JPH03505250A - 体液および組織におけるｒａｓタンパクの検出、定量および分類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 体液および組織におけるｒａｓタンパクの検出、定量および分類 発明の分野 本発明は体組織液または体液におけるｒａｓｐ２１タンパクの検出、定量および 分類、特に細胞性−ｒａｓｐ２１タンパク全体を同定し、正常型−１突然変異性 −および個々のハーベイ−、キルステンーおよびＮ−ｒａＳ蛋白ファミリイのよ うな個々の成分に定量するだけでなく、正常型および突然変異性ｒａｓタンパク を含む全細胞性ｒａｓの検出および定量に関する。

発明の背景 ハーベイ−、キルステンーおよびＮ−ｒａｓタンパクは免疫学的に関連したタン パクであり、集合的にｐ２１と呼ばれている。それらは、広範囲の有核哺乳類細 胞において発見される細胞遺伝子のｒａｓ蛋白ファミリイの生成物である。ｒａ ｓ遺伝子は、一連の酵素触媒反応により正常細胞を悪性にすることができる遺伝 子変異の通常のターゲットである。ｒａｓ発ガン性は前悪性および悪性細胞の広 いアレイにおいて同定されている。

ｐ２１タンパクは、約２１，０００ダルトンの分子量を有する約１８８乃至１８ ９個のアミノ酸から構成される。ウィルスおよび細胞性ｒａｓ遺伝子は、グアニ ンヌクレオチド（Ｓｃｈｌｏｎｊｃｋ氏他によるＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）　７Ｂ： ５３５５　　（１９７９）　　；Ｐ　ａｐａｇｅｏｒｇｅ氏他によるＪ、　Ｖｌ ｒｏｌ、　４４：５０９　（１９８２）　　；およびＦｉｎｅ氏他によるＣｅ１ ｌ　３７：１５１　（１９８４）　）を限定する細胞膜限定タンパクをエンコー ドしくＷ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｉｎｇｈａ＋１氏他にょるＣｅ１ｌ　１９　；　１００ ５　（１９８０）　）　、本質的なＧＴベース活性を所有している（ＭＣＧｒａ ｔｈ氏他によるＮａｔｕｒｅ　３０１：８４４　　（１９８４）　　；Ｓ　ｗｅ ｅｔ氏他ｉこよるＮａｔｕｒｅ　３１１：２７３　　（１９８４）　　；　Ｇｉ ｂｂｓ氏他によるＰＮＡＳ　　（ＵＳＡ）８１：５７０４　　（１９１１１４） および＆１ａｎｎ氏他によるＰＮＡＳ　８２：３７Ｂ　　（１９１１５）　）。

レシピエンドとしてＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用したＤＮＡ介在トランスフェクショ ン実験は、ハーベイ（Ｈａ−ｒａｓ）およびキルステン（Ｋｉ　−ｒａｓ）肉腫 ビールスのｒａｓ遺伝子に類似している活性化された変形遺伝子の７７ミリイを 同定する。Ｎ　ｒａｓと示されたｒａｓファミリイの第３のメンバーは同定され るが、レトロビアル（ｒｅｔｒｏν１ｒａｌ）複製を有することは認められてい ない。活性化された（突然変異の）　ｒａｓ遺伝子は位置１２．１３または６１ でタンパク中にアミノ酸置換を有するそれらの正常ホモログと構造的に異なる（ Ｔａｂｌｎ氏他によるＮａｔｕｒｅ　３００：１４９　（１９ｇ２）　　；　Ｂ ｏｓ氏他によるＮａｔｕｒｅ　３１５ニア１Ｂ　（１９８５）　　；　Ｙｕａｓ ａ氏他によるＮａｔｕｒｅ　３０３ニア７５−７７９　（１９８３）；　Ｄｅｒ 氏他によるＣｅ１ｌ　４４：１８７−１７８　　（１９８８年１月１７日））。

Ｔａｐａｒｏｗｓｋｙ氏他によるＢａｎｂｕｒｙ　Ｒｅｐｏｒｔ、１４：１２３ −１３３（１９８３）　ｃＩｔｅｄ　１ｎ　Ｃｈｅｍ、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　Ｃ Ａ　１００（１）＋１４２５ｎは、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）からバリン（ｖ ａｌｌｎｅ）へのＨｒａｓｐ２１のＮターミナス（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）からの残 基１２における変化が、変形タンパクに正常なタンパクを変化するのに十分であ ることを示唆している。

Ｓｈ１ｗｉｚｕ氏他によるＮａｔｕｒｅ　３０４：４９７−５００　（１９８３ ）　ｃｉｔｅｄ　ｊｎＣｈｅＩｌ、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　９９（１９）：１５３ ０９３Ｂは、ｖ−Ｘｉ−ｒａＳ遺伝子の人間の肺ガン細胞ラインｃａｌｕ−１ホ モログにおけるアミノ酸１２におけるシスチン残基の存在を示唆している。Ｆ　 ａｓａｎｏ氏他にょるＪ、）１ｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、２（２）：１７ ３−１８０　、ｃｉｔｅｄ　ｉｎ　Ｃｈｅｍ、Ａｂｓｔｒａ−ｃｔｓ　ＣＡ　９ ９（１９）：１５３０８０ｖは、Ｔ２４　Ｈ−ｒａｓ−１生物物がハーベイ肉腫 ビールスによってエンコードされたｖ−）１−ｒａｓ　ｐ　２１変形タンパクと ほぼ同一であることを示唆している。最近の報告は４０乃至５０％の人間のコロ レフタル（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ）ガンにおける活性化されたｒａｓｐ２１の存 在およびアデノマス（ａｄｅｎｏｍａｓ）と呼ばれるコロンのブレネオプラスチ ック（ｐｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）レジョンズ（Ｉｅｓｉｏｎｓ）　　（Ｂｏ ｓ氏他によるＮａｔｕｒｅ　３２７：２９３（１９８７）、　Ｆｏｒｒｅｓｔｅ ｒ氏他によるＮａｔｕｒｅ　３２７：２９９（１９１１７）およびＶｏ１ｇｅｌ ｓｔｅｉｎ氏他によるＮＥＪＭ　３１９：５２５　（１９８８年９月））を示し ている。最近の研究はまた２０乃至３０％の肺ガンにおける（Ｒｏｄｅｎｈｕｉ ｓ氏他によるＣａｎｃｅｒ　Ｒａｓ、、４ｇ：５７３ｇ（１９１ｉ１８）　）お よびパンクリエイチック（ｐａｒ＋ｃｒｅａｔｉｃ）ガンの９０％を越える（＾ １ｍｏｇｕｅｒａ氏他によるＣｅ１ｌ　５３：５４９（１９８ｇ）　）活性化さ れたｒａｓ遺伝子および突然変異ｒａｓ　ｐ　２１タンパクの表示を示している 。急性骨髄性白血病のような白血病のある形態およびプレロイケミツク（ｐｒｅ ｌｅｕｋｅｍｌｃ　）状懸において、活性化されたｒａｓｐ２１タンパクが記載 されている。

これらの活性化されたｒａｓ遺伝子および突然変異タンパク形成された細胞ライ ンにおいて認められる。Ｇａｌｂｋｅ氏他による（Ｎａｔｕｒｅ　３０７：４７ Ｂ、　１９ｇ４）は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者からの骨髄細胞中の変 形Ｎ　ｒａＳ遺伝子を説明した。対照的に・同じ患者のフィブロブラスト（ｆｉ ｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞からのＤＮＡは変形しなかった。

正常な活性化されない形態のタンパク中のｐ　２１　ｒａｓタンパクは位置１２ および１３においてグリシンＣｇ＋ＶＣＩｎｅ　）アミノ酸を、また位置６１に おいてグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　）アミノ酸を含む。正常細胞中に認め られるｐ　２１　ｒａｓタンパクはアミノ酸シーケンス５乃至１９として主要な アミノ酸構造、　８　Ｌｙｓ　Ｉｎｅ−１ｅｕｃｉｎｅ−ｖａｔ　ｆｎｅ−ｖａ ｌ　１ｎｅ−ｖａ　Ｉ　ｉｎｅ−ｇ　Ｉｙｓｉｎ−１ｙｓ　Ｉｎｅ−ｓｅｒｉｎ ｅ−ａｌａｎｉｎｅ−１ｅｕｃｉｎｅ１９を有する〇従来の報告は、イースト（ ｙｅａｓｔ）および悪性細胞における正常および活性化された発ガン性（突然変 異）ｒａｓｐ２１タンパクに反応する複数のラットモノクローナル（ｍｏｎｏｃ ｌｏｎａｌ）抗体を示している（Ｒｏｂ１ｎｓｏｎ氏他によるＢｒ、Ｊ、Ｃａｎ ｃｅｒ　５４：８７７−８８３（１９８Ｂ）、　Ｆｕｒｔｈ氏他によるＪ、ＶＩ ｒｏｌ、４８：２９４（１９８２））。

ＥＰＯ特許第８５１１１８２４．０号明細書（１９８８年４月１６日）および欧 州特許第８５１１１８２３．２号明細書（１９８６年３月２６日）は、タンパク １６と１７との間に挿入されたシスチン残基を含み、さらに位置１２にアミノ酸 置換を含むｒａｓｐ２１タンパクのアミノ酸５乃至１７からなるポリペプチドを 示している。アミノ酸バリン（ｖａｌｉｎｅ）　、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）　、 アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）、シスチン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）　、アスパー チック（ａｓｐａｒｔｌｃ）酸またはアラニン（ａｌａｎｊｎｅ　）は位置１２ に挿入された。これらのポリペプチドはキャリアタンパクに結合され、ここで論 じられた抗体の生成を誘発するために免疫性遺伝子（ＩＩｌ＋ａｕｎｏｇｅｎｓ ）として使用された。この参照文献はさらに、ｐ２１遺伝子生成物における単一 のアミノ酸の差のためにｒａｓ発ガン遺伝子をそれらの正常な複製から区別する ことができる抗体が医療における悪性細胞の診断検出に適用可能なことを示し、 さらにそれは位置１２または６１における単一のアミノ酸の差を有するミュータ ント（ｍｕｔａｎｔ）　ｒａｓ　ｐ　２１と正常なｒａｓｐ２１を区別すること ができるこのような抗体がイミュノフルオレセンス（１ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅ ｓｃｅｎｃｅ）　、イミュノベロキシダスステイニング（ｉａｍｕｎｏｐｅｒｏ ｘｉｄａｓｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　）　、イミニノブレシピテイシシン（ｉｍａ ＋ｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔ１ｏｎ　）　、　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａまたはウェ スタンプロティング（ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｌｎｇ）技術のような標準的 な技術によってｒａｓ発ガン遺伝子生成物を検出するために使用されることを示 している。

Ｃａｒｎｅｙ氏他によるＰ　ＮＡ　Ｓ　（Ｕ　Ｓ　Ａ）　８３ニア４８５−７４ １ｔ９　（１９８Ｂ）およびＥＰＯＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、０１９００ ３　　（１９８８年８月６日出願）は活性化されたｒａｓタンパクに特有のモノ クローナル抗体を示している。このモノクローナル抗体は、位置１２においてグ リシンの代わりにバリンをエンコードする突然変異のｒａｓ遺伝子のアミノ酸に 対応した対称的なペプチドに対して生成されたｏ　ＥＰＯＰｕｂｌｉｃａｔｉｏ ｎ　Ｎｏ、０Ｌ９００３はモノクローナル抗体が通常の診断方法によって主要な および転移した病巣の診断に有効であり、また診断はまた人間の血液サンプルま たは他の体液の分析のような通常のｉｎ　ｖ１ｔｒｏ診断方法によって行われ得 ることを示している。Ｃａｒｎｅｙ氏他によるＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐ、Ｍｏｌ　、 Ｃｅ１１、Ｂｉｏｌ、、Ｎｅｖ　Ｓｅｒ、１９８５　ｃｉｔｅｄ　ｉｎ　Ｃｈａ ｔｓ、＾ｂｓｔｒａｃｔｓ、ｃＡ１０４：ｌθ８５７０６は、人間のガンに関し て免疫反応を示すｒａｓ関係対称ペプチドに対して発生されたモノクローナル抗 体を記載している。Ｃａｒｎｅｙ氏他は、位置１２においてグルタミン酸、アル ギニンまたは）くリンのアミ酸置換を含むう対称ペプチドに対して発生された一 連のモノクローナル抗体を報告した（＾Ｂｏｏｋｏｒ　Ａｂａｔｒａｃｔｓ　ｆ ｒｏａ　ｔｈｅ　３ｄ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｎ　Ｏｎｃｏｇｅｎ ｓ　ｈｅｌｄ　ａｔ　ＨＯＯＤ　ＣｏＣｏ１１ｅ、Ｆｒｅｄｒｉｃｋ、ＭＤ、１ ９８７年７月７−１１日）。

種々の方法によって発生された別のモノクローナル抗体はまた種々の形態のｒａ ｓ　ｐ　２１タンパクと反応することが報告されティる。Ｈａｎｄ氏他によるＰ ｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１　、ＬＩＳＡ、ｖｏｌ　、ｌｉｌ　、ｐＬ５ ２２７−５２３１（１９８４）　　；　Ｔｈｏｒ氏他によるＮａｔｕｒｅ、Ｖｏ ｌ、３１１．ｐｐ、５Ｂ２−５６５（１９８４）　　；　Ｖｏｎｇ氏他によるＣ ａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、４Ｂ、ｐｐ。

６０２９−６０３３　（１９８Ｂ）およびＴａｎａｋａ氏によるＰｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｖｏｌ、８２．ｐｐ３４００−３４０４（１ ９８５）。

いくつかの科学報告書は、正常細胞が位置１３にグリシンを持つｒａｓタンパク を含むことを示している。

１９８５年にはＢｏｓ氏他による文献（Ｎａｔｕｒｅ　３１５４２Ｂ　１９８５ 　）は、ＡＭＬ患者の細胞から分離されたＤＮＡがＮ１）１３Ｔ３細胞を変形す ることができることを明らかにした。この結果はガン細胞の存在を表し、これを 高く示唆するものである。これらの変形遺伝子は活性化されたｒａｓ遺伝子であ ることが示された。対照的に、正常部分からのＤＮＡは変形しないものであり、 したがって活性化されたＮ　ｒａｓを含んでいなかった。これらの実験者は、オ リゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｌｄｅ　）プローブを使用してミ ューティジョン（ｍｕｔａｔ　１ｏｎ）の存在に対して活性化されたＮ　ｒａｓ 遺伝子を分析し、活性化されたＮｒａｓ遺伝子が結果的にタンパクの位Ｗ１３で アミノ酸置換になるミューティジョンを含むことを発見した。位置１３における これらのミューティシランは、正常なアミノ酸グリシンでなくアスバーチック（ ａｓｐａｒｔ　ｉｃ）酸またはバリンのいずれかであることが示された。

１９８７年の２つの報告書は、位置１３にアルギニンを持つｒａｓミューティジ ョンを説明した。Ｎｌｔｔａ氏他は、ヒトの直腸ガンから分離された活性化され たＮｒａｓｐ２１の位置１３におけるグリシンとのアルギニンのアミノ酸置換を 示している。旧ｒａｉ氏他による報告書（Ｎａｔｕｒｅ　３２７：４３０　１９ ８７年）は、ミニロブイスプラスチック（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ　） 症候群を持つ患者からの骨髄細胞における活性化されたＮ　ｒａＳ遺伝子を示し ている。旧ｒａｔ氏他により成された観察は、位置１３のミューティシランを持 つ活性化されたＮ　ｒａｓ遺伝子の存在が白血病の初期段階において重要である ことを示唆している。

Ｅ、Ｌｕ１氏他による報告書（Ｎａｔｕｒｅ　３３０：１ｇ６．１９８７）は、 患者が急性白血病に進む１．５年前にミニロブイスプラスチック病を持つ患者の 中のｒａｓｐ２１の位置１３のアスパーチック（ａｓｐａｒｔｉｃ）酸ミューテ ィシランの存在を表した。したがってモノクローム抗体を有する位置１３のミュ ーティシランを持つ活性化されたｒａｓタンパクの存在に対してミニロブイスプ ラスチック症候群を持つ患者をスクリーンすることは、ミニロブイスプラスチッ ク病を持つどの患者の急性白血病が発達する危険性が高いかを予測するのにを効 な試験である。

特に、Ｗｏｎｄｅｒ−Ｆｉ　Ｉ　Ｉｐｏｖｉｃｚ氏他は、ヒトのＴ細胞ノンホジ キンリンフｔ−７（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ　ｌｙｍｐｈｏａ＋ａ）中の活 性化さレタＮｒａｓ遺伝子の存在を報告した（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ｐｐ、４５７ −４８１゜Ｖｏｌ、ｌ、Ｎｏ、４−（１９８７）　、これらの研究は位置１３で のグリシンとのシスチンの置換を表した。

報告書は、Ｈ，ＫｉおよびＮｒａｓｐ２１の１８８−１８９のアミノ酸シーケン スが発達中にかなり保存されることを示唆している。しかしながら、Ｈ，Ｋｉお よびＮｐ２１タンノくりの間の最も重要な相違はｐ２１タンパクのカルボキシ（ ｃａｒｂｏｘｙ　）端部に配置された１５−２０のアミノ酸を有するセグメント において局部化される（Ｔａｐａｒｏｖｓｋｙ氏他によるＮａｔｕｒｅ　３００ ニアＢ２（１９８２））。

