ES2616337T3 - Un epítopo de linfocito T citotóxico humano y su epítopo agonista del número no variable de secuencias de repetición en tándem de MUC-1 - Google Patents

Un epítopo de linfocito T citotóxico humano y su epítopo agonista del número no variable de secuencias de repetición en tándem de MUC-1 Download PDF

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Abstract

Un polipéptido aislado de hasta 12 aminoácidos de longitud y que comprende la secuencia de aminoácidos del SED ID NO: 1, 14, 15, 16, o 19.

Description

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DESCRIPCION
Un epftopo de linfocito T citotoxico humano y su epftopo agonista del numero no variable de secuencias de repeticion en tandem de MUC-1
Campo de la invencion
Se han identificado secuencias epitopicas de CTL fuera de los antfgenos tumorales inmunogenicos MUC-1 tradicionales y los residuos de anclaje de HLA. En particular, la invencion describe un metodo para la activacion de celulas T mediante la modificacion de residuos de anclaje de HLA para proporcionar una respuesta inmunitaria mas fuerte a los antfgenos nativos asociados con tumores solidos, leucemias o linfomas.
Antecedentes de la invencion
El antfgeno asociado a tumor MUC-1, o DF-3/MUC-1, se expresa en exceso en la superficie celular de muchos adenocarcinomas humanos, tales como carcinoma de ovario, mama, pancreas, colorrectal y de prostata y neoplasias malignas hematologicas incluyendo el mieloma multiple y algunos linfomas no Hodgkin de celulas B. Mientras MUC-1 se expresa en algunos tejidos epiteliales normales en las superficies luminales, se ha demostrado que la localizacion apical de MUC-1 se pierde en los tejidos tumorales. Ademas, MUC-1 esta infra-glicosilada en los adenocarcinomas humanos en comparacion con los tejidos normales y por lo tanto los epftopos antigenicos de la protefna central estan mas expuestos. Tambien se ha demostrado que un alto nivel de expresion y secrecion de MUC-1 esta asociado con un mal pronostico y un alto potencial metastasico. Inicialmente se demostro que las celulas T citotoxicas no restringidas por el complejo de histocompatibilidad (MHC) podrfan establecerse a partir de sujetos con carcinoma de pancreas, cancer de ovario y mieloma multiple; se mostro que estas celulas T reconocfan el nucleo de la protefna MUC-1 en el numero variables de 20 aminoacidos de la region de repeticiones en tandem (VNTR)2. Si bien la region VNTR es inmunogenica para los CTL no restringidos por MHC asf como para la produccion de anticuerpos especfficos para MUC-1, se encuentra disponible una informacion relativamente limitada con respecto a la inmunogenicidad de la region fuera de la VNTR.
Brossart et al. (1999; Blood 93: 4309-4317) identifican dos epftopos de celulas T restringidos por HLA-A2 derivados de MUC-1 y sugieren el uso de los peptidos para el desarrollo de terapias de vacunacion basadas en celulas dendrfticas.
Heukamp et al. (2001; Int. J. Cancer 91: 385-392) identifican tres epftopos de celulas T restringidos por HLA-A*0201 no derivados de MUC-1 VNTR que inducen inmunidad antitumoral protectora en ratones transgenicos para HLA- A2/Kb.
El tratamiento actual de los canceres incluye la terapia de radiacion y la quimioterapia, que tienen efectos particularmente adversos en un sujeto sometido a este tipo de terapias.
En consecuencia, existe una necesidad de mejorar los tratamientos mas seguros que tienen efectos protectores de larga duracion para la prevencion y el tratamiento de tumores. En particular, existe una necesidad de tratamientos que sean mas especfficos y menos toxicos que los agentes terapeuticos actualmente disponibles.
Compendio de la invencion
De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se proporciona un polipeptido aislado de hasta 12 aminoacidos de longitud y que comprende la secuencia de aminoacidos de los SEQ iD NO: 1, 14, 15, 16, o 19.
Tambien se proporciona una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica uno o mas de los polipeptidos definidos anteriormente.
Se proporciona adicionalmente un vector de acido nucleico que comprende una o mas moleculas de acido nucleico definidas anteriormente, conectado operablemente a un promotor inducible.
La invencion tambien proporciona una celula anfitriona que comprende el vector definido anteriormente.
Tambien se proporciona el uso de la molecula de acido nucleico aislada que se ha definido anteriormente para la fabricacion de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria a un antfgeno tumoral MUC-1.
Se proporciona adicionalmente de acuerdo con la invencion el uso del vector de acido nucleico definido anteriormente para la fabricacion de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria a un antfgeno tumoral
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MUC-1.
La invencion proporciona adicionalmente una molecula de acido nucleico aislada como se define anteriormente para su uso en la generacion de una respuesta inmunitaria a un antfgeno tumoral MUC-1.
Tambien se proporciona el uso de uno o mas de los polipeptidos tal como se definen anteriormente para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece o es susceptible a un tumor MUC-1.
Se proporcionan adicionalmente uno o mas de los polipeptidos definidos anteriormente para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o es susceptible a un tumor MUC-1.
Ademas se proporciona el uso de celulas dendnticas de un sujeto que sufre cancer, para la fabricacion de un medicamento para tratar un tumor MUC-1,
en donde las celulas dendnticas se afslan de un sujeto que sufre cancer y se tratan con uno o mas de los polipeptidos definidos anteriormente antes de ser administradas al sujeto.
Tambien se proporcionan de acuerdo con la invencion celulas dendnticas de un sujeto que padece cancer para el uso en el tratamiento de un tumor MUC-1,
en donde las celulas dendnticas se afslan de un sujeto que padece cancer y se tratan con uno o mas de los polipeptidos definidos anteriormente antes de ser administradas al sujeto. Se proporciona adicionalmente el uso de uno o mas de los polipeptidos definidos anteriormente fusionados a un inmunogeno debil para la fabricacion de un medicamento para la generacion de una respuesta inmunitaria al inmunogeno debil.
Se proporcionan adicionalmente uno o mas de los polipeptidos definidos anteriormente fusionados a un inmunogeno debil para su uso en la generacion de una respuesta inmunitaria al inmunogeno debil.
La invencion proporciona adicionalmente el uso de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) para la
fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un tumor MUC-1,
en donde las PBMC se activan poniendo en contacto las PBMC con celulas dendnticas, y
en donde las celulas dendnticas se afslan de un sujeto que padece cancer y se tratan con uno o mas de los polipeptidos definidos anteriormente antes de que las PBMC activadas sean administradas al sujeto.
Tambien se proporcionan celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de un sujeto que padece cancer para su uso en el tratamiento de un tumor MUC-1,
en donde las PBMC se activan poniendo en contacto las PBMC con celulas dendnticas, y
en donde las celulas dendnticas se afslan de un sujeto que padece cancer y se tratan con uno o mas de los polipeptidos definidos anteriormente antes de que las PBMC activadas sean administradas al sujeto.
Otras caractensticas de la invencion se definen en las reivindicaciones adjuntas y se describen a continuacion.
La invencion describe la identificacion y caracterizacion de epftopos de linfocitos T citotoxicos (CTL) anti-tumorales. En particular, se describen los epftopos de CTL de MUC-1 en la region extracelular de la region de repeticiones terminales en tandem de numero no variable (VNTR) de MUC-1. La VNTR no es una region de MUC-1, que se sabe tradicionalmente que tienen epftopos inmunogenicos. La invencion tambien describe la generacion de epftopos agonistas potenciadores que generan una reaccion de las celulas inmunitarias mas fuerte que los peptidos nativos.
La invencion describe una molecula de acido nucleico aislada que codifica un anftgeno polipepftdico agonista derivado de un anftgeno tumoral, tal como, por ejemplo, MUC-1, en donde el polipeptido agonista estimula una respuesta inmunitaria mas fuerte en comparacion con un polipeptido nativo.
El polipeptido agonista se puede unir a moleculas HLA con una alta avidez en comparacion con los polipeptidos nativos. Preferiblemente, el polipeptido agonista tiene una constante de asociacion (Ka) superior para las moleculas HLA que un polipeptido nativo. Tambien preferiblemente, el polipeptido agonista tiene una constante de disociacion (Kd) inferior para moleculas HLA que un polipeptido nativo.
El polipeptido agonista de la invencion deriva de una region de repeticiones en tandem de numero no variable de MUC-1. El polipeptido agonista genera una respuesta inmunitaria.
En un aspecto de la invencion, la respuesta inmunitaria generada es una respuesta inmunitaria celular. Las respuestas inmunitarias celulares incluyen respuestas de celulas T citotoxicas, respuestas de celulas T auxiliares, y las respuestas inmunitarias de celulas B.
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La descripcion proporciona una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico correspondiente a (es decir, que puede codificar) cualquiera de las secuencias de aminoacidos identificadas por los SEQ ID NO: 1 a 19, fragmentos o variantes de los mismos. Los SEQ ID NO: 1 a 19 se identifican por:
SEQ ID NO (peptido)
Secuencia peptfdica Secuencia de nucleotidos SEQ ID NO (n.t.)
1
ATWGQDVTSV GCC/ACC/T GG/GGA/CAG/GAT/GT C/ACC/TCG/GTC 20
2
ALWGQDVTSV GCC/CTG/TGG/GGA/CAG/GAT/GT C/ACC/TCG/GTC 21
3
ALLVLVCVLV GCC/CTG/CTG/GT C/CTG/GTC/T GC/GTC/CTG/GT C 22
4
TISDVSVSDV ACC/AT C/TCG/GAT/GTC/TC G/GTC/TC G/GAT/GTC 23
5
ALAIVYLIAL GCC/CTG/GCC/AT C/GT C/T AC/CT G/AT C/GCC/CT G 24
6
VLVALAIVYL GTC/CTG/GTC/GCC/CT G/GCC/AT C/GTC/TAC/CTG 25
7
YLIALAVCQC T AC/CTG/AT C/GCC/CTG/GCC/GTC/T GC/AAC/TGC 26
8
WGQDVTSVPV T GG/GGA/CAG/GAT/GTC/AC C/TCG/GT C/ACC/GT C 27
9
REGTINVHDV AGA/GAA/GGT/ACC/AT C/AAC/GT C/CAC/GAT/GTC 28
10
GTQSPFFLLL GGC/ACC/CAG/TCT/AAC/TT C/TT C/CT G/CTG/CT G 29
11
LAFREGTINV CT G/GCC/TT C/AGA/GAA/GGT/ACC/AT C/AAC/GT C 30
12
TLASHSTKTD ACT/CTG/GCC/TCG/CAC/TCG/ACC/AAG/ACC/GAT 31
13
LQRDISEMFL CT G/AAC/AGA/GAT/AT C/TCG/GAA/AT G/TT C/CTG 32
14
AIWGQDVTSV GCC/ACT/T GG/GGA/CAG/GAT/GT C/ACC/T CG/GTC 33
15
ALWGQDVTSL GCC/CTG/TGG/GGA/CAG/GAT/GT C/ACC/TCG/CTG 34
16
AMWGQDVTS V GCC/ATG/TGG/GGA/CAG/GAT/GTC/ACC/TCG/GTC 35
17
AMWGQDVTSL GCC/ATG/TGG/GGA/CAG/GAT/GT C/ACC/TCG/CTG 36
18
AIWGQDVTSL GCC/ACT/TGG/GGA/CAG/GAT/GTC/ACC/TCG/CTG 37
19
ALWGQDVTSV
El vector de la invencion puede comprender moleculas de acido nucleico que codifican moleculas co-estimuladoras de celulas inmunitarias, tales como por ejemplo, B7-1, ICAM-1 y LFA-331.
La descripcion proporciona la transduccion de celulas dendrfticas con un vector que comprende cualquiera de las moleculas identificadas por los SEQ ID NO: 1 a 19, los fragmentos o variantes de los mismos, y opcionalmente, las moleculas co-estimuladoras de celulas inmunitarias, tales como por ejemplo, B7-1, ICAM-1 y LFA-3.35.
Las celulas dendrfticas transducidas con el vector que comprende cualquiera de las moleculas identificadas por los SEQ ID NO: 1 a 19, fragmentos o variantes de los mismos, y opcionalmente, las moleculas co-estimuladoras de celulas inmunitarias, puede generar una respuesta inmunitaria, tal como la activacion de una respuesta de celulas T citotoxicas.
La descripcion proporciona un vector de acido nucleico que comprende una o mas secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos como los identificados por cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 19, fragmentos o variantes de los mismos, conectado operablemente a un promotor inducible.
El vector de acido nucleico puede ser un vector viral, un plasmido y similares. El vector de acido nucleico puede comprender un promotor inducible que es especffico del tejido, y, opcionalmente, moleculas co-estimuladoras de celulas inmunitarias.
La celula anfitriona de la invencion puede ser una celula presentadora de antfgeno, tal como por ejemplo, un monocito/macrofago, celula dendrftica o similares.
En un aspecto de la invencion, el polipeptido comprende el fragmento de union a HLA del SEQ ID NO: 19.
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En otro aspecto de la invencion, el inmunogeno debil es un antfgeno de diferenciacion, o un antfgeno tumoral.
En otra realizacion preferida, el fragmento de union a HLA del SEQ ID NO: 19 se fusiona a un antfgeno carcinoembrionario, un antfgeno tumoral, un auto-antfgeno, un antfgeno viral y similares.
En un aspecto de la invencion, el polipeptido comprende el SEQ ID NO: 19. Preferiblemente, el polipeptido se une a moleculas HLA con una alta avidez y tiene una constante de asociacion (Ka) superior para el HLA que un polipeptido nativo y/o una constante de disociacion (Kd) inferior para el HLA que un polipeptido nativo.
En otro aspecto de la invencion, la presentacion de antfgenos, por las celulas presentadoras de antfgenos de los polipeptidos induce una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta inmunitaria celular. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria celular es una respuesta de las celulas T citotoxicas, una respuesta de las celulas T auxiliares, o una respuesta inmunitaria de celulas B.
Se describen otros aspectos de la invencion mas abajo.
Breve descripcion de las figuras
Las Figuras 1A y 1B son graficos que muestran la union del peptido P-92 de MUC-1 y los agonistas P-93L y P-93I a la molecula HLA-A2. La Figura 1A es un grafico que muestra el uso de los peptidos a concentraciones de 0-50 pg/ml. La Figura 1B es un grafico que muestra el uso de los peptidos a concentraciones de 0-12,5 pg/ml. peptido P92 de MUC-1 (cuadrado abierto), P-93L (cuadrado cerrado), P-93I (triangulo cerrado). Los resultados se expresan en intensidad media de fluorescencia (IMF).
La Figura 2 es un grafico que muestra la comparacion de la estabilidad del complejo del peptido P-92, P-93L o P-93I con HLA-A2. Se incubaron celulas T2 durante la noche con peptido P-92 (cuadrado abierto), P-93L (cuadrado cerrado) o P-93I (triangulo cerrado) a una concentracion de 50 pg/ml y despues se elimino el peptido no unido y se incubaron con brefeldina-A para bloquear el suministro de nuevas moleculas de clase I a la superficie celular. En los tiempos indicados, las celulas se tineron para determinar la presencia de complejos peptido de superficie-HLA-A2. Los resultados se expresan en porcentaje relativo de union en comparacion con el 100% a tiempo 0.
La Figura 3 es un grafico que muestra la capacidad de las celulas B autologas pulsadas con peptido P-92 (cuadrado abierto), peptido P-93L (cuadrado cerrado) y peptido P-93I (triangulo cerrado) de MUC-1 nativa para inducir la produccion de IFN-y por las celulas T especfficas de MUC-1. Los peptidos se utilizaron a concentraciones de 0-6,25 pg/ml. Los resultados se expresan en pg/ml.
La Figura 4 es un grafico que muestra la citotoxicidad de las lfneas de celulas T especfficas de MUC-1 contra las celulas C1R-A2 pulsadas con peptido P-92 y P-93L. T-1191-P-93L contra C1R-A2 pulsadas con peptido P-93L (cuadrado cerrado), T-1191-P-93L contra C1R-A2 pulsadas con peptido P-92 (cuadrado abierto), T-1191-P-93L contra C1R-A2 pulsadas con peptido CAP1-6D (cfrculo cerrado), T-1191-P-92 contra C1R-A2 pulsadas con peptido P-93L (triangulo cerrado), T-1191-P-92 contra C1R-A2 pulsadas con peptido P-92 (triangulo abierto), T-1191-P-92 contra C1R-A2 pulsadas con peptido CAP1-6D (cfrculo abierto). Razon E:T = 25:1 y 12,5:1 en un analisis de liberacion de In111 de 16 h. Barras = DT.
La Figura 5 muestra una representacion esquematica de ciertos constructos virales.
La Figura 6 es una representacion grafica de un analisis de citometrfa de flujo de la expresion de marcadores de superficie sobre DC (por sus siglas en ingles) humanas sin infectar, infectadas con el vector de control (V-WT), o infectadas con rV-CEA/MUC/TRICOM. Las dC (1 x 106) se incubaron en 1 ml de medio Opti-MEM a 37°C con rV- CEA/MUC/TRICOM o vector de control (V-WT) durante 1 hora, a una MOI de 5:1. Las DC infectadas se suspendieron en 10 ml de medio completo templado, de nueva aportacion que contenfa 100 ng/ml de rhGM-CSF y 20 ng/ml de rhIL-4, y despues se cultivaron durante 24 horas. Los numeros en cada histograma indican el porcentaje de celulas positivas y la intensidad media de fluorescencia (entre parentesis).
La Figura 7 es una representacion grafica de un analisis de citometrfa de flujo de la expresion de marcadores de superficie sobre las DC humanas sin infectar, infectadas con el vector de control (FP-WT), o infectadas con rF- CEA/MUC/TRICOM. Las DC (1 x 106) se incubaron en 1 ml de medio Opti-MEM a 37°C con rF-CEA/MUC/TRICOM o vector de control (FP-WT) durante 2 horas, a una MOI de 40:1. Las DC infectadas se suspendieron en 10 ml de medio completo templado de nueva aportacion que contenfa 100 ng/ml de rhGM-CSF y 20 ng/ml de rhIL-4, y luego se cultivaron durante 24 h. Los numeros en cada histograma indican el porcentaje de celulas positivas y la intensidad media de fluorescencia (entre parentesis).
La figura 8 muestra un analisis de inmunotransferencia de CD humanas no infectadas o infectadas con rF- CEATRICOM, rF-MUC-1-TRICOM, rF-CEA/MUC/TRICOM y rV-CEA/MUC/TRICOM. Los anticuerpos monoclonales COL-1 y DF-3 fueron utilizados para la deteccion de CEA y MUC- 1, respectivamente.
La Figura 9 es la secuencia de nucleotidos del vector wMUC-1(6) (SEQ ID NO: 41).
La Figura 10 es la secuencia de aminoacidos de wMUC-1(6) (SEQ ID NO: 42).
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Descripcion detallada de la invencion
Los autores de la presente invencion describen en la presente memoria, entre otros, la identificacion de nuevos epftopos HLA-A2 de clase I de MUC-1 que residen fuera de la region de repeticiones en tandem de numero variable (VNTR) que son importantes para las terapias inmunologicas en el tratamiento del cancer. Los autores de la presente invencion han demostrado la capacidad de estos epftopos para activar las celulas T humanas medida por la produccion de IFN-y. En particular, un epftopo, ATWGQDVTSV (SEQ ID NO: 1), en la posicion de aminoacidos 92-101 y denominada P-92), demostro el nivel mas alto de union de HLA-A2 y que inducfa el mayor nivel de IFN-y en celulas T humanas. La invencion proporciona tambien la generacion de epftopos agonistas potenciadores, identificados por el epftopo, ALWGQDvTsV, (SEQ ID NO: 19; denominado P-93L).
Practicamente todos los tumores expresan multiples antfgenos asociados a tumores y la gran mayorfa de ellos se expresan de forma heterogenea en masas tumorales. Se ha demostrado que esto es atribuible a la heterogeneidad antigenica inherente, los factores ambientales en el medio del tumor tales como la configuracion espacial, o la deriva antigenica debida a la intervencion terapeutica. Por lo tanto, las vacunas que expresan transgenes multiples pueden tambien ayudar a aliviar este obstaculo de la heterogeneidad antigenica. El CEA (por sus siglas en ingles) se expresa en la inmensa mayorfa de los tumores colorrectales, pancreaticos, y gastricos, y en aproximadamente 70% de los canceres de pulmon de celulas no pequenas, 50% de los canceres de mama, asf como otros tipos de tumores tales como el carcinoma de cabeza y cuello y los subconjuntos de carcinoma de ovario (Thompson JA, Grunert F, Zimmermann, W. Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinical perspectives. J Clin Lab Anal 1991;5:344-66; y Robbins PF, Eggensperger D, Qi CF, Schlom J. Definition of the expression of the human carcinoembryonic antigen and non-specific cross-reacting antigen in human breast and lung carcinomas. Int J Cancer 1993;53:892-7). La MUC-1, por otro lado, se expresa en exceso en la inmensa mayorfa de los canceres colorrectales, pancreaticos, de mama y de ovario, asf como otros tipos de carcinoma (Kufe D, Inghirami G, Abe M. Differential reactivity of a novel monoclonal antibody (DF3) with human malignant versus benign breast tumors. Hybridoma 1984;3:223-32; Burchell J, Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, et al. Development and characterization of breast cancer reactive monoclonal antibodies directed to the core protein of the human milk mucin. Cancer Res 1987;47: 5476-82; Zotter S, Hageman PC, Lossnitzer A, Mooi WJ, Hilgers J. Tissue and tumor distribution of human polymorphic epithelial mucin. Cancer Rev 1988;11-12: 55-101; Kotera Y, Fontenot JD, Pcher G, Metzgar RS, Finn OJ. Humoral immunity against a tandem repeat epitope of human mucin MUC-1 in sera from breast, pancreatic, and colon cancer patients. Cancer Res 1994;54:2856-60; and Goydos JS, Eler E, Whiteside TL, Finn OJ, Lotze MT. A phase I trial of a synthetic mucin peptide vaccine. Induction of specific immune reactivity in patients with adenocarcinoma. J Surg Res 1996;63:298-304). Por lo tanto, el direccionamiento, ya sea individual ya sea de multiples dianas, de estos dos antfgenos puede resultar ventajoso para aquellos tipos de cancer que expresan ambos antfgenos.
Las siguientes definiciones de ciertos terminos que se utilizan en la presente, se exponen a continuacion.
Segun se utiliza en la presente memoria, "molecula" se utiliza genericamente para abarcar cualquier vector, anticuerpo, protefna, farmaco y similares, que se utilizan en la terapia y se puede detectar en un sujeto por los metodos de la invencion. Por ejemplo, multiples tipos diferentes de vectores de suministro de acido nucleico que codifican diferentes tipos de genes que pueden actuar conjuntamente para promover un efecto terapeutico, o para aumentar la eficacia o la selectividad de la transferencia de genes y/o la expresion genica en una celula. El vector de suministro de acido nucleico se puede proporcionar en forma de acidos nucleicos desnudos o en un vehfculo de suministro asociado con una o mas moleculas para facilitar la entrada de un acido nucleico en una celula. Los vehfculos de suministro adecuados incluyen, pero no se limitan a: formulaciones liposomales, polipeptidos; polisacaridos; lipopolisacaridos, formulaciones virales (p. ej., incluyendo virus, partfculas virales, envolturas virales artificiales y similares), vehfculos de suministro de celulas, y similares.
Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "administrar una molecula a una celula" (p. ej., un vector de expresion, acido nucleico, citoquinas, un vehfculo de suministro, un agente, y similares) se refiere a la transduccion, transfeccion, microinyeccion, electroporacion, o disparo, a las celulas con la molecula. En algunos aspectos, las moleculas se introducen en una celula diana poniendo en contacto la celula diana con una celula de suministro (p. ej., mediante fusion celular o mediante lisis de la celula de suministro cuando esta en la proximidad de la celula diana).
El termino "o" puede ser inclusivo o exclusivo.
A "modificacion genetica" se refiere a cualquier adicion, delecion o interrupcion en los nucleotidos normales de una celula. Cualquier metodo que puede lograr la modificacion genetica de las APC esta dentro del espfritu y alcance de esta invencion. Los metodos reconocidos en la tecnica incluyen la transferencia genica mediada por virus, la transferencia mediada por liposomas, la transformacion, la transfeccion y la transduccion.
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Los terminos "molecula de acido nucleico" o "polinucleotido" se utilizaran indistintamente en toda la memoria descriptiva, a menos que se especifique lo contrario. Segun se utiliza en la presente memoria, "molecula de acido nucleico" se refiere a la forma polimerica de ester fosfato de ribonucleosidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moleculas de ARN") o desoxirribonucleosidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina, o desoxicitidina; "moleculas de ADN"), o cualquiera de los analogos de fosfoester de los mismos, tales como fosforotioatos y tioesteres, ya sea en forma de hebra sencilla o de helice de doble hebra. Son posibles helices de doble cadena ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. El termino molecula de acido nucleico, y en particular molecula de ADN o ARN, se refiere solo a la estructura primaria y secundaria de la molecula, y no la limita a ninguna forma terciaria en particular. Por lo tanto, este termino incluye ADN de doble hebra encontrado, entre otras, en moleculas de ADN lineal o circular (p. ej., fragmentos de restriccion), plasmidos y cromosomas. Al comentar la estructura de moleculas de ADN de doble hebra particulares, las secuencias pueden describirse en la presente memoria de acuerdo con la convencion normal de proporcionar solo la secuencia en la direccion 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de ADN (es decir, la hebra que tiene una secuencia homologa al ARNm). Una "molecula de ADN recombinante" es una molecula de ADN que ha sufrido una manipulacion biologica molecular.
Hay que senalar que, segun se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a "una celula anfitriona" incluye una pluralidad de tales celulas anfitrionas, la referencia al "anticuerpo" es una referencia a uno o mas anticuerpos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la tecnica, y asf sucesivamente.
Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "fragmento o segmento", aplicado a una secuencia de acido nucleico, gen o polipeptido, normalmente tendra una longitud de al menos aproximadamente 5 bases de acido nucleico (para la secuencia de acido nucleico o gen) o aminoacidos (para los polipeptidos) contiguos, tfpicamente al menos aproximadamente 10 bases de acido nucleico o aminoacidos contiguos, mas tfpicamente al menos aproximadamente 20 bases de acido nucleico o aminoacidos contiguos, habitualmente al menos aproximadamente 30 bases de acido nucleico o aminoacidos contiguos, preferiblemente al menos aproximadamente 40 bases de acidos nucleicos o aminoacidos contiguos, mas preferiblemente al menos aproximadamente 50 bases de acido nucleico o aminoacidos contiguos, e incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 60 a 80 o mas bases de acido nucleico o aminoacidos contiguos. "Fragmentos solapantes", segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a fragmentos de acidos nucleicos o peptidos contiguos que comienzan en el extremo amino terminal de un acido nucleico o protefna y terminan en el extremo terminal carboxi del acido nucleico o protefna. Cada fragmento de acido nucleico o peptido tiene al menos aproximadamente una posicion de acido nucleico o aminoacido contigua en comun con el siguiente fragmento de acido nucleico o peptido, mas preferiblemente al menos aproximadamente tres posiciones de bases de acido nucleico o aminoacidos contiguas, lo mas preferiblemente al menos aproximadamente diez posiciones de bases de acidos nucleicos o aminoacidos contiguas en comun.
Un "fragmento" significativo en un contexto de acido nucleico es un segmento contiguo de al menos aproximadamente 17 nucleotidos, generalmente al menos 20 nucleotidos, mas generalmente al menos 23 nucleotidos, comunmente al menos 26 nucleotidos, mas comunmente al menos 29 nucleotidos, a menudo al menos 32 nucleotidos, mas a menudo al menos 35 nucleotidos, tfpicamente al menos 38 nucleotidos, mas tfpicamente al menos 41 nucleotidos, normalmente al menos 44 nucleotidos, mas normalmente al menos 47 nucleotidos, preferiblemente al menos 50 nucleotidos, mas preferiblemente al menos 53 nucleotidos, y en realizaciones particularmente preferidas seran al menos 56 o mas nucleotidos.
Un "vector" es una composicion que puede transducir, transfectar, transformar o infectar una celula, haciendo de ese modo que la celula exprese acidos nucleicos y/o protefnas distintos de los nativos de la celula, o de una manera que no es nativa para la celula. Una celula es "transducida" por un acido nucleico cuando el acido nucleico se transloca a la celula desde el entorno extracelular. Se puede utilizar cualquier metodo de transferencia de un acido nucleico a la celula; el termino, a menos que se indique lo contrario, no implica ningun metodo particular de suministro de un acido nucleico a una celula. Una celula es "transformada" por un acido nucleico cuando el acido nucleico es transducido a la celula y replica de manera estable. Un vector incluye un acido nucleico (generalmente ARN o ADN) que va a ser expresado por la celula. Un vector incluye opcionalmente materiales que contribuyan a conseguir la entrada del acido nucleico en la celula, tal como una partfcula viral, un liposoma, un recubrimiento de protefna o similar. Un "vector de transduccion celular" es un vector que codifica un acido nucleico susceptible de replicacion estable y de expresion en una celula una vez que el acido nucleico se transduce a la celula.
"Secuencia reguladora de la transcripcion" es un termino generico utilizado en toda la memoria descriptiva para referirse a secuencias de ADN, tales como senales de inicio, potenciadores, promotores, elementos de silenciamiento, que inducen, inhiben o controlan la transcripcion de secuencias codificantes de protefnas con las que estan unidas operablemente.
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Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "aguas abajo", cuando se utiliza en referenda a una direccion a lo largo de una secuencia de nucleotidos significa en la direccion del extremo 5' al extremo 3'. Del mismo modo, el termino "aguas arriba" significa en la direccion desde el 3' al extremo 5'.
Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "gen" representa el gen y todas las variantes conocidas en la actualidad del mismos y cualquier variante posterior que pudiera ser dilucidada.
El termino "variante", cuando se utiliza en el contexto de una secuencia de polinucleotidos, puede abarcar una secuencia de polinucleotidos relacionada con un gen de tipo salvaje. Esta definicion tambien puede incluir, por ejemplo, variantes "alelicas", "de corte y empalme", "de especie", o "polimorficas". Una variante de corte y empalme puede tener una identidad significativa con una molecula de referencia, pero en general tendra un numero mayor o menor de polinucleotidos debido al corte y empalme alternativo de los exones durante el procesamiento del ARNm. El polipeptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o ausencia de dominios. Las variantes de especie son secuencias de polinucleotidos que varfan de una especie a otra. Tienen una utilidad particular en la invencion las variantes de genes diana de tipo salvaje. Las variantes pueden ser el resultado de al menos una mutacion en la secuencia de acido nucleico y pueden dar como resultado ARNm alterados o polipeptidos cuya estructura o funcion puede o no puede estar alteradas. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas formas alelicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleotidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede ocurrir solo o combinado con los otros, una o mas veces en una secuencia dada.
Segun se utiliza en la presente memoria, "variante" de polipeptidos se refiere a una secuencia de aminoacidos que es alterada por uno o mas residuos de aminoacidos. La variante puede tener cambios "conservativos", en donde un aminoacido sustituido tiene propiedades estructurales o qufmicas similares (p. ej., sustitucion de leucina por isoleucina). Mas raramente, una variante puede tener cambios "no conservativos" (p. ej., la sustitucion de glicina por triptofano). Las variaciones minoritarias analogas tambien pueden incluir deleciones o inserciones de aminoacidos, o ambas cosas. La orientacion en la determinacion de que residuos de aminoacidos puede ser sustituidos, insertados o eliminados sin abolir la actividad biologica se pueden encontrar utilizando programas informaticos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, el soporte logico LAsErGENE (DNASTAR).
Los polipeptidos resultantes tendran generalmente una identidad de aminoacidos significativa entre si. Una variante polimorfica es una variacion en la secuencia de polinucleotidos de un gen particular entre los sujetos de una especie dada. Las variantes polimorficas tambien pueden abarcar "polimorfismos de un solo nucleotido" (SNP",) o mutaciones de una sola base en las que la secuencia de polinucleotidos varfa en una base.
Los terminos "complementario" o "complementos" se utilizan indistintamente de principio a fin y significa que dos secuencias son complementarias cuando la secuencia de uno se puede unir a la secuencia del otro en un sentido anti-paralelo en donde el extremo 3' de cada secuencia se une al extremo 5' de la otra secuencia y cada A, T(U), G, y C de una secuencia se alinea con una T(U), A, C, y G, respectivamente, de la otra secuencia. Normalmente, la secuencia complementaria del oligonucleotido tiene al menos 80% o 90%, preferiblemente 95%, lo mas preferiblemente 100%, de complementariedad con una secuencia definida. Preferiblemente, los alelos o variantes de las mismas pueden ser identificados. Tambien se puede emplear un programa BLAST para evaluar dicha identidad de secuencia.
