JPH0759588A - 増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体の製造方法及び抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、ヒト癌細胞の可溶化物を免疫抗原と
して用いることを特徴とする増殖因子レセプターに対す
るモノクローナル抗体の製造方法、並びにヒト乳癌細胞
株ＳＫ−ＢＲ−３で免疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳
動物の骨髄細胞との融合により形成されたハイブリドー
マにより産生されｃ−ｅｒｂＢ−２関連蛋白質に特異的
に反応する抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体と該
抗体を必須成分として含有する抗腫瘍剤及び癌の診断剤
とを提供するものである。 【効果】本発明抗体は、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連蛋白質に
特異的に反応することを特徴としており、腺癌、特に乳
癌の診断及び治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、癌の診断及び治療に有
用な増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体、
代表的にはｃ−ｅｒｂＢ−２関連蛋白質に対するモノク
ローナル抗体の製造方法及び該モノクローナル抗体に関
する。

【０００２】

【従来の技術】癌遺伝子産物は、現在約５０種類知られ
ている。その癌遺伝子産物中、もっとも大きなグループ
を形成するのはチロシンキナーゼであり、これは細胞膜
にぶら下がるように存在するｓｒｃ型と、細胞膜を貫通
し増殖因子との結合部位を有する受容体型に大別され
る。この受容体型チロシンキナーゼ（チロシン残基特異
的蛋白質リン酸化酵素）癌遺伝子は、種々の構造的変化
を受けて癌遺伝子として活性化されることが知られてい
る。しかしながら、ヒト悪性腫瘍においては、この構造
的変化は認められずに、遺伝子増幅と癌遺伝子産物の高
発現が検出される場合がしばしば認めれる。特に、受容
体型チロシンキナーゼのうち、上皮細胞成長因子（ｅｐ
ｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＥＧ
Ｆ）と該ＥＧＦの受容体（レセプター）と酷似する蛋白
質をコードする関連遺伝子として見い出されたｃ−ｅｒ
ｂＢ−２遺伝子［Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，２３０−２３４（１９８
６）］の癌遺伝子産物であるｐ１８５遺伝子は、種々の
ヒト悪性腫瘍において該遺伝子の増幅と癌遺伝子産物の
高発現が認められており、特に腺癌中に高頻度のｃ−ｅ
ｒｂＢ−２遺伝子の増幅が認められている。また、この
ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の増幅程度が、その腺癌、特に
乳癌の予後と強い相関を示すことが既に見い出だされて
いる［Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３５， １７７−１８２（１９８７）］。

【０００３】ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子は、センバらによ
りＥＧＦレセプター遺伝子と類似の構造を持つ遺伝子と
して発見され［Ｓｅｍｂａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８
２，６４９７−６５０１（１９８５）］、Ｎ末端のシグ
ナルペチプドに続く細胞外ドメインには、２ケ所のシス
テインに富んだ領域があり、またＥＧＦレセプターとの
アミノ酸配列の相同性が４４％と高く、同様のレセプタ
ーの働きをしていると考えられている。該遺伝子の細胞
内ドメインは最初のキナーゼドメインとＣ末端の制御ド
メインとよりなり、前者はアミノ酸配列において、ＥＧ
Ｆレセプターのキナーゼドメインと８２％の高い相同性
を示す。後者は相同性こそ３２％とやや低いが、Ｃ末端
近くのキナーゼ活性制御に重要と考えられる３個のチロ
シン残基が、それぞれＥＧＦに対応する位置に保存され
ている。また、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子はワインバーグ
らの分離したラットの癌遺伝子ｎｅｕ［Ｂａｒｇｍａｎ
ｎ，Ｃ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，
２２６−２３０（１９８６）］と相同性が高く、該ラッ
トにおけるｎｅｕとヒトにおけるｃ−ｅｒｂＢ−２と
は、同じ遺伝子を指しているものと結論された。更に、
ｃ−ｅｒｂＢ−２は分子量が１８５ｋｄの大きさの特異
的なタンパク質として検出され、アミノ酸の一次構造か
ら予想された分子量１４０ｋｄよりかなり大きいことか
ら、糖鎖の結合したタンパク質であると推定された［Ａ
ｋｉｙａｍａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２３２，１６４４−１６４６（１９８６）］。そして、
このタンパク質は試験管内において、チシロンに特異的
なタンパク質リン酸化酵素活性を示した。

【０００４】ｃ−ｅｒｂＢ−２の変異と発癌性（トラン
スフォーム能）については、ラットのｎｅｕ遺伝子のト
ランスフォーム活性が、細胞膜通過領域にただ一つの変
異が起り、バリンがグルタミン酸に変化したことにより
獲得されるものであることが明らかになり［Ｂａｒｇｍ
ａｎｎ，Ｃ．Ｉ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４５，６
４９−６５７（１９８６）］、このことからｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２においても、対応する６５９番目のアミノ酸がバ
リンであることから、これをグルタミン酸に変異させる
とｎｅｕ遺伝子と同様に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するト
ランスフォーム能を獲得すると報告されている［Ｄｉ−
Ｆｉｏｒｅ，Ｐ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３７，１７８−１８２（１９８７）］。また、Ｃ
末端の制御ドメインを大幅に欠損させる変異によって
も、前記の変異よりは弱いものの、細胞トランスフォー
ム能を獲得し得る。更に、上記両変異が共存すると、ｃ
−ｅｒｂＢ−２はより高いトランスフォーム能を獲得す
ることができる。これらのトランスフォーム能を獲得し
た例では、いずれもｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質のチロ
シンリン酸化活性が上昇しており［Ｓｅｇａｔｔｏ，
Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
８，５５７０−５５７４（１９８８）］、ｃ−ｅｒｂＢ
−２タンパク質もＥＧＦレセプターと同様に、チロシン
リン酸化によって細胞外の増殖シグナルを細胞内に伝え
ていること、及び変異によって癌遺伝子化することが考
えられている。

【０００５】いま一つの活性化としては、遺伝子の増幅
が考えられる。この点については、ＳＶ４０プロモータ
ーにつないだｃ−ｅｒｂＢ−２は、ＮＩＨ３Ｔ３をトラ
ンスフォームする活性を持たないが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞
中で導入されたＳＶ４０プロモーターつきｃ−ｅｒｂＢ
−２遺伝子の増幅を起こし、その発現が上昇するとＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞は、トランスフォームした形質を示すよう
になる。このことから、ｃ−ｅｒｂＢ−２の高い発現
は、やはり細胞の異常増殖に役割を果たすと考えられる
［Ｄｉ−Ｆｉｏｒｅ，Ｐ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３７，１７８−１８２（１９８７）］。

【０００６】ｃ−ｅｒｂＢ−２のヒト癌における遺伝子
増幅については、胃癌と乳癌を中心とした腺癌におい
て、しばしば遺伝子増幅の認められることが報告されて
いる［Ｙｏｋｏｔａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅ
ｔＩ，７６５−７６７（１９８５）］。乳癌について
は、ヒト乳癌と乳癌由来の培養細胞に、ｃ−ｅｒｂＢ−
２の遺伝子増幅が認められること［Ｋｉｎｇ，Ｃ．
Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，９７４
−９７６（１９８５）；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，２３０−２３４（１９
８６）］と、欧米では乳癌は最も頻度の高い癌の一つで
あることとが重なって、現在までに遺伝子増幅と乳癌の
悪性度の関係が種々追求されてきている。之等多くの報
告を総合すると、乳癌手術組織においてほぼ２０％前後
の割合で、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の増幅が見られ、そ
の多くは予後が悪いか、転移が見られる等、悪性度の高
いことが示唆されている［Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，１７７−１８２
（１９８７）；Ｋｒａｕｓ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，
ＥＭＢＯ Ｊ．，６，６０５−６１０（１９８７）；Ｚ
ｂｏｕ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．，４７，６１２３−６１２５（１９８７）；Ｖｉｊ
ｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，７，２０１９−２０２３（１９８７）；Ｇｕｅｒ
ｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＯｎｃｏｇｅｎｅＲｅ
ｓ．，３，２１−３１（１９８８）；Ａｌｉ，Ｉ．
Ｕ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｒｅｓ．，３，１３９
−１４６（１９８８）；Ｔａｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４８，１５１７−１５２０
（１９８８）］。本邦においても津田らが手術組織の病
理標本から抽出したＤＮＡを用いて、スロット・ブロッ
ト法でｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の増幅を検討し、１０年
間の術後生存率を比較した成績を報告しており、該報告
によれば、遺伝子増幅の見られた例では明らかに予後が
悪かった［Ｔｓｕｄａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓ．，４９，３１０４−３１０８（１９８
９）］。

【０００７】以上のような背景の中で近年では、ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２タンパク質に対する抗体やモノクローナル抗
体も開発され、病理材料のみならず、手術材料を直ちに
免疫染色法によって検査する方法も開発されつつあり
［Ｍａｓｕｋｏ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ８０，１０−１４（１９８
９）；Ｙａｍａｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，８０，１１９２−１１９
８（１９８９）］、ｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子産物を認
識する抗体としても、例えばｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の
Ｃ末端領域を認識するポリクローナル抗体、ｐＡｂ１
（Ｔ４８８１）［トリトンバイオサイエンス社製（Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．；Ａｌａｍ
ｅｄａ，ＣＡ）］や、キナーゼドメインを認識するポリ
クローナル抗体Ａｂ−１［オンコジーンサイエンス社製
（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．：Ｍａ
ｎｈａｓｓｅｔ，ＮＹ）］や、ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞
外ドメインを認識するモノクローナル抗体、ＳＶ２−６
１γ［ニチレイ株式会社製（Ｎｉｔｉｒａｉ Ｃｏ．：
Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）］等が知られている。

