CN110922487B - 一种抗人her-2单克隆抗体，抗原、杂交瘤细胞株及免疫组化试剂盒 - Google Patents

一种抗人her-2单克隆抗体，抗原、杂交瘤细胞株及免疫组化试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗人HER‑2单克隆抗体，抗原、杂交瘤细胞株及免疫组化试剂盒，属于生物工程领域。本发明中提供的抗人HER‑2单克隆抗体，是以人HER‑2胞内区片段蛋白(676‑1255aa)作为抗原通过免疫学方法制备而成；人HER‑2蛋白胞内区近C末端具有良好的抗原表位，以其作为抗原制备抗体，能够为后续筛选获得优势抗体提供更大的概率。本发明中的抗人HER‑2单克隆抗体通过动物免疫、细胞融合、无血清培养和纯化过程得到，所获得的抗人HER‑2单克隆抗体的特异性强、灵敏度高。

Description

一种抗人HER-2单克隆抗体，抗原、杂交瘤细胞株及免疫组化 试剂盒
技术领域
本发明涉及一种抗人HER-2单克隆抗体，抗原、杂交瘤细胞株及免疫组化试剂盒，属于生物工程领域。
背景技术
HER-2基因又称为neu或c-erbB-2基因，是一种细胞来源癌基因，其阳性表达可见于各种癌症，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、涎腺肿瘤、肺癌、胆管癌、膀胱癌、前列腺癌、结直肠癌等。目前，对HER-2癌基因蛋白产物P185的病理研究首先多见于乳腺癌，其作用也较为明确。HER-2蛋白具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体样蛋白，由胞外区、跨膜区及胞内区构成，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。目前普遍认为HER-2蛋白产物的阳性表达可作为判断乳腺癌预后的一个独立指标。
公布号为CN 103102414A的中国发明专利申请公开了一种抗HER2蛋白单克隆抗体及其用途，所述抗HER2蛋白单克隆抗体是通过扩增HER2基因的ORF全序列，表达全长HER2蛋白，并以其作为抗原通过免疫学方法制备单克隆抗体；该抗原在制备过程中存在以下问题：全长的HER2蛋白难以表达，需要使用HEK293T细胞进行表达，但表达量仍较低。公布号为CN101463344A的中国发明专利申请公开了一种抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂盒及其用途，所述单克隆抗体使用HER2蛋白的胞外区作为抗原进行制备，但是该方法能够筛选到的细胞株数量较少，其所表达的HER2抗体的量也较低。
发明内容
本发明的目的是提供了一种抗人HER-2单克隆抗体，所述抗人HER-2单克隆抗体的特异性强、灵敏度高。
本发明还提供了一种人HER-2抗原，所述人HER-2抗原可用于生产抗人HER-2单克隆抗体。
本发明还提供了一种抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株可用于分泌抗人HER-2单克隆抗体。
本发明还提供了一种用于检测人HER-2蛋白的免疫组化试剂盒，所述试剂盒能够快速、准确地检测出人HER-2蛋白。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种抗人HER-2单克隆抗体，所述抗人HER-2单克隆抗体是由抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌得到；
所述抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株是以人HER-2胞内区片段蛋白作为抗原制备而成，所述人HER-2胞内区片段蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
或者所述抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞系CH-HER2，保藏编号：CCTCC NO:C 2019325。
本发明中提供的抗人HER-2单克隆抗体，是以人HER-2胞内区片段蛋白(676-1255aa)作为抗原制备而成；人HER-2蛋白胞内区近C末端具有良好的抗原表位，以其作为抗原制备抗体，能够为后续筛选获得优势抗体提供更大的概率。本发明中所获得的抗人HER-2单克隆抗体的特异性强、灵敏度高。
所述人HER-2胞内区片段蛋白可以通过常规的方法获得。优选的，所述人HER-2胞内区片段蛋白是由大肠杆菌表达得到。
具体的，所述人HER-2胞内区片段蛋白是由包括如下步骤的方法制备得到：
1)获得人HER-2胞内区片段蛋白的基因序列；
2)将步骤1)中的基因序列连接到大肠杆菌表达载体上，并转入大肠杆菌中诱导表达人HER-2胞内区片段蛋白，纯化后得到人HER-2胞内区片段蛋白。
步骤1)中，所述人HER-2胞内区片段蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。该序列为人HER-2全长基因的第2026-3768位的基因片段。
