KR20170102002A - 에볼라 바이러스 백신접종을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20170102002A
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프랭크 알. 존스
엘리자베스 가비츠쉬
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이투빅스 코포레이션
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Abstract

동일한 아데노바이러스 벡터를 이용한 복수의 백신접종 및 아데노바이러스에 대한 기존 면역을 가진 개체에서 백신접종을 가능하게 하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법이 제공된다.

Description

에볼라 바이러스 백신접종을 위한 방법 및 조성물
상호참조
본 출원은 2015년 1월 9일에 출원된 미국 가출원 62/101,968에 대해 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
서열목록
본 출원은, ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었으며 그 전문이 인용에 의해 본원에 포함되는 서열 목록을 포함한다. 상기 ASCII 카피는 2016년 1월 25일에 생성되었으며, 39891-715.601_SL_SL.txt로 명명되고 크기는 166,679 바이트이다.
기술분야
본 발명은 에볼라 바이러스 백신접종을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
필로바이러스과의 구성원인 에볼라 바이러스는 인간 및 비인간 영장류에서 고 치사율의 유행성 출혈열의 발병과 연관이 있다. 분디부교(Bundibugyo) 에볼라바이러스, 자이르(Zaire) 에볼라바이러스 및 수단 에볼라바이러스는 모두 아프리카에서 대규모 발병과 연관이 있어 왔다. 서아프리카에서의 현재의 에볼라 발병의 심각성은, 의료에의 일상적인 접근을 갖지 않은 위험 집단에 대해, 많은 균주들을 커버하는 오래 지속되고 압축적인 에볼라 백신에 대한 의료 수요로 강조된다. 일부 재조합 아데노바이러스-기반 백신들이 단일 면역화 후 다수의 에볼라 균주들에 대항하여 양호한 보호를 부여하였지만, 인간에서 이들 백신의 효능은 상기 고찰된 바와 같이 아데노바이러스에 대한 기존 면역(pre-existing immunity)에 의해 종종 약화된다.
인간에서 강력한 T 세포 매개성 면역(CMI: cell-mediated immune) 반응을 유도하기 위해 반복적으로 사용되어 온 Ad5-기반 면역치료제들이 특히 흥미로우며, 이들 면역치료제들은 모두 폭넓은 안전성 프로파일을 유지한다. 또한, Ad5 벡터는 신뢰가능하게 대량 제조될 수 있고, 외래 환자 투여를 위한 저장 및 운반에 안정하다. 그렇긴 하지만, 1세대 (E1-결실된) Ad5-기반 벡터의 사용에 있어서 주요 걸림돌은 기존의 항-아데노바이러스 타입 5 중화 항체의 높은 빈도이다. 이들 항체는 이전의 야생형 아데노바이러스 감염 및/또는 Ad5-기반 백신을 사용한 반복된 주사에 의한 아데노바이러스 중화 항체의 유도로 인해, 잠재적인 백신 수용자에 존재할 수 있으며, 표적 EA에 대하여 부적절한 면역 자극을 초래할 수 있다.
아데노바이러스 벡터가 갖는 주요 문제점은 대체로, 면역-적격(competent) 피험체에서 아데노바이러스 벡터 및 바이러스성으로 형질도입된 세포를 제거하는 숙주 면역 반응으로 인해 장기적인 전이유전자 발현의 지속 불능이었다. 따라서, 1세대 아데노바이러스 벡터 백신의 사용은 아데노바이러스(Ad)에 대한 백신의 기존 면역 또는 유도 면역에 의해 심각하게 제한을 받는다(문헌[Yang, et al. J Virol 77/799-803 (2003); Casimiro, et al. J Virol 77/6305-6313 (2003)]). 한 그룹은, 다수의 인간들이, 유전자 전달 벡터를 위해 가장 광범위하게 사용되는 혈청형인 아데노바이러스 타입　5(Ad5)에 대한 항체를 가지고 있으며, 연구된 인간 중 2/3가 Ad에 대한 림프구-증식성 반응을 가지고 있음을 보고하였다(문헌[Chirmule, et al. Gene Ther 6/1574-1583 (1999)]). 또 다른 연구에서, HIV-1 외피 유전자를 운반하는 아데노바이러스 벡터 백신은 비-보조된(non-adjuvanted) DNA를 사용하여 프라이밍된(primed) 면역 반응을 재면역화할 수 없었다(문헌[Barouch, et al. J.　Virol 77/8729-8735 (2003)]). 또 다른 그룹은, Ad5를 사용한 단일 면역화로 인해 Ad5에 대하여 기존 면역을 가진 비-인간 영장류가 HIV 단백질에 대해 전이유전자-특이적인 항체를 생성할 수 없었으며, 뿐만 아니라 전반적인 T-세포 반응을 변경할 수도 없었음을 보고하였다(문헌[McCoy, et al. J.　Virol 81/6594-6604 (2007)]).
기존 면역이 아데노바이러스 벡터 백신을 방해하는 메커니즘들이 많이 존재하지만, 하나의 주요 관심사는 중화 항체의 존재, 및 Ad에 의해 감염된 항원을 가진 세포의 세포 매개 면역 제거이다. 이들 반응은 둘 다 몇몇 Ad 단백질에 관한 것일 수 있다. 하나의 접근법은 벡터 백신 용량을 증가시키는 것이다. 백신 용량의 증가가 Ad-면역 동물에서 요망되는 세포 매개 면역(CMI) 반응의 유도를 증가시킬 수 있다는 증거가 존재하긴 하지만(문헌[Barouch, et al. J.　Virol 77/8729-8735 (2003)]), 그로 인해 종종 동물 및 인간에서 허용 불가능한 부작용이 생기기도 한다. 1세대 Ad5 벡터 백신을 사용하는 경우, 하나의 옵션은 네이키드(비-벡터화된) DNA를 프라이밍 백신접종으로서 사용하고, 후속해서 Ad5 벡터 면역주사를 사용하는 이종성 프라임-부스트 처방(regimen)의 접근법을 사용하는 것일 수 있다. 이러한 프로토콜은, 당업자가, 동일한 바이러스 백본을 이용하는 동일한 (또는 상이한) 아데노바이러스 벡터 백신을 이용한 추가의 재면역주사(부스트)를 투여할 수 없도록 Ad5에 대한 후속적인 면역 반응을 초래할 수 있다. 따라서, 현재의 1세대 Ad5 벡터를 이용하는 이러한 접근법의 사용 또한, Ad5 면역화된 백신에서 Ad5 벡터 면역화의 임의의 추가 사용을 저지할 수 있다.
1세대 (E1-결실된) 아데노바이러스 벡터 백신은 Ad 후기 유전자를 야생형 Ad 바이러스보다 감소된 수준이긴 하지만 더 오랫동안 발현한다(문헌[Nevins, et al. Cell 26/213-220 (1981); Gaynor, et al. Cell 33/683-693 (1983); Yang, et al. J Virol 70/7209-7212 (1996)]). 면역화를 위해 1세대 아데노바이러스 벡터를 사용하는 경우, 백신 항원은 고도로 면역원성인 Ad 캡시드 단백질과 함께 동시에 면역 시스템에 제시된다. 이들 아데노바이러스 벡터가 가진 주요 문제점은, 발생된 면역 반응이 요망되는 백신 에피토프에 대한 것일 가능성이 낮고(문헌[McMichael, et al. Nat Rev Immunol 2/283-291 (2002)]), 아데노바이러스-유래 항원에 관한 것일 가능성이 높다는 점, 즉, 항원 경쟁적이라는 점이다. 1세대 아데노바이러스 벡터가 강력한 면역원이 되는 메커니즘에 대해서는 논란이 있다. Ad 캡시드의 조성물 또는 바이러스 유전자의 독성 효과가 전반적인 염증을 일으켜, 비특이적인 면역 자극 효과를 초래하는 것으로 가정되어 왔다. Ad의 E1 단백질은 감염 후 염증을 저해하는 작용을 한다(문헌[Schaack, et al. PNAS 101/3124-3129 (2004)]). 1세대 아데노바이러스 벡터에 대한 경우인 이들 단백질에 대한 유전자 분절의 제거는 염증 수준을 증가시킨다(문헌[Schaack, et al. PNAS 101/3124-3129 (2004); Schaack, et al. Viral Immunol 18/79-88 (2005)]).
따라서, 보다 효과적인 에볼라 백신 벡터 후보물질이 요망되고 있는 것이 분명하다. 장기적인 면역 반응, 복수의 백신접종, 및 Ad에 대한 기존 면역을 가진 개체에서의 백신접종을 허용하는 Ad 백신 벡터. 본 발명은 이러한 이점 및 다른 이점들을 제공한다.
본 발명은 표적 항원, 특히 에볼라 세포와 관련된 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위한 방법 및 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 이와 같이, 본 발명은 추가로, 하나 이상의 관심 표적 항원을 코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 제공한다. 이와 같이, 본 발명은 본원에 추가로 기재된 바와 같은 임의의 소스 유래의 표적 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 이러한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
항-Ad 면역을 극복하려는 시도는 대안적인 Ad 혈청형의 사용 및/또는 Ad5 바이러스 캡시드 단백질에서의 변경을 포함하였으며, 이들은 각각, 생성된 백신의 생체분포를 유의하게 변경시키는 데 있어서 제한된 성공률 및 잠재력을 가지고 있었다. 따라서, 완전히 신규 접근법은 기존의 Ad 면역의 표적인 것으로 알려진 단백질인, E1 결실된 Ad5 벡터로부터의 바이러스 단백질 발현을 더 감소시킴으로써 시도되었다. 구체적으로는, 신규 재조합 Ad5 플랫폼은 초기 1(E1) 유전자 영역에 결실이 존재하고, 초기 2b(E2b) 유전자 영역에 부가적인 결실이 존재하는 것(Ad5[E1-, E2b-])으로 기재되어 있다. (DNA 폴리머라제 및 전-말단(pre-terminal) 단백질을 코딩하는) E2b 영역이 결실되면, 바이러스 DNA 복제 및 후기 바이러스 단백질 발현이 감소한다. 이러한 벡터 플랫폼은 암 및 감염성 질환의 동물 모델에서 CMI 반응을 성공적으로 유도하는 것으로 이미 보고된 바 있으며, 보다 중요하게는, 이러한 재조합 Ad5 유전자 전달 플랫폼은 Ad5 면역의 장벽을 극복하고, 기존의 Ad 면역 및/또는 벡터-유도 Ad 면역의 설정에 사용되어, 백신의 복수의 동종 투여(homologous administration)를 가능하게 할 수 있다.
본 개시내용은 개체에서 하나 또는 다수의 에볼라 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 본 조성물은 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함(replication defective) 아데노바이러스 벡터를 포함하며, 여기서, 에볼라 바이러스 항원 코딩 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 70% 내지 100%의 서열 동일성을 가진다.
일 양태에서, 재조합 핵산 벡터를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서, 재조합 핵산 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하고; 인간에게 투여 시, 조성물은 상기 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있으며, 여기서, 면역 반응은 세포 매개성 면역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E2b 유전자 영역에 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원은 25개 이하의 아미노산의 변형을 포함한다.
일 양태에서, 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 서열을 포함하는 E2b 유전자 영역에 결실을 갖는 재조합 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서, 에볼라 바이러스 항원은 25개 이하의 아미노산의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원은 20개, 15개, 10개, 5개 또는 그 미만의 아미노산의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원은 2개, 3개 또는 4개 아미노산에서의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원은 1개 아미노산에서의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E1 유전자 영역에서의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E3 유전자 영역에서의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E4 유전자 영역에서의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스는 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV, RESTV 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 100%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 벡터는 형질감염된 세포에서 에볼라 바이러스 항원의 과발현을 일으킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산 벡터는 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대하여, 기준(basal)보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배 또는 25배 높은 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간은 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200을 초과하는 역(인버스)(inverse) Ad5 중화 항체 역가를 가진다. 일부 실시형태에서, 인간은 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 또는 4767을 초과하는 역의 Ad5 중화 항체 역가를 가진다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 중화 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 세포 매개성 면역(CMI)으로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IFN-γ 분비로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IL-2 분비로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응은 ELISspot 검정법에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원 특이적인 CMI는 106개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cells) 당 25개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개를 초과하는 IFN-γ 스폿 형성 세포(SFC: spot forming cells)이다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 감염 세포주 유래의 또는 자가(autologous) 에볼라 감염 세포 유래의 동종이계(allogeneic) 에볼라 바이러스 항원 발현 세포, CAP-1 펄스(pulsed) 항원 제시 세포의 T 세포 용해에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 면역원성 성분을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 성분은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 성분은 IL-7, IL-7을 코딩하는 핵산, IL-7에 대해 실질적인 동일성을 가진 단백질, 및 IL-7에 대해 실질적인 동일성을 가진 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 0.8 mL 내지 1.2 mL 범위의 부피의 치료 용액으로 이루어진 조성물을 포함하는 바이알(vial)이 제공되며, 이 치료 용액은 2.5x1011개 내지 7.5x1011개의 바이러스 입자를 포함하며; 여기서, 바이러스 입자는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함 아데노바이러스를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산 벡터는 형질감염된 세포에서 에볼라 바이러스 항원의 과발현을 일으킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 형질감염된 세포는 E.C7 세포이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스는, 인간에서 에볼라 바이러스 항원 발현 세포에 대해 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 중화 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 세포 매개성 면역(CMI)으로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IFN-γ 분비로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IL-2 분비로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응은 ELISspot 검정법에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원 특이적인 CMI는 106개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 당 25개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개를 초과하는 IFN-γ 스폿 형성 세포(SFC)이다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 감염 세포주 유래의 또는 자가 에볼라 감염 세포 유래의 동종이계 에볼라 바이러스 항원 발현 세포, CAP-1 펄스 항원 제시 세포의 T 세포 용해에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 치료 용액은 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 적어도 1.0x1011개, 1.5x1011개, 2.0x1011개, 2.5x1011개, 3.0x1011개, 3.5x1011개, 4.0x1011개, 4.5x1011개, 4.8x1011개, 4.9x1011개, 4.95x1011개 또는 4.99x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 용액은 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 최대 7.0x1011개, 6.5x1011개, 6.0x1011개, 5.5x1011개, 5.2x1011개, 5.1x1011개, 5.05x1011개 또는 5.01x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 용액은 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 1.0x1011개 내지 7.0x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 용액은 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 4.5x1011개 내지 5.5x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 용액은 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 4.8x1011개 내지 5.2x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 용액은 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 4.9x1011개 내지 5.1x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 용액은 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 4.95x1011개 내지 5.05x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 용액은 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 4.99x1011개 내지 5.01x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이알은 면역원성 성분을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 성분은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13의 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 성분은 IL-7, IL-7을 코딩하는 핵산, IL-7에 대해 실질적인 동일성을 가진 단백질, 및 IL-7에 대해 실질적인 동일성을 가진 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 인간에서 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법이 제공되며, 본 방법은 본원에 기재된 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 인간에서 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법이 제공되며, 본 방법은 본원에 기재된 바이알의 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 투여 단계는 적어도 1회 반복된다. 일부 실시형태에서, 투여 단계는 이전의 투여 단계 이후 약 3주 후에 반복된다. 일부 실시형태에서, 투여 단계는 이전의 투여 단계 이후 약 3개월 후에 반복된다. 일부 실시형태에서, 투여 단계는 2회 반복된다.
일 양태에서, 인간에서 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법이 제공되며, 본 방법은, 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 제1 치료기; 및 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 제2 치료기를 포함한다.
일 양태에서, 치료 방법이 제공되며, 본 방법은, 제1 치료기 및 제2 치료기를 선택하는 단계; 제1 치료기 동안, 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 총 n회 투여하는 단계; 및 제2 치료기 동안, 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간에게 총 m회 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, n은 1보다 크다. 일부 실시형태에서, n은 3이다. 일부 실시형태에서, m은 1보다 크다. 일부 실시형태에서, m은 3이다. 일부 실시형태에서, 제1 치료기는 적어도 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주이다. 일부 실시형태에서, 제2 치료기는 적어도 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월 또는 8개월이다. 일부 실시형태에서, 제2 치료기는 제1 치료기가 종료한 후 3주 내지 16주째에 시작한다. 일부 실시형태에서, 제1 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여는 적어도 18일의 간격을 둔다. 일부 실시형태에서, 제1 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여는 약 21일의 간격을 둔다. 일부 실시형태에서, 제1 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여는 최대 24일의 간격을 둔다. 일부 실시형태에서, 제2 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여는 적어도 10주의 간격을 둔다. 일부 실시형태에서, 제2 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여는 약 13주의 간격을 둔다. 일부 실시형태에서, 제2 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여는 최대 16주의 간격을 둔다.
일 양태에서, 치료 방법이 제공되며, 본 방법은, 제1 치료기 및 제2 치료기를 선택하는 단계; 제1 치료기 동안, 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 총 3회, 약 3주 간격으로 투여하는 단계; 및 제2 치료기 동안, 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 상기 인간에게 총 3회, 약 3개월 간격으로 투여하는 단계를 포함하며; 여기서, 제2 치료기는 제1 치료기의 종료 후 약 3개월째에 시작한다.
일부 실시형태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원은 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원은 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원과 상이하다. 일부 실시형태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터 및 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 60% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 60% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원은 25개 이하의 아미노산의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원은 20개, 15개, 10개 또는 5개 또는 그 미만의 아미노산의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원은 1개 아미노산의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E2b 유전자 영역에 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 추가로 E1 유전자 영역에 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 추가로 E3 유전자 영역에 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 추가로 E4 유전자 영역에 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E2b 유전자 영역에 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 추가로 E1 유전자 영역에 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 추가로 E3 유전자 영역에 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 추가로 E4 유전자 영역에 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다는 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 적어도 1.0x1011개, 1.5x1011개, 2.0x1011개, 2.5x1011개, 3.0x1011개, 3.5x1011개, 4.0x1011개, 4.5x1011개, 4.8x1011개, 4.9x1011개, 4.95x1011개 또는 4.99x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다는 바이러스 입자를 최대 7.0x1011개, 6.5x1011개, 6.0x1011개, 5.5x1011개, 5.2x1011개, 5.1x1011개, 5.05x1011개 또는 5.01x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다는 바이러스 입자를 1.0x1011개 내지 7.0x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다는 바이러스 입자를 4.5x1011개 내지 5.5x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다는 바이러스 입자를 4.8x1011개 내지 5.2x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다는 바이러스 입자를 4.9x1011개 내지 5.1x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다는 바이러스 입자를 4.95x1011개 내지 5.05x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다는 바이러스 입자를 4.99x1011개 내지 5.01x1011개 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응은 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배 또는 25배 증가한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 중화 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 세포 매개성 면역(CMI)으로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IFN-γ 분비로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IL-2 분비로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응은 ELISspot 검정법에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원 특이적인 CMI는 106개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 당 25개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개를 초과하는 IFN-γ 스폿 형성 세포(SFC)이다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 에볼라 감염 세포주 유래의 또는 자가 에볼라 감염 세포 유래의 동종이계 에볼라 바이러스 항원 발현 세포, CAP-1 펄스 항원 제시 세포의 T 세포 용해에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스는 인간에서 수지상 세포를 감염시키고, 여기서, 감염된 수지상 세포는 에볼라 바이러스 항원을 제시하여, 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 투여 단계는 피하 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간은 투여 단계 전에 50, 75, 100, 125, 150, 160, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300을 초과하는 역 Ad5 중화 항체 역가를 가진다. 일부 실시형태에서, 인간은 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 또는 4767을 초과하는 역 Ad5 중화 항체 역가를 가진다. 일부 실시형태에서, 인간은 스테로이드, 코르티코스테로이드, 면역억제제 및 면역요법 중 임의의 하나에 의한 치료를 동시에 받고 있지 않다. 일부 실시형태에서, 인간은 투여 단계 전에, 스테로이드, 코르티코스테로이드, 면역억제제 및 면역요법 중 임의의 하나에 의한 치료를 받은 적이 없다. 일부 실시형태에서, 인간은 자가면역 질환을 갖고 있지 않다. 일부 실시형태에서, 인간은 염증성 장질환, 전신 홍반성 루푸스, 강직성 척추염, 경피증, 다발성 경화증, 바이러스 간염 또는 HIV를 갖고 있지 않다. 일부 실시형태에서, 인간은 자가면역과 관련된 갑상선 질환 또는 백반증을 갖고 있다. 일부 실시형태에서, 인간은 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포를 갖고 있다. 일부 실시형태에서, 인간은 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포를 갖고 있지 않다. 일부 실시형태에서, 인간은 에볼라 바이러스 감염의 적어도 1개, 2개 또는 3개의 증상을 갖고 있다. 일부 실시형태에서, 인간은 투여 전에 치료(요법)를 받은 적이 있다. 일부 실시형태에서, 제1 치료기 이전에, 인간은 경구 또는 정맥내 유체를 이용한 재수화, 혈액 제제, 면역 치료제, 발열, 피로, 근육통, 두통 및 인후통, 구토, 설사, 발진, 신장 및 간 기능 장애, 및 내출혈 및 외출혈과 같은 특정의 증상에 대한 약물 또는 치료제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 약물치료를 제공받은 적이 있다. 일부 실시형태에서, 인간은 화학요법 또는 방사선요법 치료를 동시에 받는다. 일부 실시형태에서, 인간은 플루오로피리미딘, 이리노테칸(irinotecan), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 베바시주맙(bevacizunab), 카페시타빈(Capecitabine), 미토마이신(Mitomycin), 레고라페닙(Regorafenib), 세툭시맙(cetuxinab), 파니투무맙(panitumumab) 및 아세트아미노펜(acetinophen)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 약물의 투여를 포함하는 요법을 동시에 받는다. 일부 실시형태에서, 인간은 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포는 에볼라 바이러스 항원을, 비감염 세포에서의 에볼라 바이러스 항원의 기준선(baseline) 발현보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배 또는 20배 더 높이 과발현한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포는 에볼라 감염 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포는 면역 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포는 혈구를 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포는 상피 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 에볼라 바이러스 항원은 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV, RESTV 또는 이들의 임의의 조합에서 유래한 항원이다.
인용에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공개, 특허 또는 특허 출원이 인용에 의해 구체적으로 및 개별적으로 포함되는 것으로 지시된 것과 동일한 범위로 인용에 의해 본원에 포함된다.
도　1은 Ad5-널(null)(빈 벡터)을 사용하여 면역화한 마우스의 항체 수준을 보여주는 막대 그래프를 예시한 것이다. 마우스에게 14일 간격으로 Ad5-널 바이러스 입자(VP)를 3회 면역화하였다. 각각의 면역화 후 항-Ad 항체(중화 항체) 수준이 증가하였다.
도　2는 Ad5-널을 사용하여 면역화한 마우스의 중화 항체(NAb) 수준을 보여주는 막대 그래프를 예시한 것이다. 마우스에게 14일 간격으로 Ad5-널 VP를 3회 면역화하였다. 각각의 면역화 후 중화 항체 수준이 증가하였다. 광학 밀도 판독값은 생존가능한 표적 세포의 존재를 나타낸다.
도　3은 에볼라 바이러스 게놈의 하나의 구조를 예시한 것이다.
도　4는 Hela 세포에서 Ad5[E1-, E2b-] 벡터에 의한 후기 유전자 발현의 결여를 예시한 것이다. Hela 세포를 Ad5[E1-]-LacZ 벡터 또는 Ad5[E1-, E2b-]-LacZ 벡터를 사용하여 감염시켰다. 단백질 용해물을 수합하고, 66 kD 섬유 단백질을 웨스턴 블로팅에 의해 검출하였다. 양성 대조군으로서, 보완 세포주(complementing cell line)에서 성장된 Ad 바이러스의 생산적 감염(productive infection) 유래의 단백질 용해물 중 일부가 포함된다.
도　5는 백신접종된 마우스, 및 식염수 또는 Ad5-널을 주사한 대조군 마우스에서의 생존율을 예시한 것이다.
도　6은 백신접종된 마우스(상단) 또는 대조군 마우스(하단)를 예시한 것이다. 시도(challenge) 후, 백신접종된 마우스에서가 아니라 대조군 마우스에서의 폭넓은 염증에 주목한다.
도　7은, 혈구응집 저해(HAI) 역가가 Ad5[E1-, E2b-]-HA를 사용한 1회의 백신접종 후 Ad5-면역 원숭이에서 유도되었음을 예시한 것이다. HAI 활성이 면역화 후 14일째에 검출되었으며, 제28일까지 제14일째의 수준보다 유의하게 증가하였음에 주목한다(P<0.01). 평균 ± SEM.
도 8은 생성된 4개의 Ad5[E1-, E2b-]-EA 기반 백신을 예시한 것이다.
도　9는 Ad5[E1, Eb2-]-GPEZ을 사용하여 24시간 동안 감염시킨 E.C7 세포로부터의 에볼라 GP의 발현을 예시한 것이다(좌측 레인). 우측 레인(비감염 세포 유래의 용해물)에서가 아니라 좌측 레인에서 GP 단백질 밴드의 존재가 대략 125 kDA 이동하였음에 주목한다.
하기 단락들은 본 발명의 상이한 양태들을 보다 상세히 기재하고 있다. 본 발명의 각각의 양태는 명확히 다르게 지시되지 않는 한, 본 발명의 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 지시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 지시된 특징들 중 임의의 다른 특징과 조합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 다르게 지시되지 않는 한, 관사 "a"는 명쾌하게 다르게 제공되지 않는 한 하나 이상을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 다르게 지시되지 않는 한, "함유하다," "함유하는," "수반하다," "수반하는"과 같은 용어들은 "포함하는"을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 다르게 지시되지 않는 한, 용어 "또는"은 결합적이거나 분리적일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 다르게 지시되지 않는 한, 임의의 실시형태는 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있다.
Ad5[E1-, E2b-] 벡터가 항원 특이적인 면역 반응의 유도에 있어서 Ad5[E1-] 벡터보다 더 안전할 뿐만 아니라 우수한 것으로 보이며, 이로써 임상 반응을 초래할 수 있는 에볼라 백신을 전달하기 위한 플랫폼으로서 훨씬 더 적합한 것으로 발견되었다. 다른 경우, 면역 유도는 수개월이 소요될 수 있다. Ad5[E1-, E2b-] 벡터는 항원 특이적인 면역 반응의 유도에 있어서 Ad5[E1-] 벡터보다 더 안전할 뿐만 아니라 우수한 것으로 보이며, 이로써 임상 반응을 초래할 수 있는 에볼라 백신을 전달하기 위한 플랫폼으로서 훨씬 더 적합하다.
본 발명의 다양한 실시형태들은 에볼라에 대한 치료용 백신을 개발하려는 오랫동안 요망된 수요를 전달하는 데 있어서 새로운 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 시스템을 이용함으로써, 다른 Ad5 시스템에서 발견된 장벽을 극복하고, 이전에 Ad5에 노출된 적이 있는 사람의 면역화를 가능하게 한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 에볼라에 대한 치료용 백신을 개발하려는 오랫동안 요망된 수요를 전달하는 데 있어서 새로운 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 시스템을 이용함으로써, 다른 Ad5 시스템에서 발견된 장벽을 극복하고, 이전에 Ad5에 노출된 적이 있는 사람의 면역화를 가능하게 한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 에볼라에 대한 치료용 백신을 개발하려는 오랫동안 요망된 수요를 전달하는 데 있어서 새로운 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 시스템을 이용함으로써, 다른 Ad5 시스템에서 발견된 장벽을 극복하고, 이전에 Ad5에 노출된 적이 있는 사람의 면역화를 가능하게 한다.
"아데노바이러스"(Ad)는 아데노바이러스과 유래의 비-외피화된 DNA 바이러스를 지칭한다. 이들 바이러스는 인간, 조류, 소, 돼지 및 개 종에서 발견될 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 E2b 결실된 바이러스 벡터, 또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 결실을 함유하는 벡터를 기반으로 하는, 아데노바이러스과의 4개의 속(예, 조류아데노바이러스(Aviadenovirus), 포유류아데노바이러스(Mastadenovirus), 애트아데노바이러스(Atadenovirus) 및 시아데노바이러스(Siadenovirus)) 중 임의의 속 유래의 임의의 Ad의 사용을 고려한다. 또한, 몇몇 혈청형들이 각각의 종에서 발견된다. Ad는 또한, 이들 바이러스 혈청형들 중 임의의 혈청형의 유전적 유도체와 관련이 있으며, 이로는 유전적 돌연변이, 결실 또는 전이 등이 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다.
"헬퍼 아데노바이러스" 또는 "헬퍼 바이러스"는, 특정 숙주 세포는 할 수 없는 바이러스 기능을 공급할 수 있는 Ad를 지칭한다(숙주는 E1 단백질과 같은 Ad 유전자 생성물을 제공할 수 있음). 이 바이러스는 제2 바이러스 또는 헬퍼 의존적 바이러스(예, 거티드(gutted) 또는 거트리스(gutless) 바이러스, 또는 특정 영역, 예컨대 E2b 또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 영역이 결실된 바이러스)에 결여되어 있는 기능(예, 단백질)을 인 트랜스(in trans) 공급하는 데 사용되며; 제1 복제-무능 바이러스는 제2, 헬퍼 의존적 바이러스를 "도와" 세포에서 제2 바이러스 게놈의 생성을 허용하는 것으로 일컬어진다.
"아데노바이러스 5 널(Ad5-널)"은 발현을 위한 임의의 이종성 핵산 서열을 함유하지 않는 비-복제성 Ad를 지칭한다.
"1세대 아데노바이러스"는, 초기 영역 1(E1)이 결실된 Ad를 지칭한다. 부가적인 경우, 초기 영역 3(E3) 또한 결실될 수 있다.
"거티드" 또는 "거트리스"는 모든 바이러스 코딩 영역들이 결실된 Ad 벡터를 지칭한다.
"형질감염"은 진핵 세포 내로의 외래 핵산의 도입을 지칭한다. 예시적인 형질감염 수단으로는, 칼슘 포스페이트-DNA 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, 전기천공, 현미주사, 리포좀 융합, 리포펙션, 원형질 융합, 레트로바이러스 감염 및 유전자총(biolistics) 등이 있다.
"안정한 형질감염" 또는 "안정하게 형질감염된"은 형질감염된 세포의 게놈 내로의 외래 핵산, DNA 또는 RNA의 도입 및 통합을 지칭한다. 용어 "안정한 형질감염체"는 게놈 DNA 내에 안정하게 통합된 외래 DNA를 가진 세포를 지칭한다.
"리포터 유전자"는 리포터 분자(예, 효소)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. "리포터 분자"는 비제한적으로 효소-기반 검출 검정법(예, ELISA, 조직화학적 검정법), 형광 시스템, 방사성 시스템 및 발광 시스템 등을 포함한 여러 가지 검출 시스템들 중 임의의 검출 시스템에서 검출 가능하다. 이. 콜라이(E. coli) β-갈락토시다제 유전자, 녹색 형광 단백질(GFP), 인간 태반 알칼리 포스파타제 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자; 및 다른 리포터 유전자들이 이용될 수 있다.
"이종(성) 서열"은, 자연상에서는 연결되어 있지 않거나 또는 자연상에서는 상이한 위치에서 연결되어 있는 핵산 서열에 연결되어 있거나 또는 연결되도록 조작된 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 이종성 핵산은 자연 발생적 뉴클레오타이드 서열 또는 이러한 자연 발생적 서열에 대한 일부 변형을 포함할 수 있다.
"전이유전자(transgene)"는 피험체의 세포 또는 게놈 내에 도입된 자연적 또는 이종성 핵산 서열 또는 융합된 상동성 또는 이종성 핵산 서열인 임의의 유전자 코딩 영역을 지칭한다. 전이유전자는 피험체의 세포에 전이유전자를 도입하는 데 사용되는 임의의 바이러스 벡터 상에서 운반될 수 있다.
"2세대 아데노바이러스"는 E1, E2, E3, 및 소정의 실시형태에서는, E4 DNA 유전자 서열의 전부 또는 일부가 바이러스로부터 결실된(제거된) Ad를 지칭한다.
"피험체"는 비제한적으로 인간, 비-인간 영장류(예, 레수스(rhesus) 또는 다른 타입의 마카크(macaque)), 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 래트 및 가금류를 포함한 임의의 동물을 지칭한다.
"면역원성 단편"은, B-세포 및/또는 T-세포 표면 항원 수용체에 의해 특이적으로 인지(즉, 특이적으로 결합)되어 단편에 대해 특이적으로 면역 반응을 발생시키는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다.
"표적 항원" 또는 "표적 단백질"은 면역 반응이 유도되는 분자, 예컨대 단백질을 지칭한다.
"E2b 결실된"은 적어도 하나의 E2b 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능을 방지하는 방식으로 돌연변이화된 DNA 서열을 지칭한다. 따라서, 소정의 실시형태에서, "E2b 결실된"은 Ad 게놈으로부터 결실된(제거된) 특정한 DNA 서열과 관련되어 사용된다. E2b 결실된 또는 "E2b 영역 내에 결실을 함유하는"은 Ad 게놈의 E2b 영역 내에서의 적어도 하나의 염기쌍의 결실을 지칭한다. 따라서, 소정의 실시형태에서, 1개 초과의 염기쌍이 결실되고, 추가의 실시형태에서, 적어도 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개 또는 150개의 염기쌍이 결실된다. 또 다른 실시형태에서, 결실은 Ad 게놈의 E2b 영역 내에서의 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 250개 또는 300개 초과의 염기쌍의 결실이다. E2b 결실은 적어도 하나의 E2b 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능을 방지하는 결실일 수 있고, 따라서, E2b-특이적 단백질의 부분을 코딩하는 엑손 내에서의 결실뿐만 아니라 프로모터 및 리더 서열 내에서의 결실을 포함한다. 소정의 실시형태에서, E2b 결실은 E2b 영역의 DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질 중 하나 또는 둘 다의 발현 및/또는 기능을 방지하는 결실이다. 추가의 실시형태에서, "E2b 결실된"은, 하나 이상의 코딩된 단백질이 비-기능성이 되도록, Ad 게놈의 이러한 영역의 DNA 서열에서의 하나 이상의 점 돌연변이를 지칭한다. 이러한 돌연변이는 비기능성 단백질을 초래하는 아미노산 서열에서의 변화를 이끄는 상이한 잔기로 대체된 잔기를 포함한다.
"E1-결실된"은 적어도 하나의 E1 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능을 방지하는 방식으로 돌연변이화된 DNA 서열을 지칭한다. 따라서, 소정의 실시형태에서, "E1 결실된"은 Ad 게놈으로부터 결실된(제거된) 특정한 DNA 서열과 관련되어 사용된다. E1 결실된 또는 "E1 영역 내에 결실을 함유하는"은 Ad 게놈의 E1 영역 내에서의 적어도 하나의 염기쌍의 결실을 지칭한다. 따라서, 소정의 실시형태에서, 1개 초과의 염기쌍이 결실되고, 추가의 실시형태에서, 적어도 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개 또는 150개의 염기쌍이 결실된다. 또 다른 실시형태에서, 결실은 Ad 게놈의 E1 영역 내에서의 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 250개 또는 300개 초과의 염기쌍의 결실이다. E1 결실은 적어도 하나의 E1 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능을 방지하는 결실일 수 있고, 따라서, E1-특이적 단백질의 부분을 코딩하는 엑손 내에서의 결실뿐만 아니라 프로모터 및 리더 서열 내에서의 결실을 포함한다. 소정의 실시형태에서, E1 결실은 E1 영역의 트랜스-작용 전사 조절 인자 중 하나 또는 둘 다의 발현 및/또는 기능을 방지하는 결실이다. 추가의 실시형태에서, "E1 결실된"은, 하나 이상의 코딩된 단백질이 비-기능성이 되도록, Ad 게놈의 이러한 영역의 DNA 서열에서의 하나 이상의 점 돌연변이를 지칭한다. 이러한 돌연변이는 비기능성 단백질을 초래하는 아미노산 서열에서의 변화를 이끄는 상이한 잔기로 대체된 잔기를 포함한다.
"면역 반응을 발생시키는" 또는 "면역 반응을 유도하는"은 하나 이상의 면역 세포(T-세포, B-세포, 항원-제시 세포, 수지상 세포, 호중구 등)의 수 또는 이들 면역 세포 중 하나 이상의 활성(CTL 활성, HTL 활성, 사이토카인 분비, 사이토카인 분비의 프로파일의 변화 등)에서의 통계학적으로 유의한 변화, 예를 들어 증가 또는 감소를 지칭한다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본원에서 본질적으로 상호호환적으로 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA(예, 게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는, 인트론을 함유하고 DNA 분자와 1-대-1 방식으로 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자일 수 있다. 부가적인 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있긴 하지만 그럴 필요는 없으며, 폴리뉴클레오타이드가 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있긴 하지만 그럴 필요는 없다. 본원에 사용된 바와 같이, 단리된 폴리뉴클레오타이드는, 폴리뉴클레오타이드가 다른 코딩 서열로부터 실질적으로 분리됨을 의미한다. 예를 들어 본원에 사용된 바와 같이, 단리된 DNA 분자는 관련이 없는 코딩 DNA, 예컨대 크기가 큰 염색체 단편 또는 다른 기능성 유전자 또는 폴리펩타이드 코딩 영역의 큰 부분들을 함유하지 않는다. 이는 본래 단리된 대로의 DNA 분자를 지칭하고, 이후에 실험실에서 재조합에 의해 분절에 첨가된 유전자 또는 코딩 영역을 배제하지 않는다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같이 표적 항원, 항원 단편, 펩타이드 등을 발현하거나 또는 발현하도록 개조될 수 있는 게놈 서열, 게놈-외 서열 및 플라스미드-코딩된 서열 및 더 작은 조작된 유전자 분절을 포함할 수 있다. 이러한 분절은 자연적으로 단리되거나, 합성에 의해 인위적으로 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열을 비교할 때, 하기 기재된 바와 같이 2개의 서열 내의 뉴클레오타이드 서열이 최대 상응을 위해 정렬되었을 때 동일하다면 이 2개의 서열들은 "동일"하다. 2개 서열들 사이의 비교는 전형적으로, 비교 창에 걸쳐 서열들을 동일성에 대해 비교함으로써 수행되고, 서열 유사성의 로컬 영역들을 비교한다. 본원에 사용된 바와 같이, "비교 창"은 적어도 약 20개, 통상 30개 내지 약 75개, 40개 내지 약 50개의 연속적인(contiguous) 위치들로 된 분절을 지칭하며, 이러한 비교 창에서, 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후, 서열이, 동일한 수의 연속적인 위치들로 된 참조 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하여 Lasergene 스위트 오브 바이오인포매틱스 소프트웨어(DNASTAR, Inc., 위스콘신주 매디슨)에서 Megalign 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 몇몇 정렬안을 구현한다.
대안적으로, 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌[Smith and Waterman, Add. APL. Math 2:482 (1981)]의 로컬 동일성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, J.　Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 동일성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA)의 컴퓨터화된 실행에 의해, 또는 조사에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성% 및 서열 유사성%를 확인하는 데 적합한 알고리즘의 일례는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들어 본원에 기재된 파라미터들과 함께 사용되어, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 대한 서열 동일성%를 확인할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터를 통해 공개적으로 입수 가능하다. 하나의 예시적인 예에서, 누적 점수는 뉴클레오타이드 서열에 대해, 파라미터 M(매칭 잔기 쌍에 대한 보상 점수(reward score); 항상 0 초과) 및 파라미터 N(미스매칭 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 0 미만)을 사용하여 계산될 수 있다. 각각의 방향에서의 워드 히트(word hit)의 연장은, 누적 정렬 점수가 이의 최대로 달성된 값으로부터 X 양만큼 하락할 때; 하나 이상의 음성-점수화 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하로 될 때; 또는 어느 서열이든지 이의 말단에 도달할 때, 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 워드 길이(W) 및 10의 예상값(E)을 사용하고, BLOSUM62 점수화 매트릭스 정렬은 50의 (B), 10의 예상값(E), M=5, N=-4 및 2개 가닥들의 비교를 사용한다.
"서열 동일성%"는 적어도 20개 위치들의 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 확인될 수 있으며, 여기서, 비교 창 내의 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분은, 2개 서열의 최적 정렬을 위한 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여, 20% 이하, 통상 5% 내지 15%, 또는 10% 내지 12%의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 퍼센트는, 2개 서열에서 동일한 핵산 염기들이 존재하는 위치의 수를 확인하여 매칭된 위치의 수를 수득하고, 이 매칭된 위치의 수를 참조 서열 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱해서 서열 동일성%를 수득한다.