El termino "secuencia complementaria" que se refiere a una secuencia de polinucleotidos, se refiere a la secuencia de bases en otra molecula de acido nucleico por las reglas de emparejamiento de bases. Mas particularmente, el termino o un termino similar se refiere a la hibridacion o emparejamiento de bases entre los nucleotidos o acidos nucleicos, tales como, por ejemplo, entre las dos hebras de una molecula de ADN de doble hebra o entre un cebador oligonucleotfdico y un sitio de union al cebador en un acido nucleico de hebra sencilla que se vaya a secuenciar o amplificar. Los nucleotidos complementarios son, en general, A y T (o A y U), o C y G. Se dice que dos moleculas de aRn o ADN de hebra sencilla son sustancialmente complementarias cuando los nucleotidos de una hebra, optimamente alineados y comparados y con inserciones o deleciones de nucleotidos apropiadas, se emparejan con al menos aproximadamente 95% de los nucleotidos de la otra hebra, por lo general al menos aproximadamente 98%, y mas preferiblemente de aproximadamente 99% a aproximadamente 100%. Las secuencias de polinucleotidos complementarias pueden ser identificadas por una variedad de enfoques incluyendo el uso de algoritmos informaticos y soporte logico bien conocidos, por ejemplo el programa BLAST.
El termino "identidad de secuencia sustancial", cuando se utiliza en relacion con secuencias de peptidos/aminoacidos, se refiere a secuencias de peptidos/aminoacidos, que son sustancialmente identicas o similares en secuencia, dando lugar a una identidad de secuencia en la conformacion y por lo tanto a una actividad biologica similar. No se pretende que el termino implique una evolucion comun de las secuencias.
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Tfpicamente, las secuencias de peptidos/aminoacidos que tienen una "identidad de secuencia sustancial" son secuencias que tienen una identidad de secuencia de al menos 50%, mas preferiblemente al menos 80%, al menos en algunas de las regiones que se sabe que estan involucradas en la actividad deseada. Lo mas preferiblemente, no mas de cinco residuos, con excepcion de los extremos, son diferentes. Preferiblemente, la divergencia en la secuencia, al menos en las regiones mencionadas anteriormente, es en forma de "modificaciones conservativas".
Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias de peptidos/aminoacidos o de dos secuencias de acidos nucleicos, las secuencias se alinean para una comparacion optima (p. ej., pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos para una alineacion optima y las secuencias no homologas pueden no tenerse en cuenta a efectos de comparacion). Por ejemplo, la longitud de una secuencia de referencia alineada para su comparacion es al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, mas preferiblemente al menos 50%, incluso mas preferiblemente al menos 60%, e incluso mas preferiblemente al menos 70%, 80 %, o 90% de la longitud de la secuencia de referencia (p. ej., cuando se alinea una segunda secuencia a la primera secuencia de aminoacidos que tiene por ejemplo 100 residuos de aminoacido, al menos 30, preferiblemente al menos 40, mas preferiblemente al menos 50, incluso mas preferiblemente al menos 60, e incluso mas preferiblemente al menos 70, 80 o 90 residuos de aminoacido estan alineados). Los residuos de aminoacido o nucleotidos en las posiciones de aminoacidos o las posiciones de nucleotidos correspondientes se comparan a continuacion. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo residuo de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, en ese caso las moleculas son identicas en esa posicion (segun se utiliza en la presente memoria la "identidad" de aminoacidos o acidos nucleicos es equivalente a la "identidad de secuencia" de aminoacidos o de acidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, que han de ser introducidos para el alineamiento optimo de las dos secuencias.
Los terminos "protefna" y "polipeptido" se utilizan indistintamente en la presente memoria. El termino "peptido" se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a una cadena de dos o mas aminoacidos o analogos de aminoacidos (incluyendo los aminoacidos no naturales), con los aminoacidos adyacentes unidos enlaces peptfdicos (-NHCO-). Por lo tanto, los peptidos de la invencion incluyen oligopeptidos, polipeptidos, protefnas, mimotopos y peptidomimeticos. Los metodos para preparar mimotopos y peptidomimeticos se conocen en la tecnica.
Los terminos "mimotopo" y "peptidomimetico" se usan indistintamente en la presente memoria. Un "mimotopo" de un compuesto X se refiere a un compuesto en el que las estructuras qufmicas de X necesarias para la actividad funcional de X se han sustituido por otras estructuras qufmicas que imitan la conformacion de X. Los ejemplos de peptidomimeticos incluyen compuestos peptfdicos en los que la cadena principal del peptido esta sustituida con una o mas moleculas de benzodiazepina (vease p. ej., James, G. L. et al. (1993) Science 260:1937-1942) y peptidos "retro-inversos" (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 4.522.752 de Sisto). Los terminos "mimotopo" y "peptidomimetico" tambien se refieren a un radical, distinto de un aminoacido de origen natural, que sirve conformacionalmente y funcionalmente como un sustituto de un aminoacido particular en un compuesto que contiene el peptido sin interferir negativamente en un grado significativo en la funcion del peptido. Los ejemplos de los mimeticos de aminoacidos incluyen los D-aminoacidos. Los peptidos sustituidos con uno o mas D-aminoacidos se pueden preparar utilizando procedimientos de sfntesis de peptidos bien conocidas. Las sustituciones adicionales incluyen analogos de aminoacidos que tienen cadenas laterales variantes con grupos funcionales, por ejemplo, b- cianoalanina, canavanina, acido djenkolico, norleucina, 3-fosfoserina, homoserina, dihidroxifenilalanina, 5- hidroxitriptofano, 1 -metilhistidina, o 3-metilhistidina.
Segun se utiliza en la presente memoria un "analogo" de un compuesto X se refiere a un compuesto que conserva las estructuras qufmicas de X necesarias para la actividad funcional de X, incluso que tambien contiene ciertas estructuras qufmicas que difieren de X. Un ejemplo de un analogo de un peptido de origen natural es un peptido que incluye uno o mas aminoacidos de origen no natural. Tambien se pretende que el termino "analogo" incluya mimotopos y/o peptidomimeticos modificados, peptidos y polipeptidos modificados, y variantes alelicas de peptidos y polipeptidos. Los analogos de un peptido por lo tanto produciran un analogo de peptido que sea sustancialmente homologo o, en otras palabras, tiene una identidad de secuencia sustancial con el peptido original. El termino "aminoacido" incluye su significado reconocido en la tecnica. Los aminoacidos preferidos incluyen los aminoacidos de origen natural, asf como derivados sinteticos, y los aminoacidos derivados de protefnas, p. ej., protefnas tales como casefna, es decir, casaminoacidos, o productos de digestion enzimatica o qufmica, p. ej., de levadura, un producto animal, p. ej., un producto digerido de carne, o un producto de planta, p. ej., protefna de soja, protefna de semilla de algodon, o aguas de infusion de mafz (vease, p. ej., Traders' Guide to Fermentation Media, Traders Protein, Memphis, TN (1988), Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1989), and Product Data Sheet for Corn Steep Liquor, Grain Processing Corp., IO).
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Los polipeptidos recombinantes de la presente invencion se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica a partir de celulas anfitrionas modificadas geneticamente que comprenden sistemas de expresion. En consecuencia, en un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a sistemas de expresion que comprenden un polinucleotido o polinucleotidos de la presente invencion, a celulas anfitrionas que estan modificadas por ingenierfa genetica con tales sistemas de expresion y a la produccion de polipeptidos de la invencion mediante tecnicas recombinantes. Los sistemas de traduccion libres de celulas tambien se pueden emplear para producir tales protefnas utilizando derivados de ARN de los constructos de ADN de la presente invencion.
Para la produccion recombinante, las celulas anfitrionas pueden ser modificadas geneticamente para incorporar sistemas de expresion o porciones de los mismos para los polinucleotidos de la presente invencion. La introduccion de polinucleotidos en celulas anfitrionas se puede efectuar mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Tales metodos preferidos incluyen, por ejemplo, la transfeccion con fosfato de calcio, la transfeccion mediada por DEAE-dextrano, la transveccion, la microinyeccion, la transfeccion mediada por lfpidos cationicos, la electroporacion, la transduccion, la carga por legrado, la introduccion balfstica o la infeccion.
Un componente "heterologo" se refiere a un componente que se introduce en o se produce dentro de una entidad diferente de aquella en la que se encuentra de forma natural. Por ejemplo, un polinucleotido derivado de un organismo e introducido por tecnicas de ingenierfa genetica en un organismo diferente es un polinucleotido heterologo que si se expresa puede codificar un polipeptido heterologo. Del mismo modo, un promotor o potenciador que se retira de su secuencia codificante nativa y se une operablemente a una secuencia de codificacion diferente es un promotor o potenciador heterologo. Una posible terminologfa alternativa incluye "foraneo" o "exogeno". Una secuencia de nucleotidos heterologa puede codificar una secuencia de aminoacidos, es decir, un peptido o un polipeptido.
Un "promotor', segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de polinucleotidos que controla la transcripcion de un gen o secuencia codificante a la que esta ligado operablemente. Se conoce en la tecnica un gran numero de promotores, incluyendo promotores constitutivos, inducibles y reprimibles, de una variedad de fuentes diferentes, y se encuentra disponible como o dentro de secuencias de polinucleotidos clonados (de, p. ej., depositos tales como la ATCC, asf como otras fuentes comerciales o de sujetos).
Un "potenciador", segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de polinucleotidos que potencia la transcripcion de un gen o una secuencia codificante a los que esta conectado operablemente. Es bien conocido en la tecnica un gran numero de potenciadores, de una variedad de fuentes diferentes y esta disponible como o dentro de secuencias de polinucleotidos clonados (de, p. ej., depositos tales como la ATCc, asf como de otras fuentes comerciales o de sujetos). Una serie de polinucleotidos que comprenden secuencias promotoras (tales como el promotor de CMV utilizado comunmente) tambien comprenden secuencias potenciadoras.
"Conectado operablemente" se refiere a una yuxtaposicion, en donde los componentes asf descritos estan en una relacion que les permite funcionar de la manera pretendida. Un promotor esta unido operablemente a una secuencia codificante si el promotor controla la transcripcion de la secuencia codificante. Aunque un promotor conectado operablemente generalmente se encuentra aguas arriba de la secuencia codificante, no es necesariamente contiguo a la misma. Un potenciador esta conectado operablemente a una secuencia codificante si el potenciador incrementa la transcripcion de la secuencia codificante. Los potenciadores conectados operablemente pueden estar situados aguas arriba, dentro o aguas abajo de las secuencias codificantes. Una secuencia de poliadenilacion esta conectada operablemente a una secuencia codificante si esta situada en el extremo aguas abajo de la secuencia codificante de tal manera que la transcripcion prosigue a traves de la secuencia codificante hacia la secuencia de poliadenilacion.
"Suministro de genes", "transferencia de genes", y similares segun se utiliza en la presente memoria, son terminos que se refieren a la introduccion de un polinucleotido exogeno (a veces referidos como "transgenes") en una celula anfitriona, independientemente del metodo utilizado para la introduccion. Tales metodos incluyen una variedad de tecnicas bien conocidas tales como la transferencia de genes mediada por vectores (mediante, p. ej., infeccion/transfeccion viral, u otros varios complejos de suministro de genes basados en protefnas o basados en lfpidos), asf como tecnicas que facilitan el suministro de polinucleotidos "desnudos" (tales como la electroporacion, el suministro con "pistola de genes" y otras diversas tecnicas utilizadas para la introduccion de polinucleotidos). El polinucleotido introducido se puede mantener de manera estable o transitoria en la celula anfitriona. El mantenimiento estable requiere tfpicamente que el polinucleotido introducido contenga un origen de replicacion compatible con la celula anfitriona o se integre en un replicon de la celula anfitriona, tal como un replicon extracromosomico (p. ej., un plasmido) o un cromosoma nuclear o mitocondrial. Se conocen numerosos vectores que son capaces de mediar la transferencia de genes a celulas de mamffero, como se conoce en la tecnica y se describe en la presente memoria.
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Segun se utiliza en la presente memoria, una "celula diana" o "celula receptora" se refiere a una celula objeto o celula que se desea que sea, o haya sido, un receptor de moleculas exogenas de acido nucleico, polinucleotidos y/o protefnas. Tambien se pretende que el termino incluya la progenie de una unica celula.
Suministro de genes, transferencia genica, terapia genica "in vivo" y similares, segun se utilizan en la presente memoria, son terminos que se refieren a la introduccion de un vector que comprende un polinucleotido exogeno directamente en el cuerpo de un organismo, tal como un ser humano o un mamffero no humano, por medio de los cuales el polinucleotido exogeno se introduce en una celula de semejante organismo in vivo.
Una celula es "transducida" por un acido nucleico cuando el acido nucleico se transloca a la celula desde el entrono extracelular. Se puede utilizar cualquier metodo de transferencia de un acido nucleico a la celula; el termino, a menos que se indique lo contrario, no implica ningun metodo particular de suministro de un acido nucleico a una celula. Una celula es "transformada" por un acido nucleico cuando el acido nucleico es transducido a la celula y replica de manera estable. Un vector incluye un acido nucleico (generalmente ARN o ADN) que va a ser expresado por la celula. Un vector incluye opcionalmente materiales que contribuyan a conseguir la entrada del acido nucleico en la celula, tal como una partfcula viral, liposoma, recubrimiento de protefna o similar. Un "vector de transduccion celular" es un vector que codifica un acido nucleico susceptible de replicacion estable y de expresion en una celula una vez que el acido nucleico se transduce a la celula.
Segun se utiliza en la presente memoria, "recombinacion homologa" se refiere a que una secuencia de nucleotidos en un vector es homologa a una secuencia de nucleotidos en otro vector. El uso de enzimas de restriccion para cortar las dos secuencias y la ligacion de las dos secuencias da como resultado dos vectores que se combinan. Tfpicamente, se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (en los extremos tanto 5' como 3') (vease, p. ej., Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripcion de vectores de recombinacion homologa).
Las secuencias de acido nucleico homologas, cuando se comparan, muestran una identidad o similitud de secuencia significativas. Las normas para la identidad de secuencia en los acidos nucleicos son medidas para la identidad de secuencia generalmente utilizadas en la tecnica mediante comparacion de secuencias o basandose en las condiciones de hibridacion. Las condiciones de hibridacion se describen con mayor detalle a continuacion.
La homologfa de secuencia y la identidad de secuencia se utilizan de manera indistinta en la presente memoria.
"Rigurosidad" representa la combinacion de condiciones a las que los acidos nucleicos estan sujetas que hacen que el duplex se disocie, tales como la temperatura, la fuerza ionica y la concentracion de aditivos tales como formamida. Las condiciones que son mas propensas a causar la disociacion del duplex se denominan "alta rigurosidad", p. ej., mayor temperatura, menor fuerza ionica y mayor concentracion de formamida.
Para aplicaciones que requieren una alta selectividad, se deseara emplear tfpicamente condiciones relativamente rigurosas para formar los hfbridos, p. ej., se seleccionaran condiciones de salinidad relativamente baja y/o alta temperatura, tales como las proporcionados por NaCl de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,10 M a temperaturas de aproximadamente 50° C a aproximadamente 70°C.
Para ciertas aplicaciones, se aprecia que se requieren condiciones de rigurosidad inferiores. En estas condiciones, la hibridacion se puede producir a pesar de que las secuencias de sonda y la hebra diana no son perfectamente complementarias, sino que no coinciden en una o mas posiciones. Las condiciones se pueden volver menos rigurosas aumentando la concentracion de sal y disminuyendo la temperatura. Por ejemplo, unas condiciones de rigurosidad media podrfan ser proporcionadas por NaCl de aproximadamente 0,1 a 0,25 M a temperaturas de aproximadamente 37°C a aproximadamente 55°C, mientras que unas condiciones de baja rigurosidad podrfan ser proporcionadas con sal de aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M, a temperaturas que varfen de aproximadamente 20°C a aproximadamente 55°C. Por lo tanto, las condiciones de hibridacion pueden manipularse facilmente dependiendo de los resultados deseados.
La expresion "condiciones de hibridacion" y sus equivalentes gramaticales, cuando se utiliza con un perfodo de tiempo de mantenimiento, supone someter la mezcla de reaccion de hibridacion, en el contexto de la concentracion de los reactivos y de los reactivos complementarios de la mezcla, a unas condiciones de tiempo, temperatura, pH suficientes para permitir que la sonda polinucleotfdica hibride con la secuencia diana, por lo general para formar el duplex de acido nucleico. Tales condiciones de tiempo, temperatura y pH requeridas para llevar a cabo la hibridacion dependen, como es bien conocido en la tecnica, de la longitud de la sonda polinucleotfdica que se vaya a hibridar, del grado de complementariedad entre la sonda polinucleotfdica y la diana, del contenido de guanidina y citosina del polinucleotido, de la rigurosidad de la hibridacion deseada, y de la presencia de sales o reactivos adicionales en la mezcla de reaccion de hibridacion que pueden afectar a la cinetica de la hibridacion. Los metodos para la optimizacion de las condiciones de hibridacion para una mezcla de reaccion de hibridacion dada son bien conocidos
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en la tecnica.
Segun se utiliza en la presente memoria, "identidad de secuencia sustancial" en el contexto de la comparacion de secuencias de acidos nucleicos significa que los segmentos, o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son identicos cuando se alinean optimamente, con inserciones o deleciones de nucleotidos apropiadas, en al menos aproximadamente 50% de los nucleotidos, generalmente al menos 56%, mas generalmente al menos 59%, normalmente al menos 62%, mas normalmente al menos 65%, a menudo al menos 68%, mas a menudo al menos 71%, tfpicamente al menos 74%, mas tfpicamente al menos 77%, habitualmente al menos 80%, mas habitualmente al menos aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 95 a 98% o mas, y en realizaciones particulares, tan alto como aproximadamente 99% o mas de los nucleotidos. Alternativamente, existe una identidad de secuencia sustancial cuando los segmentos hibridaran en condiciones de hibridacion selectivas, a una hebra, o su complemento, tfpicamente utilizando un fragmento derivado del SEQ ID NO: 1. Tfpicamente, la hibridacion selectiva se producira cuando exista una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 55% a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 14 nucleotidos, preferiblemente al menos aproximadamente 65%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 75%, y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente 90%. Vease Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213. La longitud de la comparacion de identidad de secuencia, como se ha descrito, puede ser a lo largo de tramos mas largos, y en ciertas realizaciones sera a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 17 nucleotidos, habitualmente al menos aproximadamente 20 nucleotidos, mas habitualmente al menos aproximadamente 24 nucleotidos, tfpicamente al menos aproximadamente 28 nucleotidos, mas tfpicamente al menos aproximadamente 40 nucleotidos, preferiblemente al menos aproximadamente 50 nucleotidos, y mas preferiblemente al menos aproximadamente 75 a 100 o mas nucleotidos. Los puntos finales de los segmentos pueden estar en muchas combinaciones de pares diferentes. En la determinacion de la identidad de secuencia o el porcentaje de homologfa se emplean adecuadamente los protocolos y programas discutidos mas abajo para la similitud de secuencia, incluyendo el algoritmo BLAST.
El termino "polimorfismo" se refiere a la coexistencia de mas de una forma de un gen o una porcion (p. ej., variante alelica) del mismo. Una porcion de un gen del cual hay al menos dos formas diferentes, es decir, dos secuencias de nucleotidos diferentes, se denomina una "region polimorfica de un gen". Una secuencia genetica especffica en una region polimorfica de un gen es un alelo. Una region polimorfica puede ser un solo nucleotido, cuya identidad difiere en los diferentes alelos. Una region polimorfica tambien puede tener varios nucleotidos de longitud.
Las secuencias de acidos nucleicos y protefnas de la presente invencion se pueden utilizar ademas como una "secuencia de consulta" para realizar una busqueda frente a bases de datos publicas para identificar, por ejemplo, otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas busquedas se pueden realizar utilizando los programas NBLAST y XBLAST (version 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las busquedas de nucleotidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleotidos homologas a las moleculas de acido nucleico NIP2b, NIP2cL, y NIP2cS de la invencion. Las busquedas de protefnas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas de las protefna NIP2b, NIP2cL, y NIP2cS de la invencion. Para obtener alineamientos con huecos con fines de comparacion, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parametros por defecto de los programas respectivos (p. ej., XBLAST y NBLAST). Vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Las busquedas de similitud de secuencias se pueden realizar tambien manualmente o mediante el uso de varios programas informaticos disponibles conocidos por los expertos en la tecnica. Preferiblemente, se pueden utilizar los algoritmos BLAST y Smith-Waterman, que estan disponibles y son conocidos por los expertos en la tecnica, y similares. Blast es una herramienta de busqueda de similitud de secuencias de NCBI disenada para apoyar el analisis de bases de datos de secuencias de nucleotidos y protefnas. El Paquete GCG ofrece una version local de Blast que se puede utilizar ya sea con bases de datos de dominio publico o con cualquier base de datos disponible a nivel local. El Paquete GCG v9.0 es un paquete de soporte logico disponible comercialmente que contiene mas de 100 programas de soporte logico relacionados entre sf que permite el analisis de secuencias mediante la edicion, cartograffado, comparacion y alineamiento de las mismas. Otros programas incluidos en el Paquete GCG incluyen, por ejemplo, los programas que facilitan las predicciones de la estructura secundaria, del ARN, el ensamblaje de fragmentos de acido nucleico, y el analisis de la evolucion. Ademas, las bases de datos geneticas mas prominentes (GenBank, EMBL, PIR y SWISS-PROT) se distribuyen junto con el Paquete GCG y son completamente accesibles con los programas de busqueda y manipulacion de la base de datos. Se puede acceder a GCG a traves de Internet, por ejemplo, en
http://www.gcg.com/. Fetch es una herramienta disponible en GCG que pueden anotar los registros de GenBank basados en los numeros de acceso y es similar a Entrez. Otra busqueda de similitud de secuencias pueden realizarse con Geneworld y GeneThesaurus de Pangea. Geneworld 2.5 es una alicacion de alto rendimiento, flexible, automatizada para el analisis de secuencias de polinucleotidos y protefnas. Geneworld permite el analisis
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automatico y las anotaciones de las secuencias. Al igual que GCG, Geneworld incorpora varias herramientas para la busqueda de identidad de secuencia, el descubrimiento de genes, el alineamiento de secuencias multiples, la prediccion de estructura secundaria, y la identificacion de motivos. GeneThesaurus 1.0™ es un servicio de suscripcion de datos de secuencias y anotacion que proporciona informacion de multiples fuentes, proporcionando un modelo de datos relacional para los datos publicos y locales.
Otra busqueda de similitud de secuencia alternativa se puede realizar, por ejemplo, por medio de BlastParse. BlastParse es un clasificador en Perl que se ejecuta en una plataforma UNIX que automatiza la estrategia descrita anteriormente. BlastParse toma una lista de numeros de acceso diana de interes y analiza todos los campos de GenBank en texto "delimitado por tabuladores" que luego pueden ser guardados en un formato de "base de datos relacional" para la busqueda y el analisis mas facil, lo que proporciona flexibilidad. El resultado final es una serie de registros de GenBank completamente analizados que pueden ser facilmente ordenados, filtrados y consultados frente, asf como una base de datos de anotaciones-relacional.
Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "hibrida especfficamente" o "detecta especfficamente" se refiere a la capacidad de una molecula de acido nucleico para hibridar con al menos aproximadamente 6 nucleotidos consecutivos de un acido nucleico de la muestra.
"Sustancialmente purificado" se refiere a moleculas de acidos nucleicos o protefnas que se retiran de su entorno natural y se afslan o separan, y estan al menos aproximadamente 60% libres, preferiblemente aproximadamente 75% libres, y mas preferiblemente aproximadamente 90% libres, de otros componentes con los que se asocian de forma natural.
Un "antfgeno" es cualquier sustancia que reacciona especfficamente con los anticuerpos o linfocitos T (celulas T). Un "sitio de union al antfgeno" es la parte de una molecula de inmunoglobulina que se une especfficamente a un antfgeno. Ademas, un sitio de union al antfgeno incluye cualquier sitio en cualquier molecula de union al antfgeno, incluyendo, pero no limitada a, una molecula de MHC o un receptor de celulas T. "Procesamiento antigenico" se refiere a la degradacion de un antfgeno en fragmentos (p. ej., la degradacion de una protefna en peptidos) y a la asociacion de uno o mas de estos fragmentos (p. ej., a traves de la union) con moleculas del MHC para la presentacion por medio de "celulas presentadoras de antfgenos" a las celulas T especfficas.
Las "celulas dendrfticas" (DC) son celulas presentadoras de antfgeno potentes, capaces de desencadenar una respuesta inmunitaria adaptativa robusta in vivo. Se ha demostrado que las DC maduras, activas proporcionan las senales necesarias para la activacion y la proliferacion de las celulas T. Estas senales se pueden clasificar en dos tipos. El primer tipo, que proporciona especificidad a la respuesta inmunitaria, esta mediado a traves de la interaccion entre el complejo receptor de celulas T/CD3 ("TCR/CD3") y un peptido antigenico presentado por una protefna del complejo principal de histocompatibilidad ("MHC" definido anteriormente) de clase I o II sobre la superficie de las APC. El segundo tipo de senal, denominada una senal co-estimuladora, no es ni especffica del antfgeno ni restringida por el MHC, y puede conducir a una respuesta de proliferacion total de las celulas T y a la induccion de las funciones efectoras de celulas T en presencia del primer tipo de senales. Esta senalizacion doble puede, por lo tanto, dar como resultado una respuesta inmunitaria vigorosa. Como se ha senalado mas arriba, en la mayorfa de los vertebrados no aviares, las DC se originan a partir de precursores derivados de medula osea. Las DC inmaduras se encuentran en la sangre periferica y en la sangre del cordon y en el timo. Las poblaciones inmaduras adicionales pueden estar presentes en otros lugares. Las DC de diversas fases de madurez tambien se encuentran en el bazo, los ganglios linfaticos, las amfgdalas, y el intestino humano. Las DC aviares tambien se pueden encontrar en la bolsa de Fabricio, un organo inmunitario primario unico de las aves. En una realizacion preferida, las celulas dendrfticas de la presente invencion son de mamffero, preferiblemente de ser humano, raton o rata.
Una "molecula co-estimuladora" abarca cualquier molecula o combinacion de moleculas que, cuando actuan junto con un complejo de peptido/MHC unido por un receptor de celulas T sobre la superficie de una celula T, proporcionan un efecto co-estimulador que logra la activacion de la celula T que se une al peptido.
Segun se utiliza en la presente memoria, "inmunorreceptores" hara referencia al MHC de clase I (HLA-A, -B, -C, -G) y similares) y otros receptores inmunitarios relacionados, tales como por ejemplo Gp49, PIR, PIRA, PIRB, LIR, NKR- P1, NKp46, Digrl, ILT, MIR, KIR y similares. El MHC tambien puede incluir otras clases tales como MHC de clase II y MHC de clase III, derivados y mutantes de los mismos. El complejo MHC humano tambien se denomina complejo de antfgeno leucocitario humano (HLA). Los antfgenos del MHC se dividen en antfgenos del MHC de clase I (en los seres humanos, esta clase incluye los antfgenos HLA-A, -B, y -C) y antfgenos del MHC de clase II (en los seres humanos, esta clase incluye los antfgenos HLA-DP, -DQ y -DR). Por lo tanto, los terminos "antfgenos MHC-II", "antfgenos MHC de clase II", y "antfgenos de transplante de clase II del MHC" se utilizan indistintamente en la presente memoria para referirse a la clase de protefnas, que en los seres humanos, incluye los antfgenos HLA-DP, -DQ y -DR. Mientras los terminos "genes de MHC de clase II" y "genes MHC-II" se utilizan indistintamente en la presente memoria para referirse a los genes que codifican los antfgenos de trasplante de la clase II del MHC. El
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termino "MHC-II" se utiliza en la presente memoria para referirse al locus del gen que codifica los antfgenos de trasplante de la clase II del MHC, asf como al grupo de las protefnas codificadas por ese locus. Los antfgenos de trasplante tambien incluyen moleculas de la superficie celular distintas de los antfgenos del MHC de clase I y II. Estos antfgenos incluyen los siguientes: (1) los antfgenos ABO implicados en el reconocimiento de celulas sangufneas; (2) las moleculas de adherencia celular tales como ICAM, que estan implicadas en el reconocimiento celula-celula de leucocitos; y (3) la microglobulina p2, un polipeptido asociado con el polipeptido de cadena pesada de 44 kd que comprende los antfgenos HLA-I, pero no esta codificada por el complejo MHC. Los haplotipos/alotipos de HLA varfan de un sujeto a otro y con frecuencia son utiles para determinar el tipo de HLA del sujeto. El tipo de HLA se puede determinar mediante procedimientos de tipificacion convencionales y los linfocitos de sangre periferica (PBL) se pueden purificar por medio de gradientes de Ficoll.
"Diagnostico" o "diagnosticado" representa la identificacion de la presencia o naturaleza de una afeccion patologica. Los metodos de diagnostico difieren en su sensibilidad y especificidad. La "sensibilidad" de un analisis de diagnostico es el porcentaje de sujetos enfermos que dan positivo (porcentaje de los "verdaderos positivos"). Los sujetos enfermos no detectados por el analisis son "falsos negativos". Los sujetos que no estan enfermos y que obtienen un resultado negativo en el analisis, se denominan "verdaderos negativos". La "especificidad" de un analisis de diagnostico es 1 menos la tasa de falsos positivos, donde la "tasa de falsos positivos" se define como la proporcion de aquellos sin la enfermedad que dan positivo. Mientras que un metodo de diagnostico en particular puede no proporcionar un diagnostico definitivo de una afeccion, es suficiente que el procedimiento proporcione una indicacion positiva que ayude en el diagnostico.
Los terminos "sujeto" o "sujeto" se utilizan indistintamente en la presente memoria, y se pretende que represente un sujeto mamffero que se va a tratar, siendo preferidos los sujetos humanos. En algunos casos, los metodos de la invencion encuentran uso en animales de experimentacion, en aplicaciones veterinarias y en el desarrollo de modelos animales para la enfermedad, incluyendo, pero no limitados a, roedores, incluyendo ratones, ratas y hamsters; y primates.
Las "moleculas de marcaje" son radicales qufmicos o bioqufmicos utilizados para el marcaje de un polinucleotido, un polipeptido, o un anticuerpo. Estos incluyen, pero no se limitan a, radionuclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes cromogenicos, agentes quimioluminiscentes, partfculas magneticas, y similares. Las moleculas informadoras se unen especfficamente, establecen la presencia de, y permiten la cuantificacion de, un determinado polinucleotido, polipeptido, o anticuerpo.
"Muestra" se utiliza aquf en su sentido mas amplio. Una muestra que comprende los polinucleotidos, polipeptidos, peptidos, anticuerpos y similares puede comprender un fluido corporal; una fraccion soluble de una preparacion de celulas, o medios en los que se cultivaron las celulas; un cromosoma, un organulo, o membrana aislados o extrafdos de una celula; ADN genomico, ARN o ADNc, polipeptidos, o peptidos en solucion o unidos a un sustrato; una celula; un tejido; una impresion de tejido; una huella digital, piel o cabello; y similares.
Segun se utiliza en la presente memoria, "tumores frescos" se refiere a tumores retirados de un anfitrion por medios quirurgicos u otros metodos.
Segun se utiliza en la presente memoria, "trastorno de crecimiento proliferativo" enfermedad neoplasica", "tumor", "cancer" utilizados indistintamente en la presente memoria se refieren a una afeccion caracterizada por el crecimiento incontrolado, anormal de las celulas. Preferiblemente, el cancer que se va tratar es cancer positivo para MUC-1 y la proliferacion anormal de las celulas puede ser en cualquier celula del organo. Los ejemplos de cancer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma y sarcoma. Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento que surge del epitelio, se encuentra en la piel o, mas comunmente, en el revestimiento de organos del cuerpo.
"Tratamiento" es una intervencion realizada con la intencion de prevenir el desarrollo o alterar la patologfa o los sfntomas de un trastorno. Por consiguiente, "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas. "Tratamiento" tambien puede especificarse como cuidados paliativos. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno asf como aquellos en los que el trastorno debe prevenirse. En el tratamiento del tumor (p. ej., cancer), un agente terapeutico puede disminuir directamente la patologfa de las celulas tumorales, o hacer que las celulas tumorales sean mas susceptibles al tratamiento por otros agentes terapeuticos, p. ej., radiacion y/o quimioterapia.
