DE69024369T2

DE69024369T2 - Latenz assoziierte peptide und deren verwendung

Info

Publication number: DE69024369T2
Application number: DE69024369T
Authority: DE
Inventors: Glenn R. Berkeley Ca 94705 Hammonds; Arthur Hillsborough Ca 94010 Levinson; Anthony Burlingame Ca 94010 Mason
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1989-11-22
Filing date: 1990-10-30
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2010-10-31
Also published as: AU639047B2; WO1991008291A3; ES2083469T3; DE69024369D1; DK0502036T3; AU6744090A; WO1991008291A2; GR3019343T3; EP0502036A1; EP0502036B1; JPH05503003A; ATE131872T1; CA2068204C; CA2068204A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein latenzassoziiertes Peptid, Mittel und Verfahren zu seiner Herstellung in therapeutisch signifikanten Mengen, sowie Verwendungszwecke für das Peptid.

Beschreibung des Stands der Technik

Die β-umwandelnden Wachstumsfaktoren (TGF-β) sind multifunktionale Cytokine, die durch viele Zel arten hergestellt werden (einschließlich hämatopoietischer, neuraler, Herz-, Fibroblasten- und Tumorzellen), die das Wachstum und die Differenzierung der Zellen aus einer Vielzahl an Gewebsursprüngen regulieren können (Sporn et al., Science 233: 532 [1986]) und die Ausbildung verschiedener stromaler Elemente stimulieren. Von besonderem Interesse aus immunologischer Sicht sind die hochwirksamen immununterdrückenden Aktivitäten von TGF-β; dazu gehören die lymphokinaktivierte Killer- (LAK) und die zytotoxische T-Lymphozyten- (CTL) Inhibierung (Ranges et al., J. Exp. Med., 166: 991 [1987], Espevik et al., J. Immunol., 140: 2312 [1988], Grimm et al., Cancer Immunol. Immunother., 27: 53 [1988], Kasid et al., J.Immunol., 141: 690 [1988], Mule et al., Cancer Immunol.Immunother 26: 95 [1988]), die deprimierte B-Zellen-Lymphopoiese und κ-Leichtketten-Expression (lee et al., J. Exp. Med., 166: 1290 [1987], die negative Regulierung der Hämatopoiese (Hino et al., Br. J. Haematol., 70: 143 [1988], Sing et al., Blood, 72: 1504 [1988]), die Abwärtsregulierung von HLA-DR-Expression auf Tumorzellen (Czarniecki et al., J. Immunol., 140: 4217 [1988], Zuber et al., Eur. J. Immunol., 18: 1623 [1988]) und die Inhibierung der Proliferation von antigenaktivierten B-Lymphozyten als Reaktion auf einen B-Zellen-Wachstumsfaktor (Petit-Koskas et al., Eur. J. Immunol., 18: 111 [1988]). Die Beobachtung, daß viele menschliche Tumoren (deMartin et al., EMBO J., 6: 3673 [1987], Kuppner et al., Int. J. Cancer, 42: 562 [1988]) und viele Tumorzellinien (Derynck et al., Cancer Res., 47: 707 [1987], Roberts et al., Br. J. Cancer, 57: 594 [1988]) TGF-β erzeugen, legt einen möglichen Mechanismus für diese Tumoren nahe, um der normalen immunologischen Kontrolle entkommen zu können. Diese negative Immunmodulation in Verbindung mit Beobachtungen, daß bestimmte transformierte Zellinien die Fähigkeit verloren haben, auf TGF-β in autokriner Weise zu reagieren (Wakefield et al., J. Cell Biol., 105: 965 [1987], McMahon et al., Cancer Res., 46: 4665 [1986]) und daß TGF-β die Stromabildung stimuliert und die Immunüberwachung des Tumors senkt, führen zu attraktiven Modellen zur Neoplasma-Deregulierung und -Proliferation (Roberts et al., Br. J. Cancer, oben).
Es gibt zumindest fünf Formen von derzeit identifiziertem TGF-β: TGF-β1, TGF-β2, TGF- β3, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5. Geeignete Verfahren zur Reinigung dieser TGF-β- Familie aus verschiedenen Spezies wie z.B. Menschen, Mäusen, Grünen Meerkatzen, Schweinen, Rindern, Küken und Fröschen sowie aus verschiedenen Körperquellen wie z.B. Knochen, Blutplättchen oder Plazenta, zur Herstellung in rekombinanter Zellkultur und zur Bestimmung ihrer Aktivität sind bekannt. Siehe z.B. R. Derynck et al., Nature, 316: 701-705 [1985]; EP-A Nr. 200.341, veröffentlicht am 10. Dezember 1986; 169.016, veröffentlicht am 22. Januar 1986; 268.561, veröffentlicht am 25. Mai 1988; und 267.463, veröffentlicht am 18. Mai 1988; US-PS 4.774.322; Cheifretz et al., Cell, 48: 409-415 [1987]; Jakowlew et al., Molecular Endocrin., 2: 747-755 [1988]; Dijke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85: 4715-4719 [1988]; Derynck et al., J. Biol. Chem., 261: 4377-4379 [1986]; Sharples et al., DNA, 6: 239-244 [1987]; Derynck et al., Nucl. Acids Res., 15: 3188-3189 [1987]; Derynck et al., Nucl. Acids Res., 15: 3187 [1987]; Derynck et al., EMBO J., 7: 3737-3743 [1988]; Seyedin et al., J. Biol. Chem., 261: 5693- 5695 [1986]; Madisen et al., DNA, 7: 1-8 [1988]; und Hanks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85: 79-82 [1988].
Die aktivierte Form von TGF-β1 ist ein Homodimer, das durch Dimerisierung der carboxyterminalen 112 Aminosäuren eines Vorläufers mit 390 Aminosäuren gebildet wird (Derynck et al., Nature, oben). TGF-β2 besitzt eine Vorläuferform von 414 Aminosäuren und wird aus den carboxyterminalen 112 Aminosäuren zu einem Homodimer verarbeitet, das etwa 70% Homologie mit der aktiven Form von TGF-β1 aufweist (Marquardt et al., J. Biol. Chem., 262: 12127 [1987]). TGF-β2 wurde aus Schweine-Blutplättchen (Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262: 1946-1949 [1987)) und menschlichen Glioblastom-Zellen (Wrann et al., EMBO J., 6: 1633 [1987]) gereinigt, und rekombinanter menschlicher TGF-β2 wurde kloniert (deMartin et al., oben). Rekombinanter TGF-β1 wurde kloniert (Derynck et al., Nature, oben) und in chinesischen Hamstereierstock-Zellen exprimiert (Gentry et al., Mol. Cell. Biol., 7: 3418-3427 [1987]).
TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5, bei denen es sich um die zuletzt entdeckten Formen von TGF-β handelt, wurden durch Screenen von cDNA-Sammlungen identifiziert. Keines dieser drei vermutlichen Proteine wurde aus natürlichen Quellen isoliert, obwohl Northern-Blots die Expression der korrespondierenden mRNAs aufzeigen. Menschlicher und Schweine-TGF-β3 wurde bereits kloniert und beschrieben (Derynck et al., EMBO J., 7: 3737-3743 (1988), ten Dijke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4715 [1988]). TGF-β4 und TGF-β5 wurden aus einer Hühner-Chondrozyten-cDNA-Sammlung (Jakowlew et al., Molec. Endocrinol., 2: 1186-1195 [1988]) bzw. einer Frösche- Oozyten-cDNA-Sammlung kloniert. Die Frösche-Oozyten-cDNA-Sammlung kann mittels einer Sonde gescrennt werden, die aus einer oder mehreren Sequenzen einer weiteren Art von TGF-β stammt. TGF-β4-mRNA ist in Hühnerembryo-Chondrozyten nachweisbar, ist aber in viel geringeren Mengen vorhanden als TGF-β3-mRNA in sich entwickelnden Embryonen oder in Hühnerembryo-Fibroblasten. TGF-β5-mRNA wird in Fröscheembryonen nach dem ersten Neurulastadium und in Xenopus-Kaulquappen- (XTC) Zellen exprimiert.
Es wurde gezeigt, daß TGF-β auf eine Vielzahl an normalen und neoplastischen Zellen zahlreiche regulierende Wirkungen ausübt. TGF-β ist multifunktionell, da er die Zellproliferation, -differenzierung und andere entscheidende Prozesse der Zellfunktion stimulieren oder inhibieren kann (M. Sporn, Science, 233: 532 [1986]). Ein allgemeinerer Überblick über TGF-β und seine Wirkungsweisen findet sich in Sporn et al., J. Cell Biol., 105: 1039-1045 (1987), Sporn und Roberts, Nature, 332: 217-219 (1988) und Roberts et al., Recent Progress in Hormone Research, 44: 157-197 (1988).
Natürlicher TGF-β1 wird vorwiegend - wenn nicht sogar ausschließlich - in einer biologisch latenten Form gebildet, die durch Denaturantien wie z.B. Harnstoff, Wärme, Plasmin, hohe Salzkonzentrationen, Endoglycosidase F, Cathepsin D, Collagenase vom Typ IV, co-kultivierte Endothelzellen und Perizyten, Plasminogenaktivatoren wie z.B. Urokinase, stimulierte Osteoclasten oder extreme ph-Werte in vitro stimuliert werden kann. Siehe Pircher et al., Canc. Res., 44: 5538-5543 (1984) in bezug auf latenten TGF- β aus nicht-transformierten und Kirsten-Sarkomvirus-transformierten normalen Rattennieren-Zellen; Antonelli-Orlidge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4544-4548 (1989) in bezug auf latenten TGF-β aus Perizyten und kapillaren Endothelzellen; Lawrence et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 133: 1026-1034 (1985) in bezug auf TGF-β aus Hühnerembryonen-Fibroblasten; Oreffo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 158: 817-823 (1989) in bezug auf latenten TGF-β aus Mäuseknochen- Organkuturen; Keski-Oja et al., J. Cell Biol., 107: (6 Teil 3), 1988, 50a in bezug auf latenten TGF-β aus der menschlichen Lungenadenokarzinom-Zellinie; Miyazono und Heldin, J. Cell. Biochem. Supp. 0 (13 Teil B) 1989, S.92 und Miyazono und Heldin, Nature, 338: 158-160 (1989) in bezug auf latenten TGF-β aus menschlichen Blutplättchen und seine Kohlehydratstruktur; und Pircher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 136: 30-37 (1986) in bezug auf latenten TGF-β aus menschlichen Blutplättchen. Siehe auch Lawrence et al., J. Cell. Physiol., 121: 184-188 (1984); Kryceve-Martinerie et al., Int. J. Cancer, 35: 553-558; Brown et al., "TGF-β" NY Acad. Sci. Meeting Abstract, 18-20. Mai, 1989; Danielpour et al., J. Cell. Physiol., 138: 79-86 (1989); Wakefield et al., J. Biol. Chem., 263: 7646-7654 (1988); und Miyazono et al., J. Biol. Chem., 263: 6407-6415 (1988).
Mehrere Forschergruppen charakterisierten die latente Form von TGF-β1, der durch menschliche Blutplättchen sekretiert wird. Pircher et al., 1986, oben, zeigte, daß er ein scheinbares Molekulargewicht von 400 Kd aufweist. Später wurde er als Dreikomponenten-Komplex von etwa 235 Kd charakterisiert, worin der aktive TGF-β1 (Dimer von 25 Kd) mit dem Rest des verarbeiteten Vorläufers (Dimer von 75 Kd) nichtkovalent assoziiert ist, der seinerseits mit einem unzusammenhängenden Protein von 125-160 Kd mittels Disulfid-Bindung verbunden ist (Wakefield et al., J. Biol. Chem., 263, oben; Miyazono et al., oben; Miyazono et al., J. Cell Biochem. Supp., 0 (12 Teil A), 1988, S.200; Wakefield et al., J. Cell. Biochem. Suppl., 11A: 0, 46 [1987]). Die Funktion des Bindungsproteins von 125-169 Kd bleibt noch aufzuklären. In letzter Zeit erfolgte Charakterisierungen zeigen auf, daß es zumindest 14 EGF-ähnliche Wiederholungen und sechs potentielle N-Glykosylierungsstellen und Kalzium- Bindungsdomänen besitzt (Kanzaki et al., "TGF-β", NY Acad. Sci. meeting abstract, 18.- 20. Mai, 1989; Miyazono, "TGF-β", NY Acad. Sci. meeting abstract, 18-20. Mai 1989). Latenter TGF-β, der durch viele Zellen in Kultur sekretiert wird, besitzt eine ähnliche Struktur (Wakefield et al., J. Biol. Chem., oben), wobei dies die Form ist, in der der TGF- β1 wahrscheinlich anfänglich durch die Zielzellen in vivo wahrgenommen wird. Es wurde angenommen, daß der Vorläuferrest von TGF-β eine wichtige unabhängige biologische Funktion bezogen auf die Konservierung der Sequenzen im Vorläuferbereich besitzen könnte (Roberts et al., Recent Progress in Hormone Research, oben). Zusätzlich wird berichtet, daß eine Mutation an Position 33 des Vorläufer-TGF- β1 die Ausbeute an reifem TGF-β1 steigert; die Dimerisierung des Vorläufer-"pro"- Bereichs wird als notwendig angenommen, um Latenz zu verleihen (Brunner et al., J. Biol. Chem., 264: 13660-13664 [1989]).
Es wurde eine latente Form von aus Schweine-Blutplättchen als Komplex mit hohem Molekulargewicht gereinigtem TGF analysiert. Das reife TGF-β-Dimer ist bei nichtreduzierender SDS-PAGE nicht-kovalent mit einer Komponente von 210 Kd verbunden. Nach der Reduktion mit Dithiothreitol löste sich diese große Komponente in Bänder von 40 Kd und 115-130 Kd auf. Kamerud et al., J. Cell Biol., 107 (6 Teil 3), 29. Januar bis 2. Februar, 1989, 49a.
Ein weiteres aus Blutplättchen abgeleitetes Molekül, das latenten TGF-β bilden kann, ist das in JP-A-63-196.600 (veröffentlicht am 15. August 1988) beschriebene. Es handelt sich um eine Glykoprotein-Untereinheit von etwa 46 Kd, die sich assoziiert mit vier oder mehr Molekülen reversibel an TGF-β auf Plättchen bindet, was die TGF-β-Aktivität steuert, wärme- und säurebeständig ist und ihre TGF-β-hemmende Aktivität einbüßt, wenn sie mit Dithiothreitol oder Trypsin behandelt wird. Ein zusätzlicher, aus Blutplättchen abgeleiteter, latenter TGF-β ist in JP-A-63-150.300 (veröffentlicht am 22. Juni 1988) geoffenbart. Dieses Glykoprotein besitzt ein Molekulargewicht von etwa 44 Kd, bindet an TGF-β in reversibler Weise, um die TGF-β-Aktivität zu hemmen, ist wärme- und säurebeständig und büßt seine TGF-β-hemmende Aktivität durch Behandlung mit Dithiothreitol und Trypsin ein.
Ein zusätzliches Maskierungsprotein für TGF-β aus Ratten-Blutplättchen mit einem Molekulargewicht von etwa 440 Kd ist durch Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 141: 176-184 (1986) beschrieben. Weitere Analysen zeigen, daß das Maskierungsprotein aus zwei Untereinheiten mit 39 Kd und 105-120 Kd besteht, die durch Disulfid-Bindungen verbunden sind, um einen Komplex von 180-210 Kd zu bilden. Okada et al., Cell Struct. Funct., 13 (6): 615 (1988); Okada et al., FEBS Letters, 242: 240-244 (1989), Die N-terminale Sequenz der 39 Kd-Untereinheit stellte sich als identisch zum N-terminalen Teil des TGF-β-Vorläufers heraus, der 30 Reste von der Initiationsstelle des transkribierten Vorläufers beginnt. Die 180-210 Kd-Komponente besaß eine Maskierungsaktivität, doch die Komponenten von 39 Kd bzw. 105-120 Kd wiesen keine Aktivität auf, was die Autoren auf S.243 zum Schluß führte, daß die Komponente von 180-210 Kd die minimale aktive Einheit zur Maskierung von TGF-β ist.
Der Mechanismus der in vivo-Aktivierung ist nicht bekannt, kann aber Proteolyse oder Dissoziation beinhalten (Lyons et al., J. Cell. Biol., 106: 1659-1665 (1988); Keski-Oja et al., J. Cell Biochem. Suppl., 11A: 0, 60 [1987]). Da der TGF-β1-Rezeptor fast überall exprimiert wird, kann die Zielrestriktion für die TGF-β1-Wirkung durch die Gegenwart oder Abwesenheit des Aktivierungsmechanismus und nicht des Rezeptors definiert werden (Wakefield et al., J. Cell. Biol., 105: 965-975 [1987]); man kann erwarten, daß die Aktivierung der latenten Form ein wichtiger regulierender Schritt in der TGF-β1- Wirkungsweise ist.
Es wurde unlängst berichtet, daß die latente Form von TGF-β in Serum aus TGF-β besteht, der an α2-Makroglobulin gebunden ist; dabei handelt es sich um ein wichtiges Serumprotein, das bei der Entfernung von Serum-Endoproteasen, einschließlich Thrombin, Nukleophilen und Trypsin, aus dem Blutkreislauf eine Rolle spielt. O'Connor und Wakefield, J. Biol. Chem., 262: 14090-14099 (1987); Huang et al., Fed. Proc., 46: (6) 2024 (1987); Huang et al., J. Biol. Chem., 263: 1535-1541 (1988). Eine unterschiedliche Hemmung von TGF-β1- und TGF-β2-Aktivität durch α2-Makroglobulin wurde durch Danielpour und Sporn, J. Cell Biochem., 13B: 83 (1989) beobachtet. Es wurde postuliert, daß TGF-β1 in Blutplättchen in einem latenten Komplex gelagert wird, der den NH2-terminalen Teil seines Vorläufers und das TGF-β1-Bindungsprotein enthält, und daß andere Proteine, einschließlich α2-Makroglobulin, als "Reiniger" dienen und freigesetzten TGF-β1 inaktivieren können. Ergebnisse aus jüngster Zeit zeigen, daß die Wechselwirkung von TGF-β mit α2-Makroglobulin zu keiner Clearance des TGF-β-α2- Makroglobulinkomplexes führt, wie dies früher behauptet wurde. Philip und O'Connor- McCourt, "TGF-β", NY Acad. Sci. meeting abstract, 18-20. Mai 1989. Die Autoren nehmen an, daß der Komplex möglicherweise eine zirkulierende latente Form von TGF- β ist, der bei den Endocrin-Wirkungsweisen von TGF-β eine wichtige Rolle spielt.
Der gesamte TGF-β1-Vorläufer-Kodierungsbereich wurde erfolgreich in chinesischen Hamstereierstock-Zellen (Gentry et al., oben, und Lyons et al., J. Cell. Biol., 107 (6 Teil 3) 1988, 51a für Affen-TGF-β1) und in einer menschlichen Nierenkarzinom-Zellinie (Wakefield et al., J. Cell Biochem. Supp. 0 (13 Teil B) 21.-27. Januar 1989, S. 100 und Wakefield et al., Growth Factors, 1: (1989) für menschlichen TGF-β1) exprimiert. Wie Blutplättchen-TGF-β1 wird der rekombinante TGF-β1 in einer biologisch latenten Form sekretiert. Die rekombinante latente Form erfordert vorübergehendes Ansäuern zur Aktivierung. Immunblot-Analyse und Gelfitration zeigen, daß der rekombinante latente TGF-β1 ein Komplex von 100 Kd ist, worin aktiver 25 Kd-TGF-β nicht-kovalent mit den verbleibenden 75 Kd des verarbeiteten Vorläufers assoziiert ist, von dem er biosynthetisch abgespalten wurde. Im Gegensatz zum latenten Blutplättchen-Komplex enthält der rekombinante latente Komplex keine 135 Kd-Komponente. Gentry et al. wiesen hohe Mengen an Vorläufersequenzen nach, wobei ein Mangel an reifem TGF-β im konditionierten Medium des transfizierten CHO-Zeilen vorlag, und die recht stabil schienen.
Wakefield et al., Growth Factors, oben, beobachteten die Sekretion in etwa gleichen Anteilen einer weiteren 100 Kd-Spezies von latentem menschlichen TGF-β1, worin die 75 Kd- und 25 Kd-Komponenten durch eine Disulfid-Bindung kovalent verbunden sind. Diese Molekularspezies scheint wenig inhärente Bioaktivität aufzuweisen, obwohl sie TGF-β1 langsam im Verlauf der Zeit freisetzt, wahrscheinlich durch eine Disulfid- Austausch-Reaktion. Eine ähnliche Spezies mit Disulfid-Bindung wurde in anderen Expressionssystemen für TGF-β1 beobachtet (Gentry et al., Mol. and Cell. Biol., 8: 4162- 4168 [1988]), und es ist nicht klar, ob es sich dabei um ein Artefakt des Expressionssystems oder um ein normales biosynthetisches Zwischenprodukt handelt, das sich aufgrund einer Überladung der zellulären Verarbeitungsmaschinerie ansammelt.
Die latente Form von TGF-β2 wurde auch kürzlich in mit dem geeigneten Vektor transfizierten COS-Zellen hergestellt. Madisen et al., DNA, 8: 205-212 (1989). Die Autoren stellten zusätzlich fest, daß DNA, die für das latenzassoziierte Peptid von TGF- β1, das mit DNA fusioniert ist, die für reifen TGF-β2 kodiert, kodiert und in CHO-Zeiien exprimiert wird, bei der Aktivierung zu sekretiertem reifem TGF-β2 führte. Somit können die im TGF-β1-aminoterminalen Vorläuferabschnitt enthaltenen Verarbeitungssignale bei der Herstellung von reifem TGF-β2 eine Funktion haben.
Einige Autoren schrieben, daß sowohl Blutplättchen als auch Zellen in Kultur TGF-β in einer latenten Form freisetzen, die durch Säurebehandlung irreversibel aktiviert wird (Lyons et al., J. Cell Biochem. Suppl., 0 (12 Teil A), 24-30. Januar 1988). Andere nahmen in Zusammenhang mit rekombinantem sowie natürlichem latentem TGF-β an, daß es aufgrund des irreversiblen Charakters der Aktivierung bei der Dissoziation des Komplexes wahrscheinlich zu einer konformationalen Änderung des Vorläuferabschnitts kommt, sodaß sich das aktive Molekül von 25 Kd nicht mehr an den Vorläuferabschnitt binden kann (Lyons et al., J. Cell Biol., 106, oben). Andere Autoren charakterisierten die Aktivierung rekombinanter und Blutplättchen-Komplexe als reversibel (Wakefield et al., J. Cell Biochem. (1989), oben, und Wakefield et al., Growth Factors, oben).
Angesichts der deutlichen Hemmwirkung des rekombinanten, latenzassoziierten Peptids von TGF-β auf die Wirkungsweise sowohl von exogen verabreichten als auch endogen erzeugten aktiven TGF-β ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein solches Peptid in kommerziell nützlichen Mengen aus einem therapeutisch annehmbaren Ursprung zur Verwendung bei der in vivo-Inhibierung der schädlichen Auswirkungen von aktivem TGF-β bereitzustellen, d.h. ein latenzassoziiertes Peptid, das völlig frei von anderen natürlich vorkommenden (Ursprungs)Proteinen ist.
Weiters ist es ein Ziel der Erfindung, eine Aminosäure-Sequenz und andere Varianten des latenzassoziierten Peptids bereitzustellen, die die biologische Aktivität des Peptids nicht wesentlich negativ beeinflussen.
Ein weiteres Ziel besteht darin, eine Form von latentem TGF-β durch Kombinieren des latenzassoziierten Peptids mit reifem TGF-β zur therapeutischen Verabreichung bereitzustellen.
Diese und andere Ziele der Erfindung ergeben sich aus der gesamten Beschreibung.
In einem Aspekt bietet die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure-Sequenz, umfassend eine DNA-Sequenz, die für das in Fig.8 gezeigte Peptid kodiert, oder Analoge oder Varianten davon, die die biologische Aktivität eines latenzassoziierten Peptids besitzt, vorausgesetzt, daß die Sequenz nicht auch für reifen TGF-β kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Expressionsvektor, umfassend die obige Nukleinsäure-Sequenz, die mit Steuersequenzen operabel verbunden ist, die von einem mit dem Vektor transformierten Wirt erkannt werden, sowie mit diesem Expressionsvektor transformierte Wirtszellen zur Verfügung.
In einem weiteren Verfahren stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines latenzassoziierten Peptids zur Verfügung, welches Verfahren das Kultivieren der transformierten Wirtszellen umfaßt, um für das Peptid in der Wirtszellenkultur kodierende Nukleinsäure zu exprimieren.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein latenzassoziiertes Peptid, das völlig frei von Ursprungsproteinen ist, zur Verfügung.
Außerdem stellt die Erfindung ein latenzassozilertes Peptid zur Verwendung in einem Verfahren der medizinischen Behandlung oder Diagnose bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die zum Antagonisieren einer TGF-β-Aktivität dient, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des Peptids in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung die Verwendung eines latenzassoziierten Peptids bei der Herstellung eines Medikaments zum Antagonisieren einer TGF-β-Aktivität in einem Säugetier.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die aufgrund einer TGF-β-Aktivität nützlich ist, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des obigen Peptids und eine therapeutisch wirksame Menge eines reifen TGF-β in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Weiters stellt die Erfindung die Verwendung eines latenzassoziierten Peptids und eines TGF-β bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers bereit, das einer TGF-β-Behandlung bedarf.
In einem noch weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Diagnostizieren des Vorliegens einer Krankheit oder Störung bereitgestellt, die durch die Gegenwart von reifem TGF-β in einer Serumprobe eines Patienten nachweisbar ist, umfassend die Zugabe einer markierten Form des obigen latenzassoziierten Peptids zur Serumprobe und das Testen auf die Gegenwart von markierten Komplexen des Peptids und des reifen TGF-β in der Serumprobe.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Herstellung eines wärmelabilen, latenzassoziierten Peptids und/oder seiner Derivate durch rekombinante Techniken sowie Produkte und Verfahren, die mit einer solchen Herstellung in Zusammenhang stehen. Man ist der Ansicht, daß sich das durch das hierin beschriebene Verfahren hergestellte latenzassoziierte Peptid zur Steuerung der TGF-β-Aktivität z.B. durch Reinigen und Inaktivieren von überschüssigem aktivem TGF-β aus einer exogenen oder endogenen Quelle im Blutkreislauf, Gewebe usw. eignet. Es kann z.B. in Situationen verwendet werden, wo die TGF-β-Aktivierung an der Pathogenese bestimmter Krankheiten, beispielsweise jenen mit exzessiver Fibrose, beteiligt war. Überdies eignet sich das latenzassoziierte Peptid zur Behandlung anderer schädlicher Zustände, die durch TGF-β verursacht werden oder sich aus der Herstellung von TGF-β ergeben, z.B. bei der Unterdrückung von Tumoren, die autonom durch einen autokrinen, Mechanismus wachsen, bei dem TGF-β involviert ist, oder bei der Umkehr der Immununterdrückung. Das Peptid kann auch als diagnostisches Mittel eingesetzt werden.
Latenter TGF-β kann durch individuelles Exprimieren und Reinigen des latenzassoziierten Peptids und des aktiven (reifen) Abschnitts von TGF-β rekombinant hergestellt werden. Bei der gemeinsamen Zugabe können sich diese Proteine erneut assoziieren, um einen inaktiven (latenten) Komplex zu bilden. Dieser Komplex kann sich dazu eignen, TGF-β zu Stellen zu befördern, die zu seiner Aktivierung fähig sind, sodaß sich bei der latenten Form ein anderes Aktivitätsspektrum ergibt als bei reifem TGF-β alleine. In einer solchen Ausführungsform wird der Komplex systemisch verabreicht, um TGF-β auf seine Rezeptorstellen zu richten, wo die Aktivierung üblicherweise auftritt, wodurch man eine unerwünschte Ausbreitung im System unterbindet und erwünschte TGF-β-Aktivitäten erzielt, z.B. die Immununterdrückung und Knochenbildung.
Andere Verwendungszwecke des latenzassoziierten Peptids sind für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig.1 zeigt latente Formen von TGF-β und ihre standardisierte Nomenklatur. Der prepro- TGF-β voller Länge wird - ob in monomerer oder dimerer Form - als "Vorläufer" bezeichnet. Der Ausdruck "latenzassoziiertes Peptid" betrifft jenen Abschnitt des rekombinant hergestellten, latenten TGF-β-Komplexes, der einen Mangel an reifem TGF- β aufweist (wobei die rekombinanten Komplexe einen "kleinen, latenten TGF-β- Komplex" und einen "TGF-β-Komplex mit Disulfid-Bindung" enthalten). Das Bindungsprotein von 125-160 Kd, das mittels Disulfid-Bindung am latenzassoziierten Peptid im in vivo hergestellten "großen, latenten TGF-β-Komplex" befestigt ist, wird als "Bindungsprotein" bezeichnet.
Fig.2 zeigt die Konstruktion des Vektors pSVI-tPA, der als Ausgangsvektor verwendet wird, um den endgültigen Vektor für das latenzassoziierte Peptid zu konstruieren.
Fig.3 zeigt die Konstruktion des Vektors pSVI2-tPA.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion des Vektors pSVI3-tPA.
Fig.5 zeigt die Konstruktion des Vektors pSVI5-tPA.
Fig.6 zeigt die Konstruktion des Vektors pSVI6B-tPA.
Fig.7 zeigt die Konstruktion des allgemeinen Expressionsvektors pSVI6B5, in den das für das latenzassoziierte Peptid kodierende Gen günstigerweise eingesetzt wird.
Fig.8 zeigt die vollständige Nukleotid- und vorausgesagte Aminosäure-Sequenz des latenzassoziierten Peptids. Vorausgesagte Aminosäuren des Peptids sind unterhalb der DNA-Sequenz dargestellt und vom ersten Rest des N-Terminus der Peptidsequenz an numeriert. Die reife TGF-β-Sequenz ist nicht enthalten. Negative Nummern zeigen die Signalsequenz an, positive Nummern die Sequenz des sekretierten Peptids.
Fig.9 zeigt die Konstruktion der Expressionsvektoren pSVI6B-LAP-ARG und pSVI6B-LAP- SER aus pSVI6B5, die zur Transformation der Säugetier-Wirtszellen eingesetzt werden, um das latenzassoziierte Peptid zu erzeugen.
Fig.10 stellt die Menge an bioaktivem TGF-β in ng/ml dar - bestimmt durch einen Nerzlungen-Fibroblastzellen-Assay als Funktion des Grades von verdünntem, wärmeaktiviertem TGF-β-Überstand (Kreise) und bei Zugabe von wärmeinaktiviertem, latenzassoziiertem Peptid (Quadrate mit Strichlinien), oder unbehandeltem, latenzassoziiertem Peptid (Quadrate mit durchgehenden Linien), zum wärmeaktivierten TGF-β.
Fig.11 zeigt die Sequenzen von menschlichem TGF-β1, menschlichem TGF-β2, menschlichem TGF-β3, Küken-TGF-β4 und Frosch-TGF-β5.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

