JP2007523633A - ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球のエピトープ及びそのＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲ（ｎｏｎ−ｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ）由来のアゴニストエピトープ - Google Patents

ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球のエピトープ及びそのＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲ（ｎｏｎ−ｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ）由来のアゴニストエピトープ Download PDF

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Abstract

本発明は、ＶＮＴＲ領域外の新規ＭＵＣ−１エピトープを同定し、ＭＵＣ−１の最初のアゴニストエピトープについて記載するものである。ペプチド、タンパク質及びベクターベースのワクチンにアゴニストエピトープを使用することは、一連のヒト癌に有効なワクチンの開発に有用である。

Description

（関連出願）
本出願は、２００３年１２月１２日に出願された米国仮出願第６０／５２９，３２９号の優先権を主張するものであり、当該仮出願を参照してその全てを本明細書に取り込む。
従来のＭＵＣ−１免疫原性癌抗原及びＨＬＡアンカー残基の外側にあるＣＴＬエピトープの配列は同定されている。特に、本発明は、ＨＬＡアンカー残基を修飾して固形腫瘍、白血病又はリンパ腫に関連する天然抗原に対する、より強力な免疫反応を提供することによってＴ細胞を活性化する方法に関するものである。
腫瘍関連抗原であるＭＵＣ−１又はＤＦ−３／ＭＵＣ−１は、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌及び前立腺癌など多くのヒト腺癌並びに多発性骨髄腫及び幾つかのＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含む造血器腫瘍の細胞表面で過剰発現されている。ＭＵＣ−１は、管腔表面の正常な上皮組織では発現しているが、腫瘍組織のアピカル（apical）には局在しないことが明らかになっている。さらに、ＭＵＣ−１は、ヒト腺癌では正常な組織に比べてグリコシル化が不十分であるため、このタンパク質コアの抗原エピトープはより大きく露出している。ＭＵＣ−１の高レベルの発現及び分泌も、予後不良及び高転移能と関連していることが示されている。膵臓癌、卵巣癌及び多発性骨髄腫の患者から主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）非拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞を樹立できることが最初に実証され、これらのＴ細胞が２０個のアミノ酸の（ＶＮＴＲ（variable number of tandem repeat））２領域にあるＭＵＣ−１タンパク質コアを認識することが示された。ＶＮＴＲ領域は、ＭＵＣ−１特異的抗体の産生に対してだけでなく、ＭＨＣ非拘束性ＣＴＬに対しても免疫原性があるが、ＶＮＴＲの外側の領域の免疫原性については、比較的限られた情報しか利用することができない。
現在の癌治療法には、放射線療法及び化学療法などがあるが、これらの療法は患者に特に有害な副作用をもたらす。
したがって、腫瘍を予防及び治療するために長期間持続する保護作用を有する、改良された、より安全性の高い治療法が必要とされている。特に、現在利用可能な治療薬よりも特異性が高く、毒性の低い治療法が必要とされている。
本発明は、抗腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープの同定及び特徴付けに関し、特にＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲ細胞外領域にあるＭＵＣ−１のＣＴＬエピトープに関するものである。免疫原性エピトープを有するものとして従来から知られているＶＮＴＲの領域は、ＭＵＣ−１の領域とは異なる。本発明はまた、天然型ペプチドよりも強力な免疫細胞反応を生じさせるエンハンサーアゴニストエピトープの産生にも関する。
好適な態様において、本発明は、例えば、ＭＵＣ−１のような腫瘍抗原に由来するアゴニストポリペプチド抗原であって、天然型ポリペプチドよりも強力な免疫応答を刺激するアゴニストポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
別の好適な態様において、アゴニストポリペプチドは、天然型のポリペプチドよりも高い親和力でＨＬＡ分子に結合する。好ましくは、アゴニストポリペプチドは、ＨＬＡ分子に対して天然型のポリペプチドよりも高い結合定数（Ｋａ）を有する。また好適に、アゴニストポリペプチドは、ＨＬＡ分子に対して天然型のポリペプチドよりも低い解離定数（Ｋｄ）を有する。
別の好適な態様において、核酸分子は、最長で約１２アミノ酸のアゴニストポリペプチドをコードする。好ましくは、アゴニストポリペプチドは、ムチン腫瘍抗原に由来する。
別の好適な態様において、アゴニストポリペプチドは、ＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲ領域に由来する。好ましくは、アゴニストポリペプチドは、免疫応答を惹起させる。
本発明の一態様において、惹起される免疫応答は細胞性免疫応答である。細胞性免疫応答は、細胞傷害性Ｔ細胞応答、Ｔヘルパー細胞応答、及びＢ細胞免疫応答を含む。
別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に対応する（すなわち、それをコードできる）核酸配列を含む核酸分子又はその断片若しくは変異体を提供する。配列番号１〜１９を以下に示す。
Figure 2007523633
別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸のいずれか一つを発現する、単離された核酸分子を含むベクターを提供する。
別の好適な態様において、ベクターは、例えば、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３３１などの免疫細胞共刺激分子をコードする核酸分子を含む。
さらに別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示す分子又はその断片若しくは変異体、及び任意に、例えば、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３．３５などの免疫細胞共刺激分子を含むベクターによる樹状細胞への形質導入を提供する。
本発明の一態様において、配列番号１〜１９の何れかに示す分子及びその断片若しくは変異体、並びに任意に免疫細胞共刺激分子を含むベクターによって形質導入された樹状細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞応答の活性化など、免疫応答を惹起させる。
別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチド又はその断片若しくは変異体をコードする一つ又はそれ以上の、誘導型プロモーターに作動可能に連結された核酸配列を含有して成る核酸ベクターを提供する。
別の好適な態様において、核酸ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドなどである。好ましくは、核酸ベクターは、組織特異的な誘導型プロモーター、及び免疫細胞共刺激分子を含んでいてもよい。
別の好適な態様において、ベクターは配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチドのいずれか一つをコードする核酸配列を含む。
別の好適な態様において、ベクターは、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチドであって、配列番号１〜１９の何れかに、少なくとも約１０％、より好ましくは２５％の配列相同性、さらにより好ましくは、配列番号１〜１９の何れかに、約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９．９％の配列相同性を有するポリペプチドをコードする。
別の好適な態様において、ベクターは、配列番号２０〜３７の何れかに示す配列であって、配列番号２０〜３７の何れかに、少なくとも約１０％、より好ましくは２５％の配列相同性、さらに好ましくは、配列番号３０〜３７の何れかに、約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９．９％の配列相同性を有する配列を含む。
別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示すベクターのポリペプチド産物であって、配列番号１〜１９の何れかに、少なくとも約１０％、より好ましくは２５％、さら好ましくは、約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９．９％の配列相同性を有するポリペプチド産物を発現する宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞は、例えば、単球／マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞である。
別の好適な態様において、本発明は、ＭＵＣ−１腫瘍を患っているか、又はそれに罹患する恐れのある患者を治療する方法であって、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチド又はその断片若しくは変異体を患者に投与することを含有してなる、方法を提供する。
別の好適な態様において、本発明は、ＭＵＣ−１腫瘍を患っているか又はそれに罹患する恐れのある患者を治療する方法であって、配列番号２０〜３７の何れかに示す核酸又はその断片若しくは変異体を患者に投与することを含有してなる、方法を提供する。
別の好適な態様において、本発明は、ＭＵＣ−１腫瘍抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチド又はその断片若しくは変異体をコードする単離核酸分子及び任意に免疫細胞共刺激分子を、細胞性免疫応答を生じさせるのに十分な治療有効量を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、ベクターは、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチドであって、配列番号１〜１９の何れかに、少なくとも約１０％、より好ましくは２５％、さらに好ましくは、約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９．９％の配列相同性を有するポリペプチドを発現する。
別の好適な態様において、本発明は、ＭＵＣ−１腫瘍を患っているか又はそれに罹患する恐れのある患者を治療する方法であって、癌を患っている患者から樹状細胞を単離すること及び配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチド又はその断片若しくは変異体によって樹状細胞を処理することを含有してなる方法を提供する。好ましくは、処理した樹状細胞を患者に投与する。
別の好適な態様において、本発明は、弱い免疫原性抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、ＨＬＡに対して高い親和力をもつポリペプチドを弱い免疫原に融合させたものを患者に投与することを含有してなる方法を提供する。
本発明の一態様において、ポリペプチドは、配列番号１９のＨＬＡが結合している断片を含む。
本発明の別の態様において、弱い免疫原は、分化抗原又は腫瘍抗原である。
別の好適な態様において、配列番号１９のＨＬＡが結合している断片は、癌胎児性抗原、腫瘍抗原、自己抗原、ウイルス抗原などに融合している。
別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその断片若しくは変異体を提供する。
別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチドであって、配列番号１〜１９の何れかに、少なくとも約１０％、より好ましくは２５％、さらに好ましくは、約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９．９％の配列相同性を有するポリペプチドを提供する。
本発明の一態様において、ポリペプチドは、配列番号１９を含む。好ましくは、ポリペプチドは、高い親和力をもってＨＬＡ分子に結合し、また、ＨＬＡに対して天然型ポリペプチドよりも高い結合定数（Ｋａ）、及び／又はＨＬＡに対して天然型ポリペプチドよりも低い解離定数（Ｋｄ）を有する。
本発明の別の態様において、ポリペプチドはムチン腫瘍抗原に由来し、好ましくは、ポリペプチドは、ＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲ領域に由来する。
本発明の別の態様において、ポリペプチドの抗原提示細胞による抗原提示は、免疫応答、好ましくは細胞性免疫応答を誘導する。例えば、細胞性免疫応答は、細胞傷害性Ｔ細胞応答、Ｔヘルパー細胞応答又はＢ細胞免疫応答である。
別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９のアミノ酸配列に、少なくとも約６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むアゴニストポリペプチド又はその断片若しくは変異体を提供し、より好ましくは、当該アゴニストポリペプチドは、配列番号１〜１９のアミノ酸配列に、少なくとも約８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、より好ましくは、当該アゴニストポリペプチドは、配列番号１〜１９のアミノ酸配列に、少なくとも約９０％、９５％又は９９．９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
別の好適な態様において、ＭＵＣ−１腫瘍を患っているか又はそれに罹患する恐れのある患者を治療する方法が開示される。当該方法は、癌を患う患者から樹状細胞を単離すること、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチドで当該樹状細胞を処理すること、処理した樹状細胞によって末梢血単核細胞を活性化すること、及び、活性化されたＰＢＭＣ細胞を患者に投与することを含むことが可能である。
本発明の他の態様は後述する。
（発明の詳細な説明）
本明細書において、本発明者らは、とりわけ、非ＶＮＴＲ領域の外側に存在し、癌治療における免疫療法にとって重要な、ＭＵＣ−１の新規クラスＩ ＨＬＡ−Ａ２エピトープの同定について説明する。本発明者らは、ＩＦＮ−γ産生によって測定したところ、これらのエピトープがヒトＴ細胞を活性化できることを明らかにしている。特に、アミノ酸第９２〜１０１位がであるためＰ−９２と命名された一つのエピトープＡＴＷＧＱＤＶＴＳＶ（配列番号１）が、ＨＬＡ−Ａ２にもっとも強いレベルで結合し、ヒトＴ細胞においてＩＦＮ−γを最も大量に誘導することが示された。本発明は、また、エピトープＡＬＷＧＱＤＶＴＳＶ（配列番号１９；Ｐ−９３Ｌと命名）の何れかに示すエンハンサーアゴニストエピトープの作成法も提供する。
ほぼすべての腫瘍が、多数の腫瘍関連抗原を発現しており、それらの大部分が腫瘤の中で不均一に発現されている。これは、固有の抗原不均一性、空間配置など、腫瘍環境における環境因子又は治療的介入による抗原連続変異によって起こりうることが分かっている。したがって、多数の導入遺伝子を発現するワクチンは、この抗原不均一性という障害を緩和するのに十分役立ちうる。ＣＥＡは、結腸直腸癌、膵臓癌、及び胃癌の大部分で発現し、約７０％の非小細胞肺癌、５０％の乳癌、また、頭頸部癌や卵巣癌の一部など、その他の腫瘍型でも発現している（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＡ、Ｇｒｕｎｅｒｔ Ｆ、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、 Ｗ．「癌胎児性抗原遺伝子ファミリー：分子生物学及び臨床的視点（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ）」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ａｎａｌ １９９１、５：３４４−６６；及びＲｏｂｂｉｎｓ ＰＦ、Ｅｇｇｅｎｓｐｅｒｇｅｒ Ｄ、Ｑｉ ＣＦ、Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ．「ヒトの乳癌及び肺癌におけるヒト癌胎児性抗原及び非特異的交差反応性抗原の発現の定義（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）」Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９３、５３：８９２−７）。一方、ＭＵＣ−１は、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌及び卵巣癌の大部分と、他の癌型において過剰発現される（Ｋｕｆｅ Ｄ、Ｉｎｇｈｉｒａｍｉ Ｇ、Ａｂｅ Ｍ．「新規モノクローナル抗体（ＤＦ３）とヒトの悪性対良性の乳癌との示差的反応性（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＤＦ３） ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｖｅｒｓｕｓ ｂｅｎｉｇｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ）」、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９８４、３：２２３−３２；Ｂｕｒｃｈｅｌｌ Ｊ、Ｇｅｎｄｌｅｒ Ｓ、Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ Ｊら．「ヒト乳汁ムチンのコアタンパク質に対する乳癌反応性モノクローナル抗体の開発と特徴づけ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｍｕｃｉｎ）」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８７；４７：５４７６−８２；Ｚｏｔｔｅｒ Ｓ、Ｈａｇｅｍａｎ ＰＣ、Ｌｏｓｓｎｉｔｚｅｒ Ａ、Ｍｏｏｉ ＷＪ、Ｈｉｌｇｅｒｓ Ｊ．「ヒト多型性上皮性ムチンの組織及び腫瘍における分布（Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｕｃｉｎ）」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｖ １９８８；１１−１２：５５−１０１；Ｋｏｔｅｒａ Ｙ、Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ＪＤ、Ｐｃｈｅｒ Ｇ、Ｍｅｔｚｇａｒ ＲＳ、Ｆｉｎｎ ＯＪ．「乳癌、膵臓癌、及び結腸癌の患者由来の血清における、ヒトムチンＭＵＣ−１のＶＮＴＲエピトープに対する液性免疫（Ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｃｉｎ ＭＵＣ−１ ｉｎ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｂｒｅａｓｔ、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ、ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ）」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９４；５４：２８５６−６０；及びＧｏｙｄｏｓ ＪＳ、Ｅｌｅｒ Ｅ、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ ＴＬ、Ｆｉｎｎ ＯＪ、Ｌｏｔｚｅ ＭＴ．「合成ムチンペプチドワクチンの第１相試験。腺癌患者における特異的免疫応答の誘導（Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｕｃｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）」、Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ １９９６；６３：２９８−３０４）。したがって、これらの２つの抗原を個別標的又は複数標的することは、両抗原を発現する癌型にとって有利であることが分かる。
特定の態様に於いては、核酸分子は図９に記載された通りの配列を有さない。
特定の態様に於いては、核酸分子は図１０に記載された通りの配列を有さない。
特定の態様に於いては、核酸分子は図９に記載された通りの配列を有す。
特定の態様に於いては、核酸分子は図１０に記載された通りの配列を有す。
特定の態様に於いては、核酸分子は図９に記載された通りの配列の連続したヌクレオチドである約３０ヌクレオチド部分を有さない。
特定の態様に於いては、核酸分子は図１０に記載された通りの配列の連続したヌクレオチドである約３０ヌクレオチド部分を有さない。
特定の態様に於いては、核酸分子は図９に記載された通りの配列を有す。
特定の態様に於いては、核酸分子は図１０に記載された通りの配列を有す。
特定の態様に於いては、核酸分子は、２００４年１１月１２日付け出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３７８１０及び２００４年１１月１２日付け出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３８６４３の図７及び／又は８に記載された通りの配列の連続したヌクレオチドである約３０ヌクレオチド部分を有さない。
特定の態様に於いては、核酸分子は、２００４年１１月１２日付け出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３７８１０及び２００４年１１月１２日付け出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３８６４３の図７及び／又は８に記載された通りの配列を有す。
特定の態様に於いては、核酸分子は、２００４年１１月１２日付け出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３７８１０及び２００４年１１月１２日付け出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３８６４３に記載された通りの配列の連続したヌクレオチドである約３０ヌクレオチド部分を有さない。
特定の態様に於いては、核酸分子は、２００４年１１月１２日付け出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３７８１０及び２００４年１１月１２日付け出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３８６４３に記載された通りの配列を有す。
本明細書によって使用されている特定の用語の定義は以下の通りである。
本明細書において、「分子」は、ベクター、抗体、タンパク質、薬剤などであって、治療に使用され、本発明の方法によって患者において検出することができるものすべてを含むよう総称的に用いられる。例えば、治療効果を高めるよう、又は細胞における遺伝子移入及び／又は遺伝子発現の有効性又は選択性を高めるよう一緒に作用することができる異なったタイプの遺伝子をコードする、多数の異なったタイプの核酸輸送用ベクターなどである。核酸輸送用ベクターは、裸の核酸として又は核酸が細胞の中に入るのを容易にする１種類以上の分子に結合した輸送用媒体にして提供することができる。適当な輸送用媒体は、リポソーム製剤、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、ウイルス製剤（例えば、ウイルス、ウイルス粒子、人工ウイルスエンベロープなど）、細胞輸送用媒体などであるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において、「分子を細胞に投与する」（例えば、発現ベクター、核酸、サイトカイン、輸送用媒体、薬剤など）という用語は、細胞に分子を形質導入、形質移入、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、又はシューティング（shooting）を意味する。いくつかの態様において、標的細胞に輸送用細胞を（例えば、細胞融合によって又は輸送用細胞が標的細胞の近くに来たら輸送用細胞を溶解することによって）接触させて、標的細胞の中に分子を導入する。
「又は」という用語は、包括的にも排他的にも使用されることがある。
「遺伝的改変」とは、細胞の正常なヌクレオチドに対する付加、欠失又は破損を意味する。ＡＰＣの遺伝的改変を行うことができる方法が、本発明の趣旨と範囲に含まれる。当該技術分野に於いて承認されている方法は、ウイルスによる遺伝子導入、リポソームによる遺伝子移入、形質移入、及び遺伝子導入などである。
「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、特段の記載がない限り、本明細書全体で互換的に使用される。本明細書において、「核酸分子」は、１本鎖型又は２本鎖らせん型になっている、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）、又はデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルの重合体又はホスホロチオエート及びチオエステルなど、それらのリン酸エステル類似体を意味する。２本鎖ＤＮＡ−−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、及びＲＮＡ−−ＲＮＡのらせん型が可能である。核酸分子という用語、特にＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子は、当該分子の１次構造及び２次構造を意味し、特定の３次形状に限定するものではない。すなわち、この用語は、とりわけ直鎖状又は環状ＤＮＡ分子に見られる２本鎖ＤＮＡ（例えば制限酵素断片）、プラスミド、及び染色体を含む。具体的な２本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する際には、ＤＮＡの非翻訳鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５′から３′方向になっている配列だけを示すという通常の慣行に従って、配列を本明細書に記載するものとする。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的処置を施したＤＮＡ分子である。
本明細書において、また、添付の請求の範囲において、文の前後関係から明確に特段の指示がない限り、単数形（「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」）は、複数形への言及も含む。したがって、例えば、「宿主細胞（ａ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」と言うときは、その宿主細胞が複数のときを含み、「抗体（ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」と言うときには、１個以上の抗体、及び当業者に公知の等価物を指す等である。
本明細書において、「断片又は分節」という用語は、核酸配列、遺伝子又はポリペプチドに適用される場合には、通常、約５個以上の連続した核酸塩基（核酸配列又は遺伝子について）又はアミノ酸（ポリペプチドについて）のことであり、長さが、典型的には約１０個以上の連続した核酸塩基又はアミノ酸、より典型的には約２０個以上の連続した核酸塩基又はアミノ酸、普通には約３０個以上の連続した核酸塩基又はアミノ酸、好ましくは約４０個以上の連続した核酸塩基又はアミノ酸、より好ましくは約５０個以上の連続した核酸塩基又はアミノ酸、また、さらに好ましくは、少なくとも約６０個から８０個以上の連続した核酸塩基又はアミノ酸であろう。本明細書において、「重複断片」は、ある核酸又はタンパク質のアミノ末端から開始して、その核酸又はタンパク質のカルボキシ末端で終わる連続した核酸又はペプチドの断片を意味する。核酸又はペプチドの各断片は、次の核酸又はペプチドの断片と約１個以上の連続した核酸又はアミノ酸の配置を共有しており、より好ましくは約３個以上の連続した核酸又はアミノ酸の配置を共有しており、最も好ましくは約１０個以上の連続した核酸又はアミノ酸の配置を共有している。
核酸の場合、有意な「断片」とは、約１７ヌクレオチド以上、一般的には約２０ヌクレオチド以上、より一般的には約２３ヌクレオチド以上、通常は約２６ヌクレオチド以上、より通常は約２９ヌクレオチド以上、しばしば約３２ヌクレオチド以上、より頻繁には約３５ヌクレオチド以上、典型的には約３８ヌクレオチド以上、より典型的には約４１ヌクレオチド以上、普通には約４４ヌクレオチド以上、より普通には約４７ヌクレオチド以上、好ましくは約５０ヌクレオチド以上、より好ましくは約５３ヌクレオチド以上、また、特に好適な態様において、約５６個又はそれ以上のヌクレオチドの連続した分節である。
「ベクター」は、細胞に形質導入、トランスフェクト（形質移入）、トランスフォーム（形質転換）又は感染して、当該細胞が、当該細胞に本来存在する核酸及び／又はタンパク質以外の、又は当該細胞にとって本来とは異なった態様で、核酸及び／又はタンパク質を発現させることができる組成物である。核酸が、細胞外の環境から細胞の中に移行すると、細胞は核酸によって「形質導入」される。核酸を細胞の中に移入するいずれの方法を用いることも可能であり、この用語は、別段の記載がない限り、細胞の中に核酸を輸送する特定の方法を意味するものではない。核酸が細胞の中に導入されて、安定して複製される場合に、細胞は核酸によって「トランスフォーム（形質転換）」される。ベクターは、細胞によって発現されるべき核酸（通常はＲＮＡ又はＤＮＡ）を含む。ベクターは、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティングなど、核酸が細胞の中に入れるよう補助する物質を含んでいてもよい。「細胞形質導入ベクター」は、核酸が一旦細胞の中に形質導入されれば、その細胞の中で安定して複製及び発現することができる核酸をコードするベクターである。
「転写調節配列」は、本明細書全体にわたって使用される一般用語であり、開始シグナル、エンハンサー、プロモーター、サイレンシング要素などのＤＮＡ配列であって、それらが作動可能に連結しているタンパク質コード配列の転写を誘導、阻害、又は調節するＤＮＡ配列を意味する。
本明細書において、「下流」という用語は、ヌクレオチド配列に沿った方向について言う場合には、５′末端から３′末端への方向を意味する。同様に、「上流」という用語は、３′末端から５′末端への方向を意味する。
本明細書において、「遺伝子」という用語は、遺伝子、及び現在公知のその変異体、及び解明される可能性がある更なる変異体を意味する。
「変異体」という用語は、ポリヌクレオチド配列との関係で用いられる場合、野生型遺伝子に関係したポリヌクレオチド配列を含む。この定義は、また例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「分子種」、又は「多型」の変異体も含む。スプライス変異体は、参照分子に対し有意な一致を示すことができるが、通常は、ｍＲＮＡプロセッシング過程におけるエクソンの選択的スプライシングによって、ポリヌクレオチドの数が多くなったり少なくなったりする。対応するポリペプチドは、さらなる機能ドメインを有することもあり、ドメインがなくなることもある。分子種変異体は、一つの分子種から別の分子種に変るポリヌクレオチド配列である。本発明において特に有用なのは、野生型標的遺伝子の変異体である。変異体は、核酸配列中の一つ又はそれ以上の突然変異によって生じ、改変されたｍＲＮＡ、又はその構造若しくは機能が改変されているか、改変されていないポリヌクレオチドになることができる。いかなる天然型又は組換え型の遺伝子も、０個、１個又は多数の対立遺伝子型をもつ可能性がある。変異体を生じさせる一般的な突然変異による変化は、通常、ヌクレオチドの自然な欠失、付加又は置換とされる。これらの種類の変化は、単独で起こることがあり、又はその他と組み合わされて所定の配列において１回以上起こることがある。
本明細書において、ポリペプチドの「変異体」は、１個以上のアミノ酸残基が改変されているアミノ酸配列を意味する。変異体は、置換されたアミノ酸が同じような構造又は化学的性質を有する「保存的」変化（例えば、イソロイシンによるロイシンの置換）を有する可能性がある。より稀には、変異体が、「非保存的」変異（例えば、トリプトファンによるグリシンの置換）を有する可能性もある。同じような軽微な変異には、アミノ酸の欠失若しくは挿入、又はその両者も含みうる。どのアミノ酸残基が、生物活性を損なうことなく置換、挿入、又は欠失を行うことができるかを決定するための指針は、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）など、当該技術分野において周知のコンピュータプログラムを利用して見つけ出すことができる。
その結果得られるポリペプチドは、一般的に、互いに対して有意なアミノ酸相同性を有するはずである。多型性変異体は、定められた種に属する被検体間における、特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が変化しているもののことである。多型性変異体は、「一塩基変異多型」（ＳＮＰ）、すなわち、ポリヌクレオチド配列が一塩基変化する単一塩基突然変異も包含する。
「相補的」又は「相補体」という用語は完全に互換的に使用されており、一方の配列が他方の配列に逆平行の方向で結合することができ、各配列の３′末端が、もう一方の配列の５′末端に結合して、一方の配列にあるＡ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、及びＣが、他方の配列において、それぞれＴ（Ｕ）、Ａ、Ｃ、及びＧと配列されるとき、２つの配列は相補的であるという意味である。通常は、オリゴヌクレオチドの相補配列は、定義済みの配列に対し、少なくとも８０％又は９０％、好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の相補性を有する。好ましくは、それらの対立遺伝子又は変異体が同定される。このような配列相同性は、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて測定することもできる。