당업자는, 유전자 코드의 축퇴 결과, 본원에 기재된 바와 같이 관심 특정 항원 또는 이의 단편을 코딩하는 많은 뉴클레오타이드 서열들이 존재함을 이해할 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 최소의 상동성을 가진다. 그렇긴 하지만, 코돈 사용빈도에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 의해 구체적으로 고려된다. 나아가, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립 유전자는 본 발명의 범위 내에 존재한다. 대립 유전자는 뉴클레오타이드의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 첨가 및/또는 치환의 결과 변경되는 내인성 유전자이다. 생성되는 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만 그럴 필요는 없다. 대립 유전자는 표준 기술(예, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 동정될 수 있다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해하게 될 바와 같이, Ad 게놈의 다른 영역이 결실될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, Ad 게놈의 특정 영역에서 "결실된"다는 것은 해당 영역에 의해 코딩되는 적어도 하나의 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능을 방지하는 방식으로 돌연변이화된 특정한 DNA 서열을 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 특정 영역에서 "결실된"다는 것은 해당 영역에 의해 코딩되는 발현 및/또는 기능(예, DNA 폴리머라제의 E2b 기능 또는 전-말단 단백질 기능)을 방지하는 방식으로 Ad 게놈으로부터 결실된(제거된) 특정한 DNA 서열을 지칭한다. 특정 영역 내에서 "결실된" 또는 "결실을 함유하는"은 Ad 게놈의 해당 영역 내에서의 적어도 하나의 염기쌍의 결실을 지칭한다. 따라서, 소정의 실시형태에서, 1개 초과의 염기쌍이 결실되고, 추가의 실시형태에서, 적어도 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개 또는 150개의 염기쌍이 특정 영역으로부터 결실된다. 또 다른 실시형태에서, 결실은 Ad 게놈의 특정 영역 내에서의 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 250개 또는 300개 초과의 염기쌍의 결실이다. 이들 결실은 그 영역에 의해 코딩되는 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능이 방지되도록 하는 결실이다. 따라서, 결실은 단백질의 부분을 코딩하는 엑손 내에서의 결실뿐만 아니라 프로모터 및 리더 서열 내에서의 결실을 포함한다. 추가의 실시형태에서, Ad 게놈의 특정 영역에서 "결실된"은, 하나 이상의 코딩된 단백질이 비-기능성이 되도록, Ad 게놈의 이러한 영역의 DNA 서열에서의 하나 이상의 점 돌연변이를 지칭한다. 이러한 돌연변이는 비기능성 단백질을 초래하는 아미노산 서열에서의 변화를 이끄는 상이한 잔기로 대체된 잔기를 포함한다. Ad 게놈에서의 결실 또는 돌연변이는 E1a, E1b, E2a, E2b, E3, E4, L1, L2, L3, L4, L5, TP, POL, IV 및 VA 영역 중 하나 이상 내에 존재할 수 있다. 본 발명의 결실된 아데노바이러스 벡터는 재조합 기술을 사용하여 발생될 수 있다.
당업자가 인지하게 될 바와 같이, 본 발명에 사용되기 위한 아데노바이러스 벡터는, E2b 유전자 생성물 및 결실되었을 수 있는 필수적인 유전자들 중 임의의 유전자의 생성물을 구성적으로 발현하는 적절한 패키징 세포주를 사용하여 높은 역가까지 성공적으로 성장될 수 있다. 소정의 실시형태에서, E1 및 DNA 폴리머라제 단백질뿐만 아니라 Ad-전-말단 단백질을 구성적으로 발현하는 HEK-293-유래의 세포가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 높은 역가 스톡(stock)의 아데노바이러스 벡터를 성공적으로 성장시키는 데 E.C7 세포가 사용된다.
자가-증식성 아데노바이러스 벡터로부터 중요한 유전자를 결실시키기 위해, 표적화된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 우선 HEK-293 세포에서 공동발현될 수 있거나 유사하게는 E1 단백질과 함께 공동발현될 수 있다. 예를 들어, 구성적으로 공동발현될 때 무독성인 단백질(또는 유도적으로-발현되는 독성 단백질)만이 선택적으로 이용될 수 있다. HEK-293 세포에서 E1 및 E4 유전자의 공동발현이 가능하다. E1 및 단백질 IX 유전자, 비리온 구조 단백질이 공동발현될 수 있다. E1, E4 및 단백질 IX 유전자의 추가의 공동발현이 또한, 가능하다. E1 및 100 k 유전자가 트랜스보완(transcomplementing) 세포주에서 성공적으로 발현될 수 있으며, E1 및 프로테아제 유전자가 또한 그럴 수 있다.
E2b 결실된 Ad 입자를 높은 역가로 성장시키는 데 사용되기 위한 E1 및 E2b 유전자 생성물을 공동발현하는 세포주가 기재되어 있다. E2b 영역은 Ad 게놈 복제에 필수적인 바이러스 복제 단백질을 코딩한다. 유용한 세포주는 대략 140 kDa Ad-DNA 폴리머라제 및/또는 대략 90 kDa 전-말단 단백질을 구성적으로 발현한다. 특히, 독성 없이 E1, DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질의 높은-수준의 구성적 공동발현을 가진 세포주(예, E.C7)가, 복수의 백신접종에 사용되기 위한 Ad를 증식시키는 데 사용되기에 바람직하다. 이들 세포주는 E1, DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질에 대해 결실된 아데노바이러스 벡터의 증식을 가능하게 한다.
바이러스 운반 시스템에 대한 추가의 정보는 문헌[Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990]; 미국 특허 4,603,112, 4,769,330 및 5,017,487; WO 89/01973; 미국 특허 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; 문헌[Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; 및 Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993]에서 찾을 수 있다.
이종성 핵산
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 전형적으로, 하나 이상의 관심 표적 항원, 또는 이의 변이체, 단편 또는 융합체를 코딩하는 변형된 핵산 서열 또는 이종성 핵산 서열을 포함하며, 이에 대해 면역 반응을 발생시키는 것이 바람직하다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는, 하나 이상의 단백질, 이의 변이체, 이의 융합체 또는 이의 단편을 코딩하며 면역 반응을 조정할 수 있는 변형된 핵산 서열 또는 이종성 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시형태에서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 특정한 항원, 예컨대 탄저병 보호 항원에 대한 하나 이상의 항체를 코딩하여, 수동적인 면역요법을 가능하게 한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 치료 효과(예, 항-바이러스, 항균, 항-기생충 또는 항-에볼라 기능)를 가진 하나 이상의 단백질을 코딩하는 변형된 핵산 서열 또는 이종성 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 이종성 핵산 서열을 포함하는 2세대 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 이종성 변형된 또는 핵산 서열은 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 이종성 변형된 또는 핵산 서열은 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이들의 조합의 조합 또는 융합이다. 일부 실시형태에서, 이종성 변형된 또는 핵산 서열은 BOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이들의 조합의 조합 또는 융합이다.
특히, 본 발명은, 하나 이상의 항원 표적 엔티티에 대한 복수의 백신접종이 달성될 수 있도록 개선된 아데노바이러스(Ad)-기반 백신을 제공한다. 일부 실시형태에서, 개선된 아데노바이러스(Ad)-기반 백신은 표적 항원, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 운반하는 복제 결함 아데노바이러스, 예컨대 Ad5[E1-, E2b-]-서열 번호1, Ad5[E1-, E2b-]-서열 번호2, Ad5[E1-, E2b-]-서열 번호4, Ad5[E1-, E2b-]-서열 번호5, Ad5[E1-, E2b-]-서열 번호6을 포함한다. 일부 실시형태에서, 개선된 아데노바이러스(Ad)-기반 백신은 표적 항원, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 운반하는 복제 결함 아데노바이러스, 예컨대 Ad5[E1-, E2b-]-GP, Ad5[E1-, E2b-]-NP, Ad5[E1-, E2b-]-VP40, Ad5[E1-, E2b-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30 및 Ad5[E1-, E2b-]-VP24를 포함한다. 표적 항원, 예를 들어 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원의 변이체 및/또는 단편, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30 또는 VP24는 면역원성 잠재성을 포함한 여러 가지 인자들을 기반으로 선택될 수 있다. 이에, 본 발명의 다양한 실시형태들에서, EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원의 돌연변이체, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30 또는 VP24 항원의 돌연변이체가 야생형 형태와 비교하여 면역 반응을 상승시키는 능력의 증가를 위해 이용된다. 중요하게는, 백신접종은 Ad에 대한 기존 면역의 존재 하에 수행되고/거나 본 발명의 아데노바이러스 벡터 또는 다른 아데노바이러스 벡터를 사용하여 이미 수회 면역화된 피험체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터는, 예를 들어 비제한적으로 본원에 기재된 바와 같고 GenBank에서 공개적으로 입수 가능한 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV의 하나 이상의 표적 항원, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30 또는 VP24 및/또는 하나 이상의 에볼라 바이러스 균주에 대한 항체의 생성 및 세포 매개성 면역 반응을 포함하여, 관심 항원, 예를 들어 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30 또는 VP24에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 피험체에게 수회 투여될 수 있다.
면역원성 폴리펩타이드는 에볼라 자이르(GenBank: KJ660347.2) 유래의 RNA 서열 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 면역원성 폴리펩타이드에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 동일성을 가진 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역원성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호1의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호1에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 동일성을 갖는 서열, 또는 인간 게놈에 대해 최적화된 대안적인 코돈 대체에 의해 서열 번호1로부터 발생된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩된 면역원성 폴리펩타이드는 야생형 GenBank 서열(자이르 KJ660347)과 비교하여 최대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개 또는 그 이상의 점 돌연변이, 예컨대 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역원성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호2에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 동일성을 갖는 서열, 또는 인간 게놈에 대해 최적화된 대안적인 코돈 대체에 의해 서열 번호2로부터 발생된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩된 면역원성 폴리펩타이드는 야생형 GenBank 서열(수단 KC545392.1)과 비교하여 최대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개 또는 그 이상의 점 돌연변이, 예컨대 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역원성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호4에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 동일성을 갖는 서열, 또는 인간 게놈에 대해 최적화된 대안적인 코돈 대체에 의해 서열 번호4로부터 발생된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩된 면역원성 폴리펩타이드는 야생형 GenBank 서열(타이 포레스트 NC_014372.1)과 비교하여 최대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개 또는 그 이상의 점 돌연변이, 예컨대 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역원성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호5의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 동일성을 갖는 서열, 또는 인간 게놈에 대해 최적화된 대안적인 코돈 대체에 의해 서열 번호5로부터 발생된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩된 면역원성 폴리펩타이드는 야생형 NCBI 서열 분디부교 에볼라바이러스(NC_014373.1)과 비교하여 최대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개 또는 그 이상의 점 돌연변이, 예컨대 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역원성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호6의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 동일성을 갖는 서열, 또는 인간 게놈에 대해 최적화된 대안적인 코돈 대체에 의해 서열 번호6으로부터 발생된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩된 면역원성 폴리펩타이드는 야생형 레스톤(Reston) 에볼라바이러스(GenBank: JX477166.1)와 비교하여 최대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개 또는 그 이상의 점 돌연변이, 예컨대 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 본원에 기재된 아데노바이러스-유래 벡터는 E2b 영역, 및 선택적으로 E1 영역에 결실을 갖고 있으며, 이러한 결실은 본원에 기재된 바와 같은 면역요법에서 벡터의 사용에 여러 가지 이점들을 부여한다.
아데노바이러스 게놈 내의 소정의 영역은 필수적인 기능을 수행하고, 본 발명의 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 구축할 때 실질적으로 보존될 필요가 있을 수 있다(문헌[Lauer et al., J. Gen. Virology, 85, 2615-2625 (2004)); Leza et al., J. Virology, pp. 3003-3013 (1988); 및 Miralles et al., JBC. Vol. 264, No. 18, pp. 10763-10772 (1983)] 참조).
1세대, E1-결실된 아데노바이러스 서브타입 5(Ad5)-기반 벡터가 백신으로서 사용되기 위한 플랫폼을 약속하긴 하지만, 이는 자연 발생적 또는 유도된 Ad-특이적 중화 항체에 의해 활성에 있어서 방해를 받는다. E1 및 E2b 영역이 결실된 Ad5-기반 벡터(Ad5[E1-, E2b-])는 후기 바이러스 단백질 발현의 감소로 인해, Ad-면역 숙주에서 코딩된 항원 전이유전자에 대한 면역학적 제거를 피하고 보다 강력한 면역 반응을 유도하는 기회를 제공하며, 상기 E2b 영역은 DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질을 코딩한다.
에볼라 항원을 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-]-EA를 사용한 다수의 상동성 면역화가 본 발명에 따라 사용되어, 기존의 Ad5-중화 항체 또는 유도된 Ad5-중화 항체의 존재 하에도 불구하고 마우스에서 항-에볼라 활성을 가진 EA-특이적 세포 매개성 면역(CMI) 반응을 유도할 수 있다. 에볼라 환자의 코호트는 증가하는 용량의 Ad5[E1-, E2b-]-EA를 사용하여 면역화될 수 있다. EA-특이적 CMI 반응이 많은 환자 또는 대부분의 환자에서 기존의 Ad5 면역의 존재에도 불구하고 관찰될 수 있다. 중요하게는, 최소의 독성 및 전반적인 환자 생존율은 기존의 Ad5 중화 항체 역가와 무관하게 유사할 수 있다. 에볼라 감염된 피험체에서, 신규 Ad5[E1-, E2b-] 유전자 전달 플랫폼은 자연적으로 획득된 Ad5 특이적인 면역 및 면역화-유도된 Ad5 특이적인 면역 둘 다의 설정에서 에볼라 항원에 대한 유의한 CMI 반응을 발생시키는 데 사용될 수 있다. 에볼라 항원 특이적인 CMI는 예를 들어, 106개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 당 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10000개 또는 그 이상의 수를 초과하는 IFN-γ 스폿 형성 세포(SFC)일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 재조합 핵산 벡터에 관한 것이며, 여기서, 재조합 핵산 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하고, 인간에게 투여 시, 조성물은 상기 인간에서 에볼라 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 면역 반응은 Ad5에 대한 기존 면역의 존재 하에서도 유도될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 1000, 12000, 15000 또는 그 이상의 수를 초과하는 기존의 역 Ad5 중화 항체 역가를 가진 인간 피험체에서 상승된다. 면역 반응은 본원에 기재된 바와 같이 세포 매개성 면역 및/또는 체액성 면역을 포함할 수 있다. 면역 반응은 세포내 사이토카인 염색(ICS), ELISPOT, 증식 검정법, 크롬 방출을 포함한 세포독성 T 세포 검정법 또는 동등한 검정법, 및 임의의 수의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 유전자 발현 분석 또는 RT-PCR 기반 검정법뿐만 아니라 당업계에서 면역 반응을 측정하기 위한 것으로 알려진 임의의 다른 적합한 검정법 중 하나 이상에 의해 본원에 기재된 바와 같이 그리고 이러한 방법들이 당업자에게 이용 가능한 범위로 측정될 수 있다.
에볼라-연관된 항원(EA)을 전달함으로써 달성되는 에볼라 면역요법이 일부 생존 이점을 제공하긴 하지만, 이들 전략에 대한 한계들이 존재하고, 보다 면역학적으로 강력한 백신이 요망된다. 낮은 면역원성을 해결하기 위해, 보조제와 면역 자극 사이토카인의 공동-투여를 포함한 여러 가지 진보된, 다성분 백신접종 전략들이 제공된다. 본 발명은, 선천성 염증촉진 신호를 본래 제공하면서도 관심 항원을 발현하도록 동시에 조작된 재조합 바이러스 벡터에 관한 것이다. 특히, 강력한 T 세포 매개성 면역(CMI) 반응을 유도하기 위해 인간에서 반복적으로 사용되어 온 아데노바이러스 혈청형-5(Ad5)-기반 면역치료제가 관심이 있으며, 이들은 모두 폭넓은 안전성 프로파일을 유지한다. 또한, Ad5 벡터는 다량으로 신뢰 가능하게 제조될 수 있으며, 외래 환자 투여를 위해 저장 및 운반에 안정하다. 그렇긴 하지만, 1세대(E1-결실된) Ad5-기반 벡터의 사용에 있어 주요한 장애물은 기존의 항-아데노바이러스 타입 5 중화 항체의 높은 빈도이다. 이들 항체는, 이전의 야생형 아데노바이러스 감염 및/또는 Ad5-기반 백신의 반복된 주사에 의한 아데노바이러스 중화 항체의 유도로 인해 잠재적인 백신에 존재할 수 있으며, 각각은 표적 EA에 대하여 부적절한 면역 자극을 초래할 수 있다.
본 발명은 T 세포 반응을 증강시키는 변형을 가진 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원에 대한 유전자 삽입물을 함유하는 Ad5[E1-, E2b-] 플랫폼을 제공하며, 본 발명의 다양한 실시형태들에서 적어도 하나의 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원에 대한 면역 반응을 상승시키는 요법에 사용된다. 이러한 Ad5 플랫폼을 사용한 복수의 면역화는 마우스에서 기존의 Ad5 면역의 존재에도 불구하고 항-에볼라 활성을 가진 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원 특이적인 CMI 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, Ad5[E1-, E2B-]는 서열 번호1, 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호5, 서열 번호6 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ad5[E1-, E2B-]는 GenBank로부터의 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ad5[E1-, E2B-]는 GenBank 또는 NCBI로부터의 인간 단리물 유래의 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원 코딩 서열의 아종을 포함한다. 본원에 제공된 바와 같이 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 면역요법의 I/II상 임상 시험은 안전성을 나타낼 것이고, 인간 CMI에서 면역원성이 기존의 Ad5-면역의 존재와 비교하여 임상 결과에 대한 실질적인 영향 없이 유도될 수 있는 것으로 고려된다.
면역 반응에 대한 표적으로서의 EBOV
에볼라 바이러스(EBOV)는 필로바이러스과의 구성원이다. 이의 게놈은 크기가 대략 19-kb인 단일-가닥 RNA 분자를 포함한다. 에볼라 비리온은 목양 지팡이, "U"자 또는 "6"자 모양으로 보일 수 있고 코일형, 환상체 또는 분지형일 수 있는 필라멘트성 입자이다. 일반적으로, 에볼라 비리온은 폭이 80 나노미터(nm)이고, 길이가 14,000 nm일 수 있다. EBOV는 상이한 병원성 수준에 따라 적어도 5개의 구별되는 종으로 하위구분될 수 있다. 5개의 상이한 에볼라바이러스(BDBV, EBOV, RESTV, SUDV 및 TAFV)의 게놈은 서열이 상이하고, 유전자의 수 및 위치가 중복된다.
에볼라 바이러스는 바이러스에게 이의 특징적인 명칭을 부여하고, 외피화되며, 비-분절화되고, 음성 가닥 RNA 및 다양한 모양을 가진 필라멘트성 입자를 나타낸다. 에볼라 바이러스 게놈은 7개의 유전자, 핵단백질(NP), 비리온 단백질(VP) 35, VP40, 당단백질(GP), VP30, VP24 및 RNA-의존적 RNA 폴리머라제(L)를 함유한다. GP를 제외한, 모든 유전자들은 모노시스트론이고, 하나의 구조 단백질을 코딩한다. 바이러스의 내부 리보핵단백질 복합체는 NP에 의해 캡슐화된 RNA 게놈을 함유하고, VP35, VP30 및 RNA-의존적 RNA 폴리머라제와 결합하여 기능성 전사효소-레플리카제 복합체로 된다. 리보핵단백질 복합체의 단백질은 인터페론 길항제인 VP35와 같은 부가적인 기능을 가진다. VP40은 기질 단백질이고 바이러스 입자 형성을 매개한다. VP24는 막과 연관된(associated) 또 다른 구조 단백질이고 인터페론 신호전달을 방해한다. GP는 유일한 막관통 표면 단백질이고, 2개의 이황화 연결된 퓨린-절단 단편인 GP-1 및 GP-2로 이루어진 삼량체 스파이크(spike)를 형성한다. 다른 모노네가바이러스(Mononegavirales)와 비교하여 에볼라 바이러스의 중요한 특징은 감염된 세포 밖으로 분비되는 (GP 유전자 유래의) 용해성 GP의 생성이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 BDBV 유래의 적어도 하나의 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 EBOV 유래의 적어도 하나의 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 RESTV 유래의 적어도 하나의 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 SUDV 유래의 적어도 하나의 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 TAFV 유래의 적어도 하나의 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 GenBank 및 NCBI에 기재된 에볼라 바이러스 유래의 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 에볼라 균주, 예를 들어 BDBV, EBOV, RESTV, SUDV 및 TAFV, 및 GenBank 및 NCBI에 기재된 바와 같은 다른 것들의 조합 유래의 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다.
다른 필로바이러스의 비리온과 같은 에볼라 비리온은 7개의 단백질(도 3 참조): 표면 당단백질(GP), 핵단백질(NP), 4개의 비리온 구조 단백질(VP40, VP35, VP30 및 VP24) 및 RNA-의존적 RNA 폴리머라제(L)를 함유할 수 있다.
에볼라 바이러스의 당단백질은 2개의 오픈 리딩 프레임에서 코딩되는 점에서 특이하다. 전사 편집은 비리온 내에 혼입된 막관통 형태를 발현하는 데 필요하다. 비편집된 형태는 감염 과정 동안 초기에 다량으로 합성되는 비구조적 분비 당단백질(sGP)을 생성한다. 일부 경우, 코딩된 단백질은 번역 후 절단되어, 바이러스 입자의 표면 상에 놓이는 성숙한 분비 형태뿐만 아니라 당-코팅된 더 작은 부분을 생성한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 에볼라 비리온의 당단백질(GP) 유래의 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 에볼라 비리온의 핵단백질(NP) 유래의 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 에볼라 비리온의 4개의 비리온 구조 단백질(VP40, VP35, VP30 및 VP24) 중 적어도 하나로부터 유래하는 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 예를 들어, 재조합 벡터는 적어도 하나의 에볼라 비리온의 VP40 유래의 표적 바이러스 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 벡터는 적어도 하나의 에볼라 비리온의 VP35 유래의 표적 바이러스 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 벡터는 적어도 하나의 에볼라 비리온의 VP30 유래의 표적 바이러스 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 벡터는 적어도 하나의 에볼라 비리온의 VP24 유래의 표적 바이러스 항원을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 에볼라 비리온의 L 단백질 유래의 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다.
에볼라 라이프 사이클은 비리온이 숙주 세포와 접촉 시 시작하는 것으로 생각된다. 구조 당단백질(GP1,2로 알려져 있음)은 표적화된 세포에 결합하고 이를 감염시키는 바이러스의 능력에 책임이 있다. 비리온은 숙주 세포 상의 특이적인 세포-표면 수용체, 예를 들어, C-타입 렉틴, DC-SIGN 또는 인테그린에 부착되고, 후속해서, 바이러스 외피가 숙주 세포의 세포막과 융합하는 것으로 생각된다. 비리온이 숙주 세포에 의해 취해진 후, 비리온은 산성 엔도좀 및 리소좀으로 이동하고, 그곳에서 바이러스 외피 당단백질 GP가 절단된다.
L 유전자에 의해 코딩된 바이러스 RNA 폴리머라제는 뉴클레오캡시드를 부분적으로 언코트하고, 유전자를 양성-가닥 mRNA로 전사시키며, 그런 다음 mRNA는 비리온을 포함하는 구조 단백질 및 비구조 단백질로 번역된다. 생성되는 가장 풍부한 단백질은 핵단백질이고, 숙주 세포에서의 이의 농도는 L이 유전자 전사로부터 게놈 복제로 스위치할 때 확인된다. 바이러스 게놈의 복제를 통해 전장 양성-가닥 안티게놈(antigenome)이 생성되고, 이는 다시 음성-가닥 바이러스 자손의 게놈 복사물로 전사된다. 새로 합성된 구조 단백질 및 게놈은 자가-조립하고 세포막 내부 근처에 축적된다. 비리온은 숙주 세포로부터 출아되어, 이것이 출아되는 세포막으로부터 이의 외피를 얻는다. 그런 다음, 성숙한 바이러스 자손 입자는 다른 세포를 감염시켜, 사이클을 반복한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 에볼라 비리온의 L 유전자 유래의 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 에볼라 비리온의 핵단백질의 생성을 저해하는 표적 바이러스를 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 에볼라 비리온의 게놈 복제를 저해하는 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 에볼라 비리온의 출아 과정을 저해하는 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 에볼라 비리온의 감염 과정을 저해하는 표적 바이러스 항원을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 재조합 벡터를 제공한다.
다양한 실시형태들에서, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호1, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호2, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호4, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호5, 및/또는 Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호6은 수지상 세포에 형질도입되는 능력을 증가시켜, Ad5[E1-, E2b-] 벡터 바이러스 단백질에 대한 감소된 염증 반응 및 결과적으로 기존의 Ad 면역의 회피를 이용함으로써 백신에서 항원 특이적인 면역 반응을 개선한다.
예를 들어, Ad5[E1-, E2B-]-GP, Ad5[E1-, E2B-]-NP, Ad5[E1-, E2B-]-VP40, Ad5[E1-, E2B-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30, [E1-, E2b-]-VP24, 및/또는 [E1-, E2b-]-L은 수지상 세포에 형질도입되는 능력을 증가시켜, Ad5[E1-, E2b-] 벡터 바이러스 단백질에 대한 감소된 염증 반응 및 결과적으로 기존의 Ad 면역의 회피를 이용함으로써 백신에서 항원 특이적인 면역 반응을 개선할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호1, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호2, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호4, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호5, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호6 치료용 및 예방용 백신은 인간의 총 생존율(OS)을 증가시키고 기술적 안전성의 독성 프로파일 한계를 가지는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, Ad5[E1-, E2B-]-GP, Ad5[E1-, E2B-]-NP, Ad5[E1-, E2B-]-VP40, Ad5[E1-, E2B-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30, [E1-, E2b-]-VP24, 및/또는 [E1-, E2b-]-L 치료용 및 예방용 백신은 인간의 총 생존율(OS)을 증가시키고 기술적 안전성의 독성 프로파일 한계를 가지는 데 사용될 수 있다.
나아가 다양한 실시형태들에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 에볼라에 의해 감염된 인간의 임상 반응, 예컨대 변경된 질병 진행 또는 기대 수명을 초래한다. 나아가, 다양한 실시형태들에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 에볼라에 의한 낮은 감염 위험도, 중간 감염 위험도 및 높은 감염 위험도에서 임상 반응, 예컨대 변경된 질병 진행 또는 기대 수명을 초래한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 및 RESTV 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항원을 발현하는 아데노바이러스 기반 벡터를 사용하는 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및 L 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항원을 발현하는 아데노바이러스 기반 벡터를 사용하는 조성물 및 방법을 제공한다.
나아가 다양한 실시형태들에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 에볼라에 의해 감염된 인간의 임상 반응, 예컨대 변경된 질병 진행 또는 기대 수명을 초래한다. 나아가, 다양한 실시형태들에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 에볼라에 의한 낮은 감염 위험도, 중간 감염 위험도 및 높은 감염 위험도에서 임상 반응, 예컨대 변경된 질병 진행 또는 기대 수명을 초래한다.
Ad5-기반 에볼라 백신
아데노바이러스는 선형 이중-가닥 게놈을 함유하는 정20면체의 비-외피화된 캡시드를 특징으로 하는 DNA 바이러스과이다. 인간 Ad 중에서, 임의의 신생물 질병과 연관된 것은 아무것도 없으며, 오로지 면역적격 개체에서 상대적으로 온화한 자가-제한 병을 유발할 뿐이다. 바이러스에 의해 발현되는 제1 유전자는 E1 유전자이고, 이 E1 유전자는 야생형 게놈에 존재하는 다른 Ad5 유전자 프로모터로부터 높은-수준의 유전자 발현을 개시하는 작용을 한다. 바이러스 DNA 복제 및 자손 비리온의 조립은 감염된 세포의 핵 내에서 발생하고, 전체 라이프 사이클은 약 36시간 소요되고 산출량은 1개 세포 당 대략 104개 비리온이다. 야생형 Ad5 게놈은 대략 36 kb이고, DNA 복제 이전 또는 이후에 발현되는지에 따라 초기 바이러스 기능 및 후기 바이러스 기능으로 구분되는 유전자를 코딩한다. 초기/후기 경계 식별(delineation)은 거의 완벽한데, 왜냐하면 Ad5에 의해 이미 감염된 세포의 중복 감염(super-infection)은 중복 감염 바이러스가 그 자체의 게놈을 복제한 후 상기 바이러스로부터 후기 유전자 발현을 결여시키는 것으로 언급되어 있기 때문이다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이는 Ad5 주요 후기 프로모터(MLP)의 복제 의존적 cis-활성화로 인해, 복제된 게놈이 캡슐화되도록 존재할 때까지 후기 유전자 발현(주로 Ad5 캡시드 단백질)을 방지하기 때문인 것 같다. 본 발명의 조성물 및 방법은 진보된 세대의 Ad 벡터/백신의 개발에서 특징을 이용한다.
Ad5 벡터
1세대, 또는 E1-결실된 아데노바이러스 벡터 Ad5[E1-]는, 전이유전자가 유전자의 E1 영역만 대체하도록 구축된다. 전형적으로, 약 90%의 야생형 Ad5 게놈이 벡터 내에 보유된다. Ad5[E1-] 벡터는 감소된 복제 능력을 갖고 있으며, Ad5 E1 유전자를 발현하지 않는 세포의 감염 후 감염성 바이러스를 생성하지 못한다. 재조합 Ad5[E1-] 벡터는 인간 세포(전형적으로 293 세포)에서 증식되어, Ad5[E1-] 벡터 복제 및 패키징을 허용한다. Ad5[E1-] 벡터는 다수의 긍정적인 특질들을 가지고 있으며; 가장 중요한 것 중 하나는 스케일 업 및 cGMP 생성에 있어서 이러한 벡터의 상대적인 용이성이다. 현재, 220개가 넘는 인간 임상 시험들이 Ad5[E1-] 벡터를 이용하며, 2,000명이 넘는 피험체가 바이러스를 피하, 근육내 또는 정맥내로 제공 받는다. 부가적으로, Ad5 벡터는 통합되지 않으며; 이의 게놈은 에피솜으로(episomal) 남아 있다. 일반적으로, 숙주 게놈 내에 통합되지 않는 벡터에 있어서, 삽입 돌연변이생성 및/또는 생식선 전이(germ-line transmission) 위험은 있다 한다 해도 극히 낮다. 종래의 Ad5[E1-] 벡터는 7 kb에 달하는 운반 능력을 가진다.
백신으로서 사용되는 Ad5 [E1-] 벡터
여러 가지 항원들을 코딩하는 Ad5[E1-] 벡터는 생체외에서 높은 역가의 벡터에 노출된 DC 중 95%에 효율적으로 형질도입될 수 있다. 중요하게는, 증가하는 외래 유전자 발현 수준은, 벡터에 의한 감염 다중도(multiplicities of infection; MOI)가 증가하는 DC에서 주지되었다. 여러 가지 항원들(종양 항원 MART-1, MAGE-A4, DF3/MUC1, p53, hugp100 흑색종 항원, 폴리오마 바이러스 중간-T 항원 포함)을 코딩하는 Ad5[E1-] 벡터에 의해 감염된 DC는 항원 특이적인 CTL 반응을 유도하는 경향을 가지며, 증강된 항원 제시 능력을 가지고, 혼합된 림프구 반응에서 T-세포 증식을 개시하는 개선된 능력을 가진다. 종양 특이적인 항원을 코딩하는 Ad5 벡터에 의해 형질도입된 DC에 의한 동물의 면역화는, 각각의 항원을 발현하는 종양 세포를 사용한 시도 시 동물에 대해 유의한 수준의 보호를 초래하는 것으로 나타났다. 흥미롭게는, IL-7을 코딩하는 Ad의 종양내 감염은 항종양 면역을 유도하는 데 있어서 IL-7 코딩 Ad5 벡터에 의해 형질도입된 DC의 주사보다 덜 효과적이어서, Ad5 벡터에 의한 DC의 생체외 형질도입에서 관심을 더 강조하였다. 생체외 DC 형질도입 전략은 또한, 예를 들어 DC 내로의 CTLA4Ig의 Ad5 매개 운반에 의해 DC CD80과 T-세포 상에 존재하는 CD28 분자와의 상호작용을 차단하여 수용체 숙주에서 관용성을 유도하려는 시도로 사용되어 왔다.
DC와 Ad5 벡터 캡시드의 상호작용은 몇몇 유익한 반응을 유발할 수 있으며, 이러한 유익한 반응은 Ad5 벡터에 의해 코딩된 항원을 제시하는 DC의 경향의 증강일 수 있다. 예를 들어, 항원 취득에 있어 특수화된 미성숙한 DC는 T-세포 활성화의 상대적으로 비효율적인 효과기이다. DC 성숙화는 T-세포 면역을 구동하는 DC의 증강된 능력과 일치한다. 일부 경우, 본 발명의 조성물 및 방법은 Ad5 감염을 이용하여 DC 성숙화를 직접적으로 유도한다. 마우스의 미성숙 골수 유래 DC에 관한 연구는, 마우스의 미성숙 골수 유래 DC의 Ad 벡터 감염이 DC 성숙화와 통상적으로 연관된 세포 표면 마커(MHC I 및 II, CD40, CD80, CD86 및 ICAM-1)를 상향조절할 뿐만 아니라, 골수성 DC 성숙화 시 하향조절되는 것으로 알려진 인테그린인 CD11c를 하향조절할 수 있다고 제시한다. 일부 경우에, Ad 벡터 감염은 DC 성숙화의 마커인 IL-12의 DC에 의한 생성을 유발한다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이들 사건은 가능하게는 NF-κB 경로의 Ad5 유발된 활성화로 인한 것일 수 있다. 성숙한 DC는 Ad 벡터에 의해 효율적으로 형질도입될 수 있고, (말초 혈액 단핵구 유래의) 성숙한 CD83+ 인간 DC에 의해 나타나는 바와 같이 더 낮은 MOI에서 네이브(naive) T-세포의 증식을 자극시키는 기능적인 잠재성을 상실하지 않았다. 그러나, 성숙한 DC는 또한, 미성숙 DC보다 감염성이 더 낮을 수 있다. 캡시드 단백질의 변형은, 통상적인 CAR 수용체 감염 메커니즘을 사용하기 보다는 예를 들어 CD40L 수용체를 바이러스 벡터 수용체로서 사용하여 Ad 벡터에 의한 DC의 감염을 최적화할 뿐만 아니라 기능적인 성숙화를 증강시키는 전략으로서 사용될 수 있다.
가장 극적으로는, 항-HIV 면역 반응을 유도하는 비-바이러스 벡터의 잠재성이 Ad5 기반 벡터 시스템과 직접 비교되었을 때, Ad5 기반 시스템이 훨씬 더 우수한 것으로 확인되었다. 예를 들어, Ad5 네이브 영장류 모델에서, HIV gag를 발현하는 Ad5[E1-]를 사용한 백신접종은 HIV-gag를 발현하는 네이키드 DNA 백신을 이용하는 유사한 노력과 비교하여, SHIV 감염으로부터 동물을 보호하는 데 있어서 우수하였다. 따라서, 바이러스 벡터는 네이키드 DNA 접근법보다 우수할 수 있다. 네이키드 DNA-gag 백신을 프라이밍 백신접종으로 사용하고 후속해서 Ad5[E1-]-gag 백신을 사용하여 부스팅하는 조합된 전략(네이키드 DNA-gag 벡터 단독을 이용한 임상적 경험의 구축)은 인간 시험에서 DNA-HIV-gag 코딩 벡터만을 이용한 경우에 주지된 것보다 T 세포 반응을 더 개선하였다.
안전성 및 면역원성을 평가하는 현재의 1상 임상 시험에서, 20명의 건강한 성인에게 자이르 및 수단 균주의 에볼라 바이러스의 GP 성분을 함유하는 재조합 침팬지 Ad-기반(cAd) 백신(cAd-EBO)을 사용하여 1회 근육내로 백신접종하였다. GP-특이적 항체가 20명 피험체 모두에서 유도되었다. 항체 역가는 2x1010개 VP를 받은 그룹(n=10)과 비교하여 2x1011개 바이러스 입자(VP)를 받은 그룹(n=10)에서 가장 높았다. 달성된 항체 반응은, 비인간 영장류(NHP)를 수반하는 시도 연구에서 백신-유도된 보호적 면역과 연관된 것으로 보고된 범위 내에서 관찰되었다. GP-특이적 T-세포 반응은 또한, 2x1010개 VP 용량을 받은 것과 비교하여 2X1011개 VP 용량을 받은 피험체에서 더 빈번하였다. 백신은 안전하게 관용되었고, 심각한 부작용은 관찰되지 않았다. 중요하게는, 항-침팬지 Ad 항체 또한 피험체에서 유도되었으며 이들 항체는 보호적 면역 반응을 유지하는 데 필요할 수 있는 추가의 백신접종(부스트)을 방지할 것으로 나타났다. 부스팅 시도를 회피하기 위해, 이들 연구자들은 에볼라 바이러스의 GP를 함유하는 재조합 변형된 백시나 바이러스 앙카라(MVA)로 이루어진 부스터 백신(MVA-EBO)과 조합된 cAd-EBO 백신의 안전성 및 면역원성을 평가하는 부가적인 임상 시험을 수행할 것을 제안하고 있다. 이러한 접근법이 성공적이더라도, cAd 및 MVA 둘 다에 대한 중화 항체의 개발은 이들 2개의 재조합 백신을 사용한 추가의 면역화를 경감시킬 수 있으므로 고려되어야 한다.
Ad5 벡터는 EA, 예컨대 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 및 RESTV 항원, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및 L의 높은 수준 및 효율적인 형질도입을 허용하는 독특한 기회를 제공한다. Ad5 기반 벡터가 가진 주요한 문제점들 중 하나는 인간 집단에서 Ad에 대한 기존 면역의 높은 경향, 및 이것이 임의의 부가적인 백신 적용에 있어서 대부분의 인간 집단에서 종래의 Ad5[E1-] 결실(1세대 Ad)의 사용을 어떻게 배제할 수 있느냐이다.
Ad5 [E1-, E2B -]-에볼라 백신: 기존의 항- Ad5 면역의 시도를 극복하기 위한 Ad5[E1-, E2b -] 백신의 사용
인간 및 동물에서의 연구는, Ad5에 대한 기존 면역이 Ad-기반 백신의 상업적인 사용에 대한 저해 인자일 수 있음을 언급하고 있다. 대부분의 인간은 인간 백신에 가장 광범위하게 사용되는 서브타입인 Ad5에 대한 항체를 갖고 있으며, 연구된 인간의 2/3는 Ad5에 대한 림프구-증식성 반응을 갖고 있다. 이러한 기존 면역은 전형적인 Ad5 백신을 사용한 면역화 또는 재-면역화를 저해할 수 있고, 이후에 Ad5 벡터를 사용한 제2 항원에 대한 백신의 면역화를 배제할 수 있다. 기존의 항-벡터 면역의 문제점을 극복하는 것이 심도있는 조사의 주제가 되어 왔다. 대안적인 인간(비-Ad5 기반) Ad5 서브타입 또는 심지어 비-인간 형태의 Ad5를 사용한 조사가 시험되어 왔다. 이들 접근법이 초기 면역화에 성공한다 하더라도, 후속적인 백신접종은 신규 Ad5 서브타입에 대한 면역 반응으로 인해 문제가 될 수 있다. Ad5 면역화 장벽을 피하고, 최적 면역 반응을 유도하는 데 있어서 1세대 Ad5[E1-] 벡터의 제한된 효능을 개선하기 위해, 본 발명의 다양한 실시형태들은 차세대 Ad5 벡터 기반 백신 플랫폼에 관한 것이다. 새로운 Ad5 플랫폼은 E2b 영역에 DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질 유전자를 제거하는 부가적인 결실을 가진다. Ad5[E1-, E2b-] 플랫폼은 많은 가능한 유전자들의 포함을 허용하기에 충분한 확장된 클로닝 용량을 가지고 있다. Ad5[E1-, E2b-] 벡터는 Ad5[E1-] 벡터의 7 kb 용량과 비교하여 최대 약 12 kb의 유전자-운반 능력을 가지고 있으며, 필요하다면 다수의 유전자들을 위한 공간을 제공한다. 일부 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 kb 초과의 삽입물이 Ad5 벡터, 예컨대 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 내에 도입된다. E2b 영역의 결실은 본 발명의 Ad5 벡터에 유리한 면역 특성을 부여하며, 종종, Ad 바이러스 단백질에 대한 면역 반응을 최소화하면서도 표적 전이유전자 항원에 대한 강력한 면역 반응을 유도한다.
다양한 실시형태들에서, 본 발명의 Ad5[E1-, E2b-] 벡터는 강력한 CMI, 뿐만 아니라 Ad 면역의 존재 하에서도 벡터 발현된 백신 항원에 대한 항체를 유도한다. Ad5[E1-, E2b-] 벡터는 또한, Ad5[E1-] 벡터와 비교하여 감소된 부작용, 특히 간독성 및 조직 손상의 감소된 출현을 가진다. 이들 Ad5 벡터의 주요 양태는, Ad5 후기 유전자의 발현이 크게 감소된다는 점이다. 예를 들어, 캡시드 섬유 단백질의 생성은 Ad5[E1-] 벡터의 경우 생체내에서 검출될 수 있었으며, 한편 섬유 발현은 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 백신으로부터 제거되었다. 야생형 Ad에 대한 선천적 면역 반응은 복잡하다. Ad5[E1-, E2b-] 벡터로부터 결실된 단백질은 일반적으로 중요한 역할을 한다. 구체적으로는, 전-말단 단백질 또는 DNA 폴리머라제가 결실된 Ad5[E1-, E2b-] 벡터는, Ad5[E1-] 벡터와 비교하여, 주사 후 처음 24시간 내지 72시간 동안 감소된 염증을 나타낸다. 다양한 실시형태들에서, Ad5 유전자 발현의 결여는, 감염된 세포가 항-Ad 활성에 대해 보이지 않게 하고 감염된 세포가 전이유전자를 연장된 기간 동안 발현하도록 허용하며, 이는 표적에 대한 면역을 발달시킨다.