本发明中的抗人HER-2单克隆抗体是通过免疫学方法获得，在制备过程中抗原的选择最为关键，而其他的制备过程如动物免疫、细胞融合、无血清培养和纯化过程均为本领域的常规技术。
具体的，所述抗人HER-2单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
1)取人HER-2胞内区片段蛋白作为抗原进行动物免疫，取免疫后动物的脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到获得融合细胞株；
2)筛选步骤1)中的融合细胞株，得到能准确在组织细胞中定位HER-2的抗体细胞株；
3)对筛选得到的抗体细胞株进行无血清培养，上清经过纯化得到目的单克隆抗体。
步骤1)中，所述动物免疫是采用皮下多点结合腹腔免疫的方式进行动物免疫。该免疫方式具有更好的免疫效果。
本发明中提供的抗人HER-2单克隆抗体的制备方法能够简单、方便的获得抗人HER-2单克隆抗体。
一种人HER-2抗原，所述人HER-2抗原为人HER-2胞内区片段蛋白，所述人HER-2胞内区片段蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明中提供的人HER-2抗原，为人HER-2胞内区片段蛋白(676-1255aa)，可通过免疫学方法制备抗人HER-2单克隆抗体。
所述人HER-2胞内区片段蛋白可以通过常规的方法获得。优选的，所述人HER-2胞内区片段蛋白是由大肠杆菌表达得到。
一种抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株是以人HER-2胞内区片段蛋白作为抗原制备而成；所述人HER-2胞内区片段蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明中提供的抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株，是以人HER-2胞内区片段蛋白作为抗原通过免疫学方法制备而成；该杂交瘤细胞株能够分泌特异性强、灵敏度高的抗人HER-2单克隆抗体。
一种抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株，其名称为杂交瘤细胞系CH-HER2，保藏编号：CCTCC NO:C 2019325，保藏日期：2019年12月10日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
本发明中提供的抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C2019325，该杂交瘤细胞株能够分泌特异性强、灵敏度高的抗人HER-2单克隆抗体，且表达量高，表达稳定性好。
一种用于检测人HER-2蛋白的免疫组化试剂盒，包含一抗试剂，所述一抗试剂中包含抗人HER-2单克隆抗体。
本发明中提供的用于检测人HER-2蛋白的免疫组化试剂盒，包含以人HER-2胞内区片段蛋白作为抗原通过免疫学方法制备而成的抗人HER-2单克隆抗体，能够快速、准确地检测出细胞中人HER-2蛋白的表达水平。
保藏证明和存活证明说明
保藏细胞系：杂交瘤细胞系CH-HER2，保藏编号：CCTCC NO:C 2019325，保藏日期：2019年12月10日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
附图说明
图1为本发明中抗人HER-2单克隆抗体对于乳腺癌2+组织免疫组化染色图；
图2为本发明中抗人HER-2单克隆抗体对于另一乳腺癌2+组织免疫组化染色图；
图3为本发明中抗人HER-2单克隆抗体对于乳腺癌3+组织免疫组化染色图；
图4为本发明中抗人HER-2单克隆抗体对于另一乳腺癌3+组织免疫组化染色图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例中的人HER-2抗原，由包括如下步骤的方法制备得到：
1、抗原制备
目的基因的获取：根据CCDS Database查阅获得HER-2编码序列(登录号：CCDS32642.1)，直接合成676-1255处氨基酸对应的HER-2基因(如SEQ ID NO.2所示)，并设计上下游引物：
上游引物1：5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGAAGCGACGGCAGCAGAA-3’；
下游引物2：5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCACACTGGCACGTCCAGA-3’。
1.1、重组构建原核表达载体
首先，通过NdeI和XhoI内切酶对pET-28a质粒进行双酶切，然后收集获得双酶切后的质粒线性化片段。
同时，利用上下游引物特异性扩增目的条带，获得含有与pET-28a载体同源的序列和酶切位点序列的人HER-2胞内区片段基因序列。
