CN113621069B

CN113621069B - 抗her-2蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113621069B
Application number: CN202111037454.2A
Authority: CN
Inventors: 杨清海; 陈惠玲; 王小亚; 周洪辉; 高惠然
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Priority date: 2021-09-06
Filing date: 2021-09-06
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2041-09-06
Also published as: CN113621069A

Abstract

本发明涉及一种可以识别人HER‑2抗原的单克隆抗体，其制备方法以及其在免疫检测中的用途。本发明提供一种抗HER‑2蛋白兔单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。该抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达HER‑2蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

Description

抗HER-2蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗HER-2蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

HER-2基因(ERBB2基因)定位于17q12，其表达的蛋白是表皮生长因子受体家族的成员之一，亦称为受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)erbB-2，HER-2基因可以编码分子量185kDa为的酪氨酸激酶活性跨膜糖蛋白。HER-2与配体结合形成二聚体，构象发生改变，导致细胞内受体酪氨酸激酶的磷酸化，引起信号通路上的连锁反应，促进细胞增殖分化。国内外研究报道，HER-2过度表达与乳腺癌的发生、发展、侵袭和转移密切相关。

乳腺癌个体化沴疗在临床实践中发挥着越来越重要的作用。依据受体状态选择乳腺癌内分泌治疗和分子靶向治疗成为个体化诊疗的典范尤其是人表皮生长因子受体(HER-2)在乳腺癌治疗中的地位越来越受重视，不仅可以预测细胞毒性药物蒽环类或紫杉类药物的疗效，而且已经成为评价HER-2抗靶向药物临床获益的重要分子标志物。针对HER-2的单克隆抗体曲妥珠单抗，使HER-2阳性乳腺癌患者复发风险明显降低，无论单药、与化疗联合或辅助治疗均能够持续改善患者的无病生存时间，因其在乳腺癌治疗取得的卓越疗效，成为肿瘤分子靶向治疗的代表。因此，根据HER-2表达状态制定细胞毒性药物及靶向药物的合理治疗方案，并预测药物疗效和评价预后已经成为乳腺癌沴疗的主要策略。

因此，开发具有高特异性和高敏感性的HER-2免疫组化单克隆抗体对于乳腺癌病理诊断和指导靶向用药具有重要意义。

发明内容

发明人提供了一种抗HER-2蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别HER-2蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体。

发明人又提供了一种抗HER-2蛋白单克隆抗体的制备方法，用于免疫兔的抗原为重组蛋白，所述重组蛋白由大肠杆菌重组表达；选择1033-1255位点的蛋白片段，其为SEQID NO.1所示的氨基酸序列；优化成适合在大肠杆菌表达的基因片段,其为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；并将该基因片段克隆至pET-32a载体上。

进一步的，所述重组蛋白包含TrxA蛋白标签和组氨酸蛋白标签。

发明人还提供了上述单克隆抗体在HER-2蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

发明人最后提供了一种HER-2蛋白免疫组化检测试剂，所述免疫组化检测试剂含有上述单克隆抗体为其有效成分。

区别于现有技术，本发明所产生的有益技术效果为：上述技术方案提供一种抗HER-2蛋白兔单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。该抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达HER-2蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为实施例1融合组氨酸标签的HER-2重组肽段纯化结果胶图。

图2为乳腺癌1免疫组化染色结果对比图；其中左为兔单抗HER-2(3A3)，右为市售HER-2。

图3为乳腺癌2免疫组化染色结果对比图；其中左为兔单抗HER-2(3A3)，右为市售HER-2。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1重组HER-2蛋白片段的制备

一、基因优化与合成

HER-2按照UniHER-2ot数据库中登录号为P04626的蛋白质序列，选择1033-1255位点的蛋白片段，为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；优化成适合在大肠杆菌E.coli Rosetta表达的基因片段,为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；并将该基因片段克隆至pET-32a载体上。

用表达载体转化大肠杆菌感受态细胞E.coli Rosetta，挑取平板上的克隆接种，进行菌液PCR鉴定。挑选PCR结果阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆使用。

