KR20190034160A - Her2/neu 가 관련되는 종양 백신화 및 면역요법을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Her2/neu 가 관련되는 종양 백신화 및 면역요법을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20190034160A
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프랭크 알 존스
조셉 벨린트
웨인 갓프레이
엘리자베스 가비치
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이투빅스 코포레이션
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Abstract

특정 구현예에서, 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프에 대항하는 면역 반응을 발생시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 아데노바이러스에 대한 기존의 면역성을 가진 개체에서 백신화를 허용하는 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 아데노바이러스-기반 벡터 백신의 구축 및 제조 방법이 제공될 수 있다.

Description

HER2/NEU 가 관련되는 종양 백신화 및 면역요법을 위한 조성물 및 방법
본 출원은 그 전체가 참고로서 본원에 인용된, 2016 년 7 월 12 일에 출원된 미국 가특허출원 제 62/361,292 호, 및 2016 년 6 월 3 일에 출원된 미국 가특허출원 제 62/345,575 호의 혜택을 주장한다.
정부 지원
본 발명은 미국 국립 암센터 (National Cancer Institute (NCI)) 에서 승인된 SBIR Grant No. 1R43CA139663-01, SBIR Contract No. HHSN261201100090C, SBIR Contract No. HHSN261201300066C, 및 Award W81XWH-12-1-0574; 미국 국방부 (Department of Defense) 로부터 BC113107 하에 미국 정부 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에서 특정한 권리를 갖는다.
백신은 신체가 유해한 성분 및 질병에 걸린 세포를 인지하고 파괴하도록 면역계를 훈련시킴으로써 질환과 싸우는 것을 돕는다. 백신은 크게 2 가지 유형, 예방 및 치료 백신으로 나뉠 수 있다. 예방 백신은 건강한 사람들에게 특정 질환의 발달을 예방하도록 제공되는 반면, 또한 면역요법으로도 불리는 치료 백신은 질환이 있는 것으로 진단된 사람에게 질환이 성장하고 번지는 것을 중단시키는 것을 돕거나 예방책으로서 제공된다.
바이러스 백신은 현재 감염성 질환 및 암과 싸우는 것을 돕도록 개발되고 있다. 이들 바이러스 백신은 숙주의 세포 내에서 질환과 연관된 유전자의 적은 부분의 발현을 유도함으로써 작동하고, 이것은 차례로, 숙주의 면역계가 질환에 걸린 세포를 확인하고 파괴하도록 향상시킨다. 이와 같이, 바이러스 백신의 임상적 반응은 고-레벨 면역원성을 수득하고 장기간 발현을 유지하도록 하는 백신의 능력에 따라 다를 수 있다.
그러므로, 암과 같은 복합 질환에 대한 향상된 치료 반응을 위한 신규한 조성물 및 방법을 발견하기 위한 필요성이 남아있다.
다양한 양상에서, 본 발명은 고유의 HER2/neu 단백질의 단편인 HER2/neu 항원을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제-결함성 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양상에서, HER2/neu 항원은 고유의 HER2/neu 단백질의 세포내 도메인을 갖지 않는다. 일부 양상에서, HER2/neu 항원은 고유의 HER2/neu 단백질의 막통과 도메인 및 세포외 도메인을 갖는다. 일부 양상에서, HER2/neu 항원은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 갖고, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 1033-3107 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 갖고/갖거나, 복제-결함성 바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 갖는다.
일부 양상에서, 복제-결함성 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역, E2b 영역, E3 영역, E4 영역, 또는 이의 조합 내에 결실을 포함한다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역 내에 결실을 포함한다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역, E2b 영역, 및 E3 영역 내에 결실을 포함한다.
일부 양상에서, 조성물은 적어도 1x109 내지 적어도 5x1012 바이러스 입자를 포함한다. 일부 양상에서, 조성물은 적어도 5x109 바이러스 입자를 포함한다. 일부 양상에서, 조성물은 적어도 5x1010 바이러스 입자를 포함한다. 일부 양상에서, 조성물은 적어도 5x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 양상에서, 조성물은 적어도 5x1012 바이러스 입자를 포함한다.
일부 양상에서, 복제-결함성 바이러스 벡터는 동시자극적 분자를 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함성 바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 추가 양상에서, 동시자극적 분자는 B7, ICAM-1, LFA-3, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, 동시자극적 분자는 B7, ICAM-1, 및 LFA-3 의 조합을 포함한다.
일부 양상에서, 조성물은 동일한 복제-결함성 바이러스 벡터 내에 위치한 다수의 동시자극적 분자를 엔코딩하는 다수의 핵산 서열을 추가로 포함한다.
일부 양상에서, 조성물은 별도의 복제-결함성 바이러스 벡터 내에 위치한 다수의 동시자극적 분자를 엔코딩하는 다수의 핵산 서열을 추가로 포함한다.
일부 양상에서, 조성물은 하나 이상의 표적 항원 또는 이의 면역학적 에피토프를 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함성 바이러스 벡터는 하나 이상의 표적 항원 또는 이의 면역학적 에피토프를 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 하나 이상의 표적 항원은 종양 네오-항원, 종양 네오-에피토프, 종양-특이적 항원, 종양-연관 항원, 조직-특이적 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원, 효모 항원, 진균 항원, 원생동물 항원, 기생생물 항원, 미토겐, 또는 이의 조합이다. 일부 양상에서, 하나 이상의 표적 항원은 폴레이트 수용체 알파, WT1, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, HER2/neu, BRCA1, BRACHYURY, BRACHYURY(TIVS7-2, 다형성), BRACHYURY (IVS7 T/C 다형성), T BRACHYURY, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1-c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, WT1, AFP, β-카테닌/m, 캐스파아제-8/m, CEA, CDK-4/m, HER3, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, 또는 TEL/AML1, 또는 개질된 변이체, 스플라이스 변이체, 기능적 에피토프, 에피토프 작동제, 또는 이의 조합이다. 일부 양상에서, 하나 이상의 표적 항원은 CEA, Brachyury, MUC1, MUC1-c, 또는 이의 조합이다. 일부 양상에서, 하나 이상의 표적 항원은 CEA 이다.
일부 양상에서, 하나 이상의 표적 항원은 Brachyury 이다.
일부 양상에서, 하나 이상의 표적 항원은 MUC1 또는 MUC1-c 이다.
일부 양상에서, 하나 이상의 표적 항원은 HER3 이다.
일부 양상에서, CEA 는 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, 또는 SEQ ID NO: 29 의 위치 1057-3165 와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 포함한다. 일부 양상에서, MUC1-c 는 SEQ ID NO: 32 또는 SEQ ID NO: 33 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, Brachyury 는 SEQ ID NO: 34 와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, HER3 은 SEQ ID NO: 27 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 복제-결함성 바이러스 벡터는 선별가능 마커를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 선별가능 마커는 lacZ 유전자, 티미딘 키나아제, gpt, GUS, 또는 백시니아 K1L 숙주 범위 유전자, 또는 이의 조합이다.
다양한 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다양한 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 조성물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
다양한 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 약학 조성물의 제조를 포함하는, 종양 백신의 제조 방법을 제공한다.
다양한 양상에서, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서의 면역 반응의 향상 방법을 제공한다.
다양한 양상에서, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서의 암의 치료 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 방법은 약학 조성물을 대상에게 재투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 양상에서, 방법은 면역 체크포인트 억제제를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD1, PDL1, PDL2, CD28, CD80, CD86, CTLA4, B7RP1, ICOS, B7RPI, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TCR, LAG3, CD137, CD137L, OX40, OX40L, CD27, CD70, CD40, CD40L, TIM3, GAL9, ADORA, CD276, VTCN1, IDO1, KIR3DL1, HAVCR2, VISTA, 또는 CD244 를 억제한다. 일부 양상에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD1 또는 PDL1 을 억제한다. 일부 양상에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD1 또는 항-PDL1 항체이다. 일부 양상에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PDL1 항체이다.
일부 양상에서, 투여는 정맥내, 피하, 림프내, 종양내, 피부내, 근육내, 복강내, 직장내, 질내, 비강내, 경구, 방광 점적주입을 통해, 또는 방혈 (scarification) 을 통한 것이다.
일부 양상에서, 향상된 면역 반응은 세포-매개성 또는 체액성 반응이다. 일부 양상에서, 향상된 면역 반응은 B-세포 증식, CD4+ T 세포 증식, CD8+ T 세포 증식, 또는 이의 조합의 향상이다. 일부 양상에서, 향상된 면역 반응은 IL-2 생산, IFN-γ 생산 또는 이의 조합의 향상이다. 일부 양상에서, 향상된 면역 반응은 항원 제시 세포 증식, 기능 또는 이의 조합의 향상이다.
일부 양상에서, 대상은 아데노바이러스 벡터를 이전에 투여받았다. 일부 양상에서, 대상은 아데노바이러스 벡터에 대해 기존의 면역성을 갖는다. 일부 양상에서, 대상은 아데노바이러스 벡터에 대해 기존의 면역성을 갖는다고 결정된다.
일부 양상에서, 방법은 대상에게 화학요법, 방사선, 상이한 면역요법, 또는 이의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 양상에서, 대상은 인간 또는 비-인간 동물이다.
일부 양상에서, 대상은 암에 대해 이전에 치료받았다.
일부 양상에서, 치료적으로 유효한 양의 투여는 적어도 3 회 반복된다. 일부 양상에서, 치료적으로 유효한 양의 투여는 적어도 1x109 내지 적어도 5x1012 바이러스 입자를 포함한다. 일부 양상에서, 치료적으로 유효한 양의 투여는 투여량 당 5x109 바이러스 입자를 포함한다. 일부 양상에서, 치료적으로 유효한 양의 투여는 투여량 당 적어도 5x1010 바이러스 입자를 포함한다. 일부 양상에서, 치료적으로 유효한 양의 투여는 투여량 당 적어도 5x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 양상에서, 치료적으로 유효한 양의 투여는 투여량 당 적어도 5x1012 바이러스 입자를 포함한다. 일부 양상에서, 치료적으로 유효한 양의 투여는 매 2 또는 3 주 반복된다.
일부 양상에서, 치료적으로 유효한 양의 투여에는 동일한 조성물 또는 약학 조성물을 포함하는 하나 이상의 부스트 면역화가 뒤따른다. 일부 양상에서, 부스트 면역화는 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 또는 그 이상 투여된다. 일부 양상에서, 부스트 면역화는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 회 또는 그 이상 반복된다. 일부 양상에서, 치료적으로 유효한 양의 투여는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 회 또는 그 이상 동안 매 1, 2, 또는 3 주 반복된 일차 면역화 이후, 3 회 이상 동안 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 또는 그 이상 반복된 부스트 면역화이다.
일부 양상에서, 방법은 대상에게 조작된 자연 살해 (NK) 세포의 집단을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 조작된 NK 세포는 KIR (살해 억제 수용체) 의 발현이 본질적으로 결여되도록 개질된 하나 이상의 NK 세포, 고 친화성 CD16 변이체를 발현하도록 개질된 하나 이상의 NK 세포, 및 하나 이상의 CAR (키메라성 항원 수용체) 을 발현하도록 개질된 하나 이상의 NK 세포, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, 조작된 NK 세포는 발현 KIR 이 본질적으로 결여되도록 개질된 하나 이상의 NK 세포를 포함한다. 일부 양상에서, 조작된 NK 세포는 고 친화성 CD16 변이체를 발현하도록 개질된 하나 이상의 NK 세포를 포함한다. 일부 양상에서, 조작된 NK 세포는 하나 이상의 CAR 을 발현하도록 개질된 하나 이상의 NK 세포를 포함한다. 추가 양상에서, CAR 은 종양 네오-항원, 종양 네오-에피토프, WT1, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, DAM-10, 폴레이트 수용체 알파, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-8, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, HER2/neu, HER3, BRCA1, Brachyury, Brachyury (TIVS7-2, 다형성), Brachyury (IVS7 T/C 다형성), T Brachyury, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, AFP, β-카테닌/m, 캐스파아제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPl/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, TEL/AML1, 또는 이의 임의의 조합에 대한 CAR 이다.
일부 양상에서, 복제-결함성 아데노바이러스 벡터는 세포 내에 포함된다. 일부 양상에서, 세포는 수지상 세포 (DC) 이다.
일부 양상에서, 방법은 치료적으로 유효한 양의 IL-15 또는 IL-15 를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제-결함성 벡터를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 양상에서, 대상은 HER2/neu-발현 암을 갖는다. 일부 양상에서, 대상은 HER2/neu 발현 유방암을 갖는다. 일부 양상에서, 대상은 HER2/neu 발현 뼈암을 갖는다. 일부 양상에서, 암은 골육종이다. 일부 양상에서, 대상은 HER2/neu 발현 위암을 갖는다. 일부 양상에서, 대상은 절제불가능한, 국부 진행성 또는 전이성 암을 갖는다. 일부 양상에서, 방법은 부가적인 암 요법을 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정한 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참고로 하여 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1 은 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 벡터, pAd5CMV/HER2/neu/Δpp 의 제한효소 맵의 예시적 구현예를 보여준다.
도 2 는 임상 연구 디자인 및 치료 섭생의 예시적 구현예를 보여준다.
상세한 설명
다양한 구현예를 제조 및 사용하는 것이 하기에 상세히 논의되는 반면, 본원에 제공되는 많은 적용가능한 본 발명의 개념이 광범위한 구체적인 문맥에 포함될 수 있다는 것이 인정되어야만 한다. 본원에 논의되는 특정 구현예는 본 발명을 제조 및 사용하기 위한 특정 방식의 예시일 뿐, 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다.
특정 양상의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어가 하기에 정의된다. 본원에 정의된 용어는 본 출원과 관련된 영역에서 당업자에 의해 통상 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다.
용어, 예컨대 관사는 오직 단수형 실체를 말하기 위해 의도되었으나, 예시를 위해 사용될 수 있는 특정 예의 일반적인 계열을 포함한다. 본원의 용어는 본 발명의 특정 구현예를 기술하기 위해 사용되나, 이들의 사용은 청구항에 개략화된 것을 제외하고는, 본 발명을 제한하지 않는다.
"개인" "대상" 또는 "환자" 는 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 개, 또는 돼지를 포함하나 이에 제한되지 않는, 요법이 요구되는 임의의 단일 대상을 의미한다. 또한 대상으로서 포함되는 것으로 의도되는 것은 질환의 임의의 임상적 징후를 보이지 않는 임상 연구 시험에 수반되는 임의의 대상, 또는 역학 연구에 수반되는 대상, 또는 대조군으로서 사용되는 대상이다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "유전자" 는 기능적 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드-엔코딩 단위를 말한다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 이들 기능적 용어는 사람의 손으로 변경될 수 있는 것들을 포함하여, 게놈 서열, cDNA 서열, 또는 이의 단편 또는 조합 뿐 아니라, 유전자 생성물을 포함한다. 정제된 유전자, 핵산, 단백질 등은 그것이 본래 연관되는 적어도 하나의 오염 핵산 또는 단백질로부터 확인 및 분리되는 경우 이들 실체를 말하기 위해 사용된다. 용어 "대립유전자" 또는 "대립 형태" 는 동일한 기능적 단백질을 엔코딩하나 또다른 버전의 동일한 유전자와 관련되어 뉴클레오티드 서열에 차이를 함유하는 유전자의 대안적인 버전을 말한다. 특정 양상에서, 용어 "유전자" 는 유전자 및 이의 모든 현재 알려진 변이체 및 설명될 수 있는 임의의 추가의 변이체를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은, "핵산" 또는 "핵산 분자" 는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오티드, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 발생되는 단편, 및 임의의 라이게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용에 의해 발생되는 단편을 말한다. 핵산 분자는 자연-발생적 뉴클레오티드 (예컨대, DNA 및 RNA) 인 단량체, 또는 자연-발생적 뉴클레오티드의 유사체 (예를 들어, 자연-발생적 뉴클레오티드의 α-거울상이성질 형태), 또는 둘의 조합으로 구성될 수 있다. 개질된 뉴클레오티드는 당 잔기 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 잔기 중에 변경을 가질 수 있다. 당 개질은 예를 들어, 하나 이상의 히드록실 기의 할로겐, 알킬 기, 아민, 및 아지도 기로의 대체를 포함하거나, 또는 당은 에테르 또는 에스테르로서 작용화될 수 있다. 게다가, 전체 당 잔기는 입체적으로 그리고 전자적으로 유사한 구조, 예컨대 아자-당 및 카르보사이클 당 유사체로 대체될 수 있다. 염기 잔기 중의 개질의 예는 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 기타 잘 알려진 헤테로시클릭 치환을 포함한다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트, 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자" 는 또한 폴리아미드 백본에 부착된 자연-발생적 또는 개질된 핵산 염기를 포함하는 소위 "펩티드 핵산" 을 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, 다르게 표시되지 않는다면, 관사 "a" 는 다르게 정확하게 제공되지 않는다면 하나 이상을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 다르게 표시되지 않는다면, "함유하다," "~ 를 함유하는," "포함하다," "~ 를 포함하는," 등과 같은 용어는 "~ 을 포함하는" 을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 다르게 표시되지 않는다면, 용어 "또는" 은 연결형 또는 분리형일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, 다르게 표시되지 않는다면, 임의의 구현예는 임의의 다른 구현예와 조합될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, 다르게 표시되지 않는다면, 본원의 일부 본 발명의 구현예는 수치 범위를 포함한다. 다양한 양상은 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식으로의 설명은 단지 편의 및 간결을 위한 것임을 이해해야만 하고, 본 발명의 범주에 대한 엄격한 제한으로서 해석되어서는 안된다. 따라서, 범위의 설명은 가능한 하위범위 뿐 아니라 명쾌하게 적힌 바와 같이 그 범위 내의 개별적인 수치 값이 모두 구체적으로 기재되는 것으로 고려되어야만 한다. 예를 들어, 1 내지 6 과 같은 범위의 설명은 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등 뿐 아니라, 상기 범위 내의 개별적인 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6 을 구체적으로 기재하는 것으로 고려되어야만 한다. 이것은 범위의 폭과 관계없이 적용된다. 범위가 제시될 때, 이 범위는 범위 종결점을 포함한다.
용어 "아데노바이러스" 또는 "Ad" 는 아데노비리다에 (Adenoviridae) 과로부터의 비-외피 DNA 바이러스의 그룹을 말한다. 인간 숙주 외에, 이들 바이러스는 제한 없이, 조류, 소, 돼지 및 개 종에서 발견될 수 있다. 특정 영역은 E2b 결실된 바이러스 벡터, 또는 본원에 기재된 기타 결실을 함유하는 벡터의 기반으로서 아데노비리다에 (Adenoviridae) 과의 4 가지 속 (예를 들어, 아비아데노바이러스, 마스트아데노바이러스, 아트아데노바이러스 및 시아데노바이러스) 중 임의의 것으로부터의 임의의 아데노바이러스의 용도를 고려할 수 있다. 부가적으로, 각 종에서 여러 개의 혈청형이 발견된다. Ad 는 또한, 제한 없이, 상동 또는 이종 DNA 서열의 유전적 돌연변이, 결실 또는 전위를 포함하는, 이들 바이러스 혈청형 중 임의의 것의 유전적 유도체에 관한 것이다.
"헬퍼 아데노바이러스" 또는 "헬퍼 바이러스" 는 특정 숙주 세포가 할 수 없는 (숙주는 Ad 유전자 생성물, 예컨대 E1 단백질을 제공할 수 있음) 바이러스 기능을 공급할 수 있는 Ad 를 말한다. 상기 바이러스는 두번째 바이러스, 또는 헬퍼 의존성 바이러스 (예를 들어, 거트 (gutted) 또는 거트리스 (gutless) 바이러스, 또는 특정 영역, 예컨대 E2b 또는 본원에 기재된 다른 영역이 결실된 바이러스) 에서 결여된 기능 (예를 들어, 단백질) 을 공급하는데 사용되고; 첫번째 복제-무능 바이러스는 두번째, 헬퍼 의존성 바이러스를 "도와", 세포에서 두번째 바이러스 게놈의 생산을 허용하는 것으로 언급된다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "아데노바이러스5 null (Ad5null)" 는 발현을 위해 임의의 이종 핵산 서열을 함유하지 않는 비-복제 Ad 를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "제 1 세대 아데노바이러스" 는 초기 영역 1 (E1) 이 결실된 Ad 를 말한다. 부가적인 경우에서, 비필수 초기 영역 3 (E3) 이 또한 결실될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "거트 (gutted)" 또는 "거트리스 (gutless)" 는 모든 바이러스 코딩 영역이 결실된 아데노바이러스 벡터를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "트랜스펙션" 은 외래 핵산의 진핵 세포 내로의 도입을 말한다. 트랜스펙션은 칼슘 포스페이트-DNA 공-침전, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 폴리브렌-매개 트랜스펙션, 전기천공, 마이크로주사, 리포좀 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염, 및 바이오리스틱스 (biolistics) 를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
용어 "안정한 트랜스펙션" 또는 "안정하게 트랜스펙션된" 은 외래 핵산, DNA 또는 RNA 의, 트랜스펙션된 세포의 게놈 내로의 도입 및 통합을 말한다. 용어 "안정한 트랜스펙션체" 는 게놈 DNA 내로 안정하게 통합된 외래 DNA 를 갖는 세포를 말한다.
용어 "리포터 유전자" 는 리포터 분자 (효소 포함) 를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. "리포터 분자" 는 제한 없이, 효소-기반 검출 어세이 (예를 들어, ELISA 뿐 아니라, 효소-기반 조직화학 어세이), 형광, 방사능, 및 발광 시스템을 포함하는, 다양한 검출 시스템 중 임의의 것에서 검출가능하다.
하나의 구현예에서, 리포터 유전자로서의 E. coli β-갈락토시다아제 유전자 (Pharmacia Biotech, Pistacataway, N.J. 에서 이용가능함), 녹색 형광 단백질 (GFP) (Clontech, Palo Alto, Calif. 에서 시판 이용가능함), 인간 태반 알칼리 포스파타아제 유전자, 클로르암페니콜 아세틸트랜스페라아제 (CAT) 유전자가 제공될 수 있고; 기타 리포터 유전자가 당업계에 공지되고 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "핵산 분자 엔코딩," "DNA 서열 엔코딩," 및 "DNA 엔코딩" 은 데옥시리보핵산의 가닥을 따른 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 말한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 (단백질) 사슬을 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 핵산 서열은 따라서 아미노산 서열을 코딩한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "이종 핵산 서열" 은 자연에서 라이게이션되지 않는, 또는 이것이 자연에서 상이한 위치에 라이게이션되는 핵산 서열에, 라이게이션되는, 또는 라이게이션되도록 조작되는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 이종 핵산은 그것이 도입되는 세포 내에서 자연적으로 발견되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있거나, 이종 핵산은 자연 발생 서열에 대해 일부 개질을 함유할 수 있다.
용어 "이식유전자" 는 시험 대상의 세포 또는 게놈 내로 도입되는, 천연 또는 이종 핵산 서열 또는 융합된 상동 또는 이종 핵산 서열인, 임의의 유전자 코딩 영역을 말한다. 특정 양상에서, 이식유전자는 이식유전자를 대상의 세포에 도입하는데 사용되는 임의의 바이러스 벡터 상에 보유된다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "제 2 세대 아데노바이러스" 는 바이러스로부터 결실된 (제거된) E1, E2, E3, 및, 특정 구현예에서, E4 DNA 유전자 서열의 전부 또는 일부를 갖는 Ad 를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 핵산 서열, 유전자 또는 폴리펩티드에 적용되는 바와 같은 용어 "단편 또는 분절" 은 보통 길이가 적어도 약 5 개의 근접 핵산 염기 (핵산 서열 또는 유전자의 경우) 또는 아미노산 (폴리펩티드의 경우), 전형적으로 적어도 약 10 개의 근접 핵산 염기 또는 아미노산, 더욱 전형적으로 적어도 약 20 개의 근접 핵산 염기 또는 아미노산, 통상 적어도 약 30 개의 근접 핵산 염기 또는 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 40 개의 근접 핵산 염기 또는 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50 개의 근접 핵산 염기 또는 아미노산, 더 더욱 바람직하게는 적어도 약 60 내지 80 개 또는 그 이상의 근접 핵산 염기 또는 아미노산일 것이다. 본원에 사용되는 바와 같은, "중복 단편" 은 핵산 또는 단백질의 아미노 종결 말단에서 시작하여 핵산 또는 단백질의 카르복시 종결 말단에서 끝나는 근접 핵산 또는 펩티드 단편을 말한다. 각각의 핵산 또는 펩티드 단편은 다음 핵산 또는 펩티드 단편과 적어도 약 1 개의 근접 핵산 또는 아미노산 위치를 공통으로, 더욱 바람직하게는 적어도 약 3 개의 근접 핵산 염기 또는 아미노산 위치를 공통으로, 가장 바람직하게는 적어도 약 10 개의 근접 핵산 염기 아미노산 위치를 공통으로 갖는다.
핵산 문맥에서 중요한 "단편" 은 적어도 약 17 개의 뉴클레오티드, 일반적으로 적어도 20 개의 뉴클레오티드, 더욱 일반적으로 적어도 23 개의 뉴클레오티드, 보통 적어도 26 개의 뉴클레오티드, 더욱 보통 적어도 29 개의 뉴클레오티드, 종종 적어도 32 개의 뉴클레오티드, 더욱 종종 적어도 35 개의 뉴클레오티드, 전형적으로 적어도 38 개의 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로 적어도 41 개의 뉴클레오티드, 통상 적어도 44 개의 뉴클레오티드, 더욱 통상 적어도 47 개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 50 개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 53 개의 뉴클레오티드의 근접 분절이고, 특히 바람직한 구현예에서는 적어도 56 개 이상 뉴클레오티드의 근접 분절일 것이다.
"벡터" 는 세포를 형질도입, 트랜스펙션, 형질전환 또는 감염시켜, 세포가 세포에게 고유한 것 이외의 핵산 및/또는 단백질을, 또는 세포에게 고유하지 않은 방식으로, 발현하도록 하는 조성물이다. 세포는 핵산이 세포외 환경으로부터 세포 내에 전위되는 경우 핵산에 의해 "형질도입" 된다. 핵산의 세포 내로의 임의의 이송 방법이 사용될 수 있다; 용어는, 다르게 표시되지 않는다면, 핵산의 세포 내로의 임의의 특정 전달 방법을 시사하지 않는다. 세포는 핵산이 세포 내로 형질도입되고 안정하게 복제될 때 핵산에 의해 "형질전환" 된다. 벡터는 세포에 의해 발현되어지는 핵산 (보통 RNA 또는 DNA) 을 포함한다. 벡터는 임의로 바이러스 입자, 리포좀, 단백질 코팅 등과 같은, 핵산의 세포 내로의 유입을 달성하는데 도움을 주는 물질을 포함한다. "세포 형질도입 벡터" 는 일단 핵산이 세포 내로 형질도입되면 세포에서 안정한 복제 및 발현을 할 수 있는 핵산을 엔코딩하는 벡터이다.
용어 "변이체" 는 폴리뉴클레오티드 서열의 문맥에서 사용되는 경우, 야생형 유전자와 관련한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 정의는 또한, 예를 들어, "대립유전자," "스플라이스," "종," 또는 "다형성" 변이체를 포함할 수 있다. 스플라이스 변이체는 참조 분자에 대한 상당한 일치성을 가질 수 있으나, 일반적으로 mRNA 프로세싱 동안 엑손의 대안적인 스플라이싱으로 인해 좀더 큰 또는 좀더 적은 수의 폴리뉴클레오티드를 가질 것이다. 상응하는 폴리펩티드는 부가적인 기능적 도메인 또는 도메인의 부재를 가질 수 있다. 종 변이체는 종마다 상이한 폴리뉴클레오티드 서열이다. 본 발명에서 특히 유용한 것은 야생형 표적 유전자의 변이체이다. 변이체는 핵산 서열 내의 적어도 하나의 돌연변이로부터 산출될 수 있고, 구조 또는 기능이 변경될 수 있거나 변경될 수 없는 변형된 mRNA 또는 폴리펩티드를 산출할 수 있다. 임의의 제시된 자연적 또는 재조합 유전자는 대립 형태가 없거나, 하나, 또는 많은 대립 형태를 가질 수 있다. 변이체를 야기하는 공통의 돌연변이 변화는 일반적으로 뉴클레오티드의 자연적인 결실, 부가, 또는 치환의 결과로 간주된다. 이들 유형의 변화 각각은 단독으로, 또는 서로 조합으로, 제시된 서열에서 1 회 이상 발생할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, 폴리펩티드의 "변이체" 는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 변형된 아미노산 서열을 말한다. 변이체는 "보존적" 변화를 가질 수 있고, 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성 (예를 들어, 류신의 이소류신으로의 대체) 을 갖는다. 더욱 드물게, 변이체는 "비-보존적" 변화 (예를 들어, 글리신의 트립토판으로의 대체) 를 가질 수 있다. 유사한 사소한 변형은 또한 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 생물학적 활성을 없애지 않으면서 어떤 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는 지를 결정하는데 있어서의 지침은 당업계에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, LASERGENE 소프트웨어 (DNASTAR) 을 사용하여 발견될 수 있다.
산출되는 폴리펩티드는 일반적으로 서로에 대해 상당한 아미노산 일치성을 가질 것이다. 다형성 변이체는 제시된 종의 개체 사이에 특정 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 내의 변형이다. 다형성 변이체는 또한 폴리뉴클레오티드 서열이 하나의 염기에 의해 상이한 "단일 뉴클레오티드 다형성" (SNP) 또는 단일 염기 돌연변이를 포함할 수 있다.
"항원" 은 항체 또는 T 림프구 (T 세포) 와 특이적으로 반응하는 임의의 성분이다. "항원-결합 부위" 는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자의 일부이다. 부가적으로, 항원-결합 부위는 제한 없이, MHC 분자 또는 T 세포 수용체를 포함하는 임의의 항원-결합 분자 상의 임의의 이러한 부위를 포함한다. "항원 프로세싱" 은 항원의 단편으로의 분해 (예를 들어, 단백질의 펩티드로의 분해) 및 하나 이상의 이들 단편의 특이적 T 세포에 대한 "항원-제시 세포" 에 의한 제시를 위한 MHC 분자와의 (예를 들어, 결합을 통한) 연합을 말한다.
"수지상 세포" (DC) 는 생체 내에서 강력한 적응 면역 반응을 촉발시킬 수 있는 강한 항원-제시 세포이다. 활성화된, 성숙 DC 가 T 세포 활성화 및 증식에 필요한 신호를 제공하는 것으로 제시된다. 이들 신호는 2 가지 유형으로 분류될 수 있다. 면역 반응에 특이성을 제공하는 첫번째 유형은, APC 의 표면 상에 주 조직적합성 복합체 (상기 정의된 "MHC") 클래스 I 또는 II 단백질에 의해 제시되는 항원 펩티드와 T-세포 수용체/CD3 ("TCR/CD3") 복합체 사이의 상호작용을 통해 매개된다. 소위 공동-자극성 신호로 불리는, 두번째 유형의 신호는, 항원-특이적도 아닌 MHC-제한적인 것도 아니며, 첫번째 유형의 신호의 존재 하에 T 세포의 완전한 증식 반응 및 T 세포 효과기 작용의 유도를 도출할 수 있다. 상기 2 배 신호는 따라서, 격렬한 면역 반응을 산출할 수 있다. 상기 명시된 바와 같이, 대부분의 비-조류 척추동물에서, DC 는 골수-유래 전구체로부터 발생한다. 미성숙 DC 는 말초 혈액 및 제대 혈액에서 그리고 흉선에서 발견된다. 부가적인 미성숙 집단은 다른 곳에도 존재할 수 있다. 다양한 성숙 단계의 DC 는 또한 비장, 림프절, 편도선, 및 인간 창자에서 발견된다. 조류 DC 는 또한 조류에 독특한 일차 면역 기관인, 파브리키우스 소낭에서 발견될 수 있다. 특정 구현예에서, 수지상 세포는 포유류, 바람직하게는 인간, 마우스, 또는 래트이다.
"공동-자극성 분자" 는 T 세포의 표면 상에 T 세포 수용체에 의해 결합된 펩티드 MHC 복합체와 함께 작용하는 경우, 펩티드에 결합하는 T 세포의 활성화를 달성하는 공동-자극 효과를 제공하는 임의의 단일 분자 또는 분자의 조합을 포함한다.
"진단" 또는 "진단된" 은 병리학적 상태의 존재 또는 특성을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법은 그들의 민감성 및 특이성이 상이하다. 진단 어세이의 "민감성" 은 양성으로 시험된 질병에 걸린 개체의 백분율 ("참 양성" 의 백분율) 이다. 어세이에 의해 검출되지 않은 질병에 걸린 개체는 "가 음성" 이다. 질병에 걸리지 않고 어세이에서 음성으로 시험된 대상은 "참 음성" 으로 불린다. 진단 어세이의 "특이성" 은 1 - 가 양성 비율이고, 이때 "가 양성" 비율은 양성으로 시험된 질환이 없는 자의 비율로서 정의된다. 특정 진단 방법이 상태의 결정적인 진단을 제공하지 못할 수 있기 때문에, 방법이 진단을 돕는 긍정적인 지표를 제공한다면 충분하다.
본 출원을 통틀어, 용어 "약" 은 값이 장치에 대한 오차의 고유의 변화를 포함하는 것을 나타내기 위해 사용되며, 방법은 연구 대상 중에 존재하는 값, 또는 변화를 측정하기 위해 사용된다.
본 명세서 및 청구항(들) 에서 사용되는 바와 같이, 단어 "~ 를 포함하는" (및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "~ (들)을 포함하다"), "~ 를 갖는" (및 갖는의 임의의 형태, 예컨대 "~ (들)을 갖다"), "~ 가 포함되는" (및 포함되는의 임의의 형태, 예컨대 "~ (들)이 포함되다") 또는 "~ 를 함유하는" (및 함유하는의 임의의 형태, 예컨대 "~ (들)을 함유하다") 은 포함적이거나 개방적이고, 부가적인, 비언급된 요소 또는 방법 단계를 배재하지 않는다. 본원에 사용되는 바와 같은, 구절 "~ 로 본질적으로 이루어지는" 은 청구항의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들) 에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들에 제한하지 않는다. 본원에 사용되는 바와 같은, 구절 "~ 로 이루어지는" 은 예를 들어, 보통 요소와 연관된 불순물 또는 제한을 제외하고, 청구항에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "또는 이의 조합" 은 용어 이전에 나열된 항목의 모든 순열 및 조합을 말한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이의 조합" 은 하기 중 적어도 하나: A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC, 및 특정 문맥에서 순서가 중요한 경우, 또는 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 예로 계속하면, 표현적으로 포함되는 것은 하나 이상의 항목 또는 용어, 예컨대 BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, 등의 반복을 함유하는 조합이다. 당업자는 전형적으로 문맥상 다르게 명백하지 않는 경우, 임의의 조합으로의 항목 또는 용어의 수에 대한 제한이 없는 것으로 이해할 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은, 근사치 단어, 예컨대, 제한 없이, "약," "실질적인" 또는 "실질적으로" 는 수정된 것이 반드시 절대적이거나 완벽하지는 않지만, 해당 조건을 존재하는 것으로 지정할 수 있도록 당업자의 것에 충분히 가까운 것으로 고려될 것인 조건을 말한다. 설명이 다양할 수 있는 범위는 얼마나 큰 변화가 도입될 수 있으며, 당업자가 여전히 비수식된 특징의 특징 및 능력을 필요로 하는 수식된 특징을 여전히 인지하는지에 따라 다를 것이다. 일반적으로, 그러나 앞서 논의에 따라, 근사치 단어 예컨대 "약" 에 의해 수식된 본원의 수치 값은 언급된 값으로부터 적어도 ± 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12, 또는 15% 달라질 수 있다.
상기 기재된 다양한 구현예는 추가의 구현예를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 명세서에 언급되고/거나 출원 데이터 시트에 나열된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공개는 각각의 개별적인 공개, 특허, 또는 특허 출원이 참고에 의해 인용되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 표시되는 경우, 그 전체가 동일한 범주까지, 참조로서 본원에 인용된다.
구현예의 양상은 또다른 추가 구현예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공개의 개념을 사용하도록 필요하다면, 개질될 수 있다.
상기-상세화된 설명의 견지에서 구현예에 이들 및 다른 변화가 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구항에서, 사용되는 용어는 청구항을 명세서 및 청구항에 기재된 특정 구현예에 제한하도록 해석되어야만 하고, 이러한 청구항이 표제로 하고 있는 동등한 전체 범주에 따라 모든 가능한 구현예를 포함하도록 해석되어야만 한다. 따라서, 청구항은 설명에 의해 제한되지 않는다.
I. HER2/neu 표적 항원
특정 양상에서, 관심 또는 표적 항원, 예컨대 본원에 기재된 HER2/neu 항원 또는 에피토프의 하나 이상의 표적 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구축물 또는 벡터를 제공할 수 있다.
HER-2/neu (p185) 는 HER-2/neu 암유전자의 단백질 생성물이다. 일부 양상에서, HER-2/neu 유전자가 증폭되고, HER-2/neu 단백질은 유방, 난소, 위, 결장, 폐, 전립선, 및 뼈를 포함하는 다양한 암에서 과발현된다. 일부 양상에서, HER-2/neu 는 악성 변형과 관련된다. 일부 양상에서, 이것은 관 제자리 암종의 50%-60% 및 모든 유방암의 20%-40% 뿐 아니라, 난소, 전립선, 결장 및 폐에서 발생하는 선암종의 상당한 부분에서 발견된다. 일부 양상에서, HER-2/neu 단백질은 골육종을 포함하는, 뼈의 암에서 과발현된다. 일부 양상에서, HER-2/neu 는 악성 표현형 뿐 아니라, 모든 침윤성 유방암의 4 분의 1 에서 발견되는, 악성의 공격성과도 밀접하게 연관된다. 일부 양상에서, HER-2/neu 과발현은 유방 및 난소 암 모두에서 열약한 예후와 연관이 있다.
일부 양상에서, HER-2/neu 는 길이가 대략 1255 개 아미노산 (aa) 인 185 kd 의 상대 분자 질량을 가진 막관통 단백질이다. 이것은 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 와 40% 상동을 가진, 대략 645 aa 의 세포외 결합 도메인 (ECD), 고도의 소수성 막관통 도메인 (TM), 및 EGFR 과 80% 상동을 가진 대략 580 aa 의 세포내 도메인을 갖는다.
추가 양상에서, 적어도, 최대 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 상이한 관심의 표적 항원 또는 이로부터 유래되는 임의의 수 또는 범위를 엔코딩하는 핵산을 함유할 수 있는 발현 구축물 또는 벡터를 제공할 수 있다. 발현 구축물 또는 벡터는 1 개의 HER2/neu 항원으로부터의 다중 단편 또는 에피토프를 엔코딩하는 핵산 서열을 함유할 수 있거나 또는 본원에 기재된 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 포함하는 수 많은 상이한 표적 항원으로부터의 하나 이상의 단편 또는 에피토프를 함유할 수 있다.
HER2/neu 항원은 전체 길이 단백질일 수 있거나 또는 이의 면역원성 단편 (예를 들어, 에피토프) 일 수 있다. 면역원성 단편은 이용가능한 기술, 예컨대 Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993) 및 그곳에 인용된 참고문헌에 요약된 것들을 사용하여 확인될 수 있다. 면역원성 단편을 확인하기 위한 대표적인 기술은 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대해 폴리펩티드를 스크리닝하는 것을 포함한다. 특정 표적 폴리펩티드의 면역원성 단편은 전체 길이 표적 폴리펩티드 (예를 들어, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 어세이에서) 의 반응성보다 실질적으로 적지 않은 레벨에서 이러한 항혈청 및/또는 T-세포와 반응하는 단편일 수 있다. 다른 말로는, 면역원성 단편은 전체 길이 폴리펩티드의 반응성과 유사한 또는 이보다 큰 레벨에서 이러한 어세이 내에서 반응할 수 있다. 이러한 스크리닝은 일반적으로 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 에 기재된 것과 같은, 당업자에게 이용가능한 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 경우에서, 면역원성 에피토프, 예컨대 HER2/neu 에피토프는 8 내지 10 개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 경우에서, HER2/neu 에피토프는 4 내지 10 개의 아미노산 길이 또는 10 개의 아미노산 길이를 넘는다. 면역원성 에피토프, 예컨대 HER2/neu 에피토프는 적어도, 약, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개의 아미노산의 길이 또는 이로부터 유래되는 임의의 수 또는 범위의 길이를 포함할 수 있다. 면역원성 에피토프, 예컨대 HER2/neu 에피토프는 임의의 길이의 아미노산일 수 있다.
일부 구현예에서, HER2/neu 에피토프는 SEQ ID NO: 1 (막관통 및 세포외 도메인을 함유하는 절단된 HER2/neu 의 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 1033-3107 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, HER2/neu 에피토프는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 1033-3107 (Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 벡터의 핵산 서열로서, 이때 HER2/neu 는 SEQ ID NO: 1 의 절단된 HER2/neu 임) 에 언급된 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 벡터는 SEQ ID NO: 3 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신은 Ad5 [E1-, E2b-]-HER3 백신과 조합될 수 있으며, 이때 HER3 항원은 막관통 및 세포외 도메인을 포함하는 절단된 HER3 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, HER 3 항원은 SEQ ID NO: 27 (막관통 및 세포외 도메인을 함유하는 절단된 HER3 의 핵산 서열) 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 핵산 서열일 수 있다.