A.Definitionen

Der Ausdruck "latenzassoziiertes Peptid" bzw. "LAP" bezeichnet einen Vorläuferabschnitt von rekombinant hergestelltem TGF-β (d.h. von jedem TGF-β in der Familie der TGF-β) mit einem Molekulargewicht von etwa 75 Kd (d.h. 75 bis zu etwa 78 Kd), gemessen durch SDS-Page auf einem nicht-reduzierenden Gel und mit der Aminosäure-Sequenz von Fig.8, sowie Analoge und Varianten davon mit der biologischen Aktivität des korrespondierenden rekombinanten LAP. Die biologische Aktivität von rekombinantem LAP zeigt jedes Analog oder jede Variante davon, der bzw. die in der Lage ist, eine biologische Aktivität von reifem TGF-β zu antagonisieren. LAP, das die angegebene biologische Aktivität nicht besitzt, d.h. durch Wärmebehandlung abgebaut wird, ist ausgenommen. Das LAP ist ein dimeres Molekül, das bei der Reduktion ein Monomer mit einem Molekulargewicht von etwa 37-39 Kd auf reduzierendem SDS-PAGE bildet; die Varianten weisen diese dimere Eigenschaft nicht notwendigerweise auf.
Analoge oder Varianten sind als Moleküle definiert, worin die Aminosäure-Sequenz, Glykosylierung oder ein anderes Merkmal von rekombinantem LAP kovalent oder nichtkovalent modifiziert wurde. Somit können Varianten ein Molekulargewicht von etwa 70 Kd aufweisen oder nicht (bestimmt durch SDS-PAGE in Abwesenheit eines reduzierenden Mittels wie z.B. β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol). Beispielsweise besitzt nicht-glykosyliertes LAP mit der rekombinanten LAP-Sequenz auf nichtreduzierender SDS-PAGE ein geringeres Molekulargewicht. Aminosäure- Sequenzvarianten umfassen nicht nur Allele der Sequenz von Fig.8, sondern auch vorbestimmte Mutationen davon. Im allgemeinen besitzen Aminosäure- Sequenzvarianten eine Aminosäure-Sequenz mit zumindest etwa 80%-iger Sequenzidentität (typischererweise zumindest etwa 90%-iger Sequenzidentität) mit jener des rekombinanten LAP von Fig.8. Der Ausdruck LAP bezieht sich im weiteren entweder auf die rekombinant hergestellte Sequenz, eine Variantenform oder auf Fragmente, die eine oder mehrere biologisch aktive Stellen innerhalb des Moleküls darstellen, soferne es nicht anders zweckmäßig ist.
Der erfindungsgemäße Schutzumfang umfaßt somit ein LAP mit der in Fig.8 dargestellten rekombinanten menschlichen LAP-Aminosäure-Sequenz, analoge LAP- Proteine aus anderen Spezies wie z.B. Rinder-, Pferde-, Schweine-, Schafe-, Hunde-, Mäuse-, Katzen-LAP u.dgl., LAP-Sequenzen aus anderen Arten von TGF-β wie z.B. TGF- β2 (siehe z.B. Madisen et al., DNA, oben) und biologisch aktive Aminosäure- Sequenzvarianten dieser LAP-Moleküle, einschließlich der Allele und in vitro-erzeugten kovalenten Derivate von LAP, die seine biologische Aktivität zeigen.
Der Ausdruck "TGF-β" bezieht sich hierin auf die Familie der oben beschriebenen Moleküle, die die native Aminosäure-Sequenz voller Länge jedes beliebigen TGF-β aus jeder beliebigen Spezies besitzen. Verweise auf solche TGF-β verstehen sich als Verweise auf eine beliebige der derzeit identifizierten Formen, einschließlich TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5 (deren Sequenzen in Fig.11 dargestellt sind), sowie auf zukünftig identifizierte TGF-β-Spezies, einschließlich jener Polypeptide, die von der Sequenz von jedem bekannten TGF-β abgeleitet sind und zu zumindest 75% der Reste identisch sind. Die spezifischen Ausdrücke "TGF-β1", "TGF-β2" und "TGF-β3" beziehtn sich auf die in der Literatur definierten TGF-β, z.B. Derynck et al., Nature, oben; Seyedin et al., J. Biol. Chem.-, 262, oben, und deMartin et al., oben.
Mitglieder der TGF-β-Familie sind als jene definiert, die im reifen Abschnitt des Moleküls über neun Cystein-Reste verfügen, zumindest 65% Sequenzidentität mit anderen bekannten TGF-β-Sequenzen im reifen Bereich aufweisen und um den gleichen Rezeptor konkurrieren können. Zusätzlich scheinen sie alle als größerer Vorläufer kodiert zu werden, der einen Bereich hoher Homologie in der Nähe des N-Terminus teilt und eine Konservierung von drei Cystein-Resten im Abschnitt des Vorläufers aufweist, der später durch Verarbeitung entfernt wird. Außerdem scheinen die TGF-β eine Verarbeitungsstelle mit vier oder fünf basischen Aminosäuren zu besitzen.
"Neutralisierung" einer TGF-β-Aktivität bezieht sich hierin auf die Neutralisierung eines TGF-β, gemessen durch die Hemmung der Aufnahme von ³H-Thymidin einer Nerzlungen-Fibroblasten-Zellinie, z.B. Mv-3D9 und CCL 64.
Der Ausdruck "eine biologische Aktivität von TGF-β antagonisieren" bedeutet die Blockierung einer Aktivität eines TGF-β, d.h. im wesentlichen die Verhinderung zumindest einer unerwünschten, wachstumshemmenden, immunosuppressiven, stromabildenden (die stromalen Elemente enthalten Entzündungszellen, Endothelzellen und Fibroblasten) oder verankerungsunabhängigen, wachstumsfördernden Aktivität von reifem TGF-β, wie in der Literatur definiert. Das LAP kann daher die Aktivität von allem endogen freigesetzten TGF-β blockieren, der durch Tumoren und Unterdrücker- Lymphoidzellen (T-Zeilen) erzeugt wird. Die Identifizierung von LAP-Molekülen mit dieser Wirkung erfolgt durch den oben dargelegten Neutralisierungstest.
Beispiele für Zustände, die durch Therapie oder Prophylaxe unter Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden können, umfassen Zustände, die verursacht werden durch Unterdrückung des Immunsystems aufgrund endogener TGF-β-Produktion, einschließlich des erworbenen Immunschwäche- Syndroms, akute/akuter Immundefizienzen aufgrund schwerer Verletzungen, Verbrennungen, und Krankheiten wie z.B. virale oder bakterielle Infektionen, zystische Fibrose, mehrere Organe betreffende, systemische Erkrankungen aufgrund von TGF-β- Produktion ober Überproduktion, sowie TGF-β-erzeugende Tumoren. Solche Zustände umfassen nicht jene, die das Ergebnis der Zellproliferation der Lymphoid- und Myeloid- Abstammungslinien sind, welche Proliferation durch TGF-β gehemmt wird (z.B. Burkitt- Lymphom, T-Zellen-Lymphome, B-Zellen-Lymphome und verschiedene myelozytische Leukämien).
Solche Zustände umfassen auch Krankheiten, die durch zirkulierenden TGF-β oder an einer lokalen Stelle aktivierten TGF-β verursacht werden, z.B. jene Krankheiten, die mit chronischer Granulierung oder Hyperproliferation einhergehen, wie z.B. fibrotische Erkrankungen, einschließlich der Fibrose jedes Organs, z.B. Sclerodermie, der Fibrose der Lunge, der Niere, des Peritonealraums und der Leber, sowie Krankheiten, die durch einen Überschuß an aktivem TGF-β verursacht werden, z.B. die durch einen TGF-β-2- Überschuß verursachte Vitreoretinopathie. Ebenfalls enthalten ist die Verbindung von Krankheiten und Nebenwirkungen, die sich durch TGF-β und einen anderen Regulator der Immunfunktion in einem Säugetier ergeben (Definition folgt).
Der Ausdruck "Regulatoren der Immunfunktion in einem Säugetier" bezieht sich auf Cytokine und Wachstumsfaktoren, die die Immunfunktion eines Säugetiers regulieren; dazu zählen Interleukine, der Tumornekrose-Faktor, Lymphotoxin, der epidermale Wachstumsfaktor, der Wachstumsfaktor aus Blutplättchen, TGF-α, der Makrophage- Wanderungs-Hemmfaktor, der Makrophage-Aktivierungsfaktor, der Fibroblasten- Wachstumsfaktor, Makrophage-Aktivierungsfaktoren, Interferone und Kolonie- Stimulierungsfaktoren. Diese Regulatoren können aus natürlichen Quellen stammen, durch Leukozyten gebildet, im Bedarfsfall durch chemische Verfahren synthetisiert oder durch rekombinante Techniken hergestellt werden. Vorzuziehen davon sind IL-1, IL-2, IL-6 und IFN-γ.

