DE68929511T2

DE68929511T2 - Nachweis, Quantifizierung und Klassifizierung von RAS-Proteinen in Körperflüssigkeiten und Geweben

Info

Publication number: DE68929511T2
Application number: DE1989629511
Authority: DE
Inventors: Walter Patrick Carney
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1988-04-22
Filing date: 1989-04-20
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2009-04-21
Also published as: CA1340368C; EP0767381A1; AU634961B2; FI905189A0; EP0767381B1; DE68928106T2; EP0411018A1; EP0411018B1; ATE258686T1; DK254390D0; DK254390A; ATE154134T1; DE68928106D1; DE68929511D1; AU3447989A; EP0411018A4; JPH03505250A; JPH0816679B2; WO1989010565A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf einen Sandwich-ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) mit monoklonalem Antikörper zum Quantifizieren oder Klassifizieren von aktiviertem ras p21 oder individuellen Harvey-, Kirsten- oder N-ras-Familien von ras-Proteinen in Körperflüssigkeiten, Gewebelysaten oder Zelllysaten.
Hintergrund der Erfindung
Harvey-, Kirsten- und N-ras-Proteine sind immunologisch verwandte Proteine und werden zusammen p21 genannt. Sie sind Produkte der ras-Familie zellulärer Gene, die man in einer großen Vielfalt kernhaltiger Säugerzellen findet. Die ras-Gene scheinen häufige Ziele genetischer Veränderungen zu sein, die normale Zellen auf den Weg der Malignität führen können. Ras-Oncogene wurden in einer großen Zahl prämaligner und maligner Zellen identifiziert.
Die p21-Proteine bestehen aus etwa 188–189 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von etwa 21 000 Dalton. Virale und zelluläre ras-Gene codieren membrangebundene Proteine (Willingham et al., Cell 19; 1005 (1980)), die Guaninnucleotide binden (Schlonick et al., PNAS (USA) 76: 5355 (1979); Papageorge et al., J. Virol. 44: 509 (1982); und Fine et al., Cell 37: 151 (1984)), und besitzen intrinsische GTPase-Aktivität (McGrath et al., Nature 301: 644 (1984); Sweet et al., Nature 311: 273 (1984); Gibbs et al., PNAS (USA) 81: 5704 (1984); und Manne et al., PNAS 82: 376 (1985)).
DNA-vermittelte Transfektionsexperimente unter Verwendung von NIH3T3-Zellen als Empfänger führten zur Identifizierung einer Familie aktivierter transformieren der Gene, die zu den ras-Genen der Harvey- (Ha-ras) und Kirsten-Sarkomviren (Ki-ras) homolog sind. Ein drittes Mitglied der ras-Familie, das als N-ras bezeichnet wird, wurde identifiziert, aber es wurde kein retrovirales Gegenstück gefunden. Aktivierte (mutierte) ras-Gene unterschieden sich strukturell von ihren normalen Homologen durch Aminosäuresubstitutionen im Protein in den Positionen 12, 13 oder 61 (Tabin et al., Nature 300: 143 (1982); Reddy et al., Nature 300: 149 (1982); Bos et al., Nature 315: 716 (1985); Yuasa et al., Nature, 303: 775–779 (1983); Der et al., Cell 44: 167–176 (17. Januar 1986)). Taparowsky et al., Banbury Report, 14: 123–133 (1983), zitiert in Chem. Abstracts CA 100(1): 1425n, lehrt, dass die Änderung des H-ras-p21 am Rest 12 vom N-Terminus aus von Glycin zu Valin ausreicht, um das normale Protein in ein transformierendes Protein umzuwandeln.
Shimizu et al., Nature 304: 497–500 (1983), zitiert in Chem. Abstracts 99(19): 1530936, lehrt die Anwesenheit eines Cysteinrestes als Aminosäure 12 im Homologen des v-Ki-ras-Gens der Human-Lungenkrebs-Zelllinie calu-1. Fasano et al., J. Mol. Appl. Genet., 2(2): 173–180, zitiert in Chem. Abstracts CA 99(19): 153080v, lehrt, dass das Produkt des T24-N-ras-1-Gens fast identisch mit dem v-H-ras-p21-transformierenden Protein ist, das im Harvey-Sarkom-Virus codiert ist. Neuere Berichte haben die Anwesenheit aktivierter ras-p21-Proteine in 40–50% der Human-Kolon-Rektum-Krebse und präneoplastischen Läsionen des Kolons, die Adenome genannt werden, gezeigt (Bos et al., Nature 327: 293 (1987), Forrester et al., Nature 327: 299 (1987), und Vogelstein et al., NEJM 319: 525 (Sept. 1988)). Neuere Untersuchungen haben auch eine Expression aktivierter ras-Gene und mutierter ras-p21-Proteine in 20–30% der Lungenkarzinome (Rodenhuis et al., Cancer Res., 48: 5738 (1988)) und über 90% der Pankreas-Karzinome (Almoguera et al., Cell 53: 549 (1988)) gezeigt. Bei bestimmten Formen der Leukämie, wie akuter myelogener Leukämie, und bei bestimmten präleukämischen Zuständen wurden aktivierte ras-p21-Proteine beschrieben.
Diese aktivierten ras-Gene und mutierten Proteine wurden auch in etablierten Zelllinien sowie primären und metastatischen Tumoren gefunden. Gambke et al. (Nature 307: 476, 1984) wies ein transformierendes N-ras-Gen in Knochenmark zellen von einem Patienten mit akuter myeloblastischer Leukämie (AML) nach. Dagegen war die DNA aus Fibroblasten von demselben Patienten nicht transformierend.
Das p21-ras-Protein in seiner normalen nichtaktivierten Form enthält die Aminosäure Glycin in den Positionen 12 und 13 und die Aminosäure Glutamin in der Position 61. Das in normalen Zellen gefundene p21-Protein hat für die Aminosäuresequenz 5 bis 19 die folgende primäre Aminosäurestruktur: ⁵Lysin-Leucin-Valin-Valin-Valin-Glycin-Alanin-Glycin-Glycin-Valin-Glycin-Lysin-Serin-Alanin-Leucin¹⁹.
Frühere Berichte haben mehrere monoklonale Rattenantikörper beschrieben, die gegenüber normalen und aktivierten oder onkogenen (mutierten) ras-p21-Proteinen in Hefe und Säugerzellen reaktiv sind (Robinson et al., Br. J. Cancer 54: 877–883 (1986), Furth et al., J. Virol. 43: 294 (1982)).
EP-A-0 177 814, veröffentlicht am 16. April 1986, und EP-A-0 175 360, veröffentlicht am 26. März 1986, offenbaren ein Polypeptid, das aus den Aminosäuren 5 bis 17 des ras-p21-Proteins besteht, die einen Cysteinrest enthalten, der zwischen den Positionen 16 und 17 insertiert ist, und weiterhin Aminosäuresubstitutionen in der Position 12 enthalten. Die Aminosäuren Valin, Serin, Arginin, Cystein, Asparaginsäure oder Alanin wurden an der Position 12 insertiert. Diese Polypeptide wurden mit Trägerproteinen gekoppelt und als Immunogene verwendet, um die Erzeugung der dort diskutierten Antikörper zu induzieren. Diese Literaturstelle weist weiter darauf hin, dass Antikörper, die ras-Oncogene anhand einzelner Aminosäureunterschiede im p21-Genprodukt von ihren normalen Gegenstücken zu unterscheiden vermögen, für den diagnostischen Nachweis maligner Zellen in klinischen Situationen anwendbar sein können, und sie weist weiter darauf hin, dass solche Antikörper, die normales ras-p21 von mutantem ras-p21, das einen einzelnen Aminosäureunterschied in der Position 12 oder 61 aufweist, zu unterscheiden vermögen, "verwendet werden würden, um das ras-Onkogen-Produkt durch Standardtechniken, wie Immunofluoreszenz-, Immuno-Peroxidase-Anfärbungs-, Immunfällungs-, ELISA- oder Western-Blotting-Techniken, nachzuweisen".
Carney et al., PNAS (USA) 83: 7485–7489 (1986), und EP-A-0 019 003, veröffentlicht am 6. August 1986, offenbaren einen monoklonalen Antikörper, der für ein aktiviertes ras-Protein spezifisch ist. Dieser monoklonale Antikörper wurde gegen ein synthetisches Peptid erzeugt, das den Aminosäuren eines mutierten ras-Gens entsprach, das Valin anstelle von Glycin auf Position 12 codiert. EP-A-0 190 003 erwähnt, dass der monoklonale Antikörper DWP für die Diagnose primärer und metastatischer Läsionen durch herkömmliche Diagnoseverfahren geeignet ist und dass die Diagnose auch durch herkömmliche in-vitro-Diagnoseverfahren, wie Assay von Human-Blutproben oder anderen Körperflüssigkeiten, durchgeführt werden kann. Carney et al., UCLA Symp. Mol. Cell. Biol., New Ser. 1985, zitiert in Chem. Abstracts CA 104: 1665706, offenbaren einen monoklonalen Antikörper, der gegen ein ras-verwandtes synthetisches Peptid erzeugt wurde, das Immunreaktivität bei Human-Karzinomen zeigt. Carney et al. berichteten über eine Reihe von monoklonalen Antikörpern, die gegen synthetische Peptide erzeugt wurden, die auf Position 12 Aminosäuresubstitutionen von Glutaminsäure, Arginin oder Valin enthalten (A Book of Abstracts from the 3d Annual Meeting on Oncogenes held at Hood College, Frederick, MD, 7.–11. Juli 1987). Von anderen monoklonalen Antikörpern, die mit verschiedenen Verfahren erzeugt wurden, wurde ebenfalls berichtet, dass sie mit den verschiedenen Formen des ras-p21-Proteins reagieren. Hand et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 81, S. 5227–5231 (1984); Thor et al., Nature, Vol. 311, S. 562–565 (1984); Wong et al., Cancer Research, Vol. 46, S. 6029–6033 (1986); und Tanaka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, S. 3400–3404 (1985).
Mehrere wissenschaftliche Berichte haben gezeigt, dass normale Zellen ras-Proteine mit Glycin auf Position 13 enthalten.
Im Jahre 1985 wiesen Bos et al. (Nature 315: 726, 1985) nach, dass DNA, die aus Zellen von AML-Patienten isoliert wurde, in der Lage ist, NIH3T3-Zellen zu transformieren. Dieses Ergebnis weist auf die Gegenwart eines Onkogens hin und legt sie in hohem Maße nahe. Es wurde gezeigt, dass diese transformierenden Gene aktivierte ras-Gene sind. Dagegen war DNA aus normalen Geweben nichttransformierend und enthielt daher kein aktiviertes N-ras. Diese Forscher analysierten die aktivierten N-ras-Gene unter Verwendung von Oligonucleotidsonden auf die Anwesenheit von Mutationen und fanden, dass die aktivierten N-ras-Gene Mutationen enthalten, die zu Aminosäuresubstitutionen in Position 13 des Proteins führen. Es wurde gezeigt, dass es sich bei diesen Mutationen in Position 13 entweder um Asparaginsäure oder um Valin anstelle der normalen Aminosäure Glycin handelt.
Zwei Berichte im Jahre 1987 beschrieben ras-Mutationen mit Arginin auf Position 13. Nitta et al. (Jpn. J. Cancer Res. (Gann), 78: 21–26, 1987) haben eine Aminosäuresubstitution von Glycin auf Position 13 eines aktivierten N-ras-p21, das aus einem Human-Rektal-Karzinom isoliert worden war, durch Arginin gezeigt. Ein Bericht von Hirai et al. (Nature 327: 430, 1987) zeigte aktivierte N-ras-Gene in Knochenmarkzellen von Patienten mit myelodysplastischem Syndrom. Die Beobachtungen von Hirai et al. lassen vermuten, dass die Anwesenheit aktivierter N-ras-Gene mit Mutationen auf Position 13 in frühen Stadien der Leukämie wichtig sein kann.
Ein Bericht von E. Liu et al. (Nature 330: 186, 1987) zeigte die Anwesenheit der Asparaginsäuremutation auf Position 13 von ras-p21 bei einem Patienten mit myelodysplastischer Erkrankung 1,5 Jahre, bevor der Patient zu akuter Leukämie überging. Daher kann die Durchmusterung von Patienten mit myelodysplastischem Syndrom auf die Anwesenheit aktivierter ras-Proteine mit Mutationen in Position 13 mit Hilfe monoklonaler Antikörper ein wertvoller Test sein, um vorherzusagen, bei welchen Patienten mit myelodysplastischem Syndrom eine erhöhte Gefahr besteht, dass sie akute Leukämie entwickeln.
In jüngster Zeit berichteten Wodnar-Filipowicz et al. (Oncogene, 5. 457–461, Vol. 1, Nr. 4 (1987)) über die Anwesenheit von aktivierten N-ras-Genen in einem Human-T-Zellen-Nicht-Hodgkin-Lymphom. Diese Untersuchungen wiesen die Substitution von Glycin in Position 13 durch Cystein nach.
Berichte ließen vermuten, dass die Aminosäuresequenz 188–189 der N-, Ki- und N-ras-p21 während der Evolution in hohem Maße konserviert wurde. Die wichtigsten Unterschiede zwischen den N-, Ki- und N-p21-Proteinen scheinen jedoch in einem Segment mit 15–20 Aminosäuren lokalisiert zu sein, das sich am Carboxyende des p21-Proteins befindet (Taparowsky et al., Nature 300: 762 (1982)).
Weiterhin zeigten McGrath et al., Nature 304: 501–506 (1983), und Shimizu et al., Nature 304: 497–500 (1983), dass das Ki-Gen in der Lage ist, zwei verschiedene Proteine zu codieren, die als Ki4A und Ki4B bezeichnet werden. Die Ausdrücke Ki4A und Ki4B werden in derselben Bedeutung wie Ki2A und Ki2B verwendet. Da dieser variable Bereich unter den Aminosäuren 160–180 am C-terminalen Ende von ras-p21 auftritt, ist es theoretisch möglich, monoklonale Antikörper zu erzeugen, die die einzelnen H-, Ki4A-, Ki4B- und N-ras-p21 spezifisch binden könnten. Seitdem weisen Berichte darauf hin, dass die Aktivierung eines bestimmten ras-Gens, wie des N-ras-Gens bei akuter myelogener Leukämie (Bos et al., Nature 315: 726 (1985)), oder die Überexpression des besonderen H-ras-Gens (Spandidos et al., Anticancer Res. 4: 269 (1984)) häufig mit einem speziellen Krebstyp (Brustkrebs) assoziiert ist.
EP-A-0 203 587, veröffentlicht am 3. Dezember 1986, offenbart Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die von den variablen Bereichen der Proteinfamilien ras", ras", ras^4KA und ras^4KB abgeleitet sind, immunogene Zusammensetzungen, wobei diese Polypeptide kovalent an immunogene Träger gebunden sind, mit Hilfe solcher Immunogene erzeugte Antikörper, wobei diese Antikörper spezifisch für das ras-Onkogen sind, aus dem die Polypeptidsequenz abgeleitet wurde, sowie Immunoassays, bei denen diese Antikörper eingesetzt werden, um zwischen den einzelnen p21-ras-Onkogenfamilien zu unterscheiden. Die offenbarten Peptidstrukturen entsprechen den Aminosäuren 171–189 und 170–189 von H-ras-p21, 170–186 von N-ras-p21, 171–186 von Ki4A-ras-p21 und 170–185 von Ki4B-ras-p21. Anscheinend wurden keine Antikörper hinterlegt.