표적 항원의 부가적인 비-제한적 예는 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (HER2/neu), 암배아 항원 (CEA), 종양 네오-항원 또는 종양 네오-에피토프, 폴레이트 수용체 알파, WT1, brachyury (TIVS7-2, 다형성), brachyury (IVS7 T/C 다형성), T brachyury, T, hTERT, hTRT, iCE, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, Cyp-B, EGFR, HER2/neu, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1-c, MUC1-n, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, β-카테닌/m, 캐스파아제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, TEL/AML1, 인간 상피 성장 인자 수용체 3 (HER3), 알파-액티닌-4, ARTC1, CAR-ABL 융합 단백질 (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, 베타-카테닌, Cdc27, CDK4, CDKN2A, COA-1, dek-can 융합 단백질, EFTUD2, 신장 인자 2, ETV6-AML1 융합 단백질, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, LDLR-푸코실트랜스페라아제 융합 단백질, HLA-A2d, HLA-Al ld, hsp70-2, KIAAO205, MART2, ME1, 미오신 클래스 I, NFYC, OGT, OS-9, pml-RAR알파 융합 단백질, PRDX5, PTPRK, K-ras, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SYT-SSX1- 또는 -SSX2 융합 단백질, TGF-betaRII, 트리오스포스페이트 이소머라아제, BAGE-1, GAGE-1, 2, 8, Gage 3, 4, 5, 6, 7, GnTVf, HERV-K-MEL, KK-LC-1, KM-HN-1, LAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-Al2, MAGE-C2, 뮤신, NA-88, NY-ESO-1/LAGE-2, SAGE, Sp17, SSX-2, SSX-4, TAG-1, TAG-2, TRAG-3, TRP2-INT2g, XAGE-1b, gp100/Pmel17, , 맘마글로빈-A, 멜란-A/MART-1, NY-BR-1, OA1, RAB38/NY-MEL-1, TRP-1/gp75, 아디포필린, AIM-2, ALDH1A1, BCLX (L), BCMA, BING-4, CPSF, 사이클린 D1, DKK1, ENAH (hMena), EP-CAM, EphA3, EZH2, FGF5, G250/MN/CAIX, IL13R알파2, 창자 카르복실 에스테라아제, 알파 태아단백질, M-CSFT, MCSP, mdm-2, MMP-2, p53, PBF, PRAME, RAGE-1, RGS5, RNF43, RU2AS, 세서린 1, SOX10, 서바이빈, 텔로머라아제, VEGF, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양상에서, 본원에 사용되는 바와 같은, 종양 네오-에피토프는 종양-특이적 에피토프, 예컨대 EQVWGMAVR (SEQ ID NO: 6) 또는 CQGPEQVWGMAVREL (SEQ ID NO: 7) (FLRT2 의 R346W 돌연변이), GETVTMPCP (SEQ ID NO: 8) 또는 NVGETVTMPCPKVFS (SEQ ID NO: 9) (VIPR2 의 V73M 돌연변이), GLGAQCSEA (SEQ ID NO: 10) 또는 NNGLGAQCSEAVTLN (SEQ ID NO: 11) (FCRL1 의 R286C 돌연변이), RKLTTELTI (SEQ ID NO: 12), LGPERRKLTTELTII (SEQ ID NO: 13), 또는 PERRKLTTE (SEQ ID NO: 14) (FAT4 의 S1613L 돌연변이), MDWVWMDTT (SEQ ID NO: 15), AVMDWVWMDTTLSLS (SEQ ID NO: 16), 또는 VWMDTTLSL (SEQ ID NO: 17) (PIEZO2 의 T2356M 돌연변이), GKTLNPSQT (SEQ ID NO: 18), SWFREGKTLNPSQTS (SEQ ID NO: 19), 또는 REGKTLNPS (SEQ ID NO: 20) (SIGLEC14 의 A292T 돌연변이), VRNATSYRC (SEQ ID NO: 21), LPNVTVRNATSYRCG (SEQ ID NO: 22), 또는 NVTVRNATS (SEQ ID NO: 23) (SIGLEC1 의 D1143N 돌연변이), FAMAQIPSL (SEQ ID NO: 24), PFAMAQIPSLSLRAV (SEQ ID NO: 25), 또는 AQIPSLSLR (SEQ ID NO: 26) (SLC4A11 의 Q678P 돌연변이) 이다.
종양-연관 항원은 숙주에 의해 정상적으로 발현되지 않는 항원일 수 있고; 이들은 숙주에 의해 정상적으로 발현되는 분자의 돌연변이된, 절단된, 미스폴딩된 또는 다르게는 비정상 소견일 수 있고; 이들은 정상적으로 발현되나 비정상적으로 높은 수준에서 발현되는 분자와 일치할 수 있고; 또는 이들은 비정상인 문맥 또는 환경에서 발현될 수 있다. 종양-연관 항원은 예를 들어, 단백질 또는 단백질 단편, 복합 탄수화물, 강글리오사이드, 합텐, 핵산, 기타 생물학적 분자 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
II. CEA 표적 항원
본원에 기재되는 것은 동일 또는 별도의 복제-결함성 벡터 중에 HER2/neu 항원을 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열, 및/또는 뮤신 패밀리 항원, 예컨대 CEA 를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열, 및/또는 Brachyury 를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열, 및/또는 MUC1-c 를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 복제-결함성 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.
CEA 는 이것이 거의 모든 결장직장암 및 췌장암에서 과발현되고, 또한 일부 폐 및 유방암, 및 드문 종양, 예컨대 수질 갑상선 암에 의해 발현되나, 위창자 상피에서의 저-레벨 발현을 제외하고는 신체의 다른 세포에서는 발현되지 않기 때문에 면역요법을 위한 매력적인 표적 항원을 나타낸다. CEA 는 T-세포에 의해 MHC 제한된 방식으로 인지될 수 있는 에피토프를 함유한다.
종양 항원 CEA 를 엔코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 로의 다중 상동 면역화는, 기존의 또는 유도된 Ad5-중화 항체의 존재에도 불구하고 마우스에서 항종양 활성과 함께 CEA-특이적 세포-매개 면역 (CMI) 반응을 유도하였다는 것이 밝혀졌다. 현재 상 I/II 연구에서, 진행된 결장직장암을 가진 환자의 코호트를 상승 용량의 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 로 면역화하였다. CEA-특이적 CMI 반응은 대다수 (61.3%) 의 환자에서 기존의 Ad5 면역성의 존재에도 불구하고 관찰되었다. 중요하게는, 최소의 독성이 있었고, 전반적인 환자 생존률 (12 개월에 48%) 은 기존의 Ad5 중화 항체 역가와 관계없이 유사하였다. 결과는 암 환자에서, 신규 Ad5 [E1-, E2b-] 유전자 전달 플랫폼이 자연적으로 습득된 및 면역화-유도된 Ad5 특이적 면역성 모두의 설정에서 종양 항원 CEA 에 대한 상당한 CMI 반응을 발생시킨다는 것을 입증한다.
CEA 항원 특이적 CMI 는 예를 들어, 106 개의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 당 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10000 초과, 또는 그 이상의 IFN-γ 스폿 형성 세포 (SFC) 일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 인간 대상에서 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 1000, 12000, 15000 초과 또는 그 이상의 기존의 역의 Ad5 중화 항체 역가로 생성된다. 면역 반응은 본원에 기재된 세포-매개 면역성 및/또는 체액성 면역성을 포함할 수 있다. 면역 반응은 본원에 그리고 당업자에게 이용가능한 범위까지 기술된 바와 같은, 세포내 사이토카인 염색 (ICS), ELISpot, 증식 어세이, 크롬 방출을 포함하는 세포독성 T-세포 어세이 또는 등가 어세이, 및 임의의 횟수의 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 또는 RT-PCR 기반 어세이를 사용하는 유전자 발현 분석 중 하나 이상 뿐 아니라, 면역 반응을 측정하기 위해 당업계에 공지된 임의의 기타 적합한 어세이에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스 벡터는 폴리펩티드의 야생형 서브유닛과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 일치성을 갖는 서브유닛을 엔코딩하는 개질된 서열을 포함한다.
면역원성 폴리펩티드는 돌연변이체 CEA 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역원성 폴리펩티드는 위치 610 에 Asn->Asp 치환을 가진 돌연변이체 CEA 를 포함한다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스 벡터는 면역원성 폴리펩티드에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 일치성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 30 (CEA-CAP1(6D) 에 대한 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 31 (돌연변이된 CAP1(6D) 에피토프에 대한 아미노산 서열) 의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31 과 적어도 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 일치성을 갖는 서열 또는 대안적인 코돈 대체에 의해 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31 로부터 생성되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터에 의해 엔코딩되는 면역원성 폴리펩티드는 야생형 인간 CEA 서열과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 까지, 또는 그 이상의 포인트 돌연변이, 예컨대 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31 로부터의 서열 또는, 예를 들어, SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31 의, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 까지, 또는 그 이상의 포인트 돌연변이, 예컨대 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는, 개질된 버전을 포함한다.
CEA 유전자 패밀리의 일원은 서열 유사성, 발달 발현 패턴 및 이들의 생물학적 기능에 기반해서 3 개의 서브그룹으로 다시 나뉜다: 12 개의 유전자 (CEACAM1, CEACAM3-CEACAM8, CEACAM16 및 CEACAM18-CEACAM21) 를 함유하는 CEA-관련 세포 부착 분자 (CEACAM) 서브그룹, 11 개의 가깝게 관련된 유전자 (PSG1-PSG11) 를 함유하는 임신 특이적 당단백질 (PSG) 서브그룹 및 11 개의 위유전자 (pseudogene) (CEACAMP1-CEACAMP11) 의 서브그룹. CEACAM 서브그룹의 대부분의 일원은 면역글로불린 가변 도메인에 대한 구조적 상동을 갖는 단일 N-말단 V-세트 도메인으로 구성되는 세포외 Ig-유사 도메인에 이어, A 또는 B 서브타입의 C2-세트 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인의 다양한 일원으로 이루어지는 유사한 구조를 갖는다. 이들 구조의 조직화에 몇몇 예외를 나타내는 2 개 일원의 CEACAM 서브그룹 (CEACAM16 및 CEACAM20) 이 있다. CEACAM16 은 그의 N 및 C 말단에 2 개의 Ig-유사 V-유형 도메인을 함유하고, CEACAM20 은 절단된 Ig-유사 V-유형 1 도메인을 함유한다. CEACAM 분자는 이들 막관통 도메인 (CEACAM5 내지 CEACAM8) 을 통해 세포 표면에 고정되거나 또는 글리코포스파티딜이노시톨 (GPI) 지질 잔기 (CEACAM5, CEACAM18 내지 CEACAM21) 에 직접 연결될 수 있다.
CEA 패밀리 일원은 상이한 세포 유형에서 발현되고, 광범위한 생물학적 기능을 갖는다. CEACAM 은 대부분의 상피 세포 상에서 현저하게 발견되고, 상이한 백혈구 상에 존재한다. 인간에서, CEA 패밀리의 선조 일원인, CEACAM1 은, 상피 및 내피 세포의 첨단 면 뿐 아니라, 림프 및 골수 세포 상에서 발현된다. CEACAM1 은 헤모필릭 (hemophilic) (CEACAM1 내지 CEACAM1) 뿐 아니라 헤테로탈릭 (heterothallic) (예를 들어, CEACAM1 내지 CEACAM5) 상호작용을 통한 세포-세포 부착을 매개한다. 부가적으로, CEACAM1 은 많은 다른 생물학적 과정, 예컨대 혈관신생, 세포 이동, 및 면역 기능에 관여된다. CEACAM3 및 CEACAM4 발현은 과립구에 크게 제한되며, 이들은 네이세리아 (Neisseria), 모락셀라 (Moraxella), 및 하에모필루스 (Haemophilus) 종을 포함하는 여러 박테리아 병원균의 섭취 및 파괴를 전달할 수 있다.
따라서, 다양한 구현예에서, 조성물 및 방법은 CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM16, CEACAM18, CEACAM19, CEACAM20, CEACAM21, PSG1, PSG2, PSG3, PSG4, PSG5, PSG6, PSG7, PSG8, PSG9, 및 PSG11 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, CEA 에 대항하는 면역 반응을 유발하는 것에 관한 것이다. 면역 반응은 방법 및 조성물을 사용하여, 하나 이상의 CEA 를 발현 또는 과발현하는 세포, 예를 들어, 암 세포에 대해 유발될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 암 세포에서의 하나 이상의 CEA 의 과발현은 비-암 세포와 비교하여 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 배 또는 그 이상을 넘는다.
특정 구현예에서, 본원에서 사용되는 CEA 항원은 야생형 CEA 항원 또는 YLSGANLNL 에 돌연변이를 적어도 갖는 개질된 CEA 항원 (SEQ ID NO: 28), CEA 의 CAP1 에피토프이다. 돌연변이는 보존적 또는 비-보존적, 치환, 부가, 또는 결실일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 사용되는 CEA 항원은 YLSGADLNL 에 언급된 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 31), 돌연변이된 CAP1 에피토프를 갖는다. 추가의 구현예에서, CEA 를 발현하는 첫번째 복제-결함성 벡터 또는 복제-결함성 벡터는 SEQ ID NO: 29 의 임의의 부분 (개질된 CEA 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터의 예상된 서열), 예컨대 SEQ ID NO: 29 의 위치 1057 내지 3165 또는 전체-길이 SEQ ID NO: 29 와 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 100% 일치하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
III. 뮤신 패밀리 표적 항원
본원에 기재되는 것은 동일한 또는 분리된 복제-결함성 벡터 내에 HER2/neu 항원을 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열, 및/또는 뮤신 패밀리 항원, 예컨대 MUC1 을 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열, 및/또는 Brachyury 를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열, 및/또는 CEA 를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 복제-결함성 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.
인간 뮤신 패밀리 (MUC1 내지 MUC21) 는 체내 상피 표면 상에 보호성 점액 장벽을 형성하는데 중요한 역할을 하는 분비된 및 막관통 뮤신을 포함한다. 이들 단백질 기능은 호흡관, 위창자관을 라이닝하는 상피, 및 중요한 기관, 예컨대, 예를 들어 유선, 간, 위장, 췌장, 및 신장 내의 라이닝 도관을 보호하는 것이다.
MUC1 (CD227) 은 다수의 인간 암종 및 여러 혈액학적 악성에서 과발현되는 TAA 이다. MUC1 (GenBank: X80761.1, NCBI: NM_001204285.1) 은 인간 질환에 관여하는 것으로 알려진 많은 중요한 세포성 경로를 활성화시킨다. MUC1 은 여러 인간 암에서 통상 과발현되는 2 개의 서브유닛에 의해 형성된 헤테로이량체 단백질이다. MUC1 은, 차례로 안정한 비공유 헤테로이량체를 형성하는, 2 개의 서브유닛 MUC1n 및 MUC1c 를 발생시키는 자가단백질분해를 겪는다.
MUC1 C-말단 서브유닛 (MUC1c) 은 58 aa 세포외 도메인 (ED), 28 aa 막관통 도메인 (TM) 및 72 aa 세포질 도메인 (CD) 을 포함할 수 있다. MUC1c 는 또한 MUC1 의 이량체화를 허용할 수 있는 "CQC" 모티프를 함유할 수 있고, 이것은 또한 세포에 종양발생 기능을 부여할 수 있다. 일부 경우에서, MUC1 은 부분적으로 MUC1c 를 통한 세포 신호 유도를 통해 종양발생 기능을 할 수 있다. MUC1c 는 EGFR, ErbB2 및 기타 수용체 티로신 키나아제와 상호작용하고 PI3K→AKT 및 MEK→ERK 세포 경로의 활성화에 기여할 수 있다. 핵에서, MUC1c 는 Wnt/β-카테닌, STAT, 및 NF-κB RelA 세포 경로를 활성화시킨다. 일부 경우에서, MUC1 은 MUC1n 을 통한 세포 신호 유도를 통해 종양발생 기능을 부여할 수 있다. MUC1 N-말단 서브유닛 (MUC1n) 은 글리코실화될 수 있는 가변 수의 20 개의 아미노산 탠덤 반복부를 포함할 수 있다. MUC1 은 선상피 세포의 표면에서 정상적으로 발현되고, 암종에서 과발현되고 비정상적으로 글리코실화된다. MUC1 은 종양 면역요법에 대한 표적으로서 이용될 수 있는 TAA 이다. 여러 임상 시험이 있어왔고, 면역요법 백신에서의 MUC1 의 용도를 평가하도록 수행된다. 중요하게도, 이들 시험은 MUC1 을 표적으로 하는 면역요법이 안전하고 생존 이득을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다.
그러나, 임상 시험은 또한 MUC1 이 비교적 열악한 면역원이라는 것을 나타낸다. 이를 극복하기 위해, 본 발명자는 MUC1 종양단백질 (MUC1-C 또는 MUC1c) 의 C 말단 영역 내의 T 림프구 면역 인핸서 펩티드 서열을 확인하였다. 고유의 펩티드 서열과 비교하여, 이들의 개질된 MUC1-C 로의 작동제는 (a) 낮은 펩티드 농도에서 HLA-A2 에 결합하였고, (b) HLA-A2 에 대해 더 높은 결합활성 (avidity) 을 나타내었고, (c) 항원-제시 세포와 사용되는 경우, 고유의 펩티드를 사용하는 것보다 T-세포에 의해 좀더 많은 IFN-γ 의 생산을 유도하였고, (d) 암 환자로부터 MUC1-특이적 인간 T-세포주를 좀더 효과적으로 발생시킬 수 있었다. 중요하게는, 작동제 에피토프를 사용하여 생성되는 T-세포주는 고유의 에피토프로 펄스된 표적의 용해물에 대해 및 MUC1 을 발현하는 HLA-A2 인간 종양 세포의 용해물에서 고유의 에피토프로 생성된 것들보다 좀더 효과적이었다. 부가적으로, 본 발명자는 MUC1-C 의 부가적인 CD8+ 세포독성 T 림프구 면역 인핸서 작동제 서열 에피토프를 확인하였다.
특정 양상에서, 면역 인해서 능력 (mMUC1-C 또는 MUC1-C 또는 MUC1c) 을 위해 개질된 강력한 MUC1-C 가 제공된다. 본 명세서는 신규하고 좀더 강력한 면역요법 백신을 제조하기 위해 이것을 재조합 Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼 내로 도입한 면역 인해서 능력에 대해 개질된 강력한 MUC1-C 를 제공한다. 예를 들어, 면역요법 백신은 MUC1 발현 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C 일 수 있다.
번역-후 개질은 신체 및 인간 질환에서 단백질 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 상기 논의된 단백질분해 분할 외에, MUC1 은 특정 아미노산 잔기에 여러 번역-후 개질, 예컨대 글리코실화, 시알릴화, 팔미토일화, 또는 이의 조합을 가질 수 있다. 본원에서 제공되는 것은 MUC1 의 글리코실화, 시알릴화, 인산화, 또는 팔미토일화 개질을 표적하는 면역요법이다.
MUC1 은 고도로 글리코실화될 수 있다 (모노- 내지 펜타-글리코실화 범위의, 각각의 탠덤 반복부 내에 세린 및 트레오닌 잔기에 대해 상이한 정도로의 시알산 및 N- 및 O-연결된 탄수화물). 다르게는 3,4-연결된 GlcNAc 으로 유방 암종에서 O-글리코실화됨. N-글리코실화는 분비된 형태 MUC1/SEC 로의 고-만노오스, 산성 복합체-유형 및 하이브리드 글리칸, 및 막관통 형태, MUC1/TM.4 로의 중성 복합체-유형으로 이루어진다. 본 명세서는 MUC1 의 다르게 O-글리코실화된 형태를 표적하는 면역요법을 제공한다.
추가로, MUC1 은 시알릴화될 수 있다. 신장 및 유방암 세포로부터의 막-차폐 당단백질은 우선적으로 코어 1 구조에 시알릴화되는 반면, 동일한 조직으로부터의 분비된 형태는 주로 코어 2 구조를 나타낸다. O-글리코실화 함량은 모든 이들 조직에서 말단 푸코오스 및 갈락토오스, 2- 및 3-연결된 갈락토오스, 3- 및 3,6-연결된 GalNAc-올 및 4-연결된 GlcNAc 우세 (predominating) 와 중복되고 있다. 본 명세서는 MUC1 의 다양한 시알릴화 형태를 표적하는 면역요법을 제공한다. CQC 모티프 중의 시스테인 잔기에 대한 이중 팔미토일화는 엔도좀에서 원형질 막으로 다시 재순환하기 위해 필요하다. 본 명세서는 MUC1 의 다양한 팔미토일화 형태를 표적하는 면역요법을 제공한다.
인산화는 인간 건강에 중요한 특이적 세포 신호 반응을 유도하는 MUC1 의 능력에 영향을 줄 수 있다. 본 명세서는 MUC1 의 다양한 인산화된 형태를 표적하는 면역요법을 제공한다. 예를 들어, MUC1 은 C-말단 도메인 중의 티로신 및 세린 잔기를 인산화시킬 수 있다. C-말단 도메인 중의 티로신 상의 인산화는 MUC1 및 β-카테닌의 핵 위치화 (nuclear location) 를 증가시킬 수 있다. PKC 델타에 의한 인산화는 MUC1 의 β-카테닌/CTNNB1 에 대한 결합을 유도하고 β-카테닌/E-카드헤린 복합체의 형성을 감소시킬 수 있다. MUC1 의 Src-매개된 인산화는 GSK3B 와의 상호작용을 억제할 수 있다. Tyr-1229 에 대한 MUC1 의 Src- 및 EGFR-매개된 인산화는 β-카테닌/CTNNB1 에 대한 결합을 증가시킬 수 있다. Ser-1227 에 대한 MUC1 의 GSK3B-매개된 인산화는 상기 상호작용을 감소시킬 수 있으나, β-카드헤린/E-카드헤린 복합체의 형성을 복원시킨다. MUC1 의 PDGFR-매개된 인산화는 MUC1CT 및 CTNNB1 의 핵 공존화를 증가시킬 수 있다. 본 명세서는 이의 세포 신호 능력을 조절하는 것으로 알려진 MUC1, MUC1c, 및 MUC1n 의 상이한 인산화된 형태를 표적하는 면역요법을 제공한다.
본 명세서는 MUC1c 세포질 도메인 및 세포 내에서의 이의 기능을 조절하는 면역요법을 제공한다. 본 명세서는 MUC1c 내의 CQC 모티프를 조절하는 것을 포함하는 면역요법을 제공한다. 본 명세서는 MUC1c 의 세포외 도메인 (ED), 막관통 도메인 (TM), 세포질 도메인 (CD), 또는 이의 조합을 조절하는 것을 포함하는 면역요법을 제공한다. 본 명세서는 EGFR, ErbB2, 또는 다른 수용체 티로신 키나아제를 통해 세포 신호를 유도하는 MUC1c 의 능력을 조절하는 것을 포함하는 면역요법을 제공한다. 본 명세서는 PI3K→AKT, MEK→ERK, Wnt/β-카테닌, STAT, NF-κB RelA 세포 경로, 또는 이의 조합을 유도하는 MUC1c 의 능력을 조절하는 것을 포함하는 면역요법을 제공한다.
일부 구현예에서, MUC1c 면역요법은 동일한 복제-결함성 바이러스 벡터 또는 별도의 복제-결함성 바이러스 벡터 내에 HER2/neu, CEA, 또는 Brachyury 면역요법을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서는 또한 MUC1n 및 이의 세포 기능을 조절하는 면역요법을 제공한다. 본 명세서는 또한 MUC1n 의 탠덤 반복부, MUC1n 의 탠덤 반복부 상에 글리코실화 부위, 또는 이의 조합을 포함하는 면역요법을 제공한다. 일부 구현예에서, MUC1n 면역요법은 동일한 복제-결함성 바이러스 벡터 또는 별도의 복제-결함성 바이러스 벡터 내에 HER2/neu, CEA, 또는 Brachyury 면역요법을 추가로 포함한다.
본 명세서는 또한 MUC1n, MUC1c, HER2/neu, brachyury, CEA, 또는 이의 조합을 포함하는 백신을 제공한다. 본 명세서는 MUC1c 및 HER2/neu, brachyury, CEA, 또는 이의 조합을 포함하는 백신을 제공한다. 본 명세서는 또한 MUC1n 및 HER2/neu, Brachyury, CEA, 또는 이의 조합을 표적하는 백신을 제공한다. 일부 구현예에서, 항원 조합은 본원에 제공되는 하나의 벡터 내에 함유된다. 일부 구현예에서, 항원 조합은 본원에 제공되는 별도의 벡터 내에 함유된다.
본 발명은 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함하는 혈청형 5 의 복제 결함성 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 면역원성 폴리펩티드는 MUC1 의 이소형 또는 이의 서브유닛 또는 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스 벡터는 면역원성 폴리펩티드와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 일치성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터에 의해 엔코딩되는 면역원성 폴리펩티드는 야생형 인간 MUC1 서열과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 까지, 또는 그 이상의 포인트 돌연변이, 예컨대 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 MUC1-c 항원은 개질된 MUC1 일 수 있고, SEQ ID NO: 32 와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서의 MUC1-c 항원은 SEQ ID NO: 32 에 언급된 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 MUC1-c 항원은 개질된 MUC1 일 수 있고, SEQ ID NO: 33 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서의 MUC1-c 항원은 SEQ ID NO: 33 에 언급된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
IV. Brachyury 표적 항원
본원에 기재된 것은 동일한 또는 별도의 복제-결함성 벡터 내에 HER2/neu 항원을 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열, 및/또는 뮤신 패밀리 항원, 예컨대 MUC1 을 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열, 및/또는 Brachyury 을 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열, 및/또는 CEA 를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 복제-결함성 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 명세서는 Brachyury 에 대한 하나 이상의 항원을 포함하는 면역요법을 제공한다. Brachyury (또한 인간에서 "T" 단백질로서 공지됨) 는 초기 발달 동안, 주로 정상 중배엽의 형성 및 분화에서 핵심 역할을 하는 전사 인자의 T-박스 패밀리의 일원이고, T-도메인으로서 지정된 고도로 보존된 DNA-결합 도메인을 특징으로 한다. 상피-중간엽 전이 (EMT) 는 Brachyury 가 중요한 역할을 하는 전이 상태로의 원발 종양의 진행 동안의 핵심 단계이다. 인간 암종 세포 내의 Brachyury 의 발현은 중간엽 마커의 상향-조절, 상피 마커의 하향-조절, 및 세포 이동 및 침윤의 증가를 포함하는, EMT 의 특징 변화를 유도한다. 반대로, Brachyury 의 억제는 중간엽 마커의 하향-조절 및 세포 이동 및 침윤의 상실을 초래하고, 전이를 형성하는 인간 종양 세포의 능력을 소실시킨다. Brachyury 는 상피-중간엽 전이를 매개하고 침윤을 촉진하는 기능을 할 수 있다.
본 명세서는 또한 세포 증식 질환, 예컨대 암에서 상피-중간엽 전이 기능에 대한 Brachyury 영향을 조절하는 면역요법을 제공한다. 본 명세서는 또한 세포 증식 질환, 예컨대 암에서 침윤을 촉진하는 Brachyury 의 능력을 조절하는 면역요법을 제공한다. 본 명세서는 또한 Brachyury 의 T-박스 도메인의 DNA 결합 기능을 조절하는 면역요법을 제공한다. 일부 구현예에서, Brachyury 면역요법은 HER2/neu, CEA, 또는 MUC1, MUC1c, 또는 MUC1n 에 대한 하나 이상의 항원을 추가로 포함할 수 있다.
Brachyury 발현은 대부분의 정상 인간 조직에서 거의 검출불가능하고, 인간 종양에 크게 제한되어 있으며, 종종 과발현되어 이것을 면역요법을 위한 매력적인 표적 항원으로 만든다. 인간에서, Brachyury 는 T 유전자에 의해 엔코딩된다 (GenBank: AJ001699.1, NCBI: NM_003181.3). 인간에서 발견된 대안적인 스플라이싱에 의해 생성된 적어도 2 개의 상이한 이소형이 있다. 각각의 이소형은 다수의 자연적인 변이체를 갖는다.
Brachyury 는 면역원성이고, 시험관 내에서 확장된 Brachyury-특이적 CD8+ T-세포는 Brachyury 과발현 종양 세포를 용해할 수 있다. Brachyury 의 이러한 특징은 이것을 면역요법을 위한 매력적인 종양 연관 항원 (TAA) 으로 만든다. Brachyury 단백질은 T-박스 전사 인자이다. 이것은 T-박스로 불리는, 이의 N-말단 내의 영역을 통해 근접 앞뒤역순상동 (palindromic) 서열 "TCACACCT" 인, 특이적 DNA 요소에 결합하여, 이러한 부위에 결합하는 경우 유전자 전사를 활성화시킬 수 있다.
본 명세서는 또한 Brachyury, HER2/neu, MUC1, CEA, 또는 이의 조합을 포함하는 백신을 제공한다. 일부 구현예에서, 항원 조합은 본원에 제공되는 하나의 벡터에 함유된다. 일부 구현예에서, 항원 조합은 본원에 제공되는 별도의 벡터에 함유된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함하는 혈청형 5 의 복제 결함성 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 면역원성 폴리펩티드는 Brachyury 의 이소형 또는 이의 서브유닛 또는 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스 벡터는 면역원성 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 일치성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터에 의해 엔코딩되는 면역원성 폴리펩티드는 야생형 인간 Brachyury 서열과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 개 까지, 또는 그 이상의 포인트 돌연변이, 예컨대 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 Brachyury 항원은 SEQ ID NO: 34 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서의 Brachyury 항원은 SEQ ID NO: 34 에 언급된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
V. 벡터
특정 양상은 세포 내에 하나 이상의 표적 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 발현 구축물을 이송하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 구축물의 세포 내로의 이송은 바이러스 벡터를 사용하여 달성될 수 있다. 바이러스 벡터는 그곳에 클로닝된 재조합 유전자 구축물을 발현하기에 충분한 바이러스 서열을 함유하는 이들 구축물을 포함하도록 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 선형 이중-가닥 게놈을 함유하는 20 면체, 비-외피 캡시드를 특징으로 하는 DNA 바이러스의 패밀리이다. 인간 아데노바이러스 중에서, 임의의 신생물 질환과 연관된 것이 없고, 단지 면역적격 개체에서 비교적 온화한, 자기-제한적 질병만을 야기한다.
아데노바이러스 벡터는 게놈 DNA 내로의 낮은 통합 역량을 가질 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 고도로 효과적인 유전자 이송을 산출할 수 있다. 아데노바이러스 벡터의 부가적인 장점은 이들은 비분할 및 분할 세포 모두에 대한 유전자 전달에 효율적이고, 다량으로 제조될 수 있다는 것을 포함한다.
바이러스 통합과는 반대로, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 염색체 통합을 초래할 수 없는데, 아데노바이러스 DNA 가 잠재적 유전독성 없이 에피솜 방식으로 복제될 수 있기 때문이다. 또한, 아데노바이러스 벡터는 구조적으로 안정할 수 있고, 광범위한 증폭 후 게놈 재배열이 검출되지 않는다. 아데노바이러스는 이의 중간-크기의 게놈, 조작의 용이성, 높은 역가, 넓은 표적-세포 범위, 및 높은 감염력 때문에 유전자 전달 벡터로서 사용하기에 특히 적합하다.
바이러스에 의해 발현되는 첫번째 유전자는 E1 유전자이며, 이것은 야생형 게놈에 존재하는 다른 Ad5 유전자 프로모터로부터 고-레벨 유전자 발현을 개시하도록 행동한다. 바이러스 DNA 복제 및 자손 비리온의 어셈블리는 감염된 세포의 핵 내에서 일어나고, 전체 수명 사이클은 세포 당 대략 104 비리온의 생산량으로 약 36 시간 걸린다.
야생형 Ad5 게놈은 대략 36 kb 이고, 이들이 DNA 복제 전 또는 후에 발현하는지에 따라, 초기 및 후기 바이러스 기능으로 나뉘는 유전자를 엔코딩한다. 초기/후기 묘사는 거의 절대적인데, Ad5 로 이전에 감염된 세포의 과-감염은 이것이 그 자체의 게놈을 복제할 때까지 과-감염 바이러스로부터의 후기 유전자 발현 결여를 초래한다는 것이 입증되었기 때문이다. 이론에 구애되지 않고, 이것은 복제된 게놈이 캡슐화되어 존재할 때까지 후기 유전자 발현 (주로 Ad5 캡시드 단백질) 을 방지하는, Ad5 주요 후기 프로모터 (MLP) 의 복제 의존성 시스-활성화로 인한 것 같다. 조성물 및 방법은 진보된 세대 Ad 벡터/백신의 개발에서 이들 특징의 장점을 취할 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 복제 결함성이거나, 또는 적어도 조건적으로 결함성일 수 있다. 아데노바이러스는 42 개의 상이한 공지된 혈청형 또는 서브그룹 A-F 중 임의의 것일 수 있고, 다른 혈청형 또는 서브그룹이 구상된다. 서브그룹 C 의 아데노바이러스 유형 5 는 특정 구현예에서 복제-결함성 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 아데노바이러스 유형 5 가 그에 대한 많은 생화학적 및 유전적 정보가 알려진 인간 아데노바이러스이고, 이것이 역사적으로 벡터로서 아데노바이러스를 사용하는 대부분의 구축물에 사용되어 왔기 때문이다.
아데노바이러스 성장 및 조작은 당업자에게 공지되고, 시험관 내 및 생체 내에서 넓은 숙주 범위를 나타낸다. 개질된 바이러스, 예컨대 CAR 도메인의 변형이 있는 아데노바이러스가 또한 사용될 수 있다. 전달 향상 또는 면역 반응 회피를 위한 방법, 예컨대 바이러스의 리포좀 캡슐화가 또한 구상된다.
벡터는 아데노바이러스, 예컨대 E2 결실된 아데노바이러스 벡터, 또는 더욱 구체적으로, E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 유전적으로 조작된 형태를 포함할 수 있다. 용어 "E2b 결실된," 본원에 사용되는 바와 같은, 적어도 하나의 E2b 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능을 방지하도록 하는 방식으로 돌연변이된 특이적 DNA 서열을 말한다. 따라서, 특정 구현예에서, "E2b 결실된" 은 Ad 게놈으로부터 결실된 (제거된) 특이적 DNA 서열을 말한다. E2b 결실된 또는 "E2b 영역 내에 결실을 함유하는" 은 Ad 게놈의 E2b 영역 내에 적어도 하나의 염기 쌍의 결실을 말한다. 특정 구현예에서, 1 개 초과의 염기 쌍이 결실되고, 추가의 구현예에서, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 개의 염기 쌍이 결실된다. 또다른 구현예에서, 결실은 Ad 게놈의 E2b 영역 내에 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 또는 300 개 초과의 염기 쌍이다. E2b 결실은 적어도 하나의 E2b 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능을 방지하고 따라서, E2b-특이적 단백질의 엑손 엔코딩 부분 내에 결실 뿐 아니라 프로모터 및 리더 서열 내에 결실을 포함하는 결실일 수 있다. 특정 구현예에서, E2b 결실은 DNA 폴리머라아제 및 E2b 영역의 말단이전 단백질 중 하나 또는 모두의 발현 및/또는 기능을 방지하는 결실이다. 추가 구현예에서, "E2b 결실된" 은 하나 이상의 엔코딩된 단백질이 비-기능성인 Ad 게놈의 상기 영역의 DNA 서열 내의 하나 이상의 포인트 돌연변이를 말한다. 이러한 돌연변이는 비-기능성 단백질을 산출하는 아미노산 서열 내 변화를 도출하는 상이한 잔기로 대체되는 잔기를 포함한다.
본 명세서를 판독시 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, Ad 게놈의 다른 영역이 결실될 수 있다. 따라서 본원에 사용되는 바와 같은, Ad 게놈의 특정 영역에서 "결실되는" 것은, 상기 영역에 의해 엔코딩되는 적어도 하나의 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능을 방지하도록 하는 방식으로 돌연변이된 특이적 DNA 서열을 말한다. 특정 구현예에서, 특정 영역에서 "결실된" 은 상기 영역에 의해 엔코딩되는 발현 및/또는 기능 (예를 들어, DNA 폴리머라아제의 E2b 기능 또는 말단이전 단백질 기능) 을 방지하도록 하는 방식으로 Ad 게놈으로부터 결실된 (제거된) 특이적 DNA 서열을 말한다. 특정 영역 내에서 "결실된" 또는 "결실을 함유하는" 은 Ad 게놈의 상기 영역 내의 적어도 하나의 염기 쌍의 결실을 말한다.
따라서, 특정 구현예에서, 1 개 초과의 염기 쌍이 결실되고, 추가의 구현예에서, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 개의 염기 쌍이 특정 영역으로부터 결실된다. 또다른 구현예에서, 결실은 Ad 게놈의 특정 영역 내의 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 또는 300 개 초과의 염기 쌍이다. 이들 결실은 상기 영역에 의해 엔코딩되는 유전자 생성물의 발현 및/또는 기능이 방지되는 것과 같다. 따라서 결실은 단백질의 일부를 엔코딩하는 엑손 내에 결실 뿐 아니라, 프로모터 및 리더 서열 내에 결실을 포함한다. 추가 구현예에서, Ad 게놈의 특정 영역 내의 "결실된" 은 하나 이상의 엔코딩된 단백질이 비-기능성인 것과 같은 Ad 게놈의 상기 영역의 DNA 서열 내의 하나 이상의 포인트 돌연변이를 말한다. 이러한 돌연변이는 비기능성 단백질을 산출하는 아미노산 서열 내 변화를 도출하는 상이한 잔기로 대체된 잔기를 포함한다.
특정 구현예에서, 사용에 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 및, 임의로, E1 영역 내에 결실을 갖는 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 결실된 Ad 게놈의 임의의 다른 영역을 갖지 않는다.
또다른 구현예에서, 사용에 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 내에 결실 및, 임의로, E1 및 E3 영역 내에 결실을 갖는 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 결실된 다른 영역을 갖지 않는다.
추가 구현예에서, 사용에 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 내에 결실 및, 임의로, E1, E3 내에 결실, 및, 또한 임의로, E4 영역의 부분적인 또는 완전한 제거를 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다.
또다른 구현예에서, 사용에 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 내에 결실 및, 임의로, E1 및/또는 E4 영역 내에 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 함유하지 않는다.
부가적인 구현예에서, 사용에 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2a, E2b, 및/또는 E4 영역 내에 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 함유하지 않는다.
하나의 구현예에서, 본원에서 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는 결실된 E2b 영역의 E1 및/또는 DNA 폴리머라아제 기능을 갖는 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다.
추가 구현예에서, 본원에서 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는 결실된 E2b 영역의 E1 및/또는 말단이전 단백질 기능을 갖는다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다.
또다른 구현예에서, 본원에서 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는 결실된 E1, DNA 폴리머라아제, 및/또는 말단이전 단백질 기능을 갖는다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 하나의 특정한 구현예에서, 본원에서 사용하기 위해 고려되는 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역 및/또는 E1 영역의 적어도 일부에 대해 결실된다.
일부 경우에서, 이러한 벡터는 "거트 (gutted)" 아데노바이러스 벡터가 아니다. 이와 관련하여, 벡터는 E2b 영역의 DNA 폴리머라아제 및 말단이전 단백질 기능 모두에 대해 결실될 수 있다. 부가적인 구현예에서, 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E1, E2b, 및/또는 100K 영역 내에 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 "거트 (gutted)" 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에서 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는 결실된 E1, E2b, 및/또는 프로테아제 기능을 갖는 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다.
추가 구현예에서, 본원에서 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는 결실된 E1 및/또는 E2b 영역을 갖는 반면, 섬유 유전자는 돌연변이 또는 다른 변형 (예를 들어, Ad 굴성을 변형시키기 위해) 에 의해 개질되었다. E3 또는 E4 영역으로부터 유전자의 제거는 언급된 아데노바이러스 벡터 중 임의의 것에 부가될 수 있다.
결실된 아데노바이러스 벡터는 당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, Amalfitano, et al. J. Virol. 1998; 72:926-33; Hodges, et al. J Gene Med 2000; 2:250-59 참고). 당업자에게 인지될 바와 같이, 특정 양상에서 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는 E2b 유전자 생성물 및 결실될 수 있는 필요한 유전자 중 임의의 것의 생성물을 구성적으로 발현하는 적합한 패키징 세포주를 사용하는 고 역가로 성공적으로 성장할 수 있다. 특정 구현예에서, E1 및 DNA 폴리머라아제 단백질 뿐 아니라, Ad-말단이전 단백질을 구성적으로 발현하는 HEK-293-유래된 세포가 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, E.C7 세포는 아데노바이러스 벡터의 높은 역가 저장액을 성공적으로 성장시키는데 사용된다 (예를 들어, Amalfitano, et al. J. Virol. 1998; 72:926-33; Hodges, et al. J Gene Med 2000; 2:250-59 참고)
자가-전파 아데노바이러스 벡터로부터 중대한 유전자를 결실시키기 위해, 표적화된 유전자에 의해 엔코딩되는 단백질은 E1 단백질과 함께, HEK-293 세포, 또는 유사한 곳에서 공동발현될 수 있다. 따라서, 구성적으로 공동발현되는 (또는 독성 단백질 유도성으로-발현되는) 경우 무-독성인 이들 단백질만 이용될 수 있다. E1 및 E4 유전자의 HEK-293 세포 내의 공동발현은 입증되었다 (유도가능하나, 구성적이 아닌, 프로모터를 이용함) (Yeh, et al. J. Virol. 1996; 70:559; Wang et al. Gene Therapy 1995; 2:775; 및 Gorziglia, et al. J. Virol. 1996; 70:4173). E1 및 단백질 IX 유전자 (비리온 구조적 단백질) 는 공동발현되고 (Caravokyri, et al. J. Virol. 1995; 69: 6627), E1, E4, 및 단백질 IX 유전자의 공동발현의 또한 기재되었다 (Krougliak, et al. Hum. Gene Ther. 1995; 6:1575). E1 및 100k 유전자는 E1 및 프로테아제 유전자를 갖고 있는 것과 같이, 트랜스상보적인 (transcomplementing) 세포주에서 성공적으로 발현된다 (Oualikene, et al. Hum Gene Ther 2000; 11:1341-53; Hodges, et al. J. Virol 2001; 75:5913-20).
성장하는 고 역가의 E2b 결실된 Ad 입자에서 사용하기 위한 E1 및 E2b 유전자 생성물을 공동발현하는 세포주는 미국 특허 번호 6,063,622 에 기재된다. E2b 영역은 Ad 게놈 복제에 절대적으로 필요한 바이러스 복제 단백질을 엔코딩한다 (Doerfler, et al. Chromosoma 1992; 102:S39-S45). 유용한 세포주는 대략 140 kDa Ad-DNA 폴리머라아제 및/또는 대략 90 kDa 말단이전 단백질을 구성적으로 발현한다. 특히, 독성 없이, E1, DNA 폴리머라아제, 및 말단이전 단백질의 높은-레벨의, 구성적 공동발현을 갖는 세포주 (예를 들어, E.C7) 는 다중 백신화에서 사용하기 위해 Ad 를 증식시키는데 사용하기에 바람직하다. 이들 세포주는 E1, DNA 폴리머라아제, 및 말단이전 단백질에 대해 결실된 아데노바이러스 벡터의 증식을 허용한다.
