DE69033584T2

DE69033584T2 - Stammzellenfaktor

Info

Publication number: DE69033584T2
Application number: DE69033584T
Authority: DE
Inventors: Robert A. Bosselman; Francis Hall Martin; Sidney Vaughn Suggs; Krisztina M. Zsebo
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1989-10-16
Filing date: 1990-10-04
Publication date: 2001-03-08
Anticipated expiration: 2010-10-05
Also published as: DK0423980T3; SG59931A1; EP0992579A1; CZ49097A3; SK500890A3; CZ48897A3; EP1241258A3; DE69033584D1; DE69034258D1; EP0676470A1; HK1010397A1; ATE194651T1; CN1306007A; CZ286304B6; CN1289526C; CN1051937A; GR3034559T3; CZ286305B6; SK281484B6; SK281487B6

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen neue Faktoren, die primitive Vorläuferzellen, einschließlich früher hämatopoetischer Vorläuferzellen, stimulieren, und DNA- Sequenzen, die für solche Faktoren codieren. Insbesondere betrifft die Erfindung Polypeptide, die einen Teil oder die gesamte Primärstruktur und eine oder mehrere der hämatopoetischen Eigenschaften haben, die für natürlich vorkommenden Säugetier-Stammzellenfaktor (SCF) typisch sind.

Hintergrund der Erfindung

Das menschliche blutbildende (hämatopoetische) System umfaßt eine Vielzahl weißer Blutzellen (einschließlich Neutrophilen, Makrophagen, Basophilen, Mastzellen, Eosinophilen, T- und B-Zellen), rote Blutkörperchen (Erythrocyten) und Gerinnsel-bildende Zellen (Megakaryocyten, Blutplättchen).
Es wird geglaubt, daß geringe Mengen gewisser hämatopoetischer Wachstumsfaktoren für die Differenzierung einer kleinen Anzahl von "Stammzellen" in eine Vielzahl von Blutzell- Vorläufern für die umfangreiche Proliferation dieser Zellen und für die endgültige Differenzierung reifer Blutzellen aus diesen Linien verantwortlich sind. Das hämatopoetische Regenerationssystem funktioniert unter normalen Bedingungen gut. Jedoch findet unter Stress durch Chemotherapie, Bestrahlung oder natürlichen myelodysplastischen Störungen eine daraus resultierende Periode statt, während der Patienten ernsthaft leukopenisch, anämisch oder thrombocytopenisch sind. Die Entwicklung und die Verwendung hämatopoetischer Wachstumsfaktoren beschleunigt die Regenerierung von Knochenmark während dieser gefährlichen Phase.
Bei gewissen viral induzierten Störungen, wie etwa erworbener Autoimmunschwäche (AIDS), können Blutelemente, wie etwa T-Zellen, spezifisch zerstört sein. Die Steigerung der T-Zell-Produktion kann in solchen Fällen therapeutisch sein.
Da die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren in extrem geringen Mengen vorhanden sind, hat der Nachweis und die Identifizierung dieser Faktoren auf einer Reihe von Essays beruht, die bis jetzt nur zwischen den verschiedenen Faktoren auf der Grundlage von stimulierenden Effekten an kultivierten Zellen unter künstlichen Bedingungen unterscheiden.
Die Anwendung rekombinanter genetischer Techniken hat das Verständnis der biologischen Aktivitäten einzelner Wachstumsfaktoren geklärt. Zum Beispiel sind die Aminosäure- und DNA-Sequenzen für humanes Erythropoietin (EPO) erhalten worden, das die Produktion von Erythrocyten stimuliert. (Siehe Lin, U. S. Patent 4,703,008 hierin durch Bezugnahme miteinbezogen). Rekombinante Verfahren sind ebenso auf die Isolierung von cDNA für einen humanen Granulocyten-Kolonie-stimulierenden Faktor, G-CSF (siehe Souza, U. S. Patent 4,810,643 hierin durch Bezugnahme miteinbezogen), und humanen Granulocyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) [Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4360-4364 (1985); Wong, et al.; Science, 228, 810-814 (1985)], murinen G- und GM-CSF [Yokota, et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1070 (1984); Fung, et al., Nature, 307, 233 (1984); Gough, et al., Nature, 309 763 (1984)], und humanen Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF-1) [Kawasaki, et al., Science, 230, 291 (1985)] angewendet worden.
Das Hoch-Proliferative-Potential-Koloniebildende-Zell(HPP-CFC) Assay-System testet die Wirkung von Faktoren auf frühe hämatopoetische Vorläufer [Zont, J. Exp. Med., 159, 679-690 (1984)]. Eine Anzahl an Berichten existiert in der Literatur für Faktoren, die in dem HPP- CFC-Assay aktiv sind. Die Quellen dieser Faktoren sind in Tabelle 1 angezeigt. Die am besten charakterisierten Faktoren werden unten diskutiert.
Eine Aktivität in Medium, das mit menschlicher Milz konditioniert worden ist, ist als synergistischer Faktor (SF) bezeichnet worden. Mehrere menschliche Gewebe und humane und Maus-Zelllinien produzieren einen SF, bezeichnet als SF-1, der mit CSF-1 zusammenarbeitet, um die frühesten HPP-CFC zu stimulieren. Über SF-1 ist in den Medien berichtet worden, die mit humanen Milzzellen, humanen Plazentazellen, 5637-Zellen (eine Blasenkarzinom- Zelllinie) und EMT-6-Zellen (einer Maus-Mamma-Karzinomzelllinie) konditioniert worden sind. Die Identität von SF-1 muß noch bestimmt werden. Anfängliche Berichte zeigen überlappende Aktivitäten von Interleukin-1 mit SF-1 aus der Zelllinie 5637 [Zsebo et al., Blood, 71, 962-968 (1988)]. Jedoch haben zusätzliche Berichte gezeigt, daß die Kombination aus Interleukin-1 (IL-1) plus CSF-1 dieselbe Kolonie-Bildung nicht stimulieren kann, die mit CSF-1 plus partiell aufgereinigten Zubereitungen von 5637-konditionierten Medien erhalten werden können [McNiece, Blood, 73, 919 (1989)].
Der synergistische Faktor, der im Uterusextrakt von schwangeren Mäusen vorhanden ist, ist CSF-1. WEHI-3-Zellen (eine murine myelomonocytische Leukämie-Zelllinie) produzieren einen synergistischen Faktor, der mit IL-3 identisch zu sein scheint. Sowohl CSF-1 als auch IL-3 stimulieren hämatopoetische Vorläufer, die reifer sind als das Target von SF-1.
Es ist gezeigt worden, daß eine andere Klasse von synergistischem Faktor in aus TC-1-Zellen (stromale, aus Knochenmark stammenden Zellen) konditionierten Medien vorhanden sind. Diese Zelllinie produziert einen Faktor, der sowohl frühe myeloide als auch lymphoide Zelltypen stimuliert. Er ist als hämolymphopoetischer Wachstumsfaktor 1 (HLGF-1) bezeichnet worden. Er hat ein apparentes Molekulargewicht von 120.000 [McNiece et al., Exy. Hematol., 16, 383 (1988)].
Von den bekannten Interleukinen und CSFs sind IL-1, IL-3 und CSF-1 als diejenigen identifi- · ziert worden, die Aktivität in dem HPP-CFC Assay besitzen. Die anderen Quellen synergistischer Aktivität, die in Tabelle 1 erwähnt werden, sind strukturell nicht identifiziert worden. Auf der Grundlage der Polypeptid-Sequenz und des biologischen Aktivitätsprofils betrifft die vorliegende Erfindung ein Molekül, das von IL-1, IL-3, CSF-1 und SF-1 unterschiedlich ist.

Tabelle 1

Zubereitungen, die Faktoren enthalten, welche in dem HPP-CFC-Assay aktiv sind

Quelle¹ Literaturangabe

Humane Milz CM [Kriegler, Blood, 60, 503 (1982)]
Mäusemilz CM [Bradley, EXD. Hematol. Today Baum, ed., 285 (1980)]
Rattenmilz CM [Bradley, oben (1980)]
Mäuselunge CM [Bradley, oben (1980)]
humane Placenta CM [Kriegler, oben (1982)]
Uterus aus schwangerer Maus [Bradley, oben (1980)]
GTC-C cm [Bradley, oben (1980)]
RH3 cm [Bradley, oben (1980)]
PHA PBL [Bradley, oben (1980)]
WEHI-3B cm [McNiece, Cell Biol. Int. Rep., 6, 243 (1982)]
EMT-6 cm [McNiece, Exp. Hematol., 15, 854 (1987)]
L-Zelle cm [Kriegler, Exp. Hematol., 12 844 (1984)]
5637 cm [Stanley, Cell, 45, 667 (1986)]
TC-1 cm [Song, Blood, 66, 273 (1985)]
¹ CM = konditionierte Medien
Wenn parental verabreicht, werden Proteine oft schnell aus dem Kreislauf entfernt und können deshalb relativ kurzlebige, pharmakologische Aktivität hervorrufen. Infolgedessen können häufige Injektionen von relativ großen Dosen bioaktiver Proteine erforderlich sein, um eine therapeutische Effizienz zu erhalten. Es ist bekannt, daß Proteine, die durch das kovalente Anhängen von wasserlöslichen Polymeren, wie etwa Polyethylenglycol, Copolymeren von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol, Carboxymethylzellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon oder Polyprolin modifiziert worden sind, wesentlich längere Halbwertszeiten im Blut nach intravenöser Injektion aufweisen als die entsprechenden nicht-modifizierten Proteine (Abuchowski et al., in: "Enzymes as Drugs", Holcenberg et al., Herausgeber Wiley-Interscience, New York, NY, 367-383 (1981), Newmark et al., J. April. Biochem. 4: 185-189 (1982), und Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1487-1491 (1987)]. Solche Modifizierungen können auch die Löslichkeit des Proteins in wässriger Lösung verstärken, Aggregation eliminieren, die physische und chemische Stabilität des Proteins verstärken und die Immunogenität und die Antigen-Eigenschaften des Proteins in großem Maße reduzieren. Als ein Resultat kann die erwünschte biologische Aktivität in vivo erreicht werden durch die Verabreichung von solchen Polymer-Protein-Addukten weniger häufig oder in niedrigeren Dosen als mit dem nicht-modifizierten Protein.
Das Anhängen von Polyethylenglycol (PEG) an Proteine ist besonders nützlich, da PEG eine sehr geringe Toxizität bei Säugetieren hat [Carpenter et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 18, 35-40 (1971)]. Zum Beispiel wurde ein PEG-Addukt von Adenosin-Deaminase in den Verei nigten Staaten zur Verwendung bei Menschen zur Behandlung von starkem kombiniertem Immunschwäche-Syndrom zugelassen. Ein zweiter Vorteil, der durch die Konjugation von PEG geleistet wird, ist der, daß die Immunogenität und Antigen-Eigenschaften von heterologen Proteinen effektiv reduziert wird. Zum Beispiel kann ein PEG-Addukt eines menschlichen Proteins zur Behandlung einer Krankheit in anderen Säugetierarten nützlich sein ohne das Risiko, daß eine schwere Immunantwort ausgelöst wird.
Polymere wie PEG können bequem an einen oder mehrere reaktive Aminosäurereste in einem Protein angehängt werden, wie etwa an die Alpha-Amino Gruppe der aminoterminalen Aminosäure, an die Epsilon-Aminogruppen von Lysin-Seitenketten, an die Sulihydryl-Gruppen von Cystein-Seitenketten, an die Carboxyl-Gruppen von Aspartyl- und Glutamyl- Seitenketten, die Alpha-Carboxyl-Gruppe der carboxyl-terminalen Aminosäure, Tyrosin- Seitenketten oder an aktiverte Derivate von Glycosyl-Ketten, die an bestimmte Asparagin-, Serin- oder Threonin-Reste angehängt sind.
Zahlreiche aktivierte Formen von PEG, die zur direkten Reaktion mit Proteinen geeignet sind, sind beschrieben worden. Nützliche PEG-Reagenzien zur Reaktion mit Protein-Amino- Gruppen schließen aktive Ester von Carbonsäure- oder Carbonatderivate ein, insbesondere diejenigen, bei denen die Abgangsgruppen N-Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenol, Imidazol oder 1-Hydroxy-2-Nitrobenzol-4-Sulfonat sind. PEG-Derivate, die Maleimido- oder Halogenacetyl-Gruppen enthalten, sind nützliche Reagenzien zur Modifizierung von freien Protein-Sulihydryl-Gruppen. Ebenso sind PEG-Reagenzien, die Amino-, Hydrazin- oder Hydrazid- Gruppen enthalten, zur Reaktion mit Aldehyden nützlich, die durch Periodat-Oxidierung von Kohlenhydratgruppen in Proteinen erzeugt worden sind.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Faktor bereitzustellen, der das Wachstum von frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen verursacht.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Faktoren bereitgestellt, hierin als "Stammzellenfaktoren" (SCF) bezeichnet, die die Fähigkeit haben, das Wachstum primitiver Vorläufer, einschließlich hämatopoetischer Vorläuferzellen, zu stimulieren, nämlich ein Polypeptid, das einen Teil oder die gesamte Primärstruktur der in Fig. 14C, 15C, 42 oder 44 dargestellten Sequenz und eine hämatopoetische biologische Eigenschaft von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor hat. Diese SCFs sind ebenso in der Lage, nicht-hämatopoetische Stammzellen zu stimulieren, wie etwa neurale Stammzellen und primordiale Keimstammzellen. Solche Faktoren schließen aufgereinigte, natürlich vorkommende Stammzellenfaktoren ein. Die Erfindung betrifft auch nicht natürlich vorkommende Polypeptide, die Aminosäuresequenzen haben, die die von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor hinreichend duplizieren, um den Besitz einer hämatopoetischen biologischen Aktivität von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso isolierte DNA-Sequenzen zur Verwendung beim Sicherstellen von Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen von Polypeptidprodukten bereit, die Aminosäuresequenzen haben, die hinreichend diejenige von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor verdoppeln, um den Besitz einer hämatopoetischen biologischen Aktivität von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor ermöglicht, wobei besagte DNA-Sequenz ausgewählt ist aus:
(a) DNA-Sequenzen, die in Fig. 14B, 14C, 15B, 15C, 42 und 44 dargestellt sind, oder ihre komplementären Stränge;
(b) DNA-Sequenzen, die an die in (a) definierte DNA-Sequenzen oder Fragmente davon hybridisieren; und
(c) DNA-Sequenzen, die ohne die Degeneration des genetischen Codes, an die in (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen hybridiseren würden.
Ebenso werden Vektoren bereitgestellt, die solche DNA-Sequenzen enthalten, und Wirtszellen, die mit solchen Vektoren transformiert oder transfiziert sind. Ebenso von der Erfindung umfaßt sind Verfahren zum Produzieren von SCF mit rekombinanten Techniken und Verfahren zum Behandeln von Störungen. Zusätzlich werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die SCF und Antikörper, die speziell an SCF binden, einschließen.
Die Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur effizienten Gewinnung von Stammzellenfaktor aus einem Material, das SCF enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Ionenaustausch-chromatographische Trennung und/oder Umkehrphasen-Flüssigchromatographische Trennung.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein biologisch aktives Addukt bereit, das eine verlängerte in vivo-Halbwertszeit und verstärkte Potenz bei Säugetieren hat, das SCF umfaßt, der kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiert ist, wie etwa Polyethylenglycol oder Copolymere von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol, wobei besagtes Polymer nichtsubstituiert oder an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert ist. Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung liegt in einem Verfahren zum Herstellen des oben beschriebenen Addukts, das umfaßt: Umsetzen des SCF mit einem wasserlöslichen Polymer, das wenigstens eine terminale reaktive Gruppe hat, und Aufreinigen des resultierenden Addukts, um ein Produkt zu erzeugen mit verlängerter Kreislauf-Halbwertszeit und verstärkter biologischer Aktivität.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Anionenaustausch-Chromatogramm von der Aufreinigung von Säugetier- SCF.
Fig. 2 ist ein Gelfiltrations-Chromatogramm von der Aufreinigung von Säugetier-SCF.
Fig. 3 ist ein Weizenkeim-Agglutinin-Agarose-Chromatogramm von der Aufreinigung von Säugetier-SCF.
Fig. 4 ist ein Kationenaustausch-Chromatogramm von der Aufreinigung von Säugetier- SCF.
Fig. 5 ist ein C&sub4;-Chromatogramm von der Aufreinigung von Säugetier-SCF;
Fig. 6 zeigt eine Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) (SDS-PAGE) von C&sub4;-Säulenfraktionen aus Fig. 5.
Fig. 7 ist ein analytisches C&sub4;-Chromatogramm von Säugetier-SCF.
Fig. 8 zeigt SDS-PAGE von C&sub4;-Säulenfraktionen aus Fig. 7.
Fig. 9 zeigt SDS-PAGE von aufgereinigtem Säugetier-SCF und entglycosyliertem Säugetier-SCF.
Fig. 10 ist ein analytisches C&sub4;-Chromatogramm von aufgereinigtem Säugetier-SCF.
Fig. 11 zeigt die Aminosäuresequenz von Säugetier-SCF, abgeleitet aus einer Protein- Sequenzierung.
Fig. 12 zeigt
A. Oligonucleotide für Ratten-SCF-cDNA
B. Oligonucleotide für humane SCF-DNA
C. universelle Oligonucleotide;
Fig. 13 zeigt
A. ein Schema für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifizierung von Ratten-SCF-cDNA
B. ein Schema für die PCR-Amplifizierung von humaner SCF-cDNA.
Fig. 14 zeigt
A. eine Sequenzierungsstrategie für genomische Ratten-DNA
B. die Nukleinsäuresequenz von genomischer Ratten-DNA
C. die Nukleinsäuresequenz von Ratten-SCF-cDNA und die Aminosäuresequenz von Ratten-SCF-Protein.
Fig. 15 zeigt
A. die Strategie zum Sequenzieren von humaner genomischer DNA
B. die Nukleinsäuresequenz von humaner genomischer DNA
C. die zusammengesetze Nukleinsäuresequenz von humaner SCF-cDNA und Aminosäuresequenz von SCF-Protein.
Fig. 16 zeigt die aneinander ausgerichteten Aminosäuresequenzen von humanem, Affen-, Hunde-, Maus- und Ratten-SCF-Protein.
Fig. 17 zeigt die Struktur des Säugetierzell-Expressionsvektors V 19.8 SCF.
Fig. 18 zeigt die Struktur von Säugetier-CHO-Zell-Expressionsvektor pDSVE. 1.
Fig. 19 zeigt die Struktur von E.coli Expressionsvektor pCFM1156.
Fig. 20 zeigt
A. einen Radioimmungssay von Säugetier-SCF
B. SDS-PAGE von immun-gefälltem Säugetier-SCF.
Fig. 21 zeigt eine Westernanalyse von rekombinantem humanem SCF.
Fig. 22 zeigt eine Westernanalyse von rekombinantem Ratten-SCF.
Fig. 23 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung von COS-1-Zell-erzeugtem rekombinanten Ratten-SCF auf die Knochenmarktransplantation zeigt.
Fig. 24 zeigt die Wirkung von rekombinantem Ratten-SCF auf die Heilung der Makrocyten-Anämie von Steel-Mäusen.
Fig. 25 zeigt die Zellen-Anzahl von peripheren weißen Blutkörperchen (WBC) aus Steel- Mäusen, die mit rekombinantem Ratten-SCF behandelt worden sind.
Fig. 26 zeigt die Blutplättchen-Anzahlen von Steel-Mäusen, die mit rekombinantem Ratten-SCF behandelt worden sind.
Fig. 27 zeigt die differentielle WBC-Anzahl für Steel-Mäuse, die mit rekombinantem Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; PEG25 behandelt worden sind.
Fig. 28 zeigt die Lymphocyten-Untermengen für Steel-Mäuse, die mit rekombinantem Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; PEG25 behandelt worden sind.
Fig. 29 zeigt die Wirkung einer Behandlung von normalen Primaten mit rekombinantem SCF humaner Sequenz in Bezug auf eine anwachsende periphere WBC-Anzahl.
Fig. 30 zeigt die Wirkung einer Behandlung von normalen Primaten mit rekombinantem SCF humaner Sequenz in Bezug auf anwachsende Hämatokrit-Werte und Blutplättchen-Zahlen.
Fig. 31 zeigt Fotografien von
A. humanen Knochenmarkskolonien, die durch rekombinanten humanen SCF¹&supmin;¹&sup6;² stimuliert sind
B. Wright-Giemsa angefärbte Zellen aus Kolonien in Fig. 31A.
Fig. 32 zeigt die SDS-PAGE von S-Sepharose-Säulenfraktionen aus dem in Fig. 33 gezeigten
Chromatogramm
A. mit Reduktionsmittel
B. ohne Reduktionsmittel.
Fig. 33 ist ein Chromatogramm einer S-Sepharose-Säule von aus E.coli stammendem rekombinanten humanen SCF.
Fig. 34 zeigt eine SDS-PAGE von C&sub4;-Säulenfraktionen aus einem Chromatogramm, gezeigt in Fig. 35
A. mit Reduktionsmittel
B. ohne Reduktionsmittel.
Fig. 35 ist ein Chromatogramm einer C&sub4;-Säule von aus E. coli stammendem rekombinanten humanem SCF.
Fig. 36 ist ein Chromatogramm einer Q-Sepharose-Säule von aus CHO stammendem, rekombinanten Ratten-SCF.
Fig. 37 ist ein Chromatogramm einer C&sub4;-Säule von aus CHO stammendem, rekombinanten Ratten-SCF.
Fig. 38 zeigt eine SDS-PAGE von C&sub4;-Säulenfraktionen aus einem in Fig. 37 gezeigten Chromatogramm.
Fig. 39 zeigt eine SDS-PAGE von aufgereinigtem, aus CHO stammendem, rekombinantem Ratten-SCF vor und nach De-Glycosylierung.
Fig. 40 zeigt
A. eine Gelfiltrations-Chromatographie einer rekombinanten peg-ylierten Ratten- SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; Reaktionsmischung
B. eine Gelfiltrations-Chromatographie von rekombinantem Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;, nichtmodifiziert.
Fig. 41 zeigt markierten SCF, der an frische leukämische Blasten bindet;
Fig. 42 zeigt eine humane SCF-cDNA-Sequenz, erhalten aus der HT1080-Fibrosarcom- Zelllinie.
Fig. 43 zeigt ein Autoradiogramm von COS-7-Zellen, die humanen SCF¹&supmin;²&sup4;&sup8; exprimieren, und CHO-Zellen, die humanen SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; exprimieren.
Fig. 44 zeigt eine humane SCF-cDNA-Sequenz, die aus der 5637-Blasenkarzinom- Zelllinie erhalten worden ist.
Fig. 45 zeigt die erhöhte Überlebensrate von bestrahlten Mäusen nach SCF-Behandlung.
Fig. 46 zeigt die erhöhte Überlebensrate von bestrahlten Mäusen nach Knochenmarktransplantation mit 5% einer Femur- und SCF-Behandlung.
Fig. 47 zeigt die erhöhte Überlebensrate von bestrahlten Mäusen nach einer Knochenmarktransplantation mit 0,1 und 20% einer Femur- und SCF-Behandlung.
Zahlreiche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden für Fachleute nach Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung offensichtlich sein, die Illustrationen der Ausübung der Erfindung in ihren gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen bereitstellt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Stammzellenfaktoren und DNA-Sequenzen, die für den gesamten oder einen Teil von solchen SCFs codieren, bereitgestellt. Der Begriff "Stammzellenfaktor" oder "SCF", wie hierin verwendet, bezieht sich auf natürlich vorkommenden SCF (z. B. natürlichen humanen SCF) sowie nicht natürlich vorkommenden (d. h. unterschiedlich zu den natürlich vorkommenden) Polypeptiden mit Aminosäuresequenzen und einer Glycosylierung, die diejenige von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor hinreichend verdoppelt, um den Besitz einer hämatopoetischen biologischen Aktivität von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor zu ermöglichen. Ein Stammzellenfaktor hat die Fähigkeit, das Wachstum früher hämatopoetischer Vorläufer zu stimulieren, die in der Lage sind, zu erythroiden, Megakaryocyten, Granulocyten, Lymphocyten und Makrophagen-Zellen heranzureifen. Eine Behandlung von Säugetieren mit SCF führt zu einem absoluten Anwachsen hinsichtlich hämatopoetischer Zellen von sowohl myeloiden als auch lymphoiden Zelllinien. Eines der charakteristischen Merkmle von Stammzellen ist ihre Fähigkeit, in sowohl myeloide als auch lymphoide Zellen zu differenzieren [Weissmann, Science, 241 58-62 (1988)]. Eine Behandlung von Steel-Mäusen (Beispiel 8B) mit rekombinantem Ratten-SCF führt zu Steigerungen der Granulocyten, Monocyten, Erythrocyten, Lymphocyten und Blutplättchen. Eine Behandlung von normalen Primaten mit rekombinantem menschlichen SCF führt zu Steigerungen in myeloiden und lymphoiden Zellen (Beispiel 8C).
Es gibt eine embryonale Expression von SCF durch Zellen auf dem Wanderungsweg und an Homing-Stellen von Melanoblasten, Keimzellen, hämatopoetischen Zellen, Hirn und dem Rückenmark.
Frühe hämatopoetische Vorläuferzellen reichern sich im Knochenmark von Säugetieren an, das mit 5-Fluoruracil (5-FU) behandelt worden ist. Das chemotherapeutische Arzneimittel 5- FU erschöpft selektiv die späten hämatopoetischen Vorläufer. SCF ist aktiv im Hinblick auf post-5-FU-Knochenmark.
Die biologische Aktivität und das Muster der Gewebeverteilung von SCF demonstrieren seine zentrale Rolle bei der Embryogenese und Hämatopoese sowie seine Fähigkeit zur Behandlung von verschiedenen Stammzell-Defizienzen.
Die vorliegende Erfindung stellt DNA-Sequenzen bereit, die einschließen: den Einbau von Codons, die zur Expression durch ausgewählte Nicht-Säugetierwirte "bevorzugt" sind; das Bereitstellen von Stellen zur Spaltung durch Restriktionsendonuklease-Enzyme; und das Bereitstellen von zusätzlichen anfänglichen, terminalen oder dazwischen liegenden DNA- Sequenzen, die die Konstruktion von leicht exprimierten Vektoren erleichtern. Die vorliegende Erfindung stellt ebenso DNA-Sequenzen bereit, die für Polypeptid-Analoge oder Derivate von SCF codieren, die sich von natürlich vorkommenden Formen hinsichtlich der Identität oder Stelle eines oder mehrerer Aminsoäurereste unterscheiden (d. h. Deletions-Analoge, die weniger als die gesamten für SCF spezifizierten Reste enthalten; Substitutions-Analoge, wobei ein oder mehrere spezifizierte Reste durch andere Reste ersetzt worden sind; und Additions-Analoge, wobei ein oder mehrere Aminosäurereste einem terminalen oder mittleren Teil des Polypeptids zugefügt worden ist) und die einige oder alle Eigenschaften der natürlich vorkommenden Formen teilen. Die vorliegende Erfindung stellt spezifisch DNA-Sequenzen bereit, die für die nicht-verarbeitete Aminosäuresequenz in ihrer Gesamtlänge codieren, sowie DNA-Sequenzen, die für die verarbeitete Form von SCF codieren.
Neue DNA-Sequenzen der Erfindung schließen Sequenzen ein, die nützlich sind beim Sicherstellen der Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen von Polypeptidprodukten mit wenigstens einem Teil der primärstrukturellen Konformation und einer oder mehreren der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem SCF. DNA- Sequenzen der Erfindung umfassen spezifisch: (a) DNA-Sequenzen, die in Fig. 14B, 14C, 15B, 15C, 42 und 44 dargestellt sind, oder ihre komplementären Stränge; (b) DNA- Sequenzen, die (unter Hybridisierungsbedingungen, die in Beispiel 3 offenbart sind, oder stringenteren Bedingungen) an die DNA-Sequenzen in Fig. 14B, 14C, 15B, 15C, 42 und 44 oder an Fragmente davon hybridisieren; und (c) DNA-Sequenzen, die ohne die Degeneration des genetischen Codes, an die DNA-Sequenzen in Fig. 14B, 14C, 15B, 15SC, 42 und 44 hybridisieren würden. Spezifisch umfaßt in den Teilen (b) und (c) sind genomische DNA- Sequenzen, die für allelische variante Formen von SCF codieren und/oder die für SCF von anderen Säugetierarten codieren, und hergestellte DNA-Sequenzen, die für SCF, Fragmente von SCF und Analoge von SCF codieren. Die DNA-Sequenzen können Codons einbauen, die die Transkription und Translation von Boten-RNA in mikrobiellen Wirten erleichtern. Solche hergestellten Sequenzen können auf leichte Weise gemäß den Verfahren von Alton et al., veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 83/04053, konstruiert werden.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die hierin beschriebenen DNA-Sequenzen, die für Polypeptide mit SCF-Aktivität codieren, wertvoll für die Information, die sie im Hinblick auf die Aminosäuresequenz des Säugetierproteins bereitstellen, die bislang nicht zur Verfügung standen. Die DNA-Sequenzen sind ebenso als Produkte nützlich beim Durchführen einer Synthese von SCF auf großem Maßstab mit einer Vielzahl von rekombinanten Techniken. Auf eine andere Weise gesagt, sind die von der Erfindung bereitgestellten DNA-Sequenzen nützlich zum Erzeugen von neuen und nützlichen viralen und zirkulären Plasmid-DNA-Vektoren, neuen und nützlichen transformierten und transfizierten prokaryontischen und eukaryontischen Wirtszellen (einschließlich bakterieller und Hefezellen und Säugetierzellen, die in Kultur wachsen gelassen worden sind) und von neuen und nützlichen Verfahren zum kultivierten Wachstum von solchen Wirtszellen, die zur Expression von SCF und seinen verwandten Produkten in der Lage sind.
DNA-Sequenzen der Erfindung sind ebenso geeignete Materialien zur Verwendung als markierte Sonden beim Isolieren von menschlicher genomischer DNA, die für SCF und andere Gene für verwandte Proteine codiert, sowie von cDNA- und genomischen DNA-Sequenzen von anderen Säugetierarten. DNA-Sequenzen können ebenso bei verschiedenen alternativen Verfahren der Proteinsynthese (z. B. in Insektenzellen) oder bei der Gentherapie bei Menschen und anderen Säugetieren nützlich sein. Es wird erwartet, daß DNA-Sequenzen der Erfindung beim Entwickeln von transgenen Säugetierarten nützlich sind, die als eukaryontische "Wirte" zur Herstellung von SCF und SCF-Produkten in Mengen dienen können. Siehe im allgemeinen Palmiter et al., Science 222, 809-814 (1983).
Die vorliegende Erfindung stellt aufgereinigten und isolierten, natürlich vorkommenden SCF (d. h. aufgereinigt aus der Natur oder so hergestellt, daß die Primär-, Sekundär- und Tertiär- Konformation und das Glycosylierungsmuster mit natürlich vorkommendem Material identisch sind) sowie nicht natürlich vorkommende Polypeptide mit einer primärstrukturellen Konformation (d. h. eine kontinuierliche Sequenz von Aminosäureresten) und einer Glycosylierung, die hinreichend diejenige von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor verdoppelt, um den Besitz von hämatopoetischer biologischer Aktivität von natürlich vorkommendem SCF zu ermöglichen. Solche Polypeptide schließen Derivate und Analoge ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist SCF dadurch gekennzeichnet, daß er das Produkt von prokaryontischer und eukaryontischer Wirt-Expression (z. B. durch bakterielle, Hefe- hö here Pflanzen-, Insekten- und Säugetierzellen in Kultur) von exogenen DNA-Sequenzen ist, die von genomischem oder cDNA-Klonieren oder durch Gensynthese erhalten worden sind. Das heißt, in einer bevorzugten Ausführungsform ist SCF "rekombinanter SCF". Die Expressionsprodukte in typischen Hefe- (z. B. Saccharomyces cerevisiae) oder Prokaryonten- (z. B. E. coli) Wirtszellen sind frei von einer Assoziation mit irgendwelchen Säugetierproteinen. Die Produkte der Expression in Vertebraten [z. B. nicht-humane Säugetier- (z. B. COS oder CHO) und Vogel-] Zellen sind frei von einer Assoziation mit irgendwelchen humanen Proteinen. Abhängig von dem verwendeten Wirt können die Polypeptide der Erfindung mit Säugetier oder anderen eukaryontischen Kohlenhydraten glycosyliert sein oder können nichtglycosyliert sein. Die Wirtszelle kann verändert werden unter Verwendung von Techniken, wie diejenigen, die in Lee et al., J. Biol. Chem. 264, 13848 (1989) beschrieben und hierin durch Bezugnahme miteinbezogen sind. Polypeptide der Erfindung können ebenso einen anfänglichen Methioninaminosäure-Rest einschließen (bei Position -1).
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden allelischen Formen von SCF umfaßt die vorliegende Erfindung ebenso andere SCF-Produkte, wie etwa Polypeptid-Analoge von SCF. Solche Analoge schließen Fragmente von SCF ein. Unter Befolgung der Prozeduren der oben erwähnten veröffentlichten Anmeldung von Alton et al., (WO 83/04053) kann man auf leichte Weise Gene konstruieren und herstellen, die für die mikrobielle Expression von Polypeptiden codieren, die Primärkonformationen haben, welche sich von den hierin spezifizierten hinsichtlich der Identität oder Stelle von einem oder mehreren Resten (z. B. Substitutionen, terminale und intermediäre Additionen und Deletionen) unterschieden. Andererseits können Modifizierungen von cDNA und genomischen Genen auf leichte Weise durch bekannte stellengerichtete Mutagenese-Techniken erreicht und zum Erzeugen von Analogen und Derivaten von SCF verwendet werden. Solche Produkte teilen wenigstens eine der biologischen Eigenschaften von SCF, können aber hinsichtlich anderer unterschiedlich sein. Zum Beispiel schließen Produkte der Erfindung diejenigen ein, die durch z. B. Deletionen verkürzt worden sind; oder diejenigen, die gegenüber Hydrolyse stabiler sind (und deshalb stärker ausgeprägte oder langlebigere Wirkungen als natürlich vorkommende haben können); oder die verändert worden sind, um eine oder mehrere potentielle Stellen zur O-Glykosylierung und/oder N- Glykosylierung zu deletieren oder hinzuzufügen, oder die einen oder mehrere Cysteinreste deletiert oder durch z. B. Alanin- oder Serinreste ersetzt haben und potentiell leichter in einer aktiven Form aus mikrobiellen Systemen isoliert werden; oder die einen oder mehrere Tyrosinreste durch Phenylalanin ersetzt haben und mehr oder weniger leicht an Target-Proteine oder andere Rezeptoren auf Target-Zellen binden. Ebenso umfaßt sind Polypeptidfragmente, die nur einen Teil der kontinuierlichen Aminsosäuresequenz oder Sekundärkonformation innerhalb des SCF verdoppeln, wobei die Fragmente eine Eigenschaft von SCF (z. B. Rezeptorbindung) und nicht andere (z. B. frühe hämatopoetische Zeliwachstumsaktivität) besitzen können. Es ist bemerkenswert, daß eine Aktivität nicht dafür notwendig ist, daß eines oder mehrere der Produkte der Erfindung therapeutische Nützlichkeit [s. Weiland et al., Blut, 44 173- 175 (1982)] oder Nützlichkeit in anderen Kontexten hat, wie etwa bei Assays von SCF- Antagonismus. Kompetitive Antagonisten können ziemlich nützlich bei z. B. Fällen von Überproduktion von SCF oder Fällen von menschlichen Leukämien sein, bei denen die malignen Zellen Rezeptoren for SCF überexprimieren, wie durch die Überexpression von SCF- Rezeptoren in leukämischen Blasten angezeigt wird (Beispiel 13).
Von Anwendbarkeit auf Polypeptid-Analoge der Erfindung sind Berichte über die immunologische Eigenschaft von synthetischen Peptiden, die im wesentlichen die Aminosäuresequenz duplizieren, die in natürlich vorkommenden Proteinen, Glycoproteinen und Nukleoproteinen vorhanden ist. Spezifischer ist gezeigt worden, daß Polypeptide mit relativ niedrigem Molekulargewicht an Immunreaktionen teilnehmen, die hinsichtlich der Dauer und des Ausmaßes · den Immunreaktionen von physiologisch signifikanten Proteinen ähnlich sind, wie etwa viralen Antigenen, Polypeptidhormonen und ähnlichen. Eingeschlossen in den Immunreaktionen von solchen Polypeptiden ist das Hervorrufen der Bildung von spezifischen Antikörpern in immunologisch aktiven Tieren [Lerner et al., Cell, 23, 309-310 (1981); Ross et al., Nature, 294, 654-656 (1981); Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5197-5200 (1980); Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 3403-3407 (1981); Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4882-4886 (1981); Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5322-5326 (1982); Baron et al., Cell, 28, 395-404 (1982); Dressman et al., Nature, 295, 185-160 (1982); und Lerner, Scientific American, 248, 66-74 (1983)]. Siehe auch Kaiser et al. [Science, 223, 249-255 (1984)], der sich auf biologische und immunologische Eigenschaften von synthetischen Peptiden bezieht, die Sekundärstrukturen der Peptidhormone näherungsweise teilen, nicht aber ihre primärstrukturelle Konformation teilen mögen.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenso diejenige Klasse von Peptiden ein, die durch Portionen der DNA codiert werden, die komplementär zu dem Protein-codierenden Strang der humanen cDNA oder genomischen DNA-Sequenzen von SCF sind, d. h. "komplementäre in vertierte Proteine", wie beschrieben von Tramontano et al. [Nucleic Acid Res., 12, 5049-5059 (1984)].
Repräsentative SCF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf SCF¹&supmin;¹&sup4;&sup8;, SCF¹&supmin;¹&sup6;², SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;, SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup5; und SCF¹&supmin;¹&sup8;³ in Fig. 15C; SCF¹&supmin;¹&sup8;&sup5;, SCF¹&supmin; ¹&sup8;&sup8;, SCF¹&supmin;¹&sup8;&sup9; und SCF¹&supmin;²&sup4;&sup8; in Fig. 42; und SCF¹&supmin;¹&sup5;&sup7;, SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup0;, SCF¹&supmin;¹&sup6;¹ und SCF¹&supmin;²²&sup0; in Fig. 44.
SCF kann aufgereinigt werden unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten bekannt sind. Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Aufreinigen von SCF aus einem SCF-enthaltenden Material, wie etwa konditionierten Medien oder menschlichem Urin, Serum, wobei das Verfahren einen oder mehrere Schritte, wie die folgenden umfaßt: Unterziehen des SCF-enthaltenden Materials einer Ionenaustausch-Chromatographie (entweder Kationen- oder Anionenaustausch-Chromatographie); Unterziehen des SCF-enthaltenden Materials einer Umkehrphasen-flüssigchromatographischen Trennung, die z. B. ein immobilisiertes C&sub4;- oder C&sub6;-Harz einbezieht; Unterziehen der Flüssigkeit einer Chromatographie an inimobilisiertem Lectin, d. h. Binden des SCF an das immobilisierte Lectin und Eluieren mit der Verwendung eines Zuckers, der um diese Bindung konkurriert. Details bei der Verwendung dieser Verfahren werden aus den in Beispielen 1, 10 und 11 gegebenen Beschreibungen zur Aufreinigung von SCF ersichtlich werden. Die in Beispiel 2 des Lai et al. US Patents 4 667 016 beschriebenen Techniken, hiermit durch Bezugnahme miteinbezogen, sind ebenso beim Aufreinigen von Stammzellenfaktor nützlich.
Isoformen von SCF werden unter Verwendung von Standardtechniken isoliert, wie etwa die in US Ser. No. 421 444, mit mehreren Inhabern, mit dem Titel "Erythropoietin Isoforms", eingereicht am 13. Oktober 1989, hiermit durch Bezugnahme mitaufgenommen.
Ebenso von der Erfindung umfaßt sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die therapeutisch wirksame Mengen von Polypeptidprodukten der Erfindung zusammen mit geeigneten Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Löslichkeitsvermittlern, Emulgatoren, Adjuvantien und/oder Trägern, die bei einer SCF-Therapie nützlich sind, betreffen. Eine "therapeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet, bezieht sich auf diejenige Menge, die eine therapeutische Wirkung für eine gegebene Bedingung und einen Verabreichungsmodus bereitstellt. Solche Zusammensetzungen sind Flüssigkeiten oder lyophilisierte oder ansonsten getrocknete Formulierungen und schließen Verdünnungsmittel verschiedenen Puffergehalts (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH und Ionenstärke, Zusatzstoffe wie etwa Albumin oder Gelatine, um Adsorption an Oberflächen zu verhindern, Detergentien (z. B. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, Gallensäuresalze), Löslichkeitsvermittler (z. B. Glycerin, Polyethylenglycol), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Füllsubstanzen oder Modifikatoren der Tonizität (z. B. Lactose, Mannitol), kovalentes Anhängen von Polymeren, wie etwa Polyethylenglycol, an das Protein (beschrieben in Beispiel 12, unten), Komplexierung mit Metallionen oder Einbau des Materials in oder auf partikuläre Zubereitungen von polymeren Verbindungen, wie etwa Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Hydrogele, etc. oder in Liposomen, Mikroemulsionen, Micellen, unilaminare oder multilaminare Vesikel, Erythrocyten-Ghosts oder Sphäroplasten ein. Solche Zusammensetzungen werden den physischen Zustand, die Löslichkeit, die Stabilität, die Rate der in vivo-Freisetzung und die Rate der in vivo-Clearance von SCF beeinflussen. Die Auswahl der Zusammensetzung wird von den physikalischen und chemischen Eigenschaften des Proteins mit SCF-Aktivität abhängen. Zum Beispiel kann ein Produkt, das aus einer membrangebundenen Form von SCF stammt, eine Detergens-enthaltende Formulierung erfordern. Zusammensetzungen mit kontrollierter oder anhaltender Freisetzung schließen eine Formulierung in lipophilen Depots (z. B. Fettsäuren, Wachsen, Ölen) ein. Ebenso umfaßt von der Verbindung sind partikuläre Zusammensetzungen, die mit Polymeren (z. B. Poloxameren oder Poloxaminen) und SCF beschichtet sind, der an Antikörper gekoppelt ist, die gegen gewebespezifische Rezeptoren, Liganden oder Antigene gerichtet sind, oder der an Liganden von gewebespezifischen Rezeptoren gekoppelt ist. Andere Ausführungsformen der Zusammensetzungen der Erfindung schließen partikuläre Formen, Schutzschichten, Protease- Inhibitoren oder Permeationsverstärker für verschiedene Routen der Verabreichung ein, einschließlich parenteral, über die Lunge, nasal und oral.
Die Erfindung umfaßt ebenfalls Zusammensetzungen, einschließlich eines oder mehrerer zusätzlicher hämatopoetischer Faktoren, wie etwa EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IGF-I oder LIF (Leukämie- Inhibitorischer Faktor).
Polypeptide der Erfindung können durch Assoziation mit einer nachweisen Markersubstanz (z. B. radioaktiv markiert mit ¹²&sup5;I oder biotinyliert) "markiert" sein, um Reagentien bereitzustellen, die beim Nachweis und der Quantifizierung von SCF oder von Zellen, die seinen Rezeptor tragen, in festem Gewebe und flüssigen Proben, wie etwa Blut oder Urin, nützlich sind.
Biotinylierter SCF ist im Zusammenhang mit immobilisiertem Streptavidin nützlich, um leukämische Blasten aus Knochenmark bei autologer Knochenmarkstransplantation zu spülen. Biotinylierter SCF ist im Zusammenhang mit immobilisiertem Streptavidin nützlich, um Stammzellen bei autologen oder allogenen Stammzellen in autologer oder allogener Knochenmarktransplantation anzureichern. Toxin-Konjugate von SCF, wie etwa Ricin [Uhr, Proa. Clin. Biol. Res. 288, 403-412 (1989)] Diphtherie-Toxin [Moolten, J. Natl. Con. Inst., 55, 473- 477 (1975)] und Radioisotope sind zur direkten anti-neoplastischen Therapie (Beispiel 13) oder als Konditionierungsschema zur Knochenmarktransplantation nützlich.
Nukleinsäureprodukte der Erfindung sind nützlich, wenn sie mit nachweisbaren Markern markiert (wie etwa radioaktiven Markern und nicht-isotopischen Markierungen, wie etwa Biotin) und bei Hybridisierungsprozessen verwendet werden, um die Position des menschlichen SCF-Gens und/oder die Position einer verwandten Genfamilie auf einer Chromosomenkarte festzustellen. Sie sind ebenso nützlich zum Identifizieren von Störungen des menschlichen SCF-Gens auf dem DNA-Niveau und werden als Genmarker zum Identifizieren von benachbarten Genen und ihren Störungen verwendet. Das menschliche SCF-Gen wird auf Chromosom 12 codiert, und das murine SCF-Gen kartiert auf Chromosom 10 am S1-Lokus.
SCF ist nützlich, alleine oder in Kombination mit einer anderen Therapie, bei der Behandlung einer Anzahl von hämatopoetischen Störungen. SCF kann alleine oder mit einem oder mehreren zusätzlichen hämatopoetischen Faktoren verwendet werden, wie etwa EPO, G-CSF, GM- CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-1, IGF-I oder LIF bei der Behandlung von hämatopoetischen Störungen.
Es gibt eine Gruppe von Stammzellenstörungen, die durch eine Reduktion der funktionalen Markmasse aufgrund von toxischer, Bestrahlungs- oder immunologischer Verletzung charakterisiert sind und die mit SCF behandelbar sind. Aplastische Anämie ist eine Stammzellenstörung, bei der ein Fettersatz von hämatopoetischem Gewebe und Pancytopenie vorliegt. SCF verstärkt die hämatopoetische Proliferation und ist beim Behandeln von aplastischer Anämie nützlich (Beispiel 8B). Steel-Mäuse werden als ein Modell von menschlicher aplastischer Anämie verwendet [Jones, Exp. Hematol., 11, 571-580 (1983)]. Vielversprechende Resultate sind bei der Verwendung eines verwandten Cytokins, GM-CSF bei der Behandlung von aplastischer Anämie erhalten worden [Antin, et al., Blood, 70, 129a (1987)]. Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH) ist eine Stammzellenstörung, die durch die Bildung von defekten Blutplättchen und Granulocyten sowie abnormen Erythrocyten charakterisiert ist.
Es gibt viele Krankheiten, die mit SCF behandelbar sind. Diese schließen die folgenden ein: Myelofibrose, Myelosklerose, Osteopetrose, metastatisches Carcinom, akute Leukämie, multiples Myelom, Hodgkinsche Krankheit, Lymphom, Gauchersche Krankheit, Niemann- Picksche Krankheit, Letterer-Siwesche Krankheit, refraktäre erythroblastische Anämie, Di- Guglielmo Syndrom, kongestive Splenomegalie, Hodgkinsche Krankheit, Kala-Azar, Sarcoidose, primäre Milz-Pancytopenie, Miliartuberkulose, disseminierte Pilzkrankheit, Septikämie fulminans, Malaria, Vitamin B&sub1;&sub2;-Mangel und Folsäuremangel, Pyridoxinmangel, Diamond Blackfan-Anämie, Hypopigmentationsstörungen, wie etwa Piebaldismus und Vitiligo. Die erythroiden, Megakaryocyten- und Granulocyten-stimulatorischen Eigenschaften von SCF werden in Beispiel 8B und 8C illustriert.
Die Verstärkung des Wachstums in nicht-hämatopoetischen Stammzellen, wie etwa primordialen Keimzellen, aus der Neuralleiste stammende Melanocyten, kommissuralen Axonen, die aus dem dorsalen Rückenmark stammen, Cryptenzellen des Darms, mesonephrische und metanephrische Nierentubuli, und Bulbi olfactorii ist von Vorteil bei Zuständen, bei denen eine spezifische Gewebeschädigung an diese Stellen stattgefunden hat. SCF ist zum Behandeln von neurologischem Schaden nützlich und ist ein Wachstumsfaktor für Nervenzellen. SCF ist während in vitro-Befruchtungsprozeduren oder bei der Behandlung von Unfruchtbarkeitszuständen nützlich. SCF ist nützlich zum Behandeln von Darmschäden, die aus einer Bestrahlung oder Chemotherapie resultieren.
Es gibt Stammzellen-myeloproliferative Störungen, wie etwa Polycythaemia vera, chronische myelogene Leukämie, myeloide Metaplasie, primäre Thrombocythaemie und akute Leukämien, die mit SCF, anti-SCF-Antikörpern oder SCF-Toxin-Konjugaten behandelbar sind.
Es gibt zahlreiche Fälle, die die erhöhte Proliferation von leukämischen Zellen auf die hämatopoetischen Zellwachstumsfaktoren G-CSF, GM-CSF und IL-3 dokumentieren [Delwel, et al., Blood, 72, 1944-1949 (1988)]. Da der Erfolg vieler chemotherapeutischer Arzneimittel von der Tatsache abhängt, daß neoplastische Zellen einen aktiveren Zyklus als normale Zellen haben, fungiert SCF alleine oder in Kombination mit anderen Faktoren als ein Wachstumsfaktor für neoplastische Zellen und sensibilisiert sie gegenüber den toxischen Effekten von chemotherapeutischen Arzneimitteln. Die Überexpression von SCF-Rezeptoren auf leukämischen Blasten wird in Beispiel 13 gezeigt.
Eine Anzahl an rekombinanten hämatopoetischen Faktoren durchlaufen Erforschung hinsichtlich ihrer Fähigkeit, den aus Chemotherapie und Bestrahlungsschemata resultierenden Leukocyten-Tiefstand zu verkürzen. Obwohl diese Faktoren bei diesem Ansatz sehr nützlich sind, gibt ein frühes hämatopoetisches Kompartiment, das beschädigt wird, insbesondere durch Bestrahlung, und wieder bevölkert werden muß, bevor diese später agierenden Wachstumsfaktoren ihre optimale Wirkung ausüben können. Die Verwendung von SCF alleine oder in Kombination mit diesen Faktoren verkürzt weiter oder eliminiert den Leukocyten- und Blutplättchen-Tiefstand, der aus Chemotherapie oder Bestrahlungsbehandlung resultiert. Zusätzlich ermöglicht SCF eine Dosis-Intensivierung des anti-neoplastischen oder Bestrahlungs- Schema (Beispiel 19).
SCF ist zum Expandieren früher hämatopoetischer Vorläufer bei syngener, allogener oder autologer Knochenmarktransplantation nützlich. Es ist gezeigt worden, daß die Verwendung von hämatopoetischen Wachstumsfaktoren die Zeit zur Erholung der Neutrophilen nach der Transplantation verringert [Donahue, et al., Nature, 321, 872-875 (1986) und Welte et al., J. Exp. Med., 165, 941-948, (1987)]. Für Knochenmarktransplantation werden die folgenden drei Szenarien alleine oder in Kombination verwendet: Ein Donor wird mit SCF alleine oder in Kombination mit andere hämatopoetischen Faktoren vor der Knochenmarkaspiration oder Peripherblut-Leukophorese behandelt, um die Anzahl an zur Transplantation verfügbaren Zellen zu erhöhen; das Knochenmark wird in vitro behandelt, um die Zellzahl vor der Transplantation zu aktivieren oder expandieren; schließlich wird der Empfänger behandelt, um die Verpflanzung des Spendermarks zu verstärken.
SCF ist nützlich zum Verstärken der Effizienz von Gentherapie auf der Grundlage der Transfektion (oder Infektion mit einem retroviralen Vektor) von hämatopoetischen Stammzellen. SCF ermöglicht das Kultivieren und die Multiplikation der frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen, die transfiziert werden sollen. Die Kultur kann mit SCF alleine oder in Kombination mit IL-6, IL-3 oder beiden durchgeführt werden. Wenn sie transfiziert sind, werden diese Zellen dann in einem Knochenmarkstransplantat in Patienten eingespritzt, die an genetischen Störungen leiden. [Lim, Proc. Natl. Acad. Sci, 86, 8892-8896 (1989)]. Beispiele von Genen, die zur Behandlung von genetischen Störungen nützlich sind, schließen Adenosin-Deaminase, Glucocerebrosidase, Hämoglobin und cystische Fibrose ein.
SCF ist nützlich zur Behandlung von erworbener Immunschwäche (AIDS) oder starken kombinierten Immundefizienz-Zuständen (SCID) alleine oder in Kombination mit anderen Faktoren, wie etwa IL-7 (siehe Beispiel 14). Illustrativ für diesen Effekt ist die Fähigkeit einer SCF-Therapie, den absoluten Titer von zirkulierenden T-Helfer-(CD4+, OKT&sub4;+)- Lymphocyten zu erhöhen. Diese Zellen sind das primäre zelluläre Target von humanem Immunschwächevirus (HIV), was zu dem Immunschwächezustand bei AIDS-Patienten führt [Montagnier, in Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, ed. R. C. Gallo, Cold Spring Harbor, New York, 369-379 (1984)]. Zusätzlich ist SCF nützlich zum Bekämpfen der myelosuppressiven Effekte von anti-HIV-Arzneimitteln, wie etwa AZT [Gogu Life Sciences, 45, No. 4 (1989)].
SCF ist nützlich zum Verstärken der hämatopoetischen Erholung nach akutem Blutverlust.
Eine in-vivo-Behandlung mit SCF ist nützlich als ein Boost für das Immunsystem, um Neoplasie zu bekämpfen (Krebs). Ein Beispiel der therapeutischen Nützlichkeit der direkten Immunfunktions-Verstärkung durch ein vor kurzem kloniertes Cytokin (IL-2) ist in Rosenberg et al. beschrieben, N. Eng. J. Med., 313 1485 (1987).
Die Verabreichung von SCF mit anderen Mitteln, wie etwa einem oder mehreren anderen hämatopoetischen Faktoren, ist mit zeitlichen Zwischenräumen oder wird zusammen gegeben. Eine vorherige Behandlung mit SCF vergrößert eine Vorläuferpopulation, die auf terminal-agierende hämatopoetische Faktoren antwortet, wie etwa G-CSF oder EPO. Die Route der Verabreichung kann intravenös, intraperitoneal, sub-cutan oder intramuskulär sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Antikörper, die spezifisch an Stammzellenfaktor binden. Beispiel 7 unten beschreibt die Herstellung von polyklonalen Antikörpern. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind monoklonale Antikörper, die spezifisch SCF binden (siehe Beispiel 20). Im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörper- Zubereitungen, die typischerweise verschiedene Antikörper einschließen, die gegen verschiedene Determinantien (Epitope) gerichtet sind, ist jeder monoklonaler Antikörper gegen eine einzelne Determinante auf dem Antigen gerichtet. Monoklonale Antikörper sind zum Verbes sern der Selektivität und Spezifität von diagnostischen und analytischen Assay-Verfahren unter Verwendung von Antigen-Antikörper-Bindung nützlich. Ebenso werden sie verwendet, um SCF zu neutralisieren oder aus dem Serum zu entfernen. Ein zweiter Vorteil von monoklonalen Antikörpern ist, daß sie durch Hybridoma-Zellen in Kultur synthetisiert werden können, nicht-kontaminiert durch andere Immunglobuline. Monoklonale Antikörper können aus Überständen von kultivierten Hybridoma-Zellen oder aus Ascites hergestellt werden, induziert durch intraperitoneale Impfung von Hybridoma-Zellen in Mäuse. Die Hybridoma- Technik, ursprünglich von Köhler und Milstein beschrieben [Eur. J. Immunol. 6, 511-519 (1976)] ist in großem Maße angewendet worden, um hybride Zelllinien zu produzieren, die hohe Titer an monoklonalen Antikörpern gegen viele spezifische Antigene ausscheiden.
Die folgenden Beispiele werden dargeboten, um die Erfindung vollständiger zu illustrieren, sind aber nicht dazu gedacht, den Umfang davon einzuschränken.