「相補配列」がポリヌクレオチド配列を意味するとき、この用語は、塩基対形成ルールによる、別の核酸分子における塩基配列に関するものである。具体的には、この用語又は同様の用語は、例えば、２本鎖ＤＮＡ分子の２本鎖間、又はオリゴヌクレオチドプライマーと、配列決定若しくは増幅すべき１本鎖核酸上のプライマー結合部位のヌクレオチドとの間などのように、ヌクレオチド又は核酸の間でハイブリダイゼーション又は塩基対形成することを意味する。相補的ヌクレオチドは、一般的に、Ａ及びＴ（又はＡ及びＵ）、又はＣ及びＧである。２本の１本鎖のＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子は、最適に整列及び比較し、また、適当なヌクレオチド挿入又は欠失を入れると、一方の鎖のヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約９５％、通常は少なくとも約９８％、また、より好ましくは約９９％〜約１００％で対形成するときに実質的に相補的であると言われる。相補的なポリヌクレオチド配列は、例えばＢＬＡＳＴプログラムなど、周知のコンピュータアルゴリズム及びソフトウェアを使用するなど、さまざまな方法によって同定することが可能である。
ペプチド／アミノ酸配列に関連して使用されるとき、「実質的な配列相同性」という用語は、配列が実質的に同一であるか類似しているため、立体構造において配列が同一となり、そのため同じ生物活性を生じさせるペプチド／アミノ酸の配列を意味する。この用語は一般的な配列の進化を意味するものではない。
「実質的な配列相同性」を有するペプチド／アミノ酸配列とは、通常、少なくとも望ましい活性に関与することが知られている領域全体にわたって、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する配列のことである。最も好ましくは、末端を除く部位で相違が５残基以下のものである。好ましくは、配列の相違とは、少なくとも上記領域に於いては、「保存的改変（conservative modifications）」である。
２つのペプチド／アミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列相同性を測定するために、最適な比較を行う目的で配列を整列させる（例えば、最適に整列させるために、第１若しくは第２のアミノ酸配列又は核酸配列の一方若しくは両方にギャップを導入して、比較するために相同でない配列を無視する）。例えば、比較するために整列させる参照用配列の長さは、当該参照用配列の３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらにより好ましくは７０％、８０％又は９０％以上である（例えば、第２の配列を、例えば１００アミノ酸残基を有する第１のアミノ酸配列に整列させる場合、３０アミノ酸残基以上、好ましくは４０アミノ酸残基以上、より好ましくは５０アミノ酸残基以上、さらに好ましくは６０アミノ酸残基以上、さらにより好ましくは７０、８０又は９０アミノ酸残基以上を整列させる）。そして、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１配列中の位置が、第２配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められていれば、その位置で分子は一致している（本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「相同性」は、アミノ酸又はヌクレオチドの「配列相同性」と同じである）。２つの配列間における相同性は、２つの配列を最適に整列させるために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮した上で、それらの配列に共通する同一の位置数の関数である。
本明細書において、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は互換的に使用される。「ペプチド」という語は、２本以上のアミノ酸又はアミノ酸類似化合物（非天然型アミノ酸など）の鎖であって、ペプチド（−ＮＨＣＯ−）結合によって隣接するアミノ酸と結合している鎖を意味する。したがって、本発明に係るペプチドは、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）及びペプチド模倣体を含む。ミメトープ及びペプチド模倣体を調製する方法は当該技術分野公知である。
本明細書において、「ミメトープ」及び「ペプチド模倣体」は互換的に使用される。ある化合物Ｘの「ミメトープ」とは、Ｘの機能的活性に必要なＸの化学構造が、Ｘの立体構造を模倣する別の化学構造で置き換えられている化合物を意味する。ペプチド模倣体の例には、ペプチド骨格が一つ又はそれ以上のベンゾジアゼピン分子（例えば、Ｊａｍｅｓ、Ｇ．Ｌ．ら（１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１９３７−１９４２参照）及び「レトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）」ペプチド（Ｓｉｓｔｏの米国特許第４，５２２，７５２号を参照されたい）によって置換されているペプチド化合物などがある。また、「ミメトープ」及び「ペプチド模倣体」という用語は、天然型のアミノ酸以外の部分であって、ペプチドの機能を顕著に損なう程に干渉することなく、立体構造的及び機能的にペプチド含有化合物の特定のアミノ酸の代わりとなる部分も意味する。アミノ酸模倣体の例は、Ｄ型アミノ酸などである。周知のペプチド合成処理法を用いて、一つ又はそれ以上のＤ型アミノ酸で置換されたペプチドを作製することができる。さらなる置換には、例えば、ｂ−シアノアラニン、カナバニン、ジエンコル酸、ノルロイシン、３−ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、５−ヒドロキシトリプトファン、１−メチルヒスチジン又は３−メチルヒスチジンなどの官能基をもつ変異型側鎖を有するアミノ酸類似体などがある。
本明細書において、化合物Ｘの「類似体」は、Ｘの機能的活性に必要なＸの化学構造を保持するが、Ｘとは異なる一定の化学構造も含む化合物を意味する。天然のペプチドの類似体の例は、一つ又はそれ以上の非天然型アミノ酸を含むペプチドである。また、「類似体」という用語は、修飾されたミメトープ及び／又はペプチド模倣体、修飾されたペプチド及びポリペプチド、並びにペプチド及びポリペプチドの対立遺伝子変異体を含むものでもある。したがって、ペプチドの類似体は、本来のペプチドに対して実質的に相同、すなわち換言すると、実質的な配列相同性を有するペプチド類似体を作り出すことができる。「アミノ酸」という用語は当該技術分野において公知の意味をもつ。好適なアミノ酸は合成誘導体はもとより天然型アミノ酸及び例えばカゼイン、すなわちカザミノ酸などのタンパク質又は、例えば、酵母；肉の分解物などの動物性産物；大豆蛋白、綿実蛋白、コーンスティープリカーなどの植物性産物の酵素分解物若しくは化学分解物に由来するアミノ酸などである（例えば、「トレーダーの発酵用培地案内（Ｔｒａｄｅｒｓ’ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ）」、Ｔｒａｄｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍｅｍｐｈｉｓ、テネシー州（１９８８）、「バイオテクノロジー：産業微生物学教科書（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、マサチューセッツ州（１９８９）、及び「コーンスティープリカーに関する製品データシート（Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄａｔａ Ｓｈｅｅｔ ｆｏｒ Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｌｉｑｕｏｒ）」、Ｇｒａｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、アイオワ州、を参照されたい）。
本発明に係る組換えポリペプチドは、当該技術分野に於いて周知の処理法によって、発現系を含む遺伝的に改変された宿主細胞から調製することができる。したがって、更なる態様において、本発明は、ポリヌクレオチド又は本発明に係るポリヌクレオチドを含む発現系、このような発現系によって遺伝的に改造された宿主細胞、及び組換え技術によって本発明に係るポリペプチドを製造することに関する。無細胞翻訳系を用い、本発明に係るＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を産生させることができる。
組換え体を作製するために、宿主細胞を遺伝的に改造して、本発明に係るポリヌクレオチドのために発現系又はその一部を取り込ませることができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、Ｄａｖｉｓらの「分子生物学の基礎的方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋらの「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州（１９８９）など、多くの標準的な実験マニュアルに記載されている方法によって行うことができる。このような方法で好適なものは、例えば、リン酸カルシウム形質移入法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入法、トランスベクション法、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質による形質移入法、エレクトロポレーション、形質導入法、スクレープローディング法（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入法、感染などである。
「異種性」要素とは、それが天然に存在している実体とは異なる実体の中に導入されているか、その中で産生される要素を意味する。例えば、ある生物に由来し、遺伝子工学技術によって別の生物に導入されたポリヌクレオチドは、異種性ポリヌクレオチドであって、発現すると、異種性ポリペプチドをコードすることができるポリヌクレオチドである。同様に、天然のコード配列から取り出され、別のコード配列に作動可能に連結しているプロモーター又はエンハンサーは、異種性プロモーター又はエンハンサーである。代替可能な用語は「外在性（foreign）」又は「外来性（exogenous）」などである。異種性ヌクレオチド配列は、アミノ酸配列、即ちペプチド又はポリペプチドをコードすることができる。
本明細書において、「プロモーター」は、それが作動可能に連結されている遺伝子又はコード配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列を意味する。さまざまな異なった由来源からの構成型、誘導型及び抑制型のプロモーターなど多数のプロモーターは当該技術分野に於いて周知であり、クローニングされたポリヌクレオチド配列として又はクローニングされたポリヌクレオチド配列の範囲内で（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託機関及びその他の商業的供給源、又は患者から）入手可能である。
本明細書において「エンハンサー」とは、それが作動可能に連結されている遺伝子又はコード配列の転写を促進するポリヌクレオチド配列を意味する。さまざまな異なった由来源からの多数のエンハンサーは当該技術分野で周知であり、クローニングされたポリヌクレオチド配列として又はクローニングされたポリヌクレオチド配列の範囲内で（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託機関及びその他の商業的供給源、又は患者から）入手可能である。また、プロモーター配列（広範に使用されているＣＭＶプロモーターなど）を含むポリヌクレオチドの多くが、エンハンサー配列も含んでいる。
「作動可能に連結されている」とは、このように表現される要素が、意図された通りに機能できる関係になって並列していることを意味する。プロモーターがコード配列の転写を調節すれば、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているプロモーターは、通常、コード配列の上流に位置しているが、必ずしもそれと隣接している必要はない。エンハンサーが、コード配列の転写を増加させれば、そのエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているエンハンサーは、コード配列の上流、内部又は下流に位置することが可能である。ポリアデニル化配列が、コード配列からポリアデニル化配列まで転写が進行するようにコード配列の下流末端に位置していれば、そのポリアデニル化配列は、コード配列に作動可能に連結されている。
本明細書において、「遺伝子輸送」、「遺伝子移入」などは、導入するために用いられる方法には関係なく外来性のポリヌクレオチド（時に「導入遺伝子」と呼ばれる）を宿主細胞の中に導入することを意味する用語である。このような方法には、（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション又はその他タンパク質もしくは脂質を利用する遺伝子輸送複合体による）ベクター介在型遺伝子移入法、及び、「裸の」ポリヌクレオチドの輸送を促進する技術（例えば、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」輸送法及びポリヌクレオチドを導入するために利用されるその他さまざまな技術）などさまざまな周知の技術がある。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞の中で安定的又は一時的に維持することができる。安定した維持には、通常、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞に適合した複製開始点を含んでいるか、染色体外レプリコン（例えばプラスミド）、又は核若しくはミトコンドリアの染色体のような宿主細胞の中に組み込まれることが必要である。当該技術分野公知であるように、また本明細書に記載されているように、多くのベクターが、遺伝子の哺乳動物細胞への導入を媒介する能力があることが知られている。
本明細書において、「標的細胞」又は「受容細胞」は、外来性の核酸分子、ポリヌクレオチド及び／又はタンパク質のレシピエントとなることが望ましいか、レシピエントとなっている被検細胞又は細胞を意味する。この用語は、単細胞の後代を含むことも意図している。
本明細書において、「インビボ」遺伝子輸送、遺伝子導入、遺伝子治療などは、外来性ポリヌクレオチドを含むベクターを、ヒト又はヒト以外の哺乳動物などの生物の体内に直接導入することを意味する用語であり、それによって、外来性ポリヌクレオチドが、その生物の細胞の中にインビボで導入される。
核酸が、細胞外の環境から細胞の中に移入されると、細胞は当該核酸によって「形質導入」される。核酸を細胞の中に導入する任意の方法を使用することができる。すなわち、この用語は、別段の記載がない限り、核酸を細胞の中に輸送する特定の方法を意味するものではない。核酸が細胞の中に導入されて安定して複製されるとき、細胞はその核酸によって「形質転換」される。ベクターは、細胞によって発現されるべき核酸（通常はＲＮＡ又はＤＮＡ）を含む。ベクターは、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コートなど、核酸が細胞の中に入るのを補助する物質を含んでいてもよい。「細胞形質導入ベクター」は、核酸が、細胞の中に一旦導入されると、当該細胞の中で安定して複製及び発現することができる核酸をコードするベクターである。
本明細書において、「相同的組換え」は、１つのベクター上にあるヌクレオチド配列が、別のベクター上にあるヌクレオチド配列と相同であることを意味する。これら２つの配列を、制限酵素を用いて切断しライゲーションすると、これら２つのベクターが合成される。一般的には、数キロベースの（５′末端及び３′末端で）改変されない隣接ＤＮＡがベクターの中に含まれる（相同的組換えベクターの説明については、例えば、Ｔｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照）。
相同性を有する核酸配列は、比較すると、有意な配列相同性又は類似性を示す。核酸において配列相同性の標準となるのは、当該技術分野に於いて一般的に利用される、配列比較による配列相同性と、ハイブリダイゼーション条件に基づく測定値のいずれかである。ハイブリダイゼーション条件は、下記に詳しく説明する。
配列相同性及び配列相同性は、本明細書においては互換的に使用される。
「ストリンジェンシー」は、温度、イオン強度及びホルムアミドなどの添加剤の濃度など、核酸が置かれる条件の組み合わせであって、二重鎖の解離をもたらすものを意味する。例えば、より高い温度、より低いイオン強度及びより高いホルムアミド濃度など、二重鎖がより解離しやすい条件を「高ストリンジェンシー」と呼ぶ。
高い選択性を必要とする用途では、一般的に、例えば、約５０℃から約７０℃の温度で約０．０２Ｍから約０．１０ＭのＮａＣｌを供給するような、比較的低塩及び／又は高温の条件という、比較的高ストリンジェントな条件を用いてハイブリッドを形成することが望まれる。
特定の用途では、より低いストリンジェンシー条件が必要とされると考えられている。これらの条件下では、プローブの配列と標的鎖の配列とが完全に相補的でなかったとしてもハイブリダイゼーションを起こす可能性があるが、複数の位置でミスマッチが起こる。塩濃度を上げ、温度を下げることにより、条件をより低ストリンジェントにすることができる。例えば、適度のストリンジェンシー条件は、約０．１から０．２５ＭのＮａＣｌで約３７℃から５５℃とすることにより提供できるが、低ストリンジェンシー条件は、約０．１５から０．９Ｍの塩、約２０℃から約５５℃という範囲の温度により提供できる。このように、ハイブリダイゼーション条件は、望ましい結果に応じて簡単に操作することができる。
「ハイブリダイゼーション条件」という語句及びそれに文法的に相当する語句が、持続時間とともに使用される場合には、ハイブリダイゼーション反応混合液を、混合液中の反応物と随伴試薬の濃度に照らして、ポリヌクレオチドプローブを標的配列にアニールさせて、一般的には核酸二重鎖を形成するのに十分な時間、温度、ｐＨの条件に置くことを指す。ハイブリダイゼーションを生じさせるのに必要とされる、そのような時間、温度及びｐＨの条件は、当該技術分野に於いて周知であるように、ハイブリダイズさせるポリヌクレオチドプローブの長さ、ポリヌクレオチドプローブと標的との間の相補性の程度、ポリヌクレオチドのグアニジン及びシトシンの含有量、望ましいハイブリダイゼーションのストリンジェンシー及びハイブリダイゼーション反応混合液における、ハイブリダイゼーションの反応速度に影響する可能性がある塩類又は付随試薬の存在に応じて決まる。あるハイブリダイゼーション反応混合液についてハイブリダイゼーション条件を最適にする方法は、当該技術分野に於いて周知である。
本明細書において、核酸配列の比較に関して「実質的な配列相同性」とは、分節、又はそれらの相補鎖が、比較されたときに、適当なヌクレオチドの挿入又は欠失を伴って、ヌクレオチドの約５０％以上、一般的には５６％以上、より一般的には５９％以上、通常は６２％以上、より通常は６５％以上、頻繁には６８％以上、より頻繁には７１％以上、典型的には７４％以上、より典型的には７７％以上、普通には８０％以上、より普通には８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５から９８％以上、及び特定の態様において、ヌクレオチドの約９９％以上という高さで最適に整列されるときに同一であるという意味である。あるいは、選択的なハイブリダイゼーション条件下で、一般的には配列番号１に由来する断片を用いて、分節が、ある鎖又はその相補鎖にハイブリダイズする場合に実質的な配列相同性が存在する。一般的には、約１４ヌクレオチド以上の伸長に対して約５５％以上、好ましくは約６５％以上、より好ましくは約７５％以上、また最も好ましくは約９０％以上の配列相同性があるときに選択的ハイブリダイゼーションが起きる。Ｋａｎｅｈｉｓａ（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３−２１３参照。配列相同性を比較する配列の長さは、説明されているとおり、より長い伸長鎖にわたることができ、特定の態様においては、約１７ヌクレオチド以上、通常は約２０ヌクレオチド以上、より通常的には約２４ヌクレオチド以上、一般的には約２８ヌクレオチド以上、より一般的には約４０ヌクレオチド以上、好ましくは約５０ヌクレオチド以上、また、より好ましくは約７５〜１００ヌクレオチド以上伸長している。分節の終端は、さまざまな塩基対の組み合わせが可能である。配列の相同性又は相同率を決定するには、ＢＬＡＳＴアルゴリズムなど、下記で検討する配列類似性に関するプロトコル及びプログラムを適宜利用する。
「多型性」という用語は、遺伝子又はその一部（例えば、対立遺伝子変異体）の複数の形態の共存を意味する。２つ以上の異なった型、すなわち、２つの異なったヌクレオチド配列が存在する遺伝子の部位は「遺伝子の多型性領域」と呼ばれる。遺伝子の多型性領域における特異的な遺伝子配列が対立遺伝子である。多型性領域は単一のヌクレオチドであってもよく、その相同性が、さまざまな対立遺伝子で異なっている。多型性領域は、数ヌクレオチド長のこともある。
本発明に係る核酸及びタンパク質の配列は、さらに、例えば、同じファミリーの別のメンバーや関連配列を同定するために公開データベースに対して検索を行うための「クエリー配列」として利用することもできる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラムにより、スコア＝１００、語長＝１２で実施して、本発明のＮＩＰ２ｂ、ＮＩＰ２ｃＬ、及びＮＩＰ２ｃＳの核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラムにより、スコア＝５０、語長＝３で実施して、本発明のＮＩＰ２ｂ、ＮＩＰ２ｃＬ、及びＮＩＰ２ｃＳのタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的でギャップを入れたアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているように、ギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する際には、各プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを用いることもできる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。
手作業、又は当業者には公知の利用可能ないくつかのコンピュータプログラムを用いて配列類似性検索を行うことも可能である。好ましくは、利用可能であり当業者に公知であるブラスト（Ｂｌａｓｔ）及びスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）のアルゴリズムなどを用いることができる。Ｂｌａｓｔは、ヌクレオチド配列及びタンパク質配列のデータベースの解析を支援するために設計されたＮＣＢＩの配列類似性検索ツールである。ＧＣＧパッケージは、公共データベース、又はローカルで利用できる検索用データベースのいずれかで使用可能なＢｌａｓｔのローカル版を提供する。ＧＣＧパッケージｖ９．０は、配列を編集、マッピング、比較、及び整列することによって、配列の解析ができるようにする１００を超える関連のあるソフトウェアプログラムを含む市販のソフトウェアパッケージである。ＧＣＧパッケージに含まれるその他のプログラムには、例えば、ＲＮＡの二次構造予測、核酸断片のアセンブリ、及び進化的解析を容易にするプログラムが含まれている。さらに、もっとも著名な遺伝子データベース（ジェンバンク、ＥＭＢＬ、ＰＩＲ、及びスイスプロット）が、ＧＣＧパッケージとともに頒布されていて、データベースの検索及び操作プログラムを用いて完全にアクセス可能である。インターネット、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍ／を通じてＧＣＧにアクセスすることができる。フェッチ（Ｆｅｔｃｈ）は、受入番号に基づいてアノテーションされているジェンバンクレコードを得ることができる、Ｅｎｔｒｅｚと同じような、ＧＣＧで使用することができるツールである。別の配列類似性検索は、Ｐａｎｇｅａ社のＧｅｎｅＷｏｒｌｄ及びＧｅｎｅＴｈｅｓａｕｒｕｓによって行うことができる。ＧｅｎｅＷｏｒｌｄ ２．５は、ポリヌクレオチド及びタンパク質の配列を解析するための自動化された、フレキシブルな高速処理用アプリケーションである。ＧｅｎｅＷｏｒｌｄは、配列の自動的な解析とアノテーションを可能にする。ＧＣＧのように、ＧｅｎｅＷｏｒｌｄも、配列の相同性検索、遺伝子発見、配列のマルチプルアラインメント、二次構造予測、及びモチーフ同定のためのいくつかのツールを組み込んでいる。ＧｅｎｅＴｈｅｓａｕｒｕｓ１．０（商標）は、多数の由来源からの情報を提供する、配列及びアノテーションデータ登録サービスであり、公開及びローカルのデータに対する関係データモデルを提供する。
別の代替的な配列類似性検索を、例えばＢｌａｓｔＰａｒｓｅによって行うことができる。ＢｌａｓｔＰａｒｓｅは、上記のストラテジーを自動的に行う、ＵＮＩＸ（登録商標）プラットホーム上で動くＰＥＲＬスクリプトである。ＢｌａｓｔＰａｒｓｅは、関心のある標的受入番号のリストを取り出して、すべてのジェンバンクフィールドを、より簡単な検索及び解析を行うための「関係データベース」フォーマットにして保存することができる「タブ区切り」テキストに構文解析して、融通性を与える。最終的には、簡単にソート、フィルターがけ、及びクエリを行うことができる一連の完全に構文分析されたジェンバンクレコード、及びアノテーションされた関係データベースが得られる。
本明細書において、「特異的にハイブリダイズする」又は「特異的検出する」という用語は、核酸分子が、試料核酸のおよそ６個以上の連続したヌクレオチドにハイブリダイズできることを意味する。
「実質的に精製された」は、本来の環境から取り出され、単離又は分離された核酸分子及びタンパク質であって、本来はそれらが結合している他の成分を約６０％以上、好ましくは約７５％以上、そして最も好ましくは約９０％以上含まない核酸分子及びタンパク質を意味する。
「抗原」は、抗体又はＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する物質である。「抗原結合部位」は、抗原と特異的結合する免疫グロブリン分子の一部である。さらに、抗原結合部位は、ＭＨＣ分子又はＴ細胞レセプターなどを含むが、これらだけに限定されない抗原結合分子上にある同様の部位を含む。「抗原処理」は、抗原を断片に分解して（例えば、蛋白質をペプチドに分解して）、「抗原提示細胞」によって特異的なＴ細胞に対して提示するために、これらの断片の一つ又はそれ以上を（例えば、結合によって）ＭＨＣ分子と会合することを意味する。
「樹状細胞」（ＤＣ）は強力な抗原提示細胞であり、インビボにおいて健全な適応的免疫反応を開始させることができる。活性化された成熟したＤＣが、Ｔ細胞の活性化及び増殖に必要なシグナルを提供することが明らかになっている。これらのシグナルは、２つのタイプに分類することができる。第１のタイプは、免疫応答に特異性を付与するが、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３（「ＴＣＲ／ＣＤ３」）複合体と、ＡＰＣの表面上にある主要組織適合複合体（上記「ＭＨＣ」）クラスＩ又はＩＩのタンパク質によって表される抗原ペプチドとの相互作用によって仲介される。シグナルの第２のタイプは、補助刺激シグナルと呼ばれるが、抗原特異的でもＭＨＣ拘束性でもなく、第１のタイプのシグナルが存在すると、Ｔ細胞の完全な増殖反応とＴ細胞エフェクター機能の誘導とをもたらすことができる。したがって、この２重のシグナル伝達は、活発な免疫応答を生じさせることができる。上記したとおり、ほとんどの鳥類以外の脊椎動物では、ＤＣは、骨髄由来の前駆細胞から生じる。未成熟のＤＣは、末梢血及び臍帯血並びに胸腺に見出される。別の未成熟固体群が他所に存在する可能性がある。さまざまな成熟段階にあるＤＣが、脾臓、リンパ節、扁桃腺及びヒトの腸に見出される。鳥類のＤＣは、鳥類に独特の一次免疫器官であるファブリキウス嚢でもに見出すことができる。好適な態様において、本発明の樹状細胞は、哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒト、マウス、又はラットの細胞である。
「共刺激分子」は、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞レセプターが結合しているペプチド／ＭＨＣ複合体とともに作用すると、ペプチドに結合するＴ細胞を活性化する補助刺激効果をもたらす単一の分子又は分子を組み合わせたものを包含する。
本明細書において、「免疫レセプター」は、クラスＩ ＭＨＣ（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｇなど）及び、例えば、Ｇｐ４９、ＰＩＲ、ＰＩＲＡ、ＰＩＲＢ、ＬＩＲ、ＮＫＲ−Ｐ１、ＮＫｐ４６、Ｄｉｇｒｌ、ＩＬＴ、ＭＩＲ、ＫＩＲなど、その他の免疫関連レセプターを意味するだろう。ＭＨＣは、ＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩＩＩ、それらの誘導体及び変異体など、その他のクラスも含むことも可能である。ヒトＭＨＣ複合体は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体とも呼ばれる。ＭＨＣ抗原は、ＭＨＣクラスＩ抗原（ヒトでは、このクラスにＨＬＡ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃ抗原が含まれる）、及びＭＨＣクラスＩＩ抗原（ヒトでは、このクラスにＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ、及び−ＤＲ抗原が含まれる）に分類される。したがって、「ＭＨＣ−ＩＩ抗原」、「ＭＨＣクラスＩＩ抗原」、及び「ＭＨＣクラスＩＩ移植抗原」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ヒトではＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ、及び−ＤＲ抗原を含む、このクラスのタンパク質を意味する。「ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子」、及び「ＭＨＣ−ＩＩ遺伝子」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ＭＨＣクラスＩＩ移植抗原をコードする遺伝子を意味する。「ＭＨＣ−ＩＩ」という用語は、本明細書においては、ＭＨＣクラスＩＩ移植抗原をコードする遺伝子座を意味し、また、この遺伝子座によってコードされる一群のタンパク質を意味する。移植抗原は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの抗原以外の細胞表面分子も含む。これらの抗原には以下のものがある。（１）血液細胞認識に関わるＡＢＯ抗原、（２）白血球細胞間の認識に関わるＩＣＡＭなどの細胞接着分子、及び（３）ＨＬＡ−１抗原を含むが、ＭＨＣ複合体によってコードされてはいない４４ｋｄの重鎖ポリペプチドと結合しているポリペプチドであるβ２−ミクログロブリン。ＨＬＡのハプロタイプ／アロタイプは、患者毎に異なっているため、患者のＨＬＡ型を判定するのにしばしば役立つ。ＨＬＡ型は、標準的なタイピング法と、Ｆｉｃｏｌｌ勾配法によって精製された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）とによって判定することが可能である。
「診断」又は「診断する」とは、病的状態の存在又は性質を同定することを意味する。診断法は、その感度及び特異性が異なる。診断測定法の「感度」とは、試験の結果陽性とされた病気をもつ患者の割合（「真の陽性」の割合）である。測定法によって検知されなかった、病気をもつ患者は「偽陰性」である。病気でなく、測定法で陰性という試験結果になった患者は「真の陰性」と呼ばれる。診断測定法の「特異性」は、１引く偽陽性の割合であるが、ここで「偽陽性」の割合は、試験で陽性という結果が出たのに病気でない者の割合と定義される。具体的な診断法で確定的な病状診断ができなくても、診断に役立つ陽性の表示を提供すれば十分である。
「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、治療すべき哺乳動物である対象を意味し、ヒトである患者が好適である。場合によっては、本発明に係る方法は、マウス、ラット、及びハムスターなどのげっ歯類、ならびに霊長類などであるが、これらに限定されない、実験動物において、獣医学的用途において、また、病気に対する動物モデルの開発において用途がある。
「標識分子」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は抗体を標識するために使用される化学的又は生化学的な部分である。それらは、放射性核種、酵素、基質、補助因子、阻害因子、蛍光剤、発色剤、化学発光剤、磁気粒子などであるが、これらに限定されるものではない。レポーター分子は、特定のポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は抗体に特異的に結合し、その存在を確認して、定量を可能にする。
本明細書において「試料」は、広い意味をもつ。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド及び抗体などを含む試料は、体液；細胞調製物の可溶性画分、すなわち細胞を増殖させた培地；染色体、オルガネラ又は細胞から単離若しくは抽出された膜；溶液中にあるか、又は基質に結合したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡ、ポリペプチド、又はペプチド；細胞；組織；組織プリント（ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｉｎｔ）；指紋、皮膚又は髪などを含むことがある。
本明細書において、「新鮮腫瘍」は、手術などの方法で宿主から取り出した腫瘍を意味する。
本明細書において、「増殖性疾患」、「腫瘍性疾患」、「腫瘍」、「癌」は互換的に使用され、無制御で異常な細胞増殖を特徴とする症状を意味する。好ましくは、治療すべき癌は、ＭＵＣ−１陽性の癌であり、異常な細胞増殖は、どの器官の細胞であってもよい。癌の例は、上皮性悪性腫瘍、芽細胞腫及び非上皮性悪性腫瘍などであるが、これらに限定されるものではない。本明細書において、「上皮性悪性腫瘍」は、皮膚に見られる上皮、すなわちより広範には、身体器官の内皮層に発生する新生物を意味する。
「治療」は、ある疾患の病理又は症状の進行又は変化を阻止する意図で行われる介入である。したがって、「治療」は、治療上の処置と予防的又は防止的処置の両方を意味する。また、「治療」は、苦痛緩和医療としても特定することができる。治療を必要とする者には、すでに疾患を有する者及び疾患を予防しようとする者が含まれる。腫瘍（例えば、癌）の治療において、治療薬は、腫瘍細胞の病変を直接に減少させるか、腫瘍細胞をして、例えば、放射線及び／又は化学療法など、他の治療薬による治療に対してより感受性を高めることができる。
本明細書において、「そのような治療を必要とする」とは、治療を必要としている、又は治療により恩恵を受ける患者がヒトである場合に、医師、看護師、又は臨床看護師などの介護者による判断である。この判断は介護者の専門知識における各種要因に基づいてなされるが、これには本発明の組成物によって治療可能な病気に、患者が罹患しているか又は羅患する恐れがあるという知見を含むものである。