Das US-Patent 4,535,058, ausgegeben am 13. August 1985 an Weinberg et al., offenbart das allgemeine Konzept der Verwendung der Hybridomtechnik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper gegen veränderte Formen von ras-p21-Proteinen oder Peptiden, die die Position 12 der Proteine enthalten. Insbesondere sei empfohlen, die Aufmerksamkeit auf Spalte 4, Zeile 6–15, Spalte 12, Zeile 33, bis Spalte 13, Zeile 29, und Spalte 14, Zeile 40, bis Spalte 16, Zeile 22, zu richten.
Das US-Patent 4,699,877, ausgegeben am 13. Oktober 1987 an Cline et al., offenbart Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis menschlicher Tumore. Eine Reihe von Oligopeptiden, die antigenen Bereichen in den Peptidexpressionsprodukten von RNA entsprechen, die in Retrovirus-Onkogenen vorhanden ist, ist in Spalte 5 in Zeile 17–60 offenbart. In dieser Reihe enthalten sind die Oligopeptide Ras^Ki und Ras^Ha. Diese Literaturstelle offenbart weiterhin, dass diese haptenischen Oligopeptide verwendet werden sollen, um die Antikörperbildung durch Kopplung an einen geeigneten Träger zu induzieren. Das offenbarte Verfahren hält Ausschau nach zellulären Produkten, wie mRNA oder ihrem Expressionsprodukt, als Diagnostikum für die wahrscheinliche Anwesenheit maligner Zellen.
Tanaka et al., PNAS 82: 3400 (1985), berichteten über die Erzeugung einer Reihe von Kaninchenseren gegen eine Vielzahl synthetischer Peptide, die verschiedenen Teilen der ras-p21 entsprechen. Tanaka et al. berichteten über die Erzeugung von Kaninchenseren gegen ein Peptid, das den Aminosäuren 160–179 des v-Ha-ras entspricht. Die Anti-p21-Seren wurden durch Affinitätsreinigung der Kaninchenseren und Bewerten ihrer Spezifität durch biochemische Assays hergestellt. Die Spezifität dieser Reagentien ist jedoch fraglich.
Srivastava et al., Molecular and Cellular Biology 5 (11): 3316 (1985), berichteten über eine Reihe polyklonaler Kaninchenseren gegen synthetische Peptide, die verschiedenen Segmenten des Proteins und insbesondere einem Segment, das den Aminosäuren 161–176 des H-ras-p21 entspricht, entsprechen.
Tahara et al., Jpn. J. Cancer Res. (Gann) 77: 517–522 (1986), offenbaren, dass ein Schaf-Anti-p21-Antikörper gegen ein synthetisches Peptid erzeugt wurde, das den Positionen 160–179 von v-Ha-p21 entspricht.
Bizub et al., Oncogene 1: 131–142 (1987), erzeugten Antiseren in Mäusen, Ratten und Kaninchen gegen eine Vielzahl von Peptiden in den variablen Bereichen von N-, Ki- und N-ras. Einige der in diesem Bericht beschriebenen polyklonalen Antikörper waren affinitätsgereinigte Kaninchenseren, die gegen Peptide, die den Aminosäuren 171–189 von H-p21 entsprechen, oder gegen Peptide, die den Aminosäuren 171–186 von Ki4B-p21 entsprechen, erzeugt wurden. Gemäß diesem Bericht sind bei der N. C. I.-Hinterlegungsstelle (Microbiological Assoc. Inc., Bethesda, Maryland) zusätzliche Antikörper gegen die ras-p21 erhältlich. Die in dem Bericht von Bizub et al. erwähnten Antiseren wiesen darauf hin, dass beim N. C. I. erhältliche Antikörper gegen eine Peptidstruktur erzeugt worden waren, die mit der Aminosäuresequenz 157–180 der ras-p21 korreliert.
Hand et al., JNCI, 79(1): 59–65 (Juli 1987), offenbaren kompetitive Flüssigkeitsassays mit direkter Bindung unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers Y13-259 und immunohistochemischer Assays zusammen mit cDNA-Sonden zur Identifizierung spezieller ras-Onkogene mit Punktmutation, um ras-p21 in Human-Karzinomen und gutartigen Läsionen quantitativ zu erfassen. Der in Furth et al., J. Virol. 43: 294–304 (1982), diskutierte monoklonale Antikörper Y13-259 ist ein monoklonaler Ratten-Antikörper, der gegen die native Form von v-Ha-ras-p21 erzeugt wurde.
In ähnlicher Weise offenbaren Ohuchi et al., Cancer Research 47: 1413–1420 (1. März 1987), eine verstärkte Expression von c-Ha-ras-p21 in Human-Magen-Adenokarzinomen, die durch Immunoassays unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern und in-situ-Hybridisierung definiert wurde. Die Spezifität der verwendeten monoklonalen Antikörper ist fraglich.
Caruso et al., Int. J. Cancer 38: 587–595 (1986), offenbaren eine quantitative Analyse von ras-p21 in Säugerzellen unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers Y13-259, wie er oben diskutiert ist, und Y13-238, eines monoklonalen Ratten-Antikörpers, der das in Ha-MuSc codierte ras-p21 in einer Immunfällung selektiv ausfällt.
Niman et al., PNAS (USA) 82: 7924–7928 (1985), offenbaren die Verwendung von Anti-Peptid-Antikörpern zum Nachweis von mit Onkogenen zusammenhängenden Proteinen in Urin. Erhöhte Mengen von mit Onkogenen zusammenhängenden Proteinen wurden während einer Neoplasie und während einer Schwangerschaft gefunden. Die Peptidfragmente wurden ausgewählt, da sie hochgradig konservierte Bereiche ihrer Onkogenfamilien, sis, ras und fes, darstellten. Das ras-Peptid war die Ha-ras-Sequenz, die sich 37–59 Aminosäuren stromabwärts von dem durch p21, das durch v-Ha-ras oder v-Ki-ras codiert wird, autophosphorylierten Threoninrest befindet. Über den Nachweis eines Proteins von 21 000 Dalton wurde berichtet. Es ist jedoch wegen der fraglichen Spezifität der verwendeten Reagentien nicht klar, ob dieses Protein ein mit ras zusammenhängendes Protein war.
WO 85/00807, das am 28. Februar 1985 veröffentlicht wurde, beschreibt die Herstellung von Polypeptid-induzierten monoklonalen Antikörpern gegen Onkoproteine und ihre Verwendung in diagnostischen Systemen, um auf die Anwesenheit eines Onkoproteins zu testen.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Der Gegenstand dieser Erfindung ist ein Sandwich-ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) mit monoklonalem Antikörper zum Quantifizieren oder Klassifizieren von aktiviertem ras p21 oder individuellen Harvey-, Kirsten- oder N-ras-Familien von ras-Proteinen in Körperflüssigkeiten, Gewebelysaten oder Zelllysaten, umfassend:

(a) Umsetzen der Körperflüssigkeiten, Gewebelysate oder Zelllysate, von denen man annimmt, dass sie ras-p21-Proteine enthalten könnten, mit einem immobilisierten ras-p21-Abfang-Antikörper;
(b) Umsetzen des Produkts aus Schritt (a) mit wenigstens einem nachweisbar markierten Antikörper, der gegen andere Epitope als die bereits in Schritt (b) gebundenen gerichtet ist; und
(c) Quantifizieren oder Klassifizieren des Produkts von Schritt (b); gekennzeichnet durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die aus den folgenden Gruppen ausgewählt sind:
(i) monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-Proteins, das eine Aminosäuresubstitution von Arginin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Serin oder Cystein auf Position 12 aufweist, binden und nicht an ein Epitop binden, das Glycin auf Position 12 enthält;
(ii) monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-Proteins, das eine Aminosäuresubstitution von Asparaginsäure oder Valin auf Position 13 aufweist, binden und nicht an ein Epitop binden, das Glycin auf Position 13 enthält;
(iii) monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-Proteins, das eine Aminosäuresubstitution von Histidin, Lysin, Leucin oder Arginin auf Position 61 aufweist, binden und nicht an ein Epitop binden, das Glutamin auf Position 61 enthält;
(iv) monoklonale Antikörper, die gegenüber Harvey-ras-Proteinen reaktiv sind und gegenüber den Familien Kirsten 2A, 2B oder N von ras-Proteinen nicht reaktiv sind;
(v) monoklonale Antikörper, die gegenüber N-ras-Proteinen reaktiv sind und gegenüber den Familien Kirsten 2A, 2B oder Harvey von ras-Proteinen nicht reaktiv sind;
(vi) monoklonale Antikörper, die gegenüber Kirsten-2A-Proteinen reaktiv sind und gegenüber den Familien Kirsten 2B, N oder Harvey von ras-Proteinen nicht reaktiv sind; oder
(vii) monoklonale Antikörper, die gegenüber Kirsten-2B-ras-Proteinen reaktiv sind und gegenüber den Familien Kirsten 2A, N oder Harvey von ras-Proteinen nicht reaktiv sind.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das ein direktes Sandwich-Immunoassay-Format zeigt.
2 ist eine Graphik, die den Nachweis von ras-p21-Protein, das in Kulturflüssigkeiten freigesetzt/ausgeschüttet wurde, die von den Zelllinien NIH3T3 und NIH3T3 (SW480) erhalten wurden, unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung zeigt.
3 ist eine Graphik, die den Nachweis von ras-p21-Protein im Plasma tumortragender Nacktmäuse unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung zeigt.
4 ist eine Graphik, die die differentielle Expression von ras-p21-Proteinen im Plasma von Mäusen, die einen Tumor PSV LM (EJ) und NIH3T3 (SW480) tragen, unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung zeigt.
5 ist eine Graphik, die den Nachweis von ras-p21-Proteinen in Human-Plasma unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung zeigt.
5A ist eine Graphik, die den Nachweis von ras-p21-Proteinen in Human-Plasma unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung zeigt.
6 ist eine Graphik, die den Nachweis von ras-p21-Proteinen in drei Mauszelllinien, die Human-ras-Gene enthalten, unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung zeigt.
7 ist eine ras-p21-Standardkurve.
8 ist ein Balkendiagramm, das ras-p21-Protein-Mengen zeigt, die in zehn Proben von normalem menschlichen Brustgewebe und menschlichem Brustkarzinom unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung nachgewiesen wurden. Die Balken stellen die in pg p21 pro μg Protein ausgedrückte Menge an ras-p21-Protein dar.
9 ist ein Balkendiagramm, das den Nachweis und die Quantifizierung von ras-p21-Protein in zehn Proben von Human-Kolon-Karzinom unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung zeigt. Die Balken stellen die in pg p21 pro μg Protein ausgedrückte Menge an ras-p21-Protein dar.
10 ist eine Graphik, die den Nachweis von aktiviertem ras-p21-Protein mit Valin auf Position 12 in Plasma, das von tumortragenden Nacktmäusen erhalten wurde, unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung zeigt.
11 ist eine Graphik, die den Nachweis von aktiviertem ras-p21-Protein mit Arginin auf Position 12 in rekombinantem p21-Protein, das Arginin auf Position 12 aufweist, unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung zeigt.
12 ist eine Graphik, die den Nachweis von aktiviertem ras-p21-Protein mit Asparaginsäure auf Position 13 in Zelllysaten, die von der Zelllinie AML-1 erhalten wurden, unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung zeigt.
13 ist eine Graphik, die den Nachweis von ras-p21 mit Arginin auf Position 12 in Zelllysaten zeigt, die von der Zelllinie A2182 und NIH v-N-ras erhalten wurden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf einen Assay zum Quantifizieren und Klassifizieren von aktiviertem ras p21 oder individuellen Harvey-, Kirsten- oder N-ras-Familien von ras-Proteinen in Zellen, Körpergeweben, Körperflüssigkeiten, wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Stuhl, Speichel oder Aspiraten sowie Körpersekreten, wie Schweiß.
Überraschenderweise und unerwarteterweise wurde gefunden, dass normales p21, aktiviertes p21 oder ras-Familie-spezifisches p21, das von Zellen sezerniert oder freigesetzt wird, p21, das von Zellen sezerniert oder freigesetzt wird, aber an Fragmente von Zellmembranen gebunden ist sowie zelluläres ras unter Verwendung des Immunoassays der Erfindung in Körpergeweben und -flüssigkeiten nachgewiesen und quantifiziert werden kann. Dies ist überraschend und unerwartet, da man glaubte, dass sowohl virale als auch zelluläre ras-Proteine an der Innenfläche der Plasmamembran lokalisiert sind, und da man glaubt, dass niemand bisher eindeutig den Nachweis, die Quantifizierung und die Klassifizierung von ras-p21-Proteinen in Körperflüssigkeiten aufgezeigt hat.
Der Ausdruck "aktivierte ras-p21-Proteine" umfasst (1) aktivierte ras-p21-Proteine, die auf Position 12 eine Aminosäuresubstitution von Valin, Arginin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Cystein, Serin oder Alanin aufweisen, (2) aktivierte ras-p21-Proteine, die auf Position 13 eine Aminosäuresubstitution von Asparaginsäure oder Valin aufweisen, (3) aktivierte ras-p21-Proteine, die auf Position 61 Aminosäuresubstitutionen von Lysin, Leucin, Histidin oder Arginin aufweisen.
Die Abkürzungen H und Ha werden hier in gleicher Bedeutung verwendet, um die Harvey-ras-Familie zu bezeichnen. Ähnlich werden die Abkürzungen K und Ki in gleicher Bedeutung verwendet, um die Kirsten-ras-Familie zu bezeichnen, und K2A und K2B werden in gleicher Bedeutung wie K4A und K4B verwendet.
Die Ausdrücke "onkogen", "aktiviert" und "mutiert" werden in gleicher Bedeutung verwendet.
Die Ausdrücke "Immunopräzipitat" und "Immunokonzentrat" werden in gleicher Bedeutung verwendet.
Der Ausdruck "Antikörper" umfasst monoklonale oder ein immunreaktives Fragment davon.
Zu den Antikörpern, die sich für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung eignen, gehören die folgenden oder Äquivalente davon:
Synthese von rekombinantem ras-p21 mit Arginin auf Position 12
Ein als pXVR bezeichneter ras-Expressionsvektor, der die Synthese eines authentischen viralen Harvey-ras-p21 steuert, wurde in folgender Weise aufgebaut:
Ein 720-bp-Restriktionsfragment, in dem alle außer den ersten fünf Aminosäuren des viralen Narvey-ras-Gens codiert waren, wurde mit Standardverfahren mit einem synthetischen 32-bp-Oligomer ligiert, das eine bakterielle Shine-Dalgarno-Sequenz enthielt, gefolgt von einem 6-bp-Abstandsstück plus den ersten fünf Codons des viralen Harvey-ras. Mit diesem Material wurde ein Plasmidgerüst von pTR1340 ligiert, das einen tac-Promotor sowie einen Replikationsstartpunkt und ein Ampicillin-Resistenz-Gen aus pBR322 enthielt.
Die pXVR-Konstrukte wurden in den E.-coli-Stamm PR13-Q transformiert, der lac-Repressor überproduziert, so dass der lac-Promotor teilweise reprimiert und somit die Lebensfähigkeit der Zelle aufrechterhalten wurde.