BEISPIEL 1

Aufreinigung/Charakterisierung von Stammzellenfaktor aus Buffalo-Rattenleberzellenkonditioniertem Medium

A. In vitro-biologische Assays

1. HPP-CFC-Assay

Es gibt eine Vielzahl biologischer Aktivitäten, die dem natürlichen Säugetier-Ratten-SCF sowie dem rekombinanten Ratten-SCF-Protein zugeschrieben werden kann. Eine solche Aktivität ist sein Effekt auf frühe hämatopoetische Zellen. Diese Aktivität kann in einem Hochproliferativen-Potential-Koloniebildenden-Zell(HPP-CFC)-Assay [Zsebo, et al., oben (1988)] gemessen werden. Um die Wirkungen von Faktoren auf frühe hämatopoetische Zellen zu erforschen, benutzt das HPP-CFC-Assay-System Mäuse-Knochenmark, das aus Tieren stammt, zwei Tage nach einer Behandlung mit 5-Fluoruracil (5-FU). Das chemotherapeutische Arzneimittel 5-FU erschöpft selektiv späte hämatopoetische Vorläufer, was den Nachweis von frühen Vorläuferzellen und damit Faktoren, die auf solche Zellen wirken, ermöglicht. Der Ratten-SCF wird in der Anwesenheit von CSF-1 oder IL-6 in halbfesten Agarkulturen ausplattiert. Die Agarkulturen enthalten McCoysches vollständiges Medium (GIBCO), 20% fötales bovines Serum, 0,3% Agar und 2 · 10&sup5; Knochenmarkzellen/ml. Das McCoysche voll ständige Medium enthält die folgenden Bestandteile: 1 · McCoysches Medium, das mit 0,1 mM Pyruvat, 0,24 · essentielle Aminosäuren, 0,24 · nicht-essentielle Aminosäuren, 0,027% Natriumbicarbonat, 0,24 · Vitamine, 0,72 mM Glutamin, 25 ug/ml L-Serin und 12 ug/ml L- Asparagin supplementiert ist. Die Knochenmarkszellen werden aus Balb/c-Mäusen erhalten, denen i, v. 150 mg/kg 5-FU injiziert worden ist. Die Oberschenkelknochen werden zwei Tage nach 5-FU-Behandlung der Mäuse geerntet, und das Knochenmark wird ausgespült. Die roten Blutkörperchen werden mit Lysereagens für rote Blutkörperchen (Becton Dickenson) vor dem Ausplattieren lysiert. Die Testsubstanzen werden mit der obigen Mischung in 30 mm Schalen ausplattiert. Vierzehn Tage später werden die Kolonien (> 1 mm im Durchmesser), die Tausende von Zellen enthalten, bewertet. Dieser Assay wurde durch die gesamte Aufreinigung von natürlichem, aus Säugetierzellen stammenden Ratten-SCF verwendet.
In einem typischen Assay verursacht Ratten-SCF die Proliferation von näherungsweise 50 HPP-CFC pro 200.000 ausplattierten Zellen. Der Ratten-SCF hat eine synergistische Aktivität auf 5-FU-behandelte Maus-Knochenmarkzellen; HPP-CFC-Kolonien werden sich in der Anwesenheit einzelner Faktoren nicht bilden, aber die Kombination aus SCF und CSF-1 oder SCF und IL-6 ist bei diesem Assay aktiv.

2. MC/9-Assay

Eine andere nützliche biologische Aktivität von sowohl natürlich gewonnenem als auch rekombinantem Ratten-SCF ist die Fähigkeit die Proliferation der IL-4-abhängigen murinen Mastzellinie, MC/9 (ATCC CRL 8306) zu verursachen. MC/9-Zellen werden mit einer Quelle von IL-4 gemäß dem ATCC CRL 8306-Protokoll kultiviert. Das in dem Bioassay verwendete Medium ist RPMI 1640, 4% fötales bovines Serum, 5 · 10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol und 1 · Glutamin-pen-strep. Die MC/9-Zellen proliferieren in Antwort auf SCF ohne das Erfordernis für andere Wachstumsfaktoren. Diese Proliferation wird gemessen zuerst durch Kultivieren der Zellen für 24 h ohne Wachstumsfaktoren, Ausplattieren von 5000 Zellen in jedem Napf von 96-Napf-Platten mit einer Testprobe für 48 h, Pulsieren für 4 h mit 0,5 uCi ³H-thymidin (spezifische Aktivität 20 Ci/mmol), Ernten der Lösung auf Glasfaserfilter und dann Messen der spezifisch gebundenen Radioaktivität. Dieser Assay wurde bei der Aufreinigung von aus Säugetierzellen gewonnenem Ratten-SCF nach dem ACA-54-Gelfiltrationssschritt, Abschnitt C2 dieses Beispiels verwendet. Typischerweise verursachte SCF einen 4-10-fachen Anstieg in CPM vor dem Hintergrund.

3. CFU-GM

Die Wirkung von aufgereinigtem Säugetier-SCF, sowohl natürlich gewonnen als auch rekombinant, frei von störenden Kolonie-stimulierenden Faktoren (CSFs), auf normales, nichtgeschwächtes Maus-Knochenmark ist bestätigt worden. Ein CFU-GM-Assay [Broxmeyer et al. Exp. Hematol., 5, 87 (1977)] wird verwendet, um den Effekt von SCF auf normales Mark zu bewerten. In Kürze gesagt, werden die gesamten Knochenmarkszellen nach der Lyse der roten Blutkörperchen auf halbfesten Agarkulturen ausplattiert, die die Testsubstanz enthalten. Nach 10 Tagen werden die Kolonien, die Cluster von > 40 Zellen enthalten, bewertet. Die Agarkulturen können auf Glas-Objektträgern runtergetrocknet werden, und die Morphologie der Zellen kann mit spezifischen histologischen Färbungen bestimmt werden.
Auf normalem Maus-Knochenmark war der aufgereinigte Säugetier-Ratten-SCF ein pluripotenter CSF, der das Wachstum von Kolonien stimulierte, die unreife Zellen, Neutrophile, Macrophagen, Eosinophile und Megakaryocyten umfaßten, ohne das Erfordernis für andere Faktoren. Aus 200.000 ausplattierten Zellen wachsen über 100 solcher Kolonien über eine zehntägige Periode. Sowohl Ratten- als auch humaner rekombinanter SCF stimulieren die Produktion von erythroiden Zellen in Kombination mit EPO, siehe Beispiel 9.

B. Konditioniertes Medium

Buffalo-Rattenleber (BRL) 3A-Zellen aus der American Type Culture Collection (ATCC CRL 1442), wurden auf Mikroträgern in einem 20 Liter Perfusionskultur-System zur Produktion von SCF wachsen gelassen. Dieses System verwendet einen Biolafitte-Fermenter (Modell ICC-20), außer den Schirmen, die zum Zurückhalten der Mikroträger verwendet werden, und der Oxygenierungsschläuche. Die Schirme mit 75 Micron Mesh werden von Mikroträgerverstopfung frei gehalten durch periodisches Rückspülen, was durch ein System von Probeventilen und Computer-kontrollierten Pumpen erreicht wird. Jeder Schirm fungiert abwechselnd als Mediumzufuhr und Ernteschirm. Dieses oszillierende Fließmuster stellt sicher, daß die Schirme nicht verstöpfen. Eine Oxygenierung wurde durch eine Spule von Silikonschläuchen (50 Fuß lang, 0,25 Inch ID, 0,03 Inch Wand) bereitgestellt. Das Wachstumsmedium, das zur Kultur von BRL-3A-Zellen verwendet wurde, war Minimal Essential Medium (mit Earleschen-Salzen) (GIBCO), 2 mM Glutamin, 3 g/L Glucose, Tryptosephosphat (2,95 g/L), 5% fötales bovines Serum und 5% fötales Kälberserum. Das Erntemedium war identisch außer hinsichtlich des Weglassens von Serum. Der Reaktor enthielt Cytodex 2 Mikroträger (Pharmacia) in einer Konzentration von 5 g/L und wurde mit 3 · 10&sup9; BRL-3A-Zellen besät, die in Roller-Flaschen aufgezogen und durch Trypsinierung entfernt worden waren. Man ließ die Zellen auf den Mikroträgern anheften und darauf für acht Tage wachsen. Das Wachstumsmedium ließ man durch den Reaktor spülen, wie benötigt auf der Grundlage von Glucoseverbrauch. Die Glucosekonzentration wurde bei näherungsweise 1,5 g/L gehalten. Nach acht Tagen wurde der Reaktor mit sechs Volumina serumfreiem Medium gespült, um das meiste des Serums (Proteinkonzentration < 50 ug/ml) zu entfernen. Der Reaktor wurde dann chargenweise betrieben, bis die Glucose-Konzentration unter 2 g/L fiel. Von diesem Punkt an wurde der Reaktor in einer kontinuierlichen Durchspülungsrate von näherungsweise 10 L/Tag betrieben. Der pH der Kultur wurde bei 6,9 ± 0,3 gehalten durch Anpassen der CO&sub2;- Durchflußrate. Der aufgelöste Sauerstoff wurde höher als 20% Luftsättigung gehalten durch Supplementieren mit reinem Sauerstoff wie benötigt. Die Temperatur wurde bei 37 ± 0,5ºC gehalten.
Näherungsweise wurden 336 Liter serumfreies konditioniertes Medium von dem obigen System erzeugt und wurden als das Ausgangsmaterial für die Aufreinigung von natürlichem, aus Säugetierzellen stammendem Ratten-SCF verwendet.

C. Aufreinigung

Die gesamte Aufreinigungsarbeit wurde bei 4ºC durchgeführt, wenn nicht anders angezeigt.

1. DEAE-Cellulose-Anionenaustausch-Chromatographie

Ein konditioniertes Medium, das durch serumfreies Wachstum von BRL 3A-Zellen erzeugt worden war, wurde durch Filtration durch 0,45 u Sartocapsules (Sartorius) geklärt. Mehrere verschiedene Chargen (41 L, 27 L, 39 L, 30,2 L, 37,5 L und 161 L) wurden getrennt einer Auflconzentrierung, Diaflltration/Pufferaustausch und DEAE-Cellulose-Anionenaustausch- Chromatographie auf eine ähnliche Weise für jede Charge unterworfen. Die DEAE-Cellulose- Pools wurden dann vereinigt und weiter verarbeitet als eine Charge in den Abschnitten C2-5 dieses Beispiels. Die Behandlung der 41 L-Charge, zur Veranschaulichung, war wie folgt. Das gefilterte, konditionierte Medium wurde auf ~ 700 ml unter Verwendung eines Millipore Pellicon Tangentialfluß-Ultrafiltrationsapparats mit vier Polysulfonmembran-Kassetten mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 10.000 aufkonzentriert (20 Fuß² Gesamtmembranfläche; Pumpenrate ~ 1095 mumin und Filtrationsrate 250-315 ml/min). Eine Diafiltration/Pufferaustausch in Vorbereitung JUr die Anionenaustausch-Chromatographie wurde dann durch Zugabe von 500 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 zum Konzentrat, Wiederaufkonzentrieren auf 500 ml unter Verwendung des Tangentialfluß-Ultrafiltrationsapparates und einer Wiederholung hiervon für sechs zusätzliche Male erreicht. Die konzentrierte/diafiltrierte Zubereitung wurde schließlich in einem Volumen von 700 ml erhalten. Die Zubereitung wurde auf eine DEAE-Cellulose-Anionenaustausch-Säule aufgebracht (5 · 20,4 cm; Whatman DE-52-Harz), die mit dem 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 Puffer equilibriert worden war. Nach Probenaufbringung wurde die Säule mit 2050 ml des Tris-HCl-Puffers gewaschen, und ein Salzgradient (0 - 300 mM NaCl im Tris-HCl-Puffer; 4 L Gesamtvolumen) wurde aufgebracht. Es wurden Fraktionen von 15 ml bei einer Durchflußrate von 167 ml/h gesammelt. Die Chromatographie wird in Fig. 1 gezeigt. Die HPP-CFC-Kolonienzahl bezieht sich auf die biologische Aktivität in dem HPP-CFC-Assay; 100 ul von den angezeigten Fraktionen wurde getestet. Fraktionen, die während der Probenaufhringung und des Waschens gesammelt worden waren, werden nicht in der Figur gezeigt; keine biologische Aktivität wurde in diesen Fraktionen festgestellt.
Das Verhalten aller konditionierten Medien-Chargen, die der Aufkonzentrierung, Diafiltration/Pufferaustausch und Anionenaustausch-Chromatographie unterzogen worden waren, war ähnlich. Die Proteinkonzentrationen für die Chargen, bestimmt durch das Verfahren von Bradford [Anal. Biochem. 72 248-254 (1976)] mit bovinem Serumalbumin als einem Standard, waren im Bereich 30-50 ug/ml. Das Gesamtvolumen konditioniertes Medium, das für diese Zubereitung verwendet wurde, war ungefähr 336 L.

2. ACA-54 Gelfiltrations-Chromatoaraphie

Die Fraktionen, die biologische Aktivität aus dem DEAE-Cellulose-Säulenlauf für jede der sechs konditionierten Medienchargen hatten, auf die oben Bezug genommen wird (zum Beispiel Fraktionen 87-114 für den in Fig. 1 gezeigten Laui) wurden kombiniert (Gesamtvolumen 2900 ml) und auf ein Endvolumen von 74 ml unter der Verwendung von Amicongerührten Zellen und YM10-Membranen autkonzentriert. Dieses Material wurde auf eine ACA-54 (LKB)-Gelfiltrations-Säule (Fig. 2) aufgebracht, equilibriert in 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4. Fraktionen von 14 ml wurden bei einer Durchflußrate von 70 ml/h gesammelt. Aufgrund inhibitorischer Faktoren, die mit den aktiven Fraktionen zusammen eluieren, erscheint die Spitze der Aktivität (HPP-CFC-Kolonienzahl) gespalten; jedoch eluiert auf der Grundlage vorheriger Chromatogramme die Aktivität zusammen mit dem Hauptproteinpeak, und deshalb wurde ein Pool der Fraktionen gemacht.

3. Weizenkeim-Agglutinin-Agarose-Chromatographie

Fraktionen 70-112 von der ACA-54-Gelfiltrations-Säule wurden vereinigt (500 ml). Der Pool wurde in zwei Hälften geteilt, und jede Hälfte einer Chromatographie unter Verwendung von einer Weizenkeim-Agglutinin-Agarose-Säule unterzogen (5 · 24,5 cm; Harz aus E-Y Laboratories, San Mateo, CA; Weizenkeim-Agglutinin erkennt bestimmte Kohlenhydratstrukturen), die in 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7,4, equilibriert worden war. Nach den Probenaufbringungen wurde die Säule mit ungefähr 2200 ml des Säulenpuffers gewaschen, und die Elution von gebundenem Material wurde dann durch Aufbringen einer Lösung von 350 mM N-Acetyl-D-glucosamin erreicht, das in dem Säulenpuffer aufgelöst war, beginnend mit Fraktion ~ 210 in Fig. 3. Es wurden Fraktionen von 13,25 ml bei einer Durchflußrate von 122 ml/h gesammelt. Eine der chromatographischen Läufe wird in Fig. 3 gezeigt. Teile der zu testenden Fraktionen wurden dialysiert gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung; 5 uI der dialysierten Materialien wurde in den MC/9-Assay gebracht (cpm-Werte in Fig. 3), und 10 ul in den HPP-CFC-Assay (Koloniezahl-Werte in Fig. 3). Es kann gesehen werden, daß das aktive Material an die Säule bindete und mit dem N-Acetyl-D-Glucosamin eluierte, während vieles des kontaminierenden Materials durch die Säule während des Probenauftrags und der Waschung lief.

4. S-Sepharose-Fast-Flow-Kationenaustausch-Chromatographie

Die Fraktionen 211-225 aus der Weizenkeim-Agglutinin-Agarose-Chromatographie, die in Fig. 3 gezeigt wird, und äquivalente Fraktionen aus dem zweiten Lauf wurden vereinigt (375 ml) und gegen 25 mM Natriumformiat, pH 4,2, dialysiert. Um die Zeit des Exponiertseins gegenüber niedrigem pH zu minimieren, wurde die Dialyse über eine Periode von 8 h gegen 5 L Puffer gemacht, wobei vier Wechsel während der 8 h-Periode durchgeführt wurden. Am Ende dieser Dialyse-Periode war das Probenvolumen 480 ml, und der pH und die Leitfähigkeit der Probe waren nahe denjenigen des Dialysepuffers. Ausgefälltes Material erschien in der Probe während der Dialyse. Dieses wurde durch Zentrifugation bei 22.000 · g für 30 min entfernt, und der Überstand aus der zentrifugierten Probe wurde auf eine S-Sepharose-Fast- Flow-Kationenaustausch-Säule (3,3 · 10,25 cm; Harz von Pharmacia) aufgetragen, die in dem Natriumformiatpuffer equilibriert worden war. Die Durchflußrate war 465 ml/h, und es wurden Fraktionen von 14,2 ml gesammelt. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule mit 240 ml Säulenpuffer gewaschen, und eine Elution von gebundenem Material wurde durchgeführt durch Aufbringen eines Gradienten von 0-750 mM NaCl (NaCl aufgelöst in Säulenpuffer; gesamtes Gradientenvolumen 2200 ml), beginnend bei Fraktion ~ 45 in Fig. 4. Das Elutionsprofil wird in Fig. 4 gezeigt. Die gesammelten Fraktionen wurden auf pH 7 - 7,4 durch Zugabe von 200 ul 0,97 M Tris-Base eingestellt. Die cpm in Fig. 4 beziehen sich wieder auf die in dem biologischen MC/9-Assay erhaltenen Resultate; Portionen der angezeigten Fraktionen wurden gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung dialysiert und 20 ul in den Assay eingebracht. Es kann in Fig. 4 gesehen werden, daß der Großteil an biologisch aktivem Material durch die Säule ungebunden durchlief, während viel kontaminierendes Material gebunden hat und im Salzgradienten eluierte.

