 부타디엔으로 변환된다. 한가지 경로는 단계 G에 도시된 직접 탈카르복시화이다. 다른 예로, 산 모이어티는 카르복실산리덕타제 효소에 의해 알데하이드로 환원된다 (단계 A). 펜타-2,4-디에날중간 산물의 탈카르보닐화에 의해 부타디엔이 형성된다 (단계 B). 단계 H 및 E는, 2,4-펜타디에노에이트가 키나제에 의해 먼저 2,4-펜타디에노일-포스페이트로 변환된 다음 포스페이트 리덕타제에 의해 펜타-2,4-디에날로 환원되는 다른 경로를 나타낸다. 2,4-펜타디에노에이트 및 2,4-펜타디에노일-CoA는 CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 신테타제에 상호 변환된다. 2,4-펜타디에노일-CoA의 이의 대응되는 알데하이드로의 환원은 아실화 알데하이드 데하이드로게나제에 의해 촉매된다 (단계 C). 다른 예로, CoA 모이어티는 2,4-펜타디에노일-CoA 포스포트랜스퍼라제에 의해 포스페이트와 치환된다 (단계 D). 2,4-펜타디에노일-포스페이트 또는 펜타-2,4-디에날 중간 산물들은 전술한 바와 같이 부타디엔으로 추가로 변환된다. 도 6에 도시된 반응들의 후보 효소들과 유전자들은 실시예 VII에서 더욱 상세하게 기술된다.
실시예 VII.
도 1-6에 도시된 반응들의 후보 효소들
Figure 112014025824628-pct00001
1.1.1.a 옥시도리덕타제 (옥소 -> 알코올)
도 1-5에 도시된 몇가지 반응들은 알코올 데하이드로게나제 효소들에 의해 촉매된다. 이들 반응들로는 도 1의 단게 E와 K, 도 2의 단계 B, 도 4의 단계 D 및 도 5의 단계 D와 G를 포함한다. 알코올 데하이드로게나제 효소들의 예는 아래에서 보다 자세하게 기술한다.
글루타레이트 세미알데하이드 리덕타제에 의한 글루타레이트 세미알데하이드의 5-하이드록시발레레이트로의 환원은 알데하이드를 이의 대응되는 알코올로 변환하는 반응을 수반한다. 글루타레이트 세미알데하이드 리덕타제 활성을 가진 효소로는 아스퍼질러스 테레우스의 ATEG_00539 유전자 산물과 아라비돕시스 탈리아나의 4hbd에 의해 코딩된 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 (WO 2010/068953A2)가 있다. 상기 아라비돕시스 탈리아나 효소는 클로닝되었으며, 효소에서 특정화되었다 (Breitkreuz et al., J.Biol.Chem. 278:41552-41556 (2003)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
ATEG_00539 XP_001210625.1 115491995 아스퍼질러스 테레우스 NIH2624
4hbd AAK94781.1 15375068 아라비돕시스 탈리아나
알데하이드를 알코올로 환원을 촉매하는 효소를 코딩하는 추가적인 유전자들로는 (즉, 알코올 데하이드로게나제 또는 등가의 알데하이드 리덕타제), C2-C14에 대한 중쇄 알코올 데하이드로게나제를 코딩하는 alrA (Tani et al., Appl.Environ.Microbiol. 66:5231-5235 (2000)), 에스케리키아 콜라이의 yqhD 및 fucO (Sulzenbacher et al., 342:489-502 (2004)), 및 클로스트리듐 아세토부틸리컴의 부티리알데하이드를 부탄올로 변환하는 bdh I 및 bdh II (Walter et al., 174:7149-7158 (1992))가 있다. YqhD는 조인자로서 NADPH를 이용하여 매우 다양한 알데하이드 화합물들의 환원을 촉매하며, C(3) 보다 긴 체인을 선호한다 (Sulzenbacher et al., 342:489-502 (2004);Perez et al., J Biol.Chem. 283:7346-7353 (2008)). 자이모모나스 모빌리스E의 adhA 유전자 산물은 포름알데하이드, 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 및 아크롤레인 등의 다수의 알데하이드 화합물들에 대해 활성을 가지는 것으로 입증되었다 (Kinoshita et al., Appl Microbiol Biotechnol 22:249-254 (1985)). 추가적인 알데하이드 리덕타제 후보들은 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴의 bdh 및 클로스트리듐 베이예린키의 Cbei_1722, Cbei_2181 및 Cbei_2421에 의해 코딩된다. 추가적인 알데하이드 리덕타제 후보 유전자로는 사카로마이세스 세레비지애의 경우 알데하이드 리덕타제 GRE3, ALD2-6 및 HFD1, 글리옥실레이트 리덕타제 GOR1 및 YPL113C, 글리세롤 데하이드로게나제 GCY1 (WO 2011/022651A1; Atsumi et al., Nature 451:86-89 (2008))을 포함한다. 메틸글리옥살의 아세톨 또는 락트알데하이드로의 환원을 환원을 촉매하는 전술한 후보 효소들 역시 적합한 락트알데하이드 리덕타제 후보 효소이다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
alrA BAB12273.1 9967138 액시네토박터 sp. strain M-1
ADH2 NP_014032.1 6323961 사카로마이세스 세레비지애
yqhD NP_417484.1 16130909 에스케리키아 콜라이
fucO NP_417279.1 16130706 에스케리키아 콜라이
bdh I NP_349892.1 15896543 클로스트리듐 아세토부틸리컴
bdh II NP_349891.1 15896542 클로스트리듐 아세토부틸리컴
adhA YP_162971.1 56552132 자이모모나스 모빌리스
bdh BAF45463.1 124221917 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴
Cbei_1722 YP_001308850 150016596 클로스트리듐 베이예린키
Cbei_2181 YP_001309304 150017050 클로스트리듐 베이예린키
Cbei_2421 YP_001309535 150017281 클로스트리듐 베이예린키
GRE3 P38715.1 731691 사카로마이세스 세레비지애
ALD2 CAA89806.1 825575 사카로마이세스 세레비지애
ALD3 NP_013892.1 6323821 사카로마이세스 세레비지애
ALD4 NP_015019.1 6324950 사카로마이세스 세레비지애
ALD5 NP_010996.2 330443526 사카로마이세스 세레비지애
ALD6 ABX39192.1 160415767 사카로마이세스 세레비지애
HFD1 Q04458.1 2494079 사카로마이세스 세레비지애
GOR1 NP_014125.1 6324055 사카로마이세스 세레비지애
YPL113C AAB68248.1 1163100 사카로마이세스 세레비지애
GCY1 CAA99318.1 1420317 사카로마이세스 세레비지애
4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 (EC 1.1.1.61) 활성을 나타내는 효소들 역시 이 카테고리에 포함된다. 이러한 효소들은 랄스토니아 유트로파 (Bravo et al., J Forens Sci, 49:379-387 (2004))와 클로스트리듐 클루이베리 (Wolff et al., Protein Expr.Purif. 6:206-212 (1995))에서 특정화되었다. 또 다른 유전자는 지오바실러스 써모글루코시다시우스의 알코올 데하이드로게나제 adhI이다 (Jeon et al., J Biotechnol 135:127-133 (2008)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
4hbd YP_726053.1 113867564 랄스토니아 유트로파 H16
4hbd L21902.1 146348486 클로스트리듐 클루이베리 DSM 555
adhI AAR91477.1 40795502 지오바실러스 써모글루코시다시우스
알데하이드 리덕타제의 다른 예는 메틸말로네이트 세미알데하이드 리덕타제로서, 이는 3-하이드록시이소부티레이트 데하이드로게나제로도 알려져 있다 (EC 1.1.1.31). 이 효소는 발린, 루신 및 이소루신의 분해에 참여하며, 세균, 진핵생물 및 포유류에서 동정되었다. 서무스 서모필러스 HB8의 P84067에 의해 코딩되는 효소가 구조적으로 특정되었다 (Lokanath et al., J Mol Biol, 352:905-17 (2005)). 인간 3-하이드록시이소부티레이트 데하이드로게나제의 가역성이 동위 원소로 표지된 기질을 이용하여 입증되었다 (Manning et al., Biochem J, 231:481-4 (1985)). 이러한 효소를 코딩하는 추가적인 유전자들로는, 호모 사피엔스 (Hawes et al., Methods Enzymol, 324:218-228 (2000))와 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 (Hawes et al., supra; Chowdhury et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 60:2043-2047 (1996))의 3hidh, 슈도모나스 에우루지노사 및 슈도모나스 푸티다의 mmsB, 슈도모나스 푸티다 dhat(Aberhart et al., J Chem.Soc.[Perkin 1] 6:1404-1406 (1979); Chowdhury et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 60:2043-2047 (1996); Chowdhury et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 67:438-441 (2003))가 있다. 슈도모나스 에우루지노사 mmsB (Gokarn et al., US Patent 739676, (2008)) 및 슈도모나스 푸티다 mmsB 등의 수종의 3-하이드록시이소부티레이트 데하이드로게나제 효소들이 환원 방향에서 특정화되었다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
P84067 P84067 75345323 서무스 서모필러스
3hidh P31937.2 12643395 호모 사피엔스
3hidh P32185.1 416872 오릭톨라구스 쿠니쿨루스
mmsB NP_746775.1 26991350 슈도모나스 푸티다
mmsB P28811.1 127211 슈도모나스 에우루지노사
dhat Q59477.1 2842618 슈도모나스 푸티다
케톤을 하이드록실 관능기로 변환시키는 몇가지 알코올 데하이드로게나제들이 존재한다. 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 이러한 효소 2가지는 말레이트 데하이드로게나제 (mdh)와 락테이트 데하이드로게나제 (ldhA)에 의해 코딩되어 있다. 아울러, 랄스토니아 유트로파의 락테이트 데하이드로게나제는 락테이트, 2-옥소부티레이트, 2-옥소펜타노에이트 및 2-옥소글루타레이트 등의 다양한 체인 길이의 2-케토산에 대해 높은 활성을 나타내는 것으로 입증되었다 (Steinbuchel et al., Eur.J.Biochem. 130:329-334 (1983)). 알파-케토아디페이트의 알파-하이드록시아디페이트로의 변환은 인간 및 랫의 태반에서 발견된 것으로 보고된 효소인 2-케토아디페이트 리덕타제에 의해 촉매될 수 있다 (Suda et al., Arch.Biochem.Biophys. 176:610-620 (1976); Suda et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 77:586-591 (1977)). 추가적인 옥시도리덕타제는 클로닝되고 특정화된 인간 심장 유래 미토콘드리아 3-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 (bdh) 이다 (Marks et al., J.Biol.Chem. 267:15459-15463 (1992)). 클로스트리듐 베이예린키 (Ismaiel et al., J.Bacteriol. 175:5097-5105 (1993)) 및 서모안에어로박터 브록키이 (Lamed et al., Biochem.J. 195:183-190 (1981); Peretz et al., Biochemistry. 28:6549-6555 (1989))의 알코올 데하이드제나제 효소는 아세톤을 이소프로판올로 변환시킨다. 메틸 에틸 케톤 리덕타제는 MEK의 2-부탄올로의 환원을 촉매한다. MEK 리덕타제 효소의 예들은 로도코커스 루버 (Kosjek et al., Biotechnol Bioeng. 86:55-62 (2004))와 피로코커스 푸리오수스 (van der Oost et al., Eur.J.Biochem. 268:3062-3068 (2001))에서 확인될 수 있다.
유전자 유전자은행 등재번호 GI 번호 유기체
mdh AAC76268.1 1789632 에스케리키아 콜라이
ldhA NP_415898.1 16129341 에스케리키아 콜라이
ldh YP_725182.1 113866693 랄스토니아 유트로파
bdh AAA58352.1 177198 호모 사피엔스
adh AAA23199.2 60592974 클로스트리듐 베이예린키 NRRL B593
adh P14941.1 113443 서모안에어로박터 브록키이 HTD4
sadh CAD36475 21615553 로도코커스 루버
adhA AAC25556 3288810 피로코커스 푸리오수스
Matsuyama et al. J Mol Cat B Enz, 11:513-521 (2001)에 기술된 바와 같이, 특히 바실러스, 브레비박테리움 (Brevibacterium), 칸디다 및 클렙시엘라 (Klebsiella) 속에 속하는 유기체를 비롯하여, 다수의 유기체들은 3-옥소부탄올의 1,3-부탄디올로의 환원을 촉매하는 유전자들을 코딩한다. 이러한 효소들 중 한가지인 칸디다 파랍실로시스 SADH가 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되었으며 특정화된었다. 돌변연이된 로도코커스 페닐아세트알데하이드 리덕타제 (Sar268)와 레이포니아 (Leifonia) 알코올 데하이드로게나제 역시 고수율로 이러한 변환을 촉매하는 것으로 확인되었다 (Itoh et al., Appl.Microbiol Biotechnol. 75:1249-1256 (2007)).
유전자 유전자은행 등재번호 GI 번호 유기체
sadh BAA24528.1 2815409 칸디다 파랍실로시스
3-옥소아실-CoA 기질을 이의 대응되는 3-하이드록시아실-CoA 산물로 환원하는 알코올 데하이드로게나제 효소도 도 2 (단계 B) 및 도 3 (단계 B)에 도시된 경로들과 관련이 있다. 효소의 예로는 3-옥소아실-CoA 리덕타제 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제가 있다. 3-옥소아실-CoA 리덕타제 효소 (EC 1.1.1.35)는 3-옥소아실-CoA 분자를 3-하이드록시아실-CoA 분자로 변환하며, 종종 지방산 베타-산화나 페닐 아세테이트 이화 작용에 참여한다. 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 fadB 및 fadJ에 의해 코딩되는 2개의 지방산 산화 복합체들의 서브유닛들은 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제 (Binstock et al., Methods Enzymol. 71 Pt C:403-411 (1981))로서 기능한다. 에스케리키아 콜라이에서 paaH가 페닐아세테이트 분해 오페론의 다른 유전자들과의 근접성 (Nogales et al., 153:357-365 (2007))과 paaH 돌연변이가 페닐아세테이트에서는 생장할 수 없다 (Ismail et al., Eur.J Biochem. 270:3047-3054 (2003))는 점을 감안하면, 에스케리키아 콜라이 paaH 유전자 역시 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제를 코딩하는 것으로 예상된다. 추가적인 3-옥소아실-CoA 효소들로는 슈도모나스 푸티다 phaC (Olivera et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 95:6419-6424 (1998))와 슈도모나스 플루오레센스 paaC (Di et al., 188:117-125 (2007)) 유전자 산물들이 있다. 이들 효소들은 페닐아세테이트 또는 스티렌의 이화작용시에 3-하이드록시아디필-CoA를 3-옥소아디필-CoA로 가역적 산화하는 과정을 촉매한다.
아세토아세틸-CoA 리덕타제 (EC 1.1.1.36)는 아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 환원을 촉매한다. 이 효소는, 수 종의 클로스트리디아의 경우 아세틸-CoA의 부티레이트로의 발효 경로에 참여하며, 상세하게 연구되었다 (Jones et al., Microbiol Rev. 50:484-524 (1986)). 아세토아세틸-CoA 리덕타제는 또한 다수의 유기체들에서 폴리하이드록시부티레이트 생합성에 참여하며, PHB와 3-하이드록시이소부티레이트의 과다 생산을 위한 대사적 조작 응용들에서 사용되고 있다 (Liu et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 76:811-818 (2007); Qui et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 69:537-542 (2006)). hbd에 코딩된 클로스트리듐 아세토부틸리컴 유래 효소는 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되었으며, 기능적으로 발현되었다 (Youngleson et al., J Bacteriol. 171:6800-6807 (1989)). 추가적인 후보 유전자들로는 주글로에아 라미게라 phbB (Ploux et al., Eur.J Biochem. 174:177-182 (1988))와 로도박터 스페어로이데스 phaB (Alber et al., Mol.Microbiol 61:297-309 (2006))가 있다. 주글로에아 라미게라 유전자는 NADPH-의존형이며, 이 유전자는 에스케리키아 콜라이에서 발현된 바 있다 (Peoples et al., Mol.Microbiol 3:349-357 (1989)). 이 유전자에 대한 기질 특이성 연구를 통해, 아세토아세틸-CoA 이외에도 기질로서 3-옥소프로피오닐-CoA를 허용할 수 있다는 결론에 도달하였다 (Ploux et al., Eur.J Biochem. 174:177-182 (1988)). 추가적인 유전자들로는 파라코커스 데니트리피칸스 phaB, 클로스트리듐 클루이베리의 Hbd1 (C-말단 도메인) 및 Hbd2 (N-말단 도메인) (Hillmer and Gottschalk, Biochim. Biophys. Acta 3334:12-23 (1974)) 및 보스 타우루스 HSD17B10 (Wakil et al., J Biol.Chem. 207:631-638 (1954))이 있다. 파라코커스 데니트리피칸스 유래 효소는 에스케리키아 콜라이에서 기능적으로 발현시켜 특정화되었다 (Yabutani et al., FEMS Microbiol Lett. 133:85-90 (1995)). 다수의 유사 효소들도 클로스트리디아의 다른 종들과 메탈로스페라 세둘라에서 발견되었다 (Berg et al., Science. 318:1782-1786 (2007)). 칸디다 트로피칼리스 유래 효소는 페록시좀 지방산 베타-분해의 다중 기능의 효소 타입 2 (MFE-2)의 한 구성 요소이다. 이 단백질의 데하이드로게나제 B 도메인은 아세토아세틸-CoA에 대해 이화 작용을 나타낸다. 이 도메인은 에스케리키아 콜라이에서 기능적으로 발현된 바 있으며, 결정 구조가 이용가능하며, 촉매 기전이 잘 파악되어 있다 (Ylianttila et al., Biochem Biophys Res Commun 324:25-30 (2004); Ylianttila et al., J Mol Biol 358:1286-1295 (2006)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fadB P21177.2 119811 에스케리키아 콜라이
fadJ P77399.1 3334437 에스케리키아 콜라이
paaH NP_415913.1 16129356 에스케리키아 콜라이
Hbd2 EDK34807.1 146348271 클로스트리듐 클루이베리
Hbd1 EDK32512.1 146345976 클로스트리듐 클루이베리
phaC NP_745425.1 26990000 슈도모나스 푸티다
paaC ABF82235.1 106636095 슈도모나스 플루오레센스
HSD17B10 O02691.3 3183024 보스 타우루스
phbB P23238.1 130017 주글로에아 라미게라
phaB YP_353825.1 77464321 로도박터 스페어로이데스
phaB BAA08358 675524 파라코커스 데니트리피칸스
Hbd NP_349314.1 15895965 클로스트리듐 아세토부틸리컴
Hbd AAM14586.1 20162442 클로스트리듐 베이예린키
Msed_1423 YP_001191505 146304189 메탈로스페라 세둘라
Msed_0399 YP_001190500 146303184 메탈로스페라 세둘라
Msed_0389 YP_001190490 146303174 메탈로스페라 세둘라
Msed_1993 YP_001192057 146304741 메탈로스페라 세둘라
Fox2 Q02207 399508 칸디다 트로피칼리스
1.1.1.c 옥시도리덕타제 (아실-CoA -> 알코올)
2가지 기능의 옥시도리덕타제는 아실-CoA를 이의 대응되는 알코올로 변환시킨다. 이러한 활성을 가진 효소들은 3-하이드록시부티릴-CoA를 1,3-부탄디올로 변환하는데 필요하다 (단계 L, 도 5).
아실-CoA를 알코올로 변환하는 2가지 기능의 옥시도리덕타제의 예로는, 아세틸-CoA 등의 기질을 에탄올로 (예, 에스케리키아 콜라이 adhE (Kessler et al., FEBS.Lett. 281:59-63 (1991))) 및 부티릴-CoA를 부탄올로 (예, 클로스트리듐 아세토부틸리컴 adhE2 (Fontaine et al., J.Bacteriol. 184:821-830 (2002))) 변환하는 것이 있다. bdh I 및 bdh II에 의해 코딩된 클로스트리듐 아세토부틸리컴 효소들 (Walter, et al., J. Bacteriol. 174:7149-7158 (1992))은, reduce 아세틸-CoA 및 부티릴-CoA를 에탄올과 부탄올로 각각 환원시킨다. 아세틸-CoA를 에탄올로 환원시키는 것 외에도, 루코노스톡 메센테로이데스의 adhE에 의해 코딩된 효소는 분지쇄 화합물 이소부티르알데하이드를 이소부티릴-CoA로 산화하는 것으로 입증되었다 (Kazahaya et al., J.Gen.Appl.Microbiol. 18:43-55 (1972); Koo et al., Biotechnol Lett, 27:505-510 (2005)). 효소의 다른 예는 말로닐-CoA를 3-HP로 변환할 수 있다. 이러한 활성을 가진 NADPH-의존성 효소는 클로로플렉수스 아우란티아쿠스에서 특정화되었으며, 이 균주에서는 3-하이드록시프로피오네이트 사이클에 참여한다 (Hugler et al., J Bacteriol, 184:2404-2410 (2002); Strauss et al., Eur J Biochem, 215:633-643 (1993)). 이 효소는 질량이 300 kDa이며, 기질 특이성이 높으며, 다른 공지의 옥시도리덕타제와의 서열 유사성이 거의 없다 (Hugler et al., supra). 다른 유기체들에서는 이러한 특정 반응을 촉매하는 효소는 확인되지 않았지만, 다른 유기체들이 비슷한 경로를 가질 수 있다는 생물정보학적인 증거는 존재한다 (Klatt et al., Env Microbiol, 9:2067-2078 (2007)). 로세이플렉수스 카스텐홀지이, 에리트로박터 sp. NAP1 및 마린 감마 프로테오박테리움 HTCC2080 등의 다른 유기체들에서의 후보 효소들은 서열 유사성을 통해 추론할 수 있다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
adhE NP_415757.1 16129202 에스케리키아 콜라이
adhE2 AAK09379.1 12958626 클로스트리듐 아세토부틸리컴
bdh I NP_349892.1 15896543 클로스트리듐 아세토부틸리컴
bdh II NP_349891.1 15896542 클로스트리듐 아세토부틸리컴
adhE AAV66076.1 55818563 루코노스톡 메센테로이데스
mcr AAS20429.1 42561982 클로로플렉수스 아우란티아쿠스
Rcas_2929 YP_001433009.1 156742880 로세이플렉수스 카스텐홀지이
NAP1_02720 ZP_01039179.1 85708113 에리트로박터 sp. NAP1
MGP2080_00535 ZP_01626393.1 119504313 마린 감마 프로테오박테리움 HTCC2080
쇄의 길이가 긴 아실-CoA 분자들은, 알코올-형성 지방 아실-CoA 리덕타제를 코딩하는 호호바 (심몬드시아 치넨시스) FAR 등의 효소에 의해 이의 대응되는 알코올 화합물로 환원될 수 있다. 에스케리키아 콜라이에서의 이의 과다 발현시 FAR 활성이 형성되었으며, 지방 알코올이 축적되었다 (Metz et al., Plant Physiol, 122:635-644 (2000)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
FAR AAD38039.1 5020215 심몬드시아 치넨시스
이들 단계들을 촉매하는 다른 후보는 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리덕타제 (또는 HMG-CoA 리덕타제)이다. 이 효소는 천연적으로 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA에서 CoA 기를 알코올을 형성하는 메발로네이트로 환원한다. 설폴로부스 솔파타리쿠스의 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자 hmgA는 에스케리키아 콜라이에서 클로닝, 서열분석 및 발현되었다 (Bochar et al., J Bacteriol. 179:3632-3638 (1997)). 사카로마이세스 세레비지애 역시 2개의 HMG-CoA 리덕타제를 가지고 있다 (Basson et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 83:5563-5567 (1986)). 이 유전자는 아라비돕시스 탈리아나에서도 분리되었으며, 사카로마이세스 세레비지애에서 HMG-COA 리덕타제 활성을 보완하는 것으로 입증되었다 (Learned et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86:2779-2783 (1989)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
HMG1 CAA86503.1 587536 사카로마이세스 세레비지애
HMG2 NP_013555 6323483 사카로마이세스 세레비지애
HMG1 CAA70691.1 1694976 아라비돕시스 탈리아나
hmgA AAC45370.1 2130564 설폴로부스 솔파타리쿠스
1.2.1.b 옥시도리덕타제 (아실-CoA -> 알데하이드)
1.2.1 유형의 아실-CoA 리덕타제는 아실-CoA를 이의 대응되는 알데하이드로 환원한다 이러한 변환에는 글루타릴-CoA의 글루타레이트 세미알데하이드로 (단계 S, 도 1) 및 3-하이드록시부티릴-CoA의 3-하이드록시부티르알데하이드 (단계 I, 도 5)로의 환원의 촉매가 요구된다. 수종의 아실-CoA 리덕타제 효소들이 공개된 문헌들에 기술되어 있으며, 이 단계에 적합한 후보들이 나타나 있다. 이들은 아래에 기술한다.
아실-CoA 리덕타제 또는 아실화 알데하이드 데하이드로게나제는 아실-CoA를 이의 대응되는 알데하이드로 환원한다. 효소의 예로는 지방 아실-CoA 리덕타제, 숙시닐-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.76), 아세틸-CoA 리덕타제, 부티릴-CoA 리덕타제 및 프로피오닐-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.3)가 있다. 지방 아실-CoA 리덕타제 효소의 예들은 액시네토박터 칼코아세티쿠스 (Reiser, Journal of Bacteriology 179:2969-2975 (1997))와 액시네토박터 sp. M-1 (Ishige et al., Appl. Environ. Microbiol. 68:1192-1195 (2002))의 acr1에 의해 코딩된다. 숙시닐-CoA 리덕타제 활성을 가진 효소들은 클로스트리듐 클루이베리 sucD (Sohling, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996))와 포르피로모나스 깅기발리스 sucD (Takahashi, J. Bacteriol 182:4704-4710 (2000))에 의해 코딩된다. 추가적인 숙시닐-CoA 리덕타제 효소들은 메탈로스페라 세둘라 (Berg et al., Science 318:1782-1786 (2007)) 및 서모프로테우스 뉴트로필러스 (Ramos-Vera et al., J Bacteriol., 191:4286-4297 (2009)) 등의 호열성 고세균의 3-하이드록시프로피오네이트/4-하이드록시부티레이트 사이클에 참여한다. Msed_0709에 의해 코딩되는 메탈로스페라 세둘라 효소는 엄격하게 NADPH-의존형이며, 또한 말로닐-CoA 리덕타제 활성을 가진다. 서모프로테우스 뉴트로필러스 효소는 NADPH와 NADH 둘다를 이용하여 활성을 나타낸다. 슈도모나스 sp bphG에 의해 코딩되는 효소 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제는, 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 이소부티르알데하이드 및 포름알데하이드를 산화하고 아실화하는 것으로 입증된, 또 다른 예이다 (Powlowski, J. Bacteriol. 175:377-385 (1993)). 루코노스톡 메센테로이데스의 adhE에 의해 코딩되는 효소는, 아세틸-CoA를 에탄올로 환원하는 것 외에도, 분지쇄 화합물인 이소부티르알데하이드를 이소부티릴-CoA로 산화하는 것으로 확인되었다 (Kazahaya, J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972); 및 Koo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)). 부티르알데하이드 데하이드로게나제는 유사 반응, 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴 등의 용매생산 (solventogenic) 유기체에서 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 변환을 촉매한다 (Kosaka et al., Biosci Biotechnol Biochem., 71:58-68 (2007)). 프로피오닐-CoA 리덕타제 효소의 예로는 살모넬라 티피무리움 LT2의 pduP (Leal, Arch. Microbiol. 180:353-361 (2003))및 에스케리키아 콜라이 eutE (Skraly, WO Patent No. 2004/024876)가 있다. 천연적으로 프로피오닐-CoA를 프로피온알데하이드로 변환하는 살모넬라 티피무리움 LT2의 프로피오닐-CoA 리덕타제는, 5-하이드록시발레릴-CoA를 5-하이드록시펜타날의 환원도 촉매한다 (WO 2010/068953A2).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
acr1 YP_047869.1 50086359 액시네토박터 칼코아세티쿠스
acr1 AAC45217 1684886 액시네토박터 베일리
acr1 BAB85476.1 18857901 액시네토박터 sp. Strain M-1
Msed_0709 YP_001190808.1 146303492 메탈로스페라 세둘라
Tneu_0421 ACB39369.1 170934108 서모프로테우스 뉴트로필러스
sucD P38947.1 172046062 클로스트리듐 클루이베리
sucD NP_904963.1 34540484 포르피로모나스 깅기발리스
bphG BAA03892.1 425213 슈도모나스 sp
adhE AAV66076.1 55818563 루코노스톡 메센테로이데스
bld AAP42563.1 31075383 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴
pduP NP_460996 16765381 살모넬라 티피무리움 LT2
eutE NP_416950 16130380 에스케리키아 콜라이
아실-CoA를 이의 대응되는 알데하이드로 변환하는 다른 효소로는, 말로닐-CoA를 말로닉 세미알데하이드로 변환하는 말로닐-CoA 리덕타제가 있다. 말로닐-CoA 리덕타제는 호열호산성 고세균 박테리아에서 3-하이드록시프로피오네이트 사이클을 통해 독립 영양성 탄소 고정에 참여하는 주요 효소이다 (Berg, Science 318:1782-1786 (2007); 및 Thauer, Science 318:1732-1733 (2007)). 이 효소는 조인자로서 NADPH를 이용하며, 메탈로스페어라 (Metallosphaera)와 설폴로부스 sp.에서 특정화되었다 (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); 및 Hugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)). 이 효소는 메탈로스페라 세둘라의 Msed_0709에 의해 코딩된다 (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); 및 Berg, Science 318:1782-1786 (2007)). 설폴로부스 토코다이 유래 말로닐-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자가 클로닝되었으며, 에스케리키아 콜라이에서 이종적으로 발현되었다 (Alber et al., J. Bacteriol 188:8551-8559 (2006). 또한, 이 효소는 메틸말로닐-CoA의 이의 대응되는 알데하이드로의 변환을 촉매하는 것으로 확인되었다 (WO2007141208 (2007)). 이들 효소의 알데하이드 데하이드로게나제 기능성이 클로로플렉수스 아우란티아쿠스 유래의 2가지 기능의 데하이드로게나제와 비슷함에도 불구하고, 서열 유사성은 거의 없다. 말로닐-CoA 리덕타제 후보 효소 둘다 아스파르틸-4-포스페이트의 아스파르테이트 세미알데하이드로의 환원과 동시적인 탈인산화를 촉매하는 효소인 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제와 서열 유사성이 높다. 추가적인 후보 유전자들은 설폴로부스 솔파타리쿠스 및 설폴로부스 액시도칼다리우스 등의 다른 유기체들에서 단백질 서열 상동성을 통해 발굴할 수 있으며, 아래에 열거한다. CoA-아실화 알데하이드 데하이드로게나제에 대한 또 다른 후보는 클로스트리듐 베이예린키의 ald 유전자이다 (Toth, Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980 (1999). 이 효소는 아세틸-CoA 및 부티릴-CoA을 이의 대응되는 알데하이드로 환원하는 것으로 보고된 바 있다. 이 유전자는 살모넬라 티피무리움 및 에스케리키아 콜라이의 아세트알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 eutE와 매우 유사하다 (Toth, Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980 (1999).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
Msed_0709 YP_001190808.1 146303492 메탈로스페라 세둘라
Mcr NP_378167.1 15922498 설폴로부스 토코다이
asd-2 NP_343563.1 15898958 설폴로부스 솔파타리쿠스
Saci_2370 YP_256941.1 70608071 설폴로부스 액시도칼다리우스
Ald AAT66436 49473535 클로스트리듐 베이예린키
eutE AAA80209 687645 살모넬라 티피무리움
eutE P77445 2498347 에스케리키아 콜라이
1.2.1.c 옥시도리덕타제 2-옥소산 -> 아실-CoA, 탈카르복시화
2-옥소아디페이트의 글루타레이트 세미알데하이드로의 환원성 탈카르복시화 및 아실화 (단계 D, 도 1)는 EC 클래스 1.2의 옥시도리덕타제에 의해 촉매된다. 4-하이드록시-2-옥소발레레이트를 3-하이드록시부티릴-CoA로 변환시키는데 비슷한 효소가 요구된다 (단계 H, 도 5). 효소의 예는 2-케토산 데하이드로게나제 및 2-케토글루타레이트 페레독신 옥시도리덕타제 (OFOR) 패밀리들에서 확인된다.
알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제 (AKGD)는 알파-케토글루타레이트를 숙시닐-CoA로 변환하며, TCA 사이클을 통한 대사 흐름을 조절하는 주요 부위이다 (Hansford, Curr.Top.Bioenerg. 10:217-278 (1980)). 에스케리키아 콜라이의 유전자들 sucA, sucB 및 lpd에 의해 코딩되는, AKGD 유전자 발현은 혐기 조건과 글루코스 생육 조건시에 하향 조절된다 (Park et al., 15:473-482 (1995)). AKGD의 기질 종류는 적지만, E2 컴포넌트의 촉매 코어에 대한 구조 연구는 기질 특이성을 담당하는 특이 잔기에 초점이 맞추어져 있다 (Knapp et al., J.Mol.Biol. 280:655-668 (1998)). odhAB (E1 및 E2) 및 pdhD (E3, 공유 도메인)에 의해 코딩되는 바실러스 섭틸러스 AKGD는 전사 수준에서 조절되며, 탄소원과 유기체의 증식 단계에 의존적이다 (Resnekov et al., Mol.Gen.Genet. 234:285-296 (1992)). 효모의 경우, E3 컴포넌트를 코딩하는 LPD1 유전자는 글루코스에 의해 전사 수준에서 조절된다 (Roy et al., J.Gen.Microbiol. 133:925-933 (1987)). 또한, KGD1에 의해 코딩되는 E1 컴포넌트는 글루코스에 의해 조절되며, HAP2 및 HAP3 산물들에 의해 활성화된다 (Repetto et al., Mol.Cell Biol. 9:2695-2705 (1989)). AKGD 효소 컴플렉스는 산물 NADH와 숙시닐-CoA에 의해 저해되며, 이의 기능 손상이 몇가지 신경 질환들과 연계되어 있어 포유류 시스템에서 잘 연구되어 있다.
유전자 GI # 등재 번호 유기체
sucA 16128701 NP_415254.1 에스케리키아 콜라이
sucB 16128702 NP_415255.1 에스케리키아 콜라이
lpd 16128109 NP_414658.1 에스케리키아 콜라이
odhA 51704265 P23129.2 바실러스 섭틸리스
odhB 129041 P16263.1 바실러스 섭틸리스
pdhD 118672 P21880.1 바실러스 섭틸리스
KGD1 6322066 NP_012141.1 사카로마이세스 세레비지애
KGD2 6320352 NP_010432.1 사카로마이세스 세레비지애
LPD1 14318501 NP_116635.1 사카로마이세스 세레비지애
분지쇄 2-케토-산 데하이드로게나제 컴플렉스 (BCKAD)는 2-옥소이소발레레이트 데하이드로게나제라고도 하며, 분지쇄 아미노산 분해 경로들에 참여하여, 발린, 루신 및 이소루신을 이의 아실-CoA 유도체 및 CO2로 변환시킨다. 이 컴플렉스는 바실러스 섭틸리스 (Wang et al., Eur.J.Biochem. 213:1091-1099 (1993)), 라투스 노르베기쿠스 (Namba et al., J.Biol.Chem. 244:4437-4447 (1969)) 및 슈도모나스 푸티다 (Sokatch et al., 148:647-652 (1981)) 등의 다수 유기체들에서 연구되었다. 바실러스 섭틸리스에서는, 이 효소는 유전자 pdhD (E3 컴포넌트), bfmBB (E2 컴포넌트), bfmBAA 및 bfmBAB (E1 컴포넌트)에 코딩되어 있다 (Wang et al., Eur.J.Biochem. 213:1091-1099 (1993)). 포유류에서, 이 컴플렉스는 특정 포스파타제 및 단백질 키나제에 의한 인산화에 의해 조절된다. 이 컴플렉스는 랫 간세포에서 연구되었으며 (Chicco et al., J.Biol.Chem. 269:19427-19434 (1994)), Bckdha (E1 alpha), Bckdhb (E1 beta), Dbt (E2), and Dld (E3)에 코딩되어 있다. 슈도모나스 푸티다 BCKAD 컴플렉스의 E1 및 E3 컴포넌트들은 결정화되었으며 (Aevarsson et al., Nat.Struct.Biol. 6:785-792 (1999); Mattevi et al., Science. 255:1544-1550 (1992)), 이 효소 컴플렉스는 연구되었다 (Sokatch et al., 148:647-652 (1981)). 슈도모나스 푸티다 BCKAD 유전자들의 전사는 bkdR 유전자 산물에 의해 활성화된다 (HESTER et al., 233:828-836 (1995)). 라투스 노르베기쿠스 (Paxton et al., Biochem.J. 234:295-303 (1986)) 및 사카로마이세스 세레비지애 (Sinclair et al., Biochem.Mol.Biol.Int. 31:911-922 (1993))를 비롯한 일부 유기체들에서는, 이러한 컴플렉스가 분지쇄 아미노산 전구체들 외에도, 2-옥소부타노에이트 및 알파-케토글루타레이트와 같은 선형 옥소-산을 포함하는 광범위한 기질 범주를 가지는 것으로 확인되었다. 보바인 BCKAD의 활성부는 대안 기질인 아세틸-CoA를 선호하도록 조작되었다 (Meng et al., Biochemistry. 33:12879-12885 (1994)).
유전자 등재 번호 GI # 유기체
bfmBB NP_390283.1 16079459 바실러스 섭틸리스
bfmBAA NP_390285.1 16079461 바실러스 섭틸리스
bfmBAB NP_390284.1 16079460 바실러스 섭틸리스
pdhD P21880.1 118672 바실러스 섭틸리스
lpdV P09063.1 118677 슈도모나스 푸티다
bkdB P09062.1 129044 슈도모나스 푸티다
bkdA1 NP_746515.1 26991090 슈도모나스 푸티다
bkdA2 NP_746516.1 26991091 슈도모나스 푸티다
Bckdha NP_036914.1 77736548 라투스 노르베기쿠스
Bckdhb NP_062140.1 158749538 라투스 노르베기쿠스
Dbt NP_445764.1 158749632 라투스 노르베기쿠스
Dld NP_955417.1 40786469 라투스 노르베기쿠스
피루베이트의 아세틸-CoA로의 변환을 촉매하는 피루베이트 데하이드로게나제 복합체도 광범위하게 연구되고 있다. 에스케리키아 콜라이 효소의 경우, E1 컴포넌트의 특정 잔기들이 기질 특이성을 담당한다 (Bisswanger, 256:815-822 (1981); Bremer, 8:535-540 (1969); Gong et al., 275:13645-13653 (2000)). 앞서 언급한 바와 같이, 효소 조작 시도는 혐기 조건에서 에스케리키아 콜라이의 PDH 효소 활성을 개선시키게 되었다 (Kim et al., J.Bacteriol. 190:3851-3858 (2008); Kim et al., Appl.Environ.Microbiol. 73:1766-1771 (2007); Zhou et al., Biotechnol.Lett. 30:335-342 (2008)). 에스케리키아 콜라이 PDH와의 대조적으로, 바실러스 섭틸리스의 복합체는 혐기 조건에서 활성을 띄며, 혐기 조건에서의 증식을 위해 필요하다 (Nakano et al., 179:6749-6755 (1997)). 글리세롤에서 증식하는 동안에 특정화된 클렙시엘라 뉴모니애 PDH 역시 혐기 조건에서 활성을 나타낸다 (Menzel et al., 56:135-142 (1997)). 보바인 신장 유래 효소 복합체 (Zhou et al., 98:14802-14807 (2001))와 아조박터 비넬란디이의 E2 촉매 도메인에 대한 결정 구조들은 입수 가능하다 (Mattevi et al., Science. 255:1544-1550 (1992)). 일부 포유류 PDH 효소 복합체들은 2-옥소부타노에이트와 같은 대안 기질에 반응할 수 있다. 라투스 노르베기쿠스의 PDH 및 BCKAD에 대한 비교 카이네틱스에 따르면, BCKAD가 기질로서 2-옥소부타노에이트에 대해 높은 활성을 가지는 것으로 나타났다 (Paxton et al., Biochem.J. 234:295-303 (1986)). 사카로마이세스 세레비지애의 컴플렉스는 E1 (PDA1, PDB1)에 결합하는 E2 (LAT1) 코어, E3 (LPD1), 및 단백질 X (PDX1) 컴포넌트들로 구성된다 (Pronk et al., Yeast 12:1607-1633 (1996)).
유전자 등재 번호 GI # 유기체
aceE NP_414656.1 16128107 에스케리키아 콜라이
aceF NP_414657.1 16128108 에스케리키아 콜라이
lpd NP_414658.1 16128109 에스케리키아 콜라이
pdhA P21881.1 3123238 바실러스 섭틸리스
pdhB P21882.1 129068 바실러스 섭틸리스
pdhC P21883.2 129054 바실러스 섭틸리스
pdhD P21880.1 118672 바실러스 섭틸리스
aceE YP_001333808.1 152968699 클렙시엘라 뉴모니아
aceF YP_001333809.1 152968700 클렙시엘라 뉴모니아
lpdA YP_001333810.1 152968701 클렙시엘라 뉴모니아
Pdha1 NP_001004072.2 124430510 라투스 노르베기쿠스
Pdha2 NP_446446.1 16758900 라투스 노르베기쿠스
Dlat NP_112287.1 78365255 라투스 노르베기쿠스
Dld NP_955417.1 40786469 라투스 노르베기쿠스
LAT1 NP_014328 6324258 사카로마이세스 세레비지애
PDA1 NP_011105 37362644 사카로마이세스 세레비지애
PDB1 NP_009780 6319698 사카로마이세스 세레비지애
LPD1 NP_116635 14318501 사카로마이세스 세레비지애
PDX1 NP_011709 6321632 사카로마이세스 세레비지애
전술한 거대 멀티효소 2-케노-산 데하이드로게나제 복합체의 대안으로서, 일부 혐기 유기체들은 2-케토산 옥시도리덕타제 패밀리 (OFOR)의 효소를 이용하여, 2-케토-산의 아실화 산화성 탈카르복시화를 촉매한다. 데하이드로게나제 컴플렉스와는 다르게, 이들 효소는 철-황 클러스터를 함유하며, 여러가지 조인자들을 이용하며, 페레독신, 플라보디신 또는 FAD를 NAD(P)H에 대한 전자 도너로서 사용한다. 이들 패밀리에 속하는 대부분의 효소들은 기질로서 피루베이트 (POR)에 특이적이지만, 일부 2-케토-산:페레독신 옥시도리덕타제들은 알파-케토글루타레이트 및 2-옥소부타노에이트를 비롯하여 기질로서 매우 다양한 2-케토산 화합물들을 수용하는 것으로 확인되었다 (Zhang et al., J.Biochem. 120:587-599 (1996); Fukuda et al., Biochim.Biophys.Acta 1597:74-80 (2002)). 이러한 효소 한가지는 호열호산성 고세균인 설폴로부스 토코다이 7으로부터 유래된 OFOR로서, 이는 유전자 ST2300 (Zhang et al., J.Biochem. 120:587-599 (1996); Fukuda and Wakagi, Biochim.Biophys.Acta 1597:74-80 (2002))에 의해 코딩되는 알파 및 베타 서브유닛을 포함한다. 에스케리키아 콜라이에서 이들 단백질을 효율적으로 발현시키기 위해 플라스미드를 이용한 발현 시스템이 개발되었으며 (Fukuda et al., Eur.J.Biochem. 268:5639-5646 (2001)), 기질 특이성에 참여하는 잔기들이 결정되었다 (Fukuda and Wakagi, Biochim.Biophys.Acta 1597:74-80 (2002)). 설폴로부스 솔파타리쿠스 P1 유래 2-옥소산:페레독신 옥시도리덕타제는 또한 매우 다양한 2-옥소산 화합물에 대해 활성을 나타낸다 (Park et al., J.Biochem.Mol.Biol. 39:46-54 (2006)). 최근 에어로피룸 퍼닉스 str. K1으로부터 Ape1472/Ape1473에 의해 코딩된 OFOR 효소가 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되어 특정화되었으며, 2-옥소글루타레이트와 매우 다양한 2-옥소산과 반응하는 것으로 확인되었다 (Nishizawa et al., FEBS Lett. 579:2319-2322 (2005)). 유사한 효소들이 모든 고세균과, 일부 혐기성 세균 및 미토콘드리아가 없는 진핵생물들에 존재한다는 생물정보학적 증거들이 존재한다 (Fukuda and Wakagi, supra). 또한, OFOR 효소들은 하이드로게노박터 서모필러스, 데설포박터 하이드로게노필러스 및 클로로비움 속을 비롯하여, RTCA 사이클을 통해 탄소를 고정하는 유기체들에서도 발견된다 (Shiba et al., Archives of Microbiology 141:198-203 (1985); Evans et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 55:928-934 (1966)). H. 서모필러스로부터 유래된 korAB에 의해 코딩되는 2-서브유닛 효소는 에스케리키아 콜라이에 클로닝되어 발현되었다 (Yun et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 282:589-594 (2001)).
