KR101839595B1 - 락탐의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아미노산으로부터 오메가-아미노산 생합성 대사경로를 가지고 있는 미생물에 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 오메가-아미노산으로부터 락탐 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 다양한 락탐 및 오메가-아미노아실-CoA의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 미생물 및 락탐의 제조방법은 다양한 오메가-아미노산으로부터 프로피오락탐, 2-피롤리돈, 발러로락탐, 카프로락탐 및 헵타노락탐 등 다양한 락탐을 제조하는 데 유용하다.

Description

락탐의 제조방법 {Method for Preparing Various Lactam}
본 발명은 효소를 이용하여 락탐의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 오메가-아미노산을 오메가-아미노아실-CoA로 전환하는 효소 또는 상기 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물을 이용한 락탐의 제조방법에 관한 것이다.
최근 석유 고갈문제와 환경 문제로 인해 미생물을 이용한 지속가능한 다양한 부가가치 화학제품 생산에 큰 이목이 집중되고 있다. 다양한 부가가치 화합물 중에서도 나일론의 전구체인 다양한 락탐들의 생산을 위해 많은 연구가 진행 되고 있으나, 현재까지 재조합 미생물을 이용한 다양한 락탐들의 생산 성공 사례는 없다.
하지만 기존 대사공학적 방법을 이용하여 락탐들의 전구체인 오메가-아미노산들을 생산하는 재조합 미생물은 보고된 바가 많다. 대표적인 예로 락탐들인 2-피롤리돈, 발러로락탐, 카프로락탐의 전구체인 오메가-아미노산들인 gamma-aminobutyric acid (GABA), 5-aminovaleric acid (5AVA), 6-aminocaproic acid (6ACA)를 생산한 사례들이 공지되었다. 첫 번째로 GABA의 경우 크게 코리네박테리움(Corynebacterium) (Shi et al., Biotechol . Lett . 33:2469-2474 2011; Shi et al., J. Ind . Microbiol . Biotechnol . 40:1285-1296, 2013; Takahashi et al., Enzyme Microb . Tech. 51:171-176, 2012) 과 젖산 박테리아 (Lactic acid bacteria) (Li et al., Microb . Cell. Fact. 9:85, 2010) 기반의 재조합 미생물을 이용하여 생산 연구가 진행되고 있다. 그리고 5AVA의 경우 대장균 (Escherichia coli)를 이용하여 생산된 바가 있다 (Park et al., Metab . Eng . 16:42-47, 2013; Adkins et al., Biotechnol . Bioeng . 110:1726-1734, 2013). 마지막으로 6ACA의 경우 메테인세균 (methanogens)의 대사회로를 기반으로 하여 5-formylvaleric acid (US 2012/0028320 A1)를 통하여 6ACA 생산 (US 2014/0134681)을 성공하여 특허를 출원한 바 있다.
재조합 미생물을 이용한 직접적인 락탐 생산은 보고된바 없으나 가장 많은 수요를 가지고 있는 락탐 중 하나인 카프로락탐을 미생물에서 생산할 수 있는 대사 회로를 디자인한 특허가 있다 (US 2013/0303723 A1). 하지만 이 특허에서는 이러한 대사회로를 실제로 일어나게 할 수 있는 효소 및 실제 카프로락탐이 생산된 데이터는 전혀 없다.
이에, 본 발명자들은 미생물을 이용하여 다양한 락탐을 효율적으로 생산하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 오메가-아미노산(omega-amino acid)을 기질(substrate)로 받아들여 오메가-아미노아실-CoA로 전환하는 효소를 새롭게 찾았고. 상기 효소 자체 또는 그 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용하여 락탐을 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 오메가-아미노산을 오메가-아미노아실-CoA로 변환하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여 오메가-아미노산으로부터 다양한 락탐의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 오메가-아미노산을 오메가-아미노아실-CoA로 변환하는 효소를 이용하여 오메가-아미노산으로부터 다양한 락탐을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 오메가-아미노산을 오메가-아미노아실-CoA로 변환하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물을 이용한 오메가-아미노산으로부터 다양한 오메가-아미노아실-CoA를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 오메가-아미노산을 오메가-아미노아실-CoA로 변환하는 효소를 이용하여 오메가-아미노산으로부터 다양한 오메가-아미노아실-CoA를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오메가-아미노산 생합성 대사경로를 가지고 있는 미생물에 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 오메가-아미노산으로부터 락탐 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 락탐을 생성하는 단계 및; (b) 상기 생성된 락탐을 회수하는 단계를 포함하는 beta-alanine coenzyme A transferase 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용한 오메가-아미노산으로부터 락탐의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 오메가-아미노산을 포함하는 반응용액에 beta-alanine coenzyme A transferase를 혼합한 다음 반응시켜, 오메가-아미노아실-CoA를 제조하는 단계 및; (b) 상기 제조된 오메가-아미노아실-CoA의 고리 구조 형성을 통해 락탐을 제조하는 단계를 포함하는 beta-alanine coenzyme A transferase를 이용한 오메가-아미노산으로부터 락탐의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 오메가-아미노아실-CoA을 생성하는 단계 및; (b) 상기 생성된 오메가-아미노아실-CoA을 회수하는 단계를 포함하는 beta-alanine coenzyme A transferase 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용한 오메가-아미노산으로부터 오메가-아미노아실-CoA의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 오메가-아미노산을 포함하는 반응용액에 beta-alanine coenzyme A transferase를 혼합한 다음, 반응시켜, 오메가-아미노아실-CoA를 제조하는 단계를 포함하는 beta-alanine coenzyme A transferase를 이용한 오메가-아미노산으로부터 오메가-아미노아실-CoA의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 미생물은 오메가-아미노산으로부터 프로피오락탐, 2-피롤리돈, 발러로락탐, 카프로락탐 및 헵타노락탐 등의 다양한 락탐 화합물들을 제조할 수 있어, 락탐의 산업적 생산에 유용하다.
도 1은 오메가-아미노산으로부터 omega-amino acyl coenzyme A를 걸쳐 다양한 락탐을 생산하는 경로를 나타낸 것이다.
도 2은 beta-alanine coenzyme A transferase를 정제하기 위해 his-tagging 된 act 유전자가 삽입된 pET30α his-act 과발현 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 3은 정제된 beta-alanine coenzyme A의 SDS-PAGE 사진이다.
도 4은 beta-alanine coenzyme A transferase의 효소를 이용하여 in vitro 조건에서 제조한 GABA-CoA의 분석결과이다.
도 5는 beta-alanine coenzyme A transferase의 효소를 이용하여 in vitro 조건에서 제조한 6ACA-CoA의 분석결과이다.