본 발명의 다양한 실시형태는 수지상 세포에 형질도입되는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터의 능력을 증가시키고, Ad5[E1-, E2b-] 벡터 바이러스 단백질에 대한 감소된 염증 반응 및 기존의 Ad 면역에 대한 결과적인 회피를 이용함으로써, 백신에서 항원 특이적인 면역 반응을 개선하는 것을 고려한다.
일부 경우에, 이러한 면역 유도는 수개월이 소요될 수 있다. Ad5[E1-, E2b-] 벡터는 항원 특이적인 면역 반응의 유도 측면에서 Ad5[E1-] 벡터보다 더 안전할 뿐만 아니라 우수한 것으로 보이며, 이는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터를 임상 반응을 초래할 수 있는 에볼라 백신을 전달하기 위한 플랫폼으로서 훨씬 더 양호하게 적합하게 만든다.
본 발명의 다양한 실시형태들은 에볼라에 대한 치료용 백신의 개발을 위해 오랫 동안 추구되어 온 수요를 전달하는 데에 새로운 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 시스템을 이용함으로써, 다른 Ad5 시스템에서 발견된 장벽을 극복하고, Ad5에 이미 노출된 적이 있는 사람의 면역화를 허용한다.
다양한 실시형태들에서, Ad5[E1-, E2b-] 벡터를 포함하는 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안전성의 한도 내에서 증가된 총 생존율(OS)이라는 에볼라 백신 효과를 가진다.
아데노바이러스 벡터
1세대 아데노바이러스 벡터와 비교하여, 본 발명의 2세대 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 소정의 실시형태는 DNA 폴리머라제 유전자(pol)에 부가적인 결실 및 전-말단 단백질(pTP)의 결실을 함유한다. E2b 결실된 벡터는 1세대 아데노바이러스 벡터의 5 kb 내지 6 kb 용량과 비교하여 최대 13 kb의 유전자-운반 능력을 가지며, 여러 가지 표적 항원들 중 임의의 표적 항원을 코딩하는 핵산 서열을 위한 공간을 쉽게 제공한다. E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 또한, 1세대 아데노바이러스 벡터와 비교하여 감소된 부작용을 가진다. E2b 결실된 벡터는 바이러스 유전자의 감소된 발현을 가지고, 이러한 특징은 생체내에서 연장된 전이유전자 발현을 초래한다.
야생형 Ad에 대한 선천적 면역 반응은 복잡할 수 있고, 아데노바이러스 벡터로부터 발현되는 Ad 단백질은 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 구체적으로는, E2b 결실된 벡터에서 전-말단 단백질 및 DNA 폴리머라제의 결실은 주사 후 처음 24시간 내지 72시간 동안 염증을 감소시키는 것으로 보이는 반면, 1세대 아데노바이러스 벡터는 이 기간 동안 염증을 자극한다. 또한, E2b 결실에 의해 생성된 부가적인 복제 차단(block) 또한, Ad 후기 유전자의 발현에 있어서 E1, E3 결실 단독에 의해 부여되는 것을 훨씬 능가하여 10,000배의 감소를 초래하는 것으로 보고되어 있다. E2b 결실된 아데노바이러스 벡터에 의해 생성된 Ad 단백질의 감소된 수준은 Ad 항원에 대한 경쟁적이며 바람직하지 못한 면역 반응에 대한 잠재성을 효과적으로 감소시키며, 이러한 면역 반응은 Ad 면역화된 개체 또는 Ad 노출된 개체에서 플랫폼의 반복된 사용을 방지한다. 2세대 E2b 결실된 벡터에 의한 염증 반응의 감소된 유도는, 항원 제시 세포(즉, 수지상 세포)의 감염 동안 요망되는 백신 항원을 발현하는 벡터의 잠재성을 증가시키고, 항원 경쟁의 잠재성을 감소시키고, 1세대 아데노바이러스 벡터를 이용한 동일한 시도와 비교하여 요망되는 항원에 대한 백신의 면역화를 더 크게 한다. E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는, 1세대 아데노바이러스 벡터를 사용하는 이전에 기재된 백신 후보물질보다 더 안전하고, 더 효과적이며 더 다재다능한 개선된 Ad-기반 백신 후보물질을 제공한다.
따라서, 1세대, E1-결실된 아데노바이러스 서브타입 5(Ad5)-기반 벡터는 백신으로서 사용하기에 유망한 플랫폼이긴 하지만, 자연 발생적인 Ad-특이적 중화 항체 또는 유도된 Ad-특이적 중화 항체에 의해 활성이 지체된다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, E1 영역 및 E2b 영역(후자는 DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질을 코딩함)이 결실된 Ad5-기반 벡터(Ad5[E1-, E2b-])는 Ad-면역 숙주에서 예를 들어 감소된 후기 바이러스 단백질 발현으로 인해 면역학적 제거를 피하고 코딩된 항원 전이유전자에 대한 보다 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명은 미국 특허 6,063,622; 6,451,596; 6,057,158; 6,083,750; 및 8,298,549에 기재된 것들과 같은 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 사용을 고려한다. 많은 경우 E2b 영역이 결실된 벡터는 바이러스 단백질 발현에 심각한 손상을 미치고/거나 복제 적격 Ad(RCA)를 발생시키는 빈도를 감소시킨다. 이들 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 증식은, 결실된 E2b 유전자 생성물을 발현하는 세포주를 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 패지킹 세포주; 예를 들어 HEK-293 세포주 유래의 E.C7(이전에 C-7로 지칭됨)을 제공한다.
나아가, E2b 유전자 생성물, DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질은 E.C7, 또는 유사한 세포에서 E1 유전자 생성물과 함께 구성적으로 발현될 수 있다. Ad 게놈으로부터 생성 세포주로의 유전자 분절의 트랜스퍼는 즉각적인 이득을 가진다: (1) 증가된 운반 능력; 및 (2) 전형적으로 RCA를 발생시키기 위해 2개 이상의 독립적인 재조합 사건을 필요로 하는 RCA 발생의 감소된 잠재성. 본 발명에 사용되는 E1, Ad DNA 폴리머라제 및/또는 전-말단 단백질 발현 세포주는, 오염성 헬퍼 바이러스의 필요 없이, 13 kb에 달하는 운반 능력을 가진 아데노바이러스 벡터의 증식을 가능하게 할 수 있다. 또한, 바이러스 라이프 사이클에 중요한 유전자(예, E2b 유전자)가 결실된 경우, 다른 바이러스 유전자 단백질을 복제하거나 발현시키는 Ad의 추가적인 손상이 발생한다. 이는 바이러스에 의해 감염된 세포의 면역 인지를 감소시킬 수 있고, 외래 전이유전자 발현 기간을 연장시킬 수 있다.
E1, DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질 결실된 벡터는 전형적으로, E1 영역 및 E2b 영역으로부터 각각의 단백질을 발현시킬 수 없다. 나아가, 이러한 벡터는 대부분의 바이러스 구조 단백질의 발현의 결여를 나타낼 수 있다. 예를 들어, Ad의 주요 후기 프로모터(MLP)는 후기 구조 단백질 L1 내지 L5의 전사에 책임이 있다. MLP가 Ad 게놈 복제 전에 최소한으로 활성적이더라도, 고도로 독성인 Ad 후기 유전자는 주로, 오로지 바이러스 게놈 복제가 발생한 후에라야 MLP로부터 전사 및 번역된다. 후기 유전자 전사의 이러한 cis-의존적 활성화는 일반적으로 DNA 바이러스의 특징이며, 예컨대 폴리오마 및 SV-40의 성장에 있어서의 특징이다. DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질이 (E4 또는 단백질 IX 단백질과는 달리) Ad 복제에 중요하다. 이들의 결실은 아데노바이러스 벡터 후기 유전자 발현, 및 APC와 같은 세포에서 해당 발현의 독성 효과에 극도로 유해할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 것으로 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 및 선택적으로 E1 영역에 결실을 가진 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 결실된 Ad 게놈의 임의의 다른 영역을 가지지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 것으로 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역에 결실, 및 선택적으로 E1 및 E3 영역에 결실을 가진 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 결실된 다른 영역을 가지지 않는다. 추가의 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 것으로 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역에 결실, 및 선택적으로 E1, E3 영역에 결실, 및 또한 선택적으로 E4 영역의 부분적인 또는 완전한 제거를 가진 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 것으로 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역에 결실, 및 선택적으로 E1 및/또는 E4 영역에 결실을 가진 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 부가적인 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 것으로 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2a, E2b 및/또는 E4 영역에 결실을 가진 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 일 실시형태에서, 본원에 사용되기 위한 아데노바이러스 벡터는 E1 및/또는 E2b 영역의 DNA 폴리머라제 기능이 결실된 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 추가의 실시형태에서, 본원에 사용되기 위한 아데노바이러스 벡터는 E1 및/또는 E2b 영역의 전-말단 단백질 기능에 결실을 가진다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 사용되기 위한 아데노바이러스 벡터는 E1, DNA 폴리머라제 및/또는 전-말단 단백질 기능에 결실을 가진다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 하나의 특정 실시형태에서, 본원에 사용되는 것으로 고려되는 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역 및/또는 E1 영역의 적어도 일부가 결실되어 있다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 "거티드" 아데노바이러스 벡터가 아니다. 이러한 측면에서, 이러한 벡터는 E2b 영역의 DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질 기능 둘 다가 결실되어 있을 수 있다. 부가적인 실시형태에서, 본 발명에 사용되기 위한 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E1, E2b 및/또는 100K 영역에 결실을 가진 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일 실시형태에서, 본원에 사용되기 위한 아데노바이러스 벡터는 E1, E2b 및/또는 프로테아제 기능이 결실된 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 추가의 실시형태에서, 본원에 사용되기 위한 아데노바이러스 벡터는 E1 및/또는 E2b 영역이 결실되어 있는 한편, 섬유 유전자는 돌연변이 또는 (예, Ad 향성(tropism)을 변경시키기 위한) 다른 변경에 의해 변형되어 있다. E3 또는 E4 영역으로부터의 유전자의 제거는 언급된 아데노바이러스 벡터들 중 임의의 벡터에 첨가될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 "거티드" 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명은 또한, 면역 경로 체크포인트 조정제와 조합된, 에볼라 유전자에 대해 면역화하기 위한 바이러스 유전자 전달 플랫폼을 사용한, 에볼라에 대한 면역요법을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 바이러스 유전자 전달 플랫폼을 사용한, 에볼라에 대한 면역요법을 위한 조성물 및 방법이 면역 경로 체크포인트 조정제, 예컨대 PD1의 저해제와 조합되어 사용되어, 에볼라 유전자에 대해 면역화할 수 있다. 이들 조성물 및 방법은 면역 경로 체크포인트 조정제, 예컨대 체크포인트 저해제의 저해제와 조합된 Ad5[E1-, E2b-]-에볼라 백신을 이용할 수 있다.
본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 표적 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 에볼라 항원, 예컨대 세포에 의해 발현되거나 제시되는 에볼라 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되거나 제시되는 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24, L 또는 이들의 임의의 조합에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 EBOV 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 SUDV 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 TAFV 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 BDBV 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 RESTV 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 GP에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 NP에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 VP40에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 VP35에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 VP30에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 VP24에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 L에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다.
본 조성물 및 방법은 세포에 의해 발현되고/거나 제시되는 다수의 표적 항원들에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 2개 이상의 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원, 예컨대 2개 이상의 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및 L 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 EBOV 항원 및 SUDV 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 TAFV 항원 및 BDBV 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 RESTV 항원 및 EBOV 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 GP 및 NP에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 GP 및 VP40에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 GP 및 VP35에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 GP 및 VP30에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 GP 및 VP24에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 GP 및 L에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 NP 및 VP40에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 NP 및 VP35에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 NP 및 VP30에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 NP 및 VP24에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 NP 및 L에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 VP40 및 VP35에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 VP40 및 VP30에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 VP40 및 VP24에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 VP40 및 L에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 VP35 및 VP30에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 VP35 및 VP24에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 VP35 및 L에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 VP30 및 VP24에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 VP30 및 L에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물 및 방법은 VP24 및 L에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다.
EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L의 변형된 형태가, EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L; 또는 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV 또는 RESTV 항원, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L을 발현하고/거나 제시하는 세포에 대한 면역 반응을 증가시키기 위한 백신에 사용될 수 있다. 전형적으로, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 것이며, 바람직하게는 변이체 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 에피토프의 면역원성 또는 이종성 표적 단백질의 면역원성이 천연 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드와 비교하여 실질적으로 감소하지 않도록 함유할 것이다. 일부 경우에, 상기 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입은 변이체 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 에피토프의 면역원성을 증가시킬 수 있다. 본원 어디에서나 기재된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 표적 항원 또는 이의 단편(예, 에피토프)의 변이체를 코딩할 수 있으며, 여기서, 변이체 폴리펩타이드 또는 이의 단편(예, 에피토프)이 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 경향은 천연 폴리펩타이드와 비교하여 실질적으로 감소하지 않는다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 표적 항원 또는 이의 단편의 변이체를 코딩할 수 있으며, 여기서, 변이체 폴리펩타이드 또는 이의 단편이 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 경향은 천연 폴리펩타이드와 비교하여 실질적으로 증가한다.
특히, 본 발명은, 하나 이상의 항원성 표적 엔티티에 대한 복수의 백신접종이 달성될 수 있도록 개선된 Ad-기반 백신을 제공한다. 일부 실시형태에서, 개선된 Ad-기반 백신은 표적 항원, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편, 예컨대 Ad5[E1-, E2b-]-EBOV를 가진 복제 결함 아데노바이러스를 포함한다. 표적 항원, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L의 변이체 또는 단편은 면역원성 잠재성을 포함한 여러 가지 인자들을 기반으로 선택될 수 있다. 돌연변이체 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L은 각각 야생형 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L과 비교하여 면역 반응을 상승시키는 이의 증가된 능력 덕분에 이용될 수 있다. 중요하게는, 백신접종은 Ad에 대한 기존 면역의 존재 하에 수행될 수 있거나, 본 발명의 Ad 벡터 또는 다른 Ad 벡터를 사용하여 이미 수회 면역화된 피험체에게 투여될 수 있다. Ad 벡터는, 비제한적으로 하나 이상의 표적 항원에 대한 항체 생성 및 CMI 반응을 포함하여, 관심 항원, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 피험체에게 수회 투여될 수 있다. 특히 실시형태에서, 표적 항원의 변이체 또는 단편은, 이들이 하나 이상의 감소된 생물학적 활성을 갖도록 변형된다. 예를 들어, 에볼라 단백질 표적 항원은 단백질의 바이러스 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형될 수 있거나, 바이러스 단백질은 하나 이상의 활성 또는 바이러스 단백질을 감소시키거나 제거하도록 변형될 수 있다. 변형된 에볼라 단백질의 일례는 변이체 단백질, 예컨대 증가된 면역원성을 가진 변이체 단백질을 초래하는 점 돌연변이를 가진 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L이다.
요망되는 표적 항원 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 이들 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질을 발현시키기 위해, 본원에 기재된 바와 같이, 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 기능적 등가물이 당업계에 알려진 재조합 기술을 사용하여 본원 어디에서나 기재된 바와 같이 적절한 Ad 내로 삽입된다.
조성물
에볼라 면역요법 및 백신을 위한 바이러스 벡터
재조합 바이러스 벡터는 단백질 코딩 유전자 또는 항원(예, EA)을 발현하도록 사용될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터 기반의 백신 및 면역요법의 이점으로는, 높은 효율의 유전자 형질도입, 표적 세포로의 유전자의 고도로 특이적인 운반, 강력한 면역 반응의 유도, 및 증가된 세포성 면역 등이 있다. 본 개시내용은 바이러스 게놈의 결정적인 영역의 결실 또는 삽입을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 개시내용에 의해 제공되는 바이러스 벡터는 하나 이상의 관심 표적 항원, 또는 이의 변이체, 단편 또는 융합체를 코딩하는 이종성 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 이에 대한 면역 반응을 발생시키는 것이 바람직하다.
본 개시내용의 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 적합한 바이러스 벡터로는, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 프로바이러스, 백시나 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 자가-보완성(self-complementary) 아데노-연관된 바이러스, 사이토메갈로바이러스 또는 센다이 바이러스 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 복제-적격일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 복제-결함성일 수 있다. 복제-결함성 바이러스 벡터에 있어서, 바이러스의 게놈은 다른 유전자로 대체되거나 결실된 복제 및 패키징의 부가적인 라운드에 필수적인 코딩 영역을 가질 수 있다. 이들 바이러스는 이들의 표적 세포를 감염시키고 이들의 바이러스 페이로드(payload)를 전달할 수 있지만, 그런 다음 세포 용해 및 사멸을 초래하는 전형적인 용해 경로를 지속하지 못한다. 바이러스 벡터에 따라, 복제-결함성 바이러스 벡터 내의 허용 가능한 DNA 또는 cDNA 삽입물의 전형적인 최대 길이는 약 8 킬로베이스(kb) 내지 10 킬로베이스일 수 있다.
레트로바이러스는 역전사효소를 함유하는 항원, 예컨대 외피화된 단일-가닥 RNA 바이러스를 발현시키는 데 사용되어 왔다. 레트로바이러스 벡터는 복제-결함성일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 뮤린 또는 조류 기원일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) 유래일 수 있다. 유전자 발현을 위해 게놈 통합을 필요로 하는 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 장기적인 유전자 발현을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터는 대략 7 kb 내지 11 kb의 게놈 크기를 가질 수 있고, 7 kb 내지 8 kb 길이의 외래 DNA 삽입물을 가질 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 낮은 면역원성을 나타내도록 사용될 수 있고, 대부분의 환자는 레트로바이러스 벡터에 대한 기존 면역을 나타내지 않는다. 레트로바이러스 벡터는 분열중인 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 비-분열중인 세포를 감염시키지 않는 데 사용될 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 항원을 발현하도록 사용되어 왔다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 하위부류를 구성한다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열중인 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 분열중인 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열중인 세포 및 분열중인 세포 둘 다를 감염시키는 데 사용될 수 있다. 렌티바이러스는 일반적으로, 레트로바이러스보다 더 넓은 향성을 나타낸다. 몇몇 단백질, 예컨대 tat 및 rev는 렌티바이러스의 복제를 조절한다. 이들 조절 단백질은 전형적으로 레트로바이러스에는 존재하지 않는다. HIV는 전이유전자 전달 벡터 내로 조작될 수 있는 예시적인 렌티바이러스이다. 렌티바이러스 벡터의 이점은 레트로바이러스 벡터의 이점과 유사하다. 렌티바이러스가 종양발생을 잠재적으로 유발할 수 있긴 하지만, 그 위험도는 렌티바이러스의 통합 부위가 세포성 프로모터를 가진 부위와 멀리 떨어져 있기 때문에 레트로바이러스 벡터보다 더 낮다. HIV-기반 벡터는 예를 들어, HIV 바이러스 외피, 및 벡터 생성 동안 필요하지 않은 조절 유전자들 중 일부를 제거함으로써 발생될 수 있다. 외피가 세포 및 조직 특이성을 결정하기 때문에, 부모 외피 대신 몇몇 키메라 외피 벡터 또는 변형된 외피 벡터가 발생된다.
사이토메갈로바이러스(CMV) 벡터가 항원을 발현시키는 데 사용되어 왔다. CMV는 헤르페스바이러스의 구성원이다. 종-특이적 CMV가 사용될 수 있다(예, 인간 CMV(HCMV), 예를 들어, 인간 헤르페스바이러스 타입 5). HCMV는 캡시드에 의해 둘러싸인 235 kb 이중-가닥 선형 DNA 게놈을 함유한다. 외피는 당단백질 gB 및 gH를 함유하고, 이러한 당단백질은 세포성 수용체에 결합한다.
센다이 바이러스(SeV) 벡터가 항원을 발현시키는 데 사용되어 왔다. SeV는 파라믹소바이러스과의 외피화된 단일-가닥 RNA 바이러스이다. SeV 게놈은 6개의 단백질, 및 세포 도입을 매개하고 이의 향성을 결정하는 2개의 외피 당단백질, HN 및 F 단백질을 코딩한다. F 단백질이 결여된 SeV 벡터는 복제-결함성 바이러스로서 사용되어 해당 벡터의 안전성을 개선할 수 있다. 패키징 세포에서 생성된 SeV 벡터는 F 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. F 유전자-결실되고 전이유전자-삽입된 게놈은 패키징 세포 내로 형질감염될 수 있다. SeV는 RNA 의존적 RNA 폴리머라제를 함유하고, 바이러스 게놈은 세포질로 위치화된다. 이는, 감염 후 곧 신속한 유전자 발현의 발생 및 SeV의 유전자독성 이점을 보장한다. SeV 벡터는 고도로 효율적인 유전자 전달을 나타내는 데에 사용될 수 있다. SeV 벡터는 분열중인 세포 및 비-분열중인 세포 둘 다에 형질도입하는 데 사용될 수 있다. SeV 벡터는 비-분열중인 세포에 형질도입하는 데 사용될 수 있다. SeV 벡터는 분열중인 세포에 형질도입하는 데 사용될 수 있다. SeV 벡터는 예를 들어 인간 기도 상피 세포에 효율적으로 형질도입하는 데 사용될 수 있다. SeV 벡터는 예를 들어 (예, 경구 및 비)점막 경로에 의해 투여될 수 있다. 비내 투여가 사용되어, SeV에 대한 기존 면역의 영향을 근육내 투여와 비교하여 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 다른 바이러스 벡터와 비교하여, 이의 전이유전자 용량(3.4 kb)은 낮다. SeV는 인간 파라인플루엔자 타입 1(hPIV-1) 바이러스에 대해 고도로 상동성이며; 따라서, hPIV-1에 대한 기존 면역이 SeV의 사용에 불리하게 작용할 수 있다.
아데노바이러스 벡터
일반적으로, 아데노바이러스는 광범위한 향성을 가질 수 있으며, 여러 가지 분열중인 세포 타입 및 비-분열중인 세포 타입을 감염시킬 수 있고, 포유류 신체에서 전신적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 보다 선택적인 점막 표면을 통해 사용될 수 있기 때문에, 임상적으로 매력적이다. 또한, 아데노바이러스의 상대적인 열안정성은 이의 임상적 용도를 더 촉진한다. 아데노바이러스는 선형 이중-가닥 게놈을 함유하는 정20면체, 비-외피화된 캡시드를 특징으로 하는 DNA 바이러스 과이다. 일반적으로, 아데노바이러스는 크기가 대략 30 kb 내지 35 kb인 이중-가닥 DNA 게놈을 포함하는 비-외피화된 바이러스로서 발견된다. 인간 Ad 중에는, 임의의 신생물성 질환과 연관된 것은 없으며, 면역적격 개체에서 상대적으로 약하고 자가-제한적인 병을 유발할 뿐이다. 바이러스에 의해 발현되는 제1 유전자는 E1 유전자이며, 이 유전자는 야생형 게놈에 존재하는 다른 Ad5 유전자 프로모터로부터 높은-수준의 유전자 발현을 개시하는 작용을 한다. 바이러스 DNA 복제 및 자손 비리온의 조립은 감염된 세포의 핵 내에서 발생하고, 전체 라이프 사이클은 약 36시간이 소요되고, 산출량은 1개 세포 당 대략 104개 비리온이다. 야생형 Ad5 게놈은 대략 36 kb이고, 조기 바이러스 기능 및 후기 바이러스 기능으로 분류되는 유전자를, 이들이 DNA 복제 이전 또는 이후에 발현되는지에 따라 코딩한다. Ad5에 의해 이미 감염된 세포의 중복 감염은 이것이 그 자체의 게놈을 복제한 후가 될 때까지 중복 감염 바이러스로부터 후기 유전자 발현을 결여시키기 때문에, 조기/후기 경계 식별은 거의 완벽하다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이는 Ad5 주요 후기 프로모터(MLP)의 복제 의존적 cis-활성화로 인한 것일 것이며, 이러한 활성화는 복제된 게놈이 캡슐화된 상태로 존재할 때까지 후기 유전자 발현(주로 Ad5 캡시드 단백질)을 방지한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 진보된 세대의 Ad 벡터/백신의 개발에 그 특징을 이용한다. 아데노바이러스의 선형 게놈은 일반적으로 그 측면에 DNA 복제를 위한 2개의 기원(ITR)이 존재하고, RNA 폴리머라제 II-매개 전사를 위한 8개의 단위를 가진다. 게놈은 5개의 조기 단위 E1A, E1B, E2, E3, E4 및 E5, 바이러스 복제의 개시 후 지연되어 발현되는 2개의 단위(IX 및 IVa2), 및 L1 내지 L5로 세분되는 하나의 후기 단위(L)를 가진다. 일부 아데노바이러스는 바이러스-연관된(VA) RNA라고 하는 RNA의 1개 종 또는 2개 종을 추가로 코딩할 수 있다.
인간 환자에서 선천적 면역 반응 및 후천적 면역 반응을 유도하는 아데노바이러스가 제공된다. 바이러스 게놈의 결정적인 영역의 결실 또는 삽입에 의해, 바이러스 게놈의 예측 가능성(predictability)을 증가시키고 원하지 않는 부작용을 감소시키도록 조작된 재조합 벡터가 제공된다. 일부 양태에서, 본 발명은 E1A, E1B, E2, E3, E4, E5, IX, IVa2, L1, L2, L3, L4 및 L5 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 게놈 결실 또는 삽입을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 변경된 캡시드를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 일반적으로, 아데노바이러스의 캡시드는 주로 정20면체의 20개의 삼각 말단면(triangular facet)을 포함하고, 각각의 정20면체는 헥손 삼량체의 12개 복사본을 함유한다. 또한, 다른 몇몇 부가적인 부(minor) 캡시드 단백질, IIIa, VI, VIII 및 IX가 또한 존재한다.
본 개시내용은 하나 이상의 변경된 섬유 단백질을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 일반적으로, 삼량체를 형성하기도 하는 섬유 단백질은 12개의 꼭짓점에서 오량체 펜톤 염기 내에 삽입된다. 이러한 섬유는 얇은 N-말단 꼬리, 샤프트(shaft) 및 놉 도메인(knob domain)을 포함할 수 있다. 샤프트는 가변 수의 β-가닥 반복부를 포함할 수 있다. 놉은 하나 이상의 루프 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J를 포함할 수 있다. 섬유 놉 루프는 세포 수용체에 결합할 수 있다. 본 개시내용은 에볼라 치료용 백신 시스템에 사용되는 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
본 방법 및 본 개시내용의 조성물과 함께 사용될 수 있는 적합한 아데노바이러스로는, 인간 하위군 A, B1, B2, C, D, E 및 F 또는 본원에 제공된 바와 같은 이들의 결정적인 게놈 영역을 포함한 종-특이적 아데노바이러스가 있으나 이로 한정되는 것은 아니며, 이러한 하위군은 면역학적으로 구별되는 혈청형으로 더 분류될 수 있다. 나아가, 본 방법 및 개시내용의 조성물에 사용될 수 있는 적합한 아데노바이러스로는, 영장류, 소, 새, 파충류 또는 개구리로부터 동정된 종-특이적 아데노바이러스 또는 이의 결정적인 게놈 영역 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
일부 아데노바이러스 혈청형은 별개의 기관들을 우선적으로 표적화한다. 혈청형, 예컨대 AdHu1, AdHu2 및 AdHu5(아속 C)는 일반적으로 상부 호흡기 감염에 영향을 미치는 한편, 아속 A 및 아속 F는 위장 기관에 영향을 미친다. 본 개시내용은 에볼라 치료를 위해 별개의 기관을 우선적으로 표적화하는 데 사용되는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 일부 적용에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 포유류에서 특정 기관에의 향성을 감소시키도록 변경된다. 일부 적용에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 포유류에서 특정 기관에의 향성을 증가시키도록 변경된다.
아데노바이러스의 향성은 숙주 세포 수용체에의 이의 부착 능력에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에, 숙주 세포 부착 과정은, 처음에 섬유의 원위부 놉 도메인이 숙주 세포 표면 분자에 결합한 다음, 펜톤 염기 내의 RGD 모티프가 αV 인테그린과 결합하는 것을 수반할 수 있다. 본 개시내용은, 재조합 아데노바이러스 벡터가 숙주의 특정 세포 타입을 감염시키기 위해 유전자 조작될 수 있도록 변경된 향성을 가진 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 세포-특이적 에볼라 감염의 치료를 위해 변경된 향성을 가진 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 하위군 A, B, C, D 또는 F 또는 이들의 조합 유래의 하나 이상의 아데노바이러스로부터의 변경된 섬유 놉 또는 RGD 서열의 삽입을 가진 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 일부 적용에서, 변경된 섬유 놉을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 특정 세포 타입에 대한 향성이 감소된 벡터를 초래한다. 일부 적용에서, 변경된 섬유 놉을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 특정 세포 타입에 대한 향성이 증강된 벡터를 초래한다. 일부 적용에서, 변경된 섬유 놉을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 생성물-특이적 B 또는 T-세포 반응이 감소된 벡터를 초래한다. 일부 적용에서, 변경된 섬유 놉을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 생성물-특이적 B 또는 T-세포 반응이 증강된 벡터를 초래한다.
본 개시내용은 바이러스-중화 항체의 효과를 피하거나 또는 숙주 세포 내로의 형질도입을 개선하기 위해 다른 분자로 코팅된 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 숙주 세포 수용체에의 벡터의 부착에 일조하는 어댑터 분자로 코팅된 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 콕사키 Ad 수용체(CAR)를 CD40L와 연결하는 어댑터 분자로 코팅되어, 수지상 세포의 형질도입을 증가시킴으로써 피험체에서 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 다른 표적 세포 타입에의 부착을 증강시키기 위해 유사하게 조작된 다른 아데노바이러스 벡터 또한, 본 개시내용에 포함된다.
Ad5 벡터
인간 및 동물에서의 연구는, Ad5에 대한 기존 면역이 Ad-기반 백신의 상업적인 사용에 대한 저해 인자일 수 있음을 나타내었다. 대부분의 인간은 인간 백신을 위해 가장 널리 사용되는 서브타입인 Ad5에 대한 항체를 갖고 있으며, 연구된 인간의 2/3는 Ad5에 대한 림프구-증식성 반응을 갖고 있다. 이러한 기존 면역은 전형적인 Ad5 백신을 사용한 면역화 또는 재-면역화를 저해할 수 있고, 이후에 Ad5 벡터를 사용한, 제2 항원에 대한 백신의 면역화를 배제할 수 있다. 기존의 항-벡터 면역의 문제점을 극복하는 것은 심도있는 조사의 주제가 되어 왔다. 대안적인 인간(비-Ad5 기반) Ad5 서브타입 또는 심지어 비-인간 형태의 Ad5를 사용한 조사가 검사되어 왔다. 이들 접근법이 초기 면역화에서는 성공적이더라도, 후속적인 백신접종은 신규 Ad5 서브타입에 대한 면역 반응으로 인해 문제가 될 수 있다. Ad5 면역화 장벽을 피하고, 최적의 면역 반응을 유도하기 위해 1세대 Ad5[E1-] 벡터의 제한된 효능을 개선하기 위해, 본 발명의 다양한 실시형태는 차세대 Ad5 벡터-기반의 백신 플랫폼에 관한 것이다.
1세대, 또는 E1-결실된 아데노바이러스 벡터 Ad5[E1-]는, 전이유전자가 유전자의 E1 영역만 대체하도록 구축된다. 전형적으로, 야생형 Ad5 게놈의 약 90%가 벡터 내에 보유된다. Ad5[E1-] 벡터는 복제 능력이 감소되어 있으며, Ad5 E1 유전자를 발현하지 않는 세포의 감염 후 감염성 바이러스를 생성할 수 없다. 재조합 Ad5[E1-] 벡터는 이러한 Ad5[E1-] 벡터의 복제 및 패키징을 허용하는 인간 세포(예, 293 세포)에서 증식된다. Ad5[E1-] 벡터는 다수의 긍정적인 특질들을 갖고 있으며; 가장 중요한 특질 중 하나는 이의 스케일 업 및 cGMP 생성이 상대적으로 용이하다는 점이다. 현재, 220개를 훌쩍 넘는 인간 임상 시험들이 Ad5[E1-] 벡터를 이용하고 있으며, 2000명이 넘는 피험체가 바이러스를 피하, 근육내 또는 정맥내로 접종받는다. 부가적으로, Ad5 벡터는 통합되지 않으며; 이의 게놈은 에피솜에 남아 있다. 일반적으로, 숙주 게놈 내로 통합되지 않는 벡터의 경우, 삽입 돌연변이생성 및/또는 생식선 전이의 위험은 있다고 하더라고 극히 낮다. 종래의 Ad5[E1-] 벡터는 7 kb에 근접한 운반 능력을 갖고 있다.
E1 영역 및 E2b 영역이 결실된 Ad5-기반 벡터(Ad5[E1-, E2b-])는 저하된 후기 바이러스 단백질 발현에 의해 Ad-면역 숙주에서 면역학적 제거를 피하고 코딩된 에볼라 항원 전이유전자에 대해 보다 강력한 면역 반응을 유도하는 기회를 제공하며, 상기 E2b 영역은 DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질을 코딩한다. Ad5 플랫폼은 E2b 영역에 부가적인 결실을 갖고 있어서, DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질 유전자를 제거한다. Ad5[E1-, E2b-] 플랫폼은 가능한 한 많은 유전자들을 포함시키기에 충분한 확장된 클로닝 용량을 가진다. Ad5[E1-, E2b-] 벡터는 Ad5[E1-] 벡터의 7 kb 용량과 비교하여 약 12 kb 이하의 유전자-운반 능력을 가지며, 필요하다면 다수의 유전자들에 대한 공간을 제공한다. 일부 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 kb 초과의 삽입물이 Ad5 벡터, 예컨대 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 내에 도입된다. E2b 영역의 결실은 본 발명의 Ad5 벡터에 유리한 면역학적 특성을 부여하여, 종종 Ad 바이러스 단백질에 대한 면역 반응을 최소화하면서도 표적 전이유전자 항원에 대한 강력한 면역 반응을 이끌어낸다.
다양한 실시형태들에서, 본 발명의 Ad5[E1-, E2b-] 벡터는 강력한 CMI를 유도할 뿐만 아니라, 심지어 Ad 면역의 존재 하에 벡터-발현된 백신 항원에 대한 항체를 유도한다. Ad5[E1-, E2b-] 벡터는 또한, Ad5[E1-] 벡터와 비교하여 감소된 부작용, 특히 간독성의 출현 및 조직 손상을 가진다. 이들 Ad5 벡터의 주요 양태는, Ad 후기 유전자의 발현이 크게 감소된다는 것이다. 예를 들어, 캡시드 섬유 단백질의 생성은 Ad5[E1-] 벡터의 경우 생체내에서 검출될 수 있었으며, 한편, 섬유 발현은 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 백신으로부터 제거되었다. 야생형 Ad에 대한 선천적 면역 반응은 복잡하다. Ad5[E1-, E2b-] 벡터로부터 결실된 단백질은 일반적으로 중요한 역할을 한다. 구체적으로는, 전-말단 단백질 또는 DNA 폴리머라제가 결실된 Ad5[E1-, E2b-] 벡터는 Ad5[E1-] 벡터와 비교하여 주사 후 처음 24시간 내지 72시간 동안 감소된 염증을 나타낸다. 다양한 실시형태들에서, Ad5 유전자 발현의 결여는 감염된 세포에서 항-Ad 활성이 나타나지 않게 하며, 감염된 세포가 연장된 기간 동안 전이유전자를 발현할 수 있게 하여, 표적에 대한 면역을 발달시킨다.
본 발명의 다양한 실시형태는 수지상 세포에 형질도입되는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 능력을 증가시키는 것, Ad5[E1-, E2b-] 벡터 바이러스 단백질에 대한 감소된 염증 반응을 이용함으로써 백신에서 항원 특이적인 면역 반응을 개선하는 것, 및 기존의 Ad 면역의 결과적인 모면을 고려한다.
복제 결함 Ad5 벡터
항-Ad 면역을 극복하려는 시도는 대안적인 Ad 혈청형의 사용 및/또는 Ad5 바이러스 캡시드 단백질에서의 변경을 포함하였으며, 각각은 제한된 성공을 거두었으며 생성된 백신의 생체분포를 상당히 변경시키는 잠재성을 갖고 있다. 따라서, 완전히 신규 접근법은 기존의 Ad 면역의 표적인 것으로 알려진 단백질인 E1 결실된 Ad5 벡터로부터 바이러스 단백질의 발현을 추가로 감소시킴으로써 시도되었다. 구체적으로는, 신규 재조합 Ad5 플랫폼은 조기 1(E1) 유전자 영역이 결실되어 있으며 조기 2b(E2b) 유전자 영역이 부가적으로 결실되어 있는 것으로 기재되어 있다(Ad5[E1-, E2b-]). (DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질을 코딩하는) E2b 영역의 결실은 감소된 바이러스 DNA 복제 및 후기 바이러스 단백질 발현을 초래한다. 이러한 벡터 플랫폼은 에볼라 감염 동물 모델에서 CMI 반응을 유도하는 데 사용될 수 있으며, 보다 중요하게는, 이러한 재조합 Ad5 유전자 전달 플랫폼은 Ad5 면역의 장벽을 극복하고, 기존의 Ad 면역 및/또는 벡터-유도 Ad 면역의 설정에 사용될 수 있어서, 백신의 복수의 동종 투여를 가능하게 한다. 특정한 실시형태에서, 본 발명은 면역원성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 혈청형 5의 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 면역원성 폴리펩타이드는 돌연변이체, 자연적 변이체 또는 이의 단편일 수 있다.
일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 야생형 면역원성 폴리펩타이드 또는 이의 단편과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%의 동일성을 가진 폴리펩타이드를 코딩하는 변형된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 야생형 폴리펩타이드의 하위단위를 코딩하는 변형된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 서열 번호1, 2, 4, 5 또는 6과 적어도 60%의 서열 동일성을 포함하는 아데노바이러스-유래 벡터에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 선택적으로 복제 결함 아데노바이러스에 관한 아데노바이러스-유래 벡터는 서열 번호 1, 2, 4, 5 또는 6과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9%의 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호3으로부터 대안적인 코돈 대체에 의해 발생된 서열을 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 본원에 기재된 아데노바이러스-유래 벡터는 E2b 영역, 및 선택적으로 E1 영역에 결실을 가지며, 이러한 결실은 본원에 기재된 바와 같이 면역요법에서 벡터의 용도에 여러 가지 이점들을 부여한다.
아데노바이러스 게놈 내의 소정의 영역은 필수적인 기능을 수행하고, 본 발명의 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 구축할 때 실질적으로 보존될 필요가 있을 수 있다. 이들 영역은 문헌[Lauer et al., J. Gen. Virol., 85, 2615-25 (2004), Leza et al., J. Virol., p. 3003-13 (1988) 및 Miralles et al., J. Bio Chem., Vol. 264, No. 18, p. 10763-72 (1983)]에 더 기재되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 인용에 의해 포함된다. 서열 번호 1, 2, 4, 5 또는 6의 일부와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9%의 동일성 값을 가진 서열, 예컨대 서열 번호 1, 2, 4, 5 또는 6의 적어도 약 100개, 250개, 500개, 1000개 이상의 염기를 포함하는 부분을 포함하는 재조합 핵산 벡터가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터, 예컨대 미국 특허 6,063,622; 6,451,596; 6,057,158; 6,083,750; 및 8,298,549에 기재된 것들의 용도를 고려한다. 많은 경우, E2b 영역이 결실된 벡터는 바이러스 단백질 발현 기능을 제대로 하지 못하고/거나 복제 적격 Ad(RCA)를 발생시키는 빈도를 감소시킨다. 이들 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 증식은 결실된 E2b 유전자 생성물을 발현하는 세포주를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 패키징 세포주는 본원에 제공되어 있으며; 예를 들어, HEK-293 세포주로부터 유래된 E.C7(이전에는 C-7이라고 불렸음)이 있다.
