DE69712036T2

DE69712036T2 - Neue verabreichung von thrombopoietin

Info

Publication number: DE69712036T2
Application number: DE69712036T
Authority: DE
Inventors: R. Thomas
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-01-25
Filing date: 1997-01-13
Publication date: 2002-11-28
Anticipated expiration: 2017-01-14
Also published as: CA2242417A1; ATE411039T1; JP2000504325A; WO1997026907A1; EP1201246B1; PT876152E; EP1201246A2; AU711639B2; EP1201246A3; DK0876152T3; AU1533597A; US5879673A; DE69739050D1; DE69712036D1; ES2315255T3; DK1201246T3; ATE216257T1; EP0876152A1; EP0876152B1; ES2175333T3

Description

Die vorliegende Anmeldung und der darin enthaltene Gegenstand betrifft die folgende Patentanmeldung und deren Inhalt: Internationale Patentanmeldung PCT/US94/14553, eingereicht am 28. Dezember 1994 (veröffentlicht unter der Nummer WO95/18858 am 13. Juli 1995).

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Verwendung von Thrombopoietin und dessen biologisch aktiver Derivate und Isoformen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Immun- und/oder hämatopoetischen Störungen, einschließlich Thrombopenie. Gemeinsame Verabreichung solcher Substanzen mit einem Cytokin, insbesondere einem koloniestimulierenden Faktor oder Interleukin ist ebenfalls vorgesehen. Das Medikament dient der Behandlung eines Säugetiers mit Thrombopenie oder Thrombopenie-Risiko durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge dieser Substanz(en) an das Säugetier, welches eine solche Behandlung benötigt.

Hintergrund der Erfindung

Das hämatopoetische System produziert die reifen, hoch spezialisierten Blutzellen, die bekanntermaßen für das Überleben aller Säugetiere notwendig sind. Diese reifen Zellen umfassen Erythrozyten, spezialisiert auf Sauerstoff- und Kohlendioxidtransport, T- und B- Lymphozyten, verantwortlich für zell- und antikörpervermittelte Immunantworten, Blutplättchen oder Thrombozyten, spezialisiert auf die Bildung von Blutgerinnseln, und Granulozyten und Makrophagen, spezialisiert als Einfänger und Hilfszellen zur Infektionsbekämpfung. Alle dieser spezialisierten, reifen Blutzellen sind von einem einzigen, gemeinsamen, primitiven Zelltyp hergeleitet, der als pluripotente Stammzelle bezeichnet wird und in erster Linie im Knochenmark gefunden wird.
Die reifen, hoch spezialisierten Blutzellen müssen das ganze Leben eines Säugetiers hindurch fortwährend in großer Zahl produziert werden. Der überwiegende Teil dieser spezialisierten Blutzellen ist dazu bestimmt, für nur wenige Stunden bis Wochen funktionell aktiv zu bleiben. Folglich ist die fortwährende Erneuerung dieser reifen Blutzellen, der primitiven Stammzellen selbst, sowie jeglicher Zwischenstufe oder Abstammungslinie, zwischen den primitiven und reifen Zellen gelegenen, festgelegten Vorläuferzelllinien notwendig, um den für die Lebenserhaltung des Säugetiers notwendigen Fließgleichgewichtszustand der Blutzellen zu erhalten.
Im Zentrum des hämatopoetischen Systems liegt/liegen die pluripotente(n) Stammzelle(n). Diese Zellen sind in relativ geringer Anzahl vorhanden und unterliegen Selbsterneuerung durch Proliferation, um Tochterstammzellen zu produzieren, oder sie werden in einer Reihe von Differenzierungsschritten in zunehmend reifere, Abstammungslinien- ("Lineage")- eingeschränkte Vorläuferzellen transformiert und bilden letztlich die hoch spezialisierte(n), reife(n) Blutzelle(n).
Das zugrunde liegende Prinzip des normalen, hämatopoetischen Zellsystems scheint die herabgesetzte Fähigkeit zur Selbsterneuerung zu sein, wenn die Multipotenz verloren geht und Abstammungslinien-Einschränkung und Reife erlangt wird. Folglich liegt an einem Ende des Zellspektrums die pluripotente Stammzelle mit der Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung zu allen der verschiedenen Abstammungslinien-spezifischen, festgelegten Vorläuferzellen. Am anderen Ende des Spektrums liegen die höchst Abstammungslinien-eingeschränkten Vorläufer und ihre Nachkommenschaft, welche die Fähigkeit zur Selbsterneuerung verloren, jedoch reife, funktionelle Aktivität erlangt haben.
Die Proliferation und Entwicklung von Stammzellen und Abstammungslinien-eingeschränkten Vorläuferzellen wird durch eine Reihe hämatopoetischer Wachstumsfaktoren oder Cytokine sorgfältig gesteuert. Folglich können hämatopoetische Wachstumsfaktoren Wachstum und Differenzierung eines oder mehrerer Abstammungslinien beeinflussen, sich mit anderen Wachstumsfaktoren in der Beeinflussung einer einzelnen Vorläuferzelllinie überschneiden, oder synergistisch mit anderen Faktoren wirken.
Es ist aus dem Vorangegangenen klar ersichtlich, dass neue hämatopoetische Wachstumsfaktoren, welche Überleben, Proliferation, Differenzierung oder Reifung jeglicher Blutzellen oder deren Vorläufer beeinflussen, nützlich wären, insbesondere um die Wiederherstellung eines abgeschwächten hämatopoetischen Systems, verursacht durch Krankheit oder nach Strahlen- oder Chemotherapie, zu unterstützen.
Blutplättchen sind entscheidende Grundbestandteile des Blutgerinnungsmechanismus. Erschöpfung des zirkulierenden Blutplättchenspiegels, Thrombopenie genannt, tritt auf und manifestiert sich in verschiedenen klinischen Zuständen und Störungen. Klinische Thrombopenie wird gewöhnlich definiert als ein Zustand, worin die Blutplättchenanzahl unter etwa 150 · 10&sup9; pro Liter liegt. Die hauptsächlichen Ursachen von Thrombopenie kann, basierend auf der Blutplättchenlebensdauer, weitgehend in drei Kategorien unterteilt werden, nämlich: 1) verminderte Produktion von Blutplättchen durch das Knochenmark, z. B. durch Chemo- und Strahlentherapie bewirkte Thrombopenie, 2) Blutplättchensequesterierung in der Milz (Splenomegalie) und 3) verstärkte Zerstörung von Blutplättchen im peripheren Kreislauf, z. B. durch Autoimmunstörungen bewirkte Thrombopenie. Zusätzlich kann sich in Patienten, die große Volumina von schnell verabreichten, blutplättchenarmen Blutprodukten erhalten, aufgrund von Verdünnungsfaktoren Thrombopenie entwickeln. Eine ausführlichere Beschreibung von Thrombopenie und ihrer Ursachen findet sich in Schafner, "Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Disfunction", Internal Medicine, John J. Hutton et al. (Hrsg.), Little, Brown & Co., Boston/Toronto/London, 3. Aufl. (1990), sowie in der bereits zuvor erwähnten Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US94/14553 (Internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/18858).
Der therapeutische Ansatz zur Behandlung von Patienten mit Thrombopenie wird durch die Schwere und Dringlichkeit der klinischen Situation bestimmt. Die Behandlung ist ähnlich für HIV-assoziierte und nicht HIV-bezogene Thrombopenien, und obwohl eine Anzahl von verschiedenen therapeutischen Ansätzen verwendet worden sind, verbleibt die Therapie klinisch umstritten.
Aus dem Vorangegangenen ist klar ersichtlich, dass die Erlangung eines Mittels, welches in der Lage ist, die Differenzierung und Reifung von Megakaryozyten oder ihrer Vorstufen zur blutplättchenbildenden Form zu beschleunigen, einer der Wege zur Behandlung von Thrombopenie wäre. Beträchtliche Bemühungen wurden unternommen, ein solches Mittel zu identifizieren. Ein Mittel, auf das für gewöhnlich verwiesen wird, ist Thrombopoietin (TPO), der Gegenstand der vorliegenden Anmeldung. Andere, zurzeit für gewöhnlich in der Literatur angetroffene Namen für TPO umfassen: Thrombopoese-stimulierender Faktor (TSF); Megakaryozyten-Wachstums- und Entwicklungsfaktor (MK-CSF), Megakaryozyten-stimulierender Faktor, Megakaryozyten-Potentiator und mpl-Ligand.
Die zitierte Internationale Patentanmeldung PCT/US94/14553 beschreibt die Identifizierung, Isolierung, Herstellung und Verwendung eines isolierten, Megakaryozyten-Proliferation und Reifung fördernden Säugetierproteins, bezeichnet als "MPL-Ligand" (ML) oder häufiger "Thrombopoietin" (TPO), von dem gefunden wurde, dass es in der Lage ist, die Proliferation, Reifung und/oder Differenzierung von Megakaryozyten zur reifen, blutplättchenbildenden Form zu stimulieren.
Zu berücksichtigen sind auch die Internationalen Patentanmeldungs-Veröffentlichungen Nr. WO 95/26746, WO 95/21919 und WO 95/21920.
Die Anmeldung PCT/US94/14553 umfasst verschiedene Aspekte assoziierter Ausführungsformen von TPO, einschließlich eines Verfahrens zur Behandlung eines Säugetiers mit hämatopoetischer Störung oder Störungsrisiko, bemerkenswerterweise Thrombopenie, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von TPO-Stoffen an das Säugetier. Optional wird TPO als solches verabreicht, oder in Kombination mit einem Cytokin, insbesondere einem koloniestimulierenden Faktor oder Interleukin.
Zu Zwecken, die in der besagten internationalen Patentanmeldung offenbart sind, ist TPO breit definiert als TPO selbst oder verschiedene Varianten, Derivate oder Isoformen davon umfassend, einschließlich Fragmente, welche zumindest eine biologische Eigenschaft mit intaktem TPO zur Behandlung von Thrombopenie gemeinsam haben. "Biologische Eigenschaft" bedeutet, wenn in Verbindung mit der Definition der verschiedenen, wie in der besagten Patentanmeldung beschriebenen, zweckmäßigen TPO-Stoffe verwendet, dass diese thrombopoetische Aktivität oder eine in vivo-Effektor oder antigene Funktion oder Aktivität besitzen, die direkt oder indirekt durch den TPO-Stoff verursacht wird.
Bezüglich der therapeutischen Verwendung von Thrombopoietin-Stoffen werden, wie in besagter Internationaler Patentanmeldung Nr. PCT/US94/14553 beschrieben, die TPO- Stoffe darin zur Verabreichung im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger über jegliche von mehreren Verabreichungsarten beschrieben. Die Tagesvorgabe wird beschrieben als im Bereich von etwa 0,1 bis 100 ug/kg Körpergewicht liegend, vorzugsweise von etwa 0,1 bis 50 ug/kg Körpergewicht, vorzugsweise in einer Anfangsdosierung im Bereich von etwa 1 bis 5 ug/kg pro Tag. In den Lehren besagter Patentanmeldung impliziert ist eine Vorgabe der Verabreichung einer solchen Dosisrate, einer projektierten oder tatsächlichen verminderten Blutplättchenzahl folgend, über einen Zeitraum von mehreren bis vielen Tagen.
Veröffentlichte klinische Studien von klinisch verabreichtem Thrombopoietin indizieren ein Dosierungs- und Verabreichungsschema bestehend aus der subkutanen Verabreichung von Thrombopoietin in Dosierungen von 0,03 bis 5,0 ug/kg Körpergewicht einmal pro Tag über einen Zeitraum von zehn Tagen für einen durch Thrombopenie gekennzeichneten Zustand. Siehe Abstract 1977, Blood 86 (1995). Siehe auch die Abstracts 1012, 1014 und 1978, Blood 86 (1995).
Ebenso ist die Verbindung Epoetin Alfa, eine Bezeichnung für Erythropoietin (vertrieben als Epogen durch Amgen, Inc.), ein zur Stimulierung der Produktion von Erythrozyten indiziertes Glykoprotein. Es ist indiziert in einem Dosis- und Verabreichungsschema bestehend aus Anfangsdosen über einen Bereich von 150 bis 300 Units pro kg dreimal wöchentlich über einen Zeitraum von vielen Wochen, um die Proliferation von Erythrozyten in Patienten zu stimulieren, die an einer wie auch immer hervorgerufenen Verarmung leiden.
Filgastrim, vertrieben als Neupogen durch Amgen, Inc., ist ein Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (G-CSF). Dessen indiziertes Schema ist die subkutane Verabreichung von 5 bis 10 ug/kg täglich für zwei Wochen.
Basierend auf diesen Einzelberichten ist das übliche Verabreichungsschema von Stoffen für die Proliferation von Erythrozyten oder anderer primärer Blutzellen, um die Wirkungen von Thrombopenie umzukehren, die kontinuierliche Verabreichung therapeutisch wirksamer Mengen des biologischen Stoffes, täglich über einen Zeitraum von vielen Tagen, an Patienten, die nach einem Vorfall, der zu Thrombopenie führte, eine solche Therapie benötigen.
Zum Vorteil für Ärzte und insbesondere ebenso Patienten besteht die Zielsetzung in der Entwicklung alternativer Dosierungs-Nerabreichungsschema solcher biologischen Stoffe, welche vorteilhaft und therapeutisch gleichwertig oder überlegen sind, um die Auswirkungen von Thrombopenie umzukehren.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf der unerwarteten und überraschenden Erkenntnis, dass biologisch aktive Thrombopoietin-Stoffe therapeutische Wirkung hervorrufen können, und zwar durch Verabreichung einer Einzel- oder niedrig-mehrfachen, täglichen Dosis einer therapeutisch wirksamen Menge an einen Patienten mit Thrombopenie oder der eine Behandlung wegen Thrombopenie benötigt.
Folglich zielt die vorliegende Erfindung in ihrem grundlegenden Aspekt auf die Verwendung von Thrombopoietin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers mit Thrombopenie oder Thrombopenie-Risiko ab, umfassend die Verabreichung einer Einzeldosis oder zwei an einem einzelnen Tag erfolgenden therapeutischen Dosen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Thrombopoietins an ein Säugetier, welches eine solche Behandlung benötigt. In seinem bevorzugtem Aspekt dient das Medikament der Einzelverabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis.
Mit dem Begriff "niedrig-mehrfach" ist im Zusammenhang mit der Dosierung die Verabreichung mehrfacher Dosen über einen kurzen Zeitraum gemeint, der vom Eintritt der therapeutischen Reaktion, d. h. erhöhte Blutplättchenbildung/-spiegel, unabhängig ist, was hierin auch gefunden worden ist. Die fundamentale Aussage ist folglich, dass das Medikament nur der Einzelverabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Thrombopoietins dient. Es ist gefunden worden, dass eine solche Einzelverabreichung eine therapeutische Wirkung hervorruft, die derjenigen gleichwertig ist, die hervorgerufen wird, wenn eine therapeutisch wirksame Menge desselben Stoffes über das übliche mehrfache Schema über viele Tage verabreicht wird, wie gegenwärtig in der Wissenschaft empfohlen und gelehrt wird.
Es versteht sich, dass sich eine Einzelverabreichung eines Thrombopoietins an einen Patienten zur Behandlung von Thrombopenie als therapeutisch wirksam erwiesen hat. Es ist hierin gefunden worden, dass eine Einzeldosis das Eintreten einer therapeutischen Reaktion stimuliert.
Gemäß vorliegender Erfindung ist gefunden worden, dass das Einzel-Schema der vorliegenden Erfindung bei relativ geringen Dosierungsraten wirksam ist, die in der Größenordnung von etwa 0,1 bis 10, vorzugsweise etwa 0,3 bis 10, noch bevorzugter etwa 0,5 bis 10, insbesondere bevorzugt etwa 0,5 bis 5, ug/kg Körpergewicht des Patienten liegt. Bei Einzeldosierung wird für gewöhnlich eine Gesamtverabreichung von etwa 2 +/- 1,5 ug/kg Körpergewicht bevorzugt. Bei niedrig-mehrfacher Dosierung von zwei an einem einzelnen Tag erfolgenden therapeutischen Dosen wird für gewöhnlich die Verabreichung von etwa 0,5 bis 1,5 ug/kg Körpergewicht pro Dosis bevorzugt. Die obigen Dosierungen basieren auf bevorzugte intravenöse Verabreichung. Bei Verabreichung auf subkutanem Wege liegt die verabreichte Gesamtmenge für gewöhnlich im Bereich von etwa der ein- bis dreifachen, vorzugsweise zweifachen der auf intravenösem Wege verabreichten Menge.
Die optimale Dosierungsrate und das optimale Schema werden durch den behandelnden Arzt bestimmt, wobei verschiedene bekannte Faktoren, welche die Wirkung von Medikamenten verändern, einschließlich Schwere und Art der Erkrankung, Körpergewicht, Geschlecht, Ernährung, Zeitpunkt und Weg der Verabreichung, andere Medikamenten-Behandlungen und andere relevante klinische Faktoren zu berücksichtigen sind. Gemäß vorliegender Erfindung besteht das Schema der vorliegenden Erfindung aus einer Einzelverabreichung eines Thrombopoietin-Stoffes hiervon im weit gefassten Bereich von etwa 0,1 bis 100 ug/kg Körpergewicht. Insbesondere bevorzugt basiert die vorliegende Erfindung auf das unerwartete Ergebnis, dass eine Einzelverabreichung einer Dosis im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1,0 oder bevorzugter etwa 0,5 bis etwa 5,0 ug/kg eine therapeutische Wirkung hervorruft, die äquivalent zur Verabreichung derselben oder einer höheren Stoffmenge über ein Schema ist, das sich über eine tägliche Verabreichung über eine Anzahl von Tagen von einer Woche aufwärts oder mehr erstreckt.
Die biologisch aktiven Thrombopoietin-Stoffe der vorliegenden Erfindung können erfindungsgemäß über verschiedene Wege verabreicht werden, einschließlich über die Nase oder Lunge, subkutan und vorzugsweise intravenös. In allen Fällen werden die biologisch aktiven Thrombopoietin-Stoffe der vorliegenden Erfindung, in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg, vorzugsweise in Kombination mit einem geeigneten, therapeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten verabreicht. Wenn systemisch verabreicht, sollte die therapeutische Zusammensetzung pyrogenfrei sein und in parenteral annehmbarer Lösung mit geeigneter physiologischer pH-Isotonie und Stabilität vorliegen. Diese Bedingungen sind bei den entsprechenden Fachleuten allgemein gut bekannt und anerkannt.
Kurz gefasst werden die Rezepturen der Stoffe der vorliegenden Erfindung für die Lagerung oder Verabreichung präpariert, indem die Verbindung des gewünschten Reinheitsgrads mit physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten und/oder Stabilisatoren vermischt wird. Solche Stoffe sind in den angewendeten Dosierungen und Konzentrationen für den Empfänger nicht-toxisch und umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat, Acetat oder andere Salze organischer Säuren; Antioxidantien, wie z. B. Ascorbinsäure; niedermolekulare Peptide, wie z. B. Polyarginin, Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Cellulose und ihre Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine; komplexbildende Agenzien, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannitol oder Sorbitol; Gegenionen, wie z. B. Natrium und/oder nichtionische Tenside, wie z. B. Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol.
Die biologisch aktiven Thrombopoietin-Stoffe hierin können als freie Säure oder basische Form oder als pharmazeutisch annehmbares Salz verabreicht werden, und werden mit einem physiologisch annehmbaren Vehikel, Träger, Exzipienten, Bindemittel, Konservierungsmittel, Stabilisator, Geschmacksmittel, usw. hergestellt, wie es die anerkannte pharmazeutische Praxis verlangt.
Sterile Zusammensetzungen zur Injektion können gemäß konventioneller pharmazeutischer oder pharmakologischer Praxis formuliert werden. Beispielsweise kann das Auflösen oder Suspendieren des Wirkstoffs in einem Vehikel, wie z. B. Wasser oder natürlich vorkommenden Pflanzenölen, wie z. B. Sesam-, Erdnuss- oder Baumwollsamenöl, oder einem synthetischen Fettvehikel, wie z. B. Ethyloleat oder dergleichen, erwünscht sein. Es können wiederum Puffer, Konservierungsmittel, Antioxidantien und dergleichen gemäß anerkannter pharmazeutischer Praktiken beigemengt werden. Die biologisch aktiven Thrombopoietin-Stoffe der vorliegenden Erfindung können für sich alleine angewendet werden oder in Kombination mit anderen Cytokinen, Hämatopoietinen, Interleukinen, Wachstumsfaktoren oder Antikörpern zur Behandlung der oben bezeichneten, durch Thrombopenie gekennzeichneten Störungen und Konditionen verabreicht werden. Folglich können die vorliegenden aktiven Stoffe in Kombination mit einem anderen Protein oder Peptid mit thrombopoetischer Aktivität angewendet werden, welche umfassen: G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-2, IL-3, Erythropoietin (EPO), Kit-Ligand, IL-6, IL-11, FLT-3-Ligand usw.
Geeignete Beispiele für Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrices fester, hydrophober Polymere, die das Polypeptid enthalten, wobei die Matrices als geformte Produkte vorliegen, z. B. Filme oder Mikrokapseln. Beispiele für Retard-Matrices umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie beschrieben von Langer at el., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167-277 (1981), und Langer, Chem. Tec. 12, 98- 105 (1982), oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-A-3.779.919, EP-A-58.481), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547-556 (1983)), nicht-abbaubares Ethylen-Vinylacetat (Langer et al., s.o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z. B. Luprom Depot (injizierbare Mikrokügelchen, bestehend aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolid-Acetat) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP-A-133.988).
Während Polymere, wie z. B. Ethylen-Vinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die Freisetzung von Molekülen für über 100 Tage erlauben, setzen bestimmte Hydrogele Proteine in kürzeren Zeiträumen frei. Wenn eingekapselte Proteine lange Zeit im Körper verbleiben, können sie als Folge des Kontakts mit Feuchtigkeit bei 37ºC denaturieren oder aggregieren, was zum Verlust biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führt. Zweckmäßige Strategien können in Abhängigkeit vom beteiligten Mechanismus zur Proteinstabilisierung ausgearbeitet werden. Wenn beispielsweise der Aggregationsmechanismus als intermolekulare Bildung von S-S-Bindung durch Disulfid- Austausch erkannt wird, kann eine Stabilisierung für gewöhnlich durch Modifizierung der Sulfhydryl-Reste, Lyophilisierung aus sauren Lösungen, Kontrolle des Feuchtegehalts, Verwendung geeigneter Zusätze und Entwicklung spezifischer Polymermatrix- Zusammensetzungen erreicht werden.
Retard-Zusammensetzungen von thrombopoetischem Protein umfassen auch in Liposomen eingeschlossenes, megakaryozytopoetisches Protein. Liposomen, die megakaryozytopoetisches Protein enthalten, werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt: DE-A-3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688-3698 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad.. Sci. USA 77, 4030-4034 (1980); EP-A-52.322; EP-A-36.676; EP-A-88.046; EP-A-143.949; EP-A-142.641; die japanische Patentanmeldung 83-118008; die US-A-4.485.045 und 4.544.545, und EP-A-102.324. Für gewöhnlich sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200-800 Angström), unilamellaren Typ, in welchem der Lipidgehalt mehr als etwa 30 Mol-% Cholesterol beträgt, wobei der gewählte Anteil für optimale Therapie mit megakaryozytopoetischem Protein eingestellt wird.
Eine Art der kovalenten Modifizierung von TPO oder mpl-Ligand umfasst das Binden des TPO-Polypeptids an eines von vielen nicht-proteinartigen Polymeren, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, und zwar auf die in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 dargelegte Weise. An die zuvor erwähnten Polymere kovalent gebundene TPO-Polypeptide werden hierin als pegyliertes TPO bezeichnet.
Es ist einzusehen, dass ein gewisses Screening der gewonnenen TPO-Variante notwendig ist, um die optimale Variante zur Bindung an ein mpl und mit der oben definierten immunologischen und/oder biologischen Aktivität zu selektieren. Man kann auf Stabilität in rekombinanter Zellkultur oder Plasma screenen (z. B. gegen proteolytische Spaltung), auf hohe Affinität zu einem mpl-Vertreter, oxidative Stabilität, Fähigkeit zur Sekretion mit erhöhten Ausbeuten und dergleichen. Beispielsweise wird eine Änderung des immunologischen Charakters des TPO-Polypeptids, wie z. B. Affinität zu einem gegebenen Antikörper, durch einen Immuntest der kompetitiven Art gemessen. Andere potentielle Modifizierungen von Protein- oder Polypeptideigenschaften, wie z. B. Redox- oder thermische Stabilität, Hydrophobizität oder Empfindlichkeit gegen proteolytische Spaltung, werden durch gut fachbekannte Verfahren getestet.
Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung auf alle assoziierten Aspekte und Ausführungsformen abzielt, die in der vorliegend beschriebenen Erfindung eingeschlossen sind. Diese und andere sie betreffende Einzelheiten und die vorliegende Erfindung im Allgemeinen bilden Teile der unten fortgesetzten Offenbarung der vorliegenden Erfindung in ausführlicherer, beschreibender Form.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