本明細書において使用される「免疫系の細胞」又は「免疫細胞」は、Ｂ細胞とも呼ばれるＢリンパ球、Ｔ細胞とも呼ばれるＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、肥満細胞、血小板、ランゲルハンス細胞、幹細胞、樹状細胞、末梢血単核細胞、腫瘍浸潤（ＴＩＬ）細胞、ハイブリドーマなど遺伝子改変免疫細胞、薬剤で改変された免疫細胞及び上記細胞型の誘導体、前駆細胞又は先駆細胞などであるが、これらに限定されることなく、アッセイすることができる免疫系のあらゆる細胞を含むという意味である。
「免疫エフェクター細胞」は、抗原に結合することができる細胞であって、免疫応答の仲介をする細胞を意味する。これらの細胞は、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、例えば、ＣＴＬ株、ＣＴＬクローン及び腫瘍、炎症性又はその他の浸潤に由来するＣＴＬなどであるが、これらに限定されるものではない。
「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」は、胸腺で発生するリンパ球のサブセットであり、ＣＤ３複合体のタンパク質と結合するヘテロダイマーのレセプター（例えば、細胞の抗原／ＭＨＣ特異性に関与するＴ細胞表面上のヘテロダイマータンパク質である再構成されたＴ細胞レセプター）を有するサブセットである。Ｔ細胞の応答は、別の細胞に対するそれらの作用（例えば、標的細胞傷害、マクロファージ、活性化、Ｂ細胞活性化）、又はそれらが産生するサイトカインを測定することによって検出することができる。
本明細書において「活性化Ｔ細胞」という用語は、Ｔ細胞活性化を表す抗原（すなわちＴ細胞活性化マーカー）を発現するＴ細胞を意味する。Ｔ細胞活性化マーカーの例は、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＩＣＯＳ、ＯＸ−４０及び４−１ＢＢなどであるが、これらに限定されるものではない。活性化マーカーの発現は、例えば、ウエスタンブロット解析、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫蛍光アッセイ法及び蛍光標示式細胞分離装置（ＦＡＣＳ）による解析など、当業者に公知の技術で測定することができる。
本明細書において、「静止Ｔ細胞」は、Ｔ細胞活性化マーカーを発現しないＴ細胞を意味する。静止Ｔ細胞は、ＣＤ２５−、ＣＤ６９−、ＩＣＯＳ−、ＳＬＡＭ−及び４−１ＢＢ−であるＴ細胞などであるが、これらに限定されるものではない。これらマーカーの発現は、ウエスタンブロット解析、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫蛍光アッセイ法及び蛍光標示式細胞分離装置（ＦＡＣＳ）による解析など、当業者に既知の技術によって測定することができる。
「ＣＤ４」は、ＡＰＣの表面上にあるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合している抗原ペプチドのＴ細胞レセプターによる認識にとって重要な細胞表面タンパク質である。活性化が起きると、無処理のＣＤ４ Ｔ細胞は、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞という、それぞれの細胞型が、それらが産生するサイトカインによって特徴付けられている、少なくとも２つの細胞型の１つに分化する。「Ｔｈ１細胞」は、主に、細胞性免疫及び炎症反応に対してマクロファージを活性化することに関与するが、一方、「Ｔｈ２細胞」又は「ヘルパーＴ細胞」は、主に、Ｂ細胞を刺激して抗体を産生させる（液性免疫）に関与する。ＣＤ４は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対するレセプターである。Ｔｈ１細胞に対するエフェクター分子は、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＩＬ−３、ＴＮＦ−β及びＩＬ−２などであるが、これらに限定されるものではない。Ｔｈ２細胞に対するエフェクター分子は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＣＤ４０リガンド、ＩＬ−３、ＧＳ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β及びエオタキシンなどであるが、これらに限定されるものではない。Ｔｈ１型サイトカイン反応の活性化は、Ｔｈ２型サイトカイン反応を抑制することができる。
「ＣＤ８」は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合した抗原ペプチドのＴ細胞レセプターによる認識に重要な細胞表面タンパク質である。ＣＤ８ Ｔ細胞は、通常、「細胞傷害性Ｔ細胞」又は「キラーＴ細胞」及び活性型マクロファージになる。エフェクター分子は、パーフォリン、グランザイム、Ｆａｓリガンド、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βなどであるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において、抗体と、タンパク質もしくはペプチドとの相互作用について「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、この相互作用が、タンパク質上の特定の構造（すなわち、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。すなわち、抗体が、タンパク質一般ではなく、特異的なタンパク質の構造を認識して結合する。例えば、ある抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的であれば、標識された「Ａ」及び当該抗体を含む反応液中に、エピトープＡ（すなわち、遊離した非標識のＡ）を含むタンパク質が存在すると、当該抗体に結合した標識付きＡの量が減少する。一般的に、「特異的結合」は、例えば、抗原提示細胞上にあるＭＨＣ分子及びペプチドへのＴリンパ球によって発現されるＴ細胞レセプターの結合など、免疫関連分子の、そのリガンドに対する結合を意味する。
「活性」、「活性化」又は「増強」は、免疫細胞が反応して、測定可能なレベルで免疫機能を示すことができるということである。活性化の程度を測定するとは、事前に活性化された結果としてさらに刺激されると、増強された活性を発現できる免疫細胞の能力を定量的に測定することを意味する。この増強された能力は、免疫細胞が刺激されて、低用量の刺激物質に応答して活性に至らしめられる活性化プロセスの過程で生じる生化学的な変化によって生じる可能性がある。
免疫細胞活性は、（１）細胞又はＤＮＡの複製を測定することによる細胞増殖、（２）ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ又はＴＮＦ−αなどのサイトカインの具体的な測定値を含む活性されたサイトカインの産生、（３）細胞媒介性の標的傷害又は溶解、（４）細胞分化、（５）免疫グロブリン産生、（６）表現型の変化、（７）走化性を有するケモタクチン（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｎ）に応答できることを意味する化学走化性因子又は走化性の産生、（８）その他いくつかの免疫細胞型の活性を阻害することによる免疫抑制、及び（９）活性化された免疫細胞が断片化されることを意味する、異常な活性化の指標としてのアポトーシス、等により測定可能であるがこれらに限定されるものではない。
「アジュバント」は、それと混合された抗原に対する免疫応答を促進することができる物質である。宿主の種に応じて、さまざまなアジュバントを用いて、免疫学的応答を増強することができる。このようなアジュバントには、フロインド、水酸化アルミニウムなどの無機物ゲル及びリゾレシチン、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌｓ）、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ＫＬＨ及びジニトロフェノールなどの表面活性化物質、また、しばしばヒトで使用されるＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルブム、ならびにＣＣＲ６のリガンド及びその他のケモカインレセプターなどがあるが、これらに限定されるものではない。
「ケモカイン」は、食細胞及びリンパ球などの細胞の移動及び活性化に関与する小さなサイトカインであり、炎症反応において役割を果たす。３つのクラスのケモカインが、成熟タンパク質の保存されたシステイン（Ｃ）残基の並び方によって定義されている。すなわち、ＣＸＣ、つまり１個のアミノ酸残基によって、最初の２個の保存システイン残基が隔てられているαケモカイン；ＣＣ、つまり最初の２個の保存システイン残基が隣り合っているβケモカイン；Ｃ、つまり４個の保存システイン残基のうち２個（１番目と３番目）がないγケモカインである。ＣＸＣサブファミリーの中で、ケモカインは、さらに２つのグループに分けることができる。ＣＸＣケモカインの１つのグループは、アミノ末端近くにある１番目のシステイン残基の直前にＥＬＲ（グルタミン酸−ロイシン−アルギニン）モチーフという特徴的なアミノ酸３個の配列を有する。ＣＸＣケモカインの２つ目のグループには、そのようなＥＬＲドメインは存在しない。ＥＬＲドメインを有するＣＸＣケモカイン（ＩＬ−８、ＧＲＯα／β／γ、マウスＫＣ、マウスＭＩＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩ／β−ＴＧ／ＮＡＰ−２など）は、ミエロペルオキシダーゼ及びその他の酵素の放出を伴う好中球脱顆粒を誘導する化学誘因物質及び活性化因子として主に好中球上で作用する。ＥＬＲドメインをもたないＣＸＣケモカイン（例えば、ＩＰ−１０／マウスＣＲＧ、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１、ＰＦ４など）、ＣＣケモカイン（例えば、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１／２／３／４／マウスＪＥ／マウスＭＡＲＣ、エオタキシン、Ｉ−３０９／ＴＣＡ３、ＨＣＣ−１、Ｃ１０）及びＣケモカイン（例えばリンフォタクチン）は、単球、樹状細胞、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、Ｂ−リンパ球、好塩基球及び好酸球を化学誘因して活性化する。
「サイトカイン」は、そのサイトカインが作用する細胞の表面上にある「サイトカインレセプター」を通して、別の細胞の行動に影響を与える細胞によって作られるタンパク質である。リンパ球によって製造されるサイトカインは、「リンフォカイン」とも称される。サイトカインの例は、インターロイキン、インターフェロンなどである。
「免疫学的に有効な」とは、免疫応答を活性化して、癌などの増殖性細胞増殖疾患を予防又は治療するのに有効な量のペプチド又はその断片を意味する。言うまでもなく、そのような量は、多くの要素によって種及び患者に於いてさまざまである。例えば、マウスに比べてヒトでは、通常、より高い用量が効果的な免疫応答をもたらすために必要とさる。
本明細書において、「ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載されている配列を含む全長タンパク質など、あらゆる長さのアミノ酸鎖を包含する。本明細書に記載されている配列を含むタンパク質のエピトープを含むポリペプチドは、エピトープだけからなることもあり、別の付加的配列を含む場合もある。付加的配列は、天然のタンパク質に由来することあり、異種性のこともある。また、そのような配列は、免疫原性又は抗原性の性質を有することもある（がそうである必要はない）。
本明細書において、「抗体」という用語は、少なくとも１つの結合ドメインからなるポリペプチド又はポリペプチドのグループを意味するが、ここで、抗体結合ドメインは、抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内部表面形状と電荷分布を有する３次元結合スペースであって、抗原との免疫学的反応を可能にする３次元結合スペースを形成するための抗体分子の可変ドメインの折り畳みから形成される。抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ′断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦ（ａｂ′）２断片だけでなく、結合ドメインを含む組換えタンパク質を含む。本明細書において「抗体」という用語は、抗体全体の改変によって作成されたか、又は組換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成された抗体断片も含む。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は単鎖抗体も含む。抗体の「Ｆｃ」部位は、１本以上の重鎖定常領域ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むが、重鎖の可変領域を含まない、免疫グロブリン重鎖の当該部位を意味する。
本明細書において、「エピトープ」は、Ｂ−細胞及び／又はＴ細胞の表面抗原レセプターによって認識される（すなわち、特異的に結合される）ポリペプチドの一部である。エピトープは、通常、Ｐａｕｌ、「基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９３）及びそこで引用されている参考文献に要約されているような周知の技術を用いて同定することができる。そのような技術には、天然のポリペプチドから得られたポリペプチドを、抗原特異的な抗血清及び／又はＴ細胞株もしくはクローンと反応できるかをスクリーニングすることなどが含まれる。ポリペプチドのエピトープは、（例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＴ細胞反応性アッセイ法において）全長ポリペプチドの反応性と同様のレベルで、そのような抗血清及び／又はＴ細胞と反応する部位である。このようなスクリーニングは、通常、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８に記載されているものなど、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。Ｂ−細胞及びＴ細胞のエピトープは、コンピュータ分析によって予測することも可能である。腫瘍組織で選択的に発現される、あるポリペプチドのエピトープを含むポリペプチドは、（付加的なアミノ酸配列の有無にかかわらず）本発明の範囲に含まれる。
本明細書において、「アゴニストポリペプチド」は、天然のポリペプチドよりも強い免疫応答を活性化するポリペプチドにおけるエピトープを意味する。アゴニストポリペプチド対天然ポリペプチドの性質の違いの例は、ａ）より低いペプチド濃度でのＨＬＡ分子結合、（ｂ）解離アッセイ法におけるＨＬＡ分子に対するより高い親和力を示す、（ｃ）抗原提示細胞とともに用いると、天然のペプチドを用いて誘導されたＴ細胞によるよりも多くのＩＦＮ−γの産生を誘導するなどであるが、これらに限定されるものではない。増加又は増強された免疫応答は、上記したように測定される。
本明細書において、「天然のポリペプチド」は、自然環境の中で見出されるポリペプチドを意味する。例えば、天然のＭＵＣ−１腫瘍抗原は、患者の腫瘍細胞で発現されている。
好適な態様において、アゴニストペプチドは、天然のポリペプチドに比べてより強い免疫応答を生じさせる。例えば、天然のＰ−９２ペプチドと比べると、アゴニストペプチドは、（ａ）より低いペプチド濃度でＨＬＡ−Ａ２に結合し、（ｂ）解離アッセイ法においてＨＬＡ−Ａ２に対してより高い親和力を示し、（ｃ）抗原提示細胞とともに用いると、天然のペプチドを用いて誘導されたＴ細胞によって、より多くのＩＦＮ−γ産生を誘導し、また、（ｄ）健常な有志協力者及び膵臓癌患者から、より効率的にＭＵＣ−１特異的ヒトＴ細胞株を作出することができた。最も重要なのは、アゴニストエピトープを用いて作成したＴ細胞株は、天然のエピトープでパルスされた標的の溶解及びＭＵＣ−１を発現するＨＬＡ−Ａ２ヒト腫瘍細胞の溶解において、天然のエピトープを用いて作成したＴ細胞株よりも効率的であったということである。
別の好適な態様において、腫瘍、感染症などに罹っているか、それらに罹患する恐れのある患者を、例えば、樹状細胞（ＤＣ）など、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチド又はその断片若しくは変異体をコードするウイルスベクターによって形質導入されている、自己抗原を提示する細胞であって、任意に共刺激分子を発現する細胞によって治療する。例えば、ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭに感染した自系ＤＣをＡＰＣとして用いた。ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭは、ＭＵＣ−１及び三連構造のヒト共刺激分子（ＴＲＩＣＯＭと命名されたＢ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３）に対する導入遺伝子を含む複製欠損型アビポックスベクターである。ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭは、ヒトＤＣに効率的に感染して、共刺激分子のそれぞれを、ＭＵＣ−１同様、ＤＣ表面上で過剰発現させることが明らかにされた（表２）。
別の好適な態様において、本発明は、弱い免疫原性抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、弱い免疫原に融合したＨＬＡに対して高い親和力を有する、配列番号１〜１９のいずれか１つの何れかに示すアゴニストポリペプチド、その変異体又は断片を患者に投与することを含む方法を提供する。
好適な態様において、本発明は、例えばＭＵＣ−１などの腫瘍抗原に由来するアゴニストポリペプチド抗原であって、当該アゴニストポリペプチドが、天然のポリペプチドに比べると強い免疫反応刺激するアゴニストポリペプチド抗原をコードする単離核酸を提供する。腫瘍抗原の別例は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｐ５３などであるが、これらに限定されるものではない。
別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に対応する核酸配列を含む核酸分子又はその断片若しくは変異体を提供する。配列番号１〜１９を以下に示す。
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別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸を発現する単離された核酸分子又はその断片若しくは変異体を含むベクターを提供する。当該ベクターは、好ましくは、例えば、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３３１などの免疫細胞共刺激分子をコードしている。
さらに別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示す分子又はその断片若しくは変異体及び任意に、例えば、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３．３５などの免疫細胞共刺激分子を含むベクターによる、樹状細胞の形質導入を提供する。これらの組換えベクターは、ＭＵＣ−１＋腫瘍と診断されている患者に対して特異的な抗腫瘍作用を提供する。しかし、この抗原は、１つの具体例にすぎず、如何なる意味でも制限的なものと解釈されるべきではない。この他にさまざまなタイプの癌を治療するために有用な抗原の例としては、過剰発現型又は突然変異体型の抗原が含まれるが、それらに限定されるものではない。例えば、乳癌、腎臓癌、前立腺癌及びその他のＨＥＲ２腫瘍などのＨｅｒ２／ｎｅｕ＋腫瘍、胃腸癌に対する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肺癌、消化管癌及び膀胱癌に対するＫ−ｒａｓ、広範な腫瘍性成長に影響するｐ５３、頭頚部癌におけるＳＡＲＤＴ３。
別の好適な態様において、癌に罹っているか、癌に罹患する恐れのある患者の樹状細胞を、アゴニストポリペプチドエピトープを発現する組換えベクターによってインビボで形質導入する。樹状細胞を患者から単離して、生体外でベクターとともに培養し、その後、培養された樹状細胞を患者の体内に再融合することができる。樹状細胞の培養は、下記の実施例において詳しく説明する。あるいは、このような治療を必要とする患者にベクターを投与することができる。
好適な態様において、形質導入された樹状細胞は、例えば、それらの表面上にあるＭＵＣ−１抗原アゴニストペプチド断片などの抗原を提示する。提示された抗原に対して特異的なリンパ球は活性化され、増殖して、ＭＵＣ−１抗原を発現する腫瘍細胞を認識する。リンパ球は、Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞を含む。抗原エピトープを発現する細胞の免疫細胞による認識は、腫瘍細胞の破壊をもたらす。
別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチド又はその断片若しくは変異体をコードする１つ又はそれ以上の、誘導型プロモーターに作動可能に連結する核酸配列を含む核酸ベクターを提供する。
別の好適な態様において、当該核酸ベクターは、ウイルスベクターやプラスミドなどである。好ましくは、当該核酸ベクターは、組織特異的な誘導型プロモーターを含み、また、免疫細胞共刺激分子を含んでいてもよい。
別の好適な態様において、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸配列を含むベクター。
別の好適な態様において、ベクターは、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチドであって、配列番号１〜１９のいずれか１つに対して少なくとも約１０％、より好ましくは２５％、さらにより好ましくは約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９．９％の配列相同性を有するポリペプチドをコードする。
別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９の何れかに示すベクターのポリペプチド産物であって、配列番号１〜１９のいずれか１つに対して少なくとも約１０％、より好ましくは２５％、さらにより好ましくは約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９．９％の配列相同性を有するポリペプチド産物を発現する宿主細胞を提供する。
本発明に従って、形質導入された樹状細胞は、抗原を免疫系細胞に提示し、免疫系を活性化して、例えば、ＭＵＣ−１抗原を発現する腫瘍細胞などの腫瘍抗原エピトープを認識させる。
好適な態様において、ベクターは、下記の実施例に詳しく説明されているように、アゴニストポリペプチド及び共刺激分子をコードする核酸分子を含むアビポックスベクターである。その他のベクターを用いることも可能である。好適なベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質及び化学抱合体などである。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスなどである。ＤＮＡウイルスベクターが好適である。ウイルスベクターは、選ばれた細胞に遺伝子を導入するために選択することが可能である。このようなベクターは、オルソポックス又はアビポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩ型ウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６４：４８７；Ｌｉｍら、１９９５、「ＤＮＡクローニング：哺乳動物系（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード，イギリス；Ｇｅｌｌｅｒら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１１４９）、他のアデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ ＬａＳａｌｌｅら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９３，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９；Ｙａｎｇら、１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４）及びアデノ随伴ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８；Ｋｏｔｉｎら、国際公開第９８／１１２４４号（ＷＯ ９８／１１２４４）（３／１９／１９９８）及びＣｈｉｏｒｉｎｉら、国際公開第９９／６１６０１号（ＷＯ ９９／６１６０１）（１２／２／１９９９））などである。
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質の中に導入する。アビポックスウイルスベクター、核酸を短期間発現させるだけである。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及び単純ヘルペスウイルスベクターは、神経細胞の中に核酸を挿入するのに好適である。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約４ヶ月）よりも短い期間の発現（約２ヶ月）をもたらすが、これは、ＨＳＶベクターよりも短い。ベクターは、標準的な技術、例えば、感染、形質移入、形質導入又はトランスフォーメーション（形質転換）によって導入することができる。遺伝子導入法の例は、例えば、裸のＤＮＡのカルシウムリン酸沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、リポフェクション法、細胞マイクロインジェクション法及びウイルスベクター法などである。
ベクターを用いて、本質的には、任意の望ましい標的細胞を標的することができる。例えば、定位注入法を用いて、ベクター（例えばアデノウイルス、ＨＳＶ）を望ましい位置に向かわせることができる。その他に利用できる方法には、カテーテル法、静脈内、非経口、腹腔内及び皮下への注射並びに経口又はその他既知の経路による投与法が含まれる。
さらに別の好適な方法はＤＮＡ免疫法である。ＤＮＡ免疫法は、腫瘍マーカーをコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）ベクターの皮下注射を用いる。ｐＤＮＡ配列が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくは樹状細胞によって取り込まれる。細胞の内側に入るとすぐ、タンパク質をコードするＤＮＡは転写・翻訳されて、リンパ球に提示される。
遺伝子構築物は、選ばれた核酸配列をコードし、好ましくは、遺伝子発現に必要な調節要素に作動可能に連結している細胞内輸送配列を含む。
細胞に取り込まれると、遺伝子構築物は、機能的な染色体外分子として、細胞の中に存在し続け、及び／又は細胞の染色体ＤＮＡの中に組み込まれる。ＤＮＡは、細胞に取り込まれて、そこで、プラスミドの形で隔離した遺伝物質として留まる。あるいは、染色体の中に組み込まれ得る直鎖状ＤＮＡを細胞の中に導入することができる。細胞の中にＤＮＡを導入するときは、染色体の中へのＤＮＡの組み込みを促進する試薬を加えることもできる。組み込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列も、ＤＮＡ分子の中に含まれうる。あるいは、ＲＮＡを細胞に投与することも可能である。遺伝子構築物を、セントロメア、テロメア及び複製開始点を含む直鎖状のミニ染色体として提供することも考えられる。遺伝子構築物は、細胞の中で生存する弱毒化した微生物又は組換え微生物ベクターの中で遺伝子物質の一部として残ることができる。遺伝子構築物は、組換えウイルスワクチンのゲノムの一部であってもよく、遺伝子物質は、細胞の染色体の中に組み込まれるか、染色体外に残ったままでいるかのいずれかである。
遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節要素を含む。これらの要素は、プロモーター、開始コドン、終止コドン及びポリアデニル化シグナルなどである。さらに、例えば、配列番号１〜１９の何れかに示すアゴニストポリペプチド又はその断片若しくは変異体などの、選択した配列の遺伝子発現に対してエンハンサーが必要とされる。これらの要素が、望ましいタンパク質をコードする配列に作動可能に連結していること、そして、調節要素が、それらが投与される患者の体内で機能できることが必要である。
開始コドン及び終止コドンは、通常、免疫原性標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられている。しかし、これらの要素は、遺伝子構築物を投与される患者の体内で機能することが必要である。開始コドン及び終止コドンは、コード配列と同じ読み枠に存在しなければならない。
使用されるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、患者の細胞の中で機能しなければならない。
本発明を実施するために有用な、特に、ヒトの遺伝子ワクチンの産生に有用なプロモーターの例は、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶの長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、また、ヒト・アクチン、ヒト・ミオシン、ヒト・ヘモグロビン、ヒト・筋肉クレアチン及びヒト・メタロチオネインなどのヒト遺伝子に由来するプロモーターなどであるが、これらに限定されるものではない。
本発明を実施するために有用な、特に、ヒトの遺伝子ワクチンの産生に有用なポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルなどであるが、これらに限定されるものではない。
ＤＮＡ発現に必要とされる調節要素に加えて、他の要素をＤＮＡ分子に含ませることもできる。そのような付加的要素には、エンハンサーなどがある。エンハンサーは、ヒト・アクチン、ヒト・ミオシン、ヒト・ヘモグロビン、ヒト・筋肉クレアチン並びにＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶに由来するエンハンサーなど、ウイルスのエンハンサーを含むが、これらに限定されないグループから選択することができる。
遺伝子構築物は、構築物を染色体外に維持し、構築物のコピーを細胞の中に多数産生するために哺乳動物の複製開始点を備えることができる。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州サンディエゴ）のプラスミドｐＣＥＰ４及びｐＲＥＰ４は、エプスタイン・バー・ウイルスの複製開始点と、組み込まれることなく、多数のコピーのエピソーム複製を生じさせる核抗原ＥＢＮＡ−１のコードする領域とを含む。
タンパク質の産生を最大にするため、構築物を投与する細胞における遺伝子発現に十分に適した調節配列を選択することができる。さらに、細胞の中でもっとも効率的に転写されるコドンを選択することができる。当業者は、細胞の中で機能するＤＮＡ構築物を作成することができる。
本発明に係る方法は、患者の組織に核酸分子を投与する工程を含む。いくつかの好適な態様において、核酸分子は、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内、もしく局所的に、又は、洗浄液（ｌａｖａｇｅ）によって、膣、直腸、尿道、頬及び舌下腺からなるグループから選択される粘膜組織に投与される。
いくつかの態様において、核酸分子は、促進剤の投与と同時に細胞に送達される。促進剤は、ポリヌクレオチド機能増進剤又は遺伝子ワクチン促進剤とも呼ばれる。促進剤は、例えば、１９９４年１月２６日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９及び１９９５年３月３０日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０４０７１で説明されており、両方とも参照されて本明細書に組み込まれる。核酸分子とともに投与される促進剤は、核酸分子との混合物として投与されるか、核酸分子の投与とは別に、同時に、その前に、又は後に投与することができる。
いくつかの好適な態様において、本発明に係る遺伝子構築物は、例えば、安息香酸エステル、アニリド、アミジン、ウレタン及びこれらの塩酸塩で、局所麻酔剤ファミリーなどからなるグループから選択される促進剤とともに処方又は投与される。促進剤は、遺伝子構築物の前、それと同時、又はその後に投与される。促進剤及び遺伝子構築物は、同一の組成物に処方することができる。
本発明のいくつかの態様において、患者は、まず、遺伝子構築物を投与する前に、促進剤の注射を受ける。すなわち、例えば、遺伝子構築物の投与の約１週間から１０日前までに、患者は、まず促進剤を注射される。いくつかの態様において、患者は、遺伝子構築物を投与する約１から５日前又は後に促進剤を注射され、いくつかの態様においては、投与する２４時間前又は後に促進剤を注射される。あるいは、もしすぐに使用されるのであれば、促進剤は、遺伝子構築物の投与と同時に、数分前、又は数分後に投与する。したがって、促進剤と遺伝子構築物を混合して、単一の薬学的組成物を作成することができる。
いくつかの態様において、遺伝子構築物は、促進剤なしで、すなわち、促進剤を含まない処方剤とし、促進剤の投与と同時に遺伝子構築物を投与しない投与プロトコルを用いて投与される
本発明に従って細胞に送達される核酸分子は、予防用及び／又は治療用の免疫剤として機能するタンパク質に対する遺伝子の鋳型として機能することができる。好適な態様において、核酸分子は、動物の細胞の中でコード領域を転写及び翻訳するために必要な調節配列を含む。
本発明の更なる態様において、本明細書に記載されたアゴニストポリペプチドを、ＭＵＣ−１陽性腫瘍の免疫療法に使用することができる。これらの態様において、化合物（ポリペプチド、抗体、又は核酸分子）は、好ましくは、薬学的組成物又はワクチンに取り入れられる。薬学的組成物は、このような化合物の一つ又はそれ以上、及び生理学的に許容される担体を含む。ワクチンは、一つ又はそれ以上のポリペプチド及びアジュバント又はリポソーム（その中に化合物が取り込まれる）などの免疫応答亢進剤を含むことができる。薬学的組成物及びワクチンは、さらに、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号及び第５，０７５，１０９号に開示されているような生物分解性ミクロスフィアなどの送達系を含むことができる。本発明の範囲に含まれる薬学的組成物及びワクチンは、一つ又はそれ以上の別のポリペプチドなど、その他の化合物を含むこともできる。
本発明の薬学的組成物において、当業者に既知の任意の適当な担体を用いることができるが、担体のタイプは、投与形態によって変る。皮下注射などの非経口投与用には、担体は、水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、又は緩衝液を好適に含む。経口投与させるためには、上記担体のいずれか、又は、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース及び炭酸マグネシウムなどの固形担体を使用することができる。生物分解性ミクロスフィア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコール酸）も、本発明に係る薬学的組成物の担体として使用することができる。