更に、ＭｃＧｒａｔｈ等［Ｎａｔｕｒｅ、３０４：５０１−５０６．　（１９８ ３）］及びシミズ等［Ｎａｔｕｒｅ、　３０４　：４９７−５００　、　（１９ ８Ｂ）コは、Ｋｉ遺伝子がＫ１４Ａ及びＫ１４Ｂとして言及される２の別個のタ ン、（りをエンコードできる能力を有することを示した。Ｋ１４Ａ及びＫ１４Ｂ の用語は、Ｋ１２Ａ及びＫ１２Ｂと相互交換的に用いられる。この変化性領域は 、ｒａｓ　ｐ２１のＣ−末端のアミノ酸１６０−１８０の間に存在するので、特 にＨ％　Ｋ　ｌ　４　Ａ　ｓ　Ｋ　ｉ４Ｂ、及びＮモノクローナル抗体を発生す ることが理論的に゛　可能であるからである。報告が急性骨髄性白血病のＮ　ｒ ａｓ遺伝子のような特定ｒａｓ遺伝子の活性［Ｂｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕ ｒｅ　３１５ニア２Ｂ（１９８５）］及び特定Ｈ−ｒａｓ遺伝子の過剰発現［５ ｐａｎｄ　１ｄｏｓｅｔ　ａｔ、、＾ｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４＋２６ ９（ｌＨ４）］が特定の型の癌（胸の癌）と関連するのがしばしばであることを 示しているからである。

欧州特許出願８８１０７２４４号は、１９８６年１２月３日に公開され、ＨＮ　 　　　４ＫＡ、及びｒａｓ　　　　タ＞ｔ＜り族。

ｒａｓ　　ｓ　ｒａｓ　　、ｒａｓ　　　　　　　　４ＫＢ変化性領域から由来 するアミノ酸配列を存するポリペプチド、これらのポリペプチドがイムノゲンキ ャリアに共有結合的に付いたイムノゲン性組成物、ポリペプチド配列が由来する ｒａＳ腫瘍原にこれらの抗体が特異的であるようなイムノゲンから生産される抗 体、及びこれらの抗体を個々のｐ２１　ｒａｓ腫瘍原族から識別するために用い るイムノアッセイを開示する。

開示されたペプチド構造は、ｐ２１　）１　ｒａｓの１７１−１８８及び１７０ −１８９　、ｐ２１　Ｎ　ｒａｇの１７０−１８８　、ｐ２１　Ｋｉ４＾ｒａｓ の１７１−１８［１、及びｐ２１　Ｋ１４Ｂ　ｒａｓの１７−１８５に対応する 。抗体は沈殿しないようにみえる。

米国特許第４，５３５．０５８号（発行１９ｇ５，８，１３、Ｖｅｌｎｂｅｒｇ 　ｅｔａｌ、）は、タンパクの位置１２を跨がってｒａＳｐ２１タンパク又はペ プチドの変形型にモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ技術を用いる一 般的概念を開示する。特に、注目すべきは、４欄６−１５行、１２欄３３行から １３欄２９行、及び１４欄４０行から１６欄２２行である。

米国特許第４．８９９．８７７号（発行１９ｇ７．ＩＯ，１３、Ｃｌ１ｎｅ　ｅ ｔ　ａｌ、）は、ヒトの腫瘍を検出する方法及び組成物を開示する。

レトロビールス腫瘍原に存在するＲＮＡのペプチド発現生成ｉ及びｒａｓＨａオ リゴペプチドである。この文献は、これら、）７、ブチニック　オリゴペプチド が適当なキャリアにカップリングすることによって抗体形成を誘起するために用 いられることをさらに開示する。開示された方法は、悪性細胞の存在可能性の診 断としてｍＲＮＡ又はその発現生成物のような細胞状生成物にたよるものである 。

タナ力等［ＰＮＡＳ　８２：３４００　（１９１１１５）コは、ｒａｓ　ｐ２１ ｓの各種の部分に対応する各種の合成ペプチドへの一連のラビット血清の発生を 報告した。タナ力等は、ｖ−Ｈａ−ｒａｓのアミノ酸１６０−１７９に対応する ペプチドへのラビット血清の製造を報告した。抗−［）２１血清は、ラビット血 清を親和性精製し、生化学的アッセイでその特異性を評価して調製された。然し 、これらの試薬の特異性は疑問である。

５ｒｉｖａｓｔａｖａ　ｅｔ　ａｌは、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５（１１）：３３１６（１９８５）で、タンパクの 各種セグメント、特にＨｒａｓ　ｐ２１のアミノ酸１８１−１７８に対応するセ グメントに対応する合成ペプチドへの一連のラビット　ポリクローナル血清を報 告した。

テラハラ等は、Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　（Ｇａｎｎ）　７７ ：５１７−５２２（１９８６）で、シーブ抗−１）２１抗体がｖ−Ｈａ−ｐ２１ の位置１８０−１７９に対応する合成ペプチドに対して発生することを開示した 。

Ｂｌｚｕｂ　ｅｔ　ａｌ、は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｌ：１３１−１４２（１９８ ７）で、マウス、ラット及びラビットの抗血清をＨ，Ｋｉ及びＮ　ｒａｓ変化性 領域の各種のペプチドに育成した。この報告に記載された、Ｈｐ２１のアミノ酸 １７１−１８９に対応するペプチド又はに１４Ｂ　ｐ２１のアミノ酸１７１−１ ８６に対応するペプチドに対して育成された親和性精製ラビット血清であった。

この報告によると、ｒａｓ　ｐ２１ｓの追加の抗体が、Ｎ、　　Ｃ，１，レボジ トリ（Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ１＾５ｓｏｃ、Ｉｎｃ、、　Ｂｅｔｈｅｓ ｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）で入手可能である。ビズブ等の報告の指摘した抗血 清は、Ｎ、　　Ｃ，１，で入手可能な抗体がｒａｓ　ｐ２１ｓのアミノ酸配列１ ５７−１１！Ｏに関連するペプチド構造に対して育成された。

Ｈａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、は、ＪＮＣｌ、　７９（１）：　５９−６５　（Ｊｕｌ ｙ　１９８７）で、モノクローナル抗体Ｙ１３−２５９を用いる直接結合液体競 合試験、及び特異ｒａｓポインドームティテッド腫瘍原又はプロト−腫瘍原の同 定のためのｃＤＮＡプローブと提携したイムノヒストケミカルアッセイがヒト癌 腫及び良性障害のｒａｓ　　ｐ２１の定量化の可能性ある手段であり得ることを 開示した。モノクローナル抗体［Ｆｕｒｔｈ　ｅｔ　ａｔ、、　ＪＪｉｒｏｌ、 　４３：２９４−３０４　（１９ｇ２）で議論されている］は、ｖ−Ｈａ−ｒａ ｓ、　ｐ２１のネイティブフオームに対して発生したラットモノクローナルであ る。

同様に、０ｈｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｔ、は、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４ ７：１４１３−１４２０　（１９Ｂ？）で、モノクローナル抗体を用いるイムノ アッセイ、及びその場でのハイブリダイゼーションによって定められたヒト胃腺 癌のｃ−Ｈａ−ｒａｓ　ｐ２１の強化発現を開示する。用いられたモノクローナ ル抗体の特異性は疑問である。

Ｃａｒｕｓｏ　ｅｔ　ａｌ、は、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３８：５８７ −５９５　（１９８８）で、上述したＹ１３−２５９、及びＨａ−ＭｕＳＶ−エ ンコードｒａＳｐ２１を選択的にイムツブレシピテートしたラットモノクローナ ルであるＹ１８−２５９を用いて噴孔類細胞のｒａｓ　ｐ２１の定量分析を開示 する。

Ｎ１１ａｎ　ｅｔ　ａｌ、は、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ＞　８２ニア９２４−７９２８ 　（１９８５）で、尿中の腫瘍原関連タンパクを検出するための抗ペプチド抗体 の使用を開示している。腫瘍原関連タンパクの増加した水準が新形成及び妊娠中 に認められた。ペプチドフラグメントが選択された。その腫瘍原ファミリー・・ ・ｓｌｓ　、　ｒａｓ及びＹｅｓ・・・の高度保存領域を代表するからである。

ｒａｓベブタイドは、ｖ−）１ａ−ｒａｓ又はｖ−Ｋｉ−ｒａｓでエンコードさ れたｐ２１でオートフォスフォリル化されたスレオニン残基から下流の３７−６ ９アミノ酸に位置するＨａ　ｒａｓ配列であった。２１，０００ダルトンタンパ クの検出が報告された。然し、このタンパクがｒａｓ関連タンパクであるかどう かは、使用した試薬の活性が疑問であるために明らかではない。

国際公開番号νＯ８５１００８０７（１９８５，２，２８公開）のＰＣＴ出願は 、オンコブロチインに対するポリペプチド誘導モノクローナル抗体の製造、及び オンコブロチインの存在試験への診療系におけるその使用を開示している。

発明の要約 この発明の主題は、体液、組織もしくは細胞の全細胞ｒａｓｐ２１、活性ｒａｓ 　ｐ２１．またはｒａｓタンパクの個々のＨａｒｖｅｙ　５Ｋｉｒｓｔｅｎ　ｓ もしくはＮ−ｒａｓファミリーの検出、定量または分類のための免疫検定であっ て、 （ａ）　ｐ２１タンパクを有すると推定される体液、組織または細胞を固定化ｒ ａｓ　ｐ２１捕獲試薬と反応させる工程であり、前記試薬が、（１）抗−ｐ２１ 汎（ｐａｎ）反応性抗体、（１１）第１２位置（ｐｏｓｉｔｏｎ　１２）にアル ギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリンまたはシスティンのアミノ酸置 換を有する活性「ａＳタンパクのエピトープに特異的に結合し、かつ第１２位置 にグリシンを含むエピトープには結合しないモノクローナル抗体、（１１ｉ）第 １３位置にアスパラギン酸または１＜リンのアミノ酸置換を有する活性ｒａｓタ ンパクのエピトープに特異的に結合し、かつ第１３位置にグリシンを含有するエ ピトープには結合しないモノクローナル抗体、（ｉｖ）Ｍａ１位置にヒスチジン 、リシン、ロイシンまたはアルギニンのアミノ酸置換を有する活性ｒａｓタンパ クのエピトープに特異的に結合し、かつ第６１位置にグルタミンを含有するエピ トープには結合しないモノクローナル抗体、（ｖ）　Ｈａｒｖｅｙ　ｒａｓタン パクに反応し、かつ「ａｓタンパクのＫｉｒｓｔｅｎ　２Ａ　、２ＢもしくはＮ ファミリーとは反応しないモノクローナル抗体、（ｖｉ）　Ｎ　ｒａｓタンノく りに反応し、かツｒａＳタンパクのＫｉｒｓｔｅｎ　２Ａ　、　２ＢもしくはＨ ａｒｖｅｙファミリーとは反応しないモノクローナル抗体、（ｖｉｉ）　Ｋｉｒ ｓｔｅｎ２Ａ　ｒａｓタンパクに結合し、かつｒａｓタンパクのＫｉｒｓｔ６Ｈ ’ｌｆ３、Ｎもしくは）ｌａｒｖｅｙファミリーとは反応しないモノクローナル 抗体、および（ｖｉｉｉ）　Ｈｒｓｔｅｎ　２Ｂ　ｒａｓタンノくりに反応し、 か”）　ｒａｓタンパクのＫｉｒｓｔｅｎ　２＾、ＮもしくはＨａｒｖｅｙファ ミリーとは反応しないモノクローナル抗体からなる群より選ばれる少なくとも１ 種の抗体である工程、（ｂ）工程（ａ）の生成物を、少なくとも１種の検出可能 に標識された抗体と反応させる工程であり、この抗体が、（１）抗−ｐ２１汎反 応性モノクローナル抗体であって、上述の標準条件を用いる、マイクロタイター プレートをベースとするＥＬＩＳ＾で試験する際に、この抗体のウェル当り　１ ないしＬｏｎｇで約１．５ないし約２．５の光学濃度を与える抗体、（ｊｉ）第 １２位置にアルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、もしくはシス ティ°ンのアミノ酸置換を有する、活性ｒａｓタンパクのエピトープに特異的に 結合し、かつ第１２位置にグリシンを含むエピトープには結合しないモノクロー ナル抗体、（ｉｉ＋）第１３位置にアスパラギン酸もしくはバリンのアミノ酸置 換を有する、活性ｒａｓタンパクのエピトープに特異的に結合し、かつ第１３位 置にグリシンを含むエピトープには結合しないモノクローナル抗体、（ｉｖ）第 ６１位置にヒスチジン、リジン、ロイシンもしくはアルギニンのアミノ酸置換を 有する、活性ｒａｓタンパクのエピトープに特異的に結合し、かつ第６１位置に グルタミンを含むエピトープには結合しないモノクローナル抗体、（ｖ）　）Ｉ ａｒｖｅｙ　ｒａｓタンパクに反応し、かつｒａｓタンパクのＫｉｒｓｔｅｎ　 ２Ａ　、　２ＢもしくはＮファミリーには反応しないモノクローナル抗体、（ｖ ｉ）　Ｎ　ｒａｓタンパクに反応し、かつｒａｓタンパクのＫｉｒｓｔｅｎ　２ Ａ　、　２ＢもしくはＨａｒｖｅｙファミリーには反応しないモノクローナル抗 体、（ｖｌｉ）　　Ｋｉｒｓｔｅｎ　２＾ｒａｓタンパクに反応し、かつｒａｓ タンパクのＫｉｒｓｔｅｎ　２Ｂ　、　ＮもしくはＨａｒνｅｙファミリーには 反応しないモノクローナル抗体、および（ｖｉｉｌ）　Ｋｉｒｓｔｅｎ　２Ｂ　 ｒａｓタンパクに反応し、かつｒａｓタンパクのＫｉｒｓｔｅｎ　２＾、Ｎもし くはＨａｒνｅｙファミリーには反応しないモノクローナル抗体、からなる群よ り選ばれる抗体である工程、および （Ｃ）工程（ｂ）の生成物を検出し、定量し、または分類する工程、 を具備する免疫検定である。

図面の簡単な説明 第１図は、前出のサンドイッチ免疫検定の様式を説明する図、 第２図は、この発明の免疫検定を用いる、細胞株ＮＩＨ３Ｔ３およびＮＩＨ３Ｔ ３（Ｓν４８０）より得られた培養液に放出／発散（ｓｈｅｄ）されたｒａｓ　 ｐ２１タンパクの検出を示すグラフ、第３図は、この発明に免疫検定を用いる、 腫瘍を有するヌードマウスの血漿におけるｒａｓ　ｐ２１タンパクの検出を示す グラフ、 第４図は、この発明の免疫検定を用いる、腫瘍を有するＰＶＳ　ＬＭ　（ＥＪ） およびＮＩＨ３Ｔ３（Ｓ、Ｖ４８０）マウスの血漿におけるｒａｓｐ２１タンパ クの別の発現を示すグラフ、第５図は、この発明の免疫検定を用いる、ヒト血漿 中のｒａｓ　ｐ２１タンパクの検出を示すグラフ、第５Ａ図は、この発明の免疫 検定を用いる、ヒト血漿中の「ａｓ　ｐ２１タンパクの検出を示すグラフ、第６ 図は、この発明の免疫検定用いる、ヒトｒａｓ遺伝子を有する３種のマウス細胞 系におけるｒａＳ　ｐ２１タンパクの検出を示すグラフ、 第７図は、ｒａｓ　ｐ２１標準曲線、 Ｎ８図は、この発明の免疫検定を用いる、正常ヒト乳組織（ｂｒｅａｓｔ　ｔｉ ｓｓｕｅ　）およびヒト乳癌のｌＯ検体に検出された「ａｓ　ｐ２１タンパクレ ベルを示す棒グラフであり、各棒は、タンパク４当りのｐｇとして表現されたｒ ａｓ　ｐｇ１の量を表わし、第９図はミこの発明の免疫検定を用いる、ヒト結腸 癌１０検体におけるｒａｓ　ｐ２１タンパクの検出および定量を示す棒グラフで あり、各棒は、タンパク４当りのｐｇとして表現されたｒａｓ　２１の量を表わ し、 第１Ｏ図は、この発明の免疫検定を用いる、腫瘍を有するヌードマウスから得ら れた血漿における、第１２位置にバリンを有する活性ｒａｓ　ｐ２１タンパクの 検出を示すグラフ、第１１図は、この発明の免疫検定を用いる、第１２位置にア ルギニンを有する組換えｒａｓ　ｐ２１タンパクにおける、第１２位置にアルギ ニンを有する活性ｒａｓ　ｐ２１タンパクの検出を示すグラフ、 第１２図は、この発明の免疫検定を用いる、細胞株ＡＷＬ−１から得られる細胞 溶解質における、第１３位置にアスパラギン酸を有する活性ｒａＳ　ｐ２１タン パクの検出を示すグラフ、第１３図は、細胞株Ａ２１８２およびＮ１）Ｉ　ｖ− Ｈ−ｒａｓより得られる細胞溶解質における、第１２位置にアルギニンを有する ｒａｓ　ｐｇ１の検出を示すグラフである。

発明の詳細な記述 本発明は細胞や体組織、或いは血液、血清、血漿、尿、便、唾液または呼気のよ うな体液、並びに汗のような体分泌物中における、ｒａＳｐ２１タンパク（ｒａ ｓ　ｐｇ１　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の検出、定量および分類に関する。

予期し得す且つ驚Ｘべきことに、細胞によって分泌または放出される正常ｐ２１ 　、活性型ｐ２１またはｒａｓファミリー特異性ｐ２１、並びに細胞によつて分 泌または放出されるが細胞膜のフラグメントに結合されたＩ）２１は、細胞性ｒ ａｓと同様に、本発明の免疫検定を用いることにより体組織および体液中におい て検出および定量され得る。ウィルス性および細胞性のｒａｓタンパクは原形質 膜の内面に局在化されていると信じられていたし、また体液中のｒａｓ　２１タ ンパクの検出、定量および分類は、これまで誰によっても明白に示されていなか ったから、この事実は驚くべきことであり、且つ予期し得なかったことである。

全細胞性ｒａｓの用語は、ｐｇ１の細胞質形、ｐｇ１の膜結合形、および／また はｐｇ１の分泌形を集合的に意味する。この中には、（１）正常ｒａｓ　ｐ２１ タンパク、（２）部位１２にバリン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン 酸、システィン、セリンまたはアラニンのアミノ酸置換を有する活性型ｒａｓ　 ｐ２１タンパク、（３）部位１３にアスパラギン酸またはバリンのアミノ酸置換 を有する活性型ｒａｓ　ｐ２１タンパク、（４）部位６１にリシン、ロイシン、 ヒスチジンまたはアルギニンのアミノ酸置換を有する活性型ｒａｓ　ｐ２１タン パク、並びに（５）ファミリー特異的なハーベイ−、キルステンーまたはＮ−ｒ ａｓ　ｐ２１タンパクが含まれる。