Fig. 1 - Durch eine Kombination von γ-Bestrahlung mit 5,0 Gy und Carboplatin (1,2 mg) panzytopenisch gemachten Tieren wurden für 1, 2, 4 oder 8 Tage subkutan 0,1 ug rmTPO (335) injiziert. Bild A zeigt die Blutplättchenreaktion auf die Behandlungsschema, während die Bilder B und C die Erythrozyten- bzw. Leukozytenreaktionen über einen Zeitraum von 28 Tagen darstellen. Die in Bild B dargestellte Legende bezieht sich auf alle drei Bilder.
Fig. 2 - Durch eine Kombination von γ-Bestrahlung mit 5,0 Gy und Carboplatin (1,2 mg) panzytopenisch gemachten Tieren wurde 24 Stunden nach Start des Experiments subkutan eine Einzeldosis verschiedener Niveaus von rmTPO(355) injiziert. Bild A zeigt die Blutplättchenantwort auf die Behandlungsschemata, während die Bilder B und C die Erythrozyten- bzw. Leukozytenreaktionen über einen Zeitraum von 28 Tagen darstellen. Die in Bild B dargestellte Legende bezieht sich auf alle drei Bilder.
Fig. 3 - Log-lineare Darstellungen der Blutplättchen- (Bild A) und Erythrozyten- (Bild B) Antwort auf Einzelverabreichungen von rmTPO(335), entweder subkutan oder intravenös an Tiere verabreicht, welche durch eine Kombination von γ-Bestrahlung mit 5,0 Gy und Carboplatin (1,2 mg) panzytopenisch gemacht wurden. Die graphisch dargestellten Zellanzahlen sind jene, die an Tag 14 nach Start des Experiments gemessen wurden. F ist der Grundlinien-Nullwert.
Fig. 4 - Durch eine Kombination von γ-Bestrahlung mit 5,0 Gy und Carboplatin (1,2 mg) panzytopenisch gemachten Tieren wurde 24 Stunden nach Start des Experiments intravenös eine Einzeldosis verschiedener Niveaus von rmTPO(355) injiziert. Bild A zeigt die Blutplättchenantwort auf die Behandlungsschemata, während die Bilder B und C die Erythrozyten- bzw. Leukozytenreaktionen über einen Zeitraum von 28 Tagen darstellen. Die in Bild B dargestellte Legende bezieht sich auf alle drei Bilder.
Fig. 5 - Durch eine Kombination von γ-Bestrahlung mit 5,0 Gy und Carboplatin (1,2 mg) panzytopenisch gemachten Tieren wurde 24 Stunden nach Start des Experiments subkutan eine Einzeldosis verschiedener Formen von rmTPO(153) injiziert, welches an Polyethylenglykol (peg) mit entweder 20K oder 40K Molekulargewicht konjugiert war. Bild A zeigt die Blutplättchenantwort auf die Behandlungsschemata, während die Bilder B und C die Erythrozyten- bzw. Leukozytenreaktionen über einen Zeitraum von 28 Tagen darstellen. Die in Bild B dargestellte Legende bezieht sich auf alle drei Bilder.
Fig. 6 - Durch eine Kombination von γ-Bestrahlung mit 5,0 Gy und Carboplatin (1,2 mg) panzytopenisch gemachten Tieren wurde 24 Stunden nach Start des Experiments subkutan eine Einzeldosis von entweder rmTPO(355) oder rmTPO(153) injiziert, welche an Polyethylenglykol (peg) mit 40K Molekulargewicht konjugiert waren. Bild A zeigt die Blutplättchenantwort auf die Behandlungsschemata, während die Bilder B und C die Erythrozyten- bzw. Leukozytenreaktionen über einen Zeitraum von 28 Tagen darstellen. Die in Bild B dargestellte Legende bezieht sich auf alle drei Bilder.
Fig. 7 - Durch eine Kombination von γ-Bestrahlung mit 5,0 Gy und Carboplatin (1,2 mg) panzytopenisch gemachten Tieren wurde 24 Stunden nach Start des Experiments intravenös eine Einzeldosis von entweder rmTPO(335) oder rmT rmTPO(153) injiziert, welche an Polyethylenglykol (peg) mit 40K Molekulargewicht konjugiert waren. Bild A zeigt die Blutplättchenantwort auf die Behandlungsschemata, während die Bilder B und C die Erythrozyten- bzw. Leukozytenreaktionen über einen Zeitraum von 28 Tagen darstellen. Die in Bild B dargestellte Legende bezieht sich auf alle drei Bilder.