さまざまなアジュバントのいずれかを、本発明に係るワクチンに使用して、免疫応答を非特異的に増進することができる。ほとんどのアジュバントは、水酸化アルミニウム又はミネラルオイルなど、急速な代謝から抗原を保護するよう設計された物質、及びリピドＡ、百日咳菌（Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又は結核菌に由来するタンパク質などの免疫応答刺激剤を含む。適当なアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバント及び完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ミシガン州）、メルクアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、ローウェー、ニュージャージー州）、ミョウバン、生物分解性ミクロスフィア、モノホスホリルリピドＡ及びクワイルＡ（ｑｕｉｌ Ａ）のように市販されている。ＧＭ−ＣＳＦ又はインターロイキン−２、−７若しくは−１２などのサイトカインもアジュバントとして使用できる。
別の好適な態様において、本発明は、ＭＵＣ−１腫瘍に罹っているか、罹患する恐れのある患者を治療する方法であって、配列番号１〜１９の何れかに示すペプチド又はそれらの断片若しくは変異体を被験者に投与することを含む方法を提供する。
本発明によれば、細胞性免疫応答を生じさせるのに十分な治療有効量のアゴニストポリペプチドを投与することによってＭＵＣ−１腫瘍抗原に対する免疫応答を生じさせるが、ここで、アゴニストポリペプチドは、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチド又はそれらの断片若しくは変異体のいずれか１つであり、場合によっては、免疫細胞共刺激分子であってもよい。好ましくは、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチドであって、配列番号１〜１９のいずれか１つに、少なくとも約１０％、より好ましくは２５％、さらにより好ましくは、約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９．９％の配列相同性を有する。
ペプチドは、癌を罹っているか、癌に罹患する恐れのある患者に投与される。特定の癌についての明確な臨床診断が、疾患の初期段階を含めて、ペプチドを投与する根拠となる。ＭＵＣ−１陽性癌のように、疾患の家族歴があり、確実な予後指標によって危険があると予測されている患者を予防的に治療して発症前に癌を阻止できる場合には、予防的に施用するのが妥当であり、又は手術後に投与することもできる。
ペプチドワクチンは、薬学的に許容される媒体に入れて数多くの可能な処方で投与することができる。短いペプチドの場合、免疫原性を高めるために、ペプチドをＫＬＨなどの担体に結合させることができる。ワクチンは、その多くが当業者に公知のアジュバントとともに投与することができる。ワクチンで初回免疫化した後、追加免疫を行うことができる。ワクチンは、免疫応答を誘導するのに十分な投与量にして、当業者によって容易に決定することができる常法によって投与される。
予防に関連したペプチドの有効性は、以下の基準に基づいて判断される。限界希釈法によって測定されたペプチド反応性Ｔ細胞の頻度、ペプチド反応性Ｔ細胞株及びクローンの増殖反応、患者から樹立された望ましいペプチドに対するＴ細胞株及びクローンのサイトカインプロフィールなど。有効性は、反応性細胞の頻度の低下、天然型に比べ改変ペプチドによるチミジン取り込みの減少、並びにＴＮＦ及びＩＦＮ−αの減少によって確認される。臨床的測定値には、カプラン・マイヤー曲線上における、１年及び２年間隔での再発率、持続的な癌期進行の遅延、ＭＲＩ上のＴ２画像の領域及び体積の変化を含む腫瘍の数及び大きさの減少並びにガドリニウム増強画像によって決定される病変部の数及び体積の減少などがある。
本発明に係るペプチド、その変異体及び断片は、単独で、又は薬学的組成物として投与することができる。簡単に言うと、本発明に係る薬学的組成物は、一つ又はそれ以上の薬学的又は生理学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤と混合された一つ又はそれ以上のペプチドを含む。このような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストランなどの炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、又は、グリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）及び保存剤を含むことができる。さらに、本発明に係る薬学的組成物は、例えば、β−インターフェロンのようなサイトカインなどの付加的有効成分を一つ又はそれ以上含むこともできる。
本発明に係る組成物は、例えば、経口、経鼻、静脈、頭蓋内、腹腔内、皮下、又は筋肉内への投与など、指示された投与形態に合わせて処方することができる。本発明の別の態様の範囲内で、本明細書に記載された組成物を、徐放型インプラントの一部として投与することも可能である。さらに別の態様の範囲内では、凍結乾燥物としての安定性を提供する適当な賦形剤を利用して、本発明に係る組成物を、凍結乾燥物として処方化し、その後再水和することができる。
本発明に係る薬学的組成物は、治療（又は予防）すべき病気に適した方法で投与することができる。投与の量と頻度は、患者の状態、患者の病気のタイプと重度などの要素によって決められる。適当な投与量は臨床試験によって決定することができるが、本発明の特に好適な態様の範囲では、本明細書記載のペプチド、変異体、もしくはその断片、又は薬学的組成物を、約５から５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与することができる。ペプチド類似体の投与量は、約５〜５０ｍｇ／ｋｇであるが、より正確には試験をした後に決定される。患者を、上記したように、ＭＲＩにより治療の有効性及び臨床症状の悪化について観察することができる。
ＭＲＩを用いて、ガドリニウム−ＤＴＰＡ−増強画像法（ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３６：１４，１９９４）により活動性病変を、又はＴ２加重技術（Ｔ２−ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）により病変の位置及び程度を測定することができる。簡単に言うと、基線ＭＲＩを得る。各後続実験に対し、同一の画像平面と対象位置を使用する。病変部の検出を最大にし、病変部の追跡を容易にするために位置決め及び画像化の順序を選択する。各後続実験において、同一の位置決め及び画像化の順序を使用する。放射線科医師によってＭＳ病変の位置と程度を判定する。病変領域の輪郭を描き、切片ごとに合計して総病変領域を得る。新しい病変の証拠、活動性病変の出現率、病変領域の変化率という３つの解析を行うことができる（Ｐａｔｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４３：６６５，１９９３）。基線と比較して患者において、又は治療グループ対プラセボグループにおいて統計的に有意な改善があったときには、治療による改善を確認する。
本発明の別の態様において、癌を患っているか、癌に罹患する恐れのあると診断された患者に任意の腫瘍抗原ポリペプチドを投与することができる。同定された腫瘍抗原に相当するポリペプチドを用いて、免疫系の細胞を刺激して、例えば、ＣＥＡ、ｐ５３、Ｋ−ｒａｓなどの腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞を認識及び溶解することができる。
抗体の使用を含むさまざまな方法が腫瘍の治療において適用されているが、活性化された細胞傷害性Ｔ細胞を用いた試みに成功したことは、あったとしても、ほとんど記録されていない。理論的には、細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍を治療する好適な手段である。しかし、細胞傷害性Ｔ細胞を特異的に活性化するために利用できる方法はなかった。抗体とは対照的に、ＣＤ８細胞の表面上にあるＴ細胞レセプターは、外来性抗原を直接認識することができない。抗原は、まず、樹状細胞など、Ｔ細胞レセプターに提示されなければならない。
ＣＤ８ Ｔ細胞への抗原提示は、クラスＩ型の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって行われる。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、免疫応答において重要な役割を果たす広範な糖タンパク質ファミリーをコードする大きな遺伝子座を意味する。ＭＨＣ遺伝子は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原：ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ）複合体とも呼ばれるが、ヒトの６番染色体上に位置する。ＭＨＣ遺伝子によってコードされる分子は、細胞表面に存在して、組織移植片を「非自己」と認識することに大きく関わっている。したがって、膜結合型ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞による抗原の認識に密接に関係する。
ＭＨＣ産物は、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩという３つの主要なクラスに分けられる。主にヘルパー細胞として働くＴ細胞はＣＤ４を発現し、最初に、クラスＩＩ分子と相互作用するが、一方、ＣＤ８発現細胞は、主に細胞傷害性エフェクター細胞を代表し、クラスＩ分子と相互作用する。
クラスＩ分子は、内生タンパク質の細胞内分解から主に生じるペプチドに結合することができる膜糖タンパク質である。ＭＨＣ分子と、ウイルス、バクテリア及びその他の外来性タンパク質由来のペプチドとの複合体は、Ｔ細胞の抗原反応性を開始させるリガンドを含む。これに対し、ＭＨＣ分子と、正常な細胞産物から生じたペプチドとの複合体は、胸腺において、Ｔ細胞が自己ペプチドを寛容するように「教える」役割を果たす。クラスＩ分子は、完全無欠の抗原を提示するわけではなく、それらのペプチド断片であって、「ペプチド結合溝」上に「搭載された」ものを提示する。
当業者に認識されるように、「宿主適合的」細胞又は「自系」細胞という用語は、細胞が投与される患者又は「宿主」のハプロタイプと同一又は類似したハプロタイプの細胞を意味する。
ペプチドに結合したクラスＩ ＭＨＣ分子だけを提示しても、通常は、ＣＤ８細胞を活性化する上で有効ではなかった。事実上、ＣＤ８細胞は、例えば、樹状細胞のように、ペプチド結合型クラスＩ ＭＨＣ分子だけでなく、共刺激分子も提示するような抗原提示細胞によって活性化される。このような共刺激分子には、現在ではＢ７．１及びＢ７．２と命名された２つのサブグループになっていると認識されているＢ７、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３などがある。また、インテグリンなどの細胞接着分子も、このプロセスを補助することが分かっている。
樹状細胞は、血液など、すべての組織及び器官に見られる抗原提示細胞である。具体的には、樹状細胞は、Ｔリンパ球に抗原を提示する。すなわち、抗原を処理して提示し、未処理の記憶Ｔ細胞からの応答を刺激する。抗原提示における役割以外に、樹状細胞は、非リンパ組織と直接情報を交換して、非リンパを調査して傷害シグナル（例えば、虚血、感染、又は炎症）又は腫瘍増殖を測定する。シグナルがあると、樹状細胞は、リンパ球及び単球を始動させるＩＬ−１を放出して免疫応答を開始させる。ＣＤ８ Ｔ細胞が、クラスＩ ＭＨＣが結合したペプチド及び共刺激分子を有する樹状細胞などの抗原提示細胞と相互作用すると、ＣＤ８ Ｔ細胞が活性化されて増殖してエフェクターＴ細胞になる。一般的には、参照して本明細書に取り込むＪａｎｅｗａｙ及びＴｒａｖｅｒｓのＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ロンドン（１９９４）、を参照されたい。
したがって、必要とされており、本発明が提供するものは、Ｔ細胞を活性化させることにより、その増殖を促し、例えばＭＵＣ−１などの望ましい抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性とし、投与された抗原に特異的な記憶細胞を維持する手段である。このように、さまざまな腫瘍エピトープに対して免疫系が準備されており、自然発生癌が生じたら、準備された免疫細胞のプールが活性化して腫瘍細胞を認識し、死滅させる。
好ましくは、免疫系に提示されるエピトープは、本明細書に記載されているようなアゴニストエピトープを含む。アゴニストポリペプチド又はその断片若しくは変異体は、好ましくは、配列番号１〜１９のアミノ酸配列と約６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、より好ましくは、アゴニストポリペプチドは、配列番号１〜１９のアミノ酸配列に約８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、より好ましくは、アゴニストポリペプチドは、配列番号１〜１９のアミノ酸配列に少なくとも約９０％、９５％又は９９．９％相同性を有するアミノ酸配列を含む。
記憶Ｔ細胞の生物学の概説は、Ｄｕｔｔｏｎら（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６：２０１−２３で見ることができる。記憶細胞は、さまざまなパターンの細胞表面マーカーを発現し、未処理の細胞のやり方とは機能的に異なるいくつかの方法で応答する。ヒトの記憶細胞はＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋である。未処理細胞とは対照的に、記憶細胞は、全範囲のＴ細胞サイトカインを分泌する。
また、ケモカイン及びサイトカインも、免疫応答の発生において強力な役割を果たしている。白血球の輸送におけるケモカインの役割は、Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９２：５６５−８によって概説されており、そこでは、活性化のタイプと程度が異なるリンパ球の複雑な輸送における遊走反応がケモカインによって媒介されることが示唆されている。低分子を使用してケモカインを遮断することが、Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ及びＭｏｓｅｒ（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１８９−１１９１によって概説されている。
リンパ球ホーミングにおけるケモカインのさまざまな特異的役割については既述されている。例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅは、ＳＤＦ−１（ＰＢＳＦとも呼ばれる）、６−Ｃ−ｋｉｎｅ（Ｅｘｏｄｕｓ−２とも呼ばれる）及びＭＩＰ−３β（ＥＬＣ又はＥｘｏｄｕｓ−３とも呼ばれる）が、ほとんどのＣＤ４＋Ｔ細胞など、循環液中のほとんどのリンパ球の接着を誘導し、ＭＩＰ−３α（ＬＡＲＣ又はＥｘｏｄｕｓ−１とも呼ばれる）が記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の接着を開始させたが、未処理のＣＤ４＋Ｔ細胞は開始させなかったことを明らかにした。Ｔａｎｇｅｍａｎｎら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６３３０−７は、リンパ球を二次リンパ器官へホーミングさせる高内皮細静脈（ＨＥＶ）関連ケモカインである二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）の役割を開示している。Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４１（４）：１０５３−９は、ＳＬＣに対するレセプターをＣＣＲ７として記載しており、また、そのリガンドであるＳＬＣが、生理学的剪断（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｈｅａｒ）下におけるインテグリン依存性のリンパ球ローリングを迅速に停止できることを記載している。
成熟Ｂ細胞は、免疫アッセイ法で測定することができる。例えば、ＣＤ１９及びＣＤ２０などの細胞表面抗原によって、蛍光色素又は酵素で標識したモノクローナル抗体をこれらの抗原に用いて測定することができる。形質細胞に分化しているＢ細胞は、細胞内免疫グロブリンを染色して、固定した培養細胞塗抹標本における直接的免疫蛍光法によって数えることができる。
成熟と細胞分化を測定するためにいくつか異なった方法を利用することができる。例えば、このような方法の１つは、細胞の表現型を測定することによる。免疫細胞の表現型及び任意の表現型の変化は、さまざまな免疫細胞型に特徴的な膜タンパク質に結合するモノクローナル抗体を用いて、免疫蛍光染色した後にフローサイトメトリーを行って評価することができる。
細胞分化を測定する第２の手段は、細胞機能を測定することによるものである。これは、細胞内の酵素、ｍＲＮＡ、遺伝子、タンパク質、もしくはその他の代謝物の発現、又は細胞からの分泌を測定することにより生化学的に行うことができる。また、バイオアッセイ法を用いて、機能的な細胞分化を測定し、又は患者の腫瘍、腫瘍細胞株若しくは新鮮腫瘍からの細胞に対する特異的抗体の産生を測定することもできる。
免疫細胞は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清のいずれかで検出することができる多様な細胞表面分子を発現する。分化又は活性化を経た免疫細胞を、固定した培養細胞塗抹標本における直接的免疫蛍光法によって、特徴的な細胞表面タンパク質の存在を染色することによって数えることができる。
インビトロＴ細胞細胞傷害性アッセイ法が当業者に周知である。好適な方法は、５時間の５１クロム酸ナトリウム（５１Ｃｒ）放出アッセイ法で細胞傷害性を測定することである。特に、２０時間５１Ｃｒ放出アッセイ法が好適である。本明細書において「標的細胞」とも呼ばれる腫瘍細胞を平底マイクロタイタープレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートする。翌日、標的を洗浄して、３７℃にて５１Ｃｒで標識する。５１Ｃｒは、エンドサイトーシス又はピノサイトーシスによって標的細胞によって取り込まれ、細胞質の中に保持される。腫瘍細胞を含むウェルを洗浄した後、「エフェクター細胞」と呼ばれる腕付き（ａｒｍｅｄ）又は腕なし（ｕｎａｒｍｅｄ）のＡＴＣを、さまざまなＥ：Ｔ比で平板塗布し、３７℃で一晩インキュベートする。細胞溶解は、エフェクター細胞による標的細胞の破壊により標的細胞から上清の中に放出された５１Ｃｒの量を示す尺度である。マイクロタイタープレートを１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、約５０μｌから約１００μｌの等量液を取り出して、放射活性のレベルを翌日ガンマカウンターで測定して、特異的溶解の割合（％）を計算する。
以下の公式を用いて、特異的溶解の割合を測定する。
（標的細胞から放出される５１Ｃｒ）−（自然に標的細胞から放出される５１Ｃｒ）／（標的細胞から放出される５１Ｃｒの最大量）−（自然に標的細胞から放出される５１Ｃｒ）×１００
自然に標的細胞から放出される５１Ｃｒは、エフェクター細胞が加えられていない腫瘍細胞を用いて測定される。標的細胞から放出される５１Ｃｒの最大量は、例えば、１Ｍ ＨＣｌを加えることによって得られ、標的細胞の細胞質に存在する５１Ｃｒの総量を表す。
Ｔリンパ球の活性を測定するための他の方法は、下記の実施例において説明する混合リンパ球反応によるものである。それ以外にも、トリチル化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）による標的細胞の標識のような細胞傷害性アッセイ法を用いることができる。３Ｈ−ＴｄＲは、標的細胞によって細胞の核の中に取り込まれる。３Ｈ−ＴｄＲの放出は、ＤＮＡの断片化による細胞死の尺度となる。このアッセイ法は、上記したように行われるが、但し、インキュベートする時間は約４８時間以上であり、５０μｌから約１００μｌの上清を、約１ｍｌ以上のシンチレーション液の存在下でベータ−カウンターによって測定する。上記の公式を用いて、特異的溶解の割合の計算を行う。
好適な態様において、ポリペプチドは、正常な被験者における発現レベルと比較して、少なくとも、癌の患者においてより高いレベルで発現されるが、好ましくは、ポリペプチドは、正常な被験者における発現と比較すると、癌の患者で約５から約１０倍以上の高さで発現する。好ましくは、癌は、ＭＵＣ−１＋癌であり、被検者試料は、ヒト被検者のような霊長類などの哺乳動物被検対象から得る。
別の好適な態様において、本発明は、ＭＵＣ−１腫瘍を患っているか、それに罹患する恐れのある患者を治療する方法であって、癌を患う患者から樹状細胞を単離すること、そして、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチド又はそれらの断片若しくは変異体で上記樹状細胞を処理することを含む方法を提供する。好ましくは、処理した樹状細胞を患者に投与する。
さらに別の好適な態様において、自己樹状細胞を患者から単離し、本明細書で詳細に説明されているベクターによって形質導入し、培養して、再び、患者に再注入することができる。
「単離され」又は「精製され」た細胞集団は、それが本来結びついている細胞及び物質を実質的に含まない。実質的に含まないＡＰＣ、又は実質的に精製されたＡＰＣとは、集団の５０％以上がＡＰＣであり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更により好ましくは９０％以上が、それらが本来一緒になっている非ＡＰＣ細胞を含まないという意味である。
細胞表面発現マーカーに基づいて、さまざまな成熟段階の樹状細胞を単離することができる。例えば、成熟樹状細胞は、提示するための新規のタンパク質を捕捉しにくくなるが、より容易に休止Ｔ細胞を刺激して成長及び分化させることができる。したがって、成熟樹状細胞が重要なものとなりうる。成熟樹状細胞は、形態の変化、非接着性及びさまざまなマーカーの存在によって同定することができる。このようなマーカーには、Ｂ７．２、ＣＤ４０、ＣＤｌ１ｃ＋及びＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩなどの細胞表面マーカーが含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、炎症促進性サイトカインの産生を観察及び解析することによって、成熟を確認することができる。一般的なサイトフルオログラフィー及び細胞選別技術、ならびに蛍光標示式細胞分離装置（ＦＡＣＳ）などの装置を用いて、樹状細胞を集めて解析することができる。樹状細胞成熟のさまざまな段階の細胞表面抗原に対して特異的な抗体が市販されている。
患者に投与される樹状細胞の量も、患者の健康状態によって変化するので、実施者がすべての適切な要素を考慮して決定すべきである。しかし、好ましくは約１×１０６から約１×１０１２、より好ましくは約１×１０８から約１×１０１１、及び更に好ましくは約１×１０９から約１×１０１０の樹状細胞が成人に使用される。これらの用量は、患者の年齢、体重、サイズ、健康状態、性別、治療すべき腫瘍のタイプ、投与経路、治療が局所的なものか全身的なものか又はその他の要素によって変る。当業者であれば、具体的な事情および患者の必要に適合するように適切な投薬量及び投薬計画を容易に導き出すことができるはずである。
細胞構成成分を再導入する方法は当該技術分野公知であり、Ｈｏｎｓｉｋらに付与された米国特許第４，８４４，８９３号及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇに付与された第４，６９０，９１５号などに例示されている手順を含む。例えば、静脈内注射によって活性化ＣＤ８細胞を投与するのが適切である。ドナー細胞の注入によって生じる毒性が少しでも、妊娠した女性に見られたら、それ以上の注入を即座に停止することとなる。毒性は、国立癌研究所（ＮＣＩ）の基準による。
毒性類別−ＮＣＩ共通毒性基準
＊等級Ｉ〜ＩＩの毒性が生じた場合、被験者は注入計画を続行することができる。
＊等級ＩＩＩの毒性が生じた場合、毒性が等級Ｉ〜ＩＩに低下するまで「薬剤」を留保し、その後注入を再開する。再開後、等級ＩＩＩ又はＩＶの毒性が生じた場合、「薬剤］の注入を停止する。
＊等級ＩＶの毒性が生じた場合、被験者に等級ＩＶの毒性が生じていることを記録し、次回注入はそれ以前の用量に減少させる。以前の用量で等級ＩＶの毒性が生じた場合、「薬剤」を停止する。
＊特定の投薬量で３人の被験者のうち１人に等級ＩＶの毒性が生じた場合、さらに３人の被験者をその細胞用量レベルで参加させ、その用量レベルで、全部で６人の被験者としなければならない。ある細胞用量レベルで６被験者のうち２人が等級ＩＶの毒性を表した場合、この用量は最大耐用量（ＭＴＤ）と定義される。次の３被験者に前回細胞投与量の６６％（３分の２）を投与する。用量増大を評価するため、各被験者に、６回の注入のうち少なくとも４回は、同じ用量レベルで投与しなければならない。
その全文が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４９７，８７６号に記載されているように、大量の抗原提示樹状細胞を生体外で生じさせることができる。１人の患者のＣＤ３４＋造血前駆細胞及び幹細胞を収集した後、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びｆｌｔ−３リガンド（ｆｌｔ３−Ｌ）などのサイトカインを用いて、インビトロで細胞の規模を拡大し、それらを樹状細胞系統の細胞に分化させることができる。また、サイトカインを用いて、収集前に循環液中のＣＤ３４＋細胞の数を増加させることもできる。得られた樹状細胞を、免疫応答を誘導させたいと思う抗原に対して曝露し、抗原を処理させる（この処理は、当該技術分野に於いて、時に「抗原パルシング（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｕｌｓｉｎｇ）」と呼ばれる）。そして、抗原パルスされた（又は、抗原−発現）樹状細胞は、ＣＤ４０結合タンパク質によって活性化されてから、患者に投与される。
樹状細胞は、独特の形態と広範な組織分布を有する不均一な細胞集団である。樹状細胞系及び免疫におけるその役割は、本明細書において参照して組み込まれているＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：２７１−２９６（１９９１）によって概説されている。樹状細胞の細胞表面は特異で、ベール様の突起をもち、細胞表面マーカーであるＣＤｌａ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８６＋又はＨＬＡ−ＤＲ＋を有するという特徴をもつ。樹状細胞は、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞を感作する高い能力をもち、Ｔ細胞の成長及び寛容過程における自己抗原及び免疫過程での外来抗原の両方とも、非常に効果的に生体内原位置でＴ細胞に抗原提示する。
それらが効果的に抗原提示できるため、自己樹状細胞は、生体外のアロ抗原のアジュバントとして好適に利用されている（例えば、Ｒｏｍａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：８３（１９９４）参照）。樹状細胞を免疫刺激剤として使用するのは、樹状細胞が末梢血において低頻度であること、リンパ器官との接触可能性が限られていること及び樹状細胞の最終分化状態が原因で制限されている。樹状細胞は、骨髄又は末梢血液のＣＤ３４＋前駆細胞及び末梢血単核細胞から発生し、サイトカインであるＧＭ−ＣＳＦサルグラモスチム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標；Ｉｍｍｕｎｅｘ社、ワシントン州、シアトル）、ＴＮＦ−α、ｃ−ｋｉｔリガンド（幹細胞因子（ＳＣＦ）、造血幹細胞因子（ＳＦ）、又は肥満細胞増殖因子（ＭＧＦ）としても知られている）及びＩＬ−４によって、樹状細胞の増殖及び成熟を促進することができる。最近になって、ｆｌｔ３−Ｌが、インビボ及びインビトロで、機能的に成熟した多数の樹状細胞の生成を促進することが明らかにされている。
樹状細胞の生体外培養
造血幹細胞及び前駆細胞を生体外で増殖させる方法は、参照されて本明細書に組み込まれる米国特許第５，１９９，９４２号に記載されている。その他にも適当な方法が当該技術分野公知である。簡単に言うと、生体外での培養及び増殖は、（１）ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞を患者の末梢血又は骨髄外植片から採集すること、そして（２）このような細胞を生体外で増殖させること、を含む。米国特許第５，１９９，９４２号に記載されている細胞増殖因子以外にも、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３及びｃ−ｋｉｔリガンドを用いることができる。
ＣＤ３４マーカーを有する幹細胞又は前駆細胞は、骨髄内の単核細胞の僅か約１％から３％を構成するにすぎない。末梢血におけるＣＤ３４＋幹細胞又はＣＤ３４＋前駆細胞の量は、骨髄におけるよりも約１０〜１００倍少ない。ｆｌｔ３−Ｌなどのサイトカインを用いて、インビボで樹状細胞の数を増加又は結集させることができる。患者の樹状細胞の量を増加させることで、腫瘍抗原又はバクテリアもしくはウイルスの抗原など、患者の体内にすでに存在する抗原のＴ細胞に対する抗原提示を促進することができる。あるいは、免疫目的で患者に抗原を投与する前、それと同時、又はその後にサイトカインを投与することも可能である。
当該技術分野公知のアフェレーシス法を用いて末梢血細胞を集める。例えば、Ｂｉｓｈｏｐら、Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．２，ｐｐ．６１０−６１６（１９９４）参照。簡単に言うと、例えば、ヘモネティックス・モデルＶ５０（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｍｏｄｅｌ Ｖ５０）血漿交換装置（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ社、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，Ｍａｓｓ）など、従来からの装置を用いて、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）及び末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）を集める。１ｋｇあたり約６．５×１０８個の単核細胞（ＭＮＣ）が集まるまで、一般的には、１週あたり５回を超えないよう４時間の採集を行なう。細胞を標準的な培地に懸濁してから、遠心分離して、赤血球と好中球を取り除く。２つの層の界面にある細胞（軟膜）を取り出して、ＨＢＳＳに再懸濁する。懸濁された細胞は、主に単核細胞であり、細胞混合物の相当の部分が初期幹細胞である。
細胞集団からＣＤ３４＋造血幹細胞又はＣＤ３４＋前駆細胞を同定し、分離するためのさまざまな細胞選抜技術が知られている。例えば、モノクローナル抗体（又はその他の特異的細胞結合タンパク質）を用いて、幹細胞又は前駆細胞上に見られるマーカータンパク質又は表面抗原タンパク質に結合させることができる。造血幹細胞に対するこのようなマーカー又は細胞表面抗原のいくつかが（例えばｆｌｔ−３、ＣＤ３４、Ｍｙ−１０及びＴｈｙ−１）、特異的結合タンパク質として、当該技術分野に於いて知られている。
１つの方法において、抗体若しくは結合タンパク質を、例えば、ガラスビーズ若しくはフラスコ、磁気ビーズ、又は適当なクロマトグラフィー用樹脂などの表面に固定し、細胞の集団と接触させる。すると、幹細胞はビーズ基質に結合する。あるいは、結合タンパク質を細胞混合液とインキュベートすることができ、生じた合成物は、抗体−細胞複合体に対してアフィニティーを有する表面に接触した。不要な細胞及び細胞物質を除去して、比較的純粋な幹細胞の集団を提供する。特異的細胞結合タンパク質は、例えば、発色団又はフルオロフォアで蛍光標識することもでき、標識された細胞をソーティング（選別）によって分離することができる。好ましくは、単離は免疫アフィニティーカラムによって行う。
免疫アフィニティーカラムは、どのような形状でもよいが、通常は、充填ベッド型反応器を含む。これらのバイオリアクターにおける充填ベッドは、好ましくは、実質的に基質を均一にコートする多孔性材料からできている。多孔性材料は、高い表面面積対体積比をもたらし、細胞がベッドから流れ出ることを妨げることなく、細胞混合液が広い接触面積上を流れることができるようにする。基質は、その独自の性質によって、又は化学成分を付加することによって、細胞結合タンパク質上に存在する部分に対し高いアフィニティーを示さなければならない。典型的な基質は、アビジン及びストレプトアビジンなどであるが、それら以外の従来からある基質を使用することも可能である。
有用な方法の１つにおいて、分離すべき細胞上の細胞表面抗原を認識するモノクローナル抗体を一般的には更に改変して、ビオチン部分が提示されるようにする。それによって、アビジンに対するビオチンのアフィニティーが、モノクローナル抗体を充填ベッドの表面に取り外し可能な形で固定する（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，９１：１１，１９８６参照）。充填ベッドを洗浄して、未結合の物質を除去し、常法を用いて標的細胞を遊離させる。アビジンでコートされた充填ベッドに固定された抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を利用する、上記タイプの免疫アフィニティーカラムについては、例えば、国際公開９３／０８２６８号（ＷＯ ９３／０８２６８）に記載されている。
静止期の幹細胞を選択する別法は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）又は４−ヒドロキシシクロホスファミド（４−ＨＣ）などのアルキル化剤のような代謝拮抗物質を用いて、より系列づけられた分裂中の細胞型において細胞死を誘導することである。幹細胞には全く、あるいはほとんど影響を及ぼさない増殖因子を付加して、非静止期細胞が増殖及び分化するように刺激して、非幹細胞を増殖及び分化させて、それらが、５−ＦＵ又は４−ＨＣの細胞傷害作用をより受けやすいようにする。参照されて本明細書に組み込まれるＢｅｒａｒｄｉら、 Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７：１０４（１９９５）参照。