B. Durchführungsarten der Erfindung

1. Modifizierung von LAF

Derivate und Aminosäure-Sequenzvarianten von LAP sind aufgrund ihrer biologischen Aktivität geeignet, da sie therapeutisch nützlich ist, wie dies hierin erläutert wird.

a. Kovalente Modifizierung

Kovalente Modifizierungen eines LAP-Moleküls sind vom Erfindungsbereich umfaßt. LAP-Fragmentvarianten mit bis zu etwa 100 Resten können problemlos durch in vitro- Synthese hergestellt werden. Solche Modifizierungen können in das Molekül eingebracht werden, indem gezielte Aminosäure-Reste des gereinigten oder rohen Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel reagieren, das mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten reagieren kann. Die resultierenden kovalenten Derivate eignen sich für Programme zur Identifizierung von Resten, die für die biologische Aktivität wichtig sind.
Cysteinyl-Reste werden am häufigsten mit α-Haloacetaten (und korrespondierenden Ammen), z.B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethyl-Derivate zu ergeben. Cysteinyl-Reste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidazolyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2- pyridyldisulfid, p-Chlorquecksilber(II)benzoat, 2-Chlorquecksilber-(-II-)4-nitrophenol, oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei einem pH-Wert von 5,5-7,0 derivatisiert, da dieses Mittel für die Histidyl-Seitenkette relativ spezifisch ist. Para-bromphenacylbromid ist auch geeignet; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernstein- oder anderen Karbonsäure- Anhydriden umgesetzt. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln bewirkt eine Ladungsumkehr der Lysinyl-Reste. Andere zweckmäßige Reagentien zur Derivatisierung von α-amino-enthaltenden Resten sind Imidester wie z.B. Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O- Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und die durch Transaminase katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginyl-Reste werden durch die Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Resten, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin modifiziert. Die Derivatisierung von Arginin-Resten erfordert, daß die Reaktion aufgrund des hohen pK-Werts der Guanidin-funktionalen Gruppe unter alkalischen Bedingungen stattfindet. Weiters können diese Reagentien mit den Lysin-Gruppen sowie mit der Arginin-&epsi;-Aminogruppe reagieren.
Die spezifische Modifizierung von Tyrosyl-Resten wurde als solche ausführlich untersucht, wobei man sich besonders für die Einführung spektraler Markierungen in Tyrosyl-Reste durch Reaktion mit aromatischem Diazonium-Verbindungen oder Tetranitromethan interessierte. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan dazu verwendet, O-Acetyltyrosyl-Spezies bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden. Tyrosyl-Reste werden mittels ¹²&sup5;I oder ¹³¹I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung im Radioimmun-Assay herzustellen, wobei das oben beschriebene Chloramin-T-Verfahren geeignet ist.
Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R') wie z.B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4- ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4,-dimethylpentyl)carbodiimid selektiv modifiziert. Außerdem werden Aspartyl- und Glutamyl-Reste durch Reaktion mit Ammonium-Ionen zu Asparaginyl- und Glutaminyl-Resten umgewandelt.
Glutaminyl- und Asparaginyl-Reste werden häufig zu den korrespondierenden Glutamyl- und Aspartyl-Resten deamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen in den Erfindungsbereich.
Andere Modifizierungen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorilierung der Hydroxyl-Gruppen von Seryl- oder Threonyl-Resten, die Methylierung der α-Amino-Gruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T.E. Creighton, Proteins, Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S.79-86 [1983]), die Acetylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung der C-terminalen Carboxyl-Gruppe.

b. Mutation(en) in der DNA

Aminosäure-Sequenzvarianten von LAP können auch durch Mutationen in der DNA hergestellt werden. Solche Varianten umfassen z.B. Löschungen Einfügungen oder Substitutionen von Resten innerhalb der in Fig.8 dargestellten Aminosäure-Sequenz. Jede Kombination von Löschung, Einfügung und Substitution kann durchgeführt werden, um zum endgültigen Konstrukt zu gelangen, vorausgesetzt, daß das Endkonstrukt die erwünschte Aktivität aufweist. Natürlich dürfen die Mutationen in der für die Variante kodierenden DNA die Sequenz nicht außerhalb des Leserahmens setzen und bilden vorzugsweise keine komplementären Bereiche, die eine sekundäre mRNA-Struktur erzeugen könnten (siehe EP-A 75.444).
Auf genetischer Ebene werden diese Varianten üblicherweise durch stellengerichtete Mutagenese von Nukleotiden in der für das LAP kodierenden DNA, wodurch für die Variante kodierende DNA entsteht, und anschließende Expression der DNA in rekombinanter Zellkultur hergestellt. Die Varianten weisen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität auf wie das natürlich vorkommende Analoge.
Während die Stelle zur Einfügung der Aminosäure-Sequenzvariation vorbestimmt ist, muß die Mutation an sich nicht vorbestimmt sein. Zur Optimierung der Leistungsfähigkeit einer Mutation an einer bestimmten Stelle können z.B. eine Zufalls- Mutagenese am Ziel-Codon oder im Zielbereich durchgeführt und die exprimierten LAP-Varianten auf die optimale Kombination der erwünschten Aktivität gescreent werden. Techniken zur Durchführung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA mit einer bekannten Sequenz sind allgemein bekannt, z.B. stellenspezifische Mutagenese.
Die Herstellung von LAP-Varianten erfolgt gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise durch stellenspezifische Mutagenese von DNA, die für eine vorher gebildete Variante oder eine Nicht-Variantenversion des Proteins kodiert. Die stellenspezifische Mutagenese ermöglicht die Herstellung von LAP-Varianten durch die Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der erwünschten Mutation sowie für eine ausreichende Anzahl an benachbarten Nukleotiden kodieren, um eine Primer-Sequenz von ausreichender Größe und Sequenzenkomplexität bereitzustellen, um auf beiden Seiten der überquerten Löschungsverbindungsstelle einen stabilen Duplex zu bilden. Typischerweise ist ein Primer mit einer Länge von etwa 20 bis 25 Nukleotiden vorzuziehen, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verbindungsstelle der geänderten Sequenz liegen. Im allgemeinen ist das Verfahren der stellenspezifischen Mutagenese auf dem Gebiet wohlbekannt, siehe z.B. die Veröffentlichung von Adel man et al., DNA, 2: 183 (1983).
Man beachte, daß das stellenspezifische Mutagenese-Verfahren typischerweise die Verwendung eines Phagevektors vorsieht, der sowohl in einstrangiger als auch in doppelstrangiger Form besteht. Typische Vektoren, die sich zur stellengerichteten Mutagenese eignen, sind Vektoren wie z.B. M13-Phage, wie dies beispielsweise durch Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Hg. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), geoffenbart ist. Diese Phagen sind im Handel erhältlich, und ihre Verwendung ist Fachleuten auf dem Gebiet im allgemeinen bekannt. Alternativ dazu kann man Plasmidvektoren verwenden, die einen einstrangigen Phage-Replikationsursprung enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol., 153 [1987]), um einstrangige DNA zu bilden.
Im allgemeinen erfolgt die stellengerichtete Mutagense im Einklang mit der Erfindung zunächst durch Bilden eines einstrangigen Vektors, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die für das betreffende Protein kodiert. Ein Oligonukleotid- Primer, der die erwünschte mutierte Sequenz trägt, wird im allgemeinen synthetisch, z.B. durch das Verfahren nach Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75: 5765 (1978) hergestellt. Dieser Primer wird dann mit dem einstrangigen, Proteinsequenzenthaltenden Vektor verschmolzen und DNA-Polymerisierungsenzymen wie z.B. dem E.coli-Polymerase I-Klenow-Fragment ausgesetzt, um die Synthese des die Mutation tragenden Strangs abzuschließen. Somit wird ein Heteroduplex gebildet, worin ein Strang für die ursprüngliche, nicht-mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die erwünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor dient dann dazu, geeignete Zellen wie z.B. JM1O1-Zellen zu transformieren; Klone werden ausgewählt, die rekombinante, die mutierte Sequenzanordnung tragende Vektoren enthalten.
Nach der Auswahl eines solchen Klons kann der mutierte Proteinbereich entfernt und zur Proteinherstellung in einen geeigneten Vektor, im allgemeinen einen Expressionsvektor des Typs, der zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet werden kann, eingesetzt werden.

c. Arten von Mutationen

Aminosäuresequenz-Löschungen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, vorzugsweise von 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise angrenzend.
Aminosäuresequenz-Einfügungen umfassen amino- und/oder carboxylterminale Fusionen von einem Rest bis zu Polypeptiden von im wesentlichen uneingeschränkter Länge, sowie Intrasequenz-Einfügungen einzelner oder mehrerer Aminosäure-Reste. Intrasequenz-Einfügungen (d.h. Einfügungen innerhalb der reifen LAP-Sequenz) können im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten, vorzugsweise 1 bis 5 Resten, liegen.
Die dritte Gruppe von Varianten sind jene, worin zumindest ein Aminosäure-Rest im LAP-Molekül, und vorzugsweise nur einer, entfernt und ein anderer Rest an seiner Stelle eingesetzt wurde. Solche Substitutionen erfolgen vorzugsweise in Einklang mit der folgenden Tabelle 1, wenn es erwünscht ist, die Eigenschaffen eines LAP-Moleküls fein einzustellen. Tabelle 1 Ursprünglicher Rest Substitutionsbeispiele
Wesentliche Änderungen der Funktion oder immunologischen Identität erfolgen durch Auswahl von Substitutionen, die weniger konservativ als jene in Tabelle 1 sind, d.h. durch Auswahl von Resten, die sich deutlicher unterscheiden in bezug auf ihre Auswirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur des Polypeptid-Rückgrats im Substitutionsbereich, z.B. als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette. Die Substitutionen, von denen man im allgemeinen erwarten kann, daß sie die größten Veränderungen der LAP-Eigenschaften hervorrufen, sind jene, worin (a) Glycin und/oder Prolin (P) durch eine andere Aminosäure substituiert oder gelöscht oder eingefügt ist; (b) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest substituiert ist, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (c) ein Cystein- Rest für (oder durch) einen beliebigen anderen Rest substituiert ist; (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl für (oder durch) einen Rest mit einer elektronegativen Ladung, z.B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert ist; oder (e) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, für (oder durch) eine ohne solche Seitenkette, z.B. Glycin, substituiert ist.
Man kann nicht erwarten, daß die meisten Löschungen und Einfügungen - und insbesondere die Substitutionen - radikale Änderungen der Eigenschaften des LAP- Moleküls bewirken. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Auswirkung der Substitution, Löschung oder Einfügung vorauszusagen, können Fachleute auf dem Gebiet diese Auswirkungen durch Routine-Screening-Assays ermitteln. Beispielsweise wird eine Variante typischerweise durch stellenspezifische Mutagenese der nativen, für LAP kodierenden Nukleinsäure, Expression der varianten Nukleinsäure in rekombinanter Zellkultur und wahlweise durch Reinigung von der Zellkultur, beispielsweise durch Immunaffinitäts-Adsorption auf einer polyklonalen Hasen-anti-LAP- Säule, hergestellt (um die Variante zu absorbieren, indem sie an zumindest ein verbleibendes Immunepitop gebunden wird).
Da LAP zu Dimeren aggregieren kann, liegt es im Erfindungsbereich, Hetero- und Homodimere bereitzustellen, worin eine oder beide Untereinheiten Varianten sind. Wenn beide Untereinheiten Varianten sind, können die Änderungen der Aminosäure- Sequenz für jede Untereinheit-Kette gleich oder unterschiedlich sein. Man erzeugt Heterodimere durch Co-Transformieren von Wirtszellen mit für beide Untereinheiten kodierender DNA und - falls erforderlich - durch Reinigen des erwünschten Heterodimers bzw. durch getrenntes Synthetisieren der Untereinheiten, Dissoziieren der Untereinheiten (z.B. durch Behandlung mit einem chaotropen Mittel wie z.B. Harnstoff, Guanidinhydrochlorid u.dgl.), Vermischen der dissoziierten Untereinheiten und erneutes Assoziieren der Untereinheiten durch Wegdialysieren des chaotropen Mittels.
Die Aktivität des Zelllysats oder der gereinigten LAP-Variante wird dann in einem geeigneten Screening-Assay auf die erwünschte Eigenschaft getestet. Beispielsweise werden Änderungen des Werts der TGF-β-Aktivität durch die Mutanten-Kandidaten durch den zweckmäßigen Assay gemessen. Modifizierungen solcher Proteineigenschaften wie z.B. Redox- oder Wärmestabilität, Hydrophobie, Anfälligkeit gegenüber proteolytischem Abbau oder die Neigung zur Aggregatiion mit Trägern oder zu Multimeren werden durch Verfahren getestet, die für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig sind.

3. Rekombinante Expression

Das erwünschte LAP-Molekül kann durch jedes beliebige Verfahren, einschließlich rekombinanter Verfahren, hergestellt werden. Eine isolierte DNA bezieht sich entsprechend hierin auf chemisch synthetisierte DNA, cDNA, chromosomale oder extrachromosomale DNA mit oder ohne 5'-Flankierungsbereich. Vorzugsweise entsteht das erwünschte LAP hierin durch Synthese in rekombinanter Zellkultur.
Für eine solche Synthese ist es zunächst erforderlich, Nukleinsäure zu erhalten, die für LAP kodiert. Für ein LAP-Molekül kodierende DNA kann aus einer Quelle von Zellen für menschlichen TGF-β gewonnen werden; dies erfolgt durch (a) Bildung einer cDNA- Sammlung aus diesen Zellen, (b) Durchführen einer Hybridisierungsanalyse mit markierter DNA, die für TGF-β oder Fragmente davon kodiert (mit einer Länge von bis zu oder mehr als 100 Basenpaaren), um Klone in der Sammlung zu erkennen, die homologe Sequenzen enthält, und (c) Analysieren der Klone durch Restriktionsenzym- Analyse und Nukleinsäure-Sequenzieren zur Identifizierung von Klonen voller Länge. DNA, die an eine für TGF-β-kodierende DNA unter Bedingungen geringer Strenge hybridiseren kann, eignet sich zur Identifizierung einer für TGF-β kodierenden DNA. Sowohl Bedingungen hoher und geringer Strenge sind unten definiert. Wenn Klone voller Länge in einer cDNA-Sammlung nicht vorhanden sind, können geeignete Fragmente aus den verschiedenen Klonen durch praktische Anwendung der hierin geoffenbarten Information über die Nukleinsäure-Sequenz gewonnen und an Restriktionsstellen ligiert werden, die den Klonen gemeinsam sind, um ein für den TGF- β kodierendes Klon voller Länge zusammenzusetzen. Alternativ dazu bieten genomische Sammlungen die erwünschte DNA. Der reife Abschnitt des TGF-β wird gespalten, und der verbleibende Vorläufer- (LAP) Abschnitt ist der hierin verwendete Abschnitt. Die Sequenz der für menschliches LAP kodierenden DNA, die schließlich festgelegt wurde, ist in Fig.8 veranschaulicht. Sobald diese DNA identifiziert und aus der Sammlung isoliert ist, wird sie zur weiteren Klonierung oder zur Expression zu einem replizierbaren Vektor ligiert.
In einem Beispiel eines rekombinanten Expressionssystems wird ein für LAP kodierendes Gen in Säugetierzellen durch Transformation mit einem Expressionsvektor exprimiert, der für das LAP kodierende DNA umfaßt. Es ist vorzuziehen, Wirtszellen zu transformieren, die eine solche Verarbeitung durchführen können, um das LAP im Kulturmedium oder Periplasma oder Wirtszelle zu erhalten, d.h. um ein abgesondertes Molekül zu erhalten.