ここでは、ＨおよびＨａの略語が、ハーベイ−ｒａｓファミリーを示すために互 換的に用いられる。同様に、ＫおよびＫｉの略語がキルステンーｒａｓファミリ ーを示すために互換的に用いられ、またに２Ａおよびに２Ｂの略語かに４Ａおよ びに４Ｂと互換的に用いられる。

腫瘍原性゛、活性型および突然変異性の語は、互換的に用いられる。

免疫沈殿および免疫濃縮の語は、互換的に用いられる。

抗体の語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはこれらの免疫反応性 フラグメントを意味する。

本発明の実施に適切な抗体には、以下のもの又はこれらと等価のものが含まれる 。

ポリクローナル抗体 正常型および活性型のｒａｓ　ｐ２１タンパクと反応するポリクローナル抗−ｐ ２１パン反応性抗体は、本発明の実施に使用され得る。ポリクローナル抗体を製 造する技術は、当業者には周知である。このような抗体は、精製された細胞性ｒ ａｓ　ｐ２１タンパクまたは組替えｒａｓ　ｐ２１タンパクのような免疫原で、 兎またはヤギを免疫することによって生成される。例えば、バクテリア内で発現 した組替えｐ２１タンパクが使用され得る。

これらの組替えタンパクは、正常型または活性型のペプチド構造を有し得る。部 位１２にアルギニンを有するＥ、Ｃｏ１１．中で発現した組替えｐ２１は、良好 に作用することが分かった。組替えタンパクを製造する技術もまた周知である。

部位１２にアルギニンを有する組替えｐ２１タンパク合成を以下に説明する。

このような合成は、Ｆｅ１ｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃ ｒ１ｎｏｌｏｇｙ＝１）Ｉ）、　１２７−１３６．Ｖｏｌ、１．Ｎｏ、２（１９ １１７）にも記載されている。

部位１２にアルギニンを有する組替えｒａｓ　ｐ２１の合成真正のウィルス性ハ ーベイ−ｒａｓ　ｐ２１の合成を指令するｐｘＶＲで示されるｒａｓ発現ベクタ ーが、以下のようにして構築された。

ウィルス性ハーベイ−ｒａｓ遺伝子がコードするアミノ酸のうち、最初の５個の アミノ酸を除く全てのアミノ酸をコードする７２０塩基対の制限酵素フラグメン トが、標準的な操作によって、バクテリアのシャイン−ダルガノ配列と、これに 続く６塩基対のスペーサ及びウィルス性ハーベイ−ｒａｓの最初の５個のコドン を有する３２塩基対の合成オリゴマーにライゲートされた。この物質に対して、 複製開始部位およびｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子と共にｔａＣプ ロモータを含んだ、ｐＴＲ１３４０由来のプラスミド骨格がライゲートされた。

前記ｐＸＶＲ構築体は、＋ａＣリプレッサーを過剰に産生じてｔａＣプロモータ を一部抑制し、それによって細胞の生活力をを維持するのｐ２１の合成を誘発す るイソプロピルチオ−Ｂ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）と共にインキュベート した。

より詳細には、Ｅ、Ｃｏｌ　ｉ　、は＾５９０での光学密度（０，Ｄ、　）が０ ．２５になるまで成長される。５Ｍａ＋のＩ　ＰＴＧの添加によって、１）２１ が誘導される。１時間後、Ｅ、Ｃｏｌ　ｉ　、は遠心分離によって回収される。

この細胞ベレットは、ｐＨ７，４のライシス緩衝液（２５ｄ　ｔｒｉｓ−ＨＣＬ 　、　０．７ｍＭ　Ｎ　ａ　２　ＨＰＯ４、５５Ｍ　ＭＣＩ　、　０．１４Ｍ　 ＮａＣｌ、　５ｉＭ　ＥＤＴＡ、　１０１ｆ１０１ｆｉｌＩＩ　、　１％Ｔｒｉ Ｌｏｎ　Ｘ−１００、２５％スクロース及びｌｌ１ｇ／ｍｌ　１ｙｓｏｚｙＩＩ ｌｅ　）中に再度懸濁され、渦動された。この物質を２回だけ凍結／融解し、こ の抽出物をＤＮａｓｅと共にインキュベートし、次いで１０．０００Ｘ　ｇで１ ５分間遠心した。このペレット・を１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中で洗浄し 、２０１ｍ）１ＭＥＳ　２（Ｎ−モルホリンエタンスルホン酸）中の３．５Ｍグ アニジン塩酸塩５０μ（１（ｐＨ７，０）に再度懸濁し、遠心分離によって粒状 物を除去した。

以下に、部位６１にロイシンを有する組替えｐ２１　　（これはパン反応性ポリ クローナル抗体の生成にも使用され得る）の合成を説明する。

部位６１にロイシンを有する組替えタンパクの合成Ｍ１３ベクター中における完 全な長さのヒトｒａｓｕ／ハーベイｃＤＮＡクローンを用いることにより、Ｄｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ、ｐ、１６７−１７６、Ｖｏｌ、４４（Ｊａｎｕａ ｒｙ　１７．１９８Ｂ）に記載されているイン・ビトロ突然変異によって、適切 なコドン８１ｆｔ！換が誘導される。

イン・ビトロ突然変異は、タンパクの機能部位を決定し、生化学的および生物学 的活性に関連付けるために広く用いられている。ｒａｓ発現ベクターは、上記の 方法を用いて構築される。この計画は、バクテリア中で完全なｒａｓタンパクを 産生ずるために、Ｊ、Ｐ、ＭｃＧｒａｔｈ、Ｎａｔｕｒｅ　３１０：８４４．１ ９８４およびＪ、Ｃ。

Ｌａｃａｌ、ＰＮＡＳ　８１：５３０５．１９８４に記載された計画に類似して いる。

モノクローナル抗体 ハイブリドーマ方法論およびスクリーニングプロトコールは、以下のサブセクシ ョン（ｅ）に記載される。これらの方法は、キャリアタンパクに結合した以下に 記載のペプチドを用いることにより、以下に記載の抗体を生成するために用い抗 −ｐ′！１パン反応性モノクローナル抗体は、ｌＨ７年７月８日に出願された同 時係属出願節０７１．１７５号の主題を構成するもので、該同時係属出願の開示 内容はこの明細書中に参照として組み込まれる。その中に記載されている抗−９ ２１パン反応性モノクローナル抗体は、部位１２において、正常型Ｈａ−ｒａｓ 　ｐ２１タンパク中に存在するグリシンの代りにアルギニンを有する組替えＨａ 　−ｒａｓｕ　ｐ２１タンパクを用いて生成された。

組替えタンパクの合成は、上記で説明１．た通りである。これら抗−ｐ２１モノ クローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、ｒａｓ　８　、ｒａｓ　１０、ｒ ａｓ　１１と表示される。これら全てのハイブリドーマは、ブダペスト条約の下 に１９８７年５月１２日にアメリカン・タイプ・ティッシュ・カルチャー・コレ クシジン（ＡＴＣＣ）に寄託された。バイブリド−７ｒａｓ８はｒＨＢ　９４２ ８　Ｊと命名され、ハイブリドーマｒａｓ　１０はｒＨＢ　９４２Ｇ　Ｊとして 命名され、ハイブリドーマｒａｓ　１１はｒｌｌＢ　９４２７　Ｊとして命名さ れた。

これらの抗−９２１パン反応性モノクローナル抗体は、以下の標準条件下におい て、ＥＬＩＳＡに基づいてマイクロ滴定プレート中で試験されたとき、４８８ｎ １１における約１．５〜約２．５の光学密度を与えた。

標準ＥＬＪＳ八条件 へのセクションで説明するＥＬＩＳＡの目的は、抗−ｐ２１モツクローナル抗体 が正常型および突然変異性のｒａＳ　２１タンパクと反応するか否かを試験する ことである。５００ｎｇの正常型または突然変異性の組替えヒトｒａｓタンパク がウェル毎にコートされた；牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５０μｇの燐酸 緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の抗体または抗体フラグメント０，１〜１１０００ ｎを、試験サンプルとしてウェル毎に添加した１３７℃で一晩インキユベートし 、続いてＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄した；　ＢＳＡ−ＰＢＳ　５０μρ中の、西洋ワ サビパーオキシダーゼに結合したヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体１０ｎｇを、検出試 薬として添加した；３７℃で６０分間インキュベートした後、ＢＳＡ−ＰＢＳで 洗浄した。　０．１５％過酸化水素を含むＰＢＳ中の０−フェニレンジアミン５ ０μｇを、基質として添加した；１０分間の酵素反応の後、停止剤として５０μ ｇの４，５Ｍ硫酸を添加した；　４８８ｎｍでの光学密度を測定した。

ｒａｓ　８　、ｒａｓ　１０およびｒａｓ　１１に加えて、他の４つの抗−９２ １パン反応性モノクローナル抗体があり、これらは上記標準条件下にマイクロ滴 定ベースのＥＬＩＳ＾で試験したとき、４８８ｎｉにおいて約１．５〜２．５の 光学密度（ＯＤ）を与える。これらの抗体は、ｒａｓ　９．１３．１７．２０で ある。ｒａｓ　９．１３．１７は、部位１２にアルギニンを有する組替えハーベ イｒａｓタンパクを用いて生成される。このタンパクの合成は、上記に説明した 通りである。ｒａｓ　２０は、部位６１にロイシンを有する組替えハーベイｒａ ｓタンパクを免疫原に用いて生成される。このタンパクの合成も、上記に説明し た通りである。ハイブリドーマ細胞系であるＲａｓ　９，１３．１７．２０は、 １９８９年３月２９日に、ブタベスト条約の下にＡＴＣＣに寄託された。

Ｒａｓ　９は、ＡＴＣＣ寄託名称ｒＨＢ　１００５８Ｊに対応する。

Ｒａｓ　１３は、ＡＴＣＣ寄託名称ｒＨＢ　１００５２Ｊに対応する。

Ｒａｓ　１７’ｉｄ、　ＡＴＣＣ寄託名称ｒＨＢ　１００５４Ｊに対応する。

Ｒａｓ　２０は、ＡＴＣＣ寄託名称ｒｌｌＢ　１００５９Ｊに対応する。

ここに記載した免疫検定に加えて、ハイブリドーマ細胞系Ｒａｓ　９．ｉ３，１ ７．２０は、免疫ブ＋＝＋　ットおよびｒａｓ　ｐ２１タンパクの免疫濃縮にも 用いられ得る。

第１２位置で突然変異されたグリシンの代わりにバリンを有するｐ２１に特異的 で、ＤＷＰと呼ばれるモノクローナル抗体は、上記参照された欧州特許出願（Ｅ ＰＯ公開公報Ｎｏ。

０１９００３）に開示されている。このモノクローナル抗体および第１２位置に グルタミン酸またはアルギニン突然変異を有するｐ２１に特異的なモノクローナ ル抗体は、ここで参照することにより組み込まれる１９８７年１０月２２日に出 願された出願番号１１１，３１５の同時継続の出願の主題を構成する。この出願 は、２つの先の出願（１９８５年１月２９日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ　６９８，１ ９７および１９８６年１０月１日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ　９１３，９０５　）の 一部分継続出願であり、それらの優先権を主張する。バリン、グルタミン酸また はアルギニンを有するｐ２１タンパクと反応性のあるモノクローナル抗体を分泌 するハイブリドーマを、ブタペスト条約に従ってＡＴＣＣに寄託した。

第１２位置にバリンを有する突然変異ｒａｓｐ２１タンパクと反応性のあるモノ クローナル抗体を分泌し、ＤＷＰと呼ばれるハイブリドーマ細胞系は、１９８９ 年１月２３日に寄託され、へＴＴＣ指定番号ＨＢ８６９８が与えられた。

第１２位置にグルタミン酸を有する突然変異ｒａｓｐ２１タンパクと反応性のあ るモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を、２１ｇ４およびＥ１ ７０と呼んだ。ハイブリドーマＥ１８４は１９８６年９月１１日に寄託され、Ａ ＴＴＣ指定番号ＨＢ９１９４が与えられた。ハイブリドーマＥ１７０は１９８６ 年９月１１日に寄託され、ＡＴＴＣ指定番号）ＩＢ９１９５が与えられた。

第１２位置にアルギニンを有する突然変異ｒａｓｐ２１タンパクと反応性のある モノクローナル抗体を分泌し、Ｒ２５６と呼ばれるハイブリドーマ細胞系は１９ ８６年９月１１日に寄託され、ＡＴＴＣ指定番号１１Ｂ９１９Ｂが与えられた。

バリン置換体に特異的なモノクローナルは、次のポリペプチド配列を含有する免 疫原を用いて生成された：　５リジン−ロイシン−バリン−バリン−バリン−グ リシン−アラニン−バリン−グリシン−バリン−グリシン−リジン１６゜グルタ ミン酸に特異的なモノクローナルは、次のポリペプチド配列を含有する免疫原を 用いて生成された：　５リジン−ロイシン−バリン−バリン−バリン−グリシン −アラニン−グルタミン酸−グリシン−バリン−グリシン−リジン】６゜本発明 のアッセイに使用可能である他のモノクローナル抗体は、第１２位置にアスパラ ギン酸を有する活性化ｒａｓｐ２１タンパクのエピトープに特異的に結合するが 、第１２位置にグリシンを有するエピトープには結合しないモノクローナル抗体 を含む。

突然変異ｒａｓｐ２１タンパクと反応性のあるモノクローナル抗体を、ハイブリ ドーマ細胞系Ｄ１１３，０２０５．およびＤ２１０によって製造し゛た。これら の細胞系を、ブタベスト条約に従ってＡＴＴＣに寄託した。ハイブリドーマ細胞 系Ｄｌ１３は１９８９年３月３１日に寄託され、ＡＴＴＣ指定番号）ＩＢ１００ ８Ｂが与えられた。ノ１イブリドーマ細胞系Ｄ２０５は１９８９年３月２９日に 寄託され、ＡＴＴＣ指定番号ＨＢ１００８１が与えられた。ハイブリドーマ細胞 系Ｄ２１０は、１９８９年３月３１日に寄託され、ＡＴＴＯ指定番号）ＩＢＩＯ ０８３が与えられた。

ハイブリドーマ細胞系Ｄ１１３．Ｄ２０５．および０２１０は、ドデカペプチド 　５リジン−ロイシン−バリン−バリン−バリン−グリシン−アラニン−アスパ ラギン酸−グリシン−バリン−グリシン−リジン′６を用いて、下記の手順に従 ってマウスを免疫化して製造した。上述のように、ハイブリドーマ方法論おヨヒ スクリーニング・プロトコール（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ）は同 様に下記説明する。モノクローナル抗体は、第１２位置にアスパラギン酸を含有 するペプチドとの反応性および第１２位置にグリシンを含有するペプチドとの反 応性の欠乏、すなわち、アスパラギン酸陽性、グリシン陰性についてスクリーニ ングされた。

本発明のイムノアッセイに使用できるモノクローナル抗体は、第１２位置にセリ ンまたはシスティンを有する活性化ｒａｓｐ２１タンパクのエピトープに特異的 に結合するが、第１２位置にグリシンを有するエピトープには結合しないモノク ローナル抗体も同様に含む。

第１２位置にセリンを有する突然変異ｒａｓｐ２１タンパクと反応性のあるモノ クローナル抗体を、ハイブリドーマ細胞系５１１０７−８．３．により製造した 。この細胞系をブタベスト条約に従って１９８９年３月２９日にＡＴＴＣに寄託 した。ノ１イブリドーマ細胞系５１１０７−１１．３．はＡＴＴＣ指定番号）Ｉ ＢＩＯ０８０が与えられた。

ハイブリドーマ細胞系５ｌ１０７−８！、はドデカペプチド　ラリジン−ロイシ ン−バリン−バリン−バリン−グリシン−アラニン−セリン−グリシン−バリン −グリシン−リジン＋６を用いて、下記の手順に従ってマウスを免疫化して製造 した。ハイブリドーマ方法論およびスクリーニング・プロトコールはまた下に記 述する。モノクローナル抗体は、関心のあるペプチドとの反応性、すなわち、セ リン陽性、グリシン陰性について同様にスクリーニングされた。

第１２位置にシスティンを有する突然変異されたｒａｓｐ２１タンパクと反応性 のあるモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ細胞系Ｃ−１１１９−９およびＣ −１１１９−１０によって製造した。

これらの細胞系を、ブタベスト条約に従って１９８９年３月３１日にＡＴＴＣに 寄託した。Ｃ−１１１９−１０はＡＴＴＣ指定番号ＨＢ１００８Ｂが与えられた 。Ｃ−１１１９−９は＾ＴＴＣ指定番号）ＩＢ１００８４が与えられた。

ハイブリドーマ細胞系Ｃ−ＬＩＬ９−９およびＣ−１１１９−１０を、ドデカペ プチド５リジン−ロイシン−バリン−バリン−バリン−グリシン−アラニン−シ スティン−グリシン−バリン−グリシン−リジン＋６を用いて、下記の手順に従 ってマウスに免疫化して製造した。ハイブリドーマ方法論およびスクリーニング ・プロトコールはまた下に記述する。モノクローナル抗体は、関心のあるペプチ ドとの反応性、すなわち、システィン陽性、グリシン陰性について同様にスクリ ーニングされた。

ここで参照されることにより組込まれる１９８８年２月２２日に出願された出願 番号１５１ｉ、７３０の同時継続の出願において論ぜられたモノクローナル抗体 も、同様にこの出願の視点の範囲内である。ここで論ぜられたモノクローナルは 、第１３位置にアミノ酸置換体を有するｒａｓ　ｐ　２１タンパクと反応性があ る。特に、アスバルギン酸およびバリンは、通常存在するリジンシンに代えて第 １３位置に置換された。