El termino "que necesita dicho tratamiento" segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a un juicio, realizado por un cuidador tal como un medico, enfermera o profesional de enfermerfa en el caso de los seres humanos, de que un sujeto requiere o se beneficiarfa del tratamiento. Este juicio se realiza basandose a una variedad de factores que estan en el ambito de la experiencia de un cuidador, pero que incluyen el conocimiento de que el sujeto esta
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enfermo, o estara enfermo, como resultado de una afeccion que se puede tratar mediante las composiciones de la invencion.
Se entiende que "celulas del sistema inmunitario" o "celulas inmunitarias" segun se utilizan en la presente memoria, incluyen cualquier celula del sistema inmunitario que se puede analizar, incluyendo, pero no limitada a, linfocitos B, tambien llamados celulas B, linfocitos T, tambien llamados celulas T, celulas asesinas naturales (NK), celulas asesinas naturales (NK), celulas asesinas activadas por linfoquinas (LAK), monocitos, macrofagos, neutrofilos, granulocitos, mastocitos, plaquetas, celulas de Langerhans, celulas madre, celulas dendrfticas, celulas mononucleares de sangre periferica, celulas infiltrantes de tumores (TIL), celulas inmunitarias modificadas en los genes incluyendo hibridomas, celulas inmunitarias modificadas por farmacos, y derivados, precursores o progenitores de los tipos de celulas anteriores.
"Celulas efectoras inmunitarias" se refiere a celulas capaces de unirse a un antfgeno y que median en una respuesta inmunitaria. Estas celulas incluyen, pero no se limitan a, celulas T (linfocitos T), celulas B (linfocitos B), monocitos, macrofagos, celulas asesinas naturales (NK) y linfocitos T citotoxicos (CTL), por ejemplo lfneas de CTL, clones de CTL, y CTL de tumor, inflamatorios, u otros infiltrados.
Las "celulas T" o "linfocitos T" son un subconjunto de linfocitos que se originan en el timo y que tienen receptores heterodimericos asociados con protefnas del complejo CD3 (p. ej., un receptor de celulas T reordenado, la protefna heterodimerica sobre las superficies de celulas T responsables de la especificidad antfgeno/MHC de las celulas). Las respuestas de las celulas T pueden ser detectadas por medio de analisis por sus efectos sobre otras celulas (p. ej., eliminacion de celulas diana, activacion de macrofagos, activacion de celulas B) o por las citoquinas que producen.
El termino "celula T activada" segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a una celula T que expresa antfgenos indicativos de la activacion de celulas T (es decir, marcadores de activacion de celulas T). Los ejemplos de los marcadores de activacion de celulas T incluyen, pero no se limitan a, CD25, CD26, CD30, CD38, cD69, CD70, CD71, ICOS, OX-40 y el 4-1BB. La expresion de los marcadores de activacion se puede medir mediante mecanismos conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, analisis de transferencia Western, analisis de transferencia Northern, RT-PCR, analisis de inmunofluorescencia, y analisis de clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS).
El termino "celulas T en reposo", segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a una celula T que no expresa marcadores de activacion de celulas T. Las celulas T en reposo incluyen, pero no se limitan a, celulas T que son CD25", CD69", ICOS", SLAM- y 4-1BB-. La expresion de estos marcadores se puede medir mediante mecanismos conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, analisis de transferencia Western, analisis de transferencia Northern, RT-PCR, analisis de inmunofluorescencia, y analisis de clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS).
"CD4" es una protefna de la superficie celular importante para el reconocimiento por el receptor de celulas T de peptidos antigenicos unidos a moleculas del MHC de clase II sobre la superficie de una APC. Tras la activacion, las celulas T CD4 no sometidas a tratamiento previo se diferencian en uno de al menos dos tipos de celulas, las celulas Th1 y las celulas Th2, caracterizandose cada tipo por las citoquinas que produce. Las "celulas Th1" estan principalmente involucradas en la activacion de macrofagos con respecto a la inmunidad celular y la respuesta inflamatoria, mientras que las "celulas Th2" o "celulas T auxiliares" estan principalmente involucradas en la estimulacion de las celulas B para producir anticuerpos (inmunidad humoral). CD4 es el receptor para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Las moleculas efectoras para las celulas Th1 incluyen, pero no se limitan a, IFN-y, GM-CSF, TNF-a, ligando CD40, ligando Fas, IL-3, TNF-p, e IL-2. Las moleculas efectoras para las celulas Th2 incluyen, pero no se limitan a, IL-4, IL-5, ligando CD40, IL-3, GS-CSF, IL-10, TGF-p, y eotaxina. La activacion de la respuesta de citoquinas de tipo Th1 puede suprimir la respuesta de citoquinas de tipo Th2.
"CD8" es una protefna de la superficie celular importante para el reconocimiento por el receptor de celulas T de peptidos antigenicos unidos a moleculas del MHC de clase I. Las celulas T CD8 normalmente se convierten en "celulas T citotoxicas" o "celulas T asesinas" y activan los macrofagos. Las moleculas efectoras incluyen, pero no se limitan a, perforina, granzimas, ligando Fas, iFN-y, TNF-a, y TNF-p.
Los terminos "union especffica" o "que se une especfficamente", segun se utilizan en la presente memoria, en referencia a la interaccion de un anticuerpo y una protefna o peptido, significan que la interaccion depende de la presencia de una estructura particular (es decir, el determinante antigenico o epftopo) en la protefna; en otras palabras, el anticuerpo reconoce y se une a una estructura de protefna especffica en lugar de a las protefnas en general. Por ejemplo, si un anticuerpo es especffico para el epftopo "A", la presencia de una protefna que comprende el epftopo A (o libre, A no marcado) en una reaccion que comprende "A" marcado y el anticuerpo reducira la cantidad de A marcado unido al anticuerpo. "Union especffica" en general, se refiere a cualquier molecula
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relacionada con la inmunidad que se une a su ligando, tal como por ejemplo la union de un receptor de celulas T expresado por un linfocito T, a una molecula del MHC y un peptido sobre una celula presentadora de antfgenos.
"Actividad", "activacion" o "aumento" es la capacidad de las celulas del sistema inmunitario para responder y mostrar, a un nivel medible, una funcion inmunitaria. La medicion del grado de activacion se refiere a una evaluacion cuantitativa de la capacidad de las celulas inmunitarias para expresar una actividad mejorada cuando se estimula aun mas como resultado de una activacion previa. La mejora de la capacidad puede ser resultado de los cambios bioqufmicos que ocurren durante el proceso de activacion que permiten que las celulas inmunitarias sean estimuladas para la actividad en respuesta a dosis bajas de estimulantes.
La actividad de las celulas inmunitarias que se puede medir incluye, pero no se limita a (1), la proliferacion celular mediante la medicion de la replicacion celular o del ADN; (2) la produccion de citoquinas mejorada, incluyendo las mediciones especfficas de citoquinas, tales como IFN-y, GM-cSf, o TNF-a; (3) la eliminacion o lisis de la diana mediada por celulas; (4) la diferenciacion celular; (5) la produccion de inmunoglobulina; (6) los cambios fenotfpicos; (7) la produccion de factores quimiotacticos o quimiotaxis, es decir, la capacidad para responder a una quimiotactina con la quimiotaxis; (8) la inmunosupresion, por la inhibicion de la actividad de algun otro tipo de celulas inmunitarias; y, (9) la apoptosis, que se refiere a la fragmentacion de las celulas inmunitarias activadas en determinadas circunstancias, como una indicacion de la activacion anormal.
Un "coadyuvante" es cualquier sustancia capaz de potenciar la respuesta inmunitaria a un antfgeno con el que se mezcla. Dependiendo de la especie anfitriona, se pueden utilizar varios coadyuvantes para aumentar la respuesta inmunologica. Tales coadyuvantes incluyen, pero no se limitan a, coadyuvante de Freund, geles minerales tales como hidroxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, emulsiones de aceite, KLH y dinitrofenol, asf como BCG (bacilos de Calmette Guerin) y Corynabacterium parvum, que se utilizan a menudo en los seres humanos, y los ligandos de CCR6 y otros receptores de quimioquinas.
Una "quimioquina" es una pequena citoquina implicada en la migracion y activacion de celulas, incluyendo fagocitos y linfocitos, y que desempena un papel en las respuestas inflamatorias. Se han definido tres clases de quimioquinas por la disposicion de los residuos de cistefna (C) conservados de las protefnas maduras: las quimioquinas CXC o a que tienen un residuo de aminoacido que separa los dos primeros residuos de cistefna conservados; las quimioquinas CC o p en las que los dos primeros residuos de cistefna conservados estan adyacentes; las quimioquinas C o y que carecen de dos (primero y tercero) de los cuatro residuos de cistefna conservados. Dentro de la subfamilia CXC, las quimioquinas se pueden dividir en dos grupos. Un grupo de quimioquinas CXC tiene el motivo caracterfstico con la secuencia de tres aminoacidos ELR (acido glutamico-leucina-arginina) inmediatamente anterior al primera residuo de cistefna cerca del extremo amino. Un segundo grupo de quimioquinas CXC carece de dicho dominio ELR. Las quimioquinas CXC con el dominio ELR (incluyendo IL-8, GROa/p/Y, Kc de raton, MIP-2 de raton, ENA-78, GCP-2, PBP/CtApIII/P-TG/NAP-2) actuan principalmente sobre neutrofilos como quimioatrayentes y activadores, induciendo la desgranulacion de neutrofilos con liberacion de mieloperoxidasa y otras enzimas. Las quimioquinas CXC sin el dominio ELR (p. ej., IP-10/raton CRG, Mig, PBSF/SDF-1, PF4), las quimioquinas CC (p. ej., MIP-1a, MIP-1 p, RANTES, MCP-1/2/3/4/JE de raton/MARC de raton, eotaxina, I-309/TCA3, HCC-1, C10), y las quimioquinas C (p. ej., linfotactina), son quimioatrayentes y activadoras de monocitos, celulas dendrfticas, linfocitos T, celulas asesinas naturales, linfocitos B, basofilos y eosinofilos.
Una "citoquina" es una protefna producida por una celula que afecta al comportamiento de otras celulas a traves de un "receptor de citoquinas" sobre la superficie de las celulas a las que afectan las citoquinas. Las citoquinas fabricadas por los linfocitos se denominan a veces "linfoquinas". Los ejemplos de citoquinas incluyen interleuquinas, interferones y similares.
Por "inmunologicamente eficaz" se entiende una cantidad del peptido o fragmento del mismo que es eficaz para activar una respuesta inmunitaria para prevenir o tratar trastornos del crecimiento de celulas proliferativas, tales como el cancer. Obviamente, dichas cantidades pueden variar entre las especies y los sujetos en funcion de muchos factores. Por ejemplo, generalmente se requieren dosis mas altas para una respuesta inmunitaria eficaz en un ser humano en comparacion con un raton.
Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "polipeptido" abarca cadenas de aminoacidos de cualquier longitud, incluyendo protefnas de longitud completa que contienen las secuencias enumeradas en la presente memoria. Un polipeptido que comprende un epftopo de una protefna que contiene una secuencia como se describe en la presente memoria puede consistir enteramente en el epftopo, o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivar de la protefna nativa o pueden ser heterologas, y tales secuencias pueden (pero no necesariamente) poseer propiedades inmunogenicas o antigenicas.
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Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "anticuerpo" se refiere a un polipeptido o grupo de polipeptidos que se componen de al menos un dominio de union, donde se forma un dominio de union a anticuerpo a partir del plegamiento de dominios variables de una molecula de anticuerpo para formar espacios de union tridimensionales con una forma de la superficie interna y una distribucion de la carga interna complementaria a las caracterfsticas de un determinante antigenico de un antfgeno, que permite una reaccion inmunologica con el antfgeno. Los anticuerpos incluyen protefnas recombinantes que comprenden los dominios de union, asf como los fragmentos, incluyendo los fragmentos Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2. El termino "anticuerpo", segun se utiliza en la presente memoria, tambien incluye fragmentos de anticuerpo producidos por la modificacion de anticuerpos completos o aquellos sintetizados de novo utilizando metodologfas de ADN recombinante. Tambien incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos de cadena sencilla. La porcion "Fc" de un anticuerpo se refiere a aquella porcion de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende uno o mas dominios de la region constante de la cadena pesada, CHi, CH2 y CH3, pero no incluye la region variable de la cadena pesada.
Un "epftopo", segun se utiliza en la presente memoria, es una porcion de un polipeptido que es reconocida (es decir, se une especfficamente) a una celula B y/o receptor de antfgeno de la superficie de celulas T. Los epftopos se pueden identificar generalmente utilizando tecnicas bien conocidas, tales como las que resume Paul, Fundamental Immunology, 3a ed., 243-247 (Raven Press, 1993) y las referencias citadas en la misma. Tales tecnicas incluyen el escrutinio de polipeptidos derivados del polipeptido nativo para determinar la capacidad de reaccionar con antisueros especfficos de antfgeno y/o lfneas o clones de celulas T. Un epftopo de un polipeptido es una porcion que reacciona con tales antisueros y/o celulas T a un nivel que es similar a la reactividad del polipeptido de longitud completa (p. ej., en un ELISA o un analisis de reactividad de celulas T). Tales escrutinios se pueden llevar a cabo generalmente utilizando metodos bien conocidos por los expertos normales en la tecnica, tales como los descritos por Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Los epftopos de celulas B y de celulas T tambien pueden predecirse por medio de analisis por ordenador. Los polipeptidos que comprenden un epftopo de un polipeptido que se expresa preferentemente en un tejido tumoral (con o sin una secuencia de aminoacidos adicional) estan dentro del alcance de la presente invencion.
Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "polipeptido agonista" se refiere a los epftopos del polipeptido que activan una respuesta inmunitaria mas fuerte que un polipeptido nativo. Los ejemplos de las diferencias en las propiedades entre un polipeptido agonista versus un polipeptido nativo incluyen, pero no se limitan a a) se unen a moleculas de HLA a concentraciones de peptidos inferiores, (b) demuestran una mayor avidez por las moleculas de HLA en los analisis de disociacion, (c) cuando se utilizan con celulas presentadoras de antfgenos inducen la produccion de mas IFN-y por las celulas T derivadas con el uso del peptido nativo. El incremento o aumento de respuesta inmunitaria se mide como se ha descrito anteriormente.
Segun se utiliza en la presente memoria, "polipeptido nativo" se refiere a un polipeptido tal como se encuentra en su entorno natural. Por ejemplo, un antfgeno tumoral MUC-1 nativo es expresado por una celula tumoral en un sujeto.
En una realizacion preferida, los polipeptidos agonistas generan respuestas inmunitarias mas fuertes, en comparacion con el polipeptido nativo. Por ejemplo, en comparacion con el peptido nativo P-92, los polipeptidos agonistas (a) se unen a HLA-A2 en concentraciones de peptido mas bajas, (b) demuestran una avidez mas alta por HLA-A2 en los analisis de disociacion, (c) cuando se utilizan con celulas presentadoras de antfgeno inducen la produccion de mas IFN-y por las celulas T derivadas con el uso del peptido nativo, y (d) fueron capaces de generar de manera mas eficaz lfneas de celulas T humanas especfficas de MUC-1 a partir de voluntarios normales y sujetos con cancer de pancreas. Lo mas importante, las lfneas de celulas T generadas utilizando el epftopo agonista fueron mas eficaces que las generadas con el epftopo nativo, en la lisis de dianas pulsadas con el epftopo nativo y en la lisis de celulas tumorales humanas HLA-A2 que expresan MUC-1.
En esta descripcion, los sujetos que padecen o son susceptibles a, tumores, enfermedades infecciosas y similares son tratados con celulas presentadoras de antfgenos autologas, tales como por ejemplo las celulas dendrfticas (DC), que han sido transducidas con un vector viral que codifica cualquiera de los polipeptidos identificados por los SEQ ID NO: 1 a 19, fragmentos o variantes de los mismos, expresando opcionalmente moleculas co-estimuladoras. Por ejemplo, se utilizaron DC autologas infectadas con rF-MUC-1/TRICOM como APC. rF-MUC-1/TRICOM es un vector de avipoxvirus de replicacion defectuosa que contiene los transgenes para MUC-1 y para una trfada de moleculas co-estimuladoras humanas (B7-1, ICAM-1 y LFA-3, denominada TRiCoM). Se demostro que rF-MUC-1/TRICOM infectaba eficazmente las DC humanas e hiper-expresaban cada una de las moleculas co-estimuladoras, asf como MUC-1, sobre la superficie de las DC (Tabla 2).
La descripcion proporciona un metodo para generar una respuesta inmunitaria a un antfgeno debilmente inmunogenico que comprende administrar a un sujeto un polipeptido agonista, identificado por cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 19, variantes o fragmentos de los mismos, con una alta avidez por HLA fusionado al inmunogeno
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debil.
La descripcion proporciona una molecula de acido nucleico aislada que codifica un antfgeno polipeptfdico agonista derivado de un antfgeno tumoral, tal como, por ejemplo, MUC-1, en donde el polipeptido agonista estimula una respuesta inmunitaria mas fuerte en comparacion con un polipeptido nativo. Otros ejemplos de antfgenos tumorales incluyen, pero no se limitan a HER2/neu, antfgeno carcinoembrionario (CEA), p53.
La descripcion proporciona una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico correspondiente a cualquiera de las secuencias de aminoacidos identificadas por los SEQ ID NO: 1 a 19, fragmentos o variantes de los mismos. Los SEQ ID NO: 1 a 19 se identifican por
SEQ ID NO (peptido)
Secuencia peptfdica Secuencia de nucleotidos SEQ ID NO (nt.)
1
ATWGQDVTSV GCC/ACC/T GG/GGA/CAG/GAT/GT C/ACC/TCG/GTC 20
2
ALWGQDVTSV GCC/CTG/TGG/GGA/CAG/GAT/GT C/ACC/TCG/GTC 21
3
ALLVLVCVLV GCC/CTG/CTG/GT C/CTG/GTC/T GC/GTC/CTG/GT C 22
4
TISDVSVSDV ACC/ATC/TCG/GAT/GTC/TCG/GTC/TCG/ GAT/GTC 23
5
ALAIVYLIAL GCC/CTG/GCC/AT C/GT C/T AC/CT G/AT C/GCC/CT G 24
6
VLVALAIVYL GT C/CTG/GTC/GCG/CTG/GCC/ATC/GT C/TAC/CT G 25
7
YLIALAVCQC T AC/CTG/AT C/GCC/CTG/GCC/GTC/T GC/CAA/TGC 26
8
WGQDVTSVPV T GG/GGA/CAG/GAT/GTC/AC C/TCG/GT C/CCA/GT C 27
9
REGTINVHDV AGA/GAA/GGT/ACC/AT C/AAC/GT C/CAC/GAT/GTC 28
10
GTQSPFFLLL GGC/ACC/CAG/TCT/CCT/TTC/TTC/CTG/CTG/CTG 29
11
LAFREGTINV CT G/GCC/TT C/AGA/GAA/GGT/ACC/AT C/AAC/GT C 30
12
TLASHSTKTD ACT/CTG/GCC/TCG/CAC/TCG/ACC/AAG/ACC/GAT 31
13
LQRDISEMFL CT G/CAA/AGA/GAT/AT C/TCG/GAA/AT G/TT C/CTG 32
14
AIWGQDVTSV GCC/ACT/T GG/GGA/CAG/GAT/GT C/ACC/T CG/GTC 33
15
ALWGQDVTSL GCC/CTG/TGG/GGA/CAG/GAT/GT C/ACC/TCG/CTG 34
16
AMWGQDVTSV GCC/ATG/TGG/GGA/CAG/GAT/GTC/ACC/TCG/GTC 35
17
AMWGQDVTSL GCC/AT G/T GG/GGA/CAG/GAT/GT C/ACC/TCG/CTG 36
18
AIWGQDVTSL GCC/ACT/TGG/GGA/CAG/GAT/GTC/ACC/TCG/CTG 37
19
ALWGQDVTSV
La descripcion proporciona un vector que comprende una molecula de acido nucleico aislada que expresa uno cualquiera de los aminoacidos identificados por los SEQ ID NO: 1 a 19, fragmentos o variantes de los mismos. El vector codifica preferiblemente moleculas co-estimuladoras de celulas inmunitarias codificantes, tales como por ejemplo, B7-1, ICAM-1 y LFA-331.
La descripcion proporciona la transduccion de celulas dendrfticas con un vector que comprende cualquiera de las moleculas identificadas por los SEQ ID NO: 1 a 19, los fragmentos o variantes de los mismos, y opcionalmente, las moleculas co-estimuladoras de celulas inmunitarias, tales como por ejemplo, B7-1, ICAM-1 y LFA-3.35. Estos vectores recombinantes proporcionan un efecto antitumoral especffico para los sujetos que han sido diagnosticados con tumores MUC-1+. Sin embargo, este antfgeno no es mas que un ejemplo ilustrativo y no se pretende que deba interpretarse como limitante de ninguna manera. Los ejemplos de otros antfgenos que son utiles para el tratamiento de diferentes tipos de cancer, incluyen, pero no se limitan a las formas expresadas en exceso o mutadas de antfgenos. Por ejemplo, los tumores Her2/neu+ tales como los tumores de mama, renales, de prostata, y otros tumores HER2, el antfgeno carcinoembrionario (CEA) para los canceres gastrointestinales; K-ras para los canceres de pulmon, gastrointestinales y de la vejiga; p53 que afecta a una amplia variedad de crecimiento neoplasico; SARDT3 en los canceres de cabeza y cuello.
En otra descripcion, se transducen in vivo celulas dendrfticas de un sujeto, que padece o es susceptible de, cancer,
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con vectores recombinantes que expresan epftopos de polipeptidos agonistas. Las celulas dendrfticas se pueden aislar de un sujeto, cultivar ex vivo con un vector, y luego volver a infundir las celulas dendrfticas cultivadas en el sujeto. El cultivo de las celulas dendrfticas se describe con detalle en los ejemplos que siguen. Alternativamente, el vector se puede administrar a un sujeto en necesidad de semejante tratamiento.
En una descripcion, las celulas dendrfticas transducidas presentan antfgenos, por ejemplo, fragmentos peptfdicos agonistas del antfgeno MUC-1 sobre su superficie. Los linfocitos, especfficos para los antfgenos presentados, se activan, proliferan y reconocen las celulas tumorales que expresan el antfgeno MUC-1. Los linfocitos incluyen, celulas B, celulas T auxiliares y celulas T citotoxicas. El reconocimiento, de cualquier celula que expresa epftopos antigenicos por las celulas inmunitarias, da como resultado la destruccion de una celula tumoral.
La descripcion proporciona un vector de acido nucleico que comprende una o mas secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos como los identificados por cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 19, fragmentos o variantes de los mismos, conectados operablemente a un promotor inducible.
En otra realizacion preferida, el vector de acido nucleico es un vector viral, plasmido y similares. Preferiblemente, el vector de acido nucleico comprende un promotor inducible que es especffico del tejido, y opcionalmente, moleculas co-estimuladoras de celulas inmunitarias.
En otra descripcion, el vector que comprende una secuencia de acido nucleico codifica cualquiera de los polipeptidos identificados por los SEQ ID NO: 1 a 19.
En otra descripcion, el vector codifica uno cualquiera de los polipeptidos identificados por uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 19 que tienen una identidad de secuencia con cualquiera uno de los SEC ID NO: 1 a 19 de al menos aproximadamente 10%, mas preferiblemente 25%, incluso mas preferiblemente aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 99,9%.
La descripcion proporciona una celula anfitriona que expresa los productos polipeptfdicos del vector identificado por uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 19 que tiene una identidad de secuencia con uno cualquiera una de los SEQ ID NO: 1 a 19 de al menos aproximadamente 10%, mas preferiblemente 25%, incluso mas preferiblemente aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 99,9%. Preferiblemente, la celula anfitriona es una celula presentadora de antfgeno, tal como por ejemplo, un monocito/macrofago, celula dendrftica o similares.
De acuerdo con la invencion, las celulas dendrfticas transducidas presentan el antfgeno a las celulas del sistema inmunitario y activan el sistema inmunitario para que reconozcan epftopos antigenicos tumorales, tales como por ejemplo una celula tumoral que expresa el antfgeno MUC-1.
En una realizacion preferida, el vector es un vector de avipoxvirus que comprende moleculas de acido nucleico que codifican polipeptidos agonistas y moleculas co-estimuladoras, como se describe con detalle en los ejemplos que siguen. Tambien se pueden utilizar otros vectores. Los vectores preferidos incluyen vectores virales, protefnas de fusion y productos conjugados qufmicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de la leucemia murina de Moloney. Se prefieren los vectores virales de ADN. Los vectores virales pueden ser elegidos para introducir los genes en las celulas de eleccion. Tales vectores incluyen vectores de poxvirus tales como vectores de ortopoxvirus o avipoxvirus, vectores del virus del herpes tales como el vector del virus herpes simplex I (VHS) (Geller et al., 1995, J. Neurochem, 64:487; Lim et al., 1995, en DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, ed., Oxford Univ. Press, Oxford, Inglaterra; Geller et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 1149), otros vectores de adenovirus (LeGal LaSalle et al., 1993, Science 259: 988; Davidson et al., 1993, Nat. Genet. 3: 219; Yang et al., 1995, J. Virol. 69: 2004) y vectores de virus adeno-asociados (Kaplitt et al., 1994, Nat. Genet. 8: 148; Kotin, et al. WO 98/11244 (3/19/1998) y Chiorini, et al., WO 99/61601 (12/2/1999)).
Los vectores de Poxvirus introducen el gen en el citoplasma de las celulas. Los vectores de Avipoxvirus dan como resultado solamente una unica expresion a corto plazo del acido nucleico. Se prefieren los vectores de adenovirus, los vectores de virus adeno-asociados y los vectores de virus herpes simplex para la introduccion del acido nucleico en celulas neurales. El vector de adenovirus da como resultado una expresion mas a corto plazo (alrededor de 2 meses) que el virus adeno-asociado (alrededor de 4 meses), que a su vez es mas corto que el de los vectores de HSV. Los vectores se pueden introducir por tecnicas convencionales, p. ej., infeccion, transfeccion, transduccion o transformacion. Los ejemplos de los modos de transferencia de genes incluyen, por ejemplo, precipitacion con fosfato de calcio de ADN desnudo, DEAE dextrano, electroporacion, fusion de protoplastos, lipofeccion, microinyeccion de celulas y vectores virales.
El vector se puede emplear para dirigirlo esencialmente a cualquier celula diana deseada. Por ejemplo, la inyeccion estereotaxica se puede utilizar para dirigir los vectores (p. ej., adenovirus, HSV) a una ubicacion deseada. Otros
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metodos que se pueden utilizar incluyen cateteres, inyecciones intravenosas, parenterales, intraperitoneales, y subcutaneas, y las rutas de administracion orales u otras conocidas.
Otro metodo preferido es la inmunizacion con ADN. La inmunizacion con ADN emplea la inyeccion subcutanea de un vector de ADN plasmfdico (ADNp) que codifica un marcador tumoral. La secuencia del ADNp es absorbida por las celulas presentadoras de antfgenos (APC), preferiblemente por las celulas dendrfticas. Una vez en el interior de la celula, el ADN que codifica la protefna se transcribe y se traduce y se presenta a los linfocitos.
Los constructos geneticos comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de acido nucleico de eleccion y preferiblemente incluyen una secuencia de trafico intracelular conectada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresion genica.
Cuando son absorbidos por una celula, los constructos geneticos pueden permanecer presente en la celula como una molecula extracromosomica funcional y/o integrarse en el ADN cromosomico de la celula. El ADN se puede introducir en las celulas en las que permanece como material genetico separado en forma de un plasmido o plasmidos. Alternativamente, el ADN lineal que se puede integrar en el cromosoma se puede introducir en la celula. Al introducir ADN en la celula, se pueden anadir reactivos que promuevan la integracion del ADN en los cromosomas. Tambien se pueden incluir en la molecula de ADN secuencias de ADN que son utiles para promover la integracion. Alternativamente, el ARN puede ser administrado a la celula. Tambien se contempla proporcionar el constructo genetico como un minicromosoma lineal que incluye un centromero, telomeros y un origen de replicacion. Los constructos genicos pueden seguir formando parte del material genetico en microorganismos vivos atenuados o vectores microbianos recombinantes que viven en las celulas. Los constructos genicos pueden ser parte de los genomas de las vacunas virales recombinantes en las que el material genetico, se integra en el cromosoma de la celula o permanece extracromosomico.
Los constructos geneticos incluyen elementos reguladores necesarios para la expresion genica de una molecula de acido nucleico. Los elementos incluyen: un promotor, un codon de inicio, un codon de parada, y una senal de poliadenilacion. Ademas, pueden ser necesarios potenciadores para la expresion genica de la secuencia de eleccion, por ejemplo, los polipeptidos agonistas identificados por los SEQ ID NO: 1 a 19, variantes o fragmentos de los mismos. Es necesario que estos elementos se conecten operablemente a la secuencia que codifica las protefnas deseadas y que los elementos reguladores sean operables en el sujeto al que se administran.
Los codones de inicio y los codones de parada se consideran generalmente parte de una secuencia de nucleotidos que codifica la protefna diana inmunogenica. Sin embargo, es necesario que estos elementos sean funcionales en el sujeto al que se administre la construccion genica. Los codones de inicio y parada deben estar en marco con la secuencia codificante.
Los promotores y las senales de poliadenilacion utilizados deben ser funcionales dentro de las celulas del sujeto.
Los ejemplos de promotores utiles para practicar la presente invencion, especialmente en la produccion de una vacuna genetica para seres humanos, incluyen pero no se limitan a los promotores de virus de simios 40 (SV40), de virus de tumor mamario de raton (MMTV), de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tal como el promotor la larga repeticion terminal del VIH (LTR), virus de Moloney, ALV, citomegalovirus (CMV) tales como el promotor temprano inmediato de CMV, virus de Epstein Barr (EBV), virus del sarcoma de Rous (RSV), asf como promotores de genes humanos tales como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de musculo humano y metalotionefna humana.
Los ejemplos de las senales de poliadenilacion utiles para poner en practica la presente invencion, especialmente en la produccion de una vacuna genetica para seres humanos, incluyen, pero no estan limitados a senales de poliadenilacion de SV40 y senales de poliadenilacion de LTR.
Ademas de los elementos reguladores requeridos para la expresion del ADN, tambien se pueden incluir otros elementos en la molecula de ADN. Tales elementos adicionales incluyen potenciadores. El potenciador se puede seleccionar del grupo que incluye pero no se limita a: actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de musculo humano y potenciadores virales tales como los de CMV, RSV y EBV.
Los constructos geneticos pueden estar provistos del origen de replicacion de mamffero con el fin de mantener el constructo extracromosomicamente y producir multiples copias del constructo en la celula. Por ejemplo, los plasmidos pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, Calif.) contienen el origen de replicacion del virus de Epstein Barr y la region codificante del antfgeno nuclear EBNA-1 que produce replicacion episomal de alto numero de copias sin integracion.
Con el fin de maximizar la produccion de protefnas, se pueden seleccionar secuencias reguladoras que sean muy
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adecuadas para la expresion de genes en las celulas a las que se administra el constructo. Por otra parte, se pueden seleccionar los codones que se transcriben mas eficazmente en la celula. Un experto en la tecnica puede producir constructos de ADN que sean funcionales en las celulas.
El metodo de la presente descripcion comprende las etapas de administrar moleculas de acido nucleico a los tejidos del sujeto. Las moleculas de acido nucleico se pueden administrar por via intramuscular, intranasal, intraperitoneal, subcutanea, intradermica, o topica o por medio de lavado del tejido mucosal seleccionado del grupo que consiste en vaginal, rectal, uretral, bucal y sublingual.
La molecula de acido nucleico puede ser suministrada a las celulas conjuntamente con la administracion de un agente facilitador. Los agentes facilitadores tambien se denominan potenciadores de la funcion del polinucleotido o agentes facilitadores de vacunas geneticas. Los agentes facilitadores se describen, por ejemplo, en la Solicitud Internacional Num. PCT/US94/00899 presentada el 26 de Enero de 1994 y la solicitud Internacional Num. PCT/US95/04071 presentada el 30 de Marzo de 1995. Los agentes facilitadores que se administran conjuntamente con moleculas de acido nucleico se pueden administrar en forma de una mezcla con la molecula de acido nucleico o se pueden administrar por separado simultaneamente, antes o despues de la administracion de las moleculas de acido nucleico.