选择不同的抗原进行免疫可能制备出不同结合特性的抗体，该分子同时存在多种因可变剪切引起的变异体，最终导致不同抗体对表达抗原细胞的识别能力和模式不同。HER-2分子按照公布的序列进行分析，依据在细胞上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，选择HER-2的1033-1255位点的基因序列进行密码子优化，分子量约为55kDa。通过序列优化设计利用原核表达基因序列获得HER-2重组肽段。而重组免疫原由具有抗原性的HER-2重组肽段及用于重组蛋白纯化的蛋白标签组成，蛋白标签为TrxA和HIS。

二、蛋白表达和纯化

按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100mL LB培养基，加入终浓度为100μg/mL的氨苄，37℃振荡培养至OD600为0.5-0.6，加入0.8mmol/L的IPTG，37℃震荡培养4h，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用150mmol/L咪唑进行洗脱，SDS PAGE分离检测。

图1为融合组氨酸标签的重组HER-2蛋白纯化结果胶图。最终纯化蛋白浓度为3mg/mL，纯度80％，可用于动物免疫和抗体筛选与鉴定的要求。

实施例2产兔抗人HER-2单克隆抗体的单一B细胞分选

一、免疫和ELISA检测

将实施例1中的重组HER-2蛋白用弗氏完全佐剂乳化，选择6只兔子进行免疫，剂量为300μg/只。分别在第6、21、42天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂乳化，剂量为150μg/只。第70天进行冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为300μg/只。在第三、四次免疫后进行血清ELISA效价检测，其中4只兔子第四次免疫的血清进行IHC检测，根据结果(即用与抗体相对应的阳性对照片进行检测，阳性对照片中相应的检测位点上可观察到免疫组化染色)，选择其中1只兔子进行后续单抗筛选。

二、脾脏细胞分离和B淋巴细胞分选

对选定兔子进行单抗制备。冲击免疫4天后取脾脏，兔子脾脏置于含有100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RMPI基础培养基中，用手术刀片切为碎块后转移到100μm的细胞筛网中研磨。将所得细胞悬浊液滤去大的细胞团块和组织包膜，在400g下离心5分钟后去上清后保留脾脏细胞团。脾脏细胞团用低渗溶液重悬并裂解红细胞后再次于400g下离心5分钟，保留脾脏细胞。脾脏细胞用100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RMPI基础培养基重悬，400g下离心5分钟，所得脾脏细胞用完全培养基(含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RMPI基础培养基)重悬备用。

B淋巴细胞分选具体步骤参见中国专利201910125091.4《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》。

分选和培养2000个左右单一B细胞克隆，通过ELISA初筛出特异识别实施例1中的重组HER-2蛋白的阳性克隆，根据ELISA数据，选择从高到低的96个上清做IHC验证。

三、B细胞培养阳性克隆检测

使用包含HER-2阳性和阴性的多肿瘤组织芯片和正常组织芯片对单一B细胞培养上清进行IHC验证，其中12个克隆培养上清的IHC结果较好制备LEM上清，进行IHC验证，确定敏感性和特异性均优良的克隆3A3。

敏感性和特异性筛选标准为：用与抗体相对应的阳性对照片进行检测，阳性对照片中相应的检测位点上可观察到免疫组化染色，而非检测位点上未观察到任何免疫组化染色。与对照抗体比较，染色强度达到甚至高于对照抗体。

四、亲和常数测定：

包被HER-2抗原多肽，包被浓度为1μg/ml,100μL/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。将纯化的3A3的HER-2单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μL，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μL 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为1.09×10¹¹。

五、编码兔单克隆抗体基因的克隆(3A3)和兔单克隆抗体表达质粒构建

阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体轻重链可变区基因(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列。