Um die Erzeugung des p21 zu induzieren, werden die E.-coli-Zellen mit Isopropylthio-β-D-galactosid (IPTG) inkubiert, was die Synthese großer Mengen p21 induzierte.
Insbesondere lässt man die E.-coli-Zellen wachsen, bis man eine Ablesung der optischen Dichte (O. D.) von 0,25 bei A590 erhält. p21 wird durch Hinzufügen von 5 mM IPTG induziert. Nach 1 Stunde werden die E.-coli-Zellen durch Zentrifugation gewonnen. Das Zellsediment wird in Lysepuffer (25 mM Tris-HCl, 0,7 mM Na₂HPO₄, 5 mM KCl, 0,14 M NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM MgCl₂, 1% Triton X-100, 25% Sucrose und 1 mg/ml Lysozym, pH 7,4) resuspendiert und im Vortex-Mixer behandelt. Das Material wird zweimal eingefroren und wieder aufgetaut, und der Extrakt wird mit DNase inkubiert und dann 15 Minuten mit 10 000 × g zentrifugiert. Das Sediment wird in 1% Triton X-100 gewaschen, in 50 μl 3,5 M Guanidin-Hydrochlorid in 20 mM MES 2 (N-Morpholinethansulfonsäure), pH 7,0, resuspendiert, und die teilchenförmige Substanz wird durch Zentrifugation entfernt.
Im folgenden ist die Synthese eines rekombinanten p21 mit Leucin auf Position 61 beschrieben, das ebenfalls verwendet werden kann, um panreaktive polyklonale Antikörper zu erzeugen.
Synthese von rekombinantem Protein mit Leucin auf Position 61
Unter Verwendung eines Klons von Human-ras-Harvey-cDNA in voller Länge in einem M13-Vektor werden die entsprechenden Codon-6l-Substitutionen durch in-vitro-Mutagenese eingeführt, wie es in Der et al., Cell, 5. 167–176, Vol. 44 (17. Januar 1986) beschrieben ist. In-vitro-Mutagenese wird verbreitet verwendet, um funktionelle Domänen von Proteinen zu identifizieren und biochemische und biologische Wirkungen miteinander zu korrelieren. Ein ras-Expressionsvektor wird unter Verwendung des oben beschriebenen Ansatzes aufgebaut. Diese Gestaltung ist ähnlich wie die Gestaltungen, die von J. P. McGrath, Nature 310: 644, 1984, und J. C. Lacal, PNAS 81: 5305, 1984, beschrieben werden, um intaktes ras-Protein in Bakterien zu erzeugen.
Monoklonale Antikörper
Die Hybridom-Methode und Durchmusterungsvorschriften sind in Unterabschnitt (e) unten beschrieben. Diese Verfahren werden verwendet, um die unten beschriebenen Antikörper zu erzeugen, wobei man die unten beschriebenen Peptide verwendet, die an ein Trägerprotein gekoppelt sind. Die Durchmusterungsvorschriften werden maßgeschneidert, um auf eine gewünschte Reaktivität hin zu durchmustern.
Standard-ELISA-Bedingungen
Der Zweck des in diesem Abschnitt beschriebenen ELISA besteht darin, zu testen, ob der monoklonale Anti-p21-Antikörper mit normalem und onkogenem ras-p21-Protein reagiert. Pro Napf wurden 500 ng rekombinantes normales oder onkogenes Human-ras-Protein aufgetragen; 0,1 bis 1000 ng des Antikörpers oder Antikörperfragments in 50 μl phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pro Napf, die Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, als Testprobe; Inkubieren über Nacht bei 37°C und anschließendes Waschen mit BSA-PBS; 10 ng Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper, an Meerrettich-Peroxidase konjugiert, in 50 μl BSA-PBS als Nachweisreagens; 60 Minuten Inkubieren bei 37°C und anschließendes Waschen mit BSA-PBS; 50 μl o-Phenylendiamin in PBS, das 0,15% Wasserstoffperoxid enthält, als Substrat; 10 Minuten Entwickeln, 50 μl 4,5 M Schwefelsäure als Stopreagens; und Bestimmen der optischen Dichte (OD) bei 488 nm.
Neben ras 8, 10 und 11 gibt es noch vier weitere panreaktive monoklonale Anti-p21-Antikörper, die beim Testen in einem ELISA auf Mikrotiterplattenbasis unter den oben beschriebenen Standardbedingungen eine optische Dichte bei 488 nm zwischen 1,5 und 2,5 ergeben. Diese Antikörper sind ras 9, 13, 17 und 20. Ras 9, 13 und 17 wurden unter Verwendung des rekombinanten Harvey-ras-Proteins mit Arginin auf Position 12 erzeugt. Die Synthese dieses Proteins ist oben beschrieben. Ras 20 wurde unter Verwendung eines rekombinanten Harvey-ras-Proteins mit Leucin auf Position 61 als Immunogen erzeugt. Die Synthese dieses Proteins ist ebenfalls oben beschrieben. Die Hybridom-Zelllinien ras 9, 13, 17 und 20 wurden am 29. März 1989 gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt.
Ras 9 erhielt die ATCC-Bezeichnung HB10058.
Ras 13 erhielt die ATCC-Bezeichnung HB10057.
Ras 17 erhielt die ATCC-Bezeichnung HB10054.
Ras 20 erhielt die ATCC-Bezeichnung HB10059.
Neben dem hier beschriebenen Immunoassay können die Hybridom-Zelllinien Ras 9, 13, 17 und 20 auch verwendet werden, um ras-p21-Proteine einem Immuno-Blotting und einer Immunokonzentration zu unterwerfen.
a) Monoklonale Antikörper, die gegenüber Ras-Proteinen reaktiv sind die in Position 12 mutiert sind
Der als DWP bezeichnete monoklonale Antikörper wurde in EP-A-0 190 003 offenbart; er ist spezifisch für p21, das in Position 12 dadurch mutiert ist, dass es ein Valin anstelle von Glycin enthält. Dieser monoklonale Antikörper sowie monoklonale Antikörper, die für p21 mit Glutaminsäure- oder Argininmutationen auf Position 12 spezifisch sind, bilden den Gegenstand der US-Patente 4,898,932 und 5,084,380.
Diese Patente beanspruchen die Priorität von zwei früher eingereichten Anmeldungen ( US S.N. 696,197 , eingereicht am 29. Januar 1985, und US S.N. 913,905 , eingereicht am 1. Oktober 1986).
Hybridome, die monoklonale Antikörper sezernieren, die gegenüber p21-Proteinen mit Valin, Glutaminsäure oder Arginin reaktiv sind, wurden gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt.
Die Hybridom-Zelllinie, die einen monoklonalen Antikörper sezerniert, der gegenüber mutierten ras-p21-Proteinen mit Valin auf Position 12 reaktiv ist und als DWP bezeichnet wird, wurde am 23. Januar 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB8698.
Die Nybridom-Zelllinien, die monoklonale Antikörper sezernieren, die gegenüber mutierten ras-p21-Proteinen mit Glutaminsäure auf Position 12 reaktiv sind, wurden als E184 und E170 bezeichnet. Das Nybridom E184 wurde am 11. September 1986 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB9194. Das Hybridom E170 wurde am 11. September 1986 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB9195.
Die Hybridom-Zelllinie, die einen monoklonalen Antikörper sezerniert, der gegenüber mutierten ras-p21-Proteinen mit Arginin auf Position 12 reaktiv ist und als R256 bezeichnet wird, wurde am 11. Januar 1986 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB9196.
Der monoklonale Antikörper, der für die Valinsubstitution spezifisch ist, wurde unter Verwendung eines Immunogens erzeugt, das die folgende Polypeptidsequenz enthielt: ⁵Lysin-Leucin-Valin-Valin-Valin-Glycin-Alanin-Valin-Glycin-Valin-Glycin-Lysin¹⁶.
Der monoklonale Antikörper, der für die Glutaminsäuresubstitution spezifisch ist, wurde unter Verwendung eines Immunogens erzeugt, das die folgende Polypeptid sequenz enthielt: ⁵Lysin-Leucin-Valin-Valin-Valin-Glycin-Alanin-Glutaminsäure-Glycin-Valin-Glycin-Lysin¹⁶.
Der monoklonale Antikörper, der für die Argininsubstitution spezifisch ist, wurde unter Verwendung eines Immunogens erzeugt, das die folgende Polypeptidsequenz enthielt: ⁵Lysin-Leucin-Valin-Valin-Valin-Glycin-Alanin-Arginin-Glycin-Valin-Glycin-Lysin¹⁶.
Weitere monoklonale Antikörper, die im Assay dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-p21-Proteins mit Asparaginsäure auf Position 12 binden und nicht an ein Epitop mit Glycin auf Position 12 binden.
Monoklonale Antikörper, die gegenüber mutierten ras-p21-Proteinen mit Asparaginsäure auf Position 12 reaktiv sind, wurden von den Hybridom-Zelllinien D113, D205 und D210 erzeugt. Diese Zelllinien wurden gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt. Die Hybridom-Zelllinie D113 wurde am 31. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10086. Die Hybridom-Zelllinie D205 wurde am 29. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10061. Die Hybridom-Zelllinie D210 wurde am 31. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10083.
Die Hybridom-Zelllinien D113, D205 und D210 wurden hergestellt, indem man das Dodecapeptid ⁵Lysin-Leucin-Valin-Valin-Valin-Glycin-Alanin-Asparaginsäure-Glycin-Valin-Glycin-Lysin¹⁶ verwendete, um Mäuse gemäß dem unten beschriebenen Verfahren zu immunisieren. Wie oben erwähnt, sind die Hybridom-Methode und die Durchmusterungsvorschriften ebenfalls unten beschrieben. Die monoklonalen Antikörper wurden auf ihre Reaktivität gegenüber dem Peptid, das Asparaginsäure auf Position 12 enthielt, und auf fehlende Reaktivität gegenüber Peptid, das Glycin auf Position 12 enthielt, d. h. Asparaginsäure-positiv, Glycin-negativ, durchmustert.
Zu den monoklonalen Antikörpern, die im Immunoassay dieser Erfindung verwendet werden können, gehören auch monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-p21-Proteins mit Serin oder Cystein auf Position 12 binden und nicht an ein Epitop mit Glycin auf Position 12 binden.
Monoklonale Antikörper, die gegenüber mutierten ras-p21-Proteinen mit Serin auf Position 12 reaktiv sind, wurden von der Hybridom-Zelllinie S1107-8.3 erzeugt. Diese Zelllinie wurde am 29. März 1989 gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt. Die Hybridom-Zelllinie S1107-8.3 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10060.
Die Hybridom-Zelllinie S1107-8.3 wurde hergestellt, indem man das Dodecapeptid ⁵Lysin-Leucin-Valin-Valin-Valin-Glycin-Alanin-Serin-Glycin-Valin-Glycin-Lysin¹⁶ verwendete, um Mäuse gemäß dem unten beschriebenen Verfahren zu immunisieren. Die Hybridom-Methode und die Durchmusterungsvorschriften sind ebenfalls unten beschrieben. Die monoklonalen Antikörper wurden ebenfalls auf ihre Reaktivität gegenüber den interessierenden Peptiden, d. h. Serin-positiv, Glycinnegativ, durchmustert.
Monoklonale Antikörper, die gegenüber mutierten ras-p21-Proteinen mit Cystein auf Position 12 reaktiv sind, wurden von den Hybridom-Zelllinien C-1119-9 und C-1119-10 erzeugt. Diese Zelllinien wurden am 31. März 1989 gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt. C-1119-10 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10088. C-1119-9 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10084.
Die Hybridom-Zelllinien C-1119-9 und C-1119-10 wurden hergestellt, indem man das Dodecapeptid ⁵Lysin-Leucin-Valin-Valin-Valin-Glycin-Alanin-Cystein-Glycin-Valin-Glycin-Lysin¹⁶ verwendete, um Mäuse gemäß dem unten beschriebenen Verfahren zu immunisieren. Die Hybridom-Methode und die Durchmusterungsvorschriften sind ebenfalls unten beschrieben. Die monoklonalen Antikörper wurden ebenfalls auf ihre Reaktivität gegenüber den interessierenden Peptiden, d. h. Cystein-positiv, Glycin-negativ, durchmustert.
b) Monoklonale Antikörper, die gegenüber Ras-Proteinen reaktiv sind die in Position 13 mutiert sind
In den Umfang dieser Anmeldung fallen auch die monoklonalen Antikörper, die in US-Patent Nr. 5,028,527 diskutiert sind, das am 22. Februar 1988 eingereicht wurde. Die dort besprochenen monoklonalen Antikörper sind gegenüber ras-p21-Proteinen mit einer Aminosäuresubstitution auf Position 13 reaktiv. Insbesondere wurden Asparaginsäure und Valin anstelle des normalerweise vorhandenen Glycins auf Position 13 eingeführt.
Die monoklonalen Antikörper, die für die Asparaginsäuresubstitution spezifisch sind, wurden unter Verwendung eines Immunogens erzeugt, das die folgende Polypeptidsequenz enthielt: Cystein-⁵Lysin-Leucin-Valin-Valin-Valin-Glycin-Alanin-Glycin-Asparaginsäure-Valin-Glycin-Lysin-Serin-Alanin-Leucin¹⁹. Die Hybridome, die diese monoklonalen Antikörper sezernieren, wurden als D753-13 (129) und D765-13 (146) bezeichnet. Diese Hybridome wurden am 29. Januar 1988 gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt. Das Hybridom D753-13 (129) erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB9632. Das Hybridom D765-13 (146) erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB9633.
Der monoklonale Antikörper, der für die Valinsubstitution spezifisch ist, wurde unter Verwendung eines Immunogens erzeugt, das die folgende Polypeptidsequenz enthielt: Cystein-⁵Lysin-Leucin-Valin-Valin-Valin-Glycin-Alanin-Glycin-Valin-Valin-Glycin-Lysin-Serin-Alanin-Leucin¹⁹. Das Hybridom, das diesen monoklonalen Antikörper sezerniert, wurde als V647-13 bezeichnet. Dieses Hybridom wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB9634.
Weitere monoklonale Antikörper, die gegenüber ras-Proteinen reaktiv sind, die in Position 13 mutiert sind, umfassen monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-p21-Proteins mit Arginin auf Position 13 binden und nicht an ein Epitop mit Glycin auf Position 13 binden.
Diese monoklonalen Antikörper können erzeugt werden, indem man Mäuse nach dem unten beschriebenen Verfahren mit einem Immunogen immunisiert, das die folgende Polypeptidsequenz enthält: ⁵Lysin-Leucin-Valin-Valin-Valin-Glycin-Alanin-Glycin-Arginin-Valin-Glycin-Lysin¹⁶. Die Hybridom-Methode und die Durchmusterungsvorschriften sind ebenfalls unten beschrieben. Die monoklonalen Antikörper werden ebenfalls auf ihre Reaktivität gegenüber den interessierenden Peptiden, d. h. Arginin-positiv (Position 13), Glycin-negativ (Position 13), durchmustert.
c) Monoklonale Antikörper, die gegenüber Ras-Proteinen reaktiv sind die in Position 61 mutiert sind
Monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein Epitop eines ras-p21-Proteins mit Arginin, Leucin oder Histidin auf Position 61 binden und nicht an ein Epitop mit Glutamin auf Position 61 binden, wurden gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt.