【０００８】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は、腺
癌、特に乳癌の診断と治療において、これと関連の深い
増殖因子レセプター（ある種の癌遺伝子）を認識するモ
ノクローナル抗体及びその製造方法を提供することにあ
る。

【０００９】本発明はまた、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ
−３の培養上清で免疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動
物の骨髄細胞との融合により形成されたハイブリドーマ
により産生され、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連蛋白質に特異的
に反応する抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体を提
供することを目的とする。

【００１０】更に本発明は腺癌、特に乳癌の診断剤及び
治療剤を提供することをも目的としている。

【００１１】本発明者らは、上記目的から鋭意研究を重
ねた結果、ヒト癌細胞の可溶化物を免疫抗原として用い
る場合には、目的とする増殖因子レセプターを認識する
モノクローナル抗体が製造できることを見出すと共に、
ヒト乳癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ−３細胞から上記方法
に従って抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体を得る
に成功し、ここに本発明を完成するに至った。

【００１２】

【問題を解決するための手段】本発明によれば、ヒト癌
細胞の可溶化物を免疫抗原として用いることを特徴とす
る増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体の製
造方法、及びヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３で免疫した
哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄細胞との融合によ
り形成されたハイブリドーマにより産生されｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２関連蛋白質に特異的に反応することを特徴とする
抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体が提供される。

【００１３】また本発明によれば、ハイブリドーマがＧ
ＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１（微工研菌寄第１２２０６
号）である上記抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体
が提供される。

【００１４】本発明抗体は、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連蛋白
質に特異的に反応することを特徴としており、この抗体
の利用によれば、悪性腫瘍等の臨床治療及び診断を有効
に行なうことができる。従って、本発明はかかる悪性腫
瘍等の臨床治療剤及び診断剤をも提供するものである。

【００１５】以下、本発明のモノクローナル抗体の製造
方法につき詳述する。

【００１６】本発明抗体の製造は、上記の通りヒト癌細
胞の可溶化物を免疫抗原として用いることを必須の要件
として、その他は一般的モノクローナル抗体の製造方法
と同様にして実施でき、これによって増殖因子レセプタ
ーに対する所望抗体を容易に収得できる。ここで上記増
殖因子レセプターには、例えば上皮成長因子レセプター
（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子
レセプター（ＩＧＦＲ）、血小板由来成長因子レセプタ
ー（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）、コロニー刺激因子
レセプター（ＣＳＦＲ）等が包含される。

【００１７】本発明抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル
抗体を例にとり、上記製造方法を詳述すれば、これは例
えば特定の融合細胞から産生される。該融合細胞を得る
ための一方の親細胞（免疫細胞）としては、ヒト乳癌細
胞株ＳＫ−ＢＲ−３細胞の可溶化物が用いられる。該免
疫細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞より通常の方法に従い、
例えば培養上清濃縮物等の形態に可溶化して調製でき
る。ここで用いられるＳＫ−ＢＲ−３細胞は公知であ
り、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）に寄託されている［Ｈａｖｅｌ，Ｒ．
Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，
３４，１３４５−１３５３（１９５５）等参照］。

【００１８】上記ＳＫ−ＢＲ−３細胞の可溶化物を免疫
抗原として利用した本発明抗体の製造も、常法に従って
実施することができる［例えばＨａｎｆｌａｎｄ，
Ｐ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，１５，１０
５（１９７５）；Ｈａｎｆｌａｎｄ，Ｐ．，Ｃｈｅｍ．
Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，１０，２０１（１９７６）；
Ｋｏｓｃｉｅｌａｋ，Ｊ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，３７，２１４（１９７８）等参照］。

【００１９】該方法は、より具体的には、例えば上記免
疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺
乳動物の形質細胞腫細胞（骨髄細胞）との融合細胞（ｈ
ｙｂｒｉｄｏｍａ）を作成し、これよりｃ−ｅｒｂＢ−
２関連蛋白質を認識する所望抗体を生産するクーロンを
選択し、該クーロンの培養により実施できる。本発明抗
体としては、粗製抗体液、即ち抗体産生ハイブリドーマ
の培養上清あるいはマウス腹水の状態のものをそのまま
で利用でき、また、常法に従って例えば硫酸アンモニウ
ム分画やイオン交換クロマトグラフィーあるいはプロテ
ィンＡ抗原カラム等によるアフィニティクロマトグラフ
ィーにより精製した精製抗体として利用することも可能
である。

【００２０】上記融合細胞の製造において免疫抗原、即
ち、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の可溶化物で免疫される哺乳動
物としては、特に制限はないが、細胞融合に使用する形
質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが好まし
く、一般にはマウス、ラット等が有利に用いられる。免
疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原又は必要に
応じて適当な結合試薬により担体と結合させた抗原を、
哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等により投
与することにより実施できる。

【００２１】上記において用いられる担体としては、通
常抗原の作成に当り慣用されている高分子の天然もしく
は合成の蛋白質を広く使用できる。該担体には例えば各
種動物の血清アルブミン類、血清グロブリン類、チログ
ロブリン類、ヘモグロブリン類、ヘモシアニン類や回虫
より抽出された蛋白質（アスカリース抽出物、特公昭６
１−６１３５０号公報）等のほか、ポリリジン、ポリグ
ルタミン酸、リジン−グルタミン酸共重合体、リジン又
はオルニチンを含む共重合体等が包含される。

【００２２】また結合試薬としては、通常の抗原の作成
に当り慣用されているものを広く使用できる。具体的に
はアミノ基とアミノ基を架橋結合させる、例えばグリオ
キサール、マロンジアルデヒド、グルタールアルデヒ
ド、スクシンアルデヒド、アジポアルデヒド等の脂肪族
ジアルデヒド類；チオール基とチオール基とを架橋結合
させる、例えばＮ，Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイミ
ド、Ｎ，Ｎ′−ｍ−フェニレンジマレイミド等のジマレ
イミド化合物、アミノ基とチオール基とを架橋結合させ
る、例えばメタマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル等のマレイミドカルボキシル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、アミノ基と
カルボキシル基とをアミド結合させる通常のぺプチド結
合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ，Ｎ−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−ジメチル
アミノカルボジイミド、１−エチル−３−ジイソプロピ
ルアミノカルボヒドロキシスクシンイミドエステル化合
物、アミノ基とカルボキシ基とをアミド結合させる通常
のジイミド類等の脱水縮合剤等を挙げることができる。
更にｐ−ジアゾニウムフェニル酢酸等のジアゾニウムア
リールカルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応試
薬、例えば上記脱水縮合剤とを組合せたものも、上記結
合試薬として使用可能である。

【００２３】免疫は、例えばマウスを例にとり詳述すれ
ば、上記免疫抗原を生理食塩水含有リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）や生理食塩水等で適当な濃度に希釈し、所望により
通常のアジュバントと併用して、供試動物に２〜１４日
毎に数回投与し、総投与量が約１００〜５００μｇ／マ
ウス程度になるようにして実施するのが好ましい。免疫
細胞としては、上記最終投与の約３日後に摘出した脾臓
細胞を使用するのが好ましい。ここで免疫抗原として使
用される細胞は、例えば牛胎児血清（ＦＣＳ）等を含む
通常の培養用培地、具体的には５％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ
−１６４０培地等にて培養後、１０〜１００倍に濃縮し
た培養細胞として有利に使用できる。アジュバンドとし
ては、例えば百日咳ワクチン、完全フロインドアジュバ
ンドあるいはアラムを用いるのが適当である。

【００２４】上記免疫細胞と融合される他方の親細胞と
しての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の
種々のもの、例えばｐ３／×６３−Ａｇ８（Ｘ６３）
［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７
５）］、ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）［Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８１，１
−７（１９７８）］、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１
（ＮＳ−１）［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５
１１−５１９ （１９７６）］、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４
（Ｓｐ２／０）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７
０（１９７８）］、ＦＯ［Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈ．，３５，１−２１（１９８０）］等やラットにお
ける２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３．（Ｙ３）［Ｎ
ａｔｕｒｅ，２７７，１３１（１９７９）］等の骨髄腫
細胞等を使用できる。

【００２５】上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反
応は、公知の方法、例えばマイルスタインら（Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ）の方法［Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，７３，３（１９８１）］等に準じて行なうこ
とができる。より具休的には上記融合反応は、通常の融
合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下に、通常の培地
中で実施され、培地には更に融合効率を高めるためにジ
メチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加する
こともできる。また、電気処理（電気融合）による方法
等を適宜採用することもできる。免疫細胞と形質細胞腫
細胞との使用比は、通常の方法と変わりなく、例えば形
質細胞腫細胞に対して免疫細胞を約１〜１０倍程度用い
るのが普通である。融合反応時の培地としては、形質細
胞腫細胞の増殖に通常使用される各種のもの、例えばＲ
ＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他この種細胞
培養に一般に利用されるものを例示でき、通常これら培
地は牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を抜いておくの
がよい。融合は上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定
量を、上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温
したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜６０００
程度のものを、通常培地に約３０〜６０ｗ／ｖ％の濃度
で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。以後、適当
な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰
り返すことにより、所望のハイブリドーマが形成され
る。