유전자 GI # 등재 번호 유기체
ST2300 NP_378302.1 15922633 설폴로부스 토코다이 7
Ape1472 BAA80470.1 5105156 에어로피룸 퍼닉스
Ape1473 BAA80471.2 116062794 에어로피룸 퍼닉스
korA BAB21494 12583691 하이드로게노박터 서모필러스
korB BAB21495 12583692 하이드로게노박터 서모필러스
1.2.1.d 옥시도리덕타제 (탈인산화)
포스폰산의 이의 대응되는 알데하이드로의 환원은 EC 클래스 1.2.1.의 옥시도리덕타제 또는 포스페이트 리덕타제에 의해 촉매된다. 도 6의 단계 E에는 2,4-펜타디에노일-포스페이트의 이의 대응되는 알데하이드로의 환원을 위한 상기한 효소가 필요하다. 이런 변환은 지금까지 문헌에서 파악되지 않았다. 포스포네이트 리덕타제 효소의 예로는 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (EC 1.2.1.12), 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제 (EC 1.2.1.11), 아세틸글루타밀포스페이트 리덕타제 (EC 1.2.1.38) 및 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제 (EC 1.2.1.-)가 있다. 아스파르테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 (ASD, EC 1.2.1.11)는 4-아스파르틸 포스페이트의 아스파르테이트-4-세미알데하이드로의 NADPH-의존성 환원을 촉매한다. 아미노산 생합성에 ASD가 참여하며, 최근 항미생물 타겟으로서 연구되고 있다 (Hadfield et al., Biochemistry 40:14475-14483 (2001)). 에스케리키아 콜라이 ASD의 구조는 규명되었으며 (Hadfield et al., J Mol.Biol. 289:991-1002 (1999)), 이 효소는 대안 기질로서 베타-3-메틸아스파르틸 포스페이트를 수용하는 것으로 확인되었다 (Shames et al., J Biol.Chem. 259:15331-15339 (1984)). 헤모필러스 인플루엔자 효소는 활성부에 기질 결합 친화성을 변형시키기 위한 효소 조작 연구의 대상이 되고 있다 (Blanco et al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 60:1388-1395 (2004); Blanco et al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 60:1808-1815 (2004)). 다른 ASD 후보들도 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Shafiani et al., J Appl Microbiol 98:832-838 (2005)), 메타노코커스 야나스키이 (Faehnle et al., J Mol.Biol. 353:1055-1068 (2005)), 및 감염성 미생물 비브리오 콜레라와 헬리코박터 필로리 (Moore et al., Protein Expr.Purif. 25:189-194 (2002))에서 확인되었다. 관련 후보 효소는 아세틸글루타밀포스페이트 리덕타제 (EC 1.2.1.38)이며, 이 효소는 천연적으로 아세틸글루타밀포스페이트를 아세틸글루타메이트-5-세미알데하이드로 환원하며, 사카로마이세스 세레비지애 (Pauwels et al., Eur.J Biochem. 270:1014-1024 (2003)), B. 섭틸리스 (O'Reilly et al., Microbiology 140 (Pt 5):1023-1025 (1994)), 에스케리키아 콜라이 (Parsot et al., 유전자. 68:275-283 (1988)), 및 기타 유기체들에서 발견되었다. 에스케리키아 콜라이의 추가적인 포스페이트 리덕타제 효소들로는 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 (gapA (Branlant et al., Eur.J.Biochem. 150:61-66 (1985))) 및 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제 (proA (Smith et al., J.Bacteriol. 157:545-551 (1984)))가 있다. 살모넬라 티피무리움 (Mahan et al., J Bacteriol. 156:1249-1262 (1983)) 및 캄필로박터 제주니 (Louie et al., Mol.Gen.Genet. 240:29-35 (1993))로부터 유래된 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제 효소를 코딩하는 유전자들은 클로닝되었으며, 에스케리키아 콜라이에서 발현되었다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
asd NP_417891.1 16131307 에스케리키아 콜라이
asd YP_248335.1 68249223 헤모필러스 인플루엔자
asd AAB49996 1899206 미코박테리움 투베르쿨로시스
VC2036 NP_231670 15642038 비브리오 콜레라
asd YP_002301787.1 210135348 헬리코박터 필로리
ARG5,6 NP_010992.1 6320913 사카로마이세스 세레비지애
argC NP_389001.1 16078184 바실러스 섭틸리스
argC NP_418393.1 16131796 에스케리키아 콜라이
gapA P0A9B2.2 71159358 에스케리키아 콜라이
proA NP_414778.1 16128229 에스케리키아 콜라이
proA NP_459319.1 16763704 살모넬라 티피무리움
proA P53000.2 9087222 캄필로박터 제주니
1.2.1.e 옥시도리덕타제 (산 -> 알데하이드)
산에서 알데하이드로의 변환은 열역학적으로 우호적이지 않으며, 전형적으로 에너지가 풍부한 조인자와 효소적 다단계가 요구된다. 단일 효소에 의한 산의 알데하이드로의 직접 변환은 1.2,1 패밀리의 산 리덕타제 효소에 의해 촉매된다. 이 EC 클래스에 속하는 효소는 3-하이드록시부티레이트를 3-하이드록시부타날 (단계 5K, 도 5)로, 2,4-펜타디에노에이트를 펜타-2,4-디에날로 (단계 A, 도 6) 변환하는데 필요하다.
산 리덕타제 효소의 예로는 카르복실산리덕타제, 알파-아미노아디페이트 리덕타제 및 레티노익산 리덕타제가 있다. 노카르디아 아이오웬시스에서 발견된 카르복실산리덕타제 (CAR)는 카르복실산을 이의 대응되는 알데하이드로 마그네슘, ATP 및 NADPH-의존적으로 환원하는 과정을 촉매한다 (Venkitasubramanian et al., J Biol.Chem. 282:478-485 (2007)). 이 효소의 천연 기질은 벤조에이트이며, 이 효소는 p-톨루에이트 등의 다양한 방향족 기질 수용성을 나타낸다 (Venkitasubramanian et al., Biocatalysis in Pharmaceutical and Biotechnology Industries. CRC press (2006)). 노카르디아 아이오웬시스로부터 car에 의해 코딩되는 이러한 효소가 클로닝되었으며, 에스케리키아 콜라이에서 기능적으로 발현되었다 (Venkitasubramanian et al., J Biol.Chem. 282:478-485 (2007)). CAR은, 비활성형 주효소 (apoenzyme)를 활성형의 전효소로 변환시키는 포스포판테테인 트랜스퍼라제 (PPTase)에 의한 번역 후 활성화를 필요로 한다 (Hansen et al., Appl.Environ.Microbiol 75:2765-2774 (2009)). 특이적인 PPTase 산물을 코딩하는 npt 유전자의 발현은 효소의 활성을 개선시켰다. 스트렙토마이세스 그리세우스에서 발굴된 추가적인 후보 효소는 griC 및 griD 유전자들에 코딩되어 있다. griC 또는 griD 중 어느 하나의 결손시 3-아미노-4-하이드록시벤조산 대사의 션트 산물인 세포외 3-아세틸아미노-4-하이드록시벤조산이 축적되기 때문에, 이 효소는 -아미노-4-하이드록시벤조산을 3-아미노-4-하이드록시벤즈알데하이드로 변환시키는 것으로 생각된다 (Suzuki, et al., J. Antibiot. 60(6):380-387 (2007)). 노카르디아 아이오웬시스 npt의 서열과 유사한 효소인 SGR_665를 griC 및 griD와 함께 발현시키는 것이 유익할 수 있다.
유전자 유전자은행 등재번호 GI 번호 유기체
car AAR91681.1 40796035 노카르디아 아이오웬시스
npt ABI83656.1 114848891 노카르디아 아이오웬시스
griC YP_001825755.1 182438036 스트렙토마이세스 그리세우스
griD YP_001825756.1 182438037 스트렙토마이세스 그리세우스
추가적인 car 및 npt 유전자들을 서열 상동성을 토대로 동정할 수 있다.
유전자명 GI 번호 유전자은행 등재번호 유기체
fadD9 121638475 YP_978699.1 미코박테리움 보비스 BCG
BCG_2812c 121638674 YP_978898.1 미코박테리움 보비스 BCG
nfa20150 54023983 YP_118225.1 노카르디아 파르시니카 IFM 10152
nfa40540 54026024 YP_120266.1 노카르디아 파르시니카 IFM 10152
SGR_6790 182440583 YP_001828302.1 스트렙토마이세스 그리세우스 아종 그리세우스 NBRC 13350
SGR_665 182434458 YP_001822177.1 스트렙토마이세스 그리세우스 아종 그리세우스 NBRC 13350
MSMEG_2956 YP_887275.1 YP_887275.1 미코박테리움 스메그마티스 MC2 155
MSMEG_5739 YP_889972.1 118469671 미코박테리움 스메그마티스 MC2 155
MSMEG_2648 YP_886985.1 118471293 미코박테리움 스메그마티스 MC2 155
MAP1040c NP_959974.1 41407138 미코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 K-10
MAP2899c NP_961833.1 41408997 미코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 K-10
MMAR_2117 YP_001850422.1 183982131 미코박테리움 마리눔 M
MMAR_2936 YP_001851230.1 183982939 미코박테리움 마리눔 M
MMAR_1916 YP_001850220.1 183981929 미코박테리움 마리눔 M
TpauDRAFT_33060 ZP_04027864.1 227980601 츠카무렐라 파우로메타볼라 DSM 20162
TpauDRAFT_20920 ZP_04026660.1 ZP_04026660.1 츠카무렐라 파우로메타볼라 DSM 20162
CPCC7001_1320 ZP_05045132.1 254431429 시아노비움 PCC7001
DDBDRAFT_0187729 XP_636931.1 66806417 딕티오스텔리움 디스코이데움 AX4
특징이 비슷한 효소인 알파-아미노아디페이트 리덕타제 (AAR, EC 1.2.1.31)는 일부 진균 종들에서 라이신 생합성에 관여한다. 이 효소는 천연적으로 알파-아미노아디페이트를 알파-아미노아디페이트 세미알데하이드로 환원한다. 카르복실기가 먼저 ATP-의존적인 아데닐레이트의 형성을 통해 활성화된 다음, 아데닐레이트는 NAD(P)H에 의해 환원되어 알데하이드와 AMP가 만들어진다. CAR 처럼, 이 효소는 마그네슘을 이용하며, PPTase에 의한 활성화를 필요로 한다. AAR의 효소 후보들과 이의 대응되는 PPTase는 사카로마이세스 세레비지애 (Morris et al., 유전자 98:141-145 (1991)), 칸디다 알비칸스 (Guo et al., Mol.Genet.Genomics 269:271-279 (2003)), 및 시조사카로마이세스 품베 (Ford et al., Curr.Genet. 28:131-137 (1995))에서 확인되었다. 시조사카로마이세스 품베의 AAR은 에스케리키아 콜라이에서 발현시켰을 때 유의한 활성을 나타내었다 (Guo et al., Yeast 21:1279-1288 (2004)). 페니실리움 크리소게눔의 AAR은 대안 기질로서 S-카르복시메틸-L-시스테인을 수용하지만, 아디페이트, L-글루타메이트 또는 디아미노피멜레이트와는 반응하지 않는다 (Hijarrubia et al., J Biol.Chem. 278:8250-8256 (2003)). 페니실리움 크리소게눔 PPTase를 코딩하는 유전자는 아직까지 규명되지 않았으며, 서열 비교 상동성 검색을 통해서도 확신성이 높은 것은 확인되지 않았다.
유전자 유전자은행 등재번호 GI 번호 유기체
LYS2 AAA34747.1 171867 사카로마이세스 세레비지애
LYS5 P50113.1 1708896 사카로마이세스 세레비지애
LYS2 AAC02241.1 2853226 칸디다 알비칸스
LYS5 AAO26020.1 28136195 칸디다 알비칸스
Lys1p P40976.3 13124791 시조사카로마이세스 품베
Lys7p Q10474.1 1723561 시조사카로마이세스 품베
Lys2 CAA74300.1 3282044 페니실리움 크리소게눔
1.3.1.a 옥시도리덕타제 (알칸 -> 알켄)
도 1에 도시된 몇몇 변환들은 단계 B, F 및 M을 비롯하여 알칸의 알켄으로의 산화를 수반한다. 단계 B와 F는 역 방향으로 작동하는 데하이드로게나제 또는 에노에이트 리덕타제에 의해 촉매된다. 단계 M은 5-하이드록시발레릴-CoA 데하이드로게나제, 아실-CoA 데하이드로게나제 또는 에노에이트 리덕타제에 의해 촉매된다. 도 3의 단계 E과 G는 각각 펜트-3-에노일-CoA 또는 펜트-2-에노일-CoA의 2,4-펜타디에노일-CoA로의 산화를 수반한다. 후보 효소의 예들은 아래에 기술한다.
펜트-3-에노일-CoA 또는 펜트-2-에노일-CoA의 2,4-펜타디에노일-CoA로의 산화는 2,4-펜타디에노일-CoA를 형성하는 데하이드로게나제 효소에 의해 촉매된다. 2,4-디에노일-CoA 리덕타제 효소 (EC 1.3.1.34)가 이러한 변환에 적합한 후보 효소이다. 일반적으로, 박테리아의 2,4-디에노일-CoA 리덕타제는 2-에노일-CoA 산물을 생산하는데 반해, 진핵 생물의 2,4-디에노일-CoA 리덕타제는 3-에노일-CoA 산물을 생산한다 (Dommes and Kunau, J Biol Chem, 259:1781-1788 (1984)). 에스케리키아 콜라이의 fadH 유전자 산물은 NADPH-의존성 2,4-디에노일-CoA 리덕타제로서, 이것은 불포화 지방산의 베타-산화에 참여한다 (Tu et al, Biochem, 47:1167-1175 (2008). DCR 돌연변이 시리즈들이 구축되었으며, 2-에노일-CoA 및 3-에노일-CoA 산물 둘다를 생성하는 것으로 확인되었다 (Tu et al, supra). 진핵 생물의 DCR 효소들은 인간과 마우스에서 특정화되었다 (Koivuranta et al, Biochem J, 304:787-792 (1994); Geisbrecht et al, J Biol Chem 274:25814-20 (1999); Miinalainen et al, PLoS genet. 5: E1000543 (2009)). 클로스트리듐 아미노발레리쿰의 2,4-펜타디에노일-CoA 리덕타제는 3-펜트-3-에노일-CoA의 2,4-펜타디에노일-CoA로의 산화를 촉매하는 것으로 확인되었다. 이 효소는 정제 및 특정화되었으며, 구조가 결정되었다 (Eikmanns, Acta Cryst, D50: 913-914 (1994); 및 Eikmanns and Buckel, Eur J Biochem 198:263-266 (1991)). 이 효소의 전자 캐리어는 비-공지이지만, NAD(P)H는 아니다. 효소의 서열은 아직까지 공개되지 않았다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fadH NP_417552.1 16130976 에스케리키아 콜라이
Decr1 Q16698.1 3913456 호모 사피엔스
Pdcr Q9WV68.1 90109767 무스 무스쿨루스
Decr NP_080448.1 13385680 무스 무스쿨루스
EC 클래스 1.3.* 의 2-에노에이트 리덕타제 효소는 매우 다양한 알파, 베타-불포화 카르복실산 및 알데하이드 화합물의 가역적인 환원을 촉매하는 것으로 알려져 있다 (Rohdich et al., J Biol Chem 276:5779-5787 (2001)). 최근 공개된 클로스트리듐 클루이베리의 게놈 서열에서, 에노에이트 리덕타제에 대한 9개의 코딩 서열들이 보고되었으며, 이중 하나가 특정화되었다 (Seedorf et al., PNAS 105:2128-2133 (2008)). 클로스트리듐 티로부리티쿰 및 무렐라 서모아세티쿰으로부터 유래된 enr 유전자들이 클로닝되었으며, 사로 59%의 동일성을 나타낸다. 전자 유전자는 또한 클로스트리듐 클루이베리에서 특정화된 유전자와의 유사성이 대략 75%인 것으로 확인된다 (Giesel et al., 135:51-57 (1983)). 클로스트리듐 티로부티리쿰의 enr이 에스케리키아 콜라이의 FadH 디에노일 CoA 리덕타제와 매우 유사하다는 것이 이들 서열 결과들을 기초로 보고된 바 있다 (Rohdich et al., supra). 무렐라 서모아세티쿰 enr 유전자는 에스케리키아 콜라이에서 촉매적으로 활성인 형태로 발현되었다 (Rohdich et al., supra). 이 효소는 매우 다양한 알파, 베타-불포화 카르보닐 화합물들에 대해 활성을 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
enr ACA54153.1 169405742 클로스트리듐 보툴리눔 A3 str
enr CAA71086.1 2765041 클로스트리듐 티로부티리쿰
enr CAA76083.1 3402834 클로스트리듐 클루이베리
enr YP_430895.1 83590886 무렐라 서모아세티카
다른 후보 효소인 2-에노에이트 리덕타제는 말레일아세테이트 리덕타제 (MAR, EC 1.3.1.32)로서, 이 효소는 2-말레일아세테이트 (4-옥소헥스-2-에네디오에이트)의 3-옥소아디페이트로의 환원을 촉매한다. MAR 효소는 천연적으로 방향족 분해 경로에 참여한다 (Kaschabek et al., J Bacteriol. 175:6075-6081 (1993); Kaschabek et al., J Bacteriol. 177:320-325 (1995); Camara et al., J Bacteriol. (2009); Huang et al., Appl Environ.Microbiol 72:7238-7245 (2006)). 이 효소 활성은 규명되었으며, 슈도모나스 sp. strain B13에서 특정되었으며 (Kaschabek et al., 175:6075-6081 (1993); Kaschabek et al., 177:320-325 (1995)), 코딩 유전자가 클로닝되었고, 서열 분석되었다 (Kasberg et al., J Bacteriol. 179:3801-3803 (1997)). 추가적인 MAR 후보 유전자로는 슈도모나스 sp. strain B13의 clcE 유전자 (Kasberg et al., J Bacteriol. 179:3801-3803 (1997)), 로도코커스 오파쿠스의 macA 유전자 (Seibert et al., 180:3503-3508 (1998)), 랄스토니아 유트로파 (쿠프리아비두스 네카토르라고도 함)의 macA 유전자 (Seibert et al., Microbiology 150:463-472 (2004)), 랄스토니아 유트로파의 tfdFII (Seibert et al., J Bacteriol. 175:6745-6754 (1993)) 및 코리네박테리움 글루타미컴 NCgl1112 (Huang et al., Appl Environ.Microbiol 72:7238-7245 (2006))를 포함한다. ccaD에 의해 코딩되는 슈도모나스 라이네카이 MT1의 MAR은 최근에 동정되었다 (Camara et al., J Bacteriol. (2009)).
유전자 GI # 등재 번호 유기체
clcE 3913241 O30847.1 슈도모나스 sp. strain B13
macA 7387876 O84992.1 로도코커스 오파쿠스
macA 5916089 AAD55886 쿠프리아비두스 네카토르
tfdFII 1747424 AC44727.1 랄스토니아 유트로파 JMP134
NCgl1112 19552383 NP_600385 코리네박테리움 글루타미컴
ccaD ABO61029.1 134133940 슈도모나스 라이네카이 MT1
알켄을 형성하는 산화 방향을 선호하는 에노에이트 리덕타제의 예는 숙시네이트 데하이드로게나제 (EC 클래스 1.3.99 또는 1.3.5)이며, 이는 또한 숙시네이트-유비퀴논 옥시도리덕타제 및 컴플렉스 II로도 알려져 있다. SDH는 숙시네이트를 푸마레이트로 변환하며 전자를 유비퀴논으로 전달하는 막-결합형 효소 컴플렉스이다. 이 효소는 sdhAB에 의해 코딩된 2개의 촉매 서브유닛과 sdhCD에 의해 코딩되는 2개의 막 서브유닛들로 구성된다. 에스케리키아 콜라이 SDH는 가역적이지만, 이 효소는 푸마레이트의 환원 보다는 숙시네이트를 산화하는데 50배 이상 강력하다 (Maklashina et al J Biol.Chem. 281:11357-11365 (2006)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
sdhA AAC73817.1 1786942 에스케리키아 콜라이
sdhB AAC73818.1 1786943 에스케리키아 콜라이
sdhC AAC73815.1 1786940 에스케리키아 콜라이
sdhD AAC73816.1 1786941 에스케리키아 콜라이
아실-CoA 데하이드로게나제 또는 에노일-CoA 리덕타제의 예는 클로스트리듐 아세토부틸리컴 유래 bcd의 유전자 산물이며 (Atsumi et al., 10:305-311 (2008); Boynton et al., J Bacteriol. 178:3015-3024 (1996)), 이는 천연적으로 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA로의 환원을 촉매한다 (EC 1.3.99.2). 이 효소는 클로스트리디아 종들에서 부티레이트로의 아세틸-CoA 발효 경로에 참여한다 (Jones et al., Microbiol Rev. 50:484-524 (1986)). 부티릴-CoA 리덕타제의 활성은 전자 전달체 플라보단백질을 코딩하는 클로스트리듐 아세토부틸리컴의 etfAB 유전자 발현과 더불어 bcd를 발현함으로써 강화될 수 있다. 에노일-CoA 리덕타제 단계의 추가적인 후보는 유글레나 그라실리스의 미토콘드리아 에노일-CoA 리덕타제 (EC 1.3.1.44)이다 (Hoffmeister et al., J Biol.Chem 280:4329-4338 (2005)). 미토콘드리아를 타겟팅하는 리더 서열이 제거된 이 서열로부터 파생된 구조체는 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되었으며, 활성형의 효소가 생성되었다 (Hoffmeister et al, supra). TDE0597에 의해 코딩되는 원핵 생물 트레포네마 덴티콜라 유래 단백질의 밀접한 상동체도 클로닝되었고, 에스케리키아 콜라이에서 발현되었다 (Tucci et al., FEBS Lett, 581:1561-1566 (2007)). 신트로푸스 액시디트로피쿠스에서 유전자 6종이 클로스트리듐 아세토부틸리컴 bcd 유전자 산물에 대한 서열 상동성을 통해 동정되었다. 신트로푸스 액시디트로피쿠스의 유전자 syn_02637과 syn_02636은 클로스트리듐 아세토부틸리컴의 etfAB 유전자와 높은 서열 상동성을 가지며, 전자 전달체 플라보단백질의 알파 및 베타 서브유닛을 코딩하는 것으로 예측된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
bcd NP_349317.1 15895968 클로스트리듐 아세토부틸리컴
etfA NP_349315.1 15895966 클로스트리듐 아세토부틸리컴
etfB NP_349316.1 15895967 클로스트리듐 아세토부틸리컴
TER Q5EU90.1 62287512 유글레나 그라실리스
TDE0597 NP_971211.1 42526113 트레포네마 덴티콜라
syn_02587 ABC76101 85721158 신트로푸스 액시디트로피쿠스
syn_02586 ABC76100 85721157 신트로푸스 액시디트로피쿠스
syn_01146 ABC76260 85721317 신트로푸스 액시디트로피쿠스
syn_00480 ABC77899 85722956 신트로푸스 액시디트로피쿠스
syn_02128 ABC76949 85722006 신트로푸스 액시디트로피쿠스
syn_01699 ABC78863 85723920 신트로푸스 액시디트로피쿠스
syn_02637 ABC78522.1 85723579 신트로푸스 액시디트로피쿠스
syn_02636 ABC78523.1 85723580 신트로푸스 액시디트로피쿠스
추가적인 에노일-CoA 리덕타제의 후보 효소들은, 방향족 화합물들을 분해하는 유기체들에서 발견되었다. 벤조에이트 분해를 위한 모델 유기체인 로도슈도모나스 팔루스트리스는 피멜로일-CoA의 베타-산화를 경유하여 피멜레이트를 분해하는 효소적 능력을 가지고 있다. pim 오페론에서 인접한 유전자들 pimC 및 pimD는 클로스트리듐 아세토부틸리컴의 bcd와 서열 상동성을 가지고 있으며, 플라빈을 함유한 피멜로일-CoA 데하이드로게나제를 코딩하는 것으로 예측된다 (Harrison et al., 151:727-736 (2005)). 질소를 고정하는 대두 공생균 브라디리조비움 자포니쿰의 게놈도 R. 팔루스트리스의 pimC 및 pimD와의 서열 유사성이 높은 유전자들로 구성된 pim 오페론을 가지고 있다 (Harrison and Harwood, Microbiology 151:727-736 (2005)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
pimC CAE29155 39650632 로도슈도모나스 팔루스트리스
pimD CAE29154 39650631 로도슈도모나스 팔루스트리스
pimC BAC53083 27356102 브라디리조비움 자포니쿰
pimD BAC53082 27356101 브라디리조비움 자포니쿰
다른 후보 효소는 2-메틸-분지쇄 에노일-CoA 리덕타제 (EC 1.3.1.52 및 EC 1.3.99.12)이며, 이 효소는 입체 방해를 받는 트랜스-에노일-CoA 기질의 환원을 촉매한다. 이 효소는 선충 아스카리우스 숨에서 분지쇄 지방산 합성에 참여하며, 2-메틸발레릴-CoA, 2-메틸부타노일-CoA, 2-메틸펜타노일-CoA, 옥타노일-CoA 및 펜타노일-CoA 등의 다양한 직쇄 및 분지쇄 기질들을 환원할 수 있다 (Duran et al., 268:22391-22396 (1993)). 유전자 acad1과 acad에 의해 코딩되는 이 효소의 2가지 이소형들이 특정화되었다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
acad1 AAC48316.1 2407655 아스카리우스 숨
acad AAA16096.1 347404 아스카리우스 숨
1.4.1.a 옥시도리덕타제 (아민 -> 옥소)
EC 클래스 1.4.1의 효소들은 아민 화합물의 알데하이드 화합물 또는 케톤 화합물로의 산화적 탈아민화를 촉매한다. 이 EC 클래스의 효소들은 전형적으로 전자 어셉터로서 NAD+, NADP+ 또는 FAD를 사용하며, 반응은 전형적으로 가역적이다. 도 1의 단계들 C, H 및 I는 옥시도리덕타제를 탈아민화함으로써 촉매될 수 있다. 후보 효소는 아래에 기술되어 있다.
글루타메이트 데하이드로게나제 (EC 1.4.1.2), 루신 데하이드로게나제 (EC 1.4.1.9) 및 아스파르테이트 데하이드로게나제 (EC 1.4.1.21)는 아미노산을 이의 대응되는 2-케토산으로 변환한다. 에스케리키아 콜라이의 gdhA 유전자 산물 (Korber et al., J Mol.Biol. 234:1270-1273 (1993); McPherson et al., Nucleic Acids Res. 11:5257-5266 (1983)), 서모토가 마리타임의 gdh (Kort et al., Extremophiles. 1:52-60 (1997); Lebbink et al., J Mol.Biol. 280:287-296 (1998); Lebbink et al., J Mol.Biol. 289:357-369 (1999)), 및 할로박테리움 살리나룸 gdhA1 (Ingoldsby et al., 유전자 349:237-244 (2005))은 글루타메이트를 2-옥소글루타레이트와 암모니아로 가역적으로 변환하는 과정을 촉매하며, NADP(H), NAD(H) 또는 둘다를 각각 선호한다. 추가적인 글루타메이트 데하이드로게나제 후보 유전자는 바실러스 섭틸리스 (Khan et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 69:1861-1870 (2005)), 니코티아나 타바쿰 (Purnell et al., Planta 222:167-180 (2005)), 오리자 사티바 (Abiko et al., Plant Cell Physiol 46:1724-1734 (2005)), 할로페락스 메디테라나이 (Diaz et al., Extremophiles. 10:105-115 (2006)) 및 할로박트라움 살리나룸 (Hayden et al., FEMS Microbiol Lett. 211:37-41 (2002))에서 확인된다. 니코티아나 타바쿰의 효소는 gdh1 및 gdh2에 의해 코딩되는 알파 및 베타 서브유닛들로 구성된다 (Purnell et al., Planta 222:167-180 (2005)). NADH-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제의 과다 발현이 사카로마이세스 세레비지애의 조작된 균주들에서 에탄올 생산을 향상시키는 것으로 확인되었다 (Roca et al., Appl Environ.Microbiol 69:4732-4736 (2003)). 바실러스 세레우스의 ldh 유전자는 루신, 이소루신, 발린 및 2-아미노부타노에이트 등의 매우 다양한 기질을 수용하는 LeuDH 단백질을 코딩한다 (Ansorge et al., Biotechnol Bioeng 68:557-562 (2000); Stoyan et al., J Biotechnol 54:77-80 (1997)). 서모토가 마리티마의 nadX 유전자는 NAD의 생합성에 참여하는 아스파르테이트 데하이드로게나제를 코딩한다 (Yang et al., J Biol.Chem. 278:8804-8808 (2003)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
gdhA P00370 118547 에스케리키아 콜라이
gdh P96110.4 6226595 서모토가 마리티마
gdhA1 NP_279651.1 15789827 할로박테리움 살리나룸
rocG NP_391659.1 16080831 바실러스 섭틸리스
gdh1 AAR11534.1 38146335 니코티아나 타바쿰
gdh2 AAR11535.1 38146337 니코티아나 타바쿰
GDH Q852M0 75243660 오리자 사티바
GDH Q977U6 74499858 할로페락스 메디테라나이
GDH P29051 118549 할로박트라움 살리나룸
GDH2 NP_010066.1 6319986 사카로마이세스 세레비지애
ldh P0A393 61222614 바실러스 세레우스
nadX NP_229443.1 15644391 서모토가 마리티마
1차 아민 화합물을 이의 대응되는 알데하이드 화합물로 변환하는 과정을 촉매하는 효소의 예는 lysDH 유전자에 의해 코딩되는 라이신 6-데하이드로게나제 (EC 1.4.1.18)이다. 이 효소는 L-라이신의 6-아미노기의 산화적 탈아민화를 촉매하여, 2-아미노아디페이트-6-세미알데하이드를 형성한다 (Misono et al., J Bacteriol. 150:398-401 (1982)). 라이신 6-데하이드로게나제 효소의 예들은 지오바실러스 스테아로서모필러스 (Heydari et al., AEM 70:937-942 (2004)), 아그로박테리움 투메팍시엔스 (Hashimoto et al., J Biochem. 106:76-80 (1989); Misono and Nagasaki, J Bacteriol. 150:398-401 (1982)), 및 아크로모박터 데니트리피칸스 (Ruldeekulthamrong et al., BMB.Rep. 41:790-795 (2008))에서 확인된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
lysDH BAB39707 13429872 지오바실러스 스테아로서모필러스
lysDH NP_353966 15888285 아그로박테리움 투메팍시엔스
lysDH AAZ94428 74026644 아크로모박터 데니트리피칸스
1.4.3.a 아민 옥시다제
EC 클래스 1.4.3의 아민 옥시다제 효소는 아미노기의 이의 대응되는 알데하이드 화합물 또는 케톤 화합물의 산화적 탈아민화를 촉매한다. 이 클래스의 효소는 전자 어셉터로서 산소를 이용하여, 아민, O2 및 물을 알데하이드 또는 케톤, 암모니아 및 과산화수소로 변환한다. L-아미노-산 옥시다제는 다수의 L-아미노산의 이의 대응되는 2-옥소산 화합물로의 산화적 탈아민화를 촉매한다. 스트렙토코커스 올리고퍼멘탄스의 효소는 에스케리키아 콜라이에서 과다 발현되었다 (Tong et al, J Bacteriol 190:4716-21 (2008)). 라이신-6-옥시다제 (EC 1.4.3.20) 및 푸트레신 옥시다제 (EC 1.4.3.10) 등의 기타 아민 옥시다제 효소들은 말단 아민 화합물들에 특이적이다. 라이신-6-옥시다제 효소들은 마리노모나스 메디테라니아의 lodA (Lucas-Elio et al, J Bacteriol 188:2493-501 (2006))와 슈도알테로모나스 투니카타의 alpP (Mai-Prochnow et al, J Bacteriol 190:5493-501 (2008))에 의해 코딩된다. 푸트레신 옥시다제 효소는 코쿠리아 로세아의 puo (Ishizuka et al, J Gen Microbiol 139:425-32 (1993))와 아라비돕시스 탈리아나의 ATAO1 (Moller and McPherson, Plant J 13:781-91 (1998))에 의해 코딩된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
EU495328.1:1..1176 ACA52024.1 169260271 스트렙토코커스 올리고퍼멘탄스
lodA AAY33849.1 83940756 마리노모나스 메디테라니아
alpP AAP73876.1 32396307 슈도알테로모나스 투니카타
puo BAA02074.1 303641 코쿠리아 로세아
ATAO1 AAB87690.1 2654118 아라비돕시스 탈리아나
2.3.1.a 아실트랜스퍼라제 (포스페이트기 CoA 전달; 포스포트랜스아실라제)
2,4-펜타디에노일-CoA 포스포트랜스퍼라제 활성을 가진 효소는 2,4-펜타디에노일-CA를 2,4-펜타디에노일-포스페이트로 변환하는데 필요하다 (도 6, 단계 D). 포스페이트를 전달하는 아실트랜스퍼라제의 예로는 포스포트랜스아세틸라제 (EC 2.3.1.8)와 포스포트랜스부티릴라제 (EC 2.3.1.19)가 있다. 에스케리키아 콜라이의 pta 유전자는 아세틸-CoA를 아세틸-포스페이트로 가역적으로 변환하는 포스포트랜스아세틸라제를 코딩한다 (Suzuki, Biochim.Biophys.Acta 191:559-569 (1969)). 또한, 이 효소는 기질로서 프로피오닐-CoA를 이용하여, 프로세스에서 프로피오네이트를 형성할 수 있다 (Hesslinger et al., Mol.Microbiol 27:477-492 (1998)). 프로피오닐-CoA에 대해 활성을 나타내는 그외포스페이트 아세틸트랜스퍼라제는 바실러스 섭틸리스 (Rado et al., Biochim.Biophys.Acta 321:114-125 (1973)), 클로스트리듐 클루이베리 (Stadtman, Methods Enzymol 1:596-599 (1955)), 및 서모토가 마리티마 (Bock et al., J Bacteriol. 181:1861-1867 (1999))에서 확인된다. 마찬가지로, 클로스트리듐 아세토부틸리컴의 ptb 유전자는 부티릴-CoA를 부티릴-포스페이트로 가역적으로 변환하는 효소인 포스포트랜스부티릴라제를 코딩한다 (Wiesenborn et al., Appl Environ.Microbiol 55:317-322 (1989); Walter et al., Gene 134:107-111 (1993)). 추가적인 ptb 유전자들이 부티레이트 생산 박테리움 L2-50 (Louis et al., J.Bacteriol. 186:2099-2106 (2004))과 바실러스 메가테리움 (Vazquez et al., Curr.Microbiol 42:345-349 (2001))에서 확인된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
pta NP_416800.1 71152910 에스케리키아 콜라이
pta P39646 730415 바실러스 섭틸리스
pta A5N801 146346896 클로스트리듐 클루이베리
pta Q9X0L4 6685776 서모토가 마리티마
ptb NP_349676 34540484 클로스트리듐 아세토부틸리컴
ptb AAR19757.1 38425288 부티레이트 생산 박테리움 L2-50
ptb CAC07932.1 10046659 바실러스 메가테리움
2.3.1.b 베타-케토티올라제
EC 클래스 2.3.1의 베타-케토티올라제 효소들은 2개의 아실-CoA 기질의 축합을 촉매한다. 도 2의 단계 A, 도 3의 단계 A 및 도 4의 단계 A를 비롯하여, 도 2-4에 도시된 몇가지 변환들에는 베타-케토티올라제가 요구된다.
아세토아세틸-CoA 티올라제 활성을 가진 베타-케토티올라제의 예로는, 에스케리키아 콜라이 atoB (Martin et al., Nat.Biotechnol 21:796-802 (2003)), 클로스트리듐 아세토부틸리컴 thlA 및 thlB (Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007); Winzer et al., J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:531-541 (2000)), 및 사카로마이세스 세레비지애 ERG10 (Hiser et al., J.Biol.Chem. 269:31383-31389 (1994))로부터 유래된 유전자 산물들을 포함한다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
atoB NP_416728 16130161 에스케리키아 콜라이
thlA NP_349476.1 15896127 클로스트리듐 아세토부틸리컴
thlB NP_149242.1 15004782 클로스트리듐 아세토부틸리컴
ERG10 NP_015297 6325229 사카로마이세스 세레비지애
아세틸-CoA 및 프로피오닐-CoA로부터의 베타-케토발레레이트의 형성을 촉매하는 베타-케토티올라제 효소들 역시 적합한 후보 효소이다. 주글로에아 라미게라는 프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA로부터 3-케토발레릴-CoA를 형성할 수 있는 2가지 케토티올라제를 가지고 있으며, 랄스토니아 유트로파는 또한 이러한 변환을 촉매할 수 있는 베타-산화 케토티올라제를 가진다 (Gruys et al., US Patent 5,958,745 (1999)). 이들 유전자 또는 이의 번역된 단백질의 서열들은 보고되지 않았지만, 랄스토니아 유트로파, 주글로에아 라미게라, 또는 기타 유기체들에서 몇가지 후보 효소들이 랄스토니아 유트로파의 bktB와의 서열 상동성을 토대로 동정될 수 있다. 이러한 것으로는 하기를 포함한다:
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
phaA YP_725941.1 113867452 랄스토니아 유트로파
h16_A1713 YP_726205.1 113867716 랄스토니아 유트로파
pcaF YP_728366.1 116694155 랄스토니아 유트로파
h16_B1369 YP_840888.1 116695312 랄스토니아 유트로파
h16_A0170 YP_724690.1 113866201 랄스토니아 유트로파
h16_A0462 YP_724980.1 113866491 랄스토니아 유트로파
h16_A1528 YP_726028.1 113867539 랄스토니아 유트로파
h16_B0381 YP_728545.1 116694334 랄스토니아 유트로파
h16_B0662 YP_728824.1 116694613 랄스토니아 유트로파
h16_B0759 YP_728921.1 116694710 랄스토니아 유트로파
h16_B0668 YP_728830.1 116694619 랄스토니아 유트로파
h16_A1720 YP_726212.1 113867723 랄스토니아 유트로파
h16_A1887 YP_726356.1 113867867 랄스토니아 유트로파
phbA P07097.4 135759 주글로에아 라미게라
bktB YP_002005382.1 194289475 쿠프리아비두스 타이와넨시스
Rmet_1362 YP_583514.1 94310304 랄스토니아 메탈리두란스
Bphy_0975 YP_001857210.1 186475740 버크홀데리아 피마툼
다른 적합한 후보 효소는, 베타-케토아디필-CoA를 숙시닐-CoA 및 아세틸-CoA로 변환하며, 방향족 화합물 분해를 위한 베타-케토아디페이트 경로의 주된 효소인, 3-옥소아디필-CoA 티올라제 (EC 2.3.1.174)이다. 이 효소는 슈도모나스 푸티다 (Harwood et al., J Bacteriol. 176:6479-6488 (1994)) 및 액시네토박터 칼코아세티쿠스 (Doten et al., J Bacteriol. 169:3168-3174 (1987))를 비롯한 토양 세균과 진균들에 널리 분포되어 있다. 슈도모나스 strain B13 pcaF (Kaschabek et al., J Bacteriol. 184:207-215 (2002)), 슈도모나스 푸티다 U phaD (Olivera et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 95:6419-6424 (1998)), 슈도모나스 플루오레센스 ST paaE (Di et al., Arch.Microbiol 188:117-125 (2007)), 및 에스케리키아 콜라이 paaJ (Nogales et al., Microbiology 153:357-365 (2007))에 의해 코딩된 유전자 산물들은 또한 이러한 변환을 촉매한다. 슈도모나스 푸티다의 bkt, 슈도모나스 에우루지노사 PAO1의 pcaF 및 bkt, 버크홀데리아 앰비파리아의 AMMD bkt, 에스케리키아 콜라이의 paaJ, 및 슈도모나스 푸티다의 phaD 등의 수종의 베타-케토티올라제가 옥소아디필-CoA를 형성하는 방향으로 유의하며 선택적인 활성을 발휘한다.
유전자명 GI# 유전자은행 등재번호 유기체
paaJ 16129358 NP_415915.1 에스케리키아 콜라이
pcaF 17736947 AAL02407 슈도모나스 낙크무시이 (B13)
phaD 3253200 AAC24332.1 슈도모나스 푸티다
pcaF 506695 AAA85138.1 슈도모나스 푸티다
pcaF 141777 AAC37148.1 액시네토박터 칼코아세티쿠스
paaE 106636097 ABF82237.1 슈도모나스 플루오레센스
bkt 115360515 YP_777652.1 버크홀데리아 앰비파리아 AMMD
bkt 9949744 AAG06977.1 슈도모나스 에우루지노사 PAO1
pcaF 9946065 AAG03617.1 슈도모나스 에우루지노사 PAO1
2.3.1.d 포르메이트 C-아실트랜스퍼라제
EC 클래스 2.3.1의 포르메이트 C-아실트랜스퍼라제 효소는 케토산의 아실화와 동시적인 포르메이트 해리를 촉매한다. 이러한 효소는 도 1 (단계 R)에서 2-옥소아디페이트의 글루타릴-CoA로의 변환과 도 5의 단계 H에서 4-하이드록시-2-옥소발레레이트의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 변환에 적합하다.
이 클래스의 효소로는 피루베이트 포르메이트-리아제와 케토산 포르메이트-리아제가 있다. 에스케리키아 콜라이에서 pflB에 의해 코딩된 피루베이트 포르메이트-리아제 (PFL, EC 2.3.1.54)는 피루베이트를 아세틸-CoA와 포르메이트로 변환한다. PFL의 활성부는 pflA에 의해 코딩된 PFL-활성화 효소 (PFL-AE, EC 1.97.1.4)에 의해 혐기 조건에서 번역 후 활성화되는 촉매적으로 필연적인 글리실 라디칼을 함유한다 (Knappe et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 81:1332-1335 (1984); Wong et al., Biochemistry 32:14102-14110 (1993)). 케토-산 포르메이트-리아제 (EC 2.3.1.-)는 또한 2-케토부티레이트 포르메이트-리아제 (KFL) 및 피루베이트 포르메이트-리아제 4로도 알려져 있으며, 에스케리키아 콜라이에서는 tdcE의 유전자 산물이다. 이 효소는 혐기적인 트레오닌 분해 시에 2-케토부티레이트의 프로피오닐-CoA와 포르메이트로의 변환을 촉매하며, 또한 혐기적인 이화 작용에서 피루베이트 포르메이트-리아제를 대체할 수 있다 (Simanshu et al., J Biosci. 32:1195-1206 (2007)). 이 효소는 산소에 민감하며, PflB와 마찬가지로, 활성부의 글리실 라디칼을 활성화하기 위해 PFL-AE에 의한 번역 후 수정을 필요로 한다 (Hesslinger et al., Mol.Microbiol 27:477-492 (1998)). pflD에 의해 코딩되는 아르카에글루부스 풀기두스 유래 피루베이트 포르메이트-리아제가 클로닝되어 에스케리키아 콜라이에서 발현되었으며, 특정화되었다 (Lehtio et al., Protein Eng Des Sel 17:545-552 (2004)). 아르카에글루부스 풀기두스 및 에스케리키아 콜라이의 효소들의 결정 구조들이 해명되었다 (Lehtio et al., J Mol.Biol. 357:221-235 (2006); Leppanen et al., Structure. 7:733-744 (1999)). 추가적인 PFL 및 PFL-AE 후보들은 락토코커스 락티스 (Melchiorsen et al., Appl Microbiol Biotechnol 58:338-344 (2002)), 스트렙토코커스 무탄스 (Takahashi-Abbe et al., 경구.Microbiol Immunol. 18:293-297 (2003)), 클라미도모나스 라인하르드티이 (Hemschemeier et al., Eukaryot.Cell 7:518-526 (2008b); Atteia et al., J.Biol.Chem. 281:9909-9918 (2006)) 및 클로스트리듐 파스테우리아눔 (Weidner et al., J Bacteriol. 178:2440-2444 (1996))에서 발견된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
pflB NP_415423 16128870 에스케리키아 콜라이
pflA NP_415422.1 16128869 에스케리키아 콜라이
tdcE AAT48170.1 48994926 에스케리키아 콜라이
pflD NP_070278.1 11499044 아르카에글루부스 풀기두스
pfl CAA03993 2407931 락토코커스 락티스
pfl BAA09085 1129082 스트렙토코커스 무탄스
PFL1 XP_001689719.1 159462978 클라미도모나스 라인하르드티이
pflA1 XP_001700657.1 159485246 클라미도모나스 라인하르드티이
pfl Q46266.1 2500058 클로스트리듐 파스테우리아눔
act CAA63749.1 1072362 클로스트리듐 파스테우리아눔
2.3.1.h 3-옥소아실-CoA 신타제
아세토아세틸-CoA, 3-옥소펜타노일-CoA, 3-옥소-5-하이드록시펜타노일-CoA 등의 3-옥소아실-CoA 산물들은 3-옥소아실-CoA 신타제 (단계 2A, 3A, 4A, 7AS)에 의해 아실-CoA 및 말로닐-CoA 기질로부터 합성될 수 있다. 이 클래스의 효소들은 필연적으로 비가역적인 반응을 촉매하므로, 이는 대사산물, 연료 또는 아세토아세틸-CoA와 같은 3-옥소아실-CoA 중간 산물로부터 유래된 화학제를 과다 생산하기 위한 대사 조작 용도에 특히 유용하다. 예를 들어, 아세토아세틸-CoA 신타제는 부탄올 (Lan et al, PNAS USA (2012))과 폴리-(3-하이드록시부티레이트) (Matsumoto et al, Biosci Biotech Biochem, 75:364-366 (2011)를 생합성하는 유기체에서 이종적으로 발현시킨 바 있다. 아세토아세틸-CoA 신타제 (EC 2.3.1.194) 효소 (FhsA)는 토양 박테리아인 스트렙토마이세스 sp. CL190에서 특정되었으며, 이는 메발로네이트 생합성에 참여한다 (Okamura et al, PNAS USA 107:11265-70 (2010)). 그외 아세토아세틸-CoA 신타제 유전자들도 fhsA에 대한 서열 상동성을 통해 동정할 수 있다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fhsA BAJ83474.1 325302227 스트렙토마이세스 sp CL190
AB183750.1:11991..12971 BAD86806.1 57753876 스트렙토마이세스 sp. KO-3988
epzT ADQ43379.1 312190954 스트렙토마이세스 시나모넨시스
ppzT CAX48662.1 238623523 스트렙토마이세스 아눌라투스
O3I_22085 ZP_09840373.1 378817444 노카르디아 브라실리엔시스
2.6.1.a 아미노트랜스퍼라제
아미노트랜스퍼라제는 아미노기를 알데하이드 또는 케톤으로 가역적으로 변환한다. 알데하이드를 1차 아민으로 변환하는 효소의 예로는, 라이신-6-아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.36), 5-아미노발레레이트 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.48), 감마-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 및 디아민 아미노트랜스퍼라제, 예를 들어, 푸트레신 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.82 및 2.6.1.29)를 포함한다. 이들 효소들은 도 1의 단계 C와 I를 촉매하는데 적합하다. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제와 유사 효소들은 아미노산을 이의 대응되는 2-케토산으로 변환한다. 아미노산 아미노트랜스퍼라제는 2-옥소아디페이트와 2-아미노아디페이트를 상호 변환시키는데 적합한 후보 효소이다 (단계 H, 도 1).
라이신-6-아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.36)는 라이신을 알파-아미노아디페이트 세미알데하이드로 변환하며, 효모와 박테리아에서 특정되었다. 칸디다 유틸리스 (Hammer et al., J Basic Microbiol 32:21-27 (1992)), 플라보박테리움 루테센스 (Fujii et al., J Biochem. 128:391-397 (2000)) 및 스트렙토마이세스 클라불리게누스 (Romero et al., J Ind.Microbiol Biotechnol 18:241-246 (1997))로부터 후보 효소들이 특정되었다. 스트렙토마이세스 클라불리게누스로부터 유래된 재조합 라이신-6-아미노트랜스퍼라제는 에스케리키아 콜라이에서 기능적으로 발현되었다 (Tobin et al., J Bacteriol. 173:6223-6229 (1991)). 플라보박테리움 루테센스의 효소는 아미노 어셉터로서 알파-케토글루타레이트에 특이적이다 (Soda et al., Biochemistry 7:4110-4119 (1968)). 관련 효소인 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.46 and EC 2.6.1.76)는 액시네토박터 바우마니이와 헤모필러스 인플루엔자에서 dat 유전자 산물에 의해 코딩된다 (Ikai et al., J Bacteriol. 179:5118-5125 (1997); Ikai et al., Biol Pharm.Bull. 21:170-173 (1998)). 액시네토박터 바우마니이의 DAT는, 이의 천연 기질인 2,4-디아미노부티레이트 외에도, 라이신, 4-아미노부티레이트 및 오르니틴의 말단 아민을 전달한다. 추가적인 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 후보 유전자로는 마리노코커스 할로필러스와 할로바실러스 다바넨시스의 ectB 유전자 산물 (Zhao et al., Curr Microbiol 53:183-188 (2006); Louis et al., Microbiology 143 ( Pt 4):1141-1149 (1997)) 및 슈도모나스 에우루지노사의 pvdH 유전자 산물 (Vandenende et al., J Bacteriol. 186:5596-5602 (2004))이 있다. 또한, 슈도모나스 플루오레센스의 베타-알라닌 아미노트랜스퍼라제는 기질로서 2,4-디아미노부티레이트를 수용하지만 (Hayaishi et al., J Biol Chem 236:781-790 (1961)); 이의 활성은 지금까지 유전자와 연관시키지 못하였다.