재조합 Ad 는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 증식될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, E.C7 세포를 함유하는 조직 배양 플레이트는 적합한 MOI (예를 들어, 5) 에서 아데노바이러스 벡터 바이러스 저장액로 감염시키고 37.0 ℃ 에서 40-96 시간 동안 인큐베이션하였다. 감염된 세포를 수확하고, 10 mM Tris-CI (pH 8.0) 에 재현탁하고, 초음파처리하고, 바이러스를 2 회의 세슘 클로라이드 밀도 원심분리에 의해 정제한다. 특정 기술에서, 바이러스 함유 밴드를 Sephadex CL-6B 컬럼 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ.) 상에서 탈염시키고, 수크로오스 또는 글리세롤을 첨가하고, 분취액을 -80 ℃ 에서 저장하였다. 일부 구현예에서, 바이러스를 이의 안정성을 향상시키도록 디자인된 용액, 예컨대 A195 (Evans, et al. J Pharm Sci 2004; 93:2458-75) 에 넣는다. 저장액의 역가를 측정한다 (예를 들어, SDS 용해 후 바이러스의 분취액의 260 nm 에서의 광학 밀도의 측정에 의함). 또다른 구현예에서, 전체 재조합 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 포함하는, 선형 또는 환형인 플라스미드 DNA 는 E.C7, 또는 유사한 세포 내로 트랜스펙션될 수 있고, 바이러스 생산의 증거가 존재할 때까지, 37.0 ℃ 에서 인큐베이션할 수 있다 (예를 들어, 세포변성 효과). 이들 세포로부터의 조건화된 배지는 이후 정제 전에, 생성된 바이러스의 양을 팽창시키기 위해, 더 많은 E.C7, 또는 유사한 세포를 감염시키기 위해 사용될 수 있다. 정제는 2 회의 세슘 클로라이드 밀도 원심분리 또는 선택성 여과에 의해 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스는 시판 이용가능한 제품을 사용하는 컬럼 크로마토그래피 (예를 들어, Adenopure from Puresyn, Inc., Malvem, PA) 또는 주문 제작된 크로마토그래피 컬럼에 의해 정제될 수 있다.
특정 구현예에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 감염되어야 하는 세포가 특정한 수의 바이러스와 대면하는 것을 확보하기 위한 바이러스의 충분한 양을 포함할 수 있다. 그러므로, 재조합 Ad 의 저장액, 특히 재조합 Ad 의 RCA-무함유 저장액이 제공될 수 있다. Ad 저장액의 제조 및 분석은 당업계에 이용가능한 임의의 방법을 사용할 수 있다. 바이러스 저장액은 이들을 제조하는데 사용되는 바이러스 유전자형 및 프로토콜 및 세포주에 따라 크게, 역가가 상당히 상이하다. 바이러스 저장액은 적어도 약 106, 107, 또는 108 바이러스 입자 (VPs) /ml 의 역가를 가질 수 있고, 많은 이러한 저장액은 적어도 약 109, 1010, 1011, 또는 1012 VPs/ml 과 같은, 더 높은 역가를 가질 수 있다.
특정 양상은 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터, 예컨대 미국 특허 제 6,063,622; 6,451,596; 6,057,158; 6,083,750; 및 8,298,549 호에 기재된 것들의 사용을 고려한다. 많은 경우에 E2b 영역 내에 결실을 갖는 벡터는 바이러스 단백질 발현을 불구로 만들고/거나 복제 적격 (competent) Ad (RCA) 의 발생 빈도를 감소시킨다.
이들 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 증식은 결실된 E2b 유전자 생성물을 발현하는 세포주를 이용하여 수행될 수 있다. 특정 양상은 또한 HEK-293 세포주로부터 유래된, 이러한 패키징 세포주; 예를 들어 E.C7 (공식적으로 C-7 로 불림) 를 제공한다.
추가 양상에서, E2b 유전자 생성물, DNA 폴리머라아제 및 말단이전 단백질은 E1 유전자 생성물과 함께 E.C7, 또는 유사한 세포에서 구성적으로 발현될 수 있다. Ad 게놈에서 생산 세포주로의 유전자 분절의 이송은 즉각적인 이점을 갖는다: (1) 증가된 보유 역량; 및, (2) 전형적으로 RCA 를 생성하는데 2 이상의 독립적 재조합 사건을 필요로 하는, RCA 생성의 감소된 잠재력. 본원에서 사용되는 E1, Ad DNA 폴리머라아제 및/또는 말단이전 단백질 발현 세포주는 헬퍼 바이러스를 오염시킬 필요 없이, 13 kb 에 달하는 보유 역량을 가진 아데노바이러스 벡터의 증식을 가능하게 한다. 부가적으로, 바이러스 라이프 사이클에 중요한 유전자가 결실되는 경우 (예를 들어, E2b 유전자), 다른 바이러스 유전자 단백질을 복제 또는 발현하도록 하는 Ad 의 추가 불구화가 발생한다. 이것은 바이러스 감염된 세포의 면역 인지를 감소시킬 수 있고, 외래 이식유전자 발현의 확장된 지속기간을 허용한다.
E1, DNA 폴리머라아제, 및 말단이전 단백질 결실된 벡터는 전형적으로 E1 및 E2b 영역으로부터 각각의 단백질을 발현할 수 없다. 추가로, 이들은 대부분의 바이러스 구조 단백질의 발현 결여를 보일 수 있다. 예를 들어, Ad 의 주요한 후기 프로모터 (MLP) 는 후기 구조 단백질 L1 내지 L5 의 전사를 담당하고 있다. MLP 가 Ad 게놈 복제 이전에 최소로 활성이긴 하지만, 고도로 독성인 Ad 후기 유전자는 바이러스 게놈 복제가 발생한 후에만 MLP 로부터 일차적으로 전사되고 번역된다. 후기 유전자 전사의 상기 cis-의존성 활성화는 일반적으로, 폴리오마 및 SV-40 의 성장과 같은 DNA 바이러스의 특징이다. DNA 폴리머라아제 및 말단이전 단백질이 Ad 복제를 위해 중요하다 (E4 또는 단백질 IX 단백질과는 달리). E1 영역의 결실은 아데노바이러스 벡터 후기 유전자 발현에 극히 유해할 수 있고, 따라서 항원 제시 세포 (APC) 와 같은 세포 내의 후기 유전자 발현의 독성 효과를 제한할 수 있다. 따라서, E1-결실된 아데노바이러스 벡터는 APC 독성을 최소화하면서 보호 면역 반응을 유도하기 위해, 본원에 기재된 것들과 같은, APC 에 대한 치료 백신 섭생에 항원을 전달하기 위해 백신 백본으로서 사용하는데 유리하다.
특정 양상은 E1-결실된 아데노바이러스 벡터의 사용을 구상한다. 첫번째 세대, 또는 E1-결실된 아데노바이러스 벡터 Ad5 [E1-] 는 이식유전자 유전자의 E1 영역 만을 대체하는 식으로 구축된다. 전형적으로, 야생형 Ad5 게놈의 약 90% 가 벡터 내에 보유된다. Ad5 [E1-] 벡터는 감소된 복제 능력을 가져, Ad5 E1 유전자를 발현하지 않는 세포의 감염 후 감염성 바이러스를 생성할 수 없다. 재조합 Ad5 [E1-] 벡터는 Ad5 [E1-] 벡터 복제 및 패키징을 허용하는 인간 세포 (전형적으로 293 세포) 에서 증식된다. Ad5 [E1-] 벡터는 많은 긍정적인 속성을 갖는다; 가장 중요한 것 중 하나는 스케일 업 (scale up) 및 cGMP 생산에 대한 상대적인 용이함이다. 현재, 220 개를 훨씬 넘는 인간 임상 시험은 바이러스 피하로, 근육내로, 또는 정맥내로 제공된 2000 명초과의 대상과 함께, Ad5 [E1-] 벡터를 이용한다.
부가적으로, Ad5 벡터는 통합되지 않고; 이들의 게놈은 에피솜에 남아있다. 일반적으로, 숙주 게놈 내에 통합되지 않는 벡터의 경우, 삽입형 돌연변이유발 및/또는 생식-계열 전파에 대한 위험이 있다해도 극히 낮다. 통상의 Ad5 [E1-] 벡터는 대략 7kb 의 보유 역량을 갖는다.
인간 및 동물에서의 연구는 Ad5 에 대항하는 기존의 면역성이 Ad-기재 백신의 상업적 사용에 대한 억제 인자일 수 있다는 것을 입증하였다. 대부분의 인간은, 인간 백신에 대해 가장 널리 사용되는 서브타입인, Ad5 에 대항하는 항체를 갖는데, 인간의 3 분의 2 는 Ad5 에 대항하여 림프-증식성 반응을 갖는 것으로 연구되었다. 상기 기존의 면역성은 전형적인 Ad5 백신을 사용하는 면역화 또는 재-면역화를 억제할 수 있고 나중에, Ad5 벡터를 사용하는 두번째 항원에 대항하는 백신의 면역화를 배재할 수 있다. 기존의 항-벡터 면역성의 문제를 극복하는 것이 집중 연구 대상이었다. Ad5 의 대안적인 인간 (비-Ad5 기반) Ad5 서브타입 또는 심지어 비-인간 형태를 사용하는 연구가 시험되었다. 심지어 이들 접근법은 초기 면역화에서 성공했지만, 후속 백신화는 신규 Ad5 서브타입에 대한 면역 반응로 인해 문제가 있을 수 있다.
Ad5 면역화 장벽을 피하고, 최적의 면역 반응을 유도하기 위한 첫번째 세대 Ad5 [E1-] 벡터의 제한된 효능을 개선하기 위해, 다음 세대 Ad5 벡터 기반 백신 플랫폼과 관련된 특정 구현예가 제공된다. 다음 세대 Ad5 플랫폼은 DNA 폴리머라아제 및 말단이전 단백질 유전자를 제거하는, E2b 영역 내의 부가적인 결실을 갖는다. Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼은 많은 가능한 유전자의 내포를 허용하는데 충분한 확장된 클로닝 역량을 갖는다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 다중 유전자에 필요한만큼 공간을 제공하는, Ad5 [E1-] 벡터의 7 kb 역량과 비교하여 약 12 kb 까지의 유전자-보유 역량을 갖는다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 kb 초과의 삽입물이 Ad5 벡터, 예컨대 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 내로 도입된다.
E2b 영역의 결실은 Ad 바이러스 단백질에 대한 면역 반응을 최소화하면서, 종종 표적 이식유전자 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프에 대한 강력한 면역 반응을 도출하며 Ad5 벡터에 대한 유리한 면역 특성을 부여할 수 있다.
다양한 구현예에서, Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 강력한 세포-매개된 면역성 (CMI) 뿐 아니라, 심지어 Ad 면역성의 존재 하에, 벡터 발현된 표적 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프에 대항하는 항체를 유도할 수 있다.
Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 또한 Ad5 [E1-] 벡터와 비교하여 부작용, 특히 간독성 및 조직 손상의 출현을 감소시킨다.
이들 Ad5 벡터 및 Ad 후기 유전자의 발현의 특정 양상은 크게 감소된다. 예를 들어, 캡시드 섬유 단백질의 생산은 Ad5 [E1-] 벡터에 대해 생체 내에서 검출될 수 있는 반면, 섬유 발현은 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 백신으로부터 제거되었다. 야생형 Ad 에 대한 선천적 면역 반응은 복잡하다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터로부터 결실된 단백질은 일반적으로 중요한 역할을 한다. 구체적으로, 말단이전 단백질 또는 DNA 폴리머라아제의 결실을 가진 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 Ad5 [E1-] 벡터와 비교하여 주사 후 첫번째 24 내지 72 시간 동안 감소된 염증을 나타낸다. 다양한 구현예에서, Ad5 유전자 발현의 결핍은 감염된 세포가 항-Ad 활성을 보이지 않게 하고, 감염된 세포가 확장된 시간 기간 동안 이식유전자를 발현하도록 하여, 이것이 표적에 대한 면역성을 발달시킨다.
다양한 구현예는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 바이러스 단백질에 대한 감소된 염증 반응 및 기존의 Ad 면역성의 산출되는 회피라는 장점을 가짐으로써 백신에서 항원 특이적 면역 반응을 개선하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터를 수지상 세포로 형질도입하는 능력을 증가시키는 것을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 면역 유도는 수 개월 걸릴 수 있다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 항원 특이적 면역 반응 유도에 있어, Ad5 [E1-] 벡터보다 안전할 뿐 아니라, 이보다 우수한 것으로 나타나, 이들을 임상 반응을 산출할 수 있는 종양 백신을 전달하는 플랫폼으로서 훨씬 더 적합하게 만든다.
특정 구현예에서, 방법 및 조성물은 다른 Ad5 시스템으로 발견되는 장애물을 극복하고 Ad5 에 이전에 노출된 사람의 면역화를 허용하는 치료 종양 백신을 개발하기 위한 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 시스템의 장점을 취함으로써 제공된다.
E2b 결실된 벡터는 다양한 표적 항원 중 임의의 것, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 핵산 서열에 대한 공간을 용이하게 제공하는, 첫번째 세대 아데노바이러스 벡터의 5 내지 6 kb 역량과 비교하여 13 kb 까지의 유전자-보유 역량을 가질 수 있다.
E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 또한 첫번째 세대 아데노바이러스 벡터와 비교하여 감소된 부작용을 가질 수 있다. E2b 결실된 벡터는 감소된 바이러스 유전자의 발현을 가질 수 있고, 상기 특징은 생체 내에서의 연장된 이식유전자 발현을 도출할 수 있다.
첫번째 세대 아데노바이러스 벡터와 비교하여, 두번째 세대 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 특정 구현예는 DNA 폴리머라아제 유전자 (pol) 내의 부가적인 결실 및 이전-말단 단백질 (pTP) 의 결실을 함유한다.
아데노바이러스 벡터로부터 발현되는 Ad 단백질이 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 구체적으로, E2b 결실된 벡터 내의 이전-말단 단백질 및 DNA 폴리머라아제의 결실은 주사 후 첫번째 24 내지 72 시간 동안 염증을 감소시키는 반면, 첫번째 세대 아데노바이러스 벡터가 상기 기간 동안 염증을 자극하는 것으로 보인다.
부가적으로, E2b 결실에 의해 생성된 부가적인 복제 블록이 또한 E1, E3 결실 단독에 의해 제공되는 것보다 훨씬 넘어선, Ad 후기 유전자의 발현에서의 10,000 배 감소를 도출한다고 보고되었다. E2b 결실된 아데노바이러스 벡터에 의해 생성된 Ad 단백질의 감소된 수준은 Ad 면역화된 또는 노출된 개체에서 플랫폼의 반복된 사용을 방지하는 반응인, Ad 항원에 대한 경쟁적인, 원치 않는, 면역 반응에 대한 잠재력을 효과적으로 감소시킨다.
두번째 세대 E2b 결실된 벡터에 의한 염증 반응의 감소된 유도는 항원 제시 세포 (즉, 수지상 세포) 의 감염 동안, 원하는 백신 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 발현시키는 벡터에 대한 증가된 잠재력을 산출하고, 항원 경쟁을 위한 잠재력을 감소시키고, 첫번째 세대 아데노바이러스 벡터로의 동일한 시도와 관련하여 원하는 항원에 대한 백신의 더 큰 면역화를 산출한다.
E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 첫번째 세대 아데노바이러스 벡터를 사용하는 이전에 기재된 백신 후보자보다 안전하고, 좀더 효과적이고, 좀더 다용도인 개선된 Ad-기재 백신 후보자를 제공한다.
따라서, 첫번째 세대, E1-결실된 아데노바이러스 서브타입 5 (Ad5)-기재 벡터는, 백신으로 사용하기 위한 유망한 플랫폼임에도 불구하고, 자연 발생적인 또는 유도된 Ad-특이적 중화 항체에 의한 활성이 저해될 수 있다.
이론에 구애됨이 없이, E1 및 E2b 영역 (Ad5 [E1-, E2b-]) (마지막 영역은 DNA 폴리머라아제 및 이전-말단 단백질을 엔코딩함) 의 결실을 가진 Ad5-기반 벡터는, 예를 들어 소실된 후기 상 바이러스 단백질 발현 덕분에, 면역학적 소거를 회피하고 Ad-면역 숙주에서 엔코딩된 항원 이식유전자, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프에 대항하는 좀더 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다.
VI. 이종 핵산
일부 구현예에서, 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터는, 하나 이상의 종양 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프, 이의 융합 또는 이의 단편을 엔코딩하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 면역 반응을 조정할 수 있다. 특정 양상에서, 하나 이상의 종양 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하는 두번째 세대 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터가 제공될 수 있다.
이와 같이, 본원에서 추가로 기재되는 바와 같은 임의의 공급원으로부터의 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 벡터 또는 발현 구축물로 형질전환된 또는 트랜스펙션된 이러한 폴리뉴클레오티드 및 숙주 세포를 포함하는 벡터 또는 구축물이 제공될 수 있다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드" 는 본원에서 본질적으로 상호교환적으로 사용된다. 또한 당업자에게 인지되는 바와 같이, 본원에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 HnRNA 분자 (이것은 인트론을 함유하고, 1:1 방식으로 DNA 분자에 상응함), 및 mRNA 분자 (이것은 인트론을 함유하지 않음) 를 포함할 수 있다. 부가적인 코딩 또는 비-코딩 서열은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으나 반드시 그렇지는 않고, 폴리뉴클레오티드는 기타 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있으나, 반드시 그렇지는 않다. 본원에 사용되는 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드가 다른 코딩 서열로부터 실질적으로 떨어져 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용된 바와 같은 단리된 DNA 분자는 상당 부분의 미관련 코딩 DNA, 예컨대 대형 염색체 단편 또는 다른 기능적 유전자 또는 폴리펩티드 코딩 영역을 함유하지 않는다. 물론, 이것은 본래 단리된 대로의 DNA 분자를 말하며, 실험실에서 재조합을 통해 분절에 나중에 첨가되는 유전자 또는 코딩 영역을 배제하지 않는다.
당업자에 의해 이해되듯이, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 표적 항원, 항원의 단편, 펩티드 등을 발현하거나, 발현하도록 적응될 수 있는 게놈 서열, 게놈-외 및 플라스미드-엔코딩된 서열 및 좀더 작은 조작된 유전자 분절을 포함할 수 있다. 이러한 분절은 자연적으로 단리되거나, 사람의 손에 의해 합성적으로 개질될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 고유 서열 (즉, 하나 이상의 종양 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프 또는 이의 일부를 엔코딩하는 내인성 서열) 을 포함할 수 있거나, 이러한 서열의 변이체 또는 유도체를 엔코딩할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 언급된 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 돌연변이된 종양 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 고유의 뉴클레오티드 서열 또는 변이체로부터 실질적으로 변할 수 있으나 유사한 단백질 항원을 엔코딩할 수 있는 특정 세포 유형 (즉, 인간 세포주) 에서의 발현에 최적화된 신규한 유전자 서열을 나타낸다.
다른 관련된 구현예에서, 하나 이상의 종양 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 고유 서열과 실질적인 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 변이체, 예를 들어 SEQ ID NO: 1 에 언급된 고유의 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 서열 일치성 (또는 이의 임의의 도출가능한 범위 또는 값), 특히 적어도 75% 에서 99% 까지 또는 그 이상의 서열 일치성을 포함하는 것들 또는 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 하기 기재된, 표준 파라미터를 사용하는 BLAST 분석) 을 사용하는 SEQ ID NO: 2 와 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 이의 임의의 도출가능한 범위 또는 값), 특히 적어도 75% 에서 99% 까지 또는 그 이상의 서열 일치성을 가진 하나 이상의 종양 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프 또는 아미노산 서열을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공될 수 있다. 당업자는 이들 값이 코돈 퇴보성 (codon degeneracy), 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치화 등을 고려함으로써 2 개의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 단백질의 상응하는 일치성을 측정하도록 적합하게 조정될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
전형적으로, 폴리뉴클레오티드 변이체는, 바람직하게는 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 에피토프의 면역원성 또는 이종 표적 단백질의 면역원성이 고유의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드와 관련하여 실질적으로 소실되지 않는 것과 같이 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 것이다. 본원 다른 곳에서 논의되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 변이체는 바람직하게는 하나 이상의 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 이의 에피토프, 또는 단편 (예를 들어, 에피토프) 의 변이체를 엔코딩하고, 이때 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편 (예를 들어, 에피토프) 이 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 성향은 고유의 폴리펩티드에 비해 실질적으로 소실되지 않는다. 용어 "변이체" 는 또한 이종발생 기원의 상동 유전자를 포함하는 것으로 이해되어야만 한다.
특정 양상에서, 본원에 기재되는 표적 단백질 항원을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 적어도 약 5 개부터 1000 개까지 또는 그 이상의 근접 뉴클레오티드 뿐 아니라, 그 사이의 모든 중간 길이를 포함하는 또는 이것으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드가 제공될 수 있다. "중간 길이" 는 본 문맥에서, 인용된 값 사이의 임의의 길이, 예컨대 16, 17, 18, 19, 등; 21, 22, 23, 등; 30, 31, 32, 등; 50, 51, 52, 53, 등; 100, 101, 102, 103, 등; 150, 151, 152, 153, 등; 200-500; 500-1,000 등, 그 사이의 모든 정수를 포함하는 것을 의미하는 것으로 쉽게 이해될 것이다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 폴리펩티드, 예컨대 에피토프 또는 이종 표적 단백질을 엔코딩하는 고유 서열에서 발견되지 않은 부가적인 뉴클레오티드에 의해 하나 또는 양 말단에서 연장될 수 있다. 상기 부가적인 서열은 기재된 서열의 하나의 말단에서 또는 기재된 서열의 양 말단에서, 1 에서 20 개까지의 뉴클레오티드 또는 그 이상으로 이루어질 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편은, 코딩 서열 그 자체의 길이와는 상관없이, 이들의 전체 길이가 상당히 변화되는 것과 같이, 다른 DNA 서열, 예컨대 프로모터, 발현 조절 서열, 폴리아데닐화 신호, 부가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 기타 코딩 분절, 등과 조합될 수 있다. 따라서 대부분의 임의의 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있으며, 총 길이는 바람직하게는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 및 사용의 용이성에 의해 제한되는 것으로 고려된다. 예를 들어, 길이 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50 개 염기 쌍 등 (모든 중간 길이를 포함함) 의 총 길이의 예시적 폴리뉴클레오티드 분절이 특정 양상에서 유용한 것으로 고려된다.
폴리뉴클레오티드 서열을 비교할 때, 2 개 서열 중의 뉴클레오티드의 서열이 하기 기재되는 바와 같이 최대 대응 (correspondence) 으로 정렬하였을 때 동일한 경우를 2 개의 서열은 "상동" 인 것으로 말한다. 2 개의 서열 사이의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국부 영역을 확인하고 비교하는 비교 윈도우와 서열을 비교함으로써 수행된다. 본원에 사용되는 바와 같은, "비교 윈도우" 는 적어도 약 20 개의 근접 위치, 통상 30 내지 약 75, 40 내지 약 50 개의 분절을 말하며, 여기서 서열을 2 개의 서열을 최적으로 정렬한 후 동일한 수의 근접 위치의 참고 서열과 비교할 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하는 생물정보학 소프트웨어 (DNASTAR, Inc., Madison, WI) 의 Lasergene suite 에서 Megalign 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 프로그램은 하기 참고문헌에 기재된 여러 정렬 도식을 구현한다: Dayhoff MO (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff MO (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, et al. PM CABIOS 1989; 5:151-53; Myers EW, et al. CABIOS 1988; 4:11-17; Robinson ED Comb. Theor 1971; 11A 05; Saitou N, et al. Mol. Biol. Evol. 1987; 4:406-25; Sneath PHA and Sokal RR Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur WJ, et al. Proc. Natl. Acad., Sci. USA 1983 80:726-30).
대안적으로는, 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 Smith, et al. Add. APL. Math 1981; 2:482 의 위치적 일치성 알고리즘에 의해, Needleman, et al. Mol. Biol. 1970 48:443 의 일치성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85:2444 의 유사성 방법 조사에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해 (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA - the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl), 또는 검토에 의해 수행될 수 있다.
백분율 서열 일치성 및 서열 유사성을 측정하는데 적합한 알고리즘의 하나의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이것은 Altschul et al., Nucl. Acids Res. 1977 25:3389-3402, 및 Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990 215:403-10 에 각각 기재된다. BLAST 및 BLAST 2.0 가, 예를 들어 폴리뉴클레오티드에 대한 백분율 서열 일치성을 측정하기 위해, 본원에 기재된 파라미터와 함께, 사용될 수 있다. BLAST 분석을 프로그래밍하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information 를 통해 공개적으로 이용가능하다. 하나의 예시적 예에서, 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M (매칭 잔기 쌍에 대한 리워드 점수; 항상 >0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 <0) 을 사용하여 계산될 수 있다. 각 방향으로의 단어 히트의 연장은 다음과 같은 경우에 중단된다: 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성된 값으로부터 양 X 만큼 떨어지는 경우; 누적 점수가 하나 이상의 음성-득점 잔기 정렬의 축척으로 인해, 0 또는 미만으로 가는 경우; 또는 한쪽 서열의 말단이 도달하는 경우. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X 는 정렬의 민감성 및 속도를 측정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대한) 은 디폴트로서 11 의 단어 길이 (W), 및 10 의 예상값 (E) 를 사용하고, BLOSUM62 득점 매트릭스 (참고, Henikoff, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 89:10915) 정렬은, 50 의 (B), 10 의 예상값 (E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다.
특정 구현예에서, "서열 일치성의 백분율" 은 적어도 20 개 위치의 비교 윈도우에 대해 2 개의 임의로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 비교 윈도우 중의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2 개 서열의 최적 정렬을 위해, 참고 서열 (이는 부가 또는 결실을 포함하지 않음) 과 비교하여, 20% 또는 이하, 통상 5 내지 15%, 또는 10 내지 12% 의 부가 또는 결실 (즉, 갭) 을 포함할 수 있다. 백분율은 일치하는 핵산 염기가 양 서열에서 발생하는 위치의 수를 측정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 참고 서열 중의 위치의 총 수로 나누고 (즉, 윈도우 크기), 결과에 100 을 곱하여, 서열 일치성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
유전 코드의 퇴보성의 결과로서, 본원에 기재된 바와 같은 관심의 특정 항원, 또는 이의 단편을 엔코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 있음이 당업자에게 명백하다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 고유의 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소 상동을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드가 구체적으로 고려된다.
추가로, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열를 포함하는 유전자의 대립유전자가 또한 고려될 수 있다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변형되는 내인성 유전자이다. 산출되는 mRNA 및 단백질은 반드시 그럴 필요는 없지만, 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있다. 대립유전자는 표준 기술 (예컨대, 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교) 을 사용하여 확인될 수 있다.
따라서, 또다른 구현예에서, 돌연변이유발 접근법, 예컨대 부위-특이적 돌연변이유발은, 본원에 기재된 하나 이상의 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프, 또는 이의 단편을 엔코딩하는 핵산 서열의 변이체 및/또는 유도체의 제조에 사용된다. 상기 접근법에 의해, 폴리펩티드 서열 중의 특정한 개질은 이들을 엔코딩하는 근원적 폴리뉴클레오티드의 돌연변이유발을 통해 이루어질 수 있다. 이들 기술은, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 폴리뉴클레오티드 내에 도입함으로써, 상기 고려사항 중 하나 이상을 포함시키는 서열 변이체를 제조 및 시험하는 간단한 접근법을 제공한다.
부위-특이적 돌연변이유발은 횡단되는 결실 접합점의 양 면 상에 안정한 이중체를 형성하기 위한 충분한 크기의 프라이머 서열 및 서열 복잡성을 제공하기 위한, 원하는 돌연변이의 DNA 서열을 엔코딩하는 특정 올리고뉴클레오티드 서열 뿐 아니라, 충분한 수의 인접 뉴클레오티드의 사용을 통한 돌연변이체의 생산을 허용한다. 돌연변이는 폴리뉴클레오티드 그 자체의 특성을 개선, 변경, 감소, 개질 또는 다르게는 변화시키기 위해, 및/또는 엔코딩된 폴리펩티드의 특성, 활성, 조성, 안정성, 또는 일차 서열을 변경시키기 위해, 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에서 사용될 수 있다.
폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 분절 또는 단편은 자동화 올리고뉴클레오티드 합성장치를 사용하여 통상 실시되는 바와 같이, 예를 들어, 화학적 수단에 의해 단편을 직접적으로 합성함으로써 쉽게 제조될 수 있다. 또한, 단편은 핵산 재생산 기술, 예컨대 미국 특허 제 4,683,202 호의 PCR™ 기술을 적용함으로써, 재조합 생산을 위한 재조합 벡터 내에 선택된 서열을 도입함으로써, 그리고 분자 생물학 분야의 당업자에게 일반적으로 공지된 다른 재조합 DNA 기술에 의해 수득될 수 있다 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, NY 참고).
본원에 기재된, 원하는 종양 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프, 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 상기 임의의 것을 포함하는 융합 단백질을 발현시키기 위해, 폴리펩티드, 또는 기능적 등가물을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을, 당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 적합한 벡터 예컨대 복제-결함성 아데노바이러스 벡터 내로 도입한다. 적합한 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필수적인 요소 및 임의의 원하는 링커를 함유한다.
당업자에게 이용가능한 방법은 하나 이상의 종양 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 서열 및 적합한 전사 및 번역 조절 요소를 함유하는 이들 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이들 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체 내 유전적 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 예를 들어, Amalfitano, et al. J. Virol. 1998; 72:926-33; Hodges, et al. J Gene Med 2000; 2:250-259; Sambrook J, et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., and Ausubel FM, et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y 에 기술된다.
다양한 벡터/숙주 시스템이 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하고 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 제한 없이, 미생물, 예컨대 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 벡터 (예를 들어, 배큘로바이러스) 로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 벡터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아 벡터 (예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드) 로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함한다.
벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터에 존재하는 "조절 요소" 또는 "조절 서열" 은, 전사 및 번역을 수행하는 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 이들 비-번역 영역 - 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 미번역 영역 - 이다. 이러한 요소는 이들의 세기 및 특이성이 변할 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터를 포함하는 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 서열은 후기 프로모터 및 삼자간 (tripartite) 리더 서열로 이루어지는 Ad 전사/번역 복합체 내로 라이게이션될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 영역 내의 삽입은 감염된 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 독자생존가능한 (viable) 바이러스를 수득하는데 사용될 수 있다 (Logan J, et al. Proc. Natl. Acad. Sci 1984; 87:3655-59). 부가적으로, 전사 인핸서, 예컨대 Rous 육종 바이러스 (RSV) 인핸서가, 포유류 숙주 세포에서 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다.
특정 개시 신호는 또한 하나 이상의 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 서열의 좀더 효과적인 번역을 달성하는데 사용될 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열, 이의 개시 코돈, 및 업스트림 서열이 적합한 발현 벡터 내에 삽입되는 경우, 부가적인 전사 또는 번역 통제 신호는 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 오직 코딩 서열, 또는 이의 일부만 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 통제 신호가 제공되어야만 한다. 게다가, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 확보하기 위해 올바른 판독 프레임 내에 있어야만 한다. 외인성 번역 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성 모두의, 다양한 기원의 것일 수 있다. 발현 효율은 사용되는 특정 세포 시스템에 대해 적합한 인핸서, 예컨대 문헌에 기재된 것들의 포함에 의해 향상될 수 있다 (Scharf D., et al. Results Probl. Cell Differ. 1994; 20:125-62). 특정 종결 서열, 전사 또는 번역은, 또한 선택의 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열의 효과적인 번역을 달성하기 위해 도입될 수 있다.
생성물에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하는, 폴리뉴클레오티드-엔코딩된 생성물 (예를 들어, 하나 이상의 종양 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프) 의 발현을 검출 및 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 당업자에게 공지된다. 예는 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA), 방사능면역검정 (RIA), 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 를 포함한다. 제시된 폴리펩티드 상에서 2 개의 비-간섭 에피토프에 반응성인 모노클로날 항체를 이용하는 2 개-부위, 모노클로날-기반 면역어세이가 일부 적용에 대해 바람직할 수 있으나, 경쟁적 결합 어세이가 또한 사용될 수 있다. 이들 및 기타 어세이는, 다른 곳 중에서도, Hampton R et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) 및 Maddox DE, et al. (J. Exp. Med. 1983; 758:1211-16) 에 기재된다.
특정 구현예에서, 원하는 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프의 발현을 증가시키는 요소는 본원에 기재된 발현 구축물 또는 벡터 예컨대 아데노바이러스 벡터의 핵산 서열 내에 도입될 수 있다. 이러한 요소는 내부 리보솜 결합 부위를 포함한다 (IRES; Wang, et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol 1995; 203:99; Ehrenfeld, et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995; 203:65; Rees, et al. Biotechniques 1996; 20:102; Sugimoto, et al. Biotechnology 1994; 2:694). IRES 는 번역 효율을 증가시킨다. 뿐 아니라, 다른 서열은 발현을 향상시킬 수 있다. 일부 유전자의 경우, 특히 5' 말단에 있는 서열은 전사 및/또는 번역을 억제한다. 이들 서열은 통상 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 팔린드롬 (palindrome) 이다. 전달되어지는 핵산 중 임의의 이러한 서열은 일반적으로 결실된다. 전사물 또는 번역된 생성물의 발현 레벨을 어세이하여 서열이 발현에 영향을 주는 지를 확인 또는 알아내도록 한다. 전사물 레벨은 노던 블롯 (Northern blot) 하이브리드화, RNase 프로브 보호 등을 포함하는 임의의 공지된 방법에 의해 어세이될 수 있다. 단백질 레벨은 ELISA 를 포함하는, 임의의 공지된 방법에 의해 어세이될 수 있다.
당업자에게 인지되는 바와 같이, 이종 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터는 당업계에 공지된 재조합 기술, 예컨대 Maione, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:5986-91; Maione, et al. Hum Gene Ther 2000 1:859-68; Sandig, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2000; 97:1002-07; Harui, et al. Gene Therapy 2004; 11:1617-26; Parks et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:13565-570; DelloRusso, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:12979-984; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, NY) 에 기재된 것들을 이용하여 생성될 수 있다.
VII. 약학 조성물
특정 양상에서, 면역 반응이 생성되는 것에 대항하는 하나 이상의 하나 이상의 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 약학 조성물이 제공될 수 있다. 예를 들어, 종양 항원은 제한 없이, HER2/neu 항원 또는 에피토프를 또는 본원에 기재되는 또는 당업계에서 이용가능한 하나 이상의 부가적인 종양 항원과 조합으로 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터 저장액은 적합한 완충액, 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 등과 조합될 수 있다. 특정 구현예에서, 적합한 수의 아데노바이러스 벡터 입자를 적합한 완충액, 예컨대, 멸균 PBS 에 투여한다. 특정한 환경에서, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터 조성물을 비경구로, 정맥내로, 근육내로, 또는 심지어 복강내로 전달하는 것이 바람직할 것이다.
특정 구현예에서, 유리 염기 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서의 약학 조성물의 용액은 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로오스와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 다른 구현예에서, E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 삼킴으로써 또는 좌약으로서 전달되는, 알약 형태로 전달될 수 있다.
주사가능 용도에 적합한 예시적 약학 형태는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,466,468 호 참고). 모든 경우에서, 제형은 멸균되어야만 하고, 용이한 주사능력이 존재하는 범위까지 유체여야만 한다. 이것은 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야만 하고, 미생물, 예컨대 박테리아, 곰팡이 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야만 한다.
담체는 예를 들어, 물, 액체, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 이의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및/또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살, 등에 의해 용이해질 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제의, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물 내의 사용에 의해 야기될 수 있다.
하나의 구현예에서, 수용액 중의 비경구 투여를 위해, 용액을 필요한 만큼 적합하게 완충시킬 수 있고, 액체 희석제를 먼저 충분한 염분 또는 글루코오스로 등장성이 되게 할 수 있다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 명세서의 견지에서 당업자에게 잘 알려질 것이다. 예를 들어, 1 회 투여량은 1 ml 의 등장성 NaCl 용액에 용해되고, 1000 ml 의 대량피하주사 유체에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다 (예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580 참고). 치료되는 대상의 조건에 따라 다르게 투여량에서의 일부 변화가 필요하게 발생할 것이다. 게다가, 인간 투여를 위해, 제제는 당연히 바람직하게는 FDA 생물학 표준 [FDA Office of Biology standards] 에 의해 필요한 멸균성, 발열원성 및 일반 안정성 및 순도 표준을 충족할 것이다.
담체는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드, 등을 추가로 포함할 수 있다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 양립할 수 없는 것을 제외하고는, 치료 조성물 중의 이의 용도가 고려된다. 보조적 활성 성분은 또한 조성물 내에 도입될 수 있다. 구절 "약학적으로-허용가능한" 은 인간에게 투여되는 경우 알러지 또는 유사한 부작용 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 말한다.
본원에 기재된 치료 조성물의 투여 경로 및 빈도 뿐 아니라 투여량은 개인과 개인, 및 질환과 질환에 따라 변화될 것이며, 표준 기술을 사용하여 쉽게 달성될 수 있을 것이다. 일반적으로, 약학 조성물 및 백신은 주사에 의해 (예를 들어, 피부내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비강내로 (예를 들어, 흡입에 의해), 알약 형태로 (예를 들어, 삼킴, 질 또는 직장 전달용의 좌약) 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 1 내지 3 투여량을 6 주 기간에 걸쳐 투여할 수 있으며, 추가의 부스트 (booster) 백신화를 그 이후 주기적으로 제공할 수 있다.
예를 들어, 적합한 투여량은 상기 기술된 대로 투여되는 경우, 본원 다른 곳에 기재된 바와 같은 표적 항원 면역 반응을 촉진할 수 있는 아데노바이러스 벡터의 양이다. 특정 구현예에서, 면역 반응은 기저 (즉, 미처리된) 레벨의 적어도 10-50% 초과이다. 이러한 반응은 환자에서 표적 항원에 대항하는 항체를 측정함으로써 또는 시험관 내에서 표적 항원-발현 세포를 살해할 수 있는 세포용해 효과기 세포의 백신-의존성 생성에 의해, 또는 면역 반응을 모니터링하기 위한 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 표적 항원은 본원에 기재된 HER2/neu 항원 또는 에피토프이다.
일반적으로, 적합한 투여량 및 치료 섭생은 아데노바이러스 벡터를 예방적 이득을 제공하기에 충분한 양으로 제공한다. 보호성 면역 반응은 일반적으로 표준 증식, 세포독성 또는 사이토카인 어세이를 사용하여 평가될 수 있으며, 이것은 면역화 (백신화) 전 후 환자로부터 수득된 샘플을 사용하여 수행될 수 있다.
특정 양상에서, 환자 또는 대상에게 투여되는 조성물의 실제 투여 용량은 신체적 및 생리적 인자, 예컨대 체중, 상태의 경중도, 치료되는 질환의 유형, 이전 또는 현행 치료적 개입, 환자의 특발증 및 투여 경로에 따라 결정될 수 있다. 투여를 담당하는 의사는 임의의 사건에서, 개별 대상에 대한 조성물 내 활성 성분(들) 의 농도 및 적합한 투여량(들) 을 결정할 것이다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 하나의 장점이, 특히 Ad 에 대해 기존의 면역성을 가진 개체에게, 동일한 아데노바이러스 벡터를 가진 다중 백신화를 투여하는 능력이라면, 본원에 기재된 아데노바이러스 백신은 또한 프라임 및 부스트 섭생의 일부로서 투여될 수 있다. 혼합된 양상의 프라임 및 부스트 접종 계획은 향상된 면역 반응을 도출할 수 있다. 그러므로, 하나의 양상은 플라스미드 백신을 적어도 1 회 투여함으로써, 하나 이상의 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 백신, 예컨대 플라스미드 벡터로 대상을 프라임하고, 사전에 정해진 시간이 경과되도록 하고, 그 다음 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터를 투여함으로써 부스트하는 방법이다.
다중 프라임화, 예를 들어, 1-3 회가 사용될 수 있지만, 그 이상도 사용될 수 있다. 프라임 및 부스트 사이의 시간 길이는 전형적으로 약 6 개월에서 1 년으로 다양할 수 있지만, 다른 시간 프레임도 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 약학 조성물은 예를 들어, 적어도 약 0.1% 의 치료제, 예컨대 본원에서 백신으로서 사용된 발현 구축물 또는 벡터, 관련 액체 나노소낭 (nanovesicle), 또는 치료제가 적재된 엑소좀 또는 나노소낭을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 치료제는 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 예를 들어, 그 사이에 도출가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 다른 비-제한적인 예에서, 투여량은 또한 투여 당, 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중, 내지 약 1000 mg/kg/체중 또는 그 이상, 및 그 사이에 도출가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 나열된 수로부터의 도출가능한 범위의 비-제한적인 예에서, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중, 등의 범위가 투여될 수 있다.
유효량의 약학 조성물은 의도된 목적에 기반하여 결정된다. 용어 "단위 용량" 또는 "투여량" 은 대상에서 사용하기에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각각의 단위는 이의 투여와 관련하여 상기 논의된 원하는 반응, 즉, 적합한 투여 및 치료 섭생을 산출하도록 계산된 미리 결정된-양의 약학 조성물을 함유한다. 치료 횟수 또는 단위 투여량 둘다에 따른, 투여되는 양은, 희망하는 보호 또는 효과에 따라 다르다.
약학 조성물의 정확한 양은 또한 의사의 판단에 따라 다르며, 각 개인에 독특하다. 투여량에 영향을 주는 인자는 환자의 신체적 및 임상적 상태, 투여 경로, 의도되는 치료 목표 (예를 들어, 증상의 완화 대 치유) 및 특정 치료 성분의 효능, 안정성 및 독성을 포함한다.