Die Hybridom-Zelllinien, die monoklonale Antikörper erzeugen, die gegenüber mutierten ras-p21-Proteinen mit Arginin auf Position 61 reaktiv sind, sind die Hybridom-Zelllinien R61-1, R61-2, R61-3 und R61-4. Die Hybridom-Zelllinie R61-1 wurde am 29. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10063. Die Hybridom-Zelllinie R61-2 wurde am 30. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10069. Die Hybridom-Zelllinie R61-3 wurde am 30. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10071. Die Hybridom-Zelllinie R61-4 wurde am 29. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10062.
Die Hybridom-Zelllinien R61-1, R61-2, R61-3 und R61-4 wurden hergestellt, indem man ein 11mer-Peptid (Undecapeptid) mit der folgenden Struktur verwendete, um Mäuse gemäß dem unten beschriebenen Verfahren zu immunisieren: ⁵⁷Asparaginsäure-Threonin-Alanin-Glycin-Arginin-Glutaminsäure-Glutaminsäure-Tyrosin-Serin-Alanin⁶⁶-Tyrosin. Der terminale Tyrosinrest wurde hinzugefügt, um die Kopplung an ein Trägerprotein zu erleichtern. Die Hybridom-Methode und die Durchmusterungsvorschriften sind ebenfalls unten beschrieben. Die monoklonalen Antikörper wurden ebenfalls auf ihre Reaktivität gegenüber den interessierenden Peptiden, d. h. Arginin-positiv (Position 61), Glutamin-negativ (Position 61), durchmustert.
Monoklonale Antikörper, die gegenüber mutierten ras-p21-Proteinen mit Leucin auf Position 61 reaktiv sind, wurden von den Hybridom-Zelllinien L61-2 und L61-1 erzeugt. Die Hybridom-Zelllinie L61-2 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10073. Die Hybridom-Zelllinie L61-1 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10068. Beide Zelllinien wurden am 30. März 1989 hinterlegt.
Die Hybridom-Zelllinien L61-1 und L61-2 wurden hergestellt, indem man das 11mer-Peptid (Undecapeptid) mit der folgenden Struktur verwendete, um Mäuse gemäß dem unten beschriebenen Verfahren zu immunisieren: ⁵⁷Asparaginsäure-Threonin-Alanin-Glycin-Leucin-Glutaminsäure-Glutaminsäure-Tyrosin-Serin-Alanin⁶⁶-Tyrosin. Die Hybridom-Methode und die Durchmusterungsvorschriften sind ebenfalls unten beschrieben. Die monoklonalen Antikörper wurden ebenfalls auf ihre Reaktivität gegenüber den interessierenden Peptiden, d. h. Leucin-positiv (Position 61), Glutamin-negativ (Position 61), durchmustert.
Monoklonale Antikörper, die gegenüber mutierten ras-p21-Proteinen mit Histidin auf Position 61 reaktiv sind, wurden von den Hybridom-Zelllinien N61-1, N61-2, H61-3, N61-4 und N61-5 erzeugt. Die Hybridom-Zelllinie N61-1 wurde am 30. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10070. Die Hybridom-Zelllinie N61-2 wurde am 30. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10092. Die Hybridom-Zelllinie N61-3 wurde am 30. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10089. Die Hybridom-Zelllinie N61-4 wurde am 30. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10087. Die Hybridom-Zelllinie N61-5 wurde am 30. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10090.
Die Nybridom-Zelllinien H61-1, H61-2, H61-3, H61-4 und H61-5 wurden hergestellt, indem man das 11mer-Peptid (Undecapeptid) mit der folgenden Struktur verwendete, um Mäuse gemäß dem unten beschriebenen Verfahren zu immunisie ren: ⁵⁷Asparaginsäure-Threonin-Alanin-Glycin-Histidin-Glutaminsäure-Glutaminsäure-Tyrosin-Serin-Alanin⁶⁶-Tyrosin. Die Hybridom-Methode und die Durchmusterungsvorschriften sind ebenfalls unten beschrieben. Die monoklonalen Antikörper wurden ebenfalls auf ihre Reaktivität gegenüber den interessierenden Peptiden, d. h. Histidin-positiv (Position 61), Glutamin-negativ (Position 61), durchmustert.
Monoklonale Antikörper, die gegenüber mutierten ras-p21-Proteinen mit Lysin auf Position 61 reaktiv sind, werden von einer Hybridom-Zelllinie erzeugt, die unter Verwendung eines 11mer-Peptids (Undecapeptids) mit der folgenden Struktur hergestellt wird: ⁵⁷Asparaginsäure-Threonin-Alanin-Glycin-Lysin-Glutaminsäure-Glutaminsäure-Tyrosin-Serin-Alanin⁶⁶-Tyrosin. Mäuse werden gemäß dem unten beschriebenen Verfahren immunisiert. Die Hybridom-Methode und die Durchmusterungsvorschriften sind ebenfalls unten beschrieben. Die monoklonalen Antikörper werden ebenfalls auf ihre Reaktivität gegenüber den interessierenden Peptiden, d. h. Lysin-positiv (Position 61), Glutamin-negativ (Position 61), durchmustert.
d) Monoklonale Antikörper, die gegenüber Ras-Proteinen der einzelnen Harvey-, N- und Kirsten-Ras-Familien reaktiv sind
Monoklonale Antikörper, die spezifisch für Ha-, N- oder Ki2A-, Ki2B-ras-p21 sind, können zwischen den einzelnen Ha-, N- und Ki-ras-Familien unterscheiden.
Die Hybridome, die für N-ras spezifische monoklonale Antikörper erzeugen, wurden als N-770-1.1.4, H-784-4.7.7 und H-873-3.5.3 bezeichnet und wurden am 25. März 1988 gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt. Das Hybridom N-770-1.1.4 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB9673. Das Hybridom H-784-4.7.7 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB9675. Das Hybridom H-873-3.5.3 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB9674.
Die Hybridome, die für N-ras spezifische monoklonale Antikörper erzeugen, wurden als N-821-1.1.9 und N-838-1.1.6 bezeichnet und wurden am 25. März 1988 gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt. Das Hybridom N-821- 1.1.9 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB9671. Das Hybridom N-838-1.1.6 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB9672.
Die Hybridom-Zelllinien, die für Ki2A spezifische monoklonale Antikörper erzeugen, wurden als K2A-1 und K2A-2 bezeichnet und wurden am 30. März 1989 gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt. K2A-1 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10072. K2A-2 erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10065.
Die Hybridom-Zelllinien, die für Ki2B spezifische monoklonale Antikörper erzeugen, wurden als K2B-1, K2B-2, K2B-3, K2B-4, K2B-5, K2B-6 und K2B-7 bezeichnet und wurden gemäß dem Budapester Abkommen bei der ATCC hinterlegt. K2B-1 wurde am 30. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10064. K2B-2 wurde am 29. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10055. K2B-3 wurde am 30. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10066. K2B-4 wurde am 31. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10085. K2B-5 wurde am 29. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10056. K2B-6 wurde am 30. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10067. K2B-7 wurde am 31. März 1989 hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung Nr. HB10091.
Immunisierungen
Im Falle des monoklonalen Antikörpers H-770-1.1.4 wurde die (Balb/c × C57B1/6)-Maus Nr. 4607 mit dem H-spezifischen Peptid immunisiert, das nach dem Glutaraldehyd-Verfahren von A. Kagan et al., Methods of Hormone Radioimmunoassay, 5. 327–339 (2. Aufl.) (1979) an das Trägerprotein Schlitzschnecken-Hämocyanin (KLH) gekoppelt war. Wenn nichts anderes angegeben ist, ist das Kagan-Verfahren das bevorzugte Verfahren für alle hier besprochenen Kopplungen/Konjugationen. Das H-spezifische Peptid war aus 18 Aminosäuren zusammengesetzt, die den Positionen 163–180 von ras-H-p21 entsprachen. Die Struktur des immunisierenden Peptids war wie folgt: ¹⁶³Isoleucin-Arginin-Glutamin-Histidin-Lysin-Leucin-Arginin-Lysin-Leucin-Asparagin-Prolin-Prolin-Asparaginsäure-Glutaminsäure-Serin-Glycin-Prolin-Glycin¹⁸⁰.
Im Falle des monoklonalen Antikörpers N-784-4.7.7 wurde die (Balb/c × C57B1/6)-Maus Nr. 4615 mit dem N-spezifischen Peptid immunisiert, das an das Trägerprotein KLH gekoppelt war.
Im Falle des monoklonalen Antikörpers H-873-3.5.3 wurde die (Balb/c × C57B1/6)-Maus Nr. 4606 mit dem H-spezifischen Peptid immunisiert, das an das Trägerprotein KLH gekoppelt war.
Im Falle des monoklonalen Antikörpers N-821-1.1.9 wurde die (Balb/c × C57B1/6)-Maus Nr. 4486 mit dem N-spezifischen Peptid immunisiert, das wie oben diskutiert an das Trägerprotein Rinder-Thyroglobulin (BTG) gekoppelt war.
Im Falle des monoklonalen Antikörpers N-838-1.1.6 wurde die (Balb/c × C57B1/6)-Maus Nr. 4480 mit dem N-spezifischen Peptid immunisiert, das an BTG gekoppelt war. Das N-spezifische Peptid war aus 18 Aminosäuren zusammengesetzt, die den Positionen 163–180 von N-ras-p21 entsprachen. Die Struktur des N-ras-Peptids war wie folgt: ¹⁶³Isoleucin-Arginin-Glutamin-Tyrosin-Arginin-Methionin-Lysin-Lysin-Leucin-Asparagin-Serin-Serin-Asparaginsäure-Asparaginsäure-Glycin-Threonin-Glutaminsäure-Glycin¹⁸⁰.
Die immunisierenden N- und H-spezifischen Peptide wurden an die Trägerproteine KLH bzw. BTG gekoppelt, um die Immunogenität des Peptids zu erhöhen. Die erste Impfung bestand aus dem Peptid-Träger-Konjugat, das mit Freunds vollständigem Adjuvans gemischt war. Die Gesamtmenge des eingeimpften Proteins betrug 500 μg. Anschließende Impfungen wurden in Abständen von zwei Wochen verabreicht. Drei Tage vor der Fusion erhielten die Mäuse eine intraperitoneale Impfung mit dem entsprechenden Immunogen.
Im Falle der monoklonalen Antikörper K2A-1 und K2A-2 wurden einige (Balb/c × C57B1/6)-Mäuse mit einem Peptid immunisiert, das den Aminosäuren 163–180 entsprach. Wiederum wurden die Peptide vor den Impfungen an Trägerproteine gekoppelt.
Das Peptid, das den Aminosäuren 163–180 entsprach, war aus 18 Aminosäuren zusammengesetzt und hatte die folgende Struktur: ¹⁶³Isoleucin-Arginin-Glutamin-Tyrosin-Arginin-Leucin-Lysin-Lysin-Isoleucin-Serin-Serin-Glutaminsäure-Glutaminsäure-Lysin-Threonin-Prolin-Glycin-Cystein¹⁸⁰.
Ein weiteres Peptid, das den Aminosäuren 170–184 von Ki-ras-p21 entspricht, kann als Immunogen verwendet werden. Es hat die Struktur: ¹⁷⁰Lysin-Isoleucin-Serin-Lysin-Glutaminsäure-Glutaminsäure-Lysin-Threonin-Prolin-Glycin-Cystein-Valin-Lysin-Isoleucin-Lysin¹⁸⁴.
Im Falle der monoklonalen Antikörper K2B-1, K2B-2, K2B-3, K2B-4, K2B-5, K2B-6 und K2B-7 wurden (Balb/c × C57B1/6)-Mäuse mit Peptiden immunisiert, die den Aminosäuren 164–175 entsprachen. Wiederum wurden die Peptide vor der Impfung an Trägerproteine gekoppelt.
Das Peptid, das den Aminosäurepositionen 164–175 von Ki2B-ras-p21 entsprach, war aus 12 Aminosäuren zusammengesetzt und hatte die folgende Struktur: ¹⁶⁴Arginin-Lysin-Histidin-Lysin-Glutaminsäure-Lysin-Methionin-Serin-Lysin-Asparaginsäure-Glycin-Lysin¹⁷⁵.
Zwei weitere Peptide, die den Aminosäuren 163–180 bzw. 168–183 von Ki2B-ras-p21 entsprechen, können ebenfalls verwendet werden. Sie haben die folgende Struktur: ¹⁶³Isoleucin-Arginin-Lysin-Histidin-Lysin-Glutaminsäure-Lysin-Methionin-Serin-Lysin-Asparaginsäure-Glycin-Lysin-Lysin-Lysin-Lysin-Lysin-Lysin¹⁸⁰ und ¹⁶⁸Glutaminsäure-Lysin-Methionin-Serin-Lysin-Asparaginsäure-Glycin-Lysin-Lysin-Lysin-Lysin-Lysin-Lysin-Serin-Lysin-Threonin¹⁸³.
Die Ki2A- und Ki2B-spezifischen Peptide wurden an die Trägerproteine KLH oder BTG gekoppelt, um die Immunogenität des Peptids zu erhöhen. Die erste Impfung bestand aus dem Peptid-Träger-Konjugat, das mit Freunds vollständigem Adjuvans gemischt war. Die Gesamtmenge des eingeimpften Proteins betrug 500 μg. Anschließende Impfungen wurden in Abständen von zwei Wochen verabreicht. Drei Tage vor der Fusion erhielten die Mäuse eine intraperitoneale Impfung mit dem entsprechenden Immunogen.
Hybridom-Methode
Drei Tage nach einer intraperitonealen Auffrischimpfung wurden die Milzen der entsprechenden Immunmäuse entnommen und mit der nichtsekretorischen Myelomzelle Sp2/0 fusioniert. Milzzellsuspensionen wurden in serumfreiem DMEM Hochglucosemedium hergestellt und mit Myelomzellen in einem Verhältnis von 4 : 1 gemischt. Dieses Zellgemisch wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 1200 × g zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstands wurden die Zellen resuspendiert, indem man leicht gegen das Röhrchen klopfte. Der Fusionsvorgang wurde eingeleitet, indem man bei 37°C im Verlaufe von 30 Sekunden 1,0 ml 45%iges (w/v) Polyethylenglycol 3350 (Baker) hinzufügte.
Die Zellen wurden gelegentlich 90 Sekunden lang mit einer Pipettenspitze durchmischt, und im Verlaufe von 3 Minuten wurden 5 ml serumfreies DMEM-Hochglucosemedium hinzugefügt. Danach wurden 14 ml DMEM-Hochglucosemedium hinzugefügt, dem 10% Kälberfetusserum, L-Glutamin, Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin zugesetzt worden war (als HAT-Medium bezeichnet). Das HAT-Medium wurde im Verlaufe von 1 Minute zugesetzt.
Geeignete Volumina von HAT-Medium wurden zu Zellen gegeben, und dann wurden die Zellen 7 Minuten bei Raumtemperatur mit 800 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden abgesaugt, und das Zellsediment wurde mit 10 ml HAT-Medium aufgeschlossen. Peritoneale Zellen aus Balb/c × C57B1/6 wurden hinzugefügt, und das Endvolumen wurde so eingestellt, dass 200 000 Milzzellen auf jeden Napf verteilt wurden. Ungefähr 14 Tage später wurden Gewebekulturüberstände aus Näpfen, die Hybridom-Kolonien enthielten, mit ELISA auf die gewünschte Reaktivität gegenüber an Trägerproteinen konjugierten Peptiden getestet.