a. Geeignete Wirtszellen und Vektoren

Die hierin geoffenbarten Vektoren und Verfahren eignen sich zur Verwendung in Wirtszellen in einem breiten Bereich prokaryotischer und eukaryotischer Organismen.
Im allgemeinen sind Prokaryoten zur anfänglichen Klonierung, Amplifizierung oder Lagerung der interessierenden Vektoren vorzuziehen. Vektor-DNA kann man problemlos aus bestimmten Prokaryoten gewinnen. E.coli K12-Stamm MM 294 (ATCC Nr. 31.446) eignet sich besonders für diesen Zweck. Andere brauchbare Mikrobenstämme sind E.coli-Stämme wie z.B. E.coli B und E.coli X1776 (ATCC Nr. 31.537). Diese Beispiele sind natürlich veranschaulichend und nicht einschränkend.
Prokaryoten können auch zur Expression herangezogen werden. Die obigen Stämme sowie E.coli-Stämme W3110 (F, Lambda-, protroph, ATCC Nr.27.325), K5772 (ATCC Nr. 53.635) und SR101, Bazillen wie z.B. Bacillus subtilis und andere Enterobakteriaceae wie z.B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans und verschiedene Pseudomonas-Spezies können auch verwendet werden.
Im allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Steuersequenzen enthalten, die aus mit der Wirtszelle kompatiblen Spezies stammen, in Verbindung mit diesen prokaryotischen Wirten verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikationsstelle sowie Markierungssequenzen, die eine phenotypische Auswahl in transformiertenZellen ermöglichen. Beispielsweise wird E.coli typischerweise mit pBR322, einem Plasmid aus einer E.coli-Spezies, transformiert (siehe z.B. Bolivar et al., Gene, 2: 95 [1977]). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tracyclin-Resistenz und bietet somit ein leichtes Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen. Das pBR322- Plasmid bzw. ein anderes mikrobielles Plasmid oder ein anderer Phage müssen auch Promotoren enthalten (bzw. modifiziert werden, um sie zu enthalten), derer sich der Mikrobenorganismus zur Expression der auswählbaren Markergene bedienen kann.
Diese am häufigsten in der rekombinanten DNA-Konstruktion verwendeten Promotoren enthalten die β-Lactamase- (Penicillinase) und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature, 375: 615 [1978]; Itakura et al., Science, 198: 1056 [1977]; Goeddel et al., Nature, 281: 544 [1979]) und ein Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 [1980]; EP-A 0036.776). Dies sind die am häufigsten verwendeten mikrobiellen Promotoren, doch auch andere wurden entdeckt und verwendet bzw. Details über ihre Nukleotid-Sequenzen veröffentlicht, wodurch ein Fachmann auf dem Gebiet in der Lage ist, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren (siehe z.B. Siebenlist et al., Cell, 20: 269 [1980]).
Zusätzlich zu Prokaryoten kann man auch eukaryotische Mikroben wie z.B. Hefekulturen verwenden. Saccharomyces cerevisiae bzw. Backhefe ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, obwohl auch eine Anzahl anderer Stämme üblicherweise verfügbar ist. Zur Expression in Saccharomyces verwendet man allgemein das Plasmid YRp7 (siehe z.B. Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7: 141 [1979]; Tschemper et al., Gene, 10: 157 [1980]). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Auswahlmarker für einen Mutantenstamm von Hefe bietet, der nicht die Fähigkeit besitzt, in Tryptophan zu wachsen, z.B. ATCC Nr.44.076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 [1977]). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Eigenschaft des Hefe-Wirtszellen-Genoms stellt dann eine wirkungsvolle Umgebung zum Nachweis von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan dar.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren sind die Promotoren für 3- Phopshoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 [1968]; Holland et al., Biochemistry, 17: 4900 [1978]), z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6- phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glukokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Terminierungssequenzen auch in den Expressionsvektor 3' der zu exprimierenden Sequenz ligiert, um eine Polyadenylierung der mRNA und eine Terminierung zu erzielen. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription bieten, sind der Promotorbereich für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Säurephosphatase, mit dem Stickstoff- Stoffwechsel assoziierte Abbauenzyme und die oben erwähnte Glyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenase, sowie Enzyme, die für die Maltose- und Galactose- Verarbeitung verantwortlich sind. Jeder Plasmidvektor, der den hefekompatiblen Promotor, den Replikationsursprung und Terminierungssequenzen enthält, ist geeignet.
Zusätzlich zu Mikroorganismen kann man auch Zellkulturen aus multizellulären Organismen als Wirte verwenden. Im Prinzip ist jede derartige Zellkultur geeignet, ob aus einer Wirbeltier- oder einer wirbellosen Kultur. Das größte Interesse galt jedoch den Wirbeltierzellen, deren Vermehrung in Kultur (Gewebekultur) in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren wurde (Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hg. [1973]).
Beispiele solcher geeigneter Wirtszellinien sind die Affennieren-CVI-Linie, die durch SV40-Sequenzen transformiert ist (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche Embryonennieren-Linie (293, Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 [1977]); Babyhamster- Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); chinesische Hamstereierstock-Zellen (Urlaub und Chasin, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]; Mäuse-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 [1980]; Affennieren-Zellen (CVI, ATCC CCL 70); Nierenzelen der afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Gebärmutterhalskrebs-Zellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenieren-Zellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleber-Zellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäuse-Brusttumor-Zellen (MMT, 060562, ATCC CCL51); Ratten-Hepatom- Zellen (HTC, M1,54, Baumann et al., J. Cell. Biol., 85: 1-8 [1980]); und TRI-Zellen (Mather et al., Annais N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 [1982]). Der bevorzugteste eukaryotische Wirt zur stabilen Expression ist hierin die chinesische Hamstereierstock- Zellinie.
Zur Verwendung in Säugetierzellen werden die Steuerfunktionen auf den Expressionsvektoren oft durch virales Material bereitgestellt. Beispielsweise werden häufig verwendete Promotoren aus den Genomen von Polyom, Adenovirus2, Retroviren, dem Cytomegalovirus und am häufigsten dem Affenvirus 40 (SV40) abgeleitet. Andere Promotoren stammen aus heterologen Quellen, z.B. der β-Actin- Promotor. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus sind besonders geeignet, da beide leicht aus dem Virus als Fragment zu erhalten sind, das auch den viralen SV40- Replikationsursprung enthält [Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)]. Kleinere oder größere SV40-Fragmente können auch verwendet werden, vorausgesetzt, es ist eine Sequenz von etwa 250 bp enthalten, die sich von der HindIII-Stelle zur BglI-Stelle erstreckt, die im viralen Replikationsursprung angeordnet ist. Der unmittelbar frühe Promotor auf dem menschlichen Cytomegalovirus wird günstigerweise als ein HindIII- Restriktionsfragment gewonnen. Greenaway et al., Gene, 18: 355-360 (1982). Weiters ist es auch möglich und oft wünschenswert, Promotor- und Steuersequenzen zu verwenden, die normalerweise mit der erwünschten Gensequenz assoziiert sind, vorausgesetzt, solche Steuersequenzen sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
Die Transkription einer für LAP kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird durch Einfügen einer Verstärker-Sequenz in den Vektor erhöht. Der Verstärker ist ein ciswirkendes Element der DNA, üblicherweise von etwa 10 bis 300 bp, das auf einen Promotor einwirkt, um seine Transkriptionsinitiations-Aktivität zu steigern. Verstärker sind relativ ausrichtungs- und positionsunabhängig und wurden 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 993 [1981] und 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3: 1108 [1983]) zur Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell, 33: 729 [1983]) sowie innerhalb der Kodierungssequenz selbst (Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4: 1293 [1984]) vorgefunden. Vorzugsweise befindet sich jedoch das Verstärkerelement hierin stromaufwärts von der Promotor-Sequenz. Viele Verstärker-Sequenzen sind aus Säugetier-Genen bekann (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise verwendet man jedoch einen Verstärker aus einem eukaryotischen Zellvirus. Beispiele sind der SV40-Verstärker auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270), der Cytomegalovirus-frühe Promotor-Verstärker, der Polyom-Verstärker auf der späten Seite des Replikationsursprungs, und Adenovirus- Verstärker. Am bevorzugtesten ist hierin der SV40-Verstärkerbereich.
In Säugetier-Wirtszellen verwendete Expressionsvektoren enthalten auch Polyadenylierungsstellen. Beipsiele von Polyadenylierungsbereiche stammen aus Viren wie z.B. SV40 (früh und spät) oder HBV.
Ein Replikationsursprung kann entweder durch Konstruktion des Vektors bereitgestellt werden, um einen exogenen Ursprung zu enthalten (kann aus SV40 oder einer anderen viralen Quelle stammen, z.B. Polyom, Adeno, VSV, BPV), oder durch die Wirtszelle bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellen-Chromosom integriert ist, reicht das letztere oft aus.
Die Expressionsvektoren können günstigerweise ein Selektionsgen enthalten, das auch den Namen "auswählbarer Marker" trägt. Ein Selektionsgen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder das Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendig ist. Beispiele geeigneter auswählbarer Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolatreductase (DHFR), Thymidinkinase (TK) oder Neomycin. Wenn solche auswählbaren Marker erfolgreich in eine Säugetier-Wirtszelle übertragen werden, kann die transformierte Säugetier-Wirtszelle unter selektivem Druck überleben.
Es gibt zwei allgemein verwendete unterschiedliche Kategorien selektiver Systeme. Die erste Kategorie beruht auf dem Stoffwechsel einer Zelle und der Verwendung einer mutanten Zellinie, die nicht die Fähigkeit besitzt, unabhängig in einem ergänzten Medium zu wachsen. Zwei Beispiele sind die CHO-DHFR&supmin;-Zellen und Mäuse-LTK&supmin;- Zellen. Diese Zellen besitzen nicht die Fähigkeit, ohne die Zugabe von Nährstoffen wie Thymidin oder Hypoxanthin zu wachsen. Da diese Zellen einen Mangel an bestimmten Genen aufweisen, die zum vollständigen Nukleotidsynthese-Weg notwendig sind, können sie nur dann überleben, wenn die fehlenden Nukleotide in einem ergänzten Medium bereitgestellt sind. Eine Alternative zur Ergänzung des Mediums ist die Einführung eines intakten DHFR- oder TK-Gens in Zellen, die die jeweiligen Gene nicht besitzen, wodurch ihre Wachstumserfordernisse geändert werden. Einzelne Zellen, die nicht mit dem DHFR- oder TK-Gen transformiert wurden, können in einem nichtergänzten Medium nicht überleben. Daher erfordert die direkte Auswahl dieser Zellen das Zellwachstum in Abwesenheit von Ergänzungsnährstoffen.
Die zweite Kategorie ist die dominante Auswahl, die sich auf ein Selektionsschema bezieht, das die Verwendung einer mutanten Zellinie nicht erfordert. Dieses Verfahren sieht typischerweise den Einsatz eines Arzneimittels zum Stoppen des Wachstums einer Wirtszelle vor. Jene Zellen, die ein neues Gen besitzen, würden ein Arzneimittel- Resistenz verleihendes Protein exprimieren und die Selektion überleben. Beispiele von Arzneimitteln, die bei der dominanten Auswahl zum Einsatz kommen, sind Neomycin (Southern und Berg, J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 [1982]), Mycophenolsäure (Mulligan und Berg, Science, 209: 1422 [1980] oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 [1985]). Bei diesen drei obigen Beispielen werden bakterielle Gene unter eukaryotischer Steuerung verwendet, um Resistenz gegenüber dem geeigneten Arzneimittel zu verleihen, d.h. Neomycin (G418 oder Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin.
Zufriedenstellende Mengen an Protein werden durch Zellkulturen produziert; Verfeinerungen unter Verwendung einer sekundären Kodierungssequenz dienen jedoch dazu, diese Mengen noch zu steigern. Eine sekundäre Kodierungssequenz umfaßt Dihydrofolatreductase (DHFR), die durch einen von außen gesteuerten Parameter beeinflußt wird, z.B. Methotrexat (MTX), wodurch die Expressionssteuerung durch Steuerung der Methotrexat-Konzentration ermöglicht wird.
Bei der Auswahl einer bevorzugten Wirtszelle zur Transfektion durch die erfindungsgemäßen Vektoren, die DNA-Sequenzen umfassen, die sowohl für das LAP- als auch das DHFR-Protein kodieren, ist es zweckmäßig, den Wirt gemäß dem Typ des verwendeten DHFR-Proteins auszuwählen. Bei Verwendung eines DHFR-Proteins des Wildtyps ist es vorzuziehen, eine Wirtszelle mit einem Mangel an DHFR auszuwählen, wodurch die Verwendung der DHFR-Kodierungssequenz als Marker zur erfolgreichen Transfektion in selektivem Medium ermöglicht wird, dem es an Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlt. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die chinesische Hamstereierstock- (CHO) Zellinie ohne DHFR-Aktivität, die nach dem Verfahren von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216 (1980) hergestellt und vermehrt wird.
Wenn hingegen ein DHFR-Protein mit geringer Bindungsaffinität für MTX als Steuersequenz verwendet wird, ist es nicht erforderlich, auf Zellen ohne DHFR zurückzugreifen. Da Mutanten-DHFR gegenüber Methotrexat resistent ist, kann man MTX-hältige Medien als Auswahlmittel verwenden, vorausgesetzt, die Wirtszellen sind selbst gegenüber Methotrexat empfindlich. Die meisten eukaryotischen Zellen, die MTX absorbieren können, scheinen gegenüber Methotrexat empfindlich zu sein. Eine solche nützliche Zellinie ist eine CHO-Linie, CHO-K1 (ATCC Nr. CCL 61). Äußerst zufriedenstellende Mengen an Polypeptid werden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Zellkulturen erzeugt; durch Co-Transfektion mit einem getrennten, für eine sekundäre Kodierungssequenz kodierenden Vektor sind jedoch Verfeinerungen möglich. Eine sekundäre Kodierungssequenz umfaßt Dihydrofolatreductase (DHFR), die durch einen von außen gesteuerten Parameter beeinfluß wird, z.B. Methotrexat (MTX), wodurch die Expressionssteuerung durch Steuerung der Methotrexat-Konzentration ermöglicht wird.

b. Typische geeignete Methodologie

Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die die erwünschten Kodierungs- und Steuersequenzen enthalten, sieht die Anwendung herkömmlicher rekombinanter Verfahren vor. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und erneut ligiert, um das erwünschte Plasmid zu bilden.
Wenn stumpfe Enden erforderlich sind, kann das gespaltene DNA-Präparat 30 min lang bei 37ºC mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) oder T4-DNA-Polymerase behandelt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt werden. 3'- abstehende Enden werden durch die 3'- und 5'-exonukleolytische Aktivität beider Enzyme entfernt und die 5'-abstehenden Enden durch die 5'- bis 3'-Polymerase-Aktivität abgestumpft, die komplementäres nt einbaut, bis das Ende des Fragments erreicht ist.
Die Größentrennung der gespaltenen Fragmente kann unter Verwendung von 6%-igem Polyacrylamidgel erfolgen, wie dies durch Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) beschrieben ist.
Für die Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden typischerweise mit Hilfe der Ligationsgemische der E.coli K12- Stamm 294 (ATCC 31.446) oder andere geeignete E.coli-Stämme transformiert und erfolgreiche Transformanten durch Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz ausgewählt, wo dies zweckmäßig ist. Plasmide aus den Transformanten werden durch Restriktions- Kartierung und/oder DNA-Sequenzieren nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Meth. Enzym., 65: 499 (1980) hergestellt und analysiert.
Nach der Einführung der DNA in den Säugetier-Zellenwirt und der Auswahl im Medium hinsichtlich stabiler Transfektanden, erfolgt die Amplifiziuerng der für das DHFR-Protein kodierenden Sequenzen durch Züchten von Wirtszellkulturen in der Gegenwart von etwa 200-500 nM-Konzentrationen von Methotrexat, einem kompetitiven Inhibitor der DHFR-Aktivität. Der wirkungsvolle Konzentrationsbereich hängt stark von der Beschaffenheit des DHFR-Gens und den Eigenschaften des Wirts ab. Allgemein definierte Ober- und Untergrenzen können klarerweise nicht festgelegt werden. Geeignete Konzentrationen anderer Folsäure-Analoge oder anderer DHFR-hemmender Verbindungen können auch verwendet werden. MTX selbst ist jedoch geeignet, problemlos erhältlich und wirkungsvoll.
Andere zweckmäßige Verfahren sind in Abschnitt vor den Beispielen beschrieben.