특정 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 백신화 요법을 포함하는 조성물은 임의의 경로에 의해, 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 투여될 수 있고, 이러한 투여는 단일 및 다중 투여량 모두로 수행될 수 있다. 더욱 특히, 약학 조성물은 정제, 캡슐, 마름모꼴정제, 트로키, 핸드 캔디 (hand candies), 분말, 스프레이, 수성 현탁액, 주사용 용액, 엘릭시르, 시럽 등의 형태로의 다양한 약학적으로 허용가능한 비활성 담체와 조합될 수 있다. 이러한 담체는 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매질 및 다양한 무-독성 유기 용매 등을 포함한다. 게다가, 이러한 경구 약학 제형은 이러한 목적을 위해 통상 사용되는 유형의 다양한 작용제에 의해 적합한 감미 및/또는 풍미를 띠게 할 수 있다. 전반적으로 기재된 조성물은 약학 의약으로 제형화될 수 있고, 질환, 예를 들어, 암으로 진단된, 이를 필요로 하는 인간 또는 포유동물을 치료하기 위해, 또는 면역 반응을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터 또는 조성물은 하나 이상의 면역자극제, 예컨대 아쥬반트와 함께 투여될 수 있다. 면역자극제는 본질적으로 항원에 대한 면역 반응 (항체 및/또는 세포-매개됨) 을 향상시키거나 상승시키는 임의의 성분을 말한다. 하나의 유형의 면역자극제는 아쥬반트를 포함한다. 많은 아쥬반트는 항원을 빠른 분해대사로부터 보호하도록 디자인된 성분, 예컨대 알루미늄 히드록시드 또는 미네랄 오일, 및 면역 반응의 자극제, 예컨대 지질 A, 보르타델라 페르투시스 (Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 유래된 단백질을 함유한다. 특정 아쥬반트는 예를 들어, Freund's Incomplete 아쥬반트 및 Complete 아쥬반트 (Difco Laboratories); Merck 아쥬반트 65 (Merck and Company, Inc.) AS-2 (SmithKline Beecham); 알루미늄 염, 예컨대 알루미늄 히드록시드 겔 (alum) 또는 알루미늄 포스페이트; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 폴리사카라이드; 폴리포스파젠; 생분해성 마이크로스피어; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼 A (quil A) 로서 시판된다. 사이토카인, 예컨대 GM-CSF, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, 및/또는 IL-32, 및 기타, 유사 성장 인자도, 또한 아쥬반트로서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 아쥬반트 조성물은 대부분 Th1 유형의 면역 반응을 유도하는 것일 수 있다. 높은 레벨의 Th1-유형 사이토카인 (예를 들어, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12) 은 투여된 항원에 대한 세포 매개된 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. 반대로, 높은 레벨의 Th2-유형 사이토카인 (예를 들어, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10) 은 체액성 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. 본원에 제공된 바와 같은 백신의 적용 후에, 환자는 Th1- 및/또는 Th2-유형 반응을 유도하는 면역 반응을 지지할 수 있다. 특정 구현예에서, 반응은 대부분 Th1-유형인 경우, Th1-유형 사이토카인의 레벨은 Th2-유형 사이토카인의 레벨보다 더 큰 규모로 증가할 것이다. 이들 사이토카인의 레벨은 표준 어세이를 사용하여 쉽게 평가될 수 있다. 따라서, 다양한 구현예는 복제 결함성 바이러스 벡터 치료와 동시에 공급된 사이토카인, 예를 들어, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 및/또는 IL-15 를 사용하여, 표적 항원, 예를 들어 HER2/neu 항원 또는 에피토프에 대항하는 면역 반응을 일으키는 요법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 또는 사이토카인을 엔코딩하는 핵산은, 본원에 기재된 복제 결함성 바이러스와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 사이토카인 투여는 바이러스 벡터 투여 이전에 또는 이에 후속하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 항원, 예를 들어 HER2/neu 항원 또는 에피토프에 대항하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 복제 결함성 바이러스 벡터는, 사이토카인을 엔코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
대부분 Th1-유형 반응을 유발하기 위한 특정 예시적 아쥬반트는 예를 들어, 알루미늄 염과 함께, 모노포스포릴 지질 A, 예컨대 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A 의 조합을 포함한다. MPL® 아쥬반트는 시판 이용가능하다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034; 및 4,912,094 호 참고). CpG-함유 올리고뉴클레오티드 (여기서 CpG 디뉴클레오티드는 비메틸화됨) 는 또한 대부분 Th1 반응을 유도한다 (예를 들어, WO 96/02555, WO 99/33488 및 미국 특허 제 6,008,200 및 5,856,462 호 참고). 면역자극성 DNA 서열이 또한 사용될 수 있다.
일부 구현예에서 사용하기 위한 또다른 아쥬반트는 사포닌, 예컨대 Quil A, 또는 QS21 및 QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc.) 을 포함하는 이의 유도체, Escin; Digitonin; 또는 Gypsophila 또는 Chenopodium 퀴노아 사포닌을 포함한다. 다른 제형은 아쥬반트 조합, 예를 들어, QS21, QS7, Quil A, β-escin, 또는 디기토닌을 포함하는 하기 그룹 중 적어도 2 개의 조합 중에 1 개 초과의 사포닌을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 비강내 스프레이, 흡입, 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 비강내 마이크로입자 수지 및 라이소포스파티딜-글리세롤 화합물을 사용하는 약물의 전달이 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,725,871 호 참고). 마찬가지로, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스의 형태로의 예시적 점막경유 약물 전달이 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,780,045 호 참고).
리포좀, 나노캡슐, 마이크로입자, 지질 입자, 소낭 등이 적합한 숙주 세포/유기체 내로의 본원에 기재된 조성물의 도입을 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 전달을 위해 제형화되거나 지질 입자, 리포좀, 소낭, 나노스피어, 또는 나노입자 등에 캡슐화될 수 있다. 대안적으로는, 본원에 기재된 조성물은 이러한 담체 비히클의 표면에, 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 결합될 수 있다. 리포좀은 유전자, 다양한 약물, 방사선치료제, 효소, 바이러스, 전사 인자, 알로스테릭 (allosteric) 효과기 등을, 다양한 배양된 세포주 및 동물 내로 도입하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 게다가, 리포좀의 사용은 전신 전달 후 자가면역 반응 또는 허용불가능한 독성과 연관되는 것으로 보이지 않는다. 일부 구현예에서, 리포좀은 수성 매질에 분산된 인지질로부터 형성되고, 자발적으로 멀티라멜라 동심원 이중층 소낭 (즉, 멀티라멜라 소낭 (MLV)) 을 형성한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 또는 벡터의 약학적으로-허용가능한 나노캡슐 제형이 제공된다. 나노캡슐은 일반적으로 약학 조성물을 안정하고 재현가능한 방식으로 포획할 수 있다. 세포내 중합체성 과적재로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자 (크기가 대략 0.1 ㎛ 임) 는 생체 내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 디자인될 수 있다.
특정 양상에서, IL-15 를 포함하는 약학 조성물은 이를 필요로 하는 개체에게, 본원에 제공된 하나 이상의 요법과 조합으로, 특히 하나 이상의 표적 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 아데노바이러스 벡터와 조합으로 투여될 수 있다.
인터류킨 15 (IL-15) 은 IL-2 와 구조적 유사성을 갖는 사이토카인이다. IL-2 와 마찬가지로, IL-15 는 IL-2/IL-15 수용체 베타 사슬 (CD122) 및 공통의 감마 사슬 (감마-C, CD132) 로 구성된 복합체에 결합하여 이를 통해 신호를 보낸다. IL-15 는 바이러스(들) 에 의한 감염 후 단핵 포식세포 (및 일부 다른 세포) 에 의해 분비된다. 상기 사이토카인은 주된 역할이 바이러스에 감염된 세포를 죽이는 선천적 면역계의 세포인 자연 살해 세포의 세포 증식을 유도한다.
IL-15 는 전-임상 모델에서 CD8+ T 세포의 항-종양 면역성을 향상시킬 수 있다. 전이성 흑색종 및 신세포 암종 (신장암) 을 가진 환자에서 IL-15 의 안정성, 투약, 및 항-종양 효능을 평가하기 위한 제 I 상 임상 시험을 미국 국립보건원 (National Institutes of Health) 에 환자를 등록하여 시작하였다.
본원에 기재된 IL-15 는 또한 이의 고유의 형태의 기능을 유지하도록 개질된 IL-15 의 돌연변이체를 포함할 수 있다.
IL-15 는 마우스에서 염색체 4 의 34 kb 영역 4q31 에 의해, 및 염색체 8 의 중앙 영역에 의해 엔코딩되는 14-15 kDa 당단백질이다. 인간 IL-15 유전자는 9 개의 엑손 (1 - 8 및 4A) 및 8 개의 인트론을 포함하며, 이 중 4 개 (엑손 5 내지 8) 는 성숙 단백질을 코딩한다. 동일한 단백질을 엔코딩하는 상기 유전자의 2 개의 대안적으로 스플라이싱된 전사물 변이체가 보고되었다. 본래 확인된 이소형인, 48 개의 아미노산 (IL-15 LSP) 의 긴 신호 펩티드는 316 bp 5'-미번역된 영역 (UTR), 486 bp 코딩 서열 및 C-말단 400 bp 3'-UTR 영역으로 이루어졌다. 다른 이소형 (IL-15 SSP) 은 엑손 4A 및 5 에 의해 엔코딩되는 21 개의 아미노산의 짧은 신호 펩티드를 갖는다. 두 이소형은 N-말단의 신호 서열 사이에 11 개의 아미노산을 공유하였다. 두 이소형이 동일한 성숙 단백질을 생성하더라도, 이들은 세포 트래피킹 (trafficking) 이 상이하다. IL-15 LSP 이소형은 골지체 (GC), 초기 엔도좀 및 소포체 (ER) 에서 확인되었다. 이것은 2 가지 형태, 분비된 및 특히 수지상 세포 상에, 막-결합된 형태로 존재한다. 다른 한편, IL-15 SSP 이소형은 분비되지 않으며, 세포 주기의 조절에 중요한 역할을 하는 세포질 및 핵에 제한되는 것으로 보인다.
IL-15 mRNA 의 2 개의 이소형이 마우스에서 대안적인 스플라이싱에 의해 생성된다는 것이 입증되었다. 또다른 3' 스플라이싱 부위를 함유하는 대안적인 엑손 5 를 갖는 이소형은 높은 번역 효율을 나타내었고, 생성물은 N-말단의 신호 서열 중에 소수성 도메인이 결핍된다. 이것은 상기 이소형으로부터 유래되는 단백질이 세포내에 위치한다는 것을 암시한다. 대안적인 엑손 5 의 통합적 스플라이싱에 의해 발생되는 정상 엑손 5 를 가진 다른 이소형은, 세포외로 방출될 수 있다.
IL-15 mRNA 는 비만 세포, 암 세포 또는 섬유아세포를 포함하는 많은 세포 및 조직에서 발견될 수 있지만, 상기 사이토카인은 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포에 의해 주로 성숙 단백질로서 생성된다. IL-15 mRNA 의 광범위한 출현 및 단백질의 제한된 생산 사이의 상기 불일치는 IL-15 mRNA 의 번역을 억누를 수 있는, 인간에서 12 개 및 마우스에서 5 개 업스트림 개시 코돈의 존재에 의해 설명될 수 있을 것이다. 번역 비활성 mRNA 는 세포 내에 저장되고, 특정 신호 시 유도될 수 있다. IL-15 의 발현은 사이토카인 예컨대 GM-CSF, 이중-가닥 mRNA, 비메틸화된 CpG 올리고뉴클레오티드, 톨-유사 수용체(TLR) 를 통한 리포폴리사카라이드 (LPS), 인터페론 감마 (IFN-γ) 에 의해 또는 단핵구 헤르페스 바이러스, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 의 감염 후에 자극될 수 있다.
VIII. 자연 살해 (NK) 세포
특정 구현예에서, 고유의 또는 조작된 NK 세포는 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터-기반 조성물 또는 면역요법과 조합으로, 이를 필요로 하는 대상에게 투여되는 것으로 제공될 수 있다.
면역계는 감염 및 질환으로부터 보호하는 각각 그 자체의 뚜렷한 역할을 가진 면역 세포의 다양한 패밀리의 태피스트리 (tapestry) 이다. 이들 면역 세포 중에는 신체의 방어 일차선으로서의 자연 살해, 또는 NK, 세포가 있다. NK 세포는 다른 지지 분자에 의한 이전 노출 또는 활성화 없이, 비정상 세포, 예컨대 암 또는 바이러스-감염된 세포를 빠르게 찾아 파괴하는 선천적 능력을 갖는다. 적응 면역 세포 예컨대 T 세포와는 반대로, NK 세포는 제 1 상 임상 시험에서 세포-기반 "기성품 (off-the-shelf)" 치료로서 이용되었고, 암에 대한 종양 살해 능력을 입증하였다.
1. aNK 세포
고유의 NK 세포 외에, 살해 억제 수용체 (KIR) 를 발현하지 않는 환자에 투여하기 위한 NK 세포가 제공될 수 있고, 상기 질환에 걸린 세포가 종종 NK 세포의 살해 기능을 회피하기 위해 이용한다. 상기 독특한 활성화된 NK, 또는 aNK, 세포는 이들 억제 수용체가 결여되는 반면, 질환에 걸린 세포의 선택적 표적화 및 살해를 가능하게 하는 수용체 활성화의 광범위 어레이를 보유한다. aNK 세포는 또한 다량의 적재량의 그랜자임 (granzyme) 및 퍼포린 (perforin) 함유 과립을 가지므로, 이에 의해 치명적인 효소의 훨씬 더 많은 적재량을 다중 표적에 전달하도록 할 수 있다.
2. taNK 세포
키메라성 항원 수용체 (CAR) 기술은 현재 개발중인 가장 신규한 암 요법 접근법 중 하나이다. CAR 은 면역 효과기 세포가 특정 표면 항원 (표적-활성화 자연 살해) 을 나타내는 암 세포를 표적하도록 하는 단백질이고, aNK 세포를 암에서 발견되는 단백질에 표적하도록 하나 이상의 CAR 로 조작한 다음, 넓은 스펙트럼의 CAR 로 통합되는 플랫폼이다. 상기 전략은 특히 확장성, 품질 관리 및 일관성의 관점에서, 환자 또는 기증자 출처의 효과기 세포, 예컨대 자가 T-세포를 사용하는 다른 CAR 접근법에 비해 많은 장점을 갖는다.
많은 암 세포 살해는 효과기 면역 세포가 항체에 부착되고, 이것이 차례로 표적 암 세포에 결합되어, 효과기 세포에 의한 암의 살해를 용이하게 하는 ADCC (항체 의존성 세포-매개 세포독성) 에 의존한다. NK 세포는 ADCC 를 위해 체내 핵심 효과기 세포이며, 항체에 결합하는 전문화된 수용체 (CD16) 를 이용한다.
3. haNK 세포
연구는 아마도 인간 집단의 단지 20% 만이 CD16 의 "고-친화성" 변이체 (haNK 세포) 를 균일하게 발현하는데, 이것이 "저-친화성" CD16 을 가진 환자에 비해 좀더 호의적인 치료 결과와 강하게 연관되는 것을 보여준다. 부가적으로, 많은 암 환자는 화학요법, 질환 그 자체 또는 다른 인자로 인해 면역계가 심각하게 약화되었다.
특정 양상에서, NK 세포는 고-친화성 CD16 (haNK 세포) 를 발현하도록 개질된다. 이와 같이, haNK 세포는 암 세포에 대항하는 넓은 스펙트럼의 항체의 치료 효능을 강력하게 할 수 있다.
IX. 조합 요법
전반적으로 기술된 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터-기반 백신화를 포함하는 조성물은 약학 의약으로 제형화될 수 있고 이를 필요로 하는 또는 질환, 예를 들어, 암이 있는 것으로 진단된 인간 또는 포유동물을 치료하는데 사용될 수 있다. 이들 의약은 인간 또는 포유동물에 대해 하나 이상의 부가적인 백신 또는 기타 암 요법과 함께 공동-투여될 수 있다.
특정 양상에서, 본원에 기재된 의약은 유방암에 대한 하나 이상의 이용가능한 요법, 예를 들어, 통상의 암 요법, 예컨대 수술, 방사선 요법 또는 의약, 예컨대 호르몬 차단 요법, 화학요법 또는 모노클로날 항체와 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 백신 (예를 들어, Ad5[E1-, E2b-]-HER3) 은 저 용량 화학요법 또는 저 용량 방사선과 조합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 백신 (예를 들어, Ad5[E1-, E2b-]-HER3) 은 화학요법과 조합될 수 있고, 투여되는 화학요법의 용량은 관리의 임상 표준보다 낮다. 일부 구현예에서, 화학요법은 시클로포스파미드일 수 있다. 시클로포스파미드는 관리 투여의 임상 표준보다 낮은 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 화학요법은 총 8 주 동안, 매 2 주 1-5 및 8-12 일에 50 mg 1 일 2 회 (BID) 로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 백신 (예를 들어, Ad5[E1-, E2b-]-HER3) 은 방사선과 조합될 수 있고, 투여되는 방사선의 용량은 관리의 임상 표준보다 낮다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 8 Gy 로의 공존 정위 몸체 방사선요법 (SBRT) 이 제 8, 22, 36, 50 일 (4 투여량에 대해 매 2 주) 에 제공될 수 있다. 방사선은 SBRT 를 사용하여 모든 실현가능한 종양 부위에 투여될 수 있다.
특정 양상에서, 유방암 치료에 사용되는 의약은 호르몬-차단제, 화학요법, 및 모노클로날 항체를 포함한다. 일부 유방암은 계속 성장하기 위해 에스트로겐을 필요로 한다. 이들은 이들 표면 상에 에스트로겐 수용체 (ER+) 및 프로게스테론 수용체 (PR+) (종종 함께 호르몬 수용체라고 불림) 의 존재에 의해 확인될 수 있다. 이들 ER+ 암은 수용체를 차단하는 약물, 예를 들어, 타목시펜, 또는 대안적으로 아로마타아제 억제제로의 에스트로겐의 생산을 차단하는 약물, 예를 들어, 아나스트로졸 또는 레트로졸로 치료될 수 있다. 타목시펜의 사용은 10 년 동안 권고된다. 아로마타아제 억제제는 폐경 후 여성에게 유용하나; 이 그룹에서, 이들은 타목시펜보다 양호한 것으로 보인다. 이것은 폐경 후 여성에서의 활성 아로마타아제가 폐경 전 여성에서 일반적인 형태와는 상이하므로, 이들 작용제는 폐경 전 여성의 우세한 아로마타아제를 억제하는데는 효과가 없기 때문이다.
화학요법은 대부분 2-4 병기의 유방암의 경우에 사용되고, 특히 에스트로겐 수용체-음성 (ER-) 질환에서 유리하다. 화학요법 의약은, 통상 3-6 개월의 기간 동안, 조합으로 투여된다. "AC" 로 알려져 있는 가장 흔한 섭생 중 하나는 시클로포스파미드와 독소루비신을 조합한다. 종종 탁산 약물, 예컨대 도세탁셀 (Taxotere) 을 첨가하고, 섭생은 그러면 "CAT" 로 알려져 있다. 또다른 통상의 치료는 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 및 플루오로우라실 (또는 "CMF") 이다. 대부분의 화학요법 의약은 복제시 DNA 손상을 야기함으로써 또는 다른 메커니즘에 의해, 빠르게-성장하는 및/또는 빠르게-복제하는 암 세포를 파괴함으로써 작동한다. 그러나, 의약은 또한 빠르게-성장하는 정상 세포에도 손상을 주어, 이것이 심각한 부작용을 일으킬 수 있다. 심장 근육에 대한 손상이 예를 들어, 독소루비신의 가장 위험한 합병증이다.
HER2/neu 는 모노클로날 항체 트라스투주맙 (허셉틴 (Herceptin) 으로서 시판됨) 의 표적이다. HER2/neu (특히 일부 유방암 세포에서 활성인 세포 수용체) 에 대한 모노클로날 항체인 트라스투주맙은, 1-3 병기 HER2/neu-양성 유방암의 5-년 질환 무진행 생존률을 약 87% (전체 생존률 95%) 까지 개선하였다. 1 년의 트라스투주맙 요법은 또한 화학요법을 받고 있는 HER2/neu-양성 유방암을 가진 모든 환자에게 권고된다.
특정 성장 인자에 의해 자극되는 경우, HER2/neu 는 세포 성장 및 분열을 야기한다; 성장 인자에 의한 자극의 부재하에, 세포는 정상적으로 성장을 중단한다. 유방암의 25% 내지 30% 에서 HER2/neu 유전자 또는 이의 단백질 생성물이 과발현되고, 유방암에서 HER2/neu 의 과발현은 증가된 질환 재발 및 열악한 예후와 연관된다. 트라스투주맙이 수용체를 과발현하는 유방암 세포에서의 HER2/neu 에 결합하면, 트라스투주맙이 성장 인자가 수용체에 결합하여 이를 자극할 수 있는 것을 방해하고, 효과적으로 암 세포의 성장을 차단한다. HER2/neu 에 대한 트라스투주맙 결합의 중요한 다운스트림 효과는 세포 증식을 중단시키는 단백질인 p27 에서의 증가이다. 따라서, 트라스투주맙은 HER2/neu 증폭/과발현을 가진 유방암 환자에서 유용하다.
HER2/neu 및 HER3 수용체의 이량체화를 억제하는 또다른 모노클로날 항체인, 페투주맙 (Pertuzumab) 은 2012 년 6 월에 트라스투주맙과 조합으로의 사용에 대해 FDA 에 의해 승인되었다.
부가적으로, NeuVax (Galena Biopharma) 는 "살해" T 세포가 HER2/neu 를 발현하는 암 세포를 표적하고 파괴하도록 하는 펩티드-기반 면역요법이다. 이것은 제 3 상 임상 시험에 들어갔다.
ER-/ HER2/neu+ 유방암과 비교하여 ER+ (에스트로겐 수용체 양성)/ HER2/neu+ 를 가진 환자는 PI3K/AKT 분자 경로를 억제하는 약물로부터 좀더 실제로 이득을 얻을 수 있다는 것이 발견되었다.
HER2/neu 의 과-발현은 또한 다른 유전자의 증폭에 의해 억제될 수 있다. 유전자가 상기 원하는 효과를 가질 수 있는 지를 발견하기 위해 연구가 현재 계속되고 있다.
HER2/neu 의 발현은 에스트로겐 수용체를 통한 신호에 의해 조절된다. 통상, 에스트로겐 수용체를 통해 작용하는 에스트라디올 및 타목시펜은 HER2/neu 의 발현을 하향-조절한다. 그러나, 공동활성인자 AIB-3 의 비가 공동억제인자 PAX2 의 비를 초과하는 경우, HER2/neu 의 발현은 타목시펜의 존재 하에 상향조절되어, 타목시펜-저항성 유방암을 도출한다.
특정 양상에서, 본원에 기재된 이들 의약은 본원에 기재된 하나 이상의 통상의 암 요법 또는 대안적인 암 요법 또는 면역 경로 체크포인트 조절제와 함께 조합될 수 있다. 아데노바이러스 벡터-기반 의약을 수반하는 조합 요법은 임의의 암, 특히, 유방암, 또는 절제불가능, 국부 진행성, 또는 전이성 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
통상의 암 요법은 화학적 또는 방사선 기반 치료 및 수술의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다. 화학요법은 예를 들어, 시스플라틴 (CDDP), 카르보플라틴, 프로카바진, 메클로레타민, 시클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부술판, 니트로소우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 필리코마이신, 마이토마이신, 에토포시드 (VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 택솔, 겜시타빈, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스페라아제 억제제, 트랜스플라티늄, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 또는 상기의 임의의 유사체 또는 유도체 변이체를 포함한다.
DNA 손상을 일으키고 광범위하게 사용되어온 방사선 요법은 γ-선, X-선, 및/또는 종양 세포에 대한 방사성동위원소의 지정된 전달로서 통상 공지된 것들을 포함한다. DNA 손상 인자의 다른 형태, 예컨대 마이크로파 및 UV-조사와 같은 것도 또한 고려된다. 이들 인자 모두가 DNA, DNA 의 전구체, DNA 의 복제 및 복구, 및 염색체의 어셈블리 및 유지에 대한, 광범위한 손상에 영향을 주는 것 같다. X-선에 대한 투여량 범위는 연장된 시간 기간 (3 내지 4 wk) 동안 50 내지 200 뢴트겐의 일일 투여량, 내지 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 투여량의 범위이다. 방사성동위원소에 대한 투여량 범위는 널리 가변적이며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 세기 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 섭취에 따라 다르다.
용어 "접촉된" 및 "노출된" 은 세포에 적용되는 경우, 치료 구축물 및 화학치료제 또는 방사성치료제가 표적 세포에 전달되거나 또는 표적 세포와의 직접 병치로 위치하는 방법을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 세포 살해 또는 정체를 달성하기 위해, 두 작용제는 세포를 살해하거나 이것이 분할되는 것을 방지하기에 효과적인 조합된 양으로 세포에게 전달된다.
암을 가진 사람의 대략 60% 는 일부 유형의 수술을 겪을 것이고, 이것은 예방적, 진단적 또는 병기적 (staging), 치유적 및 임시적 수술을 포함한다. 치유적 수술은 다른 요법, 예컨대 본원에 기재된 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대안적 요법과 조합으로 사용될 수 있는 암 치료이다.
치유적 수술은 암성 조직의 모두 또는 일부를 물리적으로, 제거, 절단, 및/또는 파괴하는 절제를 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 말한다. 종양 절제 외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경 통제 수술 (Mohs' 수술) 을 포함한다. 본원에 기재된 치료 방법은 표면적 암, 전암, 또는 부수적인 양의 정상 조직의 제거와 함께 사용될 수 있다는 것이 추가로 고려된다.
암성 세포, 조직, 또는 종양의 일부 또는 모두 절단 시에, 공동이 신체 내에 형성될 수 있다. 치료는 부가적인 항-암 요법으로 영역의 관류, 직접 주사 또는 국부 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일, 또는 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 주 또는 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개월 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 투여량이 변화될 수 있다.
대안적인 암 요법은 수술, 화학요법 및 방사선 요법, 예컨대 면역요법, 유전자 요법, 호르몬 요법 외의 임의의 암 요법 또는 이의 조합을 포함한다. 본 방법을 사용하여 열악한 예후로 확인된 대상은 통상의 치료(들) 단독에 대해 호의적인 반응을 가질 수 없고, 하나 이상의 대안적인 암 요법 단독으로 또는 하나 이상의 통상의 치료와 조합으로 처방되거나 투여될 수 있다.
면역요법은 일반적으로 암 세포를 표적 및 파괴하기 위한 면역 효과기 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 면역 효과기는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체 단독은 요법의 효과기로서 담당할 수 있거나 이것은 세포 살해에 실제로 영향을 주기 위해 다른 세포를 모집할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학요법, 방사성핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등) 에 콘쥬게이션되고 단지 표적화제로서 담당할 수 있다. 대안적으로, 효과기는 종양 세포 표적에, 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 가지고 있는 림프구일 수 있다. 다양한 효과기 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
유전자 요법은 질환을 치료하기 위한 DNA 또는 RNA 를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 대상의 세포 및 조직 내로의 삽입이다. 안티센스 요법은 또한 유전자 요법의 형태이다. 치료 폴리뉴클레오티드는 첫번째 암 요법 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여될 수 있다. 다양한 단백질을 엔코딩하는 벡터의 전달이 일부 구현예에 제공된다. 예를 들어, 외인성 종양 억제인자 암유전자의 세포 발현은 과도한 세포 증식, 예컨대 p53, p16 및 C-CAM 을 억제하는 기능을 발휘할 것이다.
치료의 치료 효능을 개선하는데 사용되는 부가적인 작용제는 면역조절제, 세포 표면 수용체 및 GAP 접합점의 상향조절에 영향을 주는 작용제, 세포증식억제 및 분화 작용제, 세포 부착 억제제, 또는 세포사멸 유도자에 대한 과증식성 세포의 민감성 증가제를 포함한다. 면역조절제는 종양 괴사 인자; 인터페론 알파, 베타, 및 감마; IL-2 및 기타 사이토카인; F42K 및 기타 사이토카인 유사체; 또는 MIP-1, MIP-1beta, MCP-1, RANTES, 및 기타 케모카인을 포함한다. 추가로 세포 표면 수용체 또는 이들의 리간드, 예컨대 Fas / Fas 리간드, DR4 또는 DR5 / TRAIL 의 상향조절은 과증식성 세포에 대한 자가분비 또는 주변분비 효과의 달성에 의한 세포사멸 유도 능력을 강화시킬 것으로 고려된다. GAP 접합점의 수를 증가시킴으로써 세포간 신호 증가가 이웃하는 과증식성 세포 집단에 대한 항-과증식성 효과를 증가시킬 것이다. 다른 구현예에서, 세포증식억제 및 분화 작용제는 치료의 항-과증식성 효능을 개선하기 위해 본원에 기재된 약학 조성물과 조합으로 사용될 수 있다. 세포 부착 억제제는 본원에 기재된 약학 조성물의 효능을 개선하기 위해 고려된다. 세포 부착 억제제의 예는 초점 접착 키나아제 (FAK) 억제제 및 로바스타틴 (Lovastatin) 이다. 추가로 세포사멸에 대한 과증식성 세포의 민감성을 증가시키는 다른 작용제, 예컨대 항체 c225 가 치료 효능을 개선하기 위해 본원에 기재된 약학 조성물과 조합으로 사용될 수 있을 것으로 고려된다.
호르몬 요법은 또한 이전에 기재된 임의의 다른 암 요법과 조합으로 사용될 수 있다. 호르몬의 사용은 특정 호르몬, 예컨대 테스토스테론 또는 에스트로겐의 레벨을 저하시키거나 이의 효과를 차단하기 위해 특정 암, 예컨대 유방, 전립선, 난소, 또는 자궁경부암의 치료에서 이용될 수 있다. 상기 치료는 종종 전이의 위험을 감소시키기 위해 또는 치료 옵션으로서 적어도 하나의 기타 암 요법과 조합으로 사용된다.
"화학치료제" 또는 "화학치료 화합물" 및 본원에 사용되는 바와 같은 이들의 문법적 등가물은, 암의 치료에 유용한 화학 화합물일 수 있다. 기재된 T 세포와 조합으로 사용될 수 있는 화학치료 암 작용제는 제한 없이, 유사분열 억제제 (빈카 알칼로이드). 이들은 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 나벨빈™ (비노렐빈,5'-노란히드로블라스틴) 을 포함한다. 다른 구현예에서, 화학치료 암 작용제는 토포이소머라아제 I 억제제, 예컨대 캄프토테신 화합물을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은, "캄프토테신 화합물" 은 Camptosar™ (이리노테칸 HCL), Hycamtin™ (토포테칸 HCL) 및 캄프토테신으로부터 유도된 기타 화합물 및 이의 유사체를 포함한다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 화학치료 암 작용제의 또다른 카테고리는 포도필로톡신 유도체, 예컨대 에토포시드, 테니포시드 및 미토포도지드이다.
특정 양상에서, 본원에 기재된 방법 또는 조성물은 추가로 종양 세포 내의 유전 물질을 알킬화시키는, 알킬화제로서 알려진 기타 화학치료 암 작용제의 용도를 포함한다. 이들은 제한 없이, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포라미드, 카무스틴, 부술판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 및 다카르바진을 포함한다. 본 명세서는 화학치료제로서 항대사물질을 포함한다. 이들 유형의 작용제의 예는 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨린, 아자티오프라임, 및 프로카바진을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 화학치료 암 작용제의 부가적인 카테고리는 항생제를 포함한다. 예는 제한 없이, 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 마이토마이신, 마이토마이신 C, 및 다우노마이신을 포함한다. 이들은 이들 화합물에 대해 시판 이용가능한 수많은 리포좀 제형이다. 특정 양상에서, 본원에 기재된 방법 또는 조성물은 추가로 제한 없이 항-종양 항체, 다카르바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, 이포스파미드 및 미톡산트론을 포함하는 기타 화학치료 암 작용제의 사용을 포함한다.
본원에 기재된 아데노바이러스 백신은 세포독성/항신생물 작용제 및 항-혈관신생 작용제를 포함하는, 기타 항-종양 작용제와 조합으로 투여될 수 있다. 세포독성/항-신생물 작용제는 암 세포를 공격하고 살해하는 작용제로서 정의될 수 있다. 일부 세포독성/항-신생물 작용제는 종양 세포 내의 유전 물질을 알킬화하는 알킬화제, 예를 들어, 시스-플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포라미드, 카무스틴, 부술판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 및 다카바진일 수 있다. 다른 세포독성/항-신생물 작용제는 종양 세포에 대한 항대사물질, 예를 들어, 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨린, 아자티오프라임, 및 프로카바진일 수 있다. 다른 세포독성/항-신생물 작용제는 항생제, 예를 들어, 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 마이토마이신, 마이토마이신 C, 및 다우노마이신일 수 있다. 이들 화합물에 대해 시판 이용가능한 수많은 리포좀 제형이 있다. 또 다른 세포독성/항-신생물 작용제는 유사분열 억제제 (빈카 알칼로이드) 일 수 있다. 이것은 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 에토포시드를 포함한다. 기타 세포독성/항-신생물 작용제는 택솔 및 이의 유도체, L-아스파라기나아제, 항-종양 항체, 다카르바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, VM-26, 이포스파미드, 미톡산트론, 및 빈데신을 포함한다.
CAR T 세포, T 세포 수용체 조작된 T 세포, B 세포 수용체 조작된 세포의 집단(들) 을 포함하는 부가적인 제형은 본원에 기재된 약학 조성물의 투여와 함께, 전 또는 후에 대상에게 투여될 수 있다. 양자 이송된 세포의 치료적으로-효과적인 집단이 본원에 기재된 방법이 실시되는 경우 대상에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 약 1 x 104 내지 약 1 x 1010 CAR T 세포, T 세포 수용체 조작된 세포, 또는 B 세포 수용체 조작된 세포를 포함하는 제형이 투여된다. 일부 경우에서, 제형은 약 1 x 105 내지 약 1 x 109 조작된 세포, 약 5 x 105 내지 약 5 x 108 조작된 세포, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 107 조작된 세포를 포함한다. 그러나, 대상에게 투여되는 조작된 세포의 수는 암의 위치, 출처, 일치성, 범위 및 중증도, 치료되는 대상의 연령 및 상태 등에 따라, 넓은 제한 사이에서 다양할 것이다. 의사는 궁극적으로 사용되는 적합한 투여량을 결정할 것이다.
항-혈관신생 작용제가 또한 사용될 수 있다. 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 적합한 항-혈관신생 작용제는 항-VEGF 항체 (인간화된 및 키메라성 항체 포함), 항-VEGF 앱타머 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 혈관신생의 다른 억제제는 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인터페론, 인터류킨 1 (α 및 β 를 포함) 인터류킨 12, 레티노산, 및 메탈로프로테아제-1 및 -2 의 조직 억제제 (TIMP-1 및 -2) 를 포함한다. 토포이소머라아제 예컨대 라족산, 항-혈관신생 활성을 갖는 토포이소머라아제 II 억제제를 포함하는 소형 분자가 또한 사용될 수 있다.
일부 경우에서, 예를 들어, 암을 치료하는 조성물, 제형 및 방법에서, 투여되는 조성물 또는 제형의 단위 투여량은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mg, 또는 그로부터 유래되는 임의의 사이 값 또는 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 투여되는 조성물 또는 제형의 총 양은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g, 또는 그로부터 유래되는 임의의 사이 값 또는 범위일 수 있다.
X. 면역학적 융합 파트너 항원 표적
본원에 기재된 바이러스 벡터 또는 조성물은 표적 항원 예컨대 HER2/neu, 또는 본원에 기재된 임의의 기타 표적 항원의 면역원성을 증가시킬 수 있는 단백질, 또는 "면역학적 융합 파트너" 를 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 단백질을 함유하는 바이러스 벡터로의 면역화 후 생성되는 단백질은 관심의 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 단백질에 융합된 관심의 표적 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 게다가, HER2/neu 및 면역학적 융합 파트너를 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터로의 조합 요법은 면역 반응의 부스트를 산출할 수 있고, 두 치료 모이어티의 조합은 HER2/neu 단독, 또는 면역학적 융합 파트너 단독에 대해 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터보다 면역 반응을 시너지적으로 부스트하는 작용을 한다. 예를 들어, HER2/neu 및 면역학적 융합 파트너를 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터로의 조합 요법은 항원-특이적 효과기 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극, 감염된 세포 살해에 대항하여 지정되는 NK 세포 반응의 자극, 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용 (ADCP) 메커니즘, 또는 이의 임의의 조합을 통한 감염된 세포 살해에 대항하여 지정되는 호중구 또는 단핵구 세포 반응의 자극의 시너지적 향상을 산출할 수 있다. 상기 시너지적 부스트는 이를 필요로 하는 대상에 대한 투여 후 생존 결과를 크게 개선할 수 있다. 특정 구현예에서, HER2/neu 및 면역학적 융합 파트너를 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터로의 조합 요법은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상에서 약 1.5 내지 20, 또는 그 이상의 배수의 표적 항원-특이적 CTL 활성의 증가를 포함하는 면역 반응 생성을 도출할 수 있다. 또다른 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 HER2/neu 항원 및 면역학적 융합 파트너를 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터가 투여된 대상에서 약 1.5 내지 20, 또는 그 이상의 배수의 표적-특이적 CTL 활성의 증가를 포함한다. 추가 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 약 1.5 내지 20, 또는 그 이상의 배수의, 사이토카인 분비, 예컨대 인터페론-감마 (IFN-γ), 인터류킨-2 (IL-2), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 또는 기타 사이토카인을 측정하는 ELISpot 어세이에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원-특이적 세포-매개 면역성 활성의 증가를 포함한다. 추가 구현예에서, 면역 반응 생성은 적합한 대조군과 비교하여 본원에 기재된 HER2/neu 항원 및 면역학적 융합 파트너를 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터를 투여한 대상에서 1.5 내지 5 배의 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다. 또다른 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상에서 약 1.5 내지 20, 또는 그 이상의 배수의, 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다.
부가적인 예로서, 표적 에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터로의 조합 요법은 항원-특이적 효과기 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극, 감염된 세포 살해에 대항하여 지정되는 NK 세포 반응의 자극, 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용 (ADCP) 메커니즘, 또는 이의 임의의 조합을 통한 감염된 세포 살해에 대항하여 지정되는 호중구 또는 단핵구 세포 반응의 자극의 시너지적 향상을 산출할 수 있다. 상기 시너지적 부스트는 이를 필요로 하는 대상에 대한 투여 후 생존 결과를 크게 개선할 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터의 조합 요법은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상에서 약 1.5 내지 20, 또는 그 이상의 배수의 표적 항원-특이적 CTL 활성의 증가를 포함하는 면역 반응 생성을 도출할 수 있다. 또다른 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 표적 에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터가 투여된 대상에서 약 1.5 내지 20, 또는 그 이상의 배수의 표적-특이적 CTL 활성의 증가를 포함한다. 추가 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 약 1.5 내지 20, 또는 그 이상의 배수의, 사이토카인 분비, 예컨대 인터페론-감마 (IFN-γ), 인터류킨-2 (IL-2), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 또는 기타 사이토카인을 측정하는 ELISpot 어세이에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원-특이적 세포-매개 면역성 활성의 증가를 포함한다. 추가 구현예에서, 면역 반응 생성은 적합한 대조군과 비교하여 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상에서 1.5 내지 5 배의 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다. 또다른 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상에서 약 1.5 내지 20, 또는 그 이상의 배수의, 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다.
하나의 구현예에서, 이러한 면역학적 융합 파트너는 마이코박테리움 종 (Mycobacterium sp.) 으로부터 유래된다, 예컨대 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)-유래된 Ra12 단편이다. 마이코박테리움 종 (Mycobacterium sp.) 으로부터 유래된 면역학적 융합 파트너는 SEQ ID NO: 35 - SEQ ID NO: 43 에 언급된 서열 중 임의의 하나일 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열의 발현 및/또는 면역원성을 향상시키는데 사용하기 위한 Ra12 조성물 및 방법은 그 전체가 참고로서 본원에 인용되는, 미국 특허 제 7,009,042 호에 기재된다. 간략하게는, Ra12 는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) MTB32A 핵산의 서브서열인 폴리뉴클레오티드 영역을 말한다. MTB32A 는 M. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis) 의 독성 및 무독성 균주에서의 유전자에 의해 엔코딩된 32 kDa 의 세린 프로테아제이다. MTB32A 의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 기재된다 (예를 들어, 미국 특허 제 7,009,042 호 참고; Skeiky et al., Infection and Immun. 67:3998-4007 (1999), 그 전체가 본원에 참고로서 인용됨). MTB32A 코딩 서열의 C-말단 단편은 높은 레벨로 발현될 수 있고 정제 방법 내내 가용성 폴리펩티드로서 남아있을 수 있다. 게다가, Ra12 는 그것이 융합되는 이종 면역원성 폴리펩티드의 면역원성을 향상시킬 수 있다. Ra12 융합 폴리펩티드는 MTB32A 의 아미노산 잔기 192 내지 323 에 상응하는 14 kDa C-말단 단편을 포함할 수 있다. 다른 Ra12 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 Ra12 폴리펩티드의 일부를 엔코딩하는 적어도 약 15, 30, 60, 100, 200, 300 개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오티드는 고유 서열 (즉, Ra12 폴리펩티드를 엔코딩하는 내인성 서열 또는 이의 일부) 을 포함할 수 있거나, 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오티드 변이체는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있으며, 엔코딩된 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성은 고유의 Ra12 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드에 비해 실질적으로 약화되지 않는다. 변이체는 고유의 Ra12 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부에 적어도 약 70%, 80%, 또는 90% 일치성, 또는 그 이상을 가질 수 있다.