最后，利用无缝克隆试剂盒重组构建形成重组质粒pET-28a-HER-2。
1.2、目的蛋白的诱导表达及纯化
将上述的pET-28a-HER-2质粒转染BL21感受态细胞中，鉴定阳性后，在LB培养基中首先进行IPTG诱导表达，紧接着扩大HER2蛋白表达量(增加BL21阳性菌株量)，利用镍柱进行纯化，最后收集人HER-2胞内区片段蛋白。
实施例2
本实施例中的抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株，由包括如下步骤的方法制备得到：
1、动物免疫
利用上述原核表达获得的人HER-2胞内区片段蛋白，用常规方法通过弗氏佐剂免疫6～8周龄雌性Balb/c小鼠，免疫方式为皮下多点结合腹腔免疫的方式进行。首次使用弗式完全佐剂，免疫剂量为抗原100μg/只，中间间隔时期为2周，第2、3次免疫选择弗式不完全佐剂，免疫剂量同为100μg/只。融合前3天尾静脉冲击免疫50μg不含佐剂的抗原剂量。
2、细胞融合
取小鼠脾脏进行研磨，通过与SP2/0细胞在PEG溶液中(规格为MW1500)中进行融合(融合比为1：5～10)，计数脾脏数目为1亿，SP2/0细胞约为2000万。将融合后的细胞置于HAT培养液中培养7天左右(6-8天)时间。
3、融合上清筛选
通过ELISA与IHC方法对细胞上清进行筛选，挑选出可准确在组织细胞中定位HER-2的抗体细胞株，且经过与对照试剂的对比，组织芯片的验证，最终确定抗体定位的准确性。
具体为：
1)融合细胞共铺得细胞数目12板，共1152孔。
2)通过ELISA检测，共筛出阳性孔437孔，阳性率37.9％。ELISA检测抗原为表达的HER2蛋白，酶标二抗购自sigma公司。
ELISA的检测过程：抗原包被量50ng/孔，二抗稀释比例1：5000，反应体系：包被2-8℃过夜，一抗37℃孵育30min，二抗37℃孵育30min，TMB显色，读数。其中已大于阴性孔读值(0.024)不足0.05按照0.05计算，大于其2.1倍为阳性。
3)通过IHC检测，共筛出22株可应用于IHC层面的抗体细胞株，22株细胞株中，有19株细胞IHC检测后，除阳性背景区域外，有非特异染色或者染色效果不佳，亲和力低。其中特异性与亲和力较高的有3株(C1F7、C6H5、C11C6)。其细胞冻存复苏后IHC染色效果统计结果及细胞传代3代后IHC染色效果统计结果如表1和表2所示。
C1F7细胞株经过细胞冻存复苏稳定性3次验证与细胞传代稳定性3代验证，结果抗体分泌能力均能达到较好的水平。通过细胞稳定性与抗体稳定性验证，C1F7为最佳，将其保藏，保藏名称为杂交瘤细胞系CH-HER2，保藏编号：CCTCC NO:C 2019325，保藏日期：2019年12月10日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
表1细胞冻存复苏后IHC染色效果统计(选择+++阳性组织蜡块切片进行评价)
C1F7 C6H5 C11C6
第1代 +++ +++ +++
第2代 +++ +++ +++
第3代 +++ ++ +++
表2细胞传代3代后IHC染色效果统计(选择+++阳性组织蜡块切片进行评价)
C1F7 C6H5 C11C6
第1代 +++ +++ +++
第2代 +++ +++ +++
第3代 +++ +++ ++
实施例3
本实施例中的抗人HER-2单克隆抗体，是以人HER-2胞内区片段蛋白作为抗原通过免疫学方法制备而成；所述人HER-2胞内区片段蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本实施例中的抗人HER-2单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
对实施例2中筛选获得的IHC抗体细胞株(C1F7)进行无血清培养：首先增加保存细胞株同代15支，复苏1支利用无血清+胎牛血清正常培养，后每3天降低5％血清浓度，直到0％血清浓度下培养细胞。最后第七天收获上清，经过ProteinA柱纯化获得目的蛋白，具体是：先用PBS平衡层析柱，后用PBS稀释的10倍体积上清进行上样，待稳定后更换柠檬酸洗脱液进行洗脱收集，收集的同时在收集管中预先加好碱试剂进行中和，最后通过脱盐柱进行脱盐，离心浓缩收集，即为抗人HER-2单克隆抗体。
实施例4
本实施例中用于检测人HER-2蛋白的免疫组化试剂盒，包含一抗试剂，所述一抗试剂中包含由上述C1F7细胞株分泌的抗人HER-2单克隆抗体(一抗)；所述一抗试剂可以与二抗、过氧化物酶封闭剂、DAB显色液等组成试剂盒，用于检测人HER-2蛋白。
试验例单克隆抗体的使用效果
本试验例中以上述C1F7细胞株分泌的抗人HER-2单克隆抗体作为一抗，对不同的乳腺癌组织进行染色，染色过程如下所示：
1、不同乳腺癌石蜡组织样本3μm切片，65℃条件下烤片2h。
2、脱蜡与水化：石蜡切片以下经以下处理：二甲苯15min-二甲苯15min-无水乙醇5min-无水乙醇5min-90％乙醇5min-80％乙醇5min-70％乙醇5min，纯化水浸泡5min。