나아가, E2b 유전자 생성물, DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질은 E.C7, 또는 E1 유전자 생성물과 함께 유사한 세포에서 구성적으로 발현될 수 있다. Ad 게놈으로부터 생성 세포주로의 유전자 분절의 이동은 즉각적인 이득: (1) 증가된 운반 능력; 및 (2) 전형적으로 RCA를 발생시키기 위해 2개 이상의 독립적인 재조합 사건을 필요로 하는 RCA 발생의 감소된 잠재성을 가진다. 본 발명에 사용되는 E1, Ad DNA 폴리머라제 및/또는 전-말단 단백질 발현 세포주는 오염성 헬퍼 바이러스의 필요 없이, 13 kb에 근접한 운반 능력을 가진 아데노바이러스 벡터의 증식을 가능하게 할 수 있다. 또한, 바이러스 라이프 사이클에 중요한 유전자(예, E2b 유전자)가 결실된 경우, 다른 바이러스 유전자 단백질을 복제하거나 발현시키는 Ad의 추가적인 무능화가 발생한다. 이는 감염된 세포의 면역 인지를 감소시킬 수 있고, 외래 전이유전자 발현의 기간을 연장할 수 있다.
E1, DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질 결실된 벡터는 전형적으로, E1 영역 및 E2b 영역 유래의 각각의 단백질을 발현할 수 없다. 나아가, 이들은 대부분의 바이러스 구조 단백질의 발현의 결여를 보여줄 수 있다. 예를 들어, Ad의 주요 후기 프로모터(MLP)는 후기 구조 단백질 L1 내지 L5의 전사를 책임진다. MLP가 Ad 게놈 복제 전에 최소로 활성이긴 하지만, 바이러스 게놈 복제가 발생한 후에라야 고도로 독성인 Ad 후기 유전자가 mLP로부터 주로 전사되고 번역된다. 이러한 후기 유전자 전사의 cis-의존적 활성화는 일반적으로 예컨대 폴리오마 및 SV-40의 성장에서 DNA 바이러스의 특징이다. DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질은 (E4 또는 단백질 IX 단백질과는 달리) Ad 복제에 중요하다. 이들의 결실은 아데노바이러스 벡터 후기 유전자 발현, 및 APC와 같은 세포에서 이의 발현의 독성 효과에 극히 불리할 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역, 및 선택적으로 E1 영역에 결실을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 AD 게놈의 임의의 다른 영역에 결실을 갖지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역에 결실, 및 E1 및 E3 영역에 결실을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 결실된 다른 영역을 갖지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역에 결실, 및 E1 및 E3 영역에 결실, 및 E4 영역에 부분적인 또는 완전한 제거를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역에 결실, 및 E1 및/또는 E4 영역에 결실을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 함유하지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2a, E2b 및/또는 E4 영역에 결실을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 E1 영역, 및/또는 E2b 영역의 DNA 폴리머라제 기능에 결실을 가질 수 있다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 E1 영역, 및/또는 E2b 영역의 전-말단 단백질 기능에 결실을 가질 수 있다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 E1, DNA 폴리머라제 및/또는 전-말단 단백질 기능에 결실을 가질 수 있다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역 및/또는 E1 영역의 적어도 일부를 가질 수 있다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 거티드 아데노바이러스 벡터가 아니다. 이러한 측면에서, 벡터는 E2b 영역의 DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질 기능 둘 다가 결실될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E1, E2b 및/또는 100K 영역에 결실을 가질 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 E1, E2b 및/또는 프로테아제 기능이 결실된 벡터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 E1 및/또는 E2b 영역에 결실을 가질 수 있으며, 한편 섬유 유전자는 돌연변이 또는 (예, Ad 향성을 변경시키기 위한) 다른 변경에 의해 변형되어 있다. E3 영역 또는 E4 영역으로부터의 유전자의 제거가, 언급된 아데노바이러스 벡터 중 임의의 아데노바이러스 벡터에 첨가될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 거티드 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
Ad 게놈의 다른 영역이 결실될 수 있다. Ad 게놈의 특정 영역에서의 "결실"은, 해당 영역에 의해 코딩된 적어도 하나의 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능(예, DNA 폴리머라제의 E2b 기능 또는 전-말단 단백질 기능)을 방지하는 방식으로 돌연변이화 또는 제거된 특정 DNA 서열을 지칭한다. 결실은 단백질의 일부를 코딩하는 엑손 내에서의 결실뿐만 아니라 프로모터 및 리더 서열 내에서의 결실을 포함한다. 특정 영역 내에서의 결실은 Ad 게놈의 해당 영역 내에서의 적어도 하나의 염기쌍의 결실을 지칭한다. 1개 초과의 염기쌍이 결실될 수 있다. 예를 들어, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150개의 염기쌍이 특정 영역으로부터 결실될 수 있다. 이러한 결실은 Ad 게놈의 특정 영역 내에서의 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250 또는 300개 초과의 염기쌍일 수 있다. 이들 결실은 이 영역에 의해 코딩된 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능을 방지할 수 있다. 예를 들어, Ad 게놈의 특정 영역은, 하나 이상의 코딩된 단백질이 비-기능성이 되도록 하나 이상의 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는, 비기능성 단백질을 초래하는 아미노산 서열의 변화를 유발하는 상이한 잔기로 대체된 잔기를 포함한다. Ad 게놈에서의 예시적인 결실 또는 돌연변이는 E1a, E1b, E2a, E2b, E3, E4, L1, L2, L3, L4, L5, TP, POL, IV 및 VA 영역 중 하나 이상을 포함한다. 결실된 아데노바이러스 벡터는 예를 들어 재조합 기술을 사용하여 제작될 수 있다.
본 발명에 사용되기 위한 Ad 벡터는, E2b 유전자 생성물, 및 결실되었을 수 있는 필수 유전자 중 임의의 필수 유전자의 생성물을 구성적으로 발현하는 적절한 패키징 세포주를 사용하여 고 역가로 성공적으로 성장될 수 있다. E1 및 DNA 폴리머라제 단백질뿐만 아니라 Ad-전-말단 단백질을 구성적으로 발현하는 HEK-293-유래 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터의 고 역가 스톡을 성장시키기 위해, E.C7 세포가 사용될 수 있다.
자가-증식성 아데노바이러스 벡터로부터 중요한 유전자를 결실시키기 위해, 표적화된 유전자에 의해 코딩된 단백질이 HEK-293 세포에서 우선 공동발현되거나, 또는 E1 단백질과 함께 유사하게 공동발현될 수 있다. 예를 들어, 구성적으로 공동발현될 때 무독성인 이들 단백질(또는 유도적으로 발현되는 독성 단백질)은 선택적으로 이용될 수 있다. HEK-293 세포에서의 E1 유전자 및 E4 유전자의 공동발현이 (예, 구성적이 아닌 유도성 프로모터를 이용하여) 가능하다. E1 및 단백질 IX 유전자, 비리온 구조 단백질이 공동발현될 수 있다. E1, E4 및 단백질 IX 유전자의 추가적인 공동발현 또한 가능하다. E1 및 100K 유전자는 트랜스-보완 세포주에서 발현될 수 있으며, E1 및 프로테아제 유전자 또한 마찬가지로 발현될 수 있다.
E2b 결실된 Ad 입자를 고 역가로 성장시키는 데 사용되기 위한 E1 및 E2b 유전자 생성물을 공동발현하는 세포주가 사용될 수 있다. 유용한 세포주는 대략 140 kDa Ad-DNA 폴리머라제 및/또는 대략 90 kDa 전-말단 단백질을 구성적으로 발현한다. 독성 없이 E1, DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질의 높은 수준의 구성적 공동발현을 가진 세포주(예, E.C7)가 복수의 백신접종용 Ad의 증식에 사용되기에 바람직하다. 이들 세포주는 E1, DNA 폴리머라제 및 전-말단 단백질이 결실된 아데노바이러스 벡터의 증식을 허용한다.
본 발명의 재조합 Ad는 예를 들어, 적절한 MOI(예, 5)에서 Ad 벡터 바이러스 스톡을 사용하여 감염되고 37℃에서 40시간 내지 96시간 동안 인큐베이션된 E.C7 세포를 함유하는 조직 배양 플레이트를 사용하여 증식될 수 있다. 감염된 세포를 수확하고, 10 mM Tris-Cl(pH 8.0)에 재현탁하고, 초음파처리할 수 있으며, 바이러스를 2차례의 세슘 클로라이드 밀도 원심분리에 의해 정제할 수 있다. 바이러스를 함유하는 밴드를 컬럼에 걸쳐 탈염시킬 수 있으며, 수크로스 또는 글리세롤을 첨가할 수 있고, 분취액을 -80℃에 저장할 수 있으며, 바이러스를 이의 안정성을 증강시키도록 디자인된 용액, 예컨대 A195에 넣을 수 있다. 스톡의 역가를 (예, 용해 후 바이러스 분취액의 광학 밀도를 260 nm에서 측정함으로써) 측정할 수 있다. 전체 재조합 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 포함하는 선형 또는 환형 플라스미드 DNA를 E.C7 또는 유사한 세포 내에 형질감염시킬 수 있고, 바이러스 생성의 증거(예, 세포변성 효과)가 존재할 때까지 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 세포 유래의 조건화된 배지를 사용하여, 보다 많은 세포를 감염시켜, 정제 전에 생성되는 바이러스의 양을 증가시킬 수 있다. 정제는 예를 들어, 2차례의 세슘 클로라이드 밀도 원심분리 또는 선택적 여과에 의해 달성될 수 있다. 바이러스는 상업적으로 입수 가능한 제품 또는 커스컴 크로마토그래픽 컬럼을 사용한 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 감염되는 세포가 소정의 수의 바이러스와 만나는 것을 보장하기 위해 충분한 바이러스를 포함할 수 있다. 따라서, 다양한 실시형태들에서, 본 발명은 재조합 Ad의 스톡, 예컨대 재조합 Ad의 RCA-무함유 스톡을 제공한다. 바이러스 스톡은, 대체로 바이러스 유전형, 및 이를 제조하는 데 사용되는 프로토콜 및 세포주에 따라 역가가 상당히 변할 수 있다. 바이러스 스톡은 적어도 약 106, 107 또는 108 pfu/ml 또는 그 이상의 역가, 예컨대 적어도 약 109, 1010, 1011 또는 1012 pfu/ml의 역가를 가질 수 있다. 재조합 바이러스 및 패키징 세포주의 성질에 따라, 본 발명의 바이러스 스톡은 심지어 약 1013 입자/ml 이상의 역가를 가질 수 있다.
항원 표적을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 변이체
본 개시내용은 추가로, 하나 이상의 관심 표적 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 단편 또는 변이체로 지칭되기도 하는 핵산 서열을 제공한다. 이와 같이, 본 발명은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 임의의 소스 유래의 표적 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 이러한 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 요망되는 표적 항원 폴리펩타이드를 발현하기 위해, 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 기능적인 등가물이 적절한 Ad 벡터 내로 (예, 재조합 기술을 사용하여) 삽입될 수 있다. 적절한 아데노바이러스 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필수적인 요소들, 및 임의의 요망되는 링커를 함유할 수 있다. 당업자에게 잘 알려져 있는 방법이 사용되어, 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 서열, 및 적절한 전사 및 번역 조절 요소를 함유하는 이들 아데노바이러스 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, 본 발명의 표적 항원 폴리펩타이드/단백질/에피토프를 코딩하는 내인성 서열 또는 이의 일부)을 포함할 수 있거나, 이러한 서열의 변이체, 단편 또는 유도체를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 항원 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드 서열 또는 변이체와 실질적으로 다를 수 있으나 유사한 단백질 항원을 코딩하는, 특정 세포 타입에서의 발현을 위해 최적화된 신규 유전자 서열을 나타낸다.
다른 관련된 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 단백질(예, 관심 표적 항원)을 코딩하는 천연 서열과 실질적인 동일성을 가지며, 예를 들어 폴리펩타이드를 코딩하는 천연 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여 적어도 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그보다 높은 서열 동일성을 포함하는 것들이다(예, 표준 파라미터를 사용한 BLAST 분석). 이들 값은 코돈 축퇴, 아미노산 유사성, 해독 프레임 위치화(reading frame positioning) 등을 고려하여, 2개의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 단백질의 상응하는 동일성을 확인하도록 적절하게 조정될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 천연 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단백질 서열과 비교하여 예를 들어 적어도 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그보다 높은 서열 동일성을 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드(예, 표적 단백질 항원)를 코딩하는 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 11, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드, 및 이들 사이의 모든 중간 길이를 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서 "중간 길이"는 인용된 값들 사이의 임의의 길이, 예컨대 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등; 200 내지 500 사이의 모든 정수를 포함하며; 500 내지 1,000 등을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서, 폴리펩타이드, 예컨대 에피토프 또는 이종성 표적 단백질을 코딩하는 천연 서열에서 발견되지 않는 부가적인 뉴클레오타이드에 의해 연장될 수 있다. 이러한 부가적인 서열은 개시된 서열의 어느 한쪽 말단에서 또는 개시된 서열의 양쪽 말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다.
코딩 서열 자체의 길이와는 상관없이 폴리뉴클레오타이드는 다른 DNA 서열, 예컨대 프로모터, 발현 조절 서열, 폴리아데닐화 신호, 부가적인 제한 효소 부위, 다수의 클로닝 부위, 다른 코딩 분절 등과 조합될 수 있으며, 따라서 이러한 폴리뉴클레오타이드의 총 길이가 상당히 다양해질 수 있다. 따라서, 대체로 임의의 길이의 핵산 단편이 이용될 수 있는 것으로 고려되며, 총 길이는 바람직하게는 의도되는 재조합 DNA 프로토콜에서 제조 및 용도의 용이성에 의해 제한된다. (모든 중간 길이를 포함하여) 총 길이가 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50개 염기쌍 길이 등인 예시적인 폴리뉴클레오타이드 분절은 본 발명의 많은 실시에서 유용한 것으로 고려된다.
돌연변이생성 접근법, 예컨대 부위-특이적 돌연변이생성이 표적 항원 서열의 제조에 이용될 수 있다. 폴리펩타이드 서열 내의 특이적인 변형은 이를 코딩하는 기본(underlying) 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이생성을 통해 이루어질 수 있다. 요망되는 돌연변이의 DNA 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드 서열의 사용뿐만 아니라 횡단되는(traversed) 결실 연접부의 양쪽 면 상에서 안정한 듀플렉스를 형성하기 위해 충분한 크기의 프라이머 서열 및 서열 복잡성을 제공하기 위해 충분한 수의 인접한 뉴클레오타이드의 사용을 통해 돌연변이체를 만들기 위해 부위-특이적 돌연변이생성이 사용될 수 있다. 예를 들어, 길이가 약 14개 내지 약 25개 뉴클레오타이드 등을 포함하는 프라미어가 이용될 수 있으며, 서열의 연접부의 양쪽 면 상의 약 5개 내지 약 10개의 잔기가 변경된다. 돌연변이는 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에서 이루어져서, 해당 폴리뉴클레오타이드의 특성을 개선, 변경, 감소, 변형 또는 그렇지 않다면 변화시키고/거나 코딩된 폴리펩타이드의 특성, 활성, 조성, 안정성 또는 1차 서열을 변경할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 돌연변이생성은 코딩된 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성, 예컨대 폴리펩타이드에 포함된 에피토프의 면역원성 또는 표적 항원의 면역원성을 변경하는 데 사용될 수 있다. 폴리펩타이드의 면역원성을 시험하기 위한 검정법으로는, T-세포 세포독성 검정법(CTL/크롬 방출 검정법), T-세포 증식 검정법, 세포내 사이토카인 염색, ELISA, ELISPOT 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 펩타이드 및 이를 코딩하는 DNA 서열의 서열 변이체를 수득하는 다른 방식들이 이용될 수 있다. 예를 들어, 요망되는 펩타이드 서열을 코딩하는 재조합 벡터가 돌연변이생성 제제, 예컨대 하이드록실아민으로 처리되어, 서열 변이체가 수득될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절 또는 단편은 예를 들어, 단편을 화학적 수단에 의해 직접 합성함으로써 쉽게 제조될 수 있다. 단편은, 선택된 서열을 재조합 생성용 재조합 벡터 내에 도입함으로써 핵산 복제 기술, 예컨대 PCR의 적용에 의해, 및 일반적으로 분자생물학 기술의 당업자에게 알려진 다른 재조합 DNA 기술에 의해 수득될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하고 생성하도록 여러 가지 벡터/숙주 시스템들이 이용될 수 있다. 예시적인 시스템으로는, 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아; 효모 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 벡터(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 벡터(예, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아 벡터(예, Ti 플라스미드 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템 등이 있다.
Ad 벡터에 존재하는 조절 요소 또는 제어 서열은 벡터-인핸서의 비-번역된 영역, 프로모터 및 5' 및 3' 비번역된 영역을 포함할 수 있다. 이러한 요소들은 이들의 강도 및 특이성이 다양할 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 구성적 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하여 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 후기 프로모터 및 트리파타이트(tripartite) 리더 서열로 이루어진 Ad 전사/번역 복합체 내로 연결될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 영역에서의 삽입은, 감염된 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 생존가능한 바이러스를 수득하는 데 사용될 수 있다. 또한, 전사 인핸서, 예컨대 라우스 육종 바이러스(RSV) 인핸서가 사용되어, 포유류 숙주 세포에서 발현을 증가시킬 수 있다.
특이적인 개시 신호(예, ATG 개시 코돈 및 인접한 서열)가 또한 사용되어, 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 보다 효율적인 번역을 달성할 수 있다. 외인성 번역 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘 다인 다양한 기원의 것일 수 있다. 발현 효율은 사용되는 특정 세포 시스템에 적절한 인핸서의 포함에 의해 증강될 수 있다. 전사 또는 번역을 위한 특이적인 종결 서열 또한, 선택된 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 효율적인 번역을 달성하기 위해 혼입될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드-코딩된 생성물(예, 표적 항원)의 발현을 (예, 생성물에 특이적인 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 사용하여) 검출하고 측정하기 위한 여러 가지 프로토콜들이 사용될 수 있다. 그 예로는, 효소-연결 면역흡착 검정법(ELISA), 방사성면역검정법(RIA) 및 형광 활성화된 세포 소팅(FACS) 등이 있다. 주어진 폴리펩타이드 상의 2개의 비-간섭 에피토프에 반응성인 모노클로날 항체를 이용하는 2-부위, 모노클로날-기반 면역검정법이 일부 적용에 바람직할 수 있으나, 경쟁적 결합 검정법 또한, 이용될 수 있다.
Ad 벡터는 검출되거나 선별될 수 있는 생성물, 예컨대 리포터 유전자를 포함할 수 있으며, 이의 생성물은 예컨대 형광, 발색 또는 형광 기질 상에서의 효소 활성 등에 의해 검출되거나, 성장 조건에 의해 선별될 수 있다. 예시적인 리포터 유전자로는, 녹색 형광 단백질(GFP), β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 분비된 알칼리 포스파타제(SEAP) 및 인간 성장 호르몬(HGH) 등이 있다. 예시적인 선별 마커로는, 네오마이신(G418), 하이그로마이신 등과 같은 약물 내성이 있다.
Ad 벡터는 또한, 프로모터 또는 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터의 선택은 부분적으로는, 표적화된 세포 타입 및 요망되는 조절 정도 또는 타입에 따라 다를 것이다. 본 발명의 맥락에서 적합한 프로모터로는 비제한적으로, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 세포 타입 특이적 프로모터, 시간 특이적(temporal specific) 프로모터 또는 사전-특이적 프로모터 등이 있다. 구성적 프로모터 또는 비특이적 프로모터의 예로는, SV40 조기 프로모터, SV40 후기 프로모터, CMV 조기 유전자 프로모터, 소 유두종 바이러스 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터 등이 있다. 바이러스 프로모터 외에도, 세포 프로모터 또한, 본 발명의 맥락 내에 포함될 수 있다. 특히, 소위 하우스키핑 유전자를 위한 세포 프로모터가 유용하다(예, β-액틴). 바이러스 프로모터는 일반적으로, 세포 프로모터보다 더 강한 프로모터이다. 유도성 프로모터 또한, 사용될 수 있다. 이들 프로모터로는, 덱사메타손에 의해 유도성인 MMTV LTR, 중금속에 의해 유도성인 메탈로티오네인, 및 cAMP에 의해 유도성인 cAMP 반응 요소를 가진 프로모터, 열 충격 프로모터 등이 있다. 유도성 프로모터를 사용함으로써, 핵산은 세포에 전달될 수 있고, 인듀서(inducer)가 첨가될 때까지 휴지 상태로 존재할 것이다. 이는 관심 단백질의 생성 시점을 추가로 조절할 수 있게 한다. 사건-타입 특이적인 프로모터(예, HIV LTR)가 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 에볼라 바이러스 감염과 같은 사건의 발생 시에만 활성이거나 상향조절된다. HIV LTR 프로모터는, tat 유전자 생성물이 존재하지 않는 한 불활성이며, 바이러스 감염 시 활성으로 된다. 일부 사건-타입 프로모터는 또한, 조직-특이적이다. 바람직한 사건-타입 특이적 프로모터로는 바이러스 감염 시 활성화되는 프로모터가 있다.
프로모터로는, α-페토단백질, α-액틴, myo D, 암배아 항원, VEGF-수용체; FGF 수용체; TEK 또는 tie 2; tie; 유로키나제 수용체; E-셀렉틴 및 P-셀렉틴; VCAM-1; 엔도글린; 엔도시알린; αV-β3 인테그린; 엔도텔린-1; ICAM-3; E9 항원; 폰 빌레브란트 인자; CD44; CD40; 혈관-내피 캐드헤린; 노치 4, 고분자량 흑색종-연관된 항원; 전립선 특이적 항원-1, 프로바신, FGF 수용체, VEGF 수용체, erb B2; erb B3; erb B4; MUC-1; HSP-27; int-1; int-2, CEA, HBEGF 수용체; EGF 수용체; 티로시나제, MAGE, IL-2 수용체; 전립선 산 포스파타제, 프로바신, 전립선 특이적 막 항원, α-크리스탈린, PDGF 수용체, 인테그린 수용체, α-액틴, SM1 및 SM2 미오신 중쇄, 칼포닌-h1, SM22 α-안지오텐신 수용체, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, 및 CD4용 프로모터 등이 있다.
억제자 서열, 음성 제어자, 또는 조직-특이적 사일런서가 삽입되어, 폴리뉴클레오타이드의 비-특이적 발현을 감소시킬 수 있다. 다수의 억제자 요소들이 프로모터 영역 내에 삽입될 수 있다. 전사의 억제는 억제자 요소의 배향에 독립적이거나 프로모터로부터 떨어져 있다. 억제자 성려의 하나의 타입은 인슐레이터 서열(insulator sequence)이다. 이러한 서열은 전사를 저해하고, 백그라운드 전사를 침묵시킬 수 있다. 음성 제어 요소는 다수의 상이한 유전자들의 프로모터 영역에 위치할 수 있다. 억제자 요소는 스테로이드와 같은 인자의 부재 시 전사의 억제자로서 작용할 수 있으며, 오브알부민 유전자의 프로모터 영역 내의 NSE도 마찬가지이다. 이들 요소의 일부에 상응하는 올리고뉴클레오타이드는 TK 리포터의 바이러스 전사를 억제할 수 있다. 사일런서 요소들 중 하나는 다른 유전자(TCTCTCCNA (서열 번호7)) 내의 사일런서와 서열 동일성을 공유한다
나아가, 억제자 요소가 예를 들어 콜라겐 II 유전자를 포함하여 여러 가지 유전자들의 프로모터 영역 내에 위치할 수 있다. HeLa 세포 유래의 핵 인자는 사일런서 영역을 함유하는 DNA 단편에 특이적으로 결합할 수 있다. 억제자 요소는 카르바밀 포스페이트 신터타제 유전자에서 전사를 제어하는 역할을 할 수 있다. 이 유전자는 오로지 2개의 상이한 세포 타입인 간세포 및 장점막의 상피 세포에서만 발현된다. 음성 제어 영역은 또한, 콜린 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 프로모터 영역, 알부민 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK-2) 유전자 프로모터, 및 6-포스포프룩토-2-키나제/프룩토스-2,6-비스포스파타제 유전자에서 발견되며, 여기서 음성 제어 요소는 비-간(non-hepatic) 세포주에서 전사를 저해한다. 더욱이, 음성 제어 요소 Tse-1은 티로신 아미노트랜스퍼라제(TAT)를 포함한 다수의 간 특이적 유전자들에 위치한다. TAT 유전자 발현은 간 특이적이고, 글루코코티코이드 및 cAMP 신호 경로 둘 다에 의해 유도될 수 있다. cAMP 반응 요소(CRE)는 Tse-1 및 간세포-특이적 요소에 의한 억제를 위한 표적으로 요청될 수 있다. 이에, 이러한 각종 요소들이 알려져 있거나 쉽게 동정되는 것은 분명하다.
소정의 실시형태에서, 요망되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 요소가 본원에 기재된 Ad 벡터의 핵산 서열 내에 혼입될 수 있다. 예시적인 요소로는, 내부 리보좀 결합 부위(IRES)가 있다. IRES는 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, 다른 서열도 발현을 증강시킬 수 있다. 일부 유전자에 있어서, 특히 5' 말단의 서열은 전사 및/또는 번역을 저해할 수 있다. 이들 서열은 통상, 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 회문(palindrome)이다. 일부 경우, 전달되는 핵산 내의 이러한 서열은 결실된다. 전사체 또는 번역된 생성물의 발현 수준은 어떤 서열이 발현에 영향을 미치는지 확인하거나 알아내기 위해 검정될 수 있다. 전사체 수준은 노던 블롯 혼성화, RNase 프로브 보호 등을 포함한 임의의 공지된 방법에 의해 검정될 수 있다. 단백질 수준은 ELISA를 포함한 임의의 공지된 방법에 의해 검정될 수 있다.
에볼라 항원-특이적 면역요법 및 백신
본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 이러한 벡터 및 다른 벡터를 이용하는, 에볼라 항원, 예컨대 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L에 대한 단일 항원 또는 조합 항원 면역화를 제공한다. 본 개시내용은 에볼라 항원에 대한 치료용 백신을 제공한다. 본 개시내용은 에볼라 항원에 대한 예방용 백신을 제공한다. 나아가, 다양한 실시형태들에서, 조성물 및 방법은 임상 반응, 예컨대 변경된 질병 진행 또는 기대 수명을 초래할 수 있다.
여러 가지 항원들을 코딩하는 Ad5[E1-] 벡터가 사용되어, 생체외에서 노출된 DC 중 95%를 고 역가의 벡터에 효율적으로 형질도입시킬 수 있다. 중요하게는, 본 발명자들은 벡터를 이용한 감염 다중도(MOI)가 증가함에 따라 DC에서 외래 유전자 발현 수준도 증가하였음을 발견하였다. Ad5[E1-] 벡터에 의해 감염된 DC는 항원 특이적인 CTL 반응을 유도하는 경향을 가진 여러 가지 에볼라 항원들을 코딩할 수 있으며, 증강된 항원 제시 능력을 가지고/거나 혼합된 림프구 반응에서 T-세포 증식을 개시하는 개선된 능력을 가진다. 종양 특이적 항원을 코딩하는 Ad5 벡터에 의해 이전에 형질도입된 수지상 세포(DC)를 이용한 동물의 면역화는, 각각의 항원을 발현하는 종양 세포를 이용한 시도 시, 동물에게 상당한 수준의 보호를 유도하는 데 사용될 수 있다. 흥미롭게는, IL-7을 코딩하는 Ad의 종양내 주사는 항-종양 면역을 유도하는 데 있어서 IL-7 코딩 Ad5 벡터로 형질도입된 DC의 주사보다 덜 효과적이다. Ad5 벡터에 의한 DC의 생체외 형질도입은 본 개시내용에 의해 고려된다. 생체외 DC 형질도입 전략은 수용체 숙주 관용성을 유도하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, DC 내로의 CTLA4Ig의 Ad5 매개 운반은 DC CD80과 T-세포 상에 제시된 CD28 분자의 상호작용을 차단할 수 있다.
DC와 Ad5 벡터 캡시드 상호작용은 몇몇 유익한 반응을 유도할 수 있으며, 이러한 반응은 Ad5 벡터에 의해 코딩된 항원을 제시하는 DC의 능력을 증가시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 미성숙한 DC는 항원 섭취에 특화되어 있지만 T-세포 활성화에 있어서는 상대적으로 불충분한 효과기이다. DC 성숙화는, T-세포 면역을 유도하는 DC의 증강된 능력과 일치한다. 일부 경우, 본 발명의 조성물 및 방법은 Ad5 감염을 이용하여, DC 성숙화를 직접적으로 유도한다. 마우스의 미성숙 골수 유래의 DC의 Ad 벡터 감염은 DC 성숙화와 통상적으로 연관된 세포 표면 마커(MHC I 및 MHCII, CD40, CD80, CD86 및 ICAM-1)를 상향조절할 수 있을 뿐만 아니라 골수성 DC 성숙화 시 하향 조절되는 인테그린인 CD11c을 하향조절할 수 있다. 일부 경우에, Ad 벡터 감염은 DC에 의한, DC 성숙화의 마커인 IL-12 생성을 유발한다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이들 사건은 가능하게는, Ad5에 의해 유발된 NF-κB 경로의 활성화로 인한 것일 수 있다. 성숙한 DC는 Ad 벡터에 의해 효율적으로 형질도입될 수 있고, (말초 혈액 단핵구로부터 유래되는) 성숙한 CD83+ 인간 DC에 의해 나타난 바와 같이 더 낮은 MOI에서 네이브 T-세포의 증식을 자극하는 이의 기능적인 잠재성을 상실하지 않는다. 그러나, 성숙한 DC는 또한, 미성숙한 DC보다 감염성이 더 낮을 수 있다.
캡시드 단백질의 변형은 예를 들어 정상적인 CAR 수용체 감염 메커니즘을 사용하기 보다는 CD40L 수용체를 바이러스 벡터 수용체로 사용하여 Ad 벡터에 의한 DC의 감염을 최적화할 뿐만 아니라 기능적인 성숙화를 증강시키기 위한 전략으로서 사용될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, Ad5[E1-, E2b-]-GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24, L 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안전성의 경계 내에서 증가된 총 생존율(OS)이라는 백신 효과를 가진다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안전성의 경계 내에서 증가된 총 생존율(OS)이라는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터(들) GP 백신 효과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안전성의 경계 내에서 증가된 총 생존율(OS)이라는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터(들) NP 백신 효과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안전성의 경계 내에서 증가된 총 생존율(OS)이라는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터(들) VP40 백신 효과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안전성의 경계 내에서 증가된 총 생존율(OS)이라는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터(들) VP35 백신 효과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안전성의 경계 내에서 증가된 총 생존율(OS)이라는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터(들) VP30 백신 효과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안전성의 경계 내에서 증가된 총 생존율(OS)이라는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터(들) VP24 백신 효과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안전성의 경계 내에서 증가된 총 생존율(OS)이라는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터(들) L 백신 효과를 포함할 수 있다.
상기 주지한 바와 같이, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 표적 단백질 또는 관심 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 측면에서, 본 벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 상이한 관심 표적 항원들을 코딩하는 핵산을 함유할 수 있다. 표적 항원은 전장 단백질일 수 있거나 이의 단편(예, 에피토프)일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 하나의 관심 표적 단백질 유래의 다수의 단편 또는 에피토프들을 코딩하는 핵산 서열을 함유할 수 있거나, 다수의 상이한 관심 표적 단백질들 유래의 하나 이상의 단편 또는 에피토프를 함유할 수 있다.
표적 항원은 이에 대한 면역 반응을 발생시키는 것이 바람직한 임의의 성분을 포함할 수 있으나, 일반적으로 표적 항원은 단백질이다. 표적 항원은 전장 단백질, 단백질의 하위단위, 단백질의 이소폼, 또는 면역 반응을 유도하는 이의 단편(즉, 면역원성 단편)을 포함할 수 있다. 표적 항원 또는 이의 단편은 예를 들어, 표적 항원의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키거나 이의 면역원성을 증강시키기 위해 변형될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 면역원성 단편은 MHC 부류 I 분자 또는 MHC 부류 II 분자에 결합한다. 면역원성 단편은 MHC 부류 I 분자 또는 MHC 부류 II 분자에의 결합이 당업계에 알려진 임의의 검정법을 사용하여 검출 가능하다면 이러한 분자에 "결합할" 수 있다. 예를 들어, MHC 부류 I에 결합하는 폴리펩타이드의 능력은, MHC 부류 I/β2m/펩타이드 헤테로삼량체 복합체 내로의 125I 표지된 β-2-마이크로글로불린(β-2m)의 혼입을 촉진하는 능력을 모니터링함으로써 간접적으로 평가될 수 있다(문헌[Parker et al., J.　Immunol. 152:163, 1994] 참조). 대안적으로, 당업계에 알려진 기능성 펩타이드 경쟁 검정법이 이용될 수 있다. 폴리펩타이드의 면역원성 단편은 일반적으로 동정될 수 있다. 면역원성 단편을 동정하는 대표적인 기술은 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대해 폴리펩타이드를 스크리닝하는 것을 포함한다. 특정 표적 폴리펩타이드의 면역원성 단편은, (예, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 검정법에서) 전장 표적 폴리펩타이드의 반응성보다 실질적으로 낮지 않은 수준에서 이러한 항혈청 및/또는 T-세포와 반응하는 단편이다. 즉, 면역원성 단편은 이러한 검정법 내에서, 전장 폴리펩타이드의 반응성과 유사하거나 그보다 큰 수준에서 반응할 수 있다. 이러한 스크린은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 면역 반응을 조정할 수 있는 하나 이상의 단백질, 이의 변이체, 이의 융합체 또는 이의 단편을 코딩하는 이종성 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 특이적 항원, 예컨대 탄저병 보호 항원에 대한 하나 이상의 항체를 코딩하여, 수동적인 면역요법을 허용한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 치료 효과(예, 항-바이러스, 항-박테리아, 항-기생충 또는 항-에볼라 기능)를 가진 하나 이상의 단백질을 코딩하는 이종성 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2세대 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 이종성 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종성 핵산 서열은 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24, L, 이들의 변이체, 일부 또는 임의의 조합이다.
표적 항원으로는, 여러 가지 에볼라 바이러스 유래의 항원 등이 있으나 이로 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 에볼라 단백질의 일부 또는 변이체가 표적 항원으로서 이용된다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로서 이용되는 에볼라 단백질의 일부 또는 변이체는 에볼라 단백질 또는 이러한 단백질을 함유하는 세포에 대한 면역 반응을 발휘하는 변형된, 예를 들어 증가된 능력을 가진다. 본 발명의 백신은 항원에 대해 백신접종될 수 있다. 백신은 또한, 에피토프를 표적으로 할 수 있다. 항원은 에볼라 바이러스 항원일 수 있다. 에피토프는 에볼라 바이러스 에피토프일 수 있다. 이러한 에볼라 바이러스 에피토프, 예컨대 돌연변이로부터 발생된 에볼라 바이러스의 항원 및 공유된 에볼라 종 특이적 항원은 여러 가지 광범위한 에볼라 바이러스로부터 유래될 수 있다. 에볼라 항원(EA)은 숙주에 의해 통상 발현되지 않는 항원일 수 있다. 에볼라-연관된 항원은 예를 들어, 단백질 또는 단백질 단편, 복합체 탄수화물, 강글리오사이드, 합텐, 핵산, 다른 생물학적 분자 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 발명에 유용한 예시적인 에볼라 단백질로는, GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및 L 중 임의의 하나 이상이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및 L로부터 선택되는 변형된 폴리펩타이드를 코딩하는 표적 항원 서열을 포함하며, 여기서, 이러한 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 기재된 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%의 동일성을 가진다.
본 발명자들은, Ad5[E1-, E2b-]- GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L을 이용한 복수의 동종 면역화가 기존의 Ad5-중화 항체 또는 유도된 Ad5-중화 항체의 존재에도 불구하고 동물에서 항-에볼라 활성을 가진 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L-특이적 세포 매개성 면역(CMI) 반응을 유도하였음을 발견하였다. 에볼라 환자의 코호트에게, 상승하는 용량의 Ad5[E1-, E2b-]-GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L을 면역주사할 수 있다. 에볼라에 감염된 피험체에서, 신규 Ad5[E1-, E2b-] 유전자 전달 플랫폼은 자연적으로 획득된 Ad5특이적 면역 및 면역화-유도된 Ad5특이적 면역 둘 다의 설정에서 EA GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L에 대해 상당한 CMI 반응을 발생시킨다.
GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L 항원 특이적인 CMI는 예를 들어, 106개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 당 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10000개 또는 그 이상을 초과하는 IFN-γ 스폿 형성 세포(SFC)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 1000, 12000, 15000 또는 그 이상을 초과하는 기존의 역 Ad5 중화 항체 역가를 가진 인간 피험체에서 상승된다. 면역 반응은 본원에 기재된 바와 같이 세포 매개성 면역 및/또는 체액성 면역을 포함할 수 있다. 면역 반응은 본원에 기재된 바와 같이 세포내 사이토카인 염색(ICS), ELISPOT, 증식 검정법, 크롬 방출을 포함한 세포독성 T-세포 검정법 또는 등가의 검정법, 및 임의의 수의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 RT-PCR 기반 검정법을 사용한 유전자 발현 분석 중 하나 이상의 의해 이들이 당업자에게 이용 가능한 정도까지 측정될 수 있으며, 뿐만 아니라 당업계에 알려진 면역 반응 측정용의 임의의 다른 적합한 검정법에 의해서도 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 폴리펩타이드의 야생형 하위단위와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%의 동일성을 가진 하위단위를 코딩하는 변형된 서열을 포함한다. 면역원성 폴리펩타이드는 돌연변이체 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L, 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 면역원성 폴리펩타이드와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%의 동일성을 가진 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호1의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역원성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 서열 번호1, 2, 4, 5 또는 6과 적어도 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%의 동일성을 갖는 서열, 또는 대안적인 코돈 대체에 의해 서열 번호 1, 2, 4, 5 또는 6으로부터 발생된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩된 면역원성 폴리펩타이드는 야생형 인간 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L 서열과 비교하여 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40개 또는 그 이상의 점 돌연변이, 예컨대 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 에볼라 항원은 에볼라 바이러스에 의해 감염된 개체로부터 직접 동정될 수 있다. 이러한 측면에서, 여러 가지 알려진 기술들을 사용하여 스크린이 수행될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 세포 또는 조직 생검이 환자로부터 채취되며, RNA가 시료 샘플로부터 단리되고, 유전자 칩(예를 들어, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 Affymetrix사)을 사용하여 스크리닝되고, 에볼라 바이러스 항원이 동정된다. 일단 에볼라 바이러스 표적 항원이 동정되면, 이 항원은 당업계에 알려진 기술을 사용하여 클로닝, 발현 및 정제될 수 있다.
그런 다음, 이러한 표적 항원은 하나 이상의 에피토프에 혼입되거나, 본원에 기재된 카세트 또는 바이러스 벡터에 연결되고, 환자에 투여되어, 에볼라 감염된 환자 유래의 샘플로부터 단리된 표적 분자에 대한 면역 반응을 변경시킬 수 있다. 이러한 방식으로, "개인맞춤형" 면역요법 및 백신이 본 발명의 맥락에서 고려된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호1, 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호5, 서열 번호6 또는 이들의 조합과 관련된 개인맞춤형 에볼라 항원은 환자로부터 특징화되고, 나아가 전체로서, 일부로서 또는 변이체로서 표적 항원으로서 이용된다.
병용 면역요법 및 백신
본 개시내용은 에볼라 감염 치료를 위한 병용 면역요법 및 백신 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본원에 제공되는 병용 면역요법 및 백신은 에볼라 감염과 연관된 항원에 대한 다중-표적화된 면역치료제 접근법을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 제공되는 병용 면역요법 및 백신은 에볼라 감염과 연관된 항원에 대한 다중-표적화된 항원 시그너처 면역치료제 접근법을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 본원에 제공된 바와 같은 에볼라의 면역화를 위한 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L의 야생형 또는 변이체를 발현하는 바이러스-기반 벡터를 제공한다. 이들 벡터는 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L에 대한 면역 반응을 높일 수 있다.
일부 양태에서, 벡터는 적어도 하나의 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 적어도 2개의 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 적어도 3개의 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 3개 초과의 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신 제형(제제)은 벡터 : 항원을 1:1 비율로 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 벡터 : 항원을 1:2 비율로 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 벡터 : 항원을 1:3 비율로 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 벡터 : 항원을 1:4 비율로 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 벡터 : 항원을 1:5 비율로 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 벡터 : 항원을 1:6 비율로 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 벡터 : 항원을 1:7 비율로 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 벡터 : 항원을 1:8 비율로 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 벡터 : 항원을 1:9 비율로 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 벡터 : 항원을 1:10 비율로 포함한다.
일부 양태에서, 백신은 조합 백신이며, 여기서, 백신은 각각의 벡터가 적어도 하나의 단일 항원을 함유하는 적어도 2개의 벡터를 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 조합 백신이며, 여기서, 백신은 각각의 벡터가 적어도 하나의 단일 항원을 함유하는 적어도 3개의 벡터를 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 조합 백신이며, 여기서, 백신은 각각의 벡터가 적어도 하나의 단일 항원을 함유하는 적어도 3개 초과의 벡터를 포함한다.