특정 양상에서, 면역학적 융합 파트너는 그람-음성 박테리아 하에모필루스 인플루엔자에 B (Haemophilus influenzae B) 의 표면 단백질인 단백질 D 로부터 유래될 수 있다. 단백질 D 로부터 유래되는 면역학적 융합 파트너는 SEQ ID NO: 44 에 언급되는 서열일 수 있다. 일부 경우에서, 단백질 D 유도체는 대략 단백질의 첫번째 3 분의 1 (예를 들어, 첫번째 N-말단 100-110 아미노산) 을 포함한다. 단백질 D 유도체가 지질화될 수 있다. 특정 구현예에서, 지단백질 D 융합 파트너의 첫번째 109 개 잔기가 N-말단 상에 포함되어 부가적인 외인성 T-세포 에피토프를 가진 폴리펩티드를 제공하며, 이것은 E. 콜라이 (E. coli) 중의 발현 레벨을 증가시킬 수 있으며, 발현 인핸서로서 기능할 수 있다. 지질 꼬리는 항원의 항원 제시 세포에 대한 최적의 제시를 확보할 수 있다. 다른 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스로부터의 비-구조적 단백질, NS1 (헤마글루티닌) 을 포함할 수 있다. 전형적으로, N-말단 81 개의 아미노산이 사용될 수 있지만, T-헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편이 사용될 수 있다.
특정 양상에서, 면역학적 융합 파트너는 LYTA 로서 공지된 단백질, 또는 이의 일부 (특히 C-말단 부분) 일 수 있다. LYTA 로부터 유래되는 면역학적 융합 파트너는 SEQ ID NO: 45 에 언급되는 서열일 수 있다. LYTA 는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae) 로부터 유래되고, 이것은 아미다아제 LYTA (LytA 유전자에 의해 엔코딩됨) 로서 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다아제를 합성한다. LYTA 는 펩티도글리칸 백본 중의 특정 결합을 특이적으로 분해하는 오토라이신이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 일부 콜린 유사체, 예컨대 DEAE 에 대한 친화성을 담당한다. 상기 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 플라스미드를 발현하는 E. 콜라이 C-LYTA 의 발달에 이용하였다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 사용될 수 있다. 또다른 구현예에서, LYTA 의 반복 부분은 융합 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 반복 부분은 예를 들어, 잔기 178 에서 출발하는 C-말단 영역에서 발견될 수 있다. 하나의 특정 반복 부분은 잔기 188-305 를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 항원은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF 의 군으로부터 선택되는 사이토카인을 포함하는, "면역원성 성분" 으로서 또한 본원에 언급되는 면역학적 융합 파트너에 융합된다. 표적 항원 융합은 IFN-γ, TNFα IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF 중 하나 이상에 대한 실질적인 일치성을 갖는 단백질을 제조할 수 있다. 표적 항원 융합은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF 중 하나 이상에 대한 실질적인 일치성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 핵산을 엔코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원 융합은 추가로 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF 의 군으로부터 선택되는 사이토카인을 포함하는, "면역원성 성분" 으로서 또한 본원에 언급되는 하나 이상의 면역학적 융합 파트너를 포함한다. IFN-γ 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 46 에 언급되는 서열일 수 있다. TNFα 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 47 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-2 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 48 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-8 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 49 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-12 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 50 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-18 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 51 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-7 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 52 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-3 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 53 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-4 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 54 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-5 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 55 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-6 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 56 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-9 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 57 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-10 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 58 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-13 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 59 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-15 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 60 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-16 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 87 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-17 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 88 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-23 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 89 에 언급되는 서열일 수 있다. IL-32 의 서열은 제한 없이, SEQ ID NO: 90 에 언급되는 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 항원은 IFN-γ, TNFα IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, , IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF 의 군으로부터 선택되는 사이토카인을 포함하는, "면역원성 성분" 으로서 또한 본원에 언급되는 면역학적 융합 파트너에 융합되거나 이에 연결된다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 IFN-γ, TNFα IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF 의 군으로부터 선택되는 사이토카인을 포함하는, "면역원성 성분" 으로서 또한 본원에 언급되는 면역학적 융합 파트너와 함께 세포에서 공동-발현된다.
일부 구현예에서, 표적 항원은 CpG ODN (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 61 에 제시된다), 콜레라 독소 (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 62 에 제시된다), 박테리아 ADP-리보실화 외독소 유래의 절단된 A 서브유닛 코딩 영역 (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 63 에 제시된다), 박테리아 ADP-리보실화 외독소 유래의 절단된 B 서브유닛 코딩 영역 (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 64 에 제시된다), Hp91 (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 65 에 제시된다), CCL20 (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 66 에 제시된다), CCL3 (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 67 에 제시된다), GM-CSF (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 68 에 제시된다), G-CSF (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 69 에 제시된다), LPS 펩티드 모방체 (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 70 - SEQ ID NO: 81 에 제시된다), 시가 독소 (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 82 에 제시된다), 디프테리아 독소 (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 83 에 제시된다), 또는 CRM197 (비-제한적인 예시 서열은 SEQ ID NO: 86 에 제시된다) 을 포함하는, 면역학적 융합 파트너에 융합되거나 이에 연결된다.
일부 구현예에서, 표적 항원은 IL-15 과작동제를 포함하는, 면역학적 융합 파트너에 융합되거나 이에 연결된다. 인터류킨 15 (IL-15) 는 바이러스 감염 후 분비되는 자연 발생적 염증성 사이토카인이다. 분비된 IL-15 는 효과기 면역 세포 상의 이의 동족 (cognate) 수용체를 통해 신호를 전달함으로써 이의 기능을 수행할 수 있고, 따라서 효과기 면역 세포 활성의 전반적인 향상을 도출할 수 있다.
세포 면역 반응을 자극하고 유지하는 IL-15 의 광범위한 능력에 기반하여, 이것은 특정 암을 잠재적으로 치유할 수 있는 유망한 면역요법 약물인 것으로 여겨진다. 그러나, IL-15 의 임상적 개발에 주요한 제한은 표준 포유류 세포 발현 시스템에서의 낮은 생산 수율 및 짧은 혈청 반감기를 포함할 수 있다. 게다가, 유리 IL-15 사이토카인보다는 동일한 세포에 의해 공동-발현되는 단백질을 포함하는 IL-15:IL-15Rα 복합체는, IL-15 βγc 수용체를 가지고 있는 면역 효과기 세포를 자극하는 것을 담당할 수 있다.
이들 단점을 상대하기 위해, 신규한 IL-15 과작동제 돌연변이체 (IL-15N72D) 는 증가된 IL-15Rβγc 에 결합하는 능력 및 향상된 생물학적 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 마우스 또는 인간 IL-15Rα 및 Fc 융합 단백질 (면역글로불린의 Fc 영역) 의 등몰 농도의 IL-15N72D 에 대한 첨가는 IL-15 생물학적 활성에서의 추가 증가를 제공할 수 있으며, IL-15N72D:IL-15Rα/Fc 과-작동제 복합체가 자유 IL-15 사이토카인보다 10 배 초과 낮은 IL-15-의존성 세포 성장을 지지하기 위한 중간 유효 농도 (EC50) 를 나타내는 것이다.
일부 구현예에서, IL-15 과작동제는 신규한 IL-15 과작동제 돌연변이체 (IL-15N72D) 일 수 있다. 특정 구현예에서, 마우스 또는 인간 IL-15Rα 및 Fc 융합 단백질 (면역글로불린의 Fc 영역) 의 등몰 농도의 IL-15N72D 에 대한 첨가는 IL-15 생물학적 활성에서의 추가 증가를 제공할 수 있으며, IL-15N72D:IL-15Rα/Fc 과-작동제 복합체가 유리 IL-15 사이토카인보다 10 배 초과 낮을 수 있는 IL-15-의존성 세포 성장을 지지하기 위한 중간 유효 농도 (EC50) 를 나타내는 것이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 유리 IL-15 사이토카인보다 2-배 초과 낮은, 3-배 초과 낮은, 4-배 초과 낮은, 5-배 초과 낮은, 6-배 초과 낮은, 7-배 초과 낮은, 8-배 초과 낮은, 9-배 초과 낮은, 10-배 초과 낮은, 15-배 초과 낮은, 20-배 초과 낮은, 25-배 초과 낮은, 30-배 초과 낮은, 35-배 초과 낮은, 40-배 초과 낮은, 45-배 초과 낮은, 50-배 초과 낮은, 55-배 초과 낮은, 60-배 초과 낮은, 65-배 초과 낮은, 70-배 초과 낮은, 75-배 초과 낮은, 80-배 초과 낮은, 85-배 초과 낮은, 90-배 초과 낮은, 95-배 초과 낮은, 또는 100-배 초과 낮은 IL-15-의존성 세포 성장을 지지하기 위한 EC50 을 갖는 IL-15N72D:IL-15Rα/Fc 과-작동제 복합체를 제공한다.
일부 구현예에서, IL-15 과작동제는 또한 ALT-803 으로서 알려진, 가용성 IL-15Rα/Fc 융합 단백질의 이량체 및 2 개의 IL-15N72D 분자의 생물학적으로 활성인 단백질 복합체이다. ALT-803 의 조성물 및 ALT-803 의 제조 및 사용 방법은, 본원에 참고로서 인용된 미국 특허 출원 공개 2015/0374790 에 기재된다. N 말단에 소위 "스시" 도메인 (Su) 을 함유하는 가용성 IL-15Rα 단편이, 고 친화성 사이토카인 결함을 담당하는 구조 요소 대부분을 가질 수 있는 것으로 알려져 있다. 가용성 융합 단백질은 인간 IL-15RαSu 도메인 (성숙 인간 IL-15Rα 단백질의 아미노산 1-65) 을 Fc 도메인을 함유하는 인간 IgG1 CH2-CH3 영역 (232 개 아미노산) 과 연결시킴으로써 생성될 수 있다. 상기 IL-15RαSu/IgG1 Fc 융합 단백질은 IgG1 도메인을 통한 디술피드 결합을 통한 이량체 형성 및 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하는 정제의 용이성의 장점을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, ALT-803 은 이량체성 IL-15Rα 스시 도메인/인간 IgG1 Fc 융합 단백질에 고 친화성으로 연관되는 인간 IL-15 변이체의 2 단백질 서브유닛으로 이루어지는 가용성 복합체를 가질 수 있다. IL-15 변이체는 헬릭스 C 의 위치 72 에서의 Asn 에서 Asp 치환 (N72D) 을 가진 성숙 인간 IL-15 사이토카인 서열을 포함하는 114 개 아미노산 폴리펩티드이다. 인간 IL-15R 스시 도메인/인간 IgG1 Fc 융합 단백질은 Fc 도메인을 함유하는 인간 IgG1 CH2-CH3 영역 (232 개 아미노산) 에 연결된 IL-15R 서브유닛의 스시 도메인 (성숙 인간 IL-15Rα 단백질의 아미노산 1- 65) 을 포함한다. N72D 치환 외에, 모든 단백질 서열은 인간이다. 서브유닛의 아미노산 서열에 기반하여, 2 개의 IL-15N72D 폴리펩티드 (예시 IL-15N72D 서열은 SEQ ID NO: 84 에 제시된다) 및 디술피드 연결된 단독이량체성 IL-15RαSu/IgG1 Fc 단백질 (예시 IL-15RαSu/Fc 도메인은 SEQ ID NO: 85 에 제시된다) 을 포함하는 복합체의 계산된 분자량은 92.4 kDa 이다. 일부 구현예에서, 표적 항원 및 ALT-803 을 엔코딩하는 재조합 벡터는 표적 항원에 대해 엔코딩하도록 본원에 기재된 임의의 서열을 가질 수 있고, ALT-803 에 대해 엔코딩하도록, 임의의 순서로, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, 및 SEQ ID NO: 85 를 가질 수 있다.
각각의 IL-15N720 폴리펩티드는 대략 12.8 kDa 의 계산된 분자량을 갖고, IL-15RαSu/IgG 1 Fc 융합 단백질은 대략 33.4 kDa 의 계산된 분자량을 갖는다. IL-15N72D 및 IL-15RαSu/IgG 1 Fc 단백질 모두는 글리코실화되어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 대략 114 kDa 의 ALT-803 의 겉보기 분자량을 산출할 수 있다. ALT-803 에 대해 결정된 등전점 (pI) 은 대략 5.6 내지 6.5 의 범위일 수 있다. 따라서, 융합 단백질은 pH 7 에서 음전하가 될 수 있다.
HER2/neu 및 ALT-803 을 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터로의 조합 요법은 면역 반응을 부스트하는 결과를 초래할 수 있으며, 두 치료 모이어티의 조합은 요법 단독보다 면역 반응을 시너지적으로 부스트하는 작용을 한다. 예를 들어, HER2/neu 항원 및 ALT-803 을 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터로의 조합 요법은 항원-특이적 효과기 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극, 감염된 세포 살해에 대항하여 지정되는 NK 세포 반응의 자극, 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 또는 항체 의존성 세포 식균작용 (ADCP) 메커니즘을 통한 감염된 세포 살해에 대항하여 지정되는 호중구 또는 단핵구 세포 반응의 자극의 시너지적 향상을 산출할 수 있다. HER2/neu 항원 및 ALT-803 을 엔코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터로의 조합 요법은 이를 필요로 하는 대상에게 투여 후 생존률 결과를 크게 개선시키기 위해, 상기 반응 중 임의의 하나, 또는 상기 반응의 조합을 시너지적으로 부스트할 수 있다.
본원에 기재된 면역원성 향상제 중 임의의 것은 본원에 기재된 임의의 재조합 벡터를 사용하여, 동일한 재조합 벡터에서 면역원성 향상제 및 표적 항원을 발현함으로써 표적 항원에 융합되거나 연결될 수 있다.
이러한 면역원성 향상제를 엔코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 35 - SEQ ID NO: 90 중 임의의 것일 수 있고, 표 1 에 요약된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
일부 구현예에서, 표적 항원 및 면역학적 융합 파트너를 위한 핵산 서열은 임의의 핵산에 의해 분리되지 않는다. 다른 구현예에서, 링커를 엔코딩하는 핵산 서열은 본원에 기재된 임의의 표적 항원을 엔코딩하는 핵산 서열과 본원에 기재된 임의의 면역학적 융합 파트너를 엔코딩하는 핵산 서열 사이에 삽입될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 표적 항원, 링커, 및 면역학적 융합 파트너를 함유하는 바이러스 벡터로의 면역화 후 제조되는 단백질은 관심의 표적 항원에 이어 링커를 포함하고, 면역학적 융합 파트너로 종결되어, 표적 항원을 링커를 통해 관심의 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 면역학적 융합 파트너에 연결시키는 융합 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 핵산의 서열은 약 1 내지 약 150 개의 핵산 길이, 약 5 내지 약 100 개의 핵산 길이, 또는 약 10 내지 약 50 개의 핵산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 하나 이상의 아미노산 잔기를 엔코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커의 아미노산 서열은 약 1 내지 약 50 개, 또는 약 5 내지 약 25 개 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커의 서열은 10 개 미만의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리알라닌 링커, 폴리글리신 링커, 또는 알라닌 및 글리신 모두를 가진 링커일 수 있다.
이러한 링커를 엔코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 91 - SEQ ID NO: 105 중 임의의 하나일 수 있고, 표 2 에 요약된다.
Figure pct00008
XI. 동시자극적 분자
표적 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 함유하는 재조합 아데노바이러스-기반 벡터 백신의 사용 외에도, 동시-자극성 분자를 면역원성을 증가시키기 위해 상기 백신 내로 도입될 수 있다. 면역 반응의 개시는 APC 에 의한 고유의 T 세포의 활성화를 위한 적어도 2 개의 신호를 필요로 한다 (Damle, et al. J Immunol 148:1985-92 (1992); Guinan, et al. Blood 84:3261-82 (1994); Hellstrom, et al. Cancer Chemother Pharmacol 38:S40-44 (1996); Hodge, et al. Cancer Res 39:5800-07 (1999)). 항원 특이적인 첫번째 신호는 펩티드/두 조직적합성 복합체 (MHC) 를 통해 T 세포 수용체 (TCR) 를 통해 전달되고, T 세포가 세포 주기에 들어가도록 야기한다. 두번째의, 또는 동시자극적, 신호는 사이토카인 생산 및 증식을 위해 전달될 수 있다.
전문적인 항원 제시 세포 (APC) 의 표면 상에서 정상적으로 발견되는 적어도 3 개의 구별되는 분자가 T 세포 활성화를 위해 중요한 두번째 신호를 제공할 수 있는 것으로 보고되었다: B7-1 (CD80), ICAM-1 (CD54), 및 LFA-3 (인간 CD58) (Damle, et al. J Immunol 148:1985-92 (1992); Guinan, et al. Blood 84: 3261-82 (1994); Wingren, et al. Crit Rev Immunol 15: 235?53 (1995); Parra, et al. Scand. J Immunol 38: 508-14 (1993); Hellstrom, et al. Ann NY Acad Sci 690: 225-30 (1993); Parra, et al. J Immunol 158: 637-42 (1997); Sperling, et al. J Immunol 157: 3909-17 (1996); Dubey, et al. J Immunol 155: 45-57 (1995); Cavallo, et al. Eur J Immunol 25: 1154-62 (1995)).
이들 동시자극적 분자는 구별되는 T 세포 리간드를 갖는다. B7-1 은 CD28 및 CTLA-4 분자와 상호작용하고, ICAM-1 은 CD11a/CD18 (LFA-1β2 인테그린) 복합체와 상호작용하고, LFA-3 은 CD2 (LFA-2) 분자와 상호작용한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 표적 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산을 함유하는 재조합 아데노바이러스-기반 벡터 백신과 조합되는 경우, 특이적 표적 항원을 지정하는 항-종양 면역 반응을 추가로 증가/향상시킬, B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3 을 각각 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 갖는 것이 바람직할 것이다.
XII. 면역 경로 체크포인트 조절제
특정 구현예에서, 면역 경로 체크포인트 억제제는 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물과 조합된다. 특정 구현예에서, 환자는 면역 경로 체크포인트 억제제를 본원에 기재된 백신 또는 약학 조성물과 조합으로 받았다. 추가의 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 면역 경로 체크포인트 조절제와 함께 투여된다. 활성화와 억제 신호 사이의 균형은 T 림프구와 질환 세포 사이의 상호작용을 조절하는데, 여기서 T-세포 반응은 T-세포 수용체 (TCR) 에 의한 항원 인지를 통해 개시된다. 억제 경로 및 신호는 면역 경로 체크포인트로서 언급된다. 정상 상황에서, 면역 경로 체크포인트는 자가면역성의 통제 및 예방에서 중요한 역할을 하며, 또한 병원균 감염에 반응하여 조직 손상으로부터 보호한다.
특정 구현예는 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 면역 경로 체크포인트 억제 경로를 조정하기 위한 바이러스 벡터-기반 백신 및 조성물을 포함하는 조합 면역요법을 제공한다. 일부 구현예에서, 조절은 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 증가이다. 일부 구현예에서, 조절은 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 감소이다. 일부 구현예에서, 조절은 유전자 또는 단백질의 패밀리에 영향을 준다.
일반적으로, 면역 억제 경로는 리간드-수용체 상호작용에 의해 개시된다. 이제 질환에서, 질환이 대상에서 면역 저항성을 유도하기 위한 메커니즘으로서 면역-체크포인트 경로를 끌어들일 수 있다는 것이 명백하다.
제시된 질환에 의한 대상에서의 면역 저항성 또는 면역 억제 경로의 유도는 면역 억제 경로 중 하나 이상을 조절하는 것으로 알려진 분자 조성물, 예컨대 siRNA, 안티센스, 소형 분자, 모방체, 리간드, 수용체 또는 단백질의 재조합 형태, 또는 항체 (이것은 Ig 융합 단백질일 수 있음) 에 의해 차단될 수 있다. 예를 들어, 면역-체크포인트 단백질의 차단제, 예컨대 세포독성 T-림프구-연관 항원 4 (CTLA4) 및 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD1) 로의 예비 임상 소견은 항-종양 면역성을 향상시키기 위한 가능성을 보여주었다.
질환에 걸린 세포는 다중 억제 리간드를 발현할 수 있고, 질환-침윤성 림프구는 다중 억제 수용체를 발현하기 때문에, 면역 경로 체크포인트 단백질의 이중 또는 삼중 차단은 항-질환 면역성을 향상시킬 수 있다. 본원에 제공되는 조합 면역요법은 하나 이상의 하기 면역-체크포인트 단백질: PD1, PDL1, PDL2, CD28, CD80, CD86, CTLA4, B7RP1, ICOS, B7RPI, B7-H3 (또한 CD276 으로서 공지됨), B7-H4 (또한 B7-S1, B7x 및 VCTN1 로서 공지됨), BTLA (또한 CD272 로서 공지됨), HVEM, KIR, TCR, LAG3 (또한 CD223 로서 공지됨), CD137, CD137L, OX40, OX40L, CD27, CD70, CD40, CD40L, TIM3 (또한 HAVcr2 로서 공지됨), GAL9, A2aR, 및 아데노신 (Adenosine) 을 표적하는 면역 경로 체크포인트 조절제를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 분자 조성물은 siRNA 를 포함한다. 일부 구현예에서, 분자 조성물은 소형 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 분자 조성물은 리간드의 재조합 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 분자 조성물은 수용체의 재조합 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 분자 조성물은 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 요법은 1 개 초과의 분자 조성물 및/또는 1 개 초과의 유형의 분자 조성물을 포함한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 면역 체크포인트 억제 경로의 향후 발견되는 단백질은 또한 본 발명에 의해 포함되는 것으로 구상된다.
일부 구현예에서, 조합 면역요법은 CTLA4 의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 면역요법은 PD1 의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 면역요법은 PDL1 의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 면역요법은 LAG3 의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 면역요법은 B7-H3 의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 면역요법은 B7-H4 의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 면역요법은 TIM3 의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조절은 발현의 증가 또는 향상이다. 다른 구현예에서, 조절은 발현의 부재 또는 감소이다.
2 가지 비-제한적인 예시적인 면역 경로 체크포인트 억제제는 세포독성 T 림프구 연관 항원-4 (CTLA-4) 및 프로그램된 세포 사멸 단백질-1 (PD1) 을 포함한다. CTLA-4 는 이것이 T-세포 활성화의 초기 단계를 조절하는 곳에서 T-세포 상에서만 발현될 수 있다. CTLA-4 는 T-세포 활성을 억제하는 신호를 산출할 수 있는 동시-자극성 T-세포 수용체 CD28 과 상호작용한다. 일단 TCR 항원 인지가 발생하면, CD28 신호는 TCR 신호를 향상시킬 수 있어, 일부 경우에서 활성화된 T-세포 및 CTLA-4 가 CD28 의 신호 활성을 억제시킴을 도출할 수 있다. 본 발명은 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 항-CTLA-4 모노클로날 항체와 조합으로 본원에 제공된 면역요법을 제공한다. 본 발명은 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 CTLA-4 분자 조성물과 조합으로 본원에 제공된 백신 또는 면역요법을 제공한다.
프로그램된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (PDL1) 은 B7 패밀리의 일원이고, 다양한 조직 및 세포 유형에 분포한다. PDL1 은 T-세포 활성화 및 CTL 매개된 용해를 억제하는 PD1 과 상호작용할 수 있다. PDL1 의 상당한 발현은 다양한 인간 종양 상에서 입증되었고, PDL1 발현은 종양이 숙주 항-종양 면역 반응을 회피하는 핵심 메커니즘 중 하나이다. 프로그램된 사멸-리간드 1 (PDL1) 및 프로그램된 세포 사멸 단백질-1 (PD1) 은 면역 경로 체크포인트로서 상호작용한다. 상기 상호작용은 항-종양 면역 반응 및 후속 종양 진행을 더디게 하는 주요 내성 메커니즘일 수 있다. PD1 은 활성화된 T 세포 및 PDL1 상에 존재하고, PD1 의 일차 리간드는 종종, 종양 세포 및 항원-제시 세포 (APC) 뿐 아니라, B 세포를 포함하는 다른 세포 상에서 발현된다. PDL1 은 T 세포 활성화 및 세포독성 T 림프구 (CTL) 매개 용해를 억제하는 T 세포 상의 PD1 과 상호작용한다. 본 명세서는 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 항-PD1 또는 항-PDL1 모노클로날 항체와 조합으로 본원에 제공되는 면역요법을 제공한다.
특정 구현예는 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 PD1 또는 항-PDL1 분자 조성물과 조합으로 본원에 제공되는 면역요법을 제공할 수 있다. 특정 구현예는 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 항-CTLA-4 및 항-PD1 모노클로날 항체와 조합으로 본원에 제공되는 면역요법을 제공할 수 있다. 특정 구현예는 항-CTLA-4 및 PDL1 모노클로날 항체와 조합으로 본원에 제공되는 면역요법을 제공할 수 있다. 특정 구현예는 암 및 감염성 질환의 치료를 위해, 항-CTLA-4, 항-PD1, 항-PDL1 모노클로날 항체, 또는 이의 조합과 조합으로 본원에 제공되는 백신 또는 면역요법을 제공할 수 있다.
면역 경로 체크포인트 분자는 T 세포에 의해 발현될 수 있다. 면역 경로 체크포인트 분자는 면역 반응을 하향-조절 또는 억제하는 "브레이크" 로서 효과적으로 담당할 수 있다. 면역 경로 체크포인트 분자는 제한 없이, 프로그램된 사멸 1 (PD1 또는 PD-1, 또한 PDCD1 또는 CD279 로서 공지됨, 접근 번호: NM_005018), 세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4, 또한 CD152 로서 공지됨, GenBank 접근 번호 AF414120.1), LAG3 (또한 CD223 으로서 공지됨, 접근 번호: NM_002286.5), Tim3 (또한 A 형 간염 (간염 A) 바이러스 세포 수용체 2 (HAVCR2) 로서 공지됨, GenBank 접근 번호: JX049979.1), B 및 T 림프구 연관 (BTLA) (또한 CD272 로서 공지됨, 접근 번호: NM_181780.3), BY55 (또한 CD160 으로서 공지됨, GenBank 접근 번호: CR541888.1), TIGIT (또한 IVSTM3 으로서 공지됨, 접근 번호: NM_173799), LAIR1 (또한 CD305 로서 공지됨, GenBank 접근 번호: CR542051.1), SIGLECIO (GenBank 접근 번호: AY358337.1), 자연 살해 세포 수용체 2B4 (또한 CD244 로서 공지됨, 접근 번호: NM_001166664.1), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7, SIGLEC9, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIFl, ILIORA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3 (면역 세포를 직접적으로 억제함) 을 포함한다. 예를 들어, PD1 은 이를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 아데노바이러스 벡터-기반 조성물과 조합될 수 있다.
표적화될 수 있는 부가적인 면역 경로 체크포인트는 아데노신 A2a 수용체 (ADORA), CD276, V-세트 도메인 함유 T 세포 활성화 억제제 1 (VTCN1), 인돌아민 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1), 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체, 3 개의 도메인, 긴 세포질 꼬리, 1 (KIR3DL1), T-세포 활성화의 V-도메인 면역글로불린 억제인자 (VISTA), 사이토카인 유도성 SH2-함유 단백질 (CISH), 하이포잔틴 포스포리보실트랜스페라아제 1 (HPRT), 아데노-연관 바이러스 통합 부위 1 (AAVS1), 또는 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 5 (유전자/위유전자) (CCR5), 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
표 3 은, 완전하지는 않지만, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터-기반 조성물의 효율을 향상시키도록 비활성화될 수 있는 예시적인 면역 경로 체크포인트 유전자를 보여준다. 면역 경로 체크포인트 유전자는 표 3 에 나열된 이러한 유전자 및 공동-억제 수용체 기능, 세포 사멸, 사이토카인 신호, 아르기닌 트립토판 고갈, TCR 신호, 유도된 T-reg 억압, 소모 또는 아네르기 (anergy) 를 통제하는 전사 인자, 및 저산소증 매개 용인성에 수반된 기타로부터 선택될 수 있다.
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아데노바이러스-기반 조성물 및 면역 경로 체크포인트 조절제의 조합은 작용제 단독과 비교하여, 치료된 환자에서 질환의 감염, 진행, 또는 증상의 감소를 산출할 수 있다. 또다른 구현예에서, 아데노바이러스-기반 조성물 및 면역 경로 체크포인트 조절제의 조합은 작용제 단독과 비교하여, 치료된 환자의 개선된 전체적인 생존을 산출할 수 있다. 일부 경우에서, 아데노바이러스-기반 조성물 및 면역 경로 체크포인트 조절제의 조합은 작용제 단독과 비교하여, 치료된 환자에서 질환-특이적 T 세포 반응의 빈도 또는 강도를 증가시킬 수 있다.
특정 구현예는 또한 아데노바이러스 벡터-기반 조성물의 성능을 개선하기 위한 면역 경로 체크포인트 억제의 용도를 제공할 수 있다. 특정 면역 경로 체크포인트 억제제는 아데노바이러스 벡터-기반 조성물 시에 투여될 수 있다. 특정 면역 경로 체크포인트 억제제는 또한 아데노바이러스 벡터-기반 조성물의 투여 후에 투여될 수 있다. 면역 경로 체크포인트 억제는 아데노바이러스 백신 투여와 동시에 일어날 수 있다. 면역 경로 체크포인트 억제는 백신화 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 60 분에 일어날 수 있다. 면역 경로 체크포인트 억제는 또한 아데노바이러스 벡터-기반 조성물의 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 시간에 일어날 수 있다. 일부 경우에서, 면역 억제는 백신화 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일에 일어날 수 있다. 면역 경로 체크포인트 억제는 아데노바이러스 벡터-기반 조성물의 투여 전 또는 후 임의의 시간에 일어날 수 있다.
또다른 양상에서, 항원을 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 및 면역 경로 체크포인트 조절제를 포함하는 백신을 수반하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 대상의 세포 상에서 면역 경로 체크포인트 단백질, PD1 또는 PDL1 예를 들어, 및 이의 천연 결합 파트너(들) 의 하향조절로부터 이득을 얻을 조건을 가진 대상의 치료 방법이 제공된다.
면역 경로 체크포인트 조절제는 임의의 항원을 엔코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터-기반 조성물로 조합될 수 있다. 예를 들어, 항원은 종양 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프, 또는 본원에 기재된 임의의 항원일 수 있다.
면역 경로 체크포인트 조절제는 아데노바이러스 벡터-기반 조성물, 예컨대 백신과 조합되는 경우 시너지 효과를 생성할 수 있다. 면역 경로 체크포인트 조절제는 또한 아데노바이러스 벡터-기반 조성물과 조합되는 경우 유익한 효과를 생성할 수 있다.
XIII. 암
일부 구현예에서, 본 명세서의 방법 및 조성물은 이를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하기 위해 사용된다. 특정 양상에서, 이들 암은 HER2/neu 표적 항원을 과발현한다. HER2/neu 는 유방, 난소, 전립선, 위, 결장, 폐, 및 뼈를 포함하는, 상이한 암의 범위에서 과발현된다. HER2/neu 과발현은 암 치료에서 예후 마커로서 유용할 수 있다.
구체적으로 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 질환, 예컨대 과다형성, 이형성증, 신생물, 전-암, 암, 원발 종양, 또는 전이된 종양의 상태를 평가 또는 치료하는데 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 특정 구현예에서, 대상은 유방암, 더욱 특히, 다른 암 요법, 예컨대 표준 유방암 치료에 무반응성인, 절제불가능, 또는 국부 진행된 전이성 유방암 또는 유방암을 갖는 위험에 있거나, 또는 갖는 것으로 진단되었다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "신생물 세포" 및 "신생물" 은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 세포 증식의 상당한 통제 상실을 특징으로 하는 일탈적 성장 표현형을 나타내도록, 비교적 자율적인 성장을 나타내는 세포를 말한다. 신생물 세포는 악성 또는 양성일 수 있다. 특정 양상에서, 신생물은 이형성증 및 암 둘다를 포함한다. 신생물은 양성, 전-악성 (제자리 암종 또는 이형성증) 또는 악성 (암) 일 수 있다. 신생물 세포는 덩어리를 형성할 수 있거나 (즉, 종양) 또는 없다.
용어 "이형성증" 은 세포 비정상이 초기의, 제자리 신생물의 경우와 같이, 기원 조직에 제한되는 경우 사용될 수 있다. 이형성증은 초기 신생물 과정의 지표일 수 있다. 용어 "암" 은 상향조절된 세포 성장을 수반하는 다양한 질환의 넓은 그룹을 포함하는 악성 신생물을 말할 수 있다.
전이, 또는 전이성 질환은, 하나의 기관 또는 부분으로부터 또다른 비-인접 기관 또는 부분으로의 암의 퍼짐을 말할 수 있다. 그렇게 생성되는 질환의 신규한 발생을 전이라고 부를 수 있다.
기재된 방법 및 조성물에 의해 평가되거나 치료될 수 있는 암은 특히 유방으로부터의 암 세포를 포함하나, 또한 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 위, 결장, 식도, 위창자, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 혀, 또는 자궁으로부터의 세포 및 암 세포를 포함할 수 있다.
부가적으로, 암은 구체적으로 하기 조직학적 유형의 것일 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화된; 거대 및 방추 세포 암종; 소형 세포 암종; 유두 암종; 평편 세포 암종; 림포상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 세포 암종; 선암종; 가스트리노마, 악성; 담관암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 샘낭 암종; 선종 폴립 내의 선암종; 선암종, 가족성 대장 폴립증; 고형 암종; 카르시노이드 종양, 악성; 세기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 색소혐성 암종; 호산성 암종; 호산성 선암종; 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 난포 선암종; 유두 및 난포 선암종; 비캡슐화 경화 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점막표피모양 암종; 낭샘암종; 유두 낭샘암종; 유두 장액 낭샘암종; 점액 낭샘암종; 점액 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 도관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증 암종; 파제트 질환, 유방; 세엽 세포 암종; 선편평상피 암종; 선암종 w/편평상피화생; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 포막종, 악성; 과립막 세포 종양, 악성; 남성모세포종, 악성; 세르톨리 세포 암종; 라이디히 세포 종양, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방외 부신경절종, 악성; 크롬친화성세포종; 글로만지오육종; 악성 흑색종; 멜라닌결핍 흑색종; 표재 확산 흑색종; 거대색소 모반 중의 악성 흑색종; 유상피 세포 흑색종; 청색 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유 조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 혼합 종양, 악성; 뮐러 혼합 종양; 콩팥모세포종; 간모세포종; 암육종; 중간엽종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 활액 육종; 중피종, 악성; 난소고환종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소갑상선종, 악성; 융모암종; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 간엽 연골육종; 뼈이 거대 세포 종양; 유잉 육종; 치아형성 종양, 악성; 법랑아세포 치과육종; 법랑질모세포종, 악성; 법랑아세포 섬유육종; 송과체종, 악성; 척삭종; 신경교종, 악성; 뇌교종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 별모세포종; 교아세포종; 희소돌기아교세포종; 희소돌기아교모세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경아세포종; 망막아종; 후각 신경 종양; 수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경집종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨 림프종; 부육아종; 악성 림프종, 소형 림프구성; 악성 림프종, 거대 세포, 확산; 악성 림프종, 난포; 균상 식육종; 기타 구체화된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다중 골수종; 거대 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 원형질 세포 백혈병; 적혈구백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구 백혈병; 거대 세포 백혈병; 거대핵모세포 백혈병; 골수 육종; 및 모발 세포 백혈병.
유방암
특정 양상에서, HER2/neu 항원 또는 에피토프를 포함하는 복제 결함성 벡터를 포함하는 방법 및 조성물은 유방암, 특히 절제불가능, 국부 진행된, 또는 전이성 유방암을 가질 위험이 있는, 또는 갖는 것으로 진단된 대상을 치료하는데 사용된다.
특정 양상에서, 유방암은 유방의 영향을 받은 영역의 샘플 - 또는 생검 - 의 현미경 분석으로 진단된다. 또한, 전문화된 실험실 검사를 필요로 하는 유방암의 유형이 있다.
2 가지 가장 통상적으로 사용되는 스크리닝 방법인, 의료인에 의한 유방의 신체 검사 및 유방조영술은 덩어리가 암이라는 대략적인 가망성을 제공할 수 있고, 또한 일부 다른 병변, 예컨대 단순한 낭종을 검출할 수 있다. 이들 검사가 결정적이지 않은 경우, 의료인은 진단 성립을 돕는 현미경 분석 (미세 바늘 흡입, 또는 미세 바늘 흡입 및 세포검사-FNAC 로 알려진 절차) 을 위해 덩어리 내의 유체의 샘플을 제거할 수 있다. 맑은 유체의 결론은 덩어리가 암성일 가능성이 아주 낮은 반면, 피가있는 유체는 암성 세포에 대해 현미경 하의 검시를 위해 보내질 수 있다. 함께, 유방의 신체 검사, 유방조영술, 및 FNAC 는 양호한 정확도로 유방암을 진단하는데 사용될 수 있다.
생검을 위한 다른 옵션은 코어 생검 또는 진공-보조 유방 생검 (이것은 유방 덩어리의 절단물을 제거하는 절차임); 또는 절제 생검 (여기서 전체 덩어리를 제거함) 을 포함한다. 매우 종종 의료인에 의한 신체 검사, 유방조영술, 및 특정한 상황에서 수행될 수 있는 부가적인 시험 (예컨대 초음파 또는 MRI 에 의한 영상화) 의 결과는 확정적인 진단 및 일차 치료 방법으로서 절제 생검을 보장하는데 충분하다.
유방암은 상이한 도식에 의해 분류될 수 있다. 이들 양상 각각은 치료 반응 및 예후에 영향을 준다. 유방암의 설명은 이들 분류 양상 모두 뿐 아니라, 다른 발견, 예컨대 신체 검사에서 발견된 징후를 최적으로 포함할 것이다. 완전한 분류는 병리조직학적 유형, 등급, 병기 (TNM), 수용체 상태, 및 DNA 시험에 의해 결정되는 바와 같은 유전자의 존재 또는 부재를 포함한다:
병리조직학. 유방암의 상당한 대다수는 도관 또는 소엽을 라이닝하는 상피로부터 유래되고, 유선관 암종으로서 분류된다. 제자리 암종은 주변 조직의 침윤 없는 상피 조직 내의 암 세포의 증식이다. 반대로, 침윤성 암종은 주변 조직을 침유한다. 신경주위 및/또는 림프혈관 공간 침윤은 통상 유방암의 조직학적 설명의 일부로서 고려되고, 존재하는 경우 좀더 공격적인 질환과 관련될 수 있다.
등급. 등급화는 정상 유방 조직의 외양과 비교한 유방암 세포의 외양에 초점을 둔다. 유방과 같은 조직 내의 정상 세포는 분화되어지고, 이것은 이들이 그 기관의 일부로서 그들의 기능을 반영하는 특이적인 형상 및 형태를 취한다는 것을 의미한다. 암성 세포는 그 분화를 상실한다. 암에서, 수유관을 구성하도록 질서있는 방식으로 정상적으로 정렬될 세포가 무질서하게 된다. 세포 분열이 통제되지 않아진다. 세포 핵이 덜 균일하게 된다. 병리학자는 세포가 정상 유방 세포에서 보이는 특징을 점진적으로 상실하면서 세포를 잘 분화된 (저-등급), 중간으로 분화된 (중간-등급), 및 열악하게 분화된 (고-등급) 으로 기술한다. 열악하게 분화된 암은 악화된 예후를 가진다.
병기. 유방암 병기를 위한 TNM 분류는 체내 본래 출발한 암의 크기 및 이것이 돌아다닌 장소에 근거한다. 이들 암 특징은 종양 (T) 의 크기, 종양이 겨드랑이, 목 내, 및 흉부 내부의 림프절 (N) 로 퍼졌는지, 그리고 종양이 전이되었는 지 (M) (즉, 신체의 좀더 먼 부분으로 퍼졌는지) 에 따라 기술된다. 더 큰 크기, 결절 퍼짐, 및 전이는 더 큰 병기 숫자 및 악화된 예후를 갖는다.
주요 병기는 병기 0, 병기 1, 병기 2, 병기 3, 및 병기 4 이다.
병기 0 은 젖꼭지의 제자리 질환 또는 파제트 질환이다. 병기 0 은 전-암성 또는 마커 조건인, 제자리 도관 암종 (DCIS) 또는 제자리 소엽 암종 (LCIS) 이다.
병기 1-3 은 유방 또는 지역 림프절 내에 있다.
병기 4 는 전이성 암이다. 전이성 유방암은 덜 호의적인 예후를 갖는다.
수용체 상태. 세포는 이들의 표면 상에 및 이들의 세포질 및 핵 내에 수용체를 갖는다. 화학적 메신저 예컨대 호르몬이 수용체에 결합하고, 이것이 세포 내에서 변화를 일으킨다. 유방암 세포는 많은 상이한 유형의 수용체를 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있고, 분류에 존재하는 3 가지 가장 중요한 것은 다음과 같다: 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 및 HER2/neu. 이들 수용체를 가지거나 가지지 않는 세포를 ER 양성 (ER+), ER 음성 (ER-), PR 양성 (PR+), PR 음성 (PR-), HER2/neu 양성 (HER2/neu+), 및 HER2/neu 음성 (HER2/neu-) 이라고 부른다. 이들 수용체 중 아무 것도 갖지 않은 세포를 기저-유사 또는 삼중 음성이라고 부른다.
골육종
일부 구현예에서, HER2/neu 항원 또는 에피토프를 포함하는 복제-결함성 벡터를 포함하는 방법 및 조성물은 뼈 암, 특히 골육종을 갖는, 가질 위험이 있는, 또는 갖는 것으로 진단된 대상을 치료하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 골육종은 고-등급 골육종, 중간 등급 골육종, 또는 저-등급 골육종일 수 있다. 골육종은 젊은 대상에서 가장 흔히 발견되는 뼈의 암이다. 이들 암은 새로운 뼈 성장 영역에서 가장 흔히 기원한다. 일부 구현예에서, 본 명세서의 방법 및 조성물은 임의의 등급 또는 유형의 골육종을 가진 대상을 치료하기 위해 투여될 수 있다.
위암
일부 구현예에서, HER2/neu 항원 또는 에피토프를 포함하는 복제-결함성 벡터를 포함하는 방법 및 조성물은 위암을 갖는, 가질 위험이 있는, 또는 갖는 것으로 진단된 대상을 치료하는데 사용된다. 위암은 위에서 기원하는 암이며, 이의 거의 90-95% 는 선암종이다. 특정 구현예에서, 위암은 선암종, 림프종, 위창자 기질 종양, 또는 카르시노이드 종양일 수 있다. 위암은 또한 헬리코박테르 파일로리 (Helicobacter pylori) 에 의한 감염으로부터 기원할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서의 방법 및 조성물은 임의의 등급 또는 유형의 골육종을 가진 대상을 치료하기 위해 투여될 수 있다.