Ausführliche Beschreibung

Definitionen

"Cytokin" ist ein allgemeiner Begriff für durch eine Zelipopulation freigesetzte Proteine, welche auf eine andere Zelle als intrazelluläre Vermittler agieren. Beispiele für solche Cytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone. Zu den Cytokinen gehören Wachstumshormon, insulinartige Wachstumsfaktoren, Humanwachstumshormon, einschließlich humanes N-Methionyl-Wachstumshormon, Rinderwachstumshormon, Nebenschilddrüsenhormon, Thyroxin, Insulin, Proinsulin, Relaxin, Prorelaxin, Glykoproteinhormone, wie z. B. follikelstimulierendes Hormon (FSH), thyroidstimulierendes Hormon (TSH) und leuteinisierendes Hormon (LH), hämatopoetischer Wachstumsfaktor, hepatischer Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Prolactin, Plazenta-Laktogen, Tumornekrosefaktor (TNF-α und TNF-β), "Mullerian-inhibierende" Substanz, Mäuse-Gonadotropin-assoziiertes Peptid, Inhibin, Activin, Gefäßendothel-Wachstumsfaktor, Integrin, Nervenwachstumsfaktoren, wie z. B. NGF-β, insulinartiger Wachstumsfaktor-I und -II, Erythropoietin (EPO), osteoinduktive Faktoren, Interferone (IFN), wie z. B. Interferon-α, -β und -γ, koloniestimulierende Faktoren (CSFs), wie z. B. Makrophagen-CSF (M-CSF), Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CST) und Granulozyten-CSF (G-CSF), Interleukine (IL's), wie z. B. IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 und andere Polypeptidfaktoren, einschließlich LIF, SCF, FLT-3-Ligand und kit-Ligand (KL). Wie hierin verwendet umfassen die vorangehenden Begriffe Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur. Auf ähnliche Weise umfassen die Begriffe biologisch aktive Äquivalente; z. B. in ihrer Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Aminosäuren verschieden, oder in Art und Ausmaß von Glykosylierung.
"Biologisch aktiv" bedeutet, wenn hierin im Zusammenhang mit Thrombopoietin (TPO) verwendet, Thrombopoietin oder ein thrombopoetisches Polypeptid, welches thrombopoetische Aktivität zeigt oder Anteil an einer Effektorfunktion des mpl-Liganden hat, welches aus aplastischem Schweineplasma isoliert wurde oder in rekombinanter Zellkultur exprimiert wurde. Eine bekannte, hauptsächliche Effektorfunktion von mpl ist die Stimulierung der Inkorporation von markierten Nucleotiden (³H-Thymidin) in die DNA von IL-3-abhängigen, mit humanem mpl-P transfizierten Ba/F3-ZeIlen. Eine weitere bekannte Effektorfunktion von mpl-Ligand oder Polypeptid hierin ist die Fähigkeit zur Stimulierung der Inkorporation von ³&sup5;S in zirkulierende Blutplättchen in Mäuseblutplättchen-Rebound-Test. Noch eine weitere bekannte Effektorfunktion ist die Fähigkeit zur Stimulation von in-vitro-Human-Megakaryozytopoese, welche durch Verwendung eines radioaktiv markierten, gegen Magakaryozyten-Glykoprotein GPIIbIIIa spezifischen, monoklonalen Antikörpers quantifiziert werden kann.
"mpl-Ligand", "mpl-Ligand-Polypeptid", "ML", "Thrombopoietin" oder "TPO" werden hierin austauschbar verwendet und umfassen jegliches Polypeptid, welches die Eigenschaft der Bindung an mpl, ein Mitglied der Cytokinrezeptor-Überfamilie, und eine biologische Eigenschaft von ML besitzt. Eine beispielhafte biologische Eigenschaft ist die Fähigkeit zur Stimulierung der Inkorporation von markierten Nucleotiden (z. B. ³H-Thymidin) in DNA von IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen, die mit humanem mpl transfiziert wurden. Eine weitere beispielhafte biologische Eigenschaft ist die Fähigkeit zur Stimulierung der Inkorporation von ³&sup5;S in zirkulierende Blutplättchen in einem Mäuseblutplättchen-Rebound-Test. Diese Definition umfasst das Polypeptid, isoliert aus einer mpl-Liganden-Quelle, wie z. B. aus hierin beschriebenem, aplastischen Schweineplasma, oder aus einer anderen Quelle, wie z. B. einer anderen Tierspezies, einschließlich Mensch, oder hergestellt durch rekombinante oder synthetische Verfahren und inkludiert Variantenformen, einschließlich deren funktionelle Derivate, Fragmente, Allele, Isoformen und Analoge.
Ein "mpl-Ligand-Fragment" oder "TPO-Fragment" ist ein Teil einer natürlich vorkommenden, reifen mpl-Liganden- oder TPO-Sequenz mit einem oder mehreren deletierten Aminosäureresten oder Kohlenhydraten. Der/die deletierte(n) Aminosäurerest(e) können an beliebiger Stelle im Peptid auftreten, einschließlich intern oder entweder am N-Terminus oder C-Terminus. Das Fragment teilt zumindest eine biologische Eigenschaft mit dem mpl-Liganden. Mpl-Liganden-Fragmente besitzen typischerweise eine zusammenhängende Sequenz von zumindest 10, 15, 20, 25, 30 oder 40 Aminosäureresten, welche mit den Sequenzen des aus einem Säugetier isolierten mpl-Liganden identisch sind, einschließlich des Liganden, der aus- aplastischem Schweineplasma isoliert wurde oder des Human- oder Rattenliganden, insbesondere deren EPO-Domäne. Stellvertretende Beispiele für N-terminale Fragmente sind hML&sub1;&sub5;&sub3; oderTPO(Met&supmin;¹1-153).
"TPO-Varianten", "mpl-Ligand-Varianten" oder "mpl-Ligand-Sequenzvarianten" oder der Begriff "Derivate" in Verbindung mit TPO usw., bedeutet wie hierin definiert ein wie unten definiertes, biologisch aktives Material mit weniger als 100% Sequenzübereinstimmung mit dem mpl-Liganden oder TPO, der aus rekombinanter Zellkultur oder aplastischem Schweineplasma isoliert wurde oder mit dem Human-Liganden. Für gewöhnlich besitzt ein biologisch aktiver mpl-Ligand oder TPO eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 70% Aminosäuresequenzübereinstimmung mit dem mpl-Liganden/TPO, der aus aplastischem Schweineserum isoliert wurde oder reifer Ratten- oder Human-Liganden oder deren Fragmente, vorzugsweise zumindest etwa 75%, bevorzugter zumindest etwa 80%, noch bevorzugter zumindest etwa 85%, sogar noch bevorzugter zumindest etwa 90% und insbesondere bevorzugt zumindest etwa 95%.
Eine "Chimäre" ist ein Polypeptid, umfassend eine Stammsubstanz voller Länge (TPO oder mpl-Ligand) oder ein oder mehrere Fragmente davon, fusioniert oder gebunden an ein zweites, heterologes Polypeptid oder ein oder mehrere Fragmente davon. Chimären haben für gewöhnlich zumindest eine biologische Eigenschaft gemeinsam. Das zweite Polypeptid ist typischerweise ein Cytokin, Immunglobulin oder ein Fragment davon.
"Biologische Eigenschaft" bedeutet, wenn verwendet in Verbindung entweder mit "mpl- Ligand" oder "isolierter mpl-Ligand" oder "TPO", thrombopoetische Aktivität besitzend oder in-vivo-Effektor- oder antigene Funktion oder Aktivität besitzend, welche direkt oder indirekt durch einen mpl-Liganden oder TPO (ob in nativer oder denaturierter Konformation) oder ein Fragment davor verursacht oder verrichtet wird. Effektorfunktionen umfassen mpl-Bindung und jegliche Trägerbindungsaktivität, Agonismus oder Antagonismus von mpl, insbesondere Transduktion eines proliferativen Signals, einschließlich Replikation, DNA-Regulationsfunktion, Modulation der biologischen Aktivität anderer Cytokine, Rezeptor- (insbesondere Cytokin-) Aktivierung, Deaktivierung, Up- oder Down-Regulation, Zellwachstum oder -differenzierung und dergleichen. Eine antigene Funktion bedeutet den Besitz eines Epitops oder einer antigenen Stelle, das/die zur Kreuzreaktion mit Antikörpern fähig ist, welche gegen den nativen mpl-Liganden oder TPO hergestellt wurden. Die hauptsächliche antigene Funktion eines mpl-Liganden- oder TPO-Polypeptids ist, dass es mit einer Affinität von zumindest etwa 10&sup6; l/Mol an einen Antikörper bindet, der gegen mpl-Ligand oder TPO, isoliert aus aplastischem Schweineplasma, hergestellt wurde. Für gewöhnlich bindet das Polypeptid mit einer Affinität von zumindest etwa 10&sup7; l/Mol. Insbesondere bevorzugt ist das als Antigen aktive mpl-Ligand- oder TPO-Polypeptid ein Polypeptid, welches an einen Antikörper gegen den mpl-Liganden oder TPO bindet, welcher eine der oben beschriebenen Effektorfunktionen besitzt. Die zur Definition von "biologischer Aktivität" verwendeten Antikörper sind polyklonale Kaninchenantikörper, gewonnen durch Herstellen einer Rezeptur aus mpl-Ligand oder TPO, isoliert aus rekombinanter Zellkultur oder aplastischem Schweineplasma, und Freunds komplettem Adjuvans, subkutaner Injektion der Rezeptur und soosting der Immunantwort durch inträperitoneale Injektion der Rezeptur, bis der mpl- Liganden- oder TPO-Antikörpertiter das Plateau erreicht.
Der Begriff "pegylierte TPO-Polypeptide" - oder grammatikalische Variationen - davon bedeutet ein TPO-Polypeptid, welches kovalent modifiziert worden ist, und zwar durch Verknüpfung des Polypeptids mit einem aus einer Vielzahl von nicht-proteinartigen Polymeren, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen, wie oben erwähnt wurde.
Für den Menschen wird "Thrombopenie" als Zustand definiert, worin die Blutplättchenanzahl unter etwa 150 · 10&sup9; pro Liter Blut liegt.
"Thrombopoetische Aktivität" wird definiert als biologische Aktivität, bestehend aus Beschleunigung der Proliferation, Differenzierung und/oder Reifung von Megakaryozyten oder Megakaryozyten-Vorläufern zur blutplättchenbildenden Form dieser Zellen. Diese Aktivität kann mit verschiedenen Tests gemessen werden, einschließlich einem Test der in-vivo-Mäuseblutplättchen-Rebound-Synthese, Blutplättchen-Oberflächenantigen-Induktions-Test, wie gemessen durch einen Anti-Blutplättchen-Immuntest (Anti-GPIIbIIIa) für eine Humanleukämie-Megakaryoblasten-Zelllinie (CMK), und Induktion von Polyploidisierung in einer Megakaryoblasten-Zelllinie (DAMI).
"Thrombopoietin" (TPO) wird definiert als Verbindung mit thrombopoetischer Aktivität oder mit der Fähigkeit zur Steigerung der endogenen Blutplättchenanzahl um zumindest 10%, bevorzugter um 50%, besonders bevorzugt mit der Fähigkeit zur Erhöhung der Blutplättchenanzahl beim Menschen um mehr als etwa 150 · 10&sup9; pro Liter Blut. Es wird auch auf andere für TPO vorhandene Namen in der Literatur verwiesen, wie oben durch Verweis auf Literatur sowie auch auf zitierte Patentanmeldungen diskutiert wurde.
Das "mpl-Ligand"-Polypeptid oder "TPO" dieser Erfindung besitzt vorzugsweise zumindest 70% Gesamt-Sequenzübereinstimmung mit der Aminosäuresequenz des hochgereinigten, im Wesentlichen homogenen Schweine-mpl-Liganden-Polypeptids und zumindest 80% Sequenzübereinstimmung mit der "EPO-Domäne" des Schweine-mpl-Liganden-Polypeptids. Optional ist der mpl-Ligand (TPO) dieser Erfindung der reife Human- mpl-Ligand (hML) oder eine Variante oder post-transkriptionell modifizierte Form davon, oder ein Protein mit etwa 80% Sequenzübereinstimmung mit dem reifen Human- mpl-Liganden. Optional ist die mpl-Liganden-Variante ein Fragment, insbesondere ein Aminoterminus- oder "EPO-Domänen"-Fragment des reifen Human-mpl-Liganden (hML). Vorzugsweise behält das Aminoterminus-Fragment im Wesentlichen die gesamte Human-mpl-Sequenz zwischen dem ersten und vierten Cystein-Rest bei, kann aber wesentliche Additionen, Deletionen oder Substitutionen außerhalb dieser Region enthalten. Gemäß dieser Ausführungsform kann das Fragment-Polypeptid durch folgende Formel dargestellt werden:
X-hTPO(7-151)-Y
worin hTPO(7-151) die humane TPO- (hML-) Aminosäuresequenz von Cys&sup7; bis einschließlich Cys¹&sup5;¹ repräsentiert; X repräsentiert die Aminogruppe von Cys&sup7; oder einen oder mehrere der Aminoterminus-Aminosäurerest(e) des reifen TPO oder von Aminosäurerest-Extensionen daran, wie z. B. Met, Lys, Tyr oder Aminosäuresubstitutionen davon, wie z. B. Arginin oder Lysin, oder Leitsequenzen, die beispielsweise proteolytische Spaltungsstellen enthalten (z. B. Faktor Xa oder Thrombin); und Y repräsentiert die carboxyterminale Gruppe von Cys¹&sup5;¹ oder einen oder mehrere Carboxyterminus-Aminosäurerest(e) des reifen TPO oder von Extensionen daran.

Herstellungsverfahren

Isolierung des Human-mpl-Liganden- (TPO-) Gens

Humangenom-DNA-Klone des TPO-Gens wurden durch Screening einer Humangenom- Bibliothek in λ-Gem12 mit pR45 isoliert, und zwar unter wenig rauen oder sehr rauen Bedingungen mit einem der 3'-Hälfte humaner cDNA entsprechenden Fragment, welches für den mpl-Liganden kodiert. Zwei überlappende, sich über 35 kb erstreckende Lamda-Klone wurden isoliert. Zwei überlappende, das gesamte TPO-Gen enthaltende Fragmente (BamH1 und EcoRI) wurden subkloniert und sequenziert.
Die Struktur des Human-Gens besteht aus 6 Exons innerhalb 7 kb genomischer DNA. Die Grenzen aller Exon/Intron-Verbindungen stehen im Einklang mit dem Konsens-Motiv, welches für Säugetier-Gene ermittelt wurde (M. B. Shapiro et al., Nucl. Acids. Res. 15, 7155 (1987)). Exon 1 und Exon 2 enthalten untranslatierte 5'-Sequenzen und die vier Anfangsaminosäuren des Signalpeptids. Der Rest des sekretorischen Signals und die ersten 26 Aminosäuren des reifen Proteins werden innerhalb von Exon 3 kodiert. Die gesamte Carboxyldomäne und untranslatierte 3'- sowie 50 Aminosäuren der erythropoietinartigen Domäne werden innerhalb von Exon 6 kodiert. Die vier an der beobachteten Deletion innerhalb hML-2 (hTPO-2) beteiligten Aminosäuren werden am 5'-Ende von Exon 6 kodiert.
Die Analyse von Humangenom-DNA durch Southern-Blotting wies darauf hin, dass das Gen für TPO als Einzelkopie vorhanden ist. Die chromosomale Lokalisierung des Gens wurde durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) bestimmt, und es befand sich auf Chromosom 3q27-28.