유전자 유전자은행 ID GI 번호 유기체
lat BAB13756.1 10336502 플라보박테리움 루테센스
lat AAA26777.1 153343 스트렙토마이세스 클라불리게누스
dat P56744.1 6685373 액시네토박터 바우마니이
dat P44951.1 1175339 헤모필러스 인플루엔자
ectB AAB57634.1 2098609 마리노코커스 할로필러스
ectB AAZ57191.1 71979940 할로바실러스 다바넨시스
pvdH AAG05801.1 9948457 슈도모나스 에우루지노사
또한, 알데하이드의 말단 아민으로의 변환은 감마-아미노부티레이트 (GABA) 트랜스아미나제 (EC 2.6.1.19) 또는 5-아미노발레레이트 트랜스아미나제에 의해 촉매될 수 있다. GABA 아미노트랜스퍼라제는 숙시닉 세미알데하이드와 글루타메이트를 4-아미노부티레이트와 알파-케토글루타레이트로 상호 변환하며, 광범위한 기질 범위를 가지는 것으로 알려져 있다 (Schulz et al., 56:1-6 (1990); Liu et al., 43:10896-10905 (2004)). 에스케리키아 콜라이에서 2개의 GABA 트랜스아미나제 효소들은 gabT (Bartsch et al., J Bacteriol. 172:7035-7042 (1990))와 puuE (Kurihara et al., J.Biol.Chem. 280:4602-4608 (2005))에 의해 코딩된다. 또한, 무스 무스쿨루스와 수스 스크로파에서는 GABA 트랜스아미나제가 6-아미노카프로산 등의 대안 기질의 아미노기 전달을 촉매한다 (Cooper, Methods Enzymol. 113:80-82 (1985)). 5-아미노발레레이트 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.48)는 라이신이 분해되는 동안 5-아미노발레레이트를 5-옥소발레레이트로 변환한다. 이 효소는 슈도모나스 푸티다 davT (Espinosa-Urgel et al, Appl Env Microbiol, 67:5219-24 (2001))와 슈도모나스 에우루지노사 PA0266 (Yamanishi et al, FEBS J. 274:2262-73 (2007))에 의해 코딩된다. 클로스트리듐 아미노발레리쿰로부터 5-아미노발레레이트 아미노트랜스퍼라제가 정제되고 특정화되었지만, 서열은 아직까지 공개되지 않았다 (Barker et al, J Biol Chem, 262:8994-9003 (1987)).
유전자 유전자은행 ID GI 번호 유기체
gabT NP_417148.1 16130576 에스케리키아 콜라이
puuE NP_415818.1 16129263 에스케리키아 콜라이
Abat NP_766549.2 37202121 무스 무스쿨루스
gabT YP_257332.1 70733692 슈도모나스 플루오레센스
Abat NP_999428.1 47523600 수스 스크로파
davT AAK97868.1 15428718 슈도모나스 푸티다
PA0266 NP_248957.1 15595463 슈도모나스 에우루지노사
푸트레신 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.82)와 기타 디아민 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.29)는 또한 알데하이드 화합물과 일차 아민 화합물 간의 상호 변환을 촉매한다. 에스케리키아 콜라이의 푸트레신 아미노트랜스퍼라제는 ygjG 유전자에 의해 코딩되며, 정제된 효소는 대안 기질인 카다베린, 스페르미딘 및 1,7-디아미노헵탄에 아미노기를 전달한다 (Samsonova et al., BMC.Microbiol 3:2 (2003)). 2-옥소글루타레이트 (예, 피루베이트, 2-옥소부타노에이트) 이외의 아미노 어셉터를 가진 이 효소의 활성이 보고되었다 (Samsonova et al., BMC.Microbiol 3:2 (2003); KIM, J Biol.Chem. 239:783-786 (1964)). 다른 푸트레신 아미노트랜스퍼라제 효소는 슈도모나스 에우루지노사의 spuC 유전자에 의해 코딩된다 (Lu et al., J Bacteriol. 184:3765-3773 (2002)).
유전자 유전자은행 ID GI 번호 유기체
ygjG NP_417544 145698310 에스케리키아 콜라이
spuC AAG03688 9946143 슈도모나스 에우루지노사
몇몇 아미노트랜스퍼라제는 아미노산 그룹의 아미노기를 이동시켜, 2-옥소산을 형성시킨다. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제는 옥살로아세테이트에서 글루타메이트로 옥소기를 천연적으로 전달하여, 알파-케토글루타레이트와 아스파르테이트를 형성하는 효소이다. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 활성은, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이의 aspC (Yagi et al., 100:81-84 (1979); Yagi et al., 113:83-89 (1985)), 사카로마이세스 세레비지애의 AAT2 (Yagi et al., 92:35-43 (1982)) 및 아라비돕시스 탈리아나의 ASP5 (Kwok et al., 55:595-604 (2004); de la et al., 46:414-425 (2006); Wilkie et al., Protein Expr.Purif. 12:381-389 (1998))로부터 유래된 유전자 산물에 의해 촉매된다. 라투스 노르베기쿠스로부터 유래된 효소는 2-아미노헥산디오익산과 2,4-디아미노부티르산과 같은 대안 기질에 아미노기를 전달하는 것으로 확인되었다 (Recasens et al., Biochemistry 19:4583-4589 (1980)). 또한, 다른 아미노-산 기질에 작용하는 아미노트랜스퍼라제도 이러한 변환을 촉매할 수 있을 수 있다. 발린 아미노트랜스퍼라제는 발린과 피루베이트를 2-케토이소발레레이트와 알라닌으로 변환하는 과정을 촉매한다. 에스케리키아 콜라이 유전자인 avtA는 이러한 효소를 코딩한다 (Whalen et al., J.Bacteriol. 150:739-746 (1982)). 또한, 이 유전자 산물은 알파-케토부티레이트의 아미노기 전달을 촉매하여 알파-아미노부티레이트를 형성하지만, 이 반응에서 아민 공여체는 규명되지 않았다 (Whalen et al., J.Bacteriol. 158:571-574 (1984)). 에스케리키아 콜라이 serC의 유전자 산물은 2가지 반응, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 및 포스포하이드록시트레오닌 아미노트랜스퍼라제를 촉매하며 (Lam et al., J.Bacteriol. 172:6518-6528 (1990)), 비-인산화된 기질에 대한 활성은 검출할 수 없었다 (Drewke et al., FEBS.Lett. 390:179-182 (1996)). 다른 효소 후보는, 일부 유기체에서 라이신 생합성과 분해에 참여하는 효소인 알파-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.39)이다. 이 효소는 아미노 어셉터로서 알파-케토글루타레이트를 이용하여 2-아미노아디페이트와 2-옥소아디페이트를 상호 변환한다. 유전자 후보는 호모 사피엔스 (Okuno et al., Enzyme protein 47:136-148 (1993))와 서무스 서모필러스 (Miyazaki et al., Microbiology 150:2327-2334 (2004))에서 발견된다. lysN에 의해 코딩되는 서무스 서모필러스의 효소는 옥살로아세테이트, 2-옥소이소카프로에이트, 2-옥소이소발레레이트 및 2-옥소-3-메틸발레레이트 등의 수종의 대안 기질에 대해 활성을 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
aspC NP_415448.1 16128895 에스케리키아 콜라이
AAT2 P23542.3 1703040 사카로마이세스 세레비지애
ASP5 P46248.2 20532373 아라비돕시스 탈리아나
got2 P00507 112987 라투스 노르베기쿠스
avtA YP_026231.1 49176374 에스케리키아 콜라이
lysN BAC76939.1 31096548 서무스 서모필러스
AadAT-II Q8N5Z0.2 46395904 호모 사피엔스
2.7.2.a 포스포트랜스퍼라제 (키나제)
EC 클래스 2.7.2의 키나제 또는 포스포트랜스퍼라제 효소들은 ATP 하나를 동시에 가수분해하면서 카르복실산을 포스폰산에 이동시킨다. 2,4-펜타디에노에이트 키나제 활성을 가진 효소는 도 6의 단계 H에서 요구된다. 후보 효소의 예로는 부티레이트 키나제 (EC 2.7.2.7), 이소부티레이트 키나제 (EC 2.7.2.14), 아스파르토키나제 (EC 2.7.2.4), 아세테이트 키나제 (EC 2.7.2.1) 및 글리세레이트 키나제를 포함한다. 부티레이트 키나제는 클로스트리디아 종들에서 산생성 동안에 부티릴-포스페이트의 부티레이트로의 가역적인 변환을 촉매한다 (Cary et al., Appl Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990)). 클로스트리듐 아세토부틸리컴의 효소는 2개의 buk 유전자 산물들 중 어느 하나에 의해 코딩된다 (Huang et al., J Mol.Microbiol Biotechnol 2:33-38 (2000)). 다른 부티레이트 키나제 효소들은 클로스트리듐 부틸리컴과 클로스트리듐 테타노모르품에서 발견된다 (Twarog et al., J Bacteriol. 86:112-117 (1963)). 서모토가 마리티마로부터 유래된, 관련 효소인, 이소부티레이트 키나제는 에스케리키아 콜라이에서 발현되었으며, 결정 구조가 규명되었다 (Diao et al., J Bacteriol. 191:2521-2529 (2009); Diao et al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 59:1100-1102 (2003)). 아스파르토키나제는 아스파르테이트의 ATP-의존적인 인산화를 촉매하며, 수 종의 아미노산들의 합성에 참여한다. 에스케리키아 콜라이에서 lysC에 코딩된 아스파르토키나제 III 효소는 광범위한 기질 범위를 가지며, 기질 특이성에 참여하는 촉매 잔기들이 해명되었다 (Keng et al., Arch Biochem Biophys 335:73-81 (1996)). 또한, 에스케리키아 콜라이에서의 2종의 추가적인 키나제는 아세테이트 키나제와 감마-글루타밀 키나제이다. ackA에 코딩된 에스케리키아 콜라이의 아세테이트 키나제 (Skarstedt et al., J.Biol.Chem. 251:6775-6783 (1976))는 아세테이트 외에도 프로피오네이트를 인산화한다 (Hesslinger et al., Mol.Microbiol 27:477-492 (1998)). proB에 코딩된 에스케리키아 콜라이의 감마-글루타밀 키나제 (Smith et al., J.Bacteriol. 157:545-551 (1984))는 글루타메이트의 감마 탄산기를 인산화한다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
buk1 NP_349675 15896326 클로스트리듐 아세토부틸리컴
buk2 Q97II1 20137415 클로스트리듐 아세토부틸리컴
buk2 Q9X278.1 6685256 서모토가 마리티마
lysC NP_418448.1 16131850 에스케리키아 콜라이
ackA NP_416799.1 16130231 에스케리키아 콜라이
proB NP_414777.1 16128228 에스케리키아 콜라이
글리세레이트 키나제 (EC 2.7.1.31)는 글리세레이트를 글리세레이트-2-포스페이트 또는 글리세레이트-3-포스페이트로 활성화한다. 3가지 클래스의 글리세레이트 키나제들이 동정되었다. 클래스 I과 II의 효소들은 글리세레이트-2-포스페이트를 생성하는데 반해, 클래스 III의 효소는 식물과 효모에서 발견되며 글리세레이트-3-포스페이트를 생성한다 (Bartsch et al., FEBS Lett. 582:3025-3028 (2008)). 최근 연구에서, 사카로마이세스 세레비지애, 오리자 사티바 및 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된 클래스 III의 글리세레이트 키나제 효소들이 에스케리키아 콜라이에서 이종적으로 발현되었으며, 특정화되었다 (Bartsch et al., FEBS Lett. 582:3025-3028 (2008)). 또한, 본 연구에서는 에스케리키아 콜라이의 glxK 유전자 산물에 대해 글리세레이트-3-포스페이트 생성 능력을 분석하였으며, 이 효소가 이전 연구에서는 대조적으로 글리세레이트-2-포스페이트의 형성을 유일하게 촉매할 수 있다는 것을 확인하였다 (Doughty et al., J Biol.Chem. 241:568-572 (1966)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
glxK AAC73616.1 1786724 에스케리키아 콜라이
YGR205W AAS56599.1 45270436 사카로마이세스 세레비지애
Os01g0682500 BAF05800.1 113533417 오리자 사티바
At1g80380 BAH57057.1 227204411 아라비돕시스 탈리아나
2.8.3.a CoA 트랜스퍼라제
2.8.3 패밀리의 효소들은 CoA 모이어티를 한 분자에서 다른 분자로 가역적으로 전달하는 과정을 촉매한다. 이러한 변환은 도 1의 단계 L, P 및 O, 도 3의 단계 F, 도 4의 단계 B, 도 5의 단계 J 및 도 6의 단계 F에서 요구된다. 수종의 CoA 트랜스퍼라제 효소들이 공개된 문헌들에 기술되어 있으며, 이들 단계들에 적합한 후보 효소들이 제시되어 있다. 이는 하기에 기술된다.
다수의 트랜스퍼라제들은 특이성이 넓어, 특히 아세테이트, 숙시네이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 2-메틸아세토아세테이트, 3-케토헥사노에이트, 3-케토펜타노에이트, 발레레이트, 크로토네이트, 3-머캅토프로피오네이트, 프로피오네이트, 비닐아세테이트, 부티레이트와 같이 다양한 CoA 어셉터를 이용할 수 있다. 예를 들어, 로세부리아 sp. A2-183로부터 유래된 효소는 부티릴-CoA:아세테이트:CoA 트랜스퍼라제 및 프로피오닐-CoA:아세테이트:CoA 트랜스퍼라제 활성을 가지는 것으로 입증되었다 (Charrier et al., Microbiology 152, 179-185 (2006)). 예를 들어, 로세부리아 인테스티날리스 L1-82, 로세부리아 이눌리니보란스 DSM 16841, 유박테리움 렉탈 ATCC 33656에서 밀접한 상동체를 발견할 수 있다. 클로스트리듐 프로피오니컴에서 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라제 활성을 가진 다른 효소를 발견할 수 있다 (Selmer et al., Eur J Biochem 269, 372-380 (2002)). 이 효소는 CoA 어셉터로서 아세테이트, (R)-락테이트, (S)-락테이트, 아크릴레이트 및 부티레이트를 이용할 수 있다 (Selmer et al., Eur J Biochem 269, 372-380 (2002); Schweiger and Buckel, FEBS Letters, 171(1) 79-84 (1984)). 예컨대, 클로스트리듐 노비이 NT, 클로스트리듐 베이예린키 NCIMB 8052, 및 클로스트리듐 보툴리눔 C str. Eklund에서 밀접한 상동체들을 발견할 수 있다. YgfH는 에스케리키아 콜라이에서 프로피오닐 CoA:숙시네이트 CoA 트랜스퍼라제를 코딩한다 (Haller et al., Biochemistry, 39(16) 4622-4629). 예컨대, 시트로박터 융게이 ATCC 29220, 살모넬라 엔테리카 아종 아리조나 세로바 및 예르시니아 인터메디아 ATCC 29909에서 밀접한 상동체들을 발견할 수 있다. 이들 단백질들은 아래에서 확인된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
Ach1 AAX19660.1 60396828 로세부리아 sp. A2-183
ROSINTL182_07121 ZP_04743841.2 257413684 로세부리아 인테스티날리스 L1-82
ROSEINA2194_03642 ZP_03755203.1 225377982 로세부리아 이눌리니보란스
EUBREC_3075 YP_002938937.1 238925420 유박테리움 렉탈ATCC 33656
Pct CAB77207.1 7242549 클로스트리듐 프로피오니컴
NT01CX_2372 YP_878445.1 118444712 클로스트리듐 노비이 NT
Cbei_4543 YP_001311608.1 150019354 클로스트리듐 베이예린키
CBC_A0889 ZP_02621218.1 168186583 클로스트리듐 보툴리눔 C str. Eklund
ygfH NP_417395.1 16130821 에스케리키아 콜라이
CIT292_04485 ZP_03838384.1 227334728 시트로박터 융게이 ATCC 29220
SARI_04582 YP_001573497.1 161506385 살모넬라 엔테리카 아종 아리조나 세로바
yinte0001_14430 ZP_04635364.1 238791727 예르시니아 인터메디아 ATCC 29909
추가적인 후보 효소는 3-옥소아디필-CoA/숙시네이트 트랜스퍼라제 활성을 가진 것으로 입증된, 슈도모나스의 pcaI 및 pcaJ에 코딩된 2-유닛 효소이다 (Kaschabek et al., supra). 상동성을 토대로 유사한 효소들은 액시네토박터 sp. ADP1 (Kowalchuk et al., Gene 146:23-30 (1994))과 스트렙토마이세스 코엘리콜러에 존재한다. 헬리코박터 필로리 (Corthesy-Theulaz et al., J.Biol.Chem. 272:25659-25667 (1997))와 바실러스 섭틸리스 (Stols et al., Protein.Expr.Purif. 53:396-403 (2007))에 다른 숙시닐-CoA:3:옥소산-CoA 트랜스퍼라제의 예가 존재한다. 이들 단백질을 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
pcaI AAN69545.1 24985644 슈도모나스 푸티다
pcaJ NP_746082.1 26990657 슈도모나스 푸티다
pcaI YP_046368.1 50084858 액시네토박터 sp. ADP1
pcaJ AAC37147.1 141776 액시네토박터 sp. ADP1
pcaI NP_630776.1 21224997 스트렙토마이세스 코엘리콜러
pcaJ NP_630775.1 21224996 스트렙토마이세스 코엘리콜러
HPAG1_0676 YP_627417 108563101 헬리코박터 필로리
HPAG1_0677 YP_627418 108563102 헬리코박터 필로리
ScoA NP_391778 16080950 바실러스 섭틸리스
ScoB NP_391777 16080949 바실러스 섭틸리스
CoA 어셉터로서 아세테이트를 이용할 수 있는 CoA 트랜스퍼라제는 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제이며, 이는 에스케리키아 콜라이의 atoA (알파 서브유닛)와 atoD (베타 서브유닛) 유전자에 코딩되어 있다 (Vanderwinkel et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 33:902-908 (1968); Korolev et al., Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr. 58:2116-2121 (2002)). 또한, 이 효소는 이소부티레이트 (Matthies et al., Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992)), 발레레이트 (Vanderwinkel et al., supra) 및 부타노에이트 (Vanderwinkel et al., supra)를 비롯하여 다양한 분지형 및 선형 아실-CoA 기질로부터 아세테이트로 CoA 모이어티를 전달하는 것으로 입증되었다. 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 (Duncan et al., Appl Environ Microbiol 68:5186-5190 (2002)), 클로스트리듐 아세토부틸리컴 (Cary et al., Appl Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990)), 및 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴 (Kosaka et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007))에 유사한 효소들이 존재한다. 이들 단백질은 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
atoA P76459.1 2492994 에스케리키아 콜라이 K12
atoD P76458.1 2492990 에스케리키아 콜라이 K12
actA YP_226809.1 62391407 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032
cg0592 YP_224801.1 62389399 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032
ctfA NP_149326.1 15004866 클로스트리듐 아세토부틸리컴
ctfB NP_149327.1 15004867 클로스트리듐 아세토부틸리컴
ctfA AAP42564.1 31075384 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴
ctfB AAP42565.1 31075385 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴
추가적인 트랜스퍼라제 후보의 예들은 각각 숙시닐-CoA, 4-하이드록시부티릴-CoA, 및 부티릴-CoA 트랜스퍼라제 활성을 발휘하는 것으로 입증된, 클로스트리듐 클루이베리의 cat1, cat2 및 cat3 유전자 산물들에 의해 촉매된다 (Seedorf et al., supra; Sohling et al., Eur.J Biochem. 212:121-127 (1993); Sohling et al., J Bacteriol. 178:871-880 (1996)). 비슷한 CoA 트랜스퍼라제 활성들은 또한 트리코모나스 바기날리스 (van Grinsven et al., J.Biol.Chem. 283:1411-1418 (2008))와 트리파노소마 브루세이 (Riviere et al., J.Biol.Chem. 279:45337-45346 (2004))에도 존재한다. 이들 단백질은 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
cat1 P38946.1 729048 클로스트리듐 클루이베리
cat2 P38942.2 172046066 클로스트리듐 클루이베리
cat3 EDK35586.1 146349050 클로스트리듐 클루이베리
TVAG_395550 XP_001330176 123975034 트리코모나스 바기날리스 G3
Tb11.02.0290 XP_828352 71754875 트리파노소마 브루세이
혐기성 박테리아인 액시드아미노코커스 퍼멘탄스로부터 유래된 글루타코네이트-CoA-트랜스퍼라제 (EC 2.8.3.12) 효소는 2산 글루타코닐-CoA 및 3-부테노일-CoA와 반응한다 (Mack et al., FEBS Lett. 405:209-212 (1997)). 이 효소를 코딩하는 유전자가 gctA와 gctB이다. 이 효소는 글루타릴-CoA, 2-하이드록시글루타릴-CoA, 아디필-CoA 및 아크릴릴-CoA 등의 다른 CoA 유도체와 감소되었지만 검출가능한 수준의 활성을 가진다 (Buckel et al., Eur.J.Biochem. 118:315-321 (1981)). 이 효소는 클로닝되었으며, 에스케리키아 콜라이에서 발현되었다 (Mack et al., Eur.J.Biochem. 226:41-51 (1994)). 이들 단백질은 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
gctA CAA57199.1 559392 액시드아미노코커스 퍼멘탄스
gctB CAA57200.1 559393 액시드아미노코커스 퍼멘탄스
3.1.2.a CoA 하이드롤라제
3.1.2 패밀리의 효소들은 아실-CoA 분자를 이의 대응되는 산으로 가수분해한다. 이러한 변환은 도 1의 단계 O, 도 3의 단계 F, 도 4의 단계 B, 도 5의 단계 J 및 단계 6의 단계 F에 요구된다. 이러한 효소 수종이 문헌에 기술되어 있으며, 이들 단계에 적합한 후보 효소들이 제시되어 있다.
예를 들어, 라투스 노르베기쿠스의 뇌로부터 유래된 acot12에 코딩된 효소 (Robinson et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 71:959-965 (1976))는 부티릴-CoA, 헥사노일-CoA 및 말로닐-CoA와 반응할 수 있다. acot8에 코딩된 인간 디카르복실산티오에스테라제는 글루타릴-CoA, 아디필-CoA, 서베릴-CoA, 세바실-CoA 및 도데칸디오일-CoA에 대해 활성을 나타낸다 (Westin et al., J.Biol.Chem. 280:38125-38132 (2005)). 이 효소와 가장 근접한 에스케리키아 콜라이 상동체는 tesB로서, 이것 역시 다양한 CoA 티올에스테르 화합물들을 가수분해할 수 있다 (Naggert et al., J Biol Chem 266:11044-11050 (1991)). 유사 효소는 또한 랫의 간에서도 특정되었다 (Deana R., Biochem Int 26:767-773 (1992)). 에스케리키아 콜라이에서 하이드롤라제 활성을 가진 다른 효소로는 ybgC, paaI, 및 ybdB를 포함한다 (Kuznetsova, et al., FEMS Microbiol Rev, 2005, 29(2):263-279; Song et al., J Biol Chem, 2006, 281(16):11028-38). 이 서열은 보고되지 않았지만, 완두콩 잎의 미토콘드리아로부터 유래된 효소가 광범위한 기질 특이성을 가지며, 아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 부티릴-CoA, 팔미토일-CoA, 올레오일-CoA, 숙시닐-CoA 및 크로토닐-CoA에 대해 입증된 활성을 가진다 (Zeiher et al., Plant.Physiol. 94:20-27 (1990)). 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 아세틸-CoA 하이드롤라제, ACH1은 또 다른 하이드롤라제 후보 효소이다 (Buu et al., J.Biol.Chem. 278:17203-17209 (2003)).
단백질 유전자은행 등재번호 GI# 유기체
acot12 NP_570103.1 18543355 라투스 노르베기쿠스
tesB NP_414986 16128437 에스케리키아 콜라이
acot8 CAA15502 3191970 호모 사피엔스
acot8 NP_570112 51036669 라투스 노르베기쿠스
tesA NP_415027 16128478 에스케리키아 콜라이
ybgC NP_415264 16128711 에스케리키아 콜라이
paaI NP_415914 16129357 에스케리키아 콜라이
ybdB NP_415129 16128580 에스케리키아 콜라이
ACH1 NP_009538 6319456 사카로마이세스 세레비지애
추가적인 하이드롤라제 효소로는, 발린이 분해되는 동안 3-하이드록시이소부티릴-CoA의 3-하이드록시이소부티레이트로의 변환을 효율적으로 촉매하는 것으로 기술된, 3-하이드록시이소부티릴-CoA 하이드롤라제를 포함한다 (Shimomura et al., J Biol Chem. 269:14248-14253 (1994)). 이 효소를 코딩하는 유전자로는 라투스 노르베기쿠스 (Shimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240 (2000))와 호모 사피엔스 (Shimomura et al., supra)의 hibch가 있다. 서열 상동성을 통해 사카로마이세스 세레비지애의 hibch 및 바실러스 세레우스 BC_2292 등의 비슷한 후보 유전자들을 동정할 수 있다.
단백질 유전자은행 등재번호 GI# 유기체
hibch Q5XIE6.2 146324906 라투스 노르베기쿠스
hibch Q6NVY1.2 146324905 호모 사피엔스
hibch P28817.2 2506374 사카로마이세스 세레비지애
BC_2292 AP09256 29895975 바실러스 세레우스
또 다른 하이드롤라제 후보 효소는 액시드아미노코커스 퍼멘탄스의 글루타코네이트 CoA-트랜스퍼라제이다. 이 효소는 글루타릴-CoA, 아세틸-CoA 및 3-부테노일-CoA에 대해 활성을 가진 아실-CoA 하이드롤라제로 부위-특이적인 돌연변이 유발을 도입함으로써 변형되었다 (Mack et al., FEBS.Lett. 405:209-212 (1997)). 이는, 숙시닐-CoA:3-케토산-CoA 트랜스퍼라제와 아세토아세틸-CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제를 코딩하는 효소들이 이러한 반응 단계의 후보 효소로서 사용할 수 있지만, 이의 기능을 바꾸기 위해 특정 돌연변이가 필요할 것임을 시사한다. gctA 유전자와 gctB 유전자에 대한 유전자은행 등재 번호들을 위에 열거한다.
4.1.1.a 데카르복실라제
EC 클래스 4.1.1의 데카르복실라제 효소는 도 1의 단계 A, D, T 및 U, 도 2의 단계 D, 도 4의 단계 C, 도 5의 단계 C 및 F, 및 도 6의 단계 G를 촉매하는데 필요하다.
2,4-펜타디에노에이트의 부타디엔로의 탈카르복시화 반응 (도 1의 단계 T, 및 도 6의 단계 G)과 5-하이드록시펜트-2-에노에이트의 3-부텐-1-올로의 탈카르복시화 반응 (도 1의 단계 U)은 에노익산 데카르복실라제 효소들에 의해 촉매된다. 효소의 예는 소르브산 데카르복실라제, 아코니테이트 데카르복실라제, 4-옥살로크로토네이트 데카르복실라제 및 신나메이트 데카르복실라제를 포함한다. 소르브산 데카르복실라제는 소르브산을 1,3-펜타디엔으로 변환한다. 아스퍼질러스 나이거에서의 소르브산 탈카르복시화에는 유전자 3종이 요구된다: padA1, ohbA1 및 sdrA (Plumridge et al. Fung. Genet. Bio, 47:683-692 (2010). PadA1은 페닐아크릴산 데카르복실라제로, ohbA1은 추정의 4-하이드록시벤조산 데카르복실라제로, sdrA는소르브산 데카르복실라제 조절자로 주석이 첨부된다. 또한, 수종의 진균 및 효모 종들을 비롯하여 다른 종들에서도 소르브산을 탈카르복시화하는 것으로 입증되었다 (Kinderlerler and Hatton, Food Addit Contam., 7(5):657-69 (1990); Casas et al., Int J Food Micro., 94(1):93-96 (2004); Pinches and Apps, Int. J. Food Microbiol. 116: 182-185 (2007)). 예컨대, 아스퍼질러스 오리제와 네오사르토르야 피세리는 소르브산을 탈카르복시화하는 것으로 확인되었으며, padA1, ohbA1 및 sdrA와 가까운 상동체를 가진다.
유전자명 GenBankID GI 번호 유기체
padA1 XP_001390532.1 145235767 아스퍼질러스 나이거
ohbA1 XP_001390534.1 145235771 아스퍼질러스 나이거
sdrA XP_001390533.1 145235769 아스퍼질러스 나이거
padA1 XP_001818651.1 169768362 아스퍼질러스 오리제
ohbA1 XP_001818650.1 169768360 아스퍼질러스 오리제
sdrA XP_001818649.1 169768358 아스퍼질러스 오리제
padA1 XP_001261423.1 119482790 네오사르토르야 피세리
ohbA1 XP_001261424.1 119482792 네오사르토르야 피세리
sdrA XP_001261422.1 119482788 네오사르토르야 피세리
아코니테이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.6)는 칸디다 균주와 또한 필라멘트형 진균인 아스퍼질러스 테레우스에서 이타코네이트 합성의 최종 단계를 촉매한다 (Bonnarme et al. J Bacteriol. 177:3573-3578 (1995); Willke and Vorlop, Appl Microbiol. Biotechnol 56:289-295 (2001)). cis-아코니테이트 데카르복실라제 (CAD) (EC 4.1.16)가 정제되었으며, 아스퍼질러스 테레우스로부터 특정화되었다 (Dwiarti et al., J. Biosci. Bioeng. 94(1): 29-33 (2002)). 최근, 유전자가 클로닝되었고, 기능적으로 특정화되었다 (Kanamasa et al., Appl.Microbiol Biotechnol 80:223-229 (2008)) 및 (WO/2009/014437). CAD에 대한 밀접한 상동체 수종을 아래에 나열한다 (EP 2017344A1; WO 2009/014437 A1). CAD의 유전자 및 단백질 서열들은 종래에 보고되었으며 (EP 2017344 A1; WO 2009/014437 A1), 하기 표에 수종의 밀접한 상동체들을 열거한다.
유전자명 GenBankID GI 번호 유기체
CAD XP_001209273 115385453 아스퍼질러스 테레우스
XP_001217495 115402837 아스퍼질러스 테레우스
XP_001209946 115386810 아스퍼질러스 테레우스
BAE66063 83775944 아스퍼질러스 오리제
XP_001393934 145242722 아스퍼질러스 나이거
XP_391316 46139251 지베렐라 지에
XP_001389415 145230213 아스퍼질러스 나이거
XP_001383451 126133853 피키아 스티피티스
YP_891060 118473159 미코박테리움 스메그마티스
NP_961187 41408351 미코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스
YP_880968 118466464 미코박테리움 아비움
ZP_01648681 119882410 살리니스포라 아레니콜라
신나메이트 (페닐아크릴레이트)와 치환된 신나메이트 유도체의 대응되는 스티렌 유도체로의 변환을 촉매하는 데카르복실라제의 다른 클래스가 특정화되었다. 이들 효소들은 다양한 유기체들에서 공통적으로, 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고 발현된 이들 효소를 코딩하는 특이적인 유전자들로는 사카로마이세스 세레비지애 pad 1 (Clausen et al., Gene 142:107-112 (1994)), 락토바실러스 플란타룸 pdc (Barthelmebs et al., 67:1063-1069 (2001); Qi et al., Metab Eng 9:268-276 (2007); Rodriguez et al., J.Agric.Food Chem. 56:3068-3072 (2008)), 클렙시엘라 옥시토카 pofK (pad) (Uchiyama et al., Biosci.Biotechnol.Biochem. 72:116-123 (2008); Hashidoko et al., Biosci.Biotech.Biochem. 58:217-218 (1994)), 페디코커스 펜토사세우스 (Barthelmebs et al., 67:1063-1069 (2001)), 바실러스 섭틸리스 및 바실러스 푸밀루스의 padC (Shingler et al., 174:711-724 (1992))가 있다. 또한, 슈도모나스 플루오레센스 유래 페룰릭산 데카르복실라제도 정제 및 특정화되었다 (Huang et al., J.Bacteriol. 176:5912-5918 (1994)). 중요하게도, 이 클래스의 효소는 안정적인 것으로 입증되었으며, 외인성 또는 내부 결합형 조인자를 필요로 하지 않아, 이 효소는 생물변환에 이상적으로 적합하다 (Sariaslani, Annu.Rev.Microbiol. 61:51-69 (2007)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
pad1 AAB64980.1 1165293 사카로마이세스 세레비지애
pdc AAC45282.1 1762616 락토바실러스 플란타룸
pad BAF65031.1 149941608 클렙시엘라 옥시토카
padC NP_391320.1 16080493 바실러스 섭틸리스
pad YP_804027.1 116492292 페디코커스 펜토사세우스
pad CAC18719.1 11691810 바실러스 푸밀루스
4-옥살로크로네이트 데카르복실라제는 4-옥살로크로토네이트의 2-옥소펜타노에이트로의 탈카르복시화를 촉매한다. 이 효소는 다수의 유기체들에서 분리되었고, 특정화되었다. 데카르복실라제는 전형적으로 비닐피루베이트 하이드라타제와의 컴플렉스로 기능한다. 이 효소를 코딩하는 유전자로는 슈도모나스 sp. (strain 600)의 dmpH 및 dmpE (Shingler et al., 174:711-724 (1992)), 슈도모나스 푸티다의 xylII 및 xylIII (Kato et al., Arch.Microbiol 168:457-463 (1997); Stanley et al., Biochemistry 39:3514 (2000); Lian et al., J.Am.Chem.Soc. 116:10403-10411 (1994)) 및 랄스토니아 유트로파 JMP134의 Reut_B5691 및 Reut_B5692 (Hughes et al., J Bacteriol, 158:79-83 (1984))가 있다. 슈도모나스 sp. (strain 600) 으로부터 유래된 효소를 코딩하는 유전자가 클로닝되어, 에스케리키아 콜라이에서 발현되었다 (Shingler et al., J. Bacteriol. 174:711-724 (1992)). 슈도모나스 푸티다의 xylI에 코딩된 4-옥살로크로토네이트 데카르복실라제는 비닐피루베이트 하이드라타제와의 컴플렉스로 기능한다. 하이드라타제 활성이 결여되고 야행성 데카르복실라제 활성을 유지한 이 효소의 재조합 형태가 특정화되었다 (Stanley et al., Biochem. 39:718-26 (2000)). 유사 효소는 랄스토니아 픽케티이에서 확인된다 (종래 슈도모나스 픽케티이) (Kukor et al., J Bacteriol. 173:4587-94 (1991)).