【００２６】得られる所望のハイブリドーマの分離は、
通常の選別培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、
アミノプリン及びチミジンを含む培地）で培養すること
により行なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とす
るハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅す
るのに充分な時間、通常数日〜数週間程度行なえばよ
い。かくして得られるハイブリドーマは、通常の限界希
釈法等により目的とする抗体の検索及び単一クローン化
に供される。

【００２７】目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳ
Ａ法［Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０）］、プラーク
法、スポット法、凝集反応法、オクタロニー（Ｏｕｃｈ
ｔｅｒｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法
（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会
社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０−５３頁、昭和５７年
３月５日参照）に従い実施することができ、この検索に
は前記免疫抗原が利用できる。

【００２８】かくして得られるｃ−ｅｒｂＢ−２関連蛋
白質を認識する所望のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマは、通常の培地で継代培養することがで
き、また液体窒素中で長期保存することができる。上記
ハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の採取
は、該ハイブリドーマを、常法に従って培養してその培
養上清として得る方法や、ハイブリドーマをこれと適合
性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として
得る方法が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を
得るのに適しており、後者の方法は、抗体の大量生産に
適している。また上記のごとくして得られる抗体は、更
に塩析、ゲル濾過法、アフィニティクロマトグラフィー
等の通常の手段により精製することができる。

【００２９】本発明抗体は、これを利用して、例えば免
疫沈降法、アフィニティクロマトグラフィー等の通常の
手段により、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連蛋白質を簡便且つ特
異的に精製することが可能である。

【００３０】また、本発明抗体の利用によれば、検体中
のｃ−ｅｒｂＢ−２関連蛋白質を、免疫反応により特異
的に測定することができる。該方法としては、通常の競
合法、サンドイッチ法によるラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、
凝集法等の免疫学的手法が挙げられ、これら各方法の操
作、手順等は、常法に変わるところはない。より具体的
には、例えば免疫沈降法を採用する場合、プロテインＡ
−セファロース等の担体に本発明抗体を結合させるか、
或るいはウサギ抗マウスＩｇＧ抗体などの標識抗体を第
２抗体として予め担体と結合させた後、この結合物に本
発明抗体を反応させるか、又は上記第２抗体を直接カッ
プルさせた担体に本発明抗体を反応させる。次いで、測
定する検体、例えば可溶化した細胞を^３２Ｐ、^３５Ｓ、
^１２５Ｉなどで標識した後、これを本発明抗体と反応さ
せ、遠心分離後、反応沈殿物をレムリ（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ）などの緩衝液に懸濁させた後、この反応懸濁液を例
えば、１１０℃等の高温で反応させ、ポリアクリルアミ
ドゲルを使ったＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行なうことにより、本発明の
抗体と特異的に反応するｃ−ｅｒｂＢ−２関連蛋白質の
特異的バンドが検出できる。

【００３１】上記検定法において検体としては、体液、
例えば血液、細胞組織液等を使用でき、これらのうちで
は血液、特に血清又は血漿が好ましい。更に常法に従
い、細胞を可溶化細胞分解物に分画したものも上記検体
として使用することができる。ここで可溶化した細胞、
或るいは可溶化細胞分解物を標識する代わりに、本発明
抗体を標識することもできる。

【００３２】本発明抗体の標識物質としては、グルコア
ミラーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ等の各種の酵素や、^３２Ｐ、
［^３５Ｓ］システイン、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、トリチウ
ム等の放射性物質等が挙げられる。該標識化は、常法に
従えばよい［Ｎａｔｕｒｅ，１９４，４９５（１９６
２）：Ａｃｔａ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｓｕｐｐ
ｌ．，１６８，２０６（１９７２）］。

【００３３】不溶化抗体は、細胞分解産物又は本発明抗
体を、不溶性担体に化学的又は物理的に結合させること
により製造される。不溶性担体としては、セルロース粉
末、セファデックス、セファロース、ポリスチレン、濾
紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デ
キストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチュ
ーブ、ナイロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メチ
ルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重
合体、エチレン−マレイン酸共重合体等が挙げられる。
不溶化は、共有結合法としてのジアゾ法、ペプチド法、
アルキル化法、架橋試薬による担体結合法（架橋試薬と
してグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナー
ト等を用いる）、Ｕｇｌ反応による担体結合法等の化学
反応；あるいはイオン交換樹脂のような担体を用いるイ
オン結合法；ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体とし
て用いる物理的吸着法等によって行なわれる。上記測定
法において反応（免疫反応）は、通常４５℃程度以下、
好ましくは４〜４０℃程度の温度で、数時間〜２４時間
程度で行なわれる。

【００３４】かくして、本発明抗体を用いれば、簡便
に、高精度に、検体中のｃ−ｅｒｂＢ−２関連蛋白質を
測定することができる。

【００３５】かかる本発明抗体を利用した精製系並びに
測定系の設定、改変ないし応用は、当業者にとり自明で
ある。

【００３６】本発明抗体のヒト癌細胞株に対する細胞障
害試験によれば、本発明抗体はＳＫ−ＲＢ−３細胞やＡ
−４３１細胞に対する細胞障害作用を有することが観察
され、このことより本発明抗体は標的細胞障害能を有す
ることが確認された。従って、本発明抗体は抗腫瘍剤と
して有効であり、本発明によればヒト及びその他の哺乳
動物に対する抗腫瘍剤をも提供することができる。

【００３７】本発明抗腫瘍剤は、上記モノクローナル抗
体をその必須成分として含有することを基本として、他
は通常の製剤技術乃至この種モノクローナル抗体を用い
る免疫療法等で慣用される技術手段に従い調製すること
ができる。より詳しくは、本発明抗腫瘍剤は、本発明抗
体と共に適当な無毒性医薬製剤担体を配合して常法に従
い製剤組成物の形態に調整される。ここで用いられる担
体としては、調製される製剤の使用形態に応じて、通常
慣用される各種のもの、例えば充填剤、増量剤、結合
剤、表面活性剤、緩衝液、安定化剤等の賦形剤乃至希釈
剤のいずれをも使用できる。調製される製剤形態として
は、これが治療剤有効成分の有効量を効果的に含有する
状態であればよく、例えば錠剤、粉末剤等の固剤であっ
てもよいが、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態と
するのがよい。また該製剤形態としては使用前に適当な
担体の添加により液状となし得る乾燥品の形態をも採用
できる。上記いずれの形態も常法に従い調製できる。ま
た各形態の製剤は、その形態に応じて適当な投与経路、
例えば注射剤形態の製剤では静脈内、筋肉内、皮下、皮
内、腹腔内投与され、固剤形態の製剤は経口乃至経腸投
与される。

【００３８】本発明治療剤の投与量は該製剤の投与方
法、投与形態、使用目的、適応患者等に応じて適宜決定
され一定でないが、一般には有効成分とする本発明抗体
の量が約０．００００１〜８０重量％程度含有されるも
のとするのがよく、この製剤は一日成人一人当り約０．
０１μｇ〜１０ｍｇ程度の範囲で適用されるのが好まし
い。かくして本発明治療剤の投与によれば、これらを投
与された患者の体内において腫瘍組織での細胞傷害性が
増強され、かくして所望の治療効果が奏される。

【００３９】

【発明の効果】本発明によれば、増殖因子レセプターに
対するモノクローナル抗体の製造方法、並びに抗ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２モノクローナル杭体及び該抗体を利用した乳
癌の診断剤及び治療剤が提供される。

【００４０】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため実施
例を挙げるが、本発明は之等に限定されない。

【００４１】

【実施例１】 免疫処置のための細胞の調整 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）より入手したヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３（寄
託番号ＡＴＣＣ ＨＴＢ３０）を、５％熱不活性ＦＣＳ
（ベーリンガー・マンハイム社製）とペニシリン（１０
０単位／ｍｌ）及びストレプトマイシン（２００ｍｇ／
ｍｌ）とを加えたＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬社
製）で、２２５ｃｍ^２プラスチック組織培養フラスコ
（スミロン、住友−バークライト社製）で、３７℃下、
５％ＣＯ_２条件下に培養した。

【００４２】上記細胞が細胞塊に成長した時、血清フリ
ーの培養液で洗い、その後、同培養液５０ｍｌに加え
た。３７℃で７２時間インキュベートした後、培養液を
無菌下で集め、細胞の断片を除いた後、得られた血清フ
リーの培地２００ｍｌを全部ダイアフローＹＭ−１０膜
（商品名：Ｍ、カットオフ値１０００：アミコン社製）
を装着したダイアフロー・セル・タイプ８２００（アミ
コンコーポ社製）を用いて、窒素ガスにて加圧して、培
養上清を２０倍と８０倍とに濃縮した。濃縮物を、０．
２２μｍミリポアフィルターで濾過し、−８０℃で凍結
保存した。