用上述确定的天然配对的兔单克隆抗体轻和重链可变区基因序列分别构建兔单克隆抗体表达载体质粒。

实施例2由福州迈新生物技术开发有限公司委托武汉爱博泰克生物科技有限公司完成，其中由福州迈新生物技术开发有限有公司进行免疫组化筛选。

实施例3 HER-2兔单克隆抗体表达

一、质粒扩增和提取

取出一管(100μl)感受态菌(DH5α)，插入冰上，冰浴5-10min；加入5μl质粒轻轻震荡后放置冰上30min；轻轻摇匀后放入42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置5min；在超净工作台中向上述中分别加入800μl LB培养基(注：不含抗生素)，轻轻混匀，固定在摇床上37℃震荡1h；在超净工作台中取上述转化混合液50-100μl，分别滴加至已标记好的含Amp的固体LB平板培养皿中，用玻璃涂布棒(灭菌)涂布均匀；先在37℃培养箱中正置30min，令表面的菌液完全渗透至培养基中，再倒置放入37℃培养箱中过夜培养。用枪头挑取单菌落打入4ml LB培养基中(含2uL 200mg/mlAmp)，37℃摇床培养16h，37℃，220rpm。

加1ml菌液至100ml LB培养基中(含50μl 200mg/ml Amp)，37℃摇床培养16h；使用SanHER-2ep去内毒素质料DNA小量抽提试剂盒(上海生工)，根据说明书进行质粒提取。

二、转染

用Expi293FTM ExHER-2ession Medium将293F细胞浓度调整浓度至2.5-3×106viable cells/ml，并过夜培养。

1)用血球计数板计数，活细胞浓度约为4.5-5.5×106viable cells/ml，且活细胞数需达到表达体系的要求；

2)用Expi293FTM ExHER-2ession Medium稀释细胞浓度至3×106viable cells/ml；

3)将质粒DNA加入Opti-MENTM I Ruduced Serum Medium中，轻轻吹打，颠倒混匀；

4)轻轻颠倒ExpiFectamineTM 293Reagent 4-5次，将ExpiFectamineTM293Reagent和Opti-MENTM I Ruduced Serum Medium混合，温和吹打和颠倒2-3次，室温下放置5min；

5)将步骤3)和4)的溶液混合，温和吹打和颠倒2-3次，混匀；

6)将步骤5)溶液放置于室温10-20min；

7)缓慢得将混合液吸至细胞培养液中，并温和摇晃三角瓶；

8)8％CO₂，37℃摇床培养5-7天；

9)18-22小时后，加入ExpiFectamineTM 293Transfection Enhancer1和ExpiFectamineTM 293Transfection Enhancer2(注：使用前提前混合)，并温和摇晃混匀，继续培养。

三、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rHER-2otein A FF亲和层析法按说明书从上清中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4.免疫组化组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。使用3DHISTECH公司的全自动组织芯片仪制作组织芯片。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入68℃烤箱内10分钟,使组织芯与受体蜡块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到50℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入68℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二.IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育15-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟)-100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三.数据统计

1、肿瘤组织芯片检测结果：

将本抗体HER-2(3A3)和市售抗体HER-2(EP3)在60例乳腺癌肿瘤集的进行同步检测并比较检测结果。HER-2的免疫组化结果进行统计。整个试验过程采取双盲设计，统计结果如下表：

结果显示:本发明所制备的抗HER-2(3A3)蛋白单克隆抗体的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。在免疫组化检测中，阳性率高于市售抗体，部分病例的阳性强度高于市售抗体。在1例乳腺癌病例中，对照HER-2抗体为阴性，而本发明的HER-2抗体则样本为中度阳性；标记为“++”。说明其敏感性更高，有效避免假阴性结果。

图2和3均为乳腺癌组织免疫组化染色结果对比图；左为本发明兔单抗HER-2(3A3)，右为市售HER-2(EP3)。

2、正常组织芯片检测结果：

正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

将本发明兔单抗HER-2(3A3)，市售HER-2(EP3)在正常组织芯片上进行同步检测，阴阳性检测结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗HER-2蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