일부 양태에서, 백신은 조합 백신이며, 여기서 백신은 적어도 2개의 벡터를 포함하며, 적어도 2개의 벡터 중 제1 벡터는 적어도 하나의 단일 항원을 포함하고 적어도 2개의 벡터 중 제2 벡터는 적어도 2개의 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 조합 백신이며, 여기서 백신은 적어도 3개의 벡터를 포함하며, 적어도 2개의 벡터 중 제1 벡터는 적어도 하나의 단일 항원을 포함하고 적어도 3개의 벡터 중 제2 벡터는 적어도 2개의 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 조합 백신이며, 여기서 백신은 3개 이상의 벡터를 포함하며, 3개 이상의 벡터 중 제1 벡터는 적어도 하나의 단일 항원을 포함하고 3개 이상의 벡터 중 제2 벡터는 적어도 2개의 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 조합 백신이며, 여기서 백신은 각각이 적어도 2개의 항원을 함유하는 3개 초과의 벡터를 포함한다.
상이한 항원들의 혼합물이 개체 내에 동시에 투여되거나 동일한 벡터 또는 상이한 벡터로부터 발현되는 경우, 이들은 서로 경쟁할 수 있다. 그 결과, 발현되는 항원을 병용 면역요법 또는 백신에 상이한 농도 및 비율로 포함하는 제형은 투여 후 효과적이고 지속적인 면역 반응이 발생하는 것을 보장하기 위해 개체 또는 개체군에서 평가되고 맞춰져야 한다.
다수의 항원들을 포함하는 조성물은 다양한 비율로 존재할 수 있다. 예를 들어, 더 많은 벡터를 포함하는 제형은 다양한 비율을 가질 수 있다. 예를 들어, 면역요법 또는 백신은 2개의 상이한 벡터들을 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, 2:1, 2:3, 2:4, 2:5, 2:6, 2:7, 2:8, 3:1, 3:3, 3:4, 3:5, 3:6, 3:7, 3:8, 3:1, 3:3, 3:4, 3:5, 3:6, 3:7, 3:8, 4:1, 4:3, 4:5, 4:6, 4:7, 4:8, 5:1, 5:3, 5:4, 5:6, 5:7, 5:8, 6:1, 6:3, 6:4, 6:5, 6:7, 6:8, 7:1, 7:3, 7:4, 7:5, 7:6, 7:8, 8:1, 8:3, 8:4, 8:5, 8:6 또는 8:7의 화학양론으로 가질 수 있다. 예를 들어, 면역요법 또는 백신은 3개의 상이한 벡터들을 1:1:1, 1:2:1, 1:3:1, 1:4:1, 1:5:1, 1:6:1, 1:7:1, 1:8:1, 2:1:1, 2:3:1, 2:4:1, 2:5:1, 2:6:1, 2:7:1, 2:8:1, 3:1, 3:3:1, 3:4:1, 3:5:1, 3:6:1, 3:7:1, 3:8:1, 3:1:1, 3:3:1, 3:4:1, 3:5:1, 3:6:1, 3:7:1, 3:8:1, 4:1:1, 4:3:1, 4:4:1, 4:5:1, 4:6:1, 4:7:1, 4:8:1, 5:1:1, 5:3:1, 5:4:1, 5:5:1, 5:6:1, 5:7:1, 5:8:1, 6:1:1, 6:3:1, 6:4:1, 6:5:1, 6:6:1, 6:7:1, 6:8:1, 7:1:1, 7:3:1, 7:4:1, 7:5:1, 7:6:1, 7:7:1, 7:8:1, 8:1:1, 8:3:1, 8:4:1, 8:5:1, 8:6:1, 8:7:1, 8:8:1, 1:1:2, 1:2:2, 1:3:2, 1:4:2, 1:5:2, 1:6:2, 1:7:2, 1:8:2, 2:1:2, 2:3:2, 2:4:2, 2:5:2, 2:6:2, 2:7:2, 2:8:2, 3:1:2, 3:3:2, 3:4:2, 3:5:2, 3:6:2, 3:7:2, 3:8:2, 3:1:2, 3:3:2, 3:4:2, 3:5:2, 3:6:2, 3:7:2, 3:8:2, 4:1:2, 4:3:2, 4:4:2, 4:5:2, 4:6:2, 4:7:2, 4:8:2, 5:1:2, 5:3:2, 5:4:2, 5:5:2, 5:6:2, 5:7:2, 5:8:2, 6:1:2, 6:3:2, 6:4:2, 6:5:2, 6:6:2, 6:7:2, 6:8:2, 7:1:2, 7:3:2, 7:4:2, 7:5:2, 7:6:2, 7:7:2, 7:8:2, 8:1:2, 8:3:2, 8:4:2, 8:5:2, 8:6:2, 8:7:2, 8:8:2, 1:1:3, 1:2:3, 1:3:3, 1:4:3, 1:5:3, 1:6:3, 1:7:3, 1:8:3, 2:1:3, 2:3:3, 2:4:3, 2:5:3, 2:6:3, 2:7:3, 2:8:3, 3:1:3, 3:3:3, 3:4:3, 3:5:3, 3:6:3, 3:7:3, 3:8:3, 3:1:3, 3:3:3, 3:4:3, 3:5:3, 3:6:3, 3:7:3, 3:8:3, 4:1:3, 4:3:3, 4:4:3, 4:5:3, 4:6:3, 4:7:3, 4:8:3, 5:1:3, 5:3:3, 5:4:3, 5:5:3, 5:6:3, 5:7:3, 5:8:3, 6:1:3, 6:3:3, 6:4:3, 6:5:3, 6:6:3, 6:7:3, 6:8:3, 7:1:3, 7:3:3, 7:4:3, 7:5:3, 7:6:3, 7:7:3, 7:8:3, 8:1:3, 8:3:3, 8:4:3, 8:5:3, 8:6:3, 8:7:3, 8:8:3, 1:1:4, 1:2:4, 1:3:4, 1:4:4, 1:5:4, 1:6:4, 1:7:4, 1:8:4, 2:1:4, 2:3:4, 2:4:4, 2:5:4, 2:6:4, 2:7:4, 2:8:4, 3:1:4, 3:3:4, 3:4:4, 3:5:4, 3:6:4, 3:7:4, 3:8:4, 3:1:4, 3:3:4, 3:4:4, 3:5:4, 3:6:4, 3:7:4, 3:8:4, 4:1:4, 4:3:4, 4:4:4, 4:5:4, 4:6:4, 4:7:4, 4:8:4, 5:1:4, 5:3:4, 5:4:4, 5:5:4, 5:6:4, 5:7:4, 5:8:4, 6:1:4, 6:3:4, 6:4:4, 6:5:4, 6:6:4, 6:7:4, 6:8:4, 7:1:4, 7:3:4, 7:4:4, 7:5:4, 7:6:4, 7:7:4, 7:8:4, 8:1:4, 8:3:4, 8:4:3, 8:5:4, 8:6:4, 8:7:4, 8:8:4, 1:1:5, 1:2:5, 1:3:5, 1:4:5, 1:5:5, 1:6:5, 1:7:5, 1:8:5, 2:1:5, 2:3:5, 2:4:5, 2:5:5, 2:6:5, 2:7:5, 2:8:5, 3:1:5, 3:3:5, 3:4:5, 3:5:5, 3:6:5, 3:7:5, 3:8:5, 3:1:5, 3:3:5, 3:4:5, 3:5:5, 3:6:5, 3:7:5, 3:8:5, 4:1:5, 4:3:5, 4:4:5, 4:5:5, 4:6:5, 4:7:5, 4:8:5, 5:1:5, 5:3:5, 5:4:5, 5:5:5, 5:6:5, 5:7:5, 5:8:5, 6:1:5, 6:3:5, 6:4:5, 6:5:5, 6:6:5, 6:7:5, 6:8:5, 7:1:5, 7:3:5, 7:4:5, 7:5:5, 7:6:5, 7:7:5, 7:8:5, 8:1:5, 8:3:5, 8:4:5, 8:5:5, 8:6:5, 8:7:5, 8:8:5, 1:1:6, 1:2:6, 1:3:6, 1:4:6, 1:5:6, 1:6:6, 1:7:6, 1:8:6, 2:1:6, 2:3:6, 2:4:6, 2:5:6, 2:6:6, 2:7:6, 2:8:6, 3:1:6, 3:3:6, 3:4:6, 3:5:6, 3:6:6, 3:7:6, 3:8:6, 3:1:6, 3:3:6, 3:4:6, 3:5:6, 3:6:6, 3:7:6, 3:8:6, 4:1:6, 4:3:6, 4:4:6, 4:5:6, 4:6:6, 4:7:6, 4:8:6, 5:1:6, 5:3:6, 5:4:6, 5:5:6, 5:6:6, 5:7:6, 5:8:6, 6:1:6, 6:3:6, 6:4:6, 6:5:6, 6:6:6, 6:7:6, 6:8:6, 7:1:6, 7:3:6, 7:4:6, 7:5:6, 7:6:6, 7:7:6, 7:8:6, 8:1:6, 8:3:6, 8:4:6, 8:5:6, 8:6:5, 8:7:6, 8:8:6, 1:1:7, 1:2:7, 1:3:7, 1:4:7, 1:5:7, 1:6:7, 1:7:7, 1:8:7, 2:1:7, 2:3:7, 2:4:7, 2:5:7, 2:6:7, 2:7:7, 2:8:7, 3:1:7, 3:3:7, 3:4:7, 3:5:7, 3:6:7, 3:7:7, 3:8:7, 3:1:7, 3:3:7, 3:4:7, 3:5:7, 3:6:7, 3:7:7, 3:8:7, 4:1:7, 4:3:7, 4:4:7, 4:5:7, 4:6:7, 4:7:7, 4:8:7, 5:1:7, 5:3:7, 5:4:7, 5:5:7, 5:6:7, 5:7:7, 5:8:7, 6:1:7, 6:3:7, 6:4:7, 6:5:7, 6:6:7, 6:7:7, 6:8:7, 7:1:7, 7:3:7, 7:4:7, 7:5:7, 7:6:7, 7:7:7, 7:8:7, 8:1:7, 8:3:7, 8:4:7, 8:5:7, 8:6:5, 8:7:7 또는 8:8:7의 화학양론으로 가질 수 있다.
본 개시내용은 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L을 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2개의, 적어도 3개 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원들을 포함하는 병용 면역요법 또는 백신을 제공한다. 예를 들어, 병용 면역요법 또는 백신은 야생형 또는 변형된 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L을 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2개의, 적어도 3개 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원들을 포함할 수 있으며, 여기서, 야생형 또는 변형된 표적 항원은 서열 번호1과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 병용 면역요법 또는 백신은 야생형 또는 변형된 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L을 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2개의, 적어도 3개 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원들을 포함할 수 있으며, 여기서, 야생형 또는 변형된 표적 항원은 서열 번호2와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 병용 면역요법 또는 백신은 야생형 또는 변형된 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L을 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2개의, 적어도 3개 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원들을 포함할 수 있으며, 여기서, 야생형 또는 변형된 표적 항원은 서열 번호4와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 병용 면역요법 또는 백신은 야생형 또는 변형된 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L을 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2개의, 적어도 3개 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원들을 포함할 수 있으며, 여기서, 야생형 또는 변형된 표적 항원은 서열 번호5와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 병용 면역요법 또는 백신은 야생형 또는 변형된 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L을 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2개의, 적어도 3개 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원들을 포함할 수 있으며, 여기서, 야생형 또는 변형된 표적 항원은 서열 번호6과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은, EA에 대한 다중-표적화된 면역치료제를 포함하는 병용 면역요법, 및 면역 저해 경로의 적어도 하나의 면역-체크포인트 단백질을 표적으로 하는 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함하는 분자 조성물을 제공한다. 본 개시내용은, 야생형 또는 변형된 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L을 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2개의, 적어도 3개 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원, 및 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함하는 적어도 하나의 분자 조성물을 포함하는 병용 면역요법 또는 백신을 제공한다. 예를 들어, 병용 면역요법 또는 백신은 변형된 야생형 또는 변형된 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L을 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2개의, 적어도 3개 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원, 및 면역-체크포인트 저해 경로의 적어도 하나의 분자 조성물을 포함할 수 있으며, 여기서, 변형된 표적 항원은 서열 번호1, 2, 4, 5, 및/또는 6과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 분자 조성물은 CTLA4를 표적으로 하는 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 분자 조성물은 PD1을 표적으로 하는 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 분자 조성물은 PDL1을 표적으로 하는 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 분자 조성물은 LAG3을 표적으로 하는 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 분자 조성물은 B7-H3을 표적으로 하는 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 분자 조성물은 B7-H4를 표적으로 하는 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 분자 조성물은 TIM3을 표적으로 하는 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 조성물은 PD1, PDL1, PDL2, CD28, CD80, CD86, CTLA4, B7RP1, ICOS, B7RPI, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TCR, LAG3, CD137, CD137L, OX40, OX40L, CD27, CD70, CD40, CD40L, TIM3(즉, HAVcr2), GAL9 및 A2aR에 대한 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함한다.
면역학적 융합 파트너 항원 표적
본 발명의 바이러스 벡터는 또한, 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 측면에서, 이러한 단백질을 함유하는 아데노바이러스 벡터를 사용한 면역화 후 생성되는 단백질은, 관심 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 단백질에 융합된 관심 표적 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
일 실시형태에서, 이러한 면역학적 융합 파트너는 미코박테리움 sp., 예컨대 미코박테리움 튜버쿨로시스-유래의 Ra12 단편으로부터 유래된다. 이종성 폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열의 발현 및/또는 면역원성을 증강시키는 데 있어서의 Ra12 조성물 및 이의 사용 방법은 미국 특허 출원 60/158,585 및 미국 특허 7,009,042에 기재되어 있다. 간략하게는, Ra12는 미코박테리움 튜버쿨로시스 MTB32A 핵산의 하위서열인 폴리뉴클레오타이드 영역을 지칭한다. MTB32A는 M. 튜버쿨로시스의 독성(virulent) 균주 및 무독성(avirulent) 균주에서 유전자에 의해 코딩된 32 kDa의 세린 프로테아제이다. MTB32A의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 기재되어 있다(예, 미국 특허 출원 60/158,585; 문헌[Skeiky et al., Infection and Immun. 67:3998-4007 (1999)] 참조). MTB32A 코딩 서열의 C-말단 단편은 높은 수준으로 발현되고, 정제 공정 전체 동안 용해성 폴리펩타이드로 남아 있다. 더욱이, Ra12는, 이것이 융합되는 이종성 면역원성 폴리펩타이드의 면역원성을 증강시킬 수 있다. 하나의 Ra12 융합 폴리펩타이드는 MTB32A의 아미노산 잔기 192 내지 323에 상응하는 14 kDa C-말단 단편을 포함한다. 다른 Ra12 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로, Ra12 폴리펩타이드의 일부를 코딩하는 적어도 약 15, 30, 60, 100, 200, 300개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. Ra12 폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, Ra12 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오타이드 변이체는, 코딩된 융합 폴리펩타이드의 생물학적 활성이 천연 Ra12 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드와 비교하여 실질적으로 감소하지 않도록, 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 변이체는 천연 Ra12 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 80% 또는 90% 또는 그 이상의 동일성을 가질 수 있다.
면역학적 융합 파트너는 그람-음성 박테리아 헤모필루스 인플루엔자 B의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 단백질 D 유도체는 이 단백질의 대략 1/3(예, 처음 N-말단 100-110 아미노산)을 포함한다. 단백질 D 유도체는 지질화될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 지질단백질 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기는 N-말단 상에 포함되어, 폴리펩타이드에 부가적인 외인성 T-세포 에피토프를 제공하며, 이는 이. 콜라이에서 발현 수준을 증가시킬 수 있고 발현 인핸서로서 작용할 수 있다. 지질 꼬리는 항원 제시 세포에의 항원의 최적의 제시를 보장할 수 있다. 다른 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스 유래의 비-구조 단백질인 NS1(헤마글루티닌)을 포함한다. 전형적으로, N-말단 81개 아미노산이 사용되지만, T-헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편들도 사용될 수 있다.
면역학적 융합 파트너는 LYTA로서 알려진 단백질 또는 이의 일부(바람직하게는 C-말단 부분)일 수 있다. LYTA는 스트렙토콕커스 뉴모니애로부터 유래되며, (LytA 유전자에 의해 코딩되는) 아미다제 LYTA로서 알려진 N-아세틸-L-알라닌 아미다제를 합성한다. LYTA는 펩티도글리칸 백본에서 소정의 결합을 특이적으로 분해사는 자가용해소(autolysin)이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 일부 콜린 유사체에 대한 친화성을 책임진다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 이. 콜라이 C-LYTA 발현 플라스미드의 개발에 이용되어 왔다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 이용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, LYTA의 반복부는 융합 폴리펩타이드 내에 혼입될 수 있다. 반복부는 예를 들어, 잔기 178에서 시작하는 C-말단 영역에서 발견될 수 있다. 하나의 특정 반복부는 잔기 188-305를 혼입한다.
일부 실시형태에서, 항원 표적은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13의 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 면역원성 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 표적은 추가로, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13의 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 하나 이상의 면역원성 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 표적은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13을 코딩하는 핵산, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13과 실질적인 동일성을 가진 단백질, 및 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13과 실질적인 동일성을 가진 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 면역원성 성분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 표적은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13의 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 면역원성 성분에 융합되거나 연결된다. 일부 실시형태에서, 항원 표적은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13의 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 면역원성 성분과 함께 세포에서 공동-발현된다.
면역 경로 체크포인트 조정제
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 면역 경로 체크포인트 조정제와 함께 투여된다. 활성화 신호와 저해 신호 사이의 균형은 T 림프구와 질병 세포 사이의 상호작용을 제어하며, 여기서, T-세포 반응은 T-세포 수용체(TCR)에 의한 항원 인지를 통해 개시된다. 저해 경로 및 신호는 면역 체크포인트로서 지칭된다. 정상적인 환경에서, 면역 체크포인트는 자가면역을 조절하고 예방하는 데 중요한 역할을 하며, 또한 병원성 감염에 대한 반응에서 조직 손상으로부터 보호한다.
본 개시내용은 에볼라 감염의 치료를 위해 면역 체크포인트 저해 경로를 조정하기 위한 바이러스 벡터-기반 백신 및 조성물을 포함하는 병용 면역요법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조정은 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 것이다. 일부 실시형태에서, 조정은 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 것이다. 일부 실시형태에서, 조정은 유전자 또는 단백질의 패밀리에 영향을 미친다.
일반적으로, 면역 저해 경로는 리간드-수용체 상호작용에 의해 개시된다. 현재, 질병에서, 해당 질병은 면역-체크포인트 경로를 피험체에서 면역 저항을 유도하기 위한 메커니즘으로서 끌어들일 수 있다.
피험체에서 주어진 질병에 의한 면역 저항 또는 면역 저해 경로의 유도는, 하나 이상의 면역 저해 경로를 조정하는 것으로 알려진 분자 조성물, 예컨대 siRNA, 안티센스, 저분자, 모방체, 재조합 형태의 리간드, 수용체 또는 단백질, 또는 항체(Ig 융합 단백질일 수 있음)에 의해 차단될 수 있다. 예를 들어, 면역-체크포인트 단백질의 차단제, 예컨대 세포독성 T-림프구-연관된 항원 4(CTLA4) 및 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD1)을 이용한 예비 임상 발견은 항-종양 면역을 증강시키는 데 유망한 것으로 나타났다.
질병에 걸린 세포가 다수의 저해 리간드들을 발현할 수 있고 질병-침윤성 림프구가 다수의 저해 수용체들을 발현할 수 있기 때문에, 면역 체크포인트 단백질의 이중 또는 삼중 차단은 항-질병 면역을 증강시킬 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 병용 면역요법은 하기 면역-체크포인트 단백질: PD1, PDL1, PDL2, CD28, CD80, CD86, CTLA4, B7RP1, ICOS, B7RPI, B7-H3(CD276으로도 알려져 있음), B7-H4 (B7-S1, B7x 및 VCTN1로도 알려져 있음), BTLA(CD272로도 알려져 있음), HVEM, KIR, TCR, LAG3(CD223으로도 알려져 있음), CD137, CD137L, OX40, OX40L, CD27, CD70, CD40, CD40L, TIM3(HAVcr2로도 알려져 있음), GAL9, A2aR 및 아데노신 중 하나 이상을 표적으로 하는 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함하는 하나 이상의 분자 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분자 조성물은 siRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 조성물은 저분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 조성물은 재조합 형태의 리간드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 조성물은 재조합 형태의 수용체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 조성물은 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 병용 요법은 1개 초과의 분자 조성물 및/또는 1개 초과 타입의 분자 조성물을 포함한다. 당업자가 이해하게 될 바와 같이, 면역 체크포인트 저해 경로 중 향후 발견되는 단백질 또한, 본 개시내용에 포함되어야 한다.
일부 실시형태에서, 병용 면역요법은 CTLA4의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 병용 면역요법은 PD1의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 병용 면역요법은 PDL1의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 병용 면역요법은 LAG3의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 병용 면역요법은 B7-H3의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 병용 면역요법은 B7-H4의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 병용 면역요법은 TIM3의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조정은 발현의 증가 또는 증강이다. 다른 실시형태에서, 조정은 발현의 감소 또는 부재이다.
2개의 예시적인 면역 체크포인트 저해제로는 세포독성 T 림프구 연관 항원-4(CTLA-4) 및 프로그래밍된 세포 사멸 단백질-1(PD1)이 있다. CTLA-4는 T-세포 상에서만 발현될 수 있으며, 여기서 이는 T-세포 활성화의 조기 단계를 제어한다. CTLA-4는 공동-자극 T-세포 수용체 CD28과 상호작용하여, T-세포 활성을 저해하는 신호전달을 초래할 수 있다. 일단 TCR 항원 인지가 발생하면, CD28 신호전달은 TCR 신호전달을 증강시킬 수 있어서 일부 경우에 활성화된 T-세포를 초래할 수 있고, CTLA-4는 CD28의 신호전달 활성을 저해한다. 본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 면역요법을 에볼라 치료용 항-CTLA-4 모노클로날 항체와 병용하여 제공한다. 본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 면역요법을 에볼라 치료용 CTLA-4 분자 조성물과 병용하여 제공한다.
프로그래밍된 사멸 세포 단백질 리간드-1(PDL1)은 B7 패밀리의 구성원이고, 다양한 조직 및 세포 타입들에 분포되어 있다. PDL1은 PD1과 상호작용하여 T-세포 활성화 및 CTL 매개 용해를 저해할 수 있다. PDL1의 유의한 발현은 다양한 인간 종양들 상에서 나타나 있으며, PDL1 발현은 종양이 숙주 항-종양 면역 반응을 모면하는 주요 메커니즘의 하나이다. 프로그래밍된 사멸-리간드 1(PDL1) 및 프로그래밍된 세포 사멸 단백질-1(PD1)은 면역 체크포인트로서 상호작용한다. 이러한 상호작용은 주요 관용성 메커니즘일 수 있으며, 항-종양 면역 반응의 막힘 및 후속적인 종양 진행을 초래한다. PD1은 활성화된 T 세포 상에 존재하고, PD1의 1차적인 리간드인 PDL1은 종종 종양 세포 및 항원-제시 세포(APC)뿐만 아니라 B 세포를 포함한 다른 세포 상에서 발현된다. PDL1의 유의한 발현은 HPV-연관된 두경부암을 포함한 다양한 인간 종양들에서 나타나 있다. PDL1은 T 세포 상의 PD1과 상호작용하여, T 세포 활성화 및 세포독성 T 림프구(CTL) 매개 용해를 저해한다. 본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 면역요법을 에볼라 치료용 항-PD1 모노클로날 항체 또는 항-PDL1 모노클로날 항체와 병용하여 제공한다. 본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 면역요법을 에볼라 치료용 PD1 또는 항-PDL1 분자 조성물과 병용하여 제공한다. 본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 면역요법을 에볼라 치료용 항-CTLA-4 모노클로날 항체 및 항-PD1 모노클로날 항체와 병용하여 제공한다. 본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 면역요법을 에볼라 치료용 항-CTLA-4 모노클로날 항체 및 PDL1 모노클로날 항체와 병용하여 제공한다. 본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 면역요법을 에볼라 치료용 항-CTLA-4, 항-PD1, PDL1, 모노클로날 항체 또는 이들의 조합과 병용하여 제공한다.
면역 체크포인트 분자는 T 세포에 의해 발현될 수 있다. 면역 체크포인트 분자는 "브레이크"로서 효과적으로 역할을 하여, 면역 반응을 하향-조정하거나 저해할 수 있다. 면역 체크포인트 분자로는, 면역 세포를 직접적으로 저해하는 프로그래밍된 사멸 1(PD1, 또한 PDCD1 또는 CD279로 알려져 있음, 수탁 번호: NM_005018), 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4, 또한 CD152로 알려져 있음, GenBank 수탁 번호 AF414120.1), LAG3(또한 CD223으로 알려져 있음, 수탁 번호: NM_002286.5), Tim3(또한 HAVCR2로 알려져 있음, GenBank 수탁 번호: JX049979.1), BTLA(또한 CD272로 알려져 있음, 수탁 번호: NM_181780.3), BY55(또한 CD160으로 알려져 있음, GenBank 수탁 번호: CR541888.1), TIGIT(또한 IVSTM3으로 알려져 있음, 수탁 번호: NM_173799), LAIR1(또한 CD305로 알려져 있음, GenBank 수탁 번호: CR542051.1), SIGLECIO(GenBank 수탁 번호: AY358337.1), 2B4(또한 CD244로 알려져 있음, 수탁 번호: NM_001166664.1), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7, SIGLEC9, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIFl, ILIORA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, PD1은 이를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 본 발명의 아데노바이러스 백신과 병용될 수 있다.
표 1은 본 발명의 아데노바이러스 백신의 효율을 개선하기 위해 불활성화될 수 있는 예시적인 면역 체크포인트 유전자를 완전하지는 않지만 보여준다. 면역 체크포인트 유전자는 표 1에 열거된 이러한 유전자, 및 수용체 기능, 세포 사멸, 사이토카인 신호전달, 아르기닌 트립토판 고갈, TCR 신호전달, 유도된 T-reg 억제, 전사 인자 조절 소진(exhaustion) 또는 아네르기(anergy), 및 저산소증 매개 관용성을 공동-저해하는 데 관여하는 다른 것들로부터 선택될 수 있다.
유전자 기호 NCBI # (GRCh38.p2) 출발 정지 게놈 위치
1 ADORA2A 135 24423597 24442360 22q11.23
2 CD276 80381 73684281 73714518 15q23-q24
3 VTCN1 79679 117143587 117270368 1p13.1
4 BTLA 151888 112463966 112499702 3q13.2
5 CTLA4 1493 203867788 203873960 2q33
6 IDO1 3620 39913809 39928790 8p12-p11
7 KIR3DL1 3811 54816438 54830778 19q13.4
8 LAG3 3902 6772483 6778455 12p13.32
9 PDCD1 5133 241849881 241858908 2q37.3
10 HAVCR2 84868 157085832 157109237 5q33.3
11 VISTA 64115 71747556 71773580 10q22.1
12 CD244 51744 160830158 160862902 1q23.3
13 CISH 1154 50606454 50611831 3p21.3
아데노바이러스-기반 백신 및 면역 경로 체크포인트 조정제의 병용은 어느 한 제제 단독과 비교하여 치료받는 환자에서 에볼라 감염, 진행 또는 증상을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 아데노바이러스-기반 백신 및 면역 경로 체크포인트 조정제의 병용은 어느 한 제제 단독과 비교하여 치료받는 환자에서 총 생존율을 개선할 수 있다. 일부 경우에, 아데노바이러스 백신 및 면역 경로 체크포인트 조정제의 병용은 어느 한 제제 단독과 비교하여 치료받는 환자에서 에볼라-특이적 T 세포 반응의 빈도 또는 강도를 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 아데노바이러스 벡터-기반 백신의 성능을 개선하기 위한 면역 체크포인트 저해의 용도를 개시한다. 상기 면역 체크포인트 저해는 백신접종 시 투여될 수 있다. 상기 면역 체크포인트 저해는 또한, 백신 후에 투여될 수 있다. 면역 체크포인트 저해는 아데노바이러스 백신 투여와 동시에 발생할 수 있다. 면역 체크포인트 저해는 백신접종 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60분째에 발생할 수 있다. 면역 체크포인트 저해는 또한, 백신접종 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간째에 발생할 수 있다. 일부 경우에, 면역 저해는 백신접종 후 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일째에 발생할 수 있다. 면역 체크포인트 저해는 백신접종 이전 또는 이후에 임의의 시간에 발생할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항원 및 면역 경로 체크포인트 조정제를 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 면역 체크포인트 단백질, 예를 들어 PD1, 및 피험체의 세포 상의 이의 천연 결합 파트너(들)의 하향조절로부터 이득을 얻을 병태를 가진 피험체를 치료하는 방법에 관한 것일 수 있다.
면역 경로 체크포인트 조정제는 임의의 항원을 포함하는 아데노바이러스 백신과 병용될 수 있다. 예를 들어, 항원은 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L일 수 있다. 면역 경로 체크포인트 조정제는 백신과 병용 시, 상승작용 효과를 발휘할 수 있다. 면역 경로 체크포인트 조정제는 또한, 백신과 병용 시, 부가(상가) 효과를 발휘할 수 있다.
제형
본 발명은 단독으로 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 함께 임의의 경로에 의해 투여될 수 있는 백신접종 처방을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 이러한 투여는 단일 투여량 및 다수의 투여량 둘 다로 수행될 수 있다. 보다 특히, 약제학적 조성물은 다양한 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 정제, 캡슐, 론제지, 트로키, 핸드 캔디, 분말, 스프레이, 수성 현탁액, 주사액, 엘릭셔, 시럽 등의 형태로 병용될 수 있다. 이러한 담체로는, 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 배지 및 다양한 무독성 유기 용매 등이 있다. 더욱이, 이러한 경구 약제학적 제형은 이러한 목적을 위해 보편적으로 이용되는 타입의 다양한 제제들에 의해 적합하게 감미 및/또는 풍미될 수 있다. 명세서 전체에 기재된 조성물은 약제학적 약제 내로 제형화될 수 있고, 이를 필요로 하는 에볼라와 같은 질병을 진단받은 인간 또는 포유류를 치료하는 데 사용될 수 있다.
투여를 위해, 아데노바이러스 벡터 스톡은 적절한 완충제, 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 등과 조합될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 적절한 수의 바이러스 벡터 입자(VP)가 적절한 완충제, 예컨대 멸균 PBS 또는 식염수에서 투여된다. 소정의 실시형태에서, 본원에 개시된 바이러스 벡터 조성물은 피하, 비경구, 정맥내, 근육내 또는 심지어 복강내 투여용의 특정한 제형으로 제공된다. 소정의 실시형태에서, 유리 염기 또는 약물학적으로 허용 가능한 염으로서 활성 화합물의 용액 내의 제형은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한, 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 스쿠알렌-기반 에멀젼, 스쿠알렌-기반 수-중-유 에멀젼, 유-중-수 에멀젼, 수-중-유 에멀젼, 비수성 에멀젼, 파라핀유-중-수 에멀젼 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 삼키거나 좌제에 의해 투여되는 알약 형태용 특정 제형으로 제공될 수 있다.
주사용으로 적합한 예시적인 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사액 또는 분산액의 임기 제조용 멸균 분말을 포함한다(예, 미국 특허 5,466,468 참조). 용이한 주사성이 존재하는 정도까지의 유체 형태가 바람직할 수 있다. 제조 및 저장 조건 하에 안정한 형태가 본 발명의 범주 내에 존재한다. 다양한 실시형태들에서, 형태는 박테리아, 곰팡이 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존된다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물유를 함유하는 용매 또는 분산액 배지일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및/또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 및 티메로살에 의해 촉진될 수 있다. 등장성제, 예를 들어 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물에서 흡수를 지연하는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 유발될 수 있다.
일 실시형태에서, 수용액에서의 비경구 투여를 위해, 용액은 필요하다면 적합하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 처음에 충분한 식염수 또는 글루코스와 등장성으로 유지될 수 있다. 이들 특정 수용액은 특히, 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이러한 맥락에서, 이용될 수 있는 멸균 수성 배지는 본 개시내용의 측면에서 당업자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량은 1 mL의 등장성 NaCl 용액에 용해되고, 1000 mL의 대량피하주사 유체에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다. 투여량의 일부 변화는 치료받는 피험체의 병태에 따라 발생할 수 있다.
제형의 담체는 임의의 및 모든 용매, 분산액 배지, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함할 수 있다. 임의의 종래의 배지 또는 제제가 활성 성분과 비융화성인 경우를 제외하고는, 치료 조성물에서의 이의 용도가 고려된다. 보조 활성 성분 또한, 조성물 내에 혼입될 수 있다. GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및 L.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 하나 이상의 면역자극제, 예컨대 보조제와 함께 투여될 수 있다. 면역자극제는 항원에 대한 면역 반응(항체 및/또는 세포-매개)을 증강시키거나 강력하게 하는 본질적으로 임의의 성분을 지칭한다. 하나의 타입의 면역자극제는 보조제를 포함한다. 많은 보조제들은 항원을 신속한 대사로부터 보호하도록 디자인된 성분, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드 또는 미네랄 오일, 및 면역 반응의 자극제, 예컨대 지질 A, 보르타델라 페르투씨스 또는 미코박테리움 튜버쿨로시스 유래 단백질을 함유한다. 소정의 보조제는 예를 들어, Freund's Incomplete 보조제 및 Complete 보조제(Difco Laboratories); Merck 보조제 65(Merck and Company, Inc.), AS-2(SmithKline Beecham); 알루미늄 염, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드 젤(알룸(alum)) 또는 알루미늄 포스페이트; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 다당류; 폴리포스파젠; 생분해성 마이크로스피어; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼(quil) A로서 상업적으로 입수 가능하다. 사이토카인, 예컨대 GM-CSF, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및/또는 IL-13, 및 성장 인자와 같은 다른 것들 또한, 보조제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 소정의 실시형태에서, 보조제 조성물은 주로 Th1 타입의 면역 반응을 유도하는 것일 수 있다. 높은 수준의 Th1-타입 사이토카인(예, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. 이와는 대조적으로, 높은 수준의 Th2-타입 사이토카인(예, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. 본원에 제공된 바와 같은 백신의 적용 후, 환자는 Th1-타입 반응 및/또는 Th2-타입 반응을 유도하는 면역 반응을 지지할 수 있다. 반응이 주로 Th1-타입인 소정의 실시형태에서, Th1-타입 사이토카인의 수준은 Th2-타입 사이토카인의 수준보다 더 큰 범위까지 증가할 것이다. 이들 사이토카인의 수준은 표준 검정법을 사용하여 쉽게 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다양한 실시형태는 복제 결함 바이러스 벡터 요법과 동시에 제공되는 사이토카인, 예를 들어, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및/또는 IL-13을 사용하여 표적 항원, 예를 들어 서열 번호1, 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호5 또는 서열 번호6에 대한 면역 반응을 상승시키는 요법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인, 또는 사이토카인을 코딩하는 핵산은 본원에 기재된 복제 결함성 바이러스와 함께 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 투여는 바이러스 벡터 투여 이전 또는 후속해서 수행된다. 일부 실시형태에서, 표적 항원, 예를 들어, 서열 번호1, 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호5 또는 서열 번호6에 대한 면역 반응을 상승시킬 수 있는 복제 결함 바이러스 벡터는 사이토카인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
주로 Th1-타입 반응을 이끌어내기 위한 소정의 예시적인 보조제로는, 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 예컨대 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄염의 병용이 있다. MPL® 보조제는 상업적으로 입수 가능하다. CpG-함유 올리고뉴클레오타이드(여기서, CpG 다이뉴클레오타이드가 비메틸화되어 있음) 또한, 주로 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 잘 알려져 있고, 기재되어 있다. 면역자극성 DNA 서열 또한, 기재되어 있다. 본 발명에 사용하기 위한 또 다른 보조제는 사포닌, 예컨대 Quil A, 또는 QS21 및 QS7을 포함한 이의 유도체; 에스신(escin); 디기토닌(digitonin); 또는 깁소필라(gypsophila) 또는 케노포디움 퀴노아(chenopodium quinoa) 사포닌을 포함한다. 다른 제형은 본 발명의 보조 병용, 예를 들어 예를 들어 QS21, QS7, Quil A, β-에스신 또는 디기토닌을 포함하는 하기 군 중 적어도 2개의 병용에서 1개 초과의 사포닌을 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 조성물은 비내 스프레이, 흡입 및/또는 다른 에어로졸 운반 비히클에 의해 전달될 수 있다. 비내 미세입자 수지 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물(미국 특허 5,725,871)을 사용한 약물의 운반은 약제학적 분야에 잘 알려져 있다. 폴리테트라플루오로에틸렌 지지 매트릭스 형태의 예시적인 경점막 약물 운반이 기재되어 있다.
소정의 실시형태에서, 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 지질 입자, 비히클 등은 적합한 숙주 세포/유기체 내로의 본 발명의 조성물의 도입을 위해 사용된다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 비히클, 나노스피어 또는 나노입자 등 내에서 운반을 위해 제형화될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 이러한 담체 비히클의 표면에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다.
잠재적인 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀-유사 조제물의 형성 및 용도는 일반적으로 당업자에게 알려져 있다(문헌[Lasic, Trends Biotechnol 1998 July; 16(7):307-21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 March; 56(3):691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 1997 August; 35(8):801-9; Margalit, Crit. Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995; 12(2-3):233-61]; 미국 특허 5,567,434; 미국 특허 5,552,157; 미국 특허 5,565,213; 미국 특허 5,738,868 및 미국 특허 5,795,587 참조).
리포좀은 T 세포 현탁액, 원발성 간세포 배양물 및 PC 12 세포를 포함하여, 다른 절차에 의해서 형질감염시키기에 통상적으로 어려운 다수의 세포 타입들과 함께 성공적으로 사용되어 왔다. 리포좀은 유전자, 다양한 약물, 방사성치료제, 효소, 바이러스, 전사 인자, 알로스테릭 효과기 등을 여러 가지 배양된 세포주 및 동물 내에 도입하는 데 효과적으로 사용되어 왔다. 더욱이, 리포좀의 사용은 전신 운반 후, 자가면역 반응 또는 비허용 가능한 독성과 연관된 것으로 보이지 않는다.
소정의 실시형태에서, 리포좀은 수성 배지 내에 분산되어 멀티라멜라 동심 2층 소낭(멀티라멜라 소낭(MLV)으로도 지칭됨)을 자발적으로 형성하는 인지질로부터 형성된다.
대안적으로, 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 약제학적으로-허용 가능한 나노캡슐 제형을 제공한다. 나노캡슐은 일반적으로, 안정하고 재현 가능한 방식으로 화합물을 가둬둘 수 있다. 세포내 중합체성 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자(크기가 약 0.1 ㎛임)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 디자인될 수 있다. 이러한 입자는 문헌[Couvreur et al., Crit. Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988; 5(1):1-20; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. 1998 March; 45(2):149-55; Zambaux et al. J Controlled Release. 1998 Jan. 2; 50(1-3):31-40]; 및 미국 특허 5,145,684에 기재된 바와 같이 제작될 수 있다.
방법
다양한 실시형태들에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 인간 세포용해 T-세포(CTL), 예컨대 선택된 MHC 분자, 예를 들어 HLA-A2, HLA-A3 및 HLA-A24에 결합하는 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L 에피토프를 인지하는 것들을 이용한다. 소정의 혈청형의 MHC 분자, 예를 들어 HLA-A2, HLA-A3 및 HLA-A24를 발현하는 개체는 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 요법을 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 소정의 혈청형의 MHC 분자, 예를 들어 HLA-A2, HLA-A3 및 HLA-A24를 발현하는 개체는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L에 대한 면역 반응을 상승시키는 것을 포함하는 요법을 위해 선택될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 이들 T-세포는 말초 혈액 단핵 세포를 자극시키기 위해 관심 에피토프를 이용하여 펄스 항원 제시 세포를 사용하여 시험관내에서의 배양에 의해 발생될 수 있다. 또한, T-세포주는 또한, GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L 라텍스 비드, GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L 단백질-펄스 플라스틱 부착성 말초 혈액 단핵 세포, 또는 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L RNA를 이용하여 감작된 DC를 이용한 자극 후, 발생될 수 있다. T-세포는 또한, GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L 면역원을 코딩하는 백신 벡터를 이용하여 면역화된 환자로부터 발생될 수 있다. GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L 유래의 HLA A2-제시된 펩타이드는 에볼라에 의해 감염된 환자에서 추가로 발견될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 발명은 백신-GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L을 이용하여 면역화된 환자로부터의 CTL을 자극시키는 능력을 가진 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L의 HLA A2 제약된 에피토프에 관한 것이다.