En algunas realizaciones preferidas, los constructos geneticos de la invencion se formulan con o se administrar junto con un facilitador seleccionado del grupo que consiste, por ejemplo, en esteres de acido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y las sales clorhidrato de los mismos tales como las de la familia de los anestesicos locales. El agente facilitador se administra antes, simultaneamente o despues del constructo genetico. El agente facilitador y el constructo genetico se pueden formular en la misma composicion.
En algunas realizaciones de la descripcion, el sujeto se somete primero a la inyeccion del facilitador antes de la administracion del constructo genetico. Esto es, por ejemplo, hasta aproximadamente una semana a diez dfas antes de la administracion del constructo genetico, al sujeto se le inyecta primero el facilitador. En algunas realizaciones, al sujeto se le inyecta el facilitador de aproximadamente 1 a 5 dfas; en algunas realizaciones 24 horas antes o despues de la administracion del constructo genetico. Alternativamente, si se utiliza, el facilitador se administra simultaneamente, minutos antes o despues de la administracion del constructo genetico. De acuerdo con ello, el facilitador y el constructo genetico pueden combinarse para formar una sola composicion farmaceutica.
En algunas realizaciones, los constructos geneticos se administran libres de agentes facilitadores, es decir en formulaciones libres de agentes facilitadores utilizando protocolos de administracion en los que los constructos geneticos no se administran conjuntamente con la administracion de agentes facilitadores.
Las moleculas de acido nucleico que se suministran a las celulas de acuerdo con la invencion pueden servir como moldes geneticas para las protefnas que funcionan como agentes de inmunizacion profilacticos y/o terapeuticos. En realizaciones preferidas, las moleculas de acido nucleico comprenden las secuencias reguladoras necesarias para la transcripcion y traduccion de la region codificante en las celulas del animal.
En realizaciones adicionales de la presente invencion, los polipeptidos agonistas descritos en la presente memoria se pueden utilizar para la inmunoterapia de tumores positivos para MUC-1. En estas realizaciones, los compuestos (que pueden ser polipeptidos, anticuerpos o moleculas de acido nucleico) se incorporan preferiblemente a composiciones farmaceuticas o vacunas. Las composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas de tales compuestos y un portador fisiologicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o mas polipeptidos y un potenciador de la respuesta inmunitaria, tal como un coadyuvante o un liposoma (al que se incorpora el compuesto). Las composiciones farmaceuticas y vacunas pueden contener adicionalmente un sistema de suministro, tal como microesferas biodegradables que se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nums. 4.897.268 y 5.075.109. Las composiciones farmaceuticas y vacunas dentro del alcance de la presente descripcion tambien pueden contener otros compuestos, incluyendo uno o mas polipeptidos separados.
Si bien se puede emplear cualquier portador adecuado conocido por los expertos normales en la tecnica en las composiciones farmaceuticas de esta descripcion, el tipo de portador variara dependiendo del modo de administracion. Para la administracion parenteral, tal como la inyeccion subcutanea, el portador comprende preferiblemente agua, solucion salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampon. Para la administracion oral, se puede emplear cualquiera de los portadores anteriores o un portador solido, tal como manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. Las microesferas biodegradables (p. ej., polilactato-poliglicolato) tambien se pueden emplear como portadores para las composiciones farmaceuticas de esta descripcion.
Se puede emplear cualquiera de una variedad de coadyuvantes en las vacunas de esta descripcion para potenciar
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de manera no especffica la respuesta inmunitaria. La mayorfa de los coadyuvantes contienen una sustancia disenada para proteger el antfgeno del catabolismo rapido, tal como hidroxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador de las respuestas inmunitarias, tal como lfpido A, protefnas derivadas de Bordetella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Los coadyuvantes adecuados estan disponibles comercialmente, por ejemplo, como coadyuvante incompleto y coadyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), Coadyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), alumbre, microesferas biodegradables, monofosforil lfpido A y Quil A. Las citoquinas, tales como GM-CSF o interleuquina-2, -7, o -12, tambien se pueden utilizar como coadyuvantes.
La descripcion proporciona un metodo para tratar a un sujeto que padece o es susceptible a un tumor MUC-1 que comprende la administracion a un sujeto de uno cualquiera de los peptidos identificados por los SEQ ID NO: 1 a 19, fragmentos o variantes de los mismos.
De acuerdo con la descripcion, se genera una respuesta inmunitaria a un antfgeno tumoral MUC-1, por la administracion de un polipeptido agonista a una dosis terapeuticamente eficaz suficiente para generar una respuesta inmunitaria celular, en donde los polipeptidos agonistas son uno cualquiera de los polipeptidos identificados por los SEQ ID NO: 1 a 19, fragmentos o variantes de los mismos, y opcionalmente moleculas co-estimuladoras de celulas inmunitarias. Preferiblemente, los polipeptidos identificados por uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 19 que tiene una identidad de secuencia con uno cualquiera de los SEQ Id NO: 1 a 19 de al menos aproximadamente 10%, mas preferiblemente 25%, incluso mas preferiblemente aproximadamente 40 %, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 99,9%.
Los peptidos se administran a un sujeto que padece o es susceptible a diversos tipos de cancer. El diagnostico clfnico definitivo de un cancer en particular garantiza la administracion de los peptidos, incluyendo las primeras fases de la enfermedad. Las aplicaciones profilacticas estan justificadas en los casos en los que los sujetos con antecedentes familiares de la enfermedad y que se pronostica que estan en riesgo por medio de indicadores de pronostico confiables podrfan ser tratados profilacticamente para interceptar el cancer antes de su aparicion, tales como los canceres positivos para MUC-1; o se pueden administrar despues de una operacion.
Las vacunas de peptidos se pueden administrar en muchas formulaciones posibles, en medios farmacologicamente aceptables. En el caso de un peptido corto, el peptido se puede conjugar con un portador, tal como KLH, con el fin de aumentar su inmunogenicidad. La vacuna se puede administrar junto con un coadyuvante, varios de los cuales son conocidos para los expertos en la tecnica. Despues de la inmunizacion inicial con la vacuna, se puede suministrar una dosis de refuerzo. Las vacunas se administran por metodos convencionales, en dosis que son suficientes para provocar una respuesta inmunologica, que puede ser determinada facilmente por los expertos en la tecnica.
La eficacia del peptido en el contexto de la prevencion se juzga basandose en los siguientes criterios: la frecuencia de celulas T reactivas al peptido determinada por dilucion limitante, la respuesta de proliferacion de lfneas de celulas T y clones reactivos al peptido, los perfiles de citoquinas de las lfneas de celulas T y clones para el peptido deseado establecido a partir de los sujetos. La eficacia se establece por la disminucion en la frecuencia de celulas reactivas, una reduccion en la incorporacion de timidina con el peptido alterado en comparacion con la nativa, y una reduccion en TNF e IFN-a. Las mediciones clfnicas incluyen la tasa de recafda a intervalos de uno y dos anos, en una curva de Kaplan-Meier, un retraso en la reduccion sostenida de la progresion de la fase del cancer en el numero y tamano de los tumores incluyendo un cambio en el area y el volumen de las imagenes T2 en la MRI, y el numero y volumen de lesiones determinados por imagenes mejoradas con gadolinio.
Los peptidos, variantes y fragmentos de los mismos, de la presente invencion se pueden administrar ya sea solos, o en forma de una composicion farmaceutica. Brevemente, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden comprender uno o mas de los peptidos, combinados con uno o mas portadores, diluyentes o excipientes farmaceuticamente o fisiologicamente aceptables. Tales composiciones pueden comprender tampones tales como solucion salina tamponada neutra, solucion salina tamponada con fosfato y similares, carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol, protefnas, polipeptidos o aminoacidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutation, coadyuvantes (p. ej., hidroxido de aluminio) y conservantes. Ademas, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion tambien pueden contener uno o mas ingredientes activos adicionales, tales como, por ejemplo, citoquinas como el p-interferon.
Las composiciones de la presente descripcion se pueden formular para la forma de administracion indicada, incluyendo por ejemplo, para la administracion oral, nasal, venosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutanea, o intramuscular. Dentro de otras realizaciones de la descripcion, las composiciones descritas en la presente memoria se pueden administrar como parte de un implante de liberacion sostenida. En otras realizaciones mas, las composiciones de la presente descripcion se pueden formular en forma de un producto liofilizado, utilizando excipientes apropiados que proporcionen estabilidad como producto liofilizado, y despues de la rehidratacion.
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Las composiciones farmaceuticas de la presente descripcion se pueden administrar de una manera apropiada para la enfermedad que se vaya a tratar (o prevenir). La cantidad y frecuencia de administracion seran determinadas por factores tales como el estado del sujeto, y el tipo y gravedad de la enfermedad del sujeto. Dentro de realizaciones particularmente preferidas de la descripcion, los peptidos, variantes, o fragmentos de los mismos, o las composiciones farmaceuticas descritas en la presente memoria se pueden administrar a una dosificacion que varfa de aproximadamente 5 a 50 mg/kg, aunque las dosis apropiadas pueden ser determinadas por pruebas clfnicas. Las dosis de analogo de peptido seran de aproximadamente 5-50 mg/kg, pero se determinan con mayor precision despues de las pruebas. Los sujetos pueden ser controlados para determinar la eficacia terapeutica por medio de MRI, y signos de exacerbacion clfnica, como se ha descrito anteriormente.
Se puede utilizar MRI para medir lesiones activas utilizando la formacion mejorada de imagenes por gadolinio-DTPA (McDonald et al. Ann. Neurol. 36:14, 1994) o la localizacion y alcance de las lesiones utilizando tecnicas ponderadas en T2. Brevemente, se obtienen MRI de referencia. Se utilizan el mismo plano de imagen y posicion del sujeto para cada estudio posterior. Las secuencias de posicionamiento y formacion de imagenes se eligen para maximizar la deteccion de lesiones y facilitar el seguimiento de la lesion. Se utilizan las mismas secuencias de posicionamiento y de formacion de imagenes en estudios posteriores. La presencia, localizacion y alcance de las lesiones de MS son determinados por radiologos. Las areas de las lesiones se describen y se suman trozo a trozo para el area total de la lesion. Se pueden realizar tres analisis: evidencia de lesiones nuevas, velocidad de aparicion de lesiones activas, porcentaje de cambio en el area de la lesion (Paty et al., Neurology 43:665, 1993). Se establece la mejora debida a la terapia cuando hay una mejora estadfsticamente significativa en un sujeto en comparacion con la referencia o en un grupo tratado frente a un grupo con placebo.
En otro aspecto de la descripcion, se puede administrar cualquier polipeptido antigenico tumoral a un sujeto diagnosticado que padece o es susceptible de padecer diversos tipos de cancer. Los polipeptidos correspondientes a los antfgenos tumorales identificados se pueden utilizar para estimular las celulas del sistema inmunitario para reconocer y lisar las celulas tumorales que expresan los antfgenos tumorales, tales como por ejemplo, CEA, p53, Kras, y similares.
Si bien se han aplicado varios procedimientos que implican el uso de anticuerpos en el tratamiento de tumores, se han registrado pocos, si los hubiera, intentos con exito utilizando celulas T citotoxicas. Teoricamente, las celulas T citotoxicas serfan los medios preferidos de tratamiento de tumores. Sin embargo, no hay procedimientos disponibles para activar especfficamente las celulas T citotoxicas. En contraste con los anticuerpos, los receptores de celulas T sobre la superficie de las celulas CD8 no pueden reconocer los antfgenos foraneos directamente. El antfgeno debe ser presentado primero al receptor de celulas T, tal como una celula dendrftica.
La presentacion del antfgeno a las celulas T CD8 se logra por medio de moleculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) del tipo de la Clase I. El complejo principal de histocompatibilidad (MHC) se refiere a un gran locus genetico que codifica una extensa familia de glicoprotefnas que juegan un papel importante en la respuesta inmunitaria. Los genes del MHC, que tambien se conocen como complejo HLA (antfgeno leucocitario humano), estan ubicados en el cromosoma 6 en los seres humanos. Las moleculas codificadas por los genes del MHC estan presentes sobre las superficies celulares y son en gran parte responsables del reconocimiento de los transplantes de tejidos como "no propios". De este modo, las moleculas del MHC unidas a membrana estan fntimamente involucradas en el reconocimiento de antfgenos por las celulas T.
Los productos del MHC se agrupan en tres clases principales, denominadas I, II, y III. Las celulas T que sirven principalmente como celulas auxiliares expresan CD4 e interaction principalmente con moleculas de Clase II, mientras que las celulas que expresan CD8, que en su mayorfa representan celulas efectoras citotoxicas, interaccionan con moleculas de Clase I.
Las moleculas de Clase I son glicoprotefnas de membrana con la capacidad de unirse a peptidos derivados principalmente de la degradacion intracelular de protefnas endogenas. Los complejos de moleculas del MHC con peptidos derivados de protefnas foraneas virales, bacterianas y otras comprenden el ligando que desencadena la capacidad de respuesta al antfgeno de las celulas T. En contraste, los complejos de moleculas del MHC con peptidos derivados de productos celulares normales juegan un papel "al ensenar" a las celulas T a tolerar los peptidos propios, en el timo. Las moleculas de Clase I no presentan antfgenos enteros, intactos; mas bien, presentan fragmentos peptfdicos de los mismos, "cargados" en su "surco de union al peptido".
Como reconoceran los expertos en la tecnica, el termino celulas "compatibles con el anfitrion" o "autologas" representa celulas que son del misma o similar haplotipo que el del sujeto o "anfitrion" a la que se administran las celulas.
La presentacion de las moleculas del MHC de Clase I unidas solo al peptido ha sido en general ineficaz en la
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activacion de celulas CD8. En la naturaleza, las celulas CD8 son activadas por las celulas presentadoras de antfgeno, tales como, por ejemplo, las celulas dendrfticas, que presentan no solo una molecula de Clase I del MHC unida al peptido, sino tambien una molecula co-estimuladora. Tales moleculas co-estimuladoras incluyen B7 que ahora se reconoce que son dos subgrupos designados B7.1 y B7.2, ICAM-1 y LFA-3. Tambien se ha encontrado que las moleculas de adherencia celular tales como las integrinas ayudan en este proceso.
Las celulas dendrfticas son celulas presentadoras de antfgenos que se encuentran en todos los tejidos y organos, incluyendo la sangre. Especfficamente, las celulas dendrfticas presentan antfgenos para los linfocitos T, es decir, procesan y presentan antfgenos, y estimulan las respuestas de las celulas T no expuestas anteriormente a antfgenos y de memoria. Ademas de su papel en la presentacion de antfgenos, las celulas dendrfticas se comunican directamente con los tejidos no linfaticos y sondean el tejido no linfatico en busca de una senal de lesion (p. ej., isquemia, infeccion o inflamacion) o crecimiento tumoral. Una vez senalizado, las celulas dendrfticas inician la respuesta inmunitaria mediante la liberacion de IL-1 que activa los linfocitos y monocitos. Cuando la celula T CD8 interactua con una celula presentadora de antfgeno, tal como una celula dendrftica, que tiene el peptido unido por una molecula del MHC de Clase I y co-estimuladora, se activa la proliferacion de la celula T CD8 y llega a ser una celula T efectora. Vease, en general, Janeway y Travers, Immunobiology, publicado por Current Biology Limited, Londres (1994).
Por consiguiente, lo que se necesita y lo que la presente invencion proporciona, es un medio para activar las celulas T de manera que proliferen, se vuelvan citotoxicas para las celulas que expresan el antfgeno deseado, tal como por ejemplo MUC-1, y mantengan las celulas de memoria especfficas para el antfgeno administrado. Por lo tanto, el sistema inmunitario esta cebado contra varios epftopos tumorales de manera que si surgen tumores espontaneos, existe un grupo de celulas inmunitarias cebadas que se activan para reconocer y eliminar las celulas tumorales. Preferiblemente, los epftopos presentados al sistema inmunitario comprenden epftopos agonistas como se describe en la presente memoria. Los polipeptidos agonistas de la descripcion comprenden preferiblemente una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente 60% a la secuencia de aminoacidos de los SEQ ID NO: 1 a 19, los fragmentos o variantes de los mismos, mas preferiblemente, el polipeptido agonista comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente 80% a la secuencia de aminoacidos de los SEQ ID NO: 1 a 19. Mas preferiblemente, el polipeptido agonista comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente 90%, 95%, o 99,9% a la amino secuencia de aminoacidos de los SEQ ID NO: 1 a 19.
Se puede encontrar una revision de la biologfa de las celulas T de memoria en Dutton et al. (1998) Ann. Rev Immunol 16:201-23. Las celulas de memoria expresan un patron diferente de marcadores de superficie celular, y responden de varias maneras que son funcionalmente diferentes de las de las celulas no expuestas a antfgeno previamente. Las celulas de memoria humanas son CD45RA-, CD45RO+. En contraste con las celulas no expuestas a antfgenos previamente, las celulas de memoria secretan una amplia gama de citoquinas de celulas T.
Las quimioquinas y citoquinas tambien juegan un papel importante en el desarrollo de una respuesta inmunitaria. El papel de las quimioquinas en el trafico de leucocitos es revisado por Baggiolini (1998) Nature 392: 565-8, en donde se sugiere que las respuestas de migracion en el trafico complicado de linfocitos de diferentes tipos y grados de activacion estaran mediadas por quimioquinas. El uso de pequenas moleculas para bloquear las quimioquinas es revisado por Baggiolini y Moser (1997) J. Exp. Med. 186:1189-1191.
El papel de las diversas quimioquinas especfficas en el anidamiento de linfocitos se ha descrito previamente. Por ejemplo, Campbell et al. (1998) Science, mostraron que SDF-1 (tambien llamado PBSF), 6-C-quina (tambien llamada Exodus-2), y MIP-3beta (tambien llamado ELC o Exodus-3) inducfan la adherencia de la mayorfa de los linfocitos circulantes, incluyendo la mayorfa de las celulas T CD4+; y MIP-3Alpha (tambien llamado LARC o Exodus-1) desencadenaba la adherencia de las celulas T CD4+ de memoria, pero no de las no expuestas a antfgeno previamente. Tangemann et al. (1998) J. Immunol. 161:6330-7 describen el papel de la quimioquina de tejido linfoide secundario (SLC), una quimioquina asociada con venulas endoteliales altas (HEV), en el anidamiento de los linfocitos en los organos linfoides secundarios. Campbell et al. (1998) J. Cell Biol 141(4):1053-9 describen el receptor para SLC como CCR7, y que su ligando, SLC, puede desencadenar una rapida detencion dependiente de integrina del rodamiento de linfocitos bajo cizallamiento fisiologico.
Las celulas B maduras se pueden medir en inmunoanalisis, por ejemplo, por los antfgenos de la superficie celular, incluyendo CD19 y CD20 con anticuerpos monoclonales marcados pudiendose utilizar fluorocromos o enzimas para estos antfgenos. Las celulas B que se han diferenciado en celulas plasmaticas se pueden enumerar por medio de tincion para determinar las inmunoglobulinas intracelulares mediante inmunofluorescencia directa en frotis fijos de celulas cultivadas.
Se encuentran disponibles varias maneras diferentes, para evaluar la madurez y la diferenciacion celular. Por
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ejemplo, uno de tales metodos es mediante la medicion de fenotipos de celulas. Los fenotipos de las celulas inmunitarias y los cambios fenotfpicos se pueden evaluar por citometrfa de flujo despues de la tincion de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales que se uniran a protefnas de membrana caracterfsticas de diversos tipos de celulas inmunitarias.
Un segundo medio para evaluar la diferenciacion de celulas es mediante la medicion de la funcion celular. Esto se puede realizar bioqufmicamente, mediante la medicion de la expresion de enzimas, ARNm, genes, protefnas, u otros metabolitos dentro de la celula, o secretados por la celula. Tambien se pueden utilizar bioanalisis para medir la diferenciacion de celulas funcionales o medir la produccion de anticuerpos especfficos dirigidos a los tumores de un sujeto, lfneas de celulas tumorales o celulas de tumores frescos.
Las celulas inmunitarias expresan una variedad de moleculas de superficie celular que se pueden detectar con anticuerpos monoclonales o antisueros policlonales. Las celulas inmunitarias que han experimentado diferenciacion
0 activacion tambien se pueden enumerar por medio de tincion para detectar la presencia de protefnas de la superficie celular caracterfsticas por inmunofluorescencia directa en frotis fijos de celulas cultivadas.
Los analisis citotoxicos de celulas T in vitro son bien conocidos para los expertos en la tecnica. Un metodo preferido consiste en medir la citotoxicidad en un analisis de liberacion de cromato de sodio51 (51Cr) de 5 horas. En particular, se prefiere un analisis de liberacion de Cr51 de 20 hr. Las celulas tumorales, tambien denominadas en la presente memoria "celulas diana" se cultivan en placas de microtitulacion de fondo plano y se incuban a 37°C durante la noche. Las dianas se lavan y se marcan al dfa siguiente con 51Cr a 37°C. El 51Cr es absorbido por las celulas diana, por endocitosis o por pinocitosis, y se retiene en el citoplasma. Los pocillos que contienen celulas tumorales se lavan, y a continuacion las ATC armadas o no armadas, referidas como "celulas efectoras" se cultivan en placa a diferentes razones E:T y se incuban durante la noche a 37°C. La citolisis es una medida del 51Cr liberado de las celulas diana al sobrenadante debido a la destruccion de las celulas diana por las celulas efectoras. Las placas de microtitulacion se centrifugan a 1000 rpm durante 10 minutos y se retira una alfcuota de aproximadamente 50 pl a aproximadamente 100 pl y se mide el nivel de radiactividad al dfa siguiente por medio de un contador gamma y se calcula el porcentaje de lisis especffica.
El porcentaje de lisis especffica se mide mediante el uso de la formula:
(51Cr liberado de las celulas diana) - (51Cr espontaneo liberado de las celulas diana) /
(51Cr maximo liberado de las celulas diana) - (51Cr espontaneo liberado de las celulas diana) X 100
El 51Cr espontaneo liberado de las celulas diana se mide con las celulas tumorales a las que no se han anadido las celulas efectoras. El 51Cr maximo liberado de las celulas diana se obtiene mediante la adicion, por ejemplo, de HCl 1 M y representa la cantidad total de 51Cr presente en el citoplasma de la celula diana.
La liberacion espontanea de 51Cr de las celulas diana se mide con las celulas tumorales a las que no se han anadido celulas efectoras. El maximo 51Cr liberado de las celulas diana se obtiene mediante la adicion de, por ejemplo, HCl 1 M y se representa la cantidad total de 51Cr presente en el citoplasma de la celula diana.
Otros medios de analisis de la actividad de los linfocitos T es mediante la reaccion mixta de linfocitos descrita en los ejemplos que siguen. Tambien se pueden utilizar otros analisis de citotoxicidad, tales como el marcaje de celulas diana con timidina tritiada (3H-TdR). La 3H-TdR es absorbida por las celulas diana en el nucleo de la celula. La liberacion de 3H-TdR es una medida de la muerte celular por la fragmentacion del ADN. El analisis se llevo a cabo como antes, excepto que el perfodo de incubacion es al menos aproximadamente 48 horas y se miden de 50 pl a aproximadamente 100 pl del sobrenadante mediante un contador beta en presencia de al menos aproximadamente
1 ml de fluido de centelleo. El calculo del porcentaje de lisis especffica se realiza utilizando la formula anterior.
En una realizacion preferida, el polipeptido se expresa al menos a un nivel superior en un sujeto con cancer en comparacion con los niveles de expresion en los sujetos normales, preferiblemente el polipeptido se expresa de al menos aproximadamente 5 a aproximadamente 10 veces mas en un sujeto con cancer en comparacion con la expresion en un sujeto normal. Preferiblemente, el cancer es un cancer MUC-1 + y la muestra del sujeto se obtiene de un sujeto mamffero, incluyendo un primate, tal como un sujeto humano.
La descripcion proporciona un metodo para tratar un sujeto que padece o es susceptible a un tumor MUC-1 que comprende el aislamiento de celulas dendrfticas a partir de un sujeto afectado de cancer; y, el tratamiento de las celulas dendrfticas con uno o mas de los polipeptidos identificados por los SEQ ID NO: 1 a 19; fragmentos y variantes de los mismos. Preferiblemente, las celulas dendrfticas tratadas se administran al sujeto.
En otra descripcion mas, las celulas dendrfticas autologas se pueden aislar de un sujeto, transducir con los vectores
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descritos en detalle en la presente memoria, cultivar, y re-infundir al sujeto.
Una poblacion "aislada" o "purificada" de las celulas esta sustancialmente libre de celulas y materiales con los que esta asociado en la naturaleza. Por APC sustancialmente libres o sustancialmente purificadas se quiere significar que al menos 50% de la poblacion son APC, preferiblemente al menos 70%, mas preferiblemente al menos 80%, e incluso mas preferiblemente al menos 90% esta libre de celulas que no son APC con las que estan asociadas en la naturaleza.
Las celulas dendrfticas de las diferentes fases de maduracion se pueden aislar basandose en los marcadores de expresion de la superficie celular. Por ejemplo, las celulas dendrfticas maduras son menos capaces de captar nuevas protefnas para su presentacion, pero son mucho mejores en la estimulacion de las celulas T en reposo para crecer y diferenciarse. Asf, las celulas dendrfticas maduras pueden tener importancia. Las celulas dendrfticas maduras se pueden identificar por su cambio de morfologfa; por su falta de adherencia; y por la presencia de diversos marcadores. Tales marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores de superficie celular tales como B7.2, CD40, CD11c+, y MHC de Clase II. Alternativamente, la maduracion se puede identificar mediante la observacion o medicion de la produccion de citoquinas pro-inflamatorias. Las celulas dendrfticas pueden ser recogidas y analizadas utilizando tecnicas y dispositivos tfpicos de citofluorograffa y clasificacion de celulas, tales como un clasificador de celulas activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos especfficos para antfgenos de la superficie celular de las diferentes etapas de maduracion de las celulas dendrfticas estan disponibles comercialmente.
La cantidad de celulas dendrfticas administrada al sujeto tambien variara dependiendo del estado del sujeto y se debe determinar mediante la consideracion de todos los factores apropiados por el medico. Preferiblemente, sin embargo, se utilizan de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1x1012, mas preferiblemente de aproximadamente 1x108 a aproximadamente 1x1011, y aun mas preferiblemente, de aproximadamente 1x109 a aproximadamente 1x1010 celulas dendrfticas para los seres humanos adultos. Estas cantidades variaran dependiendo de la edad, el peso, el tamano, el estado, el sexo del sujeto, el tipo de tumor que se deba tratar, la via de administracion, si el tratamiento es regional o sistemico, y otros factores. Los expertos en la tecnica deben ser facilmente capaz de obtener las dosis y programas de administracion adaptados a las circunstancias y necesidades del sujeto especffico.
Los metodos de reintroduccion de componentes celulares son conocidos en la tecnica e incluyen procedimientos tales como los ilustrados en la Patente de Estados Unidos Num. 4.844.893 de Honsik, et al. y la Patente de Estados Unidos Num. 4.690.915 de Rosenberg. Por ejemplo, es apropiada la administracion de celulas CD8 activadas via infusion intravenosa. Cualquier toxicidad, de la infusion de celulas de donantes, observada en una mujer embarazada, dara lugar a la cesacion inmediata de cualquier infusion ulterior. La toxicidad se mide de acuerdo con la escala del Instituto Nacional del Cancer (NCI).
Clasificacion de toxicidad - Escala de toxicidad comun del NCI.
* Si se producen toxicidades de Grado I-II, el sujeto puede continuar con el programa de infusion.
* Si se produce toxicidad de Grado III, el "farmaco" se mantiene hasta que la toxicidad se reduce al Grado I o II, a continuacion, se reanuda la infusion. Si se produce toxicidad de Grado III o IV despues de la reanudacion, se detienen las infusiones de "farmacos".
* Si se produce toxicidad de Grado IV, se registra que el sujeto tiene toxicidad de Grado IV y la siguiente infusion se reduce a la dosis previa. Si la dosis previa provoca toxicidad de Grado IV, se detiene el "farmaco".
* Si se produce toxicidad de Grado IV en 1 de 3 sujetos a un nivel de dosis especffico, se introducen 3 sujetos adicionales en ese nivel de dosis celular para un total de 6 sujetos a ese nivel de dosis. Si 2 de 6 sujetos a un nivel de dosis celular desarrollan toxicidad de Grado IV, esta dosis se define como dosis maxima tolerada (MTD). A los siguientes 3 sujetos se les proporciona 66% (dos tercios) del nivel de dosis celular previo. A los efectos de la evaluacion del aumento de dosis, cada sujeto al mismo nivel de dosis debe haber recibido por lo menos 4 de 6 infusiones.
Se pueden generar grandes cantidades de celulas dendrfticas presentadoras de antfgeno ex vivo como se describe en la Patente de Estados Unidos Num. 6.497.876. Tras la recoleccion de progenitores hematopoyeticos y las celulas madre CD34+ de un sujeto, se puede usar citoquinas tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF) y el ligando flt-3 (flt3-L) para expandir las celulas in vitro y para conducir su diferenciacion a celulas del linaje de celulas dendrfticas. Las citoquinas tambien se pueden utilizar para aumentar el numero de celulas CD34+ en circulacion antes de la recoleccion. Las celulas dendrfticas resultantes se exponen a un antfgeno contra el que se desea provocar una respuesta inmunitaria, y se permite que se procese el antfgeno (este
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procedimiento se denomina a veces en la tecnica "pulsado con antfgeno"). Las celulas dendrfticas pulsadas con antfgeno (o que expresan el antfgeno) se activan con una protefna de union a CD40, y se administran posteriormente al sujeto.
Las celulas dendrfticas comprenden una poblacion heterogenea de celulas con morfologfa distintiva y una amplia distribucion tisular. El sistema de celulas dendrfticas y su papel en la inmunidad es revisada por Steinman, R. M., Annu. Rdo. Immunol., 9: 271-296 (1991), que se incorpora a la presente memoria como referencia. La superficie celular de las celulas dendrfticas es inusual, con proyecciones de tipo velo caracterfsticas, y se caracteriza por tener los marcadores de superficie celular CD1a+, CD4+, CD86+, o HLA-DR+. Las celulas dendrfticas tienen una alta capacidad para sensibilizar celulas T restringidas por el MHC y son muy eficaces en la presentacion de antfgenos a las celulas T in situ, tanto auto-antfgenos durante el desarrollo y la tolerancia de las celulas T y antfgenos foraneos durante la inmunidad.
Debido a su eficacia en la presentacion de antfgenos, las celulas dendrfticas autologas preferentemente se utilizan ex vivo como coadyuvantes aloantigenicos (vease, por ejemplo, Romani, et al., J. Exp. Med., 180:83 (1994). El uso de celulas dendrfticas como agentes inmunoestimuladores ha sido limitado debido a la baja frecuencia de celulas dendrfticas en la sangre periferica, la accesibilidad limitada de los organos linfoides y el estado de diferenciacion terminal de las celulas dendrfticas. Las celulas dendrfticas se originan a partir de progenitores de medula osea o de sangre periferica y celulas mononucleares de sangre periferica CD34+, y la proliferacion y maduracion de las celulas dendrfticas se pueden mejorar por las citoquinas sargramostim GM-CSF, Leukine™ (Immunex Corporation, Seattle, Wash.), TNF-a, ligando c-kit (tambien conocido como factor de celulas madre (SCF), factor de Steel (SF), o factor de crecimiento de mastocitos (MGF)) e interleuquina-4. Recientemente, se ha encontrado que flt3-L estimula la generacion de grandes cantidades de celulas dendrfticas funcionalmente maduras, tanto in vivo como in vitro.
Cultivo ex vivo de celulas dendrfticas
Un procedimiento para la expansion ex vivo de celulas madre y progenitoras hematopoyeticas se describe en la Patente de Estados Unidos Num. 5.199.942, incorporada a la presente memoria como referencia. Otros metodos adecuados son conocidos en la tecnica. Brevemente, el cultivo y expansion ex vivo comprende: (1) recoger celulas madre y progenitoras hematopoyeticas CD34+ de un sujeto a partir de la recoleccion de explantes de medula osea o sangre periferica; y (2) expandir tales celulas ex vivo. Ademas de los factores de crecimiento celular descritos en la Patente de Estados Unidos Num. 5.199.942, se pueden utilizar otros factores tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y el ligando c-kit,.