単離された幹細胞は、速度制御フリーザー（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒａｔｅ ｆｒｅｅｚｅｒ）（例えば、Ｃｒｙｏ−Ｍｅｄ社製、マウントクレメンス、ミシガン州）の中で凍結させることができ、抗凍結剤としてジメチルスルホキシドを用いて、液体窒素の気相の中で保存することができる。樹状細胞（新鮮なもの、又は凍結されたもの）の増殖及び培養のために、無血清又は血清を用いた培地など、さまざまな増殖用及び培養用の培地を用いることができる。有用な増殖培地には、ＲＰＭＩ、ＴＣ １９９、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅら、Ｆ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４７：９２３（１９７８））、ＤＭＥＭ、フィッシャー培地、アルファ培地、ＮＣＴＣ、Ｆ−１０、リーボビッツＬ−１５（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ′ｓ Ｌ−１５）、ＭＥＭ及びマッコイ培地などがある。培地に含まれる具体的な栄養分は、血清アルブミン、トランスフェリン、脂質、コレステロール、２−メルカプトエタノール又はモノチオグリセロールなどの還元剤、ピルビン酸、酪酸、及びヒドロコルチゾン−２−ヘミスクシネートのようなグルココルチコイドなどである。より具体的には、標準的な培地は、エネルギー源、ビタミン又はその他の細胞補助有機化合物、培地のｐＨを安定させるように作用する、ＨＥＰＥＳ又はＴｒｉｓなどの緩衝液及びさまざまな無機塩を含む。さまざまな無血清細胞増殖用培地が、参照されて本明細書に組み込まれる国際公開第９５／００６３２号に記載されている。採集されたＣＤ３４＋細胞を、例えば、本明細書に記載されているような適当なサイトカインとともに培養する。そして、ＣＤ３４＋細胞は、分化させられ、樹状細胞系列の細胞に決定づけられる。そして、フローサイトメトリー又は同様の手段によって、ＣＤｌａ、ＨＬＡ ＤＲ、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６など、樹状細胞の特徴であるマーカーを用いて、これらの細胞をさらに精製する。培養された樹状細胞を、例えば同種異系のクラスＩ ＨＬＡ分子などの抗原に曝露して、抗原を処理させてから、一定量のＣＤ４０結合タンパク質とともに培養して樹状細胞を活性化させる。あるいは、樹状細胞を、同種異系クラスＩ ＨＬＡ分子又は免疫関連レセプターをコードする遺伝子によって形質移入し、その後、一定量のＣＤ４０結合タンパク質とともに培養して抗原提示樹状細胞を活性化させる。
そして、抗原特異的免疫応答を促進するために、活性化された抗原運搬樹状細胞を患者に投与する。樹状細胞は、抗原投与の前、それと同時、又はその後に投与することができる。あるいは、患者からＴ細胞を採集して、インビトロで、活性化された抗原運搬樹状細胞に曝露して、抗原特異的Ｔ細胞を刺激し、それらを患者に投与することができる。
有用なサイトカイン
さまざまなサイトカインが、樹状細胞の生体外培養において役立つ。Ｆｌｔ３−Ｌは、参照されて本明細書に組み込まれるＥＰ０６２７４８７Ａ２及び国際公開第９４／２８３９１号に記載されているポリペプチドの属を意味する。ヒトｆｌｔ３−ＬｃＤＮＡは、１９９３年８月６日に米国メリーランド州ロックビルにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ６９３８２という受託番号を付与された。ＩＬ−３は、参照されて本明細書に組み込まれる米国特許第５，１０８，９１０号に記載されているようなインターロイキン−３ポリペプチドの属を意味する。本発明において使用するのに適したヒトＩＬ−３タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から、受託番号ＡＴＣＣ ６７７４７として公に入手できる。ｃ−ｋｉｔリガンドは、肥満細胞増殖因子（ＭＧＦ）、造血幹細胞因子、又は幹細胞因子（ＳＣＦ）とも呼ばれ、参照されて本明細書に組み込まれるＥＰ ４２３，９８０に記載されている。その他有用なサイトカインには、インターロイキン−４（ＩＬ−４；Ｍｏｓｌｅｙら、Ｃｅｌｌ ５９：３３５（１９８９）、Ｉｄｚｅｒｄａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：８６１（１９９０）及びＧａｌｉｚｚｉら、Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６６９（１９９０）、これらは各々、参照されて本明細書に組み込まれる）及び顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；米国特許第５，１０８，９１０号及び第５，２２９，４９６号に記載されており、これらは各々参照されて本明細書に組み込まれる）などがある。市販されているＧＭ−ＣＳＦ（サルグラモスチム、登録商標Ｌｅｕｋｉｎｅ）は、ワシントン州、シアトルにあるＩｍｍｕｎｅｘ社から入手可能である。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３のＣ末端からＮ末端までの融合）も、樹状細胞の生体外培養において有用である。このような融合タンパク質は公知であり、米国特許第５，１９９，９４２号、第５，１０８，９１０号及び第５，０７３，６２７号に記載されており、これらは各々参照されて本明細書に組み込まれる）。好適な融合タンパク質は、米国特許第５，１９９，９４２号に記載されているＰＩＸＹ３２１である。
有用なサイトカインは、樹状細胞の表面にあるレセプターに結合して、シグナルを伝達することによって作用する。さらに、ＣＤ４０結合タンパク質について本明細書に記載されているように、適当なサイトカインレセプターに結合して、樹状細胞にシグナルを伝達する付加的な結合タンパク質を調製することも可能である。例えば、国際公開９５／２７０６２号は、Ｆｌｔ−３Ｌに対するレセプターであるＦｌｔ−３に対するアゴニスト性抗体について記載されており、それから、多様なＦｌｔ−３結合タンパク質を調製することができる。これ以外に有用なサイトカインは、樹状細胞を培養するのに役立つサイトカインの生物活性型類似化合物などである。有用なサイトカイン類似体は、天然のサイトカインに実質的に類似したアミノ酸配列を有し、それらの特異的レセプターに結合して、生体信号を伝達することができる生物活性を有する。このような類似体を当該技術分野公知の方法によって調製及び試験することができる。
抗原を提示する樹状細胞を調製する代替法は、抗原、又はそれに由来する特異的ポリペプチドをコードする遺伝子で樹状細胞を形質移入することである。樹状細胞が、ＭＨＣとの関連で抗原を発現するとすぐに、ＣＤ４０結合タンパク質によって樹状細胞が活性化され、その後、患者に投与されて、その抗原に対して強化及び改善された免疫応答を提供する。
活性化された抗原提示樹状細胞をワクチンのアジュバントとして用いて、抗原投与の前、それと同時、又はその後に投与することができる。さらに、例えばＣＤ４０結合タンパク質（すなわち可溶性ＣＤ４０Ｌ）、又は可溶性ＣＤ８３分子など、免疫応答を調節するサイトカインの投与の前、それと同時、又はその後に、樹状細胞を被験者に投与することができる。これら以外に有用なサイトカインには、インターロイキン（ＩＬ）１、２、４、５、６、７、１０、１２及び１５、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、又はＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）又は、ＴＮＦ−α若しくはｃ−ｋｉｔリガンドなど、その他のサイトカインなどがあるが、これらに限定されるものではない。さらに、これらサイトカインの生物活性型誘導体；及びそれらを併用したものも有用である。
ＣＤ４０は、細胞外領域におけるシステインリッチなモチーフの存在によって定義されている、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／神経成長因子（ＮＧＦ）レセプターファミリーの一員である（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１９，１９９０；ＭａｌｌｅｔｔとＢａｒｃｌａｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １２：２２０；１９９１）。このファミリーは、リンパ球抗原ＣＤ２７、ＣＤ３０（ホジキンリンパ腫及びリード・シュテルンベルグ細胞に見られる抗原）、ＴＮＦに対する２つのレセプター、４−１ＢＢと呼ばれるマウスタンパク質、ラットＯＸ４０抗原、ＮＧＦレセプター及びＦａｓ抗原を含む。ヒトＣＤ４０抗原（ＣＤ４０）は、２７７アミノ酸からなり、分子量３０，６００のペプチドである（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、 ＥＭＢＯ Ｊ．８：１４０３，１９８９）。ＣＤ４０Ｌは、免疫応答におけるフィードバック制御において重要であると考えられている。例えば、ＣＤ４０＋抗原提示細胞がＴ細胞に抗原を提示すると、それが活性化されて、ＣＤ４０Ｌを発現するようになる。次に、ＣＤ４０Ｌは、さらに抗原提示細胞を活性化して、その抗原提示効率を高めて、クラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ、ＣＤ８０及びＣＤ８６共刺激分子、そしてさまざまなサイトカインの発現を上方制御する（Ｃａｕｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１２６３、１９９４）。
そして、精製された樹状細胞を抗原でパルス（に曝露）し、それらに、免疫系の他の細胞に対して提示するのに適した方法で抗原を取り込ませる。抗原は、古典的に処理されて、２つの経路で提示される。サイトゾル区画のタンパク質に由来するペプチドは、クラスＩ ＭＨＣ分子に関連して提示されるが、その一方、エンドサイトーシス経路で見られるタンパク質に由来するペプチドは、クラスＩＩ ＭＨＣに関連して提示される。しかし、当業者は、例えば、ＭＨＣクラスＩ上で発現される外来腫瘍抗原を認識するＣＤ８＋腫瘍特異的Ｔ細胞の反応などの例外があることを認識している。ＭＨＣ依存型抗原処理及びペプチド提示に関する概説は、Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．，Ｃｅｌｌ ７６：２８７（１９９４）にある。
抗原によって樹状細胞をパルスする数多くの方法が知られており、当業者は、選択した抗原に対して適当な方法を開発することを日常的な実験であると見なしている。通常、細胞の生存率を促進する条件下で培養樹状細胞に抗原を加え、細胞が、この抗原を取り込んで処理し、クラスＩ又はクラスＩＩのＭＨＣのいずれかとともに細胞表面上に抗原ペプチドを発現するのに十分な時間を与える。約２４時間（約１８から約３０時間、好ましくは２４時間）という時間である。樹状細胞は、抗原をコードするＤＮＡでそれらを形質移入することによって、抗原に曝露することも可能である。ＤＮＡが発現されると、抗原は、おそらく、サイトゾル／クラスＩ経路を介して処理される。
本発明は、活性化され、抗原パルスされた樹状細胞を含む治療用組成物を使用する方法を提供する。このような細胞を、可溶性サイトカインレセプターもしくはサイトカインとともに、又はその他の免疫調節性分子とともに使用することも考えられる。本発明に係る組成物は、投与されると同種異系免疫応答を促進し、ボーラス注射、持続注入、インプラントからの持続放出、又はその他適当な技術によって投与することができる。一般的には、上にある細胞を、抗原パルスされ、活性化された樹状細胞と、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤とをともに含む組成物の形にして投与する。このような担体は、使用投薬量及び濃度においてはレシピエントに対して非毒性である。中性緩衝食塩水、又は血清アルブミンと混合した食塩水が、典型的な適合希釈剤である。
一定のタイプの免疫応答を促進するためには、活性化され、抗原パルスされた樹状細胞とともに別のサイトカインを投与することも考えられる。いくつか有用なサイトカイン（又はペプチド調節因子）が、Ｓｃｈｒａｄｅｒ、Ｊ．Ｗ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：２９５；１９９１）で検討されている。そのような因子には、インターロイキン１、２、４、５、６、７、１０、１２及び１５；顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン−３及び顆粒球−マイクロファージ・コロニー刺激因子を含む融合タンパク質、インターフェロン−γ、ＴＮＦ、ＴＮＦ−β、ｆｌｔ−３リガンド及びそれらの生物的に活性な誘導体（単独又は組み合わせたもの）などがある。特に好適なサイトカインはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。本明細書に記載されているように、その他のサイトカインも有用である。このようなサイトカインをコードするＤＮＡも、例えば、樹状細胞をそのサイトカインを発現するよう形質移入することにより、本発明の方法において有用である。これらの免疫調節分子の投与は、本発明に係る細胞と同時、別途、又は連続して投与することを含む。
別の好適な態様において、本発明は、配列番号１〜１９のいずれか一つに、少なくとも約１０％、より好ましくは２５％、更に好ましくは、約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９．９％の配列相同性を有する、配列番号１〜１９のいずれか一つにより同定されるポリペプチドを提供する。樹状細胞は、生体外培養の間に、これらのポリペプチドのいずれかでパルスすることができる。
本発明の一つの態様において、ポリペプチドは、配列番号１９を含む。好ましくは、ポリペプチドは、高い親和力をもってＨＬＡ分子に結合し、ＨＬＡに対して、天然のポリペプチドよりも高い結合定数（Ｋａ）及び／又はＨＬＡに対して天然のポリペプチドよりも低い解離定数（Ｋｄ）を有する。
本発明の別の態様において、ポリペプチドはムチン腫瘍抗原に由来し、好ましくは、ポリペプチドは、ＭＵＣ−１の非可変縦列反復領域数に由来する。
本発明の別の態様において、ポリペプチドの抗原提示細胞による抗原提示は、免疫応答、好ましくは細胞性免疫応答を誘導する。例えば、細胞性免疫応答は、細胞傷害性Ｔ細胞応答、Ｔヘルパー細胞応答又はＢ細胞免疫応答である。
さらに別の態様において、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチドをコードする核酸分子の変異体を用いて、例えば、ＭＵＣ−１陽性癌を検出して溶解するために、免疫細胞に形質移入することができる。「対立遺伝子」又は「変異体」は、ある遺伝子の別の形態である。本発明において特に有用なのは、本発明に係る方法の何れかに示すＭＵＣ−１＋腫瘍細胞マーカーの可能性があるものをコードする遺伝子の変異体である。変異体は、核酸配列における一つ又はそれ以上の突然変異によって得られ、その構造又は機能が変化することもしないこともある別のｍＲＮＡ又はポリペプチドになりうる。任意の天然型又は組換え型の遺伝子は、０、１、又は多くの対立遺伝子型をもつことができる。変異体を生じさせる共通した突然変異による変化は、通常、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、又は置換による。これらの変異のタイプは、それぞれ、単独又は他の変化とともに、所定の配列において一回又はそれ以上起きることがある。
本発明に係る組成物及び方法は、上記ポリペプチド及びそれらのポリペプチドをコードする核酸配列の変異体も含む。本明細書において、ポリペプチドの「変異体」は、ポリペプチドの抗原及び／又は免疫原としての性質を保持するような置換及び／又は変更があるために天然のポリペプチドとは異なるポリペプチドである。このような変異体は、通常、上記ポリペプチド配列の一つを改変し、改変されたポリペプチドの反応性を、上記したような抗血清及び／又はＴ細胞によって評価することによって同定することができる。核酸の変異体は、コードされているポリペプチドの抗原及び／又は免疫原としての性質を保持するような、一つ又はそれ以上の置換、欠失、挿入及び／又は変更を含む。本明細書に記載されたポリペプチドの好適な変異体の一つは、ヌクレオチドの２０％を超えない位置でのヌクレオチドの置換、欠失、挿入及び／又は変更を含む変異体である。
好ましくは、変異体は保存的置換を含むが、それに限定されるものではない。「保存的置換」とは、アミノ酸が、同様の性質をもつ別のアミノ酸に置換されるものであるため、ペプチド化学の技術分野における当業者は、ポリペプチドの二次構造及び疎水性親水性指標となる性質が実質的には変化しないと予想するであろう。一般的に、以下のアミノ酸グループが、保存的変化を示す。（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｔ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；及び（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。しかし、あらゆるタイプの置換が、本発明の範囲及び態様に含まれる。
また（又は、あるいは）、変異体は、例えば、ポリペプチドの免疫原又は抗原としての性質、二次構造及び疎水性親水性指標としての性質に最小の影響しか与えない欠失又は付加によって改変することができる。例えば、ポリペプチドを、翻訳と同時に又は翻訳後にタンパク質の移動を指令するシグナル（又はリーダー）配列にたんぱく質のＮ末端で結合させることができる。また、ポリペプチドの合成、精製又は同定を容易にするために（例えばポリ−Ｈｉｓ）、又は、ポリペプチドが固形支持体に結合するのを促進するためにリンカー又はそれ以外の配列にポリペプチドを結合させることもできる。例えば、ポリペプチドを、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合させることができる。
一般的に、いくつかの技術の任意のものを用いて、本明細書に記載されたポリペプチドの全部又は一部をコードするヌクレオチド配列を調製することができる。例えば、そのようなポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子は、対応するｍＲＮＡのＭＵＣ−１腫瘍特異的発現に基づき、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲを用いてクローニングすることができる。この技術は、正常な組織及びＭＵＣ−１陽性腫瘍組織から調製したＲＮＡ鋳型の増幅産物を比較する。例えば、（ｄＴ）１２ ＡＧプライマーなどのランダムプライマーを用いて、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを調製することができる。ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅した後、腫瘍ＲＮＡに特異的な増幅産物に対応するバンドを、銀染色したゲルから切り出して、下記の実施例に記載されている適当なベクターにサブクローニングすることができる。配列番号１〜６のいずれか一つによって開示されているＭＵＣ−１腫瘍特異的ポリペプチド及びその変異体の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列を、任意のランダムプライマーを用いて上記したようにして調製したｃＤＮＡから増幅することができる。
あるいは、本明細書に記載されたポリペプチド（又は、その一部）をコードする遺伝子を、ヒトゲノムＤＮＡ、又は腫瘍細胞ｃＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる。
本発明の態様において、一つ又はそれ以上の核酸分子の存在は、正常な被検者の試料と関連づけられる。試料は、好ましくは、増殖性細胞成長障害、特にＭＵＣ−１＋癌を有すると推測される哺乳動物から得られる。
２つの配列（核酸又はポリヌクレオチド）の間の相同性及び類似性の割合は、数学的アルゴリズムを用いて決定することができる（例えば、コンピュータ分子生物学，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州，１９８８；バイオコンピューティング：インフォマティックス及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ），Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州，１９９３；配列データのコンピュータ解析、第１部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ１），Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー州，１９９４；分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及び、配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ），Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州，１９９１参照）。
別の好適な態様において、本発明に係るＭＵＣ−１のペプチド断片及び誘導体は、それらが免疫系を活性化して、例えば、ＭＵＣ−１を発現する細胞など、癌細胞を溶解するのに十分な長さのものである。したがって、配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチドをコードするＭＵＣ−１核酸分子、断片及び誘導体は、配列番号１〜１９のいずれか一つの何れかに示す配列と比較して約９０％以上のヌクレオチド、普通には、配列番号１〜１９の何れかに示す配列と比較して約８０％以上のヌクレオチド、より普通には、配列番号１〜１９の何れかに示す配列と比較して約７０％以上のヌクレオチド、さらにより一般的には、約４０％又は５０％のヌクレオチドを好適に含む。
２つの核酸配列の相同性の割合を決定するためには、最適な比較を行う目的で配列を整列させる（例えば、最適なアラインメントを行うために、第１及び第２のアミノ酸配列又は核酸配列の一方若しくは両方にギャップを導入し、また、比較目的で非相同的配列を無視することができる）。好適な態様において、比較目的で整列される参照用配列の長さは、参照用配列の長さの３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、そしてさらにより以上、好ましくは７０％、８０％又は９０％以上である。そして、対応するヌクレオチド位置にあるヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているときは、その位置で分子は同一である（本明細書において、核酸の「相同性」は、核酸の「配列相同性」と同義である）。２つの配列間における相同性の割合は、２つの配列を最適に整列させるために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した上で、それらの配列に共通する同一の位置数の関数である。
配列の比較及び２つの配列間の相同性の割合の決定は、数学的アルゴリムを用いて行うことができる。好適な態様において、２つのヌクレオチド配列の相同性の割合は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ ＣＭＰマトリックス及び４０、５０、６０、７０又は８０というギャップの重み及び１、２、３、４、５又は６という配列長の重みを用い、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐを通してオンラインで入手することができる）を用いて決定される。ＧＡＰプログラムとともに使用されるパラメータの好適で非限定的な例は、ギャップペナルティーが１２、ギャップ伸長ペナルティーが４、そして、フレームシフトのギャップペナルティーが５のＢｌｏｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスなどである。
別の態様において、ＰＡＭ１２０重み付けされた残基表を用い、ギャップ長ペナルティーを１２、ギャップペナルティーを４として、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０又はバージョン２．０Ｕ）に組み込まれているメイヤーズとミラー（Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８））を用いて、２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の相同性の割合を決定する。
腫瘍性疾患又は腫瘍細胞の治療は、本明細書全体にわたって、また、下記の実施例において記載されており、以下（１）から（８）の効果を一つ又はそれ以上生じさせることができる一定量のベクター及び／又はペプチドを意味する。（１）ある程度の腫瘍増殖の阻害であって、（ｉ）減速及び（ｉｉ）完全な増殖停止を含む；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍サイズの維持；（４）腫瘍サイズの減少；（５）末梢器官への腫瘍細胞の浸潤の（ｉ）減少、（ｉｉ）減速、又は（ｉｉｉ）完全な阻止を含む阻害；（６）転移の（ｉ）減少、（ｉｉ）減速、又は（ｉｉｉ）完全な阻止を含む阻害；（７）（ｉ）腫瘍サイズの維持、（ｉｉ）腫瘍サイズの減少、（ｉｉｉ）腫瘍増殖の減速（ｉｖ）浸潤の減少、減速、もしくは阻止、又は（ｖ）転移の減少、減速、もしくは阻止し得る抗腫瘍免疫応答の増強；及び／又は、（８）疾患に伴う症状の一つ又はそれ以上をある程度緩和すること。
このように、本発明の一つの態様において、癌に罹っている患者の治療、又は癌に罹患する恐れのある患者に対して予防的に治療するために、任意の変異体、断片、突然変異体を用いて、例えば樹状細胞などの免疫細胞に形質導入することができる。上記のとおり、本発明において同定された核酸配列の好適な使用は、例えば、ＭＵＣ−１癌細胞を溶解する治療法を創出するためのものである。核酸分子は、遺伝子の野生型、対立遺伝子、変異体、突然変異、又は断片をコードするＤＮＡ分節を含むベクターによって発現されうる。核酸分子の突然変異及び対立遺伝子は、治療用ベクターの構築にも好適に使用される。例えばＭＵＣ−１陽性癌に対する抵抗性を付与するために望ましい核酸配列を含むベクターは、好ましくは、その配列を一つ又はそれ以上有する。あるいは、ベクターは、一つ又はそれ以上のその核酸配列、又は対立遺伝子変異体との組み合わせからなってもよい。ベクターは、さまざまな対立遺伝子変異体のカセット、又は野生型核酸分子からなるものでもよい。
本発明によれば、従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術を、当業者であれば適宜用いることができる。このような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州（以下「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；「ＤＮＡクローニング：実用的方法（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」第Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，（１９８５）］；転写と翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編，１９８４）］；動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，（１９８６）］；固定細胞及び酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，分子クローニングへの実用的手引き（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）などを参照。
遺伝子又はその断片若しくは対立遺伝子の患者への導入は、ベクター、リポソーム、裸のＤＮＡ、アジュバントに補助されたＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどの使用を含みうる。ベクターは、国際公開第９３／０４７０１号に記載されているような化学的抱合体であって、標的部分（例えば、細胞表面レセプターに対するリガンド）及び核酸結合部分（例えばポリリジン）を有するもの、ウイルスベクター（例えばＤＮＡ又はＲＮＡのウイルスベクター）、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（国際公開第９５／２２６１８号）に記載されているような融合タンパク質であって、標的部分（標的細胞に特異的な抗体）及び核酸結合部分（例えばプロタミン）を含むもの、プラスミド、ファージなどである。ベクターは、染色体性、非染色体性又は合成ベクターであってよい。
別の好適な態様において、細胞は、試料、患者又はドナー患者から単離して精製され、細胞の任意の特性を測定するために機能アッセイにおいて用いられる。単離及び精製された細胞集団に応じて、当該技術分野公知である適切な機能アッセイを行なうことができる。例えば、細胞の集団が、腫瘍抗原のような望ましい抗原に特異的なＴ細胞である場合、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ、サイトカインプロフィール、Ｔ細胞成熟又は記憶Ｔ細胞に対する表面抗原の決定などを行うことができる。
本発明において有用な細胞単離は当該技術分野に於いて周知である。例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を患者から採取して、例えばフィコール・ハイパーク法（Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ）などの密度勾配遠心分離法によって単離することができる。標準的方法を用いて、特定の細胞集団を除去又は濃縮することができる。例えば、プラスチックに付着させて、単核細胞／マクロファージを単離することができる。例えば、Ｔ細胞又はＢ細胞の表面マーカーに対する抗体を用いて、陽性選択及び／又は陰性選択することによって、例えば、細胞を特異的一次モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とともにインキュベートし、次いで一次ｍＡｂに結合する二次抗体で被覆した磁気ビーズを用いて、ｍＡｂを結合する細胞を単離することによって、Ｔ細胞又はＢ細胞を濃縮又は除去することができる。幹細胞特異的ｍＡｂ（例えば、抗ＣＤ３４ｍＡｂ）を用いる同様の技術により、末梢血又は骨髄由来の造血幹細胞を単離することができる。標準的方法に従って蛍光活性化細胞選別法により、特定の細胞集団を単離することもできる。細胞特異的表面マーカーに対するモノクローナル抗体が当該技術分野公知であり、多くが市販されている。
所望であれば、最初に「比較的に粗い」分離法を用いることにより、最終分化細胞の大部分を除去することができる。例えば、磁気ビーズ分離法を用いて、多数の細胞系列が決定ずみの細胞を最初に除去することができる。望ましくは、全造血細胞の約８０％以上、通常は７０％以上を除去することができる。
分離の方法には、抗体で被覆した磁気ビーズを用いる磁気分離法；アフィニティークロマトグラフィー；モノクローナル抗体と結合しているか、又はモノクローナル抗体とともに用いる、補体及び細胞毒などを含む（これらに限定されない）細胞傷害性因子；そして、例えば、プレートなどの固形基質に付着した抗体による「パニング」、エルトリエーション、又はその他便利な技術などがありうるが、これらに限定されるものではない。
スクリーニングの手順には、分子をスクリーニングしてＭＵＣ−１腫瘍抗原に対する免疫応答を生じさせる方法が含まれうる。この方法は、
ＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲの一部をコードする核酸を改変するこ と、
改変した核酸を発現させて分子を産生させること、
樹状細胞を当該分子に接触させること、そして
Ｔ細胞を樹状細胞に接触させることとを含み、
Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の変調が、当該分子が免疫応答を生じさせる可能性があることを示す。
正確な分離を可能にする技術には、例えば、複数の色チャンネル、低角度及び鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなど、様々な程度の精巧さを有しうるフローサイトメトリーが含まれるが、これに限定されるものではない。
本明細書において開示されるペプチドは、本明細書中に列挙された対応配列によってコードすることができるが、以下の縮重コドンによりコードすることもできる。
Figure 2007523633
本発明は、好適な態様に言及して詳細に説明されている。しかし、当然のことながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲内で改変及び改良を加えることができる。以下の非制限的な実施例は、本発明の例示である。
（実施例）
実験材料及び方法
細胞培養物
ヒト乳房腺癌細胞株ＭＣＦ−７（ＨＬＡ−Ａ２陽性及びＭＵＣ−１陽性）及びＳＫ−Ｍｅｌ−２４（ＨＬＡ−Ａ２陽性及びＭＵＣ−１陰性）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，バージニア州）から購入した。培養物は、マイコプラズマを含んでおらず、完全培地［１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）］の中で維持した。Ｃ１Ｒ細胞株は、内在性のＨＬＡ−Ａ又はＨＬＡ−Ｂ抗原を発現しないヒト血漿白血病細胞株である。Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞は、形質移入されたゲノムクローンであるＨＬＡ−Ａ２．１を発現するＣ１Ｒ細胞である。これらの細胞は、Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｂｉｄｄｉｓｏｎ（国立神経疾患・脳卒中研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ）、ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，メリーランド州）から入手した。１７４ＣＥＭ−Ｔ２細胞株（Ｔ２）の輸送欠失変異体は、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ（エール大学医学部（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，コネチカット州）から提供された。Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞及びＴ２細胞はマイコプラズマを含まず、それぞれ、ＲＰＭＩ１６４０完全培地及びイスコフ改変ダルベッコ完全培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の中で維持した。
ペプチド
ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの共通モチーフとの一致について、ＭＵＣ−１のアミノ酸配列を調べた。Ｐａｒｋｅｒ Ｋ．Ｃ．ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：１６３−１７５，１９９４）によって開発された、ＮＩＨのバイオインフォマティクス及び分子解析部門（ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＩＨ（ＢＩＭＡＳ））のコンピューターアルゴリズムを用いたが、これは、ペプチド／ＭＨＣ複合体の予測された解離半減期に従って、ＭＨＣ結合ペプチドの可能性があるものをランク付けする。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子が最も普通に発現するクラスＩ対立遺伝子であるため、それを選択した。非ＶＮＴＲ由来の１０量体のペプチドが各共通モチーフに一致している場合には、それらを合成した。１０量体のＭＵＣ−１ペプチドのパネル（表１）及びＰ−９２ＭＵＣ−１ペプチドのＰ１からＰ１０の位置に一アミノ酸置換を有する類似体（図１参照）は純度＞９０％で、アメリカン・ペプチド・カンパニー社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，カリフォルニア州））によって製造された。また、純度＞９６％のＣＥＡペプチドであるＣＡＰ１−６Ｄ（２８）は、アメリカン・ペプチド・カンパニー社（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，カリフォルニア州）によって製造された。