도 6은 beta-alanine coenzyme A transferase의 효소를 이용하여 in vitro 조건에서 제조한 2-피롤리돈의 분석결과이다.
도 7은 beta-alanine coenzyme A transferase의 효소를 이용하여 in vitro 조건에서 제조한 카프로락탐의 분석결과이다.
도 8은 beta-alanine coenzyme A transferase를 미생물 내에서 발현하기 위해 제작한 act 유전자가 삽입된 pTac15k_act 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 9는 상기 벡터가 도입된 재조합 미생물을 배양하여 제조한 2-피롤리돈의 분석결과이다.
도 10은 beta-alanine coenzyme A transferase의 효소를 이용하여 in vitro 조건에서 제조한 7AHA-CoA의 분석결과이다.
도 11은 beta-alanine coenzyme A transferase의 효소를 이용하여 in vitro 조건에서 제조한 발러로락탐의 분석결과이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에서 수행한 라이신으로부터 발러로락탐을 생산하는 대사경로를 나타낸 것이다.
도 13은 beta-alanine coenzyme A transferase를 미생물 내에서 발현하기 위해 제작한 act 유전자가 삽입된 pEKEx1_act 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 14는 글루탐산 디카르복실레이즈를 미생물 내에서 발현하기 위해 제작한 gadB 유전자가 삽입된 pEKEx1_gadB 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 15는 beta-alanine coenzyme A transferase와 글루탐산 디카르복실레이즈를 미생물내에서 발현하기 위해 제작한 act와 gadB 유전자가 삽입된 pEKEx1_act_gadB 플라스미드를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 효소 beta-alanine coenzyme A transferase가 자연적인 오메가-아미노산 기질인 beta-alanine 이외에도 다양한 오메가-아미노산을 기질로 받아들여 해당되는 omega-amino acyl coenzyme A를 만든다는 것을 확인하고, 이러한 omega-amino acyl coenzyme A가 효소의 도움 없이 해당 락탐으로 전환되는 것을 확인하여, 이를 통해 효소를 이용해 오메가-아미노산으로부터 다양한 락탐을 생산할 수 있는 시스템의 확립이 가능함을 확인하고자 하였다(도 1).
본 발명에서는 오메가-아미노산을 오메가-아미노아실-CoA로 변환하는 효소 중의 하나인 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자를 도입한 미생물을 이용하여 락탐의 제조 가능성을 알아보는 실험을 수행하였다. 그 결과, 상기 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물을 이용할 경우, 락탐이 생산됨을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 미생물 내에서 대표적인 오메가-아미노산인 GABA가 GABA coenzyme A를 거쳐 2-피롤리돈이 생성되는지 확인해보기 위해, beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자 act가 클로닝 된 pTac15k_act 백터를 제작한 후(도 8), 이를 야생의 대장균에 도입하였다. 또한 미생물 내에 GABA를 공급해 주기 위해 GABA의 전구체인 글루탐산을 포도당과 함께 탄소원으로 제공해 주었다. 상기 재조합 미생물을 위와 같은 배양조건에서 배양한 결과, 미생물 배양액에서 락탐의 일종인 2-피롤리돈이 생성되는 것을 확인 할 수 있었다(도 9).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 오메가-아미노산 생합성 대사경로가 내재되어 있거나, 오메가-아미노산 생합성 경로가 도입되어 있는 미생물에 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 오메가-아미노산으로부터 락탐 생성능을 가지는 재조합 미생물 에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 “내재”는 미생물에 유전자 재조합으로 추가하지 않고, 미생물이 자체적으로 보유하고 있는 대사경로를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에서 수행한 글루탐산으로부터 GABA를 생산하는 대장균의 대사경로는 포도당으로부터 해당과정을 거쳐 글루탐산을 생합성한 다음, 내재된 글루탐산 디카르복실레이즈(GadA 혹은 GadB)에 의해 GABA를 생산하는 경로이다.
본 발명에 있어서, 상기 오메가-아미노산 생합성 경로가 도입되는 것은 해당하는 유전자를 도입하는 것일 수 있다. 예를 들어, 대장균에서 라이신으로부터 5-아미노발레익산(5AVA)를 생합성 하는 대사경로를 도입하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 라이신으로부터 5-아미노발레익산 생합성 대사경로는 delta-aminovaleramidase를 코딩하는 유전자 및 lysine 2-monooxygenase를 코딩하는 유전자를 도입하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 delta-aminovaleramidase를 코딩하는 유전자는 수도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) 유래의 davA 유전자이고, 상기 lysine 2-monooxygenase를 코딩하는 유전자는 수도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) 유래의 davB 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자는 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 act 인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 act 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 beta-alanine coenzyme A transferase는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 있어서, 상기 효소는 상동성(homology) 즉, 아미노산 서열 유사성(sequence similarity)이 50 % 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 60 % 이상인 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 70 % 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 락탐은 이종원자 환영 고리 구조이며 고리 내 아마이드 결합 (amide bond)을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 화학물질이면 모두 해당하나, 바람직하게는 프로피오락탐(propiolactam), 2-피롤리돈(2-pyrrolidone), 발러로락탐(valerolactam), 카프로락탐(caprolactam), 헵타노락탐(heptanolactam), 옥타노락탐(octanolactam), 노네노락탐(nonanolactam), 데카노락탐(decanolactam), 언데카노락탐(undecanolactam) 및 도데카노락탐(dodecanolactam)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 오메가-아미노산은 아민과 카르복시산 작용기를 동시에 가지고 있는 것을 특징으로 하는 화학물질이면 모두 해당하나, 바람직하게는 베타 알라닌(beta-alanine), 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA), 8-아미노옥타노익 산(8-aminooctanoic acid), 9-아미노노네노익 산(9-aminononanoic acid), 10-아미노데카노익 산(10-aminodecanoic acid), 11-아미노언데카토익 산(11-aminoundecanoic acid) 및 12-아미노도데카토익 산(12-aminododecanoic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 베타 알라닌은 아스파트산으로부터 L-aspartate-α-decarboxylase에 의해 생합성 되는 경로를 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 GABA는 글루탐산으로부터 글루탐산 카르복실레이즈(GadA 혹은 GadB)에 의해 생합성 되는 경로를 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 5AVA는 라이신으로부터 델타-아미노발러라미데이즈(DavA) 및 라이신-2-모노옥시지네이즈(DavB)에 의해 생합성 되는 경로를 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 6ACA 및 7AHA는 알파-케토글루탐산으로부터 homocitrate synthase, 3-isopropylmalate dehydratase, isopropylmalate/isohomocitrate dehydrogenase, branched-chain α-ketoacid decarboxylase 및 pyruvate transaminase에 의해 생합성되는 경로를 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 오메가-아미노산은 글루코오스, 수크로오스, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스, 글리세롤, 프럭토오스 및 슈가케인(sugar cane)을 포함하는 단당류, 이당류, 다당류로 구성되는 군에서 선택되는 탄소원으로부터 생합성 되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 전구체인 오메가-아미노산을 자체적으로 생산 혹은 탄소원으로 사용할 수 있는 미생물이면 모두 해당하나, 바람직하게는 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 락탐을 생성하는 단계 및; (b) 상기 생성된 락탐을 회수하는 단계를 포함하는 오메가-아미노산으로부터 락탐의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 재조합 미생물의 배양과정은 통상적으로 알려진 배양방법을 사용하여 수행될 수 있고, 본 발명의 실시예에서 사용된 특정 배지 및 특정 배양방법 이외에도 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용할 수 있고, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용할 수 있다(Lee et al., Bioprocess Biosyst . Eng ., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl . Microbiol. Biotechnol ., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol . Lett ., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72: 41, 2001).