5. Chromatographie unter VerwendunR von Kieselgel-gebundenem Kohlenwasserstoff- Harz

Die Fraktionen 4-40 von der S-Sepharose-Säule aus Fig. 4 wurden vereinigt (540 ml). 450 ml des Pools wurden mit einem gleichen Volumen an Puffer B (100 mM Ammoniumacetat, pH 6 : Isopropanol; 25 : 75) kombiniert und bei einer Durchflußrate von 540 ml/h auf eine Ca- Säule aufgebracht (Vydac Proteins C&sub4;; 2,4 · 2 cm), die mit Puffer A equilibriert worden waren (60 mM Ammoniumacetat, pH 6 : Isopropanol; 62,5 : 37,5). Nach dem Probenauftrag wurde die Durchflußrate auf 154 ml/h reduziert, und die Säule wurde mit 200 ml Puffer A gewaschen. Ein linearer Gradient von Puffer A zu Puffer B (Gesamtvolumen 140 ml) wurde dann aufgebracht, und es wurden Fraktionen von 9,1 ml gesammelt. Die Portionen des Pools von der S-Sepharose-Chromatographie, die C&sub4;-Säulen-Ausgangsprobe, der Durchlaufpool und der Waschpool wurden auf 40 ug/ml bovines Serumalbumin durch Zugabe eines geeigneten Volumens einer 1 mg/ml Stammlösung gebracht und gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung in Vorbereitung für den biologischen Assay dialysiert. Auf ähnliche Weise wurden 40 ul- Aliquots der Gradienten-Fraktionen mit 360 ul Phosphat-gepufferter Salzlösung kombiniert, die 16 ug bovines Serumalbumin enthielt, und dies wurde von einer Dialyse gegen Phosphatgepufferte Salzlösung in Vorbereitung für einen biologischen Assay gefolgt. Diese verschie denen Fraktionen wurden mit dem MC/9-Assay getestet (6,3 ul Aliquots der zubereiteten Gradientenfraktionen; cpm in Fig. 5). Die Assay-Resultate zeigten ebenso an, daß ungefähr 75% der gewonnenen Aktivität in den Durchlauf und Waschfraktionen war, und 25% in den in Fig. 5 angezeigten Gradientenfraktionen. SDS-PAGE [Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1970); die Stapelgele enthielten 4% (w/v) Acrylamid, und die Trenngele enthielten 12,5% (w/v) Acrylamid] von Aliquots aus verschiedenen Fraktionen wird in Fig. 6 gezeigt. Für das gezeigte Gel wurden die Proben-Aliquots unter Vakuum getrocknet und dann unter Verwendung von 20 ul Probenbehandlungspuffer (nicht-reduzierend, d. h. ohne 2-Mercaptoethanol) wieder aufgelöst und für 5 min vor dem Laden auf das Gel gekocht. Spuren A und B repräsentieren Säulenausgangsmaterial (75 ul aus 890 ml) bzw. Säulendurchlauf (75 ul aus 880 ml); die numerierten Markierungen zur Linken der Figur repräsentieren Wanderungspositionen (reduziert) von Markern mit Molekulargewichten von 103 mal den angezeigten Zahlen, wobei die Marker Phosphorylase b (Mr 97.400), bovines Serumalbumin (Mr 66.200), Ovalbumin (Mr 42.700), Carboanhydrase (Mr 31.000), Trypsininhibitor aus Sojabohnen (Mr 21.500) und Lysozym (Mr 14.400); Spuren 4-9 repräsentieren die entsprechenden Fraktionen, die während der Durchführung des Gradienten gesammelt worden waren (60 ul aus 9,1 ml). Das Gel wurde silbergefärbt [Morrissey, Anal. Biochem.. 117, 307-310 (1981)]. Es kann durch Vergleich von Spuren A und B gesehen werden, daß der Hauptteil an färbbarem Material durch die Säule läuft. Das gefärbte Material in Fraktionen 4-6 in den Regionen gerade oberhalb und unterhalb der Mr 31.000-Standard-Position fällt mit der in den Gradientenfraktionen (Fig. 5) nachgewiesenen biologischen Aktivität zusammen und repräsentiert das biologisch aktive Material. Es sollte bemerkt werden, daß dieses Material in Spuren 4-6 veranschaulicht wird, nicht aber in Spuren A und/oder B, weil ein viel größerer Anteil des Gesamtvolumens (0,66% des gesamten für Fraktionen 4-6 gegen 0,0084% des gesamten für Spuren A und B) für die letztere geladen worden war. Fraktionen 4-6 von dieser Säule wurden vereinigt.
Wie oben erwähnt, liefen ungefähr 75% der gewonnenen Aktivität durch die C&sub4;-Säule von Fig. 5. Dieses Material wurde unter Verwendung eines C&sub4;-Harzes im wesentlichen, wie oben beschrieben, wieder chromatographiert, außer daß eine größere Säule (1,4 · 7,8 cm) und eine geringere Durchflußrate (50-60 ml/h insgesamt) verwendet wurde. Ungefähr 50% der gewonnenen Aktivität war im Durchfluß, und 50% in Gradientenfraktionen, die eine ähnliche Erscheinung zu der der aktiven Gradientenfraktionen in Fig. 6 in der SDS-PAGE zeigten. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt (29 ml).
Eine analytische C&sub4;-Säule wurde ebenso im wesentlichen, wie oben bemerkt, durchgeführt, und die Fraktionen wurden in beiden Bioassays getestet. Wie in Fig. 7 der Fraktionen von dieser analytischen Säule angezeigt, eluieren die MC/9- und HPP-CFC-Bioaktivitäten zusammen. Eine SDS-PAGE-Analyse (Fig. 8) zeigt das Vorhandensein des Mr ~ 31.000- Proteins in den Säulenfraktionew die biologische Aktivität in beiden Assays enthalten.
Ein aktives Material in dem zweiten (verhältnismäßig geringeren) Aktivitäts-Peak, der in der S-Sepharose-Chromatographie gesehen wird (z. B. Fig. 4, Fraktionen 62-72, frühe Fraktionen im Salzgradient), wurde ebenso durch C&sub4;-Chromatographie aufgereinigt. Es wies dasselbe Verhalten in der SDS-PAGE auf und hatte dieselbe N-terminale Aminosäuresequenz (siehe Beispiel 2D) wie das durch die C&sub4;-Chromatographie der S-Sepharose-Durchfluß-Fraktion erhaltene Material.

6. Zusammenfassung der Aufreinigung

Eine Zusammenfassung der Aufreinigungsschritte, die in 1-5 oben beschrieben sind, wird in · Tabelle 2 gegeben. Tabelle 2 Zusammenfassung der Aufreinigung von Säugetier-SCF
1. Die angegebenen Werte repräsentieren die Summen der Werte für die verschiedenen Chargen, die im Text beschrieben sind.
2. Wie oben in diesem Beispiel beschrieben, wurde gefälltes Material, das während der Dialyse dieser Probe in Vorbereitung für die S-Sepharose-Chromatographie erschien, durch Zentrifugation entfernt. Die Probe nach der Zentrifugation (480 ml) enthielt 264 mg Gesamtprotein.
3. Kombination der aktiven Gradienten-Fraktionen von den zwei C&sub4;-Säulen, die, wie beschrieben, in Abfolge laufengelassen wurden.
4. Nur 450 ml dieses Materials wurde für den folgenden Schritt verwendet (dieses Beispiel, oben).
5. Bestimmt durch das Verfahren von Bradford (oben, 1976), wenn nicht andersartig angegeben.
6. Schätzung, auf der Grundlage der Intensität der Silberfärbung nach SDS-PAGE und nach Aminosäurezusammensetzungs-Analyse, wie in Abschnitt K von Beispiel 2 beschrieben.

D. SDS-PAGE und Glycosidase-Behandlungen

Eine SDS-PAGE der gepoolten Gradienten-Fraktionen von den zwei C&sub4;-Säulenläufen auf großem Maßstab werden in Fig. 9 gezeigt. Sechzig ul des Pools für die erste C&sub4;-Säule wurden geladen (Spur 1), und 40 ul des Pools für die zweite C&sub4;-Säule (Spur 2). Diese Gelspuren wurden silbergefärbt. Die Molekulargewichtsmarker waren wie für Fig. 6 beschrieben. Wie erwähnt repräsentiert das diffus wandernde Material oberhalb und unterhalb der Mr 31.000 Marker-Position das biologisch aktive Material; die apparente Heterogenität beruht zu einem großen Teil auf der Heterogenität hinsichtlich der Glycosylierung.
Um die Glycosylierung zu charakterisieren wurde aufgereinigtes Material mit ¹²&sup5;I iodiert, mit einer Vielzahl von Glycosidasen behandelt und durch SDS-PAGE (reduzierende Bedingungen) mit Autoradiographie analysiert. Die Resultate werden in Fig. 9 gezeigt. Spuren 3 und 9, ¹²&sup5;I-markiertes Material ohne irgendeine Glycosidase-Behandlung. Spuren 4-8 repräsentieren ¹²&sup5;I-markiertes Material, das mit Glycosidasen, wie folgt, behandelt wurde. Spur 4, Neuraminidase. Spur 5, Neuraminidase und O-Glycanase. Spur 6, N-Glycanase. Spur 7, Neuraminidase und N-Glycanase. Spur 8, Neuraminidase, O-Glycanase und N-Glycanase. Die Bedingungen waren 5 mM 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), 33 mM 2-Mercaptoethanol, 10 mM Tris-HCl, pH 7 - 7,2, für 3 h bei 37ºC. Die Neuraminidase (von Arthrobacter ureafaciens; Calbiochem) wurde in 0,23 Einheiten/ml Endkonzentration verwendet. O-Glycanase (Genzyme; endo-alpha-N-Acetyl-galactosaminidase) wurde in 45 Millieinheiten/ml verwendet. N-Glycanase (Genzyme; Peptid : N-Glycosidase F; Peptid-N&sup4;[N-acetyl-beta-glucosaminyl]asparaginamidase) wurde in 10 Einheiten/ml verwendet.
Es wurden Resultate, ähnlich demjenigen aus Fig. 9, nach Behandlung von nichtmarkiertem, aufgereinigtem SCF mit Glycosidasen und Sichtbarmachung der Produkte durch Silberfärbung nach SDS-PAGE erhalten.
Wo geeignet, wurden verschiedene Kontrollinkubationen durchgeführt. Diese schlossen ein: Inkubation in einem geeigneten Puffer, aber ohne Glycosidasen, um zu verifizieren, daß die Resultate auf den zugegebenen Glycosidase-Zubereitungen beruhte; Inkubation mit glycosylierten Proteinen (z. B. glycosyliertem rekombinanten humanen Erythropoietin), von denen bekannt ist, daß sie Substrate für die Glycosidasen sind, um zu verifizieren, daß die verwendeten Glycosidase-Enzyme aktiv waren; und Inkubation mit Glycosidasen, aber ohne Substrat, um zu verifizieren, daß die Glycosidasen nicht selbst zu den sichtbar gemachten Gel- Banden beitrugen oder diese verschleierten.
Die Glycosidase-Behandlungen wurden ebenso mit endo-beta N-Acetylglucosamidase F (endo F; NEN Dupont) und mit endo-beta-N-Acetylglucosaminidase H (endo H; NEN Dupont) durchgeführt, wieder mit geeigneten Kontroll-Inkubationen. Die Bedingungen der Behandlung mit endo F waren: Kochen für 3 min in der Anwesenheit von 1% (w/v) SDS, 100 mM 2- Mercaptoethanol, 100 mM EDTA, 320 mM Natriumphosphat, pH 6, gefolgt von einer dreifachen Verdünnung mit dem Einschluß von Nonidet P-40 (1,17%, v/v, Endkonzentration), Natriumphosphat (200 mM, Endkonzentration) und endo F (7 Einheiten/ml, Endkonzentration). Die Bedingungen der endo H-Behandlung waren ähnlich, außer daß die SDS-Konzentration 0,5% (w/v) war, und endo H wurde in einer Konzentration von 1 ug/ml verwendet. Die Resultate mit endo F waren dieselben wie die mit N-Glycanase, während endo H keinen Effekt auf das aufgereinigte SCF-Material hatte.
Eine Anzahl an Schlußfolgerungen können aus den oben beschriebenen Glycosidase- Experimenten gezogen werden. Die verschiedenen Behandlungen mit N-Glycanase [die so wohl komplexe als auch mannose-reiche, N-verknüpfte Kohlenhydrate entfernt (Tarentino et al., Biochemistry 24, 4665-4671) (1985)], endo F [die ähnlich der N-Glycanase funktioniert (Elder und Alexander, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4540-4544 (1982)], endo H [die mannose-reiche und gewisse N-verknüpfte Kohlenhydrate vom Hybrid-Typ entfernt (Tarentino et al., Methods Enzymol. SOC, 574-580 (1978)], Neuraminidase (die Kieselsäurereste entfernt) und O-Glycanase [die bestimmte O-verknüpfte Kohlenhydrate entfernt (Lambin et al., Biochem. Soc. Trans. 12, 599-600 (1984)], legen nahe, daß: sowohl N-verknüpfte als auch Overknüpfte Kohlenhydrate vorhanden sind; die meisten der N-verknüpften Kohlenhydrate vom komplexen Typ sind; und Sialinsäure vorhanden ist, wobei wenigstens einiges davon Teil der O-verknüpften Gruppen ist. Einige Informationen über mögliche Stellen der N- Verknüpfung kann aus Aminosäuresequenzdaten (Beispiel 2) erhalten werden. Die Tatsache, daß die Behandlung mit N-Glycanase, endo F und N-Glycanase/Neuraminidase das heterogene Material, sichtbar durch SDS-PAGE, in schneller wandernde Formen umwandeln kann, die viel homogener sind, ist konsistent mit der Schlußfolgerung, daß das gesamte Material dasselbe Polypeptid repräsentiert, wobei die Heterogenität durch eine Heterogenität hinsichtlich der Glycosylierung verursacht wird. Es ist ebenso bemerkenswert, daß die kleinsten Formen, die durch die kombinierten Behandlungen mit den verschiedenen Glycosidasen erhalten werden, im Bereich von Mr 18.000-20.000 sind, relativ zu den Molekulargewichtsmarkern, die in der SDS-PAGE verwendet werden.
Eine Bestätigung, daß das diffus wandernde Material um die Mr 31.000-Position in SDS- PAGE biologisch aktives Material repräsentiert, das insgesamt dieselbe Grund- Polypeptidkette hat, wird durch die Tatsache gegeben, daß die Aminosäuresequenzdaten, von dem Material stammend, das in dieser Region wandert (z. B. nach elektrophoretischem Transfer und Cyanogenbromid-Behandlung; Beispiel 2) mit denjenigen übereinstimmen, die ±1 W das isolierte Gen gezeigt wurden, dessen Expression mit rekombinanten DNA-Mitteln zu biologisch aktivem Material führt (Beispiel 4).

BEISPIEL 2

Aminosäuresequenz-Analyse von Säugetier-SCF

A. Umkehrphasen-Hochleistung-Flüssig-Chromatographie (HPLC) von aufgereinigtem Protein

Näherungsweise 5 ug SCF, der wie in Beispiel 1 aufgereinigt worden war (Konzentration = 0,117 mg/ml) wurde Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C&sub4;-Säule mit enger Bohrung (Vydac, 300 Å weite Bohrung, 2 mm · 15 cm) unterzogen. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 97% mobiler Phase A (0,1% Trifluoressigsäure)/3% mobiler Phase B (90% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure) bis 30% mobiler Phase A/70% mobiler Phase B in 70 min. gefolgt von einer isokratischen Elution für weitere 10 min bei einer Durchflußrate von 0,2 ml pro min eluiert. Nach Abzug eines Puffer-Nullproben-Chromatogramms war der SCF als ein einzelner symmetrischer Peak mit einer Retentionszeit von 70,05 min sichtbar, wie in Fig. 10 gezeigt. Keine größeren kontaminierenden Protein-Peaks konnten unter diesen Bedingungen nachgewiesen werden.

B. Sequenzieren von elektrophoretisch transferierten Proteinbanden

SCF, der wie in Beispiel 1 (0,5-1,0 nmol) aufgereinigt worden war, wurde wie folgt mit N- Glycanase behandelt, einem Enzym, das spezifisch die Asn-verknüpflen Kohlenhydratgruppen spaltet, die kovalent an Proteine angehängt sind (siehe Beispiel 1D). Sechs ml des vereinigten Materials aus Fraktionen 4-6 der C&sub4;-Säule aus Fig. 5 wurden unter Vakuum getrocknet. Dann wurden 150 ul 14,25 mM CHAPS, 100 mM 2-Mercaptoethanol, 335 mM Natriumphosphat, pH 8,6 zugegeben und eine Inkubation durchgeführt für 95 min bei 37ºC. Als nächstes wurden 300 ul 74 mM Natriumphosphat, 15 Einheiten/ml N-Glycanase, pH 8,6, zugegeben und die Inkubation für 19 h fortgesetzt. Die Probe wurde dann auf einem 9-18% SDS-Polyacrylamid-Gradientengel (0,7 mm Dicke, 20 · 20 cm) laufengelassen. Die Proteinbanden in dem Gel wurden elektrophoretisch auf Polyvinyldifluorid (PVDF, Millipore Corp.) unter Verwendung von 10 mM Caps-Puffer (pH 10,5) bei einer konstanten Stromstärke von 0,5 Amp für 1 h übertragen [Matsudaira, J. Biol. Chem., 261, 10035-10038 (1987)]. Die transferierten Proteinbanden wurden mit Coomassie-Blau-Färbung sichtbar gemacht. Es lagen Banden bei Mr ~ 29.000-33.000 und Mr ~ 26.000 vor, d. h. die Deglycosylierung war nur partiell (siehe Beispiel 1 D, Fig. 9); die frühere Bande repräsentiert nicht-verdautes Material, und die letztere repräsentiert Material, von dem N-verknüpftes Kohlenhydrat entfernt ist. Die Banden wurden ausgeschnitten und direkt geladen (40% für M, 29.000-33.000 Protein und 80% für Mr 26.000 Protein) auf einen Protein-Sequenzierer (Applied Biosystems Inc., Modell 477). Die Proteinsequenz-Analyse wurde unter Verwendung von Programmen durchgeführt, die vom Hersteller geliefert sind [Hewick et al., J. Biol. Chem., 256 7990-7997 (1981)], und die freigesetzten Phenylthiohydantoinyl-Aminosäuren wurden online analysiert unter Verwendung von Mikrobohrung-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-HPLC. Beide Banden ergaben kein Signal für 20-28 Sequenzierzyklen, was nahelegt, daß beide mit einer Methodologie unter Verwendung der Edman-Chemie nicht-sequenzierbar waren. Das Hintergrund-Niveau bei jedem Sequenzierlauf war zwischen 1-7 umol, was weit unter der Proteinmenge war, die in den Banden vorhanden war. Diese Daten legen nahe, daß das Protein in den Banden N- terminal blockiert war.

C. In-situ-CNBr-Spaltung von elektrophoretisch transferiertem Protein und Sequenzieren

Um zu bestätigen, daß das Protein tatsächlich blockiert war, wurden die Membranen von dem Sequenzierer (Teil B) entfernt, und eine In-situ-Cyanogenbromid(CNBr)-Spaltung der geblotteten Banden wurde durchgeführt [CNBr (5%, w/v) in 70% Ameisensäure für 1 h bei 45ºC], gefolgt von Trocknen und einer Sequenzanalyse. Starke Sequenzsignale wurden nachgewiesen, die interne Peptide repräsentierten, welche aus der Spaltung der Methionyl- Peptidbindung durch CNBr erhalten worden waren.
Beide Banden ergaben identische, gemischte Sequenzsignale, die unten für die ersten fünf Zyklen aufgelistet sind.

Identifizierte Aminosäuren

Zyklus 1: Asp; Glu; Val; Ile; Leu
Zyklus 2: Asp; Thr; Glu; Ala; Pro; Val
Zyklus 3: Asn; Ser; His; Pro; Leu
Zyklus 4: Asp; Asn; Ala; Pro; Leu
Zyklus 5: Ser; Tyr; Pro
Beide Banden ergaben ebenso ähnliche Signale für bis zu 20 Zyklen. Die anfänglichen Ausbeuten waren 40-115 umol für die Mr 26.000-Bande und 40-150 umol für die Mr 29.000- 33.000-Bande. Diese Werte sind mit den ursprünglichen molaren Mengen Protein, die auf den Sequenzierer geladen worden waren, vergleichbar. Die Resultate bestätigten, daß die Proteinbanden, die dem SCF entsprechen, einen blockierten N-Terminus enthielten. Prozeduren, die verwendet wurden, um nützliche Sequenzinformationen für N-terminal blockierte Proteine zu erhalten, schließen ein: (a) Ent-Blockieren des N-Terminus (siehe Abschnitt D); und (b) Erzeugen von Peptiden durch interne Spaltungen mit CNBr (siehe Abschnitt E), mit Trypsin (siehe Abschnitt F) und mit Staphylococcus aureus (Stamm V-8)-Protease (Glu-C) (siehe Abschnitt G). Die Sequenzanalyse kann fortschreiten, nachdem die blockierte N-terminale Aminosäure entfernt ist oder die Peptidfragmente isoliert sind. Beispiele werden im Detail unten beschrieben.

D. Seduenzanalyse von BRL-Stammzellenfaktor, der mit Pyroglutaminsäure- Aminopeptidase behandelt worden ist

Die chemische Natur der Blockierungsgruppe, die am Aminoterminus von SCF vorhanden war, war schwierig vorherzusagen. Eine Blockierung kann post-translational in vivo sein [F. Wold, Ann. Rev. Biochem., 50, 783-814 (1981)] oder kann in vitro während der Aufreinigung geschehen. Zwei post-translationale Modifizierungen werden am häufigsten beobachtet. Eine Acetylierung von gewissen N-terminalen Aminosäuren, wie etwa Ala, Ser, etc. kann stattfinden, katalysiert durch N-α-Acetyltransferase. Dies kann durch Isolierung und massenspektrometrische Analyse eines N-terminal blockierten Peptids bestätigt werden. Wenn der Aminoterminus eines Proteins Glutamin ist, kann eine Deamidierung seines gamma-Amids stattfinden. Eine Zyklisierung, die das gamma-Carboxylat und den freien N-Terminus einbezieht, kann dann stattfinden, um Pyroglutamat zu ergeben. Um Pyroglutamat nachzuweisen kann das Enzym Pyroglutamat-Aminopeptidase verwendet werden. Dieses Enzym entfernt den Pyroglutamatrest, was einen freien Aminoterminus, beginnend an der zweiten Aminosäure, hinterläßt. Die Edman-Chemie kann dann zum Sequenzieren verwendet werden.
SCF (aufgereinigt wie in Beispiel 1; 400 umol) in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,6, enthaltend Dithiothreitol und EDTA) wurde mit 1,5 Einheiten Kalbsleber-Pyroglutaminsäure- Aminopeptidase (pE-AP) für 16 h bei 37ºC inkubiert. Nach der Reaktion wurde die Mischung direkt auf den Protein-Sequenzierer geladen. Eine Hauptsequenz konnte mit 46 Zyklen identi fiziert werden. Die anfängliche Ausbeute war ungefähr 40% und eine wiederholte Ausbeute war 94,2%. Die N-terminale Sequenz von SCF, einschließlich der N-terminalen Pyroglutaminsäure, ist:
xxx, an Position 43 nicht zugeordnet
Diese Resultate zeigten an, daß SCF Pyroglutaminsäure als seinen N-Terminus enthält.

E. Isolierung und Sequenzanalyse von CNBr-Peptiden

SCF, aufgereinigt wie in Beispiel 1 (20-28 ug; 1,0-1,5 nmol) wurde mit N-Glycanase behandelt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Umwandlung in das Mr 26.000-Material war in diesem Falle vollständig. Die Probe wurde getrocknet und mit CNBr in 70% Ameisensäure (5%) für 18 h bei Zimmertemperatur verdaut. Der Verdau wurde mit Wasser verdünnt, getrocknet und in 0,1% Trifluoressigsäure wieder aufgelöst. Die CNBr-Peptide wurden mit Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C&sub4;-Säule mit enger Bohrung und Elutionsbedingungen, die mit den in Abschnitt A dieses Beispiels beschriebenen identisch waren, getrennt. Mehrere Hauptpeptid-Fraktionen wurden isoliert und sequenziert, und die Resultate werden im Folgenden zusammengefaßt:
1. Aminosäuren wurden an Positionen 12, 13 und 25 nicht nachgewiesen. Peptid b wurde nicht bis zum Ende sequenziert.
2. (N) in CB-15 wurde nicht nachgewiesen; es wurde vermutet auf der Grundlage der potentiellen N-verknüpften Glycosylierungsstelle. Das Peptid wurde nicht bis zum Ende sequenziert.
3. Bezeichnet eine Stelle, wo Asn in Asp umgewandelt sein kann nach einer N- Glycanase-Enfernung eines N-verknüpften Zuckers.
4. Der Einzelbuchstabencode wurde verwendet: A,Ala; C,Cys; D,Asp; E,Glu; F,Phe; G,Gly; H,His; I,Ile; K,Lys; L,Leu; M,Met; N,Asn; P,Pro; Q,Gln; R,Arg; S,Ser; T,Thr; V,Val; W,Trp; und Y,Tyr.

F. Isolierung und Sequenzierung von tryptischen Framnenten von BRL- Stammzellenfaktor

SCF, der wie in Beispiel 1 aufgereinigt worden war (20 ug in 150 ul 0,1 M Ammoniumbicarbonat) wurde mit 1 ug Trypsin bei 37ºC für 3,5 h verdaut. Der Verdau wurde sofort auf einer Umkehrphasen-C&sub4;-HPLC mit enger Bohrung unter Verwendung von Elutionsbedingungen laufengelassen, die zu den in Abschnitt A dieses Beispiels beschriebenen identisch waren. Alle eluierten Peptid-Peaks hatten Retentionszeiten, die zu denen von nicht-verdautem SCF (Abschnitt A) verschieden waren. Die Sequenzanalysen der isolierten Peptide werden unten gezeigt:
1. Die Aminosäure an Position 4 wurde nicht zugeordnet.
2. Die Aminosäure an Position 12 wurde nicht zugeordnet.
3. Die Aminosäuren an Positionen 20 und 21 in 6 von Peptid T-5 wurden nicht identifiziert; sie wurden versuchsweise als O-verknüpfte Zucker-Anhängungsstellen zugeordnet.
4. Die Aminosäure an Position 10 wurde nicht nachgewiesen; sie wurde als Asn vermutet, auf der Grundlage der potentiellen N-verknüpften Glycosylierungsstelle. Die Aminosäure an Position 21 wurde nicht nachgewiesen.

G. Isolierung und Sequenzierun, von BRL-Stammzellenfaktor-Peytiden nach S. aureus Glu-C-Protease-Spaltung

SCF, aufgereinigt wie in Beispiel 1 (20 ug in 150 ul 0,1 M Ammoniumbicarbonat), wurde einer Glu-C-Proteasen-Spaltung unterzogen in einem Protease-zu-Substrat-Verhältnis von 1 : 20. Der Verdau wurde bei 37ºC für 18 h durchgeführt. Der Verdau wurde sofort durch Umkehrphasen-C&sub4;-HPLC mit enger Bohrung getrennt. Fünf Hauptpeptidfraktionen wurden gesammelt und wie unten beschrieben sequenziert:
1. Die Aminosäure an Position 6 des S-2-Peptids wurde nicht zugeordnet; diese könnte eine O-verknüpfte Zucker-Anhängungsstelle sein. Das Ala an Position 16 des S-2- Peptids wurde in geringer Ausbeute nachgewiesen.
2. Peptid S-3-könnte das N-terminal blockierte Peptid sein, das von dem N-Terminus von SCF stammt.
3. N in Klammern wurde als eine potentielle N-verknüpfte Zucker-Anhängungsstelle zugeordnet.

H. Sequenzanalyse von BRL-Stammzellenfaktor nach einer BNPS-Skatol-Spaltung

SCF (2 ug) in 10 mM Ammoniumbicarbonat wurde mit Vakuum-Zentrifugation vollständig getrocknet und dann in 100 ul Eisessig wieder aufgelöst. Ein 10-20-facher molarer Überschuß von BNPS-Skatol wurde der Lösung zugefügt, und die Mischung wurde bei 50ºC für 60 min inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Vakuum-Zentrifugation getrocknet. Der getrocknete Rest wurde mit 100 ul Wasser und wieder mit 50 ul Wasser extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden dann einer Sequenzanalyse, wie oben beschrieben, unterzogen. Die folgende Sequenz wurde nachgewiesen:
Position 28 wurde nicht positiv zugeordnet; sie wurde als Asn zugeordnet, auf der Grundlage der potentiellen N-verknüpften Glycosylierungsstelle.

I. C-terminale Aminosäurebestimmung von BRL-Stammzellenfaktor

Ein Aliquot SCF-Protein (500 umol) wurde Puffer-ausgetauscht in 10 mM Natriumacetat, pH 4,0 (Endvolumen 90 ul), und Brij-35 wurde auf 0,05% (w/v) zugegeben. Ein 5 ul-Aliquot wurde zur Quantifizierung von Protein entnommen. Vierzig ul der Probe wurden auf 100 ul mit dem oben beschriebenen Puffer verdünnt. Carboxypeptidase P (von Penicillium janthinellum) wurde in einem Enzym-zu-Substrat-Verhältnis von 1 : 200 zugegeben. Der Verdau schritt bei 25ºC fort, und 20 ul-Aliquots wurden bei 0, 15, 30, 60 und 120 min entnommen. Der Verdau wurde zu jedem Zeitpunkt durch Zugabe von Trifluoressigsäure auf eine Endkonzentration von 5% beendet. Die Proben wurden getrocknet, und die freigesetzten Aminosäuren wurden durch Reaktionen mit Dabsylchlorid (Dimethylaminoazobenzolsulfonylchlorid) in 0,2 M NaHCO&sub3; (pH 9,0) bei 70ºC für 12 min derivatisiert [Chang et al., Methods Enzymol., 90, 41-48 (1983)]. Die derivatisierten Aminosäuren (ein Sechstel jeder Probe) wurden mit Umkehrphasen-HPLC mit enger Bohrung mit einer Modifizierung der Prozedur von Chang et al. analysiert [Techniques in Protein Chemistry, T. Hugli ed., Acad. Press. NY (1989), S. 305- 311]. Quantitative Zusammensetzungsresultate zu jedem Zeitpunkt wurden durch Vergleich mit derivatisierten Aminosäurestandards (1 umol) erhalten. Zum Zeitpunkt 0 wurde kontaminierendes Glycin nachgewiesen. Alanin war die einzige Aminosäure, die mit der Inkubationszeit anstieg. Nach 2 h Inkubation wurde Ala in einer Gesamtmenge von 25 umol nachgewiesen, äquivalent zu 0,66 mol Ala, freigesetzt pro mol Protein. Dieses Resultat zeigte an, daß das natürliche Säugetier-SCF-Molekül Ala als seinen Carboxyl-Terminus enthält, übereinstimmend mit der Sequenzanalyse eines C-terminalen Peptids, S-2, das C-terminales Ala enthielt. Dieser Schluß ist ebenso in Übereinstimmung mit der bekannten Spezifität von Carboxypeptidase P [Lu et al., J. Chromatog. 447, 351-364 (1988)]. Zum Beispiel hört die Spaltung auf, wenn die Sequenz Pro-Val angetroffen wird. Das Peptid S-2 hat die Sequenz S-R-V- S-V-(T)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A), und es wurde gefolgert, daß es das C-tenninale Peptid von SCF ist (siehe Abschnitt J in diesem Beispiel). Die C-terminale Sequenz von ---P-V-A-(A) schränkt die Protease-Spaltung auf ausschließlich Alanin ein. Die Aminosäurezusammensetzung von Peptid S-2 zeigt das Vorhandensein von 1 Thr, 2 Ser, 3 Pro, 2 Ala, 3 Val, 1 Met, 1 Leu, 1 Phe, 1 Lys und 1 Arg an, was insgesamt 16 Reste ergibt. Der Nachweis von 2 Ala- Resten zeigt an, daß es zwei Ala-Reste am C-Terminus dieses Peptids geben kann (siehe Tabelle in Abschnitt G). Damit endet der BRL-SCF bei Ala 164 oder Ala 165.

J. Seguenz von SCF

Durch Kombinieren der Resultate, die aus der Sequenzanalyse von (1) intaktem Stammzellenfaktor nach Entfernung seiner N-terminalen Pyroglutaminsäure, (2) den CNBr-Peptiden, (3) den Trypsin-Peptiden und (4) den Glu-C-Peptidase-Fragmenten erhalten worden waren, wurden eine N-terminale Sequenz und eine C-terminalen Sequenz abgeleitet (Fig. 11). Die Nterminale Sequenz beginnt bei Pyroglutaminsäure und endet bei Met-48. Die C-terminale Sequenz enthält 84/85 Aminosäuren (Position 82 bis 164/165). Die Sequenz von Position 49 bis 81 wurde in keinem der isolierten Peptide nachgewiesen. Jedoch wurde eine Sequenz für ein großes Peptid nach der BNPS-Skatol-Spaltung von BRL-SCF nachgewiesen, wie in Abschnitt H dieses Beispiels beschrieben. Aufgrund dieser zusätzlichen Daten sowie einer aus Ratten- SCF (Beispiel 3) erhaltenen DNA-Sequenz können die N- und C-terminalen Sequenzen aligned und die Gesamtsequenz dargestellt werden, wie in Fig. 11 gezeigt. Der N-Terminus des Moleküls ist Pyroglutaminsäure, und der C-Terminus ist Alanin, wie durch Pyroglutamat- Aminopeptidase-Verdau bzw. Carboxypeptidase-P-Verdau bestätigt.
Anhand der Sequenzdaten wird gefolgert, daß Asn-72 glycosyliert ist; Asn-109 und Asn-120 sind wahrscheinlich in einigen Molekülen glycosyliert, aber nicht in anderen. Asn-65 konnte während der Sequenzanalyse nachgewiesen werden, und mag deshalb nur partiell glycosyliert sein, wenn überhaupt. Ser-142, Thr-143 und Thr-155, vorhergesagt anhand der DNA- Sequenz, konnten während der Aminosäuresequenzanalyse nicht nachgewiesen werden und könnten deshalb Stellen für O-verknüpftes Kohlenhydrat sein. Diese potentiellen Kohlenhydrat-Anhängungsstellen sind in Fig. 11 angegeben; N-verknüpftes Kohlenhydrat ist durch ausgefüllte Buchstaben im Fettdruck angezeigt; O-verknüpftes Kohlenhydrat ist durch nicht - ausgefüllte Buchstaben im Fettdruck angezeigt.

K. Aminosäurezusammensetzungsanalyse von BRL-Stammzellenfaktor

Das Material von der C&sub4;-Säule aus Fig. 7 wurde zur Aminosäurezusammensetzungsanalyse durch Aufkonzentrierung und Pufferaustausch in 50 mM Ammoniumbicarbonat zubereitet.
Zwei 70 ul Proben wurden in 6 N HCl, die 0,1% Phenol und 0,05% 2-Mercaptoethanol enthielt, bei 110ºC in vacuo für 24 h separat hydrolysiert. Die Hydrolysate wurden getrocknet, in Natriumcitrat-Puffer wieder aufgenommen und unter Verwendung von Ionenaustausch - Chromatographie analysiert (Beckman-Modell 6300 Aminosäure-Analysator). Die Resultate sind in Tabelle 3 gezeigt. Das Verwenden von 164 Aminosäuren (von den Protein- Sequenzierungsdaten), um die Aminosäurezusammensetzung zu berechnen, gibt eine bessere Übereinstimmung mit vorhergesagten Werten als das Verwenden von 193 Aminosäuren (wie gefolgert aus PCR- abgeleiteten DNA-Sequenzierungsdaten, Fig. 14C). Tabelle 3 Quantitative Aminosäurezusammensetzung von SCF, der aus Säugetieren stammt
Berechnetes Molekulargewicht 18,424³
1. Auf der Grundlage von 158 Resten aus der Proteinsequenzanalyse (unter Ausschluß von Cys und Trp).
2. Theoretische Werte; die aus Proteinsequenzdaten (A) oder DNA-Sequenzdaten (B) errechnet worden sind.
3. Auf der Grundlage der 1-164-Sequenz.
Der Einschluß einer bekannten Menge eines internen Standards in den Aminosäure- Zusammensetzungsanalysen erlaubte ebenso die Quantifizierung des Proteins in der Probe; ein Wert von 0,117 mg/ml wurde für die analysierte Probe erhalten.