4. Anwendungsmöglichkeiten und Formulierung

Die hier betroffenen LAP-Moleküle weisen eine Reihe an therapeutischen Verwendungszwecken auf, die mit der Antagonisierung oder Neutralisierung der TGF-β- Aktivität in Zusammenhang stehen. Solche Verwendungszwecke sind die Behandlung fibrotischer Erkrankungen und von Patienten, deren Immunsystem unterdrückt ist, was daraus ersichtlich ist, daß sie sekundäre Infektionen durch Ansteckung erwerben und über längere Zeiträume aufrechterhalten können. Von besonderem Interesse sind Patienten, die an wiederkehrenden oder chronischen viralen, bakteriellen, mykologischen oder parasitären Infektionen leiden. Andere physiologische Zustände, die aufgrund der Fähigkeit des LAP, sich reversibel an reifen TGF-β zu binden, verbessert werden können, sind ebenfalls hierin umfaßt.
Weiters kann LAP als Mittel zur Vermeidung von Nebenwirkungen anderer Immunregulatoren verwendet werden (z.B. rekombinanter Cytokine), wenn sie je nach der jeweiligen klinischen Situation als Pharmazeutika oder in Kombination mit solchen Regulatoren eingesetzt werden.
Für die oben angeführten Indikationen wird das LAP-Molekül solcherart formuliert und dosiert, wie es der bewährten medizinischen Praxis entspricht, wobei die konkrete zu behandelnde Störung, der Zustand des Patienten, die Verabreichungsstelle des LAP, die Art der Verabreichung und andere den Praktikern bekannte Faktoren berücksichtigt werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist demnach die "therapeutisch wirkungsvolle Menge" des LAP eine Menge, die zur Vorbeugung, Linderung oder Heilung des behandelten Zustands die richtige ist, insbesondere jene Menge, die ausreicht, um der Aktivität eines TGF-β in vivo entgegenzuwirken.
Das LAP wird zur Lagerung oder Verabreichung vorbereitet, indem das LAP mit dem erwünschten Reinheitsgrad mit physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren vermischt wird. Solche Materialien sind bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen für die Empfänger nicht-toxisch. Wenn das LAP wasserlöslich ist, kann es in einem Puffer wie z.B. Phosphat oder einem anderen Salz einer organischen Säure vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 8 formuliert werden. Wenn eine LAP-Variante nur teilweise in Wasser löslich ist, kann sie als Mikroemulsion hergestellt werden, indem sie mit einem nicht-ionischen Tensid wie z.B. Tween, Pluronics oder PEG, z.B. Tween 80, in einer Menge von 0,04-0,05% (w/w) formuliert wird, um ihre Löslichkeit zu erhöhen.
Wahlweise können andere Ingredientien hinzugefügt werden, z.B. Antioxidantien, beispielsweise Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), z.B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunoglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlehydrate wie z.B. Zellulose oder ihre Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatisiermittel wie z.B. EDTA; und Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit.
Das zur therapeutischen Verabreichung verwendete LAP muß steril sein. Die Sterilität wird am leichtesten durch Flltrierung durch Sterilfiltriermembranen erzielt (z.B. 0,2 µm- Membranen). Das LAP wird üblicherweise in lyophilisierter Form oder als wäßrige Lösung gelagert, wenn es gegenüber thermaler oder oxidativer Denaturierung äußerst stabil ist. Der pH-Wert der LAP-Präparate liegt typischerweise bei etwa 6 bis 8, obwohl in einigen Fällen auch höhere pH-Werte geeignet sein können. Man beachte, daß die Verwendung bestimmter der obigen Exzipienten, Träger oder Stabilisatoren zur Bildung von Salzen des LAP führt.
Wenn das LAP parenteral zu verwenden ist, werden das LAP enthaltende therapeutische Zusammensetzungen im allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gefüllt, z.B. in eine Tasche oder ein Fläschchen für eine intravenöse Lösung mit einem durch eine subkutane Injektionsnadel durchstechbaren Stopfen.
Im allgemeinen sollte man, falls es die Störung zuläßt, das LAP zur verabreichungsstellenspezifischen Verabreichung formulieren und dosieren. Dies ist im Falle fibrotischer Erkrankungen und Tumoren zweckmäßig.
Formulierungen mit Langzeit-Freisetzung können auch gebildet werden - dies umfaßt die Bildung mikrokapsularer Teilchen und implantierbarer Gegenstände. Zur Bildung von LAP-Zusammensetzungen mit Langzeit-Freisetzung wird das LAP vorzugsweise in eine biologisch abbaubare Matrix oder eine Mikrokapsel eingebaut. Ein geeignetes Material für diesen Zweck ist ein Polylactid, obwohl andere Polymere von Poly-(α- hydroxykarbonsäuren) wie z.B. die Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP 133.988A) auch brauchbar sind. Andere biologisch abbaubare Polymere sind Poly(lactone), Poly(acetale), Poly(orthoester) und Poly(orthokarbonate). Die Grundüberlegung ist die, daß der Träger selbst (oder seine Abbauprodukte) im Zielgewebe nicht-toxisch ist und den Zustand nicht noch weiter verschlimmert. Dies kann durch Routine-Screenen in Tiermodellen mit der Zielstörung oder - falls keine derartigen Modelle vorhanden sind - in normalen Tieren ermittelt werden.
Beispiele der Zusammensetzungen mit Langzeit-Freisetzung finden sich in US-A- 3.773.919, EP 58-481A, US-A-3.887.699, EP 158.277A, in der kanadischen PS 1176565, U. Sidman et al., "Biopolymers" 22: 547 [1983] und R.Langer et al., "Chem. Tech." 12: 98 [1982].
Bei topischer Anwendung wird das LAP günstigerweise mit anderen Ingredientien wie z.B. Trägern und/oder Adjuvantien kombiniert. Hinsichtlich der Beschaffenheit dieser Ingredientien bestehen keine Einschränkungen, außer daß sie pharmazeutisch annehmar und für ihre beabsichtigte Verabreichung wirkungsvoll sind sowie die Aktivität der Wirkstoffe der Zusammensetzung nicht verschlechtern können. Beispiele solcher geeigneter Vehikel sind Salben, Cremen, Gele oder Suspensionen mit oder ohne gereinigtem Kollagen. Die Zusammensetzungen können auch in transdermale Flecken, Pflaster und Bandagen - vorzugsweise in flüssiger oder halbflüssiger Form imprägniert werden.
Zur Bildung einer Gelformulierung kann das in einer flüssigen Zusammensetzung formulierte LAP mit einer wirkungsvollen Menge eines wasserlöslichen Polysaccharids oder synthetischen Polymers wie z.B. Polyethylenglykol vermischt werden, um ein Gel der richtigen Viskosität zur topischen Anwendung zu bilden. Das Polysaccharid, das verwendet werden kann, umfaßt beispielsweise Zellulosederivate wie z.B. verätherte Zellulosederivate, einschließlich Alkylzellulosen, Hydroxyalkylzellulosen und Alkylhydroxyalkylzellulosen, beispielsweise Methylzellulose, Hydroxyethylzellulose, Carboxymethylzellulose, Hydroxypropymethylzellulose und Hydroxypropylzellulose; Stärke und fraktionierte Stärke; Agar; Alginsäure und Alginate; Gummiarabikum; Pullullan; Agarose; Karrageenan; Dextrane; Dextrine; Fuctane; Inulin; Mannane; Xylane; Arabinane; Chitosane; Glykogene; Glucane; und synthetische Biopolymere; sowie Gummi wie z.B. Xanthan-Gummi, Guar-Gummi; Johannisbrot-Gummi; Gummiarabikum; Tragant-Gummi; Karaya-Gummi; und Derivate und Gemische davon. Das bevorzugte Gelbildungsmittel ist hierin eines, das biologischen Systemen gegenüber inert, nicht-toxisch, einfach herzustellen oder nicht zu flüssig oder viskos ist sowie das darin gehaltene LAP nicht destabilisiert.
Vorzugsweise ist das Polysaccharid ein veräthertes Zellulose-Derivat, noch bevorzugter eines, das gut definiert, gereinigt und in USP angeführt ist, z.B. Methylzellulose und die Hydroxyalkylzellulose-Derivate wie z.B. Hydroxypropylzellulose, Hydroxyethylzellulose und Hydroxypropylmethyzellulose. Am bevorzugtesten ist hierin Methylzellose.
Das zur Gelbidung geeignete Polyethylenglykol ist typischerweise ein Gemisch aus Polyethylenglykolen mit niederem und hohem Molekulargewicht, um die richtige Viskosität zu erzielen. Beispielsweise wäre ein Gemisch aus einem Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 400-600 mit einem anderen mit einem Molekulargewicht von 1500 für diesen Zweck geeignet, wenn das Gemisch im richtigen Verhältnis vorliegt, um eine Paste zu erhalten.
Der Ausdruck "wasserlöslich" in bezug auf Polysaccharide und Polyethylenglykole umfaßt kolloidale Lösungen und Dispersionen. Im allgemeinen wird die Löslichkeit der Zellulose-Derivate durch den Substitutionsgrad der Ethergruppen bestimmt, und die hierin geeigneten stabilisierenden Derivate sollten eine ausreichende Menge solcher Ethergruppen pro Anhydroglucose-Einheit in der Zellulose-Kette aufweisen, um die Derivate wasserlöslich zu machen. Ein Grad der Ethersubstitution von zumindest 0,35 Ethergruppen pro Anhydroglucose-Einheit ist im allgemeinen ausreichend. Zusätzlich können die Zellulose-Derivate in Form von Alkalimetallsalzen vorliegen, z.B. in Form der Li-, Na-, K- oder Cs-Salze.
Bei Verwendung von Methylzellulose im Gel umfaßt sie vorzugsweise etwa 2-5%, noch bevorzugter etwa 3%, des Ges, und das LAP ist in einer Menge von etwa 300-1000 µg pro ml Gel vorhanden.
Die zu verwendende Dosierung von LAP hängt von den oben angeführten Faktoren, insbesondere von der Art der behandelten Krankheit, ab. Allgemein läßt sich sagen, daß eine Dosis von etwa 0,015 bis 15 mg/kg LAP an den Patienten verabreicht werden kann, durch eine oder mehrere Einzelgaben, kontinuierliche Infusion oder Bolus- Injektion. Beispielsweise wird eine anfängliche Dosis des LAP an den Patienten durch Injektion oder Infusion verabreicht. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder mehr wird die Behandlung je nach Zustand wiederholt, bis eine erwünschte Unterdrückung der Krankheitssymptome eintritt. Andere Dosierungen sind ebenfalls möglich.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Wirkungsgrad des LAP verbessert werden, indem man ihn mehrmals aufeinanderfolgend oder in Kombination mit einem weiteren für diesen Zweck geeigneten Mittel verabreicht; Beispiele dafür sind ein oder mehrere Anti-TGF-β-Antikörper, ein Regulator der Immunfunktion (oben beschrieben), ein oder mehrere herkömmliche Therapeutika wie z.b. Alkylierungsmittel, Folsäure-Antagonisten, Anti-Metabol iten des Nukleinsäure-Stoffwechsels, Spindelgifte, Antibiotika, Pyrimidinanaloge, 5-FU, Purinnukleoside, Amine, Aminosäuren, Triazolnukleoside, Corticosteroide, Kalzium, Retinoide, Lipoxygenase- und Cyclooxygenase-Inhibitoren, Fumarinsäure und ihre Salze, Analgetika, Psychopharmaka, Lokalanästhetika, Spasmolytika und Betablocker. Siehe z.B. Foley, N. Eng. J. Med., 313: 84-95 (1985), Nicholson, Lancet, ii, 503-506, 562-564, 617-621, 677-682 und 736-739 (1984) sowie DeClerq, Biochem. J., 205: 1-13 (1982). Solche anderen Mittel können in der verabreichten Zusammensetzung vorhanden sein oder getrennt verabreicht werden.
Alternativ dazu wird das LAP-Molekül günstigerweise mehrmals aufeinanderfolgend oder in Kombination mit radiologischen Behandlungen - Bestrahlung oder Einführung radioaktiver Substanzen - verabreicht, wie sie z.B. in UICC (Hg.) in Klinische Onkologie, Springer-Verlag (1982) angeführt sind.
In einer weiteren Ausführungsform wird das LAP in Kombination mit einem reifen TGF- β verwendet (heterogen oder homogen mit dem LAP). Beispielsweise kann ein LAP aus TGF-β1 mit reifem TGF-β1, TGF-β2 oder TGF-β3 verwendet werden. Die relativen Mengen des reifen TGF-β zu LAP sind im allgemeinen etwa äquimolekular.
Der reife TGF-β wird gleichzeitig mit dem LAP verabreicht, entweder in der gleichen Formulierung oder in getrennten Verabreichungen an der gleichen Stelle, z.B. einer Vene. Vorzugsweise werden der TGF-β und das LAP vor der Verabreichung miteinander vermischt. Wenn der Komplex instabil ist, werden die Ingredientien knapp vor der Verabreichung in etwa äquimolekularen Mengen miteinander vermischt. Wenn der Komplex stabil ist, werden der TGF-β und das LAP miteinander vermischt, der inaktive Komplex aus dem Reaktionsgemisch weggereinigt und das gereinigte Material verabreicht. Vorzugsweise ist die Verabreichung systemisch, da der Vorteil in der Verringerung der Nebenwirkungen in Zusammenhang mit bestimmten Dosen von systemisch verabreichtem TGF-β liegt.
Die Kombination von reifem TGF-β mit LAP kann sich jeder Prozeß zunutze machen, der durch die Sammlung an latentem TGF-β verstärkt wird; dazu gehört die Weich- und Hartgewebebildung wie z.B. Wundheilung und Knochenbildung sowie die Immununterdrückung. Die Therapie betrifft chirurgische sowie nicht-chirurgische Eingriffe; die Kombination kann an den Patienten z.B. einen Tag vor der Operation verabreicht werden, sodaß die Gewebsfestigkeit an der Wundenstelle erhöht wird; sie kann auch an einen Patienten mit einem einfachen Knochenbruch verabreicht werden, um die Knochenheilungsrate zu beschleunigen.
Schließlich wird das LAP günstigerweise in einem diagnostischen Assay verwendet, um den aktiven TGF-β im Serum eines Patienten einzufangen, der an einer Störung leidet, einschließlich einer Krankheit, die durch das Nachweisen von reifem TGF-β in Serum diagnostiziert werden kann. Dieses Verfahren ist besonders geeignet für den sensitiven Nachweis winziger Mengen an reifem TGF-β im Serum. Das Verfahren umfaßt die in vitro oder in vivo erfolgende Zugabe von LAP zum Serum, das durch jede geeignete und nachweisbare Gruppe wie z.B. ³²P oder alkalische Phosphatase markiert wurde, sowie das Testen auf die Gegenwart markierter Komplexe von LAP und reifem TGF-β im Serum.
Zur Vereinfachung der Beispiele und Patentansprüche werden einige häufig wiederkehrenden Verfahren mit Kurzbezeichnungen benannt.
"Transfektion" bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, ob Kodierungssequenzen exprimiert werden oder nicht. Zahlreiche Transfektionsverfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, beispielsweise CaPO&sub4; und Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion erkennt man im allgemeinen, wenn irgendein Anzeichen der Wirkungsweise dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
"Transformation" bedeutet die Einführung von DNA in einen Organismus, sodaß die DNA entweder als extrachromosomales Element oder als chromosomaler Integrant replizierbar ist. Je nach verwendeter Wirtszelle erfolgt die Transformation mittels für diese Zellen geeigneter Standardverfahren. Die Kalziumbehandlung mit Hilfe von Kalziumchlorid, wie sie durch Cohen, S.N. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972); Mandel et al., J. Mol. Biol. 53: 154 (1970) und später Liljestrom et al., Gene, 40: 241-246 (1985) beschrieben ist, wird im allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen angewendet, die beträchtliche Zellwandschranken enthalten. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände ist das Kalziumphosphat-Fällungsverfahren nach Graham, F. und van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1978) vorzuziehen. Allgemeine Aspekte der Säugetierzellen-Wirtssystem-Transformationen wurden durch Axel in US-A-4.399.216, veröffentlicht am 16. August 1983, beschrieben. Transformationen in Hefe erfolgen typischerweise gemäß dem Verfahren nach Van Solingen, P., et al., J. Bact., 130: 946 (1977) und Hsaoi, C.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76: 3829 (1979). Andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen wie z.B. durch Kerninjektion oder durch Protoplastenfusion sind auch zweckmäßig.
"Operabel verbunden" bezieht sich auf eine derartige Nebeneinanderreihung, daß die normale Funktion der Komponenten zum Tragen kommen kann. Somit bezieht sich eine Kodierungssequenz, die mit Steuersequenzen "operabel verbunden" ist, auf eine Konfiguration, worin die Kodierungssequenz unter der Steuerung dieser Sequenzen exprimiert werden kann und worin die verbundenen DNA-Sequenzen angrenzend sowie - im Falle eines sekretorischen Leaders - angrenzend und in Lesephase positioniert sind. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader operabel mit DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Verstärker ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz bewirkt; eine Ribosomen-Bindungsstelle ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie die Translation vereinfacht. Das Verbinden erfolgt mittels Ligation an geeigneten Restriktionsstellen. Wenn keine solchen Stellen bestehen, verwendet man synthetische Oligonukleotid- Adaptoren oder -Linker gemäß herkömmlicher Vorgangsweisen.
"Steuersequenzen" sind DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel verbundenen Kodierungssequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Steuersequenzen beispielsweise, die sich für Prokaryoten eignen, enthalten einen Promotor, wahlweise eine Operatorsequenz, eine Ribosomen-Bindungsstelle und möglicherweise andere, bislang noch nicht genau erforschte Sequenzen. Es ist bekannt, daß eukaryotische Zellen Promotoren, Polyadenylationssignale und Verstärker verwenden.
"Expressionssystem" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die eine erwünschte Kodierungssequenz in operabler Bindung enthalten, sodaß mit diesen Sequenzen transformierte Wirte die kodierten Proteine erzeugen können. Zur Durchführung der Transformation kann das Expressionssystem auf einem Vektor enthalten sein, die betreffende DNA kann dann aber auch in das Wirtschromosom integriert sein.
Die Ausdrücke "Zelle", "Zellinie" und "Zellkultur" werden hierin austauschbar verwendet, wobei alle diese Bezeichnungen die Nachkommenschaft umfassen. "Transformanten" oder "transformierte Zellen" enthalten den anfänglichen Transformanten und die daraus abgeleiteten Kulturen ohne Rücksicht auf die Anzahl an Übertragungen. Man beachte, daß die gesamte Nachkommenschaft aufgrund absichtlicher oder unabsichtlicher Mutationen möglicherweise nicht den gleichen DNA- Gehalt aufweist. Es ist Mutanten-Nachkommenschaft enthalten, die die gleiche Funktionalität aufweist, wie sie in der ursprünglich transformierten Zelle getestet wurde. Wenn besondere Konstruktionen gemeint sind, sorgt der Kontext für Aufklärung.
"Plasmide" werden durch ein kleines p bezeichnet, vor und/oder nach dem Großbuchstaben und/oder Zahlen stehen. Die hierin verwendeten Ausgangsplasmide sind im Handel erhältlich, uneingeschränkt öffentlich erhältlich oder können aus solchen verfügbaren Plasmiden gemäß veröffentlichter Verfahren konstruiert werden. Außerdem sind andere äquivalente Plasmide auf dem Gebiet und Fachleuten bekannt.
Die "PCR"-Technik bezieht sich hierin auffolgende Vorgangsweise: sehr kleine Mengen eines konkreten DNA-Stücks können mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden, wie dies in US-A-4.683.195, veröffentlicht am 28. Juli 1987, beschrieben ist. Im allgemeinen müssen Sequenzinformationen von den Enden des interessierenden Bereichs oder darüber hinaus verfügbar sein, sodaß die Oligonukleotid- Primer konstruiert werden können; diese Primer schauen zueinander und besitzen eine Sequenz, die den gegenüberliegenden Strängen der zu verstärkenden Schablone ähneln oder mit ihnen identisch sind. Die 5'-terminalen Nukeotide der beiden Primer fallen mit den Enden des verstärkten Materials zusammen. PCR dient auch der Amplifizierung spezifischer DNA-Sequenzen aus genomischer Gesamt-DNA, cDNA, die aus zellulärer Gesamt-RNA transkribiert ist, Bakteriophage oder Plasmidsequenzen usw. Allgemeine Informationen finden sich in H. Erlich, Hg., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989.
Die Technik der "PCR-Mutagenese" bezieht sich hierin auf die folgende Vorgangsweise (siehe Erlich, oben, das Kapitel von R. Higuchi, S.61-70): Bei Verwendung geringer Mengen an Schablonen-DNA als Ausgangsmaterial in einer PCR können Primer, die sich hinsichtlich ihrer Sequenz geringfügig vom korrespondierenden Bereich in einer Schablonen-DNA unterscheiden, dazu dienen, relativ große Mengen eines spezifischen DNA-Fragments zu erzeugen, das sich nur an jenen Positionen von der Schablonensequenz unterscheidet, an denen sich die Primer von der Schablone unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid-DNA ist einer der Primer konstruiert, die Position der Mutation zu überlappen und die Mutation zu enthalten; die Sequenz des anderen Primers muß mit einem Sequenzabschnitt auf dem gegenüberliegenden Strang des Plasmid identisch sein, doch diese Sequenz kann an einer beliebigen Stelle entlang der Plasmid-DNA positioniert sein. Es ist jedoch vorzuziehen, daß sich die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 nt von jener der ersten befindet, sodaß schließlich der gesamte amplifizierte Bereich der durch die Primer begrenzten DNA leicht sequenzierbar ist. Die PCR-Amplifizierung mittels eines Primerpaars wie z.B. des gerade beschriebenen führt zu einer Population von DNA- Fragmenten, die sich an der durch den Primer spezifizierten Position der Mutation und möglicherweise an anderen Positionen unterscheiden, da das Schablonenkopieren etwas fehleranfällig ist.
In der unten dargelegten Vorgangsweise ist das Verhältnis der Schablone zum Produktmaterial sehr gering, weshalb die überwiegende Mehrheit an Produkt-DNA- Fragmenten die erwünschte(n) Mutation(en) einschließen. Dieses Produktmaterial dient dazu, den korrespondierenden Bereich im Plasmid, das als PCR-Schablone verwendet wurde, mittels herkömmlicher DNA-Technologie zu ersetzen. Mutationen an getrennten Positionen können entweder durch Verwendung eines zweiten, mutanten Primers oder mittels Durchführung einer zweiten PCR mit unterschiedlichen mutanten Primern und gleichzeitigen Ligierens der beiden resultierenden PCR-Fragmente an das Vektorfragment in einer drei- oder mehrteiligen Ligation, gleichzeitig eingeführt werden.
Die in den Beispielen angewendete PCR-Mutagenese-Vorgangsweise war wie folgt: Schablonen-Plasmid-DNA (1 µg) wurde durch Digestion mit einer Restriktionsendonuklease linearisiert, die eine einzelne Erkennungsstelle in der Plasmid- DNA außerhalb des zu amplifizierenden Bereichs besitzt. Von diesem Material wurden 1-5 ng einem PCR-Gemisch zugegeben, das 16,6 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 67 mM Tris.HCl (pH 8,8), 6,7 mM MgCl&sub2;, 6,7 µM EDTA, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM von jeweils dATP, cCTP, cGTP und TTP, 170 µg/ml Rinder-Serumalbumin, 25 pMol jedes Oligonukleotid-Primers und 1 µl Thermus aquaticus- (Taq) DNA-Polymerase (5 Einheiten/µl, von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk,CT und Emeryville, CA) enthielt, in einem Endvolumen von 50 µl in einem 0,5-ml-Reaktionsfläschchen. Das Reaktionsgemisch wurde mit 35 µl Mineralöl überlagert und in einen DNA-Thermal Cycler (von Perkin-Elmer Cetus) gefüllt, der folgendermaßen programmiert war:
Zeitverzögerungs-Datei 12 min. 94ºC
Thermozyklus-Datei 1 min. 50ºC
2-3 min 68-72ºC
1 min. 94ºC
20 Zyklen
Zeitverzögerungs-Datei 4 min. 50ºC
Zeitverzögerungs-Datei 12 min. 68ºC
Tränk-Datei 4ºC
Jede oben angeführte Datei wurde mit der Datei auf der folgenden Zeile verbunden. Am Programmende wurde das Reaktionsfläschchen aus dem Thermozyklierer entfernt und die wäßrige Phase auf ein neues Fläschchen übertragen, mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (50:50:1 vol) extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und die DNA durch Standardverfahren gewonnen. Dieses Material wurde anschließend zur Einsetzung in einen Vektor den geeigneten Behandlungen unterzogen.
"Digestion" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an spezifischen nt-Sequenzen in der DNA wirkt. Solche Enzyme bezeichnet man als Restriktionsenzyme und die Sequenz, für die jedes spezifisch ist, als Restriktionsstelle. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich; die durch die Enzym-Lieferfirmen angegebenen Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Erfordernisse werden eingehalten. Restriktionsenzyme werden üblicherweise durch Abkürzungen gekennzeichnet, die aus einem Großbuchstaben und anderen Buchstaben, die den Mikroorganismus darstellen, aus dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich erhalten wurde, sowie aus einer das jeweilige Enzym bezeichnenden Zahl bestehen. Im allgemeinen werden etwa 1 µg des Plasmids oder DNA-Fragments mit etwa 1-2 Enzym-Einheiten in etwa 20 µl Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller angeführt. Die Inkubation erfolgt üblicherweise bei 37ºC über die Zeitspanne von einer Stunde, kann aber gemäß den Anleitungen der Lieferfirma variieren. Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die digerierte Nukleinsäure durch Ausfällung mit Ethanol aus der wäßrigen Fraktion gewonnen. Im Bedarfsfall schließt sich an die Digestion mit einem Restriktionsenzym eine bakterielle, alkalische, phosphatase-vermittelte Hydrolyse der terminalen 5'-Phosphate, an, um ein "Ringschließen" bzw. das Bilden einer geschlossenen Schleife der beiden Enden eines DNA-Fragments zu verhindern, da dies die Einfügung eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsstelle behindern würde. Soferne nicht anders angegeben, schließt sich an die Digestion von Plasmiden keine 5'- terminale Dephosphorylierung an. Die Verfahrensweisen und Reagentien zur Dephosphorylierung sind herkömmlich (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) S. 133-134).
"Gewinnung" oder "Isolierung" eines bestimmten DNA-Fragments aus einem Restriktionsdigest bezieht sich auf die Trennung des Digests auf Polyacrylamid- oder Agarose-Gel durch Elektrophorese, die Identifizierung des interessierenden Fragments durch Vergleich seiner Mobilität mit jener von Marker-DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, die Entfernung des das erwünschte Fragment enthaltenden Gelabschnitts und die Trennung des Geis von DNA. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt. Siehe beispielsweise R. Lawn, et al., Nucleic Acids Res., 9: 6103-6114 (1981) und D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).
"Ligation" bezieht sich auf ein Verfahren der Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäure-Fragmenten (T. Maniatis et al., 1982, oben, S. 146). Soferne nicht anders angegeben, kann die Ligation mittels bekannter Puffer und unter bekannten Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 µg etwa äquimolekularer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erfolgen.
"Präparation" von DNA aus Transformanten bedeutet die Isolierung von Plasmid-DNA aus Mikrobenkultur. Soferne nicht anders vorgesehen, bietet sich das alkalische/SDS- Verfahren nach Maniatis et al., 1982, oben, S.90, an.
"Oligonukleotide" sind einzel- oder doppelstrangige Polydesoxynukleotide kurzer Länge, die durch bekannte Verfahren chemisch synthetisiert werden (z.B. Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie, mittels Festphasen-Verfahren wie in EP-A 266.032, veröffentlicht am 4. Mai 1988, oder durch Desoxynukleosid-H- phosphonat-Zwischenprodukte, wie dies durch Froehler et al., Nucl. Acids. Res., 14: 5399-5407 [1986] beschrieben ist). Sie werden dann auf Polyacrylamid-Gelen gereinigt.
Die folgenden Beispiele sollen die beste derzeit bekannte Durchführungsart der Erfindung veranschaulichen, doch die Erfindung ist nicht darauf beschränkt.