アスパルギン酸置換体に特異的なモノクローナル抗体は、次のポリペプチド配列 を含有する免疫原を用いて生成されたニジスティン−５リジンーロイシンーバリ ンーバリンーバリンーグリシンーアラニンーグリシンーアスバルギン酸−バリン −グリシン−リジン−セリン−アラニン−ロイシン１９゜これらのモノクローナ ル抗体を分泌するハイブリドーマを、Ｄ７３５−１３（１２９）およびＤ７３６ −１３（１４Ｂ）と呼んだ。これらのハイブリドーマを、ブタベスト条約に従っ て１９８８年１月２９日にＡＴＴＣに寄託した。ハイブリドーマＤ７３５−１３ （１２９）はＡＴＴＣ指定呑号ＨＢ９８３２が与えられた。ハイブリドーマ［１ ７ｇＢ−１３（１４Ｂ）はＡＴＴＣ指定番号）ＩＢ９８３３が与えられた。

バリン置換体に特異的なモノクローナルは、次のポリペプチド配列を含有する免 疫原を用いて生成されるニジスティン−５リジンーロイシンーバリンーバリンー バリンーグリンンーアラニンーグリシンーバリンーバリンーグリシンーリジンー セリンー゛アラニン−ロイシン１９゜このモノクローナル抗体を分泌するハイブ リドーマを、Ｖ８４７−１３と呼んだ。このハイブリドーマはブタベスト条約に 従って寄託され、ＡＴＴＣ指定番号Ｈ８９６３４が与えられた。

第１３位置で突然変異されたｒａｓタンパクと反応性のある他のモノクローナル は、第１３位置にアルギニンを有する活性化ｒａｓ　ｐ　２１タンパクのエピト ープに特異的に結合するが、第１３位置にグリシンを有するエピトープには結合 しないモノクローナル抗体を含む。

これらのモノクローナル抗体は、次のポリペプチド配列を含有する免疫原を用い て下記の工程に従ってマウスを免疫化することによって生成できる：　ラリジン −ロイシン−バリン−バリン−バリン−グリシン−アラニン−グリシン−アルギ ニン−バリン−グリシン−リジン１６゜ハイブリドーマ方法論およびスクリーニ ング・プロトコールはまた下に記述する。

モノクローナル抗体は、関心のあるペプチドとの反応性、すなわち、アルギニン 陽性（第１３位ｆｉｆ）　、グリシン陰性（第１３位置）について同様にスクリ ーニングされる。

アルギニン、ロイシンまたはヒスチジンを第６１位置に有するｒａｓｐ２１タン パクのエピトープに特異的に結合するが、グルタミンを第６１位置に有するエピ トープには結合しないモノクローナル抗体を、ブタベスト条約に従ってＡＴＣＣ に寄託した。

第６１位装置にアルギニンを有する突然変異ｒａｓｐ２１タンパクと反応性のあ るモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマ細胞系は、ハイブリドーマ細胞 系ＲＢＩ−１，ＲＢｌ−２，Ｒ６１−３およびＲ１３１−４により製造された。

ハイブリドーマ細胞系ＲＢ１−１は１９８９年３月２９日に寄託され、ＡＴＴＣ 指定番号ＨＢＩＤＯＢ３が与えられた。ハイブリドーマ細胞系Ｒ８１−２は１９ ８９年３月３０日に寄託され、＾ＴＴＣ指定番号）ＩＢ１００６９が与えられた 。ハイブリドーマ細胞系Ｒ６１−３は１９８９年３月３０日に寄託され、ＡＴＴ Ｃ指定番号ＨＢ１００？ｌが与えられた。ハイブリドーマ細胞系Ｒ６１−４は１ ９８９年３月２９日に寄託され、ＡＴＴＣ指定番号ＨＢ１００６２が与えられた 。

ハイブリドーマ細胞系ＲＯＩ−１，Ｉ？６１−２．　Ｒ６１−３およびＲ６１− ４は、次の構造を有する１１７−（ｌｌｓｅｒ）ペプチド（ウンデカペプチド） 用いて、下記の手順に従ってマウスに免疫化して製造された＝５７アスパラギン 酸−スレオニンーアラニンーグリシンーアルギニンーグルタミン酸−グルタミン 酸−チロジン−セリン−アラニン６ローチロシン。末端チロシン残基は、キャリ アタンパクへの結合を促進するために加えた。ハイブリドーマ方法論およびスク リーニング・プロトコールはまた下に記述する。モノクローナル抗体は、関心の あるペプチドとの反応性、すなわち、アルギニン陽性（第６１位置）、グリシン 陰性（第６１位置）について同様にスクリーニングされた。

第６１位置にロイシンを有する突然変異ｒａｓｐ２１タンパクと反応性のあるモ ノクローナル抗体を・ハイブリドーマ細胞系Ｌ６１−１　’およびＬｆｉｌ−２ によって製造した◎ハイプリドーマ細胞系Ｌ６１−２はＡＴＴＣ指定番号）ＩＢ １００７３が与えられた。ハイブリドーマ細胞系Ｌ８１−１はＡＴＴＣ指定番号 ）ＩＢｌｏｏＧｇが与えられた。

両細胞系ともに１９８９年３月３０日に寄託された。

ハイブリドーマ細胞系Ｌ８１−１およびＬＳＩ−２は、下記手順に従い、マウス を免疫するための下記構造を有する１１７−ペプチド（ウンデカペプチド）を用 いて作成した。５７アスパラギン酸−トレオニン−アラニン−グリシン−ロイシ ン−グルタミン酸−グルタミン酸−チロジン−セリン−アラニン６ローチロシン 。ハイプリドーマ方法学およびスクリーニング・プロトコルはまた以下に記述さ れる。モノクローナル抗体は、関心のあるペプチドとのそれらの反応性、ロイシ ン陽性（第６１位ｒｉＬ）、グルタミン陰性（第６１位置）に対してもスクリー ニングされる。

第６１位置にヒスチジンを有する突然変異ｒａｓ　ｐ２１タンパクに反応するモ ノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞系Ｈ６１−１、）１６１−２、Ｈｌｌ ｉｌ−３，８６１−４、および１１６１−５によって作成した。ハイブリドーマ 細胞系Ｈ６１−１は１９８９年３月３０日に寄託され、ＡＴＣＣｍ別番号１１８ １００７０が与えられた。ハイブリドーマ細胞株）１６１−２は１９８９年３月 ３０日に寄託され、＾ＴＣＣ識別番号ＨＢ１００９２が与えられた。ハイブリド ーマ細胞株＋１６１−３は１９８９年３月３０日に寄託され、ＡＴＣＣ識別番号 ）ｉＢ１００８９が与えられた。

ハイブリドーマ細胞株Ｈ６１−４は１９８９年３月３０日に寄託され、ＡＴＣＣ 識別番号）ＩＢ１００８７が与えられた。ハイブリドーマ細胞株Ｈ６１−５は１ ９８９年３月３０日ニ寄託され、ＡＴＣＣ識別番号ＨＢ１００９０が与えられ゛ た。

ハイブリドーマ細胞株Ｈ６１−１、ＩＩＧＩ−２、Ｈ６１−３、Ｈ８１−４、お よびＨａ　ｌ−５は、下記手順に従い、マウスを免疫するための下記構造を有す る１１マーペプチド（ウンデカペプチド）を用いて作成した。５７アスパラギン 酸−トレオニン−アラニン−グリシン−ヒスチジン−グルタミン酸−グルタミン 酸−チロジン−セリン−アラニン６ローチロンン。ハイプリドーマ方法学および スクリーニング・プロトコルはまた下に記述される。

このモノクローナル抗体は、関心のあるペプチドに対するそれらの反応性、ヒス チジン陽性（第６１位置）、グルタミン陰性（第６１位置）に対してもスクリ− ニングされる。

第６１位置にリジンを有する突然変異ｒａｓ　ｐ２１タンパクに反応するモノク ローナル抗体は、下記構造を有する１１マーペプチド（ウンデカペプチド）を用 いて精製したハイブリドーマ細胞株によって作成した。′７アスパラギン酸−ト レオニンーアラニンーグリシンーリシンーグルタミン酸−グルタミン酸−チロジ ン−セリン−アラニン６′′−チロシン。下記手順に従ってマウスを免疫する。

モノクローナル抗体は、関心のあるペプチドに対するそれらの反応性、リジン陽 性（第６１位置）、グルタミン陰性（第６１位置）もスクリーニングされる。

）１ａ、　Ｎ若しくはＫ１２Ａ、　Ｋ１２Ｂ　ｒａｓ　ｐ２１ｓに特異的なモノ クローナル類は、１９８８年４月２２日付は提出の同時係属米国特許出願箱０７ ７１８５，１９４号に開示され、この出願は本明細書に参照として組込まれると 共に、米国特許出願第０７７１８５．５８２号と同時に提出されたものである。

これらのモノクローナル類はまた、同時提出の同時係続米国特許出願（代理人Ｄ ｏｃｋｅｔ番号ＮＮ−０２１８−Ａ　）に開示される。ここで述べられるモノク ローナル類は、個々のＨａＳＮ若しくはＫｌ−ｒａｓ族間において区別される。

Ｈ−ｒａｓに特異的なモノクローナル類を生成するハイブリドーマは、Ｈ−７７ ０−１，１，４、）Ｉ−７８４−４，７，７及びＨ−８７３−３，５，３で指定 され、ブダペスト条約の下に、１９８８年３月２５日付けでＡＴＣＣに寄託され た。ハイブリドーマＨ−７７０−１，１，４は、ＡＴＣＣ指定番号ＨＢ９６７３ のコードを付された。ハイブリドーマ）ｌ−７８４−４，７，７は、ＡＴＣＣ指 定番号ＨＢ９Ｂ７５のコードを付された。ハイブリドーマｌ＋−８７３−３，５ Ｊは、ＡＴＣＣ指定番号ＨＢ９Ｂ７４のコードを付された。

Ｎ−ｒａｓに特異的なモノクローナル類を生成するハイブリドーマはＮ−８２１ −１，１，９及びＮ−８３１１−１，１，６で指定され、ブダペスト条約の下に 、１９８８年３月２５日付けでＡＴＣＣに寄託された。ハイブリドーマＮ−８２ １−１，１，９は、ＡＴＣＣ指定番号ＨＢ９８７１のコードを付された。ハイブ リドーマＮ−１１３８−１、１、６は、ＡＴＣＣ指定番号）ＩＢ９８７２のコー ドを付された。

Ｋ１２Ａに特異的なモノクローナルを生成するハイブリドーマ細胞系はに２Ａ− １及びに２Ａ−２で指定され、ブダペスト条約の下に、１９８９年３月３０日付 けでＡＴＣＣに寄託された。Ｋ２Ａ−Ｉ１１ＡＴＣＣ指定番号ＨＢＩＯ０７２（ ７）：＋−ドを付された。Ｋ２Ａ−２ハＡＴｃｃ指定番号）ＩＢ１００Ｇ５のコ ードを付された。

ＫＩ２Ｂ　ｒａｓ−に特異的なモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細 胞系はに２Ｂ−１、Ｋ２Ｓ−２、Ｋ２Ｓ−３、Ｋ２Ｓ−４、Ｋ２Ｓ−５、Ｋ２Ｓ −６及びに２Ｂ−７で指定され、上記ブダペスト条約の下に、ＡＴＣＣに寄託さ れた。Ｋ２Ｓ−１は１９８９年３月３０日付は寄託され、ＡＴＣＣ指定番号ＨＢ １００６４のコードを付された。に２Ｂ−２は１９８９年３月２９日付は寄託さ れ、ＡＴＣＣ指定番号ＨＢ１００ｆｉ５のコードを付された。Ｋ２Ｓ−３は１９ ８９年３月３０日付は寄託され、ＡＴＣＣ指定番号）ＩＢＩＯ０８Ｇのコードを 付された。Ｋ２Ｓ−４は１９８９年３月３１日付は寄託され、＾ＴＣＣ指定番号 ＨＢ１００Ｉ！５のコードを付された。Ｋ２Ｓ−５は１９８９年３月２９日付は 寄託され、＾ＴＣＣ指定番号ＨＢ１００５６のコードを付された。Ｋ２Ｓ−６は １９８９年３月３０日付は寄託され、ＡＴＣＣ指定番号ＨＢＩＯ０６７のコード を付された。Ｋ２Ｓ−７は１９８９年３月３１日付は寄託され、ＡＴＣＣ指定番 号）ＩＢ１００９１のコードを付された。

免疫化 Ｍａｂ　Ｈ−７７０−１，１，４の場合において、Ｂａ１ｂ／ｃ　ｘ　Ｃ５７Ｂ １／６７ウス＄４８０７は、Ｋａｇａｎ等のグルタルアルデヒド法、Ｈｏｒｍｏ ｎｅＲａｄ１０ｉ１ｆｆｉｕｎＯａＳＳａｙ法、ｐｐ、３２７−３３９（２ｄ　 Ｅｄ、）（１９７９）を介して、キャリアタンパクＫｅｙｈｏｌｅ　Ｌｆｐｅｔ 　）Ｉｅｉａｃｙａｎｉｎ　（ＫＬＨ）と組合わされた１１−特異的ペプチドに よって免疫化された。他でも述べられるが、Ｋａｇａｎ法はここで述べられる全 ての組合わせ／接合にとって望ましい。Ｈ−特異的ペプチドは、ｒａｓ　Ｈｐ２ １のポジション１８３−１１１１０に対応する１８アミノ酸からなった。免疫化 ペプチドの構造は次の通りである。１６３イソロイシンーアルギニンーグルタミ ンーヒスチジンーリシンーロイシンーアルギニノーリシンーロイシンーアスパラ ギンーブロリンーブロリンーアスパラギン酸−グルタミン酸−セリン−グリシン −プロリン−グリシン１８０゜ Ｍａｂ　Ｈ−７８４−４，７，７の場合において、Ｂａ１ｂ／ｃ　Ｘ　Ｃ５７Ｂ ｌ／６ｖウス１４６１５は、キャリアタンパクＫＬＨと組合わされた■ト特異的 ペプチドによって免疫化された。

Ｍａｂ　ＨＪ７３−３．５．３の場合において、Ｂａ１ｂ／ｃ　Ｘ　Ｃ５７Ｂｌ ／６７ウス１１４８０６は、キャリアタンパクＫＬＨと組合わされたＨ−特異的 ペプチドによって免疫化された。

Ｍａｂ　）！−８２１−１．１．９の場合において、Ｂａ１ｂ／ｃ　Ｘ　Ｃ５７ Ｂｌ／６マウス書４４８Ｂは、上述のキャリアタンパクＢｏｖｉｎｅ　Ｔｈｙｒ ｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＢＴＧ）と組合わされたＮ−特異的ペプチドによって免疫 化された。

Ｍａｂ　ＨＪ３Ｂ−１，１，６の場合において、Ｂａ１ｂ／ｃ　ｘ　Ｃ５７Ｂｌ ／６７ウス８４４８０は、ＢＴＧと紹合わされたＮ−特異的ペプチドによって免 疫化された。Ｎ−特異的ペプチドは、Ｎ　ｒａｓ　ｐ２１のポジション１８３− １８０に対応する１８アミノ酸からなった。Ｎ　ｒａｓペプチドの構造は次の通 りである。′６３イソロイシンーアルギニンーグルタミンーチロシンーアルギニ ンーメチオニンーリシンーリシンーロイシンーアスバラギンーセリンーセリンー アスパラギン酸−アスパラギン酸−スレオニン−グルタミン酸−グリシン１８０ ０ 免疫化Ｎ及びＨ−特異的ペプチドは、ペプチドの免疫原性を強化する為、キャリ アタンパクＫＬ）を及びＢＴＧと夫々組合わされた。第１の接種は、Ｃｏｍｐｌ ｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔと混合されたベプチ゛ドキャリア接 合からなった。接種されＩ；タンパク総量は５００μｇであった。次に接種は２ 週間の間隔で付与された。融合（ｆｕｓｉｏｎ）　３日前、マウスは適当な免疫 原の腹腔内接種を付与された。

Ｍａｂ　Ｋ２＾−１、Ｋ２Ａ−２の場合において、Ｂａ１ｂ／ｃ　ｘ　Ｃ５７Ｂ １／６の幾つかのマウスは、アミノ酸１６３−１８０に対応するペプチドによっ て免疫化された。再び、ペプチドは接種に先立ってキャリアタンパクと組合わさ れた。

アミノ酸１８３−１８０に対応するペプチドは１８のアミノ酸からなり、次の構 造を有した。＋６３イソロイシン−アルギニン−グルタミン−チロシン−アルギ ニン−ロイシン−リシン−リシン−イソロイシン−セリン−セリン−グルタミン 酸−グルタミン酸−リシン−スレオニン−プロリン−グリシン−システィン１８ ０゜ Ｋ１　ｒａｓ　ｐ２１のアミノ酸１７０−１８４に対応する他のペプチドが免疫 原として使用可能となる。それは下記の構造を有する。

＋７０リシン−イソロイシン−セリン−リシン−グルタミン酸−グルタミン酸− リシン−スレオニン−プロリン−グリシン−システィン−バリン−リシン−イン ロイシン−リシン＋１１４゜Ｘ２Ｂ−１、Ｘ２Ｂ−２、Ｘ２Ｂ−３、Ｘ２Ｂ−４ 、Ｘ２Ｂ−５、Ｘ２Ｂ−６及びに２Ｂ−７の場合において、Ｂａ１ｂ／ｃ　Ｘ　 Ｃ５７Ｂ１／８のマウスは、アミノ酸１θ４−１７５に対応するペプチドによっ て免疫化された。再び、ペプチドは接種に先立ってキャリアタンパクと組合わさ れた。