BEISPIEL 3

Klonieren der Gene für Ratten- und humanen SCF

A. Ampliflzierung und Sequenzierung von Ratten-SCF-cDNA-Fragmenten

Die Bestimmung der Aminosäuresequenz von Fragmenten des Ratten-SCF-Protein machte es möglich, gemischte Sequenz-Oligonukleotide zu konstruieren, die für Ratten-SCF spezifisch waren. Die Oligonukleotide wurden als Hybridisierungssonden verwendet, um Ratten-cDNA- und genomische Bibliotheken zu screenen, und als Primer bei Versuchen, Teile der cDNA zu amplifizieren unter Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Strategien [Mullis et al., Methods in Enzymol. 155, 335-350 (1987)]. Die Oligodesoxynukleotide wurden durch das Phosphoramidit-Verfahren synthetisiert [Beaucage, et al., Tetrahedron Lett., 22, 1859 - 1862 (1981); McBride, et al., Tetrahedron Lett., 24, 245-248 (1983)]; ihre Sequenzen sind in Fig. 12A dargestellt. Die Buchstaben repräsentieren A, Adenin; T, Thymin, C, Cytosin; G, Guanin; I, Inosin. Das * in Fig. 12A repräsentiert Oligonukleotide, die Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen enthalten. Die Sequenzen werden 5' → 3' geschrieben.
Eine Ratten-genomische Bibliothek, eine Ratten-Leber-cDNA-Bibilothek und zwei BRL- ' cDNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung von ³²P-markierten, gemischten Oligonukleotidsonden, 219-21 und 219-22 (Fig. 12A) gescreent, deren Sequenzen auf der Aminosäuresequenz beruhten, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurde. Keine SCF-Klone wurden in diesen Experimenten unter Verwendung von Standardverfahren der cDNA-Klonierung isoliert [Maniatis, et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 212-246 (1982)].
Ein alternativer Ansatz, der zur Isolierung von SCF-Nucleinsäuresequenz führte, beinhaltete die Verwendung von PCR-Techniken. Bei dieser Methodologie wird die Region der DNA, die von zwei DNA-Primern umfaßt wird, selektiv in vitro durch vielfache Zyklen von Replikation amplifiziert, die durch eine geeignete DNA-Polymerase katalysiert werden (wie etwa TaqI-DNA-Polymerase) in der Anwesenheit von Desoxynukleosid-Triphosphaten in einem Thermocycler. Die Spezifität der PCR-Amplifizierung beruht auf zwei Oligonukleotid- Primern, die das zu amplifizierende DNA-Segment flankieren und mit gegenüberliegenden Strängen hybridisieren. Eine PCR mit doppelseitiger Spezifität für eine bestimmte DNA- Region in einer komplexen Mischung wird durch Verwendung von zwei Primern mit hinreichend für diese Region spezifischen Sequenzen erreicht. Eine PCR mit einseitiger Spezifität verwendet einen regionsspezifischen Primer und einen zweiten Primer, der an vielen Target- Stellen primen kann, die an vielen oder allen DNA-Molekülen in einer bestimmten Mischung vorhanden sind [Loh et al., Science, 243, 217-220 (1989)].
Die DNA-Produkte von erfolgreichen PCR-Amplifizierungsreaktionen sind Quellen der DNA-Sequenzinformation [Gyllensten, Biotechniciues, 7, 700-708 (1989)] und können verwendet werden, um markierte Hybridisierungssonden zu machen, die größere Länge und höhere Spezifität als Oligonukleotidsonden besitzen. Die PCR-Produkte können ebenso konstruiert werden mit geeigneten Primersequenzen, um in Plasmid-Vektoren kloniert zu werden, die die Expression des codierten Peptidprodukts ermöglichen.
Die grundlegende Strategie zum Erhalt der DNA-Sequenz der Ratten-SCF-cDNA wird in Fig. 13A dargestellt. Die kleinen Pfeile zeigen PCR-Amplifizierungen an, und die dicken Pfeile zeigen DNA-Sequenzierungsreaktionen an. PCRs 90.6 und 96.2, zusammen mit DNA- Sequenzierungen, wurden verwendet, um eine partielle Nukleinsäuresequenz für die Ratten- SCF-cDNA zu erhalten. Die bei diesen PCRs verwendeten Primer waren gemischte Oligonukleotide auf der Grundlage der in Fig. 11 dargestellten Aminosäuresequenz. Unter Verwendung der Sequenzinformation, die aus PCRs 90.6 und 96.2 erhalten worden war, wurden Primer mit einzigartiger Sequenz (224-27 und 224-28, Fig. 12A) gemacht und in den darauffolgenden Amplifizierungen und Sequenzierungsreaktionen verwendet. Die DNA, die das 5'- Ende der cDNA enthielt, wurde in PCRs 90.3, 96.6 und 625.1 unter Verwendung einer PCR mit einseitiger Spezifität erhalten. Eine zusätzliche DNA-Sequenz nahe dem C-Terminus des SCF-Proteins wurde in PCR 90.4 erhalten. Eine DNA-Sequenz für den Rest der codierenden Region von Ratten-SCF-cDNA wurde aus den PCR Produkten 630.1, 630.2, 84.1 und 84.2 erhalten, wie unten im Abschnitt C dieses Beispiels beschrieben. Die beim Erhalt der Ratten- SCF-cDNA verwendeten Techniken werden unten beschrieben.
Die RNA wurde aus BRL-Zellen hergestellt, wie von Okayama et al. beschrieben [Methods Enzymol., 154, 3-28 (1987)]. PolyA+-RNA wurde unter Verwendung einer Oligo(dT)- Zellulosesäule isoliert, wie von Jacobson beschrieben in [Methods in Enzymology. Band 152 254-261 (1987)].
Erst-Strang-cDNA wurde unter Verwendung von 1 ug BRL-polyA+-RNA als Matrize und (dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Primer gemäß dem mit dem Enzym, Mo-MLV-Reverse Transcriptase (Bethesda Research Laboratories) gelieferten Protokoll synthetisiert. Ein RNA-Strang-Abbau wurde unter Verwendung von 0,14 M NaOH bei 84ºC für 10 min oder durch Inkubation in einem kochenden Wasserbad für 5 min durchgeführt. Ein Überschuß Amoniumacetat wurde zugegeben, um die Lösung zu neutralisieren, und die cDNA wurde zuerst mit Phenol/Chloroform extrahiert, dann mit Chloroform/Iso-Amylalkohol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Um die Verwendung von Oligo(dC)-verwandten Primern in PCRs mit einseitiger Spezifität zu ermöglichen, wurde ein Poly(dG)-Schwanz dem 3'-Terminus eines Aliquot der Erst-StrangcDNA mit terminaler Transferase aus Kälberthymus (Boeringer Mannheim) zugefügt, wie zuvor beschrieben [Deng et al., Methods Enzymol., 100, 96-103 (1983)].
Wenn nicht andersartig in den Beschreibungen, die folgen, bemerkt, wurde der Denaturierungsschritt in jedem PCR-Zyklus auf 94ºC, 1 min gesetzt; und die Elongation war bei 72ºC für 3 oder 4 min. Die Temperatur und die Dauer des Annealing war von PCR zu PCR verschieden, und stellte oft einen Kompromiß auf der Grundlage der geschätzten Erfordernisse von mehreren verschiedenen PCRs dar, die simultan durchgeführt wurden. Wenn die Primerkonzentrationen reduziert wurden, um die Akkumulierung von Primer-Artefakten zu verringern [Watson, Amplifications. 2, 56 (1989)], waren längere Annealing-Zeiten angezeigt; wenn die PCR-Produktkonzentration hoch war, wurden kürzere Annealingzeiten und höhere Primerkonzentrationen verwendet um die Ausbeute zu erhöhen. Ein Hauptfaktor beim Bestimmen der Annealingtemperatur war die geschätzte Td der Primer-Target-Assoziation [Suggs et al., in Developmental Biology Using Purified Genes eds. Brown, D. D. und Fox, C. F. (Academic, New York) S. 683-693 (1981)]. Die bei den Amplifizierungen verwendeten Enzyme wurden von einem von drei Herstellern bezogen: Stratagene, Promega oder Perkin- Eimer Cetus. Die Reaktionsverbindungen wurden verwendet, wie vom Hersteller vorgeschlagen. Die Amplifizierungen wurden entweder in einem Coy Tempcycle oder einem Perkin- Eimer Cetus DNA-Thermocyler durchgeführt.
Die Amplifizierung der SCF-cDNA-Fragmente wurde gewöhnlich mit Agarose- Gelelektrophorese in Anwesenheit von Ethidiumbromid und Sichtbarmachung durch DNA- Banden-Fluoreszenz, stimuliert durch ultraviolette Bestrahlung, getestet. In einigen Fällen, in denen kleine Fragmente erwartet wurden, wurden die PCR-Produkte mit Polyacrylamid- Gelelektrophorese analysiert. Eine Bestätigung, daß die beobachteten Banden SCF-cDNA- Fragmente repräsentierten, wurde durch Beobachtung der geeigneten DNA-Banden nach darauffolgender Amplifizierung mit einem oder mehreren intern-eingenisteten Primern erhalten. Eine endgültige Bestätigung fand durch Didesoxy-Sequenzierung [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)] des PCR-Produkts und Vergleich der vorhergesagten Translationsprodukte mit der SCF-Peptidsequenzinformation statt.
In den anfänglichen PCR-Experimenten wurden gemischte Oligonukleotide, auf der Grundlage der SCF-Protein-Sequenz verwendet [Gould, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1934-1938 (1989)]. Unten sind Beschreibungen der PCR-Amplifizierungen, die verwendet wurden, um die DNA-Sequenzinformation für die Ratten-cDNA zu erhalten, die Aminosäuren - 25 bis 162 codiert.
In der PCR 90.6 wurde die BRL-cDNA mit je 4 umol von 222-11 und 223-6 in einem Reaktionsvolumen von 20 ul amplifiziert. Ein Aliquot des Produkts von PCR 90.6 wurde auf einem Agarosegel elekrophoresiert, und eine Bande von ungefähr der erwarteten Größe wurde beobachtet. Ein ul des PCR 90.6 - Produkts wurde weiter mit je 20 umol von Primern 222-11 und 223-6 in 50 ul für 15 Zyklen, Annealing bei 45ºC, amplifiziert. Ein Teil dieses Produkts wurde dann 25 Zyklen Amplifizierung in der Anwesenheit von Primern 222-11 und 219-25 (PCR 96.2) unterzogen, was eine einzelne Hauptproduktbande bei der Agarose-Gelelektrophorese ergab. Eine asymmetrische Amplifizierung des Produkts von PCR 96.2 mit denselben zwei Primern produzierte eine Matrize, die erfolgreich sequenziert wurde. Eine weitere selektive Amplifizierung von SCF-Sequenzen im Produkt von 96.2 wurde durch eine PCR- Amplifizierung des Produkts in Anwesenheit von 222-11 und dem eingenisteten Primer 219- 21 durchgeführt. Das Produkt dieser PCR wurde als eine Matrize für asymmetrische Ampliflzierung und der Erzeugung einer radioaktiv markierten Sonde verwendet (PCR2).
Um das 5'-Ende der Ratten-SCF-cDNA zu isolieren, wurden Primer, die (dC)n Sequenzen enthielten, komplementär zu den Poly(dG)-Schwänzen der cDNA, als nicht-spezifische Pnmer verwendet. PCR 90.3 enthielt (dC)&sub1;&sub2; (10 umol) und 223-6 (4 umol) als Primer und BRLcDNA als Matrize. Das Reaktionsprodukt fungierte wie ein Aggregat mit sehr hohem Molekulargewicht, das nahe der Ladetasche während der Agarose-Gelelektrophorese blieb. Ein ul der Produktlösung wurde weiter in Anwesenheit von 25 umol von (dC)&sub1;&sub2; und 10 umol 223-6 in einem Volumen von 25 ul für 15 Zyklen, Annealing bei 45ºC, amplifiziert. Ein halber ul dieses Produkts wurde dann für 25 Zyklen mit intern-eingenistetem Primer 219-25 und 201-7 (PCR 96.6) amplifiziert. Die Sequenz von 201-7 wird in Fig. 12C gezeigt. Keine Banden wurden mit Agarose-Gelelektrophorese beobachtet. Weitere 25 Zyklen PCR, Annealing bei 40ºC, wurden durchgeführt, wonach eine auffallende Bande beobachtet wurde. Southern Blotting wurde durchgeführt, und eine einzelne auffallende hybridisierende Bande wurde beobachtet. Zusätzliche 20 Zyklen PCR (625.1), Annealing bei 45ºC, wurden durchgeführt unter Verwendung von 201-7 und eingenistetem Primer 224-27. Eine Sequenzierung wurde nach asymmetrischer Amplifizierung mit PCR durchgeführt, was eine Sequenz ergab, die sich über den vermeintlichen Amino-Terminus der vermuteten Signalpeptid-Codierungssequenz von prae-SCF erstreckte. Diese Sequenz wurde verwendet, um Oligonukleotidprimer 227-29 zu konstruieren, der das 5'-Ende der Codierungsregion der Ratten-SCF-cDNA enthielt. Auf ähnliche Weise wurde die 3'-DNA-Sequenz, die bei Aminosäure 162 endet, durch Sequenzierung von PCR 90.4 erhalten (siehe Fig. 13.A).

B. Klonieren der genomischen Ratten-Stammzellenfaktor DNA

Die Sonden, die aus der PCR-Amplifizierung der für Ratten-SCF codierenden cDNA, wie im Abschnitt A oben beschrieben, gemacht worden waren, wurden verwendet, um eine Bibliothek zu screenen, die genomische Ratten-Sequenzen enthielt (bezogen von CLONTECH Laboratories, Inc.; Katalognummer RL1022 j). Die Bibliothek wurde in den Bacteriophagen λ Vektor EMBL-3 SP6/T7 konstruiert unter Verwendung von DNA, die von einer erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratte erhalten worden war. Die Bibliothek, wie vom Hersteller beschrieben, enthält 2,3 · 10&sup6; unabhängige Klone mit einer durchschnittlichen Insert-Größe von 16 kb.
PCRs wurden verwendet, um ³²P-markierte Sonden zu erzeugen, die beim Screenen der genomischen Bibliothek verwendet wurden. Die Sonde PCR1 (Fig. 13A) wurde in einer Reaktion erzeugt, die 16,7 uM ³²P[alpha]-dATP, 200 uM dCTP, 200 uM dGTP, 200 uM dTTP, Reaktionspuffer, geliefert von Perkin Elmer Cetus, Taq-Polymerase (Perkin Elmer Cetus) in 0,05 Einheiten/ml, 0,5 uM 219-26, 0,05 uM 223-6 und 1 ul Matrize 90.1 enthielt, die die Target-Stellen für die zwei Primer enthielt. Die Sonde PCR 2 wurde unter Verwendung von ähnlichen Reaktionsbedingungen gemacht, außer daß die Primer und die Matrize geändert wurden. Die Sonde PCR 2 wurde gemacht unter Verwendung von 0,5 uM 222-11, 0,05 uM 219-21 und 1 ul einer Matrize, die aus PCR 96.2 stammt.
Näherungsweise 10&sup6; Bacteriophagen wurden ausplattiert, wie in Maniatis et al. beschrieben [oben (1982)]. Die Plaques wurden auf GeneScreen PlusTM Filter übertragen (22 cm · 22cm; NEN/DuPont), die denaturiert, neutralisiert und getrocknet wurden, wie in einem Protokoll des Herstellers beschrieben. Zwei Filtertransfers wurden für jede Platte durchgeführt.
Die Filter wurden prähybridisiert in 1 M NaCl, 1% SDS, 0,1% bovinem Serumalbumin, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon (Hybridisierungslösung) für näherungsweise 16 h bei 65ºC und gelagert bei -20ºC. Die Filter wurden in eine frische Hybridisierungslösung übertragen, die ³²P-markierte PCR1-Sonde in 1,2 · 10&sup5; cpm/ml enthielt, und hybridisiert für 14 h bei 65 ºC. Die Filter wurden in 0,9 M NaCl, 0,09 M Natriumcitrat, 0,1% SDS, pH 7,2 (Waschlösung) für 2 h bei Zimmertemperatur gewaschen, gefolgt von einer zweiten Waschung in frischer Waschlösung für 30 min bei 65ºC. Die Bakteriophagen-Klone aus den Gebieten der Platten, die radioaktiven Flecken auf den Autoradiogrammen entsprachen, wurden von den Platten entfernt und erneut mit Sonden PCR1 und PCR2 gescreent.
Die DNA von positiven Klonen wurde mit Restriktionsendonukleasen BamHI, SphI oder SstI verdaut, und die resultierenden Fragmente wurden in pUC119 subkloniert und darauffolgend sequenziert. Die Strategie zum Sequenzieren der genomischen Ratten-SCF-DNA wird schematisch in Fig. 14A gezeigt. In dieser Figur repräsentiert die Linienzeichnung oben die Region der genomischen Ratten-DNA, die für SCF codiert. Die Lücken in der Linie zeigen Regionen an, die nicht sequenziert worden sind. Die großen Kästen repräsentieren Exons für codierende Regionen des SCF-Gens mit den entsprechenden codierten Aminosäuren, angezeigt oberhalb jedes Kastens. Die Pfeile repräsentieren die einzelnen Regionen, die sequenziert und verwendet wurden, um die Konsensussequenz für das Ratten-SCF-Gen zusammenzustellen. Die Sequenz für das Ratten-SFC-Gen wird in Fig. 14B gezeigt.
Unter Verwendung der PCR1-Sonde, um die genomische Ratten-Bibliothek zu screenen, wurden Klone isoliert, die Exons entsprechen, die Aminosäuren 19 bis 176 von SCF codieren. Um Klone für Exons stromauf von der für Aminosäure 19 codierenden Region zu erhalten, wurde die Bibliothek unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde 228-30 gescreent. Derselbe Satz Filter, der zuvor mit Sonde PCR 1 verwendet worden war, wurde prähybridisiert wie zuvor und in Hybridisierungslösung hybridisiert, die ³²P-markiertes Oligonukleotid 228-30 enthielt (0,03 Picomol/ml), bei 50ºC für 16 h. Die Filter wurden in Waschlösung bei Zim mertemperatur für 30 min gewaschen, gefolgt von einer zweiten Waschung in frischer Waschlösung bei 45ºC für 15 min. Bakteriophagen-Klone aus den Gebieten der Platten, die radioaktiven Flecken auf den Autoradiogrammen entsprachen, wurden von den Platten entfernt und erneut mit Sonde 228-30 gescreent. Die DNA von positiven Klonen wurde mit Restriktionsendonukleasen verdaut und wie zuvor subkloniert. Unter Verwendung von Sonde 228-30, wurden Klone erhalten, die dem Exon entsprachen, das für Aminosäuren -20 bis 18 codiert.
Mehrere Versuche wurden unternommen, um Klone zu isolieren, die dem (den) Exon(s) entsprechen, das (die) die 5'-nicht-translatierte Region und die für Aminosäuren -25 bis -21 codierende Region enthält (enthalten). Keine Klone für diese Region des Ratten-SCF-Gens sind isoliert worden.

C. Klonieren von Ratten-cDNA zur Expression in Säugetierzellen

Säugetierzell-Expressionssysteme wurden entworfen, um festzustellen, ob ein aktives Polypeptidprodukt von Ratten-SCF in Säugetierzellen exprimiert werden konnte und von ihnen ausgeschieden werden konnte. Es wurde Expressionssysteme konstruiert, um trunkierte Versionen von Ratten-SCF (SCF¹&supmin;¹&sup6;² und SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;) und ein Protein (SCF¹&supmin;¹&sup9;³) zu exprimieren, vorhergesagt anhand der Translation der Gensequenz in Fig. 14C.
Der in diesen Studien verwendete Expressionsvektor war ein Shuttle-Vektor, der pUC119, SV40 und HTLVI-Sequenzen enthielt. Der Vektor wurde konstruiert, um eine autonome Replikation in sowohl E. coli als auch Säugetierzellen zu ermöglichen und um inserierte exogene DNA unter der Kontrolle von viralen DNA-Sequenzen zu exprimieren. Dieser Vektor, bezeichnet als V 19.8, aufbewahrt in E. coli DH5, wird bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. (ATCC# 68124) hinterlegt. Dieser Vektor ist ein Abkömmling von pSVDM19, beschrieben in Souza U. S. Patent 4,810,643, das hiermit durch Bezugnahme einbezogen wird.
Die cDNA für Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² wurde in Plasmidvektor V19.8 inseriert. Die cDNA-Sequenz wird in Fig. 14C gezeigt. Die cDNA, die bei dieser Konstruktion verwendet wurde, wurde in PCR-Reaktionen 630.1 und 630.2 synthetisiert, wie in Fig. 13A gezeigt. Diese PCRs repräsentieren unabhängige Amplifizierungen und verwendeten synthetische Oligonukleotidprimer 227-29 und 227-30. Die Sequenz für diese Primer wurde aus PCR-erzeugter cDNA erhalten, wie beschrieben in Abschnitt A dieses Beispiels. Die Reaktionen, 50ul im Volumen, umfaßten 1 x Reaktionspuffer (aus einem Perkin Elmer Cetus Kit), 250 uM dATP, 250 uM dCTP, 250 uM dGTP und 250 uM dTTP, 200 ng Oligo(dT)-geprimter cDNA, 1 Picomol 227-29, 1 Picomol 227-30 und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin Elmer Cetus). Die cDNA wurde für 10 Zyklen unter Verwendung einer Denaturierungstemperatur von 94ºC für 1 min amplifiziert, einer Annealing-Temperatur von 37ºC für 2 min und einer Elongationstemperatur von 72ºC für 1 min. Nach diesen anfänglichen Runden der PCR-Amplifizierung wurden 10 Picomole 227-29 und 10 Picomole 227-30 zu jeder Reaktion zugegeben. Die Amplifizierungen wurden für 30 Zyklen unter denselben Bedingungen fortgesetzt mit der Ausnahme, daß die Annealing-Temperatur auf 55ºC verändert wurde. Die Produkte der PCR wurden mit Restriktionsendonukleasen Hindill und SstII verdaut. V19.8 wurde auf ähnliche Weise mit HindIII und SstII verdaut, und in einem Fall wurde der verdaute Plasmidvektor mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt; in anderen Fällen wurde das große Fragment von der Verdauung aus einem Agarosegel isoliert. Die cDNA wurde an V 19.8 unter Verwendung von T4 Polynukleotidligase ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in den kompetenten E. coli-Stamm DH5 transformiert, wie beschrieben [Okayama, et. al., oben (1987)]. Die DNA, die aus einzelnen bakteriellen Klonen erzeugt worden war, wurde durch das Sanger Didesoxyverfahren sequenziert. Fig. 17 zeigt ein Konstrukt von V 19.8 SCF. Diese Plasmide wurden verwendet, um Säugetierzellen zu transfizieren, wie in Beispiel 4 und Beispiel 5 beschrieben.
Der Expressionsvektor für Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; wurde unter Verwendung einer Strategie konstruiert, die ähnlich derjenigen war, die für SCF¹&supmin;¹&sup6;² verwendet worden war, bei der cDNA unter Verwendung von PCR-Amplifizierung synthetisiert und darauffolgend in V 19.8 inseriert wurde. Die bei den Konstruktionen verwendete cDNA wurde in PCR Amplifizierungen mit V19.8 synthetisiert, enthaltend SCF¹&supmin;¹&sup6;² cDNA (V19.8 : SCF¹&supmin;¹&sup6;²) als eine Matrize, 227-29 als den Primer für das 5'-Ende des Gens und 237-19 als den Primer für das 3'-Ende des Gens. Doppelte Reaktionen (50 ul) enthielten 1x Reaktionspuffer, jeweils 250 uM von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 2,5 Einheiten Taq Polymerase, 20 ng V 19.8 : SCF¹&supmin;¹&sup6;² und 20 Picomol jedes Primers. Die cDNA wurde für 35 Zyklen amplifiziert unter Verwendung einer Denaturierungstemperatur von 94ºC für 1 min. einer Annealing-Temperatur von 55ºC für 2 min und einer Elongationstemperatur von 72ºC für 2 min. Die Produkte der Amplifizierungen wurden mit Restriktionsendonukleasen Hindlil und SstII verdaut und in V 19.8 inseriert. Der resultie rende Vektor enthält die für Aminosäuren -25 bis 164 von SCF codierende Region, gefolgt von einem Terminationscodon.
Die cDNA für eine Form von Ratten-SCF mit 193 Aminosäuren (Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³ wird aus der Translation der DNA-Sequenz in Fig. 14C vorhergesagt) wurde ebenso in Plasmidvektor V19.8 unter Verwendung eines Protokolls inseriert, das ähnlich demjenigen war, das für den Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² verwendet wurde. Die cDNA, die bei dieser Konstruktion verwendet wurde, wurde in PCR-Reaktionen 84.1 und 84.2 (Fig. 13A) unter Verwendung von Oligonukleotiden 227-29 und 230-25 synthetisiert. Die zwei Reaktionen repräsentieren unabhängige Amplifizierungen, ausgehend von verschiedenen RNA-Präparationen. Die Sequenz für 227-29 wurde über PCR-Reaktionen, we in Abschnitt A dieses Beispiels beschrieben, erhalten, und die Sequenz für Primer 230-25 wurde aus genomischer Ratten-DNA erhalten (Fig. 14B). Die Reaktionen, 50 ul im Volumen, umfaßten 1x Reaktionspuffer (aus einem Perkin Elmer Cetus Kit), 250 uM dATP, 250 uM dCTP, 250 uM dGTP und 250 uM dTTP, 200 ng Oligo(dT)-geprimter cDNA, 10 Picomol 227-29, 10 Picomol 230-25 und 2,5 Einheiten Taq Polymerase (Perkin Elmer Cetus). Die cDNA wurde für 5 Zyklen unter Verwendung einer Denaturierungstemperatur von 94ºC für 1 ¹/&sub2; Minuten, einer Annealing-Temperatur von 50ºC für 2 min und einer Elongationstemperatur von 72ºC für 2 min amplifiziert. Nach diesen anfänglichen Runden wurden die Amplifizierungen für 35 Zyklen unter denselben Bedingungen fortgesetzt, mit der Ausnahme, daß die Annealing-Temperatur auf 60ºC verändert wurde. Die Produkte der PCR-Amplifizierung wurden mit Restriktionsendonukleasen Hindlil und SstII verdaut. V 19.8-DNA wurde mit Hindill und SstII verdaut, und das große Fragment von dem Verdau wurde aus einem Agarosegel isoliert. Die cDNA wurde an V 19.8 ligiert unter Verwendung von T4 Polynukleotidligase. Die Ligationsprodukte wurden in den kompetenten E. coli-Stamm DH5 transformiert, und die DNA, hergestellt aus einzelnen bakteriellen Klonen, wurde sequenziert. Diese Plasmide wurden verwendet, um Säugetierzellen in Beispiel 4 zu transfizieren.

D. Amplifizierung und Seauenzierung von humanen SCF-cDNA-PCR-Produkten

Die menschliche SCF-cDNA wurde aus einer Hepatom-Zellinie HepG2 (ATCC HB 8065) erhalten unter Verwendung einer PCR-Amplifizierung, wie in Fig. 13B dargestellt. Die grundlegende Strategie war, menschliche cDNA durch PCR mit Primern zu amplifizieren, deren Sequenz aus der Ratten-SCF-cDNA erhalten wurde.
Die RNA wurde hergestellt, wie von Maniatis et al. [oben (1982)] beschrieben. PolyA+-RNA wurde hergestellt unter Verwendung von Oligo-dT-Zellulose unter Befolgen der Anweisungen der Hersteller (Collaborative Research Inc.).
Erst-Strang-cDNA wurde hergestellt, wie oben für BRL-cDNA beschrieben, außer daß die Synthese mit 2 uM Oligonukleotid 228-28, gezeigt in Fig. 12C, geprimt wurde, das eine kurze Zufallssequenz am 3'-Ende enthält, die an eine längere einzigartige Sequenz angehängt ist. Der einzigartige Sequenzteil von 228-28 stellt eine Target-Stelle zur Amplifizierung mit PCR mit Primer 228-29 als nicht-spezifischen Primer bereit. Menschliche cDNA-Sequenzen, die mit wenigstens einem Teil der Ratten-SCF-Sequenz verwandt waren, wurden aus der HepG2-cDNA mittels PCR amplifiziert unter Verwendung von Primern 227-29 und 228-29 (PCR 22.7, siehe Fig. 13B; 15 Zyklen Annealing bei 60ºC, gefolgt von 15 Zyklen Annealing bei 55ºC). Eine Agarose-Gelelektrophorese zeigte keine ausgeprägten Banden nur eine verwischte Spur von DNA mit offensichtlich heterogener Größe. Eine weitere Amplifizierung, die Sequenzen bevorzugte, die mit Ratten-SCF-cDNA nahe verwandt waren, wurde versucht, indem eine PCR mit 1 ul des PCR 22.7 Produkts unter Verwendung eines internen eingenisteten Ratten-SCF-Primers 222-11 und des Primers 228-29 (PCR 24.3; 20 Zyklen Annealing bei 55ºC) durchgeführt wurde. Wieder wurde nur eine heterogene verwischte Spur DNA- Produkt auf den Agarosegelen beobachtet. Eine doppelseitige spezifische Amplifizierung der PCR 24.3-Produkte mit Primern 222-11 und 227-30 (PCR 25.10; 20 Zyklen) verursachte eine einzelne Hauptproduktbande derselben Größe wie das entsprechende Ratten-SCF-cDNA- PCR-Produkt. Die Sequenzierung einer asymmetrischen PCR-Produkt(PCR 33.1)-DNA unter Verwendung von 224-24 als Sequenzierungsprimer ergab ungefähr 70 Basen der humanen SCF-Sequenzen.
Auf ähnliche Weise erzeugte die Amplifizierung von 1 ul des PCR-22.7-Produkts, zuerst mit Primern 224-25 und 228-29 (PCR 24.7, 20 Zyklen), dann mit Primern 224-25 und 227-30 (PCR 41.11) eine Hauptbande derselben Größe wie das entsprechende Ratten-SCF-Produkt und ergab nach asymmetrischer Amplifizierung (PCR 42.3) eine Sequenz, die hoch homolog mit der Ratten-SCF-Sequenz war, wenn 224-24 als Sequenzierungsprimer verwendet wurde. Oligodesoxynukleotide mit einer einzigartigen Sequenz, die auf die humane SCF-cDNA gerichtet waren, wurden synthetisiert, und ihre Sequenzen werden in Fig. 12B angegeben.
Um das menschliche Gegenstück der Ratten-SCF-PCR-erzeugten Codierungssequenz, die bei Expressions- und Aktivitätsstudien verwendet wurde, zu erhalten, wurde eine PCR mit Primern 227-29 und 227-30 an 1 ul PCR-22.7-Produkt in einem Reaktionsvolumen von 50 ul (PCR 39.1) durchgeführt. Die Amplifizierung wurde in einem Coy Tempcycler durchgeführt. Da der Grad von Mismatch zwischen der humanen SCF-cDNA und dem einzigartigen Ratten- SCF-Primer 227-30 unbekannt war, wurde eine geringe Stringenz zum Annealing (37ºC) für die ersten drei Zyklen verwendet: danach fand das Annealing bei 55ºC statt. Eine auffallende Bande derselben Größe (ungefähr 590 bp) wie das Ratten-Homolog erschien und wurde weiter durch Verdünnung eines kleinen Teils des PCR 39.1-Produkts und PCR mit denselben Primern (PCR 41.1) amplifiziert. Weil mehr als eine Bande bei den Produkten von PCR 41.1 beobachtet wurde, wurde eine weitere PCR mit eingenisteten internen Primern durchgeführt, um wenigstens einen Teil seiner Sequenz vor dem Klonieren zu bestimmen. Nach 23 Zyklen PCR mit Primern 231-27 und 227-29 (PCR 51.2) war eine einzelne, intensive Bande ersichtlich. Asymmetrische PCRs mit Primern 227.29 und 231-27 und Sequenzierung bestätigte die Anwesenheit der humanen SCF-cDNA-Sequenzen. Eine Klonierung der PCR-41.1-SCF- DNA in den Expressionsvektor V 19.8 wurde durchgeführt, wie bereits für die Ratten-SCF-1- 162-PCR-Fragmente in Abschnitt C oben beschrieben. Die DNA von einzelnen bakteriellen Klonen wurde mit dem Sanger-Didesoxy-Verfahren sequenziert.

E. Klonieren der humanen genomischen Stammzellenfaktor-DNA

Eine PCR7-Sonde, die aus einer PCR-Amplifizierung von cDNA, siehe Fig. 13B, gemacht worden war, wurde verwendet, um eine Bibliothek zu screenen, die humane genomische Sequenzen enthielt. Eine Ribosonde, komplementär zu einem Teil von humaner SCF-cDNA, siehe unten, wurde verwendet, um positive Plaques erneut zu screenen. Die PCR 7-Sonde wurde erzeugt, ausgehend von dem Produkt von PCR 41.1 (siehe Fig. 13B). Das Produkt von PCR 41-1 wurde weiter mit Primern 227-29 und 227-30 amplifiziert. Das resultierende 590 bp-Fragment wure von einem Agarosegel eluiert und mit denselben Primern (PCR 58.1) reamplifiziert. Das Produkt von PCR 58.1 wurde 1000-fach in einer 50 ul Reaktion verdünnt, die 10 pmole 233-13 enthielt, und für 10 Zyklen amplifiziert. Nach der Zugabe von 10 pmolen 227-30 zur Reaktion wurde die PCR für 20 Zyklen fortgesetzt. Zusätzliche 80 pmole 233- 13 wurden zugegeben und das Reaktionsvolumen auf 90 ul erhöht, und die PCR wurde für 15 Zyklen fortgesetzt. Die Reaktionsprodukte wurden 200-fach in einer 50 ul Reaktion verdünnt, 20 pmole 231-27 und 20 pmole 233-13 wurden zugegeben, und die PCR wurde für 35 Zyklen unter Verwendung einer Annealing-Temperatur von 48ºC in Reaktion 96.1 durchgeführt. Um ³²P-markiertes PCR7 zu erzeugen, wurden Reaktionsbedingungen verwendet, die denjenigen ähnlich waren, die verwendet wurden, um PCR1 zu machen, mit den folgenden Ausnahmen: in einem Reaktionsvolumen von 50 ul wurde PCR 96.1 100-fach verdünnt; 5 pmole 231-27 wurden verwendet als der einzige Primer; und 45 Zyklen PCR wurden durchgeführt mit einer Denaturierung bei 94º für 1 Minute; Annealing bei 48º für 2 Minuten und Elongation bei 72º für 2 Minuten.
Die Ribosonde, Ribosonde 1, war eine ³²P-markierte, einzelsträngige RNA, die komplementär zu Nukleotiden 2-436 der hSCF-DNA-Sequenz war, die in Fig. 15B gezeigt wird. Um den Vektor für die Herstellung dieser Sonde zu konstruieren, wurde die PCR-41.1 (Fig. 13B)- Produkt-DNA mit Hindlil und EcoRI verdaut und in den Polylinker des Plasmidvektors pGEM3 (Promega, Madison, Wisconsin), kloniert. Die rekombinante pGEM3 : hSCF-Plasmid- DNA wurde dann durch Verdau mit Hindill linearisiert. Die ³²P-markierte Ribosonde 1 wurde aus der linearisierten Plasmid-DNA erzeugt durch eine Runoff-Transkription mit T7-RNA- Polymerase gemäß den Anweisungen, die von Promega bereitgestellt werden. Die Reaktion (3 ul) enthielt 250 ng linearisierte Plasmid-DNA und 20 uM ³²P-rCTP (Katalog #NEG-008H, New England Nuclear (NEN)) ohne zusätzliches unmarkiertes CTP.
Die humane genomische Bibliothek wurde von Stratagene erworben (La Jolla, CA; Katalog #:946203). Die Bibliothek wurde in dem Bakteriophagen Lambda Fix 11-Vektor konstruiert unter Verwendung von DNA, die aus einer männlichen kaukasischen Placenta hergestellt worden war. Die Bibliothek enthielt gemäß der Charakterisierung des Herstellers 2 · 10&sup6; primäre Plaques mit einer durchschnittlichen Insert-Größe größer als 15 kb. Näherungsweise 10&sup6; Bakteriophagen wurden ausplattiert, wie in Maniatis et al. beschrieben [oben (1982)]. Die Plaques wurden auf Gene Screen PlusTM-Filter transferiert (22 cm²; NEN/DuPont) gemäß dem Protokoll vom Hersteller. Zwei Filtertransfers wurden für jede Platte durchgeführt.
Die Filter wurden prähybridisiert in 6XSSC (0,9 M NaCl, 0,09 M Natriumcitrat pH 7,5), 1% SCS bei 60ºC. DieFilter wurden hybridisiert in frischem 6XSSC, 1% SDS-Lösung, die ³²Pmarkierte PCR7-Sonde mit 2 · 10&sup5; cpm/ml enthielt, und hybridisierten für 20 h bei 62ºC. Die Filter wurden in 6XSSC, 1% SDS für 16 h bei 62ºC gewaschen. Ein Bakteriophagen- Pfropfen wurde von einem Gebiet einer Platte entfernt, das radioaktiven Flecken auf Autoradiogrammen entsprach, und erneut mit der Sonde PCR7 und der Ribosonde 1 gescreent. Das erneute Screening mit der PCR7-Sonde wurde unter Verwendung von Bedingungen durchgeführt, die ähnlich denjenigen waren, die bei dem anfänglichen Screening verwendet wurden. Das erneute Screening mit Ribosonde 1 wurde wie folgt durchgeführt: die Filter wurden in 6XSSC, 1% SDS prähybridisiert und hybridisierten bei 62ºC für 18 h in 0,25 M NaPO&sub4;, (pH 7,5), 0,25 M NaCl, 0,001 M EDTA, 15% Formamid, 7% SDS und Ribosonde mit 1 X 10&sup6; cpm/ml. Die Filter wurden in 6XSSC, 1% SDS für 30 min bei 62ºC gewaschen, gefolgt von 1XSSC, 1% SDS für 30 min bei 62ºC. Eine DNA von positiven Klonen wurde mit den Restriktionsendonukleasen Bam HI, SphI oder SstI verdaut, und die resultierenden Fragmente wurden in pUC 119 subkloniert und darauffolgend sequenziert.
Unter Verwendung von Sonde PCR 7 wurde ein Klon erhalten, der Exons einschloß, die für Aminosäuren 40 bis 176 codierten, und dieser Klon ist bei der ATCC hinterlegt (Hinterlegung #40681). Um Klone für zusätzliche SCF-Exons zu erhalten, wurde die humane genomische Bibliothek mit Ribosonde 2 und Oligonukleotidsonde 235-29 gescreent. Die Bibliothek wurde auf eine Weise gescreent, die ähnlich derjenigen war, die zuvor gemacht wurde, mit den folgenden Ausnahmen: die Hybridisierung mit Sonde 235-29 wurde bei 37ºC durchgeführt, und die Waschungen für diese Hybridisierung waren für 1 h bei 37ºC und 1 h bei 44ºC. Positive Klone wurden erneut gescreent mit Ribosonde 2, Ribosonde 3 und Oligonukleotidsonden 235-29 und 236-31. Ribosonden 2 und 3 wurden gemacht unter Verwendung eines Protokolls, ähnlich demjenigen, das verwendet wurde, um Ribosonde 1 zu produzieren, mit den folgenden Ausnahmen: (a) die rekombinante pGEM3 : hSCF-Plasmid-DNA wurde mit Restriktionsendonuklease PvuII (Ribosonde 2) oder PstI (Ribosonde 3) linearisiert, und (b) die SP6 RNA- Polymerase (Promega) wurde verwendet, um Ribosonde 3 zu synthetisieren.
Fig. 15A zeigt die Strategie, die verwendet wurde, um humane genomische DNA zu sequenzieren. In dieser Figur repräsentiert die Linienzeichnung oben die Region von humaner genomischer DNA, die für SCF codiert. Die Lücken in der Linie zeigen Regionen an, die nicht sequenziert worden sind. Die großen Kästen repräsentieren Exons für codierende Regionen des SCF-Gens mit den entsprechenden codierten Aminosäuren angegeben über jedem Kasten. Die Sequenz des humanen SCF-Gens wird in Fig. 15B gezeigt. Die Sequenz von humaner SCF-cDNA, erhalten durch PCR-Techniken, wird in Fig. 15C gezeigt.