한편, in vitro 조건에서 상기 효소를 이용할 경우, 오메가-아미노산으로부터 다양한 락탐을 제조할 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는, beta-alanine coenzyme A transferase 가 자연적 기질인 beta-alanine 이 외에 오메가-아미노산인 GABA, 6ACA, 7AHA에도 작용한다는 것을 확인하기 위하여 enzyme assay를 진행하였다. 먼저 정제된 효소를 얻기 위해, his tag이 달린 beta-alanine coenzyme A transferase를 암호화 하는 his-act 유전자를 클로닝하여 pET30a_his_act 백터를 제작하고(도 2), his tag이 있는 beta-alanine coenzyme A transferase를 정제하였다(도 3). 정제된 단백질과 acetyl coenzyme A와 GABA, 6ACA 혹은 7AHA를 넣어 enzyme assay를 진행하였다. 추후 각 오메가-아미노산의 omega-amino acyl coenzyme A 형태인 GABA coenzyme A, 6ACA coenzyme A와 7AHA coenzyme A가 생성된 것을 HPLC-MS/MS 혹은 HPLC-MS를 이용하여 확인하였다(도 4, 도 5, 도 10).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 대표적인 오메가-아미노아실-CoA 중 하나인 GABA coenzyme A, 5AVA coenzyme A 와 6ACA coenzyme A가 효소의 도움 없이 해당되는 락탐으로 전환되는 것을 확인하기 위해 실험을 진행하였다. Enzyme assay에 의해서 GABA coenzyme A, 5AVA coenzyme A와 6ACA coenzyme A를 만들어 아무 효소의 첨가 없이 둔 결과 각각 2-피롤리돈, 발러로락탐과 카프로락탐이 생성되는 것을 확인하였다(도 6, 도 7, 도 11)
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 (a) 오메가-아미노산을 포함하는 반응용액에 beta-alanine coenzyme A transferase를 혼합한 다음, 반응시켜 오메가-아미노아실-CoA를 제조하는 단계 및; (b) 상기 제조된 오메가-아미노아실-CoA의 고리 구조 형성을 통해 락탐을 제조하는 단계를 포함하는 오메가-아미노산으로부터 락탐의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자는 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 act 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명 있어서, 상기 락탐은 이종원자 환영 고리 구조이며 고리 내 아마이드 결합 (amide bond)을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 화학물질이면 모두 해당하나, 바람직하게는 프로피오락탐, 2-피롤리돈, 발러로락탐, 카프로락탐, 헵타노락탐, 옥타노락탐, 노네노락탐, 데카노락탐, 언데카노락탐 및 도데카노락탐으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 오메가-아미노아실-CoA을 생성하는 단계 및; (b) 상기 생성된 오메가-아미노아실-CoA을 회수하는 단계를 포함하는 beta-alanine coenzyme A transferase 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용한 오메가-아미노산으로부터 오메가-아미노아실-CoA의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 생성된 오메가-아미노아실-CoA를 회수하는 단계는 세포를 파쇄하여 오메가-아미노아실-CoA를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계; 및 정제과정을 통해 오메가-아미노아실-CoA를 회수하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 세포 파쇄는 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 음파처리방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 정제과정은 크로마토그램을 이용하는 방법이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 생성된 오메가-아미노아실-CoA를 회수하는 단계는 세포를 파쇄하기 전, 세포를 고정시키는 단계 또는 화합물을 처리하여 오메가-아미노아실-CoA의 고리형성을 방지하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 오메가-아미노산을 포함하는 반응용액에 beta-alanine coenzyme A transferase를 혼합한 다음, 반응시켜, 오메가-아미노아실-CoA를 제조하는 단계를 포함하는 오메가-아미노산으로부터 오메가-아미노아실-CoA의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자는 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 act 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명 있어서, 상기 락탐은 이종원자 환영 고리 구조이며 고리 내 아마이드 결합 (amide bond)을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 화학물질이면 모두 해당하나, 바람직하게는 프로피오락탐, 2-피롤리돈, 발러로락탐, 카프로락탐, 헵타노락탐, 옥타노락탐, 노네노락탐, 데카노락탐, 언데카노락탐 및 도데카노락탐으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열 (pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능 하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질 감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 NSP 단백질을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열 (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 대장균 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용 가능하다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. Beta- alanine coenzyme A transferase의 i n vitro 활성 확인
1-1: pET30a_his_act 백터의 제작
클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 균주 유래 beta-alanine coenzyme A transferase의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 act 유전자의 염기 서열은 각각 서열번호 2 및 1와 같다.
클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3과 4의 프라이머로 PCR을 수행하여, N 말단(N terminus)에 his-tag이 달린 beta-alanine coenzyme A를 코딩하는 his_act 유전자 절편을 제작하였다.
[서열번호 3] ckphisact(NdeI, F):
5'-AGACAGCATATGCACCATCATCATCATCATAAAAGACCCTTGGAAGGTATTCG-3'
[서열번호 4] ckpact(SalI, R):
5'-AGACAGGTCGACTTAGATGACATTTTTCTCTTCCAGTGA-3'
다음으로, 상기 his_act 절편과 pET30a 플라스미드에 제한효소(NdeI 및 SalI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 his_act절편 및 pET30a 플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pET30a_his_act를 제작하였다 (도 2).