Ｋｊ２Ｂ　ｒａｓ　ｐ２１のアミノ酸ポジシラン１６４−１７５に対応するペプ チドは１２のアミノ酸からなり、次の構造を有した。１６４アルギニン゛−リシ ン−ヒスチジン−リシン−グルタミン酸−リシン−メチオニン−セリン−リシン −アスパラギン酸−グリシン−リシンエフ５゜ Ｋ１２Ｂ　ｒａｓ　ｐ２１のアミノ酸１６３−１８０及び１６ｇ−１８３１：対 応する２つの他のペプチドがまた使用可能となる。それらは下記の構造を有する 。＋６１イソロイシン−アルギニン−リシン−ヒスチジン−リシン−グルタミン 酸−リシン−メチオニン−セリン−リシン−アスパラギン酸−グリシン−リシン −リシン−リシン−リシン−リシン−リシン１８０、及び１８Ｂグルタミン酸− リシン−メチオニン−セリン−リシン−アスパラギン酸−グリシン−リシン−リ シン−リシン−リシン−リシン−セリン−リシン−スレオニン１８″。

Ｋ１２Ａ及びＫ１２Ｂ−特異的ペプチドはペプチドの免疫原性を強化する為、キ ャリアタンパクＫＬＨ若しくはＢＴＧと組合わされた。第１の接種は、Ｃｏｍｐ ｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔと混合されたペプチドキャリア接 合からなった。接種されたタンパク総量は５００μｇであった。次に接種は２週 間の間隔で付与された。融合（ｆｕｓｉｏｎ）　３日前、マウスは適当な免疫原 の腹腔内接種を付与された。

ハイブリドーマ方法論 腹腔的追加免疫の３日後、適当な免疫マウスの膵臓除去され、非分泌ミニローマ 細胞５ｐ２１０と融合された。肺臓細胞懸濁は低血清ＤＭＥＭ−高グルコース媒 体内で調製され、４：１の割合でミエローマ細胞と混合された。この細胞混合物 は、室温において、１０分間、１２００　ｘ　ｇで遠心分離された。上滑を除去 後、上記細胞は試験管を静かにタッピングすることにより再び懸濁された。融合 手続きは、３０秒間に亘って、３７℃で４５％シ／ｖポリエチレングリコール３ ３５０　（Ｂａｋｅｒ　）を１．０１添加することにより開始された。

上記細胞は、時々、９０秒間ピペット先端で混合され、３分間に亘って、５１の 低血清ＤＭＥＭ−高グルコース媒体が添加された。続いて、１０％のウシ胎仔血 清、し−グルタミン、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンが補給され たＤＭＥト高グルコース１４１が添加された（）ＩＡＴ媒体として言及する）。

ＨＡＴ媒体は１分間に亘って添加された。

ＨＡＴ媒体の適当な量が上記細胞に添加され、次に上記細胞は室温において７分 間８００Ｘｇで遠心分離された。上滑は吸引され、細胞ベレットは、１０　ｍ　 ｌのＩ（ＡＴ媒体で分断された。

Ｂａ１ｂ／ｅ　ｘ　Ｃ５７Ｂ１／６からの腹腔細胞が添加され、最終的な体積は 、２０万の肺臓細胞が各ウェルに分配されるように調整された。約１４日後、ハ イブリドーマコロニーを含有するウェルからの組織培養上清が、キャリアタンパ クと接合されたペプチドとの所望の反応性の為に、ＥＬＩＳＡによってテストさ れた。

スクリーニング処理およびエリサプロトコルスクリーニングする目的で、上記Ｈ −特異性ペブチドをＢＴＧキャリアタンパクと接合する一方、Ｎ−特異性ペプチ ドをＫＬＨキャリアタンパクと接合した。感作およびスクリーニングのためにペ プチドが異なったキャリアタンパクと結合する理論的根拠は、キャリアタンパク と反応性のある抗体の選択を回避するためである。同様の理論的根拠が、ＫＩ２ ＡおよびＫ１２Ｂｔ’ｒ異性タンパクと結合するキャリアの選択にも当てはまる 。

ハイブリドーマの上澄みをスクリーニングする前に、接合したペプチド−キャリ アを９６のウェルのあるマイクロタイタープレートに投与し、３７℃で一晩培養 した。培養後、プレートを洗浄し、プレート上の束縛の解かれた位置を牛の血清 アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。

ハイブリドーマ上澄みをスクリーニングしたとき、流体５０μｇを、適切なペプ チドキャリア接合を含むウェルに添加した。ハイブリドーマ上澄みを、４℃で一 晩培養させておいた。上澄みを翌日除去し、ウェルをＢＳＡ溶液によって洗浄し た。続いて各ウェルに、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＧＡＭＨＲＰ）に結合し ＢＳＡリン酸塩で緩衝されたサーリン（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中で希釈されたヤギのアン チーネズミＩｇＲ抗体５０μｇを受容させた。ウェルを３７℃で６０分間培養さ せた。培養後Ｇ　Ａ　Ｍ　ＨＲＰを除去し、ウェルをＰＢＳ−ＢＳＡ混合物で３ 度洗浄した。バインドされたＧ　Ａ　Ｍ　ＨＲＰの存在を、０，１５％過酸化水 素を含むリン酸塩緩衝液中の基質〇−フ二二レしジアミン（ＯＰＤ）５０μｇを 添加することによって測定した。ＨＲＰをその基１０ＰＤと組み合わせて、黄色 の生成物を得た。この黄色の生成物の成長は、室温において１５分間で起こり得 た。この酵素反応を、４．’５９ｏＭ硫酸５０μｇを添加することによって終結 させた。最終的な反応生成物の測定は、ナンクブレートリーダー（ナンク、イン コーホレーティッド、ニューバリーパーク、ＣＡ）において４８８ｎｍでの光学 濃度を測定することによってなされた。前記ウェルにおける黄色の存在は、係る 抗体がハイブリドーマ上澄み中に存在することを示している。培養流体中に抗体 がより多く存在するほど、前記光学濃度がより高くなる。

上記分析を使用して、マブ（Ｍａｂ　）　）Ｉ−７７０−１，１，４，、Ｈ−７ ８４−４，７，７，およびＨ−８７３−４，７，７，が、キャリアタンパクと結 合したＨ−特異性ペプチドと反応性があり、キャリアタンパクとも結合したＮ、 に１２ＡおよびＫ１２Ｂ−特異性ペプチドとは反応性がないことが見出された。

マブＮ−８２１−１，１，９，およびＮ−８３８−１，１，８，は、キャリアタ ンパクと結合したＮ　ｒａｓ特異性ペプチドと反応性があり、キャリアタンパク と結合したＨ、ＫＩ２Ａおよびに１２Ｂ−特異性ペプチドとは反応性がないこと が見出された。

マブに１２Ａ−１およびに１２Ａ−２は、Ｋ１２Ａ特異性ペプチドと反応性があ り、キャリアタンパクとも結合した）Ｉ、Ｎ、に１２Ａおよびに５２Ｂ−特異性 ペプチド（アミノ酸１Ｇ４−１７５　）とは反応性がないことが見出された。

マブＫ１２Ｂ−１，Ｋ１２Ｂ−２，Ｋ１２Ｂ−３，Ｋ１２Ｂ−４，Ｋ１２Ｂ−５ ，Ｋ１２Ｂ−６およびＫ１２Ｂ−７は、Ｋ１２Ｂ特異性ペプチド（アミノ酸１Ｂ ４−１７５　）と反応性があり、キャリアタンパクとも結合したＨ、Ｎおよびに ！２Ａ−ペプチドとは反応性がないことが見出された。

次の実験シリーズでは、アンチ−Ｎおよびアンチ−Ｈマブを、キャリアタンパク と結合していないペプチドとの特異性についてテストし、該マブが間過のペプチ ドについて特異性があり、そのペプチドに対して結合付着したキャリアタンパク とは反応性がないことを確証した。表１は、）Ｉ、Ｎ、Ｋ１２Ａおよびに１２Ｂ 特異性ペプチドに対してアンチ−Ｈおよびアンチ−ＮマブをテストしたＥＬＩＳ Ａの結果の概要を示す。

表　　　１ ＫＩ２Ａ　　Ｋ１２Ｂ ）１−　　　　　Ｎ−ペプチド　　　　　　　　　　　　ペプチドＨ−７８４− ４，７，７，＋　　　　　　−−−Ｈ−８７３−３，５，３，＋　　　　　　− −−）１−８２１−１．１．９．　　−　　　　　＋　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　−Ｈ−４３８−１，１，６，−＋　　　　　　　　 　　−−これらの結果は、Ｈ−ペプチドに対して培養されたマブがそのペプチド については特異性があり、Ｎペプチド、　Ｋ１２ＡペプチドまたはＫ１２Ｂペプ チドとは反応性がないことを示している。

また結果は、Ｎペプチドに対して培養されたマブがそのペプチドに対しては特異 性があり、Ｈｒａｓ関連ペプチド、Ｋ１２Ａｒａｓ関連ペプチドまたはに１２Ｂ ｒａｓ関連ペプチドとは反応性がないか、もしくは逆反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅ ａｃｔ　１ｖｃ）があることを証明している。

同様に、Ｋ１２ＡおよびＫ１２Ｂに対するマブを、キャリアタンパクと結合して いないペプチドとの特異性についてテストし、該マブが問題のペプチドについて 特異性があり、そのペプチドに対して結合付着したキャリアタンパクとは反応性 がないことを確証した。ＫＩ２＾およびＫ１２Ｂマブは、問題のペプチドについ て特異性があり、そのペプチドに対して結合付着したキャリアタンパクとは反応 性がないことが、信じられている。

免疫沈降およびウェスタンブロッティングを使用して、ＨおよびＮ　ｒａｓペプ チドに対して培養されたマブが、細胞性ＨおよびＮ　ｒａｓ　ｐ２１ｓと反応す るか、および特異性があるかどうかを測定した。実験は以下の四細胞株を使用し てなされた。

１、３Ｔ３−Ｈｒａｓをデザインした（またＰＳＶ−１３）細胞株は）Ｉ　ｒａ ｓ　ｐ２１ｓを過剰発現した。

２、３７３−Ｎｒａｓをデザインした細胞株はＮ　ｒａｓ　ｐ２１ｓを過剰発現 した。

３、３Ｔ３−Ｋｉ２Ａをデザインした細胞株（Ｋ’ＮＲＫ）はＫｉ　ｐ２１タン パクのウィルス状態を発現した。

４、３７３−Ｋｉ２Ｂをデザインした細胞株（ＳＷ４８０　）はに４　ｒａｓタ ンパクの細胞状態を発現した。

上記細胞の非放射性抽出物は、Ｒａｓ　１０をデザインしたアンチ−Ｈマブ、ア ンチ−Ｎマブ、またはアンチ−ｐ２１マブを用いて１時間培養された。前記Ｒａ ｓ　１０アンチ−ｐ２１マブは、上記のようにＲａｓ　ｐ２１タンパクの通常お よび発癌性状態と反応した。

培養後、ウサギアンチーネズミ１ｇの複合体を４℃において３０分かけてタンパ クＡセファロースに添加し、アンチ−Ｈ，アンチ−Ｎ、およびアンチ−ｐ２１マ ブを捕えた０１時間培養した後、前記サンプルを遠心分離し、得られたベレット を洗浄した。最終洗浄後、ドデシル硫酸ナトリウム還元緩衝液５０μｇをベレッ トに添加し、１００℃において５分間加熱した。その後この物質を１２．５％ポ リアクリルアミドゲルに適用した。細胞タンパクを、前記ゲルに電流を流すこと によって、分子量に従い分離した。この電気泳動処理の後、該タンパクは電気泳 動的にＢ５Ａ３％を含有するＰＢＳでブロックされたニトロセルロース膜に転移 した。アンチ−１）２１マブｒａｓ　１０またはネガティブコントロールを提供 するネズミ血清の何れか用いて、前記膜を１時間培養した。Ｒａ５１０またはネ ガティブコントロール抗体での培養後、膜をＰＢＳ−ＮＰ−４０を用いて３回洗 浄した。次いで、ＨＲＰまくをアンチーネズミに結合した免疫グロブリンで１時 間培養し、ネズミマブを発見した。次いで、膜をＰＢＳ　−ＮＰ　−４０を用い て３回洗浄し、４−クロロ−１−ナフトール基質で培養し、反応を完了させた。

実験により、アンチ−Ｈマブが、免疫沈降し、３Ｔ３−Ｈｒａｓ細胞株から細胞 性Ｈｒａｓ　ｐ２１を捕えることはできるが、Ｎ　ｒａｓ類、Ｋ１２Ａ類、また はＫ１２Ｂ類から細胞性ｐ２１ｓと反応しないことが証明された。アンチ−Ｎ　 ｒａｓマブは、特異的に免疫沈降し、または細胞性Ｎ　ｒａＳ　ｐ２１を捕えた が、しかし他の細胞性Ｈ，Ｋ１２Ａ、およびＫ１２Ｂ　ｐ２１タンパク類とは反 応しなかった。広く反応性のあるアンチ−ｐ２１マブＲａ５ＩＯは、全ての細胞 からｐ２１タンパクと反応し、一方ネガティブコントロール抗体は何れの細胞性 ｒａｓ　ｐ２１ｓとも反応しなかった。これらの結果の概要を以下の表２に示し た。

表　　　２ 細胞株 Ｈ−７１ｉｔ４−４．７．７　　＋　　　−−Ｈ−８７３−（，５，３４−−− ）１−８２１−１．１．９　−　　　　−）１−８３８−１．１．８　−　　　 　−Ｒａｓ　１０ 別の実験系において、従来の免疫沈降を用いずに細胞性ＨおよびＮ　ｒａｓｐ２ １ｓを発見できるか否かについて、アンチ−Ｈおよびアンチ−Ｎマブを評価した 。これを行うために、細胞抽出物を１２．５％のゲルに直接適用し、分離したタ ンパクに電気泳動させた。タンパクはニトロセルロース膜に転移し、アンチ−Ｈ ，アンチ−Ｎ、またはアンチ−ｐ２１マブＲａｓ　１０の何れかと反応した。ネ ズミ抗体は上記のように発見された。この結果、アンチ−１（マブは細胞性ＩＩ 　ｒａｓ　ｐ２１ｓとだけ反応し、一方アンチーＮマブは細胞性Ｎ　ｒａｓ　ｐ ２１ｓとだけ反応することが証明された。

本発明によれば、検出に使用され得る、以上で議論した抗体又は抗体の混合物は 、レポーターによって又は通常の技術を用いた特異的結合ペアの構成部分によっ て検出可能にラベルされている。　　　　・ 特異的結合ペアは、免疫タイプでも非免疫タイプでもよい。

免疫特異的結合ペアは、ハブテン／抗−ハブテン系という抗原−抗体系によって 例証される。ここでは、フルオレセイン／抗−フルオレセイン、ジニトロフェニ ル／抗−ジニトロフェニル、ビオチン／抗−ビオチン、ペプチド／抗−ペプチド などに言及することができる。特異的結合ペアの抗体部分は、当業者によく知ら れた慣習的な方法により生産することができる。このような方法は、動物を特異 的結合ペアの抗体部分で免疫化することを含んでいる。特異的結合ペアの抗体部 分が免疫的でない、例えばハブテンならば、それはキャリアタンパクに対して共 有結合的に結合させて免疫的にさせることができる。

非免疫結合ペアは、二成分が互いに自然の親和性を共有するが、抗体ではないと いう系を含んでいる。具体的な非免疫ペアは、ビオチン−ストレプトアビジン、 内因子−ビタミンＢ、２、葉酸−葉酸エステル結合タンパクなどである。

特異的結合ペアの構成部分によって抗体を共有結合的にラベルするために、様々 な方法を用いることができる。特異的結合ペアの構成部分の性質、要求される結 合のタイプ、及び各種の結合の化学構造に対する抗体の耐性に基づいて、方法が 選択される。市販品で得られる活性誘導体を用いることにより、ビオチンは抗体 に共有結合的に結合することができる。

これらのいくつかは、タンパク上のアミノ基に結合するビオチン−Ｎ−ヒドロキ シスクシンイミド；カルボジイミド結合を介してカルボハイドレート部分、アル デヒド及びカルボキシル基に結合するビオチンヒドラジド；スルホヒドリル基に 結合するビオチンマレイミド及びアイオドアセチルビオチンである。フルオレセ インインチオシアネートを用いることにより、フルオレセインをタンパクのアミ ノ基に結合することができる。２，４−ジニトロベンゼンサルフェート又は２． ４−ジニトロフルオロベンゼンを用いることにより、ジニトロフェニル基をタン パクのアミノ基に結合することができる。モノクローナル抗体を特異的結合ペア （ジアルデヒド、カルボジイミド・カップリング、ホモ三官能性架橋、及びヘテ ロ三官能性架橋を含む）に結合するために、他の標準的な結合方法を用いること ができる。カルボジイミド・カップリングは、一つの基質上のカルボキシル基を 他の基質上のアミノ基に結合させるための有効な方法である。市販品で害られる 試薬１−エチル−３−（ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡ Ｃ）を用いることにより、カルボジイミド・カップリングは促進される。

ホモ三官能性架橋剤（二官能性イミドエステル及び二官能性Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドエステルを含む）は、市販品で得られ、一つの基質上のアミノ基を他 の基質上のアミノ基に結合させるために用いられる。ヘテロ三官能性架橋剤は、 異なる官能基を有する試薬である。最も一般的な市販品で得られるヘテロ三官能 性架橋剤は、一つの官能基としてアミン反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミド エステル、及び第２の官能基としてスルホヒドリル反応性の基を有している。最 も一般的なスルホヒドリル反応性の基は、マレイミド、ピリジルジスルフィド及 び活性ハロゲンである。官能基の一つは、光照射により様々な基と反応する、光 活性のアリールナイトレンでもよい。

抗体、複数の抗体、又は特異的結合ベアの構成部分は、放射性アイソトープ、酵 素、けい光発光性、化学発光性又は電気化学的な物質でありうるレポーターと結 合される。二つの一般的に用いられる放射性アイソトープは、１２５Ｉ及び３Ｈ である。標準的な放射性アイソトープのラベリング操作は、１２５工に対するタ ロラミンＴ１ラクトペルオキシダーゼ及びポルトン−ハンター法、及び３Ｈに対 する還元メチル化を含む。