F. Seguenz der humanen SCF-cDNA-5'-Region

Das Sequenzieren von Produkten von PCRs, die von zwei genspezifischen Primern geprimed sind, offenbart die Sequenz der Region, die von den 3'-Enden der zwei Primer eingegrenzt wird. Einseitige PCRs, wie in Beispiel 3A angezeigt, können die Sequenz der flankierenden Regionen ergeben. Einseitige PCR wurde verwendet, um die Sequenz der 5'-nichttranslatierten Region humaner SCF-cDNA zu erweitern.
Erst-Strang-cDNA wurde von PolyA+-RNA von der humanen Blasen-Karzinom-Zelllinie 5637 (ATCC HTB 9) unter Verwendung von Oligonukleotid 228-28 (Fig. 12C) als Primer, wie in Beispiel 3D beschrieben, erzeugt. Ein Anhängen eines Schwanzes von dG-Resten an diese cDNA, gefolgt von einer einseitigen PCR-Amplifizierung unter Verwendung von Primern, die (dC)"Sequenzen enthalten in Kombination mit SCF-spezifischen Primern, ergab keine cDNA-Fragmente, die sich stromaufwärts (5') von der bekannten Sequenz erstreckten.
Eine geringe Menge an Sequenzinformation wurde erhalten mit einer PCR-Amplifizierung von Produkten einer Zweit-Strang-Synthese, die von Oligonukleotid 228-28 geprimed wurde. Die nicht mit einem Schwanz versehene 5637-Erst-Strang-cDNA, oben beschrieben (ungefähr 50 ng), und 2 umol 228-28 wurden mit Klenow-Polymerase und 0,5 mM von jeweils dATP, dCTP, dGTP und dTTP bei 10-12ºC für 30 Minuten in 10 ul 1xNick-Translationspuffer inkubiert [Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Eine Amplifizierung der resultierenden cDNA durch sequenzielle einseitige PCRs mit Primer 228-29 in Kombination mit den eingenisteten SCR-Primern (in der Reihenfolge ihrer Verwendung: 235-30, 233-14, 236-31 und schließlich 235-29) ergab komplexe Produktmischungen, die als verwischte Spuren auf Agarosegelen erschienen. Eine signifikante Anreicherung von SCF-verwandten cDNA-Fragmenten wurde durch die ansteigende Intensität der spezifischen Produktbande angezeigt, die beobachtet wurde, wenn vergleichbare Volumina der aufeinanderfolgenden einseitigen PCR-Produkte mit zwei SCF-Primern amplifiziert wurden (zum Beispiel 227-29 und 235-29, die ein Produkt von ungefähr 150 bp ergaben). Versuche, auf einen bestimmten Größenbereich von Produkten zu selektionieren durch Herausdrücken von Teilen der verwischten Agarosegel-Spuren und Reamplifizieren mit PCR mißlangen in den meisten Fällen, um eine wohl-definierte Bande zu ergeben, die SCFverwandte Sequenzen enthielt.
Eine Reaktion, PCR 16.17, die nur den 235-29 Primer enthielt, führte zu einer Bande, die offensichtlich aufgrund von Priming durch 235-29 an einer unbekannten Stelle 5' von der codierenden Region zusätzlich zu der erwarteten Stelle entstand, wie durch Kartierung mit den Restriktionsenzymen PvuII und PstI und PCR-Analyse mit eingenisteten Primern gezeigt wurde. Dieses Produkt wurde Gel-aufgereinigt und mit Primer 235-29 reamplifiziert, und eine Sequenzierung wurde mit dem Sanger-Didesoxyverfahren unter Verwendung von ³²Pmarkiertem Primer 228-30 versucht. Die resultierende Sequenz war die Grundlage für die Konstruktion von Oligonukleotid 254-9 (Fig. 12B). Wenn dieser 3'-gerichtete Primer in darauffolgenden PCRs in Kombination mit 5'-gerichteten SCF-Primern verwendet wurde, wurden Banden der erwarteten Größe erhalten. Eine direkte Sanger-Sequenzierung von solchen PCR-Produkten ergab Nukleotide 180 bis 204 einer humanen SCF-cDNA-Sequenz, Fig. 15C.
Um mehr Sequenz am 5'-Ende der hSCF-cDNA zu erhalten, wurde eine Erst-Strang-cDNA von 5637-PolyA+ RNA (ungefähr 300 ng) unter Verwendung eines SCF-spezifischen Primers (2 umol 233-14) in einer 16 uL-Reaktion erzeugt, die 0,2 U MMLV reverse Transkriptase (erworben von BRL) und 500 uM eines jeden dNTP enthielt. Nach Standard-Phenol- Chloroform- und Chloroform-Extraktions- und Ethanolfällungs (aus 1 M Ammoniumacetat)- Schritten wurden die Nukleinsäuren in 20 uL Wasser resuspendiert, eingebracht in ein kochendes Wasserbad für 5 Minuten, dann gekühlt und mit einem Schwanz versehen mit terminaler Transferase in der Anwesenheit von 8 uM dATP in einem CoCl&sub2;-enthaltenden Puffer [Deng und Wu, Methods in Enzymology, 100, S. 96-103]. Das Produkt, eine mit einem (dA)n- Schwanz versehene Erst-Strang-cDNA wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung aufgereinigt und in 20 uL 10mM Tris, pH 8,0, und 1 mM EDTA resuspendiert.
Eine Anreicherung und Amplifizierung von humanen SCF-verwandten cDNA 5'- Endfragmenten von ungefähr 20 ng der mit einem (dA)n-Schwanz versehenen 5637-cDNA wurde wie folgt durchgeführt: 26 Zyklen einer einseitigen PCR wurden anfangs durchgeführt in der Anwesenheit von SCF-spezifischem Primer 236-31 und einem Primer oder einer Primermischung, die (dT)n-Sequenzen am oder nahe dem 3'-Ende enthielt, z. B. Primer 221-12 oder einer Mischung von Primem 220-3, 220-7 und 220-11 (Fig. 12C). Die Produkte (1 ul) dieser PCRs wurden dann in einem zweiten Satz PCRs amplifiziert, die Primer 221-12 und 235-29 enthielten. Eine Hauptproduktbande von näherungsweise 370 bp wurde in jedem Fall nach Agarose-Gelanalyse beobachtet. Ein Gel-Pfropfen, der einen Teil dieser Bande enthielt, wurde aus dem Gel mit der Spitze einer Pasteur-Pipette herausgedrückt und in ein kleines Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. 10 uL Wasser wurde zugegeben, und der Pfropfen wurde in einem 84ºC Wärmeblock geschmolzen. Eine PCR, die die Primer 221-12 und 235- 29 (je 8 pmol) in 40 ul enthielt, wurde mit 2 uL des geschmolzenen, verdünnten Gel- Pfropfens beimpft. Nach 15 Zyklen war eine geringfügig diffuse Bande von näherungsweise 370 bp sichtbar nach einer Agarose-Gelanalyse. Asymmetrische PCRs wurden durchgeführt um Top- und Bottom-Strang-Sequenziermatrizen zu erzeugen: für jede Reaktion wurden 4 uL PCR-Reaktionsprodukt und 40 umol von entweder Primer 221-12 oder Primer 235-29 in einem Gesamtreaktionsvolumen von 100 uL 25 Zyklen PCR unterzogen (1 Minute, 95ºC; 30 Sekunden, 55ºC; 40 Sekunden, 72ºC). Ein direktes Sequenzieren der 221-12-geprimten PCR- Produktmischungen (nach den Standardextraktionen und der Ethanolfällung) mit ³²Pmarkiertem Primer 262-13 (Fig. 12B) ergab die 5'-Sequenz von Nukleotid 1 bis 179 (Fig. 15C).

6. Amplifizierung und Sequenzierung von humaner genomischer DNA an der Stelle des ersten codierenden Exons des Stammzellenfaktors

Das Screening einer humanen genomischen Bibliothek mit SCF-Oligonuldeotid-Sonden vermochte es nicht, irgendwelche Klone zu zeigen, die den bekannten Teil des ersten codierenden Exons enthielten. Ein Versuch wurde dann unternommen, eine einseitige PCR-Technik zu verwenden, um genomische Sequenzen, die dieses Exon umgeben, zu amplifizieren und zu klonieren.
Eine Primer-Extension von hitzedenaturierter humaner, placentaler DNA (erworben von Sigma) wurde mit DNA-Polymerase I (Klenow-Enzym, großes Fragment; Boehringer- Mannheim) unter Verwendung eines nicht-SCF-Primers, wie etwa 228-28 oder 221-11 unter nicht-stringenten Bedingungen (niedrige Temperatur), wie etwa 12ºC, durchgeführt, um ein Priming an einer sehr großen Anzahl verschiedener Stellen zu begünstigen. Jede Reaktion wurde dann fünffach in TaqI-DNA-Polymerase-Puffer verdünnt, der TaqI-Polymerase und 100 uM von jedem dNTP enthielt, und man ließ die Elongation der DNA-Stränge bei 72ºC für 10 Minuten fortschreiten. Das Produkt wurde dann hinsichtlich der Sequenzen des ersten Exons des Stammzellenfaktors mittels PCR in der Anwesenheit eines Oligonukleotids des ersten Exons von SCF (wie etwa 254-9) und des geeigneten nicht-SCF-Primers (228-29 oder 221-11) angereichert. Eine Agarose-Gelelektrophorese zeigte, daß die meisten Produkte kurz waren (weniger als 300 bp). Um hinsichtlich längerer Species anzureichern, wurde der Teil jeder Agarose-Gelspur, die einer Länge größer als 300 bp entsprach, ausgeschnitten und elektrophoretisch eluiert. Nach einer Ethanolfällung und Resuspension in Wasser wurden die Gelaufgereinigten PCR-Produkte in einen Abkömmling von pGEM4, der eine SfiI-Stelle enthielt, als ein HindIII-bis-SfiI-Fragment kloniert.
Die Kolonien wurden mit einem ³²P-markierten Oligonukleotid des ersten Exons von SCF gescreent. Mehrere positive Kolonien wurden identifiziert, und die Sequenzen der Inserts wurden mittels des Sanger-Verfahrens erhalten. Die resultierende Sequenz, die sich stromabwärts von dem ersten Exon durch eine Konsensus-Exon-Intron-Grenze in das benachbarte Intron erstreckt, wird in Fig. 15B gezeigt.

H. Amplifizierung und Sequenzierung von SCF-cDNA-codierenden Regionen von Maus, Affe und Hund

Eine Erst-Strang-cDNA wurde aus Gesamt-RNA oder Poly A&spplus;-RNA aus Affenleber (gekauft von Clontech) und aus den Zellinien NIH-3T3 (Maus, ATCC CRL 1658) und D17 (Hund, ATCC CCL 183) hergestellt. Der bei der Erst-Strang-cDNA-Synthese verwendete Primer war entweder der nicht-spezifische Primer 228-28 oder ein SCF-Primer (227-30, 237-19, 237-20, 230-25 oder 241-6). Eine PCR-Amplifizierung mit Primer 227-29 und einem der Primer 227- 30, 237-19 oder 237-20 ergab ein Fragment der erwarteten Größe, das entweder direkt oder nach Klonierung in V 19.8 oder einen pGEM-Vektor sequenziert wurde.
Zusätzliche Sequenzen nahe dem 5'-Ende der SCF-cDNAs wurden aus PCR- Amplifizierungen erhalten unter Verwendung eines SCF-spezifischen Primer in Kombination mit entweder 254-9 oder 228-29. Zusätzliche Sequenzen am 3'-Ende der SCF-codierenden Regionen wurden erhalten nach einer PCR-Amplifizierung von 230-25-geprimter cDNA (im Falle einer Maus) oder 241-6-geprimter cDNA (im Falle eines Affen) mit entweder 230-25 oder 241-6, wie geeignet, und einem 3'-gerichteten SCF-Primer. Keine SCF-PCR-Produkt- Banden wurden erhalten in ähnlichen Versuchen, um D17-cDNA zu amplifizieren. Der nichtspezifische Primer 228-28 wurde verwendet, um eine Erst-Strang-Synthese von D17-Gesamt- RNA zu primen, und die resultierende komplexe Produktmischung wurde hinsichtlich SCFverwandter Sequenzen durch PCR mit 3'-gerichteten SCF-Primern, wie etwa 227-29 oder 225-31 in Kombination mit 228-29 angereichert. Die Produktmischung wurde mit Stil ge schnitten und in einen Abkömmling von pGEM4 (Promega, Madison, Wisconsin), der eine Stil-Stelle enthielt, als ein SfiI-zu-stumpfes-Ende-Fragment einkloniert. Die resultierende heterogene Bibliothek wurde mit radioaktiv markiertem 237-20 gescreent, und mehrere positive Klone wurden sequenziert, was Hunde-SCF-3'-Endsequenzen ergab. Die aneinander ausgerichteten Aminosäuresequenzen von reifen SCF-Proteinen von Mensch (Fig. 42), Affe, Hund, Maus und Ratte werden in Fig. 16 gezeigt.
Die bekannten SCF-Aminosäuresequenzen sind hoch homolog über einen großen Teil ihrer Länge. Identische Consensus-Signalpeptid-Sequenzen sind in den codierenden Regionen von allen fünf Species vorhanden. Die Aminosäure, die am Aminoterminus des reifen Proteins in Analogie mit dem Ratten-SCF erwartet wird, wird mit der Zahl 1 in dieser Figur bezeichnet. Die Hunde-cDNA-Sequenz enthält eine Ambiguität, die zu einer Valin/Leucin-Ambiguität in der Aminosäuresequenz bei Codon 129 resultiert. Die humanen, Affen-, Ratten- und Mäuse- Aminosäuresequenzen alignen zusammen ohne irgendwelche Insertionen oder Deletionen. Die Hunde-Sequenz hat einen einzelnen Extrarest an Position 130, im Vergleich mit den anderen Species. Mensch und Affe unterscheiden sich nur an einer Position, einem konservativen Ersatz von Valin (Mensch) durch Alanin (Affe) bei Position 130. Die vorhergesagte SCF- Sequenz, unmittelbar vor und nach der vermeintlichen Verarbeitungsstelle nahe dem Rest 164, ist stark konserviert unter den Arten.

BEISPIEL 4

Expression von rekombinantem Ratten-SCF in COS-1-Zellen

Für die transiente Expression in COS-1-Zellen (ATCC CRL 1650) wurde der Vektor V19.8 (Beispiel 3C), der die Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;²- und -SCF¹&supmin;¹&sup9;³-Gene enthielt, in 60 mm Platten in doppelter Ausführung transfiziert [Wigler et al., Cell, 14, 725-731 (1978)]. Das Plasmid V19.8SCF wird in Fig. 17 gezeigt. Als eine Kontrolle wurde ebenso der Vektor ohne Insert transfiziert. Die Gewebekulturüberstände wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion geerntet und auf biologische Aktivität getestet. Tabelle 4 faßt die HPP-CFC- Bioassay-Resultate zusammen, und Tabelle 5 faßt die MC/9-³H-Thymidin-Aufnahme-Daten von typischen Transfektionsexperimenten zusammen. Die Bioassay-Resultate von Überständen aus COS-1-Zellen, die mit den folgenden Plasmiden transfiziert worden waren, werden in Tabellen 4 und 5 gezeigt: einer C-terminal-trunkierten Form von Ratten-SCF mit dem C- Terminus bei Aminosäureposition 162 (V19.8-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;²), SCF¹&supmin;¹&sup6;², das eine Glutamin säure an Position 81 enthielt [V19.8-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² (Glu81)] und SCF¹&supmin;¹&sup6;², der ein Alanin an Position 19 enthielt [V19.8-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² (Ala 19)]. Die Aminosäuresubstitutionen waren das Produkt von PCR-Reaktionen, die bei der Amplifizierung von Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;², wie in Beispiel 3 angezeigt, durchgeführt wurden. Einzelne Klone von V19.8-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² wurden sequenziert, und es wurde gefunden, daß zwei Klone Aminosäuresubstitutionen hatten. Wie in Tabellen 4 und 5 gesehen werden kann, ist der rekombinante Ratten-SCF in den Bioassays aktiv, die verwendet werden, um natürlichen Säugetier-SCF in Beispiel 1 aufzureinigen. Tabelle 4 HPP-CFC-Assay von COS-1-Überstände von Zellen, die mit Ratten-SCF-DNA transfiziert worden sind Tabelle 5 MC/9³H-Thymidin-Aufnahme-Assay von COS-1-Überständen aus Zellen, die mit Ratten-SCF-DNA transfiziert worden sind
Rekombinanter Ratten-SCF und andere Faktoren wurden einzeln in einem humanen CFU- GM-Assay [Broxmeyer et al., oben (1977)] getestet, der die Proliferation von normalen Knochenmarkszellen mißt, und die Daten sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Resultate für COS-1- Überstände aus Kulturen vier Tage nach der Transfektion mit V 19.8-SCF¹&supmin;¹&sup6;² in Kombination mit anderen Faktoren werden ebenso in Tabelle 6 gezeigt. Die Kolonie-Zahlen sind der Mittelwert von dreifachen Kulturen.
Der rekombinante Ratten-SCF hat hauptsächlich eine synergistische Aktivität auf normales humanes Knochenmark in dem CFU-GM-Assay. In dem Experiment in Tabelle 6 arbeitete SCF mit humanem GM-GSF, humanem IL-3 und humanem CSF-1 zusammen. In anderen Assays wurde eine Synergie ebenso mit G-CSF beobachtet. Es gab eine gewisse Proliferation von humanem Knochenmark nach 14 Tagen mit Ratten-SCF; jedoch waren die Cluster aus < 40 Zellen zusammengesetzt. Ähnliche Resultate wurden mit natürlichem SCF erhalten, der aus Säugetieren stammte.

Tabelle 6

Humaner CFU-GM-Assay von COS-1-Überständen aus Zellen, die mit Ratten-SCF-DNA transfiziert worden sind

Probe Kolonie #/100.000 Zellen (±SEM)

Kochsalzlösung 0
GM-CSF 7 ± 1
G-CSF 24 ± 1
IL-3 5 ± 1
CSF-1 0
SCF¹&supmin;¹&sup6;² 0
GM-CSF + SCF¹&supmin;¹&sup6;² 29 ± 6
G-CSF + SCF¹&supmin;¹&sup6;² 20 ± 1
IL-3 + SCF¹&supmin;¹&sup6;² 11 ± 1
CSF-1 + SCF¹&supmin;¹&sup6;² 4 ± 0

BEISPIEL 5

Expression von rekombinantem SCF in Ovarialzellen aus chinesischem Hamster

Dieses Beispiel betrifft ein stabiles Säugetier-Expressionssystem zur Ausscheidung von SCF von CHO-Zellen (ATCC CCL 61, ausgewählt nach DHFR-).

A. Rekombinanter Ratten-SCF

Der Expressionsvektor, der zur SCF-Herstellung verwendet wurde, war V 19.8 (Fig. 17). Der selektionierbare Marker, der verwendet wurde, um stabile Transformanten zu etablieren, war das Gen für Dihydrofolatreduktase im Plasmid pDSVE.1. Plasmid pDSVE.1 (Fig. 18) ist ein Abkömmling von pDSVE, der durch Verdau von pDSVE mit dem Restriktionsenzym SaII und Ligation an ein Oligonukleotidfragment hergestellt wurde, das die zwei Oligonukleotide umfaßt
5'TCGAC CCGGA TCCCC 3'
3' G GGCCT AGGGG AGCT 5'.
Der Vektor pDSVE wird in US Ser. No. 025,344 und 152,045, mit mehreren Anmeldern, beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme einbezogen sind. Der Vektorteil von V 19.8 und pDSVE.1 enthalten lange Homologieabschnitte, die einen bakteriellen ColE1- Replikationsursprung und ein Ampicillin-Resistenzgen und den SV40-Replikationsursprung einschließen. Diese Überlappung kann zu einer homologen Rekombination während des Transformationsprozesses beitragen, wodurch die Cotransformation erleichtert wird.
Calciumphosphat-Niederschläge von V19.8SCF-Konstrukten und pDSVE.1 zusammen wurden in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 ug Träger-Maus-DNA unter Verwendung von 1,0 oder 0,1 ug pDSVE.1, das mit der Restriktionsendonuklease PvuI linearisiert worden war, und V19.8-SCF, wie beschrieben [Wigler et al., oben (1987)], gemacht. Die Kolonien wurden ausgewählt auf der Grundlage der Expression des DHFR-Gens von pDSVE.1. Kolonien, die zum Wachstum in der Abwesenheit von zugegebenem Hypoxanthin und Thymidin fähig waren, wurden gepickt unter Verwendung von Klonier-Zylindern und als unabhängige Zelilinien expandiert. Zellenüberstände aus einzelnen Zeillinien wurden in einem MC/9 ³H- Thymidin-Aufnahme-Assay getestet. Die Resultate eines typischen Experiments werden in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 MC/9 ³H-Thymidin-Aufnahme-Assay von stabilen CHO-Zell-Überständen aus Zellen, die mit Ratten-SCF-DNA transfiziert worden waren

B. Rekombinanter humaner SCF

Eine Expression von SCF in CHO-Zellen wurde ebenso erreicht unter Verwendung des Expressionsvektors pDSVRα2, der beschrieben ist in Ser. No. 501,904, mit mehreren Inhabern, eingereicht am 29. März 1990, hierin durch Bezugnahme einbezogen. Dieser Vektor schließt ein Gen zur Selektion und Amplifizierung von Klonen auf der Grundlage der Expression des DHFR-Gens ein. Der Klon pDSRα2-SCF wurde durch ein Zwei-Schritt-Verfahren erzeugt. Der V19.8SCF wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und das SCF-Insert wurde in die BamHI-Stelle von pGEM3 ligiert. Die DNA aus pGEM3-SCF wurde mit Hindlil und SaII verdaut und in pDSRα2 ligiert, das mit Hindlil und Sah verdaut worden war. Derselbe Prozeß wurde für die humanen Gene wiederholt, die für einen COOH-Terminus an den Aminosäurepositionen 162, 164 und 183 der in Fig. 15C gezeigten Sequenz und Position 248 der in Fig. 42 gezeigten Sequenzen codieren. Etablierte Zellinien wurden mit Methotrexat stimuliert [Shimke, in Methods in Enzymology. 151 85-104 (1987)] in 10 nM, um die Expressionsniveaus des DHFR-Gens und des angrenzenden SCF-Gens zu erhöhen. Die Expressionsniveaus von rekombinantem humanen SCF wurden mittels eines Radioimmun-Assays getestet, wie in Beispiel 7, und/oder durch Induktion der Koloniebildung in vitro unter Verwendung von humanen Peripher-Blut-Leukocyten. Dieser Assay wird durchgeführt, wie in Beispiel 9 beschrieben (Tabelle 12), außer daß Peripher-Blut anstelle von Knochenmark verwendet wird und die Inkubation bei 20% O&sub2;, 5% CO&sub2; und 75% N&sub2; in der Anwesenheit von humanem EPO (10 U/ml) durchgeführt wird. Die Resultate von typischen Experimenten werden in Tabelle 8 gezeigt. Der CHO-Klon, der humanen SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; exprimiert, ist am 25. September 1990, bei ATCC (CRL 10557) hinterlegt und als Hu164SCF17 bezeichnet worden. Tabelle 8 hPBL-Kolonie-Assay von konditionierten Medien aus stabilen CHO-Zelllinien, die mit humaner SCF-DNA transfiziert worden waren

BEISPIEL 6

Expression von rekombinantem SCF in E. coli

A. Rekombinanter Ratten-SCF

Dieses Beispiel betrifft die Expression von SCF-Polypeptiden in E. coli mittels einer DNA- Sequenz, die für [Met&supmin;¹]-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³ (Fig. 14C) codiert. Obwohl jeder geeignete Vektor zur Proteinexpression unter Verwendung dieser DNA verwendet werden kann, war das gewählte Plasmid pCFM1156 (Fig. 19). Dieses Plasmid kann auf leichte Weise aus pCFM 836 konstruiert werden (siehe U. S.-Patent No. 4,710,473, das durch Bezugnahme hierin mit einbezogen wird) durch Zerstörung der zwei endogenen NdeI-Restriktionsstellen durch End- Füllen mit T4 Polymerase-Enzym, gefolgt von einer Stumpf-Ende-Ligation und Substituieren der kleinen DNA-Sequenz zwischen der einzigen ClaI- und KpaI-Restriktionsstelle mit dem kleinen, unten gezeigten Oligonukleotid.
5' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3'
3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5'
Die Kontrolle der Proteinexpression in dem pCFM1156-Plasmid erfolgt mittels eines synthetischen Lambda PL-Promotors, der selbst unter der Kontrolle eines temperaturempfindlichen Lambda CI857-Repressorgens [wie es zum Beispiel in E. coli-Stämmen FM5 (ATCC Hinterlegung # 53911) oder K12ΔHtrp bereitgestellt wird] steht. Der pCFM1156-Vektor wird so konstruiert, daß er eine DNA-Sequenz hat, die eine optimierte Ribosomen-Bindungsstelle und ein Initiationscodon unmittelbar 3' vom synthetischen PL-Promotor enthält. Eine einzige NdeI-Restriktionsstelle, die das ATG-Initiationscodon enthält, geht einem Multirestriktionsstellen-Kloniercluster voran, gefolgt von einer Lambda-t-oop-Transkriptionsstop-Sequenz.
Das Plasmid V 19.85CF¹&supmin;¹&sup9;³, das das Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³-Gen enthält, das von PCR-amplifizierter cDNA kloniert worden war (Fig. 14C), wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde mit BglII und SsflI verdaut und ein 603 bp DNA-Fragment isoliert. Um ein Met-Initiationscodon bereitzustellen und die Codons für die ersten drei Aminosäurereste (Gln, Glu und Ile) des Ratten- SCF-Polypeptids wiederherzustellen, wurde ein synthetischer Oligonukleotidlinker
5' TATGCAGGA 3'
3' ACGTCCTCTAG 5'
mit NdeI- und BglII-klebrigen Enden gemacht. Das kleine Oligonukleotid und das Ratten- SCF¹&supmin;¹&sup9;³-Genfragment wurden durch Ligation in pCFM1156 an der einzigen NdeI- und SstII- Stelle in dem in Fig. 19 gezeigten Plasmid eingefügt. Das Produkt dieser Reaktion ist ein Expresssionsplasmid, pCFM1156-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³.
Das pCFM1156-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³-Plasmid wurde in kompetente FMS E. coli-Wirtszellen transformiert. Eine Selektion auf Plasmid-enthaltende Zellen fand auf der Grundlage des Antibiotikum(Kanamycin)-Resistenzmarkergens statt, das auf dem pCFM1156-Vektor getragen wird. Die Plasmid-DNA wurde aus kultivierten Zellen isoliert, und die DNA-Sequenz des synthetischen Oligonukleotids und seiner Verbindung zu dem Ratten-SCF-Gen durch DNA- Sequenzierung bestätigt.
Um das Plasmid pCFM1156-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² zu konstruieren, das für das [Met&supmin;¹]-Ratten- SCF¹&supmin;¹&sup6;²-Polypeptid codiert, wurde ein EcoRI-bis-SstII-Restriktionsfragment aus V 19.8- Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² isoliert und durch Ligation in das Plasmid pCFM-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³ an der einzigen EcoRI- und SstII-Restriktionsstelle eingefügt, wodurch die codierende Region für den Carboxylterminus des Ratten-SCF-Gens ersetzt wurde.
Um die Plasmide pCFM1156-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; und pCFM1156-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup5; zu konstruieren, die für die [Met&supmin;¹]-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;- bzw. [Met&supmin;¹]-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup5;-Polypeptide codieren, wurden EcoRI-bis-SstII-Restriktionsfragmente aus PCR-amplifizierter DNA isoliert, die für das 3'-Ende des SCF-Gens codiert, und so konstruiert, daß sie stellengerichtete Änderungen in der DNA in der Region einführen, die für den Carboxylterminus des SCF-Gens codiert. Die DNA-Amplifizierungen wurden unter Verwendung der Oligonukleotidprimer 227-29 und 237-19 bei der Konstruktion von pCFM1156-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; und von 227-29 und 237-20 bei der Konstruktion von pCFM1156-Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup5; durchgeführt.

B. Rekombinanter menschlicher SCF

Dieses Beispiel betrifft die Expression in E. coli eines humanen SCF-Polypeptids mittels einer DNA-Sequenz, die für humanen [Met&supmin;¹]-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; und humanen [Met&supmin;¹]-SCF¹&supmin;¹&sup8;³ codiert (Fig. 15C). Plasmid V19.8-human-SCF¹&supmin;¹&sup6;², der das humane SCF¹&supmin;¹&sup6;²-Gen enthält, wurde als Matrize zur PCR-Amplifizierung des humanen SCF-Gens verwendet. Die Oligonukleotidprimer 227-29 und 237-19 wurden verwendet, um die PCR-DNA zu erzeugen, die dann mit PstI- und SstII-Restriktionsendonukleasen verdaut wurde. Um ein Met-Initiationscodon bereitzustellen und die Codons für die ersten vier Aminosäurereste (Glu, Gly, Ile, Cys) des humanen SCF-Polypeptids wiederherzustellen, wurde ein synthetischer Oligonukleotidlinker
5' TATGGAAGGTATCTGCA 3'
3' ACCTTCCATAG 5'
mit NdeI- und PstI-klebrigen Enden gemacht. Der kleine Oligo-Linker und das aus PCR stammende humane SCF-Genfragment wurden durch Ligation in das Expressionsplasmid pCFMI 156 (wie zuvor beschrieben) an der einzigen NdeI- und SstII-Stelle in dem in Fig. 19 gezeigten Plasmid eingefügt.
Das pCFM1156-human-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;-Plasmid wurde in kompetente FM5 E. coli-Wirtszellen transformiert. Eine Selektion auf Plasmid-enthaltende Zellen fand auf der Grundlage des Antibiotikums (Kanamycin)-Resistenz-Markergens statt, das auf dem pCFM1156-Vektor getragen wird. Die Plasmid-DNA wurde aus kultivierten Zellen isoliert und die DNA-Sequenz des humanen SCF-Gens durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Um das Plasmid pCFM1156-human-SCF¹&supmin;¹&sup8;³ zu konstruieren, das für das humane [Met&supmin;¹]- SCF¹&supmin;¹&sup8;³-Polypeptid (Fig. 15C) codiert, wurde ein EcoRI-bis-HindIII-Restriktionsfragment, das für den Carboxylterminus des humanen SCF-Gens codiert, aus pGEMhuman-SCF¹¹&sup4;&supmin;¹&sup8;³ isoliert (unten beschrieben), ein SstI-bis-EcoRI-Restriktionsfragment, das für den Aminoterminus des humanen SCF-Gens codiert, wurde aus pCFM1156-human-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; isoliert, und das größere HindIII-bis-SstI-Restriktionsfragment aus pCFM1156 wurde isoliert. Die drei DNA-Fragmente wurden zusammen ligiert, um das pCFM1156-human-SCF¹&supmin;¹&sup8;³-Plasmid zu bilden, das dann in FM5 E. coli-Wirtszellen transformiert wurde. Nach einer Kolonie- Selektion unter Verwendung von Kanamycin-Arzneiresistenz, wurde die Plasmid-DNA isoliert und die korrekte DNA-Sequenz durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das pGEMhuman-SCF¹¹&sup4;&supmin;¹&sup8;³-Plasmid ist ein Abkömmling von pGEM3, das ein EcoRI-SphI-Fragment enthält, das Nukleotide 609 bis 820 der humanen SCF-cDNA-Sequenz einschließt, die in Fig. 15C gezeigt ist. Das EcoRI-SphI-Insert in diesem Plasmid wurde aus einer PCR isoliert, die die Oligonukleotidprimer 235-31 und 241-6 (Fig. 12B) und PCR 22.7 (Fig. 13B) als Matrize verwendete. Die Sequenz des Primers 241-6 beruhte auf der humanen genomischen Sequenz zur 3'-Seite des Exons, das das Codon für Aminosäure 176 enthielt.

C. Fermentation von E. coli, die humanen SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; produzieren

Die Fermentationen für die Produktion von SCF 1-164 wurden in 16 Liter Fermentern durchgeführt unter Verwendung eines FMS E. coli K12 Wirts, der das Plasmid pCFMI 156-human- SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; enthielt. Saat-Stämme der produzierenden Kultur wurden bei -80ºC in 17% Glycerin in Luria-Medium gehalten. Zur Produktion eines Inoculums wurden 100 ul des aufgetauten Saat-Stammes auf 500 ml Luria-Medium in einen 2 L Erlenmeyer-Kolben übertragen und über Nacht wachsen gelassen bei 30ºC auf einem Rotationsschüttler (250 RPM).
Zur Produktion der E. coli-Zellpaste, die als Ausgangsmaterial zur Aufreinigung von humanem SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;, dargestellt in diesem Beispiel, verwendet wurde, wurden die folgenden Fermentationsbedingungen verwendet.
Die Inoculum-Kultur wurde aseptisch auf einen 16 L Fermenter übertragen, der 8 L Batch- Medium enthielt (siehe Tabelle 9). Die Kultur wurde in Batch-Modus wachsen gelassen, bis die OD-600 der Kultur näherungsweise 3,5 war. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine sterile Zugabe (Zugabe 1, Tabelle 10) in den Fermenter eingeführt unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe, um die Zufuhrrate zu kontrollieren. Die Zufuhrrate wurde exponentiell mit der Zeit gesteigert, um eine Wachstumsrate von 0,15 hr&supmin;¹ zu ergeben. Die Temperatur wurde auf 30ºC während der Wachstumsphase geregelt. Die Konzentration an aufgelöstem Sauerstoff in dem Fermenter wurde automatisch auf 50% Sättigung geregelt unter Verwendung von Luftdurchflußrate, Rührrate, Gefäßgegendruck und Sauerstoff-Supplementation zur Kontrolle. Der pH des Fermenters wurde automatisch auf 7,0 geregelt unter Verwendung von Phosphorsäure und Ammoniumhydroxid. Bei einer OD-600 von näherungsweise 30 wurde die Produktionsphase der Fermentation durch Steigerung der Fermentertemperatur auf 42ºC induziert. Zur selben Zeit wurde das Einbringen von Zugabe 1 gestoppt, und das Einbringen von Zugabe 2 (Tabelle 11) wurde bei einer Rate von 200 ml/br begonnen. Näherungsweise 6 Stunden, nachdem die Temperatur des Fermenters erhöht worden war, wurde der Fermenterinhalt auf 15ºC abgekühlt. Die Ausbeute von SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; war näherungsweise 30 mg/OD-L. Das Zell- Pellet wurde dann durch Zentrifugation in einem Beckman J6-B-Rotor bei 3000 · g für eine Stunde geerntet. Die geerntete Zeilpaste wurde gefroren bei -70ºC gelagert.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; ist ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren, mit Ausnahme der folgenden Modifizierungen.
1) Das Einbringen von Zugabe 1 wird nicht initiiert, bis die OD-600 der Kultur 5-6 erreicht.
2) Die Einbringrate von Zugabe 1 wird langsamer gesteigert, was zu einer langsameren Wachstumsrate führt (näherungsweise 0,08).
3) Die Kultur wird bei einer OD-600 von 20 induziert.
4) Die Zugabe 2 wird in den Fermenter mit einer Rate von 300 mL/hr eingeführt.
Der übrige Betrieb ist ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren, einschließlich der Medien.
Unter Verwendung dieses Prozesses sind Ausbeuten von SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; von näherungsweise 35-40 mg/OD-L bei OD = 25 erhalten worden.

TABELLE 9

Zusammensetzuns des Batch-Mediums

Hefeextrakt 10a g/L
Glukose 5
K&sub2;HPO&sub4; 3,5
KH&sub2;PO&sub4; 4
MGSO&sub4;.7 H&sub2;O 1
NaCl 0,625
Dow P-2000 Anti-Schäummittel 5 mL/8 L
Vitaminlösungb 2 mL/L
Spurenmetall-Lösungc 2 mL/L
a Wenn nicht anders dargestellt, werden alle Inhaltsstoffe als g/L aufgelistet.
b Spurenmetall-Lösung: FeCl&sub3;.6 H&sub2;O, 27 g/L; ZnCl&sub2;.4 H&sub2;O, 2 g/L; CaCl&sub2;.6 H&sub2;O, 2 g/L; Na&sub2;MoO&sub4;.2 H&sub2;O, 2 g/L, CuSO&sub4;.5 H&sub2;O, 1,9 g/L; konzentrierte HCl, 100 ml/L.
c Vitaminlösung: Riboflavin, 0,42 g/l; Pantothensäure, 5,4 g/L; Niacin, 6 g/L; Pyridoxin, 1,4 g/L; Biotin, 0,06 g/L; Folsäure, 0,04 g/L

TABELLE 10

Zusammensetzung des Zugabemediums

Hefeextrakt 50a
Glukose 450
MgSO&sub4;.7 H&sub2;O 8,6
Spurenmetall-Lösungb 10 mL/L
Vitamin-Lösungc 10 mL/L
a Wenn nicht anders dargestellt, werden alle Inhaltsstoffe als g/L aufgelistet.
b Spurenmetall-Lösung: FeCl&sub3;.6 H&sub2;O, 27 g/L; ZnCl&sub2;.4 H&sub2;O, 2 g/L; CaCl&sub2;. 6 H&sub2;O, 2 g/L; Na&sub2;MoO&sub4;.2 H&sub2;O, 2 g/L, CuSO&sub4;. 5 H&sub2;O, 1,9 g/L; konzentrierte HCl, 100 ml/L.
c Vitaminlösung: Riboflavin, 0,42 g/l; Pantothensäure, 5,4 g/L; Niacin, 6 g/L; Pyridoxin, 1,4 g/L; Biotin, 0,06 g/L; Folsäure, 0,04 g/L

TABELLE 11

Zusammensetzung des Zugabemediums 2

Trypton 172a
Hefeextrakt 86
Glukose 258
a Alle Inhaltsstoffe sind als g/L angegeben.