【００４３】 抗体産生ハイブリドーマの製造と一次
スクリーニング 上記で調整したＳＫ−ＢＲ−３細胞の２０倍濃縮培養
液１００μｌを、同量のフロインド完全アジュバンドと
共に、雄のＢａｌｂ／ｃ系マウス（６週齢、日本チャー
ルズ・リバー社製より入手）の腹腔内に投与して免疫し
た。その後、同液の同量を２回、３週間おきに同様にし
て追加投与し、最終投与の７日後に更にＳＫ−ＢＲ−３
細胞の８０倍濃縮培養液２００μｌを同様に追加投与し
て免疫した。

【００４４】最終免疫の３日後に、免疫したマウスより
脾臓を摘出し、摘出脾臓より脾細胞を集め、これを用い
てマイルスタインらの方法［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ｅ
ｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１
９７５）］を改良した方法によって細胞融合を以下の通
り実施した。即ち、まず上記脾細胞を３７℃に加温した
ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、同様に他方の親
株とするマウス骨髄腫細胞Ｐ３／ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１
［Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．
Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８
１，１−７（１９７８）］も洗浄した。尚、このマウス
骨髄腫細胞は、１０％熱不活性化子牛血清（ＣＢＳ：ハ
イクローン・ラボラトリーズ社製）を加えたＲＰＭＩ−
１６４０培地中で１００ｍｍ組織培養皿（コーニング社
製）上で３７℃下、５％ＣＯ_２下で培養して用いた。上
記脾細胞と骨髄腫細胞とを細胞数比１０：１になるよう
に５０ｍｌのチューブ内で混和し、得られた細胞混合物
を２００×ｇで５分間遠心後、上清をパスツールピペッ
トで完全に除去した。之等の操作は３７℃に保温した水
槽内にて行なった。

【００４５】次にポリエチレングリコール４０００（メ
ルク社製、以下「ＰＥＧ」と略称する）２ｍｌを加え
て、ゆっくりと１〜２分間かき混ぜ、１分間放置し、次
いで３７℃に保温した牛胎児血清（ＦＣＳ）を含まない
ＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌをゆっくりと１分間位か
けて加え、１分間放置し、更に同液２ｍｌを加えて２分
間放置し、更に同液４ｍｌを加えて４分間放置した。次
いで、３７℃に保温した１５％ＦＣＳ、２００ｍｇ／ｍ
ｌ硫酸ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｌペニシリン、
５４ｍｇ／ｌゲンタマイシン及び１ｍｌピルベートを含
有するＲＰＭＩ−１６４０（以下これを完全ＲＰＭＩ−
１６４０培地という）８ｍｌを２〜３分間かけて加えた
後、２００×ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引除去
し、３７℃に保温した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地液
に、脾細胞１×１０^６個／ｍｌとなるように懸濁させ
た。次に、この懸濁液を９６ウェルプレート（コースタ
ー社製）の各ウェルに０．１ｍｌずつ分注し、３７℃、
５％ＣＯ_２、１００％湿度のインキュベーター内で培養
した。２４時間後、５ｍＭヒポキサンチン、２０μｌア
ミノプテリン及び８００μｌチミジン（フロー・ラボラ
トリーズ社製）を含む１０％ＦＣＳ添加完全ＲＰＭＩ−
１６４０培地（以下これを「ＨＡＴ培地」という）の
０．１ｍｌずつを各ウェルに添加した。以後、上清を２
日目及び３日目にそれぞれ０．１ｍｌずつ吸引し、新し
いＨＡＴ培地０．１ｍｌずつを加えて液交換した。その
後、上記液交換を２〜３日おきに行なった。２週間目に
同様に上清を吸引し、５ｍＭヒポキサンチン及び８００
μｌチミジンを含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（以下
これを「ＨＴ培地」という）に代えた。以後、完全ＲＰ
ＭＩ一１６４０培地で増殖維持した。

【００４６】上記操作による細胞融合後、１０〜１４日
間でコロニーが肉眼で観察されるようになった。細胞が
９６ウェルプレートの底面積の１／４を占めた時より、
免疫抗原として用いたＳＫ−ＢＲ−３細胞の膜抗原を抗
原として、酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ法）にて、培養上清
を試験し、陽性となったウェルから直ちに限界希釈法
（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，
３（１９８１））により、ハイブリドーマのクローニン
グを行なった。尚、上記において抗原として用いたＳＫ
−ＢＲ−３細胞の膜分画は以下のようにして調製した。
即ち、５％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地でＳＫ−
ＢＲ−３細胞を培養後、塊ったＳＫ−ＢＲ−３細胞をリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．３）［１０ｍＭリン酸及び１５ｍ
Ｍ ＮａＣｌ］で洗浄し、４℃で４００×ｇで遠心分離
し、集めた細胞を低張緩衝液（ｐＨ７．４）［２０ｍＭ
１，４−ピペラジンジエタン硫酸−ＮａＯＨ、１ｍＭ
ＭｇＣｌ_２及び５ｍＭ ＫＣｌ］中で均一化（２０ス
トローク）した。細胞のホモジネートは最初４℃で１５
００×ｇで５分間遠心分離し、細胞のペレットをスクリ
ーニングのための膜画分とした。

【００４７】上記で調製したＳＫ−ＢＲ−３細胞の粗製
膜分画（１×１０^６個）を５０μｌトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）［２０ｍＭトリス塩基及び５００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、以下「ＴＢＳ」という］に溶解し、９６ウェルマイ
クロプレートの各ウェルに播き、４℃で８時間インキュ
ベートすることによりコート（被覆）した。次いで上記
各ウェルを０．０５％ツィーン２０を含むＴＢＳで３回
洗浄した。更に、飽和の非特異的蛋白結合部位に対して
２０℃で１時間、ＴＢＳ中に３００μｌ／ウェルの０．
１％（Ｗ／ｖ）ＢＳＡ（コーンのフラクションＶ：第１
純薬社製）でインキュベートした。続いて、０．０５％
ツィーン２０を含むＴＢＳで３回洗浄し、ハイブリドー
マ上清５０μｌ／ｍｌずつを各ウェルに加えた。２０℃
で１時間放置後、ウェルを洗浄し、３０００倍に希釈し
た５０μｌのアルカリフォスファターゼにカップリング
させたヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（ハイオ・ラッ
ド社製）を各ウェルに加えた。プレートを２０℃で１時
間インキュベートした後、未結合の接合体を除くために
洗浄した。

【００４８】その後、５ｍｇのｐ−ニトロフェニルリン
酸（バイオ・ラッド社製）を含む酵素−基質液の５０μ
ｌ／ウェルを加え、発色反応を０．５Ｍ ＮａＯＨの５
０μｌ／ウェルを加えることにより停止させた。吸光度
をイムノリーダーＮＪ２０００（インターメッド社製）
で測定した。

【００４９】かくして、７７４ウェルより、反応特異性
を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
１７株を得た。これらはそれぞれ「ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１
８５−１」〜「ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１７」と命名
された。 免疫沈降のための抗原の標識 上記で得た各陽性クローンにつき、之等がリン酸化さ
れたｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物を免疫沈降させる活性
を保有するか否か、を指標とする二次スクリーニングの
実施のための免疫抗原を、以下の通り作成した。

【００５０】即ち、まずＳＫ−ＢＲ−３細胞の細胞溶解
質と培養液を^３２Ｐで標識した。該標識は、カスガらの
方法［Ｋａｓｕｇａ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏ
ｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１０９，６０９−６２１（１９
８５）］に従って、まずＳＫ−ＢＲ−３細胞の１×１０
^７個／１００ｍｍ皿の集密度細胞をリン酸フリークレブ
リンガー緩衝液（ｐＨ７．４）［１１９ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．２
ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、５０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸、シグマケミカル社製）及
び０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ］で洗浄した。次に、上記
集密度細胞を^３２Ｐｉ（１８．５ＭＢｑ／ｍｌ、ニュー
イングランド・ヌクレア社製）を用いて、３７℃で２時
間、上記と同じ緩衝液２ｍｌ中で標識した。細胞を５０
ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含む溶解緩衝液［１０ｍＭピロリン
酸ナトリウム（和光純薬社製）、１００ｍＭフッ化ナト
リウム（関東化学社製）、４ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ
ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド、シ
グマケミカル社製）、１％トリトンＸ−１００及び４０
０μＭオルトバナジン酸ナトリウム］（ｐＨ７．４）で
４℃にて１時間可溶化させた。不溶物を１２０００×ｇ
で１０分間遠心分離して除去し、得られた細胞分解産物
の２００μｌをｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物に特異的に
反応するモノクローナル抗体の二次スクリーニング用免
疫抗原とした。