本発明において好適に用いられる酵素は、ホースラディッシニベルオキシダーゼ 、アルカリ性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキンダー ゼ、ルシフェラーゼ、β−ラクトアマーゼ、ウレアーゼ及びリソチームを含むが 、これらに限定されない。抗体を特異的結合ベアでラベリングするための前述し たようなジアルデヒド、カルボジイミド・カップリング、ホモ三官能性架橋剤、 ヘテロ三官能性架橋剤を用いることにより、酵素ラベリングは促進される。

選択されるラベリング方法は、酵素上で利用できる官能基とラベルされるべき物 質、及び結合状懇に対する両者の耐性に依存する。本発明のおいて用いられるラ ベリング方法は、現在使用されている通常の方法（Ｅｎｇｖａｌ　ｌとＰｅａｒ ｌＩＩａｎｎ、　ＩａｕａｕｎｏｃｈｅＩｌｌｓｔｒｙ　８，８７１（１９７１ ）；ＡｖｒａｍｅａｓとＴｅｒｎｙｎｃｋ、　ｌｓｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 　＆、１１７５（１９７５）：１ｓｈｉｋａｖａら、Ｊ、１ｍｍｕｎｏａｓｓａ ｙ、４（３）：２０９−３２７（１９８３）、及びＪａｂｌｏｎｓｋｉ、＾ｎａ １．Ｂｊｏｃｈｅ１１．１４８：１９９（１９８５）によって記述された方法を 含む）のいずれかでよいが、これらに限定されない。

ラベリングは、スペーサー又は特異的結合ベアの他の構成部分を用いるような間 接法によって達成することができる。

この−例は、ラベルされていないストレプトアビジンとビオチニル化された酵素 を順次又は同時に加えることによる、ラベルされていないストレプトアビジンと ビオチニル化された酵素でビオチニル化された抗体の検出である。このように、 本発明によれば、検出のため１．１：用いられる抗体は、レポーターによって又 は通常の技術を用いた特異的結合ベアの第１の構成部分によって検出可能にラベ ルされている。抗体が特異的結合ベアの第１の構成部分によつてラベルされると 、抗体−特異的結合ベアの第１の構成部分複合体を特異的結合ベアの第２の構成 部分（前述したようにラベルされるか又はラベルされていない）と反応させるこ とにより、検出が達成される。

更に、ラベルされていない抗体は、ラベルされていない抗体をラベルされていな い抗体に対して特異的なラベルされた抗体と反応させることにより検出すること ができる。前述したアプローチのいずれかを用いて、直接的又は間接的にこのよ うな抗−抗体をラベルすることができる。例えば、ビオチンによって抗−抗体を ラベルすることができる。検出を促進するために、前述したストレプトアビジン −ホースラディツシュベルオキシダーゼ系が用いられる。

本発明の好ましい具体例の一つは、検出可能なラベルとしてビオチンを利用する 。ビオチン化された抗体は、今度はストレプトアビジン−ホースラディツシュベ ルオキシダーゼ複合体と反応される。発色性の検出のために、オルソフェニレン ジアミン又は４−クロロ−ナフトールを基質として用いることができる。

本発明を実施するための好ましい免疫分析形式は、フォワード・サンドイッチ・ アッセイ（このアッセイでは、通常の技術を用いて、捕捉試薬が支持体の表面に 固定化されている）である。

分析に用いられる好適な支持体は、ポリプロピレン、ポリスチレン、置換された ポリスチレン例えばアミノ化又はカルボキシル化されたポリスチレン、ポリアク リルアミド、ポリアミド、ポリ塩化ビニルなどのような合成ポリマー支持体；ガ ラスピーズ；アガロース；ニトロセルロースなどである。

免疫プロットは通常の技術を用いて実施される。ｒａＳｐ２１タンパクは、ニト ロセルロースフィルターへ輸送されるに先立って免疫濃縮されるべきではない。

以下で議論される実施例は、本発明を説明することを意図しており、限定と解釈 すべきではない。

次の細胞系は、以下で議論される実施例に用いられた。

１、　ＰＳＶ−１３−これは通常のＨａｒｖｅｙ−Ｒａｓ　ｐ２１の過剰発現に よって形質転換されたＮ１）１３Ｔ３細胞である。

２、　ＮＩＨ３Ｔ３−これは形質転換されていないが、不死のマウス繊維芽細胞 である。

３、　ＮＩＨ３Ｔ３（Ｓｖ４８０）−コ、ｔＬｆ！ヒト結腸癌腫細胞系５Ｗ４８ ０からＤＮＡでトランスフェクト及び形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞である。

５Ｗ４１１０細胞は、活性化Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子（これは１２位にバリンを有す る活性化ｒａｓ　ｐ２１をエンコードする）を含んでいる。このようにＮＩＨ３ Ｔ３（Ｓν４８０）は１２位にバリンを有するこの活性化された細胞性ヒトｐ２ １を表現する。

４、　ＰＳＶ−Ｌ）ＩＥＪ又はＬＭＥＪ−これは１２位にバリンを有する活性化 された細胞性Ｈａ−ｒａｓ　ｐ２１でトランスフェクトされ、そうして形質転換 されたＮＩＨ３Ｔ３細胞である。　ＮＩＨ３Ｔ３細胞中にトランスフェクトされ たＤＮＡはＥ」で表わされるヒト膀胱癌腫から誘導される。したがって、ＰＳＶ −ＬＭＥＪは１２位にバリンを有する活性化されたｐ２１を含んでいる。

５、３−２−これは１２位のグルタミン酸をエンコードする活性化されたＨａ− ｒａｓ　ｐ２１でトランスフェクトされ、そうして形質転換されたＮ　Ｉ　！（ ３Ｔ３細胞である。

６、３Ｔ３−Ｎ−ｒａｓ又はＮＩＨ３Ｔ３（Ｎ　ｒａｓ）−これは活性化された ７、　ＫＮＲＫ−これはｖｌｒａｌ−Ｋｉｒｓｔｅｎ遺伝子（これは１２位にセ リンを有する活性化されたｐ２１をエンコードする）で形質転換された通常のラ ット腎臓細胞からなる細胞系である。

８．　ｖ−Ｈａ−ｒａｓ−これはｖｉｒａｌ−Ｈａｒｖｅｙ　ｒａｓ遺伝子（こ れは１２位にアルギニンを有する活性化されたｐ２１をエンコードする）で形質 転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞である。

９、　Ｎ１）Ｉ−Ｚｉｐ　Ｒａｓ　Ｋ−３−これは１２位のグリシンをエンコー ドする通常のＫｉ−ｒｓ　ｐ２１の過剰発現により形質転換されたＮ１）１３Ｔ ３細胞である。

１０、　ＡＭＬ−１−これはヒト急性骨髄性白血病細胞系（これは１３位にアス バルチン酸を含む活性化されたＮ　ｒａｓ　ｐ２１を含む）からＤＮＡでトラン スフェクトされたＮ１）１３Ｔ３細胞である。

１１、７１４４−１−、ｍれはヒト胸部肉腫細胞系（ｌＩｓ０５７８ｔ）　　（ 、：れは１２位にアスバルチン酸を含む活性化されたｐ２１を含む）がらＤＮＡ でトランスフェクトされたＮ１）１３Ｔ３細胞である。

１２、　Ａ２１８２−これは１２位にアルギニンを有する活性化されたｐ２１を 含むヒト癌腫細胞系である。

１３、ＮＩＨ３Ｔ３（ａｙｓ−１３）−これは活性化されたＨ　ｒａｓ遺伝子（ これは１３位にシスティンを有する活性化されたｐ２１をエンコードする）でト ランスフェクトされ、そうして形質転換されたＮ１）１３Ｔ３細胞である。

１４、　Ａ３４９−これは１２位にセリンを含む活性化されたＩ）２１を表現す るためにレポートされたヒト肺癌腫細胞系である。

次の操作は、ヌードマウスに腫瘍を形成するために用いられた：組織培養フラス コ中から細胞を採取し、遠心分離してベレットを形成し、４０〜８０ｘ１０６ｃ ｅｌｌｓ　／ｍｌの濃度まで希釈した。０．２５ｍ１すなわち１０〜４０ＸＬＯ ’　ｃｅｌｌｓをマウスの臀部に皮下接種した。腫瘍の外観のためにマウスを毎 日観察レニ。

腫瘍をサイズが２〜４印になったときに切除した。ＥＤＴＡでコートされた管に 血液を収集することにより、血漿を調製した。

実施例１ 培養液中のＲａｓ　　ｐ２１の検出 ｒａｓ　　ｐ２１の正常または活性化型を示す種々の腫瘍細胞ラインを数日間培 養フラスコにて培養し、ついで培養液を取り除き、液中にｌａｓ　　ｐ２１蛋白 質の正常または活性化型が存在するか否過判定した。

ｒａｓ　　ｐ２１が細胞培養液中に放出されたか否かを判定するため２つの生化 学的方法が用いられた。最初にｒａｓｐ２１が培養液から抗ｐ−２１ｐａｎ反応 性モノクローン抗体（ｒａｓ　　１０）を用いて免疫濃縮された。このｒａｓｐ ２１はついでウヱスターンプロットと呼ばれる免疫プロット法を用いて検出をお こなった。　培養中の細胞から得られた細胞培養液、たとえばＰＳＶ−１３およ びＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３（ＳＷ４８０）または細胞培養媒体４ｍｌを、抗ｐ−２１モ ノクローン抗体（ｒａｓ　　１０）を用いて１時間培養した。培養後、ラビット 抗マウス免疫グロブリン蛋白質Ａセファロースの複合体を培養液および抗ｐ−２ １モノクローン抗体を収容した試験管に３０−６０分間加えた抗ｐ−２１モノク ローン抗体を捕捉した。　１時間の培養後、遠心分離しベレットを生成させた。

このベレットをＲＩＰＡ　（１，０％のＴｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００，０，１％ のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、０．１５Ｍナトリウムデオキシコレー ト、０゜１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５ＴＲＩＳ−１（ＣＩ、およびプロＩｔ オアーゼ抑制剤である１、ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ） を含む緩衝液）で数回洗浄した。

最後に２−メルカプトエタノール（２−Ｍ　Ｅ　）を含むドデシル硫酸ナトリウ ムで洗浄した。得られた物質を１００℃で５分間加熱した。このｒａｓ　　ｐ２ １を含む液体を１２．５％のポリアクリルアミドゲルに適用した。

還元性緩衝液および加熱で処理し、培養液中に放出された細胞蛋白質を、ゲル中 に電流を流すことにより分子量に応じて分別した。ついで蛋白質を電気泳動的に 、５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むホスフニート緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ ）でブロッキングしたニトロセルロース膜に移した。このｒａＳ蛋白質含浸ニト ロセルロースを抗ｐ２１　ｐａｎ反応性モノクローン抗体（ｒａｓ　　１０）、 モノクローン抗体（ＤＷＰ）または陰性コントロール抗体を用いて１時間培養し た。なお、特別の指示がない限り、陰性コントロールとして、通常のマウス血清 が用いられた。

ｒａｓ　　１０、モノクローン抗体（ＤＷＰ）または陰性コントロール抗体で培 養した後、ニトロセルロース膜をＰＢＳ−ＮＰ−４０液で３回洗浄した。これら の膜をホウスラデッシニベルオキダーゼ（ＨＲＰ）に結合させた抗マウス免疫グ ロブリンで１時間培養し、マウス抗体の検出をおこなった。

抗マウス免疫グロブリン−ＨＲＰ複合体はＢｉｏ−Ｒａｄ試験場（Ｒｉｃｈｍｏ ｎｄ　　カナダ）から購入したものである。このニトロセルロース膜をＰＢＳ− ＮＰ−４０液で３回洗浄し、基材として４−クロロ−１−ナフトールを用い、培 養をおこない、反応を完了させた。

その結果、種々の細胞ラインからのｒａｓ　　ｐ２１蛋白質がここで用いられた 方法、（すなわち、１２位にアルギニン置換を有する再結合性Ｈａ−ｒａｓ　　 ｐ２１　（Ｒａｓ　　１０）に対して生成された抗ｐ２１モノクローンを用いて ｒａｓｐ２１を免疫濃縮し、をついで上述のようにモノクローン抗体を用いたウ ェスターンプロットフォーマット中にて検出する方法）を用い、培養液中で検出 しうろことが意外にも判明した。さらに、１２位にバリン置換を有する活性ｐ２ １がＤＷＰのモノクローン抗体を用いＮＩＨ３Ｔ３　（ＳＷ４８０）の培養液中 に検出しうろことが判明した。

上記同様の実験がＰＳＶ−１３から得られた培養液を用いておこなわれた。抗ｐ ２１ｐａｎ反応性モノクローン抗体（ｒａｓ　　１０）を免疫濃縮試薬およびプ ロッテング試薬として用い上記方法によりｐ２１を検出した。ＤＷＰをプロッテ ング試薬として用いたとき、ＰＳＶ−１３細胞ラインからｐ２１をプロットする ことができなかった。なぜならば、ＰＳＶ−１３は１２位ではアミノ酸バリンを 有する活性ｒａｓｐ２１蛋白質を示さないからである。

上述のＰＳＶ−ＬＭ−ＥＪお、Ｊ：びＮＩＨ３Ｔ３　（ＳＷ４８０）として認め られた細胞ラインからの培養液を用い別の実験をおこなった。ｒａｓ　　１０を ｐ２１を免疫濃縮するために用いた。ｒａｓ　　１０、ＤＷＰおよび陰性コント ロールをプロッテング工程において用いた。ｒａｓ　　１０およびＤＷＰはＰＳ Ｖ−ＬＭ−ＥＪおよびＮＩＨ３Ｔ３　（ＳＷ４８０）培養液からのｒａｓ　　ｐ ２１蛋白質と反応した。これに対し、陰性コントロールは突然変異のｐ２１蛋白 質を含む培養液とは反応しなかった。すなわち、活性ｐ２１は１２位にバリンを 有する活性ｒａｓ　　ｐ２１蛋白質を示すものとして知られている細胞ラインか ら得られた細胞培養液中に検出された。

実施例２ 免疫プロットを用いてのマウス血清中での活性および正常ｐ２１の検出 約１０−２１０−２０Ｘ１０６ＰＳＶ−Ｌ細胞または約１Ｏ−２０Ｘ１０’　Ｐ ＳＶ−１３細胞をヌードマウスに皮下注射により接種し、腫瘍を形成した。腫瘍 が発達したとき、これらマウスを殺し、血液を採取した。この血液について、腫 瘍の成長により血液中に混入したｐ　２１の存在について測定した。この測定は 上記免疫濃縮およびウェスターンブロッテング法、さらに実施例３の免疫評価法 を用いておこなわれた。

ＰＳＶ−ＬＭ−ＥＪ腫瘍を有するマウスからの血液はウェスターンプロットにて ＤＷＰと反応することが見出だされた。

これはこのＢ瘍保持マウスの血液中に１２位にアミノ酸バリンを有する突然変異 ｐ２１蛋白質の存在を示すものである。

ＰＳＶ−１３を注射したマウスの血液はＤＷＰと反応しなかったが、抗ｐ２１　 　ｐａｎ反応性抗体、ｒａｓ　　１０と反応した。これはマウス血液中に正常ｒ ａｓ　　ｐ２１が存在することを示すものである。これらの意外な結果からＰＳ Ｖ−ＬＭ−ＥＪを注射したマウスの血液中に活性ｐ２１が検出されることは腫瘍 保持マウスの血液中に活性１）　２１が検出されることが実証された。さらに、 正常ｒａｓ　　ｐ２１蛋白質は正常ｒａｓ　　ｐ２１蛋白質を示すＰＳＶ−１３ を保持するマウスの血液中に存在することが実証された。

実施例３ 免疫評価実験記録 この実施例は一般的免疫評価実験記録をしめすものである。

マイクロタイタープレートのウェルを最初に上記抗体または抗体のカクテルのす くなくとも一つで塗布した。

この抗体の量を炭酸塩緩衝液（ｐｈ、　　９．６）中にて約２゜０００ｎｇ−５ ００ｎｇとし、これをマイクロタイタープレートのウェルに移し、−昼夜、４℃ で培養した。抗体をマイクロタイタープレートのウェル表面にて不動化したのち 、余分の液体を除去し、２００μｌのブロッキング緩衝液を各ウェルに加えた。

この緩衝液は１０％のラクトースと２％のウシ血清アルブミンを含んでいた。ブ ロッキング緩衝液は非特定的結合を防止するためのものである。余分のブロッキ ング緩衝液を除去した。２００μｌのブロッキング緩衝液をさらに各ウェルに加 え、１時間培養した。ついで緩衝液を除去し、プレートを風乾した。

サンプル（細胞溶解物、腫瘍溶解物、または種々の培養液中なる）を各ウェルに 加え、室温で数時間ないし一昼夜の間、培養した。各ウェルをりん酸塩緩衝液（ Ｐ　Ｂ　Ｓ）および０゜０５％のＴｗｅｅｎ　　２０で６回洗浄した。さらにプ レートを３回洗浄し、１８０度回転し、さらに３回洗浄した。

検出試薬は検出可能にラベルした抗体または抗体のカクテルであり、これを５０ ％ラビット血清のウェル中に加え、３０分培養した。好ましくは検出抗体はビオ チンに結合させる。

プレートをＰＢＳおよび０．０５％のＴｗｅｅｎで６回洗浄したのち、ステレブ タビジンーホウスラデッシ　ペルオキシダーゼを１％のウシ血清アルブミンの状 態にて各ウェルに加え、３７℃で、３０分間培養した。プレートをさらに６回洗 浄した後、クエン酸塩（ｐｈ５．０）に涜解させたオルトフェニレンジアミン（ ＯＰ　Ｄ）を３７℃で、３０分間、加え、検出をおこなった。さらに４．５Ｍ硫 酸を加え反応を終了させた。

第１図は基本的サンドウィッチ免疫評価フォーマットを示す図である。

実施例４ 細胞および組織抽出物からのｒａｓ　　ｐ２１の検出および定量 マイクロタイタープレートのウェルを上記ｒａｓ　　１１として示される抗ｐ２ １モノクローン、またはＨａ又はＮｒａｓ　　ｐ２またんばく質に特異なモノク ローン抗体で塗布した。