Durchmusterungsverfahren und ELISA-Vorschrift
Für Durchmusterungszwecke wurde das oben beschriebene H-spezifische Peptid mit dem BTG-Trägerprotein konjugiert, während das N-spezifische Peptid mit dem KLH-Trägerprotein konjugiert wurde. Der Grund dafür, dass die Peptide für die Immunisierung und die Durchmusterung an verschiedene Trägerproteine gekoppelt wurden, war die Vermeidung einer Auswahl von Antikörpern, die gegenüber dem Trägerprotein reaktiv sind. Derselbe Grund galt für die Auswahl des Trägers zur Bildung eines Konjugats mit den Ki2A- und Ki2B-spezifischen Peptiden.
Vor der Durchmusterung von Hybridom-Überständen wurden 500 mg des Peptid-Träger-Konjugats auf 96-Napf-Mikrotiterplatten verteilt, und es wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten gewaschen, und nicht gebundene Stellen auf den Platten wurden mit Rinderserumalbumin (BSA) blockiert.
Zum Zeitpunkt der Durchmusterung der Hybridom-Überstände wurde 50 μl Flüssigkeit in die Näpfe gegeben, die das geeignete Peptid-Träger-Konjugat enthielten. Die Hybridom-Überstände wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Überstände wurden am nächsten Tag entfernt, und die Näpfe wurden mit der BSA-Lösung gewaschen. Jeder Napf erhielt anschließend 50 μl mit Meerrettich-Peroxidase konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (GAMHRP), der mit BSAphosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt war. Die Näpfe wurden 60 Minuten bei 37°C inkubiert. GAMHRP wurde nach der Inkubation entfernt, und die Näpfe wurden dreimal mit PBS-BSA-Gemischen gewaschen. Die Anwesenheit von gebundenem GAMHRP wurde bestimmt, indem man 50 μl des Substrats o-Phenylendiamin (OPD) in Phosphatpuffer, der 0,15% Wasserstoffperoxid enthielt, hinzufügte. HRP ergibt in Kombination mit ihrem Substrat OPD ein gelbes Produkt. Die Entwicklung des gelben Produkts erfolgte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 4,5 M Schwefelsäure abgebrochen. Die Messung des resultierenden Reaktionsprodukts erfolgte durch Bestimmen der optischen Dichte bei 488 nm mit einem Nunc Plate Reader (Nunc, Inc., Newbury Park, CA). Die Anwesenheit der gelben Farbe in den Näpfen zeigte an, dass interessierende Antikörper in den Hybridom-Überständen vorhanden waren. Je mehr Antikörper in der Kulturflüssigkeit vorhanden war, desto höher war die optische Dichte.
Bei Verwendung des oben beschriebenen Assays erwiesen sich die monoklonalen Antikörper H-770-1.1.4, H-784-4.7.7 und H-873-3.5.3 als reaktiv gegenüber dem an das Trägerprotein gekoppelten H-spezifischen Peptid und als nicht reaktiv gegenüber den ebenfalls an Trägerprotein gekoppelten N-, Ki2A- und Ki2Bspezifischen Peptiden. Die monoklonalen Antikörper N-821-1.1.9 und N-838-1.1.6 erwiesen sich als reaktiv gegenüber dem an das Trägerprotein gekoppelten N-rasspezifischen Peptid und als nicht reaktiv gegenüber den an Trägerprotein gekoppelten H-, Ki2A- und Ki2B-spezifischen Peptiden.
Die monoklonalen Antikörper Ki2A-1 und Ki2A-2 erwiesen sich als reaktiv gegenüber dem Ki2A-spezifischen Peptid und als nicht reaktiv gegenüber den ebenfalls an Trägerprotein gekoppelten H-, N- und Ki2B-spezifischen Peptiden (Aminosäuren 164–175).
Die monoklonalen Antikörper Ki2B-1, Ki2B-2, Ki2B-3, Ki2B-4, Ki2B-5, Ki2B-6 und Ki2B-7 erwiesen sich als reaktiv gegenüber dem Ki2B-spezifischen Peptid (Aminosäuren 164–175) und als nicht reaktiv gegenüber den ebenfalls an Trägerprotein gekoppelten H-, N- und Ki2A-spezifischen Peptiden.
Spezifität monoklonaler Antikörper für interessierende Peptide
In der nächsten Versuchsreihe wurden die monoklonalen Anti-N- und Anti-H-Antikörper mit Peptiden, die nicht an Trägerproteine gekoppelt waren, auf ihre Spezifität getestet, um zu gewährleisten, dass die monoklonalen Antikörper spezifisch für die interessierenden Peptide und nicht reaktiv gegenüber der Bindung waren, die das Trägerprotein an das Peptid bindet. Tabelle 1 fasst die ELISA-Ergebnisse vom Testen der monoklonalen Anti-H- und Anti-N-Antikörper gegen die speziellen H-, N-, Ki2A- und Ki2B-Peptide zusammen.
Tabelle 1
Diese Ergebnisse zeigen, dass monoklonale Antikörper, die gegen das H-Peptid erzeugt wurden, spezifisch für dieses Peptid und gegenüber dem N-Peptid, Ki2A-Peptid oder Ki2B-Peptid nicht reaktiv sind. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die monoklonalen Antikörper, die gegen das N-Peptid erzeugt wurden, spezifisch für dieses Peptid und gegenüber dem H-ras-verwandten Peptid, dem Ki2A-ras-verwandten Peptid oder dem Ki2B-ras-verwandten Peptid nicht reaktiv oder kreuzreaktiv sind.
In ähnlicher Weise wurden monoklonale Antikörper gegen Ki2A und Ki2B mit Peptiden, die nicht an Trägerproteine gekoppelt waren, auf ihre Spezifität getestet, um zu gewährleisten, dass die monoklonalen Antikörper spezifisch für die interessierenden Peptide und nicht reaktiv gegenüber der Bindung waren, die das Trägerprotein an das Peptid bindet. Wir glauben, dass die monoklonalen Ki2A- und Ki2B-Antikörper spezifisch für die interessierenden Peptide und nicht reaktiv gegenüber der Bindung sind, die das Trägerprotein an das Peptid bindet.
Reaktivität und Spezifität der monoklonalen Anti-Peptid-Antikörper gegenüber zellulären ras-Proteinen
Immunfällung und Western-Blotting wurden verwendet, um zu bestimmen, ob die gegen die H- und N-ras-Peptide erzeugten monoklonalen Antikörper mit den zellulären H- und N-ras-p21 reagieren und für diese spezifisch sind. Experimente wurden unter Verwendung der folgenden vier Zelllinien durchgeführt:

1. Die als 3T3-H-ras bezeichnete Zelllinie (auch als PSV-13 bezeichnet) überexprimierte das H-ras-p21-Protein.
2. Die als 3T3-N-ras bezeichnete Zelllinie überexprimierte das N-ras-p21-Protein.
3. Die als 3T3-Ki2A bezeichnete Zelllinie (KNRK) exprimierte die virale Form des Ki-p21-Proteins.
4. Die als 3T3-Ki2B bezeichnete Zelllinie (SW480) exprimierte die zelluläre Form des Ki-ras-Proteins.

Nichtradioaktive Extrakte der oben genannten Zellen wurden 1 Stunde lang mit einem monoklonalen Anti-H-Antikörper, einem monoklonalen Anti-N-Antikörper oder einem als Ras 10 bezeichneten monoklonalen Anti-p21-Antikörper inkubiert. Der monoklonale Ras-10-Anti-p21-Antikörper reagierte mit der normalen und der onkogenen Form der ras-p21-Proteine, wie sie oben besprochen sind.
Nach der Inkubation wurde ein Komplex von Kaninchen-Anti-Maus-Ig 30 Minuten lang bei 4°C zu Protein-A-Sepharose gegeben, um die monoklonalen Anti-H-, Anti-N- und Anti-p21-Antikörper abzufangen.
Nach der einstündigen Inkubation wurden die Proben zentrifugiert, und die resultierenden Sedimente wurden gewaschen. Nach der letzten Waschung wurden 50 μl eines Natriumdodecylsulfat-Reduktionspuffers zu dem Sediment gegeben, und es wurde 5 Minuten auf 100°C erhitzt. Dieses Material wurde dann auf ein 12,5%iges Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Die zellulären Proteine wurden nach dem Molekulargewicht aufgetrennt, indem man einen elektrischen Strom durch das Gel fließen ließ. Nach diesem Elektrophoresevorgang wurden die Proteine elektrophoretisch auf Nitrocellulosemembranen übertragen, die mit PBS, das 5% BSA enthielt, blockiert worden waren. Die Membranen wurden 1 Stunde lang entweder mit einem monoklonalen Anti-p21-Antikörper ras 10 oder mit Maus-Serum, das als negative Kontrolle diente, inkubiert. Nach der Inkubation mit Ras 10 oder einem als negative Kontrolle dienenden Antikörper wurden die Membranen dreimal mit PBS-NP-40 gewaschen. Dann wurden die Membranen 1 Stunde lang mit einem an HRP gekoppelten Anti-Maus-Immunglobulin inkubiert, um die monoklonalen Maus-Antikörper nachzuweisen. Dann wurden die Membranen dreimal mit PBS-NP-40 gewaschen und mit 4-Chlor-1-naphthol als Substrat inkubiert, um die Reaktion zu beenden. Experimente zeigten, dass die monoklonalen Anti-H-Antikörper in der Lage waren, das zelluläre H-ras-p21 aus der 3T3-H-ras-Zelllinie durch Immunfällung auszufällen oder abzufangen, aber nicht mit zellulären p21 aus der N-ras-Familie, Ki2A-Familie oder Ki2B-Familie reagierten. Monoklonale Anti-N-ras-Antikörper fällten das zelluläre N-ras-p21 spezifisch durch Immunfällung aus oder fingen es ab, reagierten aber nicht mit den anderen zellulären p21-Proteinfamilien N, Ki2A und Ki2B. Der monoklonale Anti-p21-Antikörper Ras 10 mit breiter Reaktivität reagierte mit p21-Proteinen aus allen Zellen, während der als negative Kontrolle dienende Antikörper mit keinem der zellulären ras-p21 reagierte. Diese Ergebnisse sind unten in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2
In einer getrennten Versuchsreihe wurde die Fähigkeit der monoklonalen Anti-H- und Anti-N-Antikörper bewertet, die zellulären H- und N-ras-p21 ohne vorherige Immunfällung nachzuweisen. Dazu wurden Zellextrakte direkt auf das 12,5%ige Gel aufgetragen und einer Elektrophorese unterworfen, um die Proteine aufzutrennen. Die Proteine wurden auf Nitrocellulosemembranen übertragen und entweder mit dem monoklonalen Anti-H, Anti-N oder Anti-p21-Antikörper Ras 10 umgesetzt. Die Maus-Antikörper wurden wie oben beschrieben nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass die monoklonalen Anti-H-Antikörper nur mit den zellulären H-ras-p21 reagierten, während die monoklonalen Anti-N-Antikörper nur mit den zellulären N-ras-p21 reagierten.
Gemäß dieser Erfindung wird der oben diskutierte Antikörper oder das Gemisch von Antikörpern, der bzw. das zum Nachweis verwendet werden kann, mit herkömmlichen Techniken nachweisbar mit einem Reporter oder mit einem Partner eines spezifischen Bindungspaars markiert.
Spezifische Bindungspaare können solche des Immun- oder des Nicht-Immuntyps sein. Beispiele für spezifische Bindungspaare des Immuntyps sind Antigen-Antikörper-Systeme oder Hapten-Antihapten-Systeme. Erwähnt seien Fluorescein/Anti-Fluorescein, Dinitrophenyl/Anti-Dinitrophenyl, Biotin/Anti-Biotin, Peptid/Anti-Peptid und dergleichen. Der Antikörperpartner des spezifischen Bindungspaars kann nach üblichen Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann vertraut sind. Zu diesen Verfahren gehört das Immunisieren eines Tiers mit dem Antigenpartner des spezifischen Bindungspaars. Wenn der Antigenpartner des spezifischen Bindungspaars nicht immunogen ist, z. B. ein Hapten, kann er kovalent an ein Trägerprotein gekoppelt werden, um ihn immunogen zu machen.
Zu den Bindungspaaren des Nicht-Immuntyps gehören Systeme, bei denen die beiden Komponenten eine natürliche Affinität zueinander haben, aber keine Antikörper sind. Beispiele für Paare des Nicht-Immuntyps sind Biotin/Streptavidin, intrinsischer Faktor/Vitamin B₁₂, Folsäure/folatbindendes Protein und dergleichen.
Für die kovalente Markierung von Antikörpern mit Partnern von spezifischen Bindungspaaren steht eine Vielzahl von Verfahren zur Verfügung. Verfahren werden auf der Basis der Natur des Partners des spezifischen Bindungspaars, des Typs der gewünschten Verknüpfung und der Toleranz des Antikörpers gegenüber verschiedenen Konjugationsreaktionen ausgewählt. Biotin kann unter Verwendung kommerziell erhältlicher aktiver Derivate kovalent an Antikörper gekoppelt werden. Einige davon sind Biotin-N-hydroxysuccinimid, das an Amingruppen an Proteinen bindet, Biotinhydrazid, das über eine Carbodiimidkopplung an Kohlenhydrat-Struktureinheiten, Aldehyde und Carboxygruppen bindet, sowie Biotinmaleinimid und Iodacetylbiotin, die an Sulfhydrylgruppen binden. Fluorescein kann unter Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat an Proteinamingruppen gekoppelt werden. Dinitrophenylgruppen können unter Verwendung von 2,4-Dinitrobenzolsulfat oder 2,4-Dinitrofluorbenzol an Proteinamingruppen gekoppelt werden. Auch andere Standardverfahren der Konjugation können eingesetzt werden, um monoklonale Antikörper an einen Partner eines spezifischen Bindungspaars zu koppeln, einschließlich Dialdehyd-, Carbodiimid-Kopplung, homofunktionelle Vernetzung und heterobifunktionelle Vernetzung. Carbodiimid-Kopplung ist ein effektives Verfahren zum Koppeln von Carboxylgruppen an einer Substanz mit Amingruppen an einer anderen. Die Carbodiimid-Kopplung wird durch Verwendung des kommerziell erhältlichen Reagens 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) erleichtert.
Homobifunktionelle Vernetzungsmittel einschließlich der bifunktionellen Imidoester und bifunktionellen N-Hydroxysuccinimidester sind kommerziell erhältlich und werden eingesetzt, um Amingruppen an einer Substanz mit Amingruppen an einer anderen zu koppeln. Heterobifunktionelle Vernetzungsmittel sind Reagentien, die verschiedene funktionelle Gruppen besitzen. Die häufigsten kommerziell erhältlichen heterobifunktionellen Vernetzungsmittel haben eine aminreaktive N-Hydroxysuccinimidestergruppe als die eine funktionelle Gruppe und eine sulfhydrylreaktive Gruppe als die zweite funktionelle Gruppe. Die häufigsten sulfhydrylreaktiven Gruppen sind Maleinimide, Pyridyldisulfide und aktive Halogene. Eine der funktionellen Gruppen kann ein photoaktives Arylnitren sein, das bei Bestrahlung mit einer Vielzahl von Gruppen reagiert.