유전자 유전자은행 GI 번호 유기체
dmpH CAA43228.1 45685 슈도모나스 sp. CF600
dmpE CAA43225.1 45682 슈도모나스 sp. CF600
xylII YP_709328.1 111116444 슈도모나스 푸티다
xylIII YP_709353.1 111116469 슈도모나스 푸티다
Reut_B5691 YP_299880.1 73539513 랄스토니아 유트로파 JMP134
Reut_B5692 YP_299881.1 73539514 랄스토니아 유트로파 JMP134
xylI P49155.1 1351446 슈도모나스 푸티다
tbuI YP_002983475.1 241665116 랄스토니아 픽케티이
nbaG BAC65309.1 28971626 슈도모나스 플루오레센스 KU-7
2-옥소아디페이트와 같은 2-케토-산의 탈카르복시화 (단계 D, 도 1)는 피루베이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.1), 벤조일포르메이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.7), 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 및 분지쇄 알파-케토산 데카르복실라제 등의 다양한 기질 특이성을 다양한 효소에 의해 촉매된다. 케토-산 데카르복실라제로도 지칭되는 피루베이트 데카르복실라제 (PDC)는 피루베이트의 아세트알데하이드로의 탈카르복시화를 촉매하는, 알코올 발효에 있어 주요 효소이다. 사카로마이세스 세레비지애 유래 효소는 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 3-하이드록시피루베이트 및 2-페닐피루베이트 (22)를 비롯한 지방족 2-케토 산 화합물들에 대해 넓은 기질 범위를 가진다. 이 효소는 광범위하게 연구되었으며, 활성 변이를 위해 조작되었고, 에스케리키아 콜라이에서 기능적으로 발현되었다 (Killenberg-Jabs et al., Eur.J.Biochem. 268:1698-1704 (2001); Li et al., Biochemistry. 38:10004-10012 (1999); ter Schure et al., Appl.Environ.Microbiol. 64:1303-1307 (1998)). 자이모모나스 모빌러스로부터 유래된 pdc에 코딩된 PDC 역시 넓은 기질 범위를 가지며, 다른 기질에 대한 친화성을 변형시키기 위한 특이적인 조작 연구의 대상이 되어 왔다 (Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)). 이 효소의 결정 구조는 이용가능하다 (Killenberg-Jabs et al., Eur.J.Biochem. 268:1698-1704 (2001)). 그외 잘-특정화된 PDC 후보 효소로는 아세토박터 파스테우리안스 (Chandra et al., 176:443-451 (2001))와 클루베로마이세스 락티스 (Krieger et al., 269:3256-3263 (2002))로부터 유래된 효소가 있다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
pdc P06672.1 118391 자이모모나스 모빌리스
pdc1 P06169 30923172 사카로마이세스 세레비지애
pdc Q8L388 20385191 아세토박터 파스테우리안스
pdc1 Q12629 52788279 클루베로마이세스 락티스
PDC 처럼, 벤조일포르메이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.7)도 넓은 기질 범위를 가지고 있으며, 효소 조작 연구의 타겟이 되고 있다. 슈도모나스 푸티다 유래 효소가 광범위하게 연구되었고, 이 효소의 결정 구조를 이용할 수 있다 (Polovnikova et al., 42:1820-1830 (2003); Hasson et al., 37:9918-9930 (1998)). 슈도모나스 푸티다 유래 효소의 활성 부위에 위치한 잔기 2개에 부위 특이적인 돌연변이를 유발한 바, 천연 및 비-천연 기질에 대한 친화성 (Km)이 변형되었다 (Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)). 이 효소의 특징들은 특이적인 조작에 의해 더욱 변형되었다 (Lingen et al., Chembiochem. 4:721-726 (2003); Lingen et al., Protein Eng 15:585-593 (2002)). mdlC에 코딩된 슈도모나스 에우루지노사 유래의 효소 역시 실험적으로 특정화되었다 (Barrowman et al., 34:57-60 (1986)). 슈도모나스 스투체리, 슈도모나스 플루오레센스 및 기타 유기체들로부터 유래된 다른 유전자 후보들은 슈도모나스 푸티타에서 개발된 증식 선별 시스템을 이용하여 동정하거나 또는 서열 상동성으로 추론할 수 있다 (Henning et al., Appl.Environ.Microbiol. 72:7510-7517 (2006)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
mdlC P20906.2 3915757 슈도모나스 푸티다
mdlC Q9HUR2.1 81539678 슈도모나스 에우루지노사
dpgB ABN80423.1 126202187 슈도모나스 스투체리
ilvB-1 YP_260581.1 70730840 슈도모나스 플루오레센스
2-옥소산을 탈카르복시화할 수 있는 3번째 효소는 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 (KGD)이다. 이 효소 클래스의 기질 범위는 지금까지 연구되지 않았다. 미코박테리움 투베르쿨로시스로부터 KDC (Tian et al., 102:10670-10675 (2005))가 클로닝되었으며, 기능적으로 발현되었다. KDC 효소의 활성은 브라디리조비움 자포니쿰 및 메소리조비움 로티 등의 수종의 리조비아에서 검출되었다 (Green et al., 182:2838-2844 (2000)). KDC-코딩 유전자(들)가 이들 유기체들에서 분리되진 않았지만, 게놈 서열들을 입수가능하며, 각 게놈에서 수개의 유전자들이 추정의 KDC로 주석이 달려있다. 또한, 유글레나 그라실리스 유래 KDC도 특정되었지만, 이 활성과 관련된 유전자는 아직까지 규명되지 않았다 (Shigeoka et al., Arch.Biochem.Biophys. 288:22-28 (1991)). N-말단에서 시작해서 처음 20개의 아미노산들은 MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV (서열번호)로 서열 분석되었다 (Shigeoka and Nakano, Arch.Biochem.Biophys. 288:22-28 (1991)). 이 유전자는 KDC 활성을 위한 N-말단 서열을 가진 후보 유전자를 테스트함으로써 동정할 수 있었다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
kgd O50463.4 160395583 미코박테리움 투베르쿨로시스
kgd NP_767092.1 27375563 브라디리조비움 자포니쿰 USDA110
kgd NP_105204.1 13473636 메소리조비움 로티
이러한 반응을 촉매하는 4번째 후보 효소는 분지쇄 알파-케토산 데카르복실라제 (BCKA)이다. 이 클래스의 효소는 탄소수 3-6 체인 길이의 다양한 화합물에 작용하는 것으로 입증되었다 (Oku et al., J Biol Chem. 263:18386-18396 (1988); Smit et al., Appl Environ Microbiol 71:303-311 (2005)). 이 효소는 락토코커스 락티스에서 2-옥소부타노에이트, 2-옥소헥사노에이트, 2-옥소펜타노에이트, 3-메틸-2-옥소부타노에이트, 4-메틸-2-옥소부타노에이트 및 이소카프로에이트 등의 다양한 분지형 및 선형 기질에 대해 특정화되었다 (Smit et al., Appl Environ Microbiol 71:303-311 (2005)). 이 효소는 구조적으로 파악되었다 (Berg et al., Science. 318:1782-1786 (2007)). 락토코커스 락티스 효소와 자이모모나스 모빌러스의 피루베이트 데카르복실라제 간의 서열 정렬은, 촉매 및 기질 인지 잔기들이 거의 동일한 것으로 나타나 (Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)), 이 효소는 특이적인 가공에 유망한 후보였다. BCKA에 의한 알파-케토글루타레이트의 탈카르복시화가 바실러스 섭틸리스에서 검출되었지만, 이 활성은 다른 분지쇄 기질에 대한 활성 보다 낮으며 (5%) (Oku and Kaneda, J Biol Chem. 263:18386-18396 (1988)), 이 효소를 코딩하는 유전자는 아직까지 규명되지 않았다. 추가적인 BCKA 유전자 후보는 락토코커스 락티스 단백질 서열에 대한 상동성을 통해 동정할 수 있다. 이 효소에 대한 BLASTp 히트 수가 높은 다수는 인돌피루베이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.74)로 주해가 첨부되어 있다. 인돌피루베이트 데카르복실라제 (IPDA)는 식물과 식물 박테리아에서 인돌피루베이트의 인돌아세트알데하이드로의 탈카르복시화를 촉매하는 효소이다. 호모 사피엔스와 보스 타우루스로부터 미토콘드리아 분지쇄 케토산 데하이드로게나제 컴플렉스의 E1 서브유닛들로부터 유래된 재조합 분지쇄 알파-케노산 데카르복실라제 효소가 클로닝되었고, 에스케리키아 콜라이에서 기능적으로 발현되었다 (Davie et al., J.Biol.Chem. 267:16601-16606 (1992); Wynn et al., J.Biol.Chem. 267:12400-12403 (1992); Wynn et al., J.Biol.Chem. 267:1881-1887 (1992)). 이들 연구들에서, 저자들은, 샤페로닌 GroEL과 GroES가 데카르복실라제의 비활성을 500배까지 강화한다는 것을 발견하였다 (Wynn et al., J.Biol.Chem. 267:12400-12403 (1992)). 이들 효소는 2개의 알파 및 2개의 베타 서브유닛들로 구성된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
kdcA AAS49166.1 44921617 락토코커스 락티스
BCKDHB NP_898871.1 34101272 호모 사피엔스
BCKDHA NP_000700.1 11386135 호모 사피엔스
BCKDHB P21839 115502434 보스 타우루스
BCKDHA P11178 129030 보스 타우루스
3-케토산의 탈카르복시화에 적합한 데카르복실라제 효소는 아세토아세테이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.4)이다. adc에 코딩된 클로스트리듐 아세토부틸리컴으로부터 유래된 이 효소는 기질 특이성이 넓으며, 2-케토사이클로헥산 카르복실레이트, 3-옥소펜타노에이트, 2-옥소-3-페닐프로피온산, 2-메틸-3-옥소부티레이트 및 벤조일-아세테이트 등의 수종의 다른 기질들을 탈카르복시화하는 것으로 입증되었다 (Rozzel et al., J.Am.Chem.Soc. 106:4937-4941 (1984); Benner and Rozzell, J.Am.Chem.Soc. 103:993-994 (1981); Autor et al., J Biol.Chem. 245:5214-5222 (1970)). 또한, 아세토아세테이트 데카르복실라제는 클로스트리듐 베이예린키에서도 특정화되었다 (Ravagnani et al., Mol.Microbiol 37:1172-1185 (2000)). 바실러스 폴리믹사로부터 유래되며 세포-비함유 추출물에서 특정화된 아세토아세테이트 데카르복실라제 역시 3-케토산 화합물들에 대해 넓은 기질 특이성을 가지며, 3-옥소펜타노에이트를 탈카르복시화할 수 있다 (Matiasek et al., Curr.Microbiol 42:276-281 (2001)). 이 효소를 코딩하는 유전자는 아직까지 규명되지 않았고, 바실러스 폴리믹사의 게놈 유전자는 아직 이용불가하다. 다른 adc가 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴에서 발견되었다 (Kosaka, et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)). 클로스트리듐 보툴리눔과 바실러스 아밀로리퀘팩시엔스 FZB42 등의 다른 유기체에서도 다른 유전자 후보들이 서열 상동성을 통해 동정될 수 있다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
adc NP_149328.1 15004868 클로스트리듐 아세토부틸리컴
adc AAP42566.1 31075386 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴
adc YP_001310906.1 150018652 클로스트리듐 베이예린키
CLL_A2135 YP_001886324.1 187933144 클로스트리듐 보툴리눔
RBAM_030030 YP_001422565.1 154687404 바실러스 아밀로리퀘팩시엔스
아스파르테이트 데카르복실라제, 라이신 데카르복실라제 및 오르니틴 데카르복실라제를 비롯하여 수많은 특정화된 효소들이 아미노산들과 유사 화합물들을 탈카르복시화한다. 아스파르테이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.11)는 아스파르테이트를 탈카르복시화하여 베타-알라닌을 만든다. 이 효소는 판토테네이트 생합성에 참여하며, 에스케리키아 콜라이에 유전자 panD에 코딩된다 (Dusch et al., Appl.Environ.Microbiol 65:1530-1539 (1999); Ramjee et al., Biochem.J 323 ( Pt 3):661-669 (1997); Merkel et al., FEMS Microbiol Lett. 143:247-252 (1996); Schmitzberger et al., EMBO J 22:6193-6204 (2003)). 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Chopra et al., Protein Expr.Purif. 25:533-540 (2002))와 코리네박테리움 글루타니쿰 (Dusch et al., Appl.Environ.Microbiol 65:1530-1539 (1999))으로부터 유래된 효소들이 에스케리키아 콜라이에서 발현 및 특정화되었다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
panD P0A790 67470411 에스케리키아 콜라이 K12
panD Q9X4N0 18203593 코리네박테리움 글루타니쿰
panD P65660.1 54041701 미코박테리움 투베르쿨로시스
라이신 데카르복실라제 (EC 4.1.1.18)는 라이신을 카다베린으로 탈카르복시화하는 과정을 촉매한다. 이 효소에 대한 2가지 이소자임들은 에스케리키아 콜라이의 게놈에 유전자 cadA 및 ldcC에 코딩되어 있다. CadA는 산 내성에 관여하며, cadC 유전자 산물에 의해 파지티브 조절을 거친다 (Lemonnier et al., Microbiology 144 ( Pt 3):751-760 (1998)). CadC는 대안 기질로서 하이드록시라이신과 S-아미노에틸시스테인을 수용하며, 2-아미노피멜레이트와 6-아미노카프로에이트가 이 효소에 대한 경쟁적인 저해제로서 작용한다 (Sabo et al., Biochemistry 13:662-670 (1974)). 구성적으로 발현된 ldc 유전자 산물은 CadA 보다 활성이 낮다 (Lemonnier and Lane, Microbiology 144 (Pt 3):751-760 (1998)). CadA와 유사한 라이신 데카르복실라제가 최근 비브리오 파라헤몰리티쿠스에서 동정되었다 (Tanaka et al., J Appl Microbiol 104:1283-1293 (2008)). ldc에 코딩된 셀레노모나스 루미난티움의 라이신 데카르복실라제는 진핵생물의 오르니틴 데카르복실라제와 서열 유사성을 가지며, 기질로서 L-라이신과 L-오르니틴 둘다를 수용한다 (Takatsuka et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 63:1843-1846 (1999)). 활성부의 잔기들이 동정되었고, 이 효소의 기질 특이성을 변형시키기 위해 조작되었다 (Takatsuka et al., J Bacteriol. 182:6732-6741 (2000)). 또한, 수종의 오르니틴 데카르복실라제 효소들 (EC 4.1.1.17) 역시 라이신과 다른 유사 화합물에 대해 활성을 나타낸다. 이러한 효소들은 니코티아나 글루티노사 (Lee et al., Biochem.J 360:657-665 (2001)), 락토바실러스 sp. 30a (Guirard et al., J Biol.Chem. 255:5960-5964 (1980)) 및 비브리오 불니피쿠스 (Lee et al., J Biol.Chem. 282:27115-27125 (2007))에서 확인된다. 락토바실러스 sp. 30a (Momany et al., J Mol.Biol. 252:643-655 (1995))와 V. 불니피쿠스로부터 유래된 효소들이 결정 구조가 파악되었다. V. 불니피쿠스의 효소는 라이신 데카르복실라제를 효과적으로 촉매하며, 기질 특이성에 참여하는 잔기들이 해명되었다 (Lee et al., J Biol.Chem. 282:27115-27125 (2007)). 유사한 효소는 트리코모나스 바기날리스에서 특정화되었지만, 이 효소를 코딩하는 유전자는 미확인되었다 (Yarlett et al., Biochem.J 293 (Pt 2):487-493 (1993)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
cadA AAA23536.1 145458 에스케리키아 콜라이
ldcC AAC73297.1 1786384 에스케리키아 콜라이
ldc O50657.1 13124043 셀레노모나스 루미난티움
cadA AB124819.1 44886078 비브리오 파라헤몰리티쿠스
AF323910.1:1..1299 AAG45222.1 12007488 니코티아나 글루티노사
odc1 P43099.2 1169251 락토바실러스 sp. 30a
VV2_1235 NP_763142.1 27367615 비브리오 불니피쿠스
글루타릴-CoA 데하이드로게나제 (GCD, EC 1.3.99.7 및 EC 4.1.1.70)는 글루타릴-CoA의 크로토닐-CoA (도 3, 단계 3)로의 산화적 탈카르복시화를 촉매하는 2가지 기능을 가진 효소이다. 2가지 기능을 가진 GCD 효소들은 전자 어셉터로서 전자 전달체 플라보단백질을 이용하여 호모테트라머이다 (Hartel et al., Arch.Microbiol 159:174-181 (1993)). 이들 효소는 방향족 화합물에서 배양하는 동안에 슈도모나스 균주들 KB740 및 K172의 세포 추출물에서 처음으로 특정화되었지만 (Hartel et al., Arch.Microbiol 159:174-181 (1993)), 이들 유기체에서 관련 유전자들은 확인되지 않았다. 글루타릴-CoA 데하이드로게나제 (gcdH)를 코딩하는 유전자와 이의 동족 전사 조절자 (gcdR)가 아조아르쿠스 sp. CIB에서 동정되었다 (Blazquez et al., Environ.Microbiol 10:474-482 (2008)). gcdH 활성이 결핍된 아조아르쿠스 균주를 이용하여, 슈도모나스 푸티다로부터 이종의 gcdH 유전자가 동정되었다 (Blazquez et al., Environ.Microbiol 10:474-482 (2008)). 슈도모나스 푸티다에서 동족 전사 조절자는 동정되지 않았지만, locus PP_0157은 아조아르쿠스 효소와 높은 서열 상동성 (> 69% 동일성)을 가진다. 슈도모나스 플루오레센스와 파라코커스 데니트리피칸스에서 다른 GCD 효소들이 확인되었다 (Husain et al., J Bacteriol. 163:709-715 (1985)). 인간 GCD가 광범위하게 연구되었고, 에스케리키아 콜라이에서 과다 발현되었고 (Dwyer et al., Biochemistry 39:11488-11499 (2000)), 결정 구조가 파악되었으며, 이 활성부에 존재하는 보존된 글루타메이트 잔기가 참여하는 촉매 기전이 개시되었다 (Fu et al., Biochemistry 43:9674-9684 (2004)). GCD는 신트로푸스 액시디트로피쿠스에서 크로토네이트에서 생장하는 동안에 CO2를 동화하는 방향으로 작동한다 (Mouttaki et al., 73:930-938 (2007))). 신트로푸스 액시디트로피쿠스에서의 GCD 유전자 2종이 아조아르쿠스 GcdH: syn_00480 (31%) 및 syn_01146 (31%)에 대한 단백질 서열 상동성을 통해 동정되었다. 아조아르쿠스 GcdR 조절 단백질에 대해 유의한 상동성은 확인되지 않았다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
gcdH ABM69268.1 123187384 아조아르쿠스 sp. CIB
gcdR ABM69269.1 123187385 아조아르쿠스 sp. CIB
gcdH AAN65791.1 24981507 슈도모나스 푸티다 KT2440
PP_0157 (gcdR) AAN65790.1 24981506 슈도모나스 푸티다 KT2440
gcdH YP_257269.1 70733629 슈도모나스 플루오레센스 Pf-5
gcvA (gcdR) YP_257268.1 70733628 슈도모나스 플루오레센스 Pf-5
gcd YP_918172.1 119387117 파라코커스 데니트리피칸스
gcdR YP_918173.1 119387118 파라코커스 데니트리피칸스
gcd AAH02579.1 12803505 호모 사피엔스
syn_00480 ABC77899 85722956 신트로푸스 액시디트로피쿠스
syn_01146 ABC76260 85721317 신트로푸스 액시디트로피쿠스
다른 예로, 크로토닐-CoA의 글루타코닐-CoA로의 카르복시화와 이후의 글루타릴-CoA로의 환원은 별개의 효소들로 촉매될 수 있다: 글루타코닐-CoA 데카르복실라제 및 글루타코닐-CoA 리덕타제. 글루타메이트를 발효하는 혐기성 박테리아에서 특정화된 글루타코닐-CoA 데카르복실라제 효소는, 조인자로서 바이오틴을 이용하여 4개의 서브유닛들 (알파, 베타, 감마, 델타)로 구성된 소듐 이온을 전이시키는 데카르복실라제이다 (Boiangiu et al., J Mol.Microbiol Biotechnol 10:105-119 (2005); Buckel, Biochim.Biophys.Acta 1505:15-27 (2001)). 이들 효소는 푸조박테리움 뉴클레아툼 (Beatrix et al., Arch.Microbiol 154:362-369 (1990))과 액시드아미노코커스 퍼멘탄스 (Braune et al., Mol.Microbiol 31:473-487 (1999))에서 특정되었다. 푸조박테리움 뉴클레아툼 글루타코닐-CoA 데카르복실라제의 알파, 베타 및 델타 서브유닛에 대한 유사체들은 신트로푸스 액시디트로피쿠스에서 확인된다. 에노일-CoA 데하이드로게나제, syn_00480로 주석이 달린 유전자인 다른 GCD가 바이오틴-카르복실 캐리어 (syn_00479)와 글루타코닐-CoA 데카르복실라제 알파 서브유닛 (syn_00481) 사이의 예상되는 오페론에 위치한다. 예시적인 유전자 산물에 대한 단백질 서열들은 하기 나타낸 유전자은행 등재 번호를 이용하여 발구리할 수 있다. 에노일-CoA 리덕타제 효소들은 상기에 기술되어 있다 (EC 1.3.1).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
gcdA CAA49210 49182 액시드아미노코커스 퍼멘탄스
gcdC AAC69172 3777506 액시드아미노코커스 퍼멘탄스
gcdD AAC69171 3777505 액시드아미노코커스 퍼멘탄스
gcdB AAC69173 3777507 액시드아미노코커스 퍼멘탄스
FN0200 AAL94406 19713641 푸조박테리움 뉴클레아툼
FN0201 AAL94407 19713642 푸조박테리움 뉴클레아툼
FN0204 AAL94410 19713645 푸조박테리움 뉴클레아툼
syn_00479 YP_462066 85859864 신트로푸스 액시디트로피쿠스
syn_00481 YP_462068 85859866 신트로푸스 액시디트로피쿠스
syn_01431 YP_460282 85858080 신트로푸스 액시디트로피쿠스
syn_00480 ABC77899 85722956 신트로푸스 액시디트로피쿠스
4.1.1.b 데카르복실라제, 알켄 형성
올레핀을 형성하는 데카르복실라제 효소는 5-하이드록시발레레이트의 3-부텐-1-올로의 변환을 촉매한다 (단계 W, 도 1). 말단의 올레핀을 형성하는 지방산 데카르복실라제는 제오트갈코쿠스 sp. ATCC8456의 oleT 유전자 산물에 의해 코딩된다 (Rude et al, AEM 77(5):1718-27 (2011)). 최근 확인된 이 효소는 시토크롬 P450 효소 패밀리에 속하는 것으로서, 지방산 하이드록시화를 촉매하는 P450과 유사하다. OleT와 상동체들은 아래 표에 열거된다. 다른 지방산 데카르복실라제 효소들은 US 2011/0196180에서 확인된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
oleT ADW41779.1 320526718 제오트갈코쿠스 sp. ATCC8456
MCCL_0804 BAH17511.1 222120176 마크로코커스 카세올리티쿠스
SPSE_1582 ADX76840.1 323464687 스타필로코커스 슈드인터메디우스
faaH ADC49546.1 288545663 바실러스 슈도퍼무스
cypC2 EGQ19322.1 339614630 스포로사르시나 뉴이오르켄시스
cypC BAK15372.1 32743900 솔리바실러스 실베스트리스
Bcoam_010100017440 ZP_03227611.1 205374818 바실러스 코아후일렌시스
4.1.99.a 데카르보닐라제
펜타-2,4-디에날의 부타디엔으로의 변환은 데카르보닐라제에 의해 촉매된다 (단계 B, 도 6). 데카르보닐라제 효소는 식물, 포유류 및 박테리아에서 알칸 생합성 최종 단계를 촉매한다 (Dennis et al., Arch. Biochem. Biophys. 287:268-275 (1991)). 비-산화적 데카르보닐라제는 CO를 동시에 발생시키면서 알칸으로 알데하이드를 전달한다. 데카르보닐라제 효소의 예로는 옥타데카날 데카르보닐라제 (EC 4.1.99.5), 스테롤 데세투라제 및 지방 알데하이드 데카르보닐라제를 포함한다. 데카르보닐라제를 함유한 코발트-포르핀이 정제되었으며, 조류 보트리요코커스 브라우니이 (Botryococcus braunii)에서 특정화되었지만, 지금까지 이 활성과 연관된 유전자는 없다 (Dennis et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 89:5306-5310 (1992)). 피슘 사티붐 (Pisum sativum) 유래 구리-함유 데카르보닐라제도 정제되었으며, 특정화되었다 (Schneider-Belhaddad et al., Arch.Biochem.Biophys. 377:341-349 (2000)). 아라비돕시스 탈리아나의 CER1 유전자는 에피쿠티쿨러 왁스 형성에 참여하는 지방산 데카르보닐라제를 코딩한다 (US 6,437,218). 추가적인 지방산 데카르보닐라제는 메디카고 트룬카툴라, 비티스 비니페라 및 오리자 사티바에서 확인된다 (US 특허 출원 2009/0061493).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
CER1 NP_850932 145361948 아라비돕시스 탈리아나
MtrDRAFT_AC153128g2v2 ABN07985 124359969 메디카고 트룬카툴라
VITISV_029045 CAN60676 147781102 비티스 비니페라
OSJNBa0004N05.14 CAE03390.2 38345317 오리자 사티바
다른 예로, 산화적 데카르보닐라제는 알데하이드를 알칸으로 변환시킬 수 있다. 산화적 데카르보닐라제는 조인자로서 NADPH와 O2를 이용하며, CO2, 물 및 NADP+를 방출하는 시토크롬 P450 효소이다. 이러한 활성은 무스카 도메스티카와 드로소필라 멜라노가스테르의 CYP4G2v1 및 CYP4G1 유전자 산물들에서 확인되었다 (US 특허 출원 2010/0136595). 산화적 데카르보닐라제 활성을 가진 추가적인 후보 효소들을 다른 유기체들, 예컨대 마메스트라 브라시카에 (Mamestra brassicae), 헬리코버파 지아 및 아시르토시폰 피숨에서 서열 상동성을 통해 동정할 수 있다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
CYP4G2v1 ABV48808.1 157382740 무스카 도메스티카
CYP4G1 NP_525031.1 17933498 드로소필라 멜라노가스테르
CYP4G25 BAD81026.1 56710314 안테리어 야마마이
CYP4M6 AAM54722.1 21552585 헬리코버파 지아
LOC100164072 XP_001944205.1 193650239 아시르토시폰 피숨
4.1.3.a 리아제
피루베이트 및 아세트알데하이드의 4-하이드록시-2-옥소발레레이트로의 축합 (단계 A, 도 5)은 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 알돌라제 (EC 4.1.3.39)에 의해 촉매된다. 이 효소는 페놀, 크레졸 및 카테콜 분해 경로들에 참여한다. mhpE에 코딩된 에스케리키아 콜라이의 효소는 어셉터로서 아세트알데하이드에 대한 특이성이 높지만, 공여체로서 대안 기질 2-케토부티레이트 또는 페닐피루베이트를 수용한다 (Pollard et al., Appl Environ Microbiol 64:4093-4094 (1998)). 비슷한 효소들은 슈도모나스 푸티다의 cmtG 및 todH 유전자에 의해 코딩된다 (Lau et al., Gene 146:7-13 (1994); Eaton, J Bacteriol. 178:1351-1362 (1996)). 슈도모나스 CF600에서, 이 효소는 dmpFG에 의해 코딩되는 2가지 기능을 가진 알돌라제-데하이드로게나제 헤테로다이머의 일부이다 (Manjasetty et al., Acta Crystallogr.D.Biol Crystallogr. 57:582-585 (2001)). 데하이드로게나제 기능은 아세트알데하이드와 아세틸-CoA를 상호 변환하여, 일부 세포에 유해한 아세트알데하이드의 세포내 농도를 감소시키는 이점을 제공한다. 유사 알돌라제-데하이드로게나제 컴플렉스는 버크홀데리아 제노보란스의 BphIJ에 의해 코딩된다 (Baker et al, Biochem 48:6551-8 (2009)).
유전자 유전자은행 ID GI 번호 유기체
mhpE AAC73455.1 1786548 에스케리키아 콜라이
cmtG AAB62295.1 1263190 슈도모나스 푸티다
todH AAA61944.1 485740 슈도모나스 푸티다
dmpG CAA43227.1 45684 슈도모나스 sp. CF600
dmpF CAA43226.1 45683 슈도모나스 sp. CF600
bphI ABE37049.1 91693852 버크홀데리아 제노보란스
bphJ ABE37050.1 91693853 버크홀데리아 제노보란스
4.2.1.a 하이드로-리아제
물을 제거하여 이중 결합을 형성하는 과정은 4.2.1 패밀리의 데하이드라타제 효소에 의해 촉매된다. 하이드라타제 효소는 때로는 가역적이며, 또한 탈수를 촉매한다. 데하이드라타제 효소는 때로는 가역적이며, 또한 수화도 촉매한다. 소정의 기질로부터 물을 제거하는 과정은 도 1의 단계 G, N 및 V, 도 2의 단계 C, 도 3의 단계 C 및 도 5의 단계 B와 E에 필요하다. 수종의 하이드라타제 효소와 데하이드라타제 효소들이 문헌에 개시되어 있으며, 이들 단계들에 적합한 후보를 제시한다.
예를 들어, 수많은 데하이드라타제 효소들이 전자-구인성 카르보닐, 카르복실레이트 또는 CoA-티올 에스테르기에 의한 알파-수소의 활성화와, 베타 위치에서 하이드록시기의 제거에 참여하는, 알파, 베타에서의 물 제거를 촉매한다 (Buckel et al, J Bacteriol, 117:1248-60 (1974); Martins et al, PNAS 101:15645-9 (2004)). 효소의 예로는 2-(하이드록시메틸)글루타레이트 데하이드라타제 (EC 4.2.1.-), 푸마라제 (EC 4.2.1.2), 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제 (EC 4.2.1.10), 사이클로헥사논 하이드라타제 (EC 4.2.1.-) 및 2-케토-4-펜테노에이트 데하이드라타제 (EC 4.2.1.80), 시트라말레이트 하이드로리아제 및 디메틸말리에이트 하이드라타제를 포함한다.
2-(하이드록시메틸)글루타레이트 데하이드라타제는 유박테리움 바케리 (종래에 클로스트리듐 바케리라 함)에서의 니코티네이트 동화 작용에 있어서의 이의 역할이 연구된, 2-(하이드록시메틸)글루타레이트를 2-메틸렌-글루타레이트로 탈수하는 [4Fe-4S]-함유 효소이다 (Alhapel et al., Proc Natl Acad Sci 103:12341-6 (2006)). 서열 상동성이 높은 유사한 효소들은 박테로이데스 카필로수스, 안에어로트룬쿠스 콜리호미니스 및 나트란에어로비우스 서모필러스에서 발견된다. 이들 효소는 [4Fe-4S]를 함유한 박테리아 세린 데하이드라타제 (예, 에스케리키아 콜라이의 tdcG, sdhB, 및 sdaA에 코딩된 효소)의 알파 및 베타 서브유닛들과 상동적이다. 유박테리움 바케리에서 유사한 기능을 가진 효소는, 디메틸말리에이트를 수화시켜 (2R,3S)-2,3-디메틸말레이트를 형성하는 아코니타제 패밀리에 속하는 가역적인 Fe2+-의존성 및 산소-민감성 효소인, 디메틸말리에이트 하이드라타제이다. 이 효소는 dmdAB에 의해 코딩된다 (Alhapel et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103:12341-6 (2006); Kollmann-Koch et al., Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem. 365:847-857 (1984)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
hmd ABC88407.1 86278275 유박테리움 바케리
BACCAP_02294 ZP_02036683.1 154498305 박테로이데스 카필로수스
ANACOL_02527 ZP_02443222.1 167771169 안에어로트룬쿠스 콜리호미니스
NtherDRAFT_2368 ZP_02852366.1 169192667 나트란에어로비우스 서모필러스
dmdA ABC88408 86278276 유박테리움 바케리
dmdB ABC88409 86278277 유박테리움 바케리
푸마레이트 하이드라타제 (EC 4.2.1.2) 효소는 천연적으로 푸마레이트의 말레이트로의 가역적인 수화를 촉매한다. 기질로서 3-옥소부탄올과 반응하는 푸마레이트 하이드라타제의 역량이 문헌에 기술되어 있지만, 이 효소에 대해 상당한 구조적인 정보의 입수가 가능하며, 다른 연구자들도 활성, 저해 및 위치화를 변형시키도록 효소를 성공적으로 조작하였다 (Weaver, 61:1395-1401 (2005)). 에스케리키아 콜라이는 푸마라제 3종, FumA, FumB 및 FumC를 가지며, 이는 증식 조건에 의해 조절된다. FumB는 산소 민감성이며, 혐기 조건에서만 활성을 나타낸다. FumA는 미세혐기 조건에서 활성을 나타내며, FumC는 호기 증식의 유일한 활성 효소이다 (Tseng et al., J Bacteriol, 183:461-467 (2001); Woods et al., 954:14-26 (1988); Guest et al., J Gen Microbiol 131:2971-2984 (1985)). 추가적인 후보 효소들은 캄필로박터 제주니 (Smith et al., Int.J Biochem.Cell Biol 31:961-975 (1999)), 서무스 서모필러스 (Mizobata et al., Arch.Biochem.Biophys. 355:49-55 (1998)) 및 라투스 노르베기쿠스 (Kobayashi et al., J. Biochem, 89:1923-1931 (1981))에서 확인된다. 서열 상동성이 높은 유사한 효소들로는 아라비돕시스 탈리아나 fum1과 코리네박테리움 글루타미컴 fumC를 포함한다. 펠로토마쿨룸 서모프로피오니컴으로부터 유래된 MmcBC 푸마라제는 2개의 서브유닛을 가진 다른 클래스의 푸마라제이다 (Shimoyama et al., FEMS Microbiol Lett, 270:207-213 (2007)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fumA NP_416129.1 16129570 에스케리키아 콜라이
fumB NP_418546.1 16131948 에스케리키아 콜라이
fumC NP_416128.1 16129569 에스케리키아 콜라이
fumC O69294 9789756 캄필로박터 제주니
fumC P84127 75427690 서무스 서모필러스
fumH P14408 120605 라투스 노르베기쿠스
fum1 P93033 39931311 아라비돕시스 탈리아나
fumC Q8NRN8 39931596 코리네박테리움 글루타미컴
MmcB YP_001211906 147677691 펠로토마쿨룸 서모프로피오니컴
MmcC YP_001211907 147677692 펠로토마쿨룸 서모프로피오니컴
4-하이드록시-2-옥소발레레이트의 2-옥소펜테노에이트로의 탈수는 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 하이드라타제 (EC 4.2.1.80)에 의해 촉매된다. 이 효소는 방향족 분해 경로에 참여하며, 전형적으로 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 알돌라제 활성을 가진 효소를 코딩하는 유전자와 함께 전사된다. 예시적인 유전자 산물들은 에스케리키아 콜라이의 mhpD (Ferrandez et al., J Bacteriol. 179:2573-2581 (1997); Pollard et al., Eur J Biochem. 251:98-106 (1998)), 슈도모나스 푸티다의 todG 및 cmtF (Lau et al., 유전자 146:7-13 (1994); Eaton, J Bacteriol. 178:1351-1362 (1996)), 코마모나스 sp. CNB-1의 cnbE (Ma et al., Appl Environ Microbiol 73:4477-4483 (2007)) 및 버크홀데리아 제노보란스의 mhpD (Wang et al., FEBS J 272:966-974 (2005))에 의해 코딩된다. 가장 근접한 효소인 2-옥소헵타-4-엔-1,7-디오에이트 하이드라타제는 4-하이드록시페닐아세트산 분해에 참여하며, 조인자로서 마그네슘을 이용하여 2-옥소-헵트-4-엔-1,7-디오에이트 (OHED)를 2-옥소-4-하이드록시-헵타-1,7-디오에이트로 변환한다 (Burks et al., J.Am.Chem.Soc. 120: (1998)). OHED 하이드라타제 후보 효소가 에스케리키아 콜라이 C (Roper et al., 유전자 156:47-51 (1995); Izumi et al., J Mol.Biol. 370:899-911 (2007))와 에스케리키아 콜라이 W (Prieto et al., J Bacteriol. 178:111-120 (1996))에서 동정 및 특정화되었다. 서열 비교를 통해, 매우 다양한 박테리아 식물 및 동물들에서 상동체들이 확인된다. 서열 유사성이 높은 효소들이 특히 클렙시엘라 뉴모니아 (동일성 91%, eval = 2e-138)와 살모넬라 엔테리카 (동일성 91%, eval = 4e-138)에 함유되어 있다.
단백질 유전자은행 등재번호 GI 번호 유기체
mhpD AAC73453.2 87081722 에스케리키아 콜라이
cmtF AAB62293.1 1263188 슈도모나스 푸티다
todG AAA61942.1 485738 슈도모나스 푸티다
cnbE YP_001967714.1 190572008 코마모나스 sp. CNB-1
mhpD Q13VU0 123358582 버크홀데리아 제노보란스
hpcG CAA57202.1 556840 에스케리키아 콜라이 C
hpaH CAA86044.1 757830 에스케리키아 콜라이 W
hpaH ABR80130.1 150958100 클렙시엘라 뉴모니애
Sari_01896 ABX21779.1 160865156 살모넬라 엔테리카
다른 후보 효소는 천연적으로 2-메틸말레이트를 메사코네이트로 탈수하는 효소인 시트라말레이트 하이드로리아제 (EC 4.2.1.34)이다. 이 효소는 메타노칼도코커스 야나스키이에서 피루베이트의 2-옥소부타노에이트로의 경로 측면에서 연구되었으며, 넓은 기질 범위를 가지는 것으로 확인되었다 (Drevland et al., J Bacteriol. 189:4391-4400 (2007)). 또한, 이 효소의 활성은 클로스트리듐 테타노모르품, 모르가넬라 모르가니이 (Morganella morganii), 시트로박터 아말로나티쿠스에서도 검출되었는데, 글루타메이트 분해에 참여하는 것으로 생각된다 (Kato et al., Arch.Microbiol 168:457-463 (1997)). 메타노칼도코커스 야나스키이의 단백질 서열은 이들 유기체의 유전자와 유의한 상동성을 가지지 않는다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
leuD Q58673.1 3122345 메타노칼도코커스 야나스키이
디메틸말리에이트 하이드라타제 (EC 4.2.1.85)는 디메틸말리에이트를 수화하여 (2R,3S)-2,3-디메틸말레이트를 형성하는 아코니타제 패밀리에 속하는 가역적이고 Fe2+-의존적이며 산소-민감성 효소이다. 이 효소는 유박테리움 바케리의 dmdAB에 코딩되어 있다 (Alhapel et al., supra; Kollmann-Koch et al., Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem. 365:847-857 (1984)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
dmdA ABC88408 86278276 유박테리움 바케리
dmdB ABC88409.1 86278277 유박테리움 바케리
올리에이트 하이드라타제는 WO2011076691에서 제시된 바와 같이 다른 적정 후보 효소이다. 예로는 하기 단백질들을 포함한다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
OhyA ACT54545.1 254031735 엘리자베스킹기아 메닌고셉티카
HMPREF0841_1446 ZP_07461147.1 306827879 스트렙토코커스 피오게네스 ATCC 10782
P700755_13397 ZP_01252267.1 91215295 피크로플렉수스 토르퀴스 ATCC 700755
RPB_2430 YP_486046.1 86749550 로도슈도모나스 팔루스트리스
에노일-CoA 하이드라타제 (EC 4.2.1.17)는 다양한 3-하이드록시아실-CoA 기질의 탈수를 촉매한다 (Roberts et al., Arch.Microbiol 117:99-108 (1978); Agnihotri et al., Bioorg. Med. Chem. 11:9-20 (2003); Conrad et al., J Bacteriol. 118:103-111 (1974)). ech에 코딩된 슈도모나스 푸티다의 에노일-CoA 하이드라타제는 3-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 변환을 촉매한다 (Roberts et al., Arch.Microbiol 117:99-108 (1978)). 이런 변환은 또한 클로스트리듐 아세토부틸리컴의 crt 유전자 산물, 클로스트리듐 클루이베리의 crt1 유전자 산물 및 기타 클로스트리디아 유기체에 의해 촉매된다 (Atsumi et al., Metab Eng 10:305-311 (2008); Boynton et al., J Bacteriol. 178:3015-3024 (1996); Hillmer et al., FEBS Lett. 21:351-354 (1972)). 추가적인 에노일-CoA 하이드라타제 후보는 슈도모나스 푸티다의 phaA와 phaB, 및 슈도모나스 플루오레센스의 paaA와 paaB이다 (Olivera et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 95:6419-6424 (1998)). 로도슈도모나스 팔루스트리스에서 pimF의 유전자 산물은 피멜로일-CoA 분해에 참여하는 에노일-CoA 하이드라타제를 코딩하는 것으로 생각된다 (Harrison et al., Microbiology 151:727-736 (2005)). 최근, 다수의 에스케리키아 콜라이 유전자들이 maoC (Park et al., J Bacteriol. 185:5391-5397 (2003)), paaF (Ismail et al., Eur.J Biochem. 270:3047-3054 (2003); Park et al., Appl.Biochem.Biotechnol 113-116:335-346 (2004); Park et al., Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)) 및 paaG (Ismail et al., Eur.J Biochem. 270:3047-3054 (2003); Park and Lee, Appl.Biochem.Biotechnol 113-116:335-346 (2004); Park and Yup, Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004))를 비롯하여 에노일-CoA 하이드라타제 기능성을 나타내는 것으로 입증되었다.
단백질 유전자은행 등재번호 GI 번호 유기체
ech NP_745498.1 26990073 슈도모나스 푸티다
crt NP_349318.1 15895969 클로스트리듐 아세토부틸리컴
crt1 YP_001393856 153953091 클로스트리듐 클루이베리
phaA ABF82233.1 26990002 슈도모나스 푸티다
phaB ABF82234.1 26990001 슈도모나스 푸티다
paaA NP_745427.1 106636093 슈도모나스 플루오레센스
paaB NP_745426.1 106636094 슈도모나스 플루오레센스
maoC NP_415905.1 16129348 에스케리키아 콜라이
paaF NP_415911.1 16129354 에스케리키아 콜라이
paaG NP_415912.1 16129355 에스케리키아 콜라이
다른 예로, 에스케리키아 콜라이에서 fadA과 fadB의 유전자 산물은, 지방산 산화에 참여하는 에노일-CoA 하이드라타제 활성을 나타내는 멀티효소 컴플렉스를 코딩한다 (Yang et al., Biochemistry 30:6788-6795 (1991); Yang, J Bacteriol. 173:7405-7406 (1991); Nakahigashi et al., Nucleic Acids Res. 18:4937 (1990)). fadR에 코딩된 네거티브 조절자의 낫 아웃을 이용하여 fadB 유전자 산물을 활성화할 수 있다 (Sato et al., J Biosci.Bioeng 103:38-44 (2007)). fadI과 fadJ 유전자들은 유사한 기능을 코딩하며, 천연적으로 혐기 조건에서 발현된다 (Campbell et al., Mol.Microbiol 47:793-805 (2003)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fadA YP_026272.1 49176430 에스케리키아 콜라이
fadB NP_418288.1 16131692 에스케리키아 콜라이
fadI NP_416844.1 16130275 에스케리키아 콜라이
fadJ NP_416843.1 16130274 에스케리키아 콜라이
fadR NP_415705.1 16129150 에스케리키아 콜라이
4.3.1.a 암모니아-리아제
도 1의 단계 J에서, 5-아미노펜-2-에노에이트의 2,4-펜타디에노에이트로의 탈아민화를 촉매하는데 EC 클래스 4.3.1의 암모니아 리아제가 필요하다. 예시적인 효소는 아스파르타제와 3-메틸아스파르타제이다. 아스파르테이트의 푸마레이트로의 탈아민화를 촉매하는 아스파르타제 (EC 4.3.1.1)가 충분히 특정화되었다 (Viola, Adv Enzym Relat Areas Mol Biol, 74:295-341 (2000)). 에스케리키아 콜라이의 효소는 아스파르테이트페닐메틸에스테르, 아스파라긴, 벤질-아스파르테이트 및 말레이트 등의 대안적인 다양한 기질에 대해 활성을 나타낸다 (Ma et al., Ann NY Acad Sci, 672:60-65 (1992)). 아울러, 기질 특이성을 변형시키기 위해 이 효소에 방향성 진화 (directed evolution)가 적용되었다 (Asano et al., Biomol Eng 22:95-101 (2005)). aspA에 코딩된 에스케리키아 콜라이의 아스파르타제의 결정 구조가 해명되었다 (Shi et al., Biochem, 36:9136-9144 (1997)). 또한, 아스파르타제 기능성을 가진 효소가 헤모필러스 인플루엔자 (Sjostrom et al., Biochim.Biophys.Acta 1324:182-190 (1997)), 슈도모나스 플루오레센스 (Takagi et al., J.Biochem. 96:545-552 (1984)), 바실러스 섭틸리스 (Sjostrom et al, Biochim Biophys Acta 1324:182-190 (1997)) 및 세라티아 마르세센스 (Takagi et al., J Bacteriol, 161:1-6 (1985))에서 특정화되었다. 3-메틸아스파르타제는 트레오-3-메틸아스파르테이트의 메사코네이트로의 탈아민을 촉매한다. 클로스트리듐 테타노모르품 유래의 3-메틸아스파르타제가 클로닝되었고, 에스케리키아 콜라이에서 기능적으로 발현되었으며, 결정 구조가 해명되었다 (Asuncion et al., Acta Cryst D Biol Crystallog, 57:731-733 (2001); Asuncion et al., J Biol Chem. 277:8306-8311 (2002); Botting et al., Biochem 27:2953-2955 (1988); Goda et al., Biochem 31:10747-10756 (1992)). 시트로박터 아말로나티쿠스에서, 이 효소는 BAA28709 (Kato et al., Arch.Microbiol 168:457-463 (1997))에 코딩되어 있다. 또한, 3-메틸아스파르타제의 결정 구조가 에스케리키아 콜라이 YG1002로부터 해명되었지만 (Asano et al., FEMS Microbiol Lett. 118:255-258 (1994)), 단백질 서열은 유전자은행과 같은 공공 데이타베이스에 등록되어 있지 않다. 서열 상동성을 이용하여 C. 테타니의 CTC_02563와 에스케리키아 콜라이 O157:H7의 ECs0761 등의 추가적인 후보 유전자들을 동정할 수 있다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
aspA NP_418562 90111690 에스케리키아 콜라이 K12 아종 MG1655
aspA P44324.1 1168534 헤모필러스 인플루엔자
aspA P07346.1 114273 슈도모나스 플루오레센스
ansB P26899.1 251757243 바실러스 섭틸리스
aspA P33109.1 416661 세라티아 마르세센스
MAL AAB24070.1 259429 클로스트리듐 테타노모르품
BAA28709 BAA28709.1 3184397 시트로박터 아말로나티쿠스
CTC_02563 NP_783085.1 28212141 클로스트리듐 테타니
ECs0761 BAB34184.1 13360220 에스케리키아 콜라이 O157:H7 str. Sakai
5.3.3.a 델타-이소머라제
특정화된 몇가지 효소들은 에노일-CoA 기질의 이중 결합을 2-위치에서 3-위치로 이동시킨다. 이러한 변환은 도 3의 단계 D에서 필요하다. 효소의 예로는 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제/비닐아세틸-CoA 델타-이소머라제 (EC 5.3.3.3), 델타-3, 델타-2-에노일-CoA 이소머라제 (EC 5.3.3.8) 및 지방산 산화 컴플렉스를 포함한다. 4-하이드록시부티룰-CoA 데하이드라타제 효소는 4-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 가역적인 변환을 촉매한다. 이들 효소는 4-하이드록시부티릴-CoA의 비닐아세틸-CoA로의 탈수와, 비닐아세틸-CoA 및 크로토닐-CoA의 이성체화를 모두 촉매하는 2가지 기능을 가진다. 4-하이드록시부티룰-CoA 데하이드라타제 효소들이 클로스트리듐 아미노부티리움과 클로스트리듐 클루이베리로부터 정제 및 특정화되었으며, N-말단의 서열이 분석되었다 (Scherf et al., Arch.Microbiol 161:239-245 (1994); Scherf and Buckel, Eur.J Biochem. 215:421-429 (1993)). abfD에 코딩된 클로스트리듐 클루이베리의 효소가 클로닝되고 서열분석되었으며, 에스케리키아 콜라이에서 발현되었다 (Gerhardt et al., Arch.Microbiol 174:189-199 (2000)). 포르피로모나스 깅기발리스 ATCC 33277로부터 유래된 abfD 유전자 산물은 클로스트리디아의 유전자 산물들과 서열 상동성이 매우 유사하다. 또한, 메탈로스페라 세둘라에서도 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제/이소머라제 활성이 검출되었으며, Msed_1220 유전자와 연관된 것으로 보인다 (Berg et al, Science 318(5857):1782-6 (2007). 또한, 델타 이성체화 반응은 지방산 산화 컴플렉스에 의해 촉매된다. 에스케리키아 콜라이의 경우, fadJ와 fadB 유전자 산물들은 호기 조건과 혐기 조건에서 각각 cis-3-에노일-CoA 분자를 trans-2-에노일-CoA 분자로 변환한다 (Campbell et al, Mol Micro 47(3):793-805 (2003)). 쿠쿠미스 사티부스 퍼옥시좀으로부터 분리된 단일 기능의 델타-이소머라제는 cis- 및 trans-3-에노일-CoA의 trans-2-에노일-CoA로의 가역적인 변환을 촉매한다 (Engeland et al, Eur J Biochem, 196 (3):699-705 (1991). 이 효소와 연관된 유전자는 지금까지 동정되지 않았다. 또한, MFP-a 유전자 산물을 비롯하여, 쿠쿠미스 사티부스로부터 유래된 다중 기능의 다수의 단백질 (MFP)들도 이러한 활성을 촉매한다 (Preisig-Muller et al, J Biol Chem 269:20475-81 (1994)).
유전자 GenBank GI 번호 유기체
abfD P55792 84028213 클로스트리듐 아미노부티리컴
abfD YP_001396399.1 153955634 클로스트리듐 클루이베리
abfD YP_001928843 188994591 포르피로모나스 깅기발리스
Msed_1220 ABP95381.1 145702239 메탈로스페라 세둘라
fadJ AAC75401.1 1788682 에스케리키아 콜라이
fadB AAC76849.1 1790281 에스케리키아 콜라이
MFP-a Q39659.1 34922495 쿠쿠미스 사티부스
6.2.1.a 산-티올 리가제
아실-CoA 기질의 이의 산 생성물로의 변환은 6.2.1 패밀리 효소들 중 CoA 산-티올 리가제 또는 CoA 신테타제에 의해 촉매될 수 있으며, 이중 몇몇은 가역적이다. 도 1-6에 나타낸 몇몇 반응들은 산-티올 리가제 효소에 의해 촉매된다. 이들 반응으로는 도 1의 단계 L, P 및 O, 도 3의 단계 F, 도 4의 단계 B, 도 5의 단계J 및 도 6의 단계 F를 포함한다. CoA 산-티올 리가제 또는 CoA 신테타제 활성을 촉매하는 효소들 몇몇이 문헌에 개시되었으며, 이들 단계에 적합한 후보 효소들이 제시되어 있다.
예컨대, ADP를 생성하는 아세틸-CoA 신테타제 (ACD, EC 6.2.1.13)는 아실-CoA 에스테르의 이의 대응되는 산으로의 변환과 동시적인 ATP 합성을 커플링하는 효소이다. AF1211에 코딩된 아르카에오글로부스 풀기두스 유래의 ACD I은 이소부티레이트, 이소펜타노에이트 및 푸마레이트를 비롯한 다양한 직쇄 및 분지쇄 기질에 작용하는 것으로 입증되었다 (Musfeldt et al., J Bacteriol. 184:636-644 (2002)).　 또한, AF1983에 코딩된 아르카에오글로부스 풀기두스의 2번째 가역적인 ACD도 사이클릭 화합물인 페닐아세테이트 및 인돌아세테이트에 대해 활성이 높은 광범위한 기질 범위를 가지는 것으로 입증되었다 (Musfeldt and Schonheit, J Bacteriol. 184:636-644 (2002)). 할로아르쿨라 마리스모라투이로부터 유래된 이 효소 (숙시닐-CoA 신테타제로 주석이 달림)는 기질로서 프로피오네이트, 부티레이트 및 분지쇄 산 (이소발레레이트 및 이소부티레이트)을 수용하며, 정방향 및 역방향으로 작용하는 것으로 입증되었다 (Brasen et al., Arch Microbiol 182:277-287 (2004)).　 초고온성 크레나르케온 (hyperthermophilic crenarchaeon) 피로바쿨룸 에어로필룸의 PAE3250에 코딩된 ACD는 모든 특정화된 ACD들 중에서 가장 광범위한 기질 범위를 나타내었으며, 아세틸-CoA, 이소부티릴-CoA (선호 기질) 및 페닐아세틸-CoA와 반응한다 (Brasen et al, supra). 방향성 진화 또는 가공을 적용하여, 숙주 유기체의 생리 온도에서 작동하도록 이 효소를 변형시킬 수 있다. 아르카에글루부스 풀기두스, H. 마리스모라투이 및 P. 에어로필룸으로부터 유래된 효소들 모두 클로닝되었으며, 기능적으로 발현되었고, 에스케리키아 콜라이에서 특정화되었다 (Brasen and Schonheit, supra; Musfeldt and Schonheit, J Bacteriol. 184:636-644 (2002)). 추가적인 후보 효소는 에스케리키아 콜라이의 sucCD과 사카로마이세스 세레비지애의 LSC1 및 LSC2 유전자에 코딩된 숙시닐-CoA 신테타제이다. 이 효소는 생체내에서 가역적인 반응으로 ATP 한개를 소비하면서 숙시네이트로부터 숙시닐-CoA를 형성하는 과정을 촉매한다 (Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985)). 슈도모나스 푸티다로부터 유래된 아실 CoA 리가제는 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 헥사노익산, 헵타노익산, 옥타노익산 및 페닐 아세트산과 페녹시아세트산 등의 방향족 화합물을 비롯한 수개의 지방족 기질에 작용하는 것으로 입증되었다 (Fernandez-Valverde et al., Appl.Environ.Microbiol. 59:1149-1154 (1993)). 리조비움 레구미노사룸 유래의 관련 효소인 말로닐 CoA 신테타제 (6.3.4.9)는 몇몇 2산 화합물, 즉, 에틸-, 프로필-, 알릴-, 이소프로필-, 디메틸-, 사이클로프로필-, 사이클로프로필메틸렌-, 사이클로부틸- 및 벤질-말로네이트를 이의 대응되는 모노티오에스테르로 변환할 수 있었다 (Pohl et al., J.Am.Chem.Soc. 123:5822-5823 (2001)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
AF1211 NP_070039.1 11498810 아르카에오글로부스 풀기두스
AF1983 NP_070807.1 11499565 아르카에오글로부스 풀기두스
Scs YP_135572.1 55377722 할로아르쿨라 마리스모라투이
PAE3250 NP_560604.1 18313937 피로바쿨룸 에어로필룸 str. IM2
sucC NP_415256.1 16128703 에스케리키아 콜라이
sucD AAC73823.1 1786949 에스케리키아 콜라이
LSC1 NP_014785 6324716 사카로마이세스 세레비지애
LSC2 NP_011760 6321683 사카로마이세스 세레비지애
paaF AAC24333.2 22711873 슈도모나스 푸티다
matB AAC83455.1 3982573 리조비움 레구미노사룸
이 단계들에서 다른 후보 효소는 피멜로일-CoA 리가제 (EC 6.2.1.14)로도 불리우는 6-카르복시헥사노에이트-CoA 리가제이며, 이는 천연적으로 그램 양성 박테리아에서 바이오틴 생합성 과정 중에 피멜레이트를 피멜로일-CoA로 활성화한다. 슈도모나스 멘도시나 유래의 효소는 에스케리키아 콜라이에서 클로닝하였으며, 대안 기질인 헥산디오에이트 및 노난디오에이트를 수용하는 것으로 입증되었다 (Binieda et al., Biochem.J 340 ( Pt 3):793-801 (1999)). 바실러스 섭틸리스 (Bower et al., J Bacteriol. 178:4122-4130 (1996))와 라이시니바실러스 스파에리쿠스 (종래에 바실러스 스파에리쿠스로 지칭됨) (Ploux et al., Biochem.J 287 ( Pt 3):685-690 (1992))에서 다른 후보 효소들이 확인된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
bioW NP_390902.2 50812281 바실러스 섭틸리스
bioW CAA10043.1 3850837 슈도모나스 멘도시나
bioW P22822.1 115012 바실러스 스파에리쿠스
추가적인 CoA-리가제로는 서열이 아직 규명되지 않은 랫의 디카르복실레이트-CoA 리가제 (Vamecq et al., Biochem.J 230:683-693 (1985)), 2종의 특정화된 페니실리움 크리소게눔 유래 페닐아세테이트-CoA 리가제 (Lamas-Maceiras et al., Biochem.J 395:147-155 (2006); Wang et al., 360:453-458 (2007)), 슈도모나스 푸티다 유래 페닐아세테이트-CoA 리가제 (Martinez-Blanco et al., J Biol Chem 265:7084-7090 (1990)) 및 바실러스 섭틸리스 유래 6-카르복시헥사노에이트-CoA 리가제 (Bower et al. J Bacteriol 178(14):4122-4130 (1996))가 있다. 무스 무스쿨루스 (Hasegawa et al., Biochim Biophys Acta 1779:414-419 (2008))와 호모 사피엔스 (Ohgami et al., Biochem.Pharmacol. 65:989-994 (2003))로부터 유래된 아세토아세틸-CoA 신테타제는 천연적으로 ATP 의존적으로 아세토아세테이트의 아세토아세틸-CoA로의 변환을 촉매한다.
단백질 등재 번호 GI 번호 유기체
phl CAJ15517.1 77019264 페니실리움 크리소게눔
phlB ABS19624.1 152002983 페니실리움 크리소게눔
paaF AAC24333.2 22711873 슈도모나스 푸티다
bioW NP_390902.2 50812281 바실러스 섭틸리스
AACS NP_084486.1 21313520 무스 무스쿨루스
AACS NP_076417.2 31982927 호모 사피엔스
다른 클래스의 효소들과 마찬가지로, EC 클래스 6.2.1의 특정 효소들은 넓은 기질 특이성을 가지는 것으로 확인되었다. 슈도모나스 푸티다로부터 유래된 아실 CoA 리가제는 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산 헥사노익산, 헵타노익산, 옥타노익산과 페닐아세트산 및 페녹시아세트산 등의 방향족 화합물을 비롯한 수종의 지방족 기질에 작용하는 것으로 입증되었다 (Fernandez-Valverde et al., Applied and Environmental Microbiology 59:1149-1154 (1993)). 리조비움 트리폴리이 (Rhizobium trifolii)로부터 유래된 관련 효소인 말로닐 CoA 신테타제 (6.3.4.9)는 수종의 2산 화합물들, 즉, 에틸-, 프로필-, 알릴-, 이소프로필-, 디메틸-, 사이클로프로필-, 사이클로프로필메틸렌-, 사이클로부틸- 및 벤질-말로네이트를 이의 대응되는 모노티오에스테르 화합물로 변환시킬 수 있었다 (Pohl et al., J.Am.Chem.Soc. 123:5822-5823 (2001)).