この実験に用いられた溶解物は上記のＰＳＶ−１３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ ３　（ＳＷ４８０）　、ＫＮＲＫ、およびＮＩＨ−（Ｎ−ｒａｓ）の細胞ライン からのものである。

ヌードマウスの組織抽出物から得られる細胞溶解物は従来の方法で得ることが出 来よう。培養により得られた細胞または培養細胞で接種されたマウスに基づく腫 瘍からの溶解物を抗ｐ２１ｐａｎ反応性ラビットポリクローン抗体で塗布された プレートに加え、−昼夜培養された。その後、プレートを洗浄し、未反応の細胞 溶解物を除去した。

プレート上に塗布された抗体に結合された細胞溶解物に存在するｐ２１はビオチ ニル化抗ｐ　２１　　ｒ　ａ　ｓ　　１０モノクローンを用いて検出することが できる。このビオチニル化モノクローン抗体はついで基材としてステレブタビジ ンーホウスラデッン　ペルオキシダーゼおよび０−フェニレンジアミンを用いて 色素原的に検出することができる。これらの結果から抗−Ｎモノクローン抗体で 塗布されたプレートはＨｒａＳ　　ｉ：＋２またんばく質のみを検出することが でき、Ｋ　＞　２　Ａ　５Ｋｉ２Ｂ、またはＮ　　ｒａｓ　　Ｉ）２またんばく 質を検出することはできない。抗−Ｎモノクローン抗体で塗布されたプレートは Ｎ　　ｒａｓ　　ｐ２またんばく質のみを検出することができ、Ｈａ、Ｋ１２Ａ 、Ｋ１２Ｂ　　ｒａｓ　　ｐ２またんばく質を検出することはできない。ｒａｓ 　　１１として指定された抗ｐ２１モノクローンで塗布されたプレートは上述の 全ての細胞ラインからｐ２またんばく質を検出することができる。

この結果から、ＨｒａｓおよびＮ　　ｒａｓ　　Ｉ）２１　　は本発明の免疫評 価フォーマットを用いて検出することができることが明らかである。

実施例５ ラビットポリクローン抗り２１　　ｐａｎ反応性抗体をマイクロプレートの表面 上に捕捉試薬として不動化した。ＮＩＨ３Ｔ３　（ＳＷ４８０）およびＮＩＨ３ Ｔ３細胞として指定された２つのマウス細胞ラインから得た培養上澄液を実施例 ３の方法に従い不動化捕捉試薬と反応させた。培養後、プレートにビオチンでラ ベルした抗ｐ２１　　ｒａｓ　　１０を加え、実施例３と同様にして免疫評価を おこなった。

結果を第２図に示す。Ｙ軸は光学的密度を示し、Ｘ軸は上澄液の稀釈における一 つを示している。この第２図からｒａｓ　　ｐ２またんばく質はＮ　Ｉ　Ｈ３７ ３の上澄液よりＮＩＨ３Ｔ３　（ＳＷ４８０）からの上澄液に高いレベルで存在 することが明らかとなった。

ｒａｓ　　ｐ２１のレベルの違いは細胞成長速度の差にほとんど基づくものであ ると考えられる。ＮＩＨ３Ｔ３　（ＳＷ４８０）はＮＩＨ３Ｔ３細胞に変形こと があるがＮＩＨ３７３細胞は変形しない。

この様なことから、ｒａｓ　　ｐ２またんばく質は培養液中に放出され、この放 出されたｌ）　２１が上述の免疫評価フォーマットにより検出されることが明ら かとなった。この免疫評価の結果は実施例１の生化学的分析の結果と一致する。

実施例６ 皮下腫瘍を保持するヌードマウスの血漿中のｒａｓ　　ｐ２１の検出 上記の免疫評価および生化学的分析の結果によればＰＳＶ−１３＠瘍細胞はＰＳ Ｖ　　ＬＭ　（ＥＪ）細胞より、高いレベルのｐ２１を含む。したがって、ＰＳ Ｖ−１３腫瘍を持つマウスからの血漿はＰＳＶ　　ＬＭ　（ＥＪ）＠瘍を持つマ ウスからの血漿より多い量のｒａｓ　　２１を含む。

実施例３の免疫評価フォーマットにより３つのタイプのマウスからの血漿を評価 した。すなわち、正常ヌードマウスの血漿、ＰＳＶ　　ＬＭ（ＥＪ）腫瘍を持つ ヌードマウスからの血漿、ＰＳＶ−１３腫瘍を持つマウスからの血漿を用いて研 究した。

親和性純化ラビット抗ｐ２１　　ｐａｎ　　反応性ポリクローン抗体を捕捉試薬 として用い、ビオチニル化ｒａｓ　　１０を検出試薬として用いた。

その結果を第３図に示す。正常マウスからの血漿には低いレベルのｐ２１が検出 され、正常ｒａｓ　　ｐ２１が通常、マウス血漿中に存在することを示している 。

高いレベルのｐ２１はＰＳＶ　　ＬＭ（ＥＪ）腫瘍およびＰＳＶ−１３腫瘍を持 つマウスからの血漿に検出された。この双方の場合、ｐ　２１のレベルは正常マ ウスの血漿から検出されるレベルを越えていた。この免疫評価の結果は実施例２ の生化学的分析の結果と一致するものである。すなわち、正常および活性化ｒａ ｓ　　ｐ２１蛋白質の双方が本発明の免疫評価法により検出された。

これらの結果はｒａｓ　　ｐ２またんばく質がマウスの循環系に放出され得るこ とのみならず、この放出されたｒａｓｐ２またんばく質が本発明の免疫評価法に よりマウスの血漿中にて検出され得ることを示している。

同じ捕捉および検出試薬を用いＰＳＶ　　ＬＭ（ＥＪ）腫瘍およびＰＳＶ−１３ １！瘍を持つマウスからの血漿におけるｒａｓ　　ｐ２１の相対量を測定する免 疫評価法がおこなわれた。

第４図はこの免疫評価法の結果を示している。これによれば、ＰＳＶ　　ＬＭ　 （ＥＪ）　腫瘍を持つマウスからの血漿に、ＮＩＨ３Ｔ３　（ＳＷ４８０）＠瘍 を持つマウスからのものより高いレベルのｒａｓ　　ｐ２１が見出だされた。こ れらの結果は実施例２の生化学的分析の結果と一致するものである。

第４図にはＦ１マウスの血漿中のｒａｓ　　ｐ２１が本発明の免疫評価法により 検出されることを示している。

実施例７ ｒａｓ　　ｐ２またんばく質の存在についてのヒト血清および血漿の評価 血清４コのヒト血清試料（ＡＳＢＳＣ，Ｄ）および４コのヒト血漿試料（ＡＳＢ ＳＣ，Ｄ）を正常な４人から採取した。

これらの試料をラビット抗ｐ２１　　ｐａｎ　　反応性ポリクローン抗体を捕捉 試薬として、ビオチニル化ｒａｓ　　１０を検出試薬として反応用いた。　第５ 図はその結果を示している。

第５Ａ図は血漿についての結果を示す。Ａ％Ｂ％Ｃ，Ｄのヒト血清試料にはｒａ ｓ　　ｐ２１は検出されなかった。感度の向上により検出が可能か否かは明らか でない。しかし、ヒト血漿試料Ａ％ＢＳＣ，Ｄにおいては種々のレベルのｒａｓ ｐ２１が検出された。

ヒト血漿試料中のｒａｓ　　ｐ２１の存在、ヒト血清試料中のｒａｓ　　ｐ２１ の不存在を確認するため、免疫濃縮およびウェスターンプロットの方法が上述の ようにしてなされた。

ヒト血清および血漿サンプルＡ、Ｂ、Ｃ％Ｄを抗ｐ２１−ｐａｎ反応性ラビット ポリクローン抗体で培養し、各サンプルからのｒａｓ　　ｐ２またんばく質を免 疫濃縮した。この方ｉｆ；Ｌ抗ｐ　２１　　ｐ　ａ　ｎ反応性マウスモノクロー ン抗体の代わりに抗ｐ２１　　ｐａｎ反応性ラビットポリクローン抗体を使用し た以外は実施例１と同じである。免疫濃縮ののち、抗ｐ２１　　ｐａｎ反応性ラ ビットポリクローン抗体とｒａｓ　　ｐ２またんばく質とからなる免疫複合体を ヤギ抗ラビット免疫グロブリンたんばく質Ａの複合体と反応させ１時間に亘って 培養させた。結果物を遠心分離しベレットを形成させ、これをＲＩＰＡで数回洗 浄した。さらに２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含むドデシル硫酸ナト リウム還元性緩衝液を用いて最終的に洗浄した。得られた物質を１００℃で５分 間加熱し、ｒａｓ　　ｐ２またんばく質を含む液体を得た。この液体を１２．５ ％のポリアクリルアミドゲルに適用した。

この緩衝液および加熱により培養液中に放出された細胞たんばく質をゲル中に電 流を流すことにより分子量に応じて分別した。これらたんばく質を電気泳動的に ５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳでブロックされたニトロセルロース膜に移 した。

このｒａｓ　　ｐ２１含浸ニトロセルロースフィルターを抗ｐ２１　　ｐａｎ反 応性モノクローン抗体および陰性コントロール（ＲＰＣ−５：マイ二ロマたんば く質）で１時間培養した。

このニトロセルロース膜をＰＢＳ−ＮＰ−４０溶液で３回洗浄した。ついでホウ スラデッシベルオキダーゼに結合した抗マウス免疫グロブリンで培養した。この 膜をＰＢＳ−ＮＰ−４０溶液で３回洗浄し、基祠として４−クロロ−１−ナフト ールで培養し、反応を完了させた。

この生化学的結果によりｒａｓ　　ｐ２またんばく質はＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄのヒト血 漿から免疫濃縮され、ウェスターンプロットにより可視化されたことが判明した 。また、この結果からｒａｓ　　ｐ２またんばく質が上記免疫フォーマット中の ヒト血漿中に検出されたこと、また、ヒト血清中にｒａｓ　　ｐ２またんばく質 が検出されなかったことが確認された。

例８ ヒトラス遺伝子を含有する３種のマウスセルラインにおけるラスｐ２１蛋白質の 検出および定量 例３に記載した免疫検定フォーマットを用いて、ヒトラス遺伝子を含有する３種 のマウスセルライン中のラスｐ２１蛋白質の存在およびレベルを決定した。これ らのセルラインは、以下のものであった：Ｓ−２、ＰＳＶ　　ＬＭ　（ＥＪ）　 、およびＰＳＶ−１３゜ 先に説明したように、捕捉試薬は、抗ｐ２］汎反応性ウサギポリクローナル抗体 であり、検出試薬は、ビオチニル化ラス１０であった。

上記例１で説明したウェスタンプロット研究は、Ｓ−２セルラインが、ＰＳＶ− １３セルラインにより表現されたラスｐ２ルベルと比較したとき、より低いラス ｐ２１蛋白質を表現したことを示した。ＰＳＶ　　ＬＭ（ＥＪ）セルラインは、 ＰＳＶ−１３により表現されたものより低く、Ｓ−２セルラインにより表現され たものより高いレベルでラスｐ２１蛋白質を表現した。

第６図は、ウェスタンプロット研究でなされた観察を確証する免疫検定結果を示 している。

１２位にアルギニンを含有する組換え体Ｈａシラス）２１蛋白質を用いて標準曲 線を作成することにより、定量分析をおこなった。第７図は、種々の濃度の組換 え体Ｈａ−ララス２１蛋白質を、固定化された抗ｐ　２１汎反応性ウサギポリク ローナル抗体と反応させ、捕捉されたｐ２１をビオチニル化抗ｐ２１汎反応性マ ウスモノクローナル抗体ラス１０を用いることによって検出することにより作成 された標準曲線を示している。免疫検定は、上記例３に記載した通りであった＠ 得られた光学密度の値を、試験したラスｐ２１蛋白質の良に対してプロットした 。結果は、以下の表３に示されている。

この標準曲線を用いて、５−２セルラインが、細胞蛋白質μｇ当り２４．５ｐｇ のラスｐ２１蛋白質を含有し、ｐｓｖＬＭ（ＥＪ）セルラインが、細胞蛋白質μ ｇ当り７１．３ｐｇのラスｐ　２１蛋白質を含有し、ＰＳＶ−１３セルラインが 、細胞蛋白質μｇ当り１５４．０ｐｇのラスｐ２１蛋白質を含有していたことが 決定された。これらの結果は、ウェスタンプロット研究を用いてなされた定性的 観察と一致した。

このことは、例３に記載した免疫検定フォーマットを使用して、試料中に存在す るラスｐ２１の量を定量するために標準曲線を作成できることを証明している。

全蛋白質のμｇ当りの　　表現の相対 腫瘍　　　　　　　Ｅ）２１のｐｇ　　　　　　レベル５７−２　　　　　　２ ５．４　　ｐｇ／μｇ１．ＯＬＭＥ　Ｊ　　　　　　７１．３ｐ　ｇ／μｇ２． ９ＰＳＶ−１３１５４，Ｏｐｇ／μｇ６．３正常胸部組織の１０個の使用と胸部 癌の１０個の試料は、マサチューセッツ州ボストン所在のダナーファ＝バー・キ ャンサー・インスチチュートのダニエル・ヘイズ（ＤａｎｉｅｌＨａｙｅｓ）博 士から入手した。これらの試料は、上記例３に記載の免疫検定フォーマットを用 いて分析した。抗ｐ　２１汎反応性ウサギポリクローナル抗体を捕捉試薬として 用い、ビオチニル化ラス１０を検出試薬として用いた。

結果は、第８図に示されている。棒は、蛋白質μｇ当りの１）　２１のｐｇとし て表現されたラスｐ２１蛋白質の量を表わす。主として脂肪および結合組織と、 非常にわずかな上皮からなる正常胸部組織は、約２ｐｇラスｐ２１／μｇ蛋白質 を含有し、胸部症使用の少なくとも５個、ナンバー３１．４０゜５１．５２およ び７０は、約８ないし１８１）ｇラスｐ２１／μｇ蛋白質を含有していることが 分かった。分析した１０個のヒト胸部症試料の内、約８０％の試料が、正常胸部 組織より高いラスｐ２１の表現を示した。

例１０ イリノイ州シカゴ所在のノーザーン大学のジエイムズ・ラドセビッチ（Ｉａａ＋ ｅｓ　Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈ）博士から入手したヒト結腸癌腫を、上記例３に記 載した免疫検定フォーマットを用いて評価した。抗ｐ２１汎反応性ポリクローナ ル抗体を捕捉試薬として用い、ビオチニル化ラス１０を検出試薬として用いた。

結果は、第９図に示されている。ラスｐ２１蛋白質レベルが、約１．Ｏｐｇ／μ ｇ蛋白質から約３．５ｐｇ／μｇ蛋白質にわたることが分かった。

例１０で示された結果は、ラスｐ２１蛋白質が、上記免疫検定フォーマットを用 いて、ヒト結腸癌試料中で検出され、定量されたことを証明している。

例　　１１ ラスｐ２１蛋白質の存在について以下のものを評価するために、例３に記載した 免疫検定フォーマットを用いた。

（１）正常ヌードマウスからの血漿、 （２）ＰＳＶ　　ＬＭ　（ＥＪ）＠瘍を担持スルマウスカラノ血漿、 （３）ＰＳＶ−１３腫瘍を担持するマウスからの血漿、（４）ＮＩＨ３Ｔ３　（ Ｎラス）を担持するマウスからの血漿、および （５）ＮＩＨＺｉｐ−ラスに一３腫瘍を担持するマウスからの血漿。

抗ｐ２１汎反応性ウサギポリクローナル抗体を捕捉試薬として用い、ＤＷＰと表 示されるモノクローナル抗体を検出抗体として用いた。ＤＷＰは、１２位にバリ ンを含有する活性化ラスｐ２１蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１２位に グリシンを含有するエピトープには結合しない。

第１０図に示されている結果は、ビオチニル化ＤＷＰは、ＰＳＶ　　ＬＭ（ＥＪ ）腫瘍担持マウスから得た血漿とのみ反応したことを示している。これは、結論 的に、１２位にバリンを含有する活性化ラスｐ２１蛋白質が、ＰＳＶ　　ＬＭ（ ＥＪ）腫瘍担持マウスの血漿中に放出／離脱（ｓｂｅｄ）され、およびこの放出 ／離脱した、１２位にバリンを含有する活性化ラスｐ　２１蛋白質がこの免疫検 定フォーマットを用いて検出できたことを証明した。それは、ウェスタンプロッ トにより得られていた結果とも一致していた。

例１２ マイクロタイターウェルを抗ｐ２１汎反応性ウサギポリクローナル抗体でコート した。ついで、この固定化捕捉試薬を１２位にグリシン、アルギニン、またはア スパラギン酸を含有する組換え体ｐ２１蛋白質と反応させた。この例で使用した 組替え体上白質は、マサチニーセッッ州ボストン所在のダナファーバー（Ｄａｎ ａ−Ｆａｒｂｅｒ）　　・キャンサー・インスチチュートのジオフリー・クーパ ー（Ｇｅｏｆｆｒｅｙ　Ｃｏｏｐｅｒ）博士から入手した。

固定化された抗ｐ　２１汎反応性ウサギポリクローナル抗体−ラスｐ２１蛋白質 複合物を、モノクローナル抗体であるビオチン標識Ｒ２５６である検出試薬と反 応させた。Ｒ２５６は、上に説明されている。免疫検定結果は、ビオチニル化Ｒ ２５６が１２位にアルギニンを含有する組換え体とのみ反応したことを示した。

すなわち、本発明の免疫検定フォーマットを用いて、活性化ラスｐ２１を検出す ることができた。第１１図は、Ｒ２５６が、１２位にアルギニンを有する組換え 体ｐ２１のみを検出することを示すグラフである。