Las celulas madre o progenitoras que tienen el marcador CD34 constituyen solo aproximadamente 1% a 3% de las celulas mononucleares de la medula osea. La cantidad de celulas madre o progenitoras CD34+ en la sangre periferica es aproximadamente 10 a 100 veces menor que en la medula osea. Se pueden utilizar citoquinas tales como flt3-L para aumentar o movilizar el numero de celulas dendrfticas en vivo. El aumento de la cantidad de celulas dendrfticas de un sujeto puede facilitar la presentacion de antfgenos a las celulas T para el antfgeno o los antfgenos que ya existen en del sujeto, tales como un antfgeno tumoral, o un antfgeno bacteriano o viral. Alternativamente, las citoquinas se pueden administrar antes de, simultaneamente a o posteriormente a la administracion de un antfgeno a un sujeto con fines de inmunizacion.
celulas de sangre periferica se recogen utilizando procedimientos de aferesis conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Bishop et al., Blood, vol. 83, Num. 2, pags. 610-616 (1994). Brevemente, las celulas progenitoras de sangre periferica (PBPC) y las celulas madre de sangre periferica (PBSC) se recogieron utilizando dispositivos convencionales, por ejemplo, un dispositivo de aferesis Haemonetics Modelo V50 (Haemonetics, Braintree, Mass.). Se realizan tfpicamente recolecciones de cuatro horas no mas de cinco veces a la semana hasta que se recogen aproximadamente 6,5x10 celulas mononucleares (MNC)/kg. Las celulas se suspenden en un medio convencional y a continuacion se centrifugan para eliminar los globulos rojos y los neutrofilos. Las celulas localizadas en la interfase entre las dos fases (la capa leucocitaria) se retiran y se resuspenden en HBSS. Las celulas suspendidas son predominantemente mononucleares y una parte sustancial de la mezcla celular son celulas madre tempranas.
Se conoce una variedad de tecnicas de seleccion de celulas para la identificacion y la separacion de celulas madre o progenitoras hematopoyeticas CD34+ a partir de una poblacion de celulas. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales (u otras protefnas de union a celulas especfficas) para unirse a una protefna protefna marcadora o el antfgeno de superficie encontrado sobre las celulas madre o progenitoras. Varios de estos marcadores o antfgenos de superficie celular para las celulas madre hematopoyeticas (es decir, flt-3, CD34, My-10, y Thy-1) son conocidos en la tecnica, puesto que son protefnas de union especffica.
En un metodo, los anticuerpos o protefnas de union se fijan a una superficie, por ejemplo, esferas de vidrio o matraz, esferas magneticas, o una resina de cromatograffa adecuada, y se ponen en contacto con la poblacion de celulas.
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Las celulas madre se unen a la matriz de esferas. Alternativamente, las protefnas de union se pueden incubar con la mezcla de celulas y la combinacion resultante se puede poner en contacto con una superficie que tiene una afinidad por el complejo de anticuerpo-celula. celulas no deseadas y la materia celular se retiran proporcionando una poblacion relativamente pura de celulas madre. Las protefnas de union celulares especfficas tambien se pueden marcar con un marcador fluorescente, p. ej., cromoforo o fluoroforo, y las celulas marcadas se pueden separar por clasificacion. Preferiblemente, el aislamiento se realiza mediante una columna de inmunoafinidad.
Las columnas de inmunoafinidad pueden adoptar cualquier forma, pero normalmente comprenden un reactor de lecho relleno. El lecho de relleno en estos biorreactores se elabora preferiblemente a partir de un material poroso que tiene un revestimiento sustancialmente uniforme de un sustrato. El material poroso, que proporciona una alta razon de area superficial a volumen, permite que la mezcla de celulas fluya sobre una gran area de contacto, a la vez que no obstaculiza el flujo de celulas fuera del lecho. El sustrato debe, ya sea por sus propias propiedades, o por la adicion de un radical qufmico, presentar alta afinidad para un radical encontrado sobre la protefna de union a celulas. Los sustratos tfpicos incluyen avidina y estreptavidina, si bien se pueden utilizar otros sustratos convencionales.
En un metodo util, los anticuerpos monoclonales que reconocen un antfgeno de superficie celular en las celulas que deben ser separadas son tfpicamente modificados adicionalmente para presentar un radical de biotina. La afinidad de la biotina por la avidina fija de ese modo de forma extrafble el anticuerpo monoclonal a la superficie de un lecho de relleno (vease Berenson, et al., J. Immunol. Meth., 91:11, 1986). El lecho de relleno se lava para eliminar el material no unido, y las celulas diana se liberan utilizando metodos convencionales. Las columnas de inmunoafinidad del tipo antes descrito que utilizan anticuerpos monoclonales anti-CD34 biotinilados fijado a un lecho de relleno recubierto de avidina se describen, por ejemplo, en el documento WO 93/08268.
Un medio alternativo de seleccion de las celulas madre quiescentes es inducir la muerte celular en los tipos celulares, de linaje mas comprometido, en division utilizando un antimetabolito tal como 5-fluorouracilo (5-FU) o un agente alquilante, tal como 4-hidroxiciclofosfamida (4-HC). Las celulas no quiescentes son estimuladas para que proliferen y se diferencien mediante la adicion de factores de crecimiento que tienen poco o ningun efecto sobre las celulas madre, haciendo que las celulas que no son celulas madre proliferen y se diferencien y haciendolas mas vulnerables a los efectos citotoxicos de 5-FU o 4-HC. Vease Berardi et al., Science, 267:104 (1995), que se incorpora a la presente memoria como referencia.
Las celulas madre aisladas pueden ser congeladas en un congelador de velocidad controlada (p. ej., Cryo-Med, Mt. Clemens, Mich.), a continuacion se almacenan en la fase de vapor de nitrogeno lfquido utilizando dimetilsulfoxido como crioprotector. Se puede utilizar una variedad de medios de crecimiento y cultivo para el crecimiento y cultivo de celulas dendrfticas (frescas o congeladas), incluyendo medios empobrecidos en suero o basados en suero. Los medios de crecimiento utiles incluyen RPMI, TC 199, medio de Dulbecco modificado por Iscove (Iscove, et al., F. J. Exp. Med., 147: 923 (1978)), DMEM, de Fischer, medio alfa, NCTC, F-10, L-15 de Leibovitz, MEM y de McCoy. Los nutrientes concretos presentes en los medios incluyen albumina serica, transferrina, lfpidos, colesterol, un agente reductor tal como 2-mercaptoetanol o monotioglicerol, piruvato, butirato y un glucocorticoide tal como 2- hemisuccinato de hidrocortisona. Mas concretamente, los medios convencionales incluyen una fuente de energfa, vitaminas u otros compuestos organicos de soporte celular, un tampon tal como HEPES o Tris, que actua para estabilizar el pH de los medios, y diversas sales inorganicas. Una variedad de medios de cultivo celular libres de suero se describe en el documento WO 95/00632, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Las celulas CD34+ recogidas se cultivan con las citoquinas adecuadas, por ejemplo, como se describe en la presente memoria. A continuacion se permite que las celulas CD34+ se diferencien y se asignen a celulas del linaje dendrftico. Estas celulas se purifican adicionalmente mediante citometrfa de flujo o medios similares, utilizando marcadores caracterfsticos de las celulas dendrfticas, tales como CD1a, HLA DR, CD80 y/o CD86. Las celulas dendrfticas cultivadas se exponen a un antfgeno, por ejemplo, una molecula de HLA de clase I alogenica, permitida para procesar el antfgeno, y despues se cultivaron con una cantidad de una protefna de union a CD40 para activar la celula dendrftica. Alternativamente, las celulas dendrfticas son transfectadas con un gen que codifica una molecula de clase I de HLA alogenica o receptores inmunologicos relacionados, y a continuacion se cultivan con una cantidad de una protefna de union a CD40 para activar las celulas dendrfticas presentadoras de antfgeno.
Las celulas dendrfticas que portan antfgeno activadas son administradas a continuacion a un sujeto con el fin de estimular una respuesta inmunitaria especffica de antfgeno. Las celulas dendrfticas se pueden administrar antes de, simultaneamente a, o despues de, la administracion del antfgeno. Alternativamente, las celulas T se pueden recoger del sujeto y exponer a las celulas dendrfticas que portan antfgeno, activadas in vitro para estimular las celulas T especfficas de antfgeno, que se administran al sujeto.
Citoquinas utiles
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Varias citoquinas seran de utilidad en el cultivo ex vivo de celulas dendrfticas. Flt3-L se refiere a un genero de polipeptidos que se describen en el documento EP 0627487 A2 y en WO 94/28391, ambos incorporados a este documento como referencia. Un ADNc de flt3-L humano se deposito en la Coleccion de Cultivos Tipo Americana, Rockville, Md., EE.UU. (ATCC) el 6 de agosto de 1993, y se le asigno el numero de acceso ATCC 69382. La IL-3 se refiere a un genero de polipeptidos de interleuquina 3 como se describe en la Patente de Estados Unidos Num. 5.108.910, Incorporada a la presente memoria como referencia. Una secuencia de ADN que codifica la protefna IL-3 humana adecuada para su uso en la invencion esta disponible al publico de la Coleccion de Cultivos Tipo Americana (ATCC) bajo el numero de acceso ATCC 67747. El ligando c-kit tambien se conoce como Factor de Crecimiento de Mastocitos (MGF), Factor Steel o Factor de Celulas Madre (SCF), y se describe en el documento EP 423.980, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Otras citoquinas utiles incluyen interleuquina-4 (IL-4; Mosley et al., Cell 59:335 (1989), Idzerda et al., J. Exp. Med. 171:861 (1990) y Galizzi et al., Intl. Immunol. 2:669 (1990), cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF; descrito en las Patentes de Estados Unidos Num. 5.108.910 y 5.229.496 cada uno de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia). El GM-CSF disponible comercialmente (sargramostim, Leukine™) es obtenible de Immunex Corp., Seattle, Wash.). Por otra parte, las protefnas de fusion GM-CSF/IL-3 (es decir, una fusion C-terminal a N-terminal de GM-CSF e IL-3) tambien sera util en el cultivo ex vivo de la celulas dendrfticas. Tales protefnas de fusion se conocen y se describen en las Patentes de Estados Unidos Num. 5.199.942, 5.108.910 y 5.073.627, Cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia. Una protefna de fusion preferida es PIXY321 como se describe en la Patente de Estados Unidos Num. 5.199.942.
Las citoquinas utiles actuan uniendose a un receptor presente en la superficie de una celula dendrftica y transduciendo una senal. Por otra parte, se pueden preparar protefnas de union adicionales como se describe en la presente memoria para las protefnas de union a CD40, que se unen a receptores de citoquinas apropiados y transducen una senal a una celula dendrftica. Por ejemplo, el documento WO 95/27062 describe anticuerpos agonfsticos para Flt-3, el receptor de Flt-3L, a partir del cual se pueden preparar varias protefnas de union a Flt-3. Las citoquinas utiles adicionales incluyen analogos biologicamente activos de las citoquinas que son utiles para el cultivo de celulas dendrfticas. Los analogos de citoquinas utiles tienen una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente similar a la de la citoquina nativa, y son biologicamente activos capaces de unirse a su receptor especffico y de transduccir una senal biologica. Tales analogos se pueden preparar y someter a ensayo por medio de metodos que son conocidos en la tecnica.
Un metodo alternativo para la preparacion de celulas dendrfticas que presentan antfgenos es para transfectar las celulas dendrfticas con un gen que codifica un antfgeno o un polipeptido especffico derivado de la misma. Una vez que las celulas dendrfticas expresan el antfgeno en el contexto del MHC, las celulas dendrfticas se activan con una protefna de union a CD40, y se administran posteriormente al sujeto para proporcionar una respuesta inmunitaria mas fuerte y mejorada al antfgeno.
Las celulas dendrfticas presentadoras de antfgeno activadas tambien se pueden usar como un coadyuvante de vacuna y se pueden administrar antes de, simultaneamente a o posteriormente a la administracion del antfgeno. Ademas, las celulas dendrfticas se pueden administrar al sujeto antes de, simultaneamente a o posteriormente a la administracion de citoquinas que modulan una respuesta inmunitaria, por ejemplo una protefna de union a CD40 (es decir, CD40L soluble), o una molecula de CD83 soluble. Las citoquinas utiles adicionales incluyen, pero no se limitan a, interleuquinas (IL) 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10, 12 y 15, factores estimulantes de colonias (CSF), tales como GM-CSF, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), o protefnas de fusion GM-CSF/IL-3, u otras citoquinas tales como TNF-a o ligando c-kit. Por otra parte, los derivados biologicamente activos de estas citoquinas; y tambien seran utiles sus combinaciones.
CD40 es un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF)/factor de crecimiento nervioso (NGF), que se define por la presencia de motivos ricos en cistefna en la region extracelular (Smith et al., Science 248:1019, 1990; Mallett y Barclay, Immunology Today 12: 220; 1991). Esta familia incluye el antfgeno linfocitario CD27, CD30 (un antfgeno encontrado en el linfoma de Hodgkin y celulas de Reed-Stemberg), dos receptores para TNF, una protefna murina referida como 4-1BB, antfgeno OX40 de rata, receptor de NGF, y antfgeno Fas. El antfgeno CD40 humano (CD40) es un peptido de 277 aminoacidos que tiene un peso molecular de 30.600 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403, 1989). Se cree que CD40L es importante en la regulacion de la retroalimentacion de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, una celula presentadora de antfgeno CD40+ presentara el antfgeno a una celula T, que a continuacion se activara y expresara CD40L. A su vez, CD40L, activara adicionalmente la celula presentadora de antfgeno, aumentando de su eficacia en la presentacion de antfgenos, y regulando al alza la expresion del MHC de Clase I y de Clase II, moleculas co-estimuladoras CD80 y CD86, asf como diversas citoquinas (Caux et al., J. Exp. Med. 180:1263, 1994).
La celulas dendrfticas purificadas se pulsaron a continuacion con (se expusieron al) antfgeno, para permitir que
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tomen el antfgeno de una manera adecuada para su presentacion a otras celulas del sistema inmunologico. Los antfgenos se procesan y se presentan clasicamente a traves de dos vfas. Los peptidos derivados de protefnas en el compartimento citosolico se presentan en el contexto de moleculas de MHC de Clase I, mientras que los peptidos derivados de protefnas que se encuentran en la via endocftica se presentan en el contexto del MHC de Clase II. Sin embargo, los expertos en la tecnica reconoceran que hay excepciones; por ejemplo, la respuesta de las celulas T especfficas de tumor CD8+, que reconocen antfgenos tumorales exogenos expresados en el MHC de Clase I. Una revision del procesamiento de antfgenos y la presentacion de peptidos dependientes del MHC se encuentra en Germain, R. N., Cell 76:287 (1994).
Se conocen numerosos procedimientos de pulsacion de celulas dendrfticas con antfgeno; los expertos en la tecnica contemplan el desarrollo de metodos adecuados para un antfgeno seleccionado como experimentacion de rutina. En general, se anade el antfgeno a las celulas dendrfticas cultivadas en condiciones que promueven la viabilidad de las celulas, y despues se deja tiempo suficiente para que las celulas absorban y procesen el antfgeno, y expresen peptidos antigenicos en la superficie celular en asociacion con el MHC de Clase I o Clase II, un perfodo de aproximadamente 24 horas (de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 horas, preferiblemente 24 horas). Las celulas dendrfticas tambien pueden estar expuestas a antfgeno mediante la transfeccion con ADN que codifica el antfgeno. El ADN se expresa, y el antfgeno se procesa supuestamente a traves de la via citosolica/Clase I.
La presente descripcion proporciona metodos de utilizacion de composiciones terapeuticas que comprenden, celulas dendrfticas pulsadas con antfgeno activados. Tambien se contempla el uso de tales celulas junto con receptores solubles de citoquinas o citoquinas, u otras moleculas inmunorreguladoras. Las composiciones se administran para estimular una respuesta inmunitaria alogenica, y se pueden administrar por inyeccion de bolo, infusion continua, liberacion sostenida a partir de implantes, u otra tecnica adecuada. Tfpicamente, las celulas seran administrados en forma de una composicion que comprende las celulas dendrfticas activadas, pulsadas con antfgeno junto con portadores, excipientes o diluyentes fisiologicamente aceptables. Tales portadores seran no toxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. La solucion salina tamponada neutra o la solucion salina mezclada con albumina de suero son ejemplos de diluyentes apropiados.
Para su uso en la estimulacion de un determinado tipo de respuesta inmunitaria, tambien se contempla la administracion de otras citoquinas ademas de, las celulas dendrfticas pulsadas con antfgeno activadas. Varias citoquinas utiles (o factores reguladores peptfdicos) son comentadas por Schrader, J. W. (Mol Immunol 28:295; 1991). Tales factores incluyen (solos o combinados) interleuquinas 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10, 12 y 15; factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos, factor estimulante de colonias de granulocitos; una protefna de fusion que comprende interleuquina-3 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos; interferon-Y, TNF, TGG-p, ligando flt-3 y derivados biologicamente activos de los mismos. Una citoquina particularmente preferida es el ligando CD40 (CD40L). Otras citoquinas tambien seran utiles, como se describe en la presente memoria. El ADN que codifica tales citoquinas tambien sera util en los metodos de la invencion, por ejemplo, mediante la transfeccion de las celulas dendrfticas para expresar las citoquinas. La administracion de estas moleculas inmunomoduladoras incluye la administracion simultanea, separada o secuencial con las celulas de la presente invencion.
La descripcion proporciona un polipeptido identificado por uno cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 19 que tiene una identidad de secuencia con una cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 19 de al menos aproximadamente 10%, mas preferiblemente, 25%, incluso mas preferiblemente de aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 99,9%. Las celulas dendrfticas pueden ser pulsadas con cualquiera de estos polipeptidos durante el cultivo ex vivo.
En un aspecto de la invencion, el polipeptido comprende el SEQ ID NO: 19. Preferiblemente, el polipeptido se une a moleculas de HLA con una alta avidez y tiene una constante de asociacion (Ka) superior para HLA que un polipeptido nativo y/o una constante de disociacion (Kd) inferior para HLA de un polipeptido nativo.
En otro aspecto de la descripcion, el polipeptido deriva de un antfgeno tumoral de mucina, preferiblemente, el polipeptido deriva de un numero no variable de la region de repeticiones en tandem de MUC-1.
En otro aspecto de la invencion, la presentacion de antfgeno, por las celulas presentadoras de antfgeno de los polipeptidos induce una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta inmunitaria celular. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria celular es una respuesta citotoxica de las celulas T, una respuesta de celulas T auxiliares, o una respuesta inmunitaria de celulas B.
En otra descripcion, las variantes de la molecula de acido nucleico que codifica los polipeptidos identificados por el SEQ ID NO: 1 a 19 se pueden utilizar para transducir las celulas inmunitarias para la deteccion y lisis de, por ejemplo, canceres positivos para MUC-1. Un "alelo" o "variante" es una forma alternativa de un gen. Son de particular utilidad en la descripcion las variantes de los genes que codifican marcadores de celulas tumorales potenciales MUC-1 + cualesquiera identificados por medio de los metodos de esta descripcion. Las variantes pueden ser el resultado de al menos una mutacion en la secuencia de acido nucleico y pueden dar como resultado ARNm
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alterados o polipeptidos cuya estructura o funcion pueden ser alterados o no. Cualquier gen natural o recombinante dado puede no tener ninguna, o tener una o muchas formas alelicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleotidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede ocurrir solo o combinado con los otros, una o mas veces en una secuencia dada.
Las composiciones y metodos de la presente descripcion tambien abarcan variantes de los polipeptidos anteriores y secuencias de acido nucleico que codifican tales polipeptidos. Una "variante" de polipeptido segun se utiliza en la presente memoria, es un polipeptido que difiere del polipeptido nativo en sustituciones y/o modificaciones, de manera que las propiedades antigenicas y/o inmunogenicas del polipeptido se mantienen. Tales variantes se pueden identificar generalmente modificando una de las secuencias de polipeptidos anteriores y evaluando la reactividad del polipeptido modificado con antisueros y/o celulas T como se ha descrito anteriormente. Las variantes de acidos nucleicos pueden contener una o mas sustituciones, deleciones, inserciones y/o modificaciones de tal manera que se conserven las propiedades antigenicas y/o inmunogenicas del polipeptido codificado. Una variante preferida de los polipeptidos descritos en la presente memoria es una variante que contiene sustituciones, deleciones, inserciones y/o modificaciones de nucleotidos en no mas de 20% de las posiciones de los nucleotidos.
Preferiblemente, pero sin limitarse a, una variante contiene sustituciones conservativas. Una "sustitucion conservativa" es una en la que un aminoacido es sustituido por otro aminoacido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la tecnica de la qufmica de peptidos esperarfa que la estructura secundaria y la naturaleza hidropatica del polipeptido permaneciera sustancialmente sin cambios. En general, los siguientes grupos de aminoacidos representan cambios conservativos: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) vat, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Sin embargo, cualquier tipo de sustitucion esta dentro del alcance y las realizaciones de la descripcion.
Las variantes pueden tambien (o alternativamente) ser modificadas mediante, por ejemplo, la delecion o adicion de aminoacidos que tienen influencia minima sobre las propiedades inmunogenicas o antigenicas, la estructura secundaria y la naturaleza hidropatica del polipeptido. Por ejemplo, un polipeptido puede ser conjugado con una secuencia senal (o lider) en el extremo N-terminal de la proteina que co-traduccionalmente o post- tranduccionalmente dirige la transferencia de la proteina. El polipeptido tambien puede ser conjugado con un conector u otra secuencia por facilidad de sfntesis, purificacion o identificacion del polipeptido (p. ej., poli-His), o para mejorar la union del polipeptido a un soporte solido. Por ejemplo, un polipeptido puede conjugarse con una region Fc de inmunoglobulina.
En general, las secuencias de nucleotidos que codifican todo o una porcion de los polipeptidos descritos en la presente memoria se pueden preparar utilizando cualquiera de varias tecnicas. Por ejemplo, las moleculas de ADNc que codifican tales polipeptidos se pueden clonar, basandose en la expresion especffica del tumor MUC-1 de los ARNm correspondientes, utilizando PCR de visualizacion diferencial. Esta tecnica compara los productos amplificados a partir de molde de ARN preparado a partir de tejido tumoral normal y positivo para MUC-1. El ADNc se puede preparar por transcripcion inversa del ARN utilizando un cebador al azar, tal como, por ejemplo, cebador (dT)12 AG. Despues de la amplificacion del ADNc utilizando un cebador al azar, se puede cortar una banda correspondiente a un producto amplificado especffico para el ARN del tumor de un gel tenido con plata y subclonar en un vector adecuado, tal como el vector de adenovirus descrito en los ejemplos siguientes. Las secuencias de nucleotidos que codifican todo o una porcion de los polipeptidos especfficos de tumores MUC-1 descritos por cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 6 y variantes de los mismos pueden ser amplificados a partir de ADNc preparado como se ha descrito anteriormente utilizando los cebadores al azar.
Alternativamente, un gen que codifica un polipeptido como se describe en la presente memoria (o una porcion del mismo) puede ser amplificado a partir de ADN genomico humano, o a partir de ADNc de celulas tumorales, por medio de la reaccion en cadena de la polimerasa.
En una realizacion de la descripcion la presencia de la una o mas moleculas de acido nucleico se correlaciona con una muestra de un sujeto normal. La muestra se obtiene preferiblemente de un mamffero sospechoso de tener un trastorno del crecimiento celular proliferativo, en particular, un cancer MUC-1+.
El porcentaje de identidad y similitud entre dos secuencias (acidos nucleicos o polipeptidos) se puede determinar utilizando un algoritmo matematico (vease, por ejemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed, Academic Press, Nueva York, 1993.; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).
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En otra realizacion preferida, los fragmentos de peptidos MUC-1 y derivados de la invencion son de una longitud suficiente de tal manera que activan el sistema inmunitario dando como resultado la lisis de las celulas cancerosas, tales como, por ejemplo las celulas que expresan MUC-1. Las moleculas de acido nucleico MUC-1, fragmentos y derivados que codifica cualquiera de los polipeptidos identificados por los SEQ ID NO: 1 a 19, por lo tanto comprenden preferiblemente al menos aproximadamente 90% de nucleotidos en comparacion con la secuencia identificada por cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 19, por lo general al menos aproximadamente 80% de nucleotidos en comparacion con la secuencia identificada por cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 19, mas usualmente al menos aproximadamente 70% de nucleotidos en comparacion con la secuencia identificada por cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 19, incluso mas tfpicamente al menos aproximadamente 40% o 50% de nucleotidos.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de acidos nucleicos, las secuencias se alinean con propositos de comparacion optima (p. ej., pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoacidos o acido nucleico para el alineamiento optimo y las secuencias no homologas pueden no tomarse en consideracion a efectos de comparacion). En una realizacion preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada con propositos de comparacion es al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, mas preferiblemente al menos 50%, incluso mas preferiblemente al menos 60%, e incluso mas preferiblemente al menos 70%, 80%, o 90% de la longitud de la secuencia de referencia. Los nucleotidos en las posiciones de nucleotidos correspondientes se comparan a continuacion. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el nucleotido como la posicion correspondiente en la segunda secuencia, en ese caso las moleculas son identicas en esa posicion (segun se utiliza en la presente memoria "identidad" de acido nucleico es equivalente a "identidad de secuencia" de acido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, que se deben introducir para el alineamiento optimo de las dos secuencias.
La comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr utilizando un algoritmo matematico. En una realizacion preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos se determina utilizando el programa GAP en el paquete de soporte logico GCG (disponible en lfnea a traves de Genetics Computer Group), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70, o 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Un ejemplo preferido, no limitante de parametros que se deben utilizar junto con el programa GAP incluye una matriz de puntuacion Blosum 62 con una penalizacion por hueco de 12, una penalizacion por extension de hueco de 4, y una penalizacion de hueco por desplazamiento de marco de 5.
En otra realizacion, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos o nucleotidos se determina utilizando el algoritmo de Meyers y Miller (Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17 (1988)) que se ha incorporado al programa ALIGN (version 2.0 o version 2.0U), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalizacion por longitud de hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4.
El tratamiento de la enfermedad neoplasica o celulas neoplasicas, se refiere a una cantidad de los vectores y/o peptidos, descritos en toda la memoria descriptiva y en los Ejemplos que siguen, capaz de invocar uno o mas de los siguientes efectos: (1) inhibicion, en cierta medida, del crecimiento del tumor, incluyendo, (i) reduccion de la velocidad y (ii) detencion completa del crecimiento; (2) reduccion del numero de celulas tumorales; (3) mantenimiento del tamano del tumor; (4) reduccion del tamano del tumor; (5) inhibicion, incluyendo (i) reduccion, (ii) ralentizacion o (iii) prevencion completa, de la infiltracion de celulas tumorales a organos perifericos; (6) inhibicion, incluyendo (i) reduccion, (ii) ralentizacion o (iii) prevencion completa, de la metastasis; (7) mejora de la respuesta inmunitaria anti-tumoral, que puede dar como resultado (i) mantenimiento del tamano del tumor, (ii) reduccion del tamano del tumor, (iii) ralentizacion del crecimiento del tumor, (iv) reduccion, ralentizacion o prevencion de la invasion o (v) reduccion, ralentizacion o prevencion de metastasis; y/o (8) alivio, hasta cierto punto, de uno o mas sfntomas asociados con el trastorno.
Asf, en un aspecto de la descripcion, se puede utilizar cualquier variante, fragmento, mutante para transducir las celulas inmunitarias, tales como por ejemplo celulas dendrfticas, para el tratamiento de un sujeto que sufre, o, de forma profilactica a un sujeto susceptible al cancer. Como se comento anteriormente, un uso preferido de secuencias de acido nucleico identificadas en la presente invencion, es para la generacion de los tratamientos que lisan por ejemplo, celulas cancerosas MUC-1. Las moleculas de acido nucleico pueden ser expresadas por un vector que contiene un segmento de ADN que codifica los alelos, variantes, mutaciones o fragmentos de los genes de tipo salvaje. Las mutaciones y alelos de las moleculas de acidos nucleicos tambien se utilizan preferiblemente en la construccion de un vector para su uso en el tratamiento. El vector que comprende la secuencia de acido nucleico deseada para conferir resistencia a, por ejemplo, cancer positivo para MUC-1, preferiblemente tiene al menos tal secuencia de acido nucleico. Alternativamente, el vector puede estar compuesto por mas de una secuencia de acido nucleico, o combinaciones de variantes alelicas. El vector tambien puede estar compuesto de cassettes de diferentes variantes alelicas o moleculas de acido nucleico de tipo natural.
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De acuerdo con la presente invencion puede emplearse biologfa molecular convencional, microbiologfa y tecnicas de ADN recombinante dentro del conocimiento practico de la tecnica. Tales tecnicas se explican completamente en la bibliograffa. Vease, p. ej., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (en la presente memoria "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
La introduccion de los genes, fragmentos o alelos de los mismos, en un sujeto puede incluir el uso de vectores, liposomas, ADN desnudo, ADN asistido por coadyuvante, pistola de genes, cateteres, etc. Los vectores incluyen productos conjugados qufmicos como se describe en el documento WO 93/04701, que tiene un radical de direccionamiento (p. ej., un ligando para un receptor de superficie celular), y un radical de union a acido nucleico (p. ej., polilisina), vector viral (p. ej., un ADN o un vector viral de ARN), protefnas de fusion como las descritas en el documento PCT/US95/02140 (documento WO 95/22618) que son protefnas de fusion que contienen un radical diana (p. ej. un anticuerpo especffico para una celula diana) y un radical de union a acidos nucleicos (p. ej., una protamina), plasmidos, fagos, etc. Los vectores pueden ser cromosomico, no cromosomico o sinteticos.
En otra realizacion preferida, las celulas son celulas aisladas y purificadas a partir de una muestra, sujeto o sujeto donante y se utilizan en analisis funcionales para determinar las propiedades de las celulas. Dependiendo de la poblacion celular aislada y purificada, se pueden llevar a cabo analisis funcionales apropiados conocidos en la tecnica. Por ejemplo, si la poblacion de celulas son celulas T especfficas para un antfgeno deseado como un antfgeno tumoral, se pueden llevar a cabo analisis de celulas T citotoxicas, analisis de proliferacion de celulas T, perfiles de citoquinas, determinacion de antfgenos de superficie para determinar celulas T maduras o celulas T de memoria, etc.
El aislamiento de celulas utiles en la presente invencion es bien conocido en la tecnica. Por ejemplo, se pueden obtener celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de un sujeto y se pueden aislar por centrifugacion en gradiente de densidad, por ejemplo, con Ficoll/Hypaque. Se pueden empobrecer o enriquecer poblaciones de celulas especfficas utilizando metodos convencionales. Por ejemplo, se pueden aislar monocitos/macrofagos mediante adherencia sobre plastico. Se pueden empobrecer o enriquecer celulas T o celulas B, por ejemplo, mediante seleccion positiva y/o negativa utilizando anticuerpos frente a marcadores de superficie de celulas T o celulas B, por ejemplo mediante la incubacion de las celulas con un anticuerpo monoclonal (mAb) primario especffico, seguido de aislamiento de las celulas que se unen al mAb utilizando esferas magneticas recubiertas con un anticuerpo secundario que se une al mAb primario. Las celulas madre hematopoyeticas derivadas de sangre periferica o de medula osea pueden ser aisladas por medio de tecnicas similares utilizando mAb especfficos de celulas madre (por ejemplo, mAbs anti-CD34). Tambien se pueden aislar poblaciones de celulas especfficas mediante clasificacion celular activada por fluorescencia de acuerdo con metodos convencionales. Los anticuerpos monoclonales para marcadores superficiales especfficos de celulas son conocidos en la tecnica y muchos estan disponibles comercialmente.
Si se desea, puede retirarse una gran proporcion de celulas diferenciadas terminalmente utilizando inicialmente una separacion "relativamente rudimentaria". Por ejemplo, se pueden utilizar inicialmente separaciones con esferas magneticas para eliminar un gran numero de celulas de linaje comprometido. Deseablemente, se puede retirar al menos aproximadamente 80%, usualmente al menos 70% de las celulas hematopoyeticas totales.
Los procedimientos para la separacion pueden incluir, pero no se limitan a, separacion magnetica, utilizando esferas magneticas recubiertas de anticuerpo, cromatograffa de afinidad, agentes citotoxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o usados en junto con un anticuerpo monoclonal, incluyendo, pero no limitado a, complemento y citotoxinas, y "inmunoprecipitacion" con anticuerpo unido a una matriz solida, p. ej., placa, elutriacion o cualquier otra tecnica conveniente.