Der oder die Antikörper oder ein Partner des spezifischen Bindungspaars wird an den Reporter gekoppelt, bei dem es sich um ein radioaktives Isotop, ein Enzym, fluorogene, chemilumineszente oder elektrochemische Materialien handeln kann. Zwei häufig verwendete radioaktive Isotope sind ¹²⁵I und ³H. Zu den Standardverfahren der Markierung mit radioaktiven Isotopen gehören das Chloramin-T-, Lactoperoxidase- und Bolton-Hunter-Verfahren für ¹²⁵I und die reduktive Methylierung für ³H.
Enzyme, die für die Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Meerrettich-Peroxidase, Alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucose-Oxidase, Luciferase, β-Lactamase, Urease und Lysozym. Die Enzymmarkierung wird durch Verwendung von Dialdehyd-, Carbodiimid-Kopplung, homobifunktionellen Vernetzungsmitteln und heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln, wie sie oben für die Markierung eines Antikörpers mit einem Partner eines spezifischen Bindungspaars beschrieben sind, erleichtert.
Das gewählte Markierungsverfahren hängt von den am Enzym verfügbaren funktionellen Gruppen und dem zu markierenden Material sowie der Toleranz beider gegenüber den Konjugationsbedingungen ab. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Markierungsverfahren kann, ohne darauf beschränkt zu sein, eines der herkömmlichen Verfahren, die zur Zeit eingesetzt werden, einschließlich der von Engvall und Pearlmann, Immunochemistry 8, 871 (1971), Avrameas und Ternynck, Immunochemistry 8, 1175 (1975), Ishikawa et al., J. Immunoassay 4(3): 209–327 (1983), und Jablonski, Anal. Biochem. 148: 199 (1985), beschriebenen sein.
Die Markierung lässt sich auch durch indirekte Verfahren erreichen, wie die Verwendung von Spacern oder anderen Partnern spezifischer Bindungspaare. Ein Beispiel dafür ist der Nachweis eines biotinylierten Antikörpers mit unmarkiertem Streptavidin und biotinyliertem Enzym, wobei Streptavidin und biotinyliertes Enzym entweder nacheinander oder gleichzeitig zugegeben werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der zum Nachweis verwendete Antikörper also nachweisbar mit einem Reporter oder mit einem ersten Partner eines spezifischen Bindungspaars markiert sein. Wenn der Antikörper mit einem ersten Partner eines spezifischen Bindungspaars markiert ist, wird der Nachweis durchgeführt, indem man den Komplex aus Antikörper und erstem Partner des spezifischen Bindungspaars mit dem zweiten Partner des Bindungspaars umsetzt, der, wie oben erwähnt, markiert oder unmarkiert ist.
Außerdem kann der unmarkierte Detektorantikörper nachgewiesen werden, indem man den unmarkierten Antikörper mit einem markierten Antikörper umsetzt, der für den unmarkierten Antikörper spezifisch ist. Ein solcher Anti-Antikörper kann unter Verwendung eines der oben besprochenen Verfahren direkt oder indirekt markiert sein. Zum Beispiel kann der Anti-Antikörper mit Biotin markiert sein. Das oben diskutierte Streptavidin/Meerrettich-Peroxidase-System könnte dann verwendet werden, um den Nachweis zu erleichtern.
Bei einer der bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung wird Biotin als nachweisbare Markierung verwendet. Der biotinylierte Antikörper wird wiederum mit Streptavidin/Meerrettich-Peroxidase-Komplex umgesetzt. Orthophenylendiamin oder 4-Chlornaphthol kann als Substrat für den chromogenen Nachweis verwendet werden.
Das bevorzugte Immunoassay-Format für die praktische Durchführung dieser Erfindung ist ein direktes Sandwichassay, bei dem das Abfangreagens unter Verwendung herkömmlicher Techniken auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert ist.
Zu den geeigneten Trägern, die in Assays verwendet werden, gehören Träger aus synthetischem Polymer, wie Polypropylen, Polystyrol, substituiertem Polystyrol, z. B. aminiertem oder carboxyliertem Polystyrol, Polyacrylamiden, Polyamiden, Polyvinylchlorid, Glaskügelchen, Agarose und Nitrocellulose.
Immunoblots werden unter Verwendung herkömmlicher Techniken durchgeführt. Die ras-p21-Proteine müssen keiner Immunkonzentrierung unterzogen werden, bevor man sie auf die Nitrocellulosefilter überträgt.
Die unten besprochenen Beispiele sollen die Erfindung erläutern und sollten nicht als Einschränkungen angesehen werden.
In den unten besprochenen Beispielen wurden die folgenden Zelllinien verwendet:

1. PSV-13: Dies ist eine NIH3T3-Ze11e, die durch Überexpression des normalen Harvey-Ras-p21 transformiert wurde.
2. NIH3T3: Dies ist eine nicht transformierte, aber immortalisierte Maus-Fibroblasten-Zelle.
3. NIH3T3 (SW480): Dies ist eine NIH3T3-Zelle, die mit DNA aus der Human-Kolon-Karzinom-Zelllinie SW480 transfiziert und transformiert wurde. SW480-Zellen enthalten ein aktiviertes Ki-ras-Gen, in dem ein aktiviertes ras p21 mit Valin auf Position 12 codiert ist. Die NIH3T3 (SW480) exprimiert also dieses aktivierte zelluläre Human-p21 mit Valin auf Position 12.
4. PSV-LM-EJ oder -LMEJ: Dies ist eine NIH3T3-Zelle, die mit einem aktivierten zellulären Ha-ras-p21 mit Valin auf Position 12 transfiziert und daher transformiert wurde. Die in NIH3T3-Zellen transfizierte DNA stammte aus dem als EJ bezeichneten Human-Blasen-Karzinom. Die PSV-LMEJ enthält also ein aktiviertes p21 mit Valin auf Position 12.
5. S-2: Dies ist eine NIH3T3-Zelle, die mit einem aktivierten Ha-ras-p21 transfiziert und daher transformiert wurde, in dem auf Position 12 Glutaminsäure codiert ist.
6. 3T3-N-ras oder NIH3T3 (N ras): Dies ist eine Zelllinie, die mit einem aktivierten N-ras-Gen transfiziert und transformiert wurde.
7. KNRK: Dies ist eine Zelllinie, die aus einer normalen Ratten-Nierenzelle besteht, die mit dem viralen Kirsten-Gen transformiert ist, in dem ein aktiviertes p21 mit Serin auf Position 12 codiert ist.
8. v-Ha-ras: Dies ist eine NIH3T3-Zelle, die mit dem viralen Harvey-ras-Gen transformiert ist, in dem ein aktiviertes p21 mit Arginin auf Position 12 codiert ist.
9. NIH-Zip Ras K-3: Dies ist eine NIH3T3-Zelle, die durch Überexpression des normalen Ki-ras p21 transformiert ist, in dem Glycin auf Position 12 codiert ist.
10. AML-1: Dies ist eine NIH3T3-Zelle, die mit DNA aus einer Zelllinie von humaner akuter myelogener Leukämie transfiziert ist, die ein aktiviertes N-ras-p21 enthält, das Asparaginsäure auf Position 13 enthält.
11. T144-1: Dies ist eine NIH3T3-Zelle, die mit DNA aus einer Zelllinie von humanem Brust-Carcinosarkom (HSO578t) transfiziert ist, die ein aktiviertes p21 enthält, das Asparaginsäure auf Position 12 enthält.
12. A2182: Dies ist eine Human-Karzinom-Zelllinie, die ein aktiviertes p21 mit Arginin auf Position 12 enthält.
13. NIH3T3(cys-13): Dies ist eine NIH3T3-Zelllinie, die mit einem aktivierten Ha-ras-Gen transfiziert und daher transformiert wurde, in dem ein aktiviertes p21 mit Cystein auf Position 13 codiert ist.
14. A549: Dies ist eine Human-Lungenkarzinom-Zelllinie, von der berichtet wird, dass sie ein aktiviertes p21 exprimiert, das Serin auf Position 12 enthält.

Das folgende Verfahren wurde verwendet, um Tumoren in Nacktmäusen zu erzeugen: Zellen wurden aus Gewebekulturkolben geerntet, unter Bildung eines Sediments zentrifugiert und auf eine Konzentration von 40–80 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt. 0,25 ml oder 10–20 × 10⁶ Zellen wurden subkutan in das Hinterteil der Maus eingeimpft. Dann wurden die Mäuse täglich auf das Auftreten von Tumoren hin beobachtet. Die Tumoren wurden bei einer Größe von 2–4 cm entnommen. Plasma wurde hergestellt, indem man Blut in mit EDTA beschichteten Röhrchen auffing.
Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel)
Nachweis von ras p21 in Kulturflüssigkeiten
Verschiedene Tumorzelllinien, von denen man weiß, dass sie entweder die normale oder aktivierte Formen von ras p21 exprimieren, wurden mehrere Tage lang in Kulturkolben gezüchtet, und die Kulturflüssigkeiten wurden entnommen, um zu bestimmen, ob normale oder aktivierte Formen von ras-p21-Proteinen in den Flüssigkeiten vorhanden waren.
Zwei biochemische Verfahren wurden verwendet, um zu bestimmen, ob ras-p21 in die Zellkulturflüssigkeit abgegeben wurde. Zuerst wurden die ras-p21 aus den Flüssigkeiten immunkonzentriert, wobei man einen als ras 10 bezeichneten panreaktiven monoklonalen Anti-p21-Antikörper verwendete. Dann wurden die ras-p21 unter Verwendung eines Western-Blotting genannten Immunoblot-Verfahrens nachgewiesen.
4 ml Zellkulturflüssigkeit, die von in Kultur wachsenden Zellen, wie PSV-13 und NIH3T3 (SW480), oder Zellkulturwachstumsmedium erhalten wurde, wurde eine Stunde lang mit einem monoklonalen Anti-p21-Antikörper (z. B. Ras 10), wie er oben diskutiert ist, inkubiert. Nach der Inkubation mit dem monoklonalen Anti-p21-Antikörper wurde ein Komplex aus Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin und Protein-A-Sepharose für 30 bis 60 Minuten in das Röhrchen gegeben, das die Kulturflüssigkeit und den monoklonalen Anti-p21-Antikörper enthielt, um den monoklonalen Anti-p21-Antikörper abzufangen. Nach einer einstündigen Inkubationszeit wurde das Material unter Bildung eines Sediments zentrifugiert. Das Sediment wurde mehrmals mit RIPA gewaschen, bei dem es sich um einen Puffer handelt, der 1,0% Triton^® X-100, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,15 M Natriumdesoxycholat, 0,15 M Natriumchlorid, 0,05 TRIS-HCl und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), einen Protease-Inhibitor, enthält. Die letzte Waschung wurde mit einem Natriumdodecylsulfat-Reduktionspuffer abgeschlossen, der 2-Mercaptoethanol (2-ME) enthielt. Das resultierende Material wurde 5 Minuten auf 100°C erhitzt. Dann wurde die resultierende Flüssigkeit, die das ras p21 enthielt, auf ein 12,5%iges Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Zelluläre Proteine, die durch die Behandlung mit dem Reduktionspuffer und das Erhitzen in die Kulturflüssigkeit abgegeben worden waren, wurden nach dem Molekulargewicht aufgetrennt, indem man einen elektrischen Strom durch das Gel fließen ließ. Dann wurden die Proteine elektrophoretisch auf Nitrocellulosemembranen übertragen, die mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die 5% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, blockiert waren. Die mit ras-Protein imprägnierte Nitrocellulose wurde eine Stunde lang mit dem oben beschriebenen, als Ras 10 bezeichneten panreaktiven monoklonalen Anti-p21-Antikörper, einem oben beschriebenen, als DWP bezeichneten monoklonalen Antikörper oder einem als negative Kontrolle dienenden Antikörper inkubiert. Wenn nichts anderes angegeben ist, wurde normales Maus-Serum als negative Kontrolle verwendet.
Nach der Inkubation mit Ras 10, DWP oder einem als negative Kontrolle dienenden Antikörper wurden die Nitrocellulosemembranen dreimal mit PBS-NP-40-Lösung gewaschen. Dann wurden diese Membranen eine Stunde lang mit einem an Meerrettich-Peroxidase (HRP) gekoppelten Anti-Maus-Immunglobulin inkubiert, um die Maus-Antikörper nachzuweisen. Das Anti-Maus-Immunglobulin/HRP-Konjugat wurde von BioRad Laboratories (Richmond, CA) bezogen.
Dann wurden die Membranen dreimal mit PBS-NP-40-Lösung gewaschen und mit 4-Chlor-1-naphthol als Substrat inkubiert, um die Reaktion zu beenden.
Die Ergebnisse zeigten überraschenderweise und unerwarteterweise, dass ras-p21-Proteine aus einer Vielzahl von Zelllinien in der Kulturflüssigkeit nachgewiesen werden können, wenn man die hier eingesetzte Methode verwendet, nämlich Immunokonzentration von ras p21 mit einem monoklonalen Anti-p21-Antikörper, der gegen rekombinantes Ha-ras p21 erzeugt wurde, das eine Argininsubstitution auf Position 12 aufwies (Ras 10), und dann Nachweis in einem Western-Blot-Format unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern wie den oben beschriebenen. Die Ergebnisse zeigten auch, dass aktivierte p21, die eine Valinsubstitution auf Position 12 enthalten, in Kulturflüssigkeit von NIH3T3 (SW480) nachgewiesen werden können, wenn man den oben beschriebenen, als DWP bezeichneten monoklonalen Antikörper verwendet.
Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung von Kulturflüssigkeiten durchgeführt, die aus dem PSV-13 erhalten wurden. Mit der oben beschriebenen Methode wurde p21 nachgewiesen, indem man den panreaktiven monoklonalen Anti-p21-Antikörper Ras 10 als immunokonzentrierendes Reagens und als Blottingreagens verwendete. Wenn DWP als Blottingreagens verwendet wurde, blottete es p21 aus der PSV-13-Zelllinie nicht, da PSV-13 kein aktiviertes ras-p21-Protein exprimiert, das die Aminosäure Valin auf Position 12 enthält.
Weitere Experimente wurden mit Kulturflüssigkeiten aus Zelllinien durchgeführt, die als PSV-LM-EJ und NIH-3T3 (SW480) identifiziert sind und die oben beschrieben wurden. Ras 10 wurde verwendet, um die p21-Proteine einer Immunkonzent ration zu unterziehen. Im Blotting-Schritt wurden Ras 10, DWP und eine negative Kontrolle verwendet. Ras 10 und DWP reagierten mit ras-p21-Proteinen aus der Kulturflüssigkeit, die von PSV-LM(EJ) und NIH 3T3 (SW480) stammte. Dagegen reagierte die negative Kontrolle nicht mit Kulturflüssigkeiten, die mutierte p21-Proteine enthielten. Aktiviertes p21 wurde also in Zellkulturflüssigkeiten nachgewiesen, die von Zelllinien stammten, von denen man weiß, dass sie ein aktiviertes ras-p21-Protein exprimieren, das Valin auf Position 12 enthält.