XIV. 치료 방법
표적 항원 예컨대 본원에 기재된 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 포함하는 복제-결함성 아데노바이러스 벡터는 본원에 기재된 하나 이상의 표적 항원에 대항하는 면역 반응을 발생시키기 위한 다수의 백신 세팅에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 임의의 표적 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프에 대항하는 면역 반응의 발생 방법이 제공된다.
아데노바이러스 벡터는 이들이 Ad 에 대해 기존의 면역성을 갖는 대상에서 면역 반응을 발생시키는데 사용될 수 있고 아데노바이러스 벡터를 사용하는 다중 회차의 면역화를 포함하는 백신화 섭생, 이전 세대 아데노바이러스 벡터를 사용하는것이 가능하지 않은 섭생에서 사용될 수 있다는 예상치 못한 발견때문에 특히 중요하다.
일반적으로, 면역 반응의 발생은 체액성 반응 및/또는 세포-매개 반응의 유도를 포함한다. 관심의 표적 항원에 대항하는 면역 반응을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
면역 반응의 발생은 면역계의 특정 세포의 활성 및/또는 수의 감소 또는 특정 사이토카인 또는 기타 효과기 분자의 레벨 및/또는 활성의 감소를 수반할 수 있다. 면역 반응에서의 변화 (예를 들어, 세포 수, 사이토카인 발현, 세포 활성) 를 검출하기 위한 다양한 방법이 이용가능하고 일부 양상에서 유용하다. 본 문맥에서 유용한 예시적 방법은 세포내 사이토카인 염색 (ICS), ELISpot, 증식 어세이, 크롬 방출을 포함하는 세포독성 T-세포 어세이 또는 등가의 어세이, 및 임의의 횟수의 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 또는 RT-PCR 기반 어세이를 사용하는 유전자 발현 분석을 포함한다.
면역 반응의 발생은 대조군과 비교하여 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상에서 1.5 내지 5 배의 표적 항원-특이적 CTL 활성에서의 증가를 포함할 수 있다. 또다른 구현예에서, 면역 반응의 발생은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상에서 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 배의 표적-특이적 CTL 활성에서의 증가를 포함한다.
면역 반응의 발생은 적합한 대조군과 비교하여 표적 항원을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상에서 1.5 내지 5 배의, 표적 항원-특이적 HTL 활성에서의 증가, 예컨대 헬퍼 T-세포의 증식을 포함할 수 있다. 또다른 구현예에서, 면역 반응의 발생은 대조군과 비교하여 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 배의 표적-특이적 HTL 활성에서의 증가를 포함한다. 본 문맥에서, HTL 활성은 특정 사이토카인, 예컨대 인터페론-γ (IFN-γ), 인터류킨-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 또는 다른 사이토카인의 생산에서의 상기 기재된 바와 같은 증가, 또는 감소를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 면역 반응의 발생은 Th2 유형 반응에서 Th1 유형 반응으로의 이동 또는 특정 구현예에서 Th1 유형 반응에서 Th2 유형 반응으로의 이동을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 면역 반응의 발생은 대부분 Th1 또는 Th2 유형 반응의 자극을 포함할 수 있다.
면역 반응의 발생은 적합한 대조군과 비교하여 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상에서 1.5 내지 5 배의 표적-특이적 항체 생산에서의 증가를 포함할 수 있다. 또다른 구현예에서, 면역 반응의 발생은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상에서 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 배의 표적-특이적 항체 생산에서의 증가를 포함한다.
따라서, 특정 구현예에서, 하기를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 개체에게 투여하는 단계: a) 아데노바이러스 벡터가 E2b 영역 내에 결실을 갖는, 복제 결함성 아데노바이러스 벡터, 및 b) 표적 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프를 엔코딩하는 핵산; 및 아데노바이러스 벡터를 적어도 1 회 개체에게 재투여하는 단계; 이에 의해 표적 항원에 대항하는 면역 반응을 발생시키는 단계를 포함하는, 관심의 표적 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프에 대항하여 면역 반응을 발생시키는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 투여되는 벡터가 거트 벡터가 아닌 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 표적 항원은 야생형 단백질, 단편, 변이체, 또는 이의 변이체 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프, 단편, 변이체, 또는 이의 변이체 단편을 포함한다.
추가 구현예에서, 개체가 Ad 에 대해 기존의 면역성을 갖고, 개체에게 하기를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하고: a) 아데노바이러스 벡터가 E2b 영역 내에 결실을 갖는, 복제 결함성 아데노바이러스 벡터, 및 b) 표적 항원을 엔코딩하는 핵산; 아데노바이러스 벡터를 적어도 1 회 개체에게 재투여하고; 이에 의해 표적 항원에 대항하는 면역 반응을 발생시킴으로써, 개체에서 표적 항원에 대항하여 면역 반응을 발생시키는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 표적 항원은 야생형 단백질, 단편, 변이체, 또는 이의 변이체 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프, 단편, 변이체, 또는 이의 변이체 단편을 포함한다.
Ad 에 대한 기존의 면역성과 관련하여, 이것은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 Ad 항체의 존재에 대해 시험하는 항체-기반 어세이를 사용하여 결정될 수 있다. 추가로, 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 먼저 개체가 Ad 에 대한 기존의 면역성을 갖는지를 결정하고, 그 다음 본원에 기재된 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것을 포함한다.
하나의 구현예는 개체에게 복제 결함성 아데노바이러스 벡터를 포함하는 첫번째 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것 (이때 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역 내에 결실, 및 적어도 하나의 표적 항원을 엔코딩하는 핵산을 가짐); 개체에게 복제 결함성 아데노바이러스 벡터를 포함하는 두번째 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것 (이때 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역 내에 결실, 및 적어도 하나의 표적 항원을 엔코딩하는 핵산을 갖고, 두번째 아데노바이러스 벡터의 적어도 하나의 표적 항원은 첫번째 아데노바이러스 벡터의 적어도 하나의 표적 항원과 동일 또는 상이함) 을 포함하는 개체에서의 하나 이상의 표적 항원에 대항하는 면역 반응을 발생시키는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 표적 항원은 야생형 단백질, 단편, 변이체, 또는 이의 변이체 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프, 단편, 변이체, 또는 이의 변이체 단편을 포함한다.
따라서, 특정 구현예는 동일한 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터로의 다중 면역화 또는 상이한 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터로의 다중 면역화를 고려한다. 각 경우에서, 아데노바이러스 벡터는 본원 그밖에 기재된 하나 이상의 표적 항원을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은 하나의 표적 항원을 엔코딩하는 E2b 결실된 아데노바이러스로의 다중 면역화, 및 동일한 아데노바이러스 벡터의 여러 번의 재-투여, 그에 의한 표적 항원에 대항하는 면역 반응의 유도를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프, 단편, 변이체, 또는 이의 변이체 단편을 포함한다.
추가 구현예에서, 방법은 하나 이상의 표적 항원을 엔코딩하는 첫번째 아데노바이러스 벡터로의 면역화, 및 이후 첫번째 아데노바이러스 벡터에 의해 엔코딩되는 이들 항원과 동일 또는 상이할 수 있는 하나 이상의 표적 항원을 엔코딩하는 두번째 아데노바이러스 벡터로의 투여를 포함한다. 이와 관련하여, 엔코딩된 표적 항원 중 하나는 상이할 수 있으며 엔코딩된 항원 중 모두가 상이할 수 있거나, 또는 일부는 동일할 수 있고 일부는 상이할 수 있다. 추가로, 특정 구현예에서, 방법은 첫번째 아데노바이러스 벡터를 여러 번 투여하는 것 및 두번째 아데노바이러스를 여러 번 투여하는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 방법은 첫번째 아데노바이러스 벡터를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 그 이상 횟수 투여하는 것 및 두번째 아데노바이러스 벡터를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 그 이상 횟수 투여하는 것을 포함한다. 투여 순서는 첫번째 아데노바이러스를 1 회 또는 여러 번 연달아 투여하는 것, 이후 두번째 아데노바이러스 벡터를 1 회 또는 여러 번 연달아 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은 각각 1 회 투여, 각각 2 회 투여, 각각 3 회 투여 등으로서 첫번째 및 두번째 아데노바이러스 벡터의 교차 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 첫번째 및 두번째 아데노바이러스 벡터는 동시에 투여된다. 다른 구현예에서, 첫번째 및 두번째 아데노바이러스 벡터는 연속으로 투여된다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프, 단편, 변이체, 또는 이의 변이체 단편을 포함한다.
당업자에게 쉽게 이해될 바와 같이, 2 개 초과의 아데노바이러스 벡터가 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 상이한 아데노바이러스 벡터가 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은 1 개 초과의 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 한번에 투여하는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 관심의 다중 표적 항원에 대항하는 면역 반응은 다중 상이한 아데노바이러스 벡터를 동시에 투여함으로써 발생될 수 있고, 각각은 하나 이상의 표적 항원을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
아데노바이러스 벡터는 암, 예컨대 암종 또는 육종 (예를 들어, 고형 종양, 림프종 및 백혈병) 에 대항하는 면역 반응을 발생시키는데 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 암, 예컨대 신경학적 암, 흑색종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 백혈병, 형질세포종, 선종, 신경교종, 흉선종, 유방암, 전립선 암, 결장직장암, 신장암, 신장 세포 암종, 자궁암, 췌장암, 식도암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 위암, 다중 골수종, 간암, 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 또는 기타 암에 대항하는 면역 반응을 발생시키는데 사용될 수 있다.
방법은 또한 본원에 기재된 감염성 질환 또는 암 중 임의의 것의 증상을 치료 또는 경감시키기 위해 제공된다. 치료 방법은 아데노바이러스 벡터를 본원에 기재된 감염성 질환 또는 암을 겪고 있는 또는 겪을 위험이 있는 개체에게 1 회 이상 투여하는 것을 포함한다. 이와 같이, 특정 구현예는 이러한 질환을 발달시킬 위험이 있는 개체에서 감염성 질환 또는 암에 대항하는 백신화 방법을 제공한다. 위험이 있는 개체는 감염성 작용제에 언젠가 노출될 수 있거나 또는 이미 노출되었으나 감염 증상을 나타내지 않는 개체 또는 암을 발달시킬 유전적 소인을 가지거나 또는 감염성 작용제에 특히 취약한 개체일 수 있다. 본원에 기재된 감염성 질환 또는 암을 겪고 있는 개체는 본원에서 요법을 가이드하는데 사용될 수 있는 표적 항원을 발현 및/또는 존재하는 것을 결정할 수 있다. 예를 들어, 예시가 표적 항원을 발현 및/또는 존재하는 것으로 밝혀질 수 있고, 표적 항원, 변이체, 단편 또는 이의 변이체 단편을 엔코딩하는 아데노바이러스 벡터가 이어서 투여될 수 있다.
특정 구현예는 표적 항원, 또는 단편, 변이체, 또는 이의 변이체 단편을 엔코딩하는 핵산의 생체 내 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 용도를 고려한다. 일단 대상에게 주사되면, 핵산 서열이 발혀되어 서열에 의해 엔코딩되는 항원에 대항하는 면역 반응을 산출한다. 아데노바이러스 벡터 백신은 "유효량" 즉, 본원 다른 곳에 기재된 면역 반응을 도출하는 선택된 투여 또는 투여 경로에서 유효한 아데노바이러스 벡터의 양으로 투여될 수 있다. 유효량은 표적 감염성 작용제 또는 암에 대항하는 숙주의 보호 또는 치료를 용이하게 하는데 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 각 백신 투여량 중 벡터의 양은 일반적으로 전형적인 백신과 연관된 상당한 부작용이 없이 면역, 면역보호성, 또는 다른 면역요법 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 일단 백신화되면, 대상은 백신 치료의 효능을 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 백신화의 효능 모니터링은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈액 또는 유체 샘플을 항체 레벨을 검출하기 위해 어세이할 수 있다. 다른 구현예에서, ELISpot 어세이는 순환 혈액 세포 또는 림프성 조직 세포로부터 세포-매개 면역 반응을 검출하기 위해 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, 1 내지 10 회 투여량이 52 주 기간이 넘게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 6 회 투여량이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 주, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개월, 또는 이로부터 추론가능한 임의의 범위 또는 값의 간격으로 투여되고, 추가의 부스트 백신화는 그로부터 주기적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 주, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개월, 또는 이로부터 추론가능한 임의의 범위 또는 값의 간격으로 제공된다. 교차 프로토콜이 개인 환자의 경우에 적합할 수 있다. 이와 같이, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이 상의 투여량이 1 년 기간 또는 그보다 짧은 또는 그보다 긴 기간 넘게, 예컨대 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 주 기간 넘게 투여될 수 있다. 투여량은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 주 간격 또는 그보다 긴 간격에 투여될 수 있다.
백신은 약 4 시간 미만의 기간 넘게, 더욱 바람직하게는, 약 3 시간 미만의 기간 넘게 주입될 수 있다. 예를 들어, 첫번째 25-50 mg 이 30 분, 바람직하게는 심지어 15 분 내에 주입될 수 있고, 나머지가 그 다음 2-3 시간 넘게 주입된다. 더욱 일반적으로, 투여된 백신 구축물의 투여량은 총 적어도 3 회 투여량에 대해 반복된, 매 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 주 1 회 투여량으로서 투여될 수 있다. 또는, 구축물은 4-6 주 동안 주 당 2 회 투여될 수 있다. 투여 스케줄은 임의로 다른 간격으로 반복될 수 있고, 투여량은 투여량 및 스케줄의 적합한 조정과 함께, 다양한 비경구 경로를 통해 제공될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 임의의 횟수의 관련 치료 양상과 함께 (예를 들어, 전, 동시에, 또는 후에) 투여될 수 있다.
적합한 투여량은 상기 기재된 바와 같이 투여되는 경우, 본원 다른곳에 기재된 표적 항원 면역 반응을 촉진할 수 있는 아데노바이러스 벡터의 양을 말한다. 특정 구현예에서, 면역 반응은 기저 (즉, 미처리된) 레벨의 적어도 10-50% 초과이다. 특정 구현예에서, 면역 반응은 기저 레벨에 비해 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500 그 이상을 넘는다. 이러한 반응은 환자에서 표적 항원(들) 항체를 측정함으로써 또는 환자 종양 또는 감염된 세포를 시험관 내에서 살해할 수 있는 세포용해 효과기 세포의 백신-의존성 발생에 의해, 또는 면역 반응을 모니터링하기 위해 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 이러한 백신은 또한 비-백신화된 환자에 비해 백신화된 환자에서 논의의 질환의 개선된 임상 결과를 도출하는 면역 반응을 일으킬 수 있어야만 한다. 일부 구현예에서, 개선된 임상 결과는 질환을 치료하는 것, 질환 증상을 감소시키는 것, 질환의 진행을 변화시키는 것, 또는 수명을 연장시키는 것을 포함한다.
본원에 제공되는 조성물 중 임의의 것이 개체에 투여될 수 있다. "개체" 는 "대상" 또는 "환자" 와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 개체는 포유동물, 예를 들어 인간 또는 동물, 예컨대 비-인간 영장류, 설치류, 토끼, 래트, 마우스, 말, 당나귀, 염소, 고양이, 개, 소, 돼지 또는 양일 수 있다. 구현예에서, 개체는 인간이다. 구현예에서, 개체는 태아, 배아, 또는 어린이이다. 일부 경우에서, 본원에 제공되는 조성물은 세포에 생체 외에서 투여된다. 일부 경우에서, 본원에 제공되는 조성물은 질환 또는 장애의 치료 방법으로서 개체에 투여된다. 일부 구현예에서, 개체는 유전 질환을 갖는다. 일부 경우에서, 개체는 질환, 예컨대 본원에 기재된 질환 중 임의의 것을 가질 위험이 있다. 일부 구현예에서, 개체는 불충분한 양의 단백질 또는 불충분한 활성의 단백질에 의해 야기되는 질환 또는 장애를 가질 증가된 위험이 있다. 개체가 질환 또는 장애를 가질 "증가된 위험" 이 있는 경우, 방법은 방지적 또는 예방적 치료를 수반한다. 예를 들어, 개체는 질환 가족력 때문에 이러한 질환 또는 장애를 가질 증가된 위험이 있을 수 있다. 전형적으로, 이러한 질환 또는 장애를 가질 증가된 위험을 갖는 개체는 예방적 치료 (예를 들어, 질환 또는 장애의 발병 또는 진행을 예방 또는 지연시킴으로써) 로부터 이득을 얻는다.
일부 경우에서, 대상은 질환을 갖지 않는다. 일부 경우에서, 본원에 기재된 치료는 질환의 발병 전에 투여된다. 대상은 미검출된 질환을 가질 수 있다. 대상은 낮은 질환 부담을 가질 수 있다. 대상은 또한 높은 질환 부담을 가질 수 있다. 특정한 경우에, 대상은 등급 척도에 따라 본원에 기재된 치료를 투여받을 수 있다. 등급 척도는 Gleason 분류일 수 있다. Gleason 분류는 어떻게 상이한 종양 조직이 정상 전립선 조직으로부터 오는지를 반영한다. 이것은 1 내지 5 의 척도를 사용한다. 의사는 암 세포의 패턴 및 성장에 기반하여 암에 숫자를 제시한다. 숫자가 낮을수록, 정상 암 세포 모양이 적어지고 등급이 높아진다. 특정 경우에서, 치료는 낮은 Gleason 점수를 가진 환자에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 3 이하의 Gleason 점수를 가진 환자는 본원에 기재된 치료를 투여받을 수 있다.
다양한 구현예는 선택된 환자 집단에서 하나 이상의 특정 표적 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프에 대항하는 면역 반응을 발생시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 암종 또는 육종을 가진 환자를 표적할 수 있고, 예컨대 신경학적 암, 흑색종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 백혈병, 형질세포종, 선종, 신경교종, 흉선종, 유방암, 전립선 암, 결장직장암, 신장암, 신장 세포 암종, 자궁암, 췌장암, 식도암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 위암, 다중 골수종, 간암, 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 또는 기타 암을 포함하나 이에 제한되지 않는 암이 요법을 위해 표적화될 수 있다. 일부 경우에서, 표적화된 환자 집단은 결장직장 선암종, 전이성 결장직장암, 진행된 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA 발현 결장직장암, 머리 및 목 암, 간암, 유방암, 폐암, 방광암, 또는 췌장암을 갖는 개체에 제한될 수 있다. 선택된 암, 예를 들어 결장직장 선암종의 조직학적으로 확인된 진단이 사용될 수 있다. 특정 질환 단계 또는 진행이 선택될 수 있다, 예를 들어, 하나 이상의 전이성, 재발성, 병기 III, 또는 병기 IV 암을 가진 환자가 본원에 기재된 방법 및 조성물로의 요법을 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 플루오로피리미딘, 이리노테칸, 옥살리플라틴, 베바시주맙, 세툭시맙, 또는 파니투무맙 함유 요법을 포함하나 이에 제한되지 않은 다른 요법을 받는 것 및, 임의로 이를 통해 진행되는 것을 필요로 할 수 있다. 일부 경우에서, 이러한 요법을 수락하는 개체의 거절은 환자가 본원에 기재된 방법 및 조성물로 요법 자격이 있는 풀 (pool) 에 포함되도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법을 받는 개체가 적어도, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 18, 21, 또는 24 개월의 추정된 기대 수명을 갖는 것을 필요로 할 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법을 받는 환자 풀은 연령에 제한이 있을 수 있다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 또는 그 이상 연령의 개체는 본원에 기재된 방법 및 조성물로의 요법 자격이 있을 수 있다. 또다른 예의 경우, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 또는 그 이하 연령의 개체는 본원에 기재된 방법 및 조성물로의 요법 자격이 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법을 받는 환자는 적합한 혈액학적 기능을 가진, 예를 들어 마이크로리터 당 적어도 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 또는 그 이상의 하나 이상의 백혈구 (WBC) 계수, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 그 이상의 g/dL 의 헤모글로빈 레벨, 마이크로리터 당 적어도 50,000; 60,000; 70,000; 75,000; 90,000; 100,000; 110,000; 120,000; 130,000; 140,000; 150,000 또는 그 이상의 혈소판 계수; 0.8, 1.0, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0, 2.5, 3.0, 또는 그 이상의 PT-INR 값 또는 그 미만, 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0 X ULN 또는 그 이상의 PTT 값 또는 그 미만을 가진 개체에 제한된다. 다양한 구현예에서, 혈액학적 기능 지표 제한은 상이한 성별 및 연령 그룹, 예를 들어 0-5, 5-10, 10-15, 15-18, 18-21, 21-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 또는 80 세 초과의 개체에 대해 상이하게 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법을 받는 환자는 적합한 신장 및/또는 간 기능을 갖는, 예를 들어 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2 mg/dL 또는 그 이상의 혈청 크레아티닌 레벨 또는 그 미만, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2 mg/dL 또는 그 이상의 빌리루빈 레벨 중 하나 이상을 갖는 개체에 제한되는 반면, 길버트 증후군에 대해서는 더 높은 제한, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 또는 2.4 mg/dL 또는 그 미만, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 또는 그 미만 x 정상의 상한 (ULN) 또는 그 이상의 ALT 및 AST 값을 허용한다. 다양한 구현예에서, 신장 및 간 기능 지표 제한은 상이한 성별 및 연령 그룹, 예를 들어 0-5, 5-10, 10-15, 15-18, 18-21, 21-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 또는 80 세 초과의 개체에 대해 상이하게 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대한 후보자인 개체의 K-ras 돌연변이 상태가 결정될 수 있다. 미리 선택된 K-ras 돌연변이 상태를 가진 개체는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대한 자격이 있는 환자 풀에 포함될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법을 받는 환자는 병행 세포독성 화학요법 또는 방사선 요법, 또는 현재, 뇌 전이의 이력, 예컨대 그러나 염증성 장 질환, 전신 루프스 홍반, 강직성 척추염, 피부경화증, 다발성 경화증, 갑상선 질환 및 백반증에 제한되지 않는 자가면역 질환의 이력, 심각한 병발 만성 또는 급성 질병, 예컨대 심장 질환 (NYHA 클래스 III 또는 IV), 또는 간 질환, 프로토콜을 개연성 있게 준수하는 의학적 또는 심리적 장애, 비 흑색종 피부암 이외의 병행 (또는 마지막 5 년 내에) 두번째 악성종양, 제자리 자궁경부 암종, 통제된 표피상 방광암, 또는 치료되었던 제자리 기타 암종, 하기를 포함하는 활성 급성 또는 만성 감염: 요로 감염, HIV (예를 들어, ELISA 에 의해 측정되고 웨스턴 블롯 (Western Blot) 에 의해 확인되는 바와 같음), 및 만성 간염, 또는 병행 스테로이드 요법 (또는 기타 면역-억제제, 예컨대 아자티오프린 또는 시클로스포린 A) 이 없는 개체에 제한된다. 일부 경우에서, 임의의 스테로이드 요법 (화학요법에 대한 예비-의약 또는 조영-증강 연구로서 사용되는 것을 제외하고) 의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 주 중단이 있는 환자는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대해 자격이 있는 개체의 풀에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법을 받은 환자는 갑상선 질환 및 백반증을 가진 개체를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법을 위한 개체 또는 후보자 개체로부터의 샘플, 예를 들어 혈청 또는 소변 샘플이 수집될 수 있다. 샘플은 요법 전, 동안, 및/또는 후, 예를 들어, 요법 시작 전 2, 4, 6, 8, 10 주 이내, 요법 시작으로부터 1 주, 10 일, 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 8 주, 또는 12 주 이내, 요법 시작 전 2, 4, 6, 8, 10 주 이내, 요법 시작으로부터 1 주, 10 일, 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 8 주, 9 주, 또는 12 주 이내, 요법 동안 1 주, 10 일, 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 8 주, 9 주, 또는 12 주 간격 내, 요법 후 1 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 2 년 간격 내, 요법 후 1 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 2 년, 또는 더 긴 기간 내에, 6 개월, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 년 또는 더 긴 기간의 지속기간에 수집될 수 있다. 샘플은 본원에 기재된 혈액학적, 신장 또는 간 기능 지표 중 임의의 것 뿐 아니라 당업계에 공지된 적합한 기타, 예를 들어 가임 여성의 경우에는 ß-HCG 에 대해 시험할 수 있다. 이와 관련하여, 차등의, PT, INR 및 PTT 가 있는 세포 혈액 계수를 포함하는 혈액학적 및 생화학적 시험, Na, K, Cl, CO2, BUN, 크레아티닌, Ca, 총 단백질, 알부민, 총 빌리루빈, 알칼리 포스파타아제, AST, ALT 및 글루코오스를 측정하는 시험이 특정 양상에 고려된다. 일부 구현예에서, HIV 항체, 간염 BsAg, 또는 간염 C 항체의 존재 또는 양은 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대해 개체 또는 후보자 개체로부터의 샘플에서 결정된다.
생물학적 마커, 예컨대 표적 항원에 대한 항체 또는 Ad5 벡터에 대한 중화 항체는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대해 개체 또는 후보자 개체로부터의 샘플, 예컨대 혈청에서 시험될 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 샘플, 예컨대 혈액 샘플은 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대해 개체 또는 후보자 개체로부터 수집 및 보관될 수 있다. 수집된 샘플은 면역학적 평가에 대해 어세이할 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대해 개체 또는 후보자 개체는 예를 들어 흉부, 복부, 또는 골반의 CT 스캔 또는 MRI 을 사용하는 영상화 연구에서 평가될 수 있다. 영상화 연구는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법 전, 동안 또는 후, 요법 동안, 및/또는 후, 예를 들어, 요법 시작 전 2, 4, 6, 8, 10 주 이내, 요법 시작으로부터 1 주, 10 일, 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 8 주, 또는 12 주 이내, 요법 시작 전 2, 4, 6, 8, 10 주 이내, 요법 시작으로부터 1 주, 10 일, 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 8 주, 9 주, 또는 12 주 이내, 요법 동안 1 주, 10 일, 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 8 주, 9 주, 또는 12 주 간격 내, 요법 후 1 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 2 년 간격 내, 요법 후 1 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 2 년, 또는 더 긴 기간 내에, 6 개월, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 년, 또는 더 긴 기간의 지속기간에 수행될 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 요법 동안 다양한 투여량 및 투여 섭생을 고려한다. 환자는 하나 이상의 복제 결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 표적 항원에 대항하는 개체에서의 면역 반응을 발생시킬 수 있는 표적 항원을 포함하는 Ad5 [E1-, E2b-]-벡터를 받을 수 있다.
다양한 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 이러한 면역 반응에 영향을 주기에 적합한 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x108 바이러스 입자 내지 약 5x1013 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 경우에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x109 내지 약 5x1012 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x108 바이러스 입자 내지 약 5x108 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 5x108 바이러스 입자 내지 약 1x109 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x109 바이러스 입자 내지 약 5x109 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 5x109 바이러스 입자 내지 약 1x1010 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1010 바이러스 입자 내지 약 5x1010 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 5x1010 바이러스 입자 내지 약 1x1011 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1011 바이러스 입자 내지 약 5x1011 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 5x1011 바이러스 입자 내지 약 1x1012 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1012 바이러스 입자 내지 약 5x1012 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 5x1012 바이러스 입자 내지 약 1x1013 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1013 바이러스 입자 내지 약 5x1013 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x108 바이러스 입자 내지 약 5x1010 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1010 바이러스 입자 내지 약 5x1012 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1011 바이러스 입자 내지 약 5x1013 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x108 바이러스 입자 내지 약 1x1010 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1010 바이러스 입자 내지 약 1x1012 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1011 바이러스 입자 내지 약 5x1013 바이러스 입자의 투여량에서 투여된다. 일부 경우에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 1x109, 2 x109, 3 x109, 4 x109, 5 x109, 6 x109, 7 x109, 8 x109, 9 x109, 1x1010, 2 x1010, 3 x1010, 4 x1010, 5 x1010, 6 x1010, 7 x1010, 8 x1010, 9 x1010, 1 x1011, 2 x1011, 3 x1011, 4 x1011, 5x1011, 6 x1011, 7 x1011, 8 x1011, 9 x1011, 1x1012, 1.5 x1012, 2 x1012, 3 x1012, 4x1012, 5x1012, 또는 그 이상의 바이러스 입자 (VP) 이상인 투여량에서 투여된다. 일부 경우에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 1x109, 2 x109, 3 x109, 4 x109, 5 x109, 6 x109, 7 x109, 8 x109, 9 x109, 1x1010, 2 x1010, 3 x1010, 4 x1010, 5 x1010, 6 x1010, 7 x1010, 8 x1010, 9 x1010, 1 x1011, 2 x1011, 3 x1011, 4 x1011, 5x1011, 6 x1011, 7 x1011, 8 x1011, 9 x1011, 1x1012, 1.5 x1012, 2 x1012, 3　x1012, 4x1012, 5x1012, 또는 그 이상의 바이러스 입자 이하인 투여량에서 투여된다. 다양한 구현예에서, 본원에 기재된 바람직한 투여량은 제형 완충액의 적합한 부피, 예를 들어 약 0.1-10 mL, 0.2-8 mL, 0.3-7 mL, 0.4-6 mL, 0.5-5 mL, 0.6-4 mL, 0.7-3 mL, 0.8-2 mL, 0.9-1.5 mL, 0.95-1.2 mL, 또는 1.0-1.1 mL 의 부피로 투여된다. 당업자는 부피가 이들 값 중 임의의 것 (예를 들어, 약 0.5 mL 내지 약 1.1 mL) 을 경계로 하는 임의의 범위 내에 있을 수 있음을 알고 있다. 바이러스 입자의 투여는 전달을 위한 다양한 적합한 경로를 통해 일어날 수 있고, 예를 들어 이것은 주사에 의해 (예를 들어, 피부내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비강내로 (예를 들어, 흡입에 의해), 알약 형태로 (예를 들어, 삼킴, 질 또는 직장 전달용의 좌약) 에 의해 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, 피하 전달이 바람직할 수 있고, 수지상 세포에 대한 더 큰 접근을 제공할 수 있다.
바이러스 입자의 개체에 대한 투여이 반복될 수 있다. 바이러스 입자의 반복된 전달은 스케줄을 따를 수 있거나 또는 대안적으로, 필요한 근거에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원, 예를 들어 종양 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프, 단편, 변이체, 또는 이의 변이체 단편에 대항하는 개체의 면역성은, 부가적인 전달과 함께 필요한 만큼 시험되고 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 전달을 위한 스케줄은 규칙적인 간격으로의 바이러스 입자의 투여를 포함한다. 합동 전달 섭생은 스케줄이 잇는 기간 및/또는 투여 이전에 평가된 필요 기반 투여 기간 중 하나 이상을 포함하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 요법 섭생은 사망을 포함하는 임의의 이유에 대해 요법으로부터 제외될 때까지 매 3 주에 한번 투여, 예컨대 피하 투여, 이후 매 3 개월 마다 또다른 면역요법 치료를 포함할 수 있다. 또다른 예시 섭생은 매 3 주 마다 3 회의 투여 이후 매 3 개월 마다 또다른 세트의 3 회의 면역요법 치료를 포함한다.
또다른 예시 섭생은 첫번째 빈도로 첫번째 투여 횟수를 가진 첫번째 기간, 두번째 빈도로 두번째 투여 횟수를 가진 두번째 기간, 세번째 빈도로 세번째 투여 횟수를 가진 세번째 기간, 등, 및 임의로 필요한 만큼 미정된 투여 횟수를 가진 하나 이상의 기간을 포함한다. 각 기간 내에 투여 횟수는 독립적으로 선택될 수 있고, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 회, 또는 그 이상일 수 있다. 각 기간 내에 투여 빈도는 또한 독립적으로 선택될 수 있고, 예를 들어 약 매일, 매 격일, 매 3 일, 주 2 회, 주 1 회, 매 격주 1 회, 매 3 주, 매달, 매 6 주, 매 2 개월, 매 3 개월, 매 4 개월, 매 5 개월, 매 6 개월, 매년 등일 수 있다. 요법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 36 개월 까지, 또는 그 이상의 총 기간을 취할 수 있다.
면역화 사이의 스케줄된 간격은 면역화 사이의 간격이 간격의 5 분의 1, 4 분의 1, 3 분의 1, 또는 절반까지 교정되도록 변경될 수 있다. 예를 들어, 3-주 간격 스케줄의 경우, 면역화는 20 내지 28 일 (3 주 -1 일 내지 3 주 +7 일) 사이에 반복될 수 있다. 첫번째 3 회 면역화의 경우, 두번째 및/또는 세번째 면역화가 지연되는 경우, 후속 면역화는 면역화 사이의 최소 양의 완충이 가능하도록 이동될 수 있다. 예를 들어, 3 주 간격 스케줄에 대해, 면역화가 지연되는 경우, 후속 면역화는 이전 면역화 후 17, 18, 19, 또는 20 일보다 일찍 일어나지 않도록 스케줄을 정할 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 다양한 상태로, 예를 들어, 실온에서, 빙상에서 또는 동결되어 제공될 수 있다. 조성물은 적합한 크기의 용기, 예를 들어 2 mL 바이알의 바이알로 제공될 수 있다. 하나의 구현예에서, 1.0 mL 의 추출가능한 백신이 있는 1 개의 2 ml 바이알은 5x1011 총 바이러스 입자/mL 를 함유한다. 온도 및 습도를 포함하는 저장 조건은 다양할 수 있다. 예를 들어, 요법에서 사용하기 위한 조성물은 실온, 4 ℃, -20 ℃, 또는 그 이하에서 저장될 수 있다.
다양한 구현예에서, 일반적인 평가가 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따른 치료를 받는 개체에게 수행될 수 있다. 하나 이상의 임의의 시험이 필요한 만큼 또는 스케줄에 기반하여, 예컨대 0, 3, 6 주 등에 수행될 수 있다. 상이한 세트의 시험이 면역화가 있는 병행 대 면역화가 없는 시점에 수행될 수 있다.
일반적인 평가가 참여 의사에 의해 체중으로의 병력, ECOG 성능 점수, Karnofsky 수행 상태, 및 종합 신체 검사 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 환자가 마지막 방문 이후로 받고 있거나 받은 임의의 다른 치료, 의약, 생물제제, 또는 혈액 제품을 기록할 수 있다. 환자는 적합한 기간, 예를 들어 대략 30 분 동안 병원에 머무른 다음, 백신을 받아, 임의의 부작용을 모니터링할 수 있다.
특정 구현예에서, 각 백신의 투여 후 국부 및 전신 반응원성을 선택된 시간 동안, 예를 들어 3 일 동안 (면역화 날 및 그로부터 2 일 후) 매일 평가할 수 있다. 증상을 보고하기 위해 일기 카드를 사용할 수 있고, 국부 반응원성을 측정하기 위해 자를 사용할 수 있다. 면역화 주사 부위를 평가할 수 있다. 흉부, 복부 및 골반의 CT 스캔 또는 MRI 를 수행할 수 있다.
다양한 구현예에서, 혈액학적 및 생화학적 평가를 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따라 치료를 받는 개체에 수행한다. 하나 이상의 임의의 시험이 필요한 만큼 또는 스케줄에 기반하여, 예컨대 0, 3, 6 주 등에 수행될 수 있다. 상이한 세트의 시험이 면역화가 있는 병행 대 면역화가 없는 시점에 수행될 수 있다. 혈액학적 및 생화학적 평가는 하나 이상의, 화학 및 혈액학을 위한 혈액 검사, 차등의 CBC, Na, K, Cl, CO2, BUN, 크레아티닌, Ca, 총 단백질, 알부민, 총 빌리루빈, 알칼리 포스파타아제, AST, ALT, 글루코오스, 및 ANA 를 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 생물학적 마커는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따른 치료를 받는 개체에서 평가된다. 하나 이상의 임의의 시험이 필요한 만큼 또는 스케줄에 기반하여, 예컨대 0, 3, 6 주 등에 수행될 수 있다. 상이한 세트의 시험이 면역화가 있는 병행 대 면역화가 없는 시점에 수행될 수 있다.
생물학적 마커 평가는 적절한 부피의 혈청 샘플로부터의, 본원에 기재된 표적 항원 또는 바이러스 벡터에 대한 항체의 하나 이상의 측정을 포함할 수 있고, 예를 들어 약 5 ml 바이오마커가 결정되고 이용가능한지 검토될 수 있다.
다양한 구현예에서, 면역학적 평가를 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따른 치료를 받는 개체에 수행한다. 하나 이상의 임의의 시험이 필요한 만큼 또는 스케줄에 기반하여, 예컨대 0, 3, 6 주 등에 수행될 수 있다. 상이한 세트의 시험이 면역화가 있는 병행 대 면역화가 없는 시점에 수행될 수 있다.
연구 동안 특정 시점 및/또는 특정 횟수의 면역화 후 면역 반응에 대한 영향이 있는지를 측정하기 위해, 각각의 면역화 전 및 적어도 어느정도 면역화 후 시점에 말초 혈액, 예를 들어 약 90 mL 을 채취할 수 있다. 면역학적 평가는 ELISpot, 증식 어세이, 복합-파라미터 유세포측정 분석, 및 세포독성 어세이를 사용하는 표적 항원, 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프에 대한 T-세포 반응에 대해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 의 하나 이상의 어세이를 포함할 수 있다. 각 채혈로부터의 혈청을 보관하고 발송 및 측정하였다.
다양한 구현예에서, 종양 평가를 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따른 치료를 받는 개체에 수행한다. 하나 이상의 임의의 시험이 필요한 만큼 또는 스케줄에 기반하여, 예컨대 0, 3, 6 주 등에 수행될 수 있다. 상이한 세트의 시험이 면역화가 있는 병행 대 면역화가 없는 시점에 수행될 수 있다. 종양 평가는 치료 이전, 적어도 어느정도 면역화 후 시점 및 첫번째 치료의 선택된 횟수, 예를 들어 2, 3, 또는 4 회의 완료 후, 및 예를 들어 치료로부터 제외할 때까지, 대략 매 3 개월에 수행된 흉부, 복부 또는 골반의 CT 또는 MRI 스캔 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
표적 항원 예컨대 HER2/neu 항원 또는 에피토프에 대항하는 면역 반응을 면역 반응을 위한 하나 이상의 적합한 시험, 예컨대 ELISpot, 사이토카인 유세포측정, 또는 항체 반응을 사용하여 개체의 샘플, 예컨대 말초 혈액 샘플로부터 평가할 수 있다. 양성 면역 반응은 T-세포 반응을 측정함으로써 결정될 수 있다. T-세포 반응은 항원이 있는 6 개의 웰 중 배경에 조정된 스팟의 평균 수가 6 개의 대조군 웰 중의 스팟의 수를 10 을 넘고, 항원을 함유하는 6 개의 웰 및 6 개의 대조군 웰의 단일 값 사이의 차이가 Student's t-검정을 사용하여 p≤0.05 의 레벨에서 통계적으로 상당한 경우 양성인 것으로 고려될 수 있다. 면역원성 어세이는 각각의 면역화 이전에 그리고 치료 기간 동안 스케줄된 시점에 일어날 수 있다. 예를 들어, 치료의 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 20 , 24, 30, 36, 또는 48 주에서의 면역원성 어세이에 대한 시점은 심지어 스케줄된 면역화 없이 그 시간에 스케줄될 수 있다. 일부 경우에서, 개체는 이들이 적어도 최소 수의 면역화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 회, 또는 그 이상의 면역화를 받는 경우, 면역 반응에 대해 평가가능한 것으로 고려될 수 있다.
일부 구현예에서, 질환 진행 또는 임상적 반응 결정은 측정가능한/평가가능한 질환이 있는 환자 중 RECIST 1.1 기준에 따라 행해진다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법은 요법을 받은 개체에서 완전 반응 (Complete Response, CR; 표적 병변에 대한 모든 표적 병변의 소실 또는 모든 비-표적 병변의 소실 및 비-표적 병변에 대한 종양 마커 레벨의 정상화) 에 영향을 준다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법은 요법을 받은 개체에서 부분 반응 (Partial Response, PR; 표적 병변에 대해 기준선 합 LD 를 참고로 택할때, 표적 병변의 LD 의 합에서의 적어도 30% 감소) 에 영향을 준다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법은 요법을 받은 개체에서 안정한 질환 (Stable Disease, SD; 치료를 표적 병변에 대해 시작한 이래로 최소 합 LD 를 참고로 택할때, PR 에 대한 자격이 있는 충분한 위축도 PD 에 대한 자격이 있는 충분한 증가도 아님) 에 영향을 준다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법은 요법을 받은 개체에서 불완전 반응/안정한 질환 (SD; 비-표적 병변에 대한 하나 이상의 비-표적 병변(들) 의 지속 또는/및 정상 한계를 넘는 종양 마커 레벨의 유지) 에 영향을 준다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 요법은 요법을 받은 개체에서 진행성 질환 (Progressive Disease, PD; 치료를 시작한 이래로 기록된 최소 합 LD 를 참고로 택할때, 표적 병변의 LD 의 합에서의 적어도 20% 증가 또는 표적 병변에 대한 하나 이상의 신규한 병변의 출현 또는 하나 이상의 비-표적 병변(들) 의 지속 또는/및 비-표적 병변에 대한 정상 한계를 넘는 종양 마커 레벨의 유지) 에 영향을 준다.
XV. 키트
본원에 기재된 조성물, 면역요법, 또는 백신은 키트의 형태로 공급될 수 있다. 본 명세서의 키트는 치료 섭생 정보를 포함하는 투여량 및 또는 투여에 관한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 기재된 면역요법 또는 백신을 제공하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 키트 성분의 투여에 유용한 성분 및 성분을 어떻게 제조하는지에 대한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 적합한 실험실 시험으로의 치료 전 후에 환자, 또는 커뮤니케이션 결과 및 의료진과의 환자 데이터 모니터링을 수행하기 위한 소프트웨어를 추가로 포함할 수 있다.