【００５１】 免疫沈降と電気泳動 上記で得た免疫抗原２００μｌと一次スクリーニング
で得られた陽性クローン１０μｌとを混合し、４℃で３
時間インキュベートした。更に、これにプロテインＡセ
ファロース（ファルマシア社製）２０μｌを加え、４
℃、３時間インキュベートした。反応溶液を１２０００
×ｇで１０分間遠心分離し、その沈降物を洗浄用緩衝液
（ｐＨ７．４）［５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭピロ
リン酸ナトリウム、１００ｍＭフッ化ナトリウム、４ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、０．０５％トリトン
Ｘ−１００及び４００μＭオルトバナジン酸ナトリウ
ム］にて３回洗浄した。遠心分離の後、沈降物を５０μ
ｌのラミエールの緩衝液に懸濁させ、１１０℃で５分間
インキュベートした。そして上記懸濁液をレムリの方法
［Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，
６８０−６８５（１９７０）］に従って、７．５％ポリ
アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分
析した。尚、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用したＳＤＳは
和光純薬社製であり、使用した分子量マーカーはミオシ
ン（分子量２０００００）、大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ（分子量１１６２５０）、ホスホリラーゼ（分子量９
７４００）、ＢＳＡ（分子量６６２００）及び卵アルブ
ミン（分子量４２６９９）で、全てバイオ・ラッド社製
である。 免疫沈降したハイブリドーマのクローニングと抗体
の製造及び精製 免疫沈降したハイブリドーマのクローニングは、９６ウ
ェルプレートに細胞を０．３個／ウェルになるように希
釈した限界希釈法によって行なった。また、クローニン
グの効率を上げるために、前もってラットの胸腺細胞を
２×１０^６個／ウェルとなるように加えた。

【００５２】上記操作の結果、３倍希釈した希釈液を更
に培養し、３５０μｌの培養液を集めて更に精製した。
１７のハイブリドーマの中から上記したようにして得ら
れたハイブリドーマはＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１と命
名したものであった。

【００５３】該ハイブリドーマの精製は次の通り行なっ
た。即ち、５０％（ｗ／ｖ）飽和の硫酸アンモニウムの
添加により沈殿させ、１４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）中に再溶解させ、溶解液の一定量をアフィニテ
ィゲルプロテインＡアガロースカラムに加え、４℃で１
４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で平
衡化させ、同緩衝液でカラムを洗浄後、結合した抗体を
１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で製品使
用書に従って溶出させ、溶出液を貯えて中性ｐＨに調整
し、−２０℃で保管した。

【００５４】上記で得られた本発明抗体産生ハイブリド
ーマＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１は、工業技術院微生物
工業技術研究所に「ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１」なる
表示で寄託されており、その寄託番号は「微工研菌寄第
１２２０６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２０６）」である。

【００５５】 モノクローナル抗体培養上清の採取 上記ハイブリドーマＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１を完全
ＲＰＭＩ−１６４０培地にて、５％ＣＯ_２条件下で、３
７℃にて９６時間培養し、培養液を３０００ｒｐｍ、１
０分間遠心分離して、目的のモノクローナル抗体を含む
培養上清を採取した。

【００５６】 精製抗体の製造 上記で得られたハイブリドーマＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８
５−１の１×１０^６個を、予めプリスタン（アルドリッ
チ社製）を接種しておいたＢａｌｂ／ｃ系マウスに腹腔
内投与した。１０〜１４日後、蓄積した腹水を採取し、
本発明抗体を含む腹水を得た。

【００５７】該腹水中の抗体を、抗体精製キット（ＭＯ
ＰＳ ｋｉｔ；、バイオ・ラッド社製）を用いて精製し
て、精製抗体ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１を得た。

【００５８】以下、上記で得られた本発明抗体の特性を
実施例２として示す。

【００５９】

【実施例２】 抗体のサブクラス マウスモノクローナル抗体サブクラス同定用キット（バ
イオ・ラッド社製）を用いて決定した上記本発明モノク
ローナル抗体のサブクラスは、ＩｇＧ_１κであった。

【００６０】 抗体産生レベル 実施例１ので得た培養上清を遠心分離し、上清を１０
％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地にて、３７℃下、
５％ＣＯ_２の条件下に１０日間インビトロにて培養し
た。

【００６１】 抗体の力価 精製したｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物関連蛋白の５０μ
ｇ／ウェルを予めコート（４℃、２４時間）した９６ウ
ェルポリスチレンマイクロプレートを、１％ＢＳＡの
０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で、４℃下に
２４時間、ブロックした。その後、実施例１ので得た
本発明抗体を含む培養上清を加え、室温で３時間反応さ
せた。上記緩衝液で３回洗浄後、パーオキシダーゼ標識
ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（ハイオ・ラッド社
製）を用いて、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物関連蛋白に
結合した抗体を測定した。培養上清の８×１０^４倍希釈
で充分な発色を示した。

【００６２】

【参考例１】ＳＫ−ＢＲ−３細胞株のノーザンブロット
分析 ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子は、ＥＧＦＲ遺伝子との相同性
がアミノ酸配列で約５０％と高いことから、ＥＧＦＲを
過剰に発現するヒト癌細胞株であるＡ−４３１細胞を対
照にして、ＳＫ−ＢＲ−３細胞がｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝
子を発現するかどうかを、既知のｃ−ｅｒｂＢ−２ｍＲ
ＮＡ蛋白の細胞外、膜通過及び細胞質ドメインをそれぞ
れ認識する合成プローブを用いたノーザンブロット分析
により試験した。

【００６３】この試験においては、ヒト上皮癌細胞株Ａ
−４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５，Ｆａｂｒｉｃａ
ｎｔ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５６５−５
６９（１９７７）を用いた。

【００６４】ＳＫ−ＢＲ−３細胞とＡ−４３１細胞を、
実施例１のの方法に従って培養した。ポリアデニルＲ
ＮＡの抽出におけるゲル電気泳動とノーザンロット分析
は、スズキらの方法［Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７，１
５７−１６３（１９８７）］に従って実施した。

【００６５】次に配列番号：１〜配列番号：５に示した
５つの合成オリゴヌクレオチドプローブを、自動ＤＮＡ
合成装置（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い
て、４種の塩基のβ−シアノエチルホスホアミダイト誘
導体より、固相法に従って合成した。合成された各オリ
ゴヌクレオチドをＨＰＬＣで精製して、目的プローブと
した。

【００６６】配列番号：１に示すオリゴヌクレオチドプ
ローブをプローブ１とし、以下各プローブに配列番号と
同符号を付して、それらの認識部位を示せば、プローブ
１、プローブ２及びプローブ３は、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺
伝子産物の細胞外ドメイン（２−２１、３４−５２と２
５４−２７３）の配列をコードするｍＲＮＡを認識す
る。プローブ４は、蛋白の膜通過ドメイン（６５４−６
７５）の配列をコードするｍＲＮＡを認識する。またプ
ローブ５は、蛋白の細胞質ドメイン（１０５５−１０７
４）の配列をコードするｍＲＮＡを認識する。

【００６７】ヒトβ−アクチンｍＲＮＡの発現は、ホン
ダらの方法［Ｈｏｎｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｐ
ｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７９，６６７−６８
１（１９８８）］に従って行なった。また、分子量マー
カーとして牛肝臓からのリボソームＲＮＡ（２８Ｓと１
８Ｓ、ファルマシア社製）を用いた。

【００６８】ＳＫ−ＢＲ−３細胞において、細胞外ドメ
インに一致するｃ−ｅｒｂＢ−２ｍＲＮＡの蛋白にハイ
ブリダイズするために３つのプローブを使用した時、
５．０ｋｂｐと２．０ｋｂｐの分子サイズをもつ２つの
バンドが検出された。前者の発現の強度は、後者の発現
の強度より強かった。膜通過ドメインに一致するｃ−ｅ
ｒｂＢ−２ｍＲＮＡの蛋白にハイブリダイズするプロー
ブでは、ただ一つ５．０ｋｂｐの分子量サイズでバンド
が検出された。Ａ−４３１細胞においては、前記条件で
は検出できなかった。β−アクチンｍＲＮＡのためにプ
ローブを使用した時は、β−アクチンｍＲＮＡに一致す
るバンドが検出された。加えて、細胞外ドメインに一致
するｃ−ｅｒｂＢ−２ｍＲＮＡの蛋白にハイブリダイズ
するプローブの時は、プローブ１とプローブ２と類似の
結果が得られた。逆に、プローブ５のケースにおいて
は、細胞質ドメインに一致するｃ−ｅｒｂＢ−２ｍＲＮ
Ａの蛋白にハイブリダイズするものは、５．０ｋｂｐの
分子サイズをもつ一つのバンドのみが検出された。上記
結果より、ＳＫ−ＢＲ−３細胞は、明らかにｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２ｍＲＮＡ蛋白を発現するものであることが判る。

【００６９】

【実施例３】各種抗体を用いた免疫沈降試験 本発明モノクローナル抗体の特徴を明らかにするために
ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白やＥＧＦ蛋白を認識するポリクロ
ーナル抗体やモノクローナル抗体を用いた免疫沈降試験
を、以下の通り行なった。

【００７０】抗体としては、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産
物のＣ末端部分（Ｃ末端１４アミノ酸配列：１２４２−
１２５５）を認識するウサギポリクローナル抗体として
ｐＡｂ１（Ｔ４８８１）（トリトン・バイオサイエンス
社製）を、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物蛋白のキナーゼ
ドメイン（アミノ酸配列：８６６−８８０）を認識する
ウサギポリクローナル抗体としてＡｂ−１（オンコジー
ン・サイエンス社製）を、またｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子
産物蛋白の細胞外ドメインを認識するマウスモノクロー
ナル抗体としてＳＶ２−６１γ（ニチレイ社製）を、そ
れぞれ使用した。この抗体はＩｇＧ_１のサブクラスを有
するものであり、マスコらの方法［Ｍａｓｕｋｏ，
Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．，８０，１０−１４（１９８９）］により作成され
たものである。また、ＥＧＦＲの細胞外ドメインの抗原
決定基［Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，８５，２３９−２４
５（１９８５）］を認識する抗ＥＧＦＲモノクローナル
抗体として、ＲＰＮ５１３（アマシャム社製）を使用し
た。この抗体は免疫原としてＡ−４３１細胞をトリプシ
ン処理したもので作成されており、ＩｇＧ_２ａの特徴を
有するものである。上記各抗体はいずれも商品取扱書に
従って使用した。