BEISPIEL 7

Immunoassays zum Nachweis von SCF

Radioimmunoassay(RIA)-Prozeduren, die zum quantitativen Nachweis von SCF in Proben angewandt wurden, wurden gemäß den folgenden Prozeduren durchgeführt.
Eine SCF-Zubereitung von BRL-3A-Zellen, aufgereinigt wie in Beispiel 1, wurde zusammen mit Antiserum für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach der zweistündigen Inkubation wurden die Probenröhrchen auf Eis gekühlt, ¹²&sup5;I-SCF wurde zugegeben, und die Röhrchen wurden bei 4ºC für wenigstens 20 h inkubiert. Jedes Assayröhrchen enthielt 500 ul Inkubationsmischung, die 50 ul verdünnte Antiseren, 60.000 cpm ¹²&sup5;I-SCF (3,8 · 10&sup7; cpm/ug), 5 ul Trasylol und 0- 400 ul SCF-Standard umfaßte, wobei Puffer (Phosphat-gepufferte Salzlösung, 0,1% bovines Serumalbumin, 0,05% Triton X-100, 0,025% Azid) das verbleibende Volumen ausmachte. Das Antiserum war die zweite Testblutung eines Kaninchens, das mit einer 50% reinen Zubereitung von natürlichem SCF aus BRL 3A-konditioniertem Medium immunisiert worden war. Die endgültige Antiserum-Verdünnung in dem Assay war 1 : 2000.
Der Antikörper-gebundene ¹²&sup5;I-SCF wurde durch Zugabe von 150 ul Staph A (Calbiochem) gefällt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Zimmertemperatur wurden die Proben zentrifugiert, und die Pellets wurden zweimal mit 0,75 ml 10 mM Tris-HCL, pH 8,2, das 0,15M NaCl, 2 mM EDTA und 0,05% Triton X-100 enthielt, gewaschen. Die gewaschenen Pellets wurden in einem Gammazähler gezählt, um den prozentualen Anteil an gebundenem ¹²&sup5;I-SCF zu bestimmen. Die von Röhrchen ohne Serum gebundenen Zahlenwerte wurden von allen Endwerten subtrahiert, um auf eine unspezifische Ausfällung zu korrigieren. Ein typischer RIA wird in Fig. 20 gezeigt. Die prozentuale Inhibition der Bindung von ¹²&sup5;I-SCF, hervorgerufen durch den nicht-markierten Standard, ist dosisabhängig (Fig. 20A), und es gibt, wie in Fig. 20B angezeigt, wenn die immunausgefällten Pellets mit SDS-PAGE und Autoradiographie untersucht werden, eine Konkurrenz für die ¹²&sup5;I-SCF-Proteinbande. In Fig. 20B ist Spur ¹²&sup5;I-SCF, und Spuren 2, 3, 4 und 5 sind immun-ausgefällte ¹²&sup5;I-SCF, mit einer Konkurrenz von 0, 2, 100 bzw. 200 ng SCF-Standard. Wie durch sowohl die Abnahme an in den RIA-Röbrchen beobachteten, Antikörper-ausfällbaren cpm als auch die Abnahme der immunausgefällten ¹²&sup5;I-SCF-Proteinbande (bei näherungsweise Mr 31.000 wandernd) bestimmt, erkennen die polyklonalen Antiseren den SCF-Standard, der wie in Beispiel 1 aufgereinigt worden war.
Western-Prozeduren wurden ebenso angewandt, um rekombinanten SCF nachzuweisen, der in E. coli, COS-1 und CHO-Zellen exprimiert wurde. Partiell aufgereinigter, in E. coli exprimierter Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³ (Beispiel 10), von COS-1-Zellen exprimierter Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² und SCF¹&supmin;¹&sup9;³ sowie humaner SCF¹&supmin;¹&sup6;² (Beispiele 4 und 9) und von CHO-Zellen exprimierter Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² (Beispiel 5) wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteinbanden auf 0,2 um Nitrozellulose unter Verwendung eine Bio-Rad- Transblot-Apparates bei 60 V für 5 h transferiert. Die Nitrozellulosefilter wurden für 4 h in PBS, pH 7,6 blockiert, das 10% Ziegenserum enthielt, gefolgt von einer 14 h Inkubation bei Zimmertemperatur mit einer 1 : 200 Verdünnung von entweder Kaninchen-Präimmun- oder Immun-Serum (Immunisierung oben beschrieben). Die Antikörper-Antiserum-Komplexe wurden unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Ziegen-anti-Kaninchen- IgG-Reagentien (Vector laboratories) und 4-Chlor-1-naphthol-Farbentwicklungs-Reagens sichtbar gemacht.
Beispiele zweier Western-Analysen werden in Fig. 21 und 22 präsentiert. In Fig. 21 sind die Spuren 3 und 5 200 ul von humanem SCF¹&supmin;¹&sup6;², der von COS-1-Zellen erzeugt wurde; Spuren 1 und 7 sind 200 ul humanes EPO, das von COS-1-Zellen erzeugt wurde (COS-1-Zellen, die mit V 19.8 EPO transfiziert worden sind); und Spur 8 ist vorgefärbter Molekulargewichtsmarker. Spuren 1-4 wurden mit Präimmun-Serum inkubiert, und die Spuren 5-8 wurden mit Immunserum inkubiert. Das Immunserum erkennt spezifisch eine diffuse Bande mit einem apparenten Mr von 30.000 Daltons von COS-1-Zellen, die humanen SCF¹&supmin;¹&sup6;² produzieren, aber nicht von COS-1-Zellen, die humanes EPO produzieren.
In dem Western, der in Fig. 22 gezeigt wird, sind die Spuren 1 und 7 l ug einer partiell aufgereinigten Zubereitung von Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³, der in E. coli hergestellt wurde; Spuren 2 und 8 sind Weizenkeim-Agglutinin-Agarose-aufgereinigter, von COS-1-Zellen produzierter Ratten- SCF¹&supmin;¹&sup9;³; Spuren 4 und 9 sind Weizenkeim-Agglutinin-Agarose-aufgereinigter, von COS-1- Zellen produzierter Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;²; Spuren 5 und 10 sind Weizenkeim-Agglutinin-Agaroseaufgereinigter, von CHO-Zellen produzierter, Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;²; und Spur 6 ist vorgefärbter Molekulargewichtsmarker. Spuren 1-5 und Spuren 6-10 wurden mit Kaninchen-Präimmun- bzw. Immunserum inkubiert. Der von E. coli produzierte Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³ (Spuren 1 und 7) wandert mit einem apparenten Mr von ~24.000 Daltons, während der von COS-1-Zellen produzierte Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³ (Spuren 2 und 8) mit einem apparenten Mr von 24-36.000 Daltons wandert. Dieser Unterschied hinsichtlich der Molekulargewichte wird erwartet, da Säugetierzellen, nicht aber Bakterien, in der Lage zur Glykosylierung sind. Die Transfektion der Sequenz, die für Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² codiert, in COS-1- (Spuren 4 und 9) oder CHO-Zellen (Spuren 5 und 10) führt zur Expression von SCF mit einem geringeren mittleren durchschnittlichen Molekulargewicht als dasjenige, das durch Transfektion mit SCF¹&supmin;¹&sup9;³ erzeugt wird (Spuren 2 und 8).
Die Expressionsprodukte von Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² aus COS-1- und CHO-Zellen sind eine Reihe von Banden im Bereich von einem apparenten Mr zwischen 24-36.000 Daltons. Die Heterogenität der exprimierten SCF beruht vermutlich auf Kohlenhydrat-Varianten, bei denen das SCF-Polypeptid in verschiedenen Ausmaßen glykosyliert ist.
Zusammenfassend zeigen Western-Analysen an, daß Immunserum aus Kaninchen, die mit natürlichem Säugetier-SCF immunisiert worden sind, rekombinanten SCF erkennt, der in E. coli, COS-1- und CHO-Zellen erzeugt worden ist, es aber nicht vermag, irgendwelche Banden in einer Kontrollprobe zu erkennen, die EPO umfaßt, das in COS-1-Zellen erzeugt worden ist. Zur weiteren Unterstützung der Spezifität des SCF-Antiserums vermochte Präimmunserum aus demselben Kaninchen es nicht, mit irgendeinem der Ratten- oder humanen SCF- Expressionsprodukt zu reagieren.

BEISPIEL 8

In vivo-Aktivität von rekombinantem SCF

A. Ratten-SCF in Knochenmarkstransplantationen

COS-1-Zellen wurden mit V19.8-SCF¹&supmin;¹&sup6;² transfiziert in einem Experiment auf großem Maßstab (T175 cm²-Kolben anstelle von 60 mm Schalen), wie in Beispiel 4 beschrieben. Näherungsweise 270 ml Überstand wurden geerntet. Dieser Überstand wurde auf Weizenkeim- Agglutinin-Agarose und S-Sepharose chromatographiert, im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben. Der rekombinante SCF wurde in einem Knochenmarkstransplantationsmodell auf der Grundlage von muriner W/Wv-Genetik bewertet. Die W/Wv-Maus hat einen Stammzellendefekt, der, unter anderen Eigenschaften, zu einer Makrocytenanämie (große rote Zellen) führt und die Transplantation von Knochenmark aus normalen Tieren ohne das Erfordernis zur Bestrahlung des Empfängertieres ermöglicht [Russel, et al., Science, 144, 844-846 (1964)]. Die normalen Spender-Staninizellen überwachsen die defizienten Empfängerzellen nach der Transplantation.
Im folgenden Beispiel enthielt jede Gruppe sechs Mäuse, deren Alter übereinstimmte. Knochenmark wurde von normalen Spendermäusen geerntet und in W/Wv-Mäuse transplantiert. Das Blutprofil der Empfängertiere wird zu verschiedenen Zeiten nach der Transplantation verfolgt, und eine Verpflanzung des Spendermarks wird auf Grund der Verschiebung der Peripher-Blutzellen vom Empfünger- zum Spender-Phänotyp bestimmt. Die Umwandlung vom Empfänger- zum Spender-Phänotyp wird durch Überwachung des Vorwärts-Streu-Profils der roten Blutkörperchen (FASCAN, Becton Dickenson) nachgewiesen. Das Profil für jedes transplantierte Tier wurde mit dem für sowohl Spender- als auch Empfänger-transplantierte Kontroll-Tier zu jedem Zeitpunkt verglichen. Der Vergleich wurde unter Verwendung eines Computerprogramms gemacht, auf der Grundlage von Kolmogorov-Smirnov-Statistik zur Analyse von Histogrammen aus Fließsystemen [Young, J. Histochem. and Cytochem., 25, 935-941 (1977)]. Ein unabhängiger, qualitativer Indikator der Verpflanzung ist der Hämoglobintyp, der nachgewiesen wird durch Hämoglobin-Elektrophorese des Empfängerbluts [Wong, et al., Mol. and Cell. Biol., 9, 798-808 (1989)], und stimmt gut mit der Bestimmung der Übereinstimmungsqualität aus der Kolmogorov-Smirnov-Statistik überein.
Näherungsweise 3 · 10&sup5;-Zellen wurden ohne SCF-Behandlung (Kontrollgruppe in Fig. 23) aus C56BL/6J-Spendem in W/Wv-Empfänger transplantiert. Eine zweite Gruppe empfing 3 · 10&sup5; Spenderzellen, die mit SCF (600 U/ml) bei 37ºC für 20 min behandelt und zusammen injiziert worden waren (vorbehandelte Gruppe in Fig. 23). (Eine Einheit SCF wird als die Menge definiert, die zu einer halbmaximalen Stimulierung im MC/9-Bioassay führt). In einer dritten Gruppe wurden die Empfängermäuse subkutan (sub-Q) mit näherungsweise 400 U SCFITag für 3 Tage nach der Transplantation von 3 · 10&sup5; Spenderzellen injiziert (sub-Q- Injektionsgruppe in Fig. 23). Wie in Fig. 23 angezeigt, wird an beiden SCF-behandelten Gruppen das Spendermark schneller als in der nicht behandelten Kontrollgruppe verpflanzt. 29 Tage nach der Transplantation hatte sich die mit SCF vorbehandelte Gruppe in den Spenderphänotypen umgewandelt. Dieses Beispiel illustriert die Nützlichkeit der SCF-Therapie bei einer Knochenmarktransplantation.

B. In vivo-Aktivität von Ratten-SCF in Steel-Mäusen

Mutationen am S1-Lokus verursachen Defizienzen in hämatopoietischen Zellen, Pigmentzellen und Keimzellen. Der hämatopoietische Defekt manifestiert sich an einer reduzierten Anzahl an roten Blutkörperchen [Russell, In : Al Gordon, Remalation of Hematopoiesis, Vol I, 649-675 Appleton-Century-Crafts, New York (1970)], Neutrophilen [Ruscetti, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 152, 398 (1976)], Monocyten [Shibata, J. Immunol. 135, 3905 (1985)], Megakaryocyten [Ebbe, Exp. Hematol 6, 201 (1978)], natürliche Killerzellen [(Clark, Immunogenetics 12, 601 (1981)], und Mastzellen [Hayashi, Dev. Biol., 109, 234 (1985)]. Steel- Mäuse sind schlechte Empfänger für ein Knochenmarktransplantat aufgrund einer verringerten Fähigkeit, Stammzellen zu unterstützen [Bannerman, Prog. Hematol., 8, 131 (1973)]. Das Gen, das für SCF codiert, ist in Steel (S1/S1)-Mäusen deletiert.
Steel-Mäuse stellen ein empfindliches in vivo-Modell für die SCF-Aktivität bereit. Verschiedene rekombinante SCF-Proteine wurden in Steel-Dickie (S1/S1d)-Mäusen für verschiedene Zeitlängen getestet. Sechs bis zehn Wochen alte Steel-Mäuse (WCB6F1-S1/S1d) wurden von Jackson Labs, Bar Harbor, ME, erworben. Peripher-Blut wurde durch einen SYSMEX F-800 Mikrozell-Zähler (Baxter, Irvine, CA) auf rote Blutkörperchen, Hämoglobin und Blutplättchen untersucht. Zum Auszählen von peripheren weißen Blutkörperchen (WBC)-Zahlen wurde ein Coulter Channelyzer 256 (Coulter Electronics, Marietta, GA) verwendet.
Bei dem Experiment in Fig. 24 wurden Steel-Dickie-Mäuse mit aus E. coli stammendem SCFIIM behandelt, aufgereinigt wie in Beispiel 10, in einer Dosis von 100 ug/kg/Tag für 30 Tage, dann in einer Dosis von 30 ug/kgf/Tag für zusätzliche 20 Tage. Das Protein wurde in injizierbarer Kochsalzlösung (Abbott Labs, North Chicago, IL) +0,1% fötalem bovinen Serum formuliert. Die Injektionen wurden täglich subkutan durchgeführt. Das Peripher-Blut wurde mittels Schwanz-Blutungen von ~50uI zu den in Fig. 24 angezeigten Zeiten überwacht. Das Blut wurde in mit 3% EDTA beschichteten Spritzen gesammelt und in gepuderte EDTA-Mikrozentrifugenröhrchen verteilt (Brinkmann, Westbury, NY). Es gibt eine signifikante Korrektur der Makrocytenanämie bei den behandelten Tieren relativ zu den Kontrolltieren. Nach Absetzen der Behandlung kehren die behandelten Tiere zum anfänglichen Zustand der Makrocytenanämie zurück.
In dem in Fig. 25 und 26 gezeigten Experiment wurden Steel-Dickie-Mäuse mit verschiedenen rekombinanten Formen von SCF, wie oben beschrieben, behandelt, aber in einer Dosis von 100 ug/kg/Tag für 20 Tage. Zwei Formen von aus E. coli stammendem Ratten-SCF, SCFIlM und SCF¹&supmin;¹&sup9;³, wurden, wie in Beispiel 10 beschrieben, hergestellt. Zusätzlich wurde E. coli SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;, modifiziert durch Zugabe von Polyethylenglykol (SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; PEG25), wie in Beispiel 12, ebenso getestet. Aus CHO-stammender SCF¹&supmin;¹&sup6;², hergestellt wie in Beispiel 5 und aufgereinigt wie in Beispiel 11, wurde ebenso getestet. Die Tiere wurden durch Herzpunktur mit 3% EDTA beschichteten Spritzen bluten gelassen und in mit EDTA bestäubten Röhrchen verteilt. Die Peripher-Blut-Profile nach 20 Behandlungstagen werden in Fig. 25 für weiße Blutkörperchen (WBC) und Fig. 26 für Blutplättchen gezeigt. Die WBC-Differentiale für die SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; PEG25-Gruppe werden in Fig. 27 gezeigt. Es gibt absolute Zunahmen bei den Neutrophilen, Monocyten, Lymphocyten und Blutplättchen. Der dramatischste Effekt wird mit SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; PEG25 gesehen.
Eine unabhängige Messung von Lymphocyten-Teilmengen wurde ebenso durchgeführt, und die Daten werden in Fig. 28 gezeigt. Das murine Äquivalent von menschlichem CD4 oder Marker von T-Helferzellen, ist L3T4 [Dialynas, J, Immunol., 131, 2445 (1983)]. LyT-2 ist ein murines Antigen auf cytotoxischen T-Zellen [Ledbetter, J. Exp. Med., 153, 1503 (1981)]. Monoklonale Antikörper gegen diese Antigene wurden verwendet, um T-Zell-Teilmengen in den behandelten Tieren zu bewerten.
Vollblut wurde auf T-Lymphocyten-Teilmengen wie folgt gefärbt. Zweihundert Mikroliter Vollblut wurden aus einzelnen Tieren in mit EDTA behandelte Röhrchen gezogen. Jede Blutprobe wurde mit sterilem entionisiertem Wasser für 60 Sekunden lysiert und dann mit 10X Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Gibco, Grand Island, NY) isotonisch gemacht. Dieses lysierte Blut wurde zweimal mit 1X PBS gewaschen (Gibco, Grand Island, NY), supplementiert mit 0,1% fötalem bovinen Serum (Flow Laboratory, Molean, VA) und 0,1% Natriumazid. Jede Blutprobe wurde in 96-Napf-Cluster-Schalen mit rundem Boden abgelegt und zentrifugiert. Das Zellpellet (enthaltend 2-10 · 10&sup5; Zellen) wurde mit 20 Mikrolitern Ratten-anti-Maus-L3T4, der mit Phycoerythrin (PE) (Becton Dickinson, Mountain View, CA) konjugiert war, und 20 Mikrolitern Ratten-anti-Maus-Lyt-2 resuspendiert, der mit Fluoresceinisothiocyanat konjugiert war, inkubiert auf Eis (4ºC) für 30 Minuten (Becton Dickinson). Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal in 1X PBS gewaschen, das wie oben angezeigt supplementiert war. Jede Blutprobe wurde dann auf einen FACScan- Zellanalysesystem analysiert (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Dieses System wurde unter Verwendung von Standard-Autokompensationsprozeduren und Calibrite-Kügelchen standardisiert (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Diese Daten zeigten ein absolutes Anwachsen bei sowohl Helfer-T-Zell-Populationen als auch cytotoxischen T-Zell-Zahlen an.

C. In vivo-Aktivität von SCF in Primaten

Menschlicher SCF 1-164, exprimiert in E. coli (Beispiel 6B) und bis zur Homogenität aufgereinigt wie in Beispiel 10, wurde auf in vivo-biologische Aktivität in normalen Primaten getestet. Erwachsene männliche Paviane (Papio sp.) wurden in drei Gruppen untersucht: unbehandelt, n = 3; SCF 100 ug/kg/Tag, n = 6; und SCF 30 ug/kg/Tag, n = 6. Die behandelten Tiere empfingen tägliche subkutane Einzelinjektionen SCF. Blutproben wurden aus den Tieren unter Ketamin-Beschränkung erhalten. Proben zum Zählen des Gesamtbluts, der Reticu locytenzahl und der Blutplättchenzahl wurden an den Tagen 1, 6, 11, 15, 20 und 25 der Behandlung erhalten.
Alle Tiere überlebten das Protokoll und hatten keine ungünstigen Reaktionen gegenüber der SCF-Therapie. Die Anzahl der weißen Blutkörperchen wuchs bei den mit 100 ug/kg behandelten Tieren an, wie in Fig. 29 gezeigt. Die differentielle Zählung, manuell erhalten aus Wright-Giemsa-gefärbten Peripherblut-Abstrichen, wird ebenso in Fig. 29 angezeigt. Es gab einen absoluten Anstieg an Neutrophilen, Lymphocyten und Monocyten. Wie in Fig. 30 angezeigt, gab es ebenso einen Anstieg bei der 100 uglkg-Dosis hinsichtlich der Hämatokriten sowie der Blutplättchen.
Humaner SCF (hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;, modifiziert durch die Zugabe von Polyethylenglycol, wie in Beispiel 12) wurde ebenso in normalen Pavianen getestet, in einer Dosis von 200 ug/kg-Tag, verabreicht durch kontinuierliche intravenöse Infusion, und verglichen mit dem nichtmodifizierten Protein. Die Tiere begannen SCF am Tag 0 und wurden für 28 Tage behandelt. Die Resultate für den Peripher-WBC sind in der folgenden Tabelle angegeben. Der PEGmodifizierte SCF rief einen früheren Anstieg bezüglich des Peripher-WBC hervor als der nicht-modifizierte SCF.
Behandlung mit 200 ug/kg-Tag hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;:
Behandlung mit 200 ug/kg-Tag PEG-hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;

BEISPIEL 9

In vitro-Aktivität von rekombinantem humanen SCF

Die cDNA von humanem SCF, die Aminosäuren 1-162 entspricht, erhalten durch PCR- Reaktionen, dargestellt in Beispiel 3D, wurde in COS-1-Zellen exprimiert, wie für den Ratten-SCF in Beispiel 4 beschrieben. COS-1-Überstände wurden auf humanes Knochenmark sowie in den murinen HPP-CFC- und MC/9-Assays getestet. Das humane Protein war in keinem murinen Assay in den getesteten Konzentrationen aktiv; es war jedoch auf humanes Knochenmark aktiv. Die Kulturbedingungen des Assays waren wie folgt: Humanes Knochenmark von gesunden Freiwilligen wurde über Ficoll-Hypaque-Gradienten zentrifugiert (Pharmacia) und in 2,1% Methylcellulose, 30% fötalem Kälberserum, 6 · 10&supmin;&sup5; M 2- Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, ISCOVE'S Medium (GIBCO), 20 U/ml EPO und 1 · 10&sup5; Zellen/ml für 14 Tage ineiner befeuchteten Atmosphäre, die 7% O&sub2;, 10% CO&sub2; und 83% N&sub2; enthielt kultiviert. Die Kolonienzahlen, die mit rekombinanten humanen und Ratten-SCF- COS-1-Überständen erzeugt wurden, sind in Tabelle 12 angezeigt. Nur diejenigen Kolonien von 0,2 mm Größe oder größer sind angezeigt. Tabelle 12 Wachstum von humanen Knochenmarkskolonien in Antwort auf SCF
Die Kolonien, die über die 14-Tages-Periode wuchsen, werden in Fig. 31A gezeigt (Vergrößerung 12x). Der Pfeil zeigt eine typische Kolonie an. Die Kolonien ähnelten den murinen HPP-CFC-Kolonien hinsichtlich ihrer großen Größe (durchschnittlich 0,5 mm). Aufgrund der Anwesenheit von EPO waren einige der Kolonien hämoglobinisiert. Wenn die Kolonien iso- · liert und auf Glas-Objektträgern unter Verwendung einer Cytospin (Shandon) zentrifugiert wurden, gefolgt von einer Färbung mit Wright-Giemsa, war der vorherrschende Zelltypus eine undifferenzierte Zelle mit einem großen Kern:Cytoplasma-Verhältnis, wie in Fig. 31B gezeigt (Vergrößerung 400x). Die Pfeile in Fig. 31B deuten auf die folgenden Strukturen: Pfeil 1, Cytoplasma; Pfeil 2, Kern; Pfeil 3, Vacuolen. Unreife Zellen als eine Klasse sind groß, und die Zellen werden fortschreitend kleiner, während sie reifen [Diggs et al., The Morphology of Human Blood Cells, Abbott Labs, 3 (1978)]. Die Kerne von frühen Zellen der hämatopoietischen Reifungssequenz sind verhältnismäßig groß in Bezug auf das Cytoplasma. Zusätzlich färbt das Cytoplasma unreifer Zellen mit Wright-Giemsa dunkler an als der Kern. Während die Zellen reifen, färbt der Kern dunkler an als das Cytoplasma. Die Morphologie von humanen Knochenmarkszellen, die aus einer Kultur mit rekombinantem humanen SCF entstehen, ist übereinstimmend mit dem Schluß, daß das Target und das unmittelbare Produkt der SCF-Wirkung ein relativ unreifer hämatopoietischer Vorläufer ist.
Rekombinanter humaner SCF wurde in Agar-Kolonie-Assays auf humanem Knochenmark in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren, wie oben beschrieben, getestet. Die Resultate werden in Tabelle 13 gezeigt. SCF arbeitet mit G-CSF, GM-CSF, IL-3 und EPO zusammen, um die Proliferation von Knochenmarktargets für die einzelnen CSFs zu erhöhen.

TABELLE 13

Synergie von rekombinantem humanem SCF mit anderen humanen Kolonie-stimulierenden Faktoren

Kolonie #/10&sup5; Zellen (14 Tage)

Kontrolle 0
hG-CSF 32 ± 3
hG-CSF + hSCF 74 ± 1
hGM-CSF 14 ± 2
hGM-CSF + hSCF 108 ± 5
hIL-3 23 ± 1
hIL-3 + hSCF 108 ± 3
hEPO 10 ± 5
hEPO + IL-3 17 ± 1
hEPO + hSCF 86 ± 10
hSCF 0
Eine weitere Aktivität von rekombinantem humanen SCF ist die Fähigkeit, Proliferation in weichem Agar der humanen akuten myelogenen Leukämie(AML)-Zellinie, KG-1 (ATCC CCL 246) zu verursachen. COS-1-Überstände aus transfizierten Zellen wurden in einem KG- 1-Agar-Klonier-Assay getestet [Koeffler et al., Science, 200, 1153-1154 (1978)], im wesentlichen wie beschrieben, außer daß die Zellen in 3000/ml ausplattiert wurden. Die Daten aus dreifachen Kulturen werden in Tabelle 14 angegeben. TABELLE 14 KG-1-Weichagar-Klonier-Assay

BEISPIEL 10

Aufreinigung von rekombinanten SCF-Produkten, die in E. coli exprimiert sind

Eine Fermentation von E. coli-human-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; wurde durchgeführt gemäß Beispiel 6C. Die geernteten Zellen (912 g Naßgewicht) wurden in Wasser auf ein Volumen von 4,6 L suspendiert und aufgebrochen durch drei Läufe durch einen Labor-Homogenisator (Gaulin Modell 15MR-8TBA) bei 8000 psi. Eine aufgebrochene Zellpelletfraktion wurde durch Zentrifugation erhalten (17700 · g, 30 mine 4ºC), einmal mit Wasser gewaschen (Resuspension und Rezentrifugation) und schließlich in Wasser auf ein Volumen von 400 ml suspendiert.
Die Pelletfraktion, die unlöslichen SCF enthielt (geschätzt 10-12 g SCF) wurde zu 3950 ml einer geeigneten Mischung zugegeben, so daß die Endkonzentrationen der Bestandteile in der Mischung 8 M Harnstoff (ultrareine Qualität), 0,1 mM EDTA, 50 mM Natriumacetat, pH 6 - 7 waren; die SCF-Konzentration wurde auf 1,5 mg/ml geschätzt. Eine Inkubation wurde bei Zimmertemperatur für 4 h durchgeführt, um den SCF löslich zu machen. Das verbleibende unlösliche Material wurde durch Zentrifugation entfernt (17700 · g, 30 min. Zimmertemperatur). Zur Rückfaltung/Rückoxidation des löslich gemachten SCF wurde die Überstandsfraktion langsam unter Rühren auf 39,15 L einer geeigneten Mischung zugegeben, so daß die Endkonzentrationen der Bestandteile in der Mischung 2,5 M Harnstoff (ultrareine Qualität), 0,01 mM EDTA, 5 mM Natriumacetat, 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM Glutathion, 0,02% (Gew./Vol.) Natriumazid waren. Die SCF-Konzentration wurde auf 150 ug/ml geschätzt. Nach 60 h bei Zimmertemperatur [kürzere Zeiten (z. B. ~ 20 h) sind ebenso geeignet, unter Rühren, wurde die Mischung zweifach konzentriert unter Verwendung eines Millipore Pellicon Ultrafiltrationsapparats mit drei Polysulfon-Membrankassetten mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10.000 (15 ft² Gesamtfläche) und dann diafiltriert gegen 7 Volumina 20 mM Tris-HCl, pH 8. Die Temperatur während der Konzentration/Ultrafiltration war 4ºC, die Pumprate war 5 L/min. und die Filtrationsrate war 600 mumin. Das Endvolumen des gewonnenen Rückstands war 26,5 L. Durch die Verwendung von SDS-PAGE, die sowohl mit als auch ohne Reduktion der Proben durchgeführt wurde, ist es offensichtlich, daß das meiste (> 80%) des Pelletfraktion-SCF durch die Inkubation mit 8 M Harnstoff löslich gemacht worden ist, und daß nach der Faltung/Oxidation vielfache Species (Formen) von SCF vorhanden sind, wie es durch die SDS-PAGE von nicht-reduzierten Proben sichtbar gemacht wird. Die Hauptform, die korrekt oxidierten SCF (siehe unten) repräsentiert, wandert mit einem apparenten Mr von ungefähr 17.000 (nicht-reduziert), relativ zu den Molekulargewichtsmarkem (reduziert), beschrieben für Fig. 9. Andere Formen schließen Material ein, das mit einem apparenten Mr von ungefähr 18-20.000 wandert (nicht-reduziert), von dem angenommen wird, daß es SCF mit nicht-korrekten Intra-Ketten-Disulfidbindungen repräsentiert; und Banden, die mit apparenten Mrs im Bereich von 37.000 wandern (nicht-reduziert) oder größer, von denen angenommen wird, daß sie verschiedene SCF-Formen repräsentieren, mit Inter- Ketten-Disulfidbindungen, was dazu führt, daß SCF-Polypeptid-Ketten kovalent verknüpft sind, um Dimere bzw. größere Oligomere zu bilden. Die folgenden Fraktionierungsschritte resultieren in einer Entfernung der verbleibenden E. coli-Verunreinigungen und der nichtgewünschten SCF-Formen, so daß ein SCF erhalten wird, der zur apparenten Homogenität in biologisch aktiver Konformation aufgereinigt worden ist.
Der pH des Ultrafiltrations-Rückstands wurde auf 4,5 durch Zugabe von 375 ml 10% (Vol/Vol) Essigsäure eingestellt, was zum Vorhandensein von sichtbarem ausgefälltem Material führte. Nach 60 min. einem Zeitpunkt, zu dem vieles des ausgefällten Materials sich auf den Boden des Gefäßes abgesetzt hatte, wurden die oberen 24 L dekantiert und durch einen CunoTM 30 SP Tiefen-Filter mit 500 ml/min gefiltert, um die Klärung abzuschließen. Das Filtrat wurde dann 1,5-fach mit Wasser verdünnt und bei 4ºC auf eine S-Sepharose-Fast- Flow(Pharmacia)-Säule aufgebracht (9 · 18,5 cm), die in 25 mM Natriumacetat, pH 4,5, equilibriert worden war. Die Säule wurde mit einer Durchflußrate von 5 L/h bei 4ºC laufen gelassen. Nach der Probenaufbringung wurde die Säule mit fünf Säulenvolumina (~ 6 L) Säulenpuffer gewaschen, und das SCF-Material, das an die Säule gebunden war, wurde mit einem Gradienten von 0 bis 0,35 M NaCl in Säulenpuffer eluiert. Das gesamte Gradientenvolumen war 20 L, und es wurden Fraktionen von 200 ml gesammelt. Das Elutionsprofil wird in Fig. 33 gezeigt. Aliquots (10 ul) von den aus der S-Sepharose-Säule gesammelten Fraktion wurden mit SDS-PAGE analysiert, die sowohl mit (Fig. 32A) als auch ohne (Fig. 32B) Reduktion der Proben durchgeführt wurde. Aus solchen Analysen ist es offensichtlich, daß praktisch die gesamte Extinktion bei 280 nm (Fig. 32 und 33) auf SCF-Material beruht.
Die korrekt oxidierte Form herrscht in dem Haupt-Extinktionspeak vor (Fraktionen 22-38, Fig. 33). Geringere Species (Formen), die in den Fraktionen sichtbar gemacht werden können, schließen das nicht-korrekt oxidierte Material mit einem apparenten Mr von 18-20.000 in SDS-PAGE (nicht-reduziert) ein, das in der vorderen Schulter des Haupt-Extinktionspeaks vorhanden ist (Fraktionen 10-21, Fig. 32 B); und Disulfid-verknüpftes Dimer-Material, das in der gesamten Extinktionsregion vorhanden ist (Fraktionen 10-38, Fig. 32 B).
Die Fraktionen 22-38 von der S-Sepharose-Säule wurden vereinigt, und der Pool wurde auf pH 2,2 durch Zugabe von ungefähr 11 ml 6 N HCl eingestellt und auf eine Vydac C&sub4;-Säule aufgebracht (Höhe 8,4 cm, Durchmesser 9 cm), equilibriert mit 50% (Vol/Vol) Ethanol, 12,5 mM HCl (Lösung A) und bei 4ºC betrieben. Das Säulenharz wurde durch Suspendieren des trockenen Harzes in 80% (Vol/Vol) Ethanol, 12,5 mM HCl (Lösung B) und dann durch Equilibrieren mit Lösung A hergestellt. Vor dem Probenauftrag wurde ein Leerversuchs- Gradient von Lösung A bis Lösung B (6 L Gesamtvolumen) aufgebracht, und die Säule wurde dann mit Lösung A re-equilibriert. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule mit 2,5 L Lösung A gewaschen, und das SCF-Material, das an die Säule gebunden wurde, wurde mit einem Gradienten von Lösung A zu Lösung B eluiert (18 L Gesamtvolumen) bei einer Durchflußrate von 2670 ml/h. 286 Fraktionen von je 50 ml wurden gesammelt, und die Aliquots wurden durch Extinktion bei 280 nm (Fig. 35) und mit SDS-PAGE (25 ul pro Fraktion), wie oben beschrieben (Fig. 34 A, reduzierende Bedingungen; Fig. 34 B, nicht-reduzierende Bedingungen) analysiert. Fraktionen 62-161, die korrekt oxidierten SCF in einem hoch aufgereinigten Zustand enthielten, wurden vereinigt [die relativ geringen Mengen an nichtkorrekt oxidiertem Monomer mit Mr von ungefähr 18-20.000 (nicht-reduziert) eluierten später in dem Gradienten (ungefähr Fraktionen 166-211), und Disulfid-verknüpftes Dimer- Material eluierte ebenso später (ungefähr Fraktionen 199-235) (Fig. 35)].
Um Ethanol aus dem Pool der Fraktionen 62-161 zu entfernen und um den SCF zu konzentrieren, wurde die folgende Prozedur unter Verwendung eines Q-Sepharose-Fast- Flow(Pharmacia)-Ionenaustauschharzes verwendet. Der Pool (5 L) wurde mit Wasser auf ein Volumen von 15,625 L verdünnt, was die Ethanolkonzentration auf ungefähr 20% (Vol/Vol) brachte. Dann wurde 1 M Tris-Base (135 ml) zugegeben, um den pH auf 8 zu bringen, gefolgt von 1 M Tris-HCl, pH 8, (23,6 ml), um die gesamte Tris-Konzentration auf 10 mM zu bringen. Als nächstes wurde 10 mM Tris-HCl, pH 8 (~ 15,5 L) zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 31,25 L zu bringen und die Ethanolkonzentration auf ungefähr 10% (Vol/Vol). Das Material wurde dann bei 4ºC auf eine Säule von Q-Sepharose-Fast-Flow aufgebracht (Höhe 6,5 cm, Durchmesser 7 cm), equilibriert mit 10 mM Tris-HCl, pH 8, und dies wurde von einem Waschen der Säule mit 2,5 L Säulenpuffer gefolgt. Die Durchflußrate während des Probenauftrags und der Waschung war ungefähr 5,5 L/h. Um den gebundenen SCF zu eluieren, wurden 200 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8 in Rückwärtsrichtung durch die Säule bei ungefähr 200 ml/h gepumpt. Fraktionen von ungefähr 12 ml wurden gesammelt und durch Extinktion bei 280 nm und SDS-PAGE wie oben analysiert. Die Fraktionen 16-28 wurden vereinigt (157 ml).
Der Pool, der SCF enthielt, wurde dann in zwei separaten Chromatographie-Läufen (78,5 ml aufgetragen in jedem) auf eine Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) Gelfiltrationssäule aufgetragen (5 · 138 cm), equilibriert mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei 4ºC. Fraktionen von ungefähr 15 ml wurden bei einer Durchflußrate von ungefähr 75 ml/h gesammelt. In jedem Fall eluierte ein Hauptpeakmaterial mit einer Extinktion bei 280 nm in den Fraktionen, die ungefähr dem Elutionsvolumenbereich von 1370 bis 1635 ml entsprachen. Die Fraktionen, die die Extinktionspeaks von den zwei Säulenläufen repräsentierten, wurden in einem einzelnen Pool von 525 ml kombiniert, ungefähr 2,3 g SCF enthaltend. Dieses Material wurde durch Filtration unter Verwendung einer Millipore Millipak 20 Membran-Patrone sterilisiert.
Alternativ kann das Material von der C&sub4;-Säule durch Ultrafiltration konzentriert werden und der Puffer durch Diafiltration ausgetauscht werden, vor der Sterilfiltration.
Das isolierte rekombinante humane SCF1¹&supmin;¹&sup6;&sup4;-Material ist sehr rein (> 98% mit SDS-PAGE mit Silberfärbung) und wird als mit pharmazeutischem Reinheitsgrad angesehen. Unter Verwendung der in Beispiel 2 dargestellten Verfahren wird gefunden, daß das Material eine Aminosäurezusammensetzung hat, die mit derjenigen übereinstimmt, die von der Analyse des SCF-Gens erwartet wird, und eine N-terminale Aminosäuresequenz Met-Glu-Gly-Ile ... hat, wie erwartet, unter Beibehaltung des Met, das durch das Initiationscodon codiert wird.
Durch Prozeduren, die denjenigen vergleichbar sind, die für humanen SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;, exprimiert in E. coli, dargestellt sind, kann Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; (ebenso in unlöslicher Form innerhalb der Zelle nach der Fermentation vorhanden) in einem gereinigten Zustand mit hoher biologischer spezifischer Aktivität gewonnen werden. Ähnlich können humaner SCF¹&supmin;¹&sup8;³ und Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³ gewonnen werden. Der Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³ tendiert während der Faltung/Oxidation dazu, verschiedenartigere oxidierte Species zu bilden, und es ist schwieriger, die nicht-erwünschten Species chromatographisch zu entfernen.
Der Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup9;³ und humane SCF¹&supmin;¹&sup8;³ neigen zu einem proteolytischem Abbau während der frühen Stadien der Gewinnung, d. h. Löslichmachung und Faltung/Oxidation. Eine Hauptstelle der Proteolyse liegt zwischen den Resten 160 und 170. Die Proteolyse kann durch geeignete Manipulation der Bedingungen minimiert werden (z. B. SCF-Konzentration; verschiedene pH; Einschluß von EDTA in 2-5 mM, oder anderer Proteaseinhibitoren), und abgebaute Formen in dem Ausmaß, daß sie vorhanden sind, können durch geeignete Fraktionierungsschritte entfernt werden.
Während die Verwendung von Harnstoff zur Löslichmachung und während der Faltung/Oxidation, wie beschrieben, eine bevorzugte Ausführungsform ist, können andere löslichmachende Mittel, wie etwa Guanidin-HCl (z. B. 6 M während der Löslichmachung und 1,25 M während der Faltung/Oxidation) und Natrium-N-Lauroyl-Sarcosin effektiv verwendet werden. Nach Entfernen der Mittel nach der Faltung/Oxidation können aufgereinigte SCFs, bestimmt durch SDS-PAGE, unter Verwendung von geeigneten Fraktionierungsschritten erhalten werden.
Zusätzlich können, während die Verwendung von Glutathion bei 1 mM während der Faltung/Oxidation eine bevorzugte Ausführungsform ist, andere Bedingungen verwendet werden mit gleicher oder nahezu gleicher Wirksamkeit. Diese schließen anstelle von 1 mM Glutathion zum Beispiel die Verwendung von 2mM Glutathion plus 0,2 mM oxidiertem Glutathion oder 4 mM Glutathion plus 0,4 mM oxidiertem Glutathion oder 1 mM 2- Mercaptoethanol oder andere Thiol-Reagentien ebenso ein.
Zusätzlich zu den beschriebenen chromatographischen Prozeduren schließen andere Prozeduren, die zum Erhalt von SCFs in einer aufgereinigten aktiven Form nützlich sind, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie [z. B. die Verwendung von Phenyl-Sepharose (Pharmacia), wobei die Probe bei neutralem pH in Anwesenheit von 1,7 M Ammoniumsulfat aufgebracht und mit einem Gradienten von sinkendem Ammoniumsulfat eluiert wird]; immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie [z. B. die Verwendung von chelierender Sepharose (Pharmacia), die mit Cu²&spplus;-Ionen beladen ist, wobei die Probe bei nahezu neutralem pH in Anwesenheit von 1 mM Imidazol aufgebracht und mit einem Gradienten von steigendem Imidazol eluiert wird]; Hydroxylapatit-Chromatographie, [wobei die Probe bei neutralem pH in der Anwesenheit von 1 mM Phosphat aufgebracht und mit einem Gradienten von steigendem Phosphat eluiert wird]; und andere Prozeduren ein, die für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sind.
Andere Formen von humanem SCF, die dem ganzen oder einem Teil des offenen Leserahmens entsprechen, der Aminosäuren 1-248 in Fig. 42 codiert, oder die dem offenen Leserahmen entsprechen, der durch alternativ gespleißte mRNAs codiert wird, die existieren können (wie diejenige, die durch die cDNA-Sequenz in Fig. 44 repräsentiert wird), können ebenso in E. coli exprimiert und in aufgereinigter Form durch Prozeduren, ähnlich den in diesem Beispiel beschriebenen und durch andere Prozeduren, die für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sind, gewonnen werden.
Die Aufreinigung und Formulierung von Formen, die die sog. Transmembran-Region einschließen, auf die in Beispiel 16 Bezug genommen wird, können die Verwendung von Detergentien, einschließlich nicht-ionischen Detergentien, und Lipiden, einschließlich Phospholipid-enthaltenden Liposom-Strukturen, beinhalten.