1-2: Beta-alanine coenzyme A transferase의 정제
Beta-alanine coenzyme A transferase의 정제를 위해서 실시예 1-1에서 수득한 플라스미드 pETa_his_act를 대장균 BL21(DE3)(F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene) (New England Biolabs, 미국)에 도입하였다.
상기 형질전환 균주들을 25mg/L 카나마이신 (kanamycin)이 포함된 10mL LB 액체 배지 (트립톤 10g/L, yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L)에 접종하여 37℃에서 200rpm으로 지속적으로 흔들어주며 초기 배양한 후, 상기와 같은 배지 200mL에 1% 접종하여 37℃에서 200rpm으로 지속적으로 흔들어주며 배양한 다음, 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도 (O.D.)가 0.4 일 때, 1mM IPTG를 첨가하여 his_act 발현을 유도하였다.
발현 유도 후 4시간 후에 배양액을 원심분리기(Hanil Science Industrial, 한국)에서 3000rpm, 4℃에서 10분간 처리하여 미생물을 분리하였고, 상등액은 제거하고, 분리된 미생물을 equilibrium buffer (50mM Na3PO4, 300mM NaCl, pH 7.0) 40mL에 다시 풀은 뒤, cell sonicator(Sonics & Materials, Inc., 미국)를 이용하여 30%의 강도로 5초간 펄스를 주고 5초간 쉬는 방식으로 2시간 동안 미생물을 용해시킨 다음, 13200rpm, 4℃에서 10분간 원심분리를 하여 세포 잔해를 제거한 후 세포 용해액을 얻었다.
이러한 세포 용해액을 0.45 μm 필터로 정제하고, Talon resin(Clontech Laboratories, Inc., 미국)을 이용하여 his-tag 이 달린 beta-alanine coenzyme A transferase를 분리하였다. Talon resin에 붙은 beta-alanine coenzyme A transferase의 분리는 각각 7.5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150mM의 imidazole이 섞인 equilibrium buffer를 이용하여 하였다. 그 후, 전체 세포 용해액, talon resins를 통과한 단백질 용액, 각 농도의 imidazole로 얻은 단백질 용액을 모두 5x Laemmli 샘플 완충용액(LPS Solution, 한국)과 섞은 샘플들을 12% SDS-PAGE를 이용하여 분리하였고, Coomassie brilliant blue R250 (Bio-Rad, 미국) 용액으로 염색하였다(도 3). 그 결과, 가장 순도가 높은 120mM로 정제한 beta-alanine coenzyme A transferase를 이용하였다.
1-3: Beta-alanine coenzyme A transferase의 enzyme assay
Enzyme assay는 50mM potassium phosphate buffer (pH 7.5)에서 진행하였다. Enzyme assay에 필요한 기질 및 효소는 아래와 같이 양으로 넣어주었다. 10mM의 GABA, 6ACA 혹은 7AHA, 1mM의 acetyl-CoA 그리고 2.5μg의 정제된 beta-alanine coenzyme A transferase를 첨가하여 2시간동안 30℃에서 반응을 진행하고, enzyme assay 혼합물에서 coenzyme A 유도체들만 분리하기 위하여 OASIS HLB SPE 카트리지(Waters, 미국)를 이용해 아래와 같은 프로토콜을 사용하였다.
처음 카트리지에 1mL의 메탄올을 흘린 뒤, 2mL의 0.15 % TCA 용액을 흘려주었다. 그 뒤 enzyme assay 한 mixture를 흘려준 다음 다시 1mL의 0.15% TCA 용액을 흘려주었다. 마지막으로 메탄올과 NH4OH가 99:1 부피비로 섞인 용액을 1mL 흘려서 정제된 coenzyme A 유도체들을 수득하고, 진공 원심분리기를 이용하여 용매를 날렸고 -24℃에 샘플을 보관하였다.
이 샘플을 HPLC-MS(Mass spectrometers: LC/MSD VL, Agilent, 미국, HPLC: Agilent, 미국) 또는 HPLC-MS/MS로 분석(Mass spectrometers: API3200QTRAP, SCIEX, 미국, HPLC: Shimadzu, 일본)하기 직전에 증류수에 녹여 coenzyme A 유도체 분석을 하였다. GABA와 6ACA를 기질로 이용하여 진행한 enzyme assay mixture의 경우 HPLC-MS/MS를 이용하여 positive mode로 분석하였고, 7AHA를 기질로 이용한 essay mixture의 경우 HPLC-MS를 이용하여 negative mode로 분석하였다.
그 결과, GABA를 기질로 이용하여 진행한 enzyme assay mixture의 1차 MS 분석 결과, GABA coenzyme A의 예상되는 m/z 값인 853과 비슷한 값인 852.2에서 피크가 나왔고, 이 피크를 2차 MS로 단편화 (fragmentation) 하여 분석한 결과, 예상되는 피크인 m/z =244, 346, 428과 비슷한 값인 243.1, 345.5, 428.1에서 피크를 확인하였다(도 4). 또한, 6ACA를 기질로 이용하여 진행한 enzyme assay mixture의 1차 MS 분석 결과, 6ACA coenzyme A의 예상되는 m/z 값인 881과 비슷한 값인 881.3에서 피크가 나왔고, 이 피크를 2차 MS로 단편화하여 분석한 결과 예상되는 피크인 m/z = 272, 374, 428과 비슷한 272.2, 374.3 428.2에서 피크를 확인하였다(도 5). 또한, 7AHA를 기질로 이용하여 진행한 enzyme assay mixture의 경우, t = 9.844 분에 새로운 CoA 유도체 피크가 보이는 것을 확인하였고 7AHA coenzyme A의 예상되는 m/z 값인 893.2 과 같은 값을 지고 있었다(도 10).
이 결과로부터, 본 발명에 따라 beta-alanine coenzyme A transferase가 성공적으로 GABA, 6ACA와 7AHA를 각각 GABA coenzyme A, 6ACA coenzyme A 그리고 7AHA coenzyme A로 전환시키는 것을 확인하였다.
실시예 2. in vitro 에서 2-피롤리돈, 발러로락탐 및 카프로락탐 생산 확인
실시예 1-3 기술된 방법으로 enzyme assay를 진행하여 GABA coenzyme A, 5AVA coenzyme A 및 6ACA coenzyme A를 제조하였다. 제조한 GABA coenzyme A, 5AVA coenzyme A 및 6ACA coenzyme A를 37℃에서 48시간동안 아무런 처리 없이 놔둔 후, 2-피롤리돈, 발러로락탐 및 카프로락탐이 생성되는지 HPLC-MS로 분석 하였다.