Beispiel 2 (Vergleichsbeispiel)
Nachweis von aktivierten und normalen p21 in Mäuseserum unter Verwendung eines Immunoblots
Ungefähr 10–20 × 10⁶ PSV-LM-EJ-Zellen oder 10–20 × 10⁶ PSV-13-Zellen, die oben beschrieben sind, wurden subkutan in getrennte Nacktmäuse eingeimpft, um Tumoren zu erzeugen. Sobald diese Mäuse Tumoren entwickelt hatten, wurden sie getötet, und Blut wurde entnommen. Dann wurde das Blut auf die Anwesenheit von p21 untersucht, das durch die wachsenden Tumorzellen in das Blut ausgeschüttet worden war. Die Bewertung wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Immunokonzentrations- und Western-Blotting-Techniken und des unten in Beispiel 3 beschriebenen Immunoassayformats vorgenommen.
In einem Western-Blot wurde gefunden, dass Blut von Mäusen, die PSV-LM-EJ-Tumoren trugen, mit DWP reagierte, wodurch die Anwesenheit von mutiertem p21-Protein, das die Aminosäure Valin auf Position 12 enthielt, im Blut dieser tumortragenden Mäuse nachgewiesen wurde. Blut von Mäusen, denen PSV-13 injiziert wurde, reagierten nicht mit DWP, reagierten jedoch mit dem panreaktiven Anti-p21-Antikörper Ras 10, wodurch die Anwesenheit von normalem p21-Protein in Mäuseblut nachgewiesen wurde.
Diese überraschenden und unerwarteten Ergebnisse zeigten, dass der Nachweis von aktiviertem p21 im Blut von Mäusen, denen man PSV-LM-EJ-Zellen injizierte, zeigte, dass aktiviertes ras p21 im Blut tumortragender Mäuse nachgewiesen werden kann. Weiterhin zeigten diese Ergebnisse, dass im Blut von Mäusen, die PSV-13-Tumoren trugen, die normales ras-p21-Protein exprimieren, normales ras-p21-Protein vorhanden war.
Beispiel 3
Immunoassay-Vorschrift
Hier wird die allgemeine Immunoassay-Vorschrift beschrieben.
Zuerst werden Näpfe von Mikrotiterplatten mit wenigstens einem der oben beschriebenen Antikörper oder mit einem Gemisch von Antikörpern beschichtet.
Mengen des Antikörpers, die in einem Bereich von etwa 2000 ng bis etwa 500 ng liegen können, in Carbonatpuffer (pH 9,6) werden in den Napf einer Mikrotiterplatte übertragen und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nachdem der oder die Antikörper auf der Oberfläche des Napfes der Mikrotiterplatte immobilisiert sind, wird die überschüssige Flüssigkeit dekantiert, und 200 μl Blockierungspuffer werden zu jedem Napf gegeben. Der Blockierungspuffer enthielt 10% Lactose und 2% Rinderserumalbumin. Der Blockierungspuffer verhindert eine nichtspezifische Bindung. Überschüssiger Blockierungspuffer wird dekantiert. Weitere 200 μl des Blockierungspuffers werden zu den Näpfen der Mikrotiterplatte gegeben und eine Stunde lang inkubiert. Der Puffer wird dekantiert, und die Platte wird an der Luft getrocknet.
Die Probe (Zelllysat, Tumorlysat oder verschiedene Flüssigkeiten) wird zu den Näpfen gegeben und eine bestimmte Zeit lang, die in einem Bereich von wenigen Stunden bis über Nacht liegen kann, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Näpfe werden sechsmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 0,05% Tween 20 gewaschen. Die Platten werden dreimal gewaschen, um 180° gedreht und wieder dreimal gewaschen.
Das Nachweisreagens ist ein nachweisbar markierter Antikörper oder ein Antikörpergemisch und wird in 50% Kaninchenserum zu den Näpfen gegeben und dreißig Minuten lang inkubiert. Vorzugsweise werden der oder die Nachweisantikörper an Biotin gekoppelt.
Nachdem die Platten sechsmal mit PBS und 0,05% Tween gewaschen wurden, wird Streptavidin/Meerrettich-Peroxidase in 1% Rinderserumalbumin zu jedem Napf gegeben und dreißig Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Platten werden noch sechsmal gewaschen, bevor man o-Phenylendiamin (OPD) in Citratpuffer (pH 5,0) bei 37°C für dreißig Minuten hinzugibt, um den Nachweis zu bewirken. 4,5 M Schwefelsäure wird hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden.
1 ist ein Diagramm, das das Sandwich-Immunoassay-Grundformat zeigt.
Beispiel 4
Nachweis und Quantifizierung von ras-p21 aus Zell- und Gewebeextrakten
Näpfe von Mikrotiterplatten wurden wie oben beschrieben mit einem als ras 11 bezeichneten monoklonalen Anti-p21-Antikörper oder mit für Ha- oder N-ras-p21-Proteine spezifischen monoklonalen Antikörpern beschichtet.
Die in diesen Experimenten verwendeten Lysate stammten von den folgenden Zelllinien, die oben beschrieben wurden: PSV-13, NIH3T3, NIH 3T3 (SW480), KNRK und NIH-(N-ras).
Zelllysate oder aus Gewebeextrakten oder Tumoren von Nacktmäusen erhaltene Lysate können mit Techniken erhalten werden, die dem Fachmann zur Verfügung stehen. Dann wurden Lysate von in Kultur gezüchteten Zellen oder von Tumoren, die aus Mäusen stammten, die mit Zellen aus einer Kultur geimpft worden waren, zu den Platten gegeben, die mit einem panreaktiven polyklonalen Kaninchen-Anti-p21-Antikörper beschichtet waren, und über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten gewaschen, um nicht umgesetztes Zelllysat zu entfernen.
p21, das im Zelllysat vorhanden war und an die Antikörper, mit denen die Platten beschichtet waren, gebunden war, konnte wie oben diskutiert unter Verwendung eines biotinylierten monoklonalen Anti-p21-Antikörpers ras 10 nachgewiesen werden. Dann wurde der biotinylierte monoklonale Antikörper chromogen nachgewiesen, wobei Streptavidin/Meerrettich-Peroxidase und das Substrat o-Phenylendiamin verwendet wurden.
Die Ergebnisse zeigten, dass die mit monoklonalen Anti-H-Antikörpern beschichteten Platten nur zum Nachweis des N-ras-p21-Proteins und nicht der Ki2A-, Ki2B- oder N-ras-p21-Proteine in der Lage waren. Mit monoklonalen Anti-N-Antikörpern beschichtete Platten waren nur zum Nachweis des N-ras-Proteins und nicht der Ha-Ki2A- oder Ki2B-ras-p21-Proteine in der Lage. Mit dem als ras 11 bezeichneten monoklonalen Anti-p21-Antikörper beschichtete Platten wiesen p21-Proteine aus allen oben diskutierten Zelllinien nach. Diese Ergebnisse zeigen also, dass die H-ras- und N-ras-p21 unter Verwendung des Immunoassay-Formats der Erfindung nachgewiesen werden können.
Beispiel 5 (Vergleichsbeispiel)
Panreaktive polyklonale Kaninchen-Anti-p21-Antikörper wurden als Abfangreagens auf der Oberfläche einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Kulturüberstandsflüssigkeit aus zwei als NIH3T3-(SW480)- und NIH3T3-Zellen bezeichneten Maus-Zelllinien wurde gemäß der in Beispiel 3 oben beschriebenen Vorschrift mit dem immobilisierten Abfangreagens umgesetzt. Nach der Inkubation erhielten die Platten mit Biotin markiertes Anti-p21 Ras 10, und der Immunoassay wurde so durchgeführt, wie es oben in Beispiel 3 beschrieben ist.
Die Ergebnisse sind in der Graphik in 2 dargestellt. Die y-Achse stellt die aufgezeichnete optische Dichte dar, und die x-Achse stellt den Kehrwert der Verdünnung der Überstandsflüssigkeit dar.
Die Ergebnisse in 2 zeigten, dass das ras-p21-Protein in Überständen von NIH3T3-(SW480)-Zellen in viel größeren Mengen vorhanden war als in Überständen von NIH3T3-Zellen. Tatsächlich wurde in den NIH3T3-Überständen nur sehr wenig ras p21 nachgewiesen. Die Unterschiede im Ausmaß der ras-p21-Expression sind höchstwahrscheinlich auf die großen Unterschiede in der Zellwachstumsrate zurückzuführen. Bei NIH3T3 (SW480) handelt es sich um transformierte NIH3T3-Zellen, wobei die NIH3T3-Zellen selbst nicht transformiert sind.
Diese Ergebnisse zeigten, dass ras-p21-Protein in die Kulturflüssigkeit freigesetzt oder ausgeschüttet wurde, und das freigesetzte/ausgeschüttete p21 wurde unter Verwendung des hier beschriebenen Immunoassay-Formats nachgewiesen. Die Immunoassay-Ergebnisse standen mit den Ergebnissen der in Beispiel 1 besprochenen biochemischen Analysen im Einklang.
Beispiel 6 (Vergleichsbeispiel)
Nachweis von Ras-p21-Proteinen im Plasma von Nacktmäusen die subkutane Tumoren tragen
Gemäß den oben diskutierten Immunoassay- und biochemischen Ergebnissen enthalten PSV-13-Tumorzellen größere Mengen von p21 als PSV-LM(EJ)-Zellen. Man glaubte also, dass Plasma aus Mäusen, die PSV-13-Tumoren tragen, größere Mengen an ras-p21-Protein enthält als Plasma von Mäusen, die PSV-LM(EJ)-Tumoren tragen.
Plasma von drei Typen von Mäusen wurde unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Immunoassay-Formats bewertet. Plasma von normalen Nacktmäusen, Plasma von Nacktmäusen, die den PSV-LM(EJ)-Tumor trugen, und Plasma von Nacktmäusen, die den PSV-13-Tumor trugen, wurden in dieser Untersuchung verwendet.
Affinitätsgereinigter panreaktiver polyklonaler Kaninchen-Anti-p21-Antikörper wurde als Abfangreagens verwendet, und biotinyliertes Ras 10 wurde als Nachweisreagens verwendet.
Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. In Plasma, das aus normalen Mäusen entnommen wurde, wurden geringe Mengen an p21 nachgewiesen, was darauf hinweist, dass normales ras p21 normalerweise in Maus-Plasma vorhanden ist.
Höhere Mengen an p21 wurden in Plasma von Mäusen nachgewiesen, die PSV-13-Tumoren und PSV-LM(EJ)-Tumoren trugen. In beiden Fällen überschritten die p21-Mengen die in Plasma, das von normalen Mäusen erhalten wurde, nachgewiesenen p21-Mengen. Diese Immunoassay-Ergebnisse stehen mit den Ergebnissen, die bei den in Beispiel 2 besprochenen biochemischen Analysen erhalten wurden, insofern im Einklang, als sowohl normale als auch aktivierte ras-p21-Proteine unter Verwendung des Immunoassays dieser Erfindung nachgewiesen wurden.
Diese Ergebnisse waren überraschend und unerwartet, da sie nicht nur zeigten, dass ras-p21-Protein in das Kreislaufsystem von Mäusen ausgeschüttet/freigesetzt werden kann, sondern die ausgeschütteten/freigesetzten p21-Proteine unter Verwendung des Immunoassays dieser Erfindung im Plasma von Mäusen nachgewiesen wurden.
Ein weiterer Immunoassay wurde durchgeführt, wobei die gleichen Abfang- und Nachweisreagentien verwendet wurden, wie sie oben erwähnt sind, um die relativen Mengen von ras-p21-Protein im Plasma von Mäusen, die PSV-LM(EJ)- und NIH3T3-(SW480)-Tumoren tragen, nachzuweisen.
4 stellt die aus diesem Immunoassay erhaltenen Ergebnisse dar. Sie zeigt, dass Plasma aus den Mäusen, die PSV-LM(EJ)-Tumoren trugen, höhere Mengen an ras-p21-Protein enthielt als Plasma aus den Mäusen, die NIH3T3-(SW480)-Tumoren trugen. Diese Ergebnisse standen mit den in Beispiel 2 oben dargestellten biochemischen Ergebnissen im Einklang. 4 zeigt auch, dass ras p21 unter Verwendung des Immunoassays dieser Erfindung in Seren von F1-Mäusen nachgewiesen wurde.
Beispiel 7 (Vergleichsbeispiel)
Bewertung von Human-Serum und -Plasma im Hinblick auf die Anwesenheit von ras-p21-Protein
Vier Human-Serumproben (A, B, C und D) und vier Human-Plasmaproben (A, B, C und D) wurden von denselben vier Individuen erhalten, die alle normal waren. Diese Proben wurden mit panreaktiven polyklonalen Kaninchen-Anti-p21-Antikörpern als Abfangreagens und biotinyliertem Ras 10 als Nachweisreagens umgesetzt.
5 stellt die Ergebnisse sowohl für Plasma als auch für Serum dar. 5A stellt die Ergebnisse für Plasma dar. In den als A, B, C oder D identifizierten Human-Serumproben wurde kein ras-p21-Protein nachgewiesen. Es ist nicht klar, ob eine erhöhte Assayempfindlichkeit den Nachweis von ras in Serum unterstützen könnte. In den als A, B, C und D identifizierten Human-Plasmaproben wurden jedoch verschiedenen Mengen ras-p21-Protein nachgewiesen.
Um die Anwesenheit von ras-p21-Protein in den Plasmaproben und die Abwesenheit von ras-p21-Protein in den Serumproben zu bestätigen, wurden eine Immunokonzentration und ein Western-Blot wie unten beschrieben durchgeführt.
Die Human-Plasma- und -Serumproben A, B, C und D wurden mit einem panreaktiven polyklonalen Kaninchen-Anti-p21-Antikörper inkubiert, um ras-p21-Protein aus jeder Probe einer Immunokonzentration zu unterziehen. Das Verfahren war dasselbe wie das in Beispiel 1 beschriebene, außer dass ein panreaktiver polyklonaler Kaninchen-Anti-p21-Antikörper anstelle eines panreaktiven monoklonalen Maus-Anti-p21-Antikörpers verwendet wurde.
Nach der Immunokonzentration wurde der Immunkomplex, der aus panreaktivem polyklonalem Kaninchen-Anti-p21-Antikörper und ras-p21-Protein bestand, mit einem Komplex aus Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin und Protein A umgesetzt und eine Stunde lang inkubiert. Das resultierende Material wurde unter Bildung eines Sediments zentrifugiert, das mehrmals mit RIPA gewaschen wurde. Eine letzte Waschung wurde unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat-Reduktionspuffer durchgeführt, der 2-Mercaptoethanol (2-ME) enthielt. Das resultierende Material wurde 5 Minuten auf 100°C erhitzt, so dass eine Flüssigkeit entstand, die ras-p21-Protein enthielt. Die Flüssigkeit wurde auf ein 12,5%iges Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Zelluläre Proteine, die durch die Behandlung mit dem Reduktionspuffer und das Erhitzen in die Kulturflüssigkeit abgegeben worden waren, wurden nach dem Molekulargewicht aufgetrennt, indem man einen elektrischen Strom durch das Gel fließen ließ. Dann wurden die Proteine elektrophoretisch auf Nitrocellulosemembranen übertragen, die mit PBS, das 5% Rinderserumalbumin enthielt, blockiert worden waren.
Die mit ras-p21 imprägnierten Nitrocellulosefilter wurden eine Stunde lang mit dem panreaktiven monoklonalen Anti-p21-Antikörper und einer negativen Kontrolle, bei der es sich um RPC-5 (ein Myelom-Protein) handelte, inkubiert.