<130> 2010

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala Ser

1 5 10 15

Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu Leu Glu Asp Asp Asp Met

20 25 30

Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe

35 40 45

Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly Gly Met Val His His Arg

50 55 60

His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly

65 70 75 80

Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser

85 90 95

Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala

100 105 110

Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln

115 120 125

Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly

130 135 140

Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln

145 150 155 160

Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro

165 170 175

Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu Ser

180 185 190

Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly Gly Ala

195 200 205

Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala Ala Pro

210 215 220

<210> 2

<211> 668

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

ttacactggc acgtccagac ccaggtactc tgggttctct gccgtaggtg tccctttgaa 60

ggtgctgggt ggagcccccg ctctggtggg tcctggtccc agtaatagag gttgtcgaag 120

gctgggctga aggcaggagg agggtggggc tgaggggcag ctccccctgg ggtgtcaagt 180

actcggggtt ctccacggca cccccaaagg caaaaacgtc tttgacgacc ccattcttcc 240

ctggggagag agtcttggcc tttccagagt ggcaccagca ggtcgggcag caggcagagg 300

gccctctcgg ggcgaagggg gctggggccg aacatctggc tggttcacat attcaggctg 360

ggggctgcag gtcagggggg caacgtagcc atcagtctca gagggcaggg gtactgtggg 420

gtcctcactg taccgctgta gagggctggg gtcatgtgtg gggaggcttt gcagcccctt 480

ggctgccccc attcccaggt caccatcaaa tacatcggag ccagcccctt cggagggtgc 540

cagtggagac ctggggcctc ctcttcagag ggctccagcc ctagtgtcag gtccccaccg 600

ccactcctgg tagatgagct gcggtgcctg tggtggacca tgcccccagc gcccggggca 660

gggtctgg 668

<210> 3

<211> 494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac aatcacctgt 120

acagtctctg gaatcgacct cagtaggtat gcaatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180

gaggggctgg aatggatcgg aacaattagt agtagtggta gtccctacta cgcgacctgg 240

gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa aatcaccagt 300

ccgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgtggcaggg gcgcctggcg tcttaacttg 360

tggggcctag gcaccctggt caccgtctcc tcagggcaac ctaaggctcc atcagtcttc 420

ccactggccc cctgctgcgg ggacacaccc agctccacgg tgaccctggg ctgcctggtc 480

aaaggctacc tccc 494

<210> 4

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

agatgtgatg ttgtgatgac ccagactcca tcctccgtgg aggcagctgt gggaggcaca 120

gtcaccatca agtgccaggc cagtcagaac attagtaatt acttatcctg gtatcagcag 180

aaaccagggc agcgtcccaa gctcctgatc tatggtccat ctattctgga atctggggtc 240

ccatcgcggt tcagcggcag tggatctggg acagagttca ctctcaccat cagcggcgtg 300

cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt caaggcggtt atggtagtag tagtaataat 360

aattatggta gtgtttttgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaaggtga tccagttgca 420

cctactgtcc tcatcttccc accagctgct gatcaggtgg caactggaac agtcaccatc 480

gtgtgtgtgg cgaataaata ctttcccgat gtcaccgtca cctgggaggt ggatggcacc 540

acccaaacaa ctggcatcga gaacagtaaa acaccgcaga attctgcaga ttgtacctac 600

aacctcagca gcactctgac actgaccagc acacagtaca acagccacaa agagtacacc 660

tgcaaggtga cccagggcac gacctcagtc gtccagagct tcaatagggg tgactgttag 720

<210> 5

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser

35 40 45

Arg Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Thr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp

65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu

85 90 95

Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly

100 105 110

Arg Gly Ala Trp Arg Leu Asn Leu Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

130 135 140

Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val

145 150 155 160

Lys Gly Tyr Leu

<210> 6

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser

20 25 30

Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser

35 40 45

Gln Asn Ile Ser Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Pro Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly

100 105 110

Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Asn Asn Tyr Gly Ser Val Phe Gly Gly

115 120 125

Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu

130 135 140

Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile

145 150 155 160

Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu

165 170 175

Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro

180 185 190

Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

195 200 205

Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr

210 215 220

Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

225 230 235

Claims

1.一种抗HER-2蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO.6所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别HER-2蛋白。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体。

5.一种HER-2蛋白免疫组化检测试剂，其特征在于，所述免疫组化检测试剂含有权利要求1-4任一所述的抗HER-2蛋白单克隆抗体为其有效成分。