치료 방법
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 표적 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위한 다수의 백신 셋팅들에서 사용될 수 있다. 본 발명은 임의의 표적 항원, 예컨대 본원 어디에서나 기재된 것들에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법을 제공한다. 아데노바이러스 벡터는, 이것이 Ad에 대한 기존 면역을 가진 피험체에서 면역 반응을 발생시키는 데 사용될 수 있고 아데노바이러스 벡터를 사용한 다수 차례의 면역화를 포함하는 백신접종 처방, 이전 세대의 아데노바이러스 벡터를 사용하여서는 가능하지 않은 처방에 사용될 수 있다는 예상치 못한 발견 때문에 특히 중요하다.
일반적으로, 면역 반응의 발생은 체액성 반응 및/또는 세포-매개 반응의 유도를 포함한다. 관심 표적 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 면역 반응의 발생은 면역 시스템의 소정의 세포의 활성 및/또는 수의 감소, 또는 소정의 사이토카인 또는 다른 효과기 분자의 수준 및/또는 활성의 감소를 수반할 수 있다. 면역 반응(예, 세포 수, 사이토카인 발현, 세포 활성)에서의 변경을 검출하기 위한 여러 가지 방법들은 당업계에 알려져 있고, 본 발명의 맥락에서 유용하다. 이러한 맥락에서 유용한 예시적인 방법은 세포내 사이토카인 염색(ICS), ELISPOT, 증식 검정법, 크롬 방출을 포함하는 세포독성 T-세포 검정법 또는 등가의 검정법, 및 임의의 수의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 RT-PCR-기반 검정법을 사용한 유전자 발현 분석을 포함한다.
면역 반응의 발생은 대조군과 비교하여 본 발명의 아데노바이러스 벡터가 투여된 피험체에서 표적 항원-특이적 CTL 활성의 1.5배 내지 5배의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 면역 반응의 발생은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 피험체에서 표적 항원-특이적 CTL 활성의 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 또는 그 이상의 증가를 포함한다.
면역 반응의 발생은 적절한 대조군과 비교하여, 표적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 본 발명의 아데노바이러스 벡터가 투여된 피험체에서 표적 항원-특이적 HTL 활성, 예컨대 헬퍼 T-세포의 증식의 1.5배 내지 5배의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 면역 반응의 발생은 대조군과 비교하여, 표적-특이적 HTL 활성의 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 또는 그 이상의 증가를 포함한다. 이러한 맥락에서, HTL 활성은 특정 사이토카인, 예컨대 인터페론-γ(IFN-γ), 인터루킨-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 또는 다른 사이토카인의 생성에서 상기 기재된 바와 같은 증가 또는 감소를 포함할 수 있다. 이러한 측면에서, 면역 반응의 발생은 Th2 타입 반응으로부터 Th1 타입 반응으로의 시프트를 포함할 수 있거나, 소정의 실시형태에서 Th1 타입 반응으로부터 Th2 타입 반응으로의 시프트를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 면역 반응의 발생은 주로 Th1 타입 반응 또는 Th2 타입 반응의 자극을 포함할 수 있다.
면역 반응의 발생은 적절한 대조군과 비교하여, 본 발명의 아데노바이러스 벡터가 투여된 피험체에서 표적-특이적 항체 생성의 1.5배 내지 5배의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 면역 반응의 발생은 대조군과 비교하여, 아데노바이러스 벡터가 투여된 피험체에서 표적-특이적 항체 생성의 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 또는 그 이상의 증가를 포함한다.
따라서, 본 발명은, a) 복제 결함 아데노바이러스 벡터, 여기서, 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역에 결실을 가짐, 및 b) 표적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 개체에게 투여하는 단계; 및 상기 아데노바이러스 벡터를 상기 개체에게 적어도 1회 재투여하는 단계; 이로써, 상기 표적 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 단계를 포함하는, 관심 표적 항원에 대한 면역 반응의 발생 방법을 제공한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명은, 투여되는 벡터가 거티드 벡터가 아닌 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에서, 표적 항원은 야생형 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24, L, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 a) 복제 결함 아데노바이러스 벡터, 여기서, 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역에 결실을 가짐, 및 b) 표적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 개체에게 투여하는 단계; 및 상기 아데노바이러스 벡터를 상기 개체에게 적어도 1회 재투여하는 단계; 이로써, 상기 표적 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 단계를 포함하는, 개체에서 표적 항원에 대한 면역 반응의 발생 방법을 제공하며, 여기서, 상기 개체는 Ad에 대한 기존 면역을 가진다. 특정한 실시형태에서, 표적 항원은 야생형 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24, L, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 포함한다.
Ad에 대한 기존 면역에 관하여, 이는 Ad 항체의 존재를 시험하기 위한 당업계에 알려진 방법, 예컨대 항체-기반 검정법을 사용하여 확인될 수 있다. 나아가, 소정의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 우선, 개체가 Ad에 대한 기존 면역을 가진 것인지 확인한 다음, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태는, 아데노바이러스 벡터가 E2b 영역에 결실을 가진 복제 결함 아데노바이러스 벡터, 및 적어도 하나의 표적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 아데노바이러스 벡터를 개체에게 투여하는 단계; 아데노바이러스 벡터가 E2b 영역에 결실을 가진 복제 결함 아데노바이러스 벡터, 및 적어도 하나의 표적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 아데노바이러스 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 하나 이상의 표적 항원에 대한 면역 반응의 발생 방법을 제공하며, 여기서, 제2 아데노바이러스 벡터의 적어도 하나의 표적 항원은 제1 아데노바이러스 벡터의 적어도 하나의 표적 항원과 동일하거나 상이하다. 특정한 실시형태에서, 표적 항원은 야생형 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24, L, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 포함한다.
따라서, 본 발명은 동일한 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 사용한 복수의 면역화, 또는 상이한 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 사용한 복수의 면역화를 고려한다. 각각의 경우, 아데노바이러스 벡터는 본원 어디에서나 기재된 바와 같은 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 방법은 하나의 표적 항원을 코딩하는 E2b 결실된 아데노바이러스를 사용한 복수의 면역화, 및 동일한 아데노바이러스 벡터의 수회의 재투여를 포함하며, 이로써 표적 항원에 대한 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24, L, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 방법은 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 제1 아데노바이러스 벡터를 이용한 면역화, 및 그런 다음 제1 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 항원과 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 제2 아데노바이러스 벡터를 이용한 투여를 포함한다. 이러한 측면에서, 코딩된 표적 항원들 중 하나가 상이할 수 있거나, 모든 코딩된 표적 항원들이 상이할 수 있거나, 일부는 동일할 수 있고 일부는 상이할 수 있다. 나아가, 소정의 실시형태에서, 본 방법은 제1 아데노바이러스 벡터를 수회 투여하고, 제2 아데노바이러스 벡터를 수회 투여하는 것을 포함한다. 이러한 측면에서, 본 방법은 제1 아데노바이러스 벡터를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회 또는 그 이상 투여하고, 제2 아데노바이러스 벡터를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회 또는 그 이상 투여하는 것을 포함한다. 투여 순서는, 제1 아데노바이러스를 1회 또는 연이어서 수회 투여한 다음, 제2 아데노바이러스를 1회 또는 연이어서 수회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 방법은 제1 아데노바이러스 벡터 및 제2 아데노바이러스 벡터를 각각 하나의 투여로서, 각각 2개의 투여로서, 각각 3개의 투여로서 등으로 교대로 투여하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 제1 아데노바이러스 벡터 및 제2 아데노바이러스 벡터는 동시에 투여된다. 다른 실시형태에서, 제1 아데노바이러스 벡터 및 제2 아데노바이러스 벡터는 순차적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24, L, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 포함한다.
당업자에 의해 쉽게 이해될 바와 같이, 2개 초과의 아데노바이러스 벡터가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 상이한 아데노바이러스 벡터들이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 방법은 1개 초과의 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 한꺼번에 투여하는 것을 포함한다. 이러한 측면에서, 다수의 관심 표적 항원들에 대한 면역 반응은 다수의 상이한 아데노바이러스 벡터들을 동시에 투여함으로써 발생될 수 있으며, 각각의 벡터는 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
에볼라 증상을 치료하거나 완화하기 위한 방법이 또한, 제공된다. 치료 방법은 본원에 기재된 바와 같은 에볼라 감염을 앓고 있거나 에볼라 감염을 앓을 위험이 있는 개체에게 아데노바이러스 벡터를 1회 이상 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같이, 본 발명은 이러한 바이러스에 의해 감염될 위험이 있는 개체에서 에볼라에 대한 백신접종 방법을 제공한다. 위험에 있는 개체는, 에볼라에 여러 차례 노출될 수 있거나, 또는 이전에 노출된 적이 있으나 아직은 에볼라 감염 증상을 갖고 잇지 않거나, 에볼라 감염에 특히 취약한 개체일 수 있다. 에볼라 감염을 앓고 있는 개체는 표적 항원을 발현하고/거나 제시하는 것으로 확인될 수 있으며, 이러한 항원은 본원에서 치료법(요법)을 가이드하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일례는 표적 항원을 발현하고/거나 제시하는 것으로 발견될 수 있고, 표적 항원, 이의 변이체, 단편 또는 변이체 단편을 코딩하는 아데노바이러스 벡터가 후속해서 투여될 수 있다.
본 발명은 표적 항원, 또는 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 코딩하는 핵산의 생체내 운반을 위한 아데노바이러스 벡터의 용도를 고려한다. 일단 피험체에게 주사되면, 핵산 서열은 발현되어, 상기 서열에 의해 코딩된 항원에 대한 면역 반응을 초래한다. 아데노바이러스 벡터 백신은 "유효량", 즉 본원 어디에서나 기재된 바와 같은 면역 반응을 이끌어내기 위해 선택된 경로 또는 투여 경로에서 효과적인 아데노바이러스 벡터의 양으로 투여될 수 있다. 유효량은 표적 에볼라에 대한 숙주의 보호 또는 치료를 촉진하기에 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 각각의 백신 용량 내 벡터의 양은, 일반적으로 전형적인 백신과 연관된 유의한 부작용 없이 면역 반응, 면역보호 반응 또는 다른 면역치료 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 일단 백신접종되면, 피험체는 백신 치료의 효능을 확인하기 위해 모니터링될 수 있다. 백신접종의 효능의 모니터링은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체의 수준을 검출하기 위해 혈액 또는 체액 시료가 검정될 수 있다. 다른 실시형태에서, 순환하는 혈구 또는 림프양 조직 세포로부터 세포 매개성 면역 반응을 검출하기 위해 ELISPOT 검정법이 수행될 수 있다.
본원에 기재된 치료 조성물의 투여 경로 및 빈도, 뿐만 아니라 투여량은 개체마다 그리고 질병마다 다를 수 있고, 표준 기술을 사용하여 쉽게 구축될 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 백신은 주사에 의해(예, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내로(예, 흡입에 의해), 알약 형태로(예, 삼킴, 질 또는 직장 운반용 좌제) 투여될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 1개 내지 10개의 용량이 52주의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 6개의 용량이 1개월 간격으로 투여되고, 이후에 추가의 부스터 백신접종이 정기적으로 주어질 수 있다. 교대 프로토콜이 개별 환자에게 적절할 수 있다. 이와 같이, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 용량이 1년이라는 기간에 걸쳐 또는 그보다 더 짧거나 더 긴 기간에 걸쳐, 예컨대 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100주라는 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 용량은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주 간격 또는 그보다 더 긴 간격으로 투여될 수 있다.
백신은 약 4시간 미만의 기간에 걸쳐, 보다 바람직하게는 약 3시간 미만의 기간에 걸쳐 주입될 수 있다. 예를 들어, 제1 25-50 mg은 30분 이내에, 바람직하게는 심지어 15분 이내에 주입될 수 있었으며, 나머지는 다음 2시간 내지 3시간에 걸쳐 주입될 수 있었다. 보다 일반적으로, 투여되는 백신 구축물의 투여량은 2주 또는 3주마다 하나의 투여량으로서 투여될 수 있으며, 적어도 총 3개의 투여량이 반복될 수 있다. 또는, 이러한 구축물은 4주 내지 6주 동안 1주 당 2회 투여될 수 있다. 투약 스케쥴은 선택적으로, 다른 간격으로 반복될 수 있고, 투여량은 다양한 비경구 경로를 통해 주어질 수 있으며, 용량 및 스케쥴은 적절히 조정된다. 본 발명의 조성물은 임의의 수의 관련 치료 양상과 함께(예, 이전에, 동시에 또는 이후에) 환자에게 투여될 수 있다.
적합한 용량은, 상기 기재된 바와 같이 투여 시, 본원 어디에서나 기재된 바와 같은 표적 항원 면역 반응을 촉진할 수 있는 아데노바이러스 벡터의 양이다. 소정의 실시형태에서, 면역 반응은 기준(즉, 미치료) 수준보다 적어도 10% 내지 50% 높다. 소정의 실시형태에서, 면역 반응은 기준 수준보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500 또는 그 이상이다. 이러한 반응은, 환자에서 표적 항원(들) 항체의 측정, 또는 시험관내에서 환자-감염된 세포를 살해할 수 있는 세포용해 효과기 세포의 백신-의존적 발생, 또는 당업계에 알려진 면역 반응을 모니터링하기 위한 다른 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 이러한 백신은 또한, 비-백신접종된 환자와 비교하여 백신접종된 환자에서 문제의 질병의 임상 결과의 개선을 초래하는 면역 반응을 유발할 수 있어야 한다. 일부 실시형태에서, 개선된 임상 결과는 질병의 치료, 질병의 증상의 감소, 질병의 진행의 변화, 또는 수명 연장을 포함한다.
일반적으로, 적절한 투여량 및 치료 처방은 치료적 및/또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 양의 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 이러한 반응은 비-치료된 환자와 비교하여, 치료를 받는 환자에서 치료되는 특정 질병에 대한 개선된 임상 결과를 구축함으로써 모니터링될 수 있다. 모니터링 데이터는 시간 경과에 따라 평가될 수 있다. 시간 경과에 따른 질병의 진행은 변경될 수 있다. 임상 결과에 있어서의 이러한 개선은 치료 임상의에 의해 쉽게 인지될 것이다. 표적 단백질에 대한 기존 면역 반응의 증가는 일반적으로, 개선된 임상 결과와 상관관계가 있을 수 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로, 표준 증식, 세포독성 또는 사이토카인 검정법을 사용하여 평가될 수 있으며, 이러한 평가는 치료 이전 및 이후에 환자로부터 수득된 시료를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 하나의 이점이 동일하거나 상이한 아데노바이러스 벡터를 사용한 복수의 백신접종을 특히 Ad에 대한 기존 면역을 가진 개체에서 투여하는 능력이긴 하지만, 본 발명의 아데노바이러스 백신은 또한, 프라임 및 부스트 처방의 일부로서 투여될 수 있다. 혼합된 양상의 프라이밍 및 부스터 접종 계획은 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 측면은 플라스미드 백신을 적어도 1회 투여하여 예정된 길이의 시간이 지나게 한 다음, 아데노바이러스 벡터를 투여함으로써, 플라스미드 백신, 예컨대 관심 표적 항원을 포함하는 플라스미드 벡터를 이용하여 피험체를 프라이밍하는 방법이다. 다수의, 예를 들어 1 내지 4회의 프라이밍이 적용될 수 있긴 하지만, 더 많은 프라이밍도 사용될 수 있다. 프라이밍과 부스트 사이의 시간 길이는 전형적으로, 약 4개월 내지 1년으로 다양할 수 있으나, 다른 시간 프레임도 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 피험체는 플라스미드 백신을 이용하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 이상 프라이밍된 다음, 4개월 후에 아데노바이러스 벡터를 이용하여 부스팅될 수 있다.
환자 선택
본 발명의 다양한 실시형태는 선택된 환자 집단에서 하나 이상의 서열 번호1, 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호5 또는 서열 번호6 항원에 대한 면역 반응을 상승시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본원에 제공된 조성물들 중 임의의 조성물은 개체에게 투여될 수 있다. "개체"는 "피험체" 또는 "환자"와 상호호환적으로 사용될 수 있다. 개체는 포유류, 예를 들어 인간 또는 동물, 예컨대 비-인간 영장류, 설치류, 토끼, 래트, 마우스, 말, 당나귀, 염소, 고양이, 개, 소, 돼지 또는 양일 수 있다. 실시형태에서, 개체는 인간이다. 실시형태에서, 개체는 태아, 배아 또는 아동이다. 일부 경우에, 본원에 제공된 조성물은 생체외에서 세포에 투여된다. 일부 경우에, 본원에 제공된 조성물은 에볼라 감염 치료 방법으로서 개체에게 투여된다.
일부 경우에, 피험체는 에볼라 감염을 갖고 있지 않다. 일부 경우에, 본 발명의 치료제는 에볼라 감염 전에 투여된다. 피험체는 미검출된 에볼라 감염을 가질 수 있다. 피험체는 낮은 에볼라 감염 부담(burden)을 가질 수 있다. 피험체는 또한, 높은 에볼라 감염 부담을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 환자는 다른 치료를 통해 받고, 선택적으로 진행되었을 것을 필요로 할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 치료에 대한 개체의 허용 거절은 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 치료 가능 풀(eligible pool)에 환자가 포함될 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료를 받을 개체는 적어도, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 18, 21 또는 24개월의 추정된 기대 수명을 가져야 할 필요가 있을 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료를 받을 환자 풀은 연령에 의해 제한을 받을 수 있다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 30, 35, 40, 50, 60세 초과 또는 그 이상의 개체가 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 치료를 받을 수 있다. 또 다른 예에서, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 35, 30, 25, 20세 미만 또는 그보다 더 어린 개체가 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 치료를 받을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료를 받는 환자는 적절한 혈액학적 기능, 예를 들어 1 마이크로리터 당 적어도 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 또는 그 이상의 WBC 계수, 1 dL 당 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 g 또는 그 이상의 헤모글로빈 수준, 1 마이크로리터 당 적어도 50,000; 60,000; 70,000; 75,000; 90,000; 100,000; 110,000; 120,000; 130,000; 140,000; 150,000개 또는 그 이상의 혈소판 계수 중 하나 이상; 0.8, 1.0, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0, 2.5, 3.0 이하 또는 그 이상의 이하의 PT-INR 값, 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0 X ULN 이하 또는 그 이상의 이하의 PTT 값을 가진 개체로 한정된다. 다양한 실시형태들에서, 혈액학적 기능 지표 한계는 상이한 성별 및 연령 군의 개체, 예를 들어 0세 내지 5세, 5세 내지 10세, 10세 내지 15세, 15세 내지 18세, 18세 내지 21세, 21세 내지 30세, 30세 내지 40세, 40세 내지 50세, 50세 내지 60세, 60세 내지 70세, 70세 내지 80세 또는 80세를 넘는 개체에 대해 상이하게 선택된다.
다양한 실시형태들에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료를 위한 개체 또는 후보물질 개체로부터의 시료, 예를 들어 혈청 또는 소변 시료가 수집될 수 있다. 시료는 치료 이전, 도중 및/또는 이후에, 예를 들어 치료의 시작 이전 2, 4, 6, 8, 10주 이내에, 치료의 시작으로부터 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주 또는 12주 이내에, 치료의 시작 이전 2, 4, 6, 8, 10주 이전에, 치료의 시작으로부터 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 9주 또는 12주 이내에, 치료의 도중 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 9주 또는 12주 간격으로, 치료 후 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년 간격으로, 치료 후 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년 또는 그 이상 이내에, 6개월, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 이상의 기간 동안 수집될 수 있다. 시료는 본원에 기재된 혈액학적 지표, 신장 기능 지표 또는 간 기능 지표 중 임의의 지표뿐만 아니라 당업계에 알려진 적합한 다른 것들, 예를 들어 임신 잠재성이 있는 여성에 있어서 β-HCG에 대해 시험될 수 있다. 이러한 측면에서, 상이한 PT, INR 및 PTT를 가진 혈구 계수, Na, K, Cl, CO2, BUN, 크레아틴, Ca, 총 단백질, 알부민, 총 빌리루빈, 알칼리 포스파타제, AST, ALT 및 글루코스를 측정하는 시험을 포함한 혈액학적 시험 및 생화학적 시험은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, HIV 항체, 간염 BsAg 또는 간염 C 항체의 존재 또는 양은 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료를 위한 개체 또는 후보물질 개체의 시료에서 확인된다. 생물학적 마커, 예컨대 서열 번호1, 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호5, 서열 번호6에 대한 항체, 또는 Ad5 벡터에 대한 중화 항체가 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료를 위한 개체 또는 후보물질 개체의 시료, 예컨대 혈청에서 시험될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 시료, 예컨대 혈액 시료는 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료를 위한 개체 또는 후보물질 개체로부터 수집되고 보관될 수 있다. 수집된 시료는 면역학적 평가를 위해 검정될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료를 위한 개체 또는 후보물질 개체는 영상 연구, 예를 들어 가슴, 복부 또는 골반의 CT 스캔 또는 MRI를 사용한 영상 연구에서 평가될 수 있다. 영상 연구는 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료 이전, 도중 또는 이후, 및/또는 치료 도중 및/또는 이후, 예를 들어 치료 시작 이전 2, 4, 6, 8, 10주 이내에, 치료 시작 후 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주 또는 12주 이내에, 치료 시작 이전 2, 4, 6, 8, 10주 이내에, 치료 시작 후 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 9주 또는 12주 이내에, 치료 동안 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 9주 또는 12주의 간격으로, 치료 후 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년의 간격으로, 치료 후 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년 또는 그보다 긴 기간 이내에, 6개월, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그보다 긴 기간 동안 수행될 수 있다.
투여량 및 투여
본 발명의 조성물 및 방법은 치료 동안 다양한 투여량 및 투여 처방을 고려한다. 환자는 개체에서 본원에 기재된 표적 항원에 대한 면역 반응을 상승시킬 수 있는 하나 이상의 복제 결함 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호1, Ad5[E1-, E2b-]-서열 번호2, Ad5[E1-, E2b-]-서열 번호4, Ad5[E1-, E2b-]-서열 번호5, Ad5[E1-, E2b-]-서열 번호6, 예를 들어 서열 번호1, 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호5 또는 서열 번호6을 제공받을 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 복제 결함 아데노바이러스는 이러한 면역 반응에 영향을 미치기에 적합한 용량으로 투여된다. 일부 경우에, 복제 결함 아데노바이러스는 1회 면역화 당 1x109, 2 x109, 3 x109, 4 x109, 5 x109, 6 x109, 7 x109, 8 x109, 9 x109, 1x1010, 2 x1010, 3 x1010, 4 x1010, 5 x1010, 6 x1010, 7 x1010, 8 x1010, 9 x1010, 1 x1011, 2 x1011, 3 x1011, 4 x1011, 5x1011, 6 x1011, 7 x1011, 8 x1011, 9 x1011, 1x1012, 1.5 x1012, 2 x1012, 3 x1012개 이상 또는 그 이상의 이상인 바이러스 입자(VP)인 용량으로 투여된다. 일부 경우에, 복제 결함 아데노바이러스는 1회 면역화 당 1x109, 2 x109, 3 x109, 4 x109, 5 x109, 6 x109, 7 x109, 8 x109, 9 x109, 1x1010, 2 x1010, 3 x1010, 4 x1010, 5 x1010, 6 x1010, 7 x1010, 8 x1010, 9 x1010, 1 x1011, 2 x1011, 3 x1011, 4 x1011, 5x1011, 6 x1011, 7 x1011, 8 x1011, 9 x1011, 1x1012, 1.5 x1012, 2 x1012, 3 x1012개 이하 또는 그 이상의 이하인 바이러스 입자인 용량으로 투여된다. 다양한 실시형태들에서, 본원에 기재된 요망되는 용량은 적합한 부피, 예를 들어 약 0.1-10 mL, 0.2-8mL, 0.3-7mL, 0.4-6 mL, 0.5-5 mL, 0.6-4 mL, 0.7-3 mL, 0.8-2 mL, 0.9-1.5 mL, 0.95-1.2 mL 또는 1.0-1.1 mL 부피의 제형 완충제 내에서 투여된다. 당업자는, 상기 부피는 이들 값(예, 약 0.5 mL 내지 약 1.1 mL) 중 임의의 값에 의해 경계가 지어지는 임의의 범위에 속할 수 있음을 이해할 것이다. 바이러스 입자의 투여는 여러 가지 적합한 운반 경로를 통해서 이루어질 수 있으며, 예를 들어 투여는 주사(예, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내(예, 흡입에 의한), 알약 형태(예, 삼킴, 질내 또는 직장 운반용 좌제)로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 피하 운반이 바람직할 수 있고, 수지상 세포에의 더 큰 접근을 제공할 수 있다.
개체에의 바이러스 입자의 투여는 반복될 수 있다. 바이러스 입자의 반복된 전달은 스케쥴을 따를 수 있거나, 대안적으로는 필요에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원, 예를 들어 서열 번호1, 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호5 또는 서열 번호6에 대한 개체의 면역은 시험될 수 있고, 필요에 따라 부가적인 전달과 함께 보충될 수 있다. 일부 실시형태에서, 운반 스케쥴은 정기적인 간격으로의 바이러스 입자의 투여를 포함한다. 조인트 운반 처방은 스케쥴을 가진 기간 및/또는 투여 전 평가된 필요-기반 투여의 기간 중 하나 이상을 포함하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 치료 처방은 사멸을 포함하는 임의의 이유로 치료로부터 배제될 때까지 투여, 예컨대 3주마다 1회 피하 투여, 및 그런 다음 3개월마다 또 다른 면역요법 치료를 포함할 수 있다. 또 다른 처방 예는 3주마다 3회의 투여, 및 그런 다음 3개월마다 3회의 면역요법 치료의 또 다른 세트를 포함한다. 또 다른 처방 예는 제1 빈도의 제1 투여 수로 이루어진 제1 기간, 제2 빈도로 제2 투여 수로 이루어진 제2 기간, 제3 빈도로 제3 투여 수로 이루어진 제3 기간 등, 및 선택적으로 필요에 따라 미정된 수의 투여로 이루어진 하나 이상의 기간을 포함한다. 각각의 기간에서 투여 수는 독립적으로 선택될 수 있고, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상일 수 있다. 각각의 기간에서 투여 빈도는 또한, 독립적으로 선택될 수 있고, 예를 들어 약 매일, 격일로, 3일마다, 1주에 2회, 1주에 1회, 격주에 1회, 3주마다, 매달, 6주마다, 격월로, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다, 6개월마다, 1년에 1회 등일 수 있다. 치료는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 36개월 또는 그 이상의 총 기간이 소요될 수 있다. 면역화들 사이의 스케쥴된 간격은 변형될 수 있어서, 면역화들 사이의 간격이 해당 간격의 최대 1/5, 1/4, 1/3 또는 1/2만큼 수정된다. 예를 들어, 3주간의 간격 스케쥴에 있어서, 면역화는 20일 내지 28일(3주-1일 내지 3주+7일) 사이에서 반복될 수 있다. 처음의 3회 면역화 동안, 제2 면역화 및/또는 제3 면역화가 지연된다면, 후속적인 면역화가 시프트되어, 면역화들 사이에 최소량의 완충제를 허용할 수 있다. 예를 들어, 3주 간격의 스케쥴에 있어서, 면역화가 지연된다면, 후속적인 면역화는 이전의 면역화 후 17일, 18일, 19일 또는 20일 지나서 발생하도록 스케쥴될 수 있다.
본 발명의 조성물, 예컨대 Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호1, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호2, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호4, Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호5 및 Ad5[E1-, E2B-]-서열 번호6 벡터 및 이들 벡터를 사용하여 생성되는 바이러스 입자는 다양한 상태, 예를 들어 실온에서, 얼음 상에서 또는 동결된 상태로 제공될 수 있다. 조성물은 적합한 크기의 용기, 예를 들어 2 mL 바이알의 바이알에서 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 1.0 mL의 추출 가능한 백신을 포함하는 1 2 ml 바이알은 5x1011개의 총 바이러스 입자/mL를 함유한다. 온도 및 습도를 포함한 저장 조건은 다양할 수 있다. 예를 들어, 치료에 사용되기 위한 조성물은 실온, 4℃ 내지 20℃ 또는 그보다 낮은 온도에서 저장될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 일반적인 평가는 본 발명의 방법 및 조성물에 따른 치료를 받는 개체에서 수행된다. 하나 이상의 임의의 시험은 필요에 따라 또는 스케쥴을 기반으로, 예컨대 0주, 3주, 6주 등을 기반으로 수행될 수 있다. 상이한 세트의 시험들은 면역화 없는 시점에서 대(vs) 면역화와 동시에 수행될 수 있다.
일반적인 평가는 의학적 이력, ECOG 수행 점수, 카르노프스키 수행 상태(Karnofsky performance status) 및 임상의에 의한 체중을 비롯한 완전한 신체 검사를 포함할 수 있다. 마지막 방문 이후 환자가 제공받는 중이거나 또는 제공받은 임의의 다른 치료, 약제, 생물제제 또는 혈액 제제는 기록될 수 있다. 환자는 백신 수여 후 임의의 부작용을 모니터링하기 위해 적합한 기간, 예를 들어 대략 30분 동안 클리닉에 머무를 수 있다. 각각의 용량의 백신 후 국소 및 전신 반응원성(reactogenicity)은 선택된 기간 동안, 예를 들어 3일 동안(면역화 당일 및 이후 2일) 매일 평가될 수 있다. 증상을 기록하기 위해 다이어리 카드가 사용될 수 있고, 국소 반응원성을 측정하기 위해 룰러가 사용될 수 있다. 면역화 주사 부위가 평가될 수 있다. 가슴, 복부 및 골반의 CT 스캔 또는 MRI가 수행될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 혈액학적 평가 및 생화학적 평가는 본 발명의 방법 및 조성물에 따른 치료를 받는 개체에서 수행된다. 하나 이상의 임의의 시험은 필요에 따라 또는 스케쥴을 기반으로, 예컨대 0주, 3주, 6주 등을 기반으로 수행될 수 있다. 상이한 세트의 시험들은 면역화 없는 시점에서 대(vs) 면역화와 동시에 수행될 수 있다. 혈액학적 평가 및 생화학적 평가는 화학 및 혈액학을 위한 혈액 시험, 상이한 Na, K, Cl, CO2, BUN, 크레아틴, Ca, 총 단백질, 알부민, 총 빌리루빈, 알칼리 포스파타제, AST, ALT, 글루코스 및 ANA를 가진 CBC 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 생물학적 마커는 본 발명의 방법 및 조성물에 따른 치료를 받는 개체에서 평가된다. 하나 이상의 임의의 시험은 필요에 따라 또는 스케쥴을 기반으로, 예컨대 0주, 3주, 6주 등을 기반으로 수행될 수 있다. 상이한 세트의 시험들은 면역화 없는 시점에서 대(vs) 면역화와 동시에 수행될 수 있다.
생물학적 마커 평가는 적절한 부피, 예를 들어 약 5 mL의 혈청 시료로부터 서열 번호1, 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호5, 서열 번호6 또는 Ad5 벡터에 대한 항체의 측정 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바이오마커는 확인되고 입수 가능하다면 리뷰될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 면역학적 평가는 본 발명의 방법 및 조성물에 따른 치료를 받는 개체에서 평가된다. 하나 이상의 임의의 시험은 필요에 따라 또는 스케쥴을 기반으로, 예컨대 0주, 3주, 6주 등을 기반으로 수행될 수 있다. 상이한 세트의 시험들은 면역화 없는 시점에서 대(vs) 면역화와 동시에 수행될 수 있다.
말초 혈액, 예를 들어 약 90 mL는, 연구 도중 및/또는 특정 수의 면역화 후 특정 시점에서 면역 반응에 미치는 효과가 존재하는지 확인하기 위해, 각각의 면역화 이전, 및 면역화 후 어느 정도의 시간이 지난 후에 채혈될 수 있다. 면역학적 평가는 ELISPOT을 사용한 서열 번호1, 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호5 또는 서열 번호6에 대한 T-세포 반응에 대한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 검정법, 증식 검정법, 멀티-파라미터 유세포 분석, 및 세포독성 검정법 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 각각의 채혈 유래의 혈청은 보관되고 보내지고, 확인될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 에볼라 감염 평가 또는 에볼라 복제 검정법은 본 발명의 방법 및 조성물에 따른 치료를 받는 개체에서 수행된다. 하나 이상의 임의의 시험은 필요에 따라 또는 스케쥴을 기반으로, 예컨대 0주, 3주, 6주 등을 기반으로 수행될 수 있다. 상이한 세트의 시험들은 면역화 없는 시점에서 대(vs) 면역화와 동시에 수행될 수 있다. 에볼라 감염은 치료 이전, 면역화 후 어느 정도의 시간이 지난 때, 및 선택된 수, 예를 들어 제1 치료의 2, 3 또는 4회 후 대략 매주 내지 3개월, 및 예를 들어 치료가 중단될 때까지, 하나 이상의 에볼라 면역특이적 시험을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 표적 항원, 서열 번호1, 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호5 또는 서열 번호6에 대한 면역 반응은 면역 반응에 대한 하나 이상의 적합한 시험, 예컨대 ELISPOT, 사이토카인 유세포 분석 또는 항체 반응을 사용하여 시료, 예컨대 개체의 말초 혈액 시료로부터 평가될 수 있다. 양성 면역 반응은 T-세포 반응을 측정함으로써 확인될 수 있다. T-세포 반응은, 항원을 함유한 6개 웰에서 백그라운드에 대해 조정된 스폿의 평균 수가 6개의 대조군 웰 내의 스폿의 수를 10배 초과하고 항원을 함유하는 6개 웰의 단일 값과 6개 대조군 웰 사이의 차이가 스튜던츠 t-테스트를 사용하여 p≤0.05의 수준에서 통계학적으로 유의하다면, 양성인 것으로 간주될 수 있다. 면역원성 검정법은 각각의 면역화 이전, 및 치료 기간 동안 스케쥴된 시점에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 치료의 대략 주 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 20, 24, 30, 36 또는 48에서 면역원성 검정법의 시점은 이러한 시점에서 스케쥴된 면역화 없이도 스케쥴될 수 있다. 일부 경우, 개체는, 적어도 최소 수의 면역화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 면역화를 받는 경우, 면역 반응에 대해 평가 가능한 것으로 간주될 수 있다.
임상 반응의 확인
일부 실시형태에서, 질병 진행 또는 임상 반응 확인은 측정 가능한/평가 가능한 질병을 앓고 있는 환자 중에서 RECIST 1.1 기준에 따라 이루어진다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료는 치료를 받고 있는 개체에서 완전한 반응(CR; 모든 항원 또는 증상 표적 부위의 소멸 또는 모든 비-표적 부위의 소멸 및 비-표적 부위에 대한 항원 또는 증상 수준의 정상화)에 영향을 미친다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료는 치료를 받고 있는 개체에서 부분 반응(PR; 표적 부위에 대한 기준선 합계 LD를 참조로서 취하여, 표적 부위의 LD의 합계에서 적어도 30%의 감소)에 영향을 미친다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료는 치료를 받고 있는 개체에서 안정한 질병(SD; 표적 부위에 대해 시작한 치료 이후 최소의 LD 합계를 참조로서 간주하여, 항원 또는 증상이 PR에 대한 자격을 얻을 정도로 충분히 감소한 것도 아니며 PD의 자격을 얻을 정도로 충분히 증가한 것도 아님)에 영향을 미친다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료는 치료를 받고 있는 개체에서 불완전한 반응/안정한 질병(SD; 하나 이상의 비-표적 부위의 지속 및/또는 비-표적 부위에 대한 정상 한계를 초과한 항원 또는 증상의 유지)에 영향을 미친다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 치료는 치료를 받고 있는 개체에서 진행형 질병(PD; 치료 시작 이후 기록된 최소 LD 합계를 참조로서 취하여 항원 또는 증상의 LD 합계의 적어도 20% 증가, 또는 하나 이상의 새로운 항원 또는 증상의 출현 또는 하나 이상의 비-표적 항원 또는 증상의 지속 및/또는 치료를 받는 개체에서 정상 한계를 초과한 항원 수준의 유지)에 영향을 미친다.
키트
조성물, 면역요법 또는 백신은 키트 형태로 공급될 수 있다. 본 개시내용의 키트는 치료 처방 정보를 포함한 투여량 및/또는 투여에 관한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 병용 다중-표적화된 에볼라 면역요법을 제공하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 에볼라 감염의 병용 다중-표적화된 치료에 대한 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 키트 성분을 투여하는 데 유용한 성분, 및 이들 성분의 제조 방법에 관한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 치료 이전 및 치료 이후 적절한 실험실 시험을 이용한 환자의 모니터링을 수행하거나, 결과 및 환자 데이터를 의료진과 소통하기 위한 소프트웨어를 추가로 포함할 수 있다. 키트를 포함하는 성분들은 건조 형태 또는 액체 형태로 존재할 수 있다. 이들이 건조 형태인 경우, 키트는 건조된 물질을 용해시키기 위한 용액을 포함할 수 있다. 키트는 또한, 액체 형태 또는 건조 형태에 이동 요소를 포함할 수 있다. 이동 요소가 건조 형태인 경우, 키트는 이동 요소를 용해시키기 위한 용액을 포함할 것이다. 키트는 또한, 성분들의 혼합 및 제조를 위한 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한, 투여를 보조하기 위한 장비, 예를 들어 바늘, 튜브, 어플리케이터, 흡입제, 주사기, 파이펫, 포셉, 계량 스푼, 점안기 또는 이러한 임의의 의학적으로 승인된 운반 비히클을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트 또는 약물 운반 시스템은 또한 전형적으로, 상업적인 판매 및 유통을 위해 밀폐된 상태로 본 개시내용의 조성물을 함유하기 위한 수단을 포함할 것이다.
실시예
실시예 1: Ad5Null 아데노바이러스 벡터의 복수 주사는 항- 아데노바이러스 항체를 생성한다
이 실시예는 Ad5-널을 복수 주사하면 주사를 받은 피험체에서 항-아데노바이러스 항체의 생성을 초래함을 보여준다.
임의의 이종성 핵산 서열을 함유하지 않는 Ad5-널 아데노바이러스 벡터는 마우스에서 중화 면역 반응을 발생시킨 것으로 나타났다. 하나의 실험에서, 5주령 내지 7주령의 암컷 Balb/c 마우스에게 Ad5-널 바이러스 입자를 14일 간격으로 면역화하였다. 항-아데노바이러스 항체의 존재를 확인하기 위해, 효소 연결된 면역흡착 검정법(ELISA)을 사용하였다. 이러한 ELISA에 있어서, 109개 바이러스 입자를 100 μL의 0.05 M 카르보네이트/비카르보네이트 완충제, pH 9.6에서 마이크로타이터 웰 상에 코팅하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 표준 면역글로불린 G(IgG) 참조 곡선에 있어서, 200 ng, 100 ng, 50 ng, 25 ng 및 0 ng의 정제된 마우스 IgG를 상기 기재된 바와 같이 마이크로타이터 웰 상에 코팅시켰다. 인큐베이션 후, 모든 웰을 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중 1% 소 혈청 알부민(BSA) 250 μL, pH 7.4를 사용하여 3회 세척하였다. 세척 후, 250 μL의 BSA/PBS를 모든 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여, 비결합된 부위를 차단시켰다. 인큐베이션 후, 모든 웰을 250 μL의 BSA/PBS로 3회 세척하였다. 세척 후, BSA/PBS 중 1/100 혈청 희석액 200 μL를 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군의 경우, BSA/PBS 중 1/10000 희석의 항-아데노바이러스 항혈청 200 μL를 웰에 첨가하였다. 대조군 웰은 BSA/PBS만 함유하였다. 인큐베이션 후, 모든 웰을 250 μL의 BSA/PBS로 3회 세척하였다. 세척 후, BSA/PBS 중 1/10000 희석의 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 γ-사슬 특이적 염소 항-마우스 IgG(Sigma Chemicals) 200 μL를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 모든 웰을 250 μL의 BSA/PBS로 3회 세척하였다. 세척 후, 200 μL의 발색 시약(0.06% 하이드로겐 퍼옥사이드를 함유하는, 0.2 M 포타슘 포스페이트 완충제 중 0.5 mg/mL 1,2-페닐렌-다이아민, pH 5.0)을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 내지 40분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 50 μL 5 N HCl을 각각의 웰에 첨가함으로써 색상 반응을 중단시켰다. 그런 다음, 모든 웰을 마이크로웰 플레이트 판독기에서 492 nm에서 판독하였다. 판독값을 수득한 후, 미지 시료의 광학 밀도 판독값을 표준 IgG 곡선과 상관관계를 지어, 1개 웰 당 결합된 IgG의 ng을 수득하였다. 이를 INSTAT 통계학적 패키지를 사용하여 수행하였다.