그 결과, 먼저 표준 2-피롤리돈 시약(Sigma-Aldrich, 미국)을 HPLC-MS로 분석한 결과, 2-피롤리돈의 피크를 6.352분에 검출하였고 이 피크를 MS 분석한 결과, m/z = 86.1, 108.1에서 피크가 나타나는 것을 확인하였다. 대조군으로 beta-alanine coenzyme A transferase를 넣지 않은, 즉 GABA coenzyme A가 만들어지지 않은 assay mixture를 분석한 결과, 6분대 아무런 피크나 나타나지 않는 것을 확인하였다.
beta-alanine coenzyme A transferase를 넣어 GABA coenzyme A가 만들어진 assay mixture 샘플에서는 표준 2-피롤리돈 시약과 비슷한 6.348 분에서 피크를 검출하였고 이 피크를 MS 분석한 결과, 역시 표준 2-피롤리돈 시약과 비슷한 m/z = 86.0, 108.0에서 피크를 검출하였다(도 6). 또한 표준 발러로락탐 시약 (Sigma-Aldrich, 미국)을 HPLC-MS로 분석한 결과, 발러로락탐의 피크를 8.098분에 검출하였고 이 피크를 MS 분석한 결과, m/z = 100.1 에서 피크가 나타나는 것을 확인하였다.
beta-alanine coenzyme A transferase를 넣어 5AVA coenzyme A가 만들어진 assay mixture 샘플에서는 표준 발러로락탐 시약과 비슷한 8.092 분에서 피크를 검출하였고 이 피크를 MS 분석한 결과, 역시 표준 발러로락탐 시약과 비슷한 m/z = 100.1 에서 피크를 검출하였다(도 11). 표준 카프로락탐 시약(Sigma-Aldrich, 미국)을 HPLC-MS로 분석한 결과, 카프로락탐의 피크를 9.395분에 검출하였고 이 피크를 MS 분석한 결과, m/z = 114.1, 136.0에서 피크가 나타나는 것을 확인 하였다.
위와 같은 논리로 beta-alanine coenzyme A transferase가 들어가지 않아 6ACA coenzyme A가 만들어지지 않은 assay mixture의 경우, 9분대에서 피크가 검출되지 않았고, beta-alanine coenzyme A transferase를 넣어 6ACA coenzyme A가 만들어진 assay mixture 샘플에서는 표준 카프로락탐 시약과 비슷한 9.469 분에서 피크가 검출되었고 이 피크를 MS 분석한 결과, 표준 카프로락탐 시약과 비슷한 m/z = 114.1, 136.0에서 피크가 검출되는 것을 확인 하였다(도 7).
이 결과로부터, 본 발명에 따라 beta-alanine coenzyme A transferase를 이용해 만든 GABA coenzyme A, 5AVA coenzyme A 및 6ACA coenzyme A가 효소의 도움 없이 각각 2-피롤리돈, 발러로락탐 및 카프로락탐으로 전환되는 것을 확인하였다.
실시예 3.재조합 미생물을 이용한 오메가-아미노산으로부터 락탐 생산
3-1: pTac15k_act 백터의 제작
클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5와 6의 프라이머로 PCR을 수행하여, beta-alanine coenzyme A를 코딩하는 act 유전자 절편을 제작하였다.
[서열번호 5] ckpact(EcoRI, F):
5'-AGACAGGAATTCATGAAAAGACCCTTGGAAGGTATT-3'
[서열번호 6] ckpact(SacI, R):
5'-AGACAGGTCGACTTAGATGACATTTTTCTCTTCCAGTG-3'
다음으로, 상기 act 절편과 tac 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTac15k(Hiszczyn´ ska-Sawicka and Kur, 1997) 플라스미드에 제한효소(EcoRI 및 SacI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 act절편 및 pTac15k 플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pTac15k_act를 제작하였다 (도 8).
3-2: pEKEx1_act 백터의 제작
실시예 3-1에서 제작한 act 절편과 tac 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pEKEx1(Eikmanns et al., Gene. 102, 93-98,1991) 플라스미드에 제한효소(EcoRI 및 BamHI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 act절편 및 pEKEx1 플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pEKEx_act를 제작하였다 (도 13).
3-3: pEKEx1_gadB 백터의 제작
대장균(Escherichia coli) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 8와 9의 프라이머로 PCR을 수행하여, 글루탐산 디카르복실레이즈를 코딩하는 gadB 유전자 절편을 제작하였다.
[서열번호 7] ecjgadB(BamHI, RBS, F):
5'-AGACAGGGATCCTTTCACACAGGAAACAATGGATAAGAAGCAAGTAACGGATT-3'
[서열번호 8] ecjgadB(SalI, R):
5'-AGACAGGTCGACTCAGGTATGTTTAAAGCTGTTCTGTT-3'
다음으로, 상기 gadB 절편과 tac 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pEKEx1(Eikmanns et al., Gene. 102, 93-98,1991) 플라스미드에 제한효소(BamHI 및 SalI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 gadB절편 및 pEKEx1 플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pEKEx_gadB를 제작하였다 (도 14).
3-4: pEKEx1_act_gadB 백터의 제작
실시예 3-2에서 제작한 pEKEx1-act 플라스미드 및 실시예 3-2에서 제작한 gadB 절편에 제한효소(BamHI 및 SalI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 gadB절편 및 pEKEx1_act 플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pEKEx_act_gadB를 제작하였다 (도 15).
3-5: 재조합 미생물 제작
미생물 내에서 beta-alanine coenzyme A 유전자를 코딩하는 act 유전자가 발현이 되도록 실시예 3-1에서 제작한 pTac15k_act 플라스미드를 대장균 WL3110 (Lee et al., Mol . Syst. Biol . 3:149 2007) 에 도입하여 재조합 미생물을 제조하였으며(WL3110/pTac15k-act), 공백터인 pTac15k가 도입된 대장균 (WL3110/pTac15k)을 대조군 균주로 사용하였다.
또한, 다양한 탄소원에서의 생산 가능성을 검출하기 위해, 미생물 내에서 beta-alanine coenzyme A 유전자를 코딩하는 act 유전자가 발현이 되도록 실시예 3-1에서 제작된 pTac15k_act 플라스미드를 대장균 XQ56/pKE112-davAB (Park et al., Metab . Eng . 16:42-47 2013) 에 도입하여 재조합 미생물을 제조하였으며(XQ56/pKE112-davAB/pTac15k-act), 공백터인 pTac15k가 도입된 대장균 (XQ56/pKE112-davAB/pTac15k)를 대조군 균주로 사용하였다.