3、抗原修复：利用pH9.0的EDTA溶液加热煮沸20min，自然冷却5min后，用自来水使之冷却，液体冷却后取出切片，纯水浸泡5min，TBS冲洗浸泡5min共2次。
4、加过氧化物酶封闭剂100μL/张，室温下孵育5min，TBS冲洗浸泡5min共2次。
5、一抗孵育：加入上述制备抗体的工作液，37℃条件下孵育30min，TBS冲洗浸泡2次，5min/次。
6、二抗孵育：先滴加100μL二抗，37℃孵育30min，TBS冲洗浸泡2次，5min/次。
7、显色：除去TBS溶液，滴加100μL DAB显色液，室温孵育5min，纯化水浸泡2次，5min/次。
8、复染：滴加100μL苏木素复染液室温孵育3min，纯化水浸泡2次，5min/次。
9、脱水透明：常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明。
10、中性树胶封片观察。
染色结果如图1-4所示，图1和图2为乳腺癌2+组织，从图中可以看出，HER2抗体定位在细胞膜，可清晰的显现完整细胞膜结构，染色浅；图3和图4为乳腺癌3+组织，从图中可以看出，HER2抗体定位在细胞膜，可清晰的显现完整细胞膜结构，染色深，背景深。
本发明具有以下有益效果：第一，实现人HER-2自主免疫组化试剂的研发，为后期免疫组化中的伴随诊断提供试剂；第二，本发明选择的人HER-2胞内区片段(676-1255aa)作为抗原，主要是因为胞内区近C末端具有良好的抗原表位，这样就为后续筛选获得优势抗体提供更大的概率；第三，与同类试剂比较，本发明所获得的抗人HER-2单克隆抗体具有更特异性的定位与免疫组化效果。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 河南赛诺特生物技术有限公司
<120> 一种抗人HER-2单克隆抗体，抗原、杂交瘤细胞株及免疫组化试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 580
<212> PRT
<213> 人
<221> 人HER-2胞内区片段
<400> 1
KRRQQKIRKY TMRRLLQETE LVEPLTPSGA MPNQAQMRIL KETELRKVKV LGSGAFGTVY 60
KGIWIPDGEN VKIPVAIKVL RENTSPKANK EILDEAYVMA GVGSPYVSRL LGICLTSTVQ 120
LVTQLMPYGC LLDHVRENRG RLGSQDLLNW CMQIAKGMSY LEDVRLVHRD LAARNVLVKS 180
PNHVKITDFG LARLLDIDET EYHADGGKVP IKWMALESIL RRRFTHQSDV WSYGVTVWEL 240
MTFGAKPYDG IPAREIPDLL EKGERLPQPP ICTIDVYMIM VKCWMIDSEC RPRFRELVSE 300
FSRMARDPQR FVVIQNEDLG PASPLDSTFY RSLLEDDDMG DLVDAEEYLV PQQGFFCPDP 360
APGAGGMVHH RHRSSSTRSG GGDLTLGLEP SEEEAPRSPL APSEGAGSDV FDGDLGMGAA 420
KGLQSLPTHD PSPLQRYSED PTVPLPSETD GYVAPLTCSP QPEYVNQPDV RPQPPSPREG 480
PLPAARPAGA TLERPKTLSP GKNGVVKDVF AFGGAVENPE YLTPQGGAAP QPHPPPAFSP 540
AFDNLYYWDQ DPPERGAPPS TFKGTPTAEN PEYLGLDVPV 580
<211> 1743
<212> DNA
<213> 人
<221> 人HER-2胞内区片段基因序列
<400> 2
aagcgacggc agcagaagat ccggaagtac acgatgcgga gactgctgca ggaaacggag 60
ctggtggagc cgctgacacc tagcggagcg atgcccaacc aggcgcagat gcggatcctg 120
aaagagacgg agctgaggaa ggtgaaggtg cttggatctg gcgcttttgg cacagtctac 180
aagggcatct ggatccctga tggggagaat gtgaaaattc cagtggccat caaagtgttg 240
agggaaaaca catcccccaa agccaacaaa gaaatcttag acgaagcata cgtgatggct 300
ggtgtgggct ccccatatgt ctcccgcctt ctgggcatct gcctgacatc cacggtgcag 360
ctggtgacac agcttatgcc ctatggctgc ctcttagacc atgtccggga aaaccgcgga 420