EA에 대한 항체를 검출하기 위한 ELISA
ELISA 플레이트를 0.05 M 카르보네이트-비카르보네이트 완충제 pH 9.6 중 100 ng의 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L을 사용하여 코팅시킬 것이며, 실온에서 밤새 인큐베이션시킬 것이다. 플레이트를, 1% Tween-20(PBS-T)을 함유하는 포스페이트 완충 식염수로 3회 세척한 다음, 1% BSA를 함유하는 PBS를 사용하여 실온에서 60분 동안 차단시켰다. 부가적인 3회의 세척 후, PBS-T에서 1/50으로 희석된 혈청을 웰에 첨가할 것이고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션할 것이다. 1:5000으로 희석된 퍼옥시다제 표지된 염소 항-마우스 면역글로불린(Ig) G(γ-사슬 특이적)(Sigma-Aldrich) 항체를 세척 후 웰에 첨가할 것이고, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척할 것이고, 1,2-페닐렌-다이아민 기질 용액을 각각의 웰에 첨가할 것이다. 10% 인산을 첨가함으로써 반응을 중단시킬 것이다. 흡광도를 SpectraMax 190 ELISA 판독기 상에서 492 nm에서 측정할 것이다. 1개 웰 당 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L에 결합된 IgG의 나노그램 당량을, 정제된 마우스 IgG를 사용하여 발생된 표준 곡선을 참조로 하여 수득하고, 이와 동시에 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L ELISA로서 발색시킬 것이다. 그 결과를 분석하고, SoftMax Pro 6.3 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.
항-아데노바이러스 IgG 항체의 유의 수준(P<0.001)을, 1010개 Ad-5-널을 사용한 제1 주사 후 2주째에 마우스에서 검출하였다(도 1). 유의하게 더 높은 수준(P<0.001)을, 1010개 아데노바이러스를 사용한 제2 주사 후 2주째에 관찰하였다. 유의하게 더 높은(P<0.001) 항체 수준은 1010개 Ad5-널을 사용한 제3 주사 후 2주째에도 계속 관찰되었다. 각각의 값은 각각의 그룹에서 5마리의 마우스의 풀링된 혈청으로부터 삼중 확인의 평균을 나타낸다. Ad5-널을 복수 주사하면, 피험체에서 항-아데노바이러스 항체가 생성되었다.
Ad에 대한 중화 항체의 존재를 확인하기 위해, 하기 검정법을 이용하였다. HEK-293T-세포주를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안, 1개 웰 당 2x103개 세포의 세포 농도로 마이크로웰 조직 배양 플레이트에서 10% 태아 소 혈청(DMEM/FCS)을 함유하는 DMEM으로 이루어진 200 μL 배양 배지에서 배양하였다. 인큐베이션 후, 100 μL의 배양 배지를 삼중 웰로부터 제거하고, 바이러스 입자(VP)를 함유하는 20 μL의 DMEM/FCS와 혼합하였다. 혼합 후, 120 μL 혼합물을 각각의 마이크로웰에 다시 첨가하였다. 삼중 웰로 된 또 다른 세트에서, 100 μL의 배양 배지를 제거하고, 이전에 실온에서 1시간 동안 VP와 함께 인큐베이션된 20 μL의 열 불활성화된(56℃에서 1시간) Ad 면역 마우스 혈청과 혼합하였다. 혼합 후, 120 μL 혼합물을 각각의 웰에 다시 첨가하였다. 삼중 세포 대조군 웰에서, 20 μL의 DMEM/FCS를 총 배양 배지 부피에 대해 대조군에 첨가하였다. 삼중 배지-단독 대조군 웰은 220 μL의 DMEM/FCS를 함유하였다. 조직 배양 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 3일 더 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 40 μL의 PROMEGA 세포 생존력 시약(Owen's 시약)을 모든 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 75분 동안 인큐베이션하였다. 이 검정법에서, Owen's 시약(MTS 테트라졸륨 화합물)을 생존가능한 세포에 의해, 조직 배양 배지에서 가용성인 유색 포르마잔 생성물로 생물환원시킨다. 490 nm에서 흡광도에 의해 측정되는 바와 같은 포르마잔 생성물의 양은 배양 중 살아 있는 세포의 수에 정비례한다. 인큐베이션 후, 150 μL를 각각의 웰로부터 제거하고, 광학 밀도 판독을 위해 또 다른 마이크로웰 플레이트로 옮겼다. 후속해서, 492 nm에서의 광학 밀도 판독값을 마이크로웰 플레이트 판독기를 사용하여 수득하였다.
Ad에 대한 중화 항체의 존재를 검출하기 위해, 5마리로 된 그룹의 각각의 마우승에게 1010개 Ad5-널을 2주 간격으로 1회, 2회 또는 3회 주사하였다. 바이러스를 마지막으로 주사한 후 2주째에, 마우스에서 채혈하고, 풀링한 다음, 열 불활성화된 혈청과 함께 또는 없이 인큐베이션된 4x107개 VP를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 중화 항체에 대해 평가하였다. 단독 배양된 세포는 대조군으로서 역할을 하였다. 정상 마우스, 및 Ad5널을 1회 주사한 마우스는 유의한 수준의 중화 항체를 나타내지 않았다(도 2). Ad를 2회 주사 받은 마우스는 바이러스 단독으로 인큐베이션된 세포와 비교하여 유의한(P<0.05) 수준의 중화 항체를 나타내었다. Ad5-널을 3회 주사 받은 마우스 또한, 바이러스 단독으로 인큐베이션된 세포와 비교하여 유의한(P<0.01) 수준의 중화 항체를 나타내었다.
실시예 2: Ad5 [E1-]- EA 벡터 백신은 Ad5 면역 마우스에서 재-면역화 시 EA 특이적인 면역 반응을 유도한다
이 실시예는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 플랫폼이 마우스에서 기존의 Ad5 면역의 존재 하에 에볼라 연관된 항원 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L에 대하여 CMI 반응을 유도함을 보여준다.
Ad5[E1-, E2B-]-GP, Ad5[E1-, E2B-]-NP, Ad5[E1-, E2B-]-VP40, Ad5[E1-, E2B-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30, [E1-, E2b-]-VP24, 및/또는 [E1-, E2b-]-L은 구축되고 생성될 것이다. 간략하게는, 전이유전자는 상동성 재조합-기반 접근법을 사용하여 Ad5[E1-, E2b-] 벡터의 E1 영역 내로 서브클로닝될 것이다. 복제 결함 바이러스는 E.C7 패키징 세포주에서 증식되고, CsCl2 정제되며, 역가 확인될 것이다. 바이러스 감염성 역가는 E.C7 세포 단일층 상에서 플라크-형성 단위(PFU)로서 확인될 것이다. VP 농도는 소듐 도데실 설페이트(SDS) 분해 및 260 nm 및 280 nm에서의 분광 광도법에 의해 확인될 것이다.
Ad5 CEA 벡터의 특징규명
초기 연구를 수행하여, 2개의 Ad5-GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L 벡터 플랫폼의 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L 유전자 발현을 확인하였다. 처음에, 백신 벡터 플랫폼을 사용하여 형질감염된 세포 상에서 항원이 발현될 수 있는지 확인하였다. A549 세포를 ATCC로부터 수득하고, Ad5[E1-]-GP, Ad5[E1-]-NP, Ad5[E1-]-VP40, Ad5[E1-]-VP35, Ad5[E1-]-VP30, [E1-]-VP24, 및/또는 [E1-]-L; 또는 Ad5[E1-, E2B-]-GP, Ad5[E1-, E2B-]-NP, Ad5[E1-, E2B-]-VP40, Ad5[E1-, E2B-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30, [E1-, E2b-]-VP24, 및/또는 [E1-, E2b-]-L을 사용하여 형질감염시켰다. 웨스턴 블롯 분석은, 벡터 플랫폼을 사용하여 형질감염된 세포가 지시된 항원을 발현하였음을 보여주었다.
방법
A549 세포에 Ad5[E1-, E2B-]-GP, Ad5[E1-, E2B-]-NP, Ad5[E1-, E2B-]-VP40, Ad5[E1-, E2B-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30, [E1-, E2b-]-VP24, 및/또는 [E1-, E2b-]-L을 555 VP/세포의 MOI로 하여 접종하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 후, 세포를 수확하고, PBS로 세척한 다음, 3회 동결/해동하였다. 전체 세포 용해물을 70℃에서 10분 동안 가열한 다음, 겔 상에 로딩하였다. 재조합 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L 대조군을 30 ng/레인으로 로딩하고, 제조된 용해물을 20 μL/레인으로 로딩하였다. 시료 로딩 완충제를 부가적인 음성 대조군으로서 포함시켰으며, 양성 대조군은 Magic Mark CP Western 마커 및 재조합 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및/또는 L이었다. 겔을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, SuperBlock 블라킹 용액을 사용하여 60분 동안 차단시켰다. 막을 마우스 모노클로날 항-GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L 1차 항체(1:1000) 및 2차 항-마우스 HRP(1:2500) 컨쥬게이트된 항체를 사용하여 프로브하였다. 막을 3회 세척한 다음, SuperSignal 화학발광 시약과 함께 인큐베이션하고, X-선 필름을 막에 노출시킨 다음 발색시켜, 밴드를 시각화였다.
마우스에서 Ad5 면역의 유도
유도될 수 있는 Ad5 면역의 수준을 평가하기 위해, Ad5 네이브 C57Bl/6 마우스의 그룹에게 Ad5 벡터 플랫폼(VP)을 피하 주사할 것이다. 28일 내지 42일 후, 혈청 시료를 수집할 것이고, 종점 Ad5 NAb 역가에 대해 평가할 것이다. 미검출 가능한 Ad5 NAb 역가(종점 Ad5 NAb 역가 < 1/25)는 정상 대조군 마우스에서 관찰될 수 있다. Ad5 NAb(1/25 내지 1/50의 종점 역가)는 1회 주사 후 검출될 수 있으나, 1010개 Ad5의 3회 주사 후 급격히 증가할 수 있다. 따라서, 부가적인 Ad5 면역 연구에서, 마우스에게 1010개 Ad5 VP를 2회 주사하여, 동물을 Ad5 면역시킬 것이다.
Ad5 [E1-]- EA 또는 Ad5 [E1-, E2b -]- EA를 사용한 Ad5 면역 마우스의 면역화
이들 실험은 Ad5 면역 마우스에서 Ad5[E1-]-EA 및 Ad5[E1-, E2b-]-EA 백신의 면역화 유도 잠재성을 확인하고 비교하도록 디자인될 것이다. 4주령 내지 8주령의 암컷 C57Bl/6 마우스의 그룹을 1010개 Ad5-널 VP를 사용하여 2주 간격으로 2회 면역화할 것이다. 마지막 Ad5-널 면역화 후 2주째에, 마우스를 1010개 VP의 Ad5[E1-]-EA 또는 Ad5[E1-, E2b-]-EA를 사용하여 매주 간격으로 3회 면역화할 것이다. 마지막 면역화 후 2주째에, 마우스를 안락사시키고, 마우스의 비장 및 혈청을 분석을 위해 수확할 것이다.
CMI 반응을, 온전한 EA 항원에 노출된 비장세포 상에서 수행된 ELISPOT 검정법에 의해 평가할 것이다. Ad5 E1-]-EA 또는 Ad5[E1-, E2b-]-EA를 피하 면역화한 Ad5 면역 C57Bl/6 마우스의 비장세포를 수확하고, IFN-γ 분비 세포 및 IL-2 분비 세포의 수에 대해 평가할 것이다. IFN-γ 분비 세포 및 IL-2 분비 세포 둘 다의 유의하게 상승된 수는 Ad5[E1-]-EA 면역화된 마우스와 비교하여 Ad5[E1-, E2b-]-EA 면역화된 마우스로부터 검정된 비장에서 관찰될 수 있다. Ad5[E1-, E2b-]-CEA를 이용한 Ad5 면역 마우스의 면역화는 유의하게 더 높은 CMI 반응을 유도하는 것으로 나타날 수 있다.
면역화된 마우스에서 간 부작용의 결여
독성 연구를, 상기 기재된 바와 같이 Ad5[E1-]-EA, Ad5[E1-, E2b-]-EA로 면역화된 Ad5 면역 암컷 C57Bl/6 마우스의 혈청 상에서 수행할 것이다. Ad5 네이브, 또는 완충제 단독으로 주사된 Ad5 면역 마우스는 대조군으로서 역할을 할 것이다. 제3 면역화 후 3일째에, 치료로 인한 간 독성을 확인하기 위해, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 수준이 혈액 시료 상에서 평가될 것이다. AST 수준은 벡터를 이용한 면역화 후 대조군을 능가하여 상승되지 않을 수 있다. 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 수준 또한, 평가될 것이고, 유사한 결과가 관찰될 수 있다.
Ad5 면역 에볼라 감염 마우스에서 Ad5 [E1-, E2b -]- CEA 면역요법
상기 관찰된 성공적인 면역학적 결과를 기반으로, 에볼라 감염이 마우스에서 구축된 다음 치료된 연구를 하기 기재된 바와 같이 수행하였다. 에볼라 감염 후, 마우스를 신규 Ad5[E1-, E2b-]-EA 벡터 플랫폼을 사용하여 치료할 것이다. Ad5 면역 에볼라 감염 마우스가 Ad5[E1-, E2b-]-EA 벡터를 사용하여 치료될 수 있는지 확인하기 위해, C57Bl/6 마우스에게 1010개 Ad5[E1-]-널 VP를 14일 간격으로 2회 피하 주사하여, 마우스 Ad5 면역을 제공할 것이다. 마지막 주사 후 2주째에, 7마리의 C57Bl/6 마우스로 된 2개의 그룹에게 106개 EA 발현 세포를 피하 주사할 것이다. 7일 후, 에볼라 감염이 감지될 수 있다면, 하나의 마우스 그룹을 제7일, 제13일 및 제19일에 1010개의 Ad5[E1-, E2b-]-EA VP를 원위(distal) 피하 주사함으로써 치료할 것이다. 주사 완충제 단독으로 치료된 C57Bl/6 마우스 그룹은 미치료 대조군으로서 역할을 할 것이다. 모든 마우스를 21일의 기간에 걸쳐 에볼라 감염 퇴행에 대해 모니터링할 것이고, 에볼라 바이러스 감염 역가를 확인할 것이다. 연구 종료 시, 비장을 마우스로부터 수집할 것이고, CEA 특이적 CMI 반응을 ELISpot 검정법에 의해 확인할 것이다.
ELISpot 검정법에 의한 CMI 반응의 분석
IFN-γ 분비 림프구에 대한 ELISpot 검정법이 수행될 것이다. 간략하게는, 개별 환자 시료로부터 단리된 PBMC(2x105개 세포/웰)를 EA 펩타이드 풀과 함께 36시간 내지 40시간 동안 인큐베이션하여, IFN-γ 생성 세포를 자극할 것이다. 환자의 PBMC를 Ad5-널(빈 벡터)에 노출시킨 후 Ad5에 대한 CMI 반응을 확인할 것이다. 세포를, 양성 대조군으로서 역할을 하는 0.25 ㎍/웰 농도의 콘카나발린 A(concanavalin A)(Con A)를 사용하여 자극할 것이다. 유색 스폿-형성 세포(SFC)를 Immunospot ELISpot 플레이트 판독기를 사용하여 계수할 것이고, 음성 대조군을 제한 후 106개 세포 당 50개 SFC가 검출되고 SFC가 음성 대조군 웰에서보다 2배 이상 더 높은 경우 반응은 양성인 것으로 간주될 것이다.
Ad5 중화 항체( NAb ) 역가의 확인
종점 Ad5 NAb 역가가 확인될 것이다. 간략하게는, 10% 태아 소 혈청을 함유하는 100 μL의 DMEM 중 열 불활성화된 시험 혈청의 희석액을 4x107개 VP의 Ad5[E1-]-널과 혼합하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션할 것이다. 시료를, 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 10% 열 불활성화된 소 혈청을 함유하는 DMEM에서 배양된 HEK293 세포를 2x103개 세포/웰로 함유하는 마이크로웰에 첨가할 것이다. 혼합물을 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 더 인큐베이션할 것이다. MTS 테트라졸륨 생물환원 검정법을 사용하여, 세포 살해 및 종점 Ad5 NAb 역가를 측정할 것이다. 1:25 미만의 값을 가진 종점 역가는 0의 값으로 지정될 것이다.
통계학
면역 반응을 비교하는 통계학적 분석을, 만-휘트니(Mann-Whitney) 시험(PRISM, Graph Pad)을 이용하여 수행할 것이다. 생존율 비교는 카플란-마이어 플롯(PRISM, Graph Pad)을 이용하여 수행할 것이다. Ad5 NAb 역가 및 EA-특이적 CMI는 연속 변량으로서 분석될 것이다. Ad5 NAb 역가와 EA-특이적 CMI의 변화의 연관성을 스피어만 상관 계수를 이용하여 시험할 것이다. Ad5 NAb 역가와 생존율의 연관성을 비례 위험 모형의 왈드 시험(Wald test)을 이용하여 시험할 것이다.
2차 목적은 생성물을 이용한 면역화 치료 후 EA 특이적인 면역 반응을 평가하는 것일 것이다.
수지상 세포는 에볼라 감염된 피험체의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 발생될 것이며; 백신접종-후 이 환자의 PBMC를 사용하여, EA에 특이적인 개별 T-세포주를 구축하려고 할 것이다. 간략하게는, PBMC를 림프구 분리 배지 구배를 사용하여 단리하고, AIM-V 배지(2x107개 세포)에 재현탁화한 다음, 6-웰 플레이트에 부착하도록 2시간 동안 놔둘 것이다. 부착성 세포를 100 ng/mL의 재조합 인간(rh) GM-CSF 및 20 ng/ml의 rhIL-4를 함유하는 AIM-V 배지에서 5일 동안 배양할 것이다. 배양 배지를 3일마다 새 것으로 교환할 것이다.
실시예 3: 임상 등급의 다중- 표적화된 백신의 GLP 생성
이 실시예는 양호한 실험실 수행(GLP) 표준을 사용하여 임상-등급 다중-표적 백신의 생성을 보여준다. 이전에, Ad5[E1-, E2b-]-CEA(6D) 생성물을 양호한 제조 수행 표준에 따라 GLP 조건 하에 5 L 세포 생물반응기를 사용하여 생성하였다. 이 실시예는, Ad5[E1-, E2b-]-EA 생성물 GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및 L이 유사한 접근법을 사용하여 5 L 세포 생물반응기에서 생성될 수 있음을 보여줄 수 있다.
간략하게는, E.C7 제조 세포주의 바이알을 해동시키고, T225 플라스크로 옮긴 다음, 처음에는 10% FBS/4 mM L-글루타민을 함유하는 DMEM에서 37℃, 5% CO2에서 배양할 것이다. 증식 후, E.C7 세포를 10-층 CELLTACKS(CS-10)를 사용하여 증식시키고, FreeStyle 혈청-무함유 배지(SFM)로 옮길 것이다. E.C7 세포를 SFM에서 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 세포 생물반응기 내 5x105개 세포/mL의 표적 농도까지 배양할 것이다. 그런 다음, E.C7 세포를 각각 Ad5[E1-, E2B-]-GP, Ad5[E1-, E2B-]-NP, Ad5[E1-, E2B-]-VP40, Ad5[E1-, E2B-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30, [E1-, E2b-]-VP24, 및/또는 [E1-, E2b-]-L을 사용하여 감염시키고, 48시간 동안 배양할 것이다.
중간-스트림 공정을, 임상 등급 Ad5[E1-, E2B-]-GP, Ad5[E1-, E2B-]-NP, Ad5[E1-, E2B-]-VP40, Ad5[E1-, E2B-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30, [E1-, E2b-]-VP24, 및/또는 [E1-, E2b-]-L 생성물을 제조하는 데 사용된 것과 동일한 방식으로 수행할 것이다. 수확 전 30분째에, 벤조나제 뉴클레아제를 배양물에 첨가하여, 농축을 위해 보다 양호한 세포 펠렛화를 촉진할 것이다. 원심분리에 의해 펠렛화한 후, 상층액을 폐기하고, 펠렛을 1% 폴리소르베이트-20을 함유하는 완충제에 실온에서 90분 동안 재현탁할 것이다. 그런 다음, 용해물을 벤조나제로 처리하고, 5 M NaCl을 첨가하여 반응을 중단시킬 것이다. 슬러리를 원심분리하고, 펠렛을 폐기할 것이다. 용해물을 여과에 의해 정제하고, 2-컬럼 이온 교환 절차로 처리할 것이다.
백신 생성물을 정제하기 위해, 2-컬럼 음이온 교환 절차를 수행할 것이다. 제1 컬럼을 Q Sepharose XL 수지로 패킹하고, 살균한 다음, 로딩 완충제를 이용하여 평형화할 것이다. 정제된 용해물을 컬럼 상으로 로딩하고, 로딩 완충제로 세척할 것이다. 백신 생성물을 용리하고, Ad5[E1-, E2B-]-GP, Ad5[E1-, E2B-]-NP, Ad5[E1-, E2B-]-VP40, Ad5[E1-, E2B-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30, [E1-, E2b-]-VP24, 및/또는 [E1-, E2b-]-L을 함유하는 주요 용리 피크(용리물)를 다음 단계로 수행할 것이다. 제2 컬럼에 Source 15Q 수지를 패킹하고, 살균한 다음, 로딩 완충제를 사용하여 평형화할 것이다. 제1 음이온 교환 컬럼 유래의 용리물을 제2 컬럼 상에 로딩하고, 백신 생성물을 100% 완충제 A(20 mM Tris, 1 mM MgCl2, pH 8.0)에서 출발하여 50% 완충제 B(20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 2 M NaCl, pH 8.0)로 진행하는 구배에서 용리할 것이다. Ad5[E1-, E2B-]-GP, Ad5[E1-, E2B-]-NP, Ad5[E1-, E2B-]-VP40, Ad5[E1-, E2B-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30, [E1-, E2b-]-VP24, 및/또는 [E1-, E2b-]-L을 함유하는 용리 피크를 수집하고 2℃ 내지 8℃에서 밤새 저장할 것이다. 피크 용리 분획을 농축 및 제형 완충제(20 mM Tris, 25 mM NaCl, 2.5% (v/v) 글리세롤, pH 8.0)에 대한 투석여과를 위해 접선 유동 여과(tangential flow filtration; TFF) 시스템을 통해 처리할 것이다. 가공 후, 최종 백신 생성물을 멸균 여과하고, 분취물로 분배하고, -60℃ 이하에서 보관할 것이다. 100% 순도로 근접하는 고도로 정제된 생성물이 전형적으로 생성되고, 이들 생성물에 대한 유사한 결과를 예측한다.
생성된 VP 생성물의 농도 및 총 수를 분광 광도법에 의해 확인할 것이다. 생성물 순도를 HPLC에 의해 평가할 것이다. 감염성 활성을, 키트를 사용하여 감염성 입자에 대한 Ad5 헥손-염색 검정법을 수행함으로써 확인할 것이다.
웨스턴 블롯을 벡터 형질감염된 세포로부터의 용해물을 사용하여 수행하여, EA 발현을 입증할 것이다. 품질 관리 시험을 수행하여, 최종 백신 생성물이 미코플라즈마-무함유이며 미생물 생물부담(bioburden)을 갖고 있지 않고 1 mL 당 2.5 내독소 단위(EU) 미만의 내독소 수준을 나타냄을 확인할 것이다. 면역원성을 확인하기 위해, 개별 벡터를 마우스에서 시험할 것이다.
실시예 7: 단일- 표적화된 및 다중- 표적화된 GP , NP, VP40, VP35, VP30, VP24, L 바이러스 벡터의 면역원성
암컷 C57BL/6 마우스에게 1010개 VP의 Ad5[E1-, E2B-]-GP, Ad5[E1-, E2B-]-NP, Ad5[E1-, E2B-]-VP40, Ad5[E1-, E2B-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30, [E1-, E2b-]-VP24 또는 [E1-, E2b-]-L, 또는 1:1:1 비율의 2개 이상의 바이러스들의 1010개 VP의 조합을 피하 주사할 것이다. 대조군 마우스에게 3x1010개 VP의 Ad-널(전이유전자 삽입물 없음)을 주사할 것이다. 용량을 25 μL의 주사 완충제(3% 수크로스를 함유하는 20 mM HEPES)에서 투여할 것이고, 마우스를 14일 간격으로 3회 백신접종할 것이다. 마지막 주사 후 14일째에 비장 및 혈청을 수집할 것이다. 혈청을 -20℃에서 동결시킬 것이다. 비장을 70 μM 나일론 세포 여과기(BD Falcon, San Jose, CA)를 통해 부드럽게 으깨어서, 비장세포 현탁액을 발생시킬 것이다. 적혈구 용해 완충제(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 첨가하여 적혈구를 제거할 것이고, 비장세포를 2회 세척하고, R10(L-글루타민(2 mM), HEPES(20 mM), 페니실린 100 U/mL 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml, 및 10% 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640)에 재현탁화할 것이다. 비장세포를 ELISPOT 및 유세포분석에 의해 사이토카인 생성에 대해 검정할 것이다.
면역원성 연구:
마지막 면역화 후 2주째에, 비장세포를 EA 펩타이드 풀에 노출시킨 후, CMI 활성을 IFN-γ 분비 세포(SFC)에 대한 ELISpot 검정법을 이용하여 확인할 것이다.
간략하게는, IFN-γ 분비 비장세포(SFC)에 대한 ELISpot 검정법에 의해 평가된 바와 같이 EA에 대한 CMI 반응을 대조군 마우스(Ad5-널 빈 벡터가 주사됨)에서가 아니라 다중-표적화된 면역화된 마우스에서 검출될 것이다. ELISPOT 검정법 반응의 특이성은 SIV-nef 또는 SIV-vif 펩타이드 항원과 관계없이 반응성의 결여에 의해 확인될 것이다. 양성 대조군은 콘카나발린 A(Con A)에 노출된 세포를 포함할 것이다.
ELISPOT 검정법
GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L-특이적 IFN-γ-분비 또는 IL-2-분비 T 세포를 새로 단리된 마우스 비장세포로부터 ELISPOT 검정법에 의해 확인할 것이다. 간략하게는, 2x105개 비장세포를, GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 또는 L로부터 유래된 단일 풀에서 오버래핑 15-량체 펩타이드 0.2 ㎍/웰을 사용하여 자극시킬 것이다. 세포를 양성 대조군으로서 1개 웰 당 0.0625 ㎍ 농도의 Con A를 사용하여 자극시킬 것이고, SIV-Nef 및 SIV-Vif로부터 유래된 오버래핑 15-량체 완전 펩타이드 풀을 관계없는 펩타이드 대조군으로서 사용할 것이다. SFC의 수를, 면역스폿 ELISPOT 플레이트 판독기를 사용하여 확인할 것이고, 그 결과를 106개 비장세포 당 SFC의 수로서 기록할 것이다. 보완 의존적 세포의 세포독성(CDCC)의 수준을 확인하기 위해, CDCC 시험을 EA 표적 세포를 사용하여 수행할 것이다.
세포내 사이토카인 자극
비장세포를 제조할 것이다. 자극 검정법을, 96-웰 U-바닥 플레이트에서 1개 웰 당 1x106개의 살아 있는 비장세포를 사용하여 수행할 것이다. GP, NP, VP40, VP35, VP30, VP24 및 L의 전체 코딩 서열을 스패닝(spanning)하는 오버래핑 펩타이드의 풀을 11-아미노산 오버랩을 가진 15-량체로서 합성할 것이고, 동결된 펩타이드 풀을 DMSO에 용해시킬 것이다. SIV-Vif 및 SIV-Nef에 상응하는 유사하게 구축된 펩타이드 풀은 오프-표적 대조군으로서 역할을 할 것이다. R10 배지(RPMI 1640, 10% 태아 소 혈청 및 항생제) 내 비장세포를, 37℃ 및 5% CO2에서 6시간 동안 2 ㎍/mL/펩타이드로 펩타이드 풀을 첨가함으로써 자극시킬 것이고, 단백질 수송 저해제(GolgiStop)를 2시간 동안 인큐베이션 내에 첨가할 것이다. 그런 다음, 자극된 비장세포를 림프구 표면 마커 CD8α 및 CD4에 대해 염색하고, 고정하고, 침투시킨 다음, IFN-γ 및 TNFα의 세포내 축적에 대해 염색할 것이다. 마우스 CD8α, CD4, IFN-γ 및 TNFα에 대한 항체를 사용할 것이고, 염색을 항-CD16/CD32의 존재 하에 수행하였다. 유세포 분석을 수행할 것이고, BD Accuri C6 소프트웨어에서 분석할 것이다.
보완-의존적 세포독성 검정법( CDC )
EA 세포를 96-웰 조직 배양 마이크로플레이트에서 1개 웰 당 2x104개 세포의 밀도로 밤새 배양할 것이다. 풀링된 열 불활성화된 마우스 혈청을 1:50 희석으로 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션할 것이다. 그런 다음, 토끼 혈청을 보완 소스로서 1:50 희석으로 첨가할 것이고, 세포를 37℃에서 2.5시간 더 인큐베이션할 것이며, 세포 배양 상층액을 Promega Cytotox 96 비-방사성 세포독성 검정법을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 검정할 것이다. EA 세포의 용해%를 식 용해% = (실험적 - 표적 자발적) / (표적 최대 - 표적 자발적) x 100%에 의해 계산할 것이다.
항-에볼라 면역요법 연구:
연구를 수행하여, 에볼라 감염이 구축된 마우스에서 면역요법 연구에서 Ad5[E1-, E2b-]-기반 다중-백신의 항-에볼라 능력을 시험할 것이다. 이 연구에서, Ad5[E1-, E2b-]-기반 다중-백신의 개별 성분의 항-에볼라 활성을 평가할 것이다.
C57Bl/6 마우스 그룹의 우측 옆구리에 5x105개의 EA 발현 세포를 피하 주사할 것이다. 마우스를 각각 1x1010개 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-널(전이유전자 없음, 예를 들어 빈 벡터), Ad5[E1-, E2B-]-GP, Ad5[E1-, E2B-]-NP, Ad5[E1-, E2B-]-VP40, Ad5[E1-, E2B-]-VP35, Ad5[E1-, E2b-]-VP30, [E1-, E2b-]-VP24 및 [E1-, E2b-]-L을 각각 3회 피하 주사함으로써 치료할 것이다.
실시예 8: 백신 표적으로서 에볼라 바이러스 GP 및 NP의 용도.
GP 및/또는 NP를 비롯한 에볼라 바이러스 유전자 성분을 함유하는 보다 이른 세대의 재조합 Ad5 기반 벡터(Ad5[E1-]) 백신이 실험실 설정에서 구축, 생성 및 시험되어 왔다. 유망한 예비-임상 보호 효과가 마우스 및 비-인간 영장류(NHP)에서 이들 백신을 사용하여 수득되었으나, 동물이 아데노바이러스에 대한 기존 면역 또는 Ad5 벡터 유도된 면역을 나타낸 경우 그 효능은 무력화되었다.
이 실시예에서, 에볼라 바이러스의 GP 및 NP 성분이 백신에 사용될 것이다. 자이르 균주 및 수단 균주가 대부분의 종-특이적인 사례 사망률에 책임이 있기 때문에, 이들 2개 균주의 바이러스 성분을 처음에 사용할 것이다. GP는, 이것이 표적화될 수 있는 표면 당단백질이기 때문에 이용될 것이다. 에볼라의 2개의 단리된 균주 유래의 GP 유전자가 에볼라에 대한 광범위한 반응성 면역 반응을 유도하는 데 사용될 것이다. NP는 VP35, VP30, 및 기능성 전사효소-레플리카제 복합체로의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제에 연관이 있기 때문에, 이는 바이러스 복제를 방해하고/거나 예방하는 면역 반응을 유도하기 위한 백신에 사용될 것이다. 이러한 방식으로, 에볼라에 대해 체액성 면역 및 세포 매개성 면역(CMI) 반응을 유도할 Ad5[E1-, E2b-] 플랫폼을 기반으로 한 광범위하게 반응성인 백신이 개발될 것이다.
백신으로서의 재조합 Ad5 [E1-, E2b -]-기반 벡터의 용도
백신은 항원-제시 세포(APC)에의 한정된 에볼라 항원의 노출을 위해 피하 주사에 의해 직접 전달되어, 강력한 면역 반응을 유도할 것이다.
Ad5[E1-, E2b-]-기반 벡터 에볼라 백신의 증폭
4개의 Ad5[E1-, E2b-]-기반 백신을 구축하였다(도 8). 자이르 균주 백신에 있어서, 현재 발병된 GP 및 NP의 뉴클레오타이드 서열(자이르 에볼라 바이러스 단리물 H.sapiens-wt/GIN/2014/Gueckedou-C07, GeneBank accession # KJ660347)을 인간 코돈 사용빈도로 최적화하고, CMV 프로모터의 조절 하에 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 내로 클로닝하였다. 아데노바이러스 E1 및 E2b 유전자를 안정하게 발현하는 E.C7 세포를 선형화된 Ad5[E1-, E2b-] 플라스미드 구축물로 형질감염시키고, Ad5[E1-, E2b-]-GPEZ 생성물 및 Ad5[E1-, E2b-]-NPEZ 생성물을 생성함으로써 바이러스 입자를 수득하였다.
수단 균주 백신을 위해, 수단 균주의 에볼라 바이러스의 GP 및 NP의 뉴클레오타이드 서열(수단 에볼라 바이러스 단리물 EboSud-682 2012, 완전 게놈 GenBank: KC545392.1)을 인간 코돈 사용빈도로 최적화하고, CMV 프로모터의 조절 하에 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 내로 클로닝하였다. 아데노바이러스 E1 및 E2b 유전자를 안정하게 발현하는 E.C7 세포를 선형화된 Ad5[E1-, E2b-] 플라스미드 구축물로 형질감염시키고, Ad5[E1-, E2b-]-GPES 생성물 및 Ad5[E1-, E2b-]-NPES 생성물을 생성함으로써 바이러스 입자를 수득하였다.
재조합 Ad5 [E1-, E2b -]-기반 백신의 생성, 정제 및 시험.
NP를 이용한 이후의 연구를 위해 부가적인 백신을 제조할 것이다. E.C7 세포주는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터가 높고 재현 가능한 수율로 성장할 수 있도록 한다. Ad5[E1-, E2b-] 벡터는, Triton X-100을 사용하여 E.C7 인간 세포로부터의 방출, CsCl 구배 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제, 및 5% 수크로스를 함유하는 20 mM HEPES(pH 7.4)에 대한 투석에 의해 제조되고 생성될 것이다. 정제된 재조합 Ad5[E1-, E2b-]-기반 바이러스 백신은 분취될 것이고, 건조 얼음-에탄올 배쓰에서 동결될 것이다. 바이러스 입자의 감염성은 플라크 검정법을 사용하여 측정된다. 바이러스 입자(VP) 농도는 260 nm에서의 흡광도로부터 계산되고, 생체내 면역화를 위한 바이러스의 양을 확인하는 데 사용될 것이다. 형질감염된 A549 세포 용해물로부터의 웨스턴 블롯은 항원 전이유전자 발현을 입증할 것이다. Ad5[E1-, E2b-]-GPEZ를 사용한 24시간 형질감염 후 E.C7 세포의 세포 용해물에서의 에볼라 GP(자이르 균주) 발현의 예가 도 9에 도시되어 있다.
용량 확대 면역원성 연구
이들 연구를 임상적으로 관련 있는 Ad5 면역 마우스 모델을 사용하여 수행할 것이다. BALB/c 마우스를 1010개 VP의 Ad5-널을 2주 간격으로 2회의 피하 주사에 의해 Ad5-면역시킬 것이다. 제2 주사 후 2주째에, Ad5 중화 Ab(NAb)에 대해 혈청을 시험하여, 마우스가 Ad5-면역되었는지 입증할 것이다. 이러한 방식으로 시험된 마우스 및 원숭이는 1/100 내지 1/200의 Ad5 NAb 역가를 달성하고, 임상 시험에서, 모든 환자들 사이에서 기존의 Ad5 NAb 역가 평균은 1:189±1:71(평균 ± SEM)이었다. 증가하는 용량의 Ad5[E1-, E2b-]-GPEZ/NPEZ 및 Ad5[E1-, E2b-]-GPES/NPES(동등하게 조합된 혼합물)에 의한 면역화 후 유도되는 면역 반응을 평가할 것이다. Ad5 면역 마우스 그룹(n=5/그룹)은 상승하는 용량의 4x108개, 4x109개 또는 4x1010개 VP(동일한 양의 Ad5[E1-, E2b-]-GPEZ/NPEZ 및 Ad5[E1-, E2b-]-GPES/NPES를 함유하는 백신 혼합물)를 사용하여 2주마다 피하 경로에 의해 2회 면역화될 것이다. 대조군 마우스(n = 5)에게 4x1010개 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-널을 동일한 스케쥴로 주사할 것이다. 최종 면역화 후 14일째에, 항체(Ab) 및 세포 매개성 면역(CMI) 반응을 평가할 것이다. CMI 평가를 위해, 개별 마우스의 비장세포를 이전에 기재된 ELISPOT 검정법을 사용하여 평가하여, GP 또는 NP 펩타이드 풀에 노출된 후의 인터페론-γ(IFN-γ) 및 IL-2-분비 림프 세포의 수를 측정할 것이다. 혈청 시료를 상업적으로 입수 가능한 정제를 사용하여 Ab 활성에 대해 평가할 것이다.
최고 면역원성 용량을 사용하여, 1개 또는 2개의 피하 면역화를 이용하는 연구를 수행하여, 1개 또는 2개의 용량이 효과적인 백신접종에 필요한지 확인할 것이다. 마우스 그룹(n=5/그룹)에게 가장 효과적인 용량의 백신을 사용하여 2주마다 1회 또는 2회 면역화할 것이다. 대조군 마우스(n = 5)에게 Ad5[E1-, E2b-]-널(백신과 동일한 양의 VP)을 동일한 스케쥴로 주사할 것이다. 최종 면역화 후 14일째에, Ab 및 CMI 반응을 상기 기재된 바와 같이 평가할 것이다. 이들 연구는, 1개 또는 2개의 면역화가 유의한 면역 반응을 유도하는 데 필요한지 또는 필요하지 않은지 확인시켜 줄 수 있다.
Ad5 면역 마우스에서 ELISA, ELISpot 및 유세포 분석에 의한 면역원성 연구
이들 연구를 위해, 상기 확인된 백신접종의 가장 효과적인 용량 및 빈도가 사용될 것이다. 원숭이에서 인플루엔자 백신을 이용한 개념 증명 연구에서, 혈구응집 저해(HAI) 검정법에 의해 평가된 바와 같은 Ab 반응은 최대 수준을 발달시키는 데 최대 30일이 필요할 것으로 관찰되었다(도 9). 따라서, 피하 백신접종 후 2주, 30일 및 60일째에 Ad5-면역 BALB/c 마우스(n=5/그룹)에서 Ab 활성 및 CMI 반응이 백신접종(동일한 양의 Ad5[E1-, E2b-]-GPEZ/NPEZ 및 Ad5[E1-, E2b-]-GPES/NPES를 함유하는 백신 혼합물)의 가장 효과적인 용량 및 빈도와 함께 평가될 것이다. 대조군 마우스에게 Ad5[E1-, E2b-]-널(백신과 동일한 VP 양)을 동일한 스케쥴로 주사할 것이다. 백신접종 후 2주, 30일 또는 60일째에, 혈청 및 비장 세포를 개별 마우스로부터 수집할 것이다. 개별 마우스의 비장세포를, ELISPOT 검정법을 사용하여 CMI 반응에 대해 평가하여, GP 또는 NP 펩타이드 풀에의 노출 후 IFN-γ 및 IL-2 분비 림프 세포의 수를 측정할 것이다. 세포독성 T 림프구(CTL) 반응이 또한, 백신 평가에 중요할 수 있기 때문에, 그랜자임 B 분비를 GP 또는 NP 펩타이드 풀에 노출된 후의 비장세포 상에서 ELISPOT 검정법에 의해 CTL 활성에 대해 분석할 것이며, 이러한 ELISPOT 검정법은 CD8 기능성 CTL 활성을 측정하기 위한 양호한 검정법이기 때문이다. 혈청 시료는 ELISA 기술을 이용하는 상업적으로 입수 가능한 정제된 에볼라 바이러스 단백질에 대한 Ab 활성에 대해 평가될 것이다. 바이러스 중화 활성에 있어서, 플라크 환원 중화 검정법 또한, 개별 마우스 유래의 혈청 상에서 수행될 것이다.
최고 CMI 반응이 관찰되는 상기 연구를 기반으로, 유세포 분석 연구 또한 수행되어, 백신을 이용한 면역화에 의해 유도되는 T-세포 면역 반응을 특징규명할 것이다. Ad5-면역 BALB/c 마우스(n = 5)는 백신접종의 가장 효과적인 용량 및 빈도를 사용하여 백신에 의해 면역화될 것이다. 대조군 마우스(n = 5)에게 Ad5[E1-, E2b-]-널(백신과 동일한 VP 양)을 동일한 스케쥴로 주사할 것이다. 백신접종 후 최적의 시간을 기반으로, 비장을 수집할 것이고, GP 또는 NP 펩타이드 풀에 노출된 후 IFN-γ 분비 세포 및/또는 TNF-α 분비 세포에 대한 유세포 분석에 의해 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 확인할 것이다. 간략하게는, 면역화된 마우스 및 대조군 마우스 유래의 비장세포를 수집하고, 단백질 수송 저해제인 GolgiStop의 존재 하에 0.5 mg/ml의 GP 또는 NP 펩타이드 풀과 함께 5시간 동안 인큐베이션할 것이다. 그런 다음, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 고정하고, 침투시킨 다음, IFN-γ 또는 TNF-α에 대해 염색한 다음, 유세포 분석에 의해 분석할 것이다.