Los procedimientos para la deteccion pueden incluir, metodos de escrutinio de moleculas para generar una respuesta inmunitaria a un antfgeno tumoral MUC-1. Los metodos pueden incluir:
alterar un acido nucleico que codifica una porcion del numero no variable de repeticiones en tandem de MUC-1; expresar el acido nucleico modificado para producir una molecula; poner en contacto una celula dendrftica con la molecula; y poner en contacto una celula T con la celula dendrftica,
en donde una modulacion de la produccion de IFN-y de la celula T indica que la molecula puede generar una respuesta inmunitaria.
Las tecnicas que proporcionan una separacion exacta incluyen, pero no se limitan a, citometrfa de flujo, que puede 5 tener diferentes grados de sofisticacion, p. ej., una pluralidad de canales de color, canales de deteccion de dispersion de luz de bajo angulo y obtuso, canales de impedancia, etc.
El peptido de acuerdo con la invencion puede ser codificado por las secuencias correspondientes que aparecen en la presente memoria, pero tambien puede ser codificado por codones degenerados, incluyendo:
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Aminoacido
Codigo
A
GCT, GCC, GCA, GCG
R
CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
n
AAT, AAC
D
GAT, GAC
C
TGT, TGC
G
GGT, GGC, GGA, GGG
Q
CAA, CAG
E
GAA, GAG
H
CAT, CAC
I
ATC, ATT, ATA
L
TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG
K
AAA, AAG
M
ATG
f
TTT, TTC
P
CCT, CCC, CCA, CCG
S
TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC
T
ACT, ACC, ACA, ACG
W
TGG
Y
TAT, TAC
V
GTT, GTC, GTA, GTG
La invencion se ha descrito en detalle con referencia a realizaciones preferidas de la misma.
Los siguientes ejemplos no limitantes son ilustrativos de la invencion.
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Ejemplos
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Materiales y metodos Cultivos celulares.
La lmea celular de adenocarcinoma de mama humano MCF-7 (positivo para HLA-A2 y positivo para MUC-1), y SK- Mel-24 (positivo para HLA-A2, negativo para MUC-1) se adquirieron de la Coleccion de Cultivos Tipo Americana (Manassas, VA) . Los cultivos estaban libres de micoplasma y se mantuvieron en medio completo [medio RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) con un suplemento de suerto fetal bovino al 10%, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 qg/ml de estreptomicina (Invitrogen Life Technologies, Inc.)]. La lmea celular C1R es una lmea celular de leucemia plasmatica humana que no expresa antfgenos HLA-A o B endogenos. Las celulas C1R-A2 son celulas C1R que expresan un clon genomico transfectado de HLA-A2.1. Estas celulas se obtuvieron del Dr. William E. Biddison (Instituto Nacional de Trastornos Neurologicos y Accidentes Cerebrovasculares, NIH, Bethesda, MD). El mutante por delecion de transporte (T2) de la lmea celular 174CEM-T2 fue proporcionado por el Dr. Peter Cresswell (Escuela de Medicina de la Universidad de Yale, New Haven, CT). Las celulas C1R-A2 y las celulas T2 estaban libres de micoplasma y se mantuvieron en medio RPMI 1640 completo y en medio completo de Dulbecco modificado por Iscove (Invitrogen Life Technologies), respectivamente.
Peptidos.
La secuencia de aminoacidos de MUC-1 se exploro en busca de coincidencias con motivos consenso para peptidos de union a HLA-A2. Se utilizo el algoritmo de la computadora de BioInformatics and Molecule Analysis Section of NIH (BIMAS) que fue desarrollado por Parker KC et al., (J. Immunol., 152: 163-175, 1994), que clasifica los posibles peptidos de union al MHC de acuerdo con la disociacion en la mitad de tiempo predictiva de los complejos de peptido/MHC. Los alelos HLA-A2 se eligieron puesto que son los alelos de Clase I expresados mas comunmente. Los peptidos decamericos del numero no variable de la secuencia de repeticion en tandem se sintetizaron si se ajustaban al respectivo motivo consenso. Un panel de peptidos MUC-1 decamericos (Tabla 1) y analogos con sustitucion de un solo aminoacido en las posiciones P1 a P10 del peptido P-92 MUC-1 (vease la Figura 1) fue preparado por American Peptide Company (Sunnyvale, CA) con una pureza >90%. Ademas, un peptido CEA CAP1- 6D (28) puro en >96% fue preparado por American Peptide Company (Sunnyvale, CA).
Analisis por citometna de flujo
(i) Analisis por citometna de flujo de un solo color.
El metodo para el analisis por citometna de flujo de un solo color se ha descrito previamente (Gaudagni F. et al. Cancer Res.:50: 6248-6255, 1990). Brevemente, las celulas se lavaron tres veces con DPBS sin Ca2+ y Mg2+ fno y a continuacion se tineron durante 1 hora a 4°C utilizando 1 qg de mAb contra HLA-A2 (A2, 28, One Lambda, Inc., Canoga Park, CA), CD3, CD4, CD8, y CD56 (BD Biosciences, San Jose, CA). Se utilizo plasmocitoma-104E por aceite mineral (Cappel/Organon Teknika Corp., West Chester, PA) como control de isotipo. A continuacion, las celulas se lavaron tres veces y se incubaron con una dilucion 1:100 de inmunoglobulina de cabra anti-raton (IgG) marcada con isotiocianato de fluorescema (FITC) (Kirkegaard y Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Las celulas se analizaron inmediatamente utilizando un FACScan Becton Dickinson equipado con un laser azul con una excitacion de 15 nW a 488 nm. Los datos se obtuvieron a partir de 10.000 celulas vivas, se almacenaron y se utilizaron para generar los resultados.
(ii) Analisis por citometna de flujo de dos colores.
El procedimiento para el analisis por citometna de flujo de dos colores fue similar al del analisis de un solo color con las siguientes excepciones. Para el analisis de las celulas dendnticas se utilizaron Anti-MHC de Clase II FITC/anti- CD11c PE, anti-MHC de Clase II FITC/anti-CD80 PE, anti-CD58 FITC/anti-CD54 PE, anti-MHC de Clase I FITC/anti- MHC de Clase II PE, y anti-IgG1 FITC/anti-IgG2a PE (controles de isotipo); >96% de las celulas dendnticas fueron positivas para CD11c y MHC de Clase II.
Los anticuerpos utilizados para el analisis de lmeas de celulas T fueron anti-CD56 FITC/anti-CD8 PE, anti-CD4 FITC/anti-CD8 PE y anti-CD45R0-FITC/anti-CD49d PE; >98% de las celulas T-1191-P92 y T-1191-P-93L fueron positivas para CD8. Los anticuerpos contra CD4, CD8, CD28, CD45RO, CD56, CD49d, CD54, CD80, CD86, CD58 y CD11c se adquirieron de BD Biosciences. Los anticuerpos contra MHC de Clase I y MHC de Clase II se adquirieron de Serotec, Oxford, Reino Unido. La tincion se realizo simultaneamente durante 1 h, despues de lo cual las celulas se lavaron tres veces, se resuspendieron como antes, y se analizaron inmediatamente utilizando un FACScan Becton Dickinson equipado con un laser azul con una excitacion de 15 mW a 488 nm con el uso del programa CELLQuest.
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Los resultados se expresaron en % de celulas positivas e intensidad media de fluorescencia (IMF). La IMF se utilizo para expresar los niveles de fluorescencia determinados midiendo el promedio para todas las celulas en el grafico de puntos de fluorescencia en ventanas de analisis. El valor de IMF se recogio en la escala logarftmica en el citometro.
Peptido de union a HLA-A2.
La union de P-92 y analogos de P-92 a las moleculas de HLA-A2 se evaluo mediante la union a las celulas T2A2 como se demuestra por citometrfa de flujo. En este analisis, el aumento de la estabilidad (acumulacion) de las moleculas de HLA-A2 en la superficie de celulas T2 como consecuencia de la union del peptido se mide por medio del aumento de la union del anticuerpo dirigido contra la molecula fr HLA-A2. En pocas palabras, se incubaron 1 x
106 celulas en medio completo de Dulbecco modificado por Iscove libre de suero con peptidos a una concentracion de 50 pg/ml en placas de cultivo de 24 pocillos a 37°C en 5% de CO2. La citometrfa de flujo para determinar la union del peptido se llevo a cabo utilizando celulas T2 y analisis de un solo color. Despues de lavar las celulas tres veces en DPBS, como se describio anteriormente, se incubaron durante 1 h con una dilucion 1:100 de MAb especffico de HLA-A2 (One Lambda, Inc.) por cada 106 celulas. Se utilizo UPC-10 (Cappel/Organon Teknika) como control de isotipo. Las celulas se lavaron a continuacion tres veces y se incubaron con una dilucion 1:100 de anti-IgG de raton marcado con FITC (BD Biosciences). El analisis se llevo a cabo con el FACScan, como se ha descrito anteriormente. Las celulas se mantuvieron en hielo durante toda la preparacion y tincion de las celulas.
Cultivo de DC a partir de PBMC.
Se obtuvieron PBMC de donantes normales de HLA-A2 a partir de sangre heparinizada. Las PBMC se separaron utilizando gradiente de medio de separacion de linfocitos (Organon Teknika, Durham, NC), como se ha descrito anteriormente (Boyum, A. Scand J. Clin. Lab. Invest. 97 (Suppl): 51 a 76, 1968). Las DC se prepararon utilizando una modificacion del procedimiento descrito por Sallusto et al. (J. Exp. Med., 179: 1109-1118, 1994). Las PBMC (1,5 x 108) se resuspendieron en medio AIM-V que contenfa glutamina 2 mM, 50 pg/ml de estreptomicina y 10 pg/ml de gentamicina (Invitrogen Life Technologies, Inc.), y se permitio que se adhirieran a un matraz T-150 (Corning Costar Corp., Cambridge, MA). Despues de 2 h a 37°C, las celulas no adherentes se eliminaron con un enjuague suave. Las celulas adherentes se cultivaron durante 6-7 dfas en medio AIM-V que contenfa 100 ng/ml de GM-CSF humano recombinante (rhGM-CSF) y 20 ng/ml de IL- 4 humana recombinante (rhIL-4). El medio de cultivo se repuso cada 3 dfas.
Virus recombinante e infeccion de las DC con el virus de la viruela aviar que contiene MUC-1 (rF-MUC-1/TRICOM).
El virus de la viruela aviar recombinante se construyo tal como describen Jenkins S., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 7: 991-998, 1991. Se utilizo un producto aislado purificado en placa de la cepa de la vacuna POXVAC- TC del virus de la viruela aviar como virus parental para este virus recombinante. Las secuencias MUC-1, LFA-3, ICAM-1, y B7-1 se insertaron en la region J BamHI, del genoma del virus de la viruela aviar. Ademas, se incluyo el gen lacZ, bajo el control del promotor C1 de la viruela aviar, para identificar y aislar los virus recombinantes utilizando un ensayo cromogenico para la p-galactosidasa. El gen MUC-1 que se inserto en el virus de la viruela aviar varfa del gen nativo MUC-1. Se codifica una secuencia senal de 30 aminoacidos, seguida de los primeros 38 aminoacidos de la secuencia N-terminal madura de la protefna MUC-1, 10 copias identicas de la secuencia repetida de 20 aminoacidos, y la porcion C-terminal de la protefna. La secuencia repetida de 600 pb fue producida utilizando oligonucleotidos sinteticos solapantes que contenfan codones con numerosas variaciones de la tercera base de cada secuencia de repeticion sin cambiar los aminoacidos codificados. Esto se hizo para reducir al mfnimo la duplicacion de secuencias de nucleotidos, que son inestables en virus de la viruela, a la vez que se mantenfan las secuencias de aminoacidos repetidas.
rF-MUC-1/TRICOM es un virus de la viruela aviar recombinante que contiene el gen de MUC-1 bajo el control del promotor 40K, el gen de LFA-3 humano bajo el control del promotor 30K de Vaccinia, el gen ICAM-1 humano bajo el control del promotor de I3 de vaccinia, y el gen B7-1 humano bajo el control del promotor temprano/tardfo sintetico (sE/L). Las celulas dendrfticas (DC) (1 x 10°) se incubaron en 1 ml de medio Opti-MEM (Life Technologies, Inc.) a 37°C con rF-MUC-1/TRICOM o vector de avipoxvirus (FP-WT). Los experimentos de titulacion demostraron que 4 x
107 unidades formadoras de placa/ml, equivalentes a una MOI de 40:1 durante 2 h, fueron capaces de inducir la expresion del transgen de modo sistematico en aproximadamente el 75% de las DC infectadas. Las DC infectadas se suspendieron en 10 ml de medio completo RPMI-1640 de nueva aportacion, tamplado que contenfa 100 ng/ml de rhGM-CSF, 20 ng/ml de rhIL-4, y 20 ng/ml de TNF-a se cultivaron durante 24 h, y a continuacion se utilizaron como APC.
Generacion de lfneas de celulas T.
La modificacion del protocolo descrito por Tsang K.Y. et al., J. Natl. Cancer Inst., 87: 982-990, 1995 , se utilizo para
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generar CTL especfficos de MUC-1. Para generar las lineas de celulas T T-1191-P-93L y T-1191-P-92, se utilizaron como APC celulas dendrfticas autologas infectadas con rF-MUC-1/TRICOM. A continuacion, se anadieron celulas no adherentes autologas a las APC en un razon de efector a APC de 10:1. Los cultivos se incubaron a continuacion durante 3 dfas a 37°C en una atmosfera humidificada que contenfa 5% de CO2. Los cultivos se complementaron con IL-2 humana recombinante a una concentracion de 20 unidades/ml durante 7 dfas; el medio que contenfa IL-2 se repuso cada 3 dfas. La incubacion de 3 dfas con el peptido y el suplemento de IL-2 de 7 dfas constituyo un ciclo de IVS. Los cultivos primarios se volvieron a estimular con DC autologasinfectadas con rF-MUC-1/TRICOM como se describio anteriormente el dfa 11 para empezar el siguiente ciclo de IVS. Las DC autologas infectadas con RF-MUC 1/TRICOM se utilizaron como APC despues de tres ciclos de IVS. Se utilizaron celulas B transformadas con EBV autologas irradiadas (23.000 rads) como APC despues del tercer ciclo de IVS. Para la reestimulacion con celulas B transformadas con EBV, se utilizaron peptidos a una concentracion de 50 mg/ml para pulsar las celulas B transformadas con EBV autologas a una razon de efector a APC de 1:3 para la reestimulacion. Los cultivos se incubaron a continuacion durante 3 dfas a 37°C en una atmosfera humidificada que contenfa 5% de CO2. Despues de la eliminacion del medio que contenfa el peptido, los cultivos se complementaron con IL-2 humana recombinante a una concentracion de 20 unidades/ml durante dfas. Se generaron lineas de celulas T de sujetos 18 y 23 (T-18-P- 92, T-18-P93L, T-23-P-92 y T-23-P93L) mediante estimulacion de PBMC con celulas dendrfticas autologas pulsadas con los peptidos P-92 o P93L utilizando el mismo protocolo de estimulacion que se ha descrito anteriormente. Los marcadores utilizados para el analisis e identificacion de las DC fueron CD11c, MHC de Clase II, CD80, CD54, CD58 y CD83. Tambien se utilizo CD3 como un marcador negativo.
Analisis citotoxico.
Las celulas diana (celulas C1R-A2 o tumorales) se marcaron con 50 pCi de oxiquinolina marcada con 111indio (Medi- Physics Inc., Arlington, IL) durante 15 min a temperatura ambiente. Se anadieron celulas diana (0,3 x 104) en 100 pl de medio RPMI-1640 completo a cada uno de los 96 pocillos en placas de analisis de fondo plano (Corning Costar Corp.). Las celulas diana C1R-A2 marcadas se incubaron con peptidos a la concentracion indicada durante 60 minutos a 37°C en 5% de CO2 antes de anadir las celulas efectoras. No se utilizo peptido cuando se utilizaron lineas celulares de carcinoma como dianas. Las celulas efectoras se suspendieron en 100 pl de medio RPMI-1640 completo con un suplemento de suero AB humano agrupado al 10% y se anadieron a las celulas diana. Las placas se incubaron a continuacion a 37°C en 5% de CO2 durante 4 o 16 h. Se recogio el sobrenadante para el recuento gamma mediante el uso de marcos cosechadores (Skatron, Inc., Sterling, VA). Las determinaciones se realizaron por triplicado, y se calcularon las desviaciones tfpicas. La lisis especffica se calculo con el uso de la siguiente formula (todos los valores en cpm):
% lisis = Liberacion observada - Liberacion espontanea x 100 Liberacion total - Liberacion espontanea
La liberacion espontanea se determino a partir de pocillos a los que se anadieron 100 pl de medio RPMI-1640 completo. La radiactividad liberable total se obtuvo despues del tratamiento de dianas con Triton X-100 al 2,5%.
Deteccion de citoquinas.
Los sobrenadantes de las celulas T expuestas durante 24 h a las celulas B transformadas con EBV autologas pulsadas con peptido, en medio libre de IL-2 a diversas concentraciones de peptidos, se escrutaron para determinar la secrecion de IFN-y utilizando un kit de ELISA (R & D Systems, Minneapolis , MN). Los resultados se expresaron en pg/ml. Tambien se utilizo un sistema CBA (BD PharMingen, San Diego, CA) para determinar la secrecion de varias citoquinas por celulas T especfficas. El sistema de CBA utiliza la deteccion de fluorescencia por citometrfa de flujo para medir analitos solubles en un inmunoanalisis basado en partfculas. El Kit CBA para citoquinas Th1/Th2 humanas de BD se utilizo para medir los niveles de protefnas IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-a en una sola muestra. Las perlas de captura de citoquinas se mezclaron con anticuerpos de deteccion conjugados con PE y despues se incubaron con los patrones de citoquinas recombinantes o muestras de ensayo para formar complejos sandwich. Los resultados de la muestra se generaron en formato grafico y tabular, utilizando soporte logico de analisis BD PharMingen CBA. Los resultados se expresan en pg/ml.
Analisis estadfstico.
El analisis estadfstico de las diferencias entre las medias se realizo mediante una prueba de la t pareada de dos colas (soporte logico estadfstico Stat View, Abacus Concepts, Berkeley, CA).
Clasificacion de Toxicidad - Escala de toxicidad comun del NCI.
* Si se producen toxicidades de Grado I-II, el sujeto puede continuar con el programa de infusion.
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* Si se produce toxicidad de Grado III, el "farmaco" se mantiene hasta que la toxicidad se reduce al Grado I o II, a continuacion, se reanuda la infusion. Si se produce toxicidad de Grado III o IV despues de la reanudacion, se detienen las infusiones de "farmacos".
* Si se produce toxicidad de Grado IV, se registra que el sujeto tiene toxicidad de Grado IV y la siguiente infusion se reduce a la dosis previa. Si la dosis previa provoca toxicidad de Grado IV, se detiene el "farmaco".
* Si se produce toxicidad de Grado IV en 1 de 3 sujetos a un nivel de dosis especffico, se introducen 3 sujetos adicionales en ese nivel de dosis celular para un total de 6 sujetos a ese nivel de dosis. Si 2 de 6 sujetos a un nivel de dosis celular desarrollan toxicidad de Grado IV, esta dosis se define como la MTD. A los siguientes 3 sujetos se les proporciona 66% (dos tercios) del nivel de dosis celular previo. A los efectos de la evaluacion del aumento de dosis, cada sujeto al mismo nivel de dosis debe haber recibido por lo menos 4 de 6 infusiones.
Ejemplo 2
Nuevos motivos de union a MUC-1
La secuencia de aminoacidos primaria de MUC-1 humana se analizo para determinar los motivos consenso para los nuevos peptidos de union a HLA-A2. Se identificaron doce peptidos decamericos, por lo tanto se sintetizaron y se estudiaron para determinar la union a la molecula HLA-A2 en un analisis de union en celulas T2. Las secuencias de aminoacidos y las posiciones de estos peptidos decamericos se muestran en la Tabla 1. El peptido CEA CAP1-6D y un peptido NCA se utilizaron como control positivo y negativo, respectivamente. La union pronosticada de los 12 peptidos tambien se proporciona en la Tabla 1. Se demostro que tres de estos peptidos (P-92, P-94 y P-1108) tenfan el nivel de union mas alto en el analisis T2.
Tabla 1. Union de peptidos MUC-1 humanos a moleculas HLA-A2
Peptido
Posicion de aminoacido en MUC- 1 Secuencia Union a HLA-A2 * Union a T2#
P-92
92-101 ATWGQDVTSV (SEQ ID NO: 1) POS 740
P-94
94-103 WGQDVTSVPV (SEQ ID NO: 8) NEG 591
P-1108
1108-1117 REGTINVHDV (SEQ ID NO: 9) NEG 482
P-4
4-13 GTQSPFFLLL (SEQ ID NO: 10) NEG 467
P-1105
1105-1114 LAFREGTINV (SEQ ID NO: 11) NEG 461
P-1004
1004-1013 TLASHSTKTD (SEQ ID NO: 12) NEG 442
P-1069
1069-1078 LQRDISEMFL (SEQ ID NO: 13) NEG 433
P-1162
1162-1171 ALLVLVCVLV (SEQ ID NO: 3) POS 431
P-1135
1135-1144 TISDVSVSDV (SEQ ID NO: 4) POS 422
P-1172
1172-1181 ALAIVYLIAL (SEQ ID NO: 5) POS 372
P-1169
1169-1178 VLVALAIVYL (SEQ ID NO: 6) POS 369
P-1177
1177-1186 YLIALAVCQC (SEQ ID NO: 7) POS 338
CAP1-6D
NA YLSGADLNL (SEQ ID NO: 38) POS 975
NCA
NA YRPGENLNL (SEQ ID NO: 39) NEG 365
* Union pronosticada sobre la base de motivos referidos (37); POS = positivo; NEG = negativo. # Los resultados se expresan en fluorescencia relativa. CAP1-6D es un peptido de antfgeno carcinoembrionario de union a HLA-A2 que se utilizo como control positivo. El peptido NCA se utilizo como control negativo. NA = no aplicable.
Ejemplo 3
Establecimiento de lfneas de celulas T especfficas de MUC-1
A continuacion, se llevaron a cabo estudios para determinar si se podrfan establecer lfneas de celulas T especfficas
38
de MUC-1 a partir de PBMC de un donante aparentemente sano. Para lograr esto, se utilizaron DC autologas infectadas con rF-MUC-1/TRICOM como APC. rF-MUC-1/TRICOM es un vector de avipoxvirus de replicacion defectuosa que contiene los transgenes de MUC-1 y de una trfada de moleculas co-estimuladoras humanas (B7-1, ICAM-1 y LFA-3, designada TRICOM). Se demostro que rF-MUC-1/TRICOM infectaba eficazmente DC humanas e 5 hiperexpresaba cada una de las moleculas co-estimuladoras, asf como MUC-1, en la superficie de DC (Tabla 2). Aproximadamente el 96% de las celulas fueron positivas CD11c y MHC de Clase II.
Tabla 2. El analisis fenotfpico de DC infectadas con rF-MUC-1/TRICOM
Celulas dendriticas infectadas con
CD80 CD54 CD58 Clase I MUC-I
No infectadas
4,8 (13,6) 59,5 (62,3) 68,1 (18,2) 99,7 (271,8) 5,0 (95,7)
FP/WT
7,4 (13,3) 79,3 (83,4) 74,0 (19,5) 99,5 (176,3) 3,1 (50,7)
rF-MUC-1/TRICOM
30,9 (35,7) 84,5 (133,9) 79,8 (27,4) 99,9 (189,3) 31,6 (213,1)
Analisis de citometrfa de flujo de la expresion de marcadores de superficie sobre las DC. Las DC utilizadas se cultivaron en medio AIM-V que contenfa 100 ng/ml de rhGM-CSF y 20 ng/ml de rhIL-4 durante 7 dfas. Las DC utilizadas para la infeccion con FP/WT o rF-MUC-1/TRICOM se cultivaron como se describe en "Materiales y Metodos". Los resultados indican el porcentaje de celulas positivas; los numeros entre parentesis representan la IMF.
10 La especificidad de las celulas T especfficas de MUC-1 generadas (denominadas T-1191-MUC-1) se analizo despues del ciclo 3 de IVS (veanse Materiales y Metodos) para determinar su capacidad para liberar IFN-y despues de la estimulacion con celulas B autologas pulsadas con cada uno de los peptidos MUC-1 que se enumeran en la Tabla 1. Los resultados mostrados en la Tabla 3 demuestran que cuando las celulas T-1191-MUC-1 se estimularon con celulas B autologas pulsadas con peptidos P-92, P-1135, P-94, P-1004, P-1069 y P-4 , las celulas T produjeron 15 IFN-y, mientras que el uso de las celulas B autologas pulsadas con los otros peptidos no dio lugar a la produccion de IFN-y. Los resultados mostrados en las Tablas 1 y 3 demuestran que el peptido P-92 tenia el nivel mas alto de union a T2, asf como la capacidad de activar T-1191-MUC-1 en las celulas para producir los mas altos niveles de IFN-y; este peptido se eligio por lo tanto para un estudio adicional.
20 Tabla 3. Produccion de IFN-y por celulas T-1191-MUC-1 estimuladas con celulas B autologas pulsadas con peptidos
MUC-1
Peptido
Produccion de IFN-y (pg/ml)
Con peptido Sin peptido
P-92
380,8 <52,3
P-1135
347,2 <52,3
P-94
323,6 <52,3
P-1004
305,6 <52,3
P-1069
288,0 <52,3
P-4
260,0 <52,3
P-1105
<52,3 <52,3
P-1108
<52,3 <52,3
P-1162
<52,3 <52,3
P-1169
<52,3 <52,3
P-1172
<52,3 <52,3
P-1177
<52,3 <52,3
Se utilizaron celulas T-1191-MUC-1 como efectores en IVS-3. Las celulas T se estimularon con celulas B transformadas con EBV autologas irradiadas pulsadas con diferentes peptidos MUC-1 a una concentracion de 25 pg/ml, y una relacion de efector a APC de 1:3. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo de veinticuatro horas y se escrutaron para determinar la secrecion de IFN-y.
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Analisis de peptidos
El analisis de los residuos de aminoacidos de anclaje a HLA-A2 primarios y secundarios en las posiciones 2 y 10 del peptido P-92 revelo que la modificacion de los aminoacidos en estas posiciones podrfa mejorar la capacidad de union del peptido a la molecula HLA-A2. Por lo tanto, se sintetizaron seis diferentes analogos de P-92, como se muestra en la Tabla 4, y se sometieron a ensayo para determinar su capacidad de union a celulas T2 junto con el peptido nativo P-92. El CEA CAP-7 (peptido de union a HLA-A3), que se ha demostrado previamente que no se une a HLA-A2, se utilizo como control negativo. Como se muestra en la Tabla 4, cuatro de los seis peptidos analogos se unieron a HLA-A2 a niveles mas altos que el peptido P-92. Los analogos P-93L y P-93i se unieron a HLA-A2 con mayor eficacia.
Tabla 4. Analogos peptfdicos de MUC-1
Secuencia de aminoacidos
Denominacion inicial Union a T2*
ATWGQDVTSV (SEQ ID NO: 1)
P-92 (nativo) 510
AIWGQDVTSV (SEQ ID NO: 14)
I-93 823
ALWGQDVTSV (SEQ ID NO: 2)
L-93 821
ALWGQDVTSL (SEQ ID NO: 15)
L-93/L-101 736
AMWGQDVTSV (SEQ ID NO: 16)
M-93 723
AMWGQDVTSL (SEQ ID NO: 17)
M-93/L-101 325
AIWGQDVTSL (SEQ ID NO: 18)
I-93/L-101 280
Secuencias de aminoacidos del peptido P-92 parental (posiciones de aminoacidos 92 a 101 de MUC-1) y peptidos analogos. Los aminoacidos se muestran mediante el codigo de una sola letra. Los aminoacidos de sustitucion se indican en negrita y cursiva. *Los resultados se expresan en valores de fluorescencia relativa. El peptido HLA-A3 (union a T2 = 200) se utilizo como un control negativo y CAP1-6D (union T2 = 875) se utilizo como control positivo.
A continuacion se llevaron a cabo experimentos para comparar la capacidad de los peptidos P-93L y P-93i de obligar a HLA-A2 a diversas concentraciones de peptidos. Como se observa en la Figura 1, los peptidos P-93L y P-93i se unieron a HLA-A2 a niveles superiores que P-92 a las diversas concentraciones de peptidos. Los niveles de union fueron similares para P-93L y P-93i a las diferentes concentraciones de peptido. Por consiguiente, estos datos indicaron que tanto P-93L y P-93i con la modificacion en la posicion 2 de anclaje primario (posicion 93 de la molecula de MUC-1) fueron agonistas potenciales de peptido P-92.
Ejemplo 5
Estabilidad del complejo de peptido-MHC.
Se examino la estabilidad del complejo de peptido-MHC para los peptidos P-92 (nativo), P-93L y P-93i. Los peptidos se incubaron con celulas T2 durante la noche, los peptidos no unidos se separaron mediante lavado y despues se incubaron con brefeldin-A para bloquear el suminostro de nuevas moleculas de Clase I a la superficie celular; en diversos puntos horarios las celulas se analizaron para determinar la presencia de complejos de peptido-HLA-A2. Como se muestra en la Figura 2, los complejos de P-93L-HLA-A2 y P-93i-HLA-A2 fueron mas estables que los complejos de P-92-HLA-A2 durante el perfodo de observacion de 8 horas, con complejos P-93L-HLA-A2 ligeramente mas estables que los complejos de P-93i-HLA-A2 en el mismo perfodo de tiempo. De este modo, se demostro que la union de peptidos a MHC y la estabilidad del complejo de peptido-MHC era mayor para los peptidos P-93L y P-93i que el peptido nativo P-92.
Se comparo a capacidad de los peptidos agonistas P-93L y P-93i a diversas concentraciones de peptido, para activar las celulas T-1191-MUC-1. Como se observa en la Figura 3, a cada concentracion de peptido, los pulsos de APC con el peptido P-93L condujeron al mayor nivel de produccion de IFN-y por las celulas T-1191-MUC-1, en comparacion con el peptido P-93i o el peptido P-92 nativo. El peptido agonista P-93L fue elegido por tanto para su posterior estudio. A continuacion se analizo el perfil de citoquinas de las celulas T-1191-MUC-1 estimuladas con APC pulsadas con cualquiera de los peptidos P-92 o P-93L. Se utilizo un ensayo CBA para el analisis. Tabla 5 muestra los niveles de cada una de las seis citoquinas producidas por la lfnea de celulas T-1191-MUC-1 estimuladas con APC pulsadas sin peptido, peptido P-92 y peptido P-93L. Estos resultados demostraron una produccion mayor de las citoquinas de tipo 1 IL-2 e IFN-g por las celulas T estimuladas con el peptido P-93L que con el peptido P-92. Con cualquier peptido se observaron niveles bajos o indetectables de las citoquinas de tipo 2 IL-4 e IL-10. No se
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pudo detectar TNF-a en los sobrenadantes en el punto horario de 24 h.
Tabla 5 Analisis de CBA para la produccion de citoquinas por celulas T estimuladas con peptido MUC-1
Peptido
Citoquinas
IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF-a IFN-y
Ninguno
<20 <20 <20 <20 <20 <20
P-92
58,8 <20 <20 <20 <20 266
P-93L
366,9 <20 140.9 <20 <20 650
Se analizo la produccion de IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-a, y IFN-y. Se utilizaron patrones a concentraciones de cada citoquina a 0 pg/ml, 312 pg/ml y 5000 pg/ml para determinar las concentraciones de estas seis citoquinas en las muestras. Las celulas T-1191 mUC-1 en IVS-3 se usaron como efectores. Las celulas T se estimularon con celulas B transformadas con EBV autologas irradiadas pulsadas sin peptido o con los peptidos P-92 o P-93L a una concentracion de 25 pg/ml, y una razon de efector a APC de 1:3. Los sobrenadantes de cultivo de veinticuatro horas se recogieron y se seleccionaron para determinar la secrecion de citoquinas. Los resultados se expresan en pg/ml/106 celulas/ml.