키트에 포함되는 성분은 건조 또는 액체 형태일 수 있다. 이들이 건조 형태인 경우, 키트는 건조된 물질을 가용화시키는 용액을 포함할 수 있다. 키트는 또한 액체 또는 건조 형태로의 전달 인자를 포함할 수 있다. 전달 인자가 건조 형태인 경우, 키트는 전달 인자를 가용화시키는 용액을 포함할 것이다. 키트는 또한 성분을 혼합 및 제조하기 위한 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 투여를 돕는 기구, 예컨대 예를 들어 바늘, 튜브, 어플리케이터, 흡입기, 주사기, 파이펫, 포셉, 측정 스푼, 점안기 또는 임의의 이러한 의학적으로 승인된 전달 비히클을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 키트 또는 약물 전달 시스템은 또한 전형적으로 시판 판매 및 배급을 위해 밀폐된 상태로 본 명세서의 조성물을 함유하기 위한 수단을 포함할 것이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 증명하기 위해 포함된다. 당업자에게는 이어지는 실시예에 기재된 기술이 본 발명의 실시에서 잘 작용하도록 발명자에 의해 발견되는 기술을 나타내는 것으로 인식되어야만 하고, 그러므로 이의 실시를 위해 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다. 그러나, 당업자는 본 명세서의 견지에서, 본 발명의 범주 및 취지로부터 벗어남 없이 기재되는 특정 구현예에 많은 변화가 일어날 수 있으며 유사한 결과를 여전히 수득할 수 있다는 것을 인지해야만 한다.
실시예 1
Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 구축
본 실시예는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 구축을 설명한다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 백본의 구축은 이전에 기재되어 있다. pBHG11 의 대략 20 kb Xba-BamHI 서브단편을 pBluescriptKSII+ (Stratagene, La Jolla, Calif.) 내에 서브클로닝하여, pAXB 를 산출하였다. 플라스미드 pAXB 를 BspEI 로 소화시키고, T4 DNA 폴리머라아제로 말단을 채우고, BamHI 소화시키고, 대략 9.0 kb 단편을 단리하였다. 플라스미드 pAXB 를 또한 BspHI 로 소화시키고, T4 DNA 폴리머라아제로 말단을 채우고, BamHI 소화시키고, 대략 13.7 kb 단편을 이전에 단리된 9.0 kb 단편에 라이게이션하여, pAXB-Δpol 을 생성하였다.
상기 서브클러닝 전략으로 폴리머라아제 유전자의 아미노 말단 내에서 608 bp (Δpol; Ad5 뉴클레오티드 7274 내지 7881) 를 결실시켰다. 상기 결실은 또한 Ad 게놈의 상기 영역 내의 우측방향 해독 가닥 상에 존재하는 개방 해독 프레임 9.4 를 효과적으로 제거하였다. pAXB-Δpol 의 Xba-BamHI 서브단편을 Xba-BamHI-소화된 pBHG11 에 재도입하여, pBHG11-Δpol 을 생성하였다.
실시예 2
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신의 구축
본 실시예는 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신의 구축을 설명한다. 최소 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서 요소 및 SV40 유래된 폴리 아데닐화 신호가 측접하는 절단된 HER2/neu 이식유전자를 셔틀 pShuttleCMV 내에 서브클로닝하여, 셔틀 플라스미드 pShuttle CMV/HER2/neu 를 생성하였다. 셔틀 플라스미드를 PmeI 로 선형화시키고, 플라스미드 pAdΔpp 로 (E.coli 박테리아에서) 상동 재조합하여, pAdCMV/HER2/neu/Δpp 를 생성하였다 (도 1).
PacI 로 선형화된 10 마이크로그램의 pAdCMV/HER2/neu/Δpp 를 Ad E1, 폴리머라아제 (E2b) 및 pTP-발현 (E.C7 세포) 내로 CaPO4 공동트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 16 시간에, 세포를 수확하고, 세포 혼합물을 9 개의 24-웰 조직 배양 클러스터 플레이트 내에 분배하고, 37 ℃ 에서 5 내지 9 일 동안 인큐베이션하였다. 바이러스 세포변성 효과를 나타내는 개별 웰을 수확하고, 단리된 바이러스를 다수의 E.C7 세포의 반복된 감염에 의해 증폭시켰다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 재조합 벡터의 단리는 이후에 (1) 벡터 게놈의 DNA 제한효소 맵핑, (2) HER2/neu 의 발현의 확인 및 (3) 다중 기능 연구에 의해 확인하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 벡터의 완전한 서열은 SEQ ID NO: 3 에서 발견된다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 벡터의 완전한 서열 (SEQ ID NO: 3) 중의 CMV 프로모터 서열은 SEQ ID NO: 4 에서 발견된다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 벡터의 완전한 서열 (SEQ ID NO: 3) 중의 SV40 polyA 꼬리 서열은 SEQ ID NO: 5 에서 발견된다.
실시예 3
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 전임상 독물학의 평가
본 실시예는 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 전임상 독물학의 평가를 기술한다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 반복-투여 독성을 BALB/c 마우스에서 GLP 연구에서 평가하였다. 연구는 8 개의 그룹: 4 개의 비히클 대조 그룹 (그룹 1 내지 4) 및 4 개의 시험 물품 처리 그룹 (그룹 5 내지 8) 으로 이루어졌다. 마우스를 제 1, 22, 및 43 일에 1.7 x 108 바이러스 입자 (VP)/투여량으로의 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 로 면역화하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 1.7 x 108 VP/투여량 (8.3 x 109 VP/kg) 의 투여량은 인간 체중을 60 kg 로 가정하고, 마우스 체중을 0.02 kg 으로 가정하여, 인간에서 5 x 1011 VP/투여량 (8.3 x 109 VP/kg) 의 최고 제안된 투여량의 마우스-대-인간 등량이다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 를 마우스에 피하 제공하였고, 이것은 또한 환자에 대한 의도된 투여 경로이다.
전반적인, Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 는 마우스에서 잘 용인되었다. 일단 마우스가 죽으면, Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신과 연관되지 않은 것으로 고려하였다. 케이지-사이드 및 실제 관찰 동안 관찰된 임상 징후 중 어느 것도 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신과 관련된 것으로 고려되지 않았다. 모든 다른 동물은 스케줄된 희생까지 생존하였다. 홍반 및 부종이 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu-치료된 동물의 일부에서 눈에 띄었으나, 홍반은 일반적으로 하루만 발생하였다. 홍반의 낮은 발병률 및 심각성으로 인해, 이것은 독물학적으로 유의한 것으로 고려되지 않는다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 로의 치료는 체중, 체중 증가, 또는 식품 섭취에 임의의 독물학적으로 유의한 영향을 갖지 않았다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신의 피하 주사로부터의 효과의 임의의 간격으로의 임상 병리학, 기관 중량, 또는 조직병리학 데이터에서는 증거가 없다.
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신으로의 치료는 혈액 계수; 프로트롬빈 시간 (PT); 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간; 소듐, 포타슘, 클로라이드, 칼슘, 크레아틴 포스포키나아제, 아스파테이트 아미노트랜스페라아제, 알라닌 아미노트랜스페라아제, 알칼리 포스파타아제, 글루코오스, 혈액 우레아 질소, 크레아티닌, 콜레스테롤, 총 빌리루빈, 총 단백질, 알부민, 및 글로불린의 레벨; 및 알부민/글로불린 비에 생물학적으로 유의한 영향을 갖지 않았다 (표 4-5).
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그룹 1: ARM 완충액 대조군을 제 1 일에 처리함; 혈액을 제 14 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 14 일에 희생됨.
그룹 2: ARM 완충액 대조군을 제 1 및 22 일에 처리함; 혈액을 제 28 일에 응고 파라미터 및 항체 분석을 위해 수집함; 제 28 일에 희생됨.
그룹 3: ARM 완충액 대조군을 제 1, 22 및 43 일에 처리함; 혈액을 제 3 일에 혈액학 및 임상 화학을 위해 수집함; 혈액을 제 45 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 45 일에 희생됨.
그룹 4: ARM 완충액 대조군을 제 1, 22 및 43 일에 처리함; 혈액을 제 28 일에 혈액학 및 임상 화학을 위해 수집함; 혈액을 제 67 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 67 일에 희생됨.
그룹 5: Ad5 [E1-E2b-]- HER2/neu 를 제 1 일에 처리함; 혈액을 제 14 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 14 일에 희생됨.
그룹 6: Ad5 [E1-E2b-]- HER2/neu 를 제 1 및 22 일에 처리함; 혈액을 제 28 일에 응고 파라미터 및 항체 분석을 위해 수집함; 제 28 일에 희생됨.
그룹 7: Ad5 [E1-E2b-]- HER2/neu 를 제 1, 22 및 43 일에 처리함; 혈액을 제 3 일에 혈액학 및 임상 화학을 위해 수집함; 혈액을 제 45 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 45 일에 희생됨.
그룹 8: Ad5 [E1-E2b-]- HER2/neu 를 제 1, 22 및 43 일에 처리함; 혈액을 제 28 일에 혈액학 및 임상 화학을 위해 수집함; 혈액을 제 67 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 67 일에 희생됨.
↑, 증가는 통계적으로 유의하였다 (p < 0.05).
↓, 감소는 통계적으로 유의하였다 (p < 0.05).
-, 통계적으로 유의하지 않음.
공급처: NantBioScience, 데이터는 파일 상에.
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그룹 1: ARM 완충액 대조군을 제 1 일에 처리함; 혈액을 제 14 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 14 일에 희생됨.
그룹 2: ARM 완충액 대조군을 제 1 및 22 일에 처리함; 혈액을 제 28 일에 응고 파라미터 및 항체 분석을 위해 수집함; 제 28 일에 희생됨.
그룹 3: ARM 완충액 대조군을 제 1, 22 및 43 일에 처리함; 혈액을 제 3 일에 혈액학 및 임상 화학을 위해 수집함; 혈액을 제 45 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 45 일에 희생됨.
그룹 4: ARM 완충액 대조군을 제 1, 22 및 43 일에 처리함; 혈액을 제 28 일에 혈액학 및 임상 화학을 위해 수집함; 혈액을 제 67 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 67 일에 희생됨.
그룹 5: Ad5 [E1-E2b-]- HER2/neu 를 제 1 일에 처리함; 혈액을 제 14 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 14 일에 희생됨.
그룹 6: Ad5 [E1-E2b-]- HER2/neu 를 제 1 및 22 일에 처리함; 혈액을 제 28 일에 응고 파라미터 및 항체 분석을 위해 수집함; 제 28 일에 희생됨.
그룹 7: Ad5 [E1-E2b-]- HER2/neu 를 제 1, 22 및 43 일에 처리함; 혈액을 제 3 일에 혈액학 및 임상 화학을 위해 수집함; 혈액을 제 45 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 45 일에 희생됨.
그룹 8: Ad5 [E1-E2b-]- HER2/neu 를 제 1, 22 및 43 일에 처리함; 혈액을 제 28 일에 혈액학 및 임상 화학을 위해 수집함; 혈액을 제 67 일에 혈액학, 임상 화학, 및 응고 파라미터를 위해 수집함; 제 67 일에 희생됨.
↑, 증가는 통계적으로 유의하였다 (p < 0.05).
↓, 감소는 통계적으로 유의하였다 (p < 0.05).
-, 통계적으로 유의하지 않음.
공급처: NantBioScience, 데이터는 파일 상에.
실시예 4
Ad5 [E1-, E2b-]- HER2/neu 백신 (주사용 현탁액) 의 제조
본 실시예는 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신 (주사용 현탁액) 의 제조를 기술한다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신 (주사용 현탁액) 은 복제 결함성, 아데노바이러스 벡터 시스템이다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 및 개질된 HER2/neu 유전자 삽입물을 포함하는 HER2/neu-표적화 백신이다. HER2/neu 유전자 삽입물은 세포외 도메인 및 막관통 영역으로 이루어지는, 절단된 인간 HER2/neu 단백질을 엔코딩한다. 종양원성 활성을 도출하는 키나아제 도메인을 함유하는 전체 세포내 도메인을 제거하였다.
약학 특성
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 는 E1 유전자의 제거, E2b 및 E3 유전자 내에 결실, 및 세포외 도메인 및 막관통 영역으로 이루어지는, 인간 HER2/neu 에 대한 절단된 유전자의 삽입에 의해 개질된 재조합 복제-결함성 Ad5 벡터이다. 종양원성 활성을 도출하는 키나아제 도메인을 함유하는 전체 세포내 도메인을 제거하였다 (Gabitzsch ES and Jones FR. J Clin Cell Immunol. 2011a;S4:001, Hartman ZC, Wei J, Osada T, et al. An adenoviral vaccine encoding full-length inactivated human HER2/neu exhibits potent immunogenicty and enhanced therapeutic efficacy without oncogenicity. Clin Cancer Res. 2010;16:1466-1477).
우발성 안정성 작용제 평가
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 는 E1, E2b, 및 E3 영역 내의 상당한 결실 및 인간 HER2/neu 유전자의 삽입에 의해 개질되었다. 산출되는 복제-결함성 바이러스 벡터는 트랜스로 (in trans) 결실된 E1 및 E2b 유전자 생성물을 공급할 수 있는 전매 인간 배아 신장 293 세포주 (E.C7) 에서 증식될 수 있다. 그러나, 복제 적격 아데노바이러스가 E.C7 (293) 세포주에 있는 E1 및 E2b 서열과의 재조합에 의해 아데노바이러스 바이러스 입자의 제조 동안 형성될 수 있을 것이라는 이론적인 가능성이 있다. 따라서, 복제 적격 아데노바이러스에 대한 민감성 시험이 상기 백신에 대한 방출 시험 내에 포함되었다.
E.C7 Master Cell Bank (MCB) 및 Master Viral Bank (MVB) 를 광범위한 패널의 바이러스에 대해 시험하였고, 모든 결과는 음성이었다. 부가적으로, MCB 또는 MVB 에서 박테리아, 진균, 또는 마이코플라즈마 오염이 검출되지 않았다.
하나의 동물-유래 성분, 우태혈청 (FBS) 을 E.C7 세포 팽창을 위한 성장 배지에 사용하였다. 오스트리아-공급처 FBS 는 생물학적 생산에 사용되는 동물 기원의 성분에 대한 9 CFR 113.53 Requirements 를 준수하는 것으로 보증되었다.
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 를 2-mL 단일-투여량 바이알에 멸균된, 맑은 현탁액으로서 공급하였다. 백신은 1 mL 당 5 x 1011 VP 의 농도로 제공하였고 ARM 제형 완충액 (20 mM TRIS, 25 mM NaCl, 2.5% 글리세롤, pH 8.0) 을 함유하였다. 각각의 바이알은 대략 1.1 mL 의 백신을 함유하였다.
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 는 사용 전까지 ≤ -20℃ 에서 조제실에 보관하였다. 주사 전, 적합한 바이알을 냉동고로부터 꺼내, 통제된 실온 20-25℃ (68-77°F) 에서 20-30 동안 해동하였고, 그 후 이것은 2-8℃ (35-46°F) 로 보관해야만 한다.
실시예 5
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 암 백신의 전임상 연구
본 실시예는 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 암 백신의 전임상 연구를 기술한다. 연구는 BALB/c 마우스 모델에서 암 백신으로서 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 를 평가하기 위해 수행되었다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 는 Ad5-나이브 및 Ad5-면역 마우스에서 HER2/neu 에 대항하는 강력한 CMI 를 유도하였다. 체액성 반응이 유도되었고, 항체는 시험관 내에서 보체의 존재 하에 HER2/neu-발현 종양 세포를 용해시키는 능력을 입증하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 는 HER2/neu-발현 종양의 성립을 예방하였으며 Ad5-나이브 및 Ad5-면역 쥣과 모델에서 성립된 종양의 진행을 상당히 억제하였다. 이들 데이터는 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 생체 내 전달이 항-HER2/neu 면역성을 유도하고, HER2/neu-발현 암의 진행을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
전임상 연구 및 주목할만한 결과는 표 6 에 제시된다
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실시예 6
절제불가능 국부 진행성 또는 전이성 HER2/neu-발현 유방암을 가진 대상에서의 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신화의 제 I 상 연구
본 실시예는 절제불가능, 국부 진행성 또는 전이성 HER2/neu-발현 (IHC 1+ 또는 2+) 유방암을 가진 대상에서의 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신화의 제 I 상 연구를 기술한다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신을 3 주 동안 주 1 회 (총 3 회 주사) 피하 (SC) 투여하고, 이어서 HER2/neu-발현 유방암을 가진 대상에게 3-개월 간격으로 3 회의 부스트 주사를 투여한다. 상기 백신 섭생의 전체적인 안정성을 측정하고, Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신의 제 2 상에서 권고되는 투여량을 확인한다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 로 치료된 HER2/neu-발현 유방암을 가진 대상에서 객관적인 반응율 (ORR), 질환 통제율 (DCR), 반응 지속기간, 무-진행 생존률 (PFS), 및 전체적인 생존률 (OS) 의 예비 평가를 진행하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 면역원성을 평가하고, 유전자 돌연변이, 유전자 증폭, RNA-발현 레벨, 및 단백질-발현 레벨을 확인하기 위해 대상의 종양의 게놈 및 단백질체 프로파일을 결정한다. 게놈/단백질체 프로파일 및 효능 결과 사이의 상관관계를 또한 평가한다.
임상 연구 요약을 표 7 에 제공한다.
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이차 종결점은 Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) Version 1.1. 에 따른 ORR (완전 또는 부분 반응을 확인함), DCR (적어도 6 개월 동안 지속되는 반응 또는 안정한 질환을 확인함), 반응 지속기간, 무-진행 생존률 (PFS), 및 전체적인 생존률 (OS) 을 포함한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 면역원성은 T-세포 빈도의 유세포측정 분석, 활성화 상태, 사이토카인 프로파일, 및 항체 레벨에 의해 평가된다. 유전적 및 단백질체 프로파일을 수행하고 효능과 연관시킨다.
연구 디자인
제 I 상 시험을 절제불가능, 국부 진행성 또는 전이성 HER2/neu-저 발현 (IHC 1+ 또는 2+) 유방암을 가진 대상을 포함시켜 수행한다. 연구를 두 부분에서 수행한다: 첫번째 부분은 3 + 3 디자인을 사용하는 용량 단계확대 (escalation) 를 수반하고, 두번째 부분은 안전성, 예비 효능, 및 면역원성을 추가로 평가하기 위한 최대 용인 투여량 (MTD) 또는 최고 시험 투여량 (HTD) 의 확대를 수반한다. 첫번째 부분에서, 3 내지 6 명의 대상을 투여량 코호트 1 에서 시작하여 연속적으로 등록한다. 코호트 1 은 5 x 1010 바이러스 입자 (VP) 를 받고, 코호트 2 는 5 x 1011 VP 를 받고, 필요하다면, 투여량 단계축소 (de-escalation) 코호트 (코호트 -1) 는 5 x 109 VP 를 받는다. 대상을 투여량-제한 독성 (DLT) 에 대해 평가한다. 투여량 확대는 MTD 또는 HTD 가 결정되었을 때 발생한다. 부가적인 12 명의 대상을 MTD 또는 HTD 에서 총 18 명의 대상에 대해, 시험의 용량 확대 성분에 등록한다. 제안된 연구 계획도는 도 2 에 제시된다.
용량-단계확대 성분에서, 3 내지 6 명의 대상을 투여량 코호트 1 에서 출발하여 연속적으로 등록한다 (표 8). 특정 코호트 등록 동안, 등록하는 연속 대상 사이에 최소 7 일을 둔다. DLT 를 연속적으로 모니터링한다.
DLT 는 National Cancer Institute (NCI) Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) Version 4.03 에 의해 정의되는 바와 같이 임의의 등급 3 또는 더 높은 독성 또는 임의의 등급 2 또는 더 높은 자가면역 반응 또는 즉각적인 과민감성 반응으로서 정의된다. 용량 단계확대를 표 8 에 제시한 바와 같이 수행한다. 환자-내 용량 단계확대는 허용되지 않는다.
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코호트 1 에서, 초기 3 명의 대상 중 아무도 DLT 를 경험하지 않는다면, 코호트 2 에 대한 용량 단계확대를 시작한다. 초기 3 명의 대상 중 한 명이 DLT 를 경험하는 경우, 3 명의 부가적인 대상을 총 6 명의 대상에 대해, 코호트 1 에 등록한다. 6 명의 대상 중 한 명 이하가 DLT 를 경험하는 경우, 코호트 2 에 대한 용량 단계확대를 시작한다. 초기 3 명의 대상 또는 6 명의 총 대상 중 2 명 이상이 DLT 를 경험하는 경우, 단계축소 코호트 -1 로의 등록을 시작한다.
코호트 2 에서, 초기 3 명의 대상 중 한 명 이하가 DLT 를 경험하는 경우, 3 명의 부가적인 대상을 총 6 명의 대상에 대해, 코호트 2 에 등록한다. 6 명의 대상 중 한 명 이하가 DLT 를 경험하는 경우, 상기 용량 레벨을 HTD 로서 정의한다. 초기 3 명의 대상 중 2 명 이상, 또는 총 6 명의 대상 중 2 명 이상이 DLT 를 경험하는 경우, 다음 더 낮은 용량 레벨로의 등록을 다음과 같이 재개할 수 있다. 3 명의 대상이 코호트 1 에서 치료되는 경우, 3 명의 부가적인 대상을 총 6 명의 대상에 대해 상기 용량 레벨로 등록한다. 6 명의 대상 중 한 명 이하가 DLT 를 경험하는 경우, 상기 용량을 MTD 로서 정의한다. 6 명의 대상 중 2 명 이상이 DLT 를 경험하는 경우, 단계축소 코호트 -1 로의 등록을 시작한다. 부가적으로, 6 명의 대상이 코호트 1 에서 치료되는 경우, 상기 용량을 MTD 로서 정의한다.
용량 단계축소 코호트 -1 에서, 초기 3 명의 대상 중 한 명 이하가 DLT 를 경험하는 경우, 3 명의 부가적인 대상을 총 6 명의 대상에 대해, 단계축소 코호트 -1 로 등록한다. 6 명의 대상 중 한 명 이하가 DLT 를 경험하는 경우, 상기 용량 레벨을 MTD 로서 정의한다. 초기 3 명의 대상 중 2 명 이상이, 또는 총 6 명의 대상 중 2 명 이상이 DLT 를 경험하는 경우, 투여를 유예하고, 연구를 재평가한다.
용량 확대는 모든 이용가능한 안전성 및 실험실 결과가 안전성 검토 위원회 (SRC) 에 의해 검토된 후, MTD 또는 HTD 가 결정되었을 때 일어난다. 부가적인 12 명의 대상을 MTD 또는 HTD 에서 총 18 명의 대상에 대해, 연구의 용량 확대 성분에 등록한다.
연구 주사의 일시적 유예를 촉발시키는 안전성 사건은 연구 작용제가 가능하게 관련된 사망, 연구 작용제가 가능하게 관련된 2 회의 등급 4 독성 사건, 단계축소 코호트 -1 중의 첫번째 6 명의 등록된 대상 중 한 명 초과가 DLT 를 경험하는 경우, 또는 확대 상 동안의 어느 시점이든 대상의 33% 초과가 연구 주입과 가능하게 관련된 등급 3 또는 4 주요 기관 독성을 경험하는 경우를 포함한다.
대상
30 명까지의 대상을 연구에 등록한다. 대상은 HER2/neu 를 발현하는 절제불가능 국부 진행성 또는 전이성 유방암 (IHC 1+ 또는 2+) 을 조직학적으로 확인받았다. HER2/neu IHC 3+ 종양이 있는 대상은 배제한다. 용량 단계확대 성분에서, 3 내지 6 명의 대상을 용량 코호트 1 에서 시작하여 연속적으로 등록한다. 용량 단계확대 성분에서 (즉, 일단 MTD 또는 HTD 가 확인되었음), 부가적인 12 명의 대상을 안전성, 예비 효능, 및 면역원성 데이터를 추가로 수득하기 위해 MTD/HTD 코호트에서 총 18 명의 대상에 대해, 등록한다.
치료의 지속기간
각각의 대상은 이들이 진행성 질환 또는 허용불가능한 독성을 경험하거나, 동의를 철회하거나, 또는 연구자가 치료를 지속하는 것이 더이상 최선이 아니라고 느낄 때까지, 대략 42 주의 치료 (0, 3, 및 6 주에 주사하고, 18, 30, 및 42 주에 부스트 주사함) 에 있는 것으로 예상된다. 대상에 대한 추정되는 치료의 지속기간은 대상의 질환, Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 를 용인하는 능력, 연구에 참여하려는 의향, 또는 연구자가 치료를 지속하는 것이 더이상 최선이 아니라고 느끼는 것에 따라 더 길거나 더 짧을 수 있다.
용량 변경
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 를 하기 이유 중 임의의 것에 대해 보류한다: CTCAE Version 4.03 에 의해 정의되는 임의의 등급 3 또는 더 큰 독성, 임의의 등급 2 또는 더 높은 자가면역 반응 또는 즉각적인 과민감성 반응, 사전치료 값으로부터 좌심실 박출율 (LVEF) 에서의 16% 미만, 또는 16%, 절대 감소, 기관 정의된 정상의 하한 (LLN) 미만의 LVEF 및 사전치료 값으로부터 LVEF 에서의 10% 초과, 또는 10%, 절대 감소.
HER2/neu 는 하기 이유 중 임의의 것에 대해 영구적으로 중단된다: Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 가 가능하게 관련된 임의의 과민감성 반응, 생명-위협적 아나필락시스 반응, 감소된 LVEF 와 함께 울혈성 심부전 징후를 발현시키는 대상, 임의의 생명-위협적 부작용, 등급 3 또는 그 이상의 주사 부위 반응 (예를 들어, 궤양, 괴사), 주사에 기인하는 등급 4 독성 (열 제외), 또는 48 시간 넘게 지속되는 등급 4 열.
하기는 투여 지연에 허용가능한 조건이다. 첫째, 처음 3 회 백신의 투여는 매 3 주 스케줄 (0, 3, 및 6 주) 에 제공되어만 하고, 충돌 시에는, 5-일 윈도우가 허용가능하다. 두번째, 스케줄된 백신화 시간에 존재하는 미관련된 급성 질병의 경우에는, 투여는 증상이 가라앉을 때까지 지연될 수 있거나, 또는 대상은 연구자의 재량으로 철회될 수 있고, 3 주까지의 지연은 상기 설정에서 허용가능한 것으로 고려된다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 에 대한 투여량 감소는 없다. 허용되는 수반 약물은 병행 비스포스포네이트 요법이다.
포함 기준
제 I 상 임상 시험에 대한 대상 자격은 포함 기준 및 배제 기준에 의해 정의된다. 포함 기준은 하기를 포함한다: 연령 18 세 이상, 남성 또는 여성, Institutional Review Board (IRB) 의 가이드라인을 이행한다는 서명된 사전 동의를 이해하고 제공하는 능력, HER2/neu 를 발현하는 조직학적으로 확인된 절제불가능 국부 진행성 또는 전이성 유방암 (IHC 1+ 또는 2+), 이용가능한 가장 최근의 전이성 생검 샘플로부터 유래됨, 분석 (기록 조직도 허용됨) 에 이용가능한 종양 조직 (블록 또는 슬라이드) 및 전혈 샘플, 및 0 또는 1 의 Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) 수행 상태.
추가로, 이전 HER2/neu-표적화 면역요법 (백신) 을 받은 대상은 본 치료를 등록 적어도 3 개월 전에 중단하였던 경우 이 실험에 대해 자격이 있다. 이전 화학요법, 방사선요법, 또는 수술 절차의 모든 독성 부작용은 NCI CTCAE 등급 ≤ 1 로 귀결되었다. 공지된 면역억제 이력을 갖지 않은 의약을 섭취하는 대상은 본 실험에 대해 자격이 있다. 부가적으로, 스크리닝시 적절한 혈액학적 기능은 하기와 같이 정의된다: 백혈구 계수 ≥ 3000/마이크로리터, 헤모글로빈 ≥ 9 g/dL (상기 레벨을 달성하기 위해 수혈하거나 에리트로포이에틴을 사용할 수 없음), 혈소판 ≥ 75,000/마이크로리터, 프로트롬빈 (PT)-국제 표준화 비 (INR) < 1.5, 및 부분 트롬보플라스틴 시간 (PTT) < 1.5 x 정상의 상한 (ULN). 스크리닝시 적절한 신장 및 간 기능은 하기와 같이 정의된다: 혈청 크레아티닌 < 2.0 mg/dL, 빌리루빈 < 1.5 mg/dL (빌리루빈 ≤ 2.0 mg/dL 를 허용하는 길버트 증후군 제외), 알라닌 아미노트랜스페라아제 (ALT) ≤ 2.5 x ULN, 및 아스파테이트 아미노트랜스페라아제 (AST) ≤ 2.5 x ULN.
적격성에 부가적으로, 포함 기준은 또한 LVEF ≥ 기관 LLN 의 멀티게이트 습득 (MUGA) 스캔 또는 심장초음파진단 (동일한 영상화 양식이 연구 전반에 사용되어짐) 을 포함한다. 가임 여성 여성 대상 및 폐경 발생 이래로 12 개월 미만의 여성은 연구 지속기간 동안 그리고 연구 의약의 마지막 주사 후 4 개월 동안 허용가능한 피임 방법을 사용하는데 동의해야만 한다. 피임을 사용하는 경우, 하기 예방책 중 2 가지를 사용해야만 한다: 파트너의 정관절제술, 나팔관 결찰, 질 격막, 자궁 내 피임 기구, 콘돔 및 살정제 (젤/폼/크림/질 좌약), 또는 절대 금주. 남성 대상은 외과적으로 멸균되어야만 하고 또는 그들 파트너와 콘돔 및 허용가능한 피임 방법을 사용하기로 동의해야만 한다. 폐경-후 여성 대상은 연속 12 개월 초과 동안 생리가 없는 자들로 정의된다. 마지막으로, 포함 기준은 적절한 팔로우 업을 위한 필요한 연구 방문 참석 및 복귀할 능력을 포함한다.
배제 기준
제 I 상 임상 시험에 대한 대상 자격은 포함 기준 및 배제 기준에 의해 정의된다. 배제 기준은 하기를 포함한다: HER2/neu IHC 3+ 종양이 있는 대상, 트라스투주맙, 페투주맙, T-DM1, 및 라파티닙을 포함하는 지속중인 HER2/neu-지시된 요법을 받는 대상, 본 연구 동안 30 일의 스크리닝 내에 연구중인 약물 또는 장치 연구에 참여하는 대상, 임신 및 수유 중인 여성, 및 지속중인 팔보시클립, 에베롤리무스를 받는 대상, 또는 면역 반응의 유도를 간섭하는 다른 유방암 요법.
부가적인 배제 기준은 병행 세포독성 화학요법 또는 방사선 요법을 받은 대상을 포함한다. 임의의 다른 이전 화학요법 (또는 방사선요법) 및 연구 치료 사이에 적어도 1 개월이 있어야만 한다. 임의의 이전 HER2/neu-표적화 면역요법 (백신) 은 연구 치료 개시 전 적어도 3 개월 중단해야만 한다. 대상은 본 연구를 위한 스크리닝 전 이전 치료로부터의 모든 급성 독성으로부터 회복되어야만 한다.
추가의 배제 기준은 활성 뇌 또는 중추 신경계 전이, 항경련제 치료를 필요로 하는 발작, 뇌혈관 사고 (< 6 개월), 또는 일과성 뇌허혈 발작을 가진 대상, 예컨대 염증성 장 질환, 전신 루프스 홍반, 강직성 척추염, 피부경화증, 또는 다발성 경화증 (자가면역-관련 갑상선 질환 및 백반증이 허용됨) 에 제한되지 않는 자가면역 질환 (활성 또는 과거) 이력을 가진 대상, 심각한 병발 만성 또는 급성 질병, 예컨대 심장 또는 폐 질환, 간 질환, 또는 조사 약물 치료에 대해 고 위험으로서 고려되는 다른 질병을 가진 대상, 심장 질환, 예컨대 울혈성 심부전 (New York Heart Association 기능 분류에 의해 정의된 클래스 II, III, 또는 IV) 이력, 불안정한 또는 열악하게 통제된 협심증 이력, 또는 심실 부정맥 이력 (< 1 년) 을 가진 대상, 및 프로토콜 대로 요법을 받는 대상의 능력을 손상시킬 또는 프로토콜 또는 프로토콜-요구 방문 및 절차를 준수할 능력을 손상시킬 의료적 또는 심리적 장애를 가진 대상이다.
악성종양 이력은 또한 하기를 제외하고는 배제 기준이다: 적절하게 치료된 비-흑색종 피부암, 제자리 자궁경부 암종, 표피상 방광암, 또는 5 년 초과 동안 치료 없이 완전한 차도 있는 다른 암종. 인간 면역결핍 바이러스 (HIV, 효소-연결 면역흡착 어세이 [ELISA] 에 의해 측정되고 웨스턴 블롯에 의해 확인되는 바와 같음) 및 간염 B 및 간염 C 바이러스 (HBV/HCV, HBsAg 및 간염 C 혈청학에 의해 결정되는 바와 같음) 를 포함하는, 공지된 활성의 급성 또는 만성 감염의 존재는 배제 기준으로 고려된다. 전신 정맥내 또는 경구 스테로이드 요법 (또는 기타 면역억제제, 예컨대 아자티오프린 또는 시클로스포린 A) 을 받는 대상은 잠재적 면역 억제를 근거로 배제된다. 대상은 등록 전 임의의 스테로이드 요법 (화학요법에 대한 예비-의약 또는 조영-증강 연구로서 사용되는 것을 제외하고) 의 적어도 6 주 중단을 가져야만 한다.
연구 생성물의 임의의 성분에 대한 공지된 알러지 또는 과민감성을 가진 대상이 배제된다. 사지의 피부 내로의 주사 또는 잠재적 피부 반응의 후속 평가를 간섭하는 급성 또는 만성 피부 장애가 있는 대상은 배제된다. 마지막으로, 대상을 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 첫번째 계획된 투여의, 각각 28 일 또는 14 일 내에, 생 (약독화된) 백신 (예를 들어, FluMist®) 또는 치사된 (비활성화된)/서브유닛 백신 (예를 들어, PNEUMOVAX®, Fluzone®) 으로 백신화하였다.
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 투여 제제
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신에 대한 제품명, 투여 형태, 단위 투여량, 투여 경로, 물리적 설명, 및 제조사를 표 9 에 요약한다.
Figure pct00018
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 주사된 투여량은 1 mL 당, 5 x 109 VP (단계축소 코호트 -1 의 경우), 5 x 1010 VP (코호트 1), 또는 5 x 1011 VP (코호트 2) 이다. 주사 전, 적합한 바이알을 냉동고로부터 꺼내, 통제된 실온 (20-25℃, 68-77°F) 에서 적어도 20 분 30 분 이하 동안 해동하였고, 그 후 이것은 2-8℃ (35-46°F) 로 보관해야만 한다.
각각의 바이알을 고무 마개로 밀폐시키고 백색의 플립-오프 (flip-off) 밀봉을 갖는다. 제품의 최종 사용자는 엄지손가락으로 캡의 백색의 플라스틱 부분을 위/아래로 뒤집어 고무 마개를 노출시킨 다음, 마개를 주사 바늘로 뚫고 액체를 빼낸다. 고무 마개는 알루미늄-고정된 밀봉을 가진 바이알로 고정된다. 해동된 바이알을 흔든 다음, 무균 기술을 사용하여, 약사는 1-mL 주사기를 사용하여 적절한 바이알로부터 적절한 부피를 빼낸다.
백신 투여량은 1 내지 1/2 인치, 20 내지 25 게이지 바늘을 사용하여 가능한 한 빨리 주사한다. 백신을 즉시 주사할 수 없는 경우, 주사기를 조제실에 되돌려놓고 기관의 정책 및 절차에 따라 적절하게 폐기하고, 폐기를 연구 제품 책임 기록에 기록한다.
2-8℃ (35-46°F) 에서 바이알 내의 백신의 저장은 8 시간을 넘지 않는다. 또한, 일단 백신이 해동되면, 재동결시키지 않는다.
코호트 2 (5 x 1011 VP) 의 투여량 제조는 다음과 같다. 바이알로부터 내용물 1 mL 을 빼내고, 주사 부위를 알코올로 준비하고, 투여량을 임의의 추가 조작 없이 허벅지에 피하 주사에 의해 대상에게 투여한다.
코호트 1 (5 x 1010 VP) 에 대한 투여량 제조는 다음과 같다. 1.0 mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여, 0.50 mL 의 유체를 0.9% 멸균 식염수의 5.0-mL 바이알로부터 제거하고, 4.50 mL 를 남긴다. 또다른 1.0 mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여, 0.50 mL 를 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 표지된 바이알로부터 제거하고, 5-mL 멸균 식염수 바이알에 남아 있는 4.5 mL 의 멸균 식염수 내로 전달한다. 내용물을 희석된 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 5 mL 용액을 역위시킴으로써 혼합한다. 1 mL 의 희석된 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 를 빼내고, 주사 부위를 알코올로 준비하고, 투여량을 허벅지에 피하 주사에 의해 대상에게 투여한다.
코호트 -1 (5 x 109 VP, 투여량 단계축소) 에 대한 투여량 제조는 다음과 같다. 0.50 mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여, 0.05 mL 의 유체를 0.9% 멸균 식염수의 5.0-mL 바이알로부터 제거하고, 4.95 mL 를 남긴다. 또다른 0.50 mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여, 0.05 mL 를 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 표지된 바이알로부터 제거하고, 5-mL 멸균 식염수 바이알에 남아 있는 4.95 mL 의 멸균 식염수 내로 전달한다. 내용물을 희석된 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 5 mL 를 역위시킴으로써 혼합한다. 1 mL 의 희석된 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 를 빼내고, 주사 부위를 알코올로 준비하고, 투여량을 허벅지에 피하 주사에 의해 대상에게 투여한다.
투여
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 를 0, 3, 및 6 주에 총 3 회 주사한 후, 3-개월 간격으로의 (18, 30, 및 42 주) 부스트 주사로 투여한다. 모든 연구 약물 투여 치료는 계획된 방문 일자의 ± 5 일 이내에 일어난다. 백신의 모든 주사는 부위를 알코올로 준비한 후 허벅지에 SC 주사에 의해 1 mL 의 부피로서 제공되어야만 한다. 허벅지는 어느 쪽이든 초기 주사에 사용될 수 있다. 후속 주사는 초기 주사와 동일한 허벅지에 제공되어야만 하고 적어도 5 cm 떨어져야만 한다.
Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 비-복제성이고 이의 게놈은 인간 게놈 내로 통합되지 않는다. 벡터가 비-복제 재조합 바이러스이므로, 이것은 Biosafety Level-2 조건 하에 취급된다. 사용되는 임의의 바이알에 담긴 Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 재료는 사용 후 오토클레이브된다.
평가 기준
안전성 종결점은 DLT, MTD 또는 HTD, 치료-출현 AEs, SAE 의 평가, 및 안전성 실험실 시험, 신체 검사, ECG, LVEF, 및 바이탈 사인에서의 임상적으로 상당한 변화를 포함한다. 독성은 National Cancer Institute (NCI) Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) Version 4.03 을 사용하여 등급화된다. 효능을 평가하기 위해, 종양 반응 (ORR 및 DCR) 을 RECIST Version 1.1; 반응 지속기간, PFS, 및 OS 에 따라 평가한다.
효능 평가
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신의 효능을 생존률 및 항종양 반응을 평가함으로써 평가한다. 대상이 연구를 완료하거나 이로부터 철회한 후, 모든 대상에 12 개월 동안 매 3 개월 그리고 이후 12 개월 동안 그로부터 대략 매 6 개월 생존을 추적한다.
종양 평가는 하기 평가를 포함할 수 있다: 신체 검사 (적용가능한, 피부 병변의 사진 및 측정); 흉부, 복부, 및 골반의 (골반 스캔은 기준선에서 공지된 골반 질환이 존재하지 않는 경우 임의적임) 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 자기 공명 영상화 (MRI) 스캔을 사용하는 횡단 영상화; 공지된/의심되는 뼈 병변을 가진 대상에 대한 원자력 뼈 스캔; 및 뇌의 CT 또는 MRI 스캔 (오직 증상/발견에 기반하여 임상적으로 보장됨). 바람직한 질환 평가 방법은 조영제로의 CT 이다. 조영제로의 CT 가 금지되는 경우, 조영제가 없는 흉부의 CT 및 조영제로의 복부/골반의 MRI 스캔이 바람직하다.
기준선에서, 종양 병변이 선택되고 표적 또는 비-표적 병변으로서 분류된다. 표적 병변은 통상의 기술로 ≥ 20 mm 또는 CT 스캔으로 ≥ 10 mm 로 적어도 1 차원으로 정확하게 측정될 수 있는 이들 병변을 포함한다. 단축 직경 ≥ 15 mm 을 가진 악성 림프절이 표적 병변으로서 고려될 수 있다. 기관 당 최대 2 개 까지의 표적 병변 및 총 5 개의 표적 병변이 기준선에서 확인된다. 이들 병변은 모든 관여한 기관의 대표물이고 이들의 크기 (최장 직경을 가진 것) 및 정확한 반복된 측정을 위한 이들의 적합성에 근거하여 선택되어야만 한다. 모든 표적 병변에 대한 최장 병변 직경 (LLD) 의 합을 계산하고 기준선에서 합 LLD 로서 보고한다. 표적 병변으로서 확인된 악성 림프절의 경우, 단축 직경은 LLD 계산의 합에 사용된다. 모든 다른 병변 (또는 질환 부위) 이 비-표적 병변 (뼈 병변 포함) 으로서 확인된다.
모든 기준선-후 반응 평가는 기준선에서 확인된 동일한 병변을 따른다. 기준선에서 병변을 확인/평가하는데 사용되는 동일한 평가 방식 (예를 들어, CT) 은 대상 안전성이 변화 (예를 들어, 조영제에 대한 알러지 반응) 를 필요로 하지 않는 경우 연과 과정 전반에 사용된다.
RECIST 반응 기준
항종양 활성은 하기 요약되는 바와 같이 RECIST Version 1.1 (Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J, et al. Eur J Cancer. 2009;45:228-247) 에 따라 표적 및/또는 비-표적 병변으로 평가된다.