BEISPIEL 1

Klonierung und Expression von für LAP kodierender DNA

1. Konstruktion von t-PA-Expressionsvektoren

Verschiedene t-PA-Vektoren wurden aus dem Stammvektor pSVI-tPA durch Änderung der Merkmale der Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor-Einheit gewonnen.

a. pSVI-tPA

Abschnitte der zwei bereits geoffenbarten Säugetier-Expressionsvektoren, pRK-tPA und pE348DHFRUC, wurden zur Bildung von pSVI-tPA kombiniert.
Säugetier-Expressionsvektor pRK-tPA wurde aus pRK5 (beschrieben in EP 307.247, oben, wobei das pCIS2.8c28D-Ausgangsplasmid in EP 278.776, veröffentlicht am 17. August 1988, beschrieben ist), und aus t-PA-cDNA (Pennica et al., Nature, 301: 214 [1983]) gewonnen. Die cDNA wurde zur Einfügung in pRK5 durch Spalten mit Restriktionsendonuklease-HindIII (spaltet 49 Basenpaare 5' vom ATG-Startcodon) und Restriktionsendonuklease-Ball (spaltet 276 Basenpaare stromabwärts vom TGA- Stopcodon) gebildet. Diese cDNA wurde mittels herkömmlicher Ligationsverfahren (Maniatis et al., 1982, oben) in pRK5 ligiert, der zuvor mit HindIII und Smal gespalten wurde. Dieses Konstrukt wurde als pRK-tPA bezeichnet und ist in Fig.2 dargestellt.
pRK-tPA treibt die effiziente Synthese von t-PA bei der vorübergehenden Transfektion in menschliche 293-Fibroblasten an. Der Vektor enthält den unmittelbar frühen Gen- Verstärker und -Promotor des Cytomegalovirus, die CMV-IE-Spleißdonor-Stelle und einen Abschnitt des assoziierten Introns, den Bakteriophage-SP6-Promotor, einen Abschnitt eines IgVH-Introns und den assoziierten Spleißakzeptor, die für t-PA kodierende cDNA, den SV40-frühen Polyadenylierungs- ("polyA") Bereich und den SV40-Replikationsursprung ("ori") in Plasmid pUC118.
Der Vektor pE348DHFRUC (Vannice und Levinson, J. Virology, 62: 1305-1313 (1988), worin er als pE bezeichnet wird, Fig.1) enthält den SV40-Verstärker und frühen Promotor-Bereich stromaufwärts von der HindIII-Stelle (Position 5171 im Virus) vor der cDNA, die für Mäuse-Dihydrofolatreductase (DHFR) kodiert; daran schließt sich das Hepatitis B-Virus- (HBV)-polyA-Signal von 684 bp in Plasmid pML1 aus den BamHI- bis zu den BglII-Stellen von HBV. Dieses Plasmid enthält einen Polylinker unmittelbar stromaufwärts von den SV40-Sequenzen.
Abschnitte der Vektoren pRK-tPA und pE348DHFRUC wurden wie folgt isoliert (Fig.2):
1. Vektor pRK-tPA wurde mit Restriktionsenzym SacII digeriert und anschließend mit dem großen ("Klenow") Fragment von E.coli-DNA-Polymerase I ("pol I") behandelt, um die 3'-vorstehenden Enden zu entfernen, die durch SacII-Spaltung entstanden. Daran schloß sich die Digestion mit dem Restriktionsenzym Spel. Das größere Fragment, das einen Abschnitt der CMV-transkribierten Sequenzen, die Spleißdonor-Intron- Spleißakzeptor-Einheit ("Intron" in Fig.2), die t-PA-cDNA, die SV40-polyA- und ori- Bereiche und pUC118 einschließlich einiger weniger Nukleotide vom 5'-Ende von CMV enthielt, wurde nach der Elektrophorese-Trennung der Fragmente aus einem Polyacrylamid-Gel isoliert ("gelsoiert").
2. Vektor pE348DHFRUC wurde mit dem Enzym ClaI digeriert, und die resultierenden 5'-vorstehenden Enden wurden unter Verwendung von Klenow-po1I in der Gegenwart aller vier Desoxyribonukleotide (dNTP: dATP, dGTP, dCTP, TTP) aufgefüllt. Nach der anschließenden Digestion mit XbaI wurden die SV40-Transkriptionsregulations- Sequenzen (Verstärker und früher Promotor, einschließlich der SV40-frühen Stellen der Transkriptionsinitiation), die auf dem kleineren XbaI-ClaI-Fragment (360 nt) vorhanden waren, gelisoliert.
Die isolierten pRK-tPA- und pE348DHFRUC-Fragmente wurden ligiert, um Vektor pSVI- tPA zu erzeugen.

b. pSVI2-tPA

Der Vektor pSVI2-tPA wurde wie in Fig.3 hergestellt, worin die Spleißdonor-Stelle von Vektor pSVI-tPA durch Ligation von drei Fragmenten mutiert wurde, die gemäß der unten angeführten Vorgangsweise hergestellt wurden. Nukleotide -3(G) und -1(C) relativ zur 5'-Exon/Intron-Grenze von pSVI-tPA wurden auf C bzw. G geändert, um die Spleißdonor-Sequenz an die Konsenssequenz CAG/GUAAGU anzugleichen. Dies geschah wie folgt:
1. Vektor pSVI-tPA wurde mit HindIII und BgIII gespalten, um ein kleines Fragment zu erzeugen, das vor allem die Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor-Einheit zwischen den zwei HindIII-Stellen an Positionen 381 und 618, ein weiteres kleines Fragment mit einem 5'-Abschnitt der t-PA-cDNA zwischen den HindIII- und BglII-Stellen an Positionen 618 und 770 und ein großes Fragment mit dem Rest der pSVI-tPA-DNA enthält. Nach der Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase ("BAP") wurden die drei Fragmente durch Gel-Elektrophorese getrennt und das größte gewonnen.
2. Vektor pSVI-tPA wurde getrennt mit Rsal und BgIII digeriert und das 327-nt-Fragment, das sich von der Rsal-Stelle an Position 443 bis zur BgIII-Stelle an Position 770 erstreckt, gelisoliert. Dieses Fragment enthält den 3'-Abschnitt des Introns, den Spleißakzeptor und einen 5'-Abschnitt der t-PA-cDNA.
3. Zwei Oligonukleotide ("Primer" in Figuren 3-7) wurden synthetisiert. Der erste (SVI379) entprach Nukleotiden 379 bis 400 (oberer Strang) von pSVI-tPA, mit Ausnahme einer Änderung von G auf C an Position 390, die eingefügt wurde, um die durch Restriktionsendonuklease EagI erkdnnte Sequenz zu erzeugen (CGGCCG), und überlappte eine HindIII-Stelle. Die Sequenz sah folgendermaßen aus (Position der Änderung ist unterstrichen):
Das zweite Oligonukleotid (SVI448) wies die gleiche Sequenz auf wie der untere Strang von pSVI-tPA zwischen Positionen 448 und 427, mit Ausnahme einer Änderung von G auf C am 11. nt und einer Änderung von C auf G an nt-13. Es enthielt eine RsaI-Stelle knapp 5' von den beiden Einzelnukleotid-Änderungen. Die Sequenz dieses Oligonukleotids war wie folgt (die Unterschiede zum zur korrespondierenden pSVI-tPA- Sequenz sind unterstrichen):
Die zwei Oligonukleotide dienten dazu, den Bereich von pSVI-tPA zwischen Positionen 379 und 448 durch PCR zu amplifizieren, wobei dieser Bereich den Spleißdonor umfaßt. Die PCR-Produkte wurden mit HindIII- und RsaI digeriert und das 62-nt- Fragment gelisoliert.
Die drei isolierten Fragmente wurden ligiert und in E.coli MM294 eingeführt. Plasmid- DNA wurde aus verschiedenen Ampicillin-resistenten Kolonien isoliert und die Nukleotidsequenz eines Isolats (pSVI2-tPA), das die drei Fragmente in der erwünschten Reihenfolge ligiert enthielt, wurde bestimmt, um die Gegenwart der Nukleotid- Änderungen, die durch die zwei Primer ausgedrückt wurden und die Integrität des aus dem amplifizierten Fragment abgeleiteten Bereichs zu verifizieren.

c. pSVI3-tPA

Der Vektor pSVI3-tPa wurde wie in Fig.4 hergestellt. Zwei angrenzende Bereiche von pSVI2-tPA wurden mittels PCR unter Verwendung jeweils eines Oligonukleotids, das mit der pSVI2-tPA-Sequenz identisch war, und eines Mutanten-Oligonukleotids, das die erwünschten Änderungen aufwies, amplifiziert. Diese Fragmente dienten dazu, die korrespondierenden Bereiche in pSVI2-tPA zu ersetzen. Die Fragmente wurden wie folgt isoliert:
1. Vektor pSVI2-tPa wurde mit HindIII digeriert, das Digest mit BAP behandelt, und die beidenhindIII-Fragmente wurden durch Gel-Elektrophorese getrennt. Das größere Fragment wurde aus dem Gel gewonnen und enthielt alle pSVI2-tPA-Sequenzen mit Ausnahme des 237-nt-HindIII-Fragments, das die Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor- Einheit umfaßt.
2. Ein neues Oligonukleotid (SVI52Bam) wurde zur PCR-Mutagenese des ATG- Trinukleotids innerhalb des pSVI2-tPA-Introns synthetisiert. Es wies die gleiche Sequenz auf wie der untere Strang von pSVI2-tPA von nt 525 bis nt 497, mit der Ausnahme einer Änderung von T auf A an Position 516, einer Änderung von A auf C an Position 519 und einer Änderung von T auf G an Position 523. Die erste Änderung sollte das ATG- Trinukleotid auf TTG ändern; die zweite und dritte Änderung sollten die Erkennungssequenz für das Enzym BamHI bilden (GGATCC). Die Nukleotidsequenz von SVI52Bam war wie folgt (die Unterschiede zur pSVI2-tPA-Sequenz sind unterstrichen):
Oligonukleotide SVI379 (siehe oben) und SVI525Bam wurden dazu verwendet, den Bereich zwischen Positionen 379 und 525 von pSVI2-tPA durch PCR-Mutagenese zu amplifizieren, während die durch SVI525Bam spezifizierten Änderungen eingebaut werden. Die Reaktionsprodukte wurden mit HindIII und BamHI digeriert und das resultierende 137-nt-Fragment gelisoliert.
3. Das Oligonukleotid SVI539Bam wurde zur PCR-Mutagenese des pSVI2-tPA- Verzweigungspunkt-Bereichs synthetisiert. Es entsprach der PsvI2-tPA-Sequenz (oberer Strang) von Position 539 bis Position 573, wies jedoch die folgenden Änderungen auf: ein G anstelle eines T an 541; ein T anstelle eines C an 544; ein C anstelle eines A an 545; ein C anstelle eines A an 553; und ein G anstelle eines A an 555. Die ersten drei Änderungen bildeten eine BamHI-Erkennungsstelle, während die letzten zwei ein Signal erzeugen sollten, das dem BPS-Konsens ähnelt. Die nt-Sequenz von SVI539Bam war wie folgt (Änderungen gegenüber der pSVI2-tPA-Sequenz unterstrichen):
Oligonukleotid SVI625 wurde synthetisiert und entsprach dem unteren Strang der pSVI2-tPA-Sequenz von Position 625 bis Position 603, mit Ausnahme einer Änderung von A auf C an Position 617, die eine BstBI-Restriktionsstelle schaffen sollte (TTCGAA). Die Sequenz von SVI625 war (Änderung unterstrichen):
Oligonukleotide SVI539Bam und SVI625 wurden verwendet, um den Bereich von pSVI2-tPA zwischen Nukeotiden 539 und 625 durch PCR zu amplifizieren und gleichzeitig die erwünschten Änderungen einzufügen. Die PCR-Produkte wurden mit HindIII und BamHI digeriert und das 77-nt-Fragment gelgereinigt.
Die drei Fragmente (Fig.4) wurden ligiert und als solche in E.coli MM294 eingefügt. Plasmid-DNA wurde aus einer Anzahl an Ampicillin-resistenten Kolonien isoliert und durch Digestion mit geeigneten Restriktionsenzymen und Gel-Elektrophorese hinsichtlich der Gegenwart aller dreier Fragmente in jeweils einer Kopie analysiert. Die relative Ausrichtung der Fragmente wurde auch durch diese Analyse bestimmt. Die Nukleotidsequenz eines rekombinanten Plasmids (pSVI3-tPA), das die drei konstituierenden Fragmente in der gleichen Reihenfolge angeordnet enthielt wie in pSVI2-tPA, wurde im Bereich bestimmt, der die drei Rekombinationsstellen (die zwei HindIII-Stellen und die BamHI-Stelle) einschließlich aller Sequenzen zwischen diesen Stellen überspannt.