例　　１３ 例３記載の免疫検定の、種々の活性化ラスｐ２１蛋白質を測定する能力を例示す るために、８つの異なるセルラインを用・いて一連の実験をおこなった。

以下のセルラインを使用した：　（ｉ）セルラインＡＭＬ−１、（ｉ　ｉ）セル ラインＴ　　１４４−１、（ｉ　ｉ　ｉ）セルラインＮＩＨ３７３（システィン −１３）、（ｉｖ）セルラインＰＳＶ−１３、（Ｖ）セルラインｖ−Ｈａ−ラス 、（ｖｉ）セルラインＡ２１８２、（ｖｉｉ）セルラインＰＳＶ　　ＬＭ（ＥＪ ）、および（ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）セルラインＡ３４９゜抗ｐ２１汎反応性抗体をマ イクロタイタープレートウェル上に固定化した。固定化後、捕捉試薬を、上記の ８つのセルラインの１つからの溶解物（Ｉｙｓａｔｅ）とともにインキュベート した。得られた免疫複合物を、以下の異なるビオチニル化抗体の１つと反応させ ることによって、そのラスｐ２１蛋白質の存在について検定した：抗１）２１汎 反応性抗体モノクローナル抗体（ラス１０）、１３位にアスパラギン酸を有する 活性化ラスｐ　２１蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１３位にグリシンを 有するエピトープに結合しないモノクローナル抗体（モノクローナル抗体１４６ ）、１２位にアスパラギン酸を有する活性化ラスｐ２１蛋白質のエピトープに特 異的に結合し、１２位にグリシンを有するエピトープに結合しないモノクローナ ル抗体（モノクローナル抗体１１３）、１２位にバリンを有する活性化ラスｐ２ １蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１２位にグリシンを有するエピトープ に結合しないモノクローナル抗体（ＤＷＰ）　、１２位にアルギニンを有する活 性化ラスｐ２１蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１２位にグリシンを有す るエピトープに結合しないモノクローナル抗体（Ｒ２５６）　、および１２位に セリンを有する活性化ラスｐ２１蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１２位 にグリシンを有するエピトープに結合しないモノクローナル抗体（Ｓ１１０７− ８．３）。

モノクローナル抗体１４６は、セルラインＡＭＬ−１によって表現された１３位 にアスパラギン酸をａＭする活性化ラスＰ２１蛋白質を特異的に検出した。第１ ２図は、本発明の免疫検定においてＭａｂ１４６を用いて得られた結果を示して いる。

モノクローナル抗体１１３は、セルラインＴ　　１４４−１によって表現された １２位にアスパラギン酸を含有する活性化ラスＰ２１蛋白質を特異的に検出した 。

モノクローナル抗体ＤＷＰは、セルラインＰＳＶ　　ＬＭ（ＥＪ）によって表現 された１２位にバリンを含有するラスＰ２１蛋白質を特異的に検出した。

モノクローナル抗体Ｒ２５６は、セルラインＡ２１８２およびセルラインｖ−Ｈ ａ−ラスによって表現された１２位にアルギニンを含有するラスＰ２１蛋白質を 特異的に検出した。

モノクローナル抗体５１１０７−８．３は、セルラインＡ３４９によって表現さ れた１２位にセリンを含有するラスＰ２１蛋白質を特異的に検出した。

これは、結論的に、活性化ラスＰ２１蛋白質を検出する本発明の免疫検定フォー マットの能力を証明している。

ＯＤ、４９０　ＮＭ ”Ｒ２５６−ｂ　　　Ｉ／２００　　　”ｆｓ、ｙ−、プしタタオＺり　（ｎ９ ） −ｏ−ｒｐ　２１　（Ａｒｑ　１２） −＋−ｒｐ２１　（Ｇｌｙ　１２） −ａ−ｒｐ　２１　（Ａｓｐ　１２） 口重Ｔ り咄所１乞イする　Ｄ−／ｌＦる　才ｍ’ａａゴＳ４０　　　１０　　２０　　 ３０　　４０　　５０　　６Ｏ−１）−ＡＭＬ−１ 一今−ＣＹＳ−１３ 一骨−ＴＩ４４−１ 一◆−ＰＳＶ−１３ 四【予 国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．体液、体組織または体細胞中の全細胞ラスｐ２１，活性化ラスｐ２１、また はラス蛋白質の個々のハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）、キルステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ ）、またはＮ−ラスファミリーを検出、定量または分類するための免疫検定であ って、（ａ）ラスｐ２１蛋白質を有するものと予測される体液、体組織または体 細胞を、固定化されたラスｐ２１捕捉試薬と反応させる工程にして、該試薬は、 （ｉ）抗ｐ２１汎反応性抗体、（ｉｉ）１２位にアルギニン、グルタミン酸、ア スパラギン酸、セリンまたはシステインのアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白 質のエピトープに特異的に結合し、１２位にグリシンを含有するエピトープに結 合しないモノクローナル抗体、（ｉｉｉ）１３位にアスパラギン酸またはバリン のアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１３ 位にグリシンを含有するエピトープに結合しないモノクローナル抗体、（ｉｖ） ６１位にヒスチジン、リシン、ロイシンまたはアルギニンのアミノ酸置換を有す る活性化ラス蛋白質のエピトープに特異的に結合し、６１位にグルタミンを含有 するエピトープに結合しないモノクローナル抗体、（ｖ）ハーベイラス蛋白質と 反応性であり、ラス蛋白質のキルステン２Ａ、２ＢまたはＮファミリーと反応性 でないモノクローナル抗体、（ｖｉ）Ｎラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質 のキルステン２Ａ、２Ｂまたはハーベイファミリーと反応性でないモノクローナ ル抗体、（ｖｉｉ）キルステン２Ａラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質のキ ルステン２Ｂ、Ｎまたはハーベイファミリーと反応性でないモノクローナル抗体 、（ｖｉｉｉ）キルステン２Ｂラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質のキルス テン２Ａ、Ｎまたはハーベイファミリーと反応性でないモノクローナル抗体から なる群の中から選ばれた少なくとも１種の抗体であり、（ｂ）工程（ａ）の生成 物を、（ｉ）ウェル当り１ないし１０ｎｇの抗体を用いて、上記の標準条件を使 用したマイクロタイタープレート系ＥＬＩＳＡにおいて試験したとき、約１．５ ないし約２．５の光学密度を提供する抗ｐ２１汎反応性モノクローナル抗体、（ ｉｉ）１２位にアルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリンまたはシス テインのアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白質のエピトープに特異的に結合し 、１２位にグリシンを含有するエピトープに結合しないモノクローナル抗体、（ ｉｉｉ）１３位にアスパラギン酸またはバリンのアミノ酸置換を有する活性化ラ ス蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１３位にグリシンを含有するエピトー プに結合しないモノクローナル抗体、（ｉｖ）６１位にヒスチジン、リシン、ロ イシンまたはアルギニンのアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白質のエピトープ に特異的に結合し、６１位にグルタミンを含有するエピトープに結合しないモノ クローナル抗体、（ｖ）ハーベイラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質のキル ステン２Ａ、２ＢまたはＮファミリーと反応性でないモノクローナル抗体、（ｖ ｉ）Ｎラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質のキルステン２Ａ、２Ｂまたはハ ーベイファミリーと反応性でないモノクローナル抗体、（ｖｉｉ）キルステン２ Ａラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質のキルステン２Ｂ、Ｎまたはハーベイ ファミリーと反応性でないモノクローナル抗体、（ｖｉｉｉ）キルステン２Ｂラ ス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質のキルステン２Ａ、Ｎまたはハーベイファ ミリーと反応性でないモノクローナル抗体からなる群の中から選ばれた少なくと も１種の検出可能に標識された抗体と反応させる工程、および（ｃ）工程（ｂ） の生成物を検出、定量または分類する工程 を包含する免疫検定。
2. ２．捕捉試薬が、抗ｐ２１汎反応性抗体であり、検出可能に標識された抗体が、 １２位にアルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリンまたはシステイン のアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１２ 位にグリシンを含有するエピトープに結合しない少なくとも１種のモノクローナ ル抗体である請求の範囲第１項記載の免疫検定。
3. ３．捕捉試薬が、抗ｐ２１汎反応性抗体であり、検出可能に標識された抗体が、 １３位にアスパラギン酸またはバリンのアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白質 のエピトープに特異的に結合し、１３位にグリシンを含有するエピトープに結合 しない少なくとも１種のモノクローナル抗体である請求の範囲第１項記載の免疫 検定。
4. ４．捕捉試薬が、（ｉ）工２位にアルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、 セリンまたはシステインのアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白質のエピトープ に特異的に結合し、１２位にグリシンを含有するエピトープに結合しないモノク ローナル抗体または（ｉｉ）１３位にアスパラギン酸またはバリンのアミノ酸置 換を有する活性化ラス蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１３位にグリシン を含有するエピトープに結合しないモノクローナル抗体からなる群の中から選ば れた少なくとも１種の抗体であり、検出可能に標識された抗体が、ウェル当り１ ないし１０ｎｇの抗体を用いて、上記の標準条件を使用したマイクロタイタープ レート系ＥＬＩＳＡにおいて試験したとき、約１．５ないし約２．５の光学密度 を提供する抗ｐ２１汎反応性モノクローナル抗体である請求の範囲第１項記載の 免疫検定。
5. ５．捕捉試薬が、抗ｐ２１汎反応性抗体であり、検出可能に標識された抗体が、 ウェル当り１ないし１０ｎｇの抗体を用いて、上記の標準条件を使用したマイク ロタイタープレート系ＥＬＩＳＡにおいて試験したとき、約１．５ないし約２． ５の光学密度を提供する抗ｐ２１汎反応性モノクローナル抗体である請求の範囲 第１項記載の免疫検定。
6. ６．捕捉試薬が、抗ｐ２１汎反応性抗体であり、検出可能に標識された抗体が、 （ｉ）ハーベイラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質のキルステン２Ａ、２Ｂ またはＮファミリーと反応性でないモノクローナル抗体、（ｉｉ）Ｎラス蛋白質 と反応性であり、ラス蛋白質のキルステン２Ａ、２Ｂまたはハーベイファミリー と反応性でないモノクローナル抗体、（ｉｉｉ）キルステン２Ａラス蛋白質と反 応性であり、ラス蛋白質のキルステン２Ｂ、Ｎまたはハーベイファミリーと反応 性でないモノクローナル抗体、（ｉｖ）キルステン２Ｂラス蛋白質と反応性であ り、ラス蛋白質のキルステン２Ａ、Ｎまたはハーベイファミリーと反応性でない モノクローナル抗体からなる群の中から選ばれた抗体である請求の範囲第１項記 載の免疫検定。
7. ７．捕捉試薬が、抗ｐ２１汎反応性抗体であり、検出可能に標識された抗体が、 ６１位にヒスチジン、ロイシンまたはアルギニンのアミノ酸置換を有する活性化 ラス蛋白質のエピトープに特異的に結合し、６１位にグルタミンを含有するエピ トープに結合しない請求の範囲第１項記載の免疫検定。
8. ８．検出可能な標識が、ピオチンである請求の範囲第１項記載の免疫検定。
9. ９．体液、体組織または体細胞中の全細胞ラスｐ２１，活性化ラスｐ２１、また はラス蛋白質の個々のハーベイ、キルステン、またはＮ−ラスファミリーを検出 、定量または分類するための免疫検定であって、 （ａ）ラスｐ２１蛋白質を有するものと予測される体液、体組織または体細胞を 、固定化されたラスｐ２１捕捉試薬と反応させる工程にして、該試薬は、（ｉ） 抗ｐ２１汎反応性抗体、（ｉｉ）１２位にバリン、アルギニン、グルタミン酸、 アスパラギン酸、セリンまたはシステインのアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋 白質のエピトープに特異的に結合し、１２位にグリシンを含有するエピトープに 結合しないモノクローナル抗体、（ｉｉｉ）１３位にアスパラギン酸またはバリ ンのアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１ ３位にグリシンを含有するエピトープに結合しないモノクローナル抗体、（ｉｖ ）ハーベイラス蛋白質と反応性であり、蛋白質のキルステン２Ａ、２ＢまたはＮ ラスファミリーと反応性でないモノクローナル抗体、（ｖ）Ｎラス蛋白質と反応 性であり、ラス蛋白質のキルステン２Ａ、２Ｂまたはハーベイファミリーと反応 性でないモノクローナル抗体、（ｖｉ）Ｎラス蛋白質と反応性であり、ラスタン パク質のキルステン２Ａ、２Ｂまたはハーベイファミリーと反応性でないモノク ローナル抗体、（ｖｉｉ）キルステン２Ａラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白 質のキルステン２Ｂ、Ｎまたはハーベイファミリーと反応性でないモノクローナ ル抗体、（ｖｉｉｉ）キルステン２Ｂラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質の キルステン２Ａ、Ｎまたはハーベイファミリーと反応性でないモノクローナル抗 体からなる群の中から選ばれた少なくとも１種の抗体であり、（ｂ）工程（ａ） の生成物を、（ｉ）ウェル当り１ないし１０ｎｇの抗体を用いて、上記の標準条 件を使用したマイクロタイクープレート系ＥＬＩＳＡにおいて試験したとき、約 １、５ないし約２．５の光学密度を提供する抗ｐ２１汎反応性モノクローナル抗 体、（ｉｉ）１２位にバリン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セ リンまたはシステインのアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白質のエピトープに 特異的に結合し、１２位にグリシンを含有するエピトープに結合しないモノクロ ーナル抗体、（ｉｉｉ）１３位にアスバラギン酸またはバリンのアミノ酸置換を 有する活性化ラス蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１３位にグリシンを含 有するエピトープに結合しないモノクローナル抗体、（ｉｖ）６１位にヒスチジ ン、リシン、ロイシンまたはアルギニンのアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白 質のエピトープに特異的に結合し、６１位にグルタミンを含有するエピトープに 結合しないモノクローナル抗体、（ｖ）ハーベイラス蛋白質と反応性であり、ラ ス蛋白質のキルステン２Ａ、２ＢまたはＮファミリーと反応性でないモノクロー ナル抗体、（ｖｉ）Ｎラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質のキルステン２Ａ 、２Ｂまたはハーベイファミリーと反応性でないモノクローナル抗体、（ｖｉｉ ）キルステン２Ａラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質のキルステン２Ｂ、Ｎ またはハーベイファミリーと反応性でないモノクローナル抗体、（ｖｉｉｉ）キ ルステン２Ｂラス蛋白質と反応性であり、ラス蛋白質のキルステン２Ａ、Ｎまた はハーベイファミリーと反応性でないモノクローナル抗体からなる群の中から選 ばれた少なくとも２種の検出可能に標識された抗体と反応させる工程、および（ ｃ）工程（ｂ）の生成物を検出、定量または分類する工程 を包含する免疫検定。
10. １０．捕捉試薬が、抗ｐ２１汎反応性抗体であり、検出可能に標識された抗体の 一つが、１２位にバリン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン またはシステインのアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白質のエピトープに特異 的に結合し、１２位にグリシンを含有するエピトープに結合しないモノクローナ ル抗体から選ばれる請求の範囲第８項記載の免疫検定。
11. １１．捕捉試薬が、抗ｐ２１汎反応性抗体であり、検出可能に標識された抗体の 一つが、１３位にアスパラギン酸またはバリンのアミノ酸置換を有する活性化ラ ス蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１３位にグリシンを含有するエピトー プに結合しないモノクローナル抗体から選ばれる請求の範囲第８項記載の免疫検 定。
12. １２．捕捉試薬が、（ｉ）１２位にバリン、アルギニン、グルタミン酸またはア スパラギン酸のアミノ酸置換を有する活性化ラス蛋白質のエピトープに特異的に 結合し、１２位にグリシンを含有するエピトープに結合しないモノクローナル抗 体または（ｉｉ）１３位にアスパラギン酸またはバリンのアミノ酸置換を有する 活性化ラス蛋白質のエピトープに特異的に結合し、１３位にグリシンを含有する エピトープに結合しないモノクローナル抗体からなる群の中から選ばれた少なく とも１種の抗体であり、検出可能に標識された抗体の一つが、ウェル当り１ない し１０ｎｇの抗体を用いて、上記の標準条件を使用したマイクロタイタープレー ト系ＥＬＩＳＡにおいて試験したとき、約１．５ないし約２．５の光学密度を提 供する抗ｐ２１汎反応性モノクローナル抗体である請求の範囲第８項記載の免疫 検定。
13. １３．捕捉試薬が、抗ｐ２１汎反応性抗体であり、検出可能に標識された抗体の 一つが、ウェル当り１ないし１０ｎｇの抗体を用いて、上記の標準条件を使用し たマイクロタイタープレート系ＥＬＩＳＡにおいて試験したとき、約１．５ない し約２．５の光学密度を提供する抗ｐ２１汎反応性モノクローナル抗体である請 求の範囲第８項記載の免疫検定。
14. １４．捕捉試薬が、抗ｐ２１汎反応性抗体であり、検出可能に標識された少なく とも２種の抗体が、（ｉ）ハーベイラス蛋白質と反応性であり、蛋白質のキルス テン２Ａ、２ＢまたはＮラスファミリーと反応性でないモノクローナル抗体、（ ｉｉ）ラス蛋白質のキルステン２Ａ、２Ｂまたはハーベイファミリーと反応性で あるモノクローナル抗体、（ｉｉｉ）キルステン２Ａラス蛋白質と反応性であり 、蛋白質のキルステン２Ｂ、ハーベイまたはＮラスファミリーと反応性でないモ ノクローナル抗体からなる群の中から選ばれる請求の範囲第８項記載の免疫検定 。
15. １５．捕捉試薬が、抗ｐ２１汎反応性抗体であり、検出可能に標識された抗体の １つが、６１位にヒスチジン、ロイシンまたはアルギニンのアミノ酸置換を有す る活性化ラス蛋白質のエピトープに特異的に結合し、６１位にグルタミンを含有 するエピトープに結合しない請求の範囲第８項記載の免疫検定。
16. １６．検出可能な標識が、ピオチンである請求の範囲第８項記載の免疫検定。