N/A (EC 번호 없음)
도 1의 단계 Q에서, 5-하이드록시발레릴-CoA의 2,4-펜타디에노일-CoA로의 변환은 2가지 기능을 갖춘 효소인 5-하이드록시발레릴-CoA 데하이드라타제/데하이드라타제에 의해 촉매된다. 클로스트리듐 아미노발레리쿰에서의 5-아미노발레레이트 발효에 참여하는 이 효소는 정제 및 특정화되었으며, 결정 구조가 해명되었다 (Eikmanns et al, Proteins: Struct Fun Gen 19:269-271 (1994), Eikmanns and Buckel, Eur J Biochem, 197:661-668 (1991)). 단백질 서열은 공지되어 있지만 지금까지 유전자은행 식별자로 등재되지 않았다. 단백질 서열이 비슷한 상동체들을 아래 표에 열거한다.
유전자 유전자은행 ID GI 번호 유기체
CLOSS21_02963 ZP_02440459.1 167768406 클로스트리듐 sp. SS2/1
CK3_30740 CBL42530.1 291563714 부티레이트 생산 박테리움 SS3/4
ANACAC_01346 ZP_02418762.1 167746635 안에어로스티페스 카케이 DSM 14662
mmgC2 ZP_07921990.1 315925783 슈도라미박터 알락톨리티쿠스
ANACAC_01346 ZP_07822451.1 167746635 펩토니필루스 하레이
FgonA2_010100002879 ZP_05630680.1 257466369 푸조박테리움 고니디아포르만스
FNP_2146 ZP_04969457.1 254302099 푸조박테리움 뉴클레아툼
acdA2 ZP_07921487.1 315925275 슈도라미박터 알락톨리티쿠스
CHY_1732 YP_360552.1 78043883 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
acdA ZP_07454495.1 306820875 유박테리움 유리
실시예 VIII
1,3-부탄디올과 3-부텐-1-올의 부타디엔으로의 화학적 탈수
적절한 조건에서는 적합한 탈수 촉매를 이용한 반응을 통해 알코올을 올레핀으로 변환시킬 수 있다. 부탄올 및 펜타놀 등의 알코올을 올레핀으로 변환하는 전형적인 탈수 촉매로는, 다양한 산 처리된 및 무처리된 알루미나 (예, 감마-알루미나)와 실리카 촉매들, 및 제올라이트 (예, 베타형 제올라이트, ZSM-5 또는 Y형 제올라이트, 플루오라이드 처리된 베타-제올라이트 촉매, 플루오라이드 처리된 클레이 촉매 등), 설폰산 수지 (예, 설폰화된 스티렌 수지, 예컨대 Amberlyst® 15), 강산, 예컨대 인산 및 황산, 루이스 산, 예컨대 보론 트리플루오라이드 및 알루미늄 트리클로라이드, 및 여러가지 타입의 다수의 금속염, 예컨대 금속 산화물 (지르코늄 산화물 또는 티타늄 이산화물) 및 금속 염화물 (예, Latshaw B E, Dehydration of Isobutanol to Isobutylen in a Slurry Reactor, Department of Energy Topical Report, February 1994)을 포함한다.
탈수 반응은 다수의 여러가지 반응조 배열에서 혼성 및 동종의 촉매 시스템을 이용하여 기상 및 액상에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 사용되는 촉매는 반응을 통해 생성되는 물에 안정적이다. 물은 통상 생성물을 이용하여 반응존으로부터 제거된다. 제조되는 알켄(들)은 기상 또는 액상 (예, 반응조의 조건에 따라)으로 반응조에서 배출되며, 하류 정제 공정에 의해 포획되거나 또는 본원에 기술된 바와 같이 반응조에서 다른 화합물들 (예, 부타디엔 또는 이소프렌)으로 추가로 변환된다. 탈수 반응으로 생성되는 물은 반응하지 않은 알코올과 알켄 생성물(들)과 함께 반응조에서 배출되며, 증류 또는 산 분리에 의해 분리된다. 물이 탈수 단계에서 다량으로 생성되기 때문에, 사용되는 탈수 촉매는 일반적으로 물에 관대하며, 기질 및 생성물로부터 물을 제거하는 공정은 탈수 단계를 포함하는 임의의 공정의 일부일 수 있다. 이러한 이유로, 탈수 반응을 위한 기질로서 습식 (즉, 수분량 최대 약 95 중량% 또는 98 중량%) 알코올을 이용하고, 탈수 반응으로 생성되는 물로 이 물을 제거할 수 있다 (예, 미국 특허 4,698,452 및 4,873,392에 기술된 바와 같이 제올라이트 촉매를 이용함). 부가적으로, 중성 알루미나 및 제올라이트는 알코올을 알켄으로 탈수하지만, 일반적으로 이들 촉매의 산성 버전 보다는 높은 온도와 압력에서 이루어질 것이다.
1,3-부탄디올의 3-부텐-1-올 및 부타디엔으로의 탈수는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 3가 금속 설페이트의 존재 하에 디올 화합물을 70 - 100 ℃의 온도로 가열함으로써 1,3-부탄디올로부터 3-부텐-1-올을 합성한다 (US 특허 44005612). 1,3-부탄디올의 부타디엔으로의 탈수는, 예를 들어, 과열 증기와 포스페이트-인산 촉매의 존재 하에 1,3-부탄디올을 가열하는 단계를 포함한다 (Sato, et al, Catalysis Communications, 5 (8), 2004, p. 397-400). 3-부텐-1-올의 부타디엔으로의 탈수는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (Gustav. Egloff and George. Hulla, Chem. Rev., 1945, 36 (1), pp 63-141).
실시예 IX
합성가스로부터 환원 당량을 추출하기 위한 하이드로게나제 및 CO 데하이드로게나제 효소의 예, 및 환원성 TCA 사이클 효소의 예
본 발명의 비-천연성 미생물 유기체에서 이용가능한 환원성 TCA 사이클 효소로는, 하나 이상의 ATP-시트레이트 리아제와 3개의 CO2-고정 효소를 포함한다: 이소시트레이트 데하이드로게나제, 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제. ATP-시트레이트 리아제 또는 시트레이트 리아제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제가 존재한다는 것은 유기체에 활성형의 환원성 TCA 회로가 존재한다는 것을 의미한다. 환원성 TCA 회로 각각의 공정의 효소들을 하기에 나타낸다.
ATP-시트레이트 리아제 (ACL, EC 2.3.3.8)는, ATP 시트레이트 신타제라고도 불리며, 시트레이트를 옥살로아세테이트 및 아세틸CoA로의 ATP-의존적인 절단을 촉매한다. ACL은 녹색유황 박테리아인 클로로비움 리미콜라 (Chlorobium limicola) 및 클로로비움 테피둠 (Chlorobium tepidum)에서 연구된 RTCA 회로의 효소이다. 클로로비움 리미콜라 유래의 알파(4)베타(4) 헤테로머 (heteromeric) 효소가 클로닝되었고 E. coli에서 특정되었다 (Kanao et al., Eur. J. Biochem. 269:3409-3416 (2002). aclAB에 의해 코딩되는 클로로비움 리미콜라 효소는 비가역적이며, 효소 활성이 ADP/ATP 비율에 의해 조절된다. 클로로비움 테피둠 유래의 재조합 ACL 역시 E. coli에서 발현되었고, 촉매 기전에서 알파 및 베타 서브유닛들의 역할을 평가하기 위한 실험에서 전효소가 시험관내에서 재구축되었다 (Kim and Tabita, J. Bacteriol. 188:6544-6552 (2006). 또한, ACL 효소들은 발레아리움 리토트로피쿰 (Balnearium lithotrophicum), 설푸리하이드로게니비움 섭테라네움 (Sulfurihydrogenibium subterraneum) 및 박테리아 문 (phylum) 아퀴피카이 (Aquificae)에 속하는 다른 구성원에서도 확인되었다 (Hugler et al., Environ. Microbiol. 9:81-92 (2007)). 이러한 활성은 일부 진균에서도 보고되었다. 유기체의 예로는 솔다리아 마크로스포라 (Sordaria macrospora) (Nowrousian et al., Curr. Genet. 37:189-93 (2000), 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 야로이와 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) (Hynes and Murray, Eukaryotic Cell, July: 1039-1048, (2010) 및 아스퍼질러스 나이거 (Meijer et al. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36:1275-1280 (2009)을 포함한다. 기타 후보들은 서열 상동성에 기반하여 발굴할 수 있다. 이들 효소와 관련된 정보는 아래에 표로 작성한다:
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
aclA BAB21376.1 12407237 클로로비움 리미콜라
aclB BAB21375.1 12407235 클로로비움 리미콜라
aclA AAM72321.1 21647054 클로로비움 테피둠
aclB AAM72322.1 21647055 클로로비움 테피둠
aclA ABI50076.1 114054981 발니어리움 리소트로피쿰
aclB ABI50075.1 114054980 발니어리움 리소트로피쿰
aclA ABI50085.1 114055040 설푸리하이드로게니비움 섭테라네움
aclB ABI50084.1 114055039 설푸리하이드로게니비움 섭테라네움
aclA AAX76834.1 62199504 설푸리모나스 데니트리피칸스
aclB AAX76835.1 62199506 설푸리모나스 데니트리피칸스
acl1 XP_504787.1 50554757 야로위아 리폴리티카
acl2 XP_503231.1 50551515 야로위아 리폴리티카
SPBC1703.07 NP_596202.1 19112994 시조사카로마이세스 품베
SPAC22A12.16 NP_593246.1 19114158 시조사카로마이세스 품베
acl1 CAB76165.1 7160185 소르다리아 마크로스포라
acl2 CAB76164.1 7160184 소르다리아 마크로스포라
aclA CBF86850.1 259487849 아스퍼질러스 니둘란스
aclB CBF86848 259487848 아스퍼질러스 니둘란스
일부 유기체에서 시트레이트에서 옥살로아세테이트 및 아세틸CoA로의 변환은 사이트릴-CoA 중간산물을 통해 진행되며, 2종의 개별 효소, 사이트릴-CoA 신테타제 (EC 6.2.1.18)와 사이트릴-CoA 리아제 (EC 4.1.3.34)에 의해 촉매된다 (Aoshima, M., Appl. Microbiol. Biotechnol. 75:249-255 (2007). 사이트릴-CoA 신테타제는 시트레이트의 시트릴-CoA로의 활성화를 촉매한다. 하이드로게노박터 서모필러스 (Hydrogenobacter thermophilus) 효소는 각각 ccsA 및 ccsB에 의해 코딩되는 대형 및 소형 서브단위들로 구성된다 (Aoshima et al., Mol. Micrbiol. 52:751-761 (2004)). 아퀴펙스 에어올리쿠스 (Aquifex aeolicus)의 사이트릴-CoA 신테타제는 sucC1 및 sucD1로 코딩되는 알파 및 베타 서브단위로 구성된다 (Hugler et al., Environ. Microbiol. 9:81-92 (2007)). 사이트릴-CoA 리아제는 사이트릴-CoA를 옥살로아세테이트와 아세틸CoA로 분할한다. 이 효소는 하이드로게노박터 서모필러스의 ccl (Aoshima et al., Mol. Microbiol. 52:763-770 (2004))과 아퀴펙스 에어올리쿠스의 aq_150 (Hugler et al., supra (2007))에 의해 코딩되는 동형삼량체이다. 시트레이트를 옥살로아세테이트 및 사이트릴-CoA로 변환하는 이러한 기전에 대한 유전자들이 최근 클로로비움 테피둠에서도 보고되었다 (Eisen et al., PNAS 99(14): 9509-14 (2002).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
ccsA BAD17844.1 46849514 하이드로게노박터 서모필러스
ccsB BAD17846.1 46849517 하이드로게노박터 서모필러스
sucC1 AAC07285 2983723 아퀴펙스 에어올리쿠스
sucD1 AAC07686 2984152 아퀴펙스 에어올리쿠스
ccl BAD17841.1 46849510 하이드로게노박터 서모필러스
aq_150 AAC06486 2982866 아퀴펙스 에어올리쿠스
CT0380 NP_661284 21673219 클로로비움 테피둠
CT0269 NP_661173.1 21673108 클로로비움 테피둠
CT1834 AAM73055.1 21647851 클로로비움 테피둠
옥살로아세테이트는 말레이트 데하이드로게나제 (EC 1.1.1.37)에 의해 말레이트로 변환되는데, 이 효소는 정방향과 역방향 둘다로 작용한다. 사카로마이세스 세레비지애는 말레이트 데하이드로게나제 3카피, MDH1 (McAlister-Henn and Thompson, J. Bacteriol. 169:5157-5166 (1987), MDH2 (Minard and McAlister-Henn, Mol. Cell. Biol. 11:370-380 (1991); Gibson and McAlister-Henn, J. Biol. Chem. 278:25628-25636 (2003)), 및 MDH3 (Steffan and McAlister-Henn, J. Biol. Chem. 267:24708-24715 (1992))를 가지고 있으며, 각각 미토콘드리아, 세포질 및 퍼옥시좀에 위치되어 있다. E. coli는 mdh에 의해 코딩되는 활성 말레이트 데하이드로게나제를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
MDH1 NP_012838 6322765 사카로마이세스 세레비지애
MDH2 NP_014515 116006499 사카로마이세스 세레비지애
MDH3 NP_010205 6320125 사카로마이세스 세레비지애
Mdh NP_417703.1 16131126 에스케리키아 콜라이
푸마레이트 하이드라타제 (EC 4.2.1.2)는 푸마레이트의 말레이트로의 가역적인 수화를 촉매한다. fumA, fumB 및fumC에 의해 코딩되는 E. coli의 3종의 푸마라제는 다른 산소이용성 조건에서 조절된다. FumB는 산소에 민감하며, 혐기성 조건에서 활성을 띈다. FumA는 미세혐기성 조건에서 활성을 띄며, FumC는 호기성 생장 조건들에서 활성을 띈다 (Tseng et al., J. Bacteriol. 183:461-467 (2001);Woods et al., Biochim. Biophys. Acta 954:14-26 (1988); Guest et al., J. Gen. Microbiol. 131:2971-2984 (1985)). 사카로마이세스 세레비지애는 푸마라제-코딩 유전자, FUM1을 1 카피 가지고 있으며, 이의 산물은 세포질과 미토콘드리아 둘다에 국지화된다 (Sass et al., J. Biol. Chem. 278:45109-45116 (2003)). 추가적인 푸마라제 효소로는 캄필로박터 제주니 (Smith et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31:961-975 (1999)), 서무스 서모필러스 (Mizobata et al., Arch. Biochem. Biophys. 355:49-55 (1998)) 및 라투스 노르베기쿠스 (Kobayashi et al., J. Biochem. 89:1923-1931 (1981))에서 확인된다. 서열 상동성이 높은 유사한 효소로는 아라비돕시스 탈리아나 유래의 fum1과 코리네박테리움 글루타미컴 유래의 fumC를 포함한다. 펠로토마쿨럼 서모프로피오니컴 (Pelotomaculum thermopropionicum) 유래의 MmcBC 푸마라제는 2개의 서브유닛을 포함하는 다른 유형의 푸마라제이다 (Shimoyama et al., FEMS Microbiol. Lett. 270:207-213 (2007)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fumA NP_416129.1 16129570 에스케리키아 콜라이
fumB NP_418546.1 16131948 에스케리키아 콜라이
fumC NP_416128.1 16129569 에스케리키아 콜라이
FUM1 NP_015061 6324993 사카로마이세스 세레비지애
fumC Q8NRN8.1 39931596 코리네박테리움 글루타미컴
fumC O69294.1 9789756 캄필로박터 제주니
fumC P84127 75427690 서무스 서모필러스
fumH P14408.1 120605 라투스 노르베기쿠스
MmcB YP_001211906 147677691 펠로토마쿨룸 서모프로피오니컴
MmcC YP_001211907 147677692 펠로토마쿨룸 서모프로피오니컴
푸마레이트 리덕타제는 푸마레이트의 숙시네이트로의 환원을 촉매한다. E. coli의 푸마레이트 리덕타제는 frdABCD에 의해 코딩된 4개의 서브유닛들로 구성되어 있으며, 막-결합형이며, 혐기성 조건에서 활성을 나타낸다. 이러한 반응의 전자 공여체는 메나퀴논이고, 이 반응에서 생성되는 2개의 양성자는 양성자 구배를 야기하지 않는다 (Iverson et al., Science 284:1961-1966 (1999)). 효모 게놈은 FRDS1 (Enomoto et al., DNA Res. 3:263-267 (1996)) 및 FRDS2 (Muratsubaki et al., Arch. Biochem. Biophys. 352:175-181 (1998))에 의해 코딩되는 2개의 가용성 푸마레이트 리덕타제 이소자임을 코딩하며, 이들은 각각 세포질과 프로미토콘드리아에 국지적으로 위치하며, 글루코스에서의 혐기성 증식에 사용된다 (Arikawa et al., FEMS Microbiol. Lett. 165:111-116 (1998)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
FRDS1 P32614 418423 사카로마이세스 세레비지애
FRDS2 NP_012585 6322511 사카로마이세스 세레비지애
frdA NP_418578.1 16131979 에스케리키아 콜라이
frdB NP_418577.1 16131978 에스케리키아 콜라이
frdC NP_418576.1 16131977 에스케리키아 콜라이
frdD NP_418475.1 16131877 에스케리키아 콜라이
ATP-의존적인 방식으로 숙시네이트를 숙시닐-CoA로 아실화하는 과정은 숙시닐-CoA 신테타제 (EC 6.2.1.5)에 의해 촉매된다. 사카로마이세스 세레비지애의 LSC1 및 LSC2 유전자와, E. coli의 sucC 및 sucD 유전자 산물은, 천연적으로, 하나의 ATP를 소비하면서 동시에 숙시네이트로부터 숙시닐-CoA를 제조하는, 생체내에서의 가역적인 반응을 촉매하는 숙시닐-CoA 신테타제 복합체를 형성한다 (Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985)). 이들 단백질을 하기에 나타낸다:
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
LSC1 NP_014785 6324716 사카로마이세스 세레비지애
LSC2 NP_011760 6321683 사카로마이세스 세레비지애
sucC NP_415256.1 16128703 에스케리키아 콜라이
sucD AAC73823.1 1786949 에스케리키아 콜라이
알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제 (EC 1.2.7.3)는, 2-옥소글루타레이트 신타제 또는 2-옥소글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제 (OFOR)로도 알려져 있으며, 2개의 페레독신 환원 당량들을 소비하면서 CO2와 숙시닐-CoA로부터 알파-케토글루타레이트를 만든다. OFOR와 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 (PFOR)는 티아민 피로포스페이트, CoA 및 철-황 클러스터들을 조인자로, 페레독신, 플라보독신 및 FAD를 전자전달체로 이용하는, 다양한 2-옥소산:페레독신 (플라보독신) 옥시도리덕타제 패밀리에 속한다 (Adams et al., Archaea. Adv. Protein Chem. 48:101-180 (1996)). 이러한 유형의 효소들은 가역적이며, 탄소를 RTCA 회로에 의해 고정하는 유기체, 예를 들면 하이드로게노박터 서모필러스, 데설포박터 하이드로게노필러스 (Desulfobacter hydrogenophilus) 및 클로로비움 종에서 카르복시화하는 방향으로 작용한다 (Shiba et al. 1985; Evans et al., Proc. Natl. Acad. ScI. U.S.A. 55:92934 (1966); Buchanan, 1971). korAB에 의해 코딩되는 하이드로게노박터 서모필러스 유래의 2개의 서브유닛 효소들은 클로닝되었으며 E. coli에서 발현되었다 (Yun et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:589-594 (2001)). 동일 유기체로부터 유래된 숙시닐-CoA에 대한 엄격한 기질 특이성을 가지며 forDABGE에 의해 코딩되는, 5 서브유닛 OFOR도 최근에 동정되었으며, E. coli에서 발현되었다 (Yun et al. 2002). 이들 2가지 하이드로게노박터 서모필러스의 OFOR 효소들 모두 CO2 고정에 대한 카이네틱스가 특정화되었다 (Yamamoto et al., Extremophiles 14:79-85 (2010)). 클로로비움 티오설파토필럼 (Chlorobium thiosulfatophilum)으로부터 CO2를 고정하는 OFOR가 정제되었으며, 특정화되었지만, 이 효소를 코딩하는 유전자는 지금까지 동정되지 않았다. 클로로비움 종에서 후보 효소들을 하이드로게노박터 서모필러스 유전자에 대한 서열 유사성을 통해 추론할 수 있다. 예를 들어, 클로로비움 리미콜라 게놈은 유사 단백질 2개를 코딩한다. 초산생성균, 예컨대 무렐라 서모아세티카 (Moorella thermoacetica)는 2개의 OFOR 효소들을 코딩하는 것으로 예측된다. Moth_0034 에 의해 코딩되는 이 효소는 CO2-동화 방향으로 작용할 것으로 예상된다. 이 효소와 연관되는 유전자 Moth_0034는 지금까지 실험적으로 검증되지 않았지만 공지된 OFOR 효소들과의 서열 유사성을 통해 추정할 수 있다.
생리적 조건에서 탈카르복시화 방향으로 작용하는 OFOR 효소들은 또한 역 반응도 촉매할 수 있다. 호열호산성 고세균인 설폴로부스 sp. strain 7로부터 유래된 ST2300에 의해 코딩되는 OFOR에 대해서는 광범위하게 연구되었다 (Zhang et al. 1996). 플라스미드-기반의 발현 시스템이 E. coli에서 이 단백질을 효율적으로 발현시키기 위해 개발되었으며 (Fukuda et al., Eur. J. Biochem. 268:5639-5646 (2001)), 기질 특이성에 관여하는 잔기들이 결정되었다 (Fukuda and Wakagi, Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80 (2002)). 에어로피럼 페르닉스 (Aeropyrum pernix) str K1으로부터 유래된 Ape1472/Ape1473에 의해 코딩되는 OFOR가 최근 E. coli에 클로닝 및 특정화되었으며, 2-옥소글루타레이트 및 매우 다양한 2-옥소산 화합물과 반응하는 것으로 확인되었다 (Nishizawa et al., FEBS Lett. 579:2319-2322 (2005)). OFOR의 다른 예는 헬리코박터 필로리의 oorDABC에 의해 코딩된다 (Hughes et al. 1998). 알파-케토글루타레이트에 특이적인 효소가 타우에라 아로마티카 (Thauera aromatica)에서 보고되었다 (Dorner and Boll, J, Bacteriol. 184 (14), 3975-83 (2002). 유사 효소는 로도스피릴룸 루브럼 (Rhodospirillum rubrum)에서도 서열 상동성에 의해 확인할 수 있다. 2 서브유닛 효소는 또한 클로로비움 테피둠에서도 동정되었다 (Eisen et al., PNAS 99(14): 9509-14 (2002)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
korA BAB21494 12583691 하이드로게노박터 서모필러스
korB BAB21495 12583692 하이드로게노박터 서모필러스
forD BAB62132.1 14970994 하이드로게노박터 서모필러스
forA BAB62133.1 14970995 하이드로게노박터 서모필러스
forB BAB62134.1 14970996 하이드로게노박터 서모필러스
forG BAB62135.1 14970997 하이드로게노박터 서모필러스
forE BAB62136.1 14970998 하이드로게노박터 서모필러스
Clim_0204 ACD89303.1 189339900 클로로비움 리미콜라
Clim_0205 ACD89302.1 189339899 클로로비움 리미콜라
Clim_1123 ACD90192.1 189340789 클로로비움 리미콜라
Clim_1124 ACD90193.1 189340790 클로로비움 리미콜라
Moth_1984 YP_430825.1 83590816 무렐라 서모아세티카
Moth_1985 YP_430826.1 83590817 무렐라 서모아세티카
Moth_0034 YP_428917.1 83588908 무렐라 서모아세티카
ST2300 NP_378302.1 15922633 설폴로부스 sp. strain 7
Ape1472 BAA80470.1 5105156 에어로피럼 페르닉스
Ape1473 BAA80471.2 116062794 에어로피럼 페르닉스
oorD NP_207383.1 15645213 헬리코박터 필로리
oorA NP_207384.1 15645214 헬리코박터 필로리
oorB NP_207385.1 15645215 헬리코박터 필로리
oorC NP_207386.1 15645216 헬리코박터 필로리
CT0163 NP_661069.1 21673004 클로로비움 테피둠
CT0162 NP_661068.1 21673003 클로로비움 테피둠
korA CAA12243.2 19571179 타우에라 아로마티카
korB CAD27440.1 19571178 타우에라 아로마티카
Rru_A2721 YP_427805.1 83594053 로도스피릴룸 루브럼
Rru_A2722 YP_427806.1 83594054 로도스피릴룸 루브럼
이소시트레이트 데하이드로게나제는 NAD(P)+ 환원과 커플링된 이소시트레이트의 2-옥소글루타레이트로의 가역적인 탈카르복시화를 촉매한다. 사카로마이세스 세레비지애와 에스케리키아 콜라이의 IDH 효소들은 각각 IDP1 및 icd에 코딩되어 있다 (Haselbeck and McAlister-Henn, J. Biol. Chem. 266:2339-2345 (1991); Nimmo, H.G., Biochem. J. 234:317-2332 (1986)). 환원성 TCA 사이클에서 역 반응, 즉 2-옥소글루타레이트를 이소시트레이트로 환원성 카르복시화하는 반응은 클로로비움 리미콜라 유래의 NADPH-의존적인 CO2-고정성 IDH에 의해 이루어지며, 기능적으로 E. coli에서 발현되었다 (Kanao et al., Eur. J. Biochem. 269:1926-1931 (2002)). 하기에 열거된 일부 다른 후보 효소들 외에도, 서열 동일성이 95%인 유사 효소는 클로로비움 테피둠 게놈에서도 확인된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
Icd ACI84720.1 209772816 에스케리키아 콜라이
IDP1 AAA34703.1 171749 사카로마이세스 세레비지애
Idh BAC00856.1 21396513 클로로비움 리미콜라
Icd AAM71597.1 21646271 클로로비움 테피둠
icd NP_952516.1 39996565 지오박터 설푸레두센스
icd YP_393560. 78777245 설푸리모나스 데니트리피칸스
하이드로게노박터 서모필러스에서 2-옥소글루타레이트를 이소시트레이트로 환원적으로 카르복시화하는 반응은 2개의 효소에 의해 촉매된다: 2-옥소글루타레이트 카르복실라제 및 옥살로숙시네이트 리덕타제. 2-옥소글루타레이트 카르복실라제 (EC 6.4.1.7)는 알파-케토글루타레이트를 옥살로숙시네이트로 ATP-의존적으로 카르복시화하는 반응을 촉매한다 (Aoshima and Igarashi, Mol. Microbiol. 62:748-759 (2006)). 이 효소는 2개의 서브유닛으로 구성된 큰 복합체이다. 큰 (A) 서브유닛의 비오틴화는 효소 기능에 필수적이다 (Aoshima et al., Mol. Microbiol. 51:791-798 (2004)). 옥살로숙시네이트 리덕타제 (EC 1.1.1.-)는 옥살로숙시네이트를 D-트레오-이소시트레이트로 NAD-의존적인 방식으로 변환하는 과정을 촉매한다. 이 효소는 하이드로게노박터 서모필러스의 icd에 의해 코딩되는 동형이량체이다. 기타 유기체에서의 이소시트레이트 데하이드로게나제 효소와는 대조적으로, 이 효소의 카이네틱 파라미터들은, 이 효소가 생체내에서 환원성 카르복시화 방향으로만 작동하는 것으로 나타났다 (Aoshima and Igarashi, J. Bacteriol. 190:2050-2055 (2008)). 서열 상동성을 토대로, 티오바실러스 데니트리피칸스 (Thiobacillus denitrificans)와 서모크리니스 알부스 (Thermocrinis albus)에서도 후보 유전자들을 확인하였다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
cfiA BAF34932.1 116234991 하이드로게노박터 서모필러스
cifB BAF34931.1 116234990 하이드로게노박터 서모필러스
Icd BAD02487.1 38602676 하이드로게노박터 서모필러스
Tbd_1556 YP_315314 74317574 티오바실러스 데니트리피칸스
Tbd_1555 YP_315313 74317573 티오바실러스 데니트리피칸스
Tbd_0854 YP_314612 74316872 티오바실러스 데니트리피칸스
Thal_0268 YP_003473030 289548042 서모크리니스 알부스
Thal_0267 YP_003473029 289548041 서모크리니스 알부스
Thal_0646 YP_003473406 289548418 서모크리니스 알부스
아코니타제 (EC 4.2.1.3)는 중간산물 시스-아코니테이트를 경유하여 시트레이트와 이소-시트레이트의 가역적인 이성체화를 촉매하는 철-황-함유 단백질이다. 이들 2가지 아코니타제는 E. coli 게놈에 acnA 및 acnB에 의해 코딩되어 있다. AcnB는 주요 이화작용 효소이고, AcnA는 보다 안정적이며 산화 또는 산 스트레스 조건에서 활성을 나타내는 것으로 보인다 (Cunningham et al., Microbiology 143 (Pt 12):3795-3805 (1997)). 살모넬라 티피무리움에는 2개의 아코니타제 이소자임이 acnA와 acnB에 코딩되어 있다 (Horswill and Escalante-Semerena, Biochemistry 40:4703-4713 (2001)). 사카로마이세스 세레비지애 아코니타제는 ACO1에 의해 코딩되어 있으며, TCA 사이클에 참여하는 경우 미토콘드리아 (Gangloff et al., Mol. Cell. Biol. 10:3551-3561 (1990))에, 글리옥실레이트 션트 (glyoxylate shunt)에 참여하는 경우 세포질 (Regev-Rudzki et al., Mol. Biol. Cell. 16:4163-4171 (2005))에 국지화된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
acnA AAC7438.1 1787531 에스케리키아 콜라이
acnB AAC73229.1 2367097 에스케리키아 콜라이
acnA NP_460671.1 16765056 살모넬라 티피무리움
HP0779 NP_207572.1 15645398 헬리코박터 필로리 26695
H16_B0568 CAJ95365.1 113529018 랄스토니아 유트로파
DesfrDRAFT_3783 ZP_07335307.1 303249064 데설포비브리오 프럭토소보란스 JJ
Suden_1040 (acnB) ABB44318.1 78497778 설푸리모나스 데니트리피칸스
Hydth_0755 ADO45152.1 308751669 하이드로게노박터 서모필러스
CT0543 (acn) AAM71785.1 21646475 클로로비움 테피둠
Clim_2436 YP_001944436.1 189347907 클로로비움 리미콜라
Clim_0515 ACD89607.1 189340204 클로로비움 리미콜라
acnB NP_459163.1 16763548 살모넬라 티피무리움
ACO1 AAA34389.1 170982 사카로마이세스 세레비지애
피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 (PFOR)는 피루베이트의 가역적 산화를 촉매하여 아세틸CoA를 형성한다. 데설포비브리오 아프리카누스 (Desulfovibrio africanus) 유래의 PFOR는 클로닝되어 E. coli에서 발현시켜, 산소 존재 하에 수일간 안정적인 활성형 재조합 효소를 수득하였다 (Pieulle et al., J. Bacteriol. 179:5684-5692 (1997)). 산소 안정성은 PFOR에서는 상대적으로 드문 일이며, 데설포비브리오 아프리카누스 효소의 폴리펩타이드 체인에 잔기 60개를 연장시킴으로써 부여되는 것으로 보인다. 이 효소에서 시스테인 잔기 2개가 이황화 결합을 형성하는데, 이는 산소 형태의 불활성화로부터 효소를 보호된다. 이러한 이황화 결합과 산소 존재 하에서의 안정성은 다른 데설포비브리오 sp.에서도 발견되었다 (Vita et al., Biochemistry, 47: 957-64 (2008)). 무렐라 서모아세티카 PFOR 역시 잘 특정화되어 있으며 (Menon and Ragsdale, Biochemistry 36:8484-8494 (1997)), 독립영양 생장시에 피루베이트를 합성하는 방향으로 높은 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다 (Furdui and Ragsdale, J. Biol. Chem. 275:28494-28499 (2000)). 또한, E. coli 는 무렐라 서모아세티카 PFOR와 51% 동일한 단백질을 코딩하는 불특정화된 오픈 리딩 프래임 ydbK을 가지고 있다. E. coli에서 피루베이트 옥시도리덕타제 활성에 대한 증거가 개시되었다 (Blaschkowski et al., Eur. J. Biochem. 123:563-569 (1982)). PFOR는 또한 로도박터 캡술라타스 (Rhodobacter capsulatas) (Yakunin and Hallenbeck, Biochimica et Biophysica Acta 1409 (1998) 39-49 (1998)) 및 콜로보움 테피둠 (Choloboum tepidum) (Eisen et al., PNAS 99(14): 9509-14 (2002))을 비롯한, 다른 유기체들에서도 보고되었다. 하이드로게노박터 서모필러스 유래의 porEDABG에 의해 코딩되는 5개의 서브유닛 PFOR을 E. coli에 클로닝하였고, 탈카르복시화와 CO2를 동화하는 방향으로 작동하는 것으로 확인되었다 (Ikeda et al. 2006; Yamamoto et al., Extremophiles 14:79-85 (2010)). 또한, 상동체는 클로스트리듐 카복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) P7에도 존재한다. 여러 추가적인 PFOR 효소들은 리뷰에 기재되어 있다 (Ragsdale, S.W., Chem. Rev. 103:2333-2346 (2003)). 마지막으로, 플라보독신 리덕타제 (예, 헬리코박터 필로리 또는 캄필로박터 제주니 유래의 fqrB) (St Maurice et al., J. Bacteriol. 189:4764-4773 (2007)) 또는 Rnf-유형의 단백질들 (Seedorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:2128-2133 (2008); 및 Herrmann, J. Bacteriol 190:784-791 (2008))은 PFOR에 의해 생성된 환원된 페레독신으로부터 NADH 또는 NADPH을 생성하는 수단을 제공한다. 이들 단백질은 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
DesfrDRAFT_0121 ZP_07331646.1 303245362 데설포비브리오 프럭토소보란스 JJ
Por CAA70873.1 1770208 데설포비브리오 아프리카누스
por YP_012236.1 46581428 데설포비브리오 불가리스 str. 힐덴보러프
Dde_3237 ABB40031.1 78220682 데설포비브리오 데설푸리칸스 G20
Ddes_0298 YP_002478891.1 220903579 데설포비브리오 데설푸리칸스 아종 데설푸리칸스 str. ATCC 27774
Por YP_428946.1 83588937 무렐라 서모아세티카
YdbK NP_415896.1 16129339 에스케리키아 콜라이
nifJ (CT1628) NP_662511.1 21674446 클로로비움 테피둠
CJE1649 YP_179630.1 57238499 캄필로박터 제주니
nifJ ADE85473.1 294476085 로도박터 캅술라투스
porE BAA95603.1 7768912 하이드로게노박터 서모필러스
porD BAA95604.1 7768913 하이드로게노박터 서모필러스
porA BAA95605.1 7768914 하이드로게노박터 서모필러스
porB BAA95606.1 776891 하이드로게노박터 서모필러스
porG BAA95607.1 7768916 하이드로게노박터 서모필러스
FqrB YP_001482096.1 157414840 캄필로박터 제주니
HP1164 NP_207955.1 15645778 헬리코박터 필로리
RnfC EDK33306.1 146346770 클로스트리듐 클루이베리
RnfD EDK33307.1 146346771 클로스트리듐 클루이베리
RnfG EDK33308.1 146346772 클로스트리듐 클루이베리
RnfE EDK33309.1 146346773 클로스트리듐 클루이베리
RnfA EDK33310.1 146346774 클로스트리듐 클루이베리
RnfB EDK33311.1 146346775 클로스트리듐 클루이베리
피루베이트의 아세틸-CoA로의 변환은 수종의 다른 효소들이나 이들의 조합에 의해 촉매될 수 있다. 예를 들어, 피루베이트 데하이드로게나제는 NAD 1분자를 NADH 환원시키면서 동시에 피루베이트를 아세틸-CoA로 변환한다. 이것은, 일련의 부분 반응들을 촉매하여 피루베이트의 아실화 산화적 탈카르복시화를 달성하는, 다중-효소 복합체이다. 이 효소는 3개의 서브유닛, 즉 피루베이트 데카르복실라제 (E1), 다이하이드로리포아미드 아실트랜스퍼라제 (E2) 및 다이하이드로리포아미드 데하이드로게나제 (E3)로 구성되어 있다. 이 효소는 천연적으로 여러 유기체들, 예를 들어 E. coli 및 사카로마이세스 세레비지애에 존재한다. E. coli 효소의 경우, E1 성분내 특정 잔기들이 기질 특이성을 담당한다 (Bisswanger, H., J. Biol. Chem. 256:815-82 (1981); Bremer, J., Eur. J. Biochem. 8:535-540 (1969); Gong et al., J. Biol. Chem. 275:13645-13653 (2000)). 효소 조작 시도를 통해 혐기성 조건에서 E. coli의 PDH 효소 활성이 개선되었다 (Kim et al., J. Bacteriol. 190:3851-3858 (2008); Kim et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771 (2007); Zhou et al., Biotechnol. Lett. 30:335-342 (2008)). E. coli의 PDH와는 다르게, 바실러스 섭틸러스에서의 복합체는 혐기성 조건에서 활성을 나타내며, 혐기 조건에서 증식하는데 필수적이다 (Nakano et al., J. Bacteriol. 179:6749-6755 (1997)). 글리세롤에서의 배양에서 특정화된 클렙시엘라 뉴모니애의 PDH 역시 혐기성 조건에서 활성을 나타낸다 (5). 소 신장 유래의 효소 복합체의 결정 구조 (18)와 아조토박터 비넬란디이 유래의 E2 촉매 도메인이 이용가능하다 (4). 이러한 변환을 촉매할 수 있는 또 다른 효소는 피루베이트 포르메이트 리아제이다. 이 효소는 피루베이트와 CoA를 아세틸-CoA과 포르메이트로 변환하는 반응을 촉매한다. 피루베이트 포르메이트 리아제는 혐기성 레독스 균형 조절에 일조하는, 원핵 유기체에서 공통된 효소이다. 이 효소의 예로는 pflB에 의해 코딩되는 에스케리키아 콜라이 (Knappe and Sawers, FEMS.Microbiol Rev. 6:383-398 (1990)), 락토코커스 락티스 (Melchiorsen et al., Appl Microbiol Biotechnol 58:338-344 (2002)), 및 스트렙토코쿠스 무탄스 (Takahashi-Abbe et al., Oral.Microbiol Immunol. 18:293-297 (2003))에서 확인할 수 있다. E. coli는 tdcE에 의해 코딩되는 추가적인 피루베이트 포르메이트 리아제를 가지고 있으며, 이것은 피루베이트 또는 2-옥소부타노에이트를 각각 아세틸-CoA 또는 프로피오닐-CoA로 변환하는 과정을 촉매한다 (Hesslinger et al., Mol. Microbiol 27:477-492 (1998)). E. coli 유래의 pflB와 tdcE 둘다 pflA에 코딩된 피루베이트 포르메이트 리아제 활성화 효소를 필요로 한다. 또한, E. coli의 yfiD 에 코딩된 짧은 단백질은 산소-절단성 피루베이트 포르메이트 리아제와 관련있을 수 있으며, 활성을 복원할 수 있다 (Vey et al., Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:16137-16141 (2008). WO/2008/080124에 기재된 바와 같이, 부탄올을 생산하기 위해 세포질내 아세틸-CoA를 증가시키기 위한 수단으로서 E. coli 유래의 pflA와 pflB를 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시켰다. 각각 pfl 및 act에 의해 코딩되는 추가적인 피루베이트 포르메이트 리아제와 이의 활성화 효소에 대한 후보 효소는 클로스트리윰 파스테리아눔에서 확인된다 (Weidner et al., J Bacteriol. 178:2440-2444 (1996)).
또한, 피루베이트를 아세틸-CoA로 변환하기 위해 여러가지 효소들을 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애에서, 아세틸-CoA는 세포질에서, 먼저 피루베이트가 탈카르복시화되어 아세트알데하이드로 된 다음, 아세트알데하이드 데하이드로게나제에 의해 아세테이트로 산화되고, 이어 아세틸-CoA 신테타제에 의해 아세틸-CoA로 활성화됨으로써, 수득된다. 아세틸-CoA 신테타제는, E. coli (Kumari et al., J. Bacteriol. 177:2878-2886 (1995)), 살모넬라 엔테리카 (Starai et al., Microbiology 151:3793-3801 (2005); Starai et al., J. Biol. Chem. 280:26200-26205 (2005)), 및 무렐라 서모아세티카 (상기에 기술됨) 등의 몇몇 다른 유기체들에 존재하는 천연적인 효소이다. 다른 예로, 아세테이트는 아세테이트 키나제와 포스포트랜스아세틸라제에 의해 활성되어 아세틸-CoA가 된다. 아세테이트 키나제는 ATP 분자를 이용하면서 먼저 아세테이트를 아세틸포스페이트로 변환시킨다. 아세틸-포스페이트와 CoA는 포스포트랜스아세틸라제에 의해 포스페이트 1분자를 방출하면서 아세틸-CoA로 변환된다. 아세테이트 키나제와 포스포트랜스아세틸라제는 모두 수종의 클로스트리듐 속 세균과 메타노사르시나 서모필라 (Methanosarcina thermophila)에서 잘 연구된 효소이다.
피루베이트를 아세틸-CoA로 변환하는 또 다른 방법은 피루베이트 옥시다제에 의한 것이다. 피루베이트 옥시다제는 유비퀴논을 전자 어셉터로서 사용하여 피루베이트를 아세테이트로 변환시킨다. E. coli에서, 이러한 활성은 poxB에 의해 코딩된다. PoxB는 사카로마이세스 세레비지애와 및 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis)의 피루베이트 데카르복실라제와 유사성을 가진다. 이 효소는 티아민 피로포스페이트 조인자 (Koland and Gennis, Biochemistry 21:4438-4442 (1982)); O'Brien et al., Biochemistry 16:3105-3109 (1977); O'Brien and Gennis, J. Biol. Chem. 255:3302-3307 (1980))와 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드 (FAD) 조인자를 가진다. 그런 후, 아세테이트는 전술된 바와 같이 아세틸-CoA 신테타제 또는 아세테이트 키나제 및 포스포트랜스아세틸라제에 의해 아세틸-CoA로 변환시킬 수 있다. 이들 효소들 중 일부는 아세틸-CoA에서 피루베이트로의 역반응을 촉매할 수도 있다.
NADH 또는 NADPH 형태의 환원 당량들을 이용하는 효소들의 경우, 환원된 페레독신으로부터 전자들을 전달함으로써 이들 환원된 전달체를 재생할 수 있다. 2가지 효소는, 전자를 환원된 페레독신으로부터 페레독신:NAD+ 옥시도리덕타제 (EC 1.18.1.3)와 페레독신:NADP+ 옥시도리덕타제 (FNR, EC 1.18.1.2)로 가역적으로 전달하는 과정을 촉매한다. 페레독신:NADP+ 옥시도리덕타제 (FNR, EC 1.18.1.2)는 NADPH에서 저-전위 어셉터, 예를 들어 페레독신 또는 플라보독신으로 전자를 가역적으로 전달하는 과정을 촉진하는, 비공유적으로 결합된 FAD 조인자를 가진다 (Blaschkowski et al., Eur. J. Biochem. 123:563-569 (1982); Fujii et al., 1977). HP1164 (fqrB)에 의해 코딩되는 헬리코박터 필로리의 FNR은, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 (PFOR)의 활성과 커플링되어 이어, 피루베이트-의존적으로 NADPH를 생산한다 (St et al. 2007). 유사한 효소는 캄필로박터 제주니에서도 확인된다 (St et al. 2007). 페레독신:NADP+ 옥시도리덕타제 효소는 E. coli 게놈에 fpr에 의해 코딩되어 있다 (Bianchi et al. 1993). 페레독신:NAD+ 옥시도리덕타제는 환원된 페레독신을 이용하여 NAD+로부터 NADH를 생성한다. E. Coli를 비롯하여, 몇몇 유기체들에서, 이 효소는 다기능성 다이옥시게나제 효소 복합체를 구성하는 한가지 성분이다. E. Coli의 페레독신:NAD+ 옥시도리덕타제는 hcaD에 의해 코딩되어 있으며, 방향족 산 이용에 참여하는 3-페닐프로피오네이트 다이옥시게나제 시스템의 한가지 성분이다 (Diaz et al. 1998). NADH:페레독신 리덕타제 활성은 하이드로게노박터 서모필러스 균주 TK-6의 세포 추출물에서 검출되었지만, 이러한 활성을 가진 유전자는 아직 밝혀지지 않았다 (Yoon et al. 2006). 마지막으로, 에너지-보존형 (energy-conserving) 막-관련 Rnf 타입의 단백질 (Seedorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:2128-2133 (2008); Herrmann et al., J. Bacteriol. 190:784-791 (2008))은 환원된 페레독신으로부터 NADH 또는 NADPH를 재생하기 위한 수단을 제공해준다. 다른 페레독신:NAD(P)+ 옥시도리덕타제들이 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7에서 보고되었다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
HP1164 NP_207955.1 15645778 헬리코박터 필로리
RPA3954 CAE29395.1 39650872 로도슈도모나스 팔루스트리스
fpr BAH29712.1 225320633 하이드로게노박터 서모필러스
yumC NP_391091.2 255767736 바실러스 섭틸러스
CJE0663 AAW35824.1 57167045 캄필로박터 제주니
fpr P28861.4 399486 에스케리키아 콜라이
hcaD AAC75595.1 1788892 에스케리키아 콜라이
LOC100282643 NP_001149023.1 226497434 지 메이스
RnfC EDK33306.1 146346770 클로스트리듐 클루이베리
RnfD EDK33307.1 146346771 클로스트리듐 클루이베리
RnfG EDK33308.1 146346772 클로스트리듐 클루이베리
RnfE EDK33309.1 146346773 클로스트리듐 클루이베리
RnfA EDK33310.1 146346774 클로스트리듐 클루이베리
RnfB EDK33311.1 146346775 클로스트리듐 클루이베리
CcarbDRAFT_2639 ZP_05392639.1 255525707 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_2638 ZP_05392638.1 255525706 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_2636 ZP_05392636.1 255525704 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_5060 ZP_05395060.1 255528241 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_2450 ZP_05392450.1 255525514 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_1084 ZP_05391084.1 255524124 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
페레독신은 환원 전위가 낮은 세포내 전자 전달체로 기능하는, 하나 이상의 철-황 클러스터를 함유한 소형 산성 단백질이다. 환원된 페레독신은 Fe-의존적인 효소, 예컨대 페레독신-NADP+ 옥시도리덕타제, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 (PFOR) 및 2-옥소글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제 (OFOR)에 전자를 제공한다. 하이드로게노박터 서모필러스 유전자인 fdx1은 각각 OFOR 및 PFOR에 의한 2-옥소글루타레이트 및 피루베이트의 가역적인 카르복시화에 필수적인 [4Fe-4S]-유형의 페레독신을 코딩한다 (Yamamoto et al., Extremophiles 14:79-85 (2010)). 설폴로부스 솔파타리쿠스 2-옥소산:페레독신 리덕타제와 조합된 페레독신은 단량체성 다이클러스터 [3Fe-4S][4Fe-4S] 타입의 페레독신이다 (Park et al. 2006). 이 단백질과 관련된 유전자는 아직 서열이 완전히 규명되지 않았지만, N-말단 도메인은 설폴로부스 액시도칼라리우스 유래 zfx 페레독신과 93%의 상동성을 공유한다. E. coli 게놈은 규명되지 않은 생리학적 기능을 가진 가용성 페레독신 fdx을 코딩하고 있다. 일부 증거에서는, 이러한 단백질이 철-황 클러스터 어셈블리에 기능할 수 있는 것으로 나타났다 (Takahashi and Nakamura, 1999). 추가적인 페레독신 단백질은 헬리코박터 필로리 (Mukhopadhyay et al. 2003)와 캄필로박터 제주니 (van Vliet et al. 2001)에서도 특정화되었다. 클로스트리윰 파스테리아눔 유래의 2Fe-2S 페레독신이 클로닝되었으며, E. coli에서 발현되었다 (Fujinaga and Meyer, Biochemical and Biophysical Research Communications, 192(3): (1993)). 초산생성균, 예를 들어 무렐라 서모아세티카, 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7 및 로도스피릴룸 루브룸 이 하기 표에 열거된 몇가지 페레독신을 코딩할 것으로 추측된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fdx1 BAE02673.1 68163284 하이드로게노박터 서모필러스
M11214.1 AAA83524.1 144806 클로스트리윰 파스테리아눔
Zfx AAY79867.1 68566938 설폴로부스 액시도칼라리우스
Fdx AAC75578.1 1788874 에스케리키아 콜라이
hp_0277 AAD07340.1 2313367 헬리코박터 필로리
fdxA CAL34484.1 112359698 캄필로박터 제주니
Moth_0061 ABC18400.1 83571848 무렐라 서모아세티카
Moth_1200 ABC19514.1 83572962 무렐라 서모아세티카
Moth_1888 ABC20188.1 83573636 무렐라 서모아세티카
Moth_2112 ABC20404.1 83573852 무렐라 서모아세티카
Moth_1037 ABC19351.1 83572799 무렐라 서모아세티카
CcarbDRAFT_4383 ZP_05394383.1 255527515 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_2958 ZP_05392958.1 255526034 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_2281 ZP_05392281.1 255525342 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_5296 ZP_05395295.1 255528511 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_1615 ZP_05391615.1 255524662 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_1304 ZP_05391304.1 255524347 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
cooF AAG29808.1 11095245 카르복시오테무스 하이드로게노포르만스
fdxN CAA35699.1 46143 로도박터 캡술라투스
Rru_A2264 ABC23064.1 83576513 로도스피릴룸 루브럼
Rru_A1916 ABC22716.1 83576165 로도스피릴룸 루브럼
Rru_A2026 ABC22826.1 83576275 로도스피릴룸 루브럼
cooF AAC45122.1 1498747 로도스피릴룸 루브럼
fdxN AAA26460.1 152605 로도스피릴룸 루브럼
Alvin_2884 ADC63789.1 288897953 알로크로마티움 비노섬 DSM 180
Fdx YP_002801146.1 226946073 아조토박터 비넬란디이 DJ
CKL_3790 YP_001397146.1 153956381 클로스트리듐 클루이베리 DSM 555
fer1 NP_949965.1 39937689 로도슈도모나스 팔루스트리스 CGA009
Fdx CAA12251.1 3724172 타우에라 아로마티카
CHY_2405　　 YP_361202.1 78044690 카르복시오테무스 하이드로게노포르만스
Fer YP_359966.1 78045103 카르복시오테무스 하이드로게노포르만스
Fer AAC83945.1 1146198 바실러스 섭틸러스
fdx1 NP_249053.1 15595559 슈도모나스 에어루지노사 PA01
yfhL AP_003148.1 89109368 에스케리키아 콜라이 K-12
숙시닐-CoA 트랜스퍼라제는 숙시닐-CoA의 숙시네이트로의 변환을 촉매하면서, CoA 모이어티를 CoA 어셉터 분자로 이동시킨다. 다수의 트랜스퍼라제들은 특이성이 넓으며, 특히 아세테이트, 숙시네이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 2-메틸아세토아세테이트, 3-케토헥사노에이트, 3-케토펜타노에이트, 발레레이트, 크로토네이트, 3-머캅토프로피오네이트, 프로피오네이트, 비닐아세테이트, 및 부티레이트와 같이 다양한 CoA 어셉터들을 이용할 수 있다.