또한, 다양한 탄소원에서 생산 가능성을 검출하기 위해, 미생물 내에서 GABA를 생합성하기 위한 글루탐산 디카르복실레이즈 유전자를 코딩하는 gadB 유전자와 beta-alanine coenzyme A 유전자를 코딩하는 act 유전자가 발현이 되도록 실시예 3-4에서 제작된 pEKEx1_act_gadB 플라스미드를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032) 에 도입하여 재조합 미생물을 제조하였으며 (ATCC 13032/pEKEx1_act_gadB), gadB 유전자만을 발현하는 실시예 3-3에서 제작된 pEKEx1_gadB 플라스미드가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC 13032/pEKEx1_gadB)을 대조군 균주로 사용하였다.
3-6: 재조합 미생물을 이용한 GABA로부터의 2-피롤리돈 생산 확인
실시예 3-5에서 제조한 재조합 미생물(WL3110/pTac15k-act)을 10mL LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 1.5mL을 350mL 플라스크에 50mL의 변형 MR-1배지에 접종하여 배양하였다.
변형 MR-1배지 (pH 7.0)의 조성은 증류수 1리터당 10g 포도당, 5g GABA, 9g (NH4)2SO4, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4 ㆍ7H2O, 0.01g CaCl2 ㆍ2H20, 5mL trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO4 ㆍ7H2O, 2.2g ZnSO4 ㆍ4H2O, 0.58g MnSO4 ㆍ4H2O, 1g CuSO4 ㆍ5H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.02g Na2B4O7 ㆍ10H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 상기 조성에서 GABA를 탄소원으로 공급하였다. 배양은 48시간동안 37℃와 200rpm으로 작동하는 shaking incubator(jSR, 한국)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상등액만을 채취하여 HPLC-MS분석을 수행함으로써, 2-피롤리돈의 생산을 확인하였다.
그 결과, 표 1에 개시된 바와 같이, 공백터가 형질전환된 재조합 미생물에서는 전혀 2-피롤리돈이 생산이 되지 않은 반면, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 193.78 mg/L의 2-피롤리돈이 생산되는 것을 확인하였다.
이 결과로부터, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 GABA를 탄소원으로 이용하여 2-피롤리돈을 성공적으로 생성함을 확인하였다.
재조합미생물의 2-피롤리돈 생산량 (mg/L)
Strain 2-피롤리돈 생산량
WL3110/pTac15k 0
WL3110/pTac15k-act 193.78
3-7: 재조합 미생물을 이용한 5AVA로부터 발러로락탐 생산 확인
실시예 3-5에서 제조한 재조합 미생물(WL3110/pTac15k-act)을 10mL LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 1.5mL을 350mL 플라스크에 50mL의 변형 MR-2배지에 접종하여 배양하였다.
변형 MR-2배지 (pH 7.0)의 조성은 증류수 1리터당 10g 포도당, 5g 5AVA, 9g (NH4)2SO4, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4 ㆍ7H2O, 0.01g CaCl2 ㆍ2H20, 5mL trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO4 ㆍ7H2O, 2.2g ZnSO4 ㆍ4H2O, 0.58g MnSO4 ㆍ4H2O, 1g CuSO4 ㆍ5H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.02g Na2B4O7 ㆍ10H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 상기 조성에서 5AVA를 탄소원으로 공급하였다. 배양은 48시간동안 37℃와 200rpm으로 작동하는 shaking incubator(jSR, 한국)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상등액만을 채취하여 HPLC-MS분석을 수행함으로써, 발로러락탐의 생산을 확인하였다.
그 결과, 표 2에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 592.68 mg/L의 발로러락탐이 생산되는 것을 확인하였다.
이 결과로부터, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 5AVA를 탄소원으로 이용하여 발러로락탐을 성공적으로 생성함을 확인하였다.
재조합미생물의 발러로락탐 생산량 (mg/L)
Strain 발러로락탐 생산량
WL3110/pTac15k-act 592.68
실시예 4.재조합 미생물을 이용한 다른 탄소원으로부터 락탐 생산
4-1: 재조합 미생물을 이용한 글루탐산으로부터의 2-피롤리돈 생성 확인
실시예 3-5에서 제조한 재조합 미생물(WL3110/pTac15k-act)을 10mL LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 1.5mL을 350mL 플라스크에 50mL의 변형 M9배지에 접종하여 배양하였다.
변형 M9배지의 조성은 증류수 1리터당 10g 포도당, 5g 글루탐산, 6.78g Na2HPO4, 3.0g KH2PO4, 0.5g NaCl, 1.0g NH4Cl, 1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 10mg thiamine의 성분으로 구성된 배지이다. 상기 조성에서 글루탐산은 미생물 내에서 GABA를 공급해주기 위해 탄소원으로 공급하였다. 배양은 48시간동안 37℃와 200rpm으로 작동하는 shaking incubator(jSR, 한국)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상등액만을 채취하여 HPLC-MS분석을 수행함으로써, 2-피롤리돈의 생산을 확인하였다.
그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이, 공백터가 형질전환된 재조합 미생물에서는 전혀 2-피롤리돈이 생산이 되지 않은 반면, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 2-피롤리돈 표준 물질과 비슷한 6.445 분에 피크를 보였으며 이 피크를 분석한 결과 표준 2-피롤리돈과 같은 m/z = 86.1, 108.0에서 피크를 갖는 것을 확인하였다,
이 결과로부터, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 글루탐산을 탄소원으로 이용하여 2-피롤리돈을 성공적으로 생성함을 확인할 수 있었다.
4-2: 재조합 미생물을 이용한 포도당으로부터 발러로락탐 생성 확인
실시예 3-5에서 제조한 재조합 미생물(XQ56/pKE112-davAB/pTac15k-act)을 10mL LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 1.5mL을 350mL 플라스크에 50mL의 변형 MR-3배지에 접종하여 배양하였다.
변형 MR-3배지 (pH 7.0)의 조성은 증류수 1리터당 10g 포도당, 9g (NH4)2SO4, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4 ㆍ7H2O, 0.01g CaCl2 ㆍ2H20, 5mL trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO4 ㆍ7H2O, 2.2g ZnSO4 ㆍ4H2O, 0.58g MnSO4 ㆍ4H2O, 1g CuSO4 ㆍ5H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O24 ㆍ4H2O, 0.02g Na2B4O7ㆍ10H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 상기 조성에서 포도당를 탄소원으로 공급하였다. 배양은 36시간동안 37℃와 200rpm으로 작동하는 shaking incubator(jSR, 한국)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상등액만을 채취하여 HPLC-MS분석을 수행함으로써, 발로러락탐의 생산을 확인하였다.