Para comparar adicionalmente la actividad biologica del peptido P-92 nativos y el peptido P-93L agonista, se establecieron dos lfneas de celulas T adicionales. Esto se logro utilizando como APC DC autologas infectadas con rF-MUC-1/TRICOM y PBMC autologas como efectores de un donante aparentemente sano. Despues de tres IVS, las lfneas de celulas T se estimularon con celulas B autologas pulsadas con el peptido P-92 o P-93L. Estas dos lfneas celulares se denominan T-1191-P-92 y T-1191-P-93L, respectivamente. Se mostro que las dos lfneas celulares eran celulas > 98% positivas para CD8, 99% positivas para CD49d, <2% positivas para CD56 y > 75% positivas para CD45RO. Las dos lfneas de celulas T se analizaron a continuacion para determinar su capacidad para lisar dianas pulsadas con peptido. Se mostro que T-1191-P-93L lisa las celulas C1R-A2 pulsadas con el peptido P- 93L en mayor medida que las celulas pulsadas con el peptido P-92 (Figura 4, cuadrados). T-1191-P-92 tambien liso celulas diana pulsadas con el peptido P-93L en un grado mayor que las pulsadas con el peptido P-92 (Figura 4, triangulos). Los datos de la Figura 4 tambien muestran que cuando las celulas diana se pulsan con el peptido nativo, la lfnea de celulas T establecida con el peptido P-93L agonista lisa celulas diana a niveles mayores que la lfnea de celulas T establecida con el peptido nativo. Esto se observo a dos razones E:T diferentes. Las celulas T-1191-P-93L y las celulas T-1191 P-92 y no lisan las celulas C1R-A2 cuando se pulsan con el peptido CEA CAP1-6D de control (Figura 4, cfrculos).
Ejemplo 6
Reconocimiento de celulas diana.
Los estudios se llevaron a cabo para determinar si estas dos lfneas de celulas T podfan lisar la lfnea celular MCF-7 de carcinoma de mama positiva para MUC-1 y positiva para HLA-A2. La lfnea celular de melanoma SK-Mel-24 negativa para MUC-1 positiva para HLA-A2 se utilizo como un control negativo. Como se muestra en la Tabla 5, las celulas MCF-7 fueron lisadas tanto por las celulas T-1191-P-92 como -P-93L T-1191. No se observo lisis frente a las celulas SK-Mel-24. Se mostro que las celulas T-1191-P-93L lisaban las celulas MCF-7 en un grado mayor en comparacion con la lfnea celular T-1191-P-92. La adicion de celulas C1R-A2 no marcadas pulsadas con el correspondiente peptido MUC-1, pero no con el peptido de control CEA CAP1-6D, disminuyo la actividad citotoxica de las dos lfneas de celulas T, lo que demuestra la especificidad por MUC-1 de la lisis (Tabla 5). Tambien se demostro que la actividad citotoxica de estas lfneas de celulas T contra las celulas MCF-7 estaba restringida por HLA-A2, como se demuestra por la inhibicion de la lisis con la adicion de anticuerpo anti-HLA-A2, pero no con el anticuerpo de control UPC-10 (Tabla 6).
Tabla 6 Capacidad de las lfneas de celulas T especfficas de MUC-1 T-1191-P-92 y T-1191-P-93L para lisar una lfnea
celular tumoral que expresan MUC-1 (MCF-7)
Diana
T-1191-P-92 T-1191-P-93L
MCF-7
16,5 (2,7)* 24,5 (4,5)*
MCF-7 + C1R-A2
15,6 (3,2)* 21,6 (2,9)*
MCF-7 + C1R-A2 + P-92
4,2 (2,2) 6,1 (1,9)
MCF-7 + C1R-A2 + P-93L
3,0 (1,5) 3,5(1,2)
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Diana
T-1191-P-92 T-1191-P-93L
MCF-7 + C1R-A2 + CAP1-6D
17,1 (3,8)* 20,8 (3,9)*
SK-Mel-24
0,5 (1,1) 1,4(0,8)
Los resultados se expresan en % de lisis especffica a E:T = 25:1. Los numeros entre parentesis son la desviacion tfpica. Las celulas MCF-7 (lfnea celular de carcinoma de mama humano) son positivas para MUC-1 y positivas para HLA-A2. Las celulas SK-Mel-24 (melanoma) son negativas para MUC-1 y positivas para HLA-A2. Las celulas T- 1191-P-92 y T-1191-P-93L se utilizaron en IVS-5. La lfnea celular T-1191-P-92 se paso sobre el peptido P-92 nativo, mientras que la lfnea celular T-1191-P-93 se paso sobre el peptido P-93L agonista, de IVS 3 a iVs 5. Las celulas MCF-7 se marcaron con 111In. Las celulas MCF-7 marcadas y las celulas C1R-A2 no marcadas se utilizaron a una razon de 1:10. Las celulas C1R-A2 se incubaron con o sin peptido P-92 (25 pg/ml), peptido P-93L (25 pg/ml) o peptido de control CAP1-6D (25 pg/ml).
* Lisis estadfsticamente significativa (p <0,01, prueba de la t de dos colas) al comparar la lisis de las celulas MCF-7 frente a celulas SK-Mel-24. Tambien hay una significacion estadfstica (p <0,01, prueba de la t de dos colas) al comparar la lisis de las celulas MCF-7 + C1R-A2 frente a MCF-7 + C1R-A2 + peptido P-92 o MCF-7 + C1R-A2 frente MCF-7 + C1R-A2 + P-93L.
Tambien se mostro que la actividad citotoxica de estas lfneas de celulas T contra las celulas MCF-7 estaba restringida por HLA-A2, como se demuestra por la inhibicion de la lisis con la adicion de anticuerpo anti-HLA-A2, pero no con el anticuerpo de control UPC -10 (Tabla 7).
Las lfneas de celulas T T-1991-P-92 y T-1191-P-93L se obtuvieron de un sujeto aparentemente sano. A continuacion, se llevaron a cabo estudios para determinar si podrfan establecerse lfneas de celulas T adicionales a partir de dos sujetos con cancer de pancreas (sujetos 23 y 18). Se generaron cuatro lfneas de celulas T especfficas de MUC-1 y se denominaron T-23-P-92, T-23-P-93L, T-18-P-92 y T-18-P-93L. Las lfneas de celulas T, T-18-P-92 y T-18-P-93L se generaron a partir del sujeto 18 mediante la estimulacion de PBMC con celulas dendrfticas autologas pulsadas con los peptidos P-92 y P-93L, respectivamente. Las lfneas de celulas T T-23-P-92 y T-23-P-93L se generaron a partir del sujeto 23 mediante estimulacion de PBMC con DC autologas pulsadas con los peptidos P-92 y P-93L, respectivamente. Como se observa en la Tabla 8, las cuatro lfneas de celulas T de los dos sujetos con cancer de pancreas pueden ser estimuladas para producir IFN-y cuando se estimulan con las DC pulsadas con el peptido P-92 o P-93L. No se observo produccion de IFN-y, sin embargo, cuando estas celulas T se estimularon de forma similar con el peptido CAP1-6D CEA. Para las cuatro lfneas de celulas T, se observaron mayores niveles de produccion de IFN-y cuando se utilizo el peptido P-93L agonista en comparacion con el peptido nativo P-92. Tambien hay que senalar que las lfneas de celulas T obtenidas utilizando el peptido agonista siempre mostraron mayores niveles de estimulacion de las lfneas de celulas T derivadas de peptido nativo, cuando se utilizo un peptido dado para la estimulacion.
Tabla 8 Produccion de IFN-y por lfneas de celulas T generadas a partir de dos sujetos con cancer de pancreas,
estimuladas con P-92, y el peptido P-93L agonista
Lfnea de celulas T
Peptido
P-92 P-93L CAP1-6D
T-23-P-92
299,8 644,5 <26
T-23-P-93L
400,5 973,0 <26
T-18-P-92
168,0 366,6 <26
T-18-P-93L
378,2 524,1 <26
aLos resultados se expresan como pg de IFN-y producido. Las celulas de las cuatro lfneas de celulas T especfficas de MUC-1 establecidas a partir de dos sujetos con cancer de pancreas (sujetos 23 y 18) se utilizaron como celulas efectoras en el IVS-4. Estas lfneas de celulas T se establecieron por estimulacion con DC autologas pulsadas con P92 (T-23-P-92 y P-18-P-92) o DC autologas pulsadas con P-93L (T-23-P-93L y T-18-P-93L). Para la produccion de IFN-y, las lfneas de celulas T se estimularon con DC alogenicas positivas para HLA-A irradiadas pulsadas con peptido P-92 o P-93L a una concentracion de 25 pg/ml y una razon de efector a APC de 10:1. Los sobrenadantes de cultivo de veinticuatro horas se recogieron y se escrutaron para determinar la secrecion de IFN-y.
Citolisis de dianas mediante lineas celulares derivadas de sujetos con cancer.
A continuacion, se llevaron a cabo estudios para determinar si las lineas de celulas T derivadas del sujeto 23 con cancer podrfan lisar las celulas de cancer positivas para HLA-A2 positivas para MUC-1. La linea de celulas SK-Mel- 5 24 (negativa para MUC-1 y positiva para HLA-A2) se utilizo como control negativo para la especificidad. Como se
puede observar en la Tabla 9 y 10, la linea T-23-P-93L, la linea T-23-P-92, la linea T-18-P-93L y la linea T-18-P-92 mostraron lisis de celulas de carcinoma MCF-7 a dos razones E:T diferentes, pero no mostraron lisis de la linea celular de melanoma. En concordancia con los resultados mostrados anteriormente, la linea de celulas T (T-23-P- 93L, T-18-P-93L) obtenida utilizando el peptido agonista demostro una mayor lisis de las celulas tumorales que la 10 linea de celulas T (T-23-P-92, T-18-P-92) obtenida utilizando el peptido nativo. Esto se observo a dos razones E:T diferentes.
Tabla 9 Capacidad de las lineas de celulas T de un sujeto con cancer de pancreas, generadas con el peptido agonista P-93L, para lisar celulas cancerosas que expresan MUC-1 nativo
Linea de celulas T
Diana Razones E:T
25:1 12.5:1
T-23-P-93L
MCF-7 24,6 (1,0)*# 17,9 (0,2)*#
T-23-P-93L
SK-Mel-24 1,3 (1,1) 0,8 (0,6)
T-23-P-92
MCF-7 14,4 (0,6)* 10,1 (0,8)*
T-23-P-92
SK-Mel-24 0,5 (1,6) 0,4 (1,9)
* Significacion estadfstica (p <0,01, prueba de la t de dos colas) al comparar la lisis de las celulas MCF-7 frente a las celulas SK-Mel-24 por las celulas T-23-P-93L y T-23P-92. # Significacion estadfstica (p <0,01, prueba de la t de dos colas) al comparar la lisis de las celulas MCF-7 por las celulas T-23-P-93L y T-23-P-92. Los resultados se expresan como % de lisis.
15
Tabla 10 Capacidad de las celulas T de un sujeto con cancer de pancreas generado con peptido agonista P-93L para lisar celulas cancerosas que expresan MUC-1 nativo
Linea de celulas T
Diana Razones E:T
25:1 12,5:1
T-18-P-93L
MCF-7 25 (0,8)*# 14,6 (0,5)*#
T-18-P-93L
SK-Mel-24 1,1 (0,9) 1,0 (0,8)
T-18-P-92
MCF-7 12,1 (0,3)* 8,4 (0,4)*
T-18-P-92
SK-Mel-24 0,9 (1,4) 1,0(1,2)
* Significacion estadfstica (p <0,01, prueba de la t de dos colas) al comparar la lisis de las celulas MCF-7 frente a las celulas SK-Mel-24 por las celulas T-18-P-93L y T-18-P-92. # Significacion estadfstica (p <0,01, prueba de la t de dos colas) al comparar la lisis de las celulas MCF-7 por las celulas T-18-P-93L y T-18-P-92.
Ejemplo 8
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Materiales y metodos
Los dos vectores virales analizados son el virus vaccinia recombinante competente para la replicacion (RV-), y el vector de avipoxvirus, de viruela aviar (rF-), que es de replicacion no competente en celulas de mamffero. Cada 25 vector codifica los transgenes para tres moleculas co-estimuladoras humanas (B7-1, ICAM-1, LFA-3, denominadas TRICOM); los transgenes CEA y MUC-1 tambien contienen epftopos agonistas. Los vectores se denominan rV- CEA/MUC/TRICOM y rF-CEA/MUC/TRICOM.
Se demuestra que cada uno de los vectores es capaz de expresar fielmente los cinco transgenes en las celulas 30 dendrfticas humanas (DC). Se muestra que las DC infectadas con cualquier vector activan las lineas de celulas T especfficas de CEA y especfficas de MUC-1 al mismo nivel que las DC infectadas con los vectores CEA-TRICOM o MUC-1-TRICOM. Por lo tanto, no se observo evidencia de la competencia antigenica entre CEA y MUC-1. Tambien se muestra que las DC humanas infectadas con rV-CEA/MUC/TRICOM o rF-CEA/MUC/TRICOM son capaces de
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generar las lineas de celulas T especfficas de MUC-1 y de CEA; a su vez se muestra que estas lineas de celulas T son capaces de lisar dianas pulsadas con peptidos MUC-1 o CEA, asf como celulas tumorales humanas que expresan endogenamente MUC-1 y/o CEA.
Cultivos celulares
La lfnea celular de adenocarcinoma de mama humano MCF-7 (positivo para HLA-A2, negativo para CEA y positivo para MUC-1), la lfnea celular de carcinoma colorrectal SW1463 (positivo para HLA-A2, positivo para CEA y positivo para MUC-1), y la lfnea celular de melanoma SKMel-24 (positivo para HLA-A2, negativa para CEA y negativo para MUC-1) fueron adquiridas de la Coleccion de Cultivos Tipo Americana (Manassas, VA). Los cultivos estaban libres de micoplasma y se mantuvieron en medio completo [RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA) con un suplemento de suerto fetal bovino al 10%, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen Life Technologies)]. La lfnea celular C1R es una lfnea celular de leucemia plasmatica humana que no expresa antfgenos HLA-A o B endogenos. Las celulas C1R-A2 son celulas C1R que expresan un clon genomico transfectado de HLA-A2.1. Estas celulas se obtuvieron del Dr. William E. Biddison (Instituto Nacional de Trastornos Neurologicos y Accidentes Cerebrovasculares, NIH, Bethesda, MD). El mutante por delecion de transporte de la lfnea celular 174CEM-T2 (T2) fue proporcionado por el Dr. Peter Cresswell (Escuela de Medicina de la Universidad de Yale, New Haven, CT). Las celulas C1R-A2 y las celulas T2 estaban libres de micoplasma y se mantuvieron en medio completo RPMI 1640 y medio completo de Dulbecco modificado por Iscove (Invitrogen Life Technologies), respectivamente. La lfnea celular V8T es una lfnea CD8+CTL dirigida contra el epftopo CAP-1 de CEA. La lfnea celular T-1191-P93L es una lfnea CTL especffica de CD8 + MUC-1 generada a partir de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de un donante sano que fue estimulado in vitro utilizando un peptido MUC-1. Ambas lineas celulares V8T y T-1191-P93L se cultivaron como se ha descrito anteriormente.
Peptidos
Los peptidos de union a HLA-A2 utilizados incluyeron: (a) el peptido agonista de CEA CAP1-6D (YLSGADLNL) (SEQ ID NO: 38), denominado peptido CEA, (b) el peptido agonista de MUC-1 P-93L (ALWGQDVTSV) (SEQ ID NO: 19), denominado peptido MuC-1, (c) el peptido PSA-3 del antfgeno especffico de prostata (PSA) (ViSNdVCAQV) (SeQ ID NO: 40). Todos los peptidos tuvieron una pureza mayor de 96% y fueron fabricados por American Peptide Company, Inc. (Sunnyvale, CA).
Cultivo de DC a partir de PBMC
Se obtuvieron PBMC de donantes normales para HLA-A2 de sangre heparinizada. Las PBMC se separaron utilizando gradiente de medio de separacion de linfocitos (Organon Teknika, Durham, NC), como se ha descrito previamente (51) (Boyum A. A one-stage procedure for isolation of granulocytes and lymphocytes from human blood. General sedimentation properties of white blood cells in 1 g gravity field, Scand J Clin Lab Invest 1968;97(Suppl):51- 76). Las DC se prepararon utilizando una modificacion del procedimiento descrito por Sallusto et al. Sallusto F, Lanzavecchia A., Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony stimulating factor plus interleukin-4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha., J Exp Med 1994; 179:1109-18. Las PBMC (1,5 x 108) se resuspendieron en medio AIM-V que contenfa glutamina 2 mM, 50 pg/ml de estreptomicina y 10 pg/ml de gentamicina (Invitrogen Life Technologies), y se dejo que se adhirieran a un matraz T-150 (Corning Costar Corp., Cambridge, MA). Al cabo de 2 horas a 37°C, las celulas no adherentes se eliminaron con un enjuague suave. Las celulas adherentes se cultivaron durante 6-7 dfas en medio AIM-V que contenfa 100 ng/ml de GM-CSF recombinante humano (rhGM-CSF) y 20 ng/ml de IL-4 recombinante humana (rhIL-4). El medio de cultivo se repuso cada 3 dfas.
Virus recombinante e infeccion de DC con rV-CEA/MUC/TRICOM y RF-CEA/MUC/TRICOM
Tanto rV-CEA/MUC/TRICOM como rF-CEA/MUC/TRICOM codifican el gen CEA humano que contiene la modificacion 6D, el gen MUC-1 humano que contiene la modificacion 93L y los genes para las moleculas co- estimuladoras humanas B7-1, ICAM-1 y LFA-3 (Figura 5) (Zaremba S, Barzaga E, Zhu M et al. Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen. Cancer Res 1997;57:4570- 7, y Tsang KY, Palena C, Gulley J, Arlen P, Schlom J. A human cytotoxic T-lymphocyte epitope and its agonist epitope from the non-variable number of tandem repeat sequence of MUC-1. Clin Cancer Res 2004;10:2139-49). Se generaron vectores recombinantes mediante recombinacion homologa como se describio anteriormente (Hodge JW, McLaughlin JP, JA Kantor, J. Schlom Diversified prime and boost protocols using recombinant vaccinia virus and recombinant nonreplicating avian pox virus to enhance T-cell immunity and antitumor responses. Vaccine 1997;16:759-68). Las DC (1 x 106) se incubaron en 1 ml de medio Opti-MEM (Invitrogen Life Technologies) a 37°C con rF-CEA/MUC/TRICOM, rV-CEA/MUC/TRICOM, vector de avipoxvirus de control (FP-WT) o vector vaccinia de control (V-WT). Los experimentos de titulacion demostraron que la infeccion de las DC durante 2 horas con 4 x 107
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unidades formadoras de placa (pfu)/ml de rF-CEA/MUC/TRICOM, igual a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 40 pfu/celula fue capaz de inducir de manera sistematica la expresion del transgen en aproximadamente 60% de las DC infectadas. Experimentos de titulacion similares demostraron que la infeccion de las DC durante 1 hora con 0,5 x 107 pfu/ml de rV-CEA/MUC/TRICOM, igual a una MOI de 5 pfu/celula, fue capaz de inducir de manera sistematica la expresion del transgen en aproximadamente 35% de las DC infectadas. Se utilizaron DC de diferentes donantes para las infecciones con rF-CEA/MUC/TRICOM y rV-CEA/MUC/TRICOM, oscilando la eficiencia de la infeccion de 50% a 65% para rF-CEA/MUC/TRICOM y de 30% a 59% para rV-CEA/MUC/TRICOM. Las DC infectadas se suspendieron en 10 ml de medio completo RPMI-1640 caliente, de nueva aportacion, que contenfa 100 ng/ml de rhGM-CSF y 20 ng/ml de rhIL-4, se cultivaron durante 24 horas, y se utilizaron posteriormente como APC.
Analisis por citometrfa de flujo
Se realizo el analisis por citometrfa de flujo de dos colores en lfneas de celulas T mediante el uso de las siguientes combinaciones de anticuerpos: anti-CD56-FITC/anti-CD8-PE, anti-CD8-FITC/anti-CD45RA-FITC y anti-CD8- FITC/anti-CD27-PE. Los anticuerpos fueron todos adquiridos de BD Biosciences (San Jose, CA). La tincion se llevo a cabo de forma simultanea durante 1 hora a 4°C, las celulas se lavaron a continuacion tres veces con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca2+ y Mg2+, se resuspendieron en el mismo tampon, y 11 se analizaron inmediatamente utilizando un FACScan y el programa CELLQuest (BD Biosciences). Los datos se obtuvieron a partir de 10.000 celulas vivas, se almacenaron y utilizaron para generar los resultados. El procedimiento para el analisis de las DC fue similar al descrito anteriormente. Se utilizaron las siguientes combinaciones de anticuerpos: anti-MHC de Clase II-FITC/anti-CD80-PE, anti-CD58-FITC/anti-CD54-PE, anti-MHC de Clase I-FITC/anti-MHC de Clase II-PE, y anti-IgG1-FITC/anti-IgG2a-PE (controles de isotipo). Los anticuerpos para MHC de Clase I y II se adquirieron de Serotec (Oxford, Reino Unido); otros anticuerpos se adquirieron de BD Biosciences. Tambien se utilizaron el anticuerpo monoclonal anti-CEA COL-1 y anticuerpos anti-MUC-1 (DF3 y DF3-P) (Muraro R, Wunderlich D, Thor A, et al. Definition by monoclonal antibodies of a repertoire of epitopes on carcinoembryonic antigen differentially expressed in human colon carcinoma versus normal adult tissues. Cancer Res 1985;45:5769-80). MOPC-104E (IgM) (Cappel/Organon Teknika Corp., West Chester, PA) se utilizo como control negativo.
Despues de la tincion, las celulas se lavaron tres veces y posteriormente se incubaron con una dilucion 1:100 de cabra marcado con FITC anti-inmunoglobulina de raton (IgG) (Kirkegaard y Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). El analisis se llevo a cabo como se ha descrito anteriormente. Los resultados se expresaron en porcentaje de celulas positivas y la intensidad de fluorescencia (IMF) significan. Se recogio el valor de IMF en escala logarftmica, y se utilizo para expresar los niveles de fluorescencia determina midiendo el promedio para todas las celulas en el grafico de puntos de fluorescencia.
Analisis de inmunotransferencia
Las DC no infectadas, las DC infectadas con MOI de 40 de los vectores rF-CEA/MUC/TRICOM, rF-CEA(6D)- TRICOM o RF-MUC-1-TRICOM, y las DC infectadas con MOI de 5 del vector rV-CEA/MUC/TRICOM se lisaron mediante el uso de reactivo de extraccion de protefna de mamffero MPER (Pierce, Rockford, IL). La concentracion de protefna de los productos lisados se determino mediante el uso de un Kit de analisis de protefnas MicroBCA (Pierce), y se transfirieron fracciones de 20 pg de protefna por muestra a una membrana de PVDF 12 utilizando un aparato Bio-Dot Microfiltration (BioRad Laboratories, Hercules, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Despues de la transferencia, las membranas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS que contenfa 5% de BSA (Biosource International, Camarillo, CA). A continuacion, las membranas se lavaron tres veces con PBS que contenfa 0,25% de Tween-20, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con una solucion a 1 pg/ml de anticuerpos COL-1, DF-3 o DF3-P. Las membranas se lavaron a continuacion tres veces como antes, y se incubaron con una dilucion 1:3000 de un anticuerpo anti-IgG de raton conjugado con HRP (Kirkegaard & Perry Laboratories) durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la inmunodeteccion de las protefnas CEA y MUC- 1, se utilizo SuperSignal West Pico Substrate Chemiluminiscent (Pierce).
Generacion de lfneas de celulas T
Se utilizo la modificacion del protocolo descrito por Tsang et al. para generar CTL especfficos de CEA y/o MUC-1 (Tsang KY, Zaremba S, Nieroda CA, et al. Generation of human cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigen epitopes from patients immunized with recombinant vaccinia-CEA vaccine. J Natl Cancer Inst 1995;87:982-90). Para generar las lfneas de celulas T T-RV y T-RF, se utilizaron como APC DC autologas infectadas con rV-CEA/MUC/TRICOM o RF-CEA/MUC/TRICOM, respectivamente. Se anadieron celulas no adherentes autologas a APC con una razon de efector a APC de 10:1; los cultivos se incubaron durante 3 dfas a 37°C, en una atmosfera humidificada que contenfa 5% de CO2. Los cultivos se complementaron con IL-2 humana recombinante a una concentracion de 20 unidades/ml durante 7 dfas; el medio que contenfa IL-2 se repuso cada 3 dfas. La incubacion de 3 dfas con el peptido y de 7 dfas con el suplemento de IL-2 constituye un ciclo de
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estimulacion in vitro (IVS). T-rV y T-rF se volvieron a estimular con DC autologas infectadas con rV- CEA/MUC/TRICOM o rF-CEA/MUC/TRICOM, respectivamente, como se ha descrito anteriormente, en el dfa 11 para empezar el siguiente ciclo de IVS. Las DC autologas infectadas cono rV-CEA/MUC/TRICOM y RF- CEA/MUC/TRICOM se utilizaron como APC durante tres ciclos de IVS. Para la generacion de lmeas de celulas T- RF(CEA) y T-RF(MUC), las celulas T se estimularon con celulas dendnticas autologas infectadas con rF- CEA/MUC/TRICOM durante una IVS, y a continuacion se volvieron a estimular con DC autologas no infectadas pulsadas con peptido CAP1-6D o P-93L, respectivamente, durante dos IVS mas. Despues del tercer ciclo de IVS, se utilizaron como APC celulas B transformadas con EBV autologos irradiadas (23.000 rads). Las celulas B transformadas con EBV se pulsaron con 25 pg/ml de peptido, y se utilizaron para la reestimulacion a una razon de efector a APC de 1:3.
Los cultivos se incubaron a continuacion durante 3 dfas a 37°C en una atmosfera humidificada que contema 5% de CO2. Despues de la eliminacion del medio que contema peptido, los cultivos se complementaron con IL-2 humana recombinante a una concentracion de 20 unidades/ml durante 7 dfas. Las lmeas de celulas T de los pacientes 55, 49 y 41 se generaron por medio de estimulacion de PBMC con DC autologas infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM, utilizando el mismo protocolo de estimulacion descrito anteriormente. El paciente de 55 experimento inicialmente un procedimiento de Whipple para el cancer pancreatico localizado seguido de radioterapia coadyuvante al lecho pancreatico. El paciente tuvo recurrencia local y recibio quimioterapia con 5-FU/Leucovorina seguido de un estudio con vacuna experimental utilizando tanto vaccinia-CEA como ALVAC-CEA antes de inscribirse en este ensayo clmico. El paciente 41 fue diagnosticado de carcinoma colorrectal con metastasis en el tngado. Antes de inscribirse en el estudio, este paciente progreso en tres diferentes regfmenes de quimioterapia, incluyendo 5FU/Leucovorina/CPT-11, 5FU/Leucovorina/Oxaliplatino, y Xeloda. El paciente 49 tema cancer colorrectal con metastasis en el tngado y el pulmon. El paciente progreso siguiendo cuatro ciclos de quimioterapia con CPT- 11/5FU/Leucovorina antes de inscribirse en el estudio.
Analisis citotoxico
Las celulas diana (celulas C1R-A2 o tumorales) se marcaron con 50 pCi de oxiquinolina marcada con 111 Indio (Medi- Physics Inc., Arlington, IL) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron celulas diana (0,3 x 104) en 100 pl de medio completo RPMI-1640 a cada uno de los 96 pocillos en placas de analisis de fondo plano (Corning Costar Corp.). Las celulas diana C1R-A2 marcadas se incubaron con peptidos a la concentracion indicada durante 60 minutos a 37°C en 5% de CO2 antes de anadir las celulas efectoras. No se utilizo peptido cuando se utilizaron lmeas celulares de carcinoma como dianas. Las celulas efectoras se suspendieron en 100 pl de medio completo RPMI-1640 con un suplemento de 10% de suero AB humano agrupado y se anadieron a las celulas diana. Las placas se incubaron a continuacion a 37°C en 5% de CO2 durante 6 o 16 horas. Se recogio el sobrenadante para el recuento gamma mediante el uso de marcos cosechadores (Skatron, Inc., Sterling, VA). Las determinaciones se realizaron por triplicado, y se calcularon las desviaciones tfpicas. La lisis espedfica se calculo con el uso de la siguiente formula (todos los valores en cpm):
% lisis = Liberacion observada - Liberacion espontanea/Liberacion total - Liberacion espontanea x 100
La liberacion espontanea se determino a partir de los pocillos a los que se anadieron 100 pl de medio completo RPMI-1640. La radiactividad liberable total se obtuvo despues del tratamiento de las dianas conTriton X-100 al 2,5%.
Deteccion de citoquinas
Los sobrenadantes de las celulas T expuestas durante 24 horas a las celulas B transformadas con EBV autologas pulsadas con peptido en medio libre de IL-2, a varias concentraciones de peptidos, se escrutaron para determinar la secrecion de IFN-a utilizando un kit de ELISA (Biosource International). Los resultados se expresaron en pg/ml.
Analisis estadfstico
El analisis estadfstico de las diferencias entre las medias se realizo mediante una prueba de la t pareada de dos colas (soporte logico estadfstico Stat View, Abacus Concepts, Berkeley, CA).
Se llevaron a cabo en primer lugar estudios para determinar si la infeccion de las DC humanas con rV- CEA/MUC/TRICOM dana lugar a la expresion de cada uno de los cinco transgenes. Los estudios iniciales utilizaron una MOI de 5 y 10 para rV-CEA/MUC/TRICOM; ambas MOI proporcionan resultados comparables y por lo tanto se utilizo una MOI de 5 en experimentos posteriores. Como se observa en la Figura 6, las DC humanas no infectadas no expresan CEA (tal como se detecta mediante el anticuerpo monoclonal COL-1); la expresion de CD80, CD54, y CD58, MHC de Clase I y MHC de Clase II por las DC es similar a la referida previamente en varios estudios (Tsang KY, Zhu MZ, Even J., et al., The infection of human dendritic cells with recombinant avipox vectors expressing a
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costimulatory molecule transgene (CD80) to enhance the activation of antigen-specific cytotoxic T cells. Cancer Res 2001;61:7568-76; y Zhu MZ, Terasawa H, Gulley J, et al. Enhanced activation of human T cells via avipox vector- mediated hyperexpression of a triad of costimulatory molecules in human dendritic cells. Cancer Res 2001 ;61:3725- 34). La infeccion con V-WT tenia un efecto pequeno, si lo hubiera, o nulo sobre cualquiera de estos ocho marcadores de superficie (Figura 6). Se muestra que la infeccion con rV-CEA/MUC/TRICOM, sin embargo, aumenta sustancialmente el nivel de expresion de CEA, mUC-1, CD80, CD54 y CD58, y no afecta sensiblemente el nivel de expresion del MHC de Clase I y Clase II. En consonancia con los resultados publicados anteriormente, la infeccion de las DC del mismo donante con rV-CEA (6D)-TRICOM mejoro el nivel de CEA, CD80, CD54, CD58 y a niveles similares a los observados con rV-CEA/MUC/TRICOM, pero no altero la expresion de MUC-1 o MHC de Clase I o Clase II. Ademas, la infeccion de las DC con rV-MUC-1 mezclado con rV-TRICOM (el constructo rV-MUC-1-TRICOM no estaba disponible) mostro niveles de expresion mejorada de MUC-1 y de las tres moleculas co-estimuladoras similares a los observados con rV-CEA/MUC/TRICOM, pero no tuvo efecto sobre el nivel de expresion de MHC de Clase I y Clase II, ni sobre la falta de expresion de CEA (datos no mostrados). Se detectaron niveles bajos de MUC- 1 en las DC no infectadas y e infectadas con vectores de control. Esto esta de acuerdo con lo referido por Wykes et al., que mostro que MUC-1 se expresa en las DC humanas y las DC derivadas de monocitos cuando se cultivan in vitro (Wykes M, MacDonald KP, Tran M, et al. MUC1 epithelial mucin (CD227) is expressed by activated dendritic cells. J Leukoc Biol 2002;72:692-701.)