Dann wurden die Nitrocellulosemembranen dreimal mit PBS-NP-40-Lösung gewaschen. Diese Membranen wurden mit einem an Meerrettich-Peroxidase gekoppelten Anti-Maus-Immunglobulin inkubiert. Die Membranen wurden dreimal mit PBS-NP-40 gewaschen und mit 4-Chlor-1-naphthol als Substrat inkubiert, um die Reaktion zu beenden.
Die biochemischen Ergebnisse zeigten, dass ras-p21-Protein aus den vier als A, B, C und D bezeichneten Human-Plasmas immunkonzentriert und durch Western-Blot sichtbar gemacht wurde. Diese biochemischen Ergebnisse bestätigten, dass ras-p21-Protein in dem oben beschriebenen Immunoassay-Format in Human-Plasma nachgewiesen wurde und in den Human-Serumproben kein ras-p21-Protein nachgewiesen wurde.
Beispiel 8 (Vergleichsbeispiel)
Nachweis und Quantifizierung von ras-p21-Protein in drei Maus-Zelllinien, die Human-ras-Gene enthalten
Das in Beispiel 3 beschriebene Immunoassay-Format wurde verwendet, um die Anwesenheit und die Menge von ras-p21-Protein in drei Maus-Zelllinien zu bestimmen, die Human-ras-Gene enthielten. Diese Zelllinien waren die folgenden: 5–2, PSV-LM(EJ) und PSV-13.
Wie oben beschrieben, war das Abfangreagens ein panreaktiver polyklonaler Kaninchen-Anti-p21-Antikörper, und das Nachweisreagens war biotinyliertes Ras 10.
In Beispiel 1 oben besprochene Western-Blot-Untersuchungen zeigten an, dass die S-2-Zelllinie eine geringere Menge an ras-p21-Protein exprimierte als die PSV-13-Zelllinie. Die PSV-LM(EJ)-Zelllinie exprimierte ras-p21-Protein in einer geringeren Menge als PSV-13 und in einer größeren Menge als die S-2-Zelllinie.
6 zeigt Immunoassay-Ergebnisse, die die bei den Western-Blot-Untersuchungen gemachten Beobachtungen bestätigen.
Quantitative Analysen wurden durchgeführt, indem man eine Standardkurve erstellte, wobei rekombinantes Ha-ras-p21-Protein verwendet wurde, das auf Position 12 Arginin enthielt. 7 zeigt die Standardkurve, die erstellt wurde, indem man verschiedene Konzentrationen von rekombinantem Ha-ras-p21-Protein mit immobilisiertem panreaktivem polyklonalem Kaninchen-Anti-p21-Antikörper umsetzte und abgefangenes p21 unter Verwendung eines biotinylierten panreaktiven monoklonalen Maus-Anti-p21-Antikörpers Ras 10 nachwies. Das Immunoassay-Format war das in Beispiel 3 oben beschriebene.
Die erhaltenen Werte der optischen Dichte wurden gegen die Menge des getesteten ras-p21-Proteins aufgetragen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Unter Verwendung dieser Standardkurve wurde bestimmt, dass die S-2-Zelllinie 24,5 pg ras-p21-Protein pro μg Zellprotein enthielt; die PSV-LM(EJ)-Zelllinie enthielt 71,3 pg ras-p21-Protein pro μg Zellprotein, und die PSV-13-Zelllinie enthielt 154,0 pg ras-p21-Protein pro μg Zellprotein. Diese Ergebnisse standen mit der unter Verwendung von Western-Blot-Untersuchungen gemachten qualitativen Beobachtung im Einklang.
Dies zeigt, dass das in Beispiel 3 beschriebene Immunoassay-Format verwendet werden kann, um eine Standardkurve zu erstellen, um die Menge des in einer Probe vorhandenen ras p21 zu quantifizieren.
Tabelle 3 p21-Expression in Tumoren
Beispiel 9 (Vergleichsbeispiel)
Bewertung von normalem Brustgewebe und von Brustkarzinom
Zehn Proben von normalem Brustgewebe und zehn Proben von Brustkarzinom wurden von Dr. Daniel Hayes vom Dana-Faber Cancer Institute, Boston, MA, erhalten. Dr. Hayes erhielt diese Proben von zehn verschiedenen Patientinnen. Diese Proben wurden unter Verwendung des in Beispiel 3 oben beschriebenen Immunoassay-Formats analysiert. Panreaktive polyklonale Kaninchen-Anti-p21-Antikörper wurden als Abfangreagens verwendet, und biotinyliertes Ras 10 wurde als Nachweisreagens verwendet.
Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Die Balken stellen die Menge des exprimierten ras-p21-Proteins in pg p21 pro μg Protein dar. Es wurde gefunden, dass normales Brustgewebe, das in erster Linie aus Fett- und Bindegewebe und sehr wenig Epithel besteht, etwa 9 pg ras p21/μg Protein enthielt, während wenigstens fünf der Brustkarzinomproben mit den Nummern 31, 40, 51, 52 und 70 ungefähr 8 bis 18 pg ras p21/μg Protein enthielten. Von den zehn analysierten Human-Brustkarzinomproben zeigten etwa 80% eine höhere Expression von ras p21 als das normale Brustgewebe.
Beispiel 10 (Vergleichsbeispiel)
Bewertung von Kolonkarzinomproben
Zehn Proben von Human-Kolonkarzinom, die von Dr. James Radosevich, Northwestern University, Chicago, Illinois, erhalten wurden, wurden unter Verwendung des in Beispiel 3 oben beschriebenen Immunoassay-Formats bewertet. Panreaktive polyklonale Anti-p21-Antikörper wurden als Abfangreagens verwendet, und biotinyliertes Ras 10 wurde als Nachweisreagens verwendet.
Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Es wurde gefunden, dass die Menge des ras-p21-Proteins in einem Bereich von etwa 1,0 pg/μg Protein bis etwa 3,5 pg/μg Protein liegt.
Die in Beispiel 10 vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass ras-p21-Protein in Human-Kolonkarzinomproben unter Verwendung des oben beschriebenen Immunoassay-Formats nachgewiesen und quantifiziert wurde.
Beispiel 11 (Vergleichsbeispiel)
Das in Beispiel 3 beschriebene Immunoassay-Format wurde verwendet, um die folgenden Proben in Bezug auf die Anwesenheit von ras-p21-Protein zu bewerten:

(1) Plasma von einer normalen Nacktmaus;
(2) Plasma von Mäusen, die PSV-LM(EJ)-Tumoren tragen;
(3) Plasma von Mäusen, die PSV-13-Tumoren tragen;
(4) Plasma von Mäusen, die NIH3T3 (N-ras) tragen; und
(5) Plasma von Mäusen, die einen NIH-Zip-ras-K-3-Tumor tragen.

Ein panreaktiver polyklonaler Kaninchen-Anti-p21-Antikörper wurde als Abfangreagens verwendet, und als DWP bezeichneter monoklonaler Antikörper wurde als Nachweisantikörper verwendet. DWP bindet spezifisch an ein Epitop von aktiviertem ras-p21-Protein, das Valin auf Position 12 enthält, und bindet nicht an ein Epitop, das Glycin auf Position 12 enthält.
In 10 dargestellte Ergebnisse zeigen, dass biotinyliertes DWP nur mit Plasma reagierte, das von den Mäusen erhalten wurde, die PSV-LM(EJ)-Tumoren trugen. Dies zeigte schlüssig, dass aktiviertes ras-p21-Protein, das Valin auf Position 12 enthielt, in das Plasma von Mäusen, die PSV-LM(EJ)-Tumoren trugen, freigesetzt/ausgeschüttet wurde, und das freigesetzte/ausgeschüttete aktivierte ras-p21-Protein, das Valin auf Position 12 enthielt, unter Verwendung dieses Immunoassay-Formats nachgewiesen werden konnte. Dies stand auch mit den Ergebnissen im Einklang, die durch Western-Blot erhalten wurden.
Beispiel 12 (Vergleichsbeispiel)
Näpfe von Mikrotiterplatten wurden mit einem panreaktiven polyklonalen Kaninchen-Anti-p21-Antikörper beschichtet. Dann wurde das immobilisierte Abfangreagens mit einem rekombinanten p21-Protein umgesetzt, das Glycin, Arginin oder Asparaginsäure auf Position 12 enthielt. Die in diesem Beispiel verwendeten rekombinanten Proteine wurden von Dr. Geoffrey Cooper, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, erhalten.
Der immobilisierte Komplex aus panreaktivem polyklonalem Kaninchen-Anti-p21-Antikörper und ras-p21-Protein wurde mit dem Nachweisreagens umgesetzt, bei dem es sich um monoklonalen Antikörper R256 handelt, der mit Biotin markiert ist. R256 ist oben diskutiert. Die Immunoassay-Ergebnisse zeigten, dass biotinyliertes R256 nur mit dem rekombinanten ras-p21-Protein reagierte, das Arginin auf Position 12 enthält. Es war also möglich, aktiviertes ras p21 unter Verwendung des Immunoassay-Formats dieser Erfindung nachzuweisen. 11 ist eine Graphik, die zeigt, dass R256 nur das rekombinante p21 mit Arginin auf Position 12 nachwies.
Beispiel 13 (Vergleichsbeispiel)
Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, wobei acht verschiedene Zelllinien verwendet wurden, um die Fähigkeit des in Beispiel 3 beschriebenen Immunoassays zum Nachweis verschiedener aktivierter ras-p21-Proteine zu zeigen.
Die folgenden Zelllinien wurden verwendet: (i) Zelllinie AML-1; (ii) Zelllinie T 144-1; (iii) Zelllinie NIH3T3 (Cystein-13); (iv) Zelllinie PSV-13; (v) Zelllinie v-Ha-ras; (vi) Zelllinie A2182; (vii) Zelllinie PSV LM(EJ); und (viii) Zelllinie A 549.
Ein panreaktiver Anti-p21-Antikörper wurde auf Näpfen von Mikrotiterplatten immobilisiert. Nach der Immobilisierung wurde das Abfangreagens mit Lysaten von einer der acht oben beschriebenen Zelllinien inkubiert. Der resultierende Immunkomplex wurde auf die Anwesenheit von ras-p21-Protein getestet, indem man ihn mit einem der verschiedenen unten aufgeführten biotinylierten Antikörper umsetzte: einem panreaktiven monoklonalen Anti-p21-Antikörper (Ras 10), einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-p21-Proteins mit Asparaginsäure auf Position 13 bindet und nicht an ein Epitop mit Glycin auf Position 13 bindet (monoklonaler Antikörper 146), einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-p21-Proteins mit Asparaginsäure auf Position 12 bindet und nicht an ein Epitop mit Glycin auf Position 12 bindet (monoklonaler Antikörper 113), einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-p21-Proteins mit Valin auf Position 12 bindet und nicht an ein Epitop mit Glycin auf Position 12 bindet (DWP), einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-p21-Proteins mit Arginin auf Position 12 bindet und nicht an ein Epitop mit Glycin auf Position 12 bindet (R256), und einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-p21-Proteins mit Serin auf Position 12 bindet und nicht an ein Epitop mit Glycin auf Position 12 bindet (S1107-8.3).
Der monoklonale Antikörper 146 wies spezifisch aktiviertes ras-p21-Protein nach, das Asparaginsäure auf Position 13 enthält und das von der Zelllinie AML-1 exprimiert wurde. 12 zeigt die bei Verwendung des monoklonalen Antikörpers 146 im Immunoassay dieser Erfindung erhaltenen Ergebnisse.
Der monoklonale Antikörper 113 wies spezifisch aktiviertes ras-p21-Protein nach, das Asparaginsäure auf Position 12 enthält und das von der Zelllinie T 144-1 exprimiert wurde.
Der monoklonale Antikörper DWP wies spezifisch ras-p21-Protein nach, das Valin auf Position 12 enthält und das von der Zelllinie PSV LM(E)) exprimiert wurde.
Der monoklonale Antikörper R256 wies spezifisch ras-p21-Protein nach, das Arginin auf Position 12 enthält und das von der Zelllinie A2182 und von der Zelllinie v-Ha-ras exprimiert wurde. Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt.
Der monoklonale Antikörper S1107-8.3 wies spezifisch ras-p21 nach, das Serin auf Position 12 enthält und das von der Zelllinie A549 exprimiert wurde.
Dies beweist schlüssig die Fähigkeit des Immunoassay-Formats der vorliegenden Erfindung zum Nachweis aktivierter ras-p21-Proteine.

Claims

Sandwich-ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) mit monoklonalem Antikörper zum Quantifizieren oder Klassifizieren von aktiviertem ras p21 oder individuellen Harvey-, Kirsten- oder N-ras-Familien von ras-Proteinen in Körperflüssigkeiten, Gewebelysaten oder Zelllysaten, umfassend: (a) Umsetzen der Körperflüssigkeiten, Gewebelysate oder Zelllysate, von denen man annimmt, dass sie ras-p21-Proteine enthalten könnten, mit einem immobilisierten ras-p21-Abfang-Antikörper; (b) Umsetzen des Produkts aus Schritt (a) mit wenigstens einem nachweisbar markierten Antikörper, der gegen andere Epitope als die bereits in Schritt (b) gebundenen gerichtet ist; und (c) Quantifizieren oder Klassifizieren des Produkts von Schritt (b); gekennzeichnet durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die aus den folgenden Gruppen ausgewählt sind: (i) monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-Proteins, das eine Aminosäuresubstitution von Arginin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Serin oder Cystein auf Position 12 aufweist, binden und nicht an ein Epitop binden, das Glycin auf Position 12 enthält; (ii) monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-Proteins, das eine Aminosäuresubstitution von Asparaginsäure oder Valin auf Position 13 aufweist, binden und nicht an ein Epitop binden, das Glycin auf Position 13 enthält; (iii) monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein Epitop eines aktivierten ras-Proteins, das eine Aminosäuresubstitution von Histidin, Lysin, Leucin oder Arginin auf Position 61 aufweist, binden und nicht an ein Epitop binden, das Glutamin auf Position 61 enthält; (iv) monoklonale Antikörper, die gegenüber Harvey-ras-Proteinen reaktiv sind und gegenüber den Familien Kirsten 2A, 2B oder N von ras-Proteinen nicht reaktiv sind; (v) monoklonale Antikörper, die gegenüber N-ras-Proteinen reaktiv sind und gegenüber den Familien Kirsten 2A, 2B oder Harvey von ras-Proteinen nicht reaktiv sind; (vi) monoklonale Antikörper, die gegenüber Kirsten-2A-Proteinen reaktiv sind und gegenüber den Familien Kirsten 2B, N oder Harvey von ras-Proteinen nicht reaktiv sind; oder (vii) monoklonale Antikörper, die gegenüber Kirsten-2B-ras-Proteinen reaktiv sind und gegenüber den Familien Kirsten 2A, N oder Harvey von ras-Proteinen nicht reaktiv sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem nachweisbaren Marker um Biotin handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der nachweisbare Marker ein radioaktives Isotop, ein Enzym, ein fluorogener Marker, ein Chemilumineszenzmarker oder ein elektrochemisches Material ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Körpergewebe, der Zelle oder der Körperflüssigkeit um Blut, Serum, Plasma, Urin, Stuhl, Speichel, Aspirat oder ein Körpersekret handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei dem Körpersekret um Schweiß handelt.