표적 반응은 표적 병변 크기 중의 백분율 변화가 하기 2 개 식에 의해 평가되는 것으로 정의된다. 첫번째, 완전 반응 또는 부분 반응을 결정할 때, 식 [(이후 값 - 기준선 값)/기준선 값] x 100 이 표적 반응을 계산하기 위해 사용된다. 두번째, 진행성 질환을 결정할 때, 식 [(이후 값 - 치료 개시 이래로의 최소 값)/(치료 개시 이래로의 최소 값)] x 100 이 표적 반응을 계산하기 위해 사용된다.
표적 반응은 표 10 에서의 RECIST Version 1.1 Target Lesion Response Criteria 에 따라 분류된다.
Figure pct00019
비-표적 반응은 표 11 에서의 RECIST Version 1.1 Non-Target Lesion Response Criteria 에 따라 분류된다.
Figure pct00020
Figure pct00021
전반적인 반응은 표 12 에서의 RECIST Version 1.1 Overall Response Criteria 에 따라 분류된다.
탐색적 종점 분석
유세포측정-기반 및 혈청 어세이에서 면역 반응을 검출하고 정량화하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 의 면역원성을 T-세포 빈도, 활성화 상태, 사이토카인 프로파일, 및 항체 레벨의 유세포 측정 분석에 의해 검출한다.
전혈로부터의 비-종양 세포와 관련된 종양 세포의 게놈 서열분석을 반응 또는 질환 진행에 기여하고 분자 비정상의 이해를 제공할 수 있는 게놈 변이를 확인하기 위해 프로파일링한다. RNA 서열분석을 발현 데이터를 제공하고 DNA 돌연변이에 대한 관련성을 제공하도록 수행한다. 정량적 단백질체 분석을 특정 단백질의 정확한 양을 측정하고 백신 면역요법 및 질환 진행에 대한 반응과 상관성이 있는 유전자의 발현을 확인하기 위해 수행한다.
약동학 평가
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신의 약동학을 말초 혈액 수집 및 수집된 샘플의 면역 평가에 의해 평가한다. 대략 80 mL 의 말초 혈액을 연구 동안 및/또는 명시된 주사 후의 특정 시점에 면역 반응에 대한 연구 약물의 효과를 평가하기 위해 대상으로부터 채취한다. 각 주사 전에 기준선에서 그 다음, 세번째 주사 대략 3 주 후 (9 주); 및 각 부스트 주사 (18, 30, 및 42 주) 이전, 및 각 부스트 주사 3 주 후 (21, 33, 및 45 주) 에 혈액 채취를 실시한다. PBMC 샘플을 위한 6 개의, 10-mL 녹색 뚜껑 소듐 헤파린 튜브 및 혈청 샘플을 위한 2 개의 8-mL 혈청-분리 튜브를 뽑는다. 면역 평가는 유세포측정-기반 및 혈청 어세이를 포함한다.
PBMC 를 하기와 같이 분석한다. Ficoll-Hypaque 밀도 구배 분리에 의해 분리된, 요법-전 및 요법-후 PBMC 를, 세포내 사이토카인 염색 어세이를 사용하는 항원-특이적 면역 반응에 대해 분석한다. PBMC 를 종양-연관 항원 HER2/neu 를 엔코딩하는 중복 15 량체 펩티드 풀로 시험관 내에서 자극한다. 대조군 펩티드 풀은 음성 대조군으로의 인간 백혈구 항원 펩티드 및 양성 대조군으로의 CEFT 펩티드 믹스의 사용을 수반한다. CEFT 는 CMV, 엡스테인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스, 인플루엔자, 및 파상풍 독소의 펩티드의 혼합물이다. CD4 및 CD8 T 세포의 자극-후 분석은 IFN-γ, IL-2, 종양 괴사 인자, 및 CD107a 의 생산을 수반한다. 충분한 PBMC 가 이용가능한 경우, 어세이는 기타 종양-연관 항원에 대한 T 세포의 발달을 위해 수행된다. PBMC 는 표준 면역 세포 유형 (CD4 및 CD8 T 세포, 자연 살해 [NK] 세포, 조절성 T 세포 [Tregs], 골수-유래된 억제인자 세포 [MDSCs], 및 수지상 세포) 뿐 아니라 123 면역 세포 서브세트에서의 변화에 대해 평가된다. 충분한 PBMC 가 이용가능한 경우, 선택된 대상으로부터의 PBMC 를 CD4 및 CD8 T 세포, NK 세포, Tregs, 및 MDSC 를 포함하는, 특이적 면역 세포 서브세트의 기능에 대해 분석한다.
가용성 인자를 하기와 같이 분석한다. 혈청을 하기 가용성 인자에 대해 요법-전 및 요법-후에 분석한다: 가용성 CD27, 가용성 CD40 리간드, 및 HER2/neu 및 기타 종양-연관 항원에 대한 항체.
게놈 및 단백질체 분자 분석 및 종양 및 전혈의 분석
전혈로부터의 비-종양 세포와 관련된 조직으로부터의 종양 세포의 게놈 서열분석을 반응 또는 질환 진행에 기여하고 분자 비정상의 이해를 제공할 수 있는 게놈 변이를 확인하기 위해 프로파일링한다. RNA 서열분석을 발현 데이터를 제공하고 DNA 돌연변이에 대한 관련성을 제공하도록 수행한다. 정량적 단백질체 분석을 특정 단백질의 정확한 양을 측정하고 백신 면역요법 및 질환 진행에 대한 반응과 상관성이 있는 유전자의 발현을 확인하기 위해 수행한다.
게놈 및 단백질체 분자 프로파일링을 다음-세대 스크리닝 및 질량 분광분석-기반 정량적 단백질체에 의해 포르말린-고정된, 파라핀 포매 (FFPE) 종양 조직 및 전혈 (종양 조직에 대항하는 정상 비교장치에 부합되는 대상) 상에 수행한다. 종양 조직 및 전혈의 수집은 본 연구에 필수적이다. 종양 조직 및 전혈을 스크리닝시 수득한다.
단일 FFPE 종양 조직 블록 또는 슬라이드를 종양 DNA, 종양 RNA, 및 종양 단백질의 추출을 위해 사용한다. 전혈 샘플은 대상 정상 DNA 의 추출을 위해 사용된다. 종양 조직 및 전혈을 NantOmics, LLC CLIA-등록된 및 CAP-공인된/CLIA-인증된 실험실에서 프로세싱한다.
통계적 방법
DLT 및 MTD 또는 HTD 의 비를 평가한다. 전반적인 안전성은 치료-출현 AE, SAE, 및 안전성 실험실 시험, 신체 검사, ECG, LVEF, 및 바이탈 사인에서의 임상적으로 상당한 변화에 있어서, 용량 코호트 내에서 그리고 전반적인 연구 집단에 대해 CTCAE Version 4.03 을 사용하는 등급에 의해 AE 의 통계된 빈도를 사용하는 서술적 분석에 의해 평가된다. ORR 및 DCR 을 용량 코호트 및 전반적으로 RECIST Version 1.1 에 따라 평가하고; 반응 지속기간을 또한 평가한다. PFS 및 OS 를 용량 코호트 및 전반적으로 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 분석한다.
본원에 개시되고 청구된 방법 모두는 본 개시 내용에 비추어 과도한 실험없이 행해질 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 바람직한 실시 양태로 기술하였지만, 당해 기술 분야의 당업자는 본 발명의 개념, 취지 및 범주를 벗어나지 않는 범위 내에서 본원에 기재된 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형을 적용할 수 있음이 명백할 것이다. 더욱 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 관련있는 특정 작용제가 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 동안 본원에 기재된 작용제를 대체할 수 있음은 자명할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구 범위에 의해 한정된 본 발명의 취지, 범주 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
<110> ETUBICS CORPORATION <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TUMOR VACCINATION AND IMMUNOTHERAPY INVOLVING HER2/NEU <130> 39891-727.601 <140> PCT/US2017/035718 <141> 2017-06-02 <150> 62/361,292 <151> 2016-07-12 <150> 62/345,575 <151> 2016-06-03 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2075 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 ctagaatgga gctggcggcc ttgtgccgct gggggctcct cctcgccctc ttgccccccg 60 gagccgcgag cacccaagtg tgcaccggca cagacatgaa gctgcggctc cctgccagtc 120 ccgagaccca cctggacatg ctccgccacc tctaccaggg ctgccaggtg gtgcagggaa 180 acctggaact cacctacctg cccaccaatg ccagcctgtc cttcctgcag gatatccagg 240 aggtgcaggg ctacgtgctc atcgctcaca accaagtgag gcaggtccca ctgcagaggc 300 tgcggattgt gcgaggcacc cagctctttg aggacaacta tgccctggcc gtgctagaca 360 atggagaccc gctgaacaat accacccctg tcacaggggc ctccccagga ggcctgcggg 420 agctgcagct tcgaagcctc acagagatct tgaaaggagg ggtcttgatc cagcggaacc 480 cccagctctg ctaccaggac 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gcatcagctg gctggggctg cgctcactga 1380 gggaactggg cagtggactg gccctcatcc accataacac ccacctctgc ttcgtgcaca 1440 cggtgccctg ggaccagctc tttcggaacc cgcaccaagc tctgctccac actgccaacc 1500 ggccagagga cgagtgtgtg ggcgagggcc tggcctgcca ccagctgtgc gcccgagggc 1560 actgctgggg tccagggccc acccagtgtg tcaactgcag ccagttcctt cggggccagg 1620 agtgcgtgga ggaatgccga gtactgcagg ggctccccag ggagtatgtg aatgccaggc 1680 actgtttgcc gtgccaccct gagtgtcagc cccagaatgg ctcagtgacc tgttttggac 1740 cggaggctga ccagtgtgtg gcctgtgccc actataagga ccctcccttc tgcgtggccc 1800 gctgccccag cggtgtgaaa cctgacctct cctacatgcc catctggaag tttccagatg 1860 aggagggcgc atgccagcct tgccccatca actgcaccca ctcctgtgtg gacctggatg 1920 acaagggctg ccccgccgag cagagagcca gccctctgac gtccatcgtc tctgcggtgg 1980 ttggcattct gctggtcgtg gtcttggggg tggtctttgg gatcctcatc aagcgacggc 2040 agcagaagat ccggaagtac acgtaatcta gataa 2075 <210> 2 <211> 688 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Met 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gccgccgccg ttagcccaag agcaacaaca gcgccaaggc 25560 taccgctcat ggcgcgggca caagaacgcc atagttgctt gcttgcaaga ctgtgggggc 25620 aacatctcct tcgcccgccg ctttcttctc taccatcacg gcgtggcctt cccccgtaac 25680 atcctgcatt actaccgtca tctctacagc ccatactgca ccggcggcag cggcagcaac 25740 agcagcggcc acacagaagc aaaggcgacc ggatagcaag actctgacaa agcccaagaa 25800 atccacagcg gcggcagcag caggaggagg agcgctgcgt ctggcgccca acgaacccgt 25860 atcgacccgc gagcttagaa acaggatttt tcccactctg tatgctatat ttcaacagag 25920 caggggccaa gaacaagagc tgaaaataaa aaacaggtct ctgcgatccc tcacccgcag 25980 ctgcctgtat cacaaaagcg aagatcagct tcggcgcacg ctggaagacg cggaggctct 26040 cttcagtaaa tactgcgcgc tgactcttaa ggactagttt cgcgcccttt ctcaaattta 26100 agcgcgaaaa ctacgtcatc tccagcggcc acacccggcg ccagcacctg ttgtcagcgc 26160 cattatgagc aaggaaattc ccacgcccta catgtggagt taccagccac aaatgggact 26220 tgcggctgga gctgcccaag actactcaac ccgaataaac tacatgagcg cgggacccca 26280 catgatatcc cgggtcaacg gaatacgcgc ccaccgaaac cgaattctcc tggaacaggc 26340 ggctattacc 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ctcagcgatg attcgcaccg cccgcagcat 29700 aaggcgcctt gtcctccggg cacagcagcg caccctgatc tcacttaaat cagcacagta 29760 actgcagcac agcaccacaa tattgttcaa aatcccacag tgcaaggcgc tgtatccaaa 29820 gctcatggcg gggaccacag aacccacgtg gccatcatac cacaagcgca ggtagattaa 29880 gtggcgaccc ctcataaaca cgctggacat aaacattacc tcttttggca tgttgtaatt 29940 caccacctcc cggtaccata taaacctctg attaaacatg gcgccatcca ccaccatcct 30000 aaaccagctg gccaaaacct gcccgccggc tatacactgc agggaaccgg gactggaaca 30060 atgacagtgg agagcccagg actcgtaacc atggatcatc atgctcgtca tgatatcaat 30120 gttggcacaa cacaggcaca cgtgcataca cttcctcagg attacaagct cctcccgcgt 30180 tagaaccata tcccagggaa caacccattc ctgaatcagc gtaaatccca cactgcaggg 30240 aagacctcgc acgtaactca cgttgtgcat tgtcaaagtg ttacattcgg gcagcagcgg 30300 atgatcctcc agtatggtag cgcgggtttc tgtctcaaaa ggaggtagac gatccctact 30360 gtacggagtg cgccgagaca accgagatcg tgttggtcgt agtgtcatgc caaatggaac 30420 gccggacgta gtcatatttc ctgaagcaaa accaggtgcg ggcgtgacaa acagatctgc 30480 gtctccggtc tcgccgctta 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caaaaaatca ggcaaagcct cgcgcaaaaa agaaagcaca tcgtagtcat 31380 gctcatgcag ataaaggcag gtaagctccg gaaccaccac agaaaaagac accatttttc 31440 tctcaaacat gtctgcgggt ttctgcataa acacaaaata aaataacaaa aaaacattta 31500 aacattagaa gcctgtctta caacaggaaa aacaaccctt ataagcataa gacggactac 31560 ggccatgccg gcgtgaccgt aaaaaaactg gtcaccgtga ttaaaaagca ccaccgacag 31620 ctcctcggtc atgtccggag tcataatgta agactcggta aacacatcag gttgattcac 31680 atcggtcagt gctaaaaagc gaccgaaata gcccggggga atacataccc gcaggcgtag 31740 agacaacatt acagccccca taggaggtat aacaaaatta ataggagaga aaaacacata 31800 aacacctgaa aaaccctcct gcctaggcaa aatagcaccc tcccgctcca gaacaacata 31860 cagcgcttcc acagcggcag ccataacagt cagccttacc agtaaaaaag aaaacctatt 31920 aaaaaaacac cactcgacac ggcaccagct caatcagtca cagtgtaaaa aagggccaag 31980 tgcagagcga gtatatatag gactaaaaaa tgacgtaacg gttaaagtcc acaaaaaaca 32040 cccagaaaac cgcacgcgaa cctacgccca gaaacgaaag ccaaaaaacc cacaacttcc 32100 tcaaatcgtc acttccgttt tcccacgtta cgtcacttcc cattttaaga aaactacaat 32160 tcccaacaca tacaagttac tccgccctaa aacctacgtc acccgccccg ttcccacgcc 32220 ccgcgccacg tcacaaactc caccccctca ttatcatatt ggcttcaatc caaaataagg 32280 tatattattg atgat 32295 <210> 4 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240 cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300 tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360 cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420 ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480 aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540 gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag 576 <210> 5 <211> 240 <212> 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of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Asn Val Gly Glu Thr Val Thr Met Pro Cys Pro Lys Val Phe Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Gly Leu Gly Ala Gln Cys Ser Glu Ala 1 5 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Asn Asn Gly Leu Gly Ala Gln Cys Ser Glu Ala Val Thr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Arg Lys Leu Thr Thr Glu Leu Thr Ile 1 5 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Leu Gly Pro Glu Arg Arg Lys Leu Thr Thr Glu Leu Thr Ile Ile 1 5 10 15 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Pro Glu Arg Arg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Arg Glu Gly Lys Thr Leu Asn Pro Ser 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Val Arg Asn Ala Thr Ser Tyr Arg Cys 1 5 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Leu Pro Asn Val Thr Val Arg Asn Ala Thr Ser Tyr Arg Cys Gly 1 5 10 15 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Asn Val Thr Val Arg Asn Ala Thr Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Phe Ala Met Ala Gln Ile Pro Ser Leu 1 5 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Pro Phe Ala Met Ala Gln Ile Pro Ser Leu Ser Leu Arg Ala Val 1 5 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gtgctggaat 1020 tcggcttaaa ggtacccaga gcagacagcc gccaccatgg agtctccctc ggcccctccc 1080 cacagatggt gcatcccctg gcagaggctc ctgctcacag cctcacttct aaccttctgg 1140 aacccgccca ccactgccaa gctcactatt gaatccacgc cgttcaatgt cgcagagggg 1200 aaggaggtgc ttctacttgt ccacaatctg ccccagcatc tttttggcta cagctggtac 1260 aaaggtgaaa gagtggatgg caaccgtcaa attataggat atgtaatagg aactcaacaa 1320 gctaccccag ggcccgcata cagtggtcga gagataatat accccaatgc atccctgctg 1380 atccagaaca tcatccagaa tgacacagga ttctacaccc tacacgtcat aaagtcagat 1440 cttgtgaatg aagaagcaac tggccagttc cgggtatacc cggagctgcc caagccctcc 1500 atctccagca acaactccaa acccgtggag gacaaggatg ctgtggcctt cacctgtgaa 1560 cctgagactc aggacgcaac ctacctgtgg tgggtaaaca atcagagcct cccggtcagt 1620 cccaggctgc agctgtccaa tggcaacagg accctcactc tattcaatgt cacaagaaat 1680 gacacagcaa gctacaaatg tgaaacccag aacccagtga gtgccaggcg cagtgattca 1740 gtcatcctga atgtcctcta tggcccggat gcccccacca tttcccctct aaacacatct 1800 tacagatcag gggaaaatct gaacctctcc tgccacgcag cctctaaccc 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cactgcattc 3540 tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaacgc ggatctgggc gtggttaagg 3600 gtgggaaaga atatataagg tgggggtctt atgtagtttt gtatctgttt tgcagcagcc 3660 gccgccgcca tgagcaccaa ctcgtttgat ggaagcattg tgagctcata tttgacaacg 3720 cgcatgcccc catgggccgg ggtgcgtcag aatgtgatgg gctccagcat tgatggtcgc 3780 cccgtcctgc ccgcaaactc tactaccttg acctacgaga ccgtgtctgg aacgccgttg 3840 gagactgcag cctccgccgc cgcttcagcc gctgcagcca ccgcccgcgg gattgtgact 3900 gactttgctt tcctgagccc gcttgcaagc agtgcagctt cccgttcatc cgcccgcgat 3960 gacaagttga cggctctttt ggcacaattg gattctttga cccgggaact taatgtcgtt 4020 tctcagcagc tgttggatct gcgccagcag gtttctgccc tgaaggcttc ctcccctccc 4080 aatgcggttt aaaacataaa taaaaaacca gactctgttt ggatttggat caagcaagtg 4140 tcttgctgtc tttatttagg ggttttgcgc gcgcggtagg cccgggacca gcggtctcgg 4200 tcgttgaggg tcctgtgtat tttttccagg acgtggtaaa ggtgactctg gatgttcaga 4260 tacatgggca taagcccgtc tctggggtgg aggtagcacc actgcagagc ttcatgctgc 4320 ggggtggtgt tgtagatgat ccagtcgtag caggagcgct gggcgtggtg cctaaaaatg 4380 tctttcagta gcaagctgat tgccaggggc aggcccttgg tgtaagtgtt tacaaagcgg 4440 ttaagctggg atgggtgcat acgtggggat atgagatgca tcttggactg tatttttagg 4500 ttggctatgt tcccagccat atccctccgg ggattcatgt tgtgcagaac caccagcaca 4560 gtgtatccgg tgcacttggg aaatttgtca tgtagcttag aaggaaatgc gtggaagaac 4620 ttggagacgc ccttgtgacc tccaagattt tccatgcatt cgtccataat gatggcaatg 4680 ggcccacggg cggcggcctg ggcgaagata tttctgggat cactaacgtc atagttgtgt 4740 tccaggatga gatcgtcata ggccattttt acaaagcgcg ggcggagggt gccagactgc 4800 ggtataatgg ttccatccgg cccaggggcg tagttaccct cacagatttg catttcccac 4860 gctttgagtt cagatggggg gatcatgtct acctgcgggg cgatgaagaa aacggtttcc 4920 ggggtagggg agatcagctg ggaagaaagc aggttcctga gcagctgcga cttaccgcag 4980 ccggtgggcc cgtaaatcac acctattacc ggctgcaact ggtagttaag agagctgcag 5040 ctgccgtcat ccctgagcag gggggccact tcgttaagca tgtccctgac tcgcatgttt 5100 tccctgacca aatccgccag aaggcgctcg ccgcccagcg atagcagttc ttgcaaggaa 5160 gcaaagtttt tcaacggttt gagaccgtcc gccgtaggca tgcttttgag cgtttgacca 5220 agcagttcca ggcggtccca cagctcggtc acctgctcta cggcatctcg atccagcata 5280 tctcctcgtt tcgcgggttg gggcggcttt cgctgtacgg cagtagtcgg tgctcgtcca 5340 gacgggccag ggtcatgtct ttccacgggc gcagggtcct cgtcagcgta gtctgggtca 5400 cggtgaaggg gtgcgctccg ggctgcgcgc tggccagggt gcgcttgagg ctggtcctgc 5460 tggtgctgaa gcgctgccgg tcttcgccct gcgcgtcggc caggtagcat ttgaccatgg 5520 tgtcatagtc cagcccctcc gcggcgtggc ccttggcgcg cagcttgccc ttggaggagg 5580 cgccgcacga ggggcagtgc agacttttga gggcgtagag cttgggcgcg agaaataccg 5640 attccgggga gtaggcatcc gcgccgcagg ccccgcagac ggtctcgcat tccacgagcc 5700 aggtgagctc tggccgttcg gggtcaaaaa ccaggtttcc cccatgcttt ttgatgcgtt 5760 tcttacctct ggtttccatg agccggtgtc cacgctcggt gacgaaaagg ctgtccgtgt 5820 ccccgtatac agacttgaga ggcctgtcct cgagcggtgt tccgcggtcc tcctcgtata 5880 gaaactcgga ccactctgag acaaaggctc gcgtccaggc cagcacgaag gaggctaagt 5940 gggaggggta gcggtcgttg tccactaggg ggtccactcg ctccagggtg tgaagacaca 6000 tgtcgccctc ttcggcatca aggaaggtga ttggtttgta ggtgtaggcc acgtgaccgg 6060 gtgttcctga aggggggcta taaaaggggg tgggggcgcg ttcgtcctca ctctcttccg 6120 catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg gtgagtactc cctctgaaaa gcgggcatga 6180 cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc acctggcccg 6240 cggtgatgcc tttgagggtg gccgcatcca tctggtcaga aaagacaatc tttttgttgt 6300 caagcttggt ggcaaacgac ccgtagaggg cgttggacag caacttggcg atggagcgca 6360 gggtttggtt tttgtcgcga tcggcgcgct ccttggccgc gatgtttagc tgcacgtatt 6420 cgcgcgcaac gcaccgccat tcgggaaaga cggtggtgcg ctcgtcgggc accaggtgca 6480 cgcgccaacc gcggttgtgc agggtgacaa ggtcaacgct ggtggctacc tctccgcgta 6540 ggcgctcgtt ggtccagcag aggcggccgc ccttgcgcga gcagaatggc ggtagggggt 6600 ctagctgcgt ctcgtccggg gggtctgcgt ccacggtaaa gaccccgggc agcaggcgcg 6660 cgtcgaagta gtctatcttg catccttgca agtctagcgc ctgctgccat gcgcgggcgg 6720 caagcgcgcg ctcgtatggg ttgagtgggg gaccccatgg catggggtgg gtgagcgcgg 6780 aggcgtacat gccgcaaatg tcgtaaacgt agaggggctc tctgagtatt ccaagatatg 6840 tagggtagca tcttccaccg cggatgctgg cgcgcacgta atcgtatagt tcgtgcgagg 6900 gagcgaggag gtcgggaccg aggttgctac gggcgggctg ctctgctcgg aagactatct 6960 gcctgaagat ggcatgtgag ttggatgata tggttggacg ctggaagacg ttgaagctgg 7020 cgtctgtgag acctaccgcg tcacgcacga aggaggcgta ggagtcgcgc agcttgttga 7080 ccagctcggc ggtgacctgc acgtctaggg cgcagtagtc cagggtttcc ttgatgatgt 7140 catacttatc ctgtcccttt tttttccaca gctcgcggtt gaggacaaac tcttcgcggt 7200 ctttccagta ctcttggatc ggaaacccgt cggcctccga acggtaagag cctagcatgt 7260 agaactggtt gacggcctgg taggcgcagc atcccttttc tacgggtagc gcgtatgcct 7320 gcgcggcctt ccggcatgac cagcatgaag ggcacgagct gcttcccaaa ggcccccatc 7380 caagtatagg tctctacatc gtaggtgaca aagagacgct cggtgcgagg atgcgagccg 7440 atcgggaaga actggatctc ccgccaccaa ttggaggagt ggctattgat gtggtgaaag 7500 tagaagtccc tgcgacgggc cgaacactcg tgctggcttt tgtaaaaacg tgcgcagtac 7560 tggcagcggt gcacgggctg tacatcctgc acgaggttga cctgacgacc gcgcacaagg 7620 aagcagagtg ggaatttgag cccctcgcct ggcgggtttg gctggtggtc ttctacttcg 7680 gctgcttgtc cttgaccgtc tggctgctcg aggggagtta cggtggatcg 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ataagtatga gcctcgaatc cacatagtga gagttggggg tccacagcgc 540 atgatcacca gccactgctt ccctgagacc cagttcatag cggtgactgc tagaagtgat 600 cacaaagaga tgatggagga acccggagac agccagcaac ctgggtactc ccaatggggg 660 tggcttcttc ctggaaccag caccgtgtgt ccacctgcaa atcctcatcc tcagtttgga 720 ggtgccctct ccctcccctc cacgcacagc tgtgacaggt acccaaccct gaggagccac 780 cggtcctcac cctaccccag cccctatgct catcggaaca attctccaac ctattctgac 840 aactcacctg catgtttatc catgctgcaa tcccatgaca attggtccag ccttggaatg 900 cctgcccatc ccagcatgct ccccgtgagc cacaatgcca gcccacctac cagctccagt 960 cagtacccca gcctgtggtc tgtgagcaac ggcgccgtca ccccgggctc ccaggcagca 1020 gccgtgtcca acgggctggg ggcccagttc ttccggggct cccccgcgca ctacacaccc 1080 ctcacccatc cggtctcggc gccctcttcc tcgggatccc cactgtacga aggggcggcc 1140 gcggccacag acatcgtgga cagccagtac gacgccgcag cccaaggccg cctcatagcc 1200 tcatggacac ctgtgtcgcc accttccatg tga 1233 <210> 35 <211> 132 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 35 Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly 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Phe Pro Leu Thr Arg Ser Gln Ser Cys Glu 965 970 975 Thr Lys Leu Leu Asp Glu Lys Thr Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Ser Ser 980 985 990 Gln Val Ser Ser Ala Val Met Lys Ser Leu Leu Cys Leu Pro Ser Ser 995 1000 1005 Ile Ser Cys Ala Gln Thr Pro Cys Ile Pro Lys Glu Gly Ala Ser Pro 1010 1015 1020 Thr Ser Ser Ser Asn Glu Asp Ser Ala Ala Asn Gly Ser Ala Glu Thr 1025 1030 1035 1040 Ser Ala Leu Asp Thr Gly Phe Ser Leu Asn Leu Ser Glu Leu Arg Glu 1045 1050 1055 Tyr Thr Glu Gly Leu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Asp Asp Gly Asp His 1060 1065 1070 Ser Ser Leu Gln Ser Gly Gln Ser Val Ile Ser Leu Leu Ser Ser Glu 1075 1080 1085 Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Glu Val Lys Val Leu Asp Glu Ala Thr 1090 1095 1100 Leu Lys Gln Leu Asp Gly Ile His Val Thr Ile Leu His Lys Glu Glu 1105 1110 1115 1120 Gly Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Ala Gly Gly Ala Asp Leu Glu Asn 1125 1130 1135 Lys Val Ile Thr Val His Arg Val Phe Pro Asn Gly Leu Ala Ser Gln 1140 1145 1150 Glu Gly Thr Ile Gln Lys Gly Asn Glu Val Leu Ser Ile Asn Gly Lys 1155 1160 1165 Ser Leu Lys Gly Thr Thr His His Asp Ala Leu Ala Ile Leu Arg Gln 1170 1175 1180 Ala Arg Glu Pro Arg Gln Ala Val Ile Val Thr Arg Lys Leu Thr Pro 1185 1190 1195 1200 Glu Ala Met Pro Asp Leu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala 1205 1210 1215 Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr Glu Ala Thr Val Cys 1220 1225 1230 Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Glu 1235 1240 1245 Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr Ile Asn Arg 1250 1255 1260 Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gln Ser Glu Thr Val Gln Pro Gly 1265 1270 1275 1280 Asp Glu Ile Leu Gln Leu Gly Gly Thr Ala Met Gln Gly Leu Thr Arg 1285 1290 1295 Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu Pro Asp Gly Pro Val Thr 1300 1305 1310 Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gln Ser Lys Glu Thr Thr Ala Ala 1315 1320 1325 Gly Asp Ser 1330 <210> 88 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly 20 25 30 Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45 Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60 Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80 Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95 Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 100 105 110 Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 115 120 125 Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 145 150 155 <210> 89 <211> 476 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln Cys Gln Gln 1 5 10 15 Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His Pro Leu Val 20 25 30 Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp 35 40 45 Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Arg 50 55 60 Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Ile Phe 65 70 75 80 Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu 85 90 95 Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu 100 105 110 Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile 115 120 125 Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Phe 130 135 140 Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val 145 150 155 160 Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro Ile Trp Glu Leu Lys Lys 165 170 175 Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu 180 185 190 Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp 195 200 205 Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys 225 230 235 240 Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu 245 250 255 Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys 260 265 270 Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe 275 280 285 Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val 290 295 300 Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala 305 310 315 320 Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu 325 330 335 Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu 340 345 350 Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr 355 360 365 Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp 370 375 380 Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val 385 390 395 400 Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr 405 410 415 Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu 420 425 430 Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys 435 440 445 Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser 450 455 460 Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 465 470 475 <210> 90 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Met Cys Phe Pro Lys Val Leu Ser Asp Asp Met Lys Lys Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Met Val Met Leu Leu Pro Thr Ser Ala Gln Gly Leu Gly Ala Trp 20 25 30 Val Ser Ala Cys Asp Thr Glu Asp Thr Val Gly His Leu Gly Pro Trp 35 40 45 Arg Asp Lys Asp Pro Ala Leu Trp Cys Gln Leu Cys Leu Ser Ser Gln 50 55 60 His Gln Ala Ile Glu Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn Ala Glu Ser 65 70 75 80 Gly Arg Gly Gln Val Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Asp Asp Phe 85 90 95 Lys Glu Gly Tyr Leu Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu Glu Gln His 100 105 110 Pro Glu Leu Thr Pro Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Gly Leu Arg Cys 115 120 125 Arg Gly Asn Arg Ser Pro Val Pro Asp Val Glu Asp Pro Ala Thr Glu 130 135 140 Glu Pro Gly Glu Ser Phe Cys Asp Lys Val Met Arg Trp Phe Gln Ala 145 150 155 160 Met Leu Gln Arg Leu Gln Thr Trp Trp His Gly Val Leu Ala Trp Val 165 170 175 Lys Glu Lys Val Val Ala Leu Val His Ala Val Gln Ala Leu Trp Lys 180 185 190 Gln Phe Gln Ser Phe Cys Cys Ser Leu Ser Glu Leu Phe Met Ser Ser 195 200 205 Phe Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Gly Asp Lys Glu Glu Leu Thr Pro 210 215 220 Gln Lys Cys Ser Glu Pro Gln Ser Ser Lys 225 230 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Met Ala Val Pro Met Gln Leu Ser Cys Ser Arg 1 5 10 <210> 92 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Arg Ser Thr Gly 1 <210> 93 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Thr Arg 1 <210> 94 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Arg Ser Gln 1 <210> 95 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Arg Ser Ala Gly Glu 1 5 <210> 96 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Arg Ser 1 <210> 97 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Gly Gly 1 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 100 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly <210> 102 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 102 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly 20 <210> 103 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 20 <210> 104 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 105 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15

Claims (83)

  1. 고유의 HER2/neu 단백질의 단편인 HER2/neu 항원을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제-결함성 바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, HER2/neu 항원이 고유의 HER2/neu 단백질의 세포내 도메인을 갖지 않는 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, HER2/neu 항원이 고유의 HER2/neu 단백질의 막관통 도메인 및 세포외 도메인을 갖는 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, HER2/neu 항원이 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 갖고/갖거나, 핵산 서열이 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 1033-3107 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 갖고/갖거나, 복제-결함성 바이러스 벡터가 SEQ ID NO: 3 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 갖는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함성 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 E1 영역, E2b 영역, E3 영역, E4 영역, 또는 이의 조합 내에 결실을 포함하는 조성물.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 E2b 영역 내에 결실을 포함하는 조성물.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 E1 영역, E2b 영역, 및 E3 영역 내에 결실을 포함하는 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1x109 내지 적어도 5x1012 바이러스 입자를 포함하는 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 5x109 바이러스 입자를 포함하는 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 5x1010 바이러스 입자를 포함하는 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 5x1011 바이러스 입자를 포함하는 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 5x1012 바이러스 입자를 포함하는 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함성 바이러스 벡터가 동시자극적 분자를 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함성 바이러스 벡터가 면역학적 융합 파트너를 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 동시자극적 분자가 B7, ICAM-1, LFA-3, 또는 이의 조합을 포함하는 조성물.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 동시자극적 분자가 B7, ICAM-1, 및 LFA-3 의 조합을 포함하는 조성물.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 복제-결함성 바이러스 벡터 내에 위치하는 다수의 동시자극적 분자를 엔코딩하는 다수의 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 별도의 복제-결함성 바이러스 벡터 내에 위치한 다수의 동시자극적 분자를 엔코딩하는 다수의 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 표적 항원 또는 이의 면역학적 에피토프를 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함성 바이러스 벡터가 하나 이상의 표적 항원 또는 이의 면역학적 에피토프를 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 하나 이상의 표적 항원이 종양 네오-항원, 종양 네오-에피토프, 종양-특이적 항원, 종양-연관 항원, 조직-특이적 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원, 효모 항원, 진균 항원, 원생동물 항원, 기생생물 항원, 미토겐, 또는 이의 조합인 조성물.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 표적 항원이 폴레이트 수용체 알파, WT1, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, HER2/neu, BRCA1, BRACHYURY, BRACHYURY(TIVS7-2, 다형성), BRACHYURY (IVS7 T/C 다형성), T BRACHYURY, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1-c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, WT1, AFP, β-카테닌/m, 캐스파아제-8/m, CEA, CDK-4/m, HER3, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, 또는 TEL/AML1, 또는 개질된 변이체, 스플라이스 변이체, 기능적 에피토프, 에피토프 작동제, 또는 이의 조합인 조성물.
  24. 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 표적 항원이 CEA, Brachyury, MUC1, MUC1-c, 또는 이의 조합인 조성물.
  25. 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 표적 항원이 CEA 인 조성물.
  26. 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 표적 항원이 Brachyury 인 조성물.
  27. 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 표적 항원이 MUC1 또는 MUC1-c 인 조성물.
  28. 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 표적 항원이 HER3 인 조성물.
  29. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, CEA 가 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, 또는 SEQ ID NO: 29 의 위치 1057-3165 와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 포함하는 조성물.
  30. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, MUC1-c 가 SEQ ID NO: 32 또는 SEQ ID NO: 33 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 포함하는 조성물.
  31. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, Brachyury 가 SEQ ID NO: 34 와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 포함하는 조성물.
  32. 제 28 항에 있어서, HER3 이 SEQ ID NO: 27 과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 일치하는 서열을 포함하는 조성물.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함성 바이러스 벡터가 선별가능 마커를 추가로 포함하는 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 선별가능 마커가 lacZ 유전자, 티미딘 키나아제, gpt, GUS, 또는 백시니아 K1L 숙주 범위 유전자, 또는 이의 조합인 조성물.
  35. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  36. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  37. 제 35 항에 따른 약학 조성물의 제조를 포함하는, 종양 백신의 제조 방법.
  38. 치료적으로 유효한 양의 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 35 항에 따른 약학 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서의 면역 반응의 향상 방법.
  39. 치료적으로 유효한 양의 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 35 항에 따른 약학 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서의 암의 치료 방법.
  40. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 약학 조성물을 대상에게 재투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  41. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD1, PDL1, PDL2, CD28, CD80, CD86, CTLA4, B7RP1, ICOS, B7RPI, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TCR, LAG3, CD137, CD137L, OX40, OX40L, CD27, CD70, CD40, CD40L, TIM3, GAL9, ADORA, CD276, VTCN1, IDO1, KIR3DL1, HAVCR2, VISTA, 또는 CD244 를 억제하는 방법.
  43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD1 또는 PDL1 을 억제하는 방법.
  44. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 항-PD1 또는 항-PDL1 항체인 방법.
  45. 제 41 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 항-PDL1 항체인 방법.
  46. 제 38 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 정맥내, 피하, 림프내, 종양내, 피부내, 근육내, 복강내, 직장내, 질내, 비강내, 경구, 방광 점적주입을 통해, 또는 방혈 (scarification) 을 통한 것인 방법.
  47. 제 38 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 향상된 면역 반응이 세포-매개성 또는 체액성 반응인 방법.
  48. 제 38 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 향상된 면역 반응이 B-세포 증식, CD4+ T 세포 증식, CD8+ T 세포 증식, 또는 이의 조합의 향상인 방법.
  49. 제 38 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 향상된 면역 반응이 IL-2 생산, IFN-γ 생산 또는 이의 조합의 향상인 방법.
  50. 제 38 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 향상된 면역 반응이 항원 제시 세포 증식, 기능 또는 이의 조합의 향상인 방법.
  51. 제 38 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 아데노바이러스 벡터를 이전에 투여받은 방법.
  52. 제 38 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 아데노바이러스 벡터에 대해 기존의 면역성을 갖는 방법.
  53. 제 38 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 아데노바이러스 벡터에 대해 기존의 면역성을 갖는다고 결정된 방법.
  54. 제 38 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에게 화학요법, 방사선, 상이한 면역요법, 또는 이의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  55. 제 38 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 인간 또는 비-인간 동물인 방법.
  56. 제 38 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 암에 대해 이전에 치료받은 방법.
  57. 제 38 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 투여가 적어도 3 회 반복되는 방법.
  58. 제 38 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 적어도 1x109 내지 적어도 5x1012 바이러스 입자를 포함하는 방법.
  59. 제 38 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 투여가 투여량 당 5x109 바이러스 입자를 포함하는 방법.
  60. 제 38 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 투여가 투여량 당 적어도 5x1010 바이러스 입자를 포함하는 방법.
  61. 제 38 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 투여가 투여량 당 적어도 5x1011 바이러스 입자를 포함하는 방법.
  62. 제 38 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 투여가 투여량 당 적어도 5x1012 바이러스 입자를 포함하는 방법.
  63. 제 38 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 투여가 매 2 또는 3 주 반복되는 방법.
  64. 제 38 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 투여에는 동일한 조성물 또는 약학 조성물을 포함하는 부스트 면역화가 뒤따르는 방법.
  65. 제 64 항에 있어서, 부스트 면역화가 매 1, 2, 또는 3 개월 투여되는 방법.
  66. 제 64 항에 있어서, 부스트 면역화가 3 회 또는 그 이상 반복되는 방법.
  67. 제 38 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 투여가 3 회 동안 매 1, 2, 또는 3 주 반복된 일차 면역화 이후, 3 회 또는 그 이상 동안 매 1, 2, 또는 3 개월 반복된 부스트 면역화인 방법.
  68. 제 38 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에게 조작된 자연 살해 (NK) 세포의 집단을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서, 조작된 NK 세포가 KIR (살해 억제 수용체) 의 발현이 본질적으로 결여되도록 개질된 하나 이상의 NK 세포, 고 친화성 CD16 변이체를 발현하도록 개질된 하나 이상의 NK 세포, 및 하나 이상의 CAR (키메라성 항원 수용체) 을 발현하도록 개질된 하나 이상의 NK 세포, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 방법.
  70. 제 68 항에 있어서, 조작된 NK 세포가 KIR 발현이 본질적으로 결여되도록 개질된 하나 이상의 NK 세포를 포함하는 방법.
  71. 제 68 항에 있어서, 조작된 NK 세포가 고 친화성 CD16 변이체를 발현하도록 개질된 하나 이상의 NK 세포를 포함하는 방법.
  72. 제 68 항에 있어서, 조작된 NK 세포가 하나 이상의 CAR 을 발현하도록 개질된 하나 이상의 NK 세포를 포함하는 방법.
  73. 제 68 항 또는 제 72 항에 있어서, CAR 이 종양 네오-항원, 종양 네오-에피토프, WT1, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, DAM-10, 폴레이트 수용체 알파, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-8, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, HER2/neu, HER3, BRCA1, Brachyury, Brachyury (TIVS7-2, 다형성), Brachyury (IVS7 T/C 다형성), T Brachyury, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, AFP, β-카테닌/m, 캐스파아제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPl/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, TEL/AML1, 또는 이의 임의의 조합에 대한 CAR 인 방법.
  74. 제 38 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함성 아데노바이러스 벡터가 세포 내에 포함되는 방법.
  75. 제 74 항에 있어서, 세포가 수지상 세포 (DC) 인 방법.
  76. 제 38 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 IL-15 또는 IL-15 를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제-결함성 벡터를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  77. 제 38 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 HER2/neu-발현 암을 갖는 방법.
  78. 제 77 항에 있어서, 대상이 HER2/neu 발현 유방암을 갖는 방법.
  79. 제 77 항에 있어서, 대상이 HER2/neu 발현 뼈암을 갖는 방법.
  80. 제 79 항에 있어서, 암이 골육종인 방법.
  81. 제 77 항에 있어서, 대상이 HER2/neu 발현 위암을 갖는 방법.
  82. 제 77 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 절제불가능한, 국부 진행성 또는 전이성 암을 갖는 방법.
  83. 제 38 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서, 부가적인 암 요법을 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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