숙시네이트에서 숙시닐-CoA로의 변환은 ATP 또는 GTP의 직접 소비하지 않는 트랜스퍼라제에 의해 수행된다. 이러한 타입의 반응은 다수의 유기체들에서 일반적이다. 숙시네이트에서 숙시닐-CoA로의 변환은 숙시닐-CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제에 의해서도 촉매할 수 있다. 클로스트리듐 클루이베리의 cat1 유전자 산물은 숙시닐-CoA: 아세틸-CoA 트랜스퍼라제 활성을 발휘하는 것으로 밝혀졌다 (Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996)). 또한, 이 활성은 트리코모나스 바기날리스 (Trichomonas vaginalis) (van Grinsven et al. 2008)와 트립아노소모 브루세이 (Trypanosoma brucei) (Riviere et al. 2004)에도 존재한다. 아세토박터 아세티 유래의, aarC에 의해 코딩되는 숙시닐-CoA:아세테이트 CoA-트랜스퍼라제는 변이된 TCA 사이클에서 숙시닐-CoA 신테타제를 대체한다 (Mullins et al. 2008). 유사한 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제 활성은 또한 트리코모나스 바기날리스 (van Grinsven et al. 2008), 트립파노소모 브루세이 (Riviere et al. 2004) 및 클로스트리듐 클루이베리 (Sohling and Gottschalk, 1996c)에도 존재한다. 슈도모나스 푸티타에 있는 pcaI 및 pcaJ에 의해 코딩되는 베타-케토아디페이트:숙시닐-CoA 트랜스퍼라제도 또 다른 후보체이다 (Kaschabek et al. 2002). 전술한 단백질들을 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
cat1 P38946.1 729048 클로스트리듐 클루이베리
TVAG_395550 XP_001330176 123975034 트리코모나스 바기날리스 G3
Tb11.02.0290 XP_828352 71754875 트리파노소마 브루세이
pcaI AAN69545.1 24985644 슈도모나스 푸티다
pcaJ NP_746082.1 26990657 슈도모나스 푸티다
aarC ACD85596.1 189233555 아세토박터 아세티
숙시네이트를 숙시닐-CoA로 변환하면서 3-케토아실-CoA를 3-케토산으로 변환하는 추가적인 트랜스퍼라제의 예는 숙시닐-CoA:3:케토산-CoA 트랜스퍼라제 (EC 2.8.3.5)이다. 숙시닐-CoA:3:케토산-CoA 트랜스퍼라제의 예는 헬리코박터 필로리 (Corthesy-Theulaz et al. 1997), 바실러스 섭틸리스, 및 호모 사피엔스 (Fukao et al. 2000; Tanaka et al. 2002)에도 존재한다. 전술한 단백질들을 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
HPAG1_0676 YP_627417 108563101 헬리코박터 필로리
HPAG1_0677 YP_627418 108563102 헬리코박터 필로리
ScoA NP_391778 16080950 바실러스 섭틸리스
ScoB NP_391777 16080949 바실러스 섭틸리스
OXCT1 NP_000427 4557817 호모 사피엔스
OXCT2 NP_071403 11545841 호모 사피엔스
숙시닐-CoA:3:케토산-CoA 트랜스퍼라제에 의해, 숙시네이트를 숙시닐-CoA로 변환하는 반응에는, 3-케토아실-CoA, 예를 들어 아세토아세틸-CoA를 아세토아세테이트와 같은 3-케토산으로 동시적으로 변환하는 과정이 필요하다. 3-케토산을 3-케토아실-CoA로 반대로 변환하는 과정은 아세토아세틸-CoA:아세테이트:CoA 트랜스퍼라제에 의해 촉매될 수 있다. 아세토아세틸-CoA:아세테이트:CoA 트랜스퍼라제는 아세토아세틸-CoA와 아세테이트를 아세토아세테이트 및 아세틸-CoA로, 또는 반대로도 변환한다. 효소의 예로는, E. coli의 atoAD (Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007), 클로스트리듐 아세토부틸리컴의 ctfAB (Jojima et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:1219-1224 (2008), 및 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴의 ctfAB (Kosaka et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)) 유전자 산물들이 있으며, 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
AtoA NP_416726.1 2492994 에스케리키아 콜라이
AtoD NP_416725.1 2492990 에스케리키아 콜라이
CtfA NP_149326.1 15004866 클로스트리듐 아세토부틸리컴
CtfB NP_149327.1 15004867 클로스트리듐 아세토부틸리컴
CtfA AAP42564.1 31075384 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴
CtfB AAP42565.1 31075385 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴
또 다른 가능성 있는 CoA 어셉터는 벤질숙시네이트이다. 숙시닐-CoA:(R)-벤질숙시네이트 CoA-트랜스퍼라제는 타우에라 아로마티카 등의 유기체에서 혐기적인 톨루엔 분해 경로의 일부분으로서 기능한다 (Leutwein and Heider, J. Bact. 183(14) 4288-4295 (2001)). 상동체는 아조아르쿠스 sp. T, 아로마톨레움 아로마티컴 (Aromatoleum aromaticum) EbN1 및 지오박터 메탈리레두센스 (Geobacter metallireducens) GS-15에서 확인할 수 있다. 전술한 단백질들은 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
bbsE AAF89840 9622535 타우에라 아로마티카
Bbsf AAF89841 9622536 타우에라 아로마티카
bbsE AAU45405.1 52421824 아조아르쿠스 sp. T
bbsF AAU45406.1 52421825 아조아르쿠스 sp. T
bbsE YP_158075.1 56476486 아로마톨레움 아로마티쿰 EbN1
bbsF YP_158074.1 56476485 아로마톨레움 아로마티쿰 EbN1
Gmet_1521 YP_384480.1 78222733 지오박터 메탈리레두센스 GS-15
Gmet_1522 YP_384481.1 78222734 지오박터 메탈리레두센스 GS-15
또한, ygfH는 E. coli에서 프로피오닐 CoA:숙시네이트 CoA 트랜스퍼라제를 코딩한다 (Haller et al., Biochemistry, 39(16) 4622-4629). 가까운 상동체는 예를 들어, 시트로박터 영에이 (Citrobacter youngae) ATCC 29220, 살모넬라 엔테리카 subsp. 아리조나 serovar, 및 예르시니아 인테르메디아 ATCC 29909에서 확인할 수 있다. 전술한 단백질들을 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
ygfH NP_417395.1 16130821 에스케리키아 콜라이 str. K-12 아종 MG1655
CIT292_04485 ZP_03838384.1 227334728 시트로박터 융게이 ATCC 29220
SARI_04582 YP_001573497.1 161506385 살모넬라 엔테리카 아종 아리조나 세로바
yinte0001_14430 ZP_04635364.1 238791727 예르시니아 인터메디아 ATCC 29909
시트레이트 리아제 (EC 4.1.3.6)는 일련의 반응들을 촉매하여, 시트레이트를 아세테이트와 옥살로아세테이트로 절단한다. 이 효소는 혐기성 조건에서 활성을 나타내며, 3개의 서브유닛, 즉 아실-운반체 단백질 (ACP, 감마), ACP 트랜스퍼라제 (알파), 및 아실 리아제 (베타)로 이루어져 있다. 효소의 활성화에는 아세틸-CoA와 구조적으로 비슷한 특이적 보결기, 2'-(5"-포스포리보실)-3-'-데포스포-CoA의 공유 결합과 아세틸화가 이용된다. 아실화는 CitC, 시트레이트 리아제 신테타제에 의해 촉매된다. 2종의 추가적인 단백질, 즉 CitG와 CitX를 이용하여 아포(apo) 효소를 활성형의 홀로(holo) 효소로 변환시킨다 (Schneider et al., Biochemistry 39:9438-9450 (2000)). 야생형 E. coli는 시트레이트 리아제 활성이 없지만, 몰리브덴 조인자 합성이 결핍된 변이체들은 활성형의 시트레이트 리아제를 가진다 (Clark, FEMS Microbiol. Lett. 55:245-249 (1990)). E. coli 효소는 citEFD에 의해 코딩되어 있으며, 시트레이트 리아제 신테타제는 citC에 의해 코딩되어 있다 (Nilekani and SivaRaman, Biochemistry 22:4657-4663 (1983)). 루코노스톡 메센테로이데스의 시트레이트 리아제가 클로닝 및 특정화되었으며, E. coli에서 발현되었다 (Bekal et al., J. Bacteriol. 180:647-654 (1998)). 시트레이트 리아제는, 또한, 시트레이트를 탄소원 및 에너지원으로 이용하는 장내세균, 예를 들어 살모넬라 티피무리움과 클렙시엘라 뉴모니애에서도 동정되었다 (Bott, Arch. Microbiol. 167: 78-88 (1997); Bott and Dimroth, Mol. Microbiol. 14:347-356 (1994)). 전술한 단백질들을 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
citF AAC73716.1 1786832 에스케리키아 콜라이
Cite AAC73717.2 87081764 에스케리키아 콜라이
citD AAC73718.1 1786834 에스케리키아 콜라이
citC AAC73719.2 87081765 에스케리키아 콜라이
citG AAC73714.1 1786830 에스케리키아 콜라이
citX AAC73715.1 1786831 에스케리키아 콜라이
citF CAA71633.1 2842397 루코노스톡 메센테로이데스
Cite CAA71632.1 2842396 루코노스톡 메센테로이데스
citD CAA71635.1 2842395 루코노스톡 메센테로이데스
citC CAA71636.1 3413797 루코노스톡 메센테로이데스
citG CAA71634.1 2842398 루코노스톡 메센테로이데스
citX CAA71634.1 2842398 루코노스톡 메센테로이데스
citF NP_459613.1 16763998 살모넬라 티피무리움
cite AAL19573.1 16419133 살모넬라 티피무리움
citD NP_459064.1 16763449 살모넬라 티피무리움
citC NP_459616.1 16764001 살모넬라 티피무리움
citG NP_459611.1 16763996 살모넬라 티피무리움
citX NP_459612.1 16763997 살모넬라 티피무리움
citF CAA56217.1 565619 클렙시엘라 뉴모니애
cite CAA56216.1 565618 클렙시엘라 뉴모니애
citD CAA56215.1 565617 클렙시엘라 뉴모니애
citC BAH66541.1 238774045 클렙시엘라 뉴모니애
citG CAA56218.1 565620 클렙시엘라 뉴모니애
citX AAL60463.1 18140907 클렙시엘라 뉴모니애
아세테이트 키나제 (EC 2.7.2.1)는 아세테이트를 아세틸포스페이트로 변환하는 가역적인 ATP-의존성 인산화 반응을 촉매한다. 아세테이트 키나제 효소의 예들이 E. coli, 클로스트리듐 아세토부틸리컴 및 메타노사르시나 서모필라 (Methanosarcina thermophila) 등의 다수의 유기체들에서 특정화되었다 (Ingram-Smith et al., J. Bacteriol. 187:2386-2394 (2005); Fox and Roseman, J. Biol. Chem. 261:13487-13497 (1986); Winzer et al., Microbioloy 143 (Pt 10):3279-3286 (1997)). 또한, 아세테이트 키나제 활성은 E. coli의 purT 유전자 산물에서도 확인되었다 (Marolewski et al., Biochemistry 33:2531-2537 (1994)). 일부 부티레이트 키나제 효소 (EC 2.7.2.7), 예를 들어 클로스트리듐 아세토부틸리컴 유래의 buk1 및 buk2 역시 기질로서 아세테이트를 받아들인다 (Hartmanis, M.G., J. Biol. Chem. 262:617-621 (1987)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
ackA NP_416799.1 16130231 에스케리키아 콜라이
Ack AAB18301.1 1491790 클로스트리듐 아세토부틸리컴
Ack AAA72042.1 349834 메타노사르시나 서모필라
purT AAC74919.1 1788155 에스케리키아 콜라이
buk1 NP_349675 15896326 클로스트리듐 아세토부틸리컴
buk2 Q97II1 20137415 클로스트리듐 아세토부틸리컴
아세틸포스페이트로부터 아세틸-CoA를 만드는 과정은 포스포트랜스아세틸라제 (EC 2.3.1.8)에 의해 촉매된다. E. coli 유래의 pta 유전자는 아세틸-CoA를 아세틸포스페이트로 가역적으로 변환하는 효소를 코딩한다 (Suzuki, T., Biochim. Biophys. Acta 191:559-569 (969)). 추가적인 아세틸트랜스퍼라제 효소들이 바실러스 섭틸러스 (Rado and Hoch, Biochim. Biophys. Acta 321:114-125 (1973), 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri) (Stadtman, E., Methods Enzymol. 1:5896-599 (1955), 및 서모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) (Bock et al., J. Bacteriol. 181:1861-1867 (1999))에서 특정화되었다. 이 반응은 클로스트리듐 아세토부틸리컴 유래의 ptb 유전자 산물을 비롯한 몇몇 포스포트랜스부티릴라제 효소들 (EC 2.3.1.19)에 의해서도 촉매된다 (Wiesenborn et al., App. Environ. Microbiol. 55:317-322 (1989); Walter et al., 유전자 134:107-111 (1993)). 추가적인 ptb 유전자들은 부티레이트-생산 박테리움 L2-50 (Louis et al., J. Bacteriol. 186:2099-2106 (2004)과 바실러스 메가테리움 (Vazquez et al., Curr. Microbiol. 42:345-349 (2001)에서도 확인된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
Pta NP_416800.1 71152910 에스케리키아 콜라이
Pta P39646 730415 바실러스 섭틸리스
Pta A5N801 146346896 클로스트리듐 클루이베리
Pta Q9X0L4 6685776 서모토가 마리티마
Ptb NP_349676 34540484 클로스트리듐 아세토부틸리컴
Ptb AAR19757.1 38425288 부티레이트 생산 박테리움 L2-50
Ptb CAC07932.1 10046659 바실러스 메가테리움
아세테이트를 아세틸-CoA로 아실화하는 반응은 아세틸-CoA 신테타제 활성을 가진 효소에 의해 촉매된다. 이 반응을 촉매하는 효소 2가지는 AMP를 형성하는 아세틸-CoA 신테타제 (EC 6.2.1.1)와 ADP를 형성하는 아세틸-CoA 신테타제 (EC 6.2.1.13)이다. AMP를 형성하는 아세틸-CoA 신테타제 (ACS)는 아세테이트를 아세틸-CoA로 활성화하는 주된 효소이다. ACS 효소의 예는 E. coli (Brown et al., J. Gen. Microbiol. 102:327-336 (1977)), 랄스토니아 유트로파 (Priefert and Steinbuchel, J. Bacteriol. 174:6590-6599 (1992)), 메타노서모박터 써마유토트로피쿠스 (Methanothermobacter thermautotrophicus) (Ingram-Smith and Smith, Archaea 2:95-107 (2007)), 살모넬라 엔테리카 (Gulick et al., Biochemistry 42:2866-2873 (2003)) 및 사카로마이세스 세레비지애 (Jogl and Tong, Biochemistry 43:1425-1431 (2004))에서 확인된다. ADP를 형성하는 아세틸-CoA 신테타제는 일반적으로 기질 범위가 넓은 가역적인 효소이다 (Musfeldt and Schonheit, J. Bacteriol. 184:636-644 (2002)). ADP를 형성하는 아세틸-CoA 신테타제에 대한 2종의 이소자임이, 아케오글로부스 풀기두스 게놈에 AF1211 및 AF1983로 코딩되어 있다 (Musfeldt and Schonheit, supra (2002)). 할로아르쿨라 마리스모르투이 유래 효소(숙시닐-CoA 신테타제로 주석됨)도 아세테이트를 기질로 수용하며, 이 효소의 가역성이 입증되었다 (Brasen and Schonheit, Arch. Microbiol. 182:277-287 (2004)). 초고온성 크레나르케온 피로바쿨럼 에어로필룸 유래의 PAE3250에 의해 코딩되는 ACD는 특정화된 모든 ACD 중에서도 기질 범위가 가장 넓으며, 아세테이트, 이소부티릴-CoA (선호 기질임) 및 페닐아세틸-CoA와 반응한다 (Brasen and Schonheit, supra (2004)). 방향 진화 또는 조작을 적용하여, 이 효소가 숙주 유기체의 생리 온도에서 작동하도록 변형시킬 수 있다. 아케오글로부스 풀기두스, 할로마르쿨라 마리스모르투이 및 피로바쿨럼 에어로필룸으로부터 효소들이 모두 클로닝되었으며, 기능적으로 발현시켜, E. coli에서 특정화되었다 (Brasen and Schonheit, supra (2004); Musfeldt and Schonheit, supra (2002)). 추가적인 후보 효소로는 E. coli의 sucCD에 의해 코딩되는 숙시닐-CoA 신테타제 (Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985))와 슈도모나스 푸티타의 아실-CoA 리가제 (Fernandez-Valverde et al., Appl. Environ. Microbiol. 59:1149-1154 (1993))가 있다. 전술한 단백질들을 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
acs AAC77039.1 1790505 에스케리키아 콜라이
acoE AAA21945.1 141890 랄스토니아 유트로파
acs1 ABC87079.1 86169671 메타노서모박터 서마우토트로피쿠스
acs1 AAL23099.1 16422835 살모넬라 엔테리카
ACS1 Q01574.2 257050994 사카로마이세스 세레비지애
AF1211 NP_070039.1 11498810 아르카에오글로부스 풀기두스
AF1983 NP_070807.1 11499565 아르카에오글로부스 풀기두스
scs YP_135572.1 55377722 할로아르쿨라 마리스모라투이
PAE3250 NP_560604.1 18313937 피로바쿨룸 에어로필룸 str. IM2
sucC NP_415256.1 16128703 에스케리키아 콜라이
sucD AAC73823.1 1786949 에스케리키아 콜라이
paaF AAC24333.2 22711873 슈도모나스 푸티다
2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 1,3-부탄디올 또는 3-부텐-1-올 등의 환원된 발효 산물을 합성하는 미생물 세포의 기질의 C-mol 당 생산 수율은 탄수화물 공급 원료내 부족한 환원 당량에 의해 제한된다. 환원 당량 또는 전자는, 합성 가스 성분들로부터, 예를 들어 CO 및 H2로부터, 각각 일산화탄소 데하이드로게나제 (CODH) 및 하이드로게나제를 이용하여 추출할 수 있다. 그런 후, 환원 당량을 어셉터, 예컨대 산화된 페레독신, 산화된 퀴논, 산화된 시토크롬, NAD(P)+, 물, 또는 과산화수소에 패스하여, 환원된 페레독신, 환원된 퀴논, 환원된 시토크롬, NAD(P)H, H2, 또는 물을 각각 제조한다. 환원된 페레독신과 NAD(P)H는 다양한 Wood-Ljungdahl 경로와 환원성 TCA 사이클 효소들에게 레독스 캐리어로서 사용할 수 있어, 특히 유용하다.
여기에서, O 및 H2로부터의 추가적인 레독스 이용가능성은 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 1,3-부탄디올 또는 3-부텐-1-올 등의 환원된 산물의 수율을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 합성가스를 당 기반의 공급원료나 다른 탄소 기질과 조합하는 조합 공급원료 전략은 이론적인 수율을 크게 개선시킬 수 있다. 이러한 공동-공급 방식에서는, 합성가스 성분 H2와 CO를 하이드로게나제 및 CO 데하이드로게나제에 의해 활용하여, 당 또는 기타 탄소 기질로부터 유래된 탄소가 최대로 보존되고 이론적인 수율이 개선된 화학적 생산 경로에 동력을 제공할 수 있는 환원 당량을 만들어 낼 수 있다. 이러한 개선은 환경적 및 경제적 이점을 제공하며, 지속가능한 화합물 생산을 크게 강화한다.
이하, 합성가스 성분들로부터 레독스 (redox)를 추출하기 위해 사용되는 효소들과 상응하는 유전자들을 본원에서 기술한다. CODH는 전자의 소비 또는 획득으로 CO와 CO2 간의 상호 변환을 촉매하는 가역적인 효소이다. ACS/CODH 복합체에서 CODH의 천연적인 생리학적 역할은, 아세틸-CoA 신타제에 의해 아세틸-CoA에 병합하기 위해 CO2를 CO로 변환하는 것이다. 그럼에도 불구하고, 이들 효소의 가역적인 특성으로 인해 이러한 CODH 효소들은 CO로부터 환원 당량들을 추출하는데 적합하다. ACS 부재 하에 CODH 효소들을 발현시키면 이의 천연적인 생리학적 역할과는 반대 방향에서 작용하게 될 수 있다 (즉, CO 산화).
무렐라 서모아세티카, 카르복시오테무스 하이드로게노포르만스, 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7, 및 여러 기타 유기체들에서는, 추가적인 CODH 코딩 유전자들이 ACS/CODH 오페론 바깥쪽에 위치한다. 이들 효소는 일산화탄소를 이산화탄소로의 변환함으로써 전자 (또는 환원 당량)을 추출하는 수단을 제공한다. 무렐라 서모아세티카 유전자 (유전자은행 등재 번호: YP_430813)는 자체적으로 오페론에서 발현되며, "핑-퐁" 반응에서 전자를 CO에서 페레독신과 같은 외부 매개체로 전달하는 것으로 보인다. 환원된 매개체는 이후 다른 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트 (NAD(P)H) 운반체 또는 페레독신-의존적인 세포 프로세스와 커플링된다 (Ragsdale, Annals of the New York Academy of Sciences 1125: 129-136 (2008)). 카르복시오테무스 하이드로게노포르만스 CODH-II 및 인접 단백질인 CooF를 코딩하는 유전자들은 클로닝되었으며, 서열도 규명되었다 (Gonzalez and Robb, FEMS Microbiol Lett. 191:243-247 (2000)). CODH-II의 세포질 분획이 동화작용을 시시하는 NADPH 형성을 촉매하는 것으로 확인되었지만, 형성되는 복합체는 막-결합형이었다 (Svetlitchnyi et al., J Bacteriol. 183:5134-5144 (2001)). CODH-II의 결정 구조도 이용가능하다 (Dobbek et al., Science 293:1281-1285 (2001)). 유사한 ACS-프리 CODH 효소는, 지오박터 메탈리레두센스 GS-15, 클로로비움 페어오박테로이데스 DSM 266, 클로스트리듐 셀룰로라이티컴 H10, 데설포비브리오 데설푸리칸스 아종 데설푸리칸스 str. ATCC 27774, 펠로박터 카르비놀리쿠스 DSM 2380, 및 캄필로박터 쿠르부스 525.92를 포함한 다양한 유기체에서 발견할 수 있다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
CODH (추정) YP_430813 83590804 무렐라 서모아세티카
CODH-II (CooS-II) YP_358957 78044574 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CooF YP_358958 78045112 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CODH (putative) ZP_05390164.1 255523193 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_0341 ZP_05390341.1 255523371 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_1756 ZP_05391756.1 255524806 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CcarbDRAFT_2944 ZP_05392944.1 255526020 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7
CODH YP_384856.1 78223109 지오박터 메탈리레두센스 GS-15
Cpha266_0148 (cytochrome c) YP_910642.1 119355998 클로로비움 페어오박테로이데스 DSM 266
Cpha266_0149
(CODH) 		YP_910643.1 119355999 클로로비움 페어오박테로이데스 DSM 266
Ccel_0438 YP_002504800.1 220927891 클로스트리듐 셀룰롤리티쿰 H10
Ddes_0382
(CODH) 		YP_002478973.1 220903661 데설포비브리오 데설푸리칸스 아종 데설푸리칸스 str. ATCC 27774
Ddes_0381 (CooC) YP_002478972.1 220903660 데설포비브리오 데설푸리칸스 아종 데설푸리칸스 str. ATCC 27774
Pcar_0057
(CODH) 		YP_355490.1 7791767 펠로박터 카르비놀리쿠스 DSM 2380
Pcar_0058
(CooC) 		YP_355491.1 7791766 펠로박터 카르비놀리쿠스 DSM 2380
Pcar_0058
(HypA) 		YP_355492.1 7791765 펠로박터 카르비놀리쿠스 DSM 2380
CooS (CODH) YP_001407343.1 154175407 캄필로박터 curvus 525.92
일부 경우에서, 하이드로게나제 코딩 유전자는 CODH에 인접해 위치되어 있다. 로도스피릴룸 루브룸의 경우, 코딩된 CODH/하이드로게나제 단백질이 막-결합형 효소 복합체를 형성하는데, 이 복합체가 CO 및 H2O에서 CO2 및 H2로의 변환으로부터 양성자 구배 형태의 에너지가 생성되는 부위인 것으로 알려졌다 (Fox et al., J Bacteriol. 178:6200-6208 (1996)). 카르복시오테무스 하이드로게노포르만스의 CODH-I과 인접 유전자들은 로도스피릴룸 루브룸 CODH/하이드로게나제 유전자 클러스터와의 유사성을 근거로, 유사한 기능적인 역할을 촉매하는 것으로 제안되었다 (Wu et al., PLoS Genet. 1:e65 (2005)). 카르복시오테무스 하이드로게노포르만스 CODH-I는 또한 전극에 연결시켰 때 상당한 CO 산화와 CO2 환원 활성을 발휘하는 것으로 확인되었다 (Parkin et al., J Am.Chem.Soc. 129:10328-10329 (2007)). 예시적 CODH와 하이드로게나제 유전자의 단백질 서열들을 아래 유전자은행 등재 번호들로 식별할 수 있다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
CODH-I (CooS-I) YP_360644 78043418 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CooF YP_360645 78044791 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
HypA YP_360646 78044340 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CooH YP_360647 78043871 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CooU YP_360648 78044023 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CooX YP_360649 78043124 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CooL YP_360650 78043938 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CooK YP_360651 78044700 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CooM YP_360652 78043942 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CooC YP_360654.1 78043296 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CooA-1 YP_360655.1 78044021 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스
CooL AAC45118 1515468 로도스피릴룸 루브룸
CooX AAC45119 1515469 로도스피릴룸 루브룸
CooU AAC45120 1515470 로도스피릴룸 루브룸
CooH AAC45121 1498746 로도스피릴룸 루브룸
CooF AAC45122 1498747 로도스피릴룸 루브룸
CODH (CooS) AAC45123 1498748 로도스피릴룸 루브룸
CooC AAC45124 1498749 로도스피릴룸 루브룸
CooT AAC45125 1498750 로도스피릴룸 루브룸
CooJ AAC45126 1498751 로도스피릴룸 루브룸
천연적으로 E. coli 및 기타 장내세균은 최대 하이드로게나제 4개를 코딩하는 복수의 유전자들이 존재한다 (Sawers, G., Antonie Van Leeuwenhoek 66:57-88 (1994); Sawers et al., J Bacteriol. 164:1324-1331 (1985); Sawers and Boxer, Eur.J Biochem. 156:265-275 (1986); Sawers et al., J Bacteriol. 168:398-404 (1986)). 효소 활성들의 다중도를 감안하면, E. coli 또는 기타 숙주 유기체는 들어오는 분자 수소를 분열시켜 해당 어셉터를 환원시키는 충분한 하이드로게나제 활성을 제공할 수 있다. E. coli 는 각각 hyaABCDEF 및 hybOABCDEFG 유전자 클러스터에 의해 코딩되는 두 종의 흡수 하이드로게나제, 즉, Hyd-1과 Hyd-2를 가진다 (Lukey et al., How E. coli is equipped to oxidize hydrogen under different redox conditions, J Biol Chem published online Nov 16, 2009). Hyd-1은 내산소성이며, 비가역적이며, hyaC 시토크롬을 통해 퀴논 환원과 커플링되어 있다. Hyd-2는 O2에 민감하고, 가역적이며, 전자를 주변세포질 공간에 존재하는 페레독신 hybA 로 전달하며, 이것은 다시 hybB 내재 막단백질을 경유하여 퀴논을 환원시킨다. 환원된 퀴논은 TCA 사이클의 환원성 분지(reductive branch)에서 푸마레이트 리덕타제에 대한 전자 소스로서 제공할 수 있다. 환원된 페레독신들은 NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제들 등의 효소에 의해 사용되어, NADPH 또는 NADH를 만들어낼 수 있다. 이것은 다른 예로는 피루베이트 페레독신 옥시도리덕타제, AKG 페레독신 옥시도리덕타제, 및 5,10-메틸렌-H4 폴레이트 리덕타제 등의 반응의 전자 공여체로서 사용될 수 있다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
HyaA AAC74057.1 1787206 에스케리키아 콜라이
HyaB AAC74058.1 1787207 에스케리키아 콜라이
HyaC AAC74059.1 1787208 에스케리키아 콜라이
HyaD AAC74060.1 1787209 에스케리키아 콜라이
HyaE AAC74061.1 1787210 에스케리키아 콜라이
HyaF AAC74062.1 1787211 에스케리키아 콜라이
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
HybO AAC76033.1 1789371 에스케리키아 콜라이
HybA AAC76032.1 1789370 에스케리키아 콜라이
HybB AAC76031.1 2367183 에스케리키아 콜라이
HybC AAC76030.1 1789368 에스케리키아 콜라이
HybD AAC76029.1 1789367 에스케리키아 콜라이
HybE AAC76028.1 1789366 에스케리키아 콜라이
HybF AAC76027.1 1789365 에스케리키아 콜라이
HybG AAC76026.1 1789364 에스케리키아 콜라이
E. coli의 수소-리아제 시스템은 페레독신을 어셉터로서 이용하는 막-결합형 효소 복합체인 하이드로게나제 3와 페레독신 어셉터를 또한 이용하는 하이드로게나제 4를 포함한다. 하이드로게나제 3 및 4는 각각 hyc 및 hyf 유전자 클러스터에 의해 코딩된다. 하이드로게나제 3는 가역적인 효소로 밝혀졌다 (Maeda et al., Appl Microbiol Biotechnol 76(5):1035-42 (2007)). E. coli에서 하이드로게나제 활성은 또한 hyp 유전자의 발견에 의존적인데, 이 유전자에 상응하는 단백질이 하이드로게나제 복합체의 조립에 관여한다 (Jacobi et al., Arch.Microbiol 158:444-451 (1992); Rangarajan et al., J. Bacteriol . 190:1447-1458 (2008)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
HycA NP_417205 16130632 에스케리키아 콜라이
HycB NP_417204 16130631 에스케리키아 콜라이
HycC NP_417203 16130630 에스케리키아 콜라이
HycD NP_417202 16130629 에스케리키아 콜라이
HycE NP_417201 16130628 에스케리키아 콜라이
HycF NP_417200 16130627 에스케리키아 콜라이
HycG NP_417199 16130626 에스케리키아 콜라이
HycH NP_417198 16130625 에스케리키아 콜라이
HycI NP_417197 16130624 에스케리키아 콜라이
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
HyfA NP_416976 90111444 에스케리키아 콜라이
HyfB NP_416977 16130407 에스케리키아 콜라이
HyfC NP_416978 90111445 에스케리키아 콜라이
HyfD NP_416979 16130409 에스케리키아 콜라이
HyfE NP_416980 16130410 에스케리키아 콜라이
HyfF NP_416981 16130411 에스케리키아 콜라이
HyfG NP_416982 16130412 에스케리키아 콜라이
HyfH NP_416983 16130413 에스케리키아 콜라이
HyfI NP_416984 16130414 에스케리키아 콜라이
HyfJ NP_416985 90111446 에스케리키아 콜라이
HyfR NP_416986 90111447 에스케리키아 콜라이
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
HypA NP_417206 16130633 에스케리키아 콜라이
HypB NP_417207 16130634 에스케리키아 콜라이
HypC NP_417208 16130635 에스케리키아 콜라이
HypD NP_417209 16130636 에스케리키아 콜라이
HypE NP_417210 226524740 에스케리키아 콜라이
HypF NP_417192 16130619 에스케리키아 콜라이
무렐라 서모아세티카의 하이드로게나제는 충분한 내인성 하이드로게나제 활성이 결핍된 숙주에게 적합하다. 무렐라 서모아세티카는 CO2를 유일한 탄소원으로 사용하여 생장하는데, 이는 환원 당량을 H2로부터 추출하여 Wood-Ljungdahl 경로를 통해 아세틸-CoA를 합성할 수 있다는 것을 의미한다 (Drake, H. L., J. Bacteriol. 150:702-709 (1982); Drake and Daniel, Res. Microbiol. 155:869-883 (2004); Kellum and Drake, J. Bacteriol. 160:466-469 (1984)) (참조 도 7). 무렐라 서모아세티카는 E. coli 유래의 몇가지 hyp, hyc 및 hyf 유전자들과 상동성을 가진다. 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질 서열들은 하기 유전자은행 등재 번호로 식별된다
E. coli의 hyp 유전자와 상동적인 무렐라 서모아세티카 단백질들을 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
Moth_2175 YP_431007 83590998 무렐라 서모아세티카
Moth_2176 YP_431008 83590999 무렐라 서모아세티카
Moth_2177 YP_431009 83591000 무렐라 서모아세티카
Moth_2178 YP_431010 83591001 무렐라 서모아세티카
Moth_2179 YP_431011 83591002 무렐라 서모아세티카
Moth_2180 YP_431012 83591003 무렐라 서모아세티카
Moth_2181 YP_431013 83591004 무렐라 서모아세티카
E. coli 하이드로게나제 3 및/또는 4 단백질과 상동적인 무렐라 서모아세티카 단백질들을 아래 표에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
Moth_2182 YP_431014 83591005 무렐라 서모아세티카
Moth_2183 YP_431015 83591006 무렐라 서모아세티카
Moth_2184 YP_431016 83591007 무렐라 서모아세티카
Moth_2185 YP_431017 83591008 무렐라 서모아세티카
Moth_2186 YP_431018 83591009 무렐라 서모아세티카
Moth_2187 YP_431019 83591010 무렐라 서모아세티카
Moth_2188 YP_431020 83591011 무렐라 서모아세티카
Moth_2189 YP_431021 83591012 무렐라 서모아세티카
Moth_2190 YP_431022 83591013 무렐라 서모아세티카
Moth_2191 YP_431023 83591014 무렐라 서모아세티카
Moth_2192 YP_431024 83591015 무렐라 서모아세티카
또한, 하이드로게나제 기능을 코딩하는 몇몇 유전자 클러스터들이 무렐라 서모아세티카에 존재하며, 이의 해당 단백질 서열들을 아래에 나타낸다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
Moth_0439 YP_429313 83589304 무렐라 서모아세티카
Moth_0440 YP_429314 83589305 무렐라 서모아세티카
Moth_0441 YP_429315 83589306 무렐라 서모아세티카
Moth_0442 YP_429316 83589307 무렐라 서모아세티카
Moth_0809 YP_429670 83589661 무렐라 서모아세티카
Moth_0810 YP_429671 83589662 무렐라 서모아세티카
Moth_0811 YP_429672 83589663 무렐라 서모아세티카
Moth_0812 YP_429673 83589664 무렐라 서모아세티카
Moth_0814 YP_429674 83589665 무렐라 서모아세티카
Moth_0815 YP_429675 83589666 무렐라 서모아세티카
Moth_0816 YP_429676 83589667 무렐라 서모아세티카
Moth_1193 YP_430050 83590041 무렐라 서모아세티카
Moth_1194 YP_430051 83590042 무렐라 서모아세티카
Moth_1195 YP_430052 83590043 무렐라 서모아세티카
Moth_1196 YP_430053 83590044 무렐라 서모아세티카
Moth_1717 YP_430562 83590553 무렐라 서모아세티카
Moth_1718 YP_430563 83590554 무렐라 서모아세티카
Moth_1719 YP_430564 83590555 무렐라 서모아세티카
Moth_1883 YP_430726 83590717 무렐라 서모아세티카
Moth_1884 YP_430727 83590718 무렐라 서모아세티카
Moth_1885 YP_430728 83590719 무렐라 서모아세티카
Moth_1886 YP_430729 83590720 무렐라 서모아세티카
Moth_1887 YP_430730 83590721 무렐라 서모아세티카
Moth_1888 YP_430731 83590722 무렐라 서모아세티카
Moth_1452 YP_430305 83590296 무렐라 서모아세티카
Moth_1453 YP_430306 83590297 무렐라 서모아세티카
Moth_1454 YP_430307 83590298 무렐라 서모아세티카
랄스토니아 유트로파 H16은 최종 전자 어셉터로서 산소를 가지고 수소를 에너지원으로 이용한다. 이것의 막-결합형 흡수 [NiFe]-하이드로게나제는 "O2-허용성" 하이드로게나제이며 (Cracknell, et al. Proc Nat Acad Sci, 106(49) 20681-20686 (2009)), 주변세포질 공간에 위치하며 b 타입의 시토크롬을 통해 호흡사슬과 연결되어 있다 (Schink and Schlegel, Biochim. Biophys. Acta, 567, 315-324 (1979); Bernhard et al., Eur. J. Biochem. 248, 179-186 (1997)). 또한, 랄스토니아 유트로파는 Hox 오페론에 의해 코딩되는 O2-허용성의 가용성 하이드로게나제를 가지고 있며, 이 효소는 세포질에 존재하며, 수소를 소비하여 직접 NAD+를 환원시킨다 (Schneider and Schlegel, Biochim. Biophys. Acta 452, 66-80 (1976); Burgdorf, J. Bact. 187(9) 3122-3132(2005)). 가용성 하이드로게나제 효소는 지오박터 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens) (Coppi, Microbiology 151, 1239-1254 (2005)), 시네코사이스티스 str. PCC 6803 (Germer, J. Biol. Chem., 284(52), 36462-36472 (2009)), 및 티오캅사 로세오페르시키나 (Rakhely, Appl. Environ. Microbiol. 70(2) 722-728 (2004)) 등의 수종의 다른 유기체들에도 또한 존재한다. 시네코사이스티스 효소는 수소로부터 NADPH를 생성할 수 있다. 시네코사이스티스 str. PCC 6803 유래의 Hox 오페론 및 노스톡 sp. PCC 7120 유래의 Hyp 오페론에 의해 코딩되는 부속 유전자를 둘다 과다발현시키는 경우, Hox 유전자를 단독 발현한 경우에 비해 하이드로게나제 활성이 증가된다 (Germer, J. Biol. Chem. 284(52), 36462-36472 (2009)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
HoxF NP_942727.1 38637753 랄스토니아 유트로파 H16
HoxU NP_942728.1 38637754 랄스토니아 유트로파 H16
HoxY NP_942729.1 38637755 랄스토니아 유트로파 H16
HoxH NP_942730.1 38637756 랄스토니아 유트로파 H16
HoxW NP_942731.1 38637757 랄스토니아 유트로파 H16
HoxI NP_942732.1 38637758 랄스토니아 유트로파 H16
HoxE NP_953767.1 39997816 지오박터 설푸레두센스
HoxF NP_953766.1 39997815 지오박터 설푸레두센스
HoxU NP_953765.1 39997814 지오박터 설푸레두센스
HoxY NP_953764.1 39997813 지오박터 설푸레두센스
HoxH NP_953763.1 39997812 지오박터 설푸레두센스
GSU2717 NP_953762.1 39997811 지오박터 설푸레두센스
HoxE NP_441418.1 16330690 시네코시스티스 str. PCC 6803
HoxF NP_441417.1 16330689 시네코시스티스 str. PCC 6803
기능 불명 NP_441416.1 16330688 시네코시스티스 str. PCC 6803
HoxU NP_441415.1 16330687 시네코시스티스 str. PCC 6803
HoxY NP_441414.1 16330686 시네코시스티스 str. PCC 6803
기능 불명 NP_441413.1 16330685 시네코시스티스 str. PCC 6803
기능 불명 NP_441412.1 16330684 시네코시스티스 str. PCC 6803
HoxH NP_441411.1 16330683 시네코시스티스 str. PCC 6803
HypF NP_484737.1 17228189 노스톡 sp. PCC 7120
HypC NP_484738.1 17228190 노스톡 sp. PCC 7120
HypD NP_484739.1 17228191 노스톡 sp. PCC 7120
기능 불명 NP_484740.1 17228192 노스톡 sp. PCC 7120
HypE NP_484741.1 17228193 노스톡 sp. PCC 7120
HypA NP_484742.1 17228194 노스톡 sp. PCC 7120
HypB NP_484743.1 17228195 노스톡 sp. PCC 7120
Hox1E AAP50519.1 37787351 티오캅사 로세오퍼시시나
Hox1F AAP50520.1 37787352 티오캅사 로세오퍼시시나
Hox1U AAP50521.1 37787353 티오캅사 로세오퍼시시나
Hox1Y AAP50522.1 37787354 티오캅사 로세오퍼시시나
Hox1H AAP50523.1 37787355 티오캅사 로세오퍼시시나
TCA 사이클의 중간산물인 옥살로아세테이트 또는 말레이트를 제조하기 위해, 피루베이트 또는 포스포에놀피루베이트에 이산화탄소를 고정하는데 사용되는 몇가지 효소들과 대응되는 유전자들을 아래에 기술한다.