cgcctgggct cccaggacct gctgaactgg tgtatgcaga ttgccaaggg gatgagctac 480
ctggaggatg tgcggctcgt acacagggac ttggccgctc ggaacgtgct ggtcaagagt 540
cccaaccatg tcaaaattac agacttcggg ctggctcggc tgctggacat tgacgagaca 600
gagtaccatg cagatggggg caaggtgccc atcaagtgga tggcgctgga gtccattctc 660
cgccggcggt tcacccacca gagtgatgtg tggagttatg gtgtgactgt gtgggagctg 720
atgacttttg gggccaaacc ttacgatggg atcccagccc gggagatccc tgacctgctg 780
gaaaaggggg agcggctgcc ccagcccccc atctgcacca ttgatgtcta catgatcatg 840
gtcaaatgtt ggatgattga ctctgaatgt cggccaagat tccgggagtt ggtgtctgaa 900
ttctcccgca tggccaggga cccccagcgc tttgtggtca tccagaatga ggacttgggc 960
ccagccagtc ccttggacag caccttctac cgctcactgc tggaggacga tgacatgggg 1020
gacctggtgg atgctgagga gtatctggta ccccagcagg gcttcttctg tccagaccct 1080
gccccgggcg ctgggggcat ggtccaccac aggcaccgca gctcatctac caggagtggc 1140
ggtggggacc tgacactagg gctggagccc tctgaagagg aggcccccag gtctccactg 1200
gcaccctccg aaggggctgg ctccgatgta tttgatggtg acctgggaat gggggcagcc 1260
aaggggctgc aaagcctccc cacacatgac cccagccctc tacagcggta cagtgaggac 1320
cccacagtac ccctgccctc tgagactgat ggctacgttg cccccctgac ctgcagcccc 1380
cagcctgaat atgtgaacca gccagatgtt cggccccagc ccccttcgcc ccgagagggc 1440
cctctgcctg ctgcccgacc tgctggtgcc actctggaaa ggcccaagac tctctcccca 1500
gggaagaatg gggtcgtcaa agacgttttt gcctttgggg gtgccgtgga gaaccccgag 1560
tacttgacac cccagggagg agctgcccct cagccccacc ctcctcctgc cttcagccca 1620
gccttcgaca acctctatta ctgggaccag gacccaccag agcggggggc tccacccagc 1680
accttcaaag ggacacctac ggcagagaac ccagagtacc tgggtctgga cgtgccagtg 1740
tga 1743
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物1
<400> 3
gtgccgcgcg gcagccatat gaagcgacgg cagcagaa 38
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物2
<400> 4
gtggtggtgg tggtgctcga gtcacactgg cacgtccaga 40

Claims (3)

1.一种抗人HER-2单克隆抗体，其特征在于：所述抗人HER-2单克隆抗体是由抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；
所述抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞系CH-HER2，保藏编号：CCTCCNO: C 2019325。
2.一种抗人HER-2单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞系CH-HER2，保藏编号：CCTCC NO: C 2019325。
3.一种用于检测人HER-2蛋白的免疫组化试剂盒，其特征在于：所述免疫组化试剂盒中包含一抗试剂，所述一抗试剂中包含如权利要求1所述的抗人HER-2单克隆抗体。
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