Expression und Reinigung von TPO aus 293-Zellen

Die Präparierung und Reinigung von ML oder TPO aus 293-Zellen wird in Beispiel 1 ausführlich beschrieben. Kurz gefasst wurde die dem gesamten offenen Leseraster entsprechende cDNA durch PCR unter Verwendung von pRK5-hmpl I erhalten. Das PCR- Produkt wurde gereinigt und zwischen die Restriktionsstellen ClaI und XbaI des Plasmids pRK5tkneo.ORF (ein für das gesamte offene Leseraster kodierender Vektor) kloniert.
Ein zweiter, für die EPO-homologe Domäne kodierender Vektor wurde auf dieselbe Weise, jedoch unter Verwendung anderer PCR-Primer erzeugt, um das fertige Konstrukt, pRK-tkneoEPO-D genannt, zu erhalten.
Diese beiden Konstrukte wurden durch das CaPO&sub4;-Verfahren in Human-Embryo-Nierenzellen transfiziert, und es wurden Neomycin-resistente Klone selektiert und bis zur Konfluenz kultiviert. Expressionen von ML&sub1;&sub5;&sub3; oder ML&sub3;&sub3;&sub2; in konditionierten Medien dieser Klone wurden unter Verwendung des Ba/F3-mpl-Proliferationstests ermittelt.
Die Reinigung von rhML&sub3;&sub3;&sub2; wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Kurz gefasst wurden 293-rhML&sub3;&sub3;&sub2;-konditionierte Medien auf eine Blue-Sepharose- (Pharmacia) Säule aufgegeben, die anschließend mit einem 2 M Harnstoff enthaltenden Puffer gewaschen wurde. Die Säule wurde mit einem Puffer eluiert, der 2 M Harnstoff und 1 M NaCl enthielt. Die vereinigten Blue-Sepharose-Eluate wurden dann direkt auf eine WGA-Sepharose-Säule aufgegeben, mit 10 Säulenvolumina Puffer gewaschen, der 2 M Harnstoff und 1 M NaCl enthielt, und mit demselben Puffer, der 0,5 M N Acetyl-D-glucosamin enthielt, eluiert. Das WGA-Sepharose-Eluat wurde auf eine C4-HPLC-Säule (Synchrom, Inc.) aufgegeben und mit einem diskontinuierlichen Propanolgradienten eluiert. In der SDS-PAGE wandert das gereinigte 293-fhML&sub3;&sub3;&sub2; als eine breite Bande im 68- 80 kDa-Bereich des Gels.
Die Reinigung von rhML&sub1;&sub5;&sub3; wurde ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Kurz gefasst wurden 293-rhML&sub1;&sub5;&sub3;-konditionierte Medien wie für rhML&sub3;&sub3;&sub2; beschrieben auf Blue-Sepharose getrennt. Das Blue-Sepharose-Eluat wurde wie oben beschrieben direkt auf eine mpl-Affinitätssäule aufgegeben. Aus der mpl-Affinitätssäule eluiertes RhML&sub1;&sub5;&sub3; wurde unter Verwendung einer C4-HPLC-Säule bis zur Homogenität gereinigt, die unter denselben Bedingungen wie für rhML&sub3;&sub3;&sub2; betrieben wurde. In der SDS-PAGE trennt sich gereinigtes rhML&sub1;&sub5;&sub3; in 20 Haupt- und 2 Nebenbanden mit Molekulargewichten (Mr) von ~18000-22000.

Expression und Reinigung von TPO aus China-Hamster-Eierstock- (CHO-) Zellen

Zur Transfektion von CHO-Zellen eingesetzte Expressionsvektoren werden wie folgt bezeichnet: pSVI5.ID.LL.MLORF (gesamte Länge von TPO&sub3;&sub3;&sub2;) und pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (trunkiert oder TPO&sub1;&sub5;&sub3;).
Dem gesamten offenen Leseraster von TPO entsprechende cDNA wurde mittels PCR erhalten. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und zwischen zwei Restriktionsstellen (CalI und SalI) des Plasmids pSVI5.ID.LL kloniert, um den Vektor pSVI5.ID.LL.MLORF zu erhalten. Ein zweites Konstrukt, das der EPO-homologen Domäne entspricht, wurde auf dieselbe Weise erzeugt, jedoch unter Verwendung eines anderen, reversen Primers (EPOD.Sal). Das fertige Konstrukt für den Vektor, der für die EPO-homologe Domäne von TPO kodiert, wird pSVI5.ID.LL.MLEPO-D genannt.
Diese beiden Konstrukte wurden mit NotI linearisiert und in China-Hamster-Eierstockzellen (CHO-DP12-Zellen, EP-A-307.247, veröffentlicht am 15. Mai 1989) durch Elektroporation transfiziert. 10&sup7; Zellen wurden in einem BRL-Elektroporationsgerät (350 Volt, 330 mF, niedrige Kapazität) in Gegenwart von 10, 25 oder 50 mg DNA wie beschrieben elektroporiert (G. L. Andreason, J. Tissue Cult. Meth. 15, 56 (1993)). Am Tag nach der Transfektion wurden die Zellen in DHFR-selektivem Medium getrennt (High- Glucose DMEM-12 50 : 50 ohne Glycin, 2 mM Glutamin, 2-5% dialysiertes fötales Kälberserum). 10 bis 15 Tage später wurden die einzelnen Kolonien in 96-Napf-Platten übertragen und bis zur Konfluenz kultiviert. Die Expression von ML&sub1;&sub5;&sub3; und ML&sub3;&sub3;&sub2; in konditionierten Medien dieser Klone wurden unter Verwendung des Ba/F3-mpl-Proliferationstests ermittelt.
Das Verfahren zur Reinigung und Isolierung von TPO aus gesammeltem CHO-Zellüberstand wird in Beispiel 2 beschrieben. Kurz gefasst wird gesammelter CHO-Zellüberstand (HCCF) im Verhältnis von etwa 100 l HCCF pro Liter Harz auf eine Blue-Sepharose- (Pharmacia) Säule aufgegeben. Die Säule wird dann mit 3 bis 5 Säulenvolumina Puffer gewaschen, gefolgt von 3 bis 5 Säulenvolumina eines 2,0 M Harnstoff enthaltenden Puffers. TPO wird dann mit 3 bis 5 Säulenvolumina Puffer eluiert, der sowohl 2,0 M Harnstoff, als auch 1,0 M NaCl enthält.
Der TPO enthaltende Blue-Sepharose-Eluat-Pool wird dann auf eine Wheat-Germ-Lectin-Sepharose-Säule (Pharmacia), äquilibriert im Blue-Sepharose-Elutionspuffer, in einem Verhältnis von 8 bis 16 ml Blue-Sepharose-Eluat pro ml Harz aufgegeben. Die Säule wird dann mit 2 bis 3 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen. TPO wird dann mit 2 bis 5 Säulenvolumina eines Puffers eluiert, der 2,0 M Harnstoff und 0,5 M N-Acetyl-D-glucosamin enthält.
Das TPO enthaltende Wheat-Germ-Lectin-Eluat wird dann angesäuert und mit C&sub1;&sub2;E&sub8; in einer Endkonzentration von 0,04% versetzt. Der erhaltene Pool wird auf eine in 0,1% TFA/0,04%-C&sub1;&sub2;E&sub8; äquilibrierte C4-Umkehrphasensäule mit einer Beladung von etwa 0,2 bis 0,5 mg Protein pro ml Harz aufgegeben.
Das Protein wird mit einem zweiphasigen, linearen Gradienten von Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA und 0,04% C&sub1;&sub2;E&sub8;, eluiert und auf Basis von SDS-PAGE gepoolt.
Der C4-Pool wird dann verdünnt und gegen etwa 6 Volumina Puffer an einer Amicon- YM- oder ähnlichen Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichts-Cut-Off von 10.000 bis 30.000 Dalton diafiltriert. Das erhalten Diafiltrat kann dann direkt weiterverarbeitet oder durch Ultrafiltration weiter konzentriert werden. Das Diafiltrat/Konzentrat wird für gewöhnlich auf eine Konzentration von 0,01% Tween-80 eingestellt.
Die Gesamtmenge oder ein Teil des Diafiltrats/Konzentrats, entsprechend 2 bis 5% des berechneten Säulenvolumens, wird dann auf eine Sephacryl S-300 HR-Säule (Pharmacia), äquilibriert in einem 0,01% Tween-80 enthaltenden Puffer, aufgetragen und chromatographiert. Die TPO enthaltenden Fraktionen, welche frei von aggregierten und proteolytischen Abbauprodukten sind, werden dann basierend auf SDS-PAGE gepoolt. Der erhaltende Pool wird filtriert und bei 2-8ºC aufbewahrt.

Verfahren zur Transformation und Induktion von TPO-Synthese in einem Mikroorganismus und Isolierung, Reinigung und Neufaltung von darin hergestelltem TPO

Die Konstruktion von TPO-Expressionsvektoren von E. coli wird in Bespiel 3 ausführlich beschrieben. Kurz gefasst wurden die Plasmide pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 und pMP202 alle dahingehend entworfen, die ersten 153 Aminosäuren von TPO, stromab eines kleinen Leaders, welcher unter den verschiedenen Konstrukten variiert, zu exprimieren. Die Leader sorgen in erster Linie für High-Level-Translationsinitiation und schnelle Reinigung. Die Plasmide pMP210-1, -T8, -21, -22, -24, -25 sind entworfen, um die ersten 153 Aminosäuren von TPO stromab eines Initiations-Methionins zu exprimieren und unterscheiden sich nur in der Codon-Nutzung für die ersten 6 TPO-Aminosäuren, während das Plasmid pMP251 ein Derivat von pMP210-1 ist, in dem das carboxyterminale Ende von TPO um zwei Aminosäuren verlängert ist. Alle obigen Plasmide erzeugen intrazelluläre High-Level-Expression von TPO in E. coli bei Induktion des Tryptophan-Promotors (D. G. Yansure et al., Methods in Enzymology 185, 54-60, D. V. Goeddel (Hrsg.), Academic Press, San Diego (1990)). Die Plasmide pMP1 und pMP172 sind Zwischenprodukte bei der Konstruktion der obigen, intrazellulären TPO-Expressionsplasmide.
Die obigen TPO-Expressionsplasmide wurden verwendet, um E. coli unter Verwendung des CaCl&sub2;-Hitzeschockverfahrens (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970)) und anderer in Beispiel 3 beschriebener Verfahren zu transformieren. Kurz gefasst wurden die transformierten Zellen zuerst bei 37ºC kultiviert, bis die optische Dichte (600 nm) der Kulturen etwa 2-3 erreichte. Die Kultur wurde dann verdünnt und es wurde, nach Vermehrung unter Belüftung, Säure zugesetzt. Die Kultur wurde dann für weitere 15 Stunden unter Belüftung weiterkultiviert und die Zellen nach dieser Zeitdauer durch Zentrifugation geerntet.
Die unter angegebenen Isolierungs-, Reinigungs- und Neufaltungsverfahren zur Herstellung von biologisch aktivem, neugefaltetem TPO oder Fragmenten davon werden in Beispiel 4 beschrieben und können zur Wiedergewinnung jeglicher TPO-Varianten, einschließlich N- und C-terminal verlängerter Formen, angewendet werden. Andere geeignete Verfahren zur Neufaltung von rekombinantem oder synthetischem TPO finden sich in folgenden Patenten: Builder et al. US-A-4.511.502; Jones et al., US-A-4.512.922; Olson, US-A-4.518.526 und Builder et al., US-A-4.620.948; für eine allgemeine Beschreibung des Gewinnungs- und Neufaltungsverfahrens für eine Reihe von rekombinanten, in unlöslicher Form in E. coli exprimierten Proteinen.

Verfahren zur Messung thrombopoetischer Aktivität

Thrombopoetische Aktivität kann in verschiedenen Tests, einschließlich des Ba/F3-mpl- Liganden-Tests, gemessen werden. Ein Test der in-vivo-Mäuse-Blutplättchen-Rebound- Synthese, Blutplättchen-Oberflächenantigene-Induktions-Test, wie gemessen durch einen Anti-Blutplättchen-Immuntest (Anti-GPIIbIIIa) für eine Humanleukämie-Megakaryoblasten-Zelllinie (CMK) (siehe Sato et al., Brit.). Heamatol. 72, 184-190 (1989)) und Induktion von Polyploidisierung in einer Megakaryoblasten-Zelllinie (DAMI) (siehe Ogura et al., Blood 72(1), 49-60 (1988)). Reifung von Megakaryozyten aus unreifen, größtenteils nicht-DNA-synthetisierenden Zellen, zu morphologisch identifizierbaren Megakaryozyten geht mit einem Verfahren einher, welches Auftreten cytoplasmatischer Organellen, Erfassung von Membranantigenen (GPIIbIIIa), Endoreplikation und Freisetzung von Blutplättchen, wie als Hintergrund der Erfindung beschrieben, umfasst. Von einem abstammungsspezifischen Promotor (z. B. der mpl-Ligand) der Megakaryozytenreifung kann erwartet werden, dass er zumindest einige dieser Veränderungen in unreifen Megakaryozyten induziert und zur Blutplättchenfreisetzung und Linderung von Thrombopenie führt. Folglich wurden Tests entworfen, um das Auftauchen dieser Parameter in unreifen Megakaryozyten-Zelllinien, d. h. CMK- und DAMI-Zellen, zu messen. Der CMK-Test misst das Auftreten eines spezifischen Blutplättchen-Markers, GPIIbIIIa, und Blutplättchen-"Shedding". Der DAMI-Test misst Endoreplikation, da Anstiege in der Ploidie kennzeichnend für reife Megakaryozyten sind. Erkennbare Megakaryozyten besitzen Ploidie-Werte von 2 N, 4 N, 8 N, 16 N, 32 N usw. Schließlich ist der in-vivo-Mäuseblutplättchen-Rebound-Test zweckdienlich, um zu zeigen, dass die Verabreichung der Testverbindung (hier der mpl-Ligand) zum Anstieg der Blutplättchenzahlen führt.
Zwei zusätzliche in-vitro-Tests sind zur Messung von TPO-Aktivität entwickelt worden. Der erste ist ein Kinase-Rezeptor-Aktivierungs- (KIRA-) ELISA, in welchem CHO-Zellen mit einer mpl-Rse-Chimäre transfiziert werden und die Tyrosinphosphorylierung von Rse nach Aussetzen des mpl-Teils der Chimäre durch ELISA gemessen wird. Der zweite ist ein Rezeptor-basierender ELISA, in dem ELISA-Platten-beschichtetes Kaninchen-Anti- Human-IgG Human-Chimäres-Rezeptor-mpl-IgG einfängt, welches den analysierten mpl-Liganden bindet. Ein biotinylierter, polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen mpl- Ligand (TPO&sub1;&sub5;&sub5;) wird verwendet, um gebundenen mpl-Liganden zu detektieren, welcher unter Verwendung von Streptavidin-Peroxidase gemessen wird.

Therapeutische Verwendung von Thrombopoietin-Stoffen

Das biologisch aktive thrombopoetische Protein (TPO) kann in einem sterilen pharmazeutischen Präparat (oder Rezeptur) verwendet werden, um megakaryozytopoetische oder thrombopoetische Aktivität in Patienten zu stimulieren, die an Thrombopenie aufgrund verminderter Produktion, Sequestrierung oder erhöhter Zerstörung von Blutplättchen leiden. Thrombopenie-assoziierte Knochenmark-Hypoplasie (z. B. aplastische Anämie im Anschluss an Chemotherapie oder Knochenmarktransplantation) kann mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung effektiv behandelt werden, sowie Störungen, wie z. B. disseminierte intravaskuläre Gerinnung (DIC), Immunthrombopenie (einschließlich HIV-induzierte ITP und nicht-HIV-induzierte ITP), chronische idiopathische Thrombopenie, angeborene Thrombopenie, Myelodisplasie und thrombotische Thrombopenie. Zusätzlich können diese megakaryozytopoetischen Proteine zur Behandlung myeloproliferativer, thrombozythämischer Krankheiten sowie Thrombozythämie von Entzündungen und bei Eisenmangel zweckdienlich sein.
Bevorzugte Anwendungen des thrombozytopoetischen Proteins (TPO) dieser Erfindung sind in der myelotoxischen Chemotherapie zur Behandlung von Leukämie oder festen Tumoren, myeloablativen Chemotherapie für autologe oder allogene Knochenmarkstransplantation, Myelodysplasie, idiopathische aplastische Anämie, angeborene Thrombopenie und Immunthrombopenie.
Weitere vorteilhaft mit den Thrombopoietin-Proteinen dieser Erfindung behandelte Störungen umfassen Defekte oder Schädigungen an Blutplättchen aufgrund von Medikamenten, Vergiftung oder Aktivierung an künstlichen Oberflächen. In diesen Fällen könnten die erfindungsgemäßen Verbindungen angewendet werden, um "Shedding" oder neue "unversehrte" Blutplättchen zu stimulieren.