【００７１】免疫沈降のための免疫抗原の作成と標識を
次の通り実施した。即ち、実施例１のと同様の方法で
ＳＫ−ＢＲ−３細胞とＡ−４３１細胞の細胞分解物中の
蛋白を^３２Ｐで標識した。

【００７２】 ポリクローナル抗体の調整及び各種抗
体との免疫沈降反応 実施例１のと同様の方法で免疫処置のためのＳＫ−Ｂ
Ｒ−３細胞と、Ａ−４３１細胞とを、培地で調整した
後、ポリクローナル抗体を作成した。即ち、３０匹のＢ
ａｌｂ／ｃ系マウスを５つのグループに分け、以下の物
質を週３回、腹腔内投与し免疫した。即ち、グループ１
にはＦＣＳのみの２００μｌ（ｎ＝３）を、グループ２
には２０倍に濃縮したＲＰＭＩ−１６４０培地の２００
μｌ（ｎ＝５）を、グループ３には血清フリーＲＰＭＩ
−１６４０培地中に含まれる１０^６個のＳＫ−ＢＲ−３
細胞（ｎ＝６）を、グループ４にはＳＫ−ＢＲ−３細胞
によって調製された２０倍濃縮培地の２００μｌ（ｎ＝
１１）を、またグループ５にはＡ−４３１細胞により調
製された２０倍濃縮培地の２００μｌ（ｎ＝５）を、そ
れぞれ投与した。第４回目の投与は次のようにして行な
った。即ち、グループ１にはＦＣＳのみの２００μｌ
を、グループ２には８０倍に濃縮したＲＰＭＩ−１６４
０培地の２００μｌを、グループ３には血清フリーのＲ
ＰＭＩ−１６４０培地中に含まれる１０^６個のＳＫ−Ｂ
Ｒ−３細胞を、グループ４にはＳＫ−ＢＲ−３細胞によ
って調製された８０倍濃縮培地の２００μｌを、またグ
ループ５にはＡ−４３１細胞により調製された８０倍濃
縮培地の２００μｌを、それぞれ投与した。３日の後、
マウスから得た血清をｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物とＥ
ＧＦＲに対する抗体の存在の確認を行なうための免疫沈
降反応に供した。免疫沈降反応と電気泳動は、実施例１
のの方法に従って、放射性標識したＳＫ−ＢＲ−３細
胞とＡ−４３１細胞からの細胞溶解質又は調整した培地
を４℃で３時間の間各１０μｌのポリクローナル抗体と
モノクローナル抗体又はＮＭＳ（正常マウス血清：ｎｏ
ｒｍａｌ ｍｏｕｓｅ ｓｅｒｕｍ）と共にインキュベ
ートした後に各種の処理をして免疫沈降を行なった。

【００７３】免疫沈降反応の結果を第１図及び第２図に
示す。

【００７４】第１図中、ＡはＳＫ−ＢＲ−３細胞の分解
産物からの、ＢはＡ−４３１細胞の分解産物からの、そ
れぞれの免疫沈降を表わし、レーンａはポリクローナル
抗体Ａｂ−１を、レーンｂはポリクローナル抗体ｐＡｂ
１を、レーンｃはモノクローナル抗体ＳＶ２−６１γ
を、レーンｄは本発明モノクローナル抗体ＧＦＤ−ＯＡ
−ｐ１８５−１を、レーンｅはＥＧＦＲに対するモノク
ローナル抗体ＲＰＮ５１３を、またレーンｆはＮＭＳ
を、それぞれ示す。また、図のＡにおける黒ぬり三角印
は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞分解物からの^３２Ｐで標識した
ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物の免疫沈澱を示し、図のＢ
における黒ぬり矢印は、Ａ−４３１細胞分解物からの
^３２Ｐで標識したＥＧＦＲ遺伝子産物の免疫沈澱を示
す。各図における数字は分子量マーカーの分子量を表わ
す。

【００７５】該図より次のことが判る。

【００７６】即ち、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の^３２Ｐ標識の
結果では、キナーゼドメインとカルボキシ末端を認識す
るポリクローナル抗体とｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物の
細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体及び本発
明のモノクローナル抗体ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１は
ともに分子量１８５０００をもつｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝
子産物でリン酸化した蛋白を免疫沈澱した（図のＡのレ
ーンａ〜レーンｄ参照）。しかし、ＥＧＦＲの細胞外ド
メインを認識する抗ＥＧＦＲ抗体は、ＮＭＳと全く同じ
ようにこの蛋白を免疫沈澱させなかった（図のＡのレー
ンｅ〜レーンｆ参照）。また、Ａ−４３１細胞の^３２Ｐ
標識の結果では、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物に一致す
るリン酸化バンドは、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物に対
する抗体では検出されなかった（図のＢのレーンａ〜レ
ーンｄ参照）。しかし、１７００００の分子量を持つリ
ン酸化したＥＧＦＲは、抗ＥＧＦＲ抗体により免疫沈澱
した（図のＢのレーンｅ参照）。

【００７７】第２図中、ＡはＳＫ−ＢＲ−３細胞の分解
産物からの、ＢはＡ−４３１細胞の分解産物からの、そ
れぞれの免疫沈降を表わし、レーンａはモノクローナル
抗体ＳＶ２−６１γを、レーンｂはモノクローナル抗体
ＲＰＮ５１３を、レーンｃはＮＭＳを、レーンｄはＦＣ
Ｓによって免疫された抗血清を、レーンｅは濃縮された
ＲＰＭＩ−１６４０培地によって免疫された抗血清を、
レーンｆ〜レーンｈはそれぞれＳＫ−ＢＲ−３細胞によ
って免疫された抗血清を、レーンｉ〜レーンｋはそれぞ
れＳＫ−ＢＲ−３細胞によって調製された２０倍濃縮培
養液により免疫された抗血清を、レーンｌ〜レーンｎは
それぞれＡ−４３１細胞によって調製された２０倍濃縮
培養液により免疫された抗血清を表わす。

【００７８】また、図のＡにおける黒ぬり三角印はＳＫ
−ＢＲ−３細胞分解物からの^３２Ｐで標識したｃ−ｅｒ
ｂＢ−２遣伝子産物の免疫沈澱を示し、図のＢにおける
黒ぬり矢印はＡ−４３１細胞分解物からの^３２Ｐで標識
したＥＧＦＲ遺伝子産物の免疫沈澱を示す。また数字は
分子量マーカーの分子量を表わす。

【００７９】該図より次のことが判る。

【００８０】即ち、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の^３２Ｐ標識の
結果では、ＮＭＳ、ＦＣＳのみ投与したマウスから得ら
れた抗血清、ＲＰＭＩ−１６４０培地で免疫された抗血
清、及びＡ−４３１細胞によって調製された濃縮培養液
により免疫された抗血清は、共に活性が認められなかっ
た（図のＡのレーンｃ、ｄ、ｅ及びｌ〜ｎ参照）。ま
た、ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体も同様に活性
を示さなかった（図のＡのレーンｂ参照）。ＳＫ−ＢＲ
−３細胞（グループ３）を投与した６匹のマウスから得
られた抗血清は、^３２Ｐで標識したＳＫ−ＢＲ−３細胞
の細胞分解物からの多くのリン酸化蛋白を免疫沈澱させ
た（図のＡのレーンｆ〜レーンｈ参照）。最も強いバン
ドが分子量１８５０００の分子量サイズであり、^３２Ｐ
で標識されたｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子として確認され
た。同様のバンドが抗ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物モノ
クローナル抗体で免疫沈澱された。（図のＡのレーンａ
参照）。ＳＫ−ＢＲ−３細胞によって調製された濃縮培
養液により免疫された（グループ４）１１匹のマウスよ
り得られた抗血清は、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物とし
て同定したリン酸化蛋白を特異的に免疫沈澱した（図の
Ａのレーンｉ〜レーンｋ参照）。また、リン酸化された
Ａ−４３１細胞の^３２Ｐ標識の結果では、Ａ−４３１細
胞によって調製した濃縮培養液で免疫されたマウス（グ
ループ５）から得られた抗血清からのものは、分子量１
７００００を持つバンドを認める抗体を発現させた（図
のＢのレーンｌ〜レーンｎ参照）。このバンドはＥＧＦ
Ｒを認識する抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体と反応した
リン酸化ＥＧＦＲと同じ位置に認められた（図のＢのレ
ーンｂ参照）。また、このグループより得られた血清
は、分子量２００００を持つバンドをも免疫沈澱させ
た。このバンドの特徴はまだわかっていない。また、Ｓ
Ｋ−ＢＲ−３細胞とＳＫ−ＢＲ−３により調整された濃
縮培養液で免疫した２つのポリクローナル抗体の１７０
０００の分子サイズを持つバンド検出によりｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２遺伝子がＥＧＦＲ遺伝子と一部共有する構造を持
つことが確認された（図のＢのレーンｆとレーンｉ参
照）。