그 결과, 표 3에 개시된 바와 같이, 공백터가 형질전환된 재조합 미생물에서는 전혀 발러로락탐이 생산이 되지 않은 반면, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 28.36 mg/L의 발로러락탐이 생산되는 것을 확인하였다.
이 결과로부터, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 포도당을 탄소원으로 이용하여 발러로락탐을 성공적으로 생성함을 확인하였다.
재조합미생물의 발러로락탐 생산량 (mg/L)
Strain 발러로락탐 생산량
XQ56/pKE112-davAB/pTac15k 0
XQ56/pKE112-davAB/pTac15k-act 28.36
4-3: 재조합 미생물을 이용한 포도당으로부터 2-피롤리돈 생성 확인
실시예 3-5에서 제조한 재조합 미생물(ATCC 13032/pEKEx1_act_gadB)을 5mL RG 배지(brain heart infusion 40g/L, 포도당 10g/L, beef extract 10g/L, sorbitol 30g/L)에 접종하여 30℃에서 12시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 1.5mL을 350mL 플라스크에 50mL의 GP1배지에 접종하여 배양하였다.
GP1배지 (pH 7.0)의 조성은 증류수 1리터당 50g 포도당, 50g (NH4)2SO4, 1.0g K2HPO4, 3.0g urea, 0.4g MgSO4 ㆍ7H2O, 50g peptone, 0.01g FeSO4, 0.01g MnSO4 ㆍ5H2O, 200μg thiamine, 0.1mM pyridoxal 5-phosphate hydrate, 50μg biotin의 성분으로 구성된 배지이다. 상기 조성에서 포도당를 탄소원으로 공급하였다. 배양은 96시간동안 30℃와 200rpm으로 작동하는 shaking incubator(jSR, 한국)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상등액만을 채취하여 HPLC-MS분석을 수행함으로써, 발로러락탐의 생산을 확인하였다.
재조합미생물의 2-피롤리돈 생산량 (mg/L)
Strain 2-피롤리돈 생산량
ATCC 13032/pEKEx1_gadB 0
ATCC 13032/pEKEx1_act_gadB 75.92
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method for Preparing Various Lactam <130> P16-B075 <150> KR 10-2015-0051994 <151> 2015-04-13 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1194 <212> DNA <213> act gene <400> 1 atgaaaagac ccttggaagg tattcgtgta cttgatttaa cacaggctta cagtggcccc 60 ttttgtacaa tgaatcttgc tgatcatggt gctgaggtta ttaaaattga gcgccccggc 120 agtggagatc aaacaagagg ttgggggcct atggaaaatg actacagtgg ctactatgct 180 tacattaacc gtaataaaaa aggaatcacc ttaaatcttg cttccgaaga aggaaagaaa 240 gtttttgccg aattggttaa atctgccgat gtgatttgcg aaaactataa ggttggtgtt 300 ttagaaaaat taggcttttc ctatgaggtc ttaaaagaac tcaacccccg catcatttat 360 ggctccatca gcggttttgg attaacaggt gaattgtcct cccgcccctg ctatgatatc 420 gtcgctcaag caatgagcgg aatgatgagt gtaaccggct ttgcagacgg tcctccctgc 480 aaaatcggcc cttctgtagg agatagctat actggtgcat atttgtgcat gggtgttttg 540 atggcattat acgaaagaga aaaaacaggc gttggccgcc gtatcgatgt gggaatggta 600 gataccctgt tctctacaat ggaaaacttt gttgttgaat acaccattgc tggtaagcat 660 ccccaccgtg caggcaatca agatccaagt attgcccctt ttgactcctt tagggcaaaa 720 gattcggatt ttgtaatggg gtgtggcaca aacaaaatgt ttgcaggact atgtaaagca 780 atgggcagag aggatttgat tgatgatcct cgtttcaata caaacctgaa tcgttgtgat 840 aactatttaa atgacttaaa gccaatcatc gaagaatgga cccaaacaaa gaccgttgca 900 gagttagagg aaatcatctg cggactttcc attcccttcg gcccaatcct cacgattccc 960 gagatttctg agcattcctt aacaaaagaa agaaatatgc tttgggaagt ttatcagcct 1020 ggcatggata gaacaattcg cattcccggc tcccctatta aaatccacgg tgaagaagat 1080 aaggctcaga aaggtgcccc tattctggga gaagacaatt ttgctgtcta cgcagaaatt 1140 ttaggtctct cagtagaaga aattaaatca ctggaagaga aaaatgtcat ctaa 1194 <210> 2 <211> 397 <212> PRT <213> act protein <400> 2 Met Lys Arg Pro Leu Glu Gly Ile Arg Val Leu Asp Leu Thr Gln Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Gly Pro Phe Cys Thr Met Asn Leu Ala Asp His Gly Ala Glu 20 25 30 Val Ile Lys Ile Glu Arg Pro Gly Ser Gly Asp Gln Thr Arg Gly Trp 35 40 45 Gly Pro Met Glu Asn Asp Tyr Ser Gly Tyr Tyr Ala Tyr Ile Asn Arg 50 55 60 Asn Lys Lys Gly Ile Thr Leu Asn Leu Ala Ser Glu Glu Gly Lys Lys 65 70 75 80 Val Phe Ala Glu Leu Val Lys Ser Ala Asp Val Ile Cys Glu Asn Tyr 85 90 95 Lys Val Gly Val Leu Glu Lys Leu Gly Phe Ser Tyr Glu Val Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Asn Pro Arg Ile Ile Tyr Gly Ser Ile Ser Gly Phe Gly Leu 115 120 125 Thr Gly Glu Leu Ser Ser Arg Pro Cys Tyr Asp Ile Val Ala Gln Ala 130 135 140 Met Ser Gly Met Met Ser Val Thr Gly Phe Ala Asp Gly Pro Pro Cys 145 150 155 160 Lys Ile Gly Pro Ser Val Gly Asp Ser Tyr Thr Gly Ala Tyr Leu Cys 165 170 175 Met Gly Val Leu Met Ala Leu Tyr Glu Arg Glu Lys Thr Gly Val Gly 180 185 190 Arg Arg Ile Asp Val Gly Met Val Asp Thr Leu Phe Ser Thr Met Glu 195 200 205 Asn Phe Val Val Glu Tyr Thr Ile Ala Gly Lys His Pro His Arg Ala 210 215 220 Gly Asn Gln Asp Pro Ser Ile Ala Pro Phe Asp Ser Phe Arg Ala Lys 225 230 235 240 Asp Ser Asp Phe Val Met Gly Cys Gly Thr Asn Lys Met Phe Ala Gly 245 250 255 Leu Cys Lys Ala Met Gly Arg Glu Asp Leu Ile Asp Asp Pro Arg Phe 260 265 270 Asn Thr Asn Leu Asn Arg Cys Asp Asn Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Pro 275 280 285 Ile Ile Glu Glu Trp Thr Gln Thr Lys Thr Val Ala Glu Leu Glu Glu 290 295 300 Ile Ile Cys Gly Leu Ser Ile Pro Phe Gly Pro Ile Leu Thr Ile Pro 305 310 315 320 Glu Ile Ser Glu His Ser Leu Thr Lys Glu Arg Asn Met Leu Trp Glu 325 330 335 Val Tyr Gln Pro Gly Met Asp Arg Thr Ile Arg Ile Pro Gly Ser Pro 340 345 350 Ile Lys Ile His Gly Glu Glu Asp Lys Ala Gln Lys Gly Ala Pro Ile 355 360 365 Leu Gly Glu Asp Asn Phe Ala Val Tyr Ala Glu Ile Leu Gly Leu Ser 370 375 380 Val Glu Glu Ile Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asn Val Ile 385 390 395 <210> 3 <211> 53 <212> DNA <213> ckphisact <400> 3 agacagcata tgcaccatca tcatcatcat aaaagaccct tggaaggtat tcg 53 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> ckpact(SalI, R) <400> 4 agacaggtcg acttagatga catttttctc ttccagtga 39 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> ckpact(EcoRI, F) <400> 5 agacaggaat tcatgaaaag acccttggaa ggtatt 36 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> ckpact(SacI, R) <400> 6 agacaggtcg acttagatga catttttctc ttccagtg 38 <210> 7 <211> 53 <212> DNA <213> ecjgadB(BamHI, RBS, F) <400> 7 agacagggat cctttcacac aggaaacaat ggataagaag caagtaacgg att 53 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> ecjgadB(SalI, R) <400> 8 agacaggtcg actcaggtat gtttaaagct gttctgtt 38