BEISPIELE

Beispiel 1

Expression und Reinigung von TPO aus 293-Zellen

Herstellung von 293-Zellen-Expressionsvektoren

Eine dem gesamten offenen Leseraster von TPO entsprechende cDNA wurde durch PCR unter Verwendung folgender Oligonucleotide als Primer erhalten:
prk5-HmplI wurde als Tempfat für die Reaktion in Gegenwart von pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) verwendet. Die anfängliche Denaturierung dauerte 7 min bei 94ºC, gefolgt von 25 Amplifikationszyklen (1 min bei 94ºC, 1 min bei 55ºC und 1 min bei 72ºC). Die letzte Extension dauerte 15 min bei 72ºC. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und zwischen den Restriktionsstellen CalI und XbaI des Plasmids pRKtkneo kloniert, einem pRK5-hergeleiteten Vektor, modifiziert zur Expression eines Neomycin-Resistenzgens unter Kontrolle des Thymidin-Kinase-Promotors, um den Vektor pRK5tkneo.ORF zu erhalten. Ein zweites, der epo-homologen Domäne entsprechendes Konstrukt wurde gleichermaßen erzeugt, jedoch unter Verwendung von Cla.FL.F als Forward-Primer und des folgenden Reverse-Primers:
Das fertige Konstrukt wird pRK5-tkneoEPO-D genannt. Die Sequenz beider Konstrukte wurde verifiziert.

Transfektion von Human-Embryo-Nierenzellen

Diese beiden Konstrukte wurden durch das CaPO&sub4;-Verfahren in humane embryonale Nierenzellen transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurde die Selektion Neomycinresistenter Klone in Gegenwart von 0,4 mg/ml G418 gestartet. 10 bis 15 Tage später wurden einzelne Kolonien in 96-Napf-Platten transferiert und bis zur Konfluenz kultiviert. Expression von ML&sub1;&sub5;&sub3; und ML&sub3;&sub3;&sub2; (TPO&sub1;&sub5;&sub3; und TPO&sub3;&sub3;&sub2;) in konditionierten Medien dieser Klone wurden mittels Ba/F3-mpl-Proliferationstest ermittelt.

Reinigung von rhML&sub3;&sub3;&sub2;

392-rhML&sub3;&sub3;&sub2;-konditionierte Medien wurden auf eine Blue-Sepharose- (Pharmacia) Säule aufgegeben, die mit 10 mM Natriumphosphat pH 7,4 (Puffer A) äquilibriert war. Die Säule wurde anschließend mit je 10 Säulenvolumina Puffer an und Puffer A mit 2 M Harnstoff gewaschen. Die Säule wurde dann mit Puffer A, der 2 M Harnstoff und 1 M NaCl enthielt, eluiert. Der Blue-Sepharose-Elutionspool wurde dann direkt auf eine mit Puffer A äquilibrierte WGA-Sepharose-Säule aufgegeben. Die WGA-Sepharose-Säule wurde dann mit 10 Säulenvolumina Puffer A, der 2 M Harnstoff und 1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit demselben Puffer, der 0,5 M M-Acetyl-D-glucosamin enthielt, eluiert. Das WGA-Sepharose-Eluat wurde auf eine in 0,1% TFA äquilibrierte C4-HPLC-Säule (Synchrom, Inc.) aufgegeben. Die C4-HPLC-Säule wurde mit einem diskontinuierlichen Propanolgradienten (0-25%, 25-35%, 35-70%) eluiert. rhML&sub3;&sub3;&sub2; eluierte im Propanolbereich von 28-30% des Gradienten. In der SDS-Elektrophorese wanderte das gereinigte rhML&sub3;&sub3;&sub2; als breite Bande im 68-8-kDa-Bereich des Gels.

Reinigung von rhML&sub1;&sub5;&sub3;

392-rhML&sub1;&sub5;&sub3;-konditionierte Medien wurden, wie für rhML&sub3;&sub3;&sub2; beschrieben, auf Blue-Sepharose getrennt. Das Blue-Sepharose-Eluat wurde, wie oben beschrieben, direkt auf eine mpl-Affinitätssäule aufgegeben. Aus der mpl-Affinitätssäule eluiertes rhML&sub1;&sub5;&sub3; wurde unter Verwendung einer C4-HPLC-Säule, die unter denselben Bedingungen wie für rhML&sub3;&sub3;&sub2; beschrieben bis zur Homogenität gereinigt. In der SDS-PAGE wurde gereinigtes rhML&sub1;&sub5;&sub3; in 2 Hauptbanden und 2 Nebenbanden mit Molekulargewichten (Mr) von etwa 18000-21000 getrennt.

Beispiel 2

Expression und Reinigung von TPO aus CHO

1. Beschreibung der CHO-Expressionsvektoren

Die in den unten beschriebenen Elektroporations-Vorschriften verwendeten Expressionsvektoren wurden wie folgt bezeichnet:
pSVI5.ID.LL.MLORF (gesamte Länge oder TPO&sub3;&sub3;&sub2;) und
pSV15.ID.LL.MLEPO-D (trunkiert oder hTPO&sub1;&sub5;&sub3;).

2. Herstellung der CHO-Expressionsvektoren

Eine dem gesamten offenen Leseraster von hTPO entsprechende cDNA wurde durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotidprimer der folgenden Tabelle erhalten. CHO-Expressionsvektor-PCR-Primer
PRKS-hmplI wurde als Templat für die Reaktion in Gegenwart von pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) verwendet. Die anfängliche Denaturierung dauerte 7 min bei 94ºC, gefolgt von 25 Amplifikationszyklen (1 min bei 94ºC, 1 min bei 55ºC und 1 min bei 72ºC). Die letzte Extension dauerte 15 min bei 72ºC. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und zwischen den Restriktionsstellen ClaI und SalI des Plasmids pSVI5.ID.LL kloniert, um den Vektor pSVI5.ID.LL.MLORF zu erhalten. Ein zweites, der EPO-homologen Domäne entsprechendes Konstrukt wurde auf dieselbe Weise erzeugt, jedoch unter Verwendung von CIa.FL.F2 als Forward-Primer und dem folgenden Reverse-Primer:
Das fertige Konstrukt wird pSVI5.ID.LL.MLEPO-D genannt. Die Sequenz beider Konstrukte wurde verifiziert.
Im Wesentlichen wurden die kodierenden Sequenzen für die gesamte Länge des Liganden und den trunkierten Liganden in die Mehrfachklonierungsstelle des Expressionsvektors pSVI5.ID.LL eingeführt. Dieser Vektor enthält die frühe SV40-Promotor/Enhancer- Region, eine modifizierte, die Mäuse-DHFR-cDNA enthaltende Spleißeinheit, eine Mehrfachklonierungsstelle für die Einführung des Gens von Interesse (in diesem Fall die beschriebenen TPO-Sequenzen), SV40-Polyadenylierungssignal und -Replikationsursprung und das Beta-Lactamase-Gen für Plasmidselektion und Amplifikation in Bakterien.

3. Verfahren zur Etablierung stabiler CHO-Zelllinien, die rekombinantes, humanes TPO&sub3;&sub3;&sub2; und TPO&sub1;&sub5;&sub3; exprimieren

a. Beschreibung der CHO-Stammzelllinie

Die zur Expression der hierin beschriebenen TPO-Moleküle verwendete Wirts-CHO- (China-Hamster-Eierstock-) Zelllinie ist als CHO-DP12 bekannt (siehe EP-A-307.247, veröffentlicht am 15 März 1989). Diese Säugetier-Zelllinie wurde durch Klonierung aus einer Transfektion der Stammlinie (CHO-K1 DUX-B11(DHFR-)-, erhalten von Dr. Frank Lee von der Stanford University mit Genehmigung von Dr. L. Chasin) selektiert, und zwar mit einem Proinsulin exprimierenden Vektor, um Klone mit herabgesetztem Insulinbedarf zu erhalten. Diese Zellen sind auch DHFR-negativ, und die Klone können durch Kultivierung auf Medium frei von Nucleosid-Zusätzen (Glycin, Hypoxanthin und Thymidin) auf die Anwesenheit von DHFR-cDNA-Vektor-Sequenzen selektiert werden. Dieses Selektionssystem zur stabilen Expression von CHO-Zelllinien wird häufig verwendet.

b. Transfektionsverfahren (Elektroporation)

TPO332- und TPO153-exprimierende Zelllinien wurden durch Transfizieren von DP12- Zellen über Elektroporation (siehe z. B. G. L. Andreason, J. Tiss. Cult. Meth. 15, 56 (1993)) mit linearisierten pSVI5.ID.LL.MLORF- bzw. pSV15.ID.LL.MLEPO-D-Plasmiden erzeugt. Drei (3) Restriktionsenzym-Reaktionsmischungen wurden für jede Plasmidspaltung angesetzt; 10 ug, 25 ug und 50 ug des Vektors mit dem Enzym NOTI durch standardmäßige, molekularbiologische Verfahren. Diese Restriktionsstelle findet sich nur einmal im Vektor in der Linearisierungsregion 3' und außerhalb der TPO-Liganden- Transkriptionseinheiten (siehe Fig. 23). Die 100 ul-Reaktionen wurden zur Inkubation über Nacht bei 37 Grad angesetzt. Am nächsten Tag wurden die Mischungen ein Maf mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (50 : 49 : 1) extrahiert und auf Trockeneis für etwa eine Stunde in Ethanol gefällt. Der Niederschlag wurde dann durch 15-minütige Mikrozentrifugation gesammelt und getrocknet. Die linearisierte DNA wurde in 50 ul Ham's DMEM-F12 1 : 1-Medium, ergänzt mit Standardantibiotika und 2 mM Glutamin, resuspendiert.
In Suspension wachsende DP12-Zellen wurden gesammelt, einmal im für die Resuspendierung der DNA beschriebenen Medium gewaschen und zum Schluss im selben Medium in einer Konzentration von 10&sup7; Zellen pro 750 ul resuspendiert. Aliquoten von Zellen (750 ul) und jeder Mischung linearisierter DNA wurden gemeinsam bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert und dann in eine BRL-Elektroporationskammer transferiert. Jede Reaktionsmischung wurde dann in einem standardmäßigen Elektroporationsgerät bei 350 V, eingestellt auf 330 uF und niedrige Kapazität, elektroporiert. Nach der Elektroporation wurden die Zellen für 5 Minuten im Gerät belassen und dann für eine weitere 10-minütige Inkubationsperiode auf Trockeneis gegeben. Die elektroporierten Zellen wurden in 60 mm-Zellkulturplatten transferiert, die 5 ml standardmäßiges, komplettes Kultivierungsmedium für CHO-Zellen enthielten (High-Glucose-DMEM-F1 2 50 : 50 ohne Glycin, ergänzt mit 1 · GHT, 2 mM Glutamin und 5% fötales Kälberserum), und über Nacht in einem Zellkulturinkubator mit 5% CO&sub2; kultiviert.

c. Selektions- und Screeningverfahren

Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Standardverfahren von den Platten trypsinisiert und in 150 mm-Gewebekulturplatten transferiert, die selektives DHFR-Medium enthielten (Ham's DMEM-F12, 1 : 1-Medium, oben beschrieben, ergänzt mit entweder 2%, oder 5% dialysiertem Fetalkälberserum, jedoch frei von Glycin, Hypoxanthin und Thymidin; dies ist das von uns verwendete, standardmäßige DHFR-Selektionsmedium). Zellen aus jeder 60 mm-Platte wurden anschließend in 5/150 mm-Platten neu ausplattiert. Die Zellen wurden dann für 10 bis 15 Tage (mit einem Mediumswechsel) bei 37ºC/ 15% CO&sub2; inkubiert, bis Klone sichtbar wurden und Größen erreichten, die dem Transfer in 96-Napf-Platten zugänglich waren. Über einen Zeitraum von 4-5 Tagen wurden Zelllinien unter Verwendung von sterilen, gelben Spitzen an einem auf 50 ml eingestellten Pipettman in 96-Napf-Platten transferiert. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz kultiviert (für gewöhnlich 3-5 Tage), und dann wurden die Schalen trypsinisiert und 2 Kopien der ursprünglichen Schale erzeugt. Zwei dieser Kopien wurden kurzzeitig in einem Tiefkühlschrank gelagert, wobei Zellen in jedem Napf in 50 ul pf 10% FCS in DMSO verdünnt waren. Für 5 Tage konditionierte, serumfreie Mediumproben aus konfluenten Näpfen in der dritten Schale wurden über den Ba/F-Zellen-basierten Aktivitätstest auf TPO-Expression getestet. Die basierend auf diesem Test am stärksten exprimierenden Klone wurden aus der Lagerhaltung wiederbelebt und zum Transfer zur Zellkulturgruppe für Suspensionsadaptierung, Wiederholungstest und Genbank auf 2 konfluente 150 mm-T-Kolben maßstabsvergrößert.

d. Amplifikationsvorschrift

Mehrere der Zelllinien mit höchstem Titer aus der oben beschriebenen Selektion wurden anschließend einer standardmäßigen Methotrexat-Amplifikations-Schema unterzogen, um Klone mit höherem Titer zu erzeugen. CHO-Zellklone werden in 10 cm-Platten in 4 Konzentrationen von Methotrexat (d. h., 50 nM, 100 nM, 200 nM und 400 nM) und zwei oder drei Zellzahlen (10&sup5;, 5 · 10&sup5; und 10&sup6; Zellen pro Platte) expandiert und ausplattiert. Diese Kulturen wurden dann bei 37ºC/5% CO&sub2; inkubiert, bis sich Klone gebildet hatten und dem Transfer auf 96-Napf-Platten für weiteres Testen zugänglich waren. Mehrere Klone dieser Selektion mit hohem Titer wurden wiederum höheren Konzentrationen von Methotrexat (d. h., 600 nM, 800 nM, 1000 nM und 1200 nM) ausgesetzt, und resistente Klone wurden wie zuvor bestimmt und dann auf 96-Napf-Platten transferiert und getestet.

4. Kultivierung von stabilen CHO-Zelllinien, die rekombinantes, humanes TPO&sub3;&sub3;&sub2; und TPO&sub1;&sub5;&sub3; exprimieren

Genbank-Zellen wurden aufgetaut und die Zelipopulation durch standardmäßige Kultivierungsverfahren entweder in serumfreiem oder in serumenthaltenem Medium expandiert. Nach Expansion auf ausreichende Zelldichte wurden die Zellen gewaschen, um verbrauchtes Zellkulturmedium zu entfernen. Die Zellen wurden dann durch beliebige Standardverfahren kultiviert, einschließlich Batch-, Fed-Batch- oder kontinuierlicher Kultur bei 25-40ºC, neutralem pH, mit einem Gehalt an gelöstem Sauerstoff von zumindest 5%, bis das konstitutiv sekretierte TPO akkumuliert war. Der Zellkulturüberstand wurde dann auf mechanische Weise, wie z. B. Zentrifugation, von den Zellen getrennt.