BEISPIEL 11

Rekombinanter SCF aus Säugetier-Zellen

A. Fermentation von CHO-Zellen, die SCF produzieren

Rekombinante Eierstock-(CHO)-Zellen aus chinesischem Hamster (Stamm CHO pDSRα2 hSCF¹&supmin;¹&sup6;²) wurden auf Mikroträgern in einem 20 Liter Perfusionskultur-System zur Produkti on von humanem SCF¹&supmin;¹&sup6;² wachsen gelassen. Das Fermenter-System ist ähnliche demjenigen, das für die Kultur von BRL-3A-Zellen, Beispiel 1B, verwendet wurde, außer im Hinblick auf das Folgende: Das für die Kultur von CHO-Zellen verwendete Wachstumsmedium war eine Mischung von Dulbeccos Modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und Ham's F-12 Nährstoffmischung in einem 1 : 1-Anteil (GIBCO), supplementiert mit 2 mM Glutamin, nichtessentiellen Aminosäuren (um die existierende Konzentration zu verdoppeln, indem eine 1 : 100-Verdünnung von Gibco #320-1140 verwendet wurde) und 5% fötalem bovinem Serum. Das Erntemedium war identisch, außer, daß das Serum ausgelassen wurde. Der Reaktor wurde mit 5,6 · 10&sup9; CHO-Zellen inokuliert, die in zwei 3-Liter-Drehkolben wachsen gelassen wurden. Die Zellen ließ man bis auf eine Konzentration von 4 · 10&sup5; Zellen/ml wachsen. An diesem Punkt wurden 100 g prästerilisierte Cytodex-2-Mikroträger (Pharmacia) dem Reaktor als eine 3-Liter-Suspension in Phosphat-gepufferter Salzlösung zugegeben. Die Zellen ließ man anheften und auf den Mikroträgern für 4 Tage wachsen. Das Wachstumsmedium wurde durch den Reaktor gespült, je nach Bedarf, auf der Grundlage des Glucoseverbrauchs. Die Glucosekonzentration wurde bei näherungsweise 2,0 g/L aufrechterhalten. Nach vier Tagen wurde der Reaktor mit 6 Volumina serumfreien Medium gespült, um das meiste des Serums zu entfernen (Proteinkonzentration < 50 ug/ml). Der Reaktor wurde dann batch-Weise betrieben, bis die Glucosekonzentration unter 2 g/L fiel. Von diesem Punkt an wurde der Reaktor bei einer kontinuierlichen Spülrate von näherungsweise 20 L/Tag betrieben. Der pH der Kultur wurde bei 6,9 ± 0,3 aufrechterhalten, indem die CO&sub2;-Durchflußrate angepaßt wurde. Der aufgelöste Sauerstoff wurde höher als 20% Luftsättigung gehalten, indem mit reinem Sauerstoff, wie benötigt, supplementiert wurde. Die Temperatur wurde bei 37 ± 0,5ºC gehalten.
Näherungsweise 450 Liter serumfreies, konditioniertes Medium wurden aus dem obigen System erzeugt und wurden als Ausgangsmaterial zur Aufreinigung von rekombinantem humanen SCF¹&supmin;¹&sup6;² verwendet.
Näherungsweise 589 Liter serumfreies, konditioniertes Medium wurden ebenso auf eine ähnliche Weise erzeugt, aber unter Verwendung von Stamm CHO pDSRα2 rSCF¹&supmin;¹&sup6;², und als Ausgangsmaterial für die Aufreinigung von Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² verwendet.

B. Aufreinigung von rekombinantem, in Säugetieren exyrimiertem Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;²

Die gesamte Aufreinigungsarbeit wurde bei 4ºC durchgeführt, wenn nicht andersartig angezeigt.

1. Aufkonzentrierung und Diafiltration

Ein konditioniertes Medium, das durch serumfreies Wachstum von Zellstamm CHO pDSRα2 Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² erzeugt wurde, wie in Abschnitt A oben durchgeführt, wurde durch Filtration durch 0,45 u Sartocapsules (Sartorius) geklärt. Mehrere verschiedene Batches (36 L, 101 L, 102 L, 200 L und 150 L) wurden separat einer Aulkonzentrierung und Diaflitration/Puffer- Austausch unterzogen. Zur Erläuterung, die Behandlung der 36 L-Charge war wie folgt. Das gefilterte, konditionierte Medium wurde auf ~ 500 ml auficonzentriert unter Verwendung eines Millipore Pellicon Tangentialfluß-Ultrafltrations-Apparates mit 3 Celluloseacetat- Membrankassetten mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10.000 (15 ft² Gesamtmembranfläche; Pumprate ~ 2.200 mL/min und Filtrationsrate 750 mumin). Diafiltration/Pufferaustausch in Vorbereitung für die Anionenaustausch-Chromatographie wurde dann durch Zugabe von 1.000 ml 10 mM Tris-HCl, pH 6,7 - 6,8 zu dem Konzentrat, Wiederaufkonzentration auf 500 ml unter Verwendung des Tangentialfluß-Ultrafiltrations-Apparates und durch Wiederholen hiervon 5 zusätzliche Male erreicht. Die auflkonzentrierte/diafiltrierte Zubereitung wurde schließlich in einem Volumen von 1000 ml erhalten. Das Verhalten aller konditionierten Medien-Batches, die der Aufkonzentration und Diafiltration/Pufferaustausch unterzogen wurden, war ähnlich. Die Proteinkonzentrationen für die Batches, bestimmt durch das Verfahren von Bradford [Anal. Bioch. 72, 248-254 (1976)] mit bovinem Serumalbumin als einen Standard, waren im Bereich 70-90 ug/ml. Das Gesamtvolumen an konditioniertem Medium, das für diese Zubereitung verwendet wurde, war ungefähr 589 L.

2. Q-Sepharose-Fast-Flow-Anionenaustausch-Chromatographie

Die aufkonzentrierten/diafiltrierten Zubereitungen aus jeder der fünf konditionierten Medien- Batches, auf die oben Bezug genommen wurde, wurden vereinigt (Gesamtvolumen 5000 ml). Der pH wurde auf 6,75 durch Zugabe von 1 M HCl eingestellt. 2000 ml 10 mM Tris-HCl, pH 6,7, wurden verwendet, um die Leitfähigkeit auf ungefähr 0,700 mmho zu bringen. Die Zubereitung wurde auf eine Q-Sepharose-Fast-Flow-Anionenaustauschsäule (36 · 14 cm; Phar macia-Q-Sepharose-Fast-Flow-Harz) aufgebracht, das mit dem Puffer 10 mM Tris-HCl, pH 6,7 equilibriert worden war. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule mit 28.700 ml Tris- Puffer gewaschen. Nach diesem Waschen wurde die Säule mit 23.000 ml 5 mM Essigsäure/l mM Glycin/6 M Harnstoff/20 uM CuSO&sub4; bei ungefähr pH 4,5 gewaschen. Die Säule wurde dann mit 10 mM Tris-HCl, 20 um CuSO&sub4;, pH 6,7 Puffer gewaschen, um zu einem neutralen pH zurückzukehren und den Harnstoff zu entfernen, und ein Salzgradient (0-700 mM NaCl in dem 10 mM Tris-HCl, 20 uM CuSO&sub4;, pH 6,7 Puffer; 40 L Gesamtvolumen) wurde verwendet. Es wurden Fraktionen von ungefähr 490 ml bei einer Durchflußrate von ungefähr 3.250 ml/h gesammelt. Das Chromatogramm wird in Fig. 36 gezeigt. "MC/9 cpm" bezieht sich auf die biologische Aktivität in dem MC/9-Assay; 5 ul von den angezeigten Fraktionen wurden getestet. Die Eluate, die während des Probenauftrags und des Waschens gesammelt wurden, sind nicht in der Figur gezeigt; keine biologische Aktivität wurde in diesen Fraktionen nachgewiesen.

3. Chromatographie unter Verwendung von an Siliziumdioxid gebundenem Kohlenwasserstoff-Harz

Fraktionen 44-66 aus dem in Fig. 36 gezeigten Lauf wurden vereinigt (11.200 ml), und EDTA wurde auf eine Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Dieses Material wurde bei einer Durchflußrate von ungefähr 2.000 ml/h auf eine C&sub4;-Säule aufgebracht (Vydac Proteins C&sub4;; 7 · 8 cm), die mit Puffer A (10 mM Tris pH 6,7/20% Ethanol) equilibriert worden war. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule mit 1000 ml Puffer A gewaschen. Ein linearer Gradient von Puffer A zu Puffer B (10 mM Tris pH 6,7/94% Ethanol) (Gesamtvolumen 6000 ml) wurde dann aufgebracht, und es wurden Fraktionen von 30-50 ml gesammelt. Teile der C&sub4;- Säulen-Ausgangsprobe, des Durchlaufpools und des Waschpools zusätzlich zu 0,5 ml Aliquots der Gradientenfraktionen wurden gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung in Vorbereitung auf den biologischen Asssay dialysiert. Diese verschiedenen Fraktionen wurden mit dem MC/9-Assay getestet (S ul Ahiquots der zubereiteten Gradientenfraktionen; cpm in Fig. 37). SDS-PAGE [Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970); die Stapelgele enthielten 4% (w/v) Acrylamid, und die Trenngele enthielten 12,5% (w/v) Acrylamid] der Aliquots von verschiedenen Fraktionen wird in Fig. 38 gezeigt. Für die gezeigten Gele wurden die Probenaliquots (100 ul) unter Vakuum getrocknet und dann unter Verwendung von 20 ul Probenbehandlungspuffer (reduzierend, d. h. mit 2-Mercaptoethanol) wieder aufgelöst und dann für 5 min vor dem Laden auf das Gel gekocht. Die numerierten Markierungen an der Linken der Figur repräsentieren Wanderungspositionen der Molekulargewichtsmarker (reduziert) wie in Fig. 6. Die numerierten Spuren repräsentieren die entsprechenden Fraktionen, die während der Verwendung des letzten Teils des Gradienten gesammelt wurden. Die Gele wurden silbergefärbt [Morrissey, Anal. Bioch. 117, 307-310 (1981)].

4. Q-Seyharose-Fast-Flow-Anionenaustausch-Chromatopraphie

Die Fraktionen 98-124 aus der in Fig. 37 gezeigten C&sub4;-Säule wurden vereinigt (1050 ml). Der Pool wurde 1 : 1 mit 10 mM Tris, pH 6,7 Puffer verdünnt, um die Ethanolkonzentration zu verringern. Der verdünnte Pool wurde dann auf eine Q-Sepharose-Fast-Flow- Anionenaustauschsäule (3,2 · 3 cm, Pharmacia-Q-Sepharose-Fast-Flow-Harz) aufgebracht, die mit dem 10 mM Tris-HCl, pH 6,7 Puffer equilibriert worden war. Die Durchflußrate war 463 ml/h. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule mit 135 ml Säulenpuffer gewaschen, und die Elution von gebundenem Material wurde durch Waschen mit 10 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl, pH 6,7, durchgeführt. Die Flußrichtung der Säule wurde umgedreht, um das Volumen des eluierten Materials zu minimieren, und es wurden 7,8 ml Fraktionen während der Elution gesammelt.

5. Sephacryl-S-200-HR-Gelfiltrations-Chromatographie

Die Fraktionen, die eluiertes Protein aus der Salzwaschung der Q-Sepharose-Fast-Flow- Anionenaustausch-Säule enthielten, wurden vereinigt (31 ml). 30 ml wurden auf eine Sephacryl-S-200-HR (Pharmacia) Gelfiltrations-Säule (5 · 55,5 cm) aufgebracht, die in Phosphat-gepufferter Salzlösung equilibriert worden war. Es wurden Fraktionen von 6,8 ml gesammelt bei einer Durchflußrate von 68 ml/hr. Die Fraktionen, die dem Peak der Extinktion bei 280 nm entsprachen, wurden vereinigt und repräsentieren das endgültige, aufgereinigte Material.
Tabelle 15 zeigt eine Zusammenfassung der Aufreinigung. TABELLE 15 Zusammenfassung der Aufreinigung von Säugetier-exprimiertem Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;²
*Bestimmt durch das Verfahren von Bradford (oben, 1976).
**Bestimmt als 47,3 mg durch quantitative Aminosäureanalyse unter Verwendung einer Methodologie, die ähnlich derjenigen war, die in Beispiel 2 dargestellt ist.
Die N-terminale Aminosäuresequenz von aufgereinigtem Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² ist näherungsweise zur Hälfte Gln-Glu-Ile ... und zur Hälfte PyroGlu-Glu-Ile ..., wie durch die in Beispiel 2 dargestellten Verfahren bestimmt. Dieses Resultat zeigt an, daß Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;² das produkt von proteolytischer Verarbeitung/Spaltung zwischen den Resten ist, die als Zahlen (-1) (Thr) und (+1) (Gln) in Fig. 14C angezeigt sind. Auf ähnliche Weise hat aufgereinigter humaner SCF¹&supmin; 162 aus mit transfizierten CHO-Zellen konditioniertem Medium (unten) die N-terminale Aminosäuresequenz Glu-Gly-Ile, was anzeigt, daß er das Produkt einer Verarbeitung/Spaltung zwischen den Resten ist, die als Zahlen (-1) (Thr) und (+1) (Glu) in Fig. 15C angezeigt sind.
Die Verwendung des oben beschriebenen Protokolls wird aufgereinigtes humanes SCF- Protein ergeben, entweder rekombinante Formen, die in CHO-Zellen exprimiert sind, oder natürlich gewonnene.
Zusätzliche Aufreinigungsverfahren, die bei der Aufreinigung von rekombinanten SCFs, aus Säugetierzellen stammend, von Nützlichkeit sind, schließen diejenigen ein, die in den Beispielen 1 und 10 dargelegt sind, sowie andere Verfahren, die für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sind.
Andere Formen von humanem SCF, die dem gesamten oder einem Teil des offenen Leserahmens entsprechen, der durch Aminosäuren 1-248 codiert wird, die in Fig. 42 gezeigt sind, oder die dem offenen Leserahmen entsprechen, der durch alternativ gespleißte mRNAs codiert wird, die existieren mögen (wie etwa diejenigen, die durch die cDNA-Sequenz in Fig. 44 repräsentiert werden), können ebenso in Säugetierzellen exprimiert und in aufgereinigter Form erhalten werden durch Prozeduren, die ähnlich denjenigen sind, die in diesem Beispiel beschrieben sind, sowie durch andere Prozeduren, die für Fachleute offensichtlich sind.

C. SDS-PAGE und Glycosidase-Behandlungen

Eine SDS-PAGE von vereinigten Fraktionen aus der Sephacryl-S-200-HR-Gelfiltrationssäule wird in Fig. 39 gezeigt; 2,5 ul des Pools wurden geladen (Spur ii). Die Spur wurde Silbergefärbt. Die Molekulargewichtsmarker (Spur 6) waren wie für Fig. 6 beschrieben. Das verschieden wandernde Material oberhalb und geringfügig unterhalb der Mr 31.000- Markerposition repräsentiert das biologisch aktive Material; die apparente Heterogenität beruht weitgehend auf der Heterogenität in der Glycosylierung.
Um die Glycosylierung zu charakterisieren, wurde aufgereinigtes Material mit einer Vielfalt von Glycosidasen behandelt, analysiert mit SDS-PAGE (reduzierende Bedingungen) und durch Silber-Färbung sichtbar gemacht. Die Resultate sind in Fig. 39 gezeigt. Spur 2, Neuraminidase, Spur 3, Neuraminidase und O-Glycanase, Spur 4, Neuraminidase, O-Glycanase und N-Glycanase. Spur 5, Neuraminidase und N-Glycanase, Spur 7, N-Glycanase, Spur 8, N- Glycanase ohne Substrat. Spur 9, O-Glycanase ohne Substrat. Die Bedingungen waren 10 mM 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), 66,6 mM 2- Mercaptoethanol, 0,04% (Gew./Vol.) Natriumazid, Phosphat-gepufferte Salzlösung, für 30 min bei 37ºC, gefolgt von einer Inkubation bei der Hälfte der beschriebenen Konzentrationen in der Anwesenheit der Glycosidasen für 18 h bei 37ºC. Eine Neuraminidase (von Arthrobacter ureafaciens; geliefert von Calbiochem) wurde in 0,5 Einheiten/ml Endkonzentration verwendet. O-Glycanase (Genzyme; endo-alpha-N-Acetylgalactosaminidase) wurde in 7,5 Millieinheiten/ml verwendet. N-Glycanase (Genzyme; Peptid: N-Glycosidase F; Peptid-N&sup4;[N- Acetyl-beta-Glucosaminyl]asparaginamidase) wurde in 10 Einheiten/ml verwendet.
Wo geeignet, wurden verschiedene Kontrollinkubationen durchgeführt. Diese schlossen ein: Eine Inkubation ohne Glycosidasen, um zu verifizieren, daß die Resultate auf den zugegebenen Glycosidase-Zubereitungen beruhten; eine Inkubation mit glycosylierten Proteinen (z. B. glycosyliertes rekombinantes menschliches Erythropoietin), von denen bekannt ist, daß sie Substrate für die Glycosidasen sind, um zu verifizieren, daß die Glycosidase-Enzyme, die verwendet wurden, aktiv waren; und eine Inkubation mit Glycosidasen, aber ohne Substrat, um zu beurteilen, wo die Glycosidase-Zubereitungen zu sichtbar gemachten Gelbanden beitrugen oder diese verschleierten (Fig. 39, Spuren 8 und 9).
Eine Anzahl von Schlußfolgerungen kann aus den oben beschriebenen Experimenten gezogen werden. Die verschiedenen Behandlungen mit N-Glycanase [die sowohl komplexe als auch mannose-reiche N-verknüpfte Kohlenhydrate entfernt (Tarentino et al., Biochemistry 24, 4665-4671 (1988)], Neuraminidase (die Sialinsäure-Reste entfernt) und O-Glycanase [die bestimmte O-verknüpfte Kohlenhydrate entfernt (Lambin et al., Biochem. Soc. Trans. 12, 599 - 600 (1984)], legen nahe, daß: sowohl N-verknüpfte als auch O-verknüpfte Kohlenhydrate vorhanden sind; und Sialinsäure vorhanden ist, wobei wenigstens ein Teil davon Teil der Overknüpften Gruppen ist. Die Tatsache, daß eine Behandlung mit N-Glycanase das in SDS- PAGE sichtbare, heterogene Material in eine schneller wandernde Form umwandeln kann, die viel homogener ist, zeigt an, daß das gesamte Material dasselbe Polypeptid repräsentiert, wobei die Heterogenität hauptsächlich durch eine Heterogenität hinsichtlich der Glycosylierung verursacht ist.

BEISPIEL 12

Zubereitung von rekombinantem SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;PEG

Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;, aufgereinigt aus einem rekombinanten E. coli Expressionssystem gemäß Beispielen 6A und 10, wurde als Ausgangsmaterial für die unten beschriebene Polyethylenglycol-Modifizierung verwendet.
Methoxypolyethylenglycol-Succinimidyl-Succinat (18,1 mg = 3,63 umol; SS-MPEG = Sigma Chemical Co. no. M3152, genähertes Molekulargewicht = 5.000) in 0,327 ml entionisiertem Wasser wurde zu 13,3 mg (0,727 umol) rekombinantem Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; in 1,0 ml 138 mM Natriumphosphat, 62 mM NaCl, 0,62 mM Natriumacetat, pH 8,0, zugegeben. Die resultierende Lösung wurde leicht geschüttelt (100 rpm) bei Zimmertemperatur für 30 Minuten. Ein 1,0 ml-Aliquot der endgültigen Reaktionsmischung (10 mg Protein) wurde dann auf eine Pharmacia Superdex 75-Gelfiltrationssäule (1,6 · 50 cm) aufgetragen und mit 100 mM Natriumphosphat, pH 6,9, bei einer Rate von 0,25 ml/min bei Zimmertemperatur eluiert. Die ersten 10 ml Säulenausfluß wurden verworfen, und 1,0 ml-Fraktionen wurden danach gesammelt. Die UV-Extinktion (280 nm) des Säulenausflusses wurde kontinuierlich überwacht und wird in Fig. 40A gezeigt. Die Fraktionen 25 bis 27 wurden vereinigt und durch Ultrafiltration durch eine 0,2 u Polysulfonmembran (Gelman Sciences no. 4454) sterilisiert, und der resultierende Pool wurde PEG-25 genannt. Ebenso wurden Fraktionen 28 bis 32 vereinigt, durch Ultrafiltration sterilisiert und als PEG-32 bezeichnet. Die vereinigte Fraktion PEG-25 enthielt 3,06 mg Protein, und die vereinigte Fraktion PEG-32 enthielt 3,55 mg Protein, wie aus A280- Messungen unter Verwendung einer Extinktion von 0,66 für eine 1,0 mgml Lösung von nicht-modifiziertem Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; zur Kalibrierung berechnet. Nicht umgesetzter Ratten- SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;, der 11,8% des Gesamtproteins in der Reaktionsmischung repräsentierte, wurde in den Fraktionen Nummer 34 bis 37 eluiert. Unter ähnlichen Chromatographie-Bedingungen wurde nicht-modifizierter Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; als ein Hauptpeak mit einem Retentionsvolumen von 45,6 ml eluiert, Fig. 40B. Die Fraktionen 77 bis 80 in Fig. 40A enthielten N- Hydroxysuccinimid, ein Nebenprodukt der Reaktion von Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; mit SS-MPEG.
Potentiell reaktive Aminogruppen in Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; schließen 12 Lysinreste und die alpha- Aminogruppe des N-terminalen Glutaminrestes ein. Die vereinigte Fraktion PEG-25 enthielt 9,3 mol reaktiver Aminogruppen pro mol Protein, wie durch spektroskopische Titration mit Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) unter Verwendung des durch Habeeb, Anal. Biochem. 14 : 328-336 (1966) beschriebenen Verfahrens bestimmt. Ebenso enthielt die vereinigte Fraktion PEG-32 10,4 mol, bzw. enthielt nicht-modifizierter Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; 13,7 mol reaktiver Aminogruppen pro mol Protein. Damit wurden durchschnittlich 3,3 (13,7 minus 10,4) Aminogruppen des Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; in der vereinigten Fraktion PEG-32 durch Umsetzung mit SS- MPEG modifiziert. Auf ähnliche Weise wurden durchschnittlich 4, 4 Aminogruppen des Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; in der vereinigten Fraktion PEG-25 modifiziert. Humaner SCF (hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;), hergestellt wie in Beispiel 10, wurde ebenso unter Verwendung der oben dargestellten Prozeduren modifiziert. Spezifisch wurden 714 mg (38,5 umol) hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; mit 962,5 mg (192,5 umol) SS-MPEG in 75 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, für 30 Minuten bei Zimmertemperatur umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde auf eine Sephacryl-S-200HR-Säule (5 · 134 cm) aufgetragen und mit PBS (Gibco Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung ohne CaCl&sub2; und MgCl&sub2;) bei einer Rate von 102 mL/hr eluiert, und es wurden 14,3 mL Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen No. 39-53, analog dem PEG-25 Pool, der oben und in Fig. 40A beschrieben ist, wurden vereinigt, und es wurde gefunden, daß sie insgesamt 354 mg Protein enthalten. Die in vivo-Aktivität dieses modifizierten SCF in Primaten wird in Beispiel 8C präsentiert.

BEISPIEL 13

SCF-Rezeptor-Expression auf leukämischen Blasten

Leukämische Blasten wurden aus dem Peripher-Blut eines Patienten mit einer Leukämie gemischter Zeillinien geerntet. Die Zellen wurden durch Dichtegradientenzentrifugation und Verarmung durch Anhaften aufgereinigt. Humaner SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; wurde gemäß dem Protokoll in Beispiel 7 iodiert. Die Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von iodiertem SCF, wie beschrieben [Broudy, BlpgIjS 1622-1626 (1990)] inkubiert. Die Resultate des Rezeptor-Bindungsexperiments sind in Fig. 41 gezeigt. Die geschätzte Rezeptordichte ist näherungsweise 70.000 Rezeptoren/Zelle.

BEISPIEL 14

Ratten-SCF-Aktivität auf frühe lymphoide Vorläufer

Die Fähigkeit von rekombinantem Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; (rrSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;), synergistisch mit IL-7 zu agieren, um die Proliferation von lymphoiden Zellen zu verstärken, wurde in Agar-Kulturen von Mäuse-Knochenmark studiert. Bei diesem Assay enthielten die Kolonien, die mit rrSCF¹&supmin; ¹&sup6;&sup4; allein gebildet wurden, Monocyten, Neutrophile und Blasten-Zellen, während die Kolonien, die durch IL-7 allein oder in Kombination mit rrSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; stimuliert worden waren, hauptsächlich Prä-B-Zellen enthielten. Prä-B-Zellen, charakterisiert als B220&spplus;, sIg&supmin;, cu&spplus;, wurden durch FACS-Analyse von vereinigten Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen das B220-Antigen [Cofflnan, Immunol. Rev., 69, 5 (1982)] und gegen Oberflächen-Ig(FITC-Ziegen-anti-K, Southern Biotechnology Assoc., Birmingham, AL) und durch Analyse von Cytospin-Objektträgem auf cytoplasmatische u-Expression unter Verwendung von Fluoreszenz-markierten Antikörpern (TRITC-Ziegen-anti-u, Southern Biotechnology Assoc.,) identifiziert. Rekombinantes humanes IL-7 (rhIL-7) wurde von Biosource International (Westlake Village, CA) erhalten. Wenn rrSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; in Kombination mit dem Prä-B- ZellenwachstumsfaktorIL-7 zugegeben wurde, wurde eine synergistische Steigerung hinsichtlich der Kolonie-Bildung beobachtet (Tabelle 16), was eine stimulatorische Rolle von rrSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; auf frühe B-Zell-Vorläufer anzeigt. Tabelle 16. Stimulation der Prä-B-Zell-Kolonie-Bildung durch rrSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; in Kombination mit hIL-7
¹ Anzahl an Kolonien pro ausplattierten 5 · 10&sup4; Maus-Knochenmarkszellen.
Jeder Wert ist der Mittelwert von drei Schalen ± SD.

BEISPIEL 15

Identifikation des Rezeptors für SCF

A. c-kit ist der Rezeptor für SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;

Um zu testen, ob SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; der Ligand für c-kit ist, wurde die cDNA für das gesamte murine ckit [Qiu et al., EMBO J., 7, 1003-1011 (1988)] amplifiziert unter Verwendung von PCR aus der auf SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; empfindlichen Mastzellen-Linie MC/9 [Nabel et al., Nature, 291, 332-334 (1981)] mit Priniern, die nach der publizierten Sequenz konstruiert worden waren. Die Liganden-bindenden und Transmembran-Domänen von humanem c-kit, die durch Aminosäuren 1- 549 codiert wurden [Yarden et al., EMBO J., 6, 3341-3351 (1987)], wurden unter Verwendung von ähnlichen Techniken aus der humanen Erythroleukämie-Zellinie HEL kloniert [Martin und Papayannopoulou, Science, 216, 1233-1235 (1982)]. Die c-kit-cDNAs wurden in den Säugetier-Expressionsvektor V 19.8 eingefügt, der in COS-1-Zellen transfiziert worden war, und Membranfraktionen hergestellt für Bindungsassays unter Verwendung von entweder Ratten- oder humanem ¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; gemäß den in Abschnitten B und C unten beschriebenen Verfahren. Tabelle 17 zeigt die Daten von einem typischen Bindungsassay. Es gab keine nachweisbare spezifische Bindung von ¹²&sup5;I humanem SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; an COS-1-Zellen, die mit V19.8 alleine transfiziert worden waren. Jedoch bindeten COS-1-Zellen, die die humanen rekombinanten c-kit-Liganden-bindenden plus Transmembran-Domänen (hckit-LT1) exprimierten, ¹²&sup5;I-hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; (Tabelle 17). Die Zugabe eines 200-fachen molekularen Überschusses von nicht-markiertem humanen SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; reduzierte das Binden auf Hintergrund-Niveaus. Auf ähnliche Weise bindeten COS-1-Zellen, die mit dem murinen c-kit (mckit-L1) voller Länge transfiziert worden waren, Ratten-¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;. Eine geringe Menge an Ratten-¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;- Bindung wurde in COS-1-Zellen-Transfektanten mit V 19.8 alleine nachgewiesen und ist ebenso in nicht-transfizierten Zellen (nicht gezeigt) beobachtet worden, was anzeigt, daß COS-1-Zellen endogenes c-kit exprimieren. Dieses Ergebnis ist in Übereinstimmung mit der weiten, zellulären Verteilung der c-kit-Expression. Ratten-¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; bindet auf ähnliche Weise an sowohl humanes als auch murines c-kit, während humaner ¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; mit geringerer Aktivität an murines c-kit bindet (Tabelle 17). Diese Daten stimmen mit dem Muster der SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;-Kreuzreaktivität zwischen den Species überein. Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; induziert die Proliferation von humanem Knochenmark mit einer spezifischen Aktivität, die ähnlich derjenigen von humanem SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; ist, während die durch humanen SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; induzierte Proliferation von murinen Mastzellen mit einer spezifischen Aktivität stattfindet, die 800-fach geringer als das Ratten-Protein ist.
In Zusammenfassung bestätigen diese Ergebnisse, daß die phänotypischen Abnormitäten, die durch W- oder S1-Mutanten-Mäuse exprimiert werden, die Konsequenzen von primären Defekten bei c-kit-Rezeptor-Liganden-Interaktionen sind, die für die Entwicklung verschiedener Zelltypen wichtig sind. Tabelle 17. SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;-Bindung an rekombinantes c-kit, das in COS-1-Zellen exprimiert wird.
a Der Durchschnitt von zweifachen Messungen wird gezeigt; das Experiment ist unabhängig mit ähnlichen Resultaten dreimal durchgeführt worden.
b 1,6 nM humaner ¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;
c 1,6 nM humaner ¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; + 320 nM nicht-markierter humaner SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;
d 1,6 nM Ratten-¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;
e 1,6 nM Ratten-¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; + 320 nM nicht-markierter Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;

B. Rekombinante c-kit-Expression in COS-1-Zellen

Humane und murine c-kit-cDNA-Klone wurden erzeugt unter Verwendung von PCR- Techniken [Saiki et al., Science, 239, 487-491 (1988)] aus Gesamt-RNA, die durch eine saure Phenol/Chloroform-Extraktions-Prozedur [Chomczynsky und Sacchi, Anal. Biochem., 162, 156-159, (1987)] aus der humanen Erythroleukämie-Zellinie HEL bzw. MC/9-Zellen isoliert worden war. Oligonukleotide mit einer einzigartigen Sequenz wurden aus den publizierten humanen und murinen c-kit-Sequenzen konstruiert. Erst-Strang-cDNA wurde aus der Gesamt-RNA gemäß dem mit dem Enzym Mo-MLV-Reversetranskription (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) bereitgestellten Protokoll synthetisiert unter Verwendung von ckit-Antisense-Oligonukleotiden als Primer. Die Amplifizierung von überlappenden Regionen der c-kit-Liganden-bindenden und Tyrosinkinase-Domänen wurde unter Verwendung von geeigneten Paaren von c-kit-Primem erreicht. Diese Regionen wurden in den Säugetier- Expressionsvektor V19.8 (Fig. 17) zur Expression in COS-1-Zellen kloniert. Die DNA- Sequenzierung von mehreren Klonen ergab unabhängige Mutationen, vermutlich entstanden während der PCR-Amplifizierung, in jedem Klon. Ein von diesen Mutationen freier Klon wurde durch erneutes Zusammensetzen von mutationsfreien Restriktrionsfragmenten aus se paraten Klonen konstruiert. Einige Unterschiede zu der publizierten Sequenz erschienen in allen oder in ungefähr der Hälfte der Klone; es wurde geschlossen, daß diese die tatsächlichen, in den verwendeten Zellinien vorhandenen Sequenzen sind, und sie können allelische Unterschiede zu den publizierten Sequenzen darstellen. Die folgenden Plasmide wurden in V19.8 konstruiert: V19.8:mckit-LT1, das gesamte murine c-kit; und V19.8:hckit-L1, das die Liganden-bindende plus Transmembran-Region (Aminosäuren 1-549) von humanem c-kit enthielt.
Die Plasmide wurden in COS-1-Zellen, im wesentlichen wie in Beispiel 4 beschrieben, transfiziert.

C. ¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;-Bindung an COS-1-Zellen, die rekombinantes c-kit exprimieren

Zwei Tage nach der Transfektion wurden die COS-1-Zellen aus der Schale gekratzt, in PBS gewaschen und bis zur Verwendung eingefroren. Nach dem Auftauen wurden die Zellen in 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, das 1 mM PMSF enthielt, 100 ug/ml Aprotinin, 25 ug/ml Leupeptin, 2 ug/ml Pepstatin und 200 ug/ml TLCK-HCl resuspendiert. Die Suspension wurde durch 5-maliges Auf- und Ab-Pipettieren dispergiert, auf Eis für 15 Minuten inkubiert, und die Zellen wurden mit 15-20 Stößen eines Dounce-Homogenisators homogenisiert. Saccharose (250 mM) wurde dem Homogenat zugegeben, und die Kernfraktion und die restlichen nicht-zerstörten Zellen wurden durch Zentrifugation bei 500 · g für 5 Min. pellettiert. Der Überstand wurde bei 25.000 g für 30 min bei 4ºC zentrifugiert, um die verbleibenden Zelltrümmer zu pellettieren. Humaner und Ratten-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; wurden mit radioaktivem Iod markiert unter Verwendung von Chloramin-T [Hunter und Greenwood, Nature, 194, 495-496 (1962)]. COS-1-Membranfraktionen wurden mit entweder humanem oder Ratten-¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; (1,6 nM) mit oder ohne einen 200-fachen molaren Überschuß von nicht-markiertem SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; in Bindungspuffer inkubiert, der RPMI, das mit 1% bovinem Serumalbumin supplementiert worden war, und 50mM HEPES (pH 7,4) umfaßte, für 1 h bei 22ºC. Arn Abschluß der Bindungs-Inkubation wurden die Membran-Zubereitungen vorsichtig auf 150 ul Phthalat-Öl aufgeschichtet und für 20 Minuten in einer Beckmann Microfuge 11 zentrifugiert, um Membrangebundenen ¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; von freiem ¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; zu trennen. Die Pellets wurden abgeschnitten, und Membran-assoziierter ¹²&sup5;I-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; wurde quantifiziert.