d. pSVI5-tPA

Vektor pSVI5-tPA wurde aus pSVI3-tPA konstruiert, indem ein Abschnitt des Introns und des Spleißakzeptors durch ein durch PCR erzeugten Mutantenfragment ersetzt wurde (siehe Fig.5). Nukleotid -16 (G) relativ zur 3'-Spleißverbindungstelle von pSVI3-tPA wurde zu Nukleotid T modifiziert, um einen durchgehenden, 16 nt langen Polypyrimidin-Abschnitt als Teil des Spleißakzeptors zu schaffen. Der Vektor wurde auch modifiziert, um einen potentiellen Zweigakzeptor nt an Position -23 relativ zur 3'- Spleißverbindungsstelle zu schaffen (eingebettet in die Sequenz GACTT TT), die zur Spleißdonor-Sequenz (G/GTAAGT) in diesem Vektor komplementär ist. Dieser BPS wird durch einen weiteren BPS (TACTG C) überlappt, der dem "breiten" BPS-Konsens entspricht und zur U2-snRNA-Sequenz komplementär ist. Der Zweigakzeptor nt in diesem BPS befindet sich an Position -27 relativ zur 3'-Spleißverbindungsstelle. Schließlich wird der Vektor durch die Einfügung eines dritten BPS knapp stromaufwärts von den zwei BPS in pSVI3-tPA modifiziert. Dieser dritte BPS entspricht dem konservierten Hefe-BPS (UACUA C) und entspricht dem "breiten" Säugetier-BPS- Konsens (PyNCUPu C). Der Zweigakzeptor in diesem BPS befindet sich an Position-34 relativ zur 3'-Spleißverbindungsstelle.
Die Fragmente zur Erzeugung von pSVIS-tPA wurden wie folgt hergestellt:
1. Vektor pSVI3-tPA wurde mit BamHI digeriert, und die resultierenden 5'-vorstehenden Enden in Gegenwart aller vier dNTPs mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt. Das Material wurde anschließend mit BstBI digeriert, mit BAP behandelt und das größere Fragment, das alles bis auf einen Teil der Intron- und Spleißakzeptor-Sequenz von pSVI3-tPA enthält, gelisoliert.
2. Zwei neue Oligonukleotide wurden zur Verwendung in aufeinanderfolgenden PCR- Amplifizierungen ohne Zwischenprodukt-Isolierung synthetisiert. Dieser Ansatz zur Einführung einer Vielzahl an Mutationen wurde ausgewählt, um die Verwendung eines einzelnen langen Oligonukleotids mit zahlreichen Fehlübereinstimmungen mit dem Ziel zu verhindern; wobei längere synthetische Oligonukleotide oft einen größeren Molekülanteil mit inkorrekter Sequenz enthalten. Zusätzlich dazu könnte das erste Oligonukleotid alleine in der Zukunft zur Bildung eines Vektors herangezogen werden, der sich hinsichtlich der Verzweigungspunkt- und Spleißakzeptor-Bereiche von pSVI3- tPA unterscheidet.
Das erste Oligonukleotid, SVI4, hatte seine 3-terminalen 13 Nukleotide mit pSVI3-tPA (Positionen 545-557) gemeinsam. Davor befanden sich 22 Nukleotide ähnlicher, doch nicht identischer Sequenz im Vergleich zur pSVI3-tPA-Sequenz zwischen Positionen 523 und 544. Die Unterschiede waren wie folgt (unterstrichen): eine Änderung von G auf T an Position 528; eine Änderung von A auf T an 535; eine Änderung von C auf A an 537; eine Änderung von C auf T an 538; eine Änderung von A auf T an 539; und eine Änderung von C auf T an Position 544. Die letzte Änderung würde eine Erweiterung des Polypyrimidin-Abschnitts des Spleißakzeptors bewirken; die erste würde die pSVI3-tPA-Sequenz GACTGAC ändern, um der BPS-Konsenssequenz zu entsprechen, die U2 entspricht. Die verbleibenden vier Einzelnukleotid-Änderungen sollten eine zum Spleißdonor komplementäre Sequenz schaffen. Die Sequenz von SV14 war wie folgt:
Das zweite Oligonukleotid (SVI5) überlappte den Mittelabschnitt SVI4. Es unterschied sich in den fünf 5'-terminalen nt von SVI4 und erstreckt sich in 5'-Richtung, um den Hefe-BPS einzuschließen (TACTAAC). Die Sequenz war wie folgt (die Unterschiede zur korrespondierenden pSVI3-tPA-Sequenz sind unterstrichen):
Der BPS/Spleißakzeptor-Bereich von pSVI3-tPA wurde amplifiziert und durch PCR- Mutagenese unter Verwendung des Oligonukleotid-Paars SVI4/SVI625 mutiert. Die PCR-Produkte wurden verdünnt und erneut mit dem Oligonukleotid-Paar SVI5/SVI625 amplifiziert. Die Produkte wurden mit T4-DNA-Polymerase und T4-Polynukleotidkinase behandelt und mit Restriktionsenzym BstBI gespalten und das 71-nt-Fragment gelisoliert.
Die zwei isolierten Fragmente (Fig.5) wurden ligiert und Plasmid-DNA aus transformierten (Ampicillin-resistenten) Bakterienkolonien gewonnen und wie oben bei pSVI3-tPA analysiert. Ein Isolat, das die erwünschten Intron-Änderungen enthielt, wurde als pSVI5-tPA bezeichnet.
Die Sequenzbestimmung identifizierte eine zusätzliche unerwartete Änderung außerhalb der Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor-Einheit. Zwei zusätzliche Nukleotide (GC) waren in pSVI5-tPA innerhalb der BstbI-Stelle von pSVI3-tPA vorhanden (TTCGAA änderte sich auf TTCGCGAA), welche Stelle daher in pSVI5-tPA fehlte. Zwei zusätzliche Nukleotide bildeten jedoch eine Erkennungsstelle für das Enzym NruI, die die einzige im Vektor ist. Die zusätzlichen Nukleotide resultierten wahrscheinlich aus einem unerwarteten Auffüllen der BstbI-vorstehenden Enden der beiden zur Ligation verwendeten konstituierenden Fragmente.

e. pSVI6B-tPA

pSVI6B-tPA wurde in ähnlicher Weise wie oben pSVI5-tPA gebildet, wobei man zwei aufeinanderfolgende Amplifizierungen mit teilweise überlappenden Mutanten- Oligonukleotiden vornahm, um die erwünschten Änderungen im Intron-Spleißakzeptor- Bereich von pSVI3-tPA hervorzurufen (siehe Fig.6).
Das erste Oligonukleotid (SVI6A) besaß die folgende Sequenz (Unterschiede zu pSVI3- tPA, Positionen 523-550, sind unterstrichen):
und das erste (SVI6B; vergleiche mit Positionen 523-545 von pSVI3-tPA):
Nukleotid-Ersetzungen in SVI6A waren: T auf C an 524, T auf G an 526, G auf C an 528 und G auf T an 544. Die durch SVI6B spezifizierten Änderungen waren: die Einfügung eines C zwischen Nukleotiden 525 und 526 von pSVI3-tPA, die Einfügung eines G zwischen Nukleotiden 526 und 527 die Ersetzung des G an Position 528 durch ein C und eine Änderung von G auf T an Position 544. Diese Änderungen sollten den pSVI3- tPA-BPS optimieren und einen zweiten BPS einführen, der ihn an der 5'-Seite flankiert; diese zwei Verzweigungspunkt-Sequenzen überlappen einander im mittleren C und sind in der SVI6B-Sequenzen kursiv dargestellt.
Aufeinanderfolgende Amplifizierungen mit Oligonukleotiden SVI6A und SVI6B in Gegenwart von SVI625 wurden durchgeführt, um die pSVI3-tPA-Intron-Spleißakzeptor- Einheit wie bei pSVI5-tPA zu modifizieren. Die enzymatische Behandlung der PCR- Produkte, die Gel-Isolierung und die Ligation an das große pSVI1-tPA-BamHI-BstBI- Fragment wurden auch für pSVI5-tPA beschrieben. Die Nukleotidsequenz-Analyse von Plasmid-DNA aus einer Ampicillin-resistenten Bakterienkolonie (dieses Plasmidisolat wurde als pSVI6B-tPA bezeichnet) zeigte mehrere unerwartete Änderungen zusätzlich zu den durch das SVI6B-Oligonukleotid spezifizierten Modifikationen; Position 545 war ein T und nicht das C von pSVI3-tPA; Position 550 war auch ein T und kein C; das zusätzliche Dinukleotid, das die Nrul-Restriktionsstelle in pSVI5-tPA bildete, war auch in der pSVI6B-tPA-Sequenz vorhanden. Die ersten zwei Änderungen würden, so konnte man erwarten, die t-PA-Expression nicht negativ beeinflussen und wurden nicht korrigiert.

2. Konstruktion von vielfach verwendbaren Stammvektoren pSVI6B5 und pSVI6B7

Ein vielseitig verwendbarer Stammvektor zur Expression verschiedener Polypeptide wurde aus pSVI6B-tPA abgeleitet (siehe Fig.7). Dieser als pSVI6B5 bezeichnete Vektor (transformierter E.coli-Stamm ATCC Nr.68.151) trägt Polylinker-Bereiche anstelle der t- PA-cDNA in pSVI6B-tPA. Der Polylinker für einen weiteren nützlichen Stammvektor, pSVI6B7 (aus pRK7), ist der gleiche wie für pSVI6B5 (aus pRK5, EP-A 307.247, veröffentlicht am 15. März 1989), mit der Ausnahme, daß die Reihenfolge der Endonuklease-Restriktionsstellen im Polylinker-Bereich zwischen ClaI und HindIII umgekehrt ist. Diese Polylinker-Bereiche bieten günstige, einzelne Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen, die man zur Einführung jeder Sequenz verwenden kann, die für ein interessierendes Polypeptid kodiert, wobei die Expression dieser Sequenz durch die in der pSVI6B-tPA-Spleißeinheit vorhandenen Modifizierungen beeinflußt wird.
Vektor pSVI6B5 wurde in vier Schritten erzeugt, wie dies unten beschrieben und in Fig.7 veranschaulicht ist. Die ersten drei Schritte umfaßten die Entfernung der BamHI-, HindIII- bzw. SalI-Restriktionsstellen aus pSVI6B-tPA; daher waren bei der Ersetzung der t-PA-cDNA durch den Polylinker im letzten Schritt die Polylinker-Stellen für diese Enzyme die einzigen im resultierenden Stamm-Expressionsplasmid.

a. Konstruktion des ersten Zwischenplasmids pSVI6B-tPAd(b)

Vektor pSVI6B-tPA wurde mit BamHI digeriert, das nur innerhalb des Introns spaltet, die resultierenden 5'-vorstehenden Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart der dNTP's aufgefüllt, und der linearisierte Vektor wurde gelisoliert und mit T4-DNA- Ligase behandelt, um zu einer erneuten Ringschließung zu führen. Dies bewirkte den Verlust der BamHI-Erkennungssequenz; stattdessen entstand die Erkennungssequenz für das Enzym ClaI. Aufgrund der Methylierung kann jedoch ClaI diese Sequenz nicht spalten, wenn Plasmid-DNA aus dam&spplus;-E.coli gewonnen wird.

b. Konstruktion des zweiten Zwischenplasmids pSVI6B-tPAd(bh)

Plasmid pSVI6B-tPAd(b) wurde mit HindIII digeriert, das an beiden Seiten der Spleißeinheit spaltet, die 5'-vorstehenden Enden wurden in der Gegenwart aller vier dNTP's mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt und ein Teil des Reaktionsgemisches mittels BAP behandelt. Die beiden sowohl im behandelten wie auch im unbehandelten Material vorhandenen Fragmente wurden durch Gel-Elektrophorese getrennt; das größere Fragment wurde aus dem behandelten Material entfernt, das kleinere Fragment wurde aus dem unbehandelten Material entfernt. Die zwei Fragmente wurden ligiert, um Plasmid pSVI6B-tPAd(bh) zu bilden. Das Auffüllen der HindIII-Ende beider konstituierenden Fragmente bewirkte den Verlust der zwei HindIII-Stellen im resultierenden Plasmid und schuf gleichzeitig zwei neue Erkennungsstellen für das Enzym Nhel.
c. Konstruktion des dritten Zwischenplasmids pSVI6B-tPAd(bhs)
Die einzelne Sall-Erkennungsstelle wurde durch Digestion mit diesen Enzym aus Plasmid pSVI6B-tPAd(bh), T4-DNA-Polymerase-Behandlung in der Gegenwart von dNTP's, Gel-Isolierung der linearen Plasmid-DNA und erneute Ringschließung unter Verwendung von T4-DNA-Ligase entfernt. Dies führte zur Bildung einer neuen Pvul- Erkennungsstelle.

d. Konstruktion von Plasmiden pSVI6B5 und pSVI6B7

Zur Bildung des endgültigen, vielseitig verwendbaren Stammplasmids wurden zwei Fragmente wie folgt hergestellt:
1. Plasmid pSVI6B-tPAd(bhs) wurde mit Pstl und ClaI digeriert. Es gibt in diesem Plasmid drei Erkennungsstellen für ClaI: eine im Intron vor der t-PA-Sequenz, eine an der Grenze der t-PA-cDNA und des frühen SV40-polyA-Bereichs und eine hin zum Ende des polyA-Bereichs. Nur eine dieser Stellen - die zweite - ist gegenüber Methylierung unempfindlich. Daher wurde die aus dam&spplus;-MM294 gebildete Plasmid-DNA durch ClaI nur an dieser Stelle gespalten. Eine Pstl-Erkennungsstelle befindet sich an der Verbindungsstelle der Spleißeinheit und der t-PA-cDNA, und weitere sind in der t-PA- Sequenz zwischen dieser Position und der gegenüber Methylierung unempfindlichen ClaI-Stelle vorhanden. Die Spaltung mit Pstl und ClaI führte somit zur Freisetzung mehrerer kleiner Fragmente mit t-PA-Sequenzen und eines großen Fragments mit allen pSVI6B-tPAd(bhs)-Sequenzen mit Ausnahme der t-PA-cDNA. Dieses größere Fragment wurde gelisoliert.
2. Zwei Oligonukleotide wurden synthetisiert. Diese waren über die gesamte Länge (47 nt) des ersten (als 5A bezeichneten) komplementär. Das zweite, 5B, wurde an seinem 5'-Ende um zwei und an seinem 3'-Ende um vier Nukleotide (in der nachstehenden 5B- Sequenz unterstrichen) erweitert. Das Verschmelzen dieser komplementären Oligonukleotide führte somit zu einem DNA-Fragment mit einem 5'- und einem 3o - vorstehenden Ende ("soberhang"). Die Sequenz des vier-nt-3'-vorstehenden Endes war TGCA-3', das zum 3'-Überhang komplementär ist, der durch Pstl-Spaltung von Pstl- Erkennungsstellen gebildet wird. Das zwei-nt-5'-vorstehende Ende bestand aus dem Dinukleotid 5'-CG, das zum 5'-Überhang komplementär ist, der durch ClaI-Spaltung der ClaI-Restriktionsstellen gebildet wird. Die Sequenzen der beiden Oligonukleotide waren weiters konstruiert, um Erkennungsstellen für eine Anzahl an Restriktionsendonukleasen zu bieten (einige davon sind unterhalb der Sequenz jedes unten dargestellten Oligonukleotids angeführt). Die Sequenz des Oligonukleotids 5A war wie folgt:
Die Sequenz von Oligonukleotid 5B war:
Oligonukleotide 5A und 5B wurden verschmolzen und an das isolierte pSVI6B- tPAd(bhs)-Fragment ligiert, um das Plasmid pSVI6B5 zu bilden. Die Ligation des Pstl- Überhangs an den TGCA-3'-Überhang der verschmolzenen Oligonukleotide regenerierte die Pstl-Stelle nicht, sondern erzeugte eine ClaI-Stelle; am anderen Ende des Linkers regenerierte die Ligation des ClaI-Überhangs an den 5'-CG-Überhang keine ClaI-Stelle.
Plasmid pSVI6B7 wurde in ähnlicher Weise unter Verwendung der folgenden beiden Oligonukleotide gebildet (7A und 7B; man beachte, daß die Reihenfolge der Restriktionsstellen in diesen Oligonukotiden im Verhältnis zu den vorstehenden Enden gegenüber Oligonukleotiden 5A und 5B umgekehrt ist):

3. Konstruktion von pSVI6B-LAP-ARG und pSVI6B-LAP-SER und Expression des für latenzassoziiertes Peptid kodierenden Gens

a. Herstellung von Plasmiden:

Das in diesem Beispiel erzeugte Polypeptid ist das latenzassoziierte Peptid (LAP), das verbleibt, wenn reifer TGF-β von seinem Vorläufer-Rest abgespalten wird. Dieses Peptid kann dazu dienen, überschüssigen TGF-β zu entfernen oder TGF-β latent zu halten, bis er die Aktivierungsstelle erreicht.
Fig.8 zeigt die vollständige Nukleotid- und die vorausgesagte Aminosäure-Sequenz von LAP. Die vorausgesagten Aminosäuren des Peptids sind unterhalb der DNA-Sequenz dargestellt und vom ersten Rest des N-Terminus der Peptidsequenz an numeriert. Die reife TGF-β-Sequenz ist nicht enthalten. Negative Zahlen zeigen die Signalsequenz, positive Zahlen die Sequenz des sekretierten Peptids an.
Plasmid pSVI6B-LAP-SER enthält die Sequenzen für den prä-pro-Bereich von TGF-β1, der am Serinrest Nr. 275 endet, der normalerweise vor den grundlegenden Spaltungsstellen im TGF-β1-Vorläufer angeordnet ist. Das Plasmid pSVI6B-LAP-ARG ist dasselbe, mit der Ausnahme, daß es an Argininrest Nr.279 endet, für den ein Codon knapp 5' von einem Stoppcodon kodiert. Die Konstruktion von pSVI6B-LAP-SER und pSVI6B-LAP-ARG ist in Fig.9 dargestellt. Das Plasmid pSVI6B-LAP-ARG wurde in einen E.coli-Stamm hinein transformiert, und der resultierende Wirt bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland am 25. Oktober 1989 unter der ATCC Nr. 68.150 hinterlegt.
Diese Vektoren wurden im Detail folgendermaßen hergestellt: DNA des offenen Leserahmens, die für präpro-TGF-β kodiert, der mit EcoRI und BGIII endet (siehe EP-A 200.341, veröffentlicht am 10. Dezember 1986) wurde isoliert. Der Vektor RK5 wurde mit EcoRI und BamHI gespalten und das große Vektorfragment isoliert. Das kleine EcoRI-BgIII-Fragment und das große pRK5-Vektorfragment wurden ligiert und ergaben das Plasmid pSBβIMF, das eine Löschung von 21 bp der Polylinker-Sequenz von pRK5 aufweist. pSBβIMF besitzt die für Vorläufer-TGF-β kodierende DNA, die durch den CMV-Promotor/Verstärker angetrieben ist, gefolgt von einem Spleißdonor-Intron- Spleißakzeptor-Bereich 5' von der für TGF-β kodierenden DNA. Am 3'-Ende der für TGF-β kodierenden DNA befindet sich der frühe SV40-polyA und ein SV40- Replikationsursprung.
Der Vektor pSBβIMF wurde mit Apal und HindIII digeriert und das große Vektorfragment isoliert. Dieses Fragment wurde mit einem der beiden nachstehenden Oligonukleotide ligiert.
Die resultierenden Plasmide pTGF-βLAP1 + 2 und pTGF-βLAP3+4 wurden mit EcoRi und HindIII gespalten und die kleinen Fragmente isoliert. Diese Fragmente wurden dann in das isolierte Vektorfragment aus pSVI6B5 ligiert, das mit EcoRI und HindIII gespalten worden war, sodaß die LAP-Fragmente in den Polylinker-Bereich des Vektors eingesetzt wurden. Die resultierenden Plasmide wurden als pSVI6B-LAP-SER und pSVI6B-LAP-ARG bezeichnet.

b. Vorübergehende Expression

Menschliche 293-S-Zellen (Graham und van der Eb, Virology, 52: 456-467 [1973]), die bei einer Konfluenz von etwa 30% in 60-mm-Schalen eingeimpft worden waren, wurden am folgenden Tag mit 2,5 µg pSVI6B-LAP-SER oder pSVI6B-LAP-ARG und 2 µg Plasmid RSV T-Antigen transfiziert (Gorman et al., Science, 221: 551-553 [1983]). Am nächsten Tag wurden die Zellen in 1,0 ml serumfreien DMEM mit 250 µCi/ml ³&sup5;S- Cystein bzw. ³&sup5;S-Methionin 1-2 Stunden lang markiert. Das Markierungmedium wurde entfernt und sekretierte Proteine 4-5 Stunden in 1 ml serumfreien Medium gesammelt. Der Überstand wurde durch Zentrifugierung geklärt, die ausgespülten Zellen wurden in 0,5 ml Lysepuffer lysiert (1% Nonidet P40; 0,5% Desoxycholat; 0,1% SDS; 5 mM EDTA in phosphatgepufferter Salzlösung) und 10 min lang abzentrifugiert, und das Lysat bis zur Verwendung gefroren.
Sekretiertes Protein (100 µl) wurde mit einem Mäuse-Antikörper gegen rekombinanten TGF-β1 immungefällt. Die mit TGF-β-Antikörper zu fällenden Überstände wurden 5 min lang bei 75ºC in Gegenwart von 0,1% BSA erhitzt und vor der Zugabe von Antikörper auf Eis gekühlt. Immunkomplexe sekretierter Proteine wurden mit Pansorbin (Calbiochem) und Zellysate mit Protein A-Sepharose (Pharmacia) gefällt. Denaturierte Immunpräzipitate oder die gesamten sekretierten Proteine (15 µl) wurden auf 13% SDS- PAGE einer Elektrophorese unterzogen und Gele mit Enhance (DuPont) durchdrungen und drei Tage einer Temperatur von -70ºC ausgesetzt.
Ein Autoradiograph einer SDS-PAGE von ³&sup5;S-markierten sekretierten Gesamtproteinen aus den transfizierten Zellen zeigt an, daß der pSVI6B-LAP-SER ein Protein mit etwa 75 Kd ergibt, das den LAP darstellt. Ein Autoradiograph der SDS-PAGE-Analyse der TGF-β1- Immunausfällung zeigt an, daß LAP mit dem gegen reifen TGF-β1 gerichteten Antikörper nicht immunausgefällt wurde.

c. Stabile Expression

CHO-dhfr-Zellen (beschrieben durch Urlaub und Chasin, oben) wurden entweder mit pSVI6B-LAP-SER oder pSVI6B-LAP-ARG und mit einem dhfr-Selektionsvektor pFD11 cotransfiziert, (Simonsen und Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2495-2499 [1983]) wobei das allgemeine Verfahren nach Graham und van der Eb, oben, zur Anwendung kam. Das letztere Plasmid kodiert für DHFR, wodurch den transfizierten Zellen Methotrexat-Resistenz verliehen und die Selektion LAP-exprimierender Transformanden ermöglicht wird. Die transformierten dhfr-Zellen wurden durch Wachstum in Glycin-, Hypoxanthin- und Thymidin-defizienten Medium ausgewählt. Kolonien, die auf diesem Selektionsmedium entstanden, wurden mittels Wattebäuschen isoliert und im gleichen Medium zu mehreren Generationen vermehrt. Nach dem Zellwachstum wurden die Zellen mit zunehmenden Mengen an Methotrexat mittels herkömmlicher Verfahren amplifiziert und ausgewählt.
Die Zellen wurden anschließend markiert und wie oben auf vorübergehende Expression analysiert. Beide Transfektionen ergaben ein Protein mit etwa 75 Kd, das das LAP-SER- oder das LAP-ARG-Segment darstellte.