5. Reinigung von rekombinantem Human-TPO aus CHO-Kulturüberständen

Gesammelter Zellkulturüberstand (HCCF) wurde direkt auf eine Blue-Sepharose-6-Fast- Flow-Säule (Pharmacia), äquilibriert in 0,01 M Na-Phosphat pH 7,4, 0,15 M NaCl, in einem Verhältnis von etwa 100 l HCCF pro Liter Harz und bei einer linearen Durchflussrate von etwa 300 ml/Stunde/cm² aufgegeben. Die Säule wurde dann mit 3 bis 5 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen, gefolgt von 3 bis 5 Säulenvolumina 0,01 M Na-Phosphat pH 7,4, 2,0 M Harnstoff. Das TPO wurde dann mit 3 bis 5 Säulenvolumina 0,01 M Na-Phosphat pH 7,4, 2,0 M Harnstoff, 1,0 M NaCl eluiert.
Der TPO enthaltende Blue-Sepharose-Pool wurde dann auf eine Wheat-Germ-Lectin-Sepharose 6MB-Säule (Pharmacia), äquilibriert in 0,01 M Na-Phosphat pH 7,4, 2,0 M Harnstoff und 1,0 M NaCl in einem Verhältnis von 8 bis 16 ml Blue-Sepharose-Pool pro ml Harz mit einer Durchflussrate von etwa 50 ml/Stunde/cm² aufgetragen. Die Säule wurde dann mit 2 bis 3 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen. Das TPO wurde dann mit 2 bis 5 Säulenvolumina 0,01 M Na-Phosphat pH 7,4, 2,0 M Harnstoff, 0,5 M N-Acetyl-D-glucosamin eluiert.
Der Wheat-Germ-Lectin-Pool wurde dann auf eine Endkonzentration von 0,04% C&sub1;&sub2;E&sub8; und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) eingestellt. Der erhaltene Pool wurde auf eine C4- Umkehrphasensäule (Vydac 214TP1022), äquilibriert in 0,1% TFA, 0,04% C&sub1;&sub2;E&sub8; mit einer Beladung von etwa 0,2 bis 0,5 mg Protein pro ml Harz mit einer Durchflussrate von 157 ml/Stunde/cm² aufgegeben.
Das Protein wurde mit einem zweiphasigen, linearen Gradienten von Acetonitril eluiert, der 0,1% TFA, 0,04% C&sub1;&sub2;E&sub8; enthält. Die erste Phase bestand aus einem linearen Gradienten von 0 bis 30% Acetonitril in 15 Minuten, die zweite Phase bestand aus einem linearen Gradienten von 30 bis 60% Acetonitril in 60 Minuten. Das TPO eluierte bei etwa 50% Acetonitril. Auf Basis von SDS-PAGE wurde ein Pool bereitet.
Der C4-Pool wurde dann mit 2 Volumina 0,01 M Na-Phosphat pH 7,4, 0,15 M NaCl verdünnt und gegen etwa 6 Volumina 0,01 M Na-Phosphat pH 7,4, 0,15 M NaCl an einer Amicon-YM oder ähnlichen Ultrafiltrationsmembran mit einem Cut-Off von 10000 bis 30000 kDa Molekulargewicht diafiltriert. Das erhaltene Diafiltrat kann dann direkt weiterverarbeitet oder durch Ultrafiltration weiter konzentriert werden. Das Diafiltrat/Konzentrat wurde auf eine Endkonzentration von 0,01% Tween-80 eingestellt.
Das gesamte oder ein Teil des Diafiltrats/Konzentrats entsprechend 2 bis 5% des berechneten Säulenvolumens wurde dann auf eine Sephacryl S-300 HR-Säule (Pharmacia), äquilibriert in 0,01 M Na-Phosphat pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,01% Tween80 aufgegeben und bei einer Durchflussrate von etwa 17 ml/Stunde/cm² chromatographiert. Die TPOenthaltenden Fraktionen frei von aggregierten und proteolytischen Abbauprodukten wurden auf Basis von SDS-PAGE gepoolt. Der erhaltene Pool wurde an einem 0,22 u- Filter, Millex-GV oder dergleichen, filtriert und bei 2-8ºC gelagert.

Beispiel 3

Transformation und Induktion von TPO-Proteinsynthese in E. coli

1. Konstruktion von E. coli-TPO-Expressionsvektoren

Die Plasmide pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 und pMP202 sind alle entworfen, die ersten 155 Aminosäuren von TPO stromab eines kleinen Leaders, der unter den verschiedenen Konstrukten variiert, zu exprimieren. Die Leader sorgen in erster Linie für High-Level-Transiationsinitiation und schnelle Reinigung. Die Plasmide pMP210-1, -T8, -21, -22, -24, -25 sind entworfen, um die ersten 153 Aminosäuren von TPO stromab eines Initiations-Methionins zu exprimieren und unterscheiden sich nur in der Codon- Verwendung für die ersten 6 TPO-Aminosäuren, während das Plasmid pMP251 ein Derivat von pMP210-1 ist, in dem das carboxyterminale Ende von TPO um zwei Aminosäuren verlängert ist. Alle obigen Plasmide erzeugen intrazelluläre High-Level-Expression von TPO in E. coli bei Induktion des Tryptophan-Promotors (D. G. Yansure et al., Methods in Enzymology 185, 54-60, D. V. Goeddel (Hrsg.), Academic Press, San Diego (19901). Die Plasmide pMP1 und pMP172 sind Zwischenprodukte der Konstruktion der obigen, intrazellulären TPO-Expressionsplasmide.

(a) Plasmid pMP1

Das Plasmid pMP1 ist ein Sekretionsvektor für die ersten 155 Aminosäuren von TPO und wurde durch Ligation von 5 DNA-Fragmenten konstruiert. Das erste davon war der Vektor pPho21, in dem das kleine MluI-BamHI-Fragment entfernt worden ist. pPho21 ist ein Derivat von phGH1 (C. N. Chang et at., Gene 55, 189-196 (1987), in dem das humane Wachstumshormon-Gen durch das E. coli-phoA-Gen ersetzt und eine MluI-Restriktionsstelle gentechnisch in die kodierende Sequenz für die STII-Signalsequenz an den Aminosäuren 20-21 eingeführt worden ist.
Die nächsten beiden Fragmente, ein HinfI-PstI-DNA-Stück von 258-Basenpaaren aus pRKS-hmpl, kodierend für TPO-Aminosäuren 18-103, und die folgende, für die Aminosäuren 1-18 kodierende, synthetische DNA
wurden mit T4-DNA-Ligase vorligiert und dann mit PstI geschnitten. Das vierte war ein PstI-HaeIII-Fragment von 152 Basenpaaren aus pRKShmplI, welches für die TPO-Aminosäuren 104-155 kodiert. Das letzte war ein StuI-BamHI-Fragment von 412 Basenpaaren aus pdh108, enthaltend den Lamda-Transkriptionsterminator, wie früher beschrieben wurde (S. Scholtissek et al., NAR 15, 3185 (1987)).

(b) Plasmid pMP21

Plasmid pMP21 ist entworfen, um die ersten 155 Aminosäuren von TPO mithilfe eines 13-Aminosäuren-Leaders zu exprimieren, der einen Teil der STII-Signalsequenz enthält. Es wurde durch Ligation von drei (3) DNA-Fragmenten konstruiert, wobei das erste davon der Vektor pVEG31 ist, in dem das kleine XbaI-SphI-Fragment entfernt worden ist. Der Vektor pVEG31 ist ein Derivat von pHGH207-1 (H. A. de Boer et al., "Promotor Structure and Function", R. L. Rodriguez und M.). Chamberlain (Hrsg.), 462, Praeger, New York (1982)), in dem das humane Wachstumshormon-Gen durch das Gen für den Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (dieser identische Vektor kann aus diesem, letzteren Plasmid erhalten werden) ersetzt worden ist.
Der zweite Teil in der Ligation war ein synthetischer DNA-Doppelstrang mit der folgenden Sequenz:
Das letzte Stück war ein MluI-SphI-Fragment von 1072 Basenpaaren aus pMP1, kodierend für 155 TPO-Aminosäuren.

(c) Plasmid pMP151

Plasmid pMP151 ist entworfen, um die ersten 155 Aminosäuren von TPO stromab eines Leaders zu exprimieren, der aus 7 Aminosäuren der STII-Signalsequenz, 8 Histidinen und einer Faktor-Xa-Spaltstelle besteht. pMP151 wurde durch Ligation von drei DNA- Fragmenten konstruiert, wobei das erste davon der vorher beschriebene Vektor pVEG31 ist, aus dem das kleine XbaI-SphI-Fragment entfernt worden ist. Das zweite war ein synthetischer DNA-Doppelstrang der folgenden Sequenz:
Das letzte davon war ein BgLI-SphI-Fragment von 1064 Basenpaaren aus pMP11, kodierend für 154 TPO-Aminosäuren. Das Plasmid pMP11 ist identisch mit pMP1 mit Ausnahme weniger Codonveränderungen in der STII-Signalsequenz (dieses Fragment kann aus pMP1 erhalten werden).

(d) Plasmid pMP202

Plasmid pMP202 ist sehr ähnlich dem Expressionsvektor pMP151 mit der Ausnahme, dass die Faktor-Xa-Spaltstelle im Leader durch eine Thrombin-Spaltstelle ersetzt worden ist. Wie in Fig. 36 gezeigt wurde pMP202 durch Ligation von drei DNA-Fragmenten konstruiert. Das erste davon war das früher beschriebene pVEG31, in dem das kleine XbaI-SphI-Fragment entfernt worden ist. Das zweite war ein synthetischer DNA-Doppelstrang der folgenden Sequenz:
Das letzte Stück war ein BglI-SphI-Fragment von 1064 Basenpaaren aus dem vorher beschriebenen Plasmid pMP11.

(e) Plasmid pMP172

Plasmid pMP172 ist ein Sekretionsvektor für die ersten 153 Aminosäuren von TPO, und ist ein Zwischenprodukt für die Konstruktion von pMP210. pMP172 wurde durch Ligation von drei DNA-Fragmenten hergestellt, wobei das erste davon der Vektor pLS321- amB war, in dem die kleine EcoRI-HindI-Sektion entfernt worden ist. Das zweite war ein EcoRI-HgaI-Fragment von 946 Basenpaaren aus dem vorher beschriebenen Plasmid pMP11. Das letzte Stück war ein synthetischer DNA-Doppelstrang der folgenden Sequenz:

(f) Plasmid pMP210

Plasmid pMP210 ist entworfen, um die ersten 153 Aminosäuren von TPO nach einem Translations-Initiations-Methionin zu exprimieren. Dieses Plasmid wurde eigentlich als eine Plasmidbank hergestellt, in der die ersten 6 TPO-Codons in der dritten Position jedes Codons randomisiert worden sind, und wurde durch Ligation von drei DNA-Fragmenten konstruiert. Das erste davon war der vorher beschriebene Vektor pVEG31, in dem das kleine XbaI-SphI-Fragment entfernt worden ist. Das zweite war ein unten gezeigter, synthetischer DNA-Doppelstrang, der zuerst mit DNA-Polymerase (Klenow) behandelt wurde, gefolgt von Verdau mit XbaI und HinI, und kodiert das Initiations-Methionin und die randomisierten, ersten 6 TPO-Codons.
Das dritte war ein HinfI-SphI-Fragment von 890 Basenpaaren aus pMP172, kodierend für die TPO-Aminosäuren 19-153.
Die pMP210-Plasmidbank von etwa 3700 Klonen wurde retransformiert, und zwar auf hochkonzentrierten Tetracyclin- (50 ug/ml) LB-Platten, um Translations-Initiations-Klone heraus zu selektieren (D. G. Yansura et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4, 151-158 (1992)). Von diesen 8 Kolonien, die sich auf den hochkonzentrierten Tetracyclin-Platten entwickelten, wurden fünf der bezüglich TPO-Expression besten Kolonien der DNA-Sequenzierung unterworfen.

(g) Plasmid pMP41

Plasmid pMP41 ist entworfen, um die ersten 155 Aminsäuren von TPO zu exprimieren, fusioniert an einen Leader bestehend aus 7 Aminosäuren der STII-Signalsequenz, gefolgt von einer Faktor-Xa-Spaltstelle. Das Plasmid wurde durch Ligation von drei DNA-Stücken konstruiert, wobei das erste davon der vorher beschriebene Vektor pVEG31 war, in dem das kleine XbaI-SphI-Fragment entfernt worden ist. Das zweite war der folgende, synthetische DNA-Doppelstrang:
Das letzte Stück der Ligation war das BglI-SphI-Fragment von 1064 Basenpaaren aus den vorher beschriebenen Plasmid pMP11.

(h) Plasmid pMP57

Plasmid pMP57 exprimiert die ersten 155 Aminosäuren von TPO stromab eines Leaders, bestehend aus 9 Aminosäuren der STII-Signalsequenz und der zweibasigen Stelle Lys- Arg. Diese zweibasige Stelle Liefert die Möglichkeit der Entfernung des Leaders mit der Protease ArgC. Dieses Plasmid wurde durch Ligation von drei DNA-Stücken konstruiert. Das erste davon war der vorher beschriebene Vektor pVEG31, in dem das kleine XbaI- SphI-Fragment entfernt worden ist. Das zweite war der folgende, synthetische DNA- Doppelstrang:
Der letzte Teil der Ligation war das BglI-SphI-Fragment von 1064 Basenpaaren aus dem vorher beschriebenen Plasmid pMP11.

(1) Plasmid pMP251

Plasmid pMP251 ist ein Derivat von pMP201-1, in dem zwei zusätzliche TPO-Aminosäuren am carboxyterminalen Ende enthalten sind. Dieses Plasmid wurde durch Ligation von zwei DNA-Stücken konstruiert, wobei das erste davon das vorher beschriebene pMP21 ist, in dem das kleine XbaI-ApaI-Fragment entfernt worden ist. Der zweite Teil der Ligation war ein XbaI-ApaI-Fragment von 316 Basenpaaren aus pMP210-1.

2. Transformation und Induktion von E. coli mit Expressionsvektoren

Die obigen TPO-Expressionsplasmide wurden verwendet, um den E. coli-Stamm 44C6 (w3110 tonAΔrpoHts IonΔgalE) unter Verwendung des CaCl&sub2;-Hitzeschockverfahrens (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970)) zu exprimieren. Die transformierten Zellen wurden zuerst bei 37ºC in LB-Medien kultiviert, die 50 pg/ml Carbenicillin enthielten, bis die optische Dichte (600 nm) der Kultur etwa 2-3 erreichte. Die LB-Kultur wurde dann 20x in M9-Medien verdünnt, die 0,49% Casaminosäuren (Gew./Vol.) und etwa 50 g/ml Carbenicillin enthielten. Nach Kultivierung mit Belüftung bei 30ºC für 1 Stunde wurde Indol-3-acrylsäure in einer Endkonzentration von 50 1lg/ml zugesetzt. Das Wachstum der Kultur wurde dann bei 30ºC mit Belüftung für weitere 15 Stunden fortgesetzt, worauf die Zellen durch Zentrifugation geerntet wurden.

Beispiel 4

Produktion von biologisch aktivem TPO (Met-1 1-153) in E. coli

Die unten dargelegten Verfahren zur Produktion von biologisch aktivem, neugefaltetem TPO (Met&supmin;¹ 1-153) können analog zur Wiedergewinnung anderer TPO-Varianten, einschließlich N- und C-terminal verlängerter Formen, angewendet werden.