Claims (19)

  1. 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 및 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA)으로 구성된 군에서 선택되는 오메가 아미노산 생합성 대사경로가 내재되어 있거나, 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 및 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA)으로 구성된 군에서 선택되는 오메가 아미노산 생합성 경로가 도입되어 있는 미생물에 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 및 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA)으로 구성된 군에서 선택되는 오메가-아미노산으로부터 각각에 상응하는 2-피롤리돈(2-pyrrolidone), 발러로락탐(valerolactam), 카프로락탐(caprolactam), 및 헵타노락탐(heptanolactam)으로 구성된 군에서 선택되는 락탐 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 유전자는 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 act 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 5-아미노발레익산 생합성 대사경로는 delta-aminovaleramidase를 코딩하는 유전자 및 lysine 2-monooxygenase를 코딩하는 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 delta-aminovaleramidase를 코딩하는 유전자는 수도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) 유래의 davA 유전자이고, 상기 lysine 2-monooxygenase를 코딩하는 유전자는 수도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) 유래의 davB 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 오메가-아미노산은 글루코오스, 수크로오스, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스, 글리세롤, 프럭토오스 및 슈가케인(sugar cane)을 포함하는 단당류, 이당류, 다당류로 구성되는 군에서 선택되는 탄소원으로부터 생합성 되는 것을 특징으로하는 재조합 미생물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 다음의 단계를 포함하는 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 및 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA)으로 구성된 군에서 선택되는 오메가-아미노산으로부터 각각에 상응하는 2-피롤리돈(2-pyrrolidone), 발러로락탐(valerolactam), 카프로락탐(caprolactam), 및 헵타노락탐(heptanolactam)으로 구성된 군에서 선택되는 락탐의 제조방법:
    (a) 제1항의 재조합 미생물을 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 및 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA)으로 구성된 군에서 선택되는 오메가-아미노산의 존재 하에 배양하여 2-피롤리돈(2-pyrrolidone), 발러로락탐(valerolactam), 카프로락탐(caprolactam), 및 헵타노락탐(heptanolactam)으로 구성된 군에서 선택되는 락탐을 생성하는 단계 및;
    (b) 상기 생성된 락탐을 회수하는 단계.
  12. 다음의 단계를 포함하는 beta-alanine coenzyme A transferase를 이용한 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 및 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA)으로 구성된 군에서 선택되는 오메가-아미노산으로부터 각각에 상응하는 2-피롤리돈(2-pyrrolidone), 발러로락탐(valerolactam), 카프로락탐(caprolactam), 및 헵타노락탐(heptanolactam)으로 구성된 군에서 선택되는 락탐의 제조방법:
    (a) 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 및 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA)으로 구성된 군에서 선택되는 오메가-아미노산을 포함하는 반응용액에 beta-alanine coenzyme A transferase를 혼합한 다음 반응시켜, 오메가-아미노아실-CoA를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 제조된 오메가-아미노아실-CoA의 고리 구조 형성을 통해 2-피롤리돈(2-pyrrolidone), 발러로락탐(valerolactam), 카프로락탐(caprolactam), 및 헵타노락탐(heptanolactam)으로 구성된 군에서 선택되는 락탐을 제조하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, beta-alanine coenzyme A transferase는 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 act 유전자에 의해 코딩되는 효소인 것을 특징으로 하는 락탐의 제조방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 다음의 단계를 포함하는 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 및 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA)으로 구성된 군에서 선택되는 오메가-아미노산으로부터 오메가-아미노아실-CoA의 제조방법:
    (a) 제1항의 재조합 미생물을 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 및 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA)으로 구성된 군에서 선택되는 오메가-아미노산의 존재 하에 배양하여 오메가-아미노아실-CoA을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 오메가-아미노아실-CoA을 회수하는 단계.
  17. 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 및 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA)으로 구성된 군에서 선택되는 오메가-아미노산을 포함하는 반응용액에 beta-alanine coenzyme A transferase를 혼합한 다음 반응시켜, 오메가-아미노아실-CoA를 제조하는 단계를 포함하는 beta-alanine coenzyme A transferase를 이용한 감마-아미노뷰티릭 산(gamma-aminobutyric acid, GABA), 5-아미노발레익 산(5-aminovaleric acid, 5AVA), 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid, 6ACA), 및 7-아미노헵타노익 산(7-aminoheptanoic acid, 7AHA)으로 구성된 군에서 선택되는 오메가-아미노산으로부터 오메가-아미노아실-CoA의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, beta-alanine coenzyme A transferase는 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 act 유전자에 의해 코딩되는 효소인 것을 특징으로 하는 오메가-아미노아실-CoA의 제조방법.
  19. 삭제
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