【００８１】細胞溶解物と培養液中の蛋白標識と各種
抗体との免疫沈降反応 −１細胞溶解物の^３２Ｐ標識 細胞の標識の前日にＳＫ−ＢＲ−３細胞とＡ−４３１細
胞を１×１０^６個／３５ｍｍ皿の密度に播き、リン酸フ
リーのＲＰＭＩ−１６４０培地で３回細胞を洗浄後、３
７℃で１２、２４及び４８時間の間、５％ＦＣＳを含む
１ｍｌのリン酸ダルベッコ改変イーグルの培地（ｐＨ
７．４）（日水製薬社製）中において^３２Ｐｉ（１８．
５ＭＢｑ／ｍｌ）でインキュベートした。細胞は４℃で
一時間の間、実施例１ので作成された溶解緩衝液の１
ｍｌで可溶化した。培養液（１ｍｌ）もまた集めた。細
胞溶解液と培養液中の不溶化物を１２０００×ｇで１０
分間遠心分離して除去した。そして細胞溶解液及び培養
液の２００μｌを免疫沈降のために使用材料とした。

【００８２】−２細胞溶解物と培養液中蛋白に対する
［^３５Ｓ］システイン標識 細胞の標識の前日にＳＫ−ＢＲ−３細胞とＡ−４３１細
胞を３×１０^６個／６０ｍｍ皿の密度に播き、細胞をシ
ステインとＦＣＳを含まないメチオニンフリーのＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地で３回洗浄後、同培養液でプレインキ
ュベーションすることにより続けた。そしてそれらを３
７℃で２０及び４８時間（ＳＫ−ＢＲ−３細胞）の間、
又は１８時間（Ａ−４３１細胞）の間、１．５ｍｌの１
％ＦＣＳ添加システィンフリーＲＰＭ１−１６４０培地
中に［^３５Ｓ］システイン（３．７ＭＢｑ／ｍｌ：ニュ
ーイングランド・ヌクレア社製）と共にインキュベート
した。放射性標識した細胞は、４℃で一時間の間、上記
３−と同様の溶解緩衝液の１．５ｍｌで可溶化した。
培養液（１．５ｍｌ）もまた集めた。細胞溶解液と培養
液中の不溶化物を１２０００×ｇで１０分間遠心分離し
て除去した。そして細胞溶解液及び培養液の７００μｌ
を免疫沈降のために使用材料とした。

【００８３】−３各種抗体との免疫沈降反応 上記−１及び−２で作成した放射性標識したＳＫ−
ＢＲ−３細胞とＡ−４３１細胞からの細胞溶解液と培養
液を使って、実施例１のと同様の方法によって免疫沈
降を行なった。

【００８４】その結果、^３２Ｐで標識したＳＫ−ＢＲ−
３細胞とＡ−４３１細胞の細胞溶解物を使用した結果、
^３２Ｐで標識したｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物（第１
図）と同様に、ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１と^３２Ｐで
標識したＥＧＦＲや抗ＥＧＦＲ抗体と全く同じく、細胞
外ドメイン、キナーゼドメイン、カルボキシル末端部分
を認識する抗ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物抗体によって
特異的に免疫沈澱した。しかし、^３２Ｐで標識したＳＫ
−ＢＲ−３細胞とＡ−４３１細胞によって調整された培
養液は、４つの抗ｃ−ｅｒｂＢ−２遣伝子産物抗体と１
つの抗ＥＧＦＲ抗体で免疫沈澱する特異的バンドは認め
られなかった。

【００８５】次に［^３５Ｓ］システイン標識した細胞溶
解物と培養液との各種の抗体との免疫反応の結果を、第
３図に示す。

【００８６】第３図中、ＡはＳＫ−ＢＲ−３細胞の細胞
分解物からの、またＢはＳＫ−ＢＲ−３細胞の培養液か
らの、それぞれの免疫沈降を表わし、レーンａはＮＭＳ
を、レーンｂはポリクローナル抗体Ａｂ−１を、レーン
ｃはポリクローナル抗体ｐＡｂ１を、レーンｄはモノク
ローナル抗体ＳＶ２−６１γを、レーンｅは本発明モノ
クローナル抗体ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１を、それぞ
れ示す。また、図のＡにおける黒ぬり三角印は、ＳＫ−
ＢＲ−３細胞分解物からの［^３５Ｓ］システインで標識
したｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物の免疫沈澱を示し、図
のＢにおける白抜き三角印は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の細
胞分解物からの関連した蛋白の免疫沈澱を示す。また数
字は分子量マーカーの分子量を表わす。

【００８７】該図より、［^３５Ｓ］システイン標識され
ているＳＫ−ＢＲ−３細胞において、４つの異なる抗ｃ
−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物抗体が細胞分解物中の分子量
１８５０００のバンドを同定した（図のＡのレーンｂ〜
レーンｅ参照）。しかしながら、いくつかの非特異的な
バンドがＮＭＳによって検出された（図のＡのレーンａ
参照）。ＮＭＳは［^３５Ｓ］システインで標識したｃ−
ｅｒｂＢ−２遺伝子産物であることを示しているバンド
を同定しなかった。［^３５Ｓ］システイン標識ＳＫ−Ｂ
Ｒ−３細胞によって調製した培養液を試験したとき、キ
ナーゼドメイン、カルボキシル末端部分を認識するｃ−
ｅｒｂＢ−２遺伝子産物に対する２つのポリクローナル
抗体は、ＮＭＳ（図のＢのレーンａ）と比較したとき、
それぞれ如何なる特異的なバンドも見られなかった（図
のＢのレーンｂとレーンｃ参照）。しかしながら細胞外
を認識する抗ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物モノクローナ
ル抗体ＳＶ２−６１γと本発明のモノクローナル抗体Ｇ
ＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１は、およそ１１００００の分
子量をもつ特異的なバンドを免疫沈澱させた（図のＢの
レーンｄとレーンｅ参照）。この結果はｃ−ｅｒｂＢ−
２遣伝子産物関連蛋白質がＳＫ−ＢＲ−３細胞によって
調製された培養液中にも存在する可能性が考えさせる。

【００８８】−４各種抗体とＳＫ−ＢＲ−３細胞とＡ
−４３１細胞によって調製した培養液中の［^３５Ｓ］シ
ステイン標識成長因子レセプター関連蛋白存在下での免
疫沈降反応 Ａ−４３１細胞によって産生したＥＧＦＲ関連蛋白とこ
の分子を比較するために、［^３５Ｓ］システインで標識
したＳＫ−ＢＲ−３とＡ−４３１細胞を５％ポリアクリ
ルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥより分析した。

【００８９】その結果を、第４図に示す。

【００９０】第４図中、ＡはＳＫ−ＢＲ−３細胞を、ま
たＢはＡ−４３１細胞によって調製した培養液中の［
^３５Ｓ］システイン標識成長因子レセプター関連蛋白質
の免疫沈澱を、それぞれ示す。各図におけるレーンは以
下の免疫沈降の結果を示す。即ち、レーンＡのａはＮＭ
Ｓと細胞分解物の反応を、レーンＡのＢは本発明のｃ−
ｅｒｂＢ−２遺伝子産物モノクローナル抗体ＧＦＤ−Ｏ
Ａ−ｐ１８５−１と細胞分解物の反応を、レーンＡのｃ
はＮＭＳと培養液の反応を、レーンＡのｄは本発明モノ
クローナル抗体ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１と培養液の
反応を、それぞれ示す。またレーンＢのａは抗ＥＧＦＲ
モノクローナル抗体と細胞分解物の反応を、レーンＢの
ｂは抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体との培養液の反応を
それぞれ示す。更に図のＡにおける黒ぬり三角印はｃ−
ｅｒｂＢ−２遺伝子産物を、白抜き三角印はｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２遺伝子産物関連蛋白質を示し、図のＢにおける黒
ぬり矢印はＥＧＦＲを、同白ぬき矢印はＥＧＦＲ関連蛋
白質を示す。尚、該図の数字は分子量マーカーの分子量
を表わす。

【００９１】上記図より、［^３５Ｓ］システインととも
にＳＫ−ＢＲ−３細胞の長時間培養でＧＦＤ−ＯＡ−ｐ
１８５−１で免疫沈澱するバンドは、よりクリアーにな
った（図のＡのレーンｄ参照）。５％ポリアクリルアミ
ドゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、培養中の特異的なバ
ンド分子量の大きさが１１００００なると計算された。
本発明者らは、この分子量が１１００００の蛋白をｐ１
１０と命名した。

【００９２】細胞分解中のｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子のバ
ンドと比較したとき、このバンドの放射性活性は大差が
なく、ｐ１１０の一つの大きなものが産生されて培養液
中に分泌されていると予想できる。またこの結果は、ｃ
−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物の細胞外ドメインを認識する
別の抗ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物モノクローナル抗体
であるＳＶ２−６１γを使用たときも同様な結果が得ら
れた。また、分子量が４２０００をもつバンドが認めら
れ（図のＡのレーンｄ参照）、それはＮＭＳによっても
検出された（第３図のＡとＢのレーンａ参照）。本発明
者らは、上記バンドの発現量は、長時間のインキュベー
ションで上昇したけれども、このバンドは非特異的バン
ドと見なした。Ａ−４３１細胞による試験結果では、分
子量１１５０００のサイズを持つＥＧＦＲ関連蛋白質が
検出された（図のＢのレーンｂ参照）。