フローサイトメトリー解析
（ｉ） 単色フローサイトメトリー解析
単色フローサイトメトリー解析法は、既述されている（Ｇａｕｄａｇｎｉ Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．：５０：６２４８−６２５５，１９９０）。簡単に言えば、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まない冷たいＤＰＢＳで細胞を３回洗浄してから、ＨＬＡ−Ａ２（Ａ２，２８，Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ，Ｉｎｃ．，Ｃａｎｏｇａ Ｐａｒｋ，カリフォルニア州）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ５６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）に対するｍＡｂを１μｇ用いて、４℃で１時間染色した。ミネラルオイル形質細胞腫１０４Ｅ（Ｃａｐｐｅｌ／Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ペンシルバニア州）をアイソタイプ対照として用いた。次いで、細胞を３回洗浄して、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）の１：１００の希釈液を用いてインキュベートした。４８８ｎｍで１５ｎＷの励起を有するブルーレーザーを備えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを用いて、細胞を直ちに解析した。１０，０００個の生細胞からデータを収集し、保存して、結果を生成するために使用した。
（ｉｉ） ２色フローサイトメトリー解析
２色フローサイトメトリー解析の手順は、以下の例外を除いては、単色フローサイトメトリー解析と同様であった。抗ＭＨＣクラスＩＩ ＦＩＴＣ／抗ＣＤ１１ｃ ＰＥ、抗ＭＨＣクラスＩＩ ＦＩＴＣ／抗ＣＤ８０ ＰＥ、抗ＣＤ５８ ＦＩＴＣ／抗ＣＤ５４ ＰＥ、抗ＭＨＣクラスＩ ＦＩＴＣ／抗ＭＨＣクラスＩＩ ＰＥ及び抗ＩｇＧ１ ＦＩＴＣ／抗ＩｇＧ２ａ ＰＥ（アイソタイプ対照）を用いて樹状細胞を解析し、＞９６％の樹状細胞がＣＤ１１ｃ及びＭＨＣクラスＩＩ陽性であった。
Ｔ細胞株の解析に用いた抗体は、抗ＣＤ５６ ＦＩＴＣ／抗ＣＤ８ ＰＥ、抗ＣＤ４ ＦＩＴＣ／抗ＣＤ８ ＰＥ及び抗ＣＤ４５Ｒ０ ＦＩＴＣ／抗ＣＤ４９ｄ ＰＥであり、Ｔ−１１９１−Ｐ９２細胞及びＴ−１１９１Ｐ−９３Ｌ細胞の＞９８％がＣＤ８陽性であった。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ５８及びＣＤ１１ｃに対する抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩに対する抗体は、英国オクスフォードにあるＳｅｒｏｔｅｃ社から購入した。１時間同時に染色を行ってから、細胞を３回洗浄して、上記のように再懸濁し、４８８ｎｍで１５ｍＷの励起を有するブルーレーザーを備えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを用い、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔプログラムを用いて直ちに解析した。
陽性細胞の％及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）で結果を示した。ＭＦＩを用いて、ゲート設定蛍光ドットプロットにおける全細胞の平均を測定して決定された蛍光レベルを表した。ＦＡＣＳＣＡＮ上で対数目盛りにしてＭＦＩ値を集めた。
ＨＬＡ−Ａ２へのペプチド結合
Ｐ−９２及びＰ−９２類似体のＨＬＡ−Ａ２分子への結合を、フローサイトメトリーにより示される、Ｔ２Ａ２細胞への結合によって評価した。本アッセイにおいて、ペプチド結合の結果、Ｔ２細胞の表面上にあるＨＬＡ−Ａ２分子の安定性が増大（蓄積）することを、ＨＬＡ−Ａ２分子に対する抗体結合の増加により測定する。要約すれば、無血清イスコフ改変ダルベッコ完全培地中１×１０６個の細胞を、濃度５０μｇ／ｍｌのペプチドとともに、５％ＣＯ２中、２４ウェル培養プレート内において、３７℃でインキュベートした。Ｔ２細胞及び単色解析法を用いて、ペプチド結合についてフローサイトメトリーを行った。上記したように、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄した後、細胞１０６個につきＨＬＡ−Ａ２特異的なＭＡｂ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ，Ｉｎｃ．）の１：１００希釈液を用いて１時間インキュベートした。アイソタイプ対照としてＵＰＣ−１０（Ｃａｐｐｅｌ／Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）を用いた。次いで、細胞を３回洗浄して、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１：１００希釈液を用いてインキュベートした。上記したように、ＦＡＣＳｃａｎで解析を行った。細胞の調製及び染色の全過程で、細胞を氷上に置いた。
ＰＢＭＣに由来するＤＣの培養
ヘパリン処理した血液から、ＨＬＡ−Ａ２の正常なドナーであるＰＢＭＣを採取した。既述されているように（Ｂｏｙｕｍ，Ａ．Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７（Ｓｕｐｐｌ）：５１−７６，１９６８）、リンパ球分離用媒体勾配（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，ノースカロライナ州）を用いて、ＰＢＭＣを分離した。Ｓａｌｌｕｓｔｏら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１１０９−１１１８，１９９４）に記載されている手順の変法を用いてＤＣを調製した。グルタミン２ｍＭ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ及びゲンタマイシン１０μｇ／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含むＡＩＭ−Ｖ培地にＰＢＭＣ（１．５×１０８）を再懸濁して、Ｔ−１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサチューセツ州）に付着させた。３７℃で２時間置いた後、非付着細胞を静かに洗い流した。付着細胞は、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）及び２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）を含むＡＩＭ−Ｖ培地の中で６〜７日間培養した。３日ごとに培養培地を補充した。
組換えウイルス及びＭＵＣ−１を含むアビポックスウイルスによるＤＣへの感染（ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭ）
Ｊｅｎｋｉｎｓ Ｓ．ら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，７：９９１−９９８，１９９１に記載された通りに、組換え鶏痘ウイルスを作成した。この組換えウイルスの母体ウイルスとして、鶏痘ウイルスのＰＯＸＶＡＣ−ＴＣワクチン株からプラーク精製した単離株を用いた。ＭＵＣ−１、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１及びＢ７−１の配列を、鶏痘ウイルスゲノムのＢａｍＨＩ、Ｊ領域に挿入した。さらに、鶏痘Ｃ１プロモーターの制御下にｌａｃＺ遺伝子を含ませて，β−ガラクトシダーゼの発色アッセイ法を用いて、組換えウイルスを同定して単離した。鶏痘ウイルスに挿入したＭＵＣ−１遺伝子は、天然のＭＵＣ−１遺伝子から変異している。それは、３０アミノ酸のシグナル配列、続いてＭＵＣ−１タンパク質の成熟型Ｎ末端配列の最初の３８アミノ酸、２０アミノ酸反復配列の１０の同一コピー及びこのタンパク質のＣ末端部分をコードする。各反復配列中に、コードされたアミノ酸を変更しない多数の第３塩基変異を有するコドンを含む重複合成ヌクレオチドを用いて、６００ ｂｐの反復配列を作成した。これは、反復アミノ酸配列を維持する際に、ポックス・ウイルスで不安定な重複ヌクレオチド配列を最小限に抑えるために行われた。
ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭは、４０Ｋプロモーターの制御下にあるＭＵＣ−１遺伝子、ワクシニア３０Ｋプロモーターの制御下にあるヒトＬＦＡ−３遺伝子、ワクシニアＩ３プロモーターの制御下にあるヒトＩＣＡＭ−１遺伝子及び合成した初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターの制御下にあるヒトＢ７−１遺伝子を含む組換え鶏痘ウイルスである。樹状細胞（ＤＣ）（１×１０６）を、１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で、ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭ又は対照用アビポックスウイルスベクター（ＦＰ−ＷＴ）とともに３７℃でインキュベートした。滴定実験により、２時間４０：１のＭＯＩに等しい４×１０７のプラーク形成単位／ｍｌで、約７５％の感染ＤＣにおいて導入遺伝子の発現を誘導できることが実証された。
感染したＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−４及び２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを含む１０ｍｌの新鮮で温かいＲＰＭＩ−１６４０完全培地中に懸濁し、２４時間培養してから、ＡＰＣとして用いた。
Ｔ細胞株の作成
Ｔｓａｎｇ Ｋ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８７：９８２−９９０，１９９５に記載されたプロトコルの変法を用いて、ＭＵＣ−１特異的ＣＴＬを作成した。Ｔ細胞株Ｔ−１１９１−Ｐ−９３Ｌ及びＴ−１１９１−Ｐ−９２を作成するために、ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭに感染させた自己樹状細胞をＡＰＣとして用いた。次いで、１０：１のエフェクター対ＡＰＣの比にして、自己の非接着性細胞をＡＰＣに添加した。そして、ＣＯ２を５％含有する加湿した雰囲気中、３７℃で３日間、培養物をインキュベートした。次いで、７日間、濃度２０単位／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を培養物に添加し、ＩＬ−２含有培地を３日毎に補充した。ペプチドとともに３日間インキュベートすることと、７日間のＩＬ−２補充とが、１回のＩＶＳサイクルを構成した。１１日目に、ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭに感染させた自己ＤＣによって、上記したように一次培養物を再刺激して、次のＩＶＳサイクルを開始させた。ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭに感染した自己ＤＣを、３回のＩＶＳサイクルでＡＰＣとして用いた。３回目のＩＶＳサイクルの後、（２３，０００ラド）照射した自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞をＡＰＣとして用いた。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞で再刺激するには、濃度５０ｍｇ／ｍｌのペプチドを用いて、エフェクター対ＡＰＣの比１：３で再刺激のために自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞をパルスした。次いで、ＣＯ２を５％含んだ加湿雰囲気中、３７℃で３日間培養物をインキュベートした。ペプチドを含んだ培地を除去してから、濃度２０単位／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を培養液に数日間添加した。上記と同一の刺激プロトコルを用いて、Ｐ−９２ペプチド又はＰ９３Ｌペプチドでパルスされた自己ＤＣによってＰＢＭＣを刺激することにより、患者１８及び２３からＴ細胞株を（Ｔ−１８−Ｐ−９２、Ｔ−１８−Ｐ９３Ｌ、Ｔ−２３−Ｐ−９２及びＴ−２３−Ｐ９３Ｌ）作成した。ＤＣの解析及び同定に用いたマーカーは、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ−クラスＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ５４、ＣＤ５８及びＣＤ８３であった。ＣＤ３も陰性マーカーとして用いた。
細胞傷害性アッセイ
標的細胞（Ｃ１Ｒ−Ａ２又は腫瘍細胞）を、５０μＣｉの１１１インジウム標識したオキシキノリン（Ｍｅｄｉ−Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，イリノイ州）を用いて室温で１５分間標識した。１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０完全培地中の標的細胞（０．３×１０４個）を、平底測定プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ）の９６ウェルのそれぞれに添加した。標識したＣ１Ｒ−Ａ２標的細胞を、エフェクター細胞を添加する前に、５％のＣＯ２中において３７℃で６０分間、表示した濃度のペプチドとともにインキュベートした。標的として癌腫細胞を用いる場合には、ペプチドを用いなかった。エフェクター細胞を、１０％のプールされたヒトＡＢ型血清を添加したＲＰＭＩ１６４０完全培地１００μｌに懸濁して、標的細胞に添加した。そして、プレートを、３７℃で４時間又は１６時間、５％のＣＯ２中においてインキュベートした。採取器（ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ｆｒａｍｅｓ：Ｓｋａｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，バージニア州）を用いて上清を回収して、ガンマ線計数を行った。測定は３回反復して行ない、標準偏差を計算した。以下の公式を用いて特異的溶解を計算した（値はすべてｃｐｍ）。
％溶解＝観察された放出量−自発的放出量×１００
全放出量−自発的放出量
自発的放出量は、１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０完全培地を添加したウェルから測定した。放出可能な全放射活性量は、２．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で標的を処理して得られた。
サイトカインの検出
さまざまなペプチド濃度でＩＬ−２を含まない培地中において、ペプチドをパルスされた自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞に２４時間曝露されたＴ細胞の上清を、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ミネソタ州）を用いて、ＩＮＦ−γの分泌についてスクリーニングした。結果をｐｇ／ｍｌで表示した。ＣＢＡ装置（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州）を用いて、特異Ｔ細胞による複数のサイトカインの分泌も測定した。ＣＢＡ装置は、フローサイトメトリーによる蛍光検出を利用して、粒子による免疫アッセイ法において可溶性検体を測定する。ＢＤのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインＣＢＡキットを用いて、単一サンプル中のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−ａタンパク質のレベルを測定した。サイトカイン捕捉用ビーズを、ＰＥ結合検出抗体と混合してから、組換えサイトカイン標準、又は試験試料とともにインキュベートして、サンドウィッチ複合体を形成させた。ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ ＣＢＡ解析ソフトウェアを用いて、グラフィック及び表形式で、サンプルの結果を作成した。結果はｐｇ／ｍｌで表示した。
統計的解析
両側ペアｔ検定（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，カリフォルニア州）を用いて、平均値間の差を統計的に解析した。
毒性類別−ＮＣＩ共通毒性基準
＊等級Ｉ〜ＩＩの毒性が生じた場合、被検者は注入計画を続行することができる。
＊等級ＩＩＩの毒性が生じた場合、毒性が等級Ｉ〜ＩＩに低下するまで「薬剤」を留保し、その後注入を再開する。再開後、等級ＩＩＩ又はＩＶの毒性が生じた場合、「薬剤］の注入を停止する。
＊等級ＩＶの毒性が生じた場合、被検者に等級ＩＶの毒性が生じていることを記録し、次回注入をそれ以前の用量に減少させる。以前の用量で等級ＩＶの毒性が生じた場合、「薬剤」を停止する。
＊特定の投薬量で３人の被検者のうち１人に等級ＩＶの毒性が生じた場合、さらに３人の被検者をその細胞用量レベルで参加させ、その用量レベルで、全部で６人の被検者としなければならない。ある細胞用量レベルで６被検者のうち２人が等級ＩＶの毒性を示した場合、この用量はＭＴＤと定義される。次の３被検者に前回細胞投与量の６６％（３分の２）を投与する。用量増大を評価するため、各被検者に、６回の注入のうち少なくとも４回は、同じ用量レベルで投与しなければならない。
新規ＭＵＣ−１結合モチーフ
ヒトＭＵＣ−１の一次アミノ酸配列を、新規ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの共通モチーフについて解析した。１２個の１０量体ペプチドを同定し、その結果合成して、Ｔ２細胞結合アッセイにおいてＨＬＡ−Ａ２分子との結合を調べた。アミノ酸配列及びこれらの１０量体ペプチドの位置を表１に示す。ＣＥＡ ＣＡＰ１−６Ｄペプチド及びＮＣＡペプチドを、それぞれ陽性対照及び陰性対照として用いた。１２個のペプチドの予測される結合も表１に示す。これらのペプチドのうち３つ（Ｐ−９２、Ｐ−９４及びＰ−１１０８）が、Ｔ２アッセイにおいて最高レベルの結合を有することを示した。
Figure 2007523633
ＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株の樹立
次いで、外見上健常なドナーのＰＢＭＣからＭＣＵ−１特異的Ｔ細胞株を樹立することができるかを決定するために実験を行った。これを行うために、ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭに感染した自己ＤＣをＡＰＣとして用いた。ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭは、ＭＵＣ−１及び三連構造ヒト共刺激分子（ＴＲＩＣＯＭと命名された、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３）に相当する導入遺伝子を含む複製欠損アビポックスベクターである。ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭは、ヒトＤＣに効率的に感染して、ＭＵＣ−１同様、各共刺激分子をＤＣ表面上に過剰発現させることが示された（表２）。細胞の約９６％がＣＤ１１ｃ及びＭＨＣ−クラスＩＩ陽性であった。
Figure 2007523633
作成されたＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞（Ｔ−１１９１−ＭＵＣ−１と命名）の特異性を、ＩＶＳを３回行った（実験材料及び方法参照）後に解析して、それらが、表１に記載した各ＭＵＣ−１ペプチドでパルスされた自己Ｂ細胞で刺激した後に、ＩＦＮ−γを放出できるかを調べた。表３に示した結果は、Ｔ−１１９１−ＭＵＣ−１細胞を、ペプチドであるＰ−９２、Ｐ−１１３５、Ｐ−９４、Ｐ−１００４、Ｐ−１０６９及びＰ−４でパルスされた自己Ｂ細胞で刺激すると、Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γを産生したが、他のペプチドでパルスされた自己Ｂ細胞を用いた場合には、ＩＦＮ−γを産生しなかったことを実証している。表１及び３に示した結果は、Ｐ−９２ペプチドが、最高レベルのＴ２結合を行うとともに、Ｔ−１１９１−ＭＵＣ−１細胞を活性化して、最高レベルのＩＦＮ−γを産生させることができることを実証している。したがって、さらなる試験のためにこのペプチドを選択した。
Figure 2007523633
ペプチド解析
Ｐ−９２の２位及び１０位における一次及び二次のＨＬＡ−Ａ２アンカーアミノ酸残基の解析により、これらの位置におけるアミノ酸の改変が、ペプチドのＨＬＡ−Ａ２分子への結合能力を強化しうることが明らかになった。従って、表４に示すように、Ｐ−９２の６つの異なる類似体を合成し、天然のＰ−９２ペプチドとともに、Ｔ２細胞への結合能力について試験を行った。ＣＥＡのＣＡＰ−７（ＨＬＡ−Ａ３結合ペプチド）は、ＨＬＡ−Ａ２に結合しないことが既に示されているので、陰性対照として用いた。表４に示したように、６つの類似体ペプチドのうち４つが、Ｐ−９２ペプチドよりも高レベルでＨＬＡ−Ａ２に結合した。類似体Ｐ−９３Ｌ及びＰ−９３Ｉは、もっとも効率的にＨＬＡ−Ａ２に結合した。
Figure 2007523633
次いで、実験を行って、さまざまなペプチド濃度でＰ−９３Ｌ及びＰ−９３ＩがＨＬＡ−Ａ２に結合する能力を比較した。図１から明らかなように、Ｐ−９３Ｌ及びＰ−９３Ｉペプチドは、すべてのペプチド濃度においてＰ−９２よりも高いレベルでＨＬＡ−Ａ２に結合した。結合レベルは、さまざまなペプチド濃度でＰ−９３Ｌ及びＰ−９３Ｉについて同様であった。したがって、これらのデータは、一次アンカー位置２（ＭＵＣ−１分子の９３位）が変更されているＰ−９３Ｌ及びＰ−９３Ｉが、ともにペプチドＰ−９２の強力なアゴニストであることを示していた。
ペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性
ペプチドＰ−９２（天然型）、Ｐ−９３Ｌ及びＰ−９３Ｉに関するペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性を調べた。ペプチドをＴ２細胞とともに一晩インキュベートし、未結合ペプチドを洗い落としてから、ブレフェルジン−Ａとともにインキュベートして、新しいクラスＩ分子が細胞表面に送達されるのをブロックした。さまざまな時点で、ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体の存在について細胞を解析した。図２に示したように、Ｐ−９３Ｌ−ＨＬＡ−Ａ２複合体及びＰ−９３Ｉ−ＨＬＡ−Ａ２複合体は、８時間にわたる観察時間に於いて、Ｐ−９２−ＨＬＡ−Ａ２複合体よりも安定していたが、Ｐ−９３Ｌ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の方が、同じ時間に於いて、Ｐ−９３Ｉ−ＨＬＡ−Ａ２複合体よりわずかに安定していた。従って、Ｐ−９３Ｌ及びＰ−９３Ｉの方が、天然のＰ−９２ペプチドより、ペプチドのＭＨＣへの結合性及びペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性ともに勝っていることが示された。
Ｐ−９３Ｌ及びＰ−９３ＩのアゴニストペプチドがＴ−１１９１−ＭＵＣ−１細胞を活性化させる能力を、さまざまなペプチド濃度で比較した。図３から明らかなように、各ペプチド濃度において、ＡＰＣをＰ−９３Ｌペプチドでパルスしたとき、Ｐ−９３Ｉペプチド又は天然のＰ−９２ペプチドと比較して、Ｔ−１１９１−ＭＵＣ−１細胞による最大レベルのＩＮＦ−γ産生がもたらされた。したがって、さらなる試験のためにＰ−９３Ｌアゴニストペプチドを選択した。次に、Ｐ−９２ペプチド又はＰ−９３ＬペプチドでパルスされたＡＰＣで刺激されたＴ−１１９１−ＭＵＣ−１細胞のサイトカインプロフィールを解析した。解析にはＣＢＡアッセイ法を用いた。表５は、ペプチドなし、Ｐ−９２ペプチド及びＰ−９３Ｌペプチド、でパルスされたＡＰＣにより刺激されたＴ−１１９１−ＭＵＣ−１細胞株によって産生された６つのサイトカインのそれぞれのレベルを示す。これらの結果は、Ｐ−９２ペプチドで刺激されるよりも、Ｐ−９３Ｌペプチドで刺激された方が、Ｔ細胞によるＩ型サイトカインＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇの産生が増大することを実証した。低レベル又は検出不能なレベルの２型サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１０が、どちらのペプチドでも見られた。２４時間の時点では、上清中にはＴＮＦ−ａを検出できなかった。
Figure 2007523633
天然のＰ−９２ペプチド及びアゴニストＰ−９３Ｌペプチドの生物学的活性をさらに比較するために、さらに２つのＴ細胞株を樹立した。これは、ＡＰＣとしてｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭに感染した自己ＤＣ及びエフェクターとして外見上健常なドナー由来の自己ＰＢＭＣを用いて行なった。３回のＩＶＳ後、Ｐ−９２ペプチド又はＰ−９３Ｌペプチドのいずれかでパルスされた自己Ｂ細胞でＴ細胞株を刺激した。これら２つの細胞株を、それぞれＴ−１１９１−Ｐ−９２及びＴ−１１９１−Ｐ−９３Ｌと命名した。２つの細胞株は、＞ ９８％がＣＤ８陽性細胞、９９％がＣＤ４９ｄ陽性細胞、＜２％がＣＤ５６陽性細胞及び＞７５％がＣＤ４５ＲＯ陽性細胞であることを示した。次いで、ペプチドでパルスした標的を溶解できるかについて、これら２つのＴ細胞株を解析した。Ｔ−１１９１−Ｐ−９３Ｌは、Ｐ−９３ＬペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２細胞を、Ｐ−９２ペプチドでパルスされた細胞よりも大きな範囲で溶解することが示された（図４、四角形）。Ｔ−１１９１−Ｐ−９２も、Ｐ−９３Ｌペプチドでパルスされた標的細胞を、Ｐ−９２ペプチドでパルスされた標的細胞よりも大きな範囲で溶解した（図４、三角形）。図４のデータも、標的細胞を天然ペプチドでパルスした場合に、アゴニストＰ−９３Ｌペプチドを用いて樹立されたＴ細胞株の方が、天然ペプチドを用いて樹立されたＴ細胞株より高レベルで標的細胞を溶解することを示している。これは、異なる２つのＥ：Ｔ比率で見られた。Ｔ−１１９１−Ｐ−９３Ｌ細胞及びＴ−１１９１−Ｐ−９２細胞は、対照であるＣＥＡ ＣＡＰ１−６Ｄペプチドでパルスされた場合には、Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞を溶解しなかった。
標的細胞認識
次に、試験を行って、これら２つのＴ細胞株が、ＭＵＣ−１陽性及びＨＬＡ−Ａ２陽性の乳癌細胞株ＭＣＦ−７を溶解することができるかを測定した。ＭＵＣ−１陰性でＨＬＡ−Ａ２陽性のＳＫ−Ｍｅｌ−２４メラノーマ細胞株を陰性対照として用いた。表５に示したように、ＭＣＦ−７細胞は、Ｔ−１１９１−Ｐ−９２細胞及びＴ−１１９１−Ｐ−９３Ｌ細胞によって溶解された。ＳＫ−Ｍｅｌ−２４細胞に対する溶解は観察されなかった。Ｔ−１１９１−Ｐ−９３Ｌ細胞は、Ｔ−１１９１−Ｐ−９２細胞株と比較して、ＭＣＦ−７細胞をより大きく溶解することが示された。ＣＥＡ ＣＡＰ１−６Ｄ対照用ペプチドではなく、対応するＭＵＣ−１ペプチドでパルスされた非標識Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞を添加すると、両方のＴ細胞株の細胞傷害活性が低下して、溶解のＭＵＣ−１特異性を示した（表５）。抗ＨＬＡ−Ａ２抗体を添加すると溶解が阻害され、対照用抗体ＵＰＣ−１０では阻害されなかったことから明らかなように、ＭＣＦ−７細胞に対するこれらのＴ細胞株の細胞傷害活性も、ＨＬＡ−Ａ２拘束性であることが示された（表６）。
Figure 2007523633
抗ＨＬＡ−Ａ２抗体を添加すると溶解が阻害され、対照用抗体ＵＰＣ−１０では阻害されなかったことから明らかなように、ＭＣＦ−７細胞に対するこれらのＴ細胞株の細胞傷害活性も、ＨＬＡ−Ａ２拘束性であることが示された（表７）。
Ｔ細胞株Ｔ−１１９１−Ｐ−９２及びＴ−１１９１−Ｐ−９３Ｌは、外見上健常な被検者由来であった。そして、２人の膵臓癌患者（患者２３及び１８）からさらに別のＴ細胞株を樹立することができるか否かを決定するために実験を行った。４つのＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株を作成して、Ｔ−２３−Ｐ−９２、Ｔ−２３−Ｐ−９３Ｌ、Ｔ−１８−Ｐ−９２及びＴ−１８−Ｐ−９３Ｌと命名した。Ｔ細胞株Ｔ−１８−Ｐ−９２及びＴ−１８−Ｐ−９３Ｌを、それぞれＰ−９２ペプチド及びＰ−９３Ｌペプチドでパルスされた自己ＤＣでＰＢＭＣを刺激することにより、患者１８から生成した。Ｔ細胞株Ｔ−２３−Ｐ−９２及びＴ−２３−Ｐ−９３Ｌは、それぞれＰ−９２及びＰ−９３Ｌペプチドでパルスされた自己ＤＣでＰＢＭＣを刺激することにより、患者２３から作成された。表８から明らかなように、Ｐ−９２ペプチド又はＰ−９３ＬペプチドでパルスされたＤＣで刺激したところ、２人の膵臓癌患者由来の４つのＴ細胞株すべてが刺激されて、ＩＦＮ−γを産生することができた。しかし、これらのＴ細胞をＣＥＡペプチドＣＡＰ１−６Ｄによって同じように刺激しても、ＩＦＮ−γの産生は認められなかった。４つのＴ細胞株すべてで、Ｐ−９３Ｌアゴニストペプチドを用いた場合の方が、Ｐ−９２天然ペプチドと比較して高レベルのＩＦＮ−γの産生が見られた。所定のペプチドを用いて刺激した場合と、アゴニストペプチドを用いて得たＴ細胞株は、天然のペプチドに由来するＴ細胞株よりも高レベルの刺激を常に示したことに留意すべきである。
Figure 2007523633
癌患者由来の細胞株による標的の細胞溶解
次に、癌患者２３から得たＴ細胞株が、ＭＵＣ−１陽性ＨＬＡ−Ａ２陽性の癌細胞を溶解することができるか否かを決定するために実験を行った。ＳＫ−Ｍｅｌ−２４細胞株（ＭＵＣ−１陰性及びＨＬＡ−Ａ２陽性）を、特異性についての陰性対照として用いた。表９及び１０に見られるように、Ｔ−２３−Ｐ−９３Ｌ細胞株、Ｔ−２３−Ｐ−９２細胞株、Ｔ−１８−Ｐ−９３Ｌ細胞株、及びＴ−１８−Ｐ−９２細胞株は、２つの異なるＥ：Ｔ比でＭＣＦ−７癌細胞の溶解を示したが、メラノーマ細胞株の溶解は認められなかった。上記の結果に従って、アゴニストペプチドを用いて得られたＴ細胞株（Ｔ−２３−Ｐ−９３Ｌ、Ｔ−１８−Ｐ−９３Ｌ）は、天然ペプチドを用いて得られたＴ細胞株（Ｔ−２３−Ｐ−９２、Ｔ−１８−Ｐ−９２）よりも優れた腫瘍細胞溶解を示した。これは、２つの異なったＥ：Ｔ比で見られた。
Figure 2007523633
Figure 2007523633
実験材料及び方法
解析した２つのウイルスベクターは、複製可能な組換えワクシニアウイルス（ｒＶ−）及びアビポックスベクターである鶏痘（ｒＦ−）であり、後者は哺乳動物細胞において複製不能である。各ベクターは、３種類のヒト共刺激分子（ＴＲＩＣＯＭと名づけられたＢ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３）に対する導入遺伝子をコードし、ＣＥＡ及びＭＵＣ−１の両導入遺伝子は、アゴニスト・エピトープも含んでいる。ベクターをｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ及びｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭと命名した。
どちらのベクターも、ヒト樹状細胞（ＤＣ）の中で５つの導入遺伝子すべてを忠実に発現させることができることが示されている。どちらかのベクターに感染したＤＣは、ＣＥＡ特異的及びＭＵＣ−１特異的なＴ細胞株を、ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭベクター又はＭＵＣ−１−ＴＲＩＣＯＭベクターで感染したＤＣと同じレベルまで活性化することが示されている。したがって、ＣＥＡとＭＵＣ−１の間に抗原競合が存在するという証拠は観察されなかった。また、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ又はｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したヒトＤＣも、ＭＵＣ−１及びＣＥＡの両方に特異的なＴ細胞株を生じさせる能力があることが示されているが、これらのＴ細胞株も、内生的にＭＵＣ−１及び／又はＣＥＡを発現するヒト腫瘍細胞はもとより、ＭＵＣ−１ペプチド又はＣＥＡペプチドでパルスされた標的を溶解できることが示されている。
細胞培養物
ヒト乳房腺癌細胞株ＭＣＦ−７（ＨＬＡ−Ａ２陽性、ＣＥＡ陰性及びＭＵＣ−１陽性）、結腸直腸癌細胞株ＳＷ１４６３（ＨＬＡ−Ａ２陽性、ＣＥＡ陽性及びＭＵＣ−１陽性）及びメラノーマ細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−２４（ＨＬＡ−Ａ２陽性、ＣＥＡ陰性及びＭＵＣ−１陰性）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，バージニア州）から購入した。培養物は、マイコプラズマを含んでおらず、完全培地［１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）］の中で維持した。Ｃ１Ｒ細胞株は、内在性のＨＬＡ−Ａ又はＨＬＡ−Ｂ抗原を発現しないヒト血漿白血病細胞株である。Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞は、形質移入されたゲノムクローンであるＨＬＡ−Ａ２．１を発現するＣ１Ｒ細胞である。これらの細胞は、Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｂｉｄｄｉｓｏｎ（国立神経疾患・脳卒中研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ）、ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，メリーランド州）から入手した。１７４ＣＥＭ−Ｔ２細胞株（Ｔ２）の輸送欠失変異体は、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ（エール大学医学部（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，コネチカット州）から提供された。Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞及びＴ２細胞はマイコプラズマを含まず、それぞれ、ＲＰＭＩ１６４０完全培地及びイスコフ改変ダルベッコ完全培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の中で維持した。Ｖ８Ｔ細胞株は、ＣＥＡのＣＡＰ−１エピトープに対するＣＤ８＋ＣＴＬ細胞株である。Ｔ−１１９１−Ｐ９３Ｌ細胞株は、ＭＵＣ−１ペプチドを用いてインビトロにおいて刺激された健常なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から作成されたＣＤ８＋ＭＵＣ−１特異的ＣＴＬ細胞株である。Ｖ８Ｔ細胞株及びＴ−１１９１−Ｐ９３Ｌ細胞株は両方とも、既述したとおりに培養した。