BEISPIEL 16

Isolierung einer humanen SCF-cDNA

A. Konstruktion der HT-1080-cDNA-Bibliothek

Gesamt-RNA wurde aus der humanen Fibrosarkom-Zelllinie HT-1080 (ATCC CCL 121) mit dem sauren Guanidinthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsverfahren [Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162, 156 (1987)] isoliert, und Poly(A)-RNA wurde unter Verwendung von Oligo(dT)-Spin-Säulen, gekauft von Clontech, gewonnen. Doppelsträngige cDNA wurde aus 2 ug Poly(A)-RNA mit einem BRL (Bethesda Research Laboratory)-cDNA-Synthesekit unter den von dem Vertreiber empfohlenen Bedingungen hergestellt. Näherungsweise 100 ng Säulen-fraktionierte, doppelsträngige cDNA mit einer durchschnittlichen Größe von 2kb wurden an 300 ng SalI/NotI-verdauten Vektor pSPORT 1 ligiert [D'Alessio et al., Focus, 12, 47-50 (1990)] und in DH5α-Zellen (BRL, Bethesda, MD) durch Elektroporation [Dower et al. m Nucl. Acids Res., 16, 6127-614 (1988)] transformiert.

B. Screening der cDNA-Bibliothek

Näherungsweise 2,2 · 10&sup5; primäre Transformanten wurden in 44 Pools aufgeteilt, von denen jeder ~5000 einzelne Klone enthielt. Die Plasmid-DNA wurde aus jedem Pool durch das CTAB-DNA-Fällungsverfahren hergestellt, wie beschrieben [Del Sal et al., Biotechniaues, 7, 514-519 (1989)]. Zwei Mikrogramm jedes Plasmid-DNA-Pools wurde mit dem Restriktionsenzym NotI verdaut und durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Die linearisierte DNA wurde auf eine GeneScreen Plus-Membran (DuPont) übertragen und mit ³²P-markierter, durch PCR erzeugter, humaner SCF-cDNA (Beispiel 3) unter zuvor beschriebenen Bedingungen [Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7580-7584 (1985)] hybridisiert. Drei Pools, die ein positives Signal enthielten, wurden aus der Hybridisierung identifiziert. Diese Pools von Kolonien wurden durch die Kolonie-Hybridisierungsprozedur erneut gescreent [Lin et al., Gene 44, 201-209 (1986)], bis eine einzelne Kolonie aus jedem Pool erhalten wurde. Die cDNA- Größen dieser drei isolierten Klone sind zwischen 5,0 bis 5,4 kb. Restriktionsenzymverdaue und die Bestimmung der Nukleotidsequenz am 5'-Ende zeigen an, daß zwei von drei Klonen identisch sind (10-1a und 21-7a). Beide enthalten die codierende Region und näherungsweise 200bp der 5'-nicht-translatierten Region (5'UTR). Der dritte Klon (26-1a) ist ungefähr 400 bp kürzer am 5'-Ende als die anderen beiden Klone. Die Sequenz dieser humanen SCF-cDNA wird in Fig. 42 gezeigt. Von besonderer Beachtung ist die hydrophobe Transmembran- Domänen-Sequenz, die in der Region der Aminosäuren 186-190 beginnt und bei Aminosäure 212 aufhört.

C. Konstruktion von pDSRα2 hSCF¹&supmin;²&sup4;&sup8;

pDSRα2 hSCF¹&supmin;²&sup4;&sup8; wurde unter Verwendung der Plasmide 10-1a (wie beschrieben in Beispiel 16B) und pGEM3 hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; wie folgt, erzeugt: Das HindIII-Insert aus pGEM3 hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; wurde in M13mp18 übertragen. Die Nukleotide, die unmittelbar stromauf vom ATG- Initiationskodon waren, wurden durch stellengerichtete Mutagenese von tttecttATG zu gecgcegecATG verändert, unter Verwendung des Antisense-Oligonukleotids
5'-TCT TCT TCA TGG CGG CGG CAA GCT T 3'
und des Oligonukleotid-gerichteten in vitro Mutagenese-System-Kit und der Protokolle von Amersham Corp., um M13mp18 hSCFK1-164 zu erzeugen. Diese DNA wurde mit HindIII verdaut und in pDSRα2 inseriert, das mit HindIII verdaut worden war. Dieser Klon wird als pDSRα2 hSCFK1-164 bezeichnet. Die DNA von pDSRα2 hSCFK1-164 wurde mit XbaI verdaut, und die DNA durch die Zugabe von Klenow-Enzym und vier dNTPs stumpfendig gemacht. Nach der Termination dieser Reaktion wurde die DNA weiter mit dem Enzym SpeI verdaut. Der Klon 10-1a wurde mit DraI verdaut, um ein stumpfes Ende zu erzeugen, das 3' zum offenen Leserahmen in dem Insert war, und mit SpeI, das an derselben Stelle innerhalb des Gens in sowohl pDSRα2 hSCFK1-164 als auch 10-1a schneidet. Diese DNAs wurden zusammenligiert, um pDSRα2 hSCFK1-248 zu erzeugen.

D. Transfektion und Immunfällung von COS-Zellen mit pDSRα2 hSCFK1-248-DNA

COS-7(ATCC CRL 1651)-Zellen wurden mit DNA transfiziert, die wie oben beschrieben konstruiert worden war. 4 · 10&sup6; Zellen in 0,8 ml DMEM + 5% FBS wurden bei 1600 V mit entweder 10 ug pDSRα2 hSCFK1-248-DNA oder 10 ug pDSRα2-Vektor-DNA (Vektorkontrolle) elektroporiert. Nach der Elektroporation wurden die Zellen erneut in zwei 60-mm- Schalen ausplattiert. Nach 24 h wurde das Medium mit frischem vollständigem Medium ersetzt.
72 h nach der Transfektion wurde jede Schale mit ³&sup5;S-Medium gemäß einer Modifizierung des Protokolls von Yarden et al. markiert (PNAS 87, 2569-2573, 1990). Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und dann mit Methionin-freiem, Cystein-freiem DMEM (met&supmin;cys&supmin; DMEM) für 30 min inkubiert. Das Medium wurde entfernt, und 1 ml met&supmin;cys&supmin;DMEM, das 100 uCi/ml Tran³&sup5;S-Markierung (ICN) enthielt, wurde jeder Schale zugegeben. Die Zellen wurden bei 37ºC für 8 h inkubiert. Das Medium wurde geerntet, durch Zentrifugation geklärt, um Zelltrümmer zu entfernen, und bei -20ºC gefroren.
Aliquots von markiertem, konditioniertem Medium von COS/pDSRα2 hSCFK1-248 und COS/pDSRα2-Vektorkontrolle wurden immungefällt zusammen mit Mediumproben von ³&sup5;Smarkierten CHO/pDSRα2 hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;-Klon 17-Zellen (siehe Beispiel 5) gemäß einer Modifizierung des Protokolls von Yarden et al. (EMBO, J., 6, 3341-3351, 1987). Ein ml jeder Probe konditioniertes Medium wurde mit 10 ul von Prä-Immun-Kaninchenserum (#1379 P. I.) behandelt. Die Proben wurden für 5 h bei 4ºC inkubiert. Einhundert Mikroliter einer 10% Suspension von Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem.) in 0,15 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 0,2% Triton X-100 wurden jedem Röhrchen zugegeben. Die Proben wurden für eine zusätzliche Stunde bei 4ºC inkubiert. Immunkomplexe wurden durch Zentrifugation bei 13.000 · g für 5 min pelletiert. Die Überstände wurden in neue Röhrchen übertragen und mit 5 ul polyklonalem Kaninchen-Antiserum (#1381 TB4), aufgereinigt wie in Beispiel 11, gegen aus CHO stammendem hSCF¹&supmin;¹&sup6;² über Nacht bei 4ºC inkubiert. 100 ul Pansorbin wurde für 1 h. zugegeben, und die Immunkomplexe wurden wie zuvor pelletiert. Die Pellets wurden 1x mit Lysepuffer gewaschen (0,5% Na-Deoxycholat, 0,5% NP-40, 50 mM NaCl, 25 mM Tris pH 8), 3x mit Waschpuffer (0,5 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,2% Triton X-100), und 1x mit 20 mM Tris pH 7,5. Die Pellets wurden in 50 ul 10 mM Tris, pH 7,5, 0,1% SDS, 0,1 M β-Mercaptoethanol resuspendiert. Das SCF-Protein wurde durch Kochen für 5 min eluiert. Die Proben wurden bei 13.000 · g für 5 min zentrifugiert, und die Überstände wurden abgenommen.
Eine Behandlung mit Glycosidasen wurde wie folgt erreicht: drei Mikroliter 75 mM CHAPS, das 1,6 mU O-Glycanase, 0,5 U N-Glycanase und 0,02 U Neuraminidase enthielt, wurden zu 25 ul Immunkomplex-Proben zugegeben und für 3 h bei 37ºC inkubiert. Ein gleiches Volumen an 2xPAGE-Probenpuffer wurde zugegeben, und die Proben wurden für 3 min gekocht. Verdaute und nicht-verdaute Proben wurden elektrophoresiert auf einem reduzierenden 15% SDS-Polyacrylamid-Gel über Nacht bei 8 mA. Das Gel wurde in Methanol-Essigsäure fixiert, mit Aufhellungs-Verstärker (NEN) für 30 min behandelt, getrocknet und einem Kodak XAR-5-Film bei -70º exponiert.
Fig. 43 zeigt das Autoradiogramm der Resultate. Spuren 1 und 2 sind Proben von den Kontroll-COS/pDSRα2-Kulturen, Spuren 3 und 4 von COS/pSRα2hSCFK1-248, Spuren 5 und 6 von CHO/pDSRα2hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;. Spuren 1, 3 und 5 sind nicht-verdaute Immun-Präzipitate; Spuren 2, 4 und 6 sind mit Glycanasen, wie oben beschrieben, verdaut worden. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker werden zur Linken gezeigt. Das Verarbeiten des SCF in COS, die mit pDSRα2hSCFK1-248 transfiziert worden sind, ähnelt stark demjenigen von hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;, der aus CHO ausgeschieden wird, die mit pDSRα2 hSCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; transfiziert worden sind (Beispiel 11). Dies legt in starkem Maße nahe, daß die natürliche, proteolytische Verarbeitungsstelle, die SCF aus der Zelle freisetzt, sich in der Nähe von Aminosäure 164 befindet.

BEISPIEL 17

Ouartärstrukturanalyse von humanem SCF.

Nach Kalibrierung der Gelfiltrationssäule (ACA 54), die in Beispiel 1 für die Aufreinigung von SCF aus BRL-Zellenmedium beschrieben worden ist, mit Molekulargewichtsstandards, und nach Elution von aufgereinigtem SCF von anderen kalibrierten Gelfiltrationssäulen ist es offensichtlich, daß SCF, der aus BRL-Zellmedium aufgereinigt worden ist, sich mit einem apparenten Molekulargewicht von näherungsweise 70.000-90.000 relativ zu den Molekulargewichtsstandards verhält. Im Gegensatz ist das apparente Molekulargewicht mit SDS-PAGE näherungsweise 28.000-35.000. Während es bekannt ist, daß glycosylierte Proteine sich in solchen Analysen anomal verhalten können, legen die Resultate nahe, daß der aus BRL stammende Ratten-SCF als ein nicht-kovalent assoziiertes Dimer unter nicht-denaturierenden Bedingungen existieren kann. Ähnliche Resultate lassen sich auf rekombinante SCF-Formen anwenden (z. B. Ratten- und humaner SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;, der aus E. coli stammt, Ratten- und humaner SCF¹&supmin;¹&sup6;², der aus CHO-Zellen stammt), dahingehend, daß die Molekülgröße, geschätzt mittels Gelitration unter nicht-denaturierenden Bedingungen, ungefähr das Doppelte derjenigen ist, geschätzt mittels Gelfiltration unter denaturierenden Bedingungen (d. h., der Anwesenheit von SDS), oder mittels SDS-PAGE in jedem einzelnen Fall. Darüber hinaus ergibt eine Sedimentations-Geschwindigkeitsanalyse, die eine genaue Bestimmung des Molekulargewichts in Lösung bereitstellt, einen Wert von ungefähr 36.000 für das Molekulargewicht von aus E. coli stammendem, rekombinantem, humanem SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;. Dieser Wert ist wiederum näherungsweise zweimal demjenigen, der mit SDS-PAGE gesehen wird (~18.000-19.000). Deshalb scheint es, während es anerkannt wird, daß es vielfache oligomere Zustände geben kann (einschließlich dem monomeren Zustand), daß der dimere Zustand unter einigen Bedingungen in Lösung vorherrscht.

BEISPIEL 18

Isolierung von humanen SCF-cDNA-Klonen aus der 5637-Zelllinie

A. Konstruktion der 5637-cDNA-Bibliothek

Gesamt-RNA wurde aus der humanen Blasen-Karzinom-Zelllinie 5637 (ATCC HTB-9) durch das saure Guanidinthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsverfahren [Chomczynski et al., Anal. Biochem, 162, 156 (1987)] isoliert, und Poly(A)-RNA wurde unter Verwendung einer Oligo(dT)-Spin-Säule, erworben von Clontech, erhalten. Doppelsträngige cDNA wurde aus 2 ug Poly(A)-RNA mit einem BRL-cDNA-Synthese-Kit unter den vom Vertreiber empfohlenen Bedingungen hergestellt. Näherungsweise 80 ng säulenfraktionierter, doppelsträngiger cDNA mit einer durchschnittlichen Größe von 2 kb wurde an 300 ng SalI/NotI-verdauten Vektor pSPORT 1 [D'Alessio et al., Focus, 12, 47-50 (1990)] ligiert und in DH5α-Zellen durch Elektroporation transformiert [Dower et al., Nucl. Acids Res., 16, 6127-6145 (1988)].

B. Screening der cDNA-Bibliothek

Näherungsweise 1,5 · 10&sup5; primäre Transformanten wurden in 30 Pools aufgeteilt, wobei jeder näherungsweise 5000 einzelne Klone enthielt. Die Plasmid-DNA wurde aus jedem Pool durch das CTAB-DNA-Fällungsverfahren hergestellt, wie beschrieben [Del Sal et al., Biotechniques, 7, 514-519 (1989)]. Zwei Mikrogramm jedes Plasmid-DNA-Pools wurde mit dem Restriktionsenzym NotI verdaut und durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Die linearisierte DNA wurde auf eine GeneScreen Plus-Membran (DuPont) übertragen und mit ³²P-markierter humaner SCF-cDNA voller Länge hybridisiert, die aus der HT1080-Zelllunie isoliert worden war (Beispiel 16), unter den zuvor beschriebenen Bedingungen [Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 7580-7584 (1985)]. Sieben Pools, die ein positives Signal enthielten, wurden aus der Hybridisierung identifiziert. Die Pools der Kolonien wurden erneut mit ³²Pmarkierter, durch PCR erzeugter, humaner SCF-cDNA gescreent (Beispiel 3) mit der Kolonie-Hybridisierungsprozedur [Lin et al., Gene, 44, 201-209 (1986)], bis eine einzelne Kolonie aus vier der Pools erhalten wurde. Die Insert-Größen der vier isolierten Klone sind näherungsweise 5,3 kb. Restriktionsenzymverdaue und die Analyse der Nukleotidsequenz der 5'- Enden der Klone zeigen an, daß die vier Klone identisch sind. Die Sequenz dieser humanen cDNA wird in Fig. 44 gezeigt. Die cDNA von Fig. 44 codiert für ein Polypeptid, in dem die Aminosäuren 149-177 der Sequenzen in Fig. 42 durch einen einzelnen Gly-Rest ersetzt worden sind.

BEISPIEL 19

SCF-Erhöhung der Überlebensrate nach einer tödlichen Bestrahlung

A. SCF-in vivo-Aktivität auf die Überlebensrate nach einer tödlichen Bestrahlung

Der Effekt von SCF auf die Überlebensrate von Mäusen nach einer tödlichen Bestrahlung wurde getestet. Die verwendeten Mäuse waren 10 bis 12 Wochen alte weibliche Balb/c. Gruppen von 5 Mäusen wurden in allen Experimenten verwendet, und die Mäuse stimmten innerhalb jedes Experiments hinsichtlich ihres Körpergewichts überein. Die Mäuse wurden mit 850 rad oder 950 rad in einer Einzeldosis bestrahlt. Den Mäusen wurden Faktoren alleine oder Faktoren plus normale Balb/c-Knochenmarkszellen injiziert. Im ersten Fall wurde den Mäusen intravenös 24 h nach der Bestrahlung Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; (20 ug/kg), aufgereinigt aus E. coli und modifiziert durch die Zugabe von Polyethylenglykol wie in Beispiel 12, oder Kochsalzlösung injiziert für die Kontrolltiere. Für das Transplantat-Modell wurden Mäusen i. v. verschiedene Zelldosen von normalem Balb/c-Knochenmark 4 Stunden nach der Bestrahlung injiziert. Die Behandlung mit Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; wurde durch Zugabe von 200 ug/kg von Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; zur Zellsuspension 1 Stunde vor der Injektion durchgeführt und als eine einzelne i. v.-Injektion von Faktor plus Zellen verabreicht.
Nach der Bestrahlung mit 850 rad wurde Mäusen Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; oder Kochsalzlösung injiziert. Die Resultate sind in Fig. 45 gezeigt. Eine Injektion von Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; erhöhte die Überlebenszeit der Mäuse signifikant im Vergleich mit den Kontrolltieren (P< 0,0001). Mäuse, denen eine Kochsalzlösung injiziert worden war, überlebten durchschnittlich 7,7 Tage, während Mäuse, die mit Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; behandelt worden waren, durchschnittlich 9,4 Tage überlebten (Fig. 45). Die in Fig. 45 präsentierten Resultate repräsentieren die Zusammenstellung von 4 getrennten Experimenten mit 30 Mäusen in jeder Behandlungsgruppe.
Die erhöhte Überlebensrate von Mäusen, die mit Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; behandelt worden waren, legt einen Effekt von SCF auf die Knochenmarkszellen der bestrahlten Tiere nahe. Vorläufige Studien der hämatologischen Parameter dieser Tiere zeigen geringfügige Steigerungen hinsichtlich ihrer Blutplättchen-Niveaus im Vergleich mit den Kontroll-Tieren 5 Tage nach der Bestrahlung, jedoch sind 7 Tage nach der Bestrahlung die Blutplättchen-Niveaus nicht signifikant unterschiedlich zu den Kontroll-Tieren. Keine Unterschiede hinsichtlich der RBC- oder WBC-Niveaus oder der Knochenmarks-Zellularität sind nachgewiesen worden.

B. Überleben von transplantierten, mit SCF behandelten Mäusen

Dosen von 10% Femur normaler Balb/c-Knochenmarkszellen, die in Mäuse transplantiert worden sind, welche bei 850 rad bestrahlt worden sind, können 90% oder mehr der Tiere retten (Daten nicht gezeigt). Deshalb wurde eine Bestrahlungsdosis von 850 rad mit einer Transplantat-Dosis von 5% Femur verwendet, um die Effekte von Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; auf das Überleben zu studieren. Bei dieser Zelldosis wurde erwartet, daß ein großer prozentualer Anteil an Mäusen, die nicht SCF erhalten, nicht überleben würde; wenn Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; die transplantierten Zellen stimulieren könnte, könnte es einen Anstieg beim Überleben geben. Wie in Fig. 46 gezeigt, überlebten näherungsweise 30% der Kontrollmäuse mehr als 8 Tage nach der Bestrahlung. Eine Behandlung mit Ratten-PEG-SCFIIM resultierte in einer dramatischen Steigerung der Überlebensrate, wobei mehr als 95% dieser Mäuse bis zu wenigstens 30 Tage überleben (Fig. 46). Die in Fig. 46 präsentierten Resultate repräsentieren die Zusammenstellung von Resultaten aus vier separaten Experimenten, die 20 Mäuse in sowohl den Kontroll- als auch Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4;-behandelten Mäusen repräsentieren. Bei höheren Bestrahlungsdosen führte eine Behandlung der Mäuse mit Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; im Zusammenhang mit einer Mark-Transplantation ebenso zu einer erhöhten Überlebensrate ( Fig. 47). Kontrollmäuse, die mit 950 rad bestrahlt und mit 10% eines Femurs transplantiert worden waren, waren bis zum Tag 8 tot, während näherungsweise 40% der Mäuse, behandelt mit Ratten-PEG-SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; 20 Tage oder länger überlebten. 20% der Kontrollmäuse, die mit 20 % eines Femurs transplantiert worden waren, überlebten länger als 20 Tage, während 80% der rSCF-behandelten Tiere überlebten (Fig. 47).

BEISPIEL 20

Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen SCF

8-Wochen alten, weiblichen BALB/c-Mäusen (Charles River, Wilmington, MA) wurde subkutan 20 ug humaner SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; injiziert, der aus E. coli in vollständigem Freundschem Adjuvans exprimiert worden war (H37-Ra; Difco Laboratories, Detroit, MI). Booster- Immunisierungen von 50 ug desselben Antigens in unvollständigem Freundschem Adjuvans wurden darauffolgend an den Tagen 14, 38 und 57 verabreicht. Drei Tage nach der letzten Injektion wurde 2 Mäuse geopfert, und ihre Milzzellen mit der sp 2/0 Myelom-Linie gemäß den von Nowinski et al., beschriebenen Prozeduren [Virology 93, 111-116 (1979)] verschmolzen.
Die zur Zellkultur von sp 2/0 und Hybridom verwendeten Medien waren Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), (Gibco, Chagrin Falls, Ohio), das mit 20% hitzeinaktiviertem fötalem bovinem Serum (Phibro Chem., Fort Lee, NJ), 110 mg/ml Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin und 100 mcg/ml Streptomycin (Gibco) supplementiert worden war. Nach der Zellverschmelzung wurden die Hybride in HAT-Medium selektioniert, dem obigen Medium, das 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4 · 10&supmin;&sup7; M Aminopterin und 1,6 · 10&supmin;&sup5; M Thymidin enthielt, für 2 Wochen, dann in einem Medium kultiviert, das Hypoxanthin und Thymidin enthielt, für 2 Wochen.
Die Hybridomen wurden wie folgt gescreent:
Polystyrol-Näpfe (Costar, Cambridge, MA) wurden mit 0,25 ug humanem SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; (E. coli) in 50 ul 50 mM Bicarbonatpuffer pH 9,2 für zwei Stunden bei Zimmertemperatur, dann über Nacht bei 4ºC sensitiviert. Die Platten wurden dann mit 5% BSA in PBS für 30 Minuten bei Zimmertemperatur blockiert, dann mit einem Hybridoma-Kultur-Überstand für eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Lösung wurde dekantiert, und die gebundenen Antikörper mit einer 1 : 500-Verdünnung von Ziegen-Anti-Maus-IgG, der mit Meerrettich-Peroxidase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) konjugiert war, für eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden mit Waschlösung gewaschen (KPL, Gaithersburg, MD) dann mit einer Mischung von H&sub2;O&sub2; und ABTS (KPL) entwickelt. Eine Kolorimetrie wurde bei 405 nm durchgeführt.
Hybridoma-Zellkulturen, die einen JUr humanen SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; (E. coli) spezifischen Antikörper ausschieden, wurden mit ELISA, dieselben wie die Hybridoma-Screening-Prozeduren, auf Kreuzreaktivitäten gegen humanen SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; (CHO) getestet. Die Hybridomen wurden durch das limitierende Verdünnungsverfahren subkloniert. 55 Näpfe Hybridoma-Überstand ergaben ein stark positives Testresultat gegenüber humanem SCF¹&supmin;¹&sup6;&sup4; (E. coli); 9 davon kreuzreagierten mit humanem SCF¹&supmin;¹&sup6;² (CHO).
Mehrere Hybridoma-Zellen sind wie folgt kloniert worden:
Die Hybridomen 4G12-13 und 8H7A wurden bei der ATCC am 26. September 1990 hinterlegt.
Während die vorliegende Erfindung hinsichtlich ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist es klar, daß Variationen und Modifizierungen den Fachleuten einfallen werden. Deshalb ist es beabsichtigt, daß die angehängten Ansprüche alle derlei äquivalenten Variationen abdecken, die in den Schutzumfang der Erfindung, wie beansprucht, kommen.
Die in der vorhergehenden Beschreibung, in den folgenden Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch in jeder beliebigen Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.
Hu164SCF17 wurde bei der ATCC am 25. September 1990 unter der Zahl CLR10557 hinterlegt, 4G-12-13 wurde bei der ATCC am 26. September 1990 unter der Zahl HB10561 hinterlegt, 8H7A wurde bei der ATCC am 26. September 1990 unter der Zahl HB 10560 hinter legt, V 19.8 wurde bei der ATCC am 13. Oktober 1989 unter der Zahl 68124 hinterlegt, und HuGenl-Human-SCF wurde am 13. Oktober 1989 unter der Zahl 40681 hinterlegt.

Claims

1. Ein Polypeptid, das einen Teil oder die gesamte Primärstruktur der in Fig. 15C dargestellten Sequenz und eine hämatopoetische biologische Eigenschaft von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor hat.

2. Ein Polypeptid, das einen Teil oder die gesamte Primärstruktur der in Fig. 42 dargestellten Sequenz und eine hämatopoetische biologische Eigenschaft von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor hat

3. Ein Polypeptid, das einen Teil oder die gesamte Primärstruktur der in Fig. 44 dargestellten Sequenz und eine hämatopoetische biologische Eigenschaft von natürlich vorkommendem Stamnizellenfaktor hat.

4. Ein Polypeptid, das einen Teil oder die gesamte Primärstruktur der in Fig. 14C dargestellten Sequenz und eine hämatopoetische biologische Eigenschaft von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor hat.

5. Ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das das Produkt von prokaryontischer oder eukaryontischer Expression einer exogenen DNA-Sequenz ist.

6. Ein Polypeptid nach Anspruch 5, wobei die exogene DNA-Sequenz eine cDNA- Sequenz ist.

7. Ein Polypeptid nach Anspruch 5, wobei die exogene DNA-Sequenz eine genomische DNA-Sequenz ist.

8. Ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die exogene DNA-Sequenz auf einem autonom replizierenden Plasmid oder viralen Vektor getragen wird.

9. Ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß es mit einer nachweisbaren Markierungssubstanz kovalent assoziiert ist.

10. Eine DNA-Sequenz zur Verwendung beim Exprimieren eines Polypeptidprodukts, das die gesamte oder einen Teil der Primärstruktur von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor und eine hämatopoetische biologische Eigenschaft von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor hat, in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle, wobei besagte DNA-Sequenz ausgewählt ist aus:

(a) DNA-Sequenzen, die in Fig. 14B, Fig. 14C, Fig. 15B, Fig. 15C dargestellt sind, oder ihre komplementären Stränge;

(b) DNA-Sequenzen, die an die in (a) definierten DNA-Sequenzen oder Fragmente davon hybridisieren; und

(c) DNA-Sequenzen, die, ohne die Degeneration des genetischen Codes, an die in (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen hybridisieren würden und die für ein Polypeptid codieren, das dieselben Aminosäuresequenzen hat.

11. Eine DNA-Sequenz zur Verwendung beim Exprimieren eines Polypeptidprodukts, das die gesamte oder einen Teil der Primärstruktur von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor und eine hämatopoetische biologische Eigenschaft von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor hat, in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle, wobei besagte DNA-Sequenz ausgewählt ist aus:

(a) Die in Fig. 42 dargestellte DNA-Sequenz oder ihr komplementärer Strang;

12. Eine DNA-Sequenz zur Verwendung beim Exprimieren eines Polypeptidprodukts, das die gesamte oder einen Teil der Primärstruktur von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor und eine hämatopoetische biologische Eigenschaft von natürlich vorkommendem Stammzellenfaktor hat, in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle, wobei besagte DNA-Sequenz ausgewählt ist aus:

(a) Die in Fig. 44 dargestellte DNA-Sequenz oder ihrer komplementärer Strang;

(b) DNA-Sequenzen, die an die in (a) definierten DNA-Sequenzen oder Fragmente davon hybridisieren;

13. Eine DNA-Sequenz nach Anspruch 10, 11 oder 12, die ein oder mehrere Codons einschließt, die für die Expression in Nicht-Säugerierzellen bevorzugt sind.

14. Eine DNA-Sequenz nach Anspruch 13, die ein oder mehrere Codons einschließt, die für die Expression in E. coli-Zellen bevorzugt sind.

15. Eine DNA-Sequenz nach Anspruch 10, 11 oder 12, die ein oder mehrere Codons einschließt, die für die Expression in Hefezellen bevorzugt sind.

16. Eine DNA-Sequenz nach Anspruch 10, 11 oder 12, die für die Expression von humanem SCF codiert.

17. Eine DNA-Sequenz nach Anspruch 10 oder 11, die für die Expression eines humanen SCF-Polypeptids codiert, das ausgewählt ist aus (unter Verwendung der Numerierung nach Fig. 42) SCF1-162, SGF1-164, SCF1-165 und SCF1-248.

18. Eine DNA-Sequenz nach Anspruch 12, die für die Expression eines humanen SCF- Polypeptids codiert, das ausgewählt ist aus (unter Verwendung der Numerierung nach Fig. 44) SCFmet1-157, SCF1-157, SCFmet1-160, SCF1-160, SCFmet1-161, SCF1-161, SCFmet1-220 oder SCF1-220.

19. Eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 10, 11 oder 12, die für die Expression eines Methionylrestes an der N-terminalen Position einer reifen Version von besagtem Polypeptid codiert.

20. Eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 10 bis 19, die mit einer nachweisbaren Markierung kovalent assoziiert ist.

21. Eine DNA-Sequenz nach Anspruch 20, wobei die Markierung eine radioaktive Markierung ist.

22. Ein biologisch funktionelles Plasmid oder ein viraler DNA-Vektor, der eine DNA nach einem der Ansprüche 10 bis 21 einschließt.

23. Eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 10 bis 19 auf eine Weise transformiert oder transfiziert ist, die es der Wirtszelle erlaubt, besagtes Polypeptidprodukt zu exprimieren.

24. Eine Wirtszelle nach Anspruch 23, wobei die Wirtszelle E. coli ist.

25. Eine Wirtszelle nach Anspruch 23, wobei die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.

26. Ein nicht-natürlich vorkommendes Polypeptidprodukt der Expression einer DNA- Sequenz nach einem der Ansprüche 10 bis 19 in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt.

27. Ein Produkt nach Anspruch 26, wobei die DNA-Sequenz eine cDNA-Sequenz ist.

28. Ein Produkt nach Anspruch 26, wobei die DNA-Sequenz eine genomische DNA- Sequenz ist.

29. Ein Verfahren zur Produktion eines Polypeptids, das einen Teil oder die gesamte Primärstruktur und eine oder mehrere der hämatopoetischen biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem Starumzellenfaktor hat, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch: Kultivieren unter geeigneten Nährstoffbedingungen von prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen, die mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 10 bis 19 auf eine Weise transformiert oder transfiziert sind, die es der Wirtszelle erlaubt, besagtes Polypeptid zu exprimieren, und Isolieren von erwünschten Polypeptidprodukten der Expression der DNA-Sequenz.

30. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder das durch das Verfahren in Anspruch 29 hergestellt worden ist, und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Träger umfaßt.

31. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder das durch das Verfahren nach Anspruch 29 hergestellt worden ist, zur Herstellung eines Medikaments zum Bereitstellen einer hämatopoetischen Therapie für ein Säugetier.

32. Verwendung nach Anspruch 31, wobei besagte Therapie aus den folgenden ausgewählt ist: die Behandlung von Leukopenie; die Behandlung von Thrombocytopenie, die Behandlung von Anämie, Verstärkung der Verpflanzung von Knochenmark während einer Transplantation, Verstärkung der Erholung von Knochenmark bei einer Strahlungsbehandlung, chemische oder chemotherapeutisch induzierte Knochenmarksaplasie oder Knochenmarksuppression und Sensibilisierung von Zellen gegenüber Chemotherapie.

33. Verwendung nach Anspruch 31, wobei die hämatopoetische Therapie die Verabreichung von besagtem Medikament an einen Spender beinhaltet, um die Anzahl an Zellen zu erhöhen, die zur Transplantation nach Knochenmarkaspiration oder Peripher-Blut- Leucopherese verfügbar sind.

34. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder das durch das Verfahren nach Anspruch 29 hergestellt worden ist, zur Herstellung eines Medikaments zum Bereitstellen einer Therapie für ein Säugetier, wobei besagte Therapie ausgewählt ist aus der Behandlung von: AIDS, Myelofibrose, Myelosklerose, Osteopetrose, metastatisches Carcinom, akute Leukämie, multiples Myelom, Hodgkinsche Krankheit, Lymphom, Gauchersche Krankheit, Niemann-Picksche Krankheit, Letterer-Siwesche Krankheit, refraktäre erythroblastische Anämie, Di-Guglielmo Syndrom, kongestive Splenomegalie, Kala-Azar, Sarcoidose, primäre Milz-Pancytopenie, Miliartuberkulose, disseminierte Pilzkrankheit Septikämie fulminans, Malaria, Vitamin B12-Mangel, Folsäuremangel und Pyrodoxinmangel.

35. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder das durch das Verfahren nach Anspruch 29 hergestellt worden ist, zur Herstellung eines Medikaments zum Bereitstellen einer Therapie für ein Säugetier, das an Nervenschaden, Unfruchtbarkeit oder Darmschaden leidet.

36. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder das durch das Verfahren in Anspruch 29 hergestellt worden ist, zur Herstellung eines Medikaments zum Bereitsstellen einer Therapie für eine Hypopigmentationsstörung.

37. Verwendung nach einem der Ansprüche 31 bis 36, wobei die Therapie die Verabreichung von wenigstens einem zusätzlichen hämatopoetischen Faktor einschließt, der ausgewählt ist aus EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 und IGF- 1.

38. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 31 bis 36, wobei die Therapie die Verabreichung von wenigstens einem zusätzlichen hämatopoetischen Faktor einschließt, der ausgewählt ist aus IL-8, IL-9 und IL-10.

39. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 31 bis 36, wobei die Therapie die Verabreichung von wenigstens einem zusätzlichen hämatopoetischen Faktor einschließt, der ausgewählt ist aus IL-11 und LIF.

40. Ein Verfahren zum Transfizieren von hämatopoetischen Zellen mit exogener DNA, das umfaßt:

(i) Kultivieren der hämatopoetischen Zellen mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, und

(ii) Transfizieren der kultivierten Zelle mit exogener DNA.

41. Ein Kit, der Bestandteile zum Kultivieren von Knochenmarkszellen oder Peripher- Blut-Vorläuferzellen enthält, wobei der Kit umfaßt:

(i) ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, fakultativ in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger;

(ii) Bestandteile, die zum Herstellen von Medium für das Kultivieren von Knochenmarkszellen oder Peripher-Blut-Vorläuferzellen geeignet sind.

42. Ein Kit nach Anspruch 41, wobei die Bestandteile wenigstens einen zusätzlichen hämatopoetischen Faktor einschließen, der ausgewählt ist aus EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 und IGF-1.

43. Ein Kit nach Anspruch 41, wobei die Bestandteile wenigstens einen zusätzlichen hämatopoetischen Faktor einschließen, der ausgewählt ist aus IL-8, IL-9 und IL-10.

44. Ein Kit nach Anspruch 41, wobei die Bestandteile wenigstens einen zusätzlichen hämatopoetischen Faktor einschließen, der ausgewählt ist aus IL-11 und ILF.

45. Ein Verfahren zum Kultivieren von hämatopoetischen Zellen in vitro, wobei das Verfahren umfaßt:

(i) Einbringen besagter Zellen in ein geeignetes Kulturmedium, wobei besagtes geeignetes Kulturmedium ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält,

(ii) Bereitstellen von geeigneten Bedingungen für das Wachstum der hämatopoetischen Zellen.

46. Ein Verfahren nach Anspruch 45, wobei das geeignete Kulturmedium wenigstens einen zusätzlichen hämatopoetischen Faktor enthält, der ausgewählt ist aus EPO, G-CSF, GM- CSF, CSF-l, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 und IGF-1.

47. Ein Verfahren nach Anspruch 46, wobei IL-3, IL-6 und G-CSF die zusätzlichen hämatopoetischen Faktoren sind.

48. Ein Verfahren nach Anspruch 45, wobei das geeignete Kulturmedium wenigstens einen zusätzlichen hämatopoetischen Faktor enthält, der ausgewählt ist aus IL-8, IL-9 und IL- 10.

49. Ein Verfahren nach Anspruch 45, wobei das geeignete Kulturmedium wenigstens einen zusätzlichen hämatopoetischen Faktor enthält, der ausgewählt ist aus IL-11 und LIF.

50. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 49, wobei die hämatopoetischen Zellen Knochenmarkszellen sind.

51. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 49, wobei die hämatopoetischen Zellen Peripher-Blut-Stammzellen sind.

52. Eine Zusammensetzung, die das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält, das kovalent an ein wasserlösliches Polymer gebunden ist.

53. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 52, wobei das Polymer ausgewählt ist aus Polyethylenglycol oder Copolyznere von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol.

54. Ein Antikörper, der selektiv an das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bindet.

55. Ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei ein oder mehrere Cysteinreste durch ein Alanin- oder Serinrest ersetzt ist.