포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 카르복시화는 포스포에놀피루베이트 카르복실라제에 의해 촉매된다. 예시적 PEP 카르복실라제 효소는 E. coli의 ppc (Kai et al., Arch. Biochem. Biophys. 414:170-179 (2003), 메틸로박테리움 엑토르?스 AM1 의 ppcA (Arps et al., J. Bacteriol. 175:3776-3783 (1993), 및 코리네박테리움 글루타미컴의 ppc (Eikmanns et al., Mol. Gen. Genet. 218:330-339 (1989)에 의해 코딩된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
Ppc NP_418391 16131794 에스케리키아 콜라이
ppcA AAB58883 28572162 메틸로박테리움 엑스토르?스
Ppc ABB53270 80973080 코리네박테리움 글루타미컴
포스포에놀피루베이트를 옥살로아세테이트로 변환하는 다른 효소는 PEP 카르복시키나제이며, 이 효소는 ATP를 생성하면서 PEP를 카르복시화한다. 대부분의 유기체에서는, PEP 카르복시키나제가 글루코스 생성 기능을 제공하며, ATP 1개를 소비하면서 옥살로아세테이트를 PEP로 변환한다. 사카로마이세스 세레비지애는 이러한 유기체 중 하나이며, 이의 천연적인 PEP 카르복시키나제인 PCK1가 글로코스 생성 역할을 제공한다 (Valdes-Hevia et al., FEBS Lett. 258:313-316 (1989)). E. coli도 이러한 유기체들 중 하나이며, 옥살로아세테이트를 생성하는 PEP 카르복시키나제 역할은, 아마도 중탄산염에 대한 PEP 카르복시키나제의 Km 값이 더 높아, PEP 카르복실라제에 비해 미미한 것으로 생각된다 (Kim et al., Appl. Environ. Microbiol. 70:1238-1241 (2004)). 그럼에도 불구하고, 천연적인 E. coli PEP 카르복시키나제가 PEP를 옥살로아세테이트로 변환하는 활성이 최근 E. coli K-12 ppc 변이체들에서 확인되었다 (Kwon et al., J. Microbiol. Biotechnol. 16:1448-1452 (2006)). 이들 균주는 성장 결함을 나타내지 않았으며, NaHCO3 고 농도에서 숙시네이트 생산이 증가되었다. E. coli 변이 균주는 적응 진화를 통해 Pck를 주요 CO2-고정 효소로서 적응할 수 있다 (Zhang et al. 2009). 일부 유기체의 경우, 특히 반추위 박테리아의 경우, PEP 카르복시키나제가 PEP로부터 옥살로아세테이트를 생산하고 ATP를 발생시키는데 아주 효과적이다. E. coli에 클로닝된 PEP 카르복시키나제 유전자의 예로는 만하이미아 숙시니시프로두센스 (Mannheimia succiniciproducens) (Lee et al., Biotechnol. Bioprocess Eng. 7:95-99 (2002)), 안에어로비오스피릴룸 숙시니시프로두센스 (Anaerobiospirillum succiniciproducens) (Laivenieks et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:2273-2280 (1997), 및 액티노바실러스 숙시노게네스 (Actinobacillus succinogenes) (Kim et al. supra)로부터 유래된 유전자를 포함한다. 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)에 의해 코딩되는 PEP 카르복시키나제 효소는 PEP로부터 옥살로아세테이트를 제조하는데 유효하다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
PCK1 NP_013023 6322950 사카로마이세스 세레비지애
pck NP_417862.1 16131280 에스케리키아 콜라이
pckA YP_089485.1 52426348 만하이미아 숙시니시프로두센스
pckA O09460.1 3122621 안에어로바이오스피릴룸 숙시니시프로두센스
pckA Q6W6X5 75440571 액티노바실러스 숙시노게네스
pckA P43923.1 1172573 헤모필러스 인플루엔자
피루베이트 카르복실라제 (EC 6.4.1.1)는 ATP 1개를 소비하면서 피루베이트를 옥살로아세테이트로 직접 변환한다. 피루베이트 카르복실라제 효소는 사카로마이세스 세레비지애의 PYC1 (Walker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:1210-1217 (1991))과 PYC2 (Walker et al., supra), 및 미코박테리움 스메그마티스의 pyc (Mukhopadhyay and Purwantini, Biochim. Biophys. Acta 1475:191-206 (2000))에 의해 코딩된다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
PYC1 NP_011453 6321376 사카로마이세스 세레비지애
PYC2 NP_009777 6319695 사카로마이세스 세레비지애
Pyc YP_890857.1 118470447 미코박테리움 스메그마티스
말릭 효소 (malic enzyme)는 환원 당량 1개를 소비하면서 CO2와 피루베이트를 말레이트로 변환하는데 이용할 수 있다. 이러한 목적의 말릭 효소로는, 비제한적인 예로, 말릭 효소 (NAD-의존형) 및 말릭 효소 (NADP-의존형)이 있다. 예를 들어, E. coli 말릭 효소들 중 한가지 효소 (Takeo, J. Biochem. 66:379-387 (1969)) 또는 활성이 보다 높은 유사 효소를 발현시켜, 피루베이트와 CO2를 말레이트로 변환할 수 있다. 말릭 효소는, PEP와는 반대로 탄소를 피루베이트에 고정함으로써, PEP의 고-에너지 포스페이트 결합을 피루베이트 키나제에 의해 보존시킬 수 있으며, 그에 따라 ATP가 피루베이트 형성시 또는 글루코스 수송을 위한 포스포트랜스퍼라제 시스템에 의해 발생된다. 말릭 효소는 전형적으로 말레이트로부터 피루베이트를 만드는 방향으로 작동하는 것으로 추측되지만, maeA에 코딩된 NAD-의존적인 효소의 과다발현을 통해 E. coli에서 숙시네이트 생산을 증가시키고 동시에 탄소-고정 방향으로 작동함으로써 혐기성 조건에서 치사상 Dpfl-DldhA 표현형을 복원하는 것으로 밝혀졌다 (Stols and Donnelly, Appl. Environ. Microbiol. 63(7) 2695-2701 (1997)). E. coli에서 아스카리스 수움 (Ascaris suum) 유래 말릭 효소를 과다발현시켰을 때, 비슷한 현상이 관찰되었다 (Stols et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65(1), 153-158 (1997)). maeB에 의해 코딩되는 2번째 E. coli 말릭 효소는 NADP-의존적이며, 옥살로아세테이트와 기타 알파-케토산을 또한 탈카르복시화한다 (Iwakura et al., J. Biochem. 85(5):1355-65 (1979)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
maeA NP_415996 90111281 에스케리키아 콜라이
maeB NP_416958 16130388 에스케리키아 콜라이
NAD-ME P27443 126732 아스카리스 숨
TCA 사이클의 환원성 분지를 통해 옥살로아세테이트 (예를 들어, PEP 카르복실라제, PEP 카르복시키나제, 또는 피루베이트 카르복실라제로부터 형성됨) 또는 말레이트 (예를 들어, 말릭 효소 또는 말레이트 데하이드로게나제로부터 형성됨)를 숙시닐-CoA로 변환하기 위해 사용되는 효소들로는, 말레이트 데하이드로게나제, 푸마레이트 데하이드라타제 (푸마라제), 푸마레이트 리덕타제, 및 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제가 있다. 이들 각각의 효소들에 대한 유전자들은 전술한 바와 같이 본원에 기술되어 있다.
숙시닐-CoA로부터 다양한 산물을 제조하는 경로를 미생물에 조작하기 위한 효소, 유전자 및 방법들이 현재 당해 기술 분야에 공지되어 있다. CO 및/또는 H2로부터 획득되는 추가적인 환원 당량은, 본원에 기술된 바와 같이, 탄수화물-기재의 공급원료를 활용하는 경우, 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 1,3-부탄디올 또는 3-부텐-1-올의 수율을 향상시킨다.
당분해 중간산물로부터 다양한 산물을 제조하는 경로를 미생물에 조작하기 위한 효소, 유전자 및 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. CO 및/또는 H2로부터 획득되는 추가적인 환원 당량은, 본원에 기술된 바와 같이, 탄수화물에 대한 이들 모든 산물들의 수율을 향상시킨다.
실시예 X
CO 및 혐기성 배양물을 취급하는 방법
본 실시예는 CO와 혐기성 배양물의 취급에 적용되는 방법을 기술한다.
A. 분석과 소규모 배양을 위한 소량의 CO 취급. CO는 무취, 무색 및 무미의 독성 가스이다. 따라서, CO를 사용하는 배양 및 분석에는 특수 관리가 요구된다. 소규모 배치 배양에서 CO 산화, 아세틸-CoA 합성, 미오글로빈을 이용한 CO 농축, 및 CO 내성(tolerance)/유용성 등의 여러가지 분석들에서는, 강제 급배기 시설 (fume hood) 안에서 분배하고 취급되는 소량의 CO 가스가 필요하였다. 생화학적 분석물은 극소량 (<2 mL)의 생화학적 분석 배지 또는 완충액을 CO로 포화시킨 후, 분석하여야 한다. 모든 CO 취급 공정들은 적당한 높이의 새시가 설치되고 송풍기가 작동되는 강제 급배기 시설에서 수행하였으며; CO는 압축가스 실린더 및 슈랭크 라인과 연결된 조절기로 공급되게 하였다. 조절기는 여러개의 어쩌면 큐벳이나 바이얼 각각에 동일 농도의 CO가 분배되도록 한다. 슈랭크 라인은 입구측에는 산소 스크러버가, 다른 측에는 유압식 기포발생기와 벤트가 설치되어 있다. 분석 큐벳들은 혐기성이며 CO를 함유한다. 이에, 분석 큐벳을 고무 마개로 밀봉하였고, 시약은 기밀성 니들 및 시린지로 투입하거나 제거하였다. 다음으로, 단단히 밀봉된 혈청병에서 소량의 (~50 mL) 배양물을 CO로 포화하면서 배양하였다. 생화학적 분석물에서와 같이, CO-포화된 미생물 배양물을 슈랭크 라인이 설치된 강제 급배기 시설에서 평형화하였다. 강제 급배기 시설 밖에서 안정하게 취급하기 위해, 생화학적 분석물과 미생물 배양물을 운반이 용이한 밀폐 용기에 소량으로 넣었다. 압축 CO 탱크는 강제 급배기 시설 옆에 설치하였다.
전형적으로, 슈랭크 라인은 CO를 큐벳에 분배하고 배출하기 위해 사용된다. 큐벳의 고무 마개에 19 또는 20 게이지의 1회용 시린지 니들로 구멍을 뚫고, 동일한 방법으로 배출시켰다. 오일 기포발생기는 CO 탱크 및 산소 스크러버와 함께 사용하였다. 유리 또는 석영 분광광도계 큐벳에는 상부에 둥근 구멍이 있으며, 여기에 Kontes 마개 슬리브, Sz7 774250-0007가 피팅된다. CO 검출기 유닛은 강제 급배기 시설 가까이 배치된다.
B. 대규모 배양물에 공급되는 대량 CO 취급. 발효 생산에서 공급원료로 합성가스를 모방하기 위해 CO 또는 CO와 H2의 혼합물을 발효 배양물에 공급한다. 즉, 1 리터 내지 수 리터의 세포 배양물에는, 배지내 CO 용해 농도를 높이기 위해, CO 가스가 첨가될 수 있다. 이럴 경우, 상당히 대규모의 CO 가스가 연속적으로 배양물에 투입된다. 여러 시점에, 배양물을 회수하거나 시료를 채취한다. 다른 예로, 발효기 일부인 일체형의 연속 유동 원심분리기로 세포들을 회수한다.
발효 과정은 혐기성 조건에서 진행된다. 일부 경우에, 호흡 환경을 제공하기 위하여 산소 또는 공기를 발효기에 투입하여 적당한 산소 포화도를 확보하는 것은 비경제적이다. 또한, 혐기성 발효 과정에서 발생되는 환원력은 호흡보다는 산물 형성에 필요할 수 있다. 더욱이, 다양한 경로들에서 다수 효소들이 차이는 있지만 산소에 민감하다. 무렐라 서모아세티카와 같은 초산생성균들은 절대적인 혐기성 미생물이고, Wood-Ljungdahl 경로의 효소들은 분자성 산소에 의해 비가역적으로 불활성화될 만큼 매우 민감하다. 산소-내성의 초산생성균들도 있지만, Wood-Ljungdahl 경로의 효소들은 대부분이 페레독신의 핵심 성분인 금속-효소이기 때문에, 산소의 존재와 양립 불가할 수 있으며, 조절을 통해 대사를 Wood-Ljungdahl 경로와는 다르게 변형시켜, 에너지 획득을 최대화할 수 있다. 동시에, 배양물 내의 세포들은 대규모 세포 생장에서 극단적인 조치 필요성을 완화시키는 산소 소거자들로 기능한다.
C. 혐기 챔버 및 조건. 예시적 혐기 챔버는 상업적으로 입수가능하다 (참고, 예를 들어, Vacuum Atmospheres Company, Hawthorne CA; MBraun, Newburyport MA). 조건은 O2 농도 1 ppm 또는 이하, 및 1 atm의 순수 N2이다. 일 예로, 3 산소 스크러버/촉매 재생기를 사용하였으며, 챔버에는 O2 전극을 포함시켰다 (예, Teledyne; City of Industry CA). 내부 챔버 문을 개방하기 전에 거의 모든 물품들과 시약들을 챔버 에어로크에서 4번 순환시켰다. 챔버에 넣기 전에 > 5 mL 부피의 시약에 순수 N2를 살포하였다. 글로브는 2회/년 교체하며, 촉매 용기는 챔버가 산소 수준 변화로 반응이 점점 부진해되면 주기적으로 재생시켰다. 챔버 압력은 솔레노이드에 의한 일-방향 밸브들로 제어하였다. 이러한 특징부들로 인하여 챔버 압력은 주변보다 고압으로 설정되므로, 매우 작은 튜브들을 퍼지 밸브를 통하여 이동시킬 수 있다.
혐기성 챔버를 일정하게 매우 낮고 고도의 산소 민감한 혐기성 조건에 요구되는, O2 수준에 도달하게 하였다. 그러나, 세포 증식 및 취급시에 통상 이러한 예비 조치가 필요한 것은 아니다. 다른 혐기성 챔버 구성으로, 믹스에 일부 수소 가스가 필요한 촉매로서 백금 또는 팔라듐을 사용할 수 있다. 솔레노이드 밸브 대신, 압력 방출은 기포발생기로 제어할 수 있다. 장치를 이용한 O2 감시 대신, 검사지가를 사용할 수 있다.
D. 혐기성 미생물학. 소량 배양물은 상기 CO 취급에서와 같이 취급한다. 특히, 혈청 또는 배지 병은 두꺼운 고무 마개를 끼우고 알루미늄 크림프로 병을 밀폐한다. 배지, 예를 들어 테리픽 (Terrific) 브로스는 통상적인 방법으로 제조하여 적정 크기의 혈청병에 배분한다. 병에 완만한 기포발생으로 30분 동안 질소를 살포한다. 이를 통해 배지에서 산소 대부분을 제거한 다음, 각 병에 고무 마개 (예를 들어 Bellco 20 mm 격막 마개; Bellco, Vineland, NJ)를 끼우고 크림프-밀폐한다 (Bellco 20 mm). 그런 후, 배지 병을 느린 (액상) 배기 사이클로 고압멸균한다. 적어도 가끔 니들로 마개를 관통시켜 고압멸균 중 배기시키고; 고압멸균기에서 꺼낸 후 니들은 즉시 제거한다. 멸균 배지에 나머지 배지 성분, 예를 들어 완충액 또는 항생제를 시린지 및 니들을 통해 첨가한다. 환원제를 넣기 전에, 병을 30 - 60 분 동안 질소 (또는 사용에 따라 CO)로 평형화한다. 환원제, 예를 들어 100 x 150 mM 황화나트륨, 200 mM 시스테인-HCl을 첨가한다. 황화나트륨은 건조 비이커에서 계량하고 시스테인은 혈청병에서 계량하여, 둘다 혐기성 챔버로 옮기고, 황화나트륨을 무산소수(anaerobic water)에 녹인 다음 혈청병 안에 든 시스테인에 첨가한다. 황화나트륨 용액이 시스테인과 접촉하여 황화수소 가스가 발생되는 즉시 마개를 덮는다. 배양물에 주입할 때, 시린지 필터를 사용하여 용액을 멸균한다. B12 (10 μM 시아노코발라민), 염화니켈 (NiCl2, 무산소수 중에서 챔버에서 제조하고, 배양물에 주입하기 전에 고압멸균 처리 또는 시린지 필터 사용에 의해 멸균처리한 40 mM 스톡용액을 사용하여, 최종 농도 20 μM), 및 황산암모늄제일철 (필요한 최종 농도는 100 μM임, 무산소수로 챔버에서 제조하고 배양물에 주입하기 전에 고압멸균 처리 또는 시린지 필터로 멸균한 100-1000x 스톡용액으로 사용됨)와 같은 기타 성분들을 시린지 니들를 통해 첨가한다. 혐기성 조건에서 더 빠르게 증식시키기 위해, 1 리터 병에 혐기적으로 배양한 전-배양물 50 mL을 접종하였다. 벡터의 pA1-lacO1 프로모터 유발은, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 최종 농도 0.2 mM로 첨가함으로써 수행하였고, 약 3 시간 동안 수행하였다.
대량 배양물은 기포를 발생시키면서 연속적인 가스 주입으로 더 큰 병에서 배양할 수 있다. 배지 첨가 후 금속성 기포발생기가 있는 고무 마개를 병에 장착하고 나머지를 설정 완료하기 전에 질소를 30 분 이상 살포한다. 멸균 필터가 주입 가스를 멸균시키고, 병 위의 호스를 작은 C 클램프로 압착할 수 있도록, 각각의 병을 모아둔다. 배지와 세포를 자석 교반 막대로 교반시킨다. 모든 배지 성분들과 세포를 첨가한 후, 계속하여 질소를 살포하면서 실온 배양기에서 배양한다.
실시예 XI
CO 산화 (CODH) 분석
본 실시예는 CO 산화 (CO 데하이드로게나제; CODH) 측정을 위한 분석 방법을 기술한다.
무렐라 서모아세티카의 7 유전자 CODH/ACS 오페론을 E. coli 발현 벡터에 클로닝하였다. 전체 ~10 kbp DNA 단편을 클로닝하였으며, 이 영역에 위치한 일부 유전자들은 자체 내인성 프로모터들로부터 발현되며, 모두 내인성 리보솜 결합 부위를 가지고 있을 것이다. CODH 활성을 정량적으로 측정하는 분석을 이용하여, 이들 클론들에서 CO 산화를 분석하였다. 비활성 (specific activity)을 평가하기 위해, 무렐라 서모아세티카 유전자 산물에 대한 항혈청을 웨스턴 블롯에 사용하였다. 무렐라 서모아세티카는 그람 양성이며, 리보솜 결합 부위 요소들이 E. coli에서 잘 작동할 것으로 예측된다. 하기에 상세히 기술된 이러한 활성은 무렐라 서모아세티카 비활성의 ~1/50 정도로 추정되었다. 무렐라 서모아세티카 효소는 약 55℃에서 최적이므로, 재조합 E. coli 세포의 CODH 활성에 제한이 될 수 있다. 이에, 중온성이며 명백하게 무손상 CODH/ACS 오페론과 Wood-Ljungdahl 경로를 가지고 있는, 무렐라와 매우 가까운 박테리아인, 데설피토박테리움 하프니엔세 (Desulfitobacterium hafniense)의 중온성 CODH/ACS 경로가 유리할 수 있다. 숙주 유기체로서 가능한 초산생성균으로는, 비제한적인 예로서, 로도스피릴룸 루브룸, 무렐라 서모아세티카 및 데설피토박테리움 하프니엔세를 포함한다.
CO 산화는 CODH/ACS 분석들에서 가장 민감성이 높고 가장 강력하다. E. coli-기반의 합성가스 이용 시스템은 궁극적으로는 특히 최적 활성을 위하여 클로스티리듐 (즉, 무렐라) 계통과 같이 거의 혐기성이여야 할 것으로 보인다. CODH 개선은 가능하지만 궁극적으로 수중 CO 가스 용해도에 의해 제한적일 것이다.
먼저, 각각의 유전자들을 발현 벡터에 클로닝하였다. 서브유닛들/1 복합체를 위한 조합 발현 유닛을 제조하였다. 단백질 수준에서 E. coli 발현을 확인하였다. 무렐라 서모아세티카의 CODH/ACS 조합 오페론 및 개별 발현 클론들을 모두 제작하였다.
CO 산화 분석. 본 분석은 Wood-Ljungdahl 경로에서 효소 활성을 분석하는 보다 단순하며, 믿을 수 있고, 보다 다재다능한 분석법이며, CODH를 테스트한다 (Seravalli et al., Biochemistry 43:3944-3955 (2004)). 무렐라 서모아세티카의 CODH 비활성은 55℃에서는 500 U이거나, 25℃에서는 ~60U이다. 이러한 분석은 CO 존재 하에 메틸 비올로겐의 환원을 이용한다. 마개를 덮은 혐기성의 유리 큐벳에서 578 nm에서 측정한다.
보다 상세하게는, 먼저 탈이온수로 4번, 아세톤으로 1번 세척한 고무 마개가 있는 유리 큐벳을 준비하였다. 소량의 진공 그리스를 고무 가스켓 상부에 도포하였다. 큐벳에 CO를 주입하고, 22 Ga. 니들 + 배기 (exhaust) 니들로 10분 건조시켰다. 반응 완충액 (50 mM Hepes, pH 8.5, 2mM 디티오트레이톨 (DTT)) 0.98 mL을, 니들로 배기시키고, 100% CO 상태로, 22 Ga. 니들을 사용하여 첨가하였다. 메틸 비올로겐 (CH3 비올로겐) 스톡용액은 1 M 수용액이다. 각각의 분석에는 20 ㎕를 20 mM 최종 농도로 사용하였다. 메틸 비올로겐을 첨가하였을 때, 18 Ga 니들 (부분)을 자켓으로 사용하여 해밀톤 시린지로 용이하게 CH3 비올로겐을 회수하였다. 4 -5 분취액들을 취하여 세척을 위해 버리고, 시린지를 가스 평형시켰다. CH3 비올로겐을 약간 환원하도록 CH3 비올로겐 스톡용액을 구성할 때, 소량의 디티온산나트륨 (0.1 M 스톡)을 첨가하였다. 온도는 가열된 Olis 분광광도계 (Bogart GA)에서 55℃로 맞추었다. 블랭크 반응 (CH3 비올로겐 + 완충액)을 먼저 수행하여 CH3 비올로겐 환원 기준율을 측정하였다. ACS90 및 ACS91 (각각 제1 cooC를 가지거나 가지지 않은 무렐라 서모아세티카의 CODH-ACS 오페론)인 E. coli 세포 조추출물. 추출물 10 ㎕를 한번에 첨가하여, 혼합 및 분석하였다. 환원된 CH3 비올로겐은 보라색이 되었다. 분석 결과를 표 I에 나타낸다.
표 I. 조추출물의 CO 산화 활성
Figure 112014025824628-pct00002
Mta98/Mta99는 무렐라 서모아세티카 유래의 메탄올 메틸트랜스퍼라제 유전자들을 발현하는 E. coli MG1655 균주이므로, 무렐라 서모아세티카 CODH 오페론을 가진 ACS90 ACS91 E. coli 균주에 대한 음성 대조군이다.
세포 단백질의~ 1%가 CODH인 경우, 이들 수치는 순수한 무렐라 서모아세티카 CODH의 500 U/mg 활성보다 약 100X 낮을 것이다. 웨스턴 블롯에 따른 실제 평가에서, 세포 단백질의 0.5%이었으므로, 활성은 무렐라 서모아세티카 CODH보다 약 50X 낮다. 그러나, 본 실험에서 재조합 E. coli에서 CO 산화 활성이 확인되었으며, 음성 대조군에서는 훨씬 낮았다. 음성 대조군에서 확인된 낮은 CO 산화 수준 (CH3 비올로겐 환원)은 E. coli가 CH3 비올로겐을 환원시키는 능력에 한계가 있을 수 있음을 의미한다.
CODH 및 Mtr 단백질의 최종 농도를 평가하기 위하여, CO 산화, ACS, 메틸트랜스퍼라제, 및 코리노이드 Fe-S 분석에 사용한 동일한 세포 추출물을 대상으로 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 사용한 항혈청은 정제된 무렐라 서모아세티카 CODH-ACS 및 Mtr 단백질에 대한 다클론성 항체이며, 알칼리 포스파타제가 접합된 염소-항-토끼 2차 항체를 이용하여 가시화하였다. 웨스턴 블롯을 수행하였으며, 그 결과를 도 9에 나타낸다. ACS90 및 ACS91에서의 CODH 함량은 대조군 레인과 비교하여 50 ng로 확인되었다. 2개의 CODH 서브유닛과 메틸트랜스퍼라제를 포함하는 CODH-ACS 오페론 유전자의 발현이 웨스턴 블롯 분석으로 확인되었다. 즉, 재조합 E. coli 세포는 7개의 유전자로 구성된 오페론을 복수의 성분으로 발현한다. 또한, 메틸트랜스퍼라제 및 코리노이드 철-황 단백질 둘다, 동일한 재조합 E. coli 세포에서 활성을 나타내었다. 이들 단백질은 동일 세포에 클로닝한 동일 오페론의 일부이다.
무렐라 서모아세티카 세포 추출물들을 이용하여 양성 대조군에 대하여 CO 산화 분석을 반복 실시하였다. E. coli ACS90 및 ACS91에서 CODH 활성을 측정가능한 수준이었지만, 무렐라 서모아세티카 대조군 보다 약 130 - 150 X 낮았다. 분석 결과는 도 10에 나타난다. 간략하게는, 세포 (CODH/ACS 오페론; ACS90 또는 ACS91 또는 빈 벡터: pZA33S를 포함하고 있는 무렐라 서모아세티카 또는 E. coli)를 배양하고, 전술한 바와 같이 추출물을 준비하였다. 추출물을 준비한 당일에, 55℃에서 여러 시간대에 전술한 바와 같이 분석을 수행하였다. 메틸비올로겐의 환원은 120 초 동안 578 nm에서 추적하였다.
이들 결과는 CO 산화 (CODH) 분석과 결과를 기술한다. 재조합 E. coli 세포는 메틸 비올로겐 환원 분석으로 측정된 바와 같이 CO 산화 활성을 발현하였다.
실시예 XII
E. coli CO 내성 실험 및 CO 농도 분석 (미오글로빈 분석)
본 실시예는 고농도 CO에 대한 E. coli 내성을 기술한다.
E. coli가 CO 포화 함량 하에 혐기적으로 증식가능하지 여부를 확인하기 위해, 상기 소량의 혐기성 미생물학에서 기술한 바와 같이, 테리픽 브로스 배지 (+ 환원성 용액, NiCl2, Fe(II)NH4SO4, 시아노코발라민, IPTG, 및 클로람페니콜) 50 ml이 든 120 ml 혈청병에서 배양을 준비하였다. 병의 절반을 30분 간 질소 가스로 평형화하고, 절반은 30분간 CO 가스로 평형화하였다. 빈 벡터 (pZA33)를 대조군으로 사용하였으며, pZA33 빈 벡터를 포함하믐 배양물과 ACS90 및 ACS91가 포함된 배양물을 N2 및 CO 둘다에서 실험하였다. 모두 접종하여, 36시간 동안 37℃에서 진탕 (250 rpm) 배양하였다. 36 시간 종료 후, 플라스크를 검사하여 모두에서 고도로 증식되었음을 확인하였다. 관찰된 상당한 증식은 밤새 이루어졌으며, 긴 지체기를 나타내었다.
모든 배양물이 CO 존재 조건에서도 잘 증식된 것으로 보이므로, 최종 CO 농도를 확인하였다. 이는 CO에 노출시켰을 때의 미오글로빈의 분광학적 쉬프트 분석으로 이루어졌다. 디티온산나트륨을 이용하여 환원된 미오글로빈은 435 nm에서 흡광 피크를 가지는데, 이 피크는 CO에 의해 423 nm로 이동한다. 파장이 짧고 300 nm에서 위로 전 스펙트럼을 기록하여야 하므로, 석영 큐벳을 사용하여야 한다. CO 농도는 표준 곡선에서 구하였으며, CO의 최대 수용해도 = 20℃ 및 1 atm에서 970 마이크로몰인 헨리 법칙 상수에 따라 달라진다.
CO 농도에 대한 미오글로빈 테스트를 위해, 큐벳을 물로 10X, 아세톤으로 1X 세척하고, CODH 분석에서와 같이 마개로 닫았다. N2를 ~10분 간 큐벳에 주입하였다. 1 ml의 혐기성 완충액 (HEPES, pH 8.0, 2 mM DTT)을 해밀톤 시린지로 블랭크 (CO로 평형화하지 않음)에 첨가하였다. 10 ㎕의 미오글로빈 (~1 mM, 가변적임, 단 상당량이 필요함)과 1 ㎕의 디티온산염 (20 mM 스톡)을 첨가하였다. 1 ㎕ 증분으로 첨가한 CO 포화 완충액에 대해 CO 표준 곡선을 작성하였다. 피크 높이와 쉬프트를 각 증분마다 기록하였다. 테스트 배양물은 pZA33/CO, ACS90/CO 및 ACS91/CO이었다. 이들 각각을 동일한 큐벳에 1 ㎕ 증분으로 첨가하였다. 실험 중에 제2 큐벡을 준비하여 사용하였다. 그 결과는 표 II에 나타낸다.
표 II. 일산화 탄소 농도, 36시간
Figure 112014025824628-pct00003
표 II의 결과는, 균주를 CO 존재 또는 부재 하에서 배양하던지 간에 증식되었음을 나타내었다. 이들 결과는 E. coli가 혐기 조건에서 CO 노출에 허용적일 수 있으며, CODH-ACS 오페론을 발현하는 E. coli 세포가 CO 일부를 대사할 수 있음을 의미한다.
이들 결과는 CODH/ACS 발현 여부와 무관하게, E. coli 세포들이 CO 포화 함량의 존재 하에서도 증식할 수 있음을 입증해준다. 아울러, 이는 CO 대신 질소 하에서도 대조군으로서 동일하게 잘 증식하였다. 이러한 실험을 통해, E. coli 실험 균주가 정상 대기압에서 수행한 합성가스 프로젝트에서 달성가능한 수준에서는 CO에 민감하지 않은 것으로 확인되었다. 아울러, 예비 실험에서 CODH/ACS를 발현하는 재조합 E. coli 세포가 실제 아마도 이산화탄소로 산화함으로써 일부 CO를 소비하는 것으로 나타났다.
실시예 XIII
1,3-부탄디올, 프로필렌 및 크로틸 알코올 합성 경로
1,3-부탄디올, 프로필렌 및 크로틸 알코올의 합성 경로들을 도 7에 나타낸다. 이들 경로는, 말로닐-ACP를 아세틸-CoA 또는 아세틸-ACP와 축합하여 아세토아세틸-ACP (단계 A)를 제조하는, 지방산 생합성의 개시와 함께 시작할 수 있다. 2번째 단계는 아세토아세틸-ACP의 3-하이드록시부티릴-ACP로의 환원을 수반한다. 크로토닐-ACP로의 탈수 및 다른 환원을 거쳐, 부티릴-ACP가 생성된다. 체인 연장은 전형적으로 장쇄 아실쇄가 형성될 때까지 말로닐-ACP를 추가로 부가하여 계속되며, 그런 후 티오에스테라제에 의해 유리형 C16 지방산으로 가수분해된다. 박테리아의 지방산 합성 시스템 (FAS II)은 각 단계에서 개별 단백질을 이용하지만, 진균과 포유류의 지방산 합성 시스템 (FAS I)은 다중기능의 컴플렉스 단백질을 이용한다. 이 경로는 지방산 생합성의 하나 이상의 효소들을 이용하여, C3 및 C4 생성물, 프로필렌, 1,3-부타디올 및 크로틸알코올을 생산한다.
도 7에 아세토아세틸-ACP를 1,3-부탄디올로 변환하는 몇가지 경로들을 나타낸다. 몇몇 경로들에서, 아세토아세틸-ACP가 먼저 아세토아세틸-CoA로 변환된다 (단계 D). 다른 예로, 아세토아세틸-CoA도 아세토아세틸-CoA 신타제 (EC 2.3.1.194)에 의해 아세틸-CoA와 말로닐-CoA로부터 합성할 수 있다. 그런 후, 아세토아세틸-CoA가 CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 신테타제 (단계 E)에 의해 아세토아세테이트로 가수분해될 수 있다. 그 후, 아세토아세테이트는 카르복실산리덕타제 (단계 F)에 의해 3-옥소부티르알데하이드로 환원된다. 다른 예로, 아세토아세틸-CoA가 CoA-의존성 알데하이드 데하이드로게나제 (단계 I)에 의해 3-옥소부티르알데하이드로 바로 변환된다. 또 다른 구현예에서, 아세토아세틸-ACP가 아실-ACP 리덕타제에 의해 3-옥소부티르알데하이드로 바로 변환된다 (단계 J). 3-옥소부티르알데하이드는 다시 4-하이드록시-2-부타논 또는 3-하이드록시부티르알데하이드 중간 산물을 경유하여 1,3-부탄디올로 환원된다 (단계 G 및 S, 또는 단계 R 및 AA). 다른 옵션은 알데하이드 데하이드로게나제/알코올 데하이드로게나제 활성을 가진 2중 기능의 효소에 의한 아세토아세틸-CoA의 4-하이드록시-2-부타논으로의 직접 변환 (단계 K)이다. 또한, 1,3-부탄디올까지의 경로는 3-하이드록시부티릴-CoA 중간 산물을 경유하여 진행될 수 있다. 이 중간 산물은 아세토아세틸-CoA의 환원 (단계 P) 또는 3-하이드록시부티릴-ACP의 트랜스아실화 (단계 X)에 의해 형성된다. 3-하이드록시부티릴-CoA는 다시 3-하이드록시부티레이트 (단계 Y), 3-하이드록시부티르알데하이드 (단계 N) 또는 1,3-부탄디올 (단계 O)로 변환된다. 다른 예로, 3-하이드록시부티레이트 중간 산물은 아세토아세테이트로부터 형성되거나 (단계 Q), 또는 3-하이드록시부티릴-ACP의 가수분해를 경유하여 형성된다 (단계 L). 또한, 3-하이드록시부티르알데하이드 중간 산물은 3-하이드록시부티릴-ACP 리덕타제의 산물 (단계 M)이다.
도 7은 또한 말로닐-ACP에서 크로틸 알코올까지의 경로들을 나타낸다. 일 구현예에서, 지방산 개시 및 연장 효소들은 크로토닐-ACP 중간 산물들을 만들어낸다 (단계 A, B, C). 크로토닐-ACP는 그후 크로토닐-CoA, 크로토네이트 또는 크로톤알데하이드로 각각 트랜스아실화, 가수분해 또는 환원된다 (단계 AE, T, U). 크로토닐-CoA와 크로토네이트는 CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제에 의해 상호 변환된다 (단계 AF). 크로토네이트는 카르복실산리덕타제에 의해 크로톤알데하이드로 환원된다 (단계 AG). 모든 경로들에서 마지막 단계에, 단계 AH에서 알데하이드 리덕타제에 의해 크로톤알데하이드가 크로틸 알코올로 환원된다. 아래 표에 열거된 다수의 대안적인 경로들 역시 본 발명에 포함된다. 크로토닐-CoA는 크로톤알데하이드 또는 크로틸 알코올로 환원될 수 있다 (단계 V, W). 다른 예로, 기존에 개시된 1,3-부탄디올 경로들의 3-하이드록시부티릴 중간 산물들 역시 크로틸 알코올 전구체로 변환될 수 있다. 예컨대, 3-하이드록시부티릴-CoA, 3-하이드록시부티레이트 또는 3-하이드록시부티르알데하이드의 탈수로 각각 크로토닐-CoA, 크로토네이트 또는 크로톤알데하이드가 수득된다 (단계 AB, AC, AD).
또한, 프로필렌 경로를 도 7에 나타낸다. 일 구현예에서, 크로톤알데하이드 중간 산물은 프로필렌으로 탈카르보닐화된다 (단계 AO). 다른 구현예에서, 3-하이드록시부티레이트 중간 산물은 알켄을 형성하는 데카르복실라제에 의해 프로필렌으로 변환된다 (단계 AR). 또한, 크로토네이트의 탈카르복시화로 프로필렌이 형성된다 (단계 AQ). 또 다른 구현예에서, 지방산 생합성 효소들은 크로토닐-ACP를 부티릴-ACP (단계 AL)로 추가로 변환하며, 그런 후 부티릴-CoA (단계 AI)로 트랜스아실화되거나, 또는 부티레이트로 가수분해될 수 있다 (단계 AP). 또한, 부티릴-CoA 중간 산물은 크로토닐-CoA가 환원되어 형성된다 (단계 AM). 부티레이트 중간 산물 역시 크로토네이트의 환원 또는 부티릴-CoA의 CoA 모이어티 제거를 통해 형성된다 (단계 AN 또는 AJ). 프로필렌은 알켄을 형성하는 데카르복실라제에 의해 부티레이트로부터 형성된다 (단계 AK). 말로닐-ACP에서 프로필렌까지의 경로를 하기 표에 열거한다.
도 7에 나타낸 경로들의 예는 하기 표에 열거한다:
생성물 경로
1,3-BDO A, D, E, F, G, S
A, D, E, F, R, AA
A, D, E, Q, Z, AA
A, D, P, Y, Z, AA
A, D, P, O
A, D, E, F, G, S
A, D, E, F, R, AA
A, D, P, N, AA
A, D, I, G, S
A, D, I R, AA
A, D, K, S
A, H, F, G, S
A, H, F, R, AA
A, H, Q, Z, AA
A, J, G, S
A, J, R, AA
A, B, X, Y, Z, AA
A, B, X, O
A, B, X, N, AA
A, B, L, Z, AA
A, B, M, AA		 AS, E, F, G, S
AS, I, G, S
AS, K,, S
AS, I, R, AA
AS, E, F, R, AA
AS, E, Q, Z, AA
AS, P, N, AA
AS, P, Y, Z, AA
AS, P, O
AS, E, F, R, AA
AS, E, F, G, S
크로틸 알코올 A, B, C, AE, AF, AG, AH
A, B, C, AE, W
A, B, C, AE, V, AH
A, B, C, T, AG, AH
A, B, C, U, AH
A, B, X, Y, Z, AD, AH
A, B, X, Y, AC, AG, AH
A, B, X, AB, AF, AG, AH
A, B, X, AB, V, AH
A, B, X, AB, W
A, B, L, Z, AD, AH
A, B, L, AC, AG, AH
A, B, M, AD, AH 		A, D, P, AB, AF, AG, AH
A, D, P, AB, V, AH
A, D, P, AB, W
A, D, P, Y, AC, AG, AH
A,D, P, Y, Z, AD, AH
A, D, P, N, AD, AH
A, D, E, F, R, AD, AH
A, D, E, Q, Z, AD, AH
A, D, E, Q, AC, AG, AH
A, D, I, R, AD, AH
A, H, F, R, AD, AH
A, H, Q, AC, AG, AH
 A, H, Q, Z, AD, AH
A, J, R, AD, AH
AS, I, R, AD, AH
AS, E, F, R, AD, AH
AS, E, Q, Z, AD, AH
AS, E, Q, AC, AG, AH
AS, P, N, AD, AH
AS, P, Y, Z, AD, AH
AS, P, Y, AC, AG, AH
AS, P, AB, V, AH
AS, P, AB, AF, AG, AH
AS, P, AB, W
프로필렌 A, B, C, AL, AI, AJ, AK
A, B, C, AL, AP, AK
A, B, C, AE, AF, AG, AO
A, B, C, AE, AF, AQ
A, B, C, AE, AF, AN, AK
A, B, C, AE, AM AJ, AK
A, B, C, AE, V, AO
A, B, C, T, AG, AO
A, B, C, T, AQ
A, B, C, T, AN, AK
A, B, C, U, AO
A, B, X, Y, Z, AD, AO
A, B, X, Y, AR
A, B, X, Y, AC, AN, AK
A, B, X, Y, AC, AQ
A, B, X, Y, AC, AG, AO
A, B, X, N, AD, AO
A, B, X, AB, AF, AG, AO
A, B, X, AB, AF, AQ
A, B, X, AB, AF, AN, AK
A, B, X, AB, AM, AJ, AK
A, B, X, AB, V, AO
A, B, L, AR
A, B, L, Z, AD, AO		 A, B, L, AC, AG, AO
A, B, L, AC, AN, AK
A, B, L, AC, AQ
A, B, M, AD, AO
A, D, E, F, R, AD, AO
A, D, E, Q, AR
A, D, E, Q, Z, AD, AO
A, D, E, Q, AC, AN, AK
A, D, E, Q, AC, AG, AO
A, D, E, Q, AC, AQ
A, D, P, Y, Z, AD, AO
A, D, P, N, AD, AO
A, D, P, Y, AR
A, D, P, Y, AC, AG, AO
A, D, P, Y, AC, AQ
A, D, P, Y, AC, AN, AK
A, D, P, AB, AM, AJ, AK
A, D, P, AB, AF, AG, AO
A, D, P, AB, AF, AQ
A, D, P, AB, AF, AN, AK
A, D, P, AB, V, AO
A, D, I, R, AD, AO
A, J, R, AD, AO
A, H, F, R, AD, AO		 A, H, Q, AR
A, H, Q, Z, AD, AO
A, H, Q, AC, AQ
A, H, Q, AC, AG, AO
A, H, Q, AC, AN, AK
A, H, Q, V, AG, AO
AS, I, R, AD, AO
AS, E, F, R, AD, AO
AS, E, Q, AD, AO
AS, P, Y, Z, AD, AO
AS, P, N, AD, AO
AS, E, Q, AC, AG, AO
AS, P, Y, AC, AG, AO
AS, P, AB, AF, AG, AO
AS, E, Q, AR
AS, P, Y, AR
AS, E, Q, AC, AQ
AS, P, Y, AC, AQ
AS, P, AB, AF, AQ
AS, E, Q, AC, AN, AK
AS, P, Y, AC, AN, AK
AS, P, AB, AF, AN, AK
AS, P, AB, AM, AJ, AK
도 7에 나타낸 반응들에 필요한 효소들을 아래 표에 나타낸다.
표시 기능 단계
1.1.1.a 옥시도리덕타제 (옥소 -> 알코올) 7B, 7G, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7AA, 7AH
1.1.1.c 옥시도리덕타제 (아실-CoA를 알코올) 7K, 7O, 7W
1.2.1.b 옥시도리덕타제 (아실-CoA를 알데하이드) 7I, 7N, 7V
1.2.1.e 옥시도리덕타제 (산 -> 알데하이드) 7F, 7Z, 7AG
1.2.1.f 옥시도리덕타제 (아실-ACP -> 알데하이드) 7J, 7M, 7U
1.3.1.a 옥시도리덕타제 (알칸 -> 알켄) 7AL, 7AM, 7AN
2.3.1.e 아실-ACP C-아실트랜스퍼라제 (탈카르복시화) 7A
2.3.1.f CoA-ACP 아실트랜스퍼라제 7D, 7X, 7AE, 7AI
2.3.1.g 지방산 신타제 7A, 7B, 7C, 7AL
2.8.3.a CoA 트랜스퍼라제 7E, 7Y, 7AJ, 7AF
3.1.2.a CoA 하이드롤라제 7E, 7Y, 7AJ, 7AF
3.1.2.b 아실-ACP 티오에스테라제 7H, 7L, 7T, 7AP
4.1.1.a 데카르복실라제 7AQ, 7AR
4.1.1.b 데카르복실라제, 알켄 형성 7AK
4.1.99.a 데카르보닐라제 7AO
4.2.1.a 하이드로-리아제 7C, 7AB, 7AC, 7AD
6.2.1.a CoA 신테타제 7E, 7Y, 7AJ, 7AF
이들 다수의 EC 클래스에 속하는 후보 효소들이 종래에 개시되었으며, 도 7에 나타낸 변환에 적합한 후보 효소가 제시되었다. 이들 효소 클래스로는 EC 1.1.1.a, 1.1.1.c, 1.2.1.b, 1.2.1.e, 2.3.1.b, 2.3.1.h, 2.8.3.a, 3.1.2.a, 4.1.1.a, 4.1.99.a, 4.2.1.a 및 6.2.1.a를 포함한다. 도 7의 경로와 관련있는 새로운 후보 효소들은 아래에 나타낸다.
1.1.1.a 옥시도리덕타제 (옥소 -> 알코올)
도 7에 나타낸 몇가지 반응들은 알코올 데하이드로게나제 효소에 의해 촉매된다. 이러한 반응들로는 단계 B, G, P, Q, R, S, AA 및 AH를 포함한다. 단계 G, P, Q, R, S, AA 및 AH를 촉매하는 알코올 데하이드로게나제 효소의 예들은 실시예 VII에서 설명되었다. 단계 B를 촉매하는데 적합한 후보 효소들을 아래에 나타낸다.
아세토아세틸-ACP의 3-하이드록시아세틸-ACP로의 환원은 아세토아세틸-ACP 리덕타제 또는 3-옥소아실-ACP 리덕타제 (EC 1.1.1.100)에 의해 촉매된다. 에스케리키아 콜라이의 3-옥소아실-ACP 리덕타제는 fabG에 의해 코딩된다. 아실-ACP 기질이 이 효소에 결합하는데 작용하는 주요 잔기들은 규명되었다 (Zhang et al, J Biol Chem 278:52935-43 (2003)). 바실러스 안트라시스 (Zaccai et al, Prot Struct Funct Gen 70:562-7 (2008))와 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Gurvitz, Mol Genet Genomics 282:407-16 (2009))에서 추가적인 이러한 활성을 가진 효소들이 특정화되었다. 진핵 생물의 지방산 신타제의 베타-케토아실 리덕타제 (KR) 도메인도 이러한 활성을 촉매한다 (Smith, FASEB J, 8:1248-59 (1994)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fabG P0AEK2.1 84028081 에스케리키아 콜라이
fabG AAP27717.1 30258498 바실러스 안트라시스
FabG1 NP_215999.1 15608621 미코박테리움 투베르쿨로시스
FabG4 YP_003030167.1 253797166 미코박테리움 투베르쿨로시스
1.2.1.f 옥시도리덕타제 (아실-ACP -> 알데하이드)
아실-ACP의 이의 대응되는 알데하이드로의 환원은 아실-ACP 리덕타제 (AAR)에 의해 촉매된다. 이러한 변환은 도 7의 단계 J, M 및 U에 도시되어 있다. 적합한 후보 효소로는 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942의 orf1594 유전자 산물과 이의 상동체를 포함한다 (Schirmer et al, Science, 329: 559-62 (2010)). 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942의 아실-ACP 리덕타제는, 대부분의 시아노박테리아 유기체에서 보존된 것으로 보이는 오페론에서 알데하이드 데카르보닐라제와 함께 발현된다. 이 효소는, 알데하이드 데카르보닐라제와 함께 에스케리키아 콜라이에서 발현되며, 알칸 생산력을 부여한다. 프로클로로코커스 마리누스의 AAR도 에스케리키아 콜라이에 클로닝되었으며, 데카르보닐라제와 함께 알칸을 생산하는 것으로 입증되었다 (US 출원 2011/0207203).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
orf1594 YP_400611.1 81300403 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942
PMT9312_0533 YP_397030.1 78778918 프로클로로코커스 마리누스 MIT 9312
syc0051_d YP_170761.1 56750060 시네코코커스 엘롱가투스 PCC 6301
Ava_2534 YP_323044.1 75908748 아나바에나 베리어빌리스 ATCC 29413
alr5284 NP_489324.1 17232776 노스톡 sp. PCC 7120
Aazo_3370 YP_003722151.1 298491974 노스톡 아졸라이
Cyan7425_0399 YP_002481152.1 220905841 시아노테세 sp. PCC 7425
N9414_21225 ZP_01628095.1 119508943 노둘라리아 스푸미게나 CCY9414
L8106_07064 ZP_01619574.1 253797166 링바야 sp. PCC 8106
1.3.1.a (알칸 -> 알켄)
도 7에 나타낸 몇몇 변환들은 알켄의 알칸으로의 환원을 수반한다. 단계 AM 및 AN에서, 에노일-CoA는 이의 대응되는 아실-CoA로 환원된다. 이들 반응을 촉매하는 후보 효소들은 실시예 VII에서 기술되었다. 단계 AL은 부티릴-ACP 리덕타제에 의해 촉매되는 크로토닐-ACP의 부티릴-ACP로의 환원을 도시한다. 이 단계에 적합한 후보 효소는 본원에 기술된다.