ペプチド
使用したＨＬＡ−Ａ２ 結合ペプチドは、以下のものを含んでいた。すなわち、（ａ）ＣＥＡペプチドと命名されたＣＥＡアゴニストペプチドＣＡＰ１−６Ｄ（ＹＬＳＧＡＤＬＮＬ）、（ｂ）ＭＵＣ−１ペプチドと命名されたＭＵＣ−１アゴニストペプチドＰ−９３Ｌ（ＡＬＷＧＱＤＶＴＳＶ）、（ｃ）前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ペプチドＰＳＡ−３（ＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶ）。すべてのペプチドは９６％よりも高い純度で、アメリカン・ペプチド・カンパニー社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ，（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，カリフォルニア州））によって製造された。
ＢＭＣからのＤＣの培養
ＨＬＡ−Ａ２の正常なドナーＰＢＭＣを、ヘパリン化血液から得た。既述されているとおりに（５１）、（Ｂｏｙｕｍ Ａ．「ヒト血液から顆粒球及びリンパ球を単離するための一段階処理法。１ｇの重力場における白血球細胞の一般的な沈降特性（Ａ ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ．Ｇｅｎｅｒａｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ １ ｇ ｇｒａｖｉｔｙ ｆｉｅｌｄ）、 Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９６８；９７（Ｓｕｐｐｌ）：５１−７６）、リンパ球分離媒体勾配（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，ノースカロライナ州）を用いてＰＢＭＣを分離した。Ｓａｌｌｕｓｔｏら（Ｓａｌｌｕｓｔｏ Ｆ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ．、培養ヒト樹状細胞による可溶性抗原の効率的な提示は、顆粒球／マクロファージ・コロニー刺激因子とインターロイキン−４によって維持され、腫瘍壊死因子αによって下方制御される（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｐｌｕｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ ａｎｄ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１１０９−１１１８，１９９４））によって説明されている手順の変法を用いてＤＣを調製した。２ｍＭのグルタミン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含むＡＩＭ−Ｖ培地にＰＢＭＣ（１．５×１０８）を再懸濁して、Ｔ−１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサチューセツ州）に付着させた。３７℃で２時間経過後、非付着細胞を静かに洗い流した。１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）及び２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）を含むＡＩＭ−Ｖ培地の中で６〜７日間、付着細胞を培養した。３日ごとに培養基を補充した。
組換えウイルス、ならびにｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ及びｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭによるＤＣの感染
ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ及びｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭは、６Ｄの変更を含むヒトＣＥＡ遺伝子、９３Ｌの変更を含むヒトＭＵＣ−１遺伝子並びにヒト共刺激分子Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３をコードする（図５）（Ｚａｒｅｍｂａ Ｓ，Ｂａｒｚａｇａ Ｅ，Ｚｈｕ Ｍら、ヒト癌胎児性抗原由来のエンハンサーアゴニストである細胞傷害性Ｔリンパ球ペプチドの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ａｇｏｎｉｓｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７；５７：４５７０−７，及びＴｓａｎｇ ＫＹ，Ｐａｌｅｎａ Ｃ，Ｇｕｌｌｅｙ Ｊ，Ａｒｌｅｎ Ｐ，Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ．ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープ、及びそのＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲ由来のアゴニストエピトープ（Ａ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｇｏｎｉｓｔ ｅｐｉｔｏｐｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｏｎ−ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＭＵＣ−１）、 Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；１０：２１３９−４９））。（Ｈｏｄｇｅ ＪＷ，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ＪＰ，Ｋａｎｔｏｒ ＪＡ，Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ．；Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ ｐｒｉｍｅ ａｎｄ ｂｏｏｓｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａｖｉａｎ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ；Ｖａｃｃｉｎｅ １９９７；１６：７５９−６８）に記載されているように、相同的組換えによって組換えベクターを作成した。ＤＣ（１×１０６個）を、１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ、対照のアビポックスウイルスベクター（ＦＰ−ＷＴ）又は対照のワクシニアベクター（Ｖ−ＷＴ）とともに３７℃でインキュベートした。滴定実験によって、４０ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）に等しい、４×１０４プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌのｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭを２時間ＤＣに感染させると、約６０％の感染ＤＣの中で導入遺伝子の発現を定常的に誘導できることが実証された。同様の滴定実験によって、５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩに等しい、０．５×１０７ｐｆｕ／ｍｌのｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭを１時間ＤＣに感染させると、約３５％の感染ＤＣの中で導入遺伝子の発現を定常的に誘導できることが実証された。ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭについては５０％〜６５％の感染効率、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭについては３０％〜５９％の感染効率で、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ及びｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭを感染させるのに、さまざまなドナー由来のＤＣを用いた。１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−４を含む新鮮で温かいＲＰＭＩ−１６４０完全培地１０ｍｌに感染したＤＣを懸濁し、２４時間培養してから、ＡＰＣとして用いた。
フローサイトメトリー解析
以下の抗体の組み合わせを用いてＴ細胞株上で２色フローサイトメトリー解析を行った。抗ＣＤ５６−ＦＩＴＣ／抗ＣＤ８−ＰＥ、抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ／抗ＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ／抗ＣＤ２７−ＰＥ。抗体はすべてＢＤバイオサイエンス社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）から購入した。４℃で１時間、同時に染色を行ってから、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まない冷たいリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し，同じ緩衝液に再懸濁して、ＦＡＣＳｃａｎ及びＣＥＬＬＱｕｅｓｔプログラム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて直ちに解析した。１０，０００個の生細胞からデータを収集し、保存し、結果を作成するために用いた。ＤＣを解析する手順は、上記した手順と同じであった。以下の抗体の組み合わせを用いた。すなわち、抗ＭＨＣ−クラスＩＩ−ＦＩＴＣ／抗ＣＤ８０−ＰＥ、抗ＣＤ５８−ＦＩＴＣ／抗ＣＤ５４−ＰＥ、抗ＭＨＣクラスＩ−ＦＩＴＣ／抗ＭＨＣクラスＩＩ−ＰＥ及び抗ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ／抗ＩｇＧ２ａ−ＰＥ（アイソタイプ対照）。ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩに対する抗体は、Ｓｅｒｏｔｅｃ社（オックスフォード，イギリス）から購入し、他の抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。抗ＣＥＡモノクローナル抗体ＣＯＬ−１及び抗ＭＵＣ−１抗体（ＤＦ−３及びＤＦ−３Ｐ）も用いた（Ｍｕｒａｒｏ Ｒ，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ Ｄ，Ｔｈｏｒ Ａ．ら、ヒト結腸癌腫対正常な成人組織で異なって発現される癌胎児性抗原上にある同じレパートリーのエピトープのモノクローナル抗体による定義（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｖｅｒｓｕｓ ｎｏｒｍａｌ ａｄｕｌｔ ｔｉｓｓｕｅｓ） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８５；４５：５７６９−８０）。ＭＯＰＣ−１０４Ｅ（ＩｇＭ）（Ｃａｐｐｅｌ／Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ペンシルバニア州）を陰性対照として用いた。
染色後、細胞を３回洗浄した後、ＦＩＴＣで標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）の１：１００希釈液でインキュベートした。上記したように解析を行った。結果を、陽性細胞の割合（％）及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表した。ＭＦＩ値を対数スケールで得て、それを用いて、蛍光ドットプロットにおけるすべての細胞の平均を測定して決定した蛍光のレベルを表した。
免疫ブロット解析
ＭＰＥＲ哺乳動物タンパク質抽出用試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ州）を用いて、非感染ＤＣ、４０ＭＯＩのｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクター、ｒＦ−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭベクター、又はｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭベクターに感染させたＤＣ及び５ＭＯＩのｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクターに感染させたＤＣを溶解した。ＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイ用キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、溶解物のタンパク質濃度を測定し、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ精密濾過装置（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，カリフォルニア州）を製造業者の指示に従って用いて、１サンプル当たり２０μｇのタンパク質画分をＰＶＤＦ膜１２の上にブロットした。ブロットした後、ＢＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，カリフォルニア州）を５％含むＰＢＳを用いて、室温で１時間、膜をブロックした。次いで、０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを用いて膜を３回洗浄してから、１μｇ／ｍｌのＣＯＬ−１抗体、ＤＦ−３抗体、又はＤＦ３−Ｐ抗体の溶液を用いて、室温で２時間インキュベートした。そして、上記したように膜を３回洗浄してから、ＨＲＰに結合した抗マウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：３０００希釈液を用いて室温で１時間インキュベートした。ＣＥＡ及びＭＵＣ−１タンパク質の免疫検出には、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた。
Ｔ細胞株の作成
Ｔｓａｎｇらに記載されたプロトコルの変法を用いて、ＣＥＡ及び／又はＭＵＣ−１に特異的なＣＴＬを作成した（Ｔｓａｎｇ ＫＹ，Ｚａｒｅｍｂａ Ｓ，Ｎｉｅｒｏｄａ ＣＡら．組換えワクシニアＣＥＡワクチンによって免疫された患者由来のヒト癌胎児性抗原に特異的なヒト細胞傷害性Ｔ細胞の作成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ−ＣＥＡ ｖａｃｃｉｎｅ）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １９９５；８７：９８２−９０）。Ｔ細胞株Ｔ−ｒＶ及びＴ−ｒＦを作成するために、それぞれｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ又はｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染させた自己ＤＣをＡＰＣとして用いた。１０：１のエフェクター対ＡＰＣの比にして、自己の非接着性細胞をＡＰＣに添加した。そして、ＣＯ２を５％含有する加湿した雰囲気中、３７℃で３日間、培養物をインキュベートした。次いで、７日間、濃度２０単位／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を培養物に添加し、ＩＬ−２含有培地を３日毎に補充した。ペプチドとともに３日間インキュベートすることと、７日間のＩＬ−２補充とが、１回のインビトロ刺激（ＩＶＳ）サイクルを構成した。上記したように、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ又はｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染した自己ＤＣで、それぞれＴ−ｒＶ及びＴ−ｒＦを再刺激し、１１日目に次のＩＶＳサイクルを開始した。ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ及びｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染した自己ＤＣを、３回のＩＶＳサイクルの間ＡＰＣとして用いた。Ｔ−ｒＦ（ＣＥＡ）細胞株及びＴ−ｒＦ（ＭＵＣ）細胞株を作成するために、１回のＩＶＳの間、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭを感染させた自己ＤＣでＴ細胞を刺激してから、さらに２回のＩＶＳの間、それぞれＣＡＰ１−６Ｄペプチド又はＰ−９３Ｌペプチドでそれぞれぞれパルスした非感染の自己ＤＣを用いて再刺激した。３回目のＩＶＳの後、（２３，０００ラド）照射した自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞をＡＰＣとして用いた。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を２５μｇ／ｍｌのペプチドでパルスして、エフェクター対ＡＰＣの比率１：３で再刺激に用いた。
次いで、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で３日間培養物をインキュベートした。ペプチドを含んだ培地を除去してから、濃度２０単位／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を培養液に７日間添加した。上記と同じ刺激の手法を用いて、ＰＢＭＣをｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染した自己ＤＣで刺激して、患者５５、４９及び４１からＴ細胞株を作成した。患者５５は、最初に限局性膵臓癌のホイップル処置を受け、続いて膵臓床（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｄ）へのアジュベント放射線療法を受けた。この患者は局所再発を起こしていたため、本臨床試験に加わる前に、５ＦＵ／ロイコボリンを用いた化学療法を受けた後、ワクシニア−ＣＥＡ及びＡＬＶＡＣ−ＣＥＡを用いる実験的ワクチン試験を受けた。患者４１は、肝転移を有する結腸直腸癌と診断された。この患者は、本試験に加わる前に、５ＦＵ／ロイコボリン／ＣＰＴ−１１、５ＦＵ／ロイコボリン／オキサリプラチン及びゼローダを含む異なる三つの化学療法が進められていた。患者４９は、肝転移及び肺転移した結腸直腸癌に罹患していた。この患者は、本試験に加わる前に、ＣＰＴ−１ｌ／５ＦＵ／ロイコボリンによる化学療法の４サイクルに従って進んでいた。
細胞傷害性アッセイ
標的細胞（Ｃ１Ｒ−Ａ２又は腫瘍細胞）を、５０μＣｉの１１１インジウム標識したオキシキノリン（Ｍｅｄｉ−Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，イリノイ州）を用いて室温で１５分間標識した。１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０完全培地中の標的細胞（０．３×１０４個）を、平底測定プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ）の９６ウェルのそれぞれに添加した。標識したＣ１Ｒ−Ａ２標的細胞を、エフェクター細胞を添加する前に、５％のＣＯ２中において３７℃で６０分間、表示した濃度のペプチドとともにインキュベートした。標的として癌腫細胞を用いる場合には、ペプチドを用いなかった。エフェクター細胞を、１０％のプールされたヒトＡＢ型血清を添加したＲＰＭＩ１６４０完全培地１００μｌに懸濁して、標的細胞に添加した。そして、プレートを、６時間又は１６時間、５％のＣＯ２中においてインキュベートした。採取器（Ｓｋａｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，バージニア州）を用いて上清を回収して、ガンマ線計数を行った。測定は３回反復して行ない、標準偏差を計算した。以下の公式を用いて特異的溶解を計算した（値はすべてｃｐｍ）。
％溶解＝（観察された放出量−自発的放出量）／（全放出量−自発的放出量）×１００
自発的放出量は、１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０完全培地を添加したウェルから測定した。放出可能な全放射活性量は、２．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で標的を処理して得られた。
サイトカインの検出
さまざまなペプチド濃度でＩＬ−２を含まない培地中において、ペプチドをパルスされた自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞に２４時間曝露されたＴ細胞の上清を、ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、ＩＮＦ−αの分泌についてスクリーニングした。結果をｐｇ／ｍｌで表示した。
統計的解析
両側ペアｔ検定（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，カリフォルニア州）を用いて、平均値間の差を統計的に解析した。
まず、ヒトＤＣをｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染させると、５つの導入遺伝子それぞれの発現がもたらされるか否かを決定するために実験を行った。最初の実験では、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに対して５及び１０というＭＯＩを用いたが、どちらのＭＯＩでも、同様の結果になったため、以後の実験ではＭＯＩを５にして用いた。図６から明らかなように、非感染のヒトＤＣはＣＥＡを発現しない（単クローン抗体ＣＯＬ−１により検出される）が、ＤＣによるＣＤ８０、ＣＤ５４及びＣＤ５８、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩの発現は、いくつかの研究において既に報告されている発現と同様である（Ｔｓａｎｇ ＫＹ，Ｚｈｕ ＭＺ，Ｅｖｅｎ Ｊ．ら、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化の促進を目的とする、共刺激分子の導入遺伝子（ＣＤ８０）を発現する組換えアビポックスベクターによるヒト樹状細胞の感染（Ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｖｉｐｏｘ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ（ＣＤ８０） ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：７５６８−７６；及びＺｈｕ ＭＺ，Ｔｅｒａｓａｗａ Ｈ，Ｇｕｌｌｅｙ Ｊら、ヒト樹状細胞におけるアビポックスベクターによる三連の共刺激分子の過剰発現を介するヒトＴ細胞の活性化増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ａｖｉｐｏｘ ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｙｐｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｒｉａｄ ｏｆ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：３７２５−３４）。Ｖ−ＷＴによる感染は、これら８つの表面マーカーのいずれにも、あったとしてもほとんど影響しなかった（図６）。一方、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭによる感染は、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＣＤ８０、ＣＤ５４及びＣＤ５８の発現レベルを顕著に増加させることが分かったが、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの発現レベルには、計測可能なほどには影響しなかった。既に公表されている結果と一致して、同一ドナー由来のＤＣをｒＶ−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭに感染させたところ、ＣＥＡ、ＣＤ８０、ＣＤ５４、及びＣＤ５８のレベルは、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したときに見られるのと同様のレベルにまで上昇したが、ＭＵＣ−１又はＭＨＣのクラスＩもしくはクラスＩＩの発現は変わらなかった。さらに、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭと混合したｒＶ−ＭＵＣ−１（ｒＶ−ＭＵＣ−１−ＴＲＩＣＯＭ構築物は利用できなかった）をＤＣに感染させると、ＭＵＣ−１及び３つの共刺激分子の発現増強レベルは、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭによる場合に見られる発現レベルと同様であることが示されたが、ＭＨＣのクラスＩ及びクラスＩＩの発現レベルにも、ＣＥＡの発現欠如にも影響しなかった（データ省略）。非感染ＤＣ及び対照用ベクターに感染したＤＣ中において、低レベルのＭＵＣ−１が検出された。
これは、インビトロで培養した場合、ＭＵＣ−１が、ヒトのＤＣ及び単核球由来のＤＣ上で発現することを示した、Ｗｙｋｅｓらの報告（Ｗｙｋｅｓ Ｍ，ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＫＰ，Ｔｒａｎ Ｍら．ＭＵＣ１上皮ムチン（ＣＤ２２７）は、活性化樹状細胞によって発現される（ＭＵＣ１ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｕｃｉｎ（ＣＤ２２７） ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）、Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ２００２；７２：６９２−７０１）と一致している。
ヒトＤＣをｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染させると、５つの導入遺伝子それぞれの発現がもたらされるか否かを決定するために並行実験を行った。最初の実験では、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭについて２０及び４０というＭＯＩを用いたところ、４０ＭＯＩのほうが導入遺伝子の発現が多かったため、以後の実験ではそれを用いた。図７から明らかなように、ＦＰ−ＷＴによる感染は、これら解析した８つの表面マーカーのいずれにも、あったとしてもほとんど影響しなかった。一方、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭによる感染は、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＣＤ８０、ＣＤ５４及びＣＤ５８の発現レベルを顕著に増加させることが分かったが、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの発現レベルには影響しなかった。同一ドナー由来のＤＣをｒＦ−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭに感染させたところ、ＣＥＡ、ＣＤ８０、ＣＤ５４、及びＣＤ５８のレベルは、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染させたときに見られるのと同様のレベルにまで上昇したが、ＭＵＣ−１又はＭＨＣのクラスＩもしくはクラスＩＩの発現は変わらなかった。さらに、ＤＣにｒＦ−ＭＵＣ−１−ＴＲＩＣＯＭを感染させると、ＭＵＣ−１及び３つの共刺激分子の発現増強レベルは、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭによる場合に見られる発現レベルと同様であることが示されたが、ＭＨＣのクラスＩ及びクラスＩＩの発現レベルにも、ＣＥＡの発現欠如にも影響しなかった（データ省略）。免疫ブロット解析により、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ、ｒＦ−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭ、ｒＦ−ＭＵＣ−１−ＴＲＩＣＯＭベクターに感染したＤＣ、又は非感染ＤＣの上におけるＣＥＡ及びＭＵＣ−１の発現を解析した。図８に示したように、ｒＦ−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭ、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ、及びｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣにおいてＣＥＡが検出されたが、非感染ＤＣや、ｒＦ−ＭＵＣ−１−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣでは検出されなかった。
上記のように、ＤＣは低レベルのＭＵＣ−１を発現したが、ｒＦ−ＭＵＣ−１−ＴＲＩＣＯＭ、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ、及びｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣでは、ＭＵＣ−１発現の大きな増加が明確に見られ、一方、ｒＦ−ＣＥＡ（６Ｄ） ＴＲＩＣＯＭに感染したＣＤではこの増加は見られなかった（図８）。
本発明者らは、ＣＥＡアゴニストペプチドであるＣＡＰ−１（６Ｄ）、及びＭＵＣ−１アゴニストペプチドであるＰ−９３ＬでパルスされたＤＣが、ヒトＴ細胞を活性化できることを実証した。ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクターをヒトＤＣに感染させると、ＣＥＡ特異的及びＭＵＣ−１特異的なＴ細胞によってＩＦＮ−γの産生が刺激されうるか否かを決定するために実験を行った。これらの結果も、ｒＦ−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭ又はｒＦ−ＭＵＣ−１−ＴＲＩＣＯＭに感染したヒトＤＣが、これらのＴ細胞を活性化させる能力と比較された。表１１から明らかなように、非感染ＤＣ、又はＦＰ−ＷＴに感染したＤＣは、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞株（Ｖ８Ｔ）、又はＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株（Ｔ−１１９１−Ｐ９３Ｌ）によるＩＮＦ−γ産生をもたらさなかった。ＣＥＡペプチドでパルスされたＤＣは、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞株のみによってＩＮＦ−γ産生を誘導し、ＭＵＣ−１ペプチドでパルスされたＤＣは、ＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株のみによってＩＮＦ−γ産生を誘導した。同様に、ｒＦ−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣは、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞株のみによってＩＮＦ−γの産生を誘導し、一方、ｒＦ−ＭＵＣ−１−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣは、ＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株のみによってＩＮＦ−γ産生を誘導した。しかし、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭによるＤＣ感染は、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞株及びＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株内におけるＩＦＮ−γ産生を誘導し、単一の腫瘍抗原導入遺伝子だけを含むベクターを用いた場合に見られるレベルと同等のレベルで誘導した。これらの実験は、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクター内では、Ｔ細胞株を活性化させる能力においてＣＥＡとＭＵＣ−１の間に抗原競合が存在しないことを示しているのかもしれない。
ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクターをヒトＤＣに感染させると、ＣＥＡ特異的及びＭＵＣ−１特異的なＴ細胞によってＩＦＮ−γ１９の産生が刺激されうるか否かを決定するために実験を行った。これらの結果も、ｒＶ−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭ又はｒＶ−ＭＵＣ−１とｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染したヒトＤＣがこれらのＴ細胞を活性化させる能力と比較された。表１２から明らかなように、非感染ＤＣ又はｒＶ−ＷＴに感染したＤＣは、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞株又はＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株によるＩＮＦ−γ産生をもたらさなかった。ＣＥＡペプチドでパルスされたＤＣは、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞株のみによってＩＮＦ−γ産生を誘導し、ＭＵＣ−１ペプチドでパルスされたＤＣは、ＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株のみによってＩＮＦ−γ産生を誘導した。同様に、ｒＶ−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣは、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞株のみによってＩＮＦ−γの産生を誘導し、一方、ＭＵＣ−１ベクターに感染したＤＣは、ＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株のみによってＩＮＦ−γ産生を誘導した。しかし、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭによるＤＣ感染は、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞株及びＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株内におけるＩＦＮ−γ産生を誘導し、単一の腫瘍抗原導入遺伝子だけを含むベクターを用いた場合に見られるレベルと同等のレベルで誘導した。これらの実験は、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクターを用いるＴ細胞株を活性化させる能力においてＣＥＡとＭＵＣ−１の間に抗原競合が存在しないことを示しているのかもしれない。次に、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ及び／又はｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染した自己ＤＣをＡＰＣとして用いて、ＰＢＭＣからヒトＴ細胞を構築することができるか否かを決定した。