【００９３】

【実施例４】ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物を発現する癌
細胞株に対するＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１の効果 ＳＫ−ＢＲ−３細胞株と、Ａ−５４９細胞株、ＰＣ−９
細胞株及びＬｕ−６５細胞株を用いて、本発明モノクロ
ーナル抗体ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１の細胞傷害活性
の有無を検討した。

【００９４】上記Ａ−５４９細胞株（ヒト肺癌細胞株：
ＡＴＣＣ ＣＣＬ１８５，［Ｇｉａｒｄ，Ｄ．Ｊ．，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，
５１，１４１７−１４２３（１９７３）］）とＰＣ−９
細胞株（ヒト肺癌細胞株：［Ｋｉｎｊｏ，Ｍ．，Ｏｋ
ａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３
９，１５−２３（１９７９）］）は、ｃ−ｅｒｂＢ−２
遺伝子が発現しており、またＬｕ−６５細胞株（ヒト肺
癌細胞株：［Ｙａｍａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｐ
ｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｒｅｓ．，７６，９６７−９９
６（１９８５）］は、同遺伝子の発現のないことが明ら
かにされている。

【００９５】上記４種類の細胞株を５％ＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ−１６４０培地中の２４ウェルプレート中に播い
た。ＳＫ−ＢＲ−３細胞とＬｕ−６５細胞は４．５×１
０^４個／ウェルの密度に、またＡ−５４９細胞とＰＣ−
９細胞は１×１０^５個／ウェルの密度になるよう播え付
けた。細胞をプレートに付着させた後、モノクローナル
抗体ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１の１００μｇを最終濃
度が１００μｇ蛋白／ｍｌとなるように加え、２４、４
８及び７２時間の間インキュベートした。ネガティブコ
ントロールとして、モノクローナル抗体の希釈のために
使用した緩衝液、或いはモノクローナル抗体の入ってい
ない培養液をコントロールプレートに加えて、同様に２
４、４８及び７２時間の間インキュベートした。それぞ
れの培養の最後に細胞の細胞数をコールターカウンター
（機種名：コールター社製）で数えた。細胞数の定量は
各３回行なった。

【００９６】その結果を第５図に示す。該図中、実線
（１）は本発明のモノクローナル抗体ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ
１８５−１の各種癌細胞株に対する細胞数を、破線
（２）はコントロールの細胞数を表わす。また、縦軸は
細胞数を示し、横軸は各種癌細胞株と本発明のモノクロ
ーナル抗体とのインキュベート時間を示す。

【００９７】該図より、本発明のモノクローナル抗体Ｇ
ＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１は、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子
産物を発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞とＡ−５４９細胞の
インビトロでの増殖を有意に抑制した。また、ｃ−ｅｒ
ｂＢ−２遺伝子産物を同じく発現するＰｃ−９細胞の成
長も本発明のモノクローナル抗体により抑制傾向がみら
れたが有意ではなかった。しかしながら、ｃ−ｅｒｂＢ
−２遺伝子産物を発現しないＬｕ−６５細胞の成長は本
発明のモノクローナル抗体では抑制できなかった。

【００９８】上記結果より、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産
物の細胞外ドメインを認識する本発明モノクローナル抗
体ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１は、インビドロにおける
癌細胞株の増殖に関して抑制効果を示し、腫瘍組織に対
する特異的標的細胞傷害活性を増強する能力を有するこ
とが明らかである。このことから本発明モノクローナル
抗体は悪性腫瘍等の臨床治療剤として有用であることが
判る。

【００９９】

【実施例５】免疫組織学的検討 本発明のモノクローナル抗体ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−
１のインビトロ特異性の定量のために、乳癌患者から得
た腫瘍組織を用いて免疫染色を行なった。

【０１００】即ち、乳癌患者（女性）から得た腫瘍組織
を１０％ホルマリンで固定した後、腫瘍組織のミクロン
の部分をパラフィン包埋した後、パラフィン切片を作成
した。ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼ法は、免疫染色を使
用した。腫瘍と正常組織のサンプルは本発明のモノクロ
ーナル抗体ＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１の２０μｇ蛋白
／ｍｌで処理した。また、非特異的抗体結合はモノクロ
ーナル抗体の代わりに非免疫血清のサンプルの使用によ
って調製を行なった。

【０１０１】その結果を、乳癌患者の腫瘍組織と本発明
の抗ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物モノクローナル抗体Ｇ
ＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−１との結合反応した結果とし
て、第６図に示す。

【０１０２】該図より、乳癌腫瘍組織と本発明のモノク
ローナル抗体の結合性は陽性染色として確認された。

【０１０３】しかしながら、正常組織は免疫ペルオキシ
ダーゼ試験において本発明のモノクローナル抗体ＧＦＤ
−ＯＡ−ｐ１８５−１に結合しなかった。更に、非免疫
血清を使用したとき、腫瘍組織の中から陽性染色細胞は
得られなかった。上記のことから本発明モノクローナル
抗体は乳癌患者の臨床診断剤として有用であることが判
る。

【配列表】

【０１０４】配列番号：１ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：ｌ−６０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧ ＧＧＧＧＧＣＡＡＧＡ ＧＧＧ
ＣＧＡＧＧＡＧ ＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧ ＣＧＧＣＡＣ
ＡＡＧＧ ＣＣＧＣＣＡＧＣＴＣ ６０

【０１０５】配列番号：２ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：ｌ−５７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ＧＣＣＣＴＧＧＴＡＧ ＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡ ＧＣＡ
ＴＧＴＣＣＡＧ ＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧ ＧＧＡＣＴＧ
ＧＣＡＧ ＧＧＡＧＣＣＧ ５７

【０１０６】配列番号：３ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：ｌ−６０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧ ＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴ ＧＣＡ
ＧＣＴＣＡＣＡ ＧＡＴＧＣＣＡＣＴＧ ＴＧＧＴＴＧ
ＡＡＧＴ ＧＧＡＧＧＣＡＧＧＣ ６０

【０１０７】配列番号：４ 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：ｌ−６６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣ ＣＣＡＡＡＧＡＣＣＡ ＣＣＣ
ＣＣＡＡＧＡＣ ＣＡＣＧＡＣＣＡＧＣ ＡＧＡＡＴＧ
ＣＣＡＡ ＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡ ６０ＧＡＴＧＡＴ６
６

【０１０８】配列番号：５ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：ｌ−６０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ＴＧＧＡＧＡＣＣＴＧ ＧＧＧＧＣＣＴＣＣＴ ＣＴＴ
ＣＡＧＡＧＧＧ ＣＴＣＣＡＧＣＣＣＴ ＡＧＴＧＴＣ
ＡＧＧＴ ＣＣＣＣＡＣＣＧＣＣ ６０

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３のに従い行なわれた、ポリクローナ
ル抗体と各種抗体との免疫沈降反応の結果を示す図面に
代わるＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。

【図２】実施例３のに従い行なわれた、ポリクローナ
ル抗体と各種抗体との免疫沈降反応の結果を示す図面に
代わるＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。

【図３】実施例３の−３に従い行なわれた、システイ
ン標識した細胞溶解物と培養液との各種の抗体との免疫
反応の結果を示す図面に代わるＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真
である。

【図４】実施例３の−４に従い行なわれた、各種抗体
とＳＫ−ＢＲ−３細胞とＡ−４３１細胞によって調製し
た培養液中のシステイン標識成長因子レセプター関連蛋
白存在下での免疫沈降反応の結果を示す図面に代わるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。

【図５】実施例４に従い行なわれた、ｃ−ｅｒｂＢ−２
遣伝子産物を発現する癌細胞株に対する本発明抗体の効
果を求めたグラフである。

【図６】実施例５に従い、本発明抗体のインビトロ特異
性定量のための免疫組織学的検討を乳癌患者の腫瘍組織
の免疫染色によりを行なった結果を示す、生物の形態を
示す図面に代わる写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 オズゲ・アルパー 東京都武蔵野市西久保町２丁目31番１号 サンパレス401号 (72)発明者 山口 建 東京都渋谷区桜丘町11番11号 ライオンズ マンション桜ケ丘301号 (72)発明者 松島 泰次郎 東京都港区白金台４丁目６番１号 東京大 学医科学研究所癌生物学研究部内 (72)発明者 阿部 薫 神奈川県横須賀市長浦町２−60

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト癌細胞の可溶化物を免疫抗原として用
   いることを特徴とする増殖因子レセプターに対するモノ
   クローナル抗体の製造方法。
2. 【請求項２】ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３の培養上清
   で免疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄細胞と
   の融合により形成されたハイブリドーマにより産生され
   ｃ−ｅｒｂＢ−２関連蛋白質に特異的に反応することを
   特徴とする抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体。
3. 【請求項３】ハイブリドーマＧＦＤ−ＯＡ−ｐ１８５−
   １（微工研菌寄第１２２０６号）である請求項２記載の
   モノクローナル抗体。
4. 【請求項４】請求項２に記載の抗体を必須成分として含
   有することを特徴とする抗腫瘍剤。
5. 【請求項５】請求項２に記載の抗体を必須成分として含
   有することを特徴とする癌の診断剤。