바이러스 시도에 대한, 백신접종된 Ad5 면역 마우스의 보호
원리 증명 시험에서, 시도 연구를 마우스에서 수행할 것이다. 2개 그룹의 BALB/c 마우스(n=15/그룹)을 상기 기재된 바와 같이 Ad5-면역화시킬 것이다. 백신접종의 가장 효과적인 용량 및 빈도를 사용하여, 하나의 그룹을 백신(동일한 양의 Ad5[E1-, E2b-]-GPEZ/NPEZ 및 Ad5[E1-, E2b-]-GPES/NPES를 함유하는 백신 혼합물)을 사용하여 면역화시킬 것이다. 대조군에게 Ad5[E1-, E2b-]-널(백신과 동일한 VP 양)을 동일한 스케쥴로 주사할 것이다. 유도된 바이러스 중화 역가가 달성되는 경우, 마우스는 치사 마우스 적응된 균주의 에볼라를 접종함으로써 시도될 것이다. 종점에 대하여 체중 감량 및 사망까지의 시간을 모니터링할 것이다. 시도 후 21일에 걸쳐 이환율의 임상 징후에 대해 마우스를 매일 관찰할 것이다.
2기 연구
2기 연구에서, NHP에서 에볼라 백신의 면역원성을 평가할 것이다. 적절한 면역화 용량, 부스팅 스케쥴 및 살아 있는 에볼라 시도 잠재성이 확인될 것이다. 또한, 자이르 및 수단 균주의 에볼라 바이러스 유래의 융합된 GP 유전자 및 NP 유전자를 함유하는 Ad5[E1-, E2b-]-기반 플랫폼을 평가할 것이다. 이러한 방식으로, 2개의 재조합 벡터, Ad5[E1-, E2b-]-GPEZ/NPEZ 생성물 및 Ad5[E1-, E2b-]-GPES/NPES 생성물이 생성될 것이다. 다수의 유전자들을 하나의 재조합 Ad5[E1-, E2b-]-기반 벡터 내에 도입함으로써, 요구되는 바이러스 입자의 수는 4개의 개별 재조합 벡터를 각각 생성하고 조합하는 것과 비교하여 상당히 감소될 것이다.
상기 기재된 다양한 실시형태들은 조합되어, 추가의 실시형태를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 지칭되고/거나 출원 데이터 시트에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공개는, 각각의 개별 공개, 특허 또는 특허 출원이 인용에 의해 구체적으로 그리고 개별적으로 지시된 바와 동일한 범위로 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되어 있다.
실시형태의 양태는, 보다 추가의 실시형태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공개들의 개념을 이용하기 위해 필요하다면 변형될 수 있다.
이들 변화 및 다른 변화들은 상술한 설명의 측면에서 실시형태에 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구항에서, 사용된 용어는 청구항을 명세서 및 청구항에서 개시된 특정 실시형태로 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되며, 그보다는 이러한 청구항이 나타내는 등가물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 실시형태들을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 이에, 청구항은 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> ETUBICS CORPORATION <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR EBOLA VIRUS VACCINATION <130> 39891-715.601 <140> PCT/US2016/012482 <141> 2016-01-07 <150> 62/101,968 <151> 2015-01-09 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18959 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 cggacacaca aaaagaaaga agaattttta ggatcttttg tgtgcgaata actatgagga 60 agattaataa ttttcctctc attgaaattt atatcggaat ttaaattgaa attgttactg 120 taatcatacc tggtttgttt cagagccata tcaccaagat agagaacaac ctaggtctcc 180 ggagggggca agggcatcag tgtgctcagt tgaaaatccc ttgtcaacat ctaggcctta 240 tcacatcaca agttccgcct taaactctgc agggtgatcc aacaacctta atagcaacat 300 tattgttaaa ggacagcatt agttcacagt caaacaagca agattgagaa ttaactttga 360 ttttgaacct gaacacccag aggactggag actcaacaac cctaaagcct ggggtaaaac 420 attagaaata gtttaaagac aaattgctcg gaatcacaaa attccgagta tggattctcg 480 tcctcagaaa gtctggatga cgccgagtct cactgaatct gacatggatt accacaagat 540 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atttaaaaat aaatctattt cttctttttt gtgtgtcca 18959 <210> 2 <211> 18874 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 cggacacaca aaaagaaaga aaagtttttt agactttttg tgtgcgaata actatgagga 60 agattaatca ttttcctcaa actcaaacta atattaacat tgagattgat ctcatcattt 120 accaattgga gacaatttaa ctagtcaatc ccccatttgg gggcattcct aaagtgttgc 180 aaaggtatgt gggtcgtatt gttttgcctt ttcctaacct ggctcctcct acaattctaa 240 cctgcttgat aagtgtgatt acctgagtaa tagactaatt tcgtcctggt aattagcatt 300 ttctagcaaa accaatacta tctcaagtcc taagagaagg tgagaagagg gtcccgaggt 360 atccctccag tccacaaaat ctagctaatt ttagctgagt ggactgatta ctctcatcac 420 acgctaacta ctaagggttt acctgagagc ctacaacatg gataaacggg tgagaggttc 480 atgggccctg ggaggacaat ctgaagttga tcttgactac cacaaaatat taacagccgg 540 gctttcggtc caacaaggga ttgtgcgaca aagagtcatc ccggtatatg ttgtgagtga 600 tcttgagggt atttgtcaac atatcattca ggcctttgaa gcaggcgtag atttccaaga 660 taatgctgac agcttccttt tacttttatg tttacatcat gcttaccaag gagatcatag 720 gctcttcctc aaaagtgatg cagttcaata cttagagggc catggtttca ggtttgaggt 780 ccgagaaaag gagaatgtgc accgtctgga tgaattgttg cccaatgtca ccggtggaaa 840 aaatcttagg agaacattgg ctgcaatgcc tgaagaggag acaacagaag ctaatgctgg 900 tcagttttta tcctttgcca gtttgtttct acccaaactt gtcgttgggg agaaagcgtg 960 tctggaaaaa gtacaaaggc agattcaggt ccatgcagaa caagggctca ttcaatatcc 1020 aacttcctgg caatcagttg gacacatgat ggtgatcttc cgtttgatga gaacaaactt 1080 tttaatcaag ttcctactaa tacatcaggg gatgcacatg gtcgcaggcc atgatgcgaa 1140 cgacacagta atatctaatt ctgttgccca agcaaggttc tctggtcttc tgattgtaaa 1200 gactgttctg gaccacatcc tacaaaaaac cgatcttgga gtacgacttc atccactggc 1260 caggacagca aaagtcaaga atgaggtcag ttcattcaag gcagctcttg gctcacttgc 1320 caagcatgga gaatatgctc catttgcacg tctcctcaat ctttctggag tcaacaactt 1380 ggaacatggg ctttatccac aactctcagc cattgctttg ggtgttgcaa ctgcccacgg 1440 gagcacgctg gctggtgtta atgtagggga gcaatatcag caactgcgtg aggctgctac 1500 tgaagctgaa aagcaactcc aacaatatgc tgagacacgt gagttggaca 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gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tactgtaata gtaatcaatt 360 acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 420 ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 480 cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 540 actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 600 aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 660 acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 720 tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 780 gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 840 aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 900 agagctggtt tagtgaaccg tcagatccgc tagagatctg 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agagaaaaaa 8100 atctcagggt tactctaagg agaaatatta tttttaaaat ttacttaaat gctgaccact 8160 tatcttaaat gagcaattaa taatatgttt ttctgcttct ttgcttgatt tacaatatga 8220 tatttctctt aataatgatt aatatattaa gaaaaactta tgacgaagat taaaggggag 8280 gatcgttaac gggaaaatct cccatctcgt tcgtcgaagc cacgttggtg gtgcttgcag 8340 ctgagaacaa ctccagagat tgtaggtaga aaggaccagc atttataggt aggggtcaga 8400 aagcaacaat agccataaaa ggagagcctg acattgctat ttaatatcct agaacctgat 8460 ttctaggttc tagttgtaca atccggatga tggagcattc aagagaacgg ggtagatcta 8520 gcaacatgcg acataatagc cgggaaccat acgaaaatcc atcaaggtct cgctcattat 8580 ctcgggaccc taatcaggtt gatcgtaggc agcctcgaag tgcatcccaa attcgtgttc 8640 cgaatctgtt ccatcggaaa aagactgatg cactcatagt tcctccggct cccaaagata 8700 tatgcccaac actcaaaaaa ggattcctct gcgatagtaa attttgcaaa aaagatcacc 8760 aattggatag cttaaatgat catgaattac tactgctaat tgcaagaaga acatgtggaa 8820 ttatcgagag caattcgcag attacatccc caaaagatat gcggttagcg aatccaacag 8880 ctgaagactt ctcacaaggt aatagtccta aattaacact tgcagtcctt cttcaaattg 8940 ctgaacattg ggcaaccaga gacctaaggc aaattgagga ctctaaactt agagctcttt 9000 taaccctttg tgccgtatta acaaggaaat tttctaaatc ccaactgggt cttctatgtg 9060 agacccacct acggcatgag ggcctcggac aggaccaagc tgattctgta ttagaggtct 9120 accaaagact ccacagtgat aaaggaggga attttgaggc tgccctgtgg caacaatggg 9180 accgacagtc gttaataatg ttcatctctg cttttctcaa cattgctctc cagacacctt 9240 gtgaaagttc tagtgtcgta gtctcaggtc ttgccacatt gtacccagca caagacaatt 9300 ctacaccatc cgaggcaact aatgatacca cctggtcaag tacagttgaa tagaaaacca 9360 ctggagctat ttttccacga ttgctctcag tcaataaatt aatatagata taatacgact 9420 tcggtgtgca attgtcaagg gttccatttg gtaataatga ttcttaaaac aatctactat 9480 cgtaattatc gatggatcta ccctatttga cggtacatga cttgaatgta ataaggtaag 9540 ttggtatctg aggtattttg tctagagtat actcaaaatc gtatgtctag caaattatca 9600 atagcaaagt taaattctcc taacctcata ttttgatcaa gtaatcatga ttttatggta 9660 attctttgca gattatcggt ttaatcttta ttaagaaaaa atcatgattg tagacaattt 9720 actggtagtc cctgggtatc caagtttatg aacagagcta gagagaattt gctacttccg 9780 aggtataact ttattatttg ctacttcgaa tgcctaaaac cagtaatgca ggatgaagat 9840 taattgcgga ggaatcagga attcaacttt agttccttaa ggcctcgtct gaatcttcat 9900 cagttagtaa gttcttttat agaagtcatt agcttctaag gtgattatat tttagtatta 9960 aattttgtta attgcttgct ataaagttga agtgtctaat gcttaaatga acatttcttt 10020 gaagctgaca tacgaataca tcatatcata tgaaaacatc gcaattagag cgtccttgaa 10080 gtctggcatt gacagtcacc aggctgttct cagtagtctg tccttggaag ctcttgggga 10140 gacaagaaga ggtcccagag agtcccaaca ggttggcata aggtcattaa caccagcata 10200 gtcagctcga tcaagactgt aagcgagtcg attgcaacta aaaagattat ttcttgttgt 10260 ttaaacaaat tccttttgtg tgagacaccc tcaaggcaca agatggctaa agccacaggc 10320 cgatacaatc tcgtgccccc aaagaaagat atggaaaagg gagtgatttt tagtgatctt 10380 tgtaatttct tgattactca aaccctgcaa ggttggaagg tttattgggc aggaattgag 10440 tttgatgtaa gtcaaaaagg catggctctt ctgacaagac tcaaaacaaa tgactttgct 10500 cctgcctggg cgatgacaag aaatctcttc ccacatctgt tccaaaaccc aaattcggtt 10560 attcaatctc ccatctgggc tttgagggta attttggcag ccggattgca ggatcagttg 10620 ttagaccatt cattggttga gccattgaca ggggctctcg gtctaatttc tgattggctc 10680 ctaactacaa cgtcaacaca tttcaatctt cgtactagaa gcgtaaagga ccagcttagt 10740 tttcgtatgt tatctttgat caggtcaaac atcttgcagt tcatcaacaa gcttgacgcc 10800 ctgcatgttg tcaattacaa tggtttactc agtagtattg agatcgggac ttctacacac 10860 acaatcatta taactcgtac aaatatgggt tttctcgtgg aagttcagga gcctgacaaa 10920 tcagctatga attctaagcg cccaggacca gtcaagttct cattacttca tgagtctgcc 10980 ttcaaacctt tcactcgtgt tccacaatct gggatgcaat cattaataat ggagttcaac 11040 agtttgttgg caatttaaca aggtgatctt aaaataagta catgaatgag aattagttgt 11100 gggtcttacc tagcattgtt gagttagcta tctaatctat tttcactaat tgcattgagc 11160 actgctagta ggtttgcacc acgttaaaga ttcagagtgt atgaattgtg cagatttaaa 11220 cttgggtttt gccttatgct tcataggtgg tctttttaaa atggagatta tcagcatttc 11280 ttcaatggga ggagttagca atcagaaatt ggagataaat ggacatcggg atagaacaat 11340 gcctaactat tgggcggctt tcatttttaa atgtgtatat aaccaatctt ttcctatctt 11400 tgcttatatt ggtgtaactt tactttaata acatgtcaat gctatactgt taagagaagg 11460 tctgaggaag attaagaaaa aggtctcgtg ttcacttggt tgccgtcaag tatcctgtgg 11520 tttttttcta cctaacttcc tcatgccata tggctaccca gcatacccag tacccggatg 11580 cacgtttatc ttcacctata gtcctggatc aatgtgattt ggtaactcga gcatgtgggt 11640 tatattcatc ttattctcta aatcctcagc taaggcaatg taaattacca aaacatatat 11700 atcgacttaa gttcgacaca atagtatcca aattcctaag tgatacacct gtagcaacac 11760 tgccgataga ctatttagta ccaattctcc tgcgttccct aacggggcac ggtgataggc 11820 cgttgacccc gacttgtaat caattccttg atggaattat taattacact cttcatgatg 11880 cagcctttct tgattactat ctcaaggcaa caggtgcaca ggaccatttg acaaacatta 11940 caactagaga gaagcttaaa aacgaaattc taaacaatga ttatgtccat caattgttct 12000 tctggcatga cctgtctatt ttggctcgac gtgggcgtct gaatcgcggg aacaaccgtt 12060 caacctggtt tgttcatgat gaattcattg atattttagg atatggcgat tatatttttt 12120 ggaaaatacc tttatcatta ttaccagtta ctatagacgg ggtcccacac gcggcaactg 12180 actggtatca accgactctt tttaaagaat ccatcctagg gcacagccaa atcctatctg 12240 tgtcgacagc tgaaatacta attatgtgta aagatattat cacctgtagg tttaatacat 12300 cactgattgc atccattgca aaattagagg atgtagatgt gtctgattat cctgacccga 12360 gtgatattct taagatatac aatgctggag actatgtaat atctattctt ggctcagaag 12420 gttataagat aataaagtac cttgaaccac tttgtttggc caaaatccaa ctttgctcta 12480 aattcacaga aagaaaaggt cgtttcctca cacagatgca tttatcagta ataaatgatc 12540 ttcgggagtt gatttctaac cgcaggttaa aggactatca gcaagagaag attagggatt 12600 ttcacaaaat attattacaa ttgcaattat ctcctcaaca gttttgtgaa ttattctctg 12660 ttcaaaaaca ttgggggcat ccaattttac atagtgagaa agctatacaa aaagtaaaac 12720 ggcatgcaac catccttaag gctctcagac ctaatgtcat ttttgagaca tattgtgtat 12780 tcaagtacaa tattgccaag cactatttcg acagccaagg aacttggtac agtgtaatct 12840 cagacaggaa tttaactcca ggactcaact ccttcataaa acgtaatcac tttccttcac 12900 tacccatgat taaggatctt ctatgggaat tctatcatct taatcaccct ccgttattct 12960 ctacaaaggt gattagtgac ttaagtattt tcatcaagga tagggccaca gctgttgaac 13020 agacatgttg ggatgcagtc tttgaaccca atgtgctagg ttacaatcct ccaaacaaat 13080 tctccactaa aagggtgccg gaacaatttc tagaacagga ggatttttca atcgaaagtg 13140 tcctgaatta tgcacaggaa ttacattatt tattaccaca gaataggaat ttttcctttt 13200 ctcttaaaga aaaagaatta aatattggac gaacatttgg taagctacca tatctcacac 13260 ggaatgtcca aactttatgt gaggctctgt tagcagatgg actggctaag gccttcccca 13320 gtaacatgat ggtagtaact gaacgtgaac aaaaagagag ccttcttcat caggcatcat 13380 ggcaccacac cagtgatgat tttggagaga atgctaccgt tcgagggagt agttttgtaa 13440 ctgatttaga gaagtacaat cttgcatttc gctatgagtt cactgcacca tttattgagt 13500 actgcaacca ttgctatggt gtgcgtaatg tctttaattg gatgcattat ttaatcccgc 13560 agtgttacat gcatgtaagt gattattata atccgcctca caatgttaat cttagcaatc 13620 gagaatatcc tcctgaaggc ccgagttcgt accgagggca cttaggaggc atagagggat 13680 tacaacaaaa actgtggacg agtatatcct gtgcacaaat ctccttagtg gaaattaaaa 13740 ctggttttaa gttacgatca gcggtcatgg gagacaatca gtgtataacc gtattgtctg 13800 tttttccact tgaaacagac cctgaagagc aggagcaaag cgccgaagac aatgctgcaa 13860 gagtagcagc aagtcttgca aaagtaacca gtgcatgtgg gatctttctt aaaccagaag 13920 agacattcgt acactcaggt ttcatttatt tcggaaaaaa acaatatctc aatggtgtac 13980 aattaccgca atcactcaaa acagcagcaa gaatggcgcc actctctgat gctatattcg 14040 atgatctaca aggaacactt gccagtattg gaactgcctt cgaacgtgct atatcggaaa 14100 cgcgacatat cctcccatgt cgtattgtag cagctttcca tacgtatttc gccgttcgga 14160 ttttacaata tcaccatctt ggatttaata aaggcatcga tttagggcag ttgtcactta 14220 gtaaaccatt agactatggg actattactc taacattggc ggttccacaa gtccttgggg 14280 gattgtcttt tctaaatcca gaaaagtgtt tttatcgaaa cttcggagat cctgtgactt 14340 ctggactttt ccagctacgg gtgtacctag aaatggttaa catgaaagac ctattttatc 14400 cattaatatc gaaaaatcca ggaaattgta gtgccattga ttttgtctta aatccatccg 14460 gattaaatgt tccaggatca caagacttga catccttttt gcgacagatc gttaggcgta 14520 gtattacact aactgcaaga aataagttaa ttaacactct cttccatgcc tctgctgatt 14580 tggaagatga gatggtttgt aaatggctcc tttcatcaaa ccctgtcatg agtcgctttg 14640 cagcggatat tttttccagg acacctagtg gtaaacgtct ccaaatatta ggttatcttg 14700 aagggaccag gactctattg gcctccaaaa tcataaacaa caacagtgag acacctgtac 14760 ttgataagct gaggaagatc accctacaaa gatggaatct gtggttcagt tatttggacc 14820 attgtgacca attactagca gatgctctac agaaaattag ttgcacagtg gatttggccc 14880 agattttgcg tgagtataca tggtcacaca tcttagaggg tagaccattg atcggagcga 14940 cattaccatg tatggtggag caattcaaag ttaagtggct aagacaatat gaaccttgtc 15000 cagaatgcct caacaaaaaa ggctcaaatg cttatgtctc agttgcagtc aaagatcaag 15060 tggtcagtgc ttggcctaat acttctcgaa taagttggac aatagggagt ggtgtcccct 15120 atatagggtc aagaaccgag gataaaatcg gacagcctgc aatcaagccg cgatgccctt 15180 catctgccct caaggaggct atagaattag catcaaggct cacttgggtt acacaaggaa 15240 gttctaatag tgaacaatta atccggcctt tcttagaagc gagagtcaac cttagtgtca 15300 gtgaagtcct gcaaatgaca ccatcacatt attcaggaaa tattgtccat cgatataacg 15360 accaatatag cccgcactca tttatggcga atcgcatgag caatactgcg acccgtctca 15420 tagtgtcaac taatacactt ggagaatttt caggtggagg gcaggccgcc agggatagca 15480 atataatttt ccagaatgtt ataaatttag cagttgccct ttatgatatt agattccgga 15540 atacgaacac ctctgatata aggcataata gggctcatct tcacctgaca gagtgctgta 15600 ctaaagaggt cccggcccag tatttgacat atacaagtgc actcaatctg gatttaagcc 15660 gttatcgtga taatgaacta atatatgact caaatccact gaggggagga ttgaactgca 15720 atttaacaat ggatagtcct ttagtgaagg gtcctaggct taacatgatt gaagatgatc 15780 ttctccgctt tccacacctt tctggatggg agttagcgaa aacggtggta caatccatca 15840 tctcagacaa tagcaactca tcaacagatc caatcagtag cggagaaaca cgctctttca 15900 caactcattt tctcacttac cctcagattg gccttcttta cagtttcggg gcagtattat 15960 gcttttatct aggcaatact atcctatgga ctaaaaaact tgattatgaa cagtttctat 16020 attatttgca taaccagctg cacaacttac ctcatcgagc actccgtgtt tttaaaccaa 16080 catttaagca tgccagtgtg atgtcccgat taatggaaat tgattccaac ttctcaattt 16140 atattggcgg gacatctgga gatcgagggc tgtctgatgc tgctcgactg tttcttcgga 16200 cagcaatcgc gagtttttta caatttctta aaagctggat catcgatcgc caaaagacaa 16260 ttcctttatg gatagtatat ccgcttgaag gtcaacagcc ggaatccatc aatgaatttc 16320 tacataaaat ttttggtctg ctcaaacaag gccccaaaaa tattccaaag gaggtcagca 16380 ttcaaaatga tggacatttg gatttggcag 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cagataactg acataactag ctcaatgtgg ttaagtaatc 17280 aaaaatataa tctaccttgt caagttgaaa tcattacgat ggatgctgaa acaacagaga 17340 acttaaacag gtcccaactc taccgagcag tatataactt aatacttgat cacattgatc 17400 cgcagtatct caaggtggtg gtactcaaag tatttctgag tgatatagaa ggaatattat 17460 ggattaatga ttacttggct ccattattcg gggctggtta cttgattaaa ccgattacat 17520 caagtgcccg gtcaagtgaa tggtaccttt gcttatcaaa tttgatatct actaacagga 17580 gatcggccca tcagactcac aaggcatgtc ttggtgttat cagagatgct ttgcaagcac 17640 aagtccagcg aggcgtgtac tggttgagtc acatcgcaca gtatgctaca aagaatctcc 17700 attgtgaata catatgcctt ggtttcccac ctctagaaaa ggtcctatat cacaggtata 17760 atctagttga tactggactc ggtccattgt cgtcagttat tagacattta actaacctcc 17820 aggcagagat acgagactta gtattagatt ataccctgat gagagagagt cgcactcaaa 17880 cgtaccattt tattaagact gcaaaaggca gaatcacaaa gttagtcaat gactttctga 17940 agttttcttt aattgtccag gcactcaaaa ataattcttc ttggtatact gagcttaaaa 18000 aattacctga ggtgattaat gtgtgtaatc gattttatca tactcacagt tgcgaatgtc 18060 aggaaaaatt ctttgtccag acgctttatt tacaacgcct acgcgatgca gaaatcaagc 18120 taattgaacg ccttaccggg ttaatgcgat tttatccaga agggttaata tattccaatc 18180 acacataggt actaaatcat catagtatga ggaataaaat aatgataatt cctgacgaca 18240 gttttagttc cgattctaag tatatcggaa gagagtatgc caatcttaat tattaaaggt 18300 aacaagctat tagttattac ttattgataa gaataaactt tatcatagcg taacacatca 18360 taactttata gcgattttgc atttctaatc ctagtattta ttagaatgta ctatcagaga 18420 aatgacccca gttcctatct ttaaataatg attgtgtgta ttaaattatt agtttattag 18480 gtttatgagt tggttacaca gtgagtatta gtaattgagg attatgtaga taggtaatct 18540 aacactgaat cacccatctg atgtcaccat atccaaatat tgtgctagtc gcatttaaac 18600 atgctatctt cagttaagta acatagactg aaaatgctaa gaagagattg gagtaaaagt 18660 ataaaataaa tttaattaaa cttcaaagtg attaaatgat aatgatcttg ggaactcgat 18720 atgacctcaa gtcaaaaata atgtcaatat aattgtttag taatatgagt tataatgtga 18780 attttgataa ctaactagct ttagtagtta agatcaaatg caaacattct aagaatgtta 18840 agcgcacaca aaaacattat aaaaaaccaa ttttttcctt tttgtgtgtc c 18891 <210> 7 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 7 tctctccna 9

Claims (138)

  1. 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물로서, 에볼라 바이러스 항원 코딩 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 70% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  2. 재조합 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 재조합 핵산 벡터가 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하고; 인간에게 투여 시, 조성물이 상기 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있으며, 면역 반응은 세포 매개성 면역을 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E2b 유전자 영역에 결실을 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원이 25개 이하의 아미노산의 변형을 포함하는 것인 조성물.
  6. 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 서열을 포함하는 E2b 유전자 영역에 결실을 가진 재조합 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함하는 조성물로서, 에볼라 바이러스 항원이 25개 이하의 아미노산의 변형을 포함하는 것인 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원이 20개, 15개, 10개, 5개 또는 그 미만의 아미노산의 변형을 포함하는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원이 2개, 3개 또는 4개의 아미노산의 변형을 포함하는 것인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원이 1개의 아미노산의 변형을 포함하는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E1 유전자 영역에 결실을 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E3 유전자 영역에 결실을 포함하는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E4 유전자 영역에 결실을 포함하는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 에볼라 바이러스가 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV, RESTV 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 100%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산 벡터가, 형질감염된 세포에서 에볼라 바이러스 항원의 과발현을 일으킬 수 있는 것인 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산 벡터가 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대하여, 기준(basal)보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배 또는 25배 높은 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 것인 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200을 초과하는 역(inverse) Ad5 중화 항체 역가를 갖는 것인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 인간이 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 또는 4767을 초과하는 역 Ad5 중화 항체 역가를 갖는 것인 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정되는 것인 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 중화 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정되는 것인 조성물.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 세포 매개성 면역(CMI)으로서 측정되는 것인 조성물.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IFN-γ 분비로서 측정되는 것인 조성물.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IL-2 분비로서 측정되는 것인 조성물.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응이 ELISpot 검정법에 의해 측정되는 것인 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원 특이적인 CMI가 106개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 당 25개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개를 초과하는 IFN-γ 스폿 형성 세포(SFC)인 조성물.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 감염 세포주 유래의 또는 자가 에볼라 감염 세포 유래의 동종이계 에볼라 바이러스 항원 발현 세포, CAP-1 펄스 항원 제시 세포의 T 세포 용해에 의해 측정되는 것인 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 성분을 추가로 포함하는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 면역원성 성분이 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 것인 조성물.
  34. 제32항에 있어서, 면역원성 성분이 IL-7, IL-7을 코딩하는 핵산, IL-7에 대해 실질적인 동일성을 가진 단백질, 및 IL-7에 대해 실질적인 동일성을 가진 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  35. 0.8 mL 내지 1.2 mL 범위의 부피의 치료 용액으로 이루어진 조성물을 포함하는 바이알(vial)로서, 치료 용액이 2.5x1011개 내지 7.5x1011개의 바이러스 입자를 포함하고; 바이러스 입자가 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함 아데노바이러스를 포함하는 것인 바이알.
  36. 제35항에 있어서, 재조합 핵산 벡터가, 형질감염된 세포에서 에볼라 바이러스 항원의 과발현을 일으킬 수 있는 것인 바이알.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 형질감염된 세포가 E.C7 세포인 바이알.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함하는 것인 바이알.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스가, 인간에서 에볼라 바이러스 항원 발현 세포에 대해 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 바이알.
  40. 제39항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정되는 것인 바이알.
  41. 제39항에 있어서, 면역 반응이 중화 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정되는 것인 바이알.
  42. 제39항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 세포 매개성 면역(CMI)으로서 측정되는 것인 바이알.
  43. 제39항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IFN-γ 분비로서 측정되는 것인 바이알.
  44. 제39항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IL-2 분비로서 측정되는 것인 바이알.
  45. 제39항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응이 ELISpot 검정법에 의해 측정되는 것인 바이알.
  46. 제45항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원 특이적인 CMI가 106개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 당 25개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개를 초과하는 IFN-γ 스폿 형성 세포(SFC)인 바이알.
  47. 제39항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 감염 세포주 유래의 또는 자가 에볼라 감염 세포 유래의 동종이계 에볼라 바이러스 항원 발현 세포, CAP-1 펄스 항원 제시 세포의 T 세포 용해에 의해 측정되는 것인 바이알.
  48. 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 용액이 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 적어도 1.0x1011개, 1.5x1011개, 2.0x1011개, 2.5x1011개, 3.0x1011개, 3.5x1011개, 4.0x1011개, 4.5x1011개, 4.8x1011개, 4.9x1011개, 4.95x1011개 또는 4.99x1011개 포함하는 것인 바이알.
  49. 제35항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 용액이 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 최대 7.0x1011개, 6.5x1011개, 6.0x1011개, 5.5x1011개, 5.2x1011개, 5.1x1011개, 5.05x1011개 또는 5.01x1011개 포함하는 것인 바이알.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 치료 용액이 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 1.0x1011개 내지 7.0x1011개 포함하는 것인 바이알.
  51. 제48항 또는 제49항에 있어서, 치료 용액이 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 4.5x1011개 내지 5.5x1011개 포함하는 것인 바이알.
  52. 제48항 또는 제49항에 있어서, 치료 용액이 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 4.8x1011개 내지 5.2x1011개 포함하는 것인 바이알.
  53. 제48항 또는 제49항에 있어서, 치료 용액이 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 4.9x1011개 내지 5.1x1011개 포함하는 것인 바이알.
  54. 제48항 또는 제49항에 있어서, 치료 용액이 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 4.95x1011개 내지 5.05x1011개 포함하는 것인 바이알.
  55. 제48항 또는 제49항에 있어서, 치료 용액이 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 4.99x1011개 내지 5.01x1011개 포함하는 것인 바이알.
  56. 제35항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 성분을 추가로 포함하는 바이알.
  57. 제56항에 있어서, 면역원성 성분이 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 것인 바이알.
  58. 제56항에 있어서, 면역원성 성분이 IL-7, IL-7을 코딩하는 핵산, IL-7에 대해 실질적인 동일성을 가진 단백질, 및 IL-7에 대해 실질적인 동일성을 가진 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 바이알.
  59. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간에서 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법.
  60. 제35항 내지 제58항 중 어느 한 항의 바이알의 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간에서 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 투여 단계가 적어도 1회 반복되는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 투여 단계가 이전의 투여 단계 이후 약 3주 후에 반복되는 것인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 투여 단계가 이전의 투여 단계 이후 약 3개월 후에 반복되는 것인 방법.
  64. 제61항에 있어서, 투여 단계가 2회 반복되는 것인 방법.
  65. (a) 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 제1 치료기; 및
    (b) 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 후속의 제2 치료기
    를 포함하는, 인간에서 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법.
  66. 치료 방법으로서,
    (a) 제1 치료기 및 제2 치료기를 선택하는 단계;
    (b) 제1 치료기 동안, 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 총 n회 투여하는 단계; 및
    (c) 제2 치료기 동안, 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간에게 총 m회 투여하는 단계
    를 포함하는 치료 방법.
  67. 제66항에 있어서, n이 1보다 큰 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, n이 3인 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, m이 1보다 큰 것인 방법.
  70. 제69항에 있어서, m이 3인 방법.
  71. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 치료기가 적어도 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주인 방법.
  72. 제65항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료기가 적어도 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월 또는 8개월인 방법.
  73. 제65항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료기는, 제1 치료기가 종료한 후 3주 내지 16주째에 시작하는 것인 방법.
  74. 제65항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여가 적어도 18일의 간격을 두는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 제1 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여가 약 21일의 간격을 두는 것인 방법.
  76. 제74항에 있어서, 제1 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여가 최대 24일의 간격을 두는 것인 방법.
  77. 제65항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여가 적어도 10주의 간격을 두는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 제2 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여가 약 13주의 간격을 두는 것인 방법.
  79. 제77항에 있어서, 제2 치료기에서, 복제 결함 아데노바이러스의 2회 투여가 최대 16주의 간격을 두는 것인 방법.
  80. 치료 방법으로서,
    (a) 제1 치료기 및 제2 치료기를 선택하는 단계;
    (b) 제1 치료기 동안, 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 총 3회, 약 3주 간격으로 투여하는 단계; 및
    (c) 제2 치료기 동안, 인간에서 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 에볼라 바이러스 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 상기 인간에게 총 3회, 약 3개월 간격으로 투여하는 단계
    를 포함하고, 제2 치료기는 제1 치료기의 종료 후 약 3개월째에 시작하는 것인 치료 방법.
  81. 제59항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원이 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원과 동일한 것인 방법.
  82. 제65항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원이 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원과 상이한 것인 방법.
  83. 제65항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터 및 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 동일한 것인 방법.
  84. 제65항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함하는 것인 방법.
  85. 제65항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함하는 것인 방법.
  86. 제65항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 60% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  87. 제65항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 60% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  88. 제65항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원이 25개 이하의 아미노산의 변형을 포함하는 것인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원이 20개, 15개, 10개, 또는 5개 또는 그 미만의 아미노산의 변형을 포함하는 것인 방법.
  90. 제88항에 있어서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에볼라 바이러스 항원이 1개의 아미노산의 변형을 포함하는 것인 방법.
  91. 제65항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E2b 유전자 영역에 결실을 포함하는 것인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E1 유전자 영역에 결실을 추가로 포함하는 것인 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E3 유전자 영역에 결실을 추가로 포함하는 것인 방법.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E4 유전자 영역에 결실을 추가로 포함하는 것인 방법.
  95. 제65항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E2b 유전자 영역에 결실을 포함하는 것인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E1 유전자 영역에 결실을 추가로 포함하는 것인 방법.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E3 유전자 영역에 결실을 추가로 포함하는 것인 방법.
  98. 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터가 E4 유전자 영역에 결실을 추가로 포함하는 것인 방법.
  99. 제65항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다가, 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 적어도 1.0x1011개, 1.5x1011개, 2.0x1011개, 2.5x1011개, 3.0x1011개, 3.5x1011개, 4.0x1011개, 4.5x1011개, 4.8x1011개, 4.9x1011개, 4.95x1011개 또는 4.99x1011개 포함하는 것인 방법.
  100. 제65항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다가 최대 7.0x1011개, 6.5x1011개, 6.0x1011개, 5.5x1011개, 5.2x1011개, 5.1x1011개, 5.05x1011개 또는 5.01x1011개의 바이러스 입자를 포함하는 것인 방법.
  101. 제99항 또는 제100항에 있어서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다가 1.0x1011개 내지 7.0x1011개의 바이러스 입자를 포함하는 것인 방법.
  102. 제99항 또는 제100항에 있어서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다가 4.5x1011개 내지 5.5x1011개의 바이러스 입자를 포함하는 것인 방법.
  103. 제99항 또는 제100항에 있어서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다가 4.8x1011개 내지 5.2x1011개의 바이러스 입자를 포함하는 것인 방법.
  104. 제99항 또는 제100항에 있어서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다가 4.9x1011개 내지 5.1x1011개의 바이러스 입자를 포함하는 것인 방법.
  105. 제99항 또는 제100항에 있어서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다가 4.95x1011개 내지 5.05x1011개의 바이러스 입자를 포함하는 것인 방법.
  106. 제99항 또는 제100항에 있어서, 제1 조성물, 제2 조성물 또는 둘 다가 4.99x1011개 내지 5.01x1011개의 바이러스 입자를 포함하는 것인 방법.
  107. 제59항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응이 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배 또는 25배 증가하는 것인 방법.
  108. 제59항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정되는 것인 방법.
  109. 제59항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 중화 에볼라 바이러스 항원 특이적인 항체 반응으로서 측정되는 것인 방법.
  110. 제59항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 세포 매개성 면역(CMI)으로서 측정되는 것인 방법.
  111. 제59항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IFN-γ 분비로서 측정되는 것인 방법.
  112. 제59항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 바이러스 항원 특이적인 IL-2 분비로서 측정되는 것인 방법.
  113. 제59항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원에 대한 면역 반응이 ELISpot 검정법에 의해 측정되는 것인 방법.
  114. 제113항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원 특이적인 CMI가 106개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 당 25개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개를 초과하는 IFN-γ 스폿 형성 세포(SFC)인 방법.
  115. 제59항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 에볼라 감염 세포주 유래의 또는 자가 에볼라 감염 세포 유래의 동종이계 에볼라 바이러스 항원 발현 세포, CAP-1 펄스 항원 제시 세포의 T 세포 용해에 의해 측정되는 것인 방법.
  116. 제59항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스가 인간에서 수지상 세포를 감염시키고, 감염된 수지상 세포가 에볼라 바이러스 항원을 제시하고, 이에 의해 면역 반응을 유도하는 것인 방법.
  117. 제59항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 피하 투여를 포함하는 것인 방법.
  118. 제59항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 투여 단계 전에 50, 75, 100, 125, 150, 160, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300을 초과하는 역 Ad5 중화 항체 역가를 보유하는 것인 방법.
  119. 제59항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 또는 4767을 초과하는 역 Ad5 중화 항체 역가를 갖는 것인 방법.
  120. 제59항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 스테로이드, 코르티코스테로이드, 면역억제제 및 면역요법 중 임의의 하나에 의한 치료를 동시에 받고 있지 않는 것인 방법.
  121. 제59항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 투여 단계 전에, 스테로이드, 코르티코스테로이드, 면역억제제 및 면역요법 중 임의의 하나에 의한 치료를 받은 적이 없는 것인 방법.
  122. 제59항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 자가면역 질환을 갖고 있지 않는 것인 방법.
  123. 제59항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 염증성 장질환, 전신 홍반성 루푸스, 강직성 척추염, 경피증, 다발성 경화증, 바이러스 간염 또는 HIV를 갖고 있지 않는 것인 방법.
  124. 제59항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 자가면역과 관련된 갑상선 질환 또는 백반증을 갖고 있는 것인 방법.
  125. 제59항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포를 갖고 있는 것인 방법.
  126. 제59항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 에볼라 바이러스 항원을 발현하는 세포를 갖고 있지 않는 것인 방법.
  127. 제59항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 에볼라 바이러스 감염의 적어도 1개, 2개 또는 3개의 증상을 갖고 있는 것인 방법.
  128. 제59항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 투여 전에 치료를 받은 적이 있는 것인 방법.
  129. 제65항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 치료기 이전에, 인간이 경구 또는 정맥내 유체를 이용한 재수화, 혈액 제제, 면역 치료제, 발열, 피로, 근육통, 두통 및 인후통, 구토, 설사, 발진, 신장 및 간 기능 장애, 및 내출혈 및 외출혈과 같은 특정의 증상에 대한 약물 또는 치료제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 약물치료를 제공받은 적이 있는 것인 방법.
  130. 제59항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 화학요법 또는 방사선요법 치료를 동시에 받는 것인 방법.
  131. 제59항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 플루오로피리미딘, 이리노테칸, 옥살리플라틴, 베바시주맙, 카페시타빈, 미토마이신, 레고라페닙, 세툭시맙, 파니투무맙 및 아세트아미노펜으로 이루어진 군의 적어도 하나의 약물의 투여를 포함하는 요법을 동시에 받는 것인 방법.
  132. 제59항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포를 포함하는 것인 방법.
  133. 제132항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포가 비감염 세포에서의 에볼라 바이러스 항원의 기준선(baseline) 발현보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배 또는 20배 더 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 것인 방법.
  134. 제132항 또는 제133항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포가 에볼라 감염 세포를 포함하는 것인 방법.
  135. 제132항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포가 면역 세포를 포함하는 것인 방법.
  136. 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포가 혈구를 포함하는 것인 방법.
  137. 제132항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원을 과발현하는 세포가 상피 세포를 포함하는 것인 방법.
  138. 제59항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 에볼라 바이러스 항원이 EBOV, SUDV, TAFV, BDBV, RESTV 또는 이들의 임의의 조합에서 유래한 항원인 방법.
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