「実験材料と方法」の項に記載したように、３回ＩＶＳを行った後、得られたＴ細胞を解析して、ペプチドでパルスされたＤＣ又はベクターに感染したＤＣによってそれらが活性化されうるか調べた。表１３から明らかなように、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ又はｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣをＡＰＣとして用いて樹立したＴ細胞株はどちらも、非感染の２０ＤＣ又はＦＰ−ＷＴに感染したＤＣによって刺激しても、活性化してＩＦＮ−γを産生することができなかった。これらの結果は、ワクシニアウイルスと鶏痘との間には、Ｔ細胞エピトープに関して交差反応性がないマウス系における以前の観察結果と一致しており（Ｈｏｄｇｅ ＪＷ，Ｐｏｏｌｅ ＤＪ，Ａａｒｔｓ ＷＭら、改変ワクシニアウイルスのアンカラ組換え株は、多様な抗原刺激及び追加免疫処方においてワクシニア組換え株と同じくらい強力に治療的抗腫瘍応答を誘発する（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ａｎｋａｒａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ａｒｅ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｓ ｖａｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ ｐｒｉｍｅ ａｎｄ ｂｏｏｓｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｒｅｇｉｍｅｎｓ ｔｏ ｅｌｉｃｉｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；６３：７９４２−９）、また、鶏痘エピトープに対して哺乳動物のＴ細胞を作成するのは難しいことを示した、以前のマウス及びヒトにおける実験とも一致している（未発表データ）。他方、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ又はｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＡＰＣを用いて作成したＴ細胞株はどちらも活性化されて、ＣＥＡペプチド又はＭＵＣ−１ペプチドのいずれかでパルスされたＤＣをＡＰＣとして用いるとＩＦＮ−γを産生した（表１３）。これらの結果は、どちらかのベクターに感染したＤＣは、ＣＥＡ及びＭＵＣ−１両抗原に対するＴ細胞をＰＢＭＣから生じさせることを示しているのかもしれない。
ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ又はｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭのいずれかに感染したＤＣによって生じたＴ細胞株は、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣに曝露されると、ＩＦＮ−γを産生した。さらなる実験で、まずｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣをＡＰＣとして用いて、Ｔ細胞を生じさせ、次いで、２回のＩＶＳの間、ＣＥＡペプチドでパルスしたＡＰＣを用いて継代した。表１３から分かるように、これらのＴ細胞は、ＭＵＣ−１ペプチドでパルスされたＤＣによって活性化される能力を失ったが、ＣＥＡペプチドでパルスされたＤＣにより活性化されて、ＩＦＮ−γを産生する能力は保持していた。逆に、まずｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣを用いて生じたＴ細胞を、ＭＵＣ−１ペプチドでパルスされたＤＣの存在下で継代すると、Ｔ細胞は、ＣＥＡペプチドでパルスされたＤＣによって活性化される能力を失ったが、ＭＵＣ−１ペプチドによって活性化される能力は保持していた。
次に、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクター又はｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクターのいずれかに感染したＤＣをＡＰＣとして用いて樹立されたＴ細胞株が、ヒト標的細胞を溶解することができるか否かを決定するために実験を行った。表１４から明らかなように、両方のＴ細胞株とも、Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞を溶解することができなかったが、ＣＥＡペプチド又はＭＵＣ−１ペプチドのいずれかでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２細胞を溶解することはできた。どちらのＴ細胞株も、対照であるＰＳＡペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２細胞を溶解することはできなかった。他方、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣを用いて樹立され、その後はＣＥＡペプチドでパルスされたＤＣをＡＰＣとして用いて継代されたＴ細胞株は、ＣＥＡペプチドでパルスされた標的細胞を溶解することはできたが、ＭＵＣ−１ペプチド又はＰＳＡペプチドでパルスされた標的細胞を溶解することはできなかった。逆に、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣを用いて樹立され、その後はＭＵＣ−１ペプチドでパルスされたＤＣをＡＰＣとして用いて継代されたＴ細胞株は、ＭＵＣ−１ペプチドでパルスされた標的細胞を溶解することはできたが、ＣＥＡペプチド又はＰＳＡペプチドでパルスされた標的細胞を溶解することはできなかった。
次に、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクター又はｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクターに感染したＤＣを用いて作成したＴ細胞株が、天然のＣＥＡ又はＭＵＣ−１のいずれかを発現するヒト腫瘍細胞を溶解する能力を有するか否かを判定するために実験を行った。次の３つのＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞株を評価した。すなわち、ＭＵＣ−１陽性でＣＥＡ陰性のＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株、ＣＥＡ及びＭＵＣ−１について陽性のヒト結腸癌細胞株ＳＷ１４６３、並びにＭＵＣ−１及びＣＥＡの発現について陰性であるＳＫ−Ｍｅｌ−２４ヒトメラノーマ細胞株である。本発明者らは、ＭＵＣ−１陰性及びＣＥＡ陽性のＨＬＡ−Ａ２＋細胞株を同定することができなかった。表１４から明らかなように、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ又はｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣを用いて作成したＴ細胞株はどちらも、乳癌細胞株及び結腸癌細胞株を溶解することができたが、メラノーマ細胞株を溶解することはできなかった。
他方、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣを用いて作成し、その後、２回のＩＶＳの間ＣＥＡペプチドでパルスされたＤＣを用いて再刺激したＴ細胞株は、ＣＥＡ陽性／ＭＵＣ−１陽性の結腸癌株を溶解することができたが、ＣＥＡ陰性／ＭＵＣ−１陽性の乳癌細胞株及びＣＥＡ陰性／ＭＵＣ−１陰性のメラノーマ細胞株を溶解することはできなかった。ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣを用いて作成し、その後、２回のＩＶＳの間、ＭＵＣ−１ペプチドでパルスしたＤＣによって再刺激したＴ細胞株は、結腸癌及び乳癌の細胞株を溶解することができたが、メラノーマ細胞株を溶解することはできなかった。総体的に、これらのデータは、組換えワクシニアベクターも組換えアビポックスベクターも、それぞれが正確に５つのヒト導入遺伝子を発現できるように構築することが可能なこと、及びこれらのベクターが、２つのヒト腫瘍関連抗原に対してヒトＴ細胞を活性化させる能力には抗原競合が認められないということを示しているのかもしれない。
Ｔ−ｒＶ、Ｔ−ｒＦ、Ｔ−ｒＦ（ＣＥＡ）及びＴ−ｒＦ（ＭＵＣ）Ｔ細胞株を、外見上健常な個体から作成した。４つ細胞株はすべて、＞９７％がＣＤ８陽性、＜２％がＤＣ５６陽性、＞７５％がＣＤ４５ＲＡ陽性、及び＞８１％がＣＤ２７陽性であった。次に、特異的なＴ細胞株を膵臓癌患者（患者５５）から得ることができるか否か判定するために実験を行った。ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣをＡＰＣとして用いてＴ細胞株を作成して、Ｔ−５５と名づけた。フローサイトメトリー解析により測定すると、Ｔ−５５細胞株は９９．９％がＣＤ８陽性、＜２％がＣＤ５６陽性、７３．６％がＣＤ４５ＲＡ陽性及び８７％がＣＤ２７陽性であった。表１５から明らかなように、このＴ細胞株は、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染した自己ＤＣ、及びＣＥＡペプチド又はＭＵＣ−１ペプチドのいずれかでパルスされたＤＣによって刺激されると、ＩＦＮ−γを産生するが、ＰＳＡ−３ペプチドでは産生しないことが示された。
次に、２３のこのＴ細胞株がＣＥＡ及び／又はＭＵＣ−１陽性及びＨＬＡ−Ａ２陽性である癌細胞株を溶解することができるか否かを決定するために実験を行った。メラノーマ細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−２４（ＭＵＣ−１陰性、ＣＥＡ陰性、及びＨＬＡ−Ａ２陽性）を陰性対照として用いた。表１６から明らかなように、Ｔ−５５細胞株は、ＣＥＡペプチド及びＭＵＣ−１ペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２細胞を溶解するが、ＰＳＡ−３ペプチドでは溶解しないことが示された。さらに、Ｔ−５５細胞株は、さまざまなＥ：Ｔ比で、ＭＣＦ−７細胞及びＳＷ１４６３細胞を溶解したが、メラノーマ細胞株の溶解は示さなかった。さらに２つのＴ細胞株を結腸癌患者から樹立した。これらのＴ細胞株をＴ−４１及びＴ−４９と名づけた。Ｔ−４１細胞株は、９８．８％がＣＤ８陽性、＜１％がＣＤ５６陽性、３３．６％がＣＤ４５ＲＡ陽性、及び９６．８％がＣＤ２７陽性であった。Ｔ−４９細胞株は、９８．９％がＣＤ８陽性、＜１％がＣＤ５６陽性、２９．８％がＣＤ４５ＲＡ陽性、及び９５．３％がＣＤ２７陽性であった。表１５から明らかなように、Ｔ−４１及びＴ−４９の両細胞株は、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染した自己ＤＣ、及びＣＥＡペプチド又はＭＵＣ−１ペプチドでパルスされたＤＣを用いて刺激されると、ＩＦＮ−γを産生するが、ＰＳＡ−３ペプチドでは産生しないことが示された。表１７から明らかなように、Ｔ−４１及びＴ−４９の細胞株はどちらも、さまざまなＥ：Ｔ比でＭＣＦ−７とＳＷ１４６３の溶解を示すが、ＳＫ−Ｍｅｌ−２４細胞株の溶解は示さなかった。
癌治療用ワクチンの開発及び使用における２つの主な関心事は、（ａ）腫瘍関連抗原の不十分な免疫原性、そして（ｂ）腫瘍の抗原不均質性である。ここで説明したベクターを開発して、これら２つの問題に取り組んだ。これらのベクターは、本発明者らの知る限りでは、アビポックスベクターの中に５つの完全な導入遺伝子が挿入されていて、複製不可能なベクターの初めてのものである。並列した５つの導入遺伝子構築物の組換えワクシニアウイルスも開発された。両ベクターとも、各導入遺伝子は自身のプロモーターによって作動した。前臨床モデル及び臨床試験における以前の実験によって、異なった２つのワクチンを用いる多様な抗原刺激及び追加免疫ワクチン療法の方が、一つのワクチンを連続使用するよりも優れていることが実証されている。こうした理由によって、組換えワクシニアベクター及び組換え鶏痘ベクターが開発されたのである。
表１２〜１７に示されているように、ＤＣをｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクター又はｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭベクターに感染させると、ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭベクター又はＭＵＣ−１−ＴＲＩＣＯＭベクターに感染したＤＣをＡＰＣとして用いる場合と同じくらい効率的に、Ｔ細胞株を活性化する結果となった。さらに、ｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ又はｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣを用いて作成したＴ細胞は、ＣＥＡ又はＭＵＣ−１のいずれかを発現する標的細胞を溶解することができた。
Figure 2007523633
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本明細書中に記載されたすべての文献は、参照して本明細書に取り込む。
以上の記述は本発明の例示であり、当然のことながら、添付の「特許請求の範囲」に記載された本発明の範囲又は本旨を逸脱することなく変更及び修正が可能である。
図１Ａは、ＭＵＣ−１ペプチドＰ−９２並びにアゴニストＰ−９３Ｌ及びＰ−９３１のＨＬＡ−Ａ２分子への結合を示すもので、ペプチドを濃度０〜５０μｇ／ｍｌで使用した場合のグラフである。Ｐ−９２ＭＵＣ−１ペプチド（白四角）、Ｐ−９３Ｌ（黒四角）、Ｐ−９３１（黒三角）。結果は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表す。 図１Ｂは、ＭＵＣ−１ペプチドＰ−９２並びにアゴニストＰ−９３Ｌ及びＰ−９３１のＨＬＡ−Ａ２分子への結合を示すもので、ペプチドを濃度０〜５０μｇ／ｍｌで使用した場合のグラフである。Ｐ−９２ＭＵＣ−１ペプチド（白四角）、Ｐ−９３Ｌ（黒四角）、Ｐ−９３１（黒三角）。結果は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表す。 図２は、Ｐ−９２ペプチド、Ｐ−９３Ｌペプチド又はＰ−９３１ペプチドとＨＬＡ−Ａ２との複合体の安定性の比較を示すグラフである。Ｔ２細胞を、濃度５０μｇ／ｍｌのＰ−９２ペプチド（白四角）、Ｐ−９３Ｌペプチド（黒四角）又はＰ−９３１ペプチド（黒三角）と一晩インキュベートした後、未結合のペプチドを洗い流してから、ブレフェルジン−Ａとともにインキュベートして、細胞表面に新しいクラスＩ分子が輸送されるのを遮断した。表示された時間に、表面ペプチドであるＨＬＡ−Ａ２複合体の存在を見るために細胞を染色した。結果を、０時間目を１００％として比較した相対的な結合割合で表す。 図３は、天然型ＭＵＣ−１ペプチドＰ−９２（白四角）、Ｐ−９３Ｌペプチド（黒四角）及びＰ−９３１ペプチド（黒三角）でパルスした自己Ｂ細胞が、ＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導することができることを示すグラフである。ペプチドは、０〜６．２５μｇ／ｍｌの濃度で用いた。結果をｐｇ／ｍｌで示す。 図４は、Ｐ−９２ペプチド及びＰ−９３ＬペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２に対する、ＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株の細胞傷害性を示すグラフである。Ｐ−９３ＬペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２に対するＴ−１１９１−Ｐ−９３Ｌ（黒四角）、Ｐ−９２ペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２に対するＴ−１１９１−Ｐ−９３Ｌ（白四角）、ＣＡＰ１−６ＤペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２に対するＴ−１１９１−Ｐ−９３Ｌ（黒丸）、Ｐ−９３ＬペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２に対するＴ−１１９１−Ｐ−９２（黒三角）、Ｐ−９２ペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２に対するＴ−１１９１−Ｐ−９２（白三角）、ＣＡＰ１−６ＤペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２に対するＴ−１１９１−Ｐ−９２（白丸）。１６時間の１１１Ｉインジウム放出アッセイ（１６−ｈ １１１In release assay）におけるＥ：Ｔ比＝２５：１及び１２．５：１。バー＝ＳＤ。 図５は、ウイルス構築物の概略図を示す。 図６は、非感染の、又は対照のベクター（Ｖ−ＷＴ）に感染した若しくはｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したヒトＤＣにおける表面マーカー発現のフローサイトメトリー分析をグラフによって示したものである。ＤＣ（１×１０６）を、１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地において、５：１のＭＯＩでｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ又は対照のベクター（Ｖ−ＷＴ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。感染したＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−４を含む１０ｍｌの新鮮で温かい完全培地に懸濁した後、２４時間培養した。各ヒストグラム中の数字は、陽性細胞の割合と平均蛍光強度（括弧内）を示している。 図７は、非感染の、又は対照のベクター（ＦＰ−ＷＴ）に感染した若しくはｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したヒトＤＣにおける表面マーカー発現のフローサイトメトリー分析をグラフによって示したものである。ＤＣ（１×１０６）を、１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地において、４０：１のＭＯＩでｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ又は対照のベクター（ＦＰ−ＷＴ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。感染したＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−４を含む１０ｍｌの新鮮で温かい完全培地に懸濁した後、２４時間培養した。各ヒストグラム中の数字は、陽性細胞の割合と平均蛍光強度（括弧内）を示している。 図８は、非感染の、又はｒＦ−ＣＥＡＴＲＩＣＯＭ、ｒＦ−ＭＵＣ−１−ＴＲＩＣＯＭ、ｒＦ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭ及びｒＶ−ＣＥＡ／ＭＵＣ／ＴＲＩＣＯＭに感染したヒトＤＣの免疫ブロット解析を示す。モノクローナル抗体ＣＯＬ−１及びＤＦ−３を、それぞれＣＥＡ及びＭＵＣ−１を検出するために用いた。 図９は、ｗＭＵＣ−ｌ（６）ベクターのヌクレオチド配列である。 図１０は、ｗＭＵＣ−１（６）のヌクレオチド配列である。

Claims (78)

  1. 免疫応答を刺激する、ＭＵＣ−１由来のアゴニストポリペプチド抗原をコードする単離された核酸分子。
  2. アゴニストポリペプチドが、ＨＬＡ分子に高親和力で結合する、請求項１に記載の核酸分子。
  3. アゴニストポリペプチドが、ＨＬＡに対して天然のポリペプチドよりも高い結合定数（Ｋａ）を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  4. アゴニストポリペプチドが、ＨＬＡに対して天然のポリペプチドよりも低い解離定数（Ｋｄ）を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  5. 長さ約１２アミノ酸までのアゴニストポリペプチドをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  6. アゴニストポリペプチドが、ムチン腫瘍抗原由来のものである、請求項１に記載の核酸分子。
  7. アゴニストポリペプチドが、ＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲ領域由来のものである、請求項１に記載の核酸分子。
  8. 免疫応答が細胞性免疫応答である、請求項１に記載の核酸分子。
  9. 細胞性免疫応答が細胞傷害性Ｔ細胞応答である、請求項８に記載の核酸分子。
  10. 細胞性免疫応答がＴヘルパー細胞応答である、請求項８に記載の核酸分子。
  11. 細胞性免疫応答がＢ細胞免疫応答である、請求項８に記載の核酸分子。
  12. 配列番号１〜１９又は配列番号１９〜３７の何れかに示すアミノ酸配列に対応する核酸配列を含有してなる、請求項１に記載の核酸分子又はその断片若しくは変異体。
  13. 配列番号１９に示すアミノ酸配列に対応する核酸配列を含有してなる、請求項１に記載の核酸分子又はその断片、又は配列番号１９〜３７の何れかに示すアミノ酸配列に対応する核酸配列を含有してなる、請求項１に記載の核酸分子又はその断片若しくは変異体、。
  14. 配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列を含有してなる、単離されたポリペプチド又はその断片若しくは変異体。
  15. 配列番号１に示すアミノ酸配列を含有してなる、単離されたポリペプチド又はその断片若しくは変異体。
  16. 配列番号１９に示すアミノ酸配列を含有してなる、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド又はその断片若しくは変異体。
  17. ＨＬＡ分子に高親和力で結合する、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。
  18. ＨＬＡに対し、天然のポリペプチドよりも高い結合定数（Ｋａ）を有する、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。
  19. ＨＬＡに対し、天然のポリペプチドよりも低い解離定数（Ｋｄ）を有する、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
  20. ムチン腫瘍抗原に由来する、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
  21. ＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲ領域に由来する、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
  22. 免疫応答を誘導する、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
  23. 免疫応答が細胞性免疫応答である、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
  24. 細胞性免疫応答が細胞傷害性Ｔ細胞応答である、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
  25. 細胞性免疫応答がＴヘルパー細胞応答である、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
  26. 細胞性免疫応答がＢ細胞免疫応答である、請求項２３に記載の単離ポリペプチド。
  27. 配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に少なくとも約６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含有してなる、アゴニストポリペプチド。
  28. 配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に少なくとも約８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含有してなる、アゴニストポリペプチド。
  29. 配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含有してなる、アゴニストポリペプチド。
  30. 配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に約９９．９％までの相同性を有するアミノ酸配列を含有してなる、アゴニストポリペプチド。
  31. 配列番号１〜１９の何れかに示す一つ又はそれ以上のポリペプチドをコードする単離された核酸分子の、細胞性免疫応答を生じさせるのに十分な治療有効量を投与することを含んで成る、ＭＵＣ−１腫瘍抗原に対する免疫応答を生じさせる方法。
  32. 単離された核酸分子が、配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に少なくとも約６０％の相同性を有するポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
  33. 単離された核酸分子が、配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に少なくとも約８０％の相同性を有するポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
  34. 単離された核酸分子が、配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
  35. 単離された核酸分子が、配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に少なくとも約９９．９％の相同性を有するポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
  36. 単離された核酸分子が、配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列の一つ又はそれ以上をコードするベクターを含有してなる、請求項３１に記載の方法。
  37. 単離された核酸分子が、配列番号１９に示すポリペプチドをコードするベクターを含有して成る、請求項３１に記載の方法。
  38. ＭＵＣ−１腫瘍に対して免疫応答が惹起される、請求項３７に記載の方法。
  39. 免疫応答が細胞傷害性Ｔ細胞応答である、請求項３１に記載の方法。
  40. 配列番号１〜１９の何れか一つ又はそれ以上に示すポリペプチドをコードする一つ又はそれ以上の、誘導型プロモーターに作動可能に連結された核酸配列を含有して成る、核酸ベクター。
  41. ベクターがウイルスベクターである、請求項４０に記載の核酸ベクター。
  42. ベクターがプラスミドである、請求項４０に記載の核酸ベクター。
  43. 誘導型プロモーターが組織特異的である、請求項４０に記載の核酸ベクター。
  44. 配列番号１〜１９に示すポリペプチドの何れか一つをコードする核酸配列を含有してなる、組換えベクター。
  45. 請求項４０〜４４の何れか一項に記載のベクターを含有してなる、宿主細胞。
  46. 配列番号１〜１９に示すペプチドの何れか一つ又はそれ以上を患者に投与することを含有してなる、ＭＵＣ−１腫瘍を患っているか、又はそれに罹患する恐れのある患者を治療する方法。
  47. 配列番号１〜１９に示するアミノ酸配列の何れか一つ又はそれ以上に、少なくとも約６０％の相同性を有するペプチドを投与することにより患者を治療する、請求項４６に記載の方法。
  48. 配列番号１〜１９に示すアミノ酸配列の何れか一つ又はそれ以上に、少なくとも約８０％の相同性を有するペプチドを投与することにより患者を治療する、請求項４６に記載の方法。
  49. 配列番号１〜１９に示すアミノ酸配列の何れか一つ又はそれ以上に、少なくとも約９０％の相同性を有するペプチドを投与することにより患者を治療する、請求項４６に記載の方法。
  50. 配列番号１〜１９に示すアミノ酸配列の何れか一つ又はそれ以上に、少なくとも約９９．９％の相同性を有するペプチドを投与することにより患者を治療する、請求項４６に記載の方法。
  51. 癌を患っている患者から樹状細胞を単離し、
    配列番号１〜１９に示す一つ又はそれ以上のポリペプチドで樹状細胞を処理し、そして
    処理した樹状細胞を患者に投与する、
    ことを含有して成る、ＭＵＣ−１腫瘍を患っているか、又はそれに罹患する恐れのある患者を治療する方法。
  52. 配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に、少なくとも約６０％の相同性を有する一つ又はそれ以上のポリペプチドで樹状細胞を処理する、請求項５１に記載の方法。
  53. 配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に、少なくとも約８０％の相同性を有する一つ又はそれ以上のポリペプチドで樹状細胞を処理する、請求項５１に記載の方法。
  54. 配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に、少なくとも約９０％の相同性を有する一つ又はそれ以上のポリペプチドで樹状細胞を処理する、請求項５１に記載の方法。
  55. 配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に、少なくとも約９９．９％の相同性を有する一つ又はそれ以上のポリペプチドで樹状細胞を処理する、請求項５１に記載の方法。
  56. 弱い免疫原を結合したＨＬＡに高い親和力を示すポリペプチドを患者に投与することを含有して成る、弱い免疫原性の抗原に対する免疫応答を惹起させる方法。
  57. 弱い免疫原が分化抗原である、請求項５６に記載の方法。
  58. 弱い免疫原が腫瘍抗原である、請求項５６に記載の方法。
  59. ポリペプチドが、配列番号１９に示すＨＬＡが結合している断片を含有して成る、請求項５６に記載の方法。
  60. 配列番号１９に示すＨＬＡが結合している断片が癌胎児性抗原を結合する、請求項５９に記載の方法。
  61. 配列番号１９に示すＨＬＡが結合している断片がウイルス抗原を結合する、請求項５９に記載の方法。
  62. 配列番号１９に示すＨＬＡが結合している断片が自己抗原を結合する、請求項５９に記載の方法。
  63. 配列番号１又は３〜１８の何れかに示すアミノ酸配列に対応する核酸配列又はそれらの断片若しくは変異体を含有して成る、免疫応答を刺激する、ＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲ領域由来のアゴニストポリペプチド抗原をコードする単離された核酸分子。
  64. ＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲの一部をコードする核酸を改変すること、
    改変した核酸を発現させて分子を産生し、
    樹状細胞を前記分子と接触させ、そして
    Ｔ細胞を前記樹状細胞と接触させ、
    Ｔ細胞に於けるＩＦＮ−γ産生の変調が、当該分子が免疫応答を起こすことが可能であることを示す、
    ことを含有して成る、ＭＵＣ−１腫瘍抗原に対する免疫応答を惹起させる分子をスクリーニングする方法。
  65. 樹状細胞が、癌と診断された患者由来のものである、請求項６４に記載の方法。
  66. 樹状細胞を、前記分子で処理した後に末梢血単核細胞と接触させる、請求項６４に記載の方法。
  67. 癌を患っている患者から樹状細胞を単離し、
    樹状細胞を配列番号１〜１９の何れかに示すポリペプチドで処理し、
    処理した樹状細胞で末梢血単核細胞を活性化し、そして
    活性化されたＰＢＭＣ細胞を患者に投与する、
    ことを含有してなる、ＭＵＣ−１腫瘍を患っているか、又はそれに罹患する恐れのある患者を治療する方法。
  68. 樹状細胞を配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列のいずれか一つに対して少なくとも約６０％の相同性を有する一つ以上のポリペプチドで処理する、請求項６７に記載の方法。
  69. 樹状細胞を配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に、少なくとも約８０％の相同性を有する一つ又はそれ以上のポリペプチドで処理する、請求項６７に記載の方法。
  70. 樹状細胞を配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に、少なくとも約９０％の相同性を有する一つ又はそれ以上のポリペプチドで処理する、請求項６７に記載の方法。
  71. 樹状細胞を配列番号１〜１９の何れかに示すアミノ酸配列に、少なくとも約９９．９％の相同性を有する一つ又はそれ以上のポリペプチドで処理する、請求項６７に記載の方法。
  72. 配列番号２０〜３７の何れかに示す単離された核酸分子の、細胞性免疫応答を生じさせるのに十分な治療有効量を投与することを含んで成る、ＭＵＣ−１腫瘍抗原に対する免疫応答を惹起させる方法。
  73. 単離された核酸分子が、配列番号２０〜３７の何れかに示すアミノ酸配列に、少なくとも約６０％の相同性を有するポリペプチドをコードする、請求項７２に記載の方法。
  74. 単離された核酸分子が、配列番号２０〜３７の何れかに示すアミノ酸配列に、少なくとも約８０％の相同性を有するポリペプチドをコードする、請求項７２に記載の方法。
  75. 単離核酸分子が、配列番号２０〜３７の何れかに示すアミノ酸配列に、少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードする、請求項７２に記載の方法。
  76. 単離された核酸分子が、配列番号２０〜３７の何れかに示すアミノ酸配列に、少なくとも約９９．９％の相同性を有するポリペプチドをコードする、請求項７２に記載の方法。
  77. 単離された核酸分子が、配列番号２０〜３７の何れかに示す配列を含有して成る、請求項７２に記載の方法。
  78. 単離された核酸分子が、配列番号１９の配列を含むベクターを含有して成る、請求項７２に記載の方法。
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