KR20070042994A - 항시노비올린 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 시노비올린 일부를 인식할 수 있는 모노클로날 항체를 제공하기 위한, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해할 수 있는, 시노비올린에 대한 항체 또는 그 단편에 관한 것이다.

Description

항시노비올린 항체{ANTI-SYNOVIOLIN ANTIBODY}

본 발명은, 항시노비올린 (anti-synoviolin) 항체에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화 (self-ubiquitinization) 를 저해할 수 있는 항체, 상기 항체를 함유하는 의약 조성물, 상기 항체를 사용하여 시노비올린이 발현되어 있는 세포를 검출하는 방법에 관한 것이다.

류머티스 관절염 (rheumatoid arthritis, 이하, RA 로 약기한다) 은, 관절의 활막 조직에 이상한 증식이 관찰되는 전신성 염증성 질환이다. 활막 세포 (synovial cell) 는 관절의 활막에서 1∼6 층의 상피 모양의 층을 형성하는 섬유아 세포 유사의 세포로, 활액에 프로테오글리칸이나 히알루론산을 공급하는 것으로 되어 있다. RA 환자의 관절에서는, 활막 조직의 증식, 그 결과적으로 야기되는 다층 구조, 활막 세포의 다른 조직에 대한 침윤과 같은 증상이 관찰된다. 또한, RA 환자의 혈청 중에는 자기의 면역 글로불린 (IgG) 의 Fc 영역에 대한 자기 항체가 존재한다. RA 인자로도 불리는 이 자기 항체는, RA 의 특징적인 진단 지표로서 오래전부터 이용되어 왔다.

그러나, 자기 면역 질환의 하나로 생각되고 있는 RA 의 병인은 미해명인 채로 있다. RA 인자의 검출에 기초하는 RA 의 진단에는 질환에 대한 특이성 및 항체가 생기는 시스템의 해명도 이루어져 있지 않아, 이 때문에 병인과의 관련이 뚜렷하지 않다.

RA 의 병태를, (a) 생체 내에서의 다채로운 면역 반응, 및 (b) 골 파괴를 동반한 관절 활막의 증식이라는 2 가지 측면에서 본 경우, 전자인 면역 반응에 관해서는 많은 연구가 이루어져, 그 분자 레벨의 실체가 규명되고 있다. 그러나, 후자인 관절 활막 세포의 연구에 관해서는, 그것이 RA 의 주좌 (主座) 임에도 불구하고 그 세포 생물학적인 특징조차 규명되어 있지 않다.

그래서 RA 의 병태 해명을 위해 본 발명자들은, 만성ㆍ난치성 질환의 발증이나 진전의 배후에 있는 분자 기전을 조사하였다. 우선 RA 환자의 배양 인간 활막 세포를 면역원으로 하여 항인간 활막 세포 항체를 얻고, 활막 세포의 cDNA 라이브러리를 면역 스크리닝 (immunoscreening) 한 결과, RA 환자의 활막 조직에서 발현되어 있는 신규한 유전자를 발견하였다. 이 유전자의 단리에도 성공하여, 그것이 코드하는 단백질을, 발현되어 있는 조직인 활막 세포 (synovial cell) 에 연관시켜 시노비올린 (synoviolin) 으로 명칭하고, 그 생리적 의의를 밝혔다 (국제 공개 제WO02/052007호 팜플렛). 발명자들이 발견한 시노비올린은 RA 질환의 주요한 요인인 활막 조직의 이상 증식에 밀접하게 관련되어 있어, 진단에 있어서 매우 중요한 정보를 제공할 것으로 기대된다. 또한, 시노비올린은, 단백질 구조 예측 시스템으로부터, RING 핑거 모티브를 갖는 E3 유비퀴틴 리가아제 (ubiquitin ligase) 를 코드함이 알려져 있다. 이 모티브는 단백질의 유비퀴틴화에 중요한 역할을 하지만, 실제로, 자기 유비퀴틴화 활성을 갖는 것이 증명되어 있고, 이것에 의해 단백질 기능의 제어도 실시하고 있을 것으로 추측된다.

본 발명자들은, 시노비올린에 의한 시그널 전달에 관한 연구를 진행시킨 결과, 시노비올린이 자기 유비퀴틴화 (self-ubiquitination) 를 일으키는 유비퀴틴 리가아제 작용을 가짐을 처음으로 발견하였다.

발명의 개시

상기한 바와 같이, 지금까지, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화 반응을 저해할 수 있는 항체, 상기 항체를 함유하는 의약 조성물 등의 개발이 요망되고 있었다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 실시한 결과, 시노비올린이 자기 유비퀴틴화 (self-ubiquitination) 를 일으키는 유비퀴틴 리가아제 작용을 갖는 것에 기초하여, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해하는 항시노비올린 항체를 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해할 수 있는, 시노비올린에 대한 항체 또는 그 단편. 이 항체 또는 그 단편은 시노비올린의 기질 단백질의 유비퀴틴화에는 영향을 주지 않는 경우도 있을 수 있다. 또한, 이 항체는 모노클로날 항체여도 된다.

(2) 서열번호 3∼5 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 항원으로 하여 면역된 동물의 항체 생성 세포와 골수종 세포와의 세포 융합에 의해서 얻어지는 하이브리도마에 의해 생성되는, 시노비올린에 대한 모노클로날 항체 또는 그 단편으로서, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해할 수 있는 상기 항체 또는 그 단편.

(3) 서열번호 3∼5 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 항원으로 하여 면역된 동물의 항체 생성 세포와 골수종 세포와의 세포 융합에 의해서 얻어지는 하이브리도마로서, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해할 수 있는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마.

(4) 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해할 수 있는, 시노비올린에 대한 모노클로날 항체의 제조 방법으로서, 서열번호 3∼5 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 항원으로 하여 