A. Wiedergewinnung von nicht-löslichem TPO (Met&supmin;¹ 1-153)

E. coli-Zellen, welche durch das Plasmid pMP201-1 kodiertes TPO (Met&supmin;¹ 1-153) exprimieren, werden wie oben beschrieben fermentiert. Typischerweise werden etwa 100 g Zellen in 1 l (10 Volumina) Zellaufschlusspuffer (10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) mit einem Polytron-Homogenisator resuspendiert und die Zellen bei 5000 · g für 30 Minuten zentrifugiert. Das gewaschene Zellsediment wird wiederum in 1 l Zellaufschlusspuffer mit dem Polytron-Homogenisator resuspendiert und die Zellsuspension durch ein LH-Zellaufschlussgerät (LH Inceltech, Inc.) oder durch einen Microfluidizer (Microfluidics International) gemäß den Herstellervorschriften geleitet. Die Suspension wird bei 5000 · g für 30 Minuten zentrifugiert und resuspendiert und ein zweites Mal zentrifugiert, um ein Refraktilkörper-Pellet zu erhalten. Das gewaschene Pellet wird sofort verwendet oder gefroren bei -70ºC gelagert.

B. Solubilisierung und Reinigung von monomerem TPO (Met&supmin;¹ 1-153)

Das obige Pellet wird nach Gewicht in 5 Volumina 20 mM Tris, pH 8, mit 6-8 M Guanidin und 25 mM DTT (Dithiotheritol) resuspendiert und für 1-3 Stunden oder über Nacht bei 4ºC gerührt, um Solubilisierung des TPO-Proteins zu bewirken. Hohe Konzentrationen von Harnstoff (6-8 M) sind ebenso zweckdienlich, führen jedoch im Allgemeinen im Vergleich mit Guanidin zu niedrigeren Ausbeuten. Nach der Solubilisierung wird die Lösung bei 30000 · g für 30 min zentrifugiert, um einen klaren Überstand zu erhalten, der denaturiertes, monomeres TPO-Protein enthält. Der Überstand wird dann an einer Superdex-200-Gelfiltrationssäule (Pharmacia, 2,6 · 60 cm) mit einer Durchflussrate von 2 ml/min chromatographiert und das Protein mit 20 mM Na-Phosphat, pH 6,0, mit 10 mM DTT eluiert. Monomeres, denaturiertes TPO-Protein enthaltende, zwischen 160 und 200 ml eluierende Fraktionen werden gepoolt. Das TPO-Protein wird auf einer semipräparativen C4-Umkehrphasensäule (2 · 20 cm VYDAC) weiter gereinigt. Die Probe wird mit 5 ml/min auf eine in 0,1% TFA (Trifluoressigsäure) mit 30% Acetonitril äquilibrierte Säule aufgegeben. Das Protein wird mit einem linearen Gradienten von Acetonitril (30-60% in 60 min) eluiert. Das gereinigte, reduzierte Protein eluiert bei etwa 50% Acetonitril. Das Material wird für Neufaltung verwendet, um biologisch aktive TPO-Variante zu erhalten.

C. Erzeugung von biologisch aktivem TPO (Met&supmin;¹ 1-153)

Etwa 20 mg monomeres, reduziertes und denaturiertes TPO-Protein in 40 ml 0,1% TFA/ 50% Acetonitril wird in 360 ml Neufaltungspuffer verdünnt, der optimalerweise folgende Reagenzien enthält:
50 mM Tris
0,3 M NaCl
5 mM EDTA
2% CHAPS-Detergens
25% Glycerin
5 mM oxidiertes Glutathion
1 mM reduziertes Glutathion
pH eingestellt auf 8,3
Nach dem Vermischen wird der Neufaltungspuffer bei 4ºC für 12-48 Stunden leicht gerührt, um maximale Neufaltungsausbeuten der korrekten Disulfid-gebundenen Form von TPO (siehe unten) zu bewirken. Die Lösung wird dann mit TFA auf eine Endkonzentration von 0,2% angesäuert, durch ein 0,45 oder 0,22 um-Filter filtriert und mit 110 Volumina Acetonitril versetzt. Diese Lösung wird dann direkt auf eine C4-Umkehrphasensäule gepumpt und das gereinigte, neugefaltete TPO (Met&supmin;¹ 1-153) mit demselben Gradientenprogramm wie oben eluiert. Neugefaltetes, biologisch aktives TPO wird unter diesen Bedingungen bei etwa 45% Acetonitril eluiert. Ungeeignete Disulfid-gebundene Versionen von TPO werden früher eluiert. Das fertig gereinigte TPO (Met&supmin;¹ 1-153) ist zu mehr als 95% rein, wie durch SDS-Gele und analytische C4-Umkehrphasenchromatographie ermittelt wurde. Für Tierstudien wurde das C4-gereinigte Material in physiologisch kompatiblen Puffern dialysiert. Isotonische Puffer (10 mM Na-Phosphat, pH 5,5, 10 mM Na-Succinat, pH 5,5 oder 10 mM Na-Phosphat, pH 7,4), die 150 mM NaCl und 0,01% Tween 80 enthielten, wurden verwendet.
Wegen der hohen Potenz von TPO im Ba/F3-Test (halbmaximale Stimulation wurde bei etwa 3 pg/ml erzielt) ist es möglich, biologisch aktives Material unter Verwendung vieler verschiedener Puffer- Detergens- und Redoxbedingungen, zu erhalten. Jedoch wird unter den meisten Bedingungen nur eine kleine Menge richtig gefaltetes Material (< 10%) erhalten. Für kommerzielle Herstellungsverfahren ist es wünschenswert, Neufaltungsausbeuten von zumindest 10%, bevorzugter 30-50% und besonders bevorzugt > 50% zu erhalten. Viele verschiedene Detergenzien (Triton X-100, Dodecyl-β-maltosid, CHAPS, CHAPSO, SDS, Sarkosyl, Tween 20 und Tween 80, Zwittergent 3-14 und andere) wurden auf ihre Effizienz hin bewertet, hohe Neufaltungsausbeuten zu fördern. Von diesen Detergenzien erwies sich in der Neufaltungsreaktion nur die CHAPS-Familie (CHAPS oder CHAPSO) als allgemein zweckdienlich, um Proteinaggregation und ungeeignete Disulfid-Bildung zu einzuschränken. CHAPS-Konzentrationen von mehr als 1% waren am zweckdienlichsten. Natriumchlorid war für höchste Ausbeuten erforderlich, wobei Konzentrationen zwischen 0,1 M und 0,5 M optimal waren. Die Gegenwart von EDTA (1-5 mM) begrenzte das Ausmaß metallkatalysierter Oxidation (und Aggregation) die in einigen Präparaten beobachtet wurde. Glycerin-Konzentrationen von mehr als 15% lieferten optimale Neufaltungsbedingungen. Für maximale Ausbeuten war es essentiell, sowohl oxidiertes als auch reduziertes Glutathion oder oxidiertes und reduziertes Cystein als Redoxreagens-Paar einzusetzen. Allgemein höhere Ausbeuten wurden beobachtet, wenn das Molverhältnis von oxidiertem Reagens gleich dem oder im Überschuss zum reduzierten Reagens des Redoxpaares ist. pH-Werte zwischen 7,5 und etwa 9 waren für die Neufaltung dieser TPO-Varianten optimal. Organische Lösungsmittel (z. B. Ethanol, Acetonitril, Methanol) wurden in Konzentrationen von 10-15% oder darunter toleriert. Höhere Konzentrationen organischer Lösungsmittel erhöhten die Menge an fehlgefalteten Formen. Tris- und Phosphatpuffer waren allgemein zweckdienlich. Inkubation bei 4ºC führte ebenfalls zu höheren Konzentrationen von richtig gefaltetem TPO.
Neufaltungsausbeuten von 40-60% (basierend auf der in der Neufaltungsreaktion verwendeten Menge von reduziertem und denaturiertem TPO) sind typisch für TPO-Präparate, die durch den ersten C4-Schritt gereinigt worden sind. Aktives Material kann mit weniger reinen Präparaten erhalten werden (z. B. direkt nach der Superdex 200-Säule oder nach der anfänglichen Refraktilkörper-Extraktion), obgleich die Ausbeuten aufgrund starker Fällung und Störung durch Nicht-TPO-Proteine während des TPO-Neufaltungsprozesses niedriger sind.
Da TPO (Met&supmin;¹ 1-153) 4 Cysteinreste enthält, ist es möglich, drei verschiedene Disulfid- Versionen dieses Proteins zu erzeugen:
Version 1: Disulfide zwischen den Cysteinresten 1-4 und 2-3
ersion 2: Disulfide zwischen den Cysteinresten 1-2 und 3-4
Version 3: Disulfide zwischen den Cysteinresten 1-3 und 2-4.
Während der anfänglichen Untersuchungen zur Ermittlung der Neufaltungsbedingungen wurden mehrere verschiedene Peaks, welche das TPO-Protein enthielten, durch C4-Umkehrphasenchromatographie getrennt. Nur einer dieser Peaks hatte signifikante, mittels Ba/F3-Test ermittelte biologische Aktivität. Anschließend wurden die Neufaltungsbedingungen optimiert, um bevorzugt diese Version zu erhalten. Unter diesen Bedingungen betrug der Anteil von fehlgefalteten Versionen weniger als 10-20% des gesamten erhaltenen TPO-Monomers.
Das Disulfidmuster des biologisch aktiven TPO ist durch Massenspektrometrie und Proteinsequenzierung mit 1-4 und 2-3 bestimmt worden (d. h. Version 1). Aliquoten der verschiedenen C4-getrennten Peaks (5-10 nmol) wurden mit Trypsin verdaut (Molverhältnis von Trypsin zu Protein 1 : 25). Die Verdaumischung wurde durch Matrix-Assisted- Laser-Desorption-Massenspektrometrie vor und nach Reduktion mit DTT analysiert. Nach Reduktion wurden Massen detektiert, welche den meisten der größeren tryptischen Peptide entsprachen. In den nicht reduzierten Proben fehlten einige dieser Massen und neue Massen wurden beobachtet. Die Masse der neuen Peaks entsprach im Grunde der Summe der einzelnen, am Disulfidpaar beteiligten tryptischen Peptide. Folglich war es möglich, das Disulfidmuster des neugefalteten, rekombinanten, biologisch aktiven TPO unzweifelhaft mit 1-4 und 2-3 festzusetzen. Dies steht im Einklang mit dem bekannten Disulfidmuster des verwandten Proteins Erythropoietin.

D. Biologische Aktivität von rekombinantem, neugefaltetem TPO (met 1-153)

Neugefaltetes und gereinigtes TPO (Met&supmin;¹ 1-153) besitzt Aktivität sowohl in in vitro-, als auch in in vivo-Tests. Im Ba/F3-Test wurde halbmaximale Stimulation von Thymidin-Einbau in die Ba/F3-Zellen bei 3,3 pg/ml (0,3 pM) erzielt. Im mpl-Rezeptor-basierenden ELISA trat halbmaximale Aktivität bei 1,9 ng/ml (120 pM) auf. In normalen und durch nahezu letale Röntgenbestrahlung erzeugten, myelosuppressiven Tieren war TPO (Met&supmin;¹ 1-153) höchst potent (Aktivität wurde bei Dosierungen von nur 30 ng/Maus beobachtet) in der Stimulierung der Produktion neuer Blutplättchen.

Beispiel 5

Daten myelosuppressiver (Carboplatin/Bestrahlung) Mäuse

Verfahren

Tiere

Alle Tierstudien wurden durch das "Institutional Care and Use Committee" von Genentech Inc. genehmigt. Vor Beginn des Experiments wurden alle Tiere zur Identifizierung am Ohr markiert und komplettes Grundlinien-Blutbild (CBC) erhalten. Gruppen von 10 weiblichen C57BL/6-Mäusen wurden mit 5,0 Gy Gammastrahlung aus einer ¹³&sup7;Cs-Quelle bestrahlt. Innerhalb von 6 Stunden wurde den Tieren 1,2 mg Carboplatin als intraperitoneale 200 ul-Injektion verabreicht.
Im Folgenden finden sich Protokolle und Ergebnisse unter Verwendung von rekombinantem Ratten-Thrombopoietin (rmTPO) in einem standardmäßigen Mausmodell. Es versteht sich, dass der Fachmann dieses Modell als auf den Menschen übertragbar ansieht. Human-Thrombopoietin ist im selben Mausmodell getestet worden und hat relevante Aktivität gezeigt, wenn auch wegen der Spezies-Spezifität in geringerem Ausmaß. Daher wurde das folgende Protokoll unter Verwendung des geeigneten Ratten-TPO-Gegenstücks für diese Spezies gewählt, so dass relevante Effekte gezeigt werden können. Verwendung von humanem TPO im Maus-Protokoll würde ähnliche Ergebnisse liefern, die sich wiederum nur im Ausmaß unterscheiden würden. Es ist klar, dass für die Verwendung von Human-TPO beim Menschen, einem weiteren geeigneten Vergleichsmodell, die Genehmigung klinischer Tests durch die FDA abgewartet werden muss.

Beschaffung von Blutproben

Vor dem Experiment und zu Zeitpunkten während der gesamten Studie wurden 40 ul Blut aus dem Orbitalsinus entnommen und sofort in 10 ml Verdünner verdünnt, um Gerinnung zu verhindern. Das komplette Blutbild (CBC) jeder Blutprobe wurde an einem Serrono Baker System 9018 Blutanalysator innerhalb von 60 min nach Abnahme gemessen. Nur der Hälfte der Tiere in jeder Dosis-Gruppe wurde an einem gegebenen Tag Blut abgenommen, folglich wurde jedem Tier an abwechselnden Zeitpunkten Blut abgenommen.

Behandlungsschemata

Experiment 1: Um in thrombozytopoetisch gemachten Tieren die Reaktion auf das rekombinante Ratten-Thrombopoietin (rmTPO335aa) zu bestimmen, wurden Gruppen von Tieren für 1, 2, 4 oder 8 aufeinander folgende Tage mit 0,1 ug/Tag (etwa 5 ug/kg/Tag) behandelt. Behandlung mit rmTPO (335aa) wurde 24 Stunden nach Initiation des Modells begonnen und wurde als tägliche, subkutane 100 ul-Injektion verabreicht.
Experiment 2: Um den Charakter der Dosis-Reaktions-Beziehung für rmTPO (335) in diesem Modell zu bestimmen, wurde den Tieren eine Einzelinjektion von rmTPO (35), 24 Stunden nach Initiation des Modells verabreicht. Gruppen von Tieren erhielten eines von 0,01, 0,03, 0,1 oder 0,3 ug TPO (335) als subkutane 100 ul-Einzelinjektion. Um zwei Verabreichungswege zu vergleichen, verwendete ein gleichzeitiges Experiment 4 Gruppen von Tieren, welche identische Dosen von rmTPO (335) erhielten, jedoch über einen intravenösen Weg (laterale Schwanzvene).
Experiment 3: Diese Serie von Experimenten wurde durchgeführt, um die Effizienz verschiedener, pegylierter, trunkierter rmTPO-Moleküle [rmTPO(153)], gekoppelt an Polyethylenglykol (PEG), zu vergleichen.
i. in diesem Experiment wurden thrombozytopenische Tiere mit einem der folgenden, pegylierten rmTPO(153)-Moleküle injiziert (0,1 ug subkutan): kein PEG, ein 20K-PEG oder ein 40K-PEG.
ii. Im letzten Experiment wurden die Wirkungen der Verabreichung eines einzelnen 40K-PEG-rmTPO(153)-Moleküls verglichen, indem thrombozytopenisch gemachten Tieren 0,1 ug entweder subkutan oder intravenös verabreicht wurden. rmTPO(335) (0,1 ug) diente als positiver Vergleich.