에노일-ACP 리덕타제는 에노일-ACP 이중 결합의 NAD(P)H-의존적인 환원에 의한 포화된 아실-ACP의 형성을 촉매한다. 에스케리키아 콜라이의 FabI 단백질은 탄소수 4-16의 에노일 기질의 환원을 촉매하는, 잘 특정화된 에노일-ACP 리덕타제이다 (Rafi et al, JBC 281:39285-93 (2006)). FabI은 생성물 저해에 의해 아실-ACP에 의해 저해된다 (Heath, J Biol Chem 271:1833-6 (1996)). 바실러스 섭틸리스는 2종의 에노일-ACP 리덕타제 이소자임, FabI와 FabL을 함유하고 있다 (Heath et al, J Biol Chem 275:40128-33 (2000)). 스트렙토코커스 뉴모니애의 FabK 단백질은 동일한 활성을 촉매하는 트리클로산-내성의 플라보단백질이다 (Heath and Rock, Nature 406:145-6 (2000)). 추가적인 후보는 최근 결정 구조가 해명된 슈도모나스 에우루지노사의 FabI 단백질이다 (Lee et al, Acta Cryst Sect F 67:214-216 (2011)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fabI P0AEK4.2 84028072 에스케리키아 콜라이
fabI P54616.2 7531269 바실러스 섭틸리스
fabL P71079.1 81817482 바실러스 섭틸리스
fabK AAF98273.1 9789231 스트렙토코커스 뉴모니애
fabI Q9ZFE4.1 7531118 슈도모나스 에우루지노사
2.3.1.e 아실-ACP C-아실트랜스퍼라제 (탈카르복시화)
도 7의 단계 A에서, 아세토아세틸-ACP는 말로닐-ACP와 아세틸-CoA 또는 아세틸-ACP 중 어느 한가지로부터 형성된다. 이런 반응은 EC 클래스 2.3.1의 아실-ACP C-아실트랜스퍼라제에 의해 촉매된다. 말로닐-ACP와 아세틸-CoA의 축합은 베타-케토아실-ACP 신타제 (KAS, EC 2.3.1.180)에 의해 촉매된다. 에스케리키아 콜라이는 fabB, fabF 및 fabH. FabH (KAS III)에 의해 코딩된 3종의 KAS 효소로서, 에스케리키아 콜라이에서 지방산 생합성을 개시하는 주요 효소이며, 아세토아세틸-ACP 형성에 선택적이다. FabB와 FabF는 말로닐-ACP와 아실-ACP 기질의 축합을 촉매하며, 아세틸-ACP와 반응하여 지방산 개시에 참여할 수 있지만, 지방산 연장에 주로 기능한다. 예를 들어, 바실러스 섭틸리스의 KAS 효소들은 FabH와 유사하지만, 선택성이 낮으며, 분지형 아실-CoA 기질을 수용한다 (Choi et al, J Bacteriol 182:365-70 (2000)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fabB AAC75383.1 1788663 에스케리키아 콜라이
fabF AAC74179.1 1787337 에스케리키아 콜라이
fabH AAC74175.1 1787333 에스케리키아 콜라이
FabHA NP_389015.1 16078198 바실러스 섭틸리스
FabHB NP_388898.1 16078081 바실러스 섭틸리스
다른 예로, 아세틸-CoA가 먼저 아세틸-ACP로 활성화된 다음, 2가지 효소, 즉 아세틸-CoA:ACP 트랜스아실라제 (EC 2.3.1.38) 및 아세토아세틸-ACP 신타제 (EC 2.3.1.41)에 의해 아세토아세틸-ACP로 축합될 수 있다. 아세틸-CoA:ACP 트랜스아실라제는 아세틸-CoA와 아실 캐리어 단백질을 아세틸-ACP로 변환하고, CoA를 방출한다. 아세틸-CoA:ACP 트랜스아실라제에 대한 후보 효소들은 아래 EC 2.3.1.f 섹션에 기술되어 있다. 아세토아세틸-ACP 신타제 효소는 아세틸-ACP와 말로닐-ACP의 축합을 촉매한다. 이런 활성은 에스케리키아 콜라이의 FabF와 FabB 뿐만 아니라 EC 2.3.1.g에 기술된 다중 기능의 진핵 생물 지방산 신타제 효소 컴플렉스들에 의해 촉매된다.
2.3.1.f CoA-ACP 아실트랜스퍼라제
CoA의 ACP 모이어티로의 치환은 EC 클래스 2.3.1의 효소에 의해 촉매된다. 이 반응은 도 7의 단계 D, X, AE 및 AI에 나타나 있다. 또한, 아세틸-CoA의 아세틸-ACP로의 활성화 (단계 A, 도 7)는 CoA:ACP 아실트랜스퍼라제에 의해 촉매된다. CoA-ACP 아실트랜스퍼라제 활성을 가진 효소로는 아세틸-CoA:ACP 트랜스아실라제 (EC 2.3.1.38)와 말로닐-CoA:ACP 트랜스아실라제 (EC 2.3.1.39)가 있다.
에스케리키아 콜라이의 FabH (KASIII) 효소는, 아세토아세틸-ACP를 형성하는 일차적인 활성 외에도, 아실-CoA:ACP 트랜스아실라제로서 기능한다. 부티릴-ACP는 FabH의 다른 기질로서 수용된다 (Prescott et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol, 36:269-311 (1972)). 플라스모디움 팔시파룸과 스트렙토마이세스 에버미틸리스로부터 유래된 아세틸-CoA:ACP 트랜스아실라제 효소들은 에스케리키아 콜라이에서 이종적으로 발현되었다 (Lobo et al, Biochem 40:11955-64 (2001)). fabH-결함성 락토코커스 락티스 숙주에서 발현시킨, 플라스모디움 팔시파룸 유래의 합성 KASIII (FabH)는 천연 fadH 활성을 보완할 수 있었다 (Du et al, AEM 76:3959-66 (2010)). 스피나시아 올레라세아 (Spinacia oleracea)로부터 유래된 아세틸-CoA:ACP 트랜스아실라제 효소는 기질로서, 부티릴-ACP 등의 다른 아실-ACP 분자들을 수용한다 (Shimakata et al, Methods Enzym 122:53-9 (1986)). 이 효소의 서열은 아직까지 결정되지 않았다. 말로닐-CoA:ACP 트랜스아실라제 효소로는 에스케리키아 콜라이와 브라시카 납수스의 FabD를 포함한다 (Verwoert et al, J Bacteriol, 174:2851-7 (1992); Simon et al, FEBS Lett 435:204-6 (1998)). 브라시카 납수스의 FabD는 fabL-결함성 에스케리키아 콜라이를 보완할 수 있었다. 다중 기능의 진핵 생물의 지방산 신타제 효소 컴플렉스 (EC 2.3.1.g) 역시 이러한 활성을 촉매한다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fabH AAC74175.1 1787333 에스케리키아 콜라이
fadA NP_824032.1 29829398 스트렙토마이세스 에버미틸리스
fabH AAC63960.1 3746429 플라스모디움 팔시파룸
합성 구조체 ACX34097.1 260178848 플라스모디움 팔시파룸
fabH CAL98359.1 124493385 락토코커스 락티스
fabD AAC74176.1 1787334 에스케리키아 콜라이
fabD CAB45522.1 5139348 브라시카 납수스
2.3.1.g 지방산 신타제
도 7의 단계 A, B, C 및 AL은, 하나 이상의 서브유닛들의 멀티 카피들로 구성된 다중 기능의 효소 컴플렉스인 지방산 신타제 또는 지방-아실-CoA 신타제에 의해 촉매될 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애의 지방산 신타제는, 지방산 합성: 활성화, 프라이밍, 연장 및 종결에 필요한 모든 반응들을 함께 촉매하는 다중 기능의 2개의 서브유닛들 FAS1과 FAS2으로 구성된 도데카머이다 (Lomakin et al, Cell 129:319-32 (2007)). 이 효소 컴플렉스는 아세틸-CoA와 말로닐-CoA로부터 장쇄 지방산을 형성하는 과정을 촉매한다. 진핵 생물의 FAS 시스템의 선호 생성물은 팔미트산 (C16)이다. 칸디다 파랍실로시스와 서모마이세스 라누기노수스에서 유사한 지방산 신타제 컴플렉스들이 확인된다 (Nguyen et al, PLoS One 22:e8421 (2009); Jenni et al, Science 316:254-61 (2007)). 미코박테리움 투베르쿨로시스와 호모 사피엔스 등의 포유류의 다중 기능의 Fas 효소들 역시 적합한 후보 효소이다 (Fernandes and Kolattukudy, Gene 170:95-99 (1996) and Smith et al, Prog Lipid Res 42:289-317 (2003)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
FAS1 CAA82025.1 486321 사카로마이세스 세레비지애
FAS2 CAA97948.1 1370478 사카로마이세스 세레비지애
Fas1 ABO37973.1 133751597 서모마이세스 라누기노수스
Fas2 ABO37974.1 133751599 서모마이세스 라누기노수스
Fas AAB03809.1 1036835 미코박테리움 투베르쿨로시스
Fas NP_004095.4 41872631 호모 사피엔스
3.1.2.b 아실-ACP 티오에스테라제
아실-ACP 티오에스테라제 효소는 아실-ACP를 이의 대응되는 산으로 변환한다. 이러한 변환은 도 7의 단계 H, L, T 및 AP에서 필요한다. 효소의 예로는 아라비돕시스 탈리아나의 FatA와 FatB 이소형을 포함한다 (Salas et al, Arch Biochem Biophys 403:25-34 (2002)). 이들 2종의 단백질들의 활성은 탄소쇄 길이에 따라 달라지며, FatA는 올레일-ACP를 선호하고, FatB는 팔미토일-ACP를 선호한다. 3.1.2.14를 참조한다. 다양한 체인 길이 특이성을 가진 다수의 티오에스테라제들이 WO 2008/113041에 기술되어 있으며, 아래 표에 포함되어 있다 [특허의 p 126 표 2A를 참조함]. 예를 들어, 움벨룰라리아 칼리포르니카 유래의 FatB와 같이, 중쇄의 식물 티오에스테라제를 에스케리키아 콜라이에서 발현시키면 주로 라우레이트 (C12:0)인 중쇄 지방산 화합물들이 고농도로 축적된다는 것이 기존에 입증되었다. 마찬가지로, 에스케리키아 콜라이에서 쿠페아 팔루스트리스의 FatB1 티오에스테라제를 발현시킨 결과 C8-10:0 아실-ACP가 축적되었다 (Dehesh et al, Plant Physiol 110:203-10 (1996)). 마찬가지로, 무스 틴크토리우스의 티오에스테라제는, 에스케리키아 콜라이에서 발현시켰을 때, C18:1 체인 종결을 >50배 증가시키며, 유리형 지방산으로서 방출된다 (Knutzon et al, Plant Physiol 100:1751-58 (1992)). 아실-ACP 티오에스테라제의 기질 특이성을 변형시키는 방법 역시 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (예컨대, EP1605048).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fatA AEE76980.1 332643459 아라비돕시스 탈리아나
fatB AEE28300.1 332190179 아라비돕시스 탈리아나
fatB2 AAC49269.1 1292906 쿠페아 호케리아나
fatB1 AAC49179.1 1215718 쿠페아 팔루스트리스
M96568.1:94..1251 AAA33019.1 404026 카르타무스 틴크토리우스
fatB1 Q41635.1 8469218 움벨룰라리아 칼리포르니카
tesA AAC73596.1 1786702 에스케리키아 콜라이
4.1.99.a 데카르보닐라제
실시예 VII에 기술된 데카르보닐라제 후보 효소들 역시 본원과 관련된다. 도 107에 나타낸 탈카르보닐화 반응을 촉매하는데 적합한 추가적인 후보 효소로는 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942의 orf1593 유전자 산물과 이의 상동체를 포함한다 (US 출원 2011/0207203).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
Orf1593 YP_400610.1 81300402 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942
4.2.1.a 하이드로-리아제
단계 C, AB, AC 및 AD를 비롯하여, 도 7의 몇몇 반응들은 탈수 반응을 도시한다. 또한, 실시예 VII에 도시된 하이드로-리아제 후보 효소들도 여기에 적용가능하다. 올리에이트 하이드라타제 효소들은 도 1-7의 모든 탈수 반응들, 특히 3-부텐-1-올의 부타디엔으로의 탈수 반응을 촉매하는데 이용할 수 있다. 올리에이트 하이드라타제 효소들은 비-활성화된 알켄의 이의 대응되는 알코올로의 가역적인 수화를 촉매한다. 이들 효소는 WO2011076691에서 제시된 바와 같이 적합한 추가적인 후보 효소이다. 엘리자베스킹기아 메닌고셉티카와 스트렙토코커스 피오게네스로부터 올리에이트 하이드라타제가 특정화되었다 (WO 2008/119735). 그 예로 하기 단백질들을 포함한다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
OhyA ACT54545.1 254031735 엘리자베스킹기아 메닌고셉티카
HMPREF0841_1446 ZP_07461147.1 306827879 스트렙토코커스 피오게네스 ATCC 10782
P700755_13397 ZP_01252267.1 91215295 피크로플렉수스 토르퀴스 ATCC 700755
RPB_2430 YP_486046.1 86749550 로도슈도모나스 팔루스트리스
3-하이드록시아실-ACP 데하이드라타제 효소는 3-하이드록시부티릴-ACP를 크로토닐-ACP로 탈수하는데 적합한 후보 효소이다 (단계 C, 도 7). 이러한 활성을 가진 효소로는 에스케리키아 콜라이의 FabA와 FabZ가 있으며, 이는 중첩되는 광범위한 기질 특이성을 가진다 (Heath, J Biol Chem 271:1833-6 (1996)). 전술한 지방산 신타제 컴플렉스 역시 이 반응을 촉매한다. 플라스모디움 팔시파룸로부터 FabZ 단백질의 구조가 결정되었다 (Kostrew et al, 단백질 Sci 14:1570-80 (2005)). 추가적인 후보는 효모의 Htd2p와, 호모 사피엔스 및 트리파노소마 브루세이의 TbHTD2에 코딩된, 미토콘드리아의 3-하이드록시아실-ACP 데하이드라타제이다 (Kastanoitis et al, Mol Micro 53:1407-21 (2004); Kaija et al, FEBS Lett 582:729-33 (2008)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
fabA AAC74040.1 1787187 에스케리키아 콜라이
fabZ AAC73291.1 1786377 에스케리키아 콜라이
PfFabZ AAK83685.1 15080870 플라스모디움 팔시파룸
Htd2p NP_011934.1 6321858 사카로마이세스 세레비지애
HTD2 P86397.1 281312149 호모 사피엔스
실시예 XIV
크로틸 알코올로부터 부타디엔의 화학적 생산
크로틸 알코올을 부타디엔으로 변환하는 전형적인 과정에서, 크로틸 알코올은 그대로 (neat) 또는 용매 중에서, 증기의 존재 또는 부재 하에, 반응 바셀 또는 튜브 안에서, 40-400 ℃로 가열된 고형 무기, 유기 또는 금속-함유성 탈수 촉매 위를 통과하여, 물이 제거되고 부타디엔이 기체로서 방출되며, 이는 응결 (부타디엔 bp = -4.4℃)되고 추가적인 가공, 저장 또는 사용을 위해 저장소에 수집된다. 전형적인 촉매로는 비스무스 몰리브데이트, 포스페이트-인산, 세슘 산화물, 카올린-철 산화물, 카올린-인산, 실리카-알루미나 및 알루미나가 있다. 전형적인 공정의 처리율은 0.1-20,000 kg/h이다. 전형적인 용매는 톨루엔, 헵탄, 옥탄, 에틸벤젠 및 자일렌이다.
실시예 XV
크로틸 알코올로부터 부타디엔을 생산하는 효소적 경로
본 실시예는 크로틸 알코올을 부타디엔으로 변환하는 효소 경로를 기술한다. 도 12에 2가지 경로가 도시된다. 한가지 경로로, 크로틸 알코올이 크로틸 알코올 키나제에 의해 2-부테닐-4-포스페이트로 인산화된다 (단계 A). 2-부테닐-4-포스페이트 중간 산물이 다시 2-부테닐-4-디포스페이트로 인산화된다 (단계 B). 부타디엔 신타제 효소는 2-부테닐-4-디포스페이트의 부타디엔으로의 변환을 촉매한다 (단계 C). 이러한 부타디엔 신타제는 본원에 기술된 바와 같이 방향성 진화 등의 방법을 이용하여 이소프렌 신타제와 같은 포스페이트 리아제 효소로부터 유래될 수 있다. 다른 경로로서, 크로틸 알코올이 디포스포키나제에 의해 2-부테닐-4-디포스페이트로 바로 변환된다 (단계 D). 단계 A-D의 후보 효소들을 아래에 제시한다.
크로틸 알코올 키나제 (도 12, 단계 A)
크로틸 알코올 키나제 효소는 크로틸 알코올의 하이드록시기로 포스페이트기를 전달하는 과정을 촉매한다. 아래 기술된 효소들은 본래 이러한 활성을 가지거나, 이러한 활성을 발휘하도록 조작될 수 있다. 포스페이트기를 알코올기로 전이하는 과정을 촉매하는 키나제는 EC 2.7.1 효소 클래스에 속한다. 아래 표에 EC 2.7.1 효소 클래스에서 몇가지 유용한 키나제 효소를 열거한다.
EC 번호 효소명 EC 번호 효소명 EC 번호 효소명
2.7.1.1 헥소키나제 2.7.1.48 우리딘 키나제 2.7.1.94 아실글리세롤 키나제
2.7.1.2 글루코키나제 2.7.1.49 하이드록시메틸피리미딘 키나제 2.7.1.95 카나마이신 키나제
2.7.1.3 케토헥소키나제 2.7.1.50 하이드록시에틸티아졸 키나제 2.7.1.100 S-메틸-5-티오리보스 키나제
2.7.1.4 프럭토키나제 2.7.1.51 L-푸쿨로키나제 2.7.1.101 타가토스 키나제
2.7.1.5 람눌로키나제 2.7.1.52 푸코키나제 2.7.1.102 하마멜로스 키나제
2.7.1.6 갈락토키나제 2.7.1.53 L-자일룰로키나제 2.7.1.103 비오마이신 키나제
2.7.1.7 만노키나제 2.7.1.54 D-아라비노키나제 2.7.1.105 6-포스포프럭토-2-키나제
2.7.1.8 글루코사민 키나제 2.7.1.55 알로스 키나제 2.7.1.106 글루코스-1,6-비스포스페이트 신타제
2.7.1.10 포스포글루코키나제 2.7.1.56 1-포스포프럭토키나제 2.7.1.107 디아실글리세롤 키나제
2.7.1.11 6-포스포프럭토키나제 2.7.1.58 2-데하이드로-3-데옥시갈락토노키나제 2.7.1.108 돌리콜 키나제
2.7.1.12 글루코노키나제 2.7.1.59 N-아세틸글루코사민 키나제 2.7.1.113 데옥시구아노신 키나제
2.7.1.13 데하이드로글루코노키나제 2.7.1.60 N-아실만노사민 키나제 2.7.1.114 AMP-티미딘 키나제
2.7.1.14 세도헵툴로키나제 2.7.1.61 아실-포스페이트-헥소스 포스포트랜스퍼라제 2.7.1.118 ADP-티미딘 키나제
2.7.1.15 리보키나제 2.7.1.62 포스포르아미데이트-헥소스 포스포트랜스퍼라제 2.7.1.119 히그로마이신-B 7"-O-키나제
2.7.1.16 리불로키나제 2.7.1.63 폴리포스페이트-글루코스 포스포트랜스퍼라제 2.7.1.121 포스포에놀피루베이트-글리세론 포스포트랜스퍼라제
2.7.1.17 자일룰로키나제 2.7.1.64 이노시톨 3-키나제 2.7.1.122 자일리톨 키나제
2.7.1.18 포스포리보키나제 2.7.1.65 스실로-이노사민 4-키나제 2.7.1.127 이노시톨-트리스포스페이트 3-키나제
2.7.1.19 포스포리불로키나제 2.7.1.66 운데카프레놀 키나제 2.7.1.130 테트라아실디사카라이드 4'-키나제
2.7.1.20 아데노신 키나제 2.7.1.67 1-포스파티딜이노시톨 4-키나제 2.7.1.134 이노시톨-테트라키스포스페이트 1-키나제
2.7.1.21 티미딘 키나제 2.7.1.68 1-포스파티딜이노시톨-4-포스페이트 5-키나제 2.7.1.136 마크롤라이드 2'-키나제
2.7.1.22 리보실니코틴아미드 키나제 2.7.1.69 단백질-Np-포스포히스티딘-당 포스포트랜스퍼라제 2.7.1.137 포스파티딜이노시톨 3-키나제
2.7.1.23 NAD+ 키나제 2.7.1.70 EC 2.7.1.37와 상동 2.7.1.138 세라마이드 키나제
2.7.1.24 데포스포-CoA 키나제 2.7.1.71 쉬키메이트 키나제 2.7.1.140 이노시톨-테트라키스포스페이트 5-키나제
2.7.1.25 아데닐릴-설페이트 키나제 2.7.1.72 스트렙토마이신 6-키나제 2.7.1.142 글리세롤-3-포스페이트-글루코스 포스포트랜스퍼라제
2.7.1.26 리보플라빈 키나제 2.7.1.73 이노신 키나제 2.7.1.143 디포스페이트-퓨린 뉴클레오사이드 키나제
2.7.1.27 에리트리톨 키나제 2.7.1.74 데옥시시티딘 키나제 2.7.1.144 타가토스-6-포스페이트 키나제
2.7.1.28 트리오키나제 2.7.1.76 데옥시아데노신 키나제 2.7.1.145 데옥시뉴클레오사이드 키나제
2.7.1.29 글리세론 키나제 2.7.1.77 뉴클레오사이드 포스포트랜스퍼라제 2.7.1.146 ADP-의존형 포스포프럭토키나제
2.7.1.30 글리세롤 키나제 2.7.1.78 폴리뉴클레오티드 5'-하이드록실-키나제 2.7.1.147 ADP-의존형 글루코키나제
2.7.1.31 글리세레이트 키나제 2.7.1.79 디포스페이트-글리세롤 포스포트랜스퍼라제 2.7.1.148 4-(시티딘 5'-디포스포)-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제
2.7.1.32 콜린 키나제 2.7.1.80 디포스페이트-세린 포스포트랜스퍼라제 2.7.1.149 1-포스파티딜이노시톨-5-포스페이트 4-키나제
2.7.1.33 판토테네이트 키나제 2.7.1.81 하이드록시라이신 키나제 2.7.1.150 1-포스파티딜이노시톨-3-포스페이트 5-키나제
2.7.1.34 판테테인 키나제 2.7.1.82 에탄올아민 키나제 2.7.1.151 이노시톨-폴리포스페이트 멀티키나제
2.7.1.35 피리독살 키나제 2.7.1.83 슈도우리딘 키나제 2.7.1.153 포스파티딜이노시톨-4,5-비스s포스페이트 3-키나제
2.7.1.36 메발로네이트 키나제 2.7.1.84 알킬글리세론 키나제 2.7.1.154 포스파티딜이노시톨-4-포스페이트 3-키나제
2.7.1.39 호모세린 키나제 2.7.1.85 베타-글루코사이드 키나제 2.7.1.156 아데노실코빈아미드 키나제
2.7.1.40 피루베이트 키나제 2.7.1.86 NADH 키나제 2.7.1.157 N-아세틸갈락토사민 키나제
2.7.1.41 글루코스-1-포스페이트 포스포디스뮤타제 2.7.1.87 스트렙토마이신 3"-키나제 2.7.1.158 이노시톨-펜타키스포스페이트 2-키나제
2.7.1.42 리보플라빈 포스포트랜스퍼라제 2.7.1.88 디하이드로스트레토마이신-6-포스페이트 3'a-키나제 2.7.1.159 이노시톨-1,3,4-트리스포스페이트 5/6-키나제
2.7.1.43 글루쿠로노키나제 2.7.1.89 티아민 키나제 2.7.1.160 2'-포스포트랜스퍼라제
2.7.1.44 갈락투로노키나제 2.7.1.90 디포스페이트-프럭토스-6-포스페이트 1-포스포트랜스퍼라제 2.7.1.161 CTP-의존형 리보플라빈 키나제
2.7.1.45 2-데하이드로-3-데옥시글루코노키나제 2.7.1.91 스핀가닌 키나제 2.7.1.162 N-아세틸헥소사민 1-키나제
2.7.1.46 L-아라비노키나제 2.7.1.92 5-데하이드로-2-데옥시글루코노키나제 2.7.1.163 히그로마이신 B 4-O-키나제
2.7.1.47 D-리불로키나제 2.7.1.93 알킬글리세롤 키나제 2.7.1.164 O-포스포세릴-tRNASec 키나제
메발로네이트 키나제 (EC 2.7.1.36)는 메발로네이트의 말단 하이드록시기를 인산화한다. 이 단계의 후보 유전자로는 사카로마이세스 세레비지애의 erg12, 메타노칼도코커스 야나스키의 mvk, 호모 사피엔스의 MVK 및 아라비돕시스 탈리아나 col의 mvk를 포함한다. 추가적인 메발로네이트 키나제 후보로는 아케온(archeon) 메타노사르시나 마제이의 피드백-내성의 메발로네이트 키나제 (Primak et al, AEM, in press (2011))와 스트렙토코커스 뉴모니애의 Mvk 단백질 (Andreassi et al, Protein Sci, 16:983-9 (2007))이 있다. 사카로마이세스 세레비지애, 스트렙토코커스 뉴모니애 및 메타노사르시나 마제이로부터 유래된 Mvk 단백질들이 이종적으로 발현되었으며, 에스케리키아 콜라이에서 특정화되었다 (Primak et al, supra). 스트렙토코커스 뉴모니애의 메발로네이트 키나제는 실로프로필메발로네이트, 비닐메발로네이트 및 에티닐메발로네이트 등의 수종의 대안적인 기질에 활성을 나타내었으며 (Kudoh et al, Bioorg Med Chem 18:1124-34 (2010)), 후속적인 실험으로 리간드 결합부가 컴팩트한 전자가 풍부한 C(3)-치환기에 대해 선택적인 것으로 확인되었다 (Lefurgy et al, J Biol Chem 285:20654-63 (2010)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
erg12 CAA39359.1 3684 사카로마이세스 세레비지애
mvk Q58487.1 2497517 메타노칼도코커스 야나스키이
mvk AAH16140.1 16359371 호모 사피엔스
mvk NP_851084.1 30690651 아라비돕시스 탈리아나
mvk NP_633786.1 21227864 메타노사르시나 마제이
mvk NP_357932.1 15902382 스트렙토코커스 뉴모니애
글리세롤 키나제는 또한 글리세롤의 말단 하이드록실기를 인산화하여 글리세롤-3-포스페이트를 만들다. 이 반응은, 에스케리키아 콜라이, 사카로마이세스 세레비지애 및 서모토가 마리티마를 비롯하여 여러가지 종들에서 이루어진다. 에스케리키아 콜라이의 글리세롤 키나제는 대체 기질로서 디하이드록시아세톤과 글리세르알데하이드 등을 받아들이는 것으로 확인된 바 있다 (Hayashi et al., J Biol.Chem. 242:1030-1035 (1967)). 서모토가 마리티마는 2종의 글리세롤 키나제를 가진다 (Nelson et al., Nature 399:323-329 (1999)). 글리세롤 키나제는 기질 특이성이 넓은 것으로 알려져 있다. Crans과 Whiteside는 4종의 유기체(에스케리키아 콜라이, 사카로마이세스 세레비지애, 바실러스 스테아로서모필러스 및 칸디다 미코더마)에서 글리세롤 키나제를 연구하였다 (Crans et al., J. Am. Chem. Soc. 107:7008-7018 (2010); Nelson et al., 상기 참조, (1999)). 이들은 글리세롤의 66종의 유사체를 연구하였고, 이 효소가 하나의 말단 하이드록실기 대신 다양한 치환기를 허용할 수 있으며 메틸기로 C2의 수소 원자를 치환할 수 있다고 결론내렸다. 흥미롭게도, 4종의 유기체에서 유래한 효소들 모두 카이네틱 상수가 매우 비슷하였다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
glpK AP_003883.1 89110103 에스케리키아 콜라이 K12
glpK1 NP_228760.1 15642775 서모토가 마리타임 MSB8
glpK2 NP_229230.1 15642775 서모토가 마리타임 MSB8
Gut1 NP_011831.1 82795252 사카로마이세스 세레비지애
호모세린 키나제는 가능성 있는 다른 후보 효소이다. 이 효소는 또한 에스케리키아 콜라이, 스트렙토마이세스 sp, 및 사카로마이세스 세레비지애 등의 다수의 유기체들에 존재한다. 에스케리키아 콜라이의 호모세린 키나제는 L-2-아미노, 1,4-부탄디올, 아스파르테이트 세미알데하이드 및 2-아미노-5-하이드록시발레레이트 등의 다양한 기질에 대해 활성을 가지는 것으로 확인되었다 (Huo et al., Biochemistry 35:16180-16185 (1996); Huo et al., Arch. Biochem. Biophys. 330:373-379 (1996)). 이 효소는 알파 위치의 카르복실시가 에스테르로 치환되거나 또는 하이드록시메틸기로 치환된 기질에 작용할 수 있다. 후보 유전자는 다음과 같다:
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
thrB BAB96580.2 85674277 에스케리키아 콜라이 K12
SACT1DRAFT_4809 ZP_06280784.1 282871792 스트렙토마이세스 sp. ACT-1
Thr1 AAA35154.1 172978 사카로마이세스 세레비지애
2-부테닐-4-포스페이트 키나제 (도 12, 단계 B)
2-부테닐-4-포스페이트 키나제 효소는 2-부테닐-4-포스페이트의 포스페이트기로 포스페이트기를 전이시키는 과정을 촉매한다. 아래 기술된 효소는 본래 이러한 활성을 가지거나, 이러한 활성을 발휘하도록 조작될 수 있다. 포스페이트기를 다른 포스페이트기로 전이시키는 과정을 촉매하는 키나제는 EC 2.7.4 효소 클래스에 속한다. 아래 표는 EC 2.7.4 효소 클래스에 속하는 수종의 유용한 키나제 효소를 열거한다.
EC 번호 효소명
2.7.4.1 폴리포스페이트 키나제
2.7.4.2 포스포메발로네이트 키나제
2.7.4.3 아데닐레이트 키나제
2.7.4.4 뉴클레오사이드-포스페이트 키나제
2.7.4.6 뉴클레오사이드-디포스페이트 키나제
2.7.4.7 포스포메틸피리미딘 키나제
2.7.4.8 구아닐레이트 키나제
2.7.4.9 dTMP 키나제
2.7.4.10 뉴클레오사이드-트리포스페이트-아데닐레이트 키나제
2.7.4.11 (데옥시)아데닐레이트 키나제
2.7.4.12 T2-유도성 데옥시뉴클레오티드 키나제
2.7.4.13 (데옥시)뉴클레오사이드-포스페이트 키나제
2.7.4.14 시티딜레이트 키나제
2.7.4.15 티아민-디포스페이트 키나제
2.7.4.16 티아민-포스페이트 키나제
2.7.4.17 3-포스포글리세로일-포스페이트-폴리포스페이트 포스포트랜스퍼라제
2.7.4.18 파르네실-디포스페이트 키나제
2.7.4.19 5-메틸데옥시시티딘-5'-포스페이트 키나제
2.7.4.20 돌리킬-디포스페이트-폴리포스페이트 포스포트랜스퍼라제
2.7.4.21 이노시톨-헥사키스포스페이트 키나제
2.7.4.22 UMP 키나제
2.7.4.23 리보스 1,5-비스포스페이트 포스포키나제
2.7.4.24 디포스포이노시톨-펜타키스스페이트 키나제
2.7.4.- 파르네실 모노포스페이트 키나제
2.7.4.- 제라닐-제라닐 모노포스페이트 키나제
2.7.4.- 피틸-포스페이트 키나제
포스포메발로네이트 키나제 효소는 매우 흥미를 끈다. 포스포메발로네이트 키나제 (EC 2.7.4.2)는 2-부테닐-4-포스페이트 키나제로의 유사 변환을 촉매한다. 이 효소는 사카로마이세스 세레비지애의 erg8 (Tsay et al., Mol.Cell Biol. 11:620-631 (1991))와 스트렙토코커스 뉴모니애, 스타필로코커스 아우레우스 및 엔테로코커스 패칼리스의 mvaK2에 의해 코딩된다 (Doun et al., Protein Sci. 14:1134-1139 (2005); Wilding et al., J Bacteriol. 182:4319-4327 (2000)). 스트렙토코커스 뉴모니애와 엔테로코커스 패칼리스에서 효소들이 클로닝되었고, 에스케리키아 콜라이에서 특정화되었다 (Pilloff et al., J Biol. Chem. 278:4510-4515 (2003); Doun et al., Protein Sci. 14:1134-1139 (2005)). 스트렙토코커스 뉴모니애의 포스포메발로네이트 키나제는 실로프로필메발로네이트 포스페이트, 비닐메발로네이트 포스페이트 및 에티닐메발로네이트 포스페이트 등의 수종의 대안적인 기질에 대해 활성을 나타내었다 (Kudoh et al, Bioorg Med Chem 18:1124-34 (2010)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
Erg8 AAA34596.1 171479 사카로마이세스 세레비지애
mvaK2 AAG02426.1 9937366 스타필로코커스 아우레우스
mvaK2 AAG02457.1 9937409 스트렙토코커스 뉴모니애
mvaK2 AAG02442.1 9937388 엔테로코커스 패칼리스
파르네실 모노포스페이트 키나제 효소는 파르네실 모노포스페이트를 파르네실 디포스페이트로 CTP 의존적으로 인산화하는 과정을 촉매한다. 마찬가지로, 제라닐제라닐 포스페이트 키나제는 CTP 의존적인 인산화를 촉매한다. 이 활성을 가진 효소는 배양한 니코티아나 타바쿰의 미소체 분획에서 동정되었다 (Thai et al, PNAS 96:13080-5 (1999)). 그러나, 연관된 유전자는 아직까지 동정되지 않았다.
부타디엔 신타제 (도 12, 단계 C)
부타디엔 신타제는 2-부테닐-4-디포스페이트의 1,3-부타디엔으로의 변환을 촉매한다. 하기 기술된 효소들은 천연적으로 이러한 활성을 가지고 있거나, 또는 이런 활성을 발휘하도록 조작될 수 있다. 포스페이트에 작용하는 탄소-옥시젠 리아제는 EC 4.2.3 효소 클래스에서 확인된다. 하기 표에는 EC 클래스 4.2.3에 속하는 유용한 효소 몇종을 열거한다.
효소 위임 번호 효소명
4.2.3.15 미르센 신타제
4.2.3.26 리날롤 신타제
4.2.3.27 이소프렌 신타제
4.2.3.36 테르펜트리엔 신타제
4.2.3.46 (E, E)-알파-파르네센 신타제
4.2.3.47 베타-파르네센 신타제
4.2.3.49 네롤리돌 신타제
특히 유용한 효소로는 이소프렌 신타제, 미르센 신타제와 파르네센 신타제가 있다. 아래에 후보 효소들을 나타낸다.
이소프렌 신타제는 천연적으로 디메틸알릴 디포스페이트의 이소프렌으로의 변환을 촉매하지만, 또한, 2-부테닐-4-디포스페이트로부터 1,3-부타디엔의 합성도 촉매할 수 있다. 이소프렌 신타제는 포풀루스 알바 (Sasaki et al., FEBS Letters, 2005, 579 (11), 2514-2518), 퓨레라리아 몬타나 (Lindberg et al., Metabolic Eng, 12(1):70-79 (2010); Sharkey et al., Plant Physiol., 137(2):700-712 (2005)), 및 포풀루스 카네센스(Populus canescens)로도 지칭되는 포풀루스 트레물라 x 포풀루스 알바 (Miller et al., Planta, 2001, 213 (3), 483-487) 등의 수종의 유기체들에서 확인할 수 있다. 포풀루스 카네센스의 이소프렌 신타제의 결정 구조가 규명되었다 (Koksal et al, J Mol Biol 402:363-373 (2010)). 추가적인 이소프렌 신타제 효소들은 (Chotani et al., WO/2010/031079, Systems Using Cell Culture for Production of Isoprene; Cervin et al., US 특허 출원 20100003716, Isoprene Syntase Variants for Improved Microbial Production of Isoprene)에 기술되어 있다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
ispS BAD98243.1 63108310 포풀루스 알바
ispS AAQ84170.1 35187004 퓨레라리아 몬타나
ispS CAC35696.1 13539551 포풀루스 트레물라 x 포풀루스 알바
미르센 신타제 효소는 제라닐 디포스페이트를 베타-미르센으로 탈인산화하는 과정을 촉매한다 (EC 4.2.3.15). 예시적인 미르센 신타제는 솔라눔 리코페시쿰의 MST2 (van Schie et al, Plant Mol Biol 64:D473-79 (2007)), 피세아 아비에스의 TPS-Myr (Martin et al, Plant Physiol 135:1908-27 (2004)), 아비에스 그란디스의 g-myr (Bohlmann et al, J Biol Chem 272:21784-92 (1997)) 및 아라비돕시스 탈리아나의 TPS10 (Bohlmann et al, Arch Biochem Biophys 375:261-9 (2000))에 의해 코딩된다. 이들 효소는 에스케리키아 콜라이에서 이종적으로 발현되었다.
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
MST2 ACN58229.1 224579303 솔라눔 리코페시쿰
TPS-Myr AAS47690.2 77546864 피세아 아비에스
G-myr O24474.1 17367921 아비에스 그란디스
TPS10 EC07543.1 330252449 아라비돕시스 탈리아나
파르네실 디포스페이트는 알파-파르네센 신타제과 베타-파르네센 신타제에 의해 각각 알파-파르네센과 베타-파르네센으로 변환된다. 예시적인 알파-파르네센 신타제 효소로는 아라비돕시스 탈리아나의 TPS03와 TPS02 (Faldt et al, Planta 216:745-51 (2003); Huang et al, Plant Physiol 153:1293-310 (2010)), 쿠쿠미스 사티부스의 afs (Mercke et al, Plant Physiol 135:2012-14 (2004), 말루스 x 도메스티카의 eafar (Green et al, Phytochem 68:176-88 (2007)) 및 피세아 아비에스의 TPS-Far (Martin, supra)가 있다. 예시적인 베타-파르네센 신타제 효소는 지아 메이스의 TPS1에 의해 코딩된다 (Schnee et al, Plant Physiol 130:2049-60 (2002)).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
TPS03 A4FVP2.1 205829248 아라비돕시스 탈리아나
TPS02 P0CJ43.1 317411866 아라비돕시스 탈리아나
TPS-Far AAS47697.1 44804601 피세아 아비에스
afs AAU05951.1 51537953 쿠쿠미스 사티부스
eafar Q84LB2.2 75241161 말루스 x 도메스티카
TPS1 Q84ZW8.1 75149279 지아 메이스
크로틸 알코올 디포스포키나제 (도 12, 단계 D)
크로틸 알코올 디포스포키나제 효소는 디포스페이트기의 크로틸 알코올의 하이드록실기로의 전이를 촉매한다. 아래 기술된 효소는 본래 이러한 활성을 가지거나, 이러한 활성을 발휘하도록 조작될 수 있다. 디포스페이트기의 전이를 촉매하는 키나제는 EC 2.7.6 효소 클래스에 속한다. 아래 표는 EC 2.7.6 효소 클래스에 속하는 몇가지 유용한 키나제 효소를 열거한다.
효소 위임 번호 효소명
2.7.6.1 리보스-포스페이트 디포스포키나제
2.7.6.2 티아민 디포스포키나제
2.7.6.3 2-아미노-4-하이드록시-6-하이드록시메틸디하이드로프테리딘 디포스포키나제
2.7.6.4 뉴클레오티드 디포스포키나제
2.7.6.5 GTP 디포스포키나제
특히 흥미로운 효소는 에스케리키아 콜라이 (Hove-Jenson et al., J Biol Chem, 1986, 261(15);6765-71)와 미코플라스마 뉴모니애 M129 (McElwain et al, International Journal of Systematic Bacteriology, 1988, 38:417-423)에서 동정된 리보스-포스페이트 디포스포키나제 효소와, 티아민 디포스포키나제 효소이다. 티아민 디포스포키나제 효소의 예는 아라비돕시스 탈리아나에서도 확인된다 (Ajjawi, Plant Mol Biol, 2007, 65(1-2);151-62).
단백질 유전자은행 ID GI 번호 유기체
prs NP_415725.1 16129170 에스케리키아 콜라이
prsA NP_109761.1 13507812 미코플라스마 뉴모니애 M129
TPK1 BAH19964.1 222424006 아라비돕시스 탈리아나 col
TPK2 BAH57065.1 227204427 아라비돕시스 탈리아나 col
본 명세서에서는 전체에 걸쳐 다양한 문헌들을 참조한다. 유전자은행 및 GI 번호 공개물을 비롯하여, 이들 간행물의 내용은 그 전체가 본 발명이 속하는 기술 분야의 상황을 보다 충분히 설명하기 위해 본 명세서에 원용에 의해 포함된다. 본 발명은 전술한 실시예를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 사상으로부터 이탈되지 않는 범위내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (69)

1,3-부탄디올 경로를 구비한 비-천연성 미생물 유기체로서,
상기 경로는 1,3-부탄디올을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 1,3-부탄디올 경로 효소를 각각 코딩하는 외인성 핵산들을 포함하며,
상기 1,3-부탄디올 경로가 하기 경로들로부터 선택되는 경로를 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체:
(33) 7AS, 7P, 7N 및 7AA;
(27) 7AS, 7E, 7F, 7G 및 7S;
(28) 7AS, 7I, 7G 및 7S;
(29) 7AS, 7K, 및 7S;
(30) 7AS, 7I, 7R 및 7AA;
(31) 7AS, 7E, 7F, 7R 및 7AA;
(32) 7AS, 7E, 7Q, 7Z 및 7AA;
(34) 7AS, 7P, 7Y, 7Z 및 7AA; 및
(35) 7AS, 7P 및 7O;
상기 경로에서, 7E는 아세토아세틸-CoA에서 아세토아세테이트로의 전환을 촉매하는, 아세토아세틸-CoA 하이드롤라제, 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제 또는 아세토아세틸-CoA 신테타제이고, 7F는 아세토아세테이트에서 3-옥소부티르알데하이드로의 전환을 촉매하는 아세토아세테이트 리덕타제 (산 환원)이고, 7G는 3-옥소부티르알데하이드에서 4-하이드록시-2-부타논으로의 전환을 촉매하는 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제 (알데하이드 환원)이고, 7I는 아세토아세틸-CoA에서 3-옥소부티르알데하이드로의 전환을 촉매하는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (CoA-의존성, 알데하이드 형성)이고, 7K는 아세토아세틸-CoA에서 4-하이드록시-2-부타논으로의 전환을 촉매하는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (알코올 형성)이고, 7N은 3-하이드록시부티릴-CoA에서 3-하이드록시부티르알데하이드로의 전환을 촉매하는 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성)이고, 7O는 3-하이드록시부티릴-CoA에서 1,3-부탄디올로의 전환을 촉매하는 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 (알코올 형성)이고, 7P는 아세토아세틸-CoA에서 3-하이드록시부티릴-CoA 로의 전환을 촉매하는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7Q는 아세토아세테이트에서 3-하이드록시부티레이트로의 전환을 촉매하는 아세토아세테이트 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7R은 3-옥소부티르알데하이드에서 3-하이드록시부티르알데하이드로의 전환을 촉매하는 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제 (케톤 환원)이고, 7S는 4-하이드록시-2-부타논에서 1,3-부탄디올로의 전환을 촉매하는 4-하이드록시-2-부타논 리덕타제이고, 7Y는 3-하이드록시부티릴-CoA에서 3-하이드록시부티레이트로의 전환을 촉매하는, 3-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 3-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제 또는 3-하이드록시부티릴-CoA 신테타제이고, 7Z는 3-하이드록시부티레이트에서 3-하이드록시부티르알데하이드로의 전환을 촉매하는 3-하이드록시부티레이트 리덕타제이고, 7AA는 3-하이드록시부티르알데하이드에서 1,3-부탄디올로의 전환을 촉매하는 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제이고, 및 7AS는 말로닐-CoA에서 아세토아세틸-CoA로의 전환을 촉매하는 아세토아세틸-CoA 신타제임.
제1항에 있어서, 상기 1,3-부탄디올 경로가 경로 (27) 7AS, 7E, 7F, 7G 및 7S을 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체.
제1항에 있어서, 상기 1,3-부탄디올 경로가 경로 (28) 7AS, 7I, 7G 및 7S 을 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체.
제1항에 있어서, 상기 1,3-부탄디올 경로가 경로 (29) 7AS, 7K, 및 7S 을 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체.
제1항에 있어서, 상기 1,3-부탄디올 경로가 경로 (30) 7AS, 7I, 7R 및 7AA 을 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체.
제1항에 있어서, 상기 1,3-부탄디올 경로가 경로 (31) 7AS, 7E, 7F, 7R 및 7AA 을 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체.
제1항에 있어서, 상기 1,3-부탄디올 경로가 경로 (32) 7AS, 7E, 7Q, 7Z 및 7AA 을 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체.
제1항에 있어서, 상기 1,3-부탄디올 경로가 경로 (33) 7AS, 7P, 7N 및 7AA 을 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체.
제1항에 있어서, 상기 1,3-부탄디올 경로가 경로 (34) 7AS, 7P, 7Y, 7Z 및 7AA 을 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체.
제1항에 있어서, 상기 1,3-부탄디올 경로가 경로 (35) 7AS, 7P 및 7O 을 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체.
제1항에 있어서,
적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5종의 상기 외인성 핵산이 이종 핵산인,
비-천연성 미생물 유기체.
제1항에 있어서,
하기 구성 요소를 더 포함하는, 비-천연성 미생물 유기체:
(i) ATP-시트레이트 리아제, 시트레이트 리아제, 시트릴-CoA 신테타제, 시트릴-CoA 리아제, 푸마레이트 리덕타제 및 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제로부터 선택되는, 환원성 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는, 환원성 TCA 경로;
(ii) 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, CO 데하이드로게나제 및 H2 하이드로게나제로부터 선택되는, 환원성 TCA 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는, 환원성 TCA 경로; 또는
(iii) CO 데하이드로게나제, H2 하이드로게나제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산.
제1항에 있어서, 상기 비-천연성 미생물 유기체가 박테리아, 효모 또는 진균의 종인, 비-천연성 미생물 유기체.
제13항에 있어서, 상기 박테리아가 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 안에어로비오스피릴룸 숙시니시프로두센스 (Anaerobiospirillum succiniciproducens), 액티노바실러스 숙시노게네스 (Actinobacillus succinogenes), 만하이미아 숙시니시프로두센스 (Mannheimia succiniciproducens), 리조비움 에틀리 (Rhizobium etli), 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum), 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator), 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans), 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 락토바실러스 플라타룸 (Lactobacillus plantarum), 스트렙토마이세스 코엘리콜러 (Streptomyces coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리컴 (Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) 및 슈도모나스 푸티타 (Pseudomonas putida)로부터 선택되는 것인, 비-천연성 미생물 유기체.
제14항에 있어서, 상기 효모 또는 진균이 사카로마이세스 세레비지애, 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 클루베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus) 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 피키아 패스토리스 (Pichia pastoris), 리조푸스 아리주스 (Rhizopus arrhizus), 리조부스 오리제 (Rhizobus oryzae), 야오이와 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 및 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 로부터 선택되는 것인, 비-천연성 미생물 유기체.
1,3-부탄디올을 생산하기 위한 조건과 충분한 기간 동안 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 비-천연성 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는,
1,3-부탄디올의 제조 방법.
제16항에 있어서, 상기 방법이 배양물내 다른 성분들로부터 1,3-부탄디올을 분리하는 것을 더욱 포함하는 것인, 제조 방법.
제17항에 있어서, 상기 분리가 추출, 연속적인 액체-액체 추출, 투석증발(pervaporation), 막 여과, 막 분리, 역삼투압, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과(extractive filtration), 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 및 한외여과 중 하나 이상을 포함하는, 제조 방법.
제18항에 있어서, 상기 분리가 증류를 포함하는, 제조 방법.
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