Se llevaron a cabo estudios paralelos para determinar si la infeccion de las DC humanas con rF-CEA/MUC/TRICOM daria lugar a la expresion de cada uno de los cinco transgenes. Los estudios iniciales utilizaron una MOI de 20 y 40 para rF-CEA/MUC/TRICOM; una MOI de 40 mostro una mayor expresion de transgenes y de este modo se utilizo en experimentos posteriores. Como se observa en la Figura 7, la infeccion con FP-WT tenia un efecto pequeno, si lo hubiera, o nulo sobre cualquiera de los ocho marcadores de superficie analizados. Se mostro, sin embargo, que la infeccion con rF-CEA/MUC/TRICOM aumentaba sustancialmente el nivel de expresion de CEA, MUC-1, CD80, CD54 y CD58, pero no afectaba al nivel de expresion de MHC de Clase I y Clase II. La infeccion de las DC del mismo donante con rF-CEA(6D)-TRICOM mejoro el nivel de CEA, CD80, CD54, y CD58 a niveles similares a los observados con rF-CEA/MUC/TRICOM, pero no altero la expresion de MUC-1 o MHC de Clase I o Clase II. Ademas, la infeccion de las DC con rF-MUC-1-TRICOM mostro niveles similares de expresion mejorada de MUC-1 y de las tres moleculas co-estimuladoras como se observa con rF-CEA/MUC/TRICOM, pero no tuvo efecto sobre el nivel de expresion del MHC de Clase I y Clase II ni sobre la falta de expresion de CEA (datos no mostrados). La expresion de CEA y MUC-1 en las DC infectadas con los vectores rF-CEA/MUC/TRICOM, rF-CEA(6D)-TRICOM, rF-MUC-1- TRICOm o las DC no infectadas se analizo mediante analisis de inmunotransferencia. Como se muestra en la Figura 8, se detecto CEA en las DC infectadas con rF-CEA(6D)-TRICOM, rF-CEA/MUC/TRICOM y rV-CEA/MUC/TRICOM, pero no en las DC no infectadas o las DC infectadas con rF-MUC-1-TRICOM. Como se describio anteriormente, las DC expresan un bajo nivel de MUC-1, pero se observo claramente un gran aumento de MUC-1 de expresion en las DC infectadas con rF-MUC-1-TRICOM, rV-CEA/MUC/TRICOM, y RF-CEA/MUC/TRICOM, pero no en las DC infectadas con rF-CEA(6D)-TRICOM (Figura 8).
Los autores de la presente invencion han demostrado la capacidad de las DC pulsadas con el peptido agonista de CEA CAP-1(6D) y peptido agonista de MUC-1 P-93L para activar las celulas T humanas. Se llevaron a cabo estudios para determinar si la infeccion de las DC humanas con el vector rF-CEA/MUC/TRICOM podrfa estimular la produccion de IFN-y por las celulas T especfficas de CEA y especfficas de MUC-1. Estos resultados tambien se compararon con la capacidad de las DC humanas infectadas con rF-CEA(6D)-TRICOM o rF-MUC-1-TRICOM para activar estas celulas T. Como se observa en la Tabla 11, las DC no infectadas o las DC infectadas con FP-WT no dieron lugar a ninguna produccion de IFN-y por la lfnea de celulas T especffica de CEA (V8T), o la lfnea de celulas T especffica de MUC-1 (T-1191-P93L). Las DC pulsadas con el peptido CEA indujeron la produccion de IFN-y solo por la lfnea de celulas T especfficas de CEA, mientras que las DC pulsadas con el peptido MUC-1 indujeron la produccion de IFN-y solo por la lfnea de celulas T especffica de MUC-1. Del mismo modo, las DC infectadas con rF- CEA(6D)-TRICOM indujeron la produccion de IFN-y solo por la lfnea de celulas T especffica de CEA, mientras que las DC infectadas con rF-MUC-1-TRICOM indujeron la produccion de IFN-y solo por la lfnea de celulas T especffica de MUC-1. La infeccion de las DC con rF-CEA/MUC/TRICOM, sin embargo, indujo la produccion de IFN-y tanto en la lfnea de celulas T especffica de CEA y la lfnea de celulas T especffica de MUC-1, y a niveles comparables a los observados cuando se utilizan los vectores que contienen solo el transgen de un unico antfgeno tumoral. Estos estudios pueden demostrar la falta de competencia antigenica entre CEA y MUC-1 en el vector rF- CEA/MUC/TRICOM en la capacidad para activar las celulas T.
Se llevaron a cabo a continuacion estudios para determinar si la infeccion de las DC humanas con el vector rV- CEA/MUC/TRICOM podrfa estimular la produccion de IFN-y 19 por las celulas T especfficas de CEA y especfficas MUC-1. Estos resultados tambien se compararon con la capacidad de las DC humanas infectadas con rV-CEA(6D)- TRICOM, o rV-MUC-1 mas rV-TRICOM, para activar esas celulas T. Como se observa en la Tabla 12, las DC no infectadas o las DC infectadas con V-WT no dieron lugar a ninguna produccion de IFN-y en la lfnea de celulas T especffica de CEA o la lfnea de celulas T especffica de MUC-1. Las DC pulsadas con el peptido CEA indujeron la
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produccion de IFN-y solo por la linea de celulas T especffica de CEA, mientras que las DC pulsadas con el peptido MUC-1 indujeron la produccion de IFN-y solo por la linea de celulas T especffica de MUC-1. Del mismo modo, las DC infectadas con rV-CEA(6D)-TRICOM indujeron la produccion de IFN-y solo por la linea de celulas T especffica de CEA, mientras que las DC infectadas con los vectores de MUC-1 indujeron la produccion de IFN-y solo en la linea de celulas T especffica de MUC-1. La infeccion de las DC con rV-CEA/MUC/TRICOM, sin embargo, indujo la produccion de IFN-y tanto en la linea de celulas T especffica de CEA como en la linea de celulas T especffica de MUC-1 y a niveles comparables a los observados cuando se utilizan los vectores que contienen solo el transgen de un unico antfgeno tumoral. Estos estudios pueden demostrar la falta de competencia antigenica entre CEA y MUC-1 en la capacidad de activar las celulas T que emplean el vector rF-CEA/MUC/TRICOM. A continuacion se realizaron estudios para determinar si las celulas T humanas podrfan establecerse a partir de PBMC utilizando celulas dendrfticas autologas infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM y/o rV-CEA/MUC/TRICOM como APC.
Despues de tres IVS, como se describe en la seccion de Materiales y Metodos, se analizaron las celulas T resultantes para determinar su capacidad para ser activadas por DC pulsadas con peptidos o infectadas con el vector. Como se observa en la Tabla 13, ninguna de las lfneas de celulas T establecidas utilizando como APC DC infectadas con rV-CEA/MUC/TRICOM o rF-CEA/MUC/TRICOM pudo ser activada para producir IFN-y, cuando fueron estimuladas por 20 DC no infectadas, o DC infectadas con FP-WT. Estos resultados son compatibles con las observaciones anteriores en el sistema murino de que no hay reactividad cruzada en terminos de epftopos de celulas T entre virus vaccinia y de la viruela aviar (Hodge JW, Poole DJ, Aarts WM, et al. Modified vaccinia virus ankara recombinants are as potent as vaccinia recombinants in diversified prime and boost vaccine regimens to elicit therapeutic antitumor responses. Cancer Res 2003;63:7942-9); esto tambien es compatible con estudios en ratones y seres humanos anteriores (datos no publicados), que mostraron que es diffcil generar celulas T de mamffero dirigidas contra epftopos de la viruela aviar. Por otro lado, las lfneas de celulas T generadas con APC infectadas con rV-CEA/MUC/TRICOM o rF-CEA/MUC/TRICOM se activan ambas para producir IFN-y cuando se utilizan como APC DC pulsadas con los peptidos CEA o MUC-1 (Tabla 13). Estos resultados pueden indicar que las DC infectadas con cualquier vector generaran las celulas T de PBMC que se dirigen contra los antfgenos de CEA y de MUC-1.
Las celulas T generadas por las DC infectadas con rV-CEA/MUC/TRICOM o rF-CEA/MUC/TRICOM producen IFN-y cuando se exponen a DC infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM. En experimentos adicionales, se generaron celulas T empleando inicialmente como APC DC infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM, y a continuacion se pasaron con APC pulsadas con peptido CEA durante dos IVS. Como se observa de la Tabla 13, estas celulas T perdieron su capacidad de ser activadas por DC pulsadas con el peptido MUC-1, pero conservaban su capacidad de ser activadas para producir IFN-y por DC pulsadas con el peptido CEA. Por el contrario, cuando las celulas T generadas utilizando inicialmente DC infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM se pasaron a continuacion en presencia de DC pulsadas con peptido MUC-1, estas perdieron su capacidad para ser activada por las DC pulsadas con el peptido CEA, pero mantuvieron su capacidad de ser activadas por el peptido MUC-1.
A continuacion, se llevaron a cabo estudios para determinar si las lfneas de celulas T, establecidas utilizando como APC DC infectadas con el vector rV-CEA/MUC/TRICOM o RF-CEA/MUC/TRICOM, podrfan lisar celulas diana humanas. Como se observa en la Tabla 14, ambas lfneas de celulas T fueron incapaces de lisar celulas CIR-A2, pero pudieron lisar celulas C1R-A2 pulsadas con el peptido CEA o con el peptido MUC-1. Ninguna linea de celulas T pudo lisar celulas C1R-A2 pulsadas con el peptido pSa de control. Por otro lado, la linea de celulas T establecida utilizando DC infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM, y a continuacion pasada utilizando como APC, DC pulsadas con peptido CEA, fue capaz de lisar celulas diana pulsadas con el peptido CEA pero no celulas diana pulsadas con peptidos MUC-1 o PSA. Por el contrario, la linea de celulas T establecida utilizando DC infectadas con rF- CEA/MUC/TRICOM, y a continuacion pasada utilizando como APC, DC pulsadas con peptido MUC-1, fue capaz de lisar celulas diana pulsadas con el peptido MUC-1, pero no celulas diana pulsadas con peptidos CEA o PSA.
A continuacion, se llevaron a cabo estudios para determinar si las lfneas de celulas T generadas utilizando DC infectadas con vectores rV-CEA/MUC/TRICOM o rF-CEA/MUC/TRICOM tenfan la capacidad de lisar celulas tumorales humanas que expresan CEA nativo o MUC-1 nativo. Se evaluaron tres lfneas celulares diana HLA-A2+: la linea de carcinoma de mama humano MCF-7, que es positiva para MUC-1 y negativa para CEA; la linea celular de carcinoma colon humano SW1463, que es positiva tanto para CEA como para MUC-1; y la linea de melanoma humano SK-Mel-24, que es negativa para la expresion tanto de MUC-1 como de CEA. Los autores de la presente invencion no pudieron identificar una linea celular HLA-A2+ que fuera negativa para MUC-1 y positiva para CEA. Como se observa en la Tabla 14, las lfneas de celulas T generadas utilizando las DC infectadas con rV- CEA/MUC/TRICOM o RF-CEA/MUC/TRICOM fueron ambas capaces de lisar las lfneas de carcinoma de mama y de colon, pero no fueron capaces de lisar la linea de melanoma.
Por otro lado, la linea de celulas T generada utilizando DC infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM y a continuacion se re-estimularon con DC pulsadas con el peptido CEA durante dos IVS fue capaz de lisar la linea de carcinoma de colon positiva para CEA/negativa para MuC-1, pero fue incapaz de lisar la linea del cancer de mama positiva de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
CEA/negativa para MUC-1 y la linea de melanoma negativa para CEA/negativa para MUC-1. La linea de celulas T generada utilizando DC infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM y a continuacion re-estimulada con DC pulsadas con el peptido MUC-1 durante dos IVS fue capaz de lisar las lfneas celulares de tanto de colon como de mama, pero no la linea de melanoma. En conjunto, estos datos pueden demostrar que ambos vectores vaccinia y de avipoxvirus recombinantes pueden ser construidos para expresar cada uno fielmente cinco transgenes humanos, y que no se observa competencia antigenica en la capacidad de estos vectores para activar las celulas T humanas dirigidas contra dos antigenos asociados a tumores humanos .
Se generaron lfneas de celulas T T-rV, T-rF, T-rF(CEA) y T-rF(MUC) a partir de un individuo aparentemente sano. Se demostro que las cuatro lfneas celulares eran > 97% positivas para CD8, <2% positivas para CD56, > 75% positivas para CD45RA, y > 81% positivas para CD27. A continuacion, se llevaron a cabo estudios para determinar si las lfneas de celulas T especfficas podrfan ser obtenidas de un paciente con cancer de pancreas (paciente 55). Se genero una linea de celulas T utilizando como APC DC infectadas rF-CEA/MUC/TRICOM, y se denomino T-55. Como se determino por analisis de citometrfa de flujo, la linea celular T-55 era 99,9% positiva para CD8, <2% positiva para CD56, 73,6% positiva para CD45RA y 87% positiva para CD27. Como se observa en la Tabla 15, se mostro que esta linea de celulas T producfa IFN-y cuando era estimulada con DC autologas infectadas con rF- CEA/MUC/TRICOM y DC pulsadas con el peptido CEA o con el peptido MUC-1, pero no con el peptido PSA-3.
A continuacion, se llevaron a cabo estudios para determinar si 23 esta linea de celulas T podia lisar lfneas celulares de cancer positivas para CEA y/o MUC-1 y positivas para HLA-A2. La linea celular de melanoma SK-Mel-24 (negativa para MUC-1, negativa para CEA y positiva para HLA-A2) se utilizo como control negativo. Como se observa en la Tabla 16, la linea celular T-55 mostro lisis de las celulas C1R-A2 pulsadas con peptido CEA y peptido MUC-1, pero no con peptido PSA-3. Ademas, la linea celular T-55 liso celulas MCF-7 y celulas SW1463 a diferentes razones E:T, pero no mostro lisis de la linea celular de melanoma. Dos lfneas de celulas T adicionales se establecieron a partir de pacientes de carcinoma de colon. Estas lfneas de celulas T fueron denominadas T-41 y T- 49. La linea de celulas T-41 fue 98,8% positiva para CD8, <1% positiva para CD56, 33,6% positiva para CD45RA y 96,8% positiva para CD27. La linea de celulas T-49 fue 98,9% positiva para CD8, <1% positiva para CD56, 29,8% positiva para CD45RA y 95,3% positiva para CD27. Como se observa en la Tabla 15, se mostro que dos lfneas celulares T-41 y T-49 producfan IFN-y cuando eran estimuladas con celulas dendrfticas autologas infectadas con rF- CEA/MUC/TRiCoM y pulsadas con DC, con el peptido CEA o con el peptido MUC-1, pero no con el peptido de PSA- 3. Como se observa en la Tabla 17, las dos lfneas celulares T-41 y T-49 mostraron lisis de las celulas MCF-7 y SW1463 a varias razones E:T, pero no mostraron lisis de la linea celular SK-Mel-24.
Dos de las principales preocupaciones en el desarrollo y uso de vacunas para el tratamiento del cancer son: (a) la escasa inmunogenicidad de los antigenos asociados a tumores y (b) la heterogeneidad antigenica de los tumores. Los vectores descritos aquf fueron desarrollados para hacer frente a estos dos problemas. Estos vectores son los primeros en los que se insertan cinco transgenes completos en un vector de avipoxvirus y, por lo que se refiere al conocimiento de los autores de la presente invencion, cualquier vector de incompetente para la replicacion. Tambien se ha desarrollado un constructo de cinco transgenes paralelo de virus vaccinia recombinante. Para ambos vectores, cada transgen fue guiado por su propio promotor. Estudios previos en ambos modelos preclfnicos y ensayos clfnicos han demostrado que regfmenes diversificados de vacunacion principal y de refuerzo utilizando dos vacunas diferentes son superiores al uso continuado de una vacuna. Es por esta razon que se desarrollaron vectores tanto vaccinia recombinante como de la viruela aviar recombinante.
Como se ha demostrado en las Tablas 12-17, la infeccion de las DC con el vector rV-CEA/MUC/TRICOM o rF- CEA/MUC/TRICOM dio como resultado la activacion de celulas T tan eficazmente como el uso de DC como APC que fueron infectadas con cualquier vector CEA-TRICOM o MUC-1-TRICOM. Por otra parte, las celulas T generadas utilizando las DC infectadas con rV-CEA/MUC/TRICOM o RF-CEA/MUC/TRICOM fueron capaces de lisar celulas diana que expresaban CEA o MUC- 1.
Tabla 11
Produccion de IFN-y por lfneas de celulas T especfficas de CEA y especfficas de MUC-1 estimuladas con rF-CEA/MUC/TRICOM
IFN-y (pg/ml)
Tratamiento de celulas dendrfticas
CTL especfficos de CEA CTL especfficos de MUC-1
No infectadas
<15 <15
FP-WT
<15 <15
No infectadas + peptido CEA
772 <15
Produccion de IFN-y por lineas de celulas T especfficas de CEA y especfficas de MUC-1 estimuladas con rF-CEA/MUC/TRICOM
IFN-y (pg/ml)
Tratamiento de celulas dendrfticas
CTL especfficos de CEA CTL especfficos de MUC-1
No infectadas + peptido MUC-1
<15 458
FP-WT + peptido CEA
689 <15
FP-WT + peptido MUC-1
<15 404
rF-CEA(6D)-TRICOM
475 <15
rF-MUC-1-TRICOM
<15 298
rF-CEA/MUC/TRICOM
455 278
Las celulas T especfficas de CEA (V8T) y las celulas T especfficas de MUC-1 (T-1191-P93L) fueron estimuladas con DC no infectadas autologas solas o pulsadas con el peptido CEA (CAP1-6D) o con el peptido MUC-1 (P-93L); DC infectadas con el vector de control FP-WT solas o pulsadas con los peptidos CEA o MUC-1; DC infectadas con rF- 5 CEA/MUC/TRICOM, rF-CEA(6D)-TRICOM o RF-mUc-1/TRICOM. Los peptidos se utilizaron a una concentracion de 25 pg/ml. La razon de efector a APC era de 10:1. Se recolectaron los sobrenadantes de cultivo de veinticuatro horas y se escrutaron para determinar para la produccion de IFN-y.
Tabla 12
Produccion de IFN-y por lineas de celulas T especfficas de CEA y especfficas de MUC-1 estimuladas con rV- CEA/MUC/TRICOM
IFN-y (pg/ml)
Tratamiento de celulas dendrfticas
CTL especfficos de CEA CTL especfficos de MUC-1
No infectadas
<15 <15
V-WT
<15 <15
No infectadas + peptido CEA
820 <15
No infectadas + peptido MUC-1
<15 550
V-WT + peptido CEA
720 <15
V-WT + MUC-1 peptido
<15 358
rV-CEA(6D)-TRICOM
384 <15
rV-MUC-1 + rV-TRICOM
<15 213
rV-CEA/MUC/TRICOM
285 256
Las celulas T especfficas de CEA (V8T) y las celulas T especfficas de MUC-1 (T-1191-P93L) fueron estimuladas con DC no infectadas autologas solas o pulsadas con el peptido CEA (CAP1-6D) o con el peptido MUC-1 (P-93L); DC infectadas con el vector de control V-WT solas o pulsadas con los peptidos CEA o MUC-1; DC infectadas con rV- CEA/MUC/TRICOM, rV-CEA(6D)-TRICOM o rV-MUC-1 mas rV-TRICOM. Los peptidos se utilizaron a una concentracion de 25 pg/ml. La razon de efector a APC era de 10:1. Se recolectaron los sobrenadantes de cultivo de veinticuatro horas y se escrutaron para determinar para la produccion de IFN-y.
Tabla 13
Produccion de IFN-gamma por celulas T especfficos de CEA y MUC-1 establecidos mediante el uso de vectores rV- CEA/MUC/TRICOM o rF-CEA/MUC/TRICOM
Celulas dendrfticas utilizadas como APC
Lfnea de celulas T
No infectada fp-wt rF-CEA/MUC/TRICOM No infectada + peptido CEA No infectada + peptido MUC-1
T-RV
<15,6 <15,6 >1,000 976,3 514,0
Produccion de IFN-gamma por celulas T especfficos de CEA y MUC-1 establecidos mediante el uso de vectores rV- CEA/MUC/TRICOM o rF-CEA/MUC/TRICOM
Celulas dendrfticas utilizadas como APC
Lfnea de celulas T
No infectada FP-WT rF-CEA/MUC/TRICOM No infectada + peptido CEA No infectada + peptido MUC-1
T-RF
<15,6 <15,6 >1,000 550,0 446,0
T-RF(CEA)
<15,6 <15,6 403,9 729,2 <15,6
T-RF(MUC)
<5,6 <15,6 381,4 <15,6 626,8
Se generaron lfneas de celulas T humanas T-RV, T-RF, T-RF (CEA) y T-RF (MUC) como se describe en la seccion de Materiales y Metodos. Estas lfneas de celulas T se estimularon con DC autologas infectadas solas o pulsadas con el peptido CEA o MUC-1, DC infectadas con el vector de control FP-WT, y DC infectadas con rF- CEA/IMUc/tRICOM. Los peptidos se utilizaron a una concentracion de 25 pg/ml; la razon de efector a APC era de 10:1. Se recolectaron los sobrenadantes de cultivo de veinticuatro horas y se escrutaron para determinar para la produccion de IFN-y.
Tabla 14
Capacidad de las lfneas de celulas T establecidas mediante el uso como APC de DC infectadas con rV- CEA/MUC/TRICOM y RF-CEA/MUC/TRICOM, para la lisis de las celulas tumorales humanas
celulas C1R-A2 pulsadas con
Lfnea de celulas T
Sin peptido Peptido CEA Peptido MUC-1 Peptido PSA MCF-7 SW1463 SK-Mel-24
T-RV
-2,1 (1,26) 57,9 (4,5)a 50,0 (1,3)a 0,6 (2,4) 34,4 (0,1)b 27,8 (0,5)b 1,6 (1,1)
T-RF
3,58 (3,9) 62,0 (4,6)a 59,7 (0,8)a 3,8 (0,2) 31,0 (2,4)b 25,6 (1,2)b 2,7 (2,0)
T-RF(CEA)
4,3 (1,6) 62,8 (1,9)a -1,9 (1,0) 2,7 (1,0) 4,2 (3,2) 32,3 (2,1)b 0,6 (3,5)
T-RF(MUC)
-1,6 (3,2) -3,6 (5,5) 46,4 (3,3)a 1,4 (4,5) 38,2 (1,3)b 25,2 (1,3)b 0,1 (1,1)
Los resultados se expresan en % de lisis (DT). Las lfneas de celulas T humanas T-RV, T-RF, T-RF(CEA) y T- RF(MUC) se establecieron como se describe en la seccion Materiales y Metodos. Se realizo un analisis de liberacion de In de 6 horas en celulas CLR-A2 y se realizo un analisis de liberacion de In de 16 horas en celulas MCF-7, SW1463 y SK-Mel-24. El peptido CEA (CAP1-6D), el peptido MUC-1 (P-93L), y el peptido PSA (PSA-3) se utilizaron a una concentracion de 25 pg/ml. MCF-7 (lfnea celular de carcinoma de mama humano: HLA- A2+, positiva para MUC-1 y negativa para CEA); SW1463 (lfnea celular de carcinoma de colon: HLA-A2+, positiva para MUC-1 y positiva para CEA); SK-Mel-24 (lfnea celular de melanoma humano: HLA-A2+, negativa para MUC- 1, negativa para CEA). La razon de efector a diana fue de 25:1. a Significacion estadfstica (P <0,01, prueba de la t de dos colas) al comparar la lisis de las celulas CIR-A2. b Significacion estadfstica (P <0,01, prueba de la t de dos colas) al comparar la lisis de celulas SK-Mel-24.
Tabla 15
El establecimiento de lfneas de celulas T de pacientes con cancer utilizando DC autologas infectadas con rF- CEA/MUC/TRICOM demuestra reactividad con ambos epftopos de CEA y MUC-1
Celulas dendrfticas utilizadas como APC
Lfnea de celulas T
No infectada FP-WT rF-CEA/MUC1/TRICOM No infectada + peptido CEA No infectada + peptido MUC-1 No infectada + peptido PSA
T-55
<15,6 <15,6 >1.000 > 1.000 985,8 <15,6
T-49
<15,6 <15,6 > 1.000 974,2 819,0 <15,6
T-41
<15,6 <15,6 846,4 933,4 745,0 <15,6
Se establecieron T-55, T-49 y T-41 mediante la estimulacion de celulas T aisladas de un paciente de cancer de pancreas (Num. 55) y pacientes de carcinoma de colon (Num. 49 y Num. 41) con celulas dendrfticas autologas infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM (MOI de 40), durante tres IVS. La razon de efector a APC era de 10:1. Los peptidos se utilizaron a una concentracion de 25 pg/ml. Se recolectaron los sobrenadantes de cultivo de veinticuatro
El establecimiento de lineas de celulas T de pacientes con cancer utilizando DC autologas infectadas con rF- CEA/MUC/TRICOM demuestra reactividad con ambos epftopos de CEA y MUC-1
Celulas dendrfticas utilizadas como APC
Lfnea de
No FP-WT rF-CEA/MUC1/TRICOM No infectada + No infectada + No infectada +
celulas T
infectada peptido CEA peptido MUC-1 peptido PSA
horas y se escrutaron para determinar para la produccion de IFN-y. Los resultados se expresan en pg/ml de IFN-y.
Tabla 16
Capacidad de una lfnea de celulas T (T-55) establecida a partir de un paciente de pancreas utilizando como APC DC infectadas con rF-CEA/MUC/DC-TRICOM, para la lisis de celulas tumorales humanas
Celulas C1R-A2 pulsadas con
Efector: Diana
Sin peptido Peptido CEAa Peptido MUC-1 Peptido PSA MCF-7 SW1463 SK-Mel- 24
50:1
0 (0,6) 52,4 (3,3)a 53,3 (0,4)a 0(0,1) 23,8 (1,2)b 24,1 (1,2)b 0,5 (0,2)
25:1
0 (0,9) 30,3 (1,3)a 34,4 (0,8)a 0,6 (0,5) 20,4 (1,1)b 17,6 (0,3)b 0,4 (0,3)
12.5:1
0 (0,2) 16,4 (1,8)a 26,2 (5,0)a 0 (0,2) 13,8 (1,2)b 15,2 (0,4)b 0 (0,3)
Se realizo un analisis de liberacion de 111In de 6 horas en celulas C1R-A2 y se realizo un analisis de liberacion de 111In de 16 horas en celulas MCF-7, SW1463 y SK-Mel-24. Los resultados se expresan en % de lisis (DT). El peptido CEA (CAP1-6D), el peptido MUC-1 (P-93L), y el peptido PSA (PSA-3) se utilizaron todos a una concentracion de 25 pg/ml. MCF-7 (lfnea celular de carcinoma de mama humano: HLA-A2+, positivo para MUC-1 y negativo para CEA); SW1463 (lfnea celular de carcinoma de colon: HLA-A2+, positivo para mUc-1 y positivo para CEA); SK-Mel-24 (lfnea celular de melanoma humano: HLA-A2+, negativo para MUC-1, negativo para CEA). T-55 se establecio mediante la estimulacion de las celulas T aisladas de un paciente de pancreas (Num. 55) con celulas dendrfticas autologas infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM (MOI de 40) durante tres IVS. a Significacion estadfstica (P <0,01, prueba de la t de dos colas) al comparar la lisis de las celulas C1R-A2. b La significacion estadfstica (p <0,01, prueba de la t de dos colas) al comparar la lisis de celulas SK-Mel-24 celulas.
Tabla 17
Capacidad de las lineas de celulas T (T-49 y T-41) establecidas a partir de pacientes de carcinoma de colon utilizando como APC DC infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM, para la lisis de las celulas tumorales humanas
Lineas de celulas T
MCF-7 SW1463 SK-Mel-24
T-49
40:1 20,6 (0,9)a 42,9 (1,9)a 0,8 (0,1)
20:1 12,0 (1,6)a 30,2 (0,3)a 0,2 (0,2)
10:1 6,7 (1,0) 21,9 (2,1)a 1,9 (0,8)
T-41
40:1 24,4 (1,6)a 33,4 (1,3)a 0,9 (0,3)
20:1 20,5 (1,2)a 26,1 (1,1)a 1,2 (0,5)
10:1 11,0 (2,0)a 20,1 (0,1)a 2,0 (0,2)
Las lineas de celulas T-41 y T-49 se establecieron mediante la estimulacion de celulas T aisladas de pacientes con carcinoma de colon (Num. 49 y Num. 41) con DC autologas infectadas con rF-CEA/MUC/TRICOM (MOI de 40), durante tres IVS. Se realizo un analisis de liberacion de 111In de 16 horas en celulas MCF-7, SW1463 y SK-Mel-24. Los resultados se expresan en % de lisis (DT). MCF-7 (lfnea celular de carcinoma de mama humano: HLA-A2+, positiva para MUC-1 y negativa para CEA); SW1463 (lfnea celular de carcinoma de colon: HLA-A2+, positiva para MUC-1 y positiva para CEA); SK-Mel-24 (lfnea celular de melanoma humano: HLA-A2+, negativa para MUC-1, negativa para CEA). a Significacion estadfstica (P <0,01, prueba de la t de dos colas) al comparar la lisis de celulas SK-Mel-24.

Claims (20)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    1. Un polipeptido aislado de hasta 12 aminoacidos de longitud y que comprende la secuencia de aminoacidos del SED ID NO: 1, 14, 15, 16, o 19.
  2. 2. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica uno o mas de los polipeptidos de la reivindicacion 1.
  3. 3. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 2, en donde la secuencia de acido nucleico se selecciona del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 20, 21, 33, 34, y 35.
  4. 4. Un vector de acido nucleico que comprende una o mas moleculas de acido nucleico de la reivindicacion 2 o 3, conectado operativamente a un promotor inducible.
  5. 5. Una celula anfitriona que comprende el vector de la reivindicacion 4.
  6. 6. El uso de la molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 2 o 3 para la fabricacion de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria a un antfgeno tumoral MUC-1.
  7. 7. El uso del vector de acido nucleico de la reivindicacion 4 para la fabricacion de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria a un antfgeno tumoral MUC-1.
  8. 8. El uso de la reivindicacion 6 o 7, en donde la respuesta inmunitaria a un antfgeno tumoral MUC-1 es una respuesta inmunitaria generada contra un tumor MUC-1.
  9. 9. Una molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicacion 2 o 3 para su uso en la generacion de una respuesta inmunitaria a un antfgeno tumoral MUC-1.
  10. 10. El uso de uno o mas de los polipeptidos de la reivindicacion 1 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece o es susceptible a un tumor MUC-1.
  11. 11. Uno o mas de los polipeptidos de la reivindicacion 1 para uso en el tratamiento de un sujeto que padece o es susceptible a un tumor MUC-1.
  12. 12. El uso de celulas dendrfticas de un sujeto afectado de cancer, para la fabricacion de un medicamento para tratar un tumor MUC-1,
    en donde las celulas dendrfticas se afslan de un sujeto afectado de cancer y se tratan con uno o mas de los polipeptidos de la reivindicacion 1 antes de ser administradas al sujeto.
  13. 13. Las celulas dendrfticas de un sujeto afectado de cancer para su uso en el tratamiento de un tumor MUC-1,
    en donde las celulas dendrfticas se afslan de un sujeto afectado de cancer y se tratan con uno o mas de los polipeptidos de la reivindicacion 1 antes de ser administradas al sujeto.
  14. 14. El uso de uno o mas de los polipeptidos de la reivindicacion 1 fusionados a un inmunogeno debil para la fabricacion de un medicamento para la generacion de una respuesta inmunitaria al inmunogeno debil.
  15. 15. El uso de la reivindicacion 14 en donde el inmunogeno debil es un antfgeno de diferenciacion, o un antfgeno tumoral.
  16. 16. El uso de la reivindicacion 14, en donde los uno o mas polipeptidos comprenden la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 19.
  17. 17. El uso de la reivindicacion 16, en donde el polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 19 se fusiona a un antfgeno carcinoembrionario, un antfgeno viral, o un auto-antfgeno.
  18. 18. Uno o mas de los polipeptidos de la reivindicacion 1 fusionados a un inmunogeno debil para su uso en la generacion de una respuesta inmunitaria al inmunogeno debil.
  19. 19. El uso de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un tumor MUC-1,
    en donde las PBMC se activan poniendo las PBMC en contacto con celulas dendrfticas, y
    en donde las celulas dendrfticas se afslan de un sujeto afectado de cancer y se tratan con uno o mas de los
    polipeptidos de la reivindicacion 1 antes de que las PBMC activadas sean administradas al sujeto.
  20. 20. Celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de un sujeto afectado de cancer para su uso en el tratamiento de un tumor MUC-1,
    5 en donde las PBMC se activan poniendo en contacto las PBMC con celulas dendrfticas, y
    en donde las celulas dendrfticas se afslan de un sujeto afectado de cancer y se tratan con uno o mas de los polipeptidos de la reivindicacion 1 antes de que las PBMc activada sean administradas al sujeto.
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