Ergebnisse

Die Kombination von subletaler Bestrahlung und Carboplatin führte zu einer reproduzierbaren Reaktion und ergab beständige Thrombopenie in 100% der Tiere. Der Tiefpunkt der Thrombopenie erfolgte am 10. Tag mit gradueller Erholung der Blutplättchenzahlen bis zu Tag 21 bis 28. Diese Thrombopenie war von einer ausgeprägten Anämie begleitet, wobei der Tiefpunkt etwas später, an Tag 14 bis 17, und die Erholung auf Vergleichswerte roter Blutkörperchen bis zum Tag 28 auftrat. Ebenso erschöpfte sich die Zahl weißer Blutkörperchen im Verlauf des Experiments.
Experiment 1: Eine Einzeldosis von 0,1 ug rmTPO(335), verabreicht 24 Stunden nach Initiation des Modells, beschleunigte die Erholung der Blutplättchenzahlen in diesem Rattenmodell. Die Einzelverabreichung von rmTPO(335) erhöhte den Tiefpunkt der Reaktion von 196 · 10³ +/- 33 · 10³/ul an Tag 10 auf 434 · 10³ +/- 7 · 10³/ul an Tag 7. Die Anfangsrate der Abnahme der Blutplättchenzahlen blieb unverändert, jedoch war die Erholungsphase viel schneller, wobei die Blutplättchenzahlen bis zum Tag 14 statt bis zum Tag 21 in der Vergleichsgruppe Normalwerte erreichten. Eine leichte Steigerung der Erholungsrate wurde durch Verabreichung von 0,1 ug/Tag an Tag 1 und Tag 2 beobachtet, war jedoch marginal. Keine weitere Steigerung konnte durch Verabreichung von rmTPO(335) für 4 oder 8 aufeinander folgende Tage (Fig. 1a) beobachtet werden. Zusätzlich zur beschleunigten Erholung der Blutplättchenzahlen wurde durch eine an Tag 1 verabreichte Einzeldosis von rmTPO(335) auch die Anämie abgeschwächt, welche sich in diesen Tieren entwickelt. Wie bei den Blutplättchenzahlen konnte durch mehr als einmalige Verabreichung von rmTPO(335) kein weiterer Vorteil erzielt werden (Fig. 1b). rmTPO(335) hatte keine Wirkung auf Leukozytopenie, welche den Abfall der Zahl von Blutplättchen und roten Blutkörperchen begleitet (Fig. 1c).
Experiment 2: Die Reaktion auf subkutane Einzeldosen von rmTPO(335), verabreicht 24 Stunden nach Initiation des Modells, war dosisabhängig. Die niedrigste getestete Dosis (0,01 ug) hatte im Vergleich zur Vergleich keine Wirkung auf die Wiedererlangung der Blutplättchen. Die Reaktion ist jedoch nahezu maximal, wenn 0,03 ug verabreicht wurden (Fig. 2a). Diese extrem steile Dosisreaktion ist klarer erkennbar, wenn die Blutplättchenzahlen an Tag 14 logarithmisch-linear aufgetragen werden (Fig. 3a). Eine ähnlich steile Dosisreaktion wird für die Erhöhung des Erythrozytenbestands in diesem Modell beobachtet (Fig. 3b). Intravenöse Verabreichung von rmTPO(335) ergab eine ähnliche dosisabhängige Reaktion. Jedoch war die niedrigste getestete Dosis (0,01 ug) bei intravenöser Verabreichung wirksam (Fig. 4a), was darauf hinweist, dass die Dosisreaktionskurve nach links verschoben ist. Dieser Potenzanstieg ist gering, da die Verschiebung weniger als eine halbe Größenordnung beträgt (Fig. 3a). Wichtiger ist, dass beide Verabreichungswege vergleichbare Maxima haben (Fig. 3a). Der subkutane und intravenöse Verabreichungsweg steigerte auch die Genesung von der Anämie auf eine dosisabhängige Weise (Fig. 2a, 3b, 4b). Jedoch hatte über den getesteten Dosisbereich weder der subkutane noch der intravenöse Verabreichungsweg eine Wirkung auf die Leukozytopenie (Fig. 2c, 4c).

Experiment 3:

i. Pegylierung von rmTPO(153) mit entweder einem einzelnen 20K-PEG oder einem einzelnen 40K-PEG hatte eine stärkere Wirkung auf die Blutplättchenerholung als das unpegylierte Molekül. Im Gegensatz zum Volllängen-Molekül beeinflusste keines der pegylierten rmTPO(153)-Moleküle den Tiefpunkt der Thrombopenie, beschleunigten jedoch überaus die Erholungsphase des Modells, wenn sie 24 Stunden nach Initiation des Modells als subkutane 0,1 ug-Einzeldosis verabreicht wurden (Fig. 5a). Dies ist an Tag 14 klar ersichtlich, wenn die Blutplättchenzahlen 80 · 10³ +/- 15 · 10³/ul, 268 · 10³ +/- 67 · 10³/ul, 697 · 10³ +/- 297 · 10³/ul und 878 · 10³ +/- 31 · 10³/ul für Vergleich, rmTPO(153) ohne PEG, rmTPO(153) + 20K-PEG bzw. rmTPO(153) + 40K-PEG betragen (Fig. 5a). Keines dieser auf rmTPO(153) basierenden Moleküle hatte in diesem Modell irgendeine Wirkung auf Leukozytopenie (Fig. 5c).
ii. rmTPO(153) + 40K-PEG (0,1 ug) führte zu einer beständigen Reaktion, wenn es entweder als intravenöse oder subkutane Einzelinjektion verabreicht wurde. In diesem Experiment veränderte der subkutane Weg den Tiefpunkt an Tag 10 leicht und bewirkte die Wiederbildung der Blutplättchen auf Vergleichsniveau bis zu Tag 14 statt bis zu Tag 28 in der Vergleichsgruppe (Fig. 6a). Bei Tieren, denen das Medikament intravenös verabreicht wurde, bestand eine ähnliche Wirkung auf Tiefpunkt und Erholungsrate (Fig. 7a). Die Reaktion auf dieses 40K-pegylierte, trunkierte rmTPO(153)-Molekül ist nahezu identisch zur Reaktion auf rmTPO(553), und zwar sowohl auf Blutplättchen- als auch auf Erythrozytenerholung bei entweder subkutaner (Fig. 6b) oder intravenöser (Fig. 7b) Verabreichung. Wie auch in allen anderen Experimenten hatte entweder subkutan oder intravenös verabreichtes rmTPO(153) + 40K-PEG keine Wirkung auf den zirkulierenden Spiegel weißer Blutkörperchen (Fig. 6c, 7c). In Parallelexperimenten veränderte die Verwendung von 10K-pegylierten Versionen dieses Moleküls nicht die Reaktion der Wiederbildung von entweder Blutplättchen oder Erythrozyten auf rmTPO(153).
Im Folgenden finden sich Vorschriften und Ergebnisse unter Anwendung von Einzeldosistherapie mit rekombinantem, humanem Thrombopoietin (rhTPO&sub3;&sub3;&sub2;) bei menschlichen Patienten, die zytotoxische Chemotherapie erhalten:

Einzeldosistherapie mit rekombinantem, humanem Thrombopoietin (rhTPO) bei Patienten, die zytotoxische Chemotherapie erhalten

Präklinische Modelle intensiver Chemoradiotherapie zeigten, dass eine Einzeldosis von rhTPO den Blutplättchen-Tiefpunkt anhebt und die Periode schwerer Thrombopenie verkürzt. Vorläufige Ergebnisse von zwei Phase-I-Studien werden vorgelegt, bei denen Einzeldosen von rhTPO an Krebspatienten, die Chemotherapie erhalten, verabreicht wurden.

Patienten und Verfahren:

Beide Studien begannen mit 21-tägigen Prä-Chemotherapieperioden (Zyklus 0) zur Ermittlung der Sicherheit von rhTPO und Blutplättchenreaktion nach IV Einzel-Bolusinjektionen von 0,3, 0,6 oder 1, 2 meg/kg (3 Patienten pro Gruppe in jeder Studie). Die Patienten erhielten dann dieselbe rhTPO-Dosis nach Chemotherapie in ausgesuchten anschließenden Zyklen. Die Population der ersten Studie bestand aus Patienten mit fortgeschrittenen Malignitäten, die an Tag nach der Salvage-Thiotepa-Chemotherapie in jedem von zwei aufeinander folgenden Chemotherapiezyklen (65 mg/m² q28d) rhTPO erhielten. Die zweite Studie umfasste naive Chemotherapie-Patienten mit Sarkomen unter Induktionsbehandlung mit Al-Chemotherapie (Doxorubicin 90 mg/m², 10 g/m² q2ld). Nach Zyklus 0 wurden Patienten dieser Studie während des ersten Chemotherapiezyklus beobachtet und erhielten eine rhTPO-Einzelinjektion an Tag nach Abschluss der Chemotherapie (d5) während des zweiten und nachfolgender Zyklen.

Ergebnisse:

14 Patienten wurden bisher behandelt. rhTPO wurde gut toleriert mit keinen berichteten, auf das untersuchte Medikament zurückzuführenden, schwerwiegenden Nebenwirkungen. Antikörper gegen rhTPO wurden nicht beobachtet. Im Zyklus 0 war die niedrigste Dosis (0,3 mcg/kg) schwach aktiv, mit erhöhter Aktivität bei höheren Dosierungen, wie unten gezeigt wird.
Die maximale Blutplättchenzahl während Zyklus 0 trat am mittleren Tag 11 (Bereich 7- 14) auf. Keine signifikanten Veränderungen wurden in WBC oder HCT gefunden. FACS- Analyse des Knochenmarks zeigte Anstiege in allen CD34+ -Untergruppen bei 2/2 Patienten nach 0,6 mcg/kg. Anstiege in Peripherblut-CD34+ -Zellen wurden bei diesen Patienten ebenfalls beobachtet, was darauf hinweist, dass TPO Stammzellen-mobilisierende Aktivität aufweisen könnte. Dosisberechnung und Post-Chemotherapie-Behandlung sind im Gange.
Gemeinsam weisen diese Phase-1-Studien darauf hin, dass Einzeldosis-Verabreichung von rhTPO sicher ist und gut vertragen wird. Die Dosisniveaus von 0,3, 0,6 und 1, 2 mcg/kg zeigen erhöhte thrombopoetische Aktivität. Die laufende Behandlung von Patienten in höheren Dosierungen wird die Hypothese überprüfen, dass eine Einzeldosis von rhTPO wirksam zur Besserung von Thrombopenie nach intensiver Chemotherapie ist.

Abschließende Bemerkungen

Die obige Beschreibung gibt im Detail spezifische Verfahren an, die für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. In Kenntnis der Details solcher spezifischer Verfahren sind Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung in der Lage, unter Nutzung der Ergebnisse der vorliegenden Erfindung alternative, zuverlässige Verfahren zu entwickeln, mit denen die gleichen Informationen erzielt werden können. Daher sollten die obigen Ausführungen, so detailliert sie im Test auch erscheinen mögen, nicht als den Schutzumfang insgesamt beschränkend aufgefasst werden, sondern der Schutzumfang der Erfindung ist nur durch die gesetzeskonforme Konstruktion der beiliegenden Ansprüche zu bestimmen.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(1) ANMELDER: Genentech, Inc.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: NEUE VERABREICHUNG VON THROMBOPOIETIN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 22
(iv) POSTANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT: Flehr, Hohbach, Test, Albritton & Herbert
(B) STRASSE: Four Embarcadero Center, Suite 3400
(C) STADT: San Francisco
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) PLZ: 94111
(v) COMPUTERLESBARE FORM.
(A) ART des MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn, Ausgabe 1.0, Version 1.30
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: PCT/US97/
(B) ANMELDEDATUM: HIERMIT
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) PRIORIÄTSANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US 08/697.631
(B) ANMELDEDATUM: 28. August 1996
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) PRIORIÄTSANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US 08/641.443
(B) ANMELDEDATUM: 29. April 1996
(vii) PRIORIÄTSANMELDUNGSDATEN
(A) ANMELDENUMMER: US 08/591.925
(B) ANMELDEDATUM: 25. Jänner 1996
(viii) ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Dreger, Walter H.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 24.190
(C) AKTENZEICHEN: FP-62953-2
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATIONEN:
(A) TELEFON: (415) 781-1989
(B) TELEFAX: (415) 398-3249
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 1
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
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(i) SEQUENZMERKMALE:
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(i) SEQUENZMERKMALE:
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(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 20:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 21
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LANGE: 45 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 21
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 22
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 38 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 22

Claims

1. Verwendung eines Thrombopoietins zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers, das an Thrombozytopönie leidet oder davon bedroht ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament in einer therapeutischen Einzeldosis oder in zwei therapeutischen Dosen pro Tag verabreicht wird.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Thrombopoietin in einer therapeutisch wirksamen Einzeldosis verabreicht wird.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die therapeutische Dosis im Bereich von 0,1 bis 100 ug/kg liegt.

4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die therapeutische Dosis im Bereich von 0,1 bis 1 ug/kg liegt.

5. Verwendung nach Anspruch 1, worin die therapeutische Dosis in einer Doppel- Dosis-Verabreichung mit wenigen Wiederholungen im Bereich von jeweils 0,5 bis 1,5 ug/kg liegt.

6. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament in Kombination mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Mittels verabreicht wird, das aus der aus einem Cytokin, Kolonie-Stimulationsfaktor und Interleukin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

7. Verwendung nach Anspruch 6, worin das Mittel aus KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, M- CSF, EPO, FLT-3, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 und IL-11 ausgewählt ist.

8. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament intravenös verabreicht wird.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Medikament subkutan verabreicht wird.

10. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten verwendet wird.

11. Verwendung nach Anspruch 10, worin der Träger oder Exzipient einen Chelatbildner enthält.

12. Verwendung nach Anspruch 11, worin der Chelatbildner EDTA ist.

13. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Thrombopoietin aus der aus

a) einem Fragment-Polypeptid;

b) einem Varianten-Polypeptid;

c) einem chimären Polypeptid; und

d) einem pegylierten Polypeptid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

14. Verwendung nach Anspruch 13, worin das pegylierte Polypeptid mit Polyethylenglykol hergestellt ist.

15. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Thrombopoietin aus der aus

a) dem von einem Säugetier isolierten Polypeptid;

b) dem auf rekombinantem Wege hergestellten Polypeptid; und

c) dem auf synthetischem Wege hergestellten Polypeptid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

16. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Thrombopoietin aus der aus

a) dem menschlichen Polypeptid; und

b) dem in einem Menschen nicht-immunogenen Polypeptid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

17. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Thrombopoietin durch die Formel

X-hTPO(7-151)-Y

dargestellt ist, worin hTPO(7-151) die Human-TPO (hML)-Aminosäuresequenz von Cys&sup7; bis inklusive Cys¹&sup5;¹ bezeichnet; X die Aminogruppe von Cys&sup7; oder einen oder mehrere der Amino-terminalen Aminosäureste des reifen TPO oder Aminosäurerest-Verlängerungen davon darstellt, wie z. B. Met, Lys, Try, oder Aminosäuresubstitutionen davon, wie z. B. Argin bis Lysin oder Thrombin; und Y die Carboxy-terminale Gruppe von Cys¹&sup5;¹ oder einen oder mehrere Carboxy-terminale(n) Aminosäurerest(e) des reifen TPO oder Verlängerungen davon darstellt.

18. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Thrombopoietin Human-Thrombopoietin ist.

19. Verwendung nach Anspruch 18, worin das Thrombopoietin Human-Thrombopoietin (153) ist.

20. Verwendung nach Anspruch 18, worin das Thrombopoietin Human-Thrombopoietin (332) ist.

21. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Thrombopoietin rhTPO&sub3;&sub3;&sub2; ist.