BEISPIEL 2

Bioaktivität von aus 293S- und CHO-Zellen sekretiertem LAP

1. Vorübergehende Bioaktivität durch Transfektion von S293-Zellen

Serumfreies konditioniertes Medium wurde aus 293S-Zellen gesammelt, die entweder mit pSVI6B-LAP-SER oder pRKTGF-β transfiziert waren, bei dem es sich um pRK5 mit TGF-β (Vorläufer-TGF-β) voller Länge als Einsatz handelt. Das konditionierte Medium diente dazu, die Auswirkungen des LAP auf TGF-β im Nerzlungen-Fibroblastassay zu untersuchen, der als Standard-Bioassay für TGF-β herangezogen wird. Der TGF-(3- Überstand wurde durch Behandlung bei 75ºC 5 min lang wärmeaktiviert und eine Reihe an Verdünnungen von 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 und 1:1600 gebildet. Eine Verdünnung von 1:200 des LAP-Überstands, der entweder unbehandelt oder wärmebehandelt war, wurde vor der Durchführung des Assays jeder dieser Verdünnungen zugegeben.
Wie aus Fig.10 ersichtlich, worin die Kreise wärmeaktivierter TGF-β, die Quadarate mit Strichlinien wärmeaktivierter LAP und die Quadrate mit durchgehenden Linien unbehandelter LAP sind, übte die Zugabe von wärmebehandeltem LAP keinen Einfluß auf die biologische Aktivität von TGF-β aus, woraus ersichtlich war, daß die Wärme LAP irreversibel inaktivierte. Im Gegensatz dazu konnte die Gegenwart von unbehandeltem LAP-Protein entweder die Menge der TGF-β-Aktivität (Verdünnungen von 1:100 bis 1:400) verringern oder die TGF-β-Aktivität (Verdünnungen von 1:800 bis 1:1600) völlig ausschalten, wenn im Überschuß vorhanden.
Die Zugabe von unbehandeltem LAP-Überstand zu einer Nerzlungen-Firbroblast- Zellinie verringerte die Ausgangsproduktion von TGF-β1 von 3 ng auf 0 ng TGF-β1. Dieses Ergebnis zeigte, daß LAP die inhibierende Aktivität des TGF-β umgekehrt hatte.

2. Stabile Bioaktivität durch Transfektion von CHO-Zellen

Serumfreies konditioniertes Medium (2,5ml) wurde aus Zellen gesammelt, die mittels Methotrexat ausgewählt wurden (siehe Beispiel 1c). Das Medium wurde wie oben bei den transfizierten S293-Zellen hinsichtlich Bioaktivität untersucht, wobei die Ergebnisse aus nachstehender Tabelle ersichtlich sind. Menge des konditionierten Mediums Aktivität von TGF-β (ng/ml) Lambda Lambda, Wärme
Der Unterschied der Aktivität zwischen den durch die beiden Plasmide erzeugten LAP (Fähigkeit zur Inaktivierung von reifem TGF-β) hängt mit der Menge jeder Zellinie zusammen, die erforderlich ist, das Protein aus der Zelle zu entfernen, und ist nicht auf die spezifische Aktivität der Form des erzeugten LAP zurückzuführen. Die Ergebnisse zeigen, daß bei Zunahme der Konzentration von unbehandeltem LAP-Überstand die TGF-β-Aktivität linear abnahm.

BEISPIEL 3

Assay hinsichtlich TNF-α

1. Zytotoxische Assay-Vorgangsweise

Das L-929-Assaysystem ist ein praktischer in vitro-Assay, der die rasche Messung der Aktivität des vorliegenden LAP wahlweise in Verbindung mit einem geeigneten Regulator der Immunfunktion ermöglicht. Sein Korrelationsgrad mit dem in vivo-Tumornekrose-Assay nach Carswell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3666 (1975) ist derzeit unbekannt, doch da spezifisch Mäuse-Tumorzellen zum Einsatz kommen, kann man eine hohe Korrelation erwarten. Die Proteine Tumornekrose-Faktor (TNF-α) und Lymphotoxin (TNF-β) zeigen in diesem Assay Aktivität. Der Assay ähnelt vom Konzept her dem in US-A-4.457.916 geoffenbarten, wo Mäuse-L-M-Zellen und Methylenblau-Färbung zum Einsatz kommen. Es wurde jedoch gezeigt, daß der L-929- Assay mit der Zytotoxizität der menschlichen Tumor-Zellinie korreliert (für TNF-α aus HL-60-Zellen).
Im vorliegenden L-929-Assaysystem werden L-929-Zellen über Nacht als Monoschichten in Mikrotiter-Platten gebildet. Die besten Proben werden zweimal über die Platte verdünnt, UV-bestrahlt und dann auf die gebildeten Zell-Monochichten aufgebracht. Die Kulturmedien in den Näpfen werden dann auf einen Gehalt von 1 µg/ml Actinomycin D gebracht. Die Platten werden 18 Stunden bei 37ºC inkubiert und visuell unter einem Mikroskop beurteilt. Jeder Napf erhält eine 25-, 50-, 75- oder 100- %-Markierung, die das Ausmaß des Zelltods im Napf kennzeichnet. Eine TNF- Aktivitätseinheit ist als Reziprokwert der Verdünnung definiert, bei der eine Abtötungsrate von 50% auftritt.

2. In vivo-Assays

Präparate können auch auf Aktivität hinsichtlich der Fähigkeit des Arzneimittels getestet werden, das Tumorwachstum zu stoppen oder zu unterdrücken und das den Tumor tragende Tier vor dem Sterben zu bewahren. Balb/c-Mäuse werden subkutan mit verschiedenen Arten von Tumorzellen injiziert, um einen lokalisierten Tumor zu schaffen. Tumor-Zellinien umfassen MethA-Mäuse-Fibrosarkom (erhalten als Zellsuspension aus Aszites-Flüssigkeit) und MCF-7, ein menschliches Brustkarzinom, das als ein 1 mm³-Zellklumpen verabreicht wird.
Für den Assay werden weibliche Balb/c-Mäuse (19-22 g) durch eine Nummer 26-Nadel entweder mit einer Suspension, die 5 x 10&sup5; Fibrosarkom-Zellen in 0,1 ml Medium enthält, oder mit den MCF-7-Klumpen subkutan injiziert. (Die Fibrosarkom-Suspension wird aus 8 Tage alter Aszites-Flüssigkeit durch Zellzählung und Verdünnung mit serumfreien Medium gebildet.) Nach 9-10 Tagen, wenn der Tumor fühlbar wird, wird 1 µg TNF-α pro Maus intravenös injiziert, wobei die Verabreichung von TNF-α an den darauffolgenden Tagen wenn nötig wiederholt wird. Die Ergebnisse werden durch Messen des Tumorvolumens und durch die Überlebensrate bewertet. Der Test wird mittels getrennter aufeinanderfolgender Injektionen von 1 µg TNF-α pro Maus und 10 mg/kg LAP pro Maus wiederholt (wie in Beispiel 1 hergestellt und durch herkömmliche Verfahren gereinigt).
Man stellt fest, daß LAP die tumorverringernde Aktivität des TNF-α sowohl in den oben beschriebenen in vivo- als auch in vitro-Versuchen steigert.

BEISPIEL 4

Assay hinsichtlich M-CSF

In einem Assay zur Bestimmung des Sarkom-Zellsterbens werden normale, anhaftende, peritoneale 2 Stunden-C3H/HeN-Mäuse-Makrophage einen Tag lang in vivo mit und ohne Mäuse-rM-CSF als Mäuse-L-Zellen-konditioniertes Medium, das 1200 U/ml M-CSF (hergestellt wie in US-A-4.847.201) enthält, und mit einer Formulierung, die das obige Mäuse-M-CSF-Medium sowie 1 mg/ml des in Beispiel 3 verwendeten LAP enthält, inkubiert. Dann werden die Inkubate in einem 20:1-Verhältnis mit ³H-Thymidinmarkierten Mäuse-Sarkom-TU5-Zellen gemeinsam mit 10% v/v conA-induziertem (10 µg/ml) Milz-Lymphokin (LK) vermischt, das Gamma-Interferon enthält. Die Freisetzung von markiertem Thymidin im Verlauf der folgenden 48 Stunden dient als Maß des Tumor-Zellsterbens.
Man stellt fest, daß LAP die Fähigkeit des M-CSF steigert, das Tumor-Zellsterben durch Mäuse-Makrophagen zu stimulieren.

BEISPIEL 5

Assay hinsichtlich IL-2

Man stellt fest, daß LAP aus Beispiel 3 bei Zugabe zu gereinigtem nativem IL-2 (isoliert aus der induzierten Jurkat-Zellinie) den Wirkungsgrad des IL-2 steigert, wie er durch seine spezifische Bioaktivität im HT-2-Zellvermehrungs-Assay gemessen wird (Watson, J. Exp. Med., 150: 1510-1519 (1979) und Gillis et al., J. Immunol., 1230: 2027-2032 [1979]).

BEISPIEL 6

Ein 60-jähriger, 90 kg schwerer männlicher Patient, der eine tiefe Wunde am Bein hatte und ein unterdrücktes Immunsystem aufwies, das zu einer Infektion des Weichgewebes führte, wird mit einer Bolusinjektion von 10 mg/kg LAP injiziert, das in Beispiel 3 verwendet wird und mit 5 mg menschlichem Serumalbumin, 8 mg Natriumchlorid, 0,2 mg Kaliumhydrogenphosphat und 1,4 mg Dinatriumhydrogenphosphat formuliert ist. Nach einer 2-wöchigen Therapie war die Infektion des Patienten behoben.

BEISPIEL 7

Ein 55-jähriger, 70 kg schwerer männlicher Patient, der an einer Streptokokken-Infektion leidet, besitzt ein unterdrücktes Immunsystem und zieht sich daher eine Sekundärinfektion zu. Er erhält über 5 Wochen eine kontinuierliche Infusion einer Zusammensetzung mit einer Dosis von 0,1 mg/kg des in Beispiel 3 verwendeten LAP. Die Behandlung bewirkt eine Behebung der Sekundärinfektion.

BEISPIEL 8

Ein 50-jähriger, 85 kg schwerer männlicher Patient mit einer tiefen Schnittwunde am Arm als Ergebnis eines chirurgischen Eingriffs, der an einer Weichgewebe-Infektion als Folge seines unterdrückten Immunsystems leidet, erhält eine intravenöse Injektion einer Formulierung mit einer Dosis von 25 µg/m² rekombinantem menschlichen IFN-Gamma (US-A-4.762.791), 1 mg/kg des in Beispiel 3 verwendeten LAP, 5 mg menschlichem Serumalbumin, 8 mg Natriumchlorid, 0,2 mg Kaliumhydrogenphosphat und 1,4 mg Dinatriumhydrogenphosphat. Diese Behandlung wird fünfmal pro Woche 4 Wochen lang durchgeführt. Nach den 4 Wochen ist die Infektion behoben.

BEISPIEL 9

Ein 35-jähriger, 75 kg schwerer männlicher Patient weist auf 50% seiner Körperoberfläche Verbrennungen dritten Grades auf und besitzt ein unterdrücktes Immunsystem, was zu einer Weichgewebe-Infektion führt. Er erhält drei- bis fünfmal pro Woche 5 Wochen lang eine intravenöse Injektion mit einer Zusammensetzung wie in Beispiel 6. Nach einer dreiwöchigen Therapie ist die oberflächliche Infektion des Patienten behoben.

Hinterlegung der Materialien

Die folgenden Stämme wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) hinterlegt: Stämme ATCC Zugriffsnummer Hinterlegungsdatum Oktober
Die Hinteriegungen erfolgten gemäß dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren und der darunterfallenden Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies gewährleistet die Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur über einen Zeitraum von 30 Jahren ab Hinterlegungsdatum. Die Organismen werden durch die ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags und im Einklang mit einer Vereinbarung zwischen Genentech, Inc. und ATCC bereitgestellt, was bei Gewährung eines betreffenden amerikanischen Patents oder bei entweder vorher oder nachher erfolgender Offenlegung aller amerikanischen oder ausländischen Patentanmeldungen, was immer zuerst erfolgen sollte, eine dauerhafte und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kulturen für die Öffentlichkeit sowie die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft auf jene einschränkt, die durch den U.S. Commissioner of Patents and Trademarks bestimmt wird, der dazu gemäß 35 USC §122 und den damit in Einklang stehenden Bestimmungen des Commissioner (darunter 37 CFR §1.14, mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) berechtigt ist.
Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung verpfichtete sich, daß die hinterlegten Kulturen im Falle ihres Sterbens, ihres Verlusts oder ihrer Zerstörung bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen unmittelbar nach Benachrichtigung durch eine lebensfähige Probe der gleichen Kultur ersetzt werden. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Kulturen darf jedoch nicht als Genehmigung angesehen werden, die Erfindung unter Zuwiderhandlung gegen die Rechte durchzuführen, die gemäß den Vollmachten einer beliebigen Regierung in Einklang mit ihrer Patentgesetzgebung gewährt werden.
Die obige schriftliche Beschreibung wird als ausreichend betrachtet, den Fachmann auf dem Gebiet zur Durchführung der Erfindung zu befähigen. Die vorliegende Erfindung ist durch die hinterlegten Kulturen in ihrem Umfang nicht eingeschränkt, da die hinterlegten Kulturen als getrennte Veranschaulichungen bestimmter Aspekte der Erfindung anzusehen sind; jede Kultur, die funktionell äquivalent ist, liegt im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Die Hinterlegung des vorliegenden Materials stellt weder ein Eingeständnis dar, daß die vorliegende schnifliche Beschreibung unzulänglich ist, um irgendeinen Aspekt der Erfindung einschließlich der besten Durchführungsart zu praktizieren, noch darf sie dahingehend ausgelegt werden, daß sie den Umfang der Ansprüche auf die jeweiligen Veranschaulichungen, die sie darstellt, beschränkt. Für Fachleute auf dem Gebiet ergeben sich aus der obigen Beschreibung zusätzlich zu den hierin dargestellten und erläuterten Änderungen zahlreiche in den Schutzumfang der beigelegten Ansprüche fallende Modifizierungen der Erfindung.

Claims

1. Isolierte Nukleinsäure-Sequenz, umfassend eine für das in Fig. 8 dargestellte Peptid kodierende DNA-Sequenz oder Analoge oder Varianten davon, die die biologische Aktivität eines latenzassoziierten Peptids besitzt, vorausgesetzt, daß die Sequenz nicht auch für einen reifen TGF-β kodiert.

2. Nukleinsäure-Sequenz nach Anspruch 1, worin das von der Nukleinsäure- Sequenz kodierte Peptid eine zumindest 80%-ige Aminosäuresequenz-Identität mit dem rekombinanten, latenzassoziierten Peptid aus Fig. 8 aufweist.

3. Expressionsvektor, umfassend die Nukleinsäure-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, die mit Steuersequenzen operabel verbunden ist, die von einem mit dem Vektor transformierten Wirt erkannt werden.

4. Vektor nach Anspruch 3, der der in Fig. 9 (Forts. a) dargestellte Vektor pSVI6B- LAP-SER ist.

5. Vektor nach Anspruch 3, der der unter ATCC 68.150 hinterlegte Vektor pSVI6B- LAP-ARG ist.

6. Mit dem Expressionsvektor nach irgendeinem der Ansprüche 3 - 5 transformierte Wirtszelle.

7. Verfahren zur Herstellung eines latenzassoziierten Peptids, umfassend das Kultivieren der Zellen nach Anspruch 6 zum Exprimieren von Nukleinsäure, die für das Peptid in der Wirtszellenkultur kodiert.

8. Latenzassoziiertes Peptid, das nach dem Verfahren nach Anspruch 7 erhalten werden kann.

9. Latenzassoziiertes Peptid mit einem Molekulargewicht von etwa 75.000, gemessen durch nicht-reduzierende SDS-PAGE, das in der Lage ist, einer biologischen Aktivität von reifem TGF-β entgegenzuwirken, und vollständig frei von Ursprungsproteinen ist.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung, die zum Entgegenwirken gegen eine TGF-β- Aktivität dient, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des Peptids nach Anspruch 8 oder 9 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, die aufgrund einer TGF-β-Aktivität nützlich ist, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des Peptids nach Anspruch 8 oder 9 und eine therapeutisch wirksame Menge eines reifen TGF-β in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

12. Verfahren zum Diagnostizieren des Vorliegens einer Krankheit oder Störung, die durch die Gegenwart von reifem TGF-β in einer Serumprobe eines Patienten nachweisbar ist, umfassend die Zugabe einer markierten Form des Peptids nach Anspruch 8 oder 9 zur Serumprobe und das Testen auf die Gegenwart von markierten Komplexen aus Peptid und reifem TGF-β in der Serumprobe.

13. Peptid nach Anspruch 8 oder 9 zur Verwendung in einem Verfahren zur medizinischen Behandlung oder Diagnose.

14. Verwendung des Peptids nach Anspruch 8 oder 9 zur Herstellung eines Medikaments zum Entgegenwirken gegen eine TGF-β-Aktivität in einem Säugetier.

15. Verwendung des Peptids nach Anspruch 8 oder 9 und TGF-β zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers, das einer TGF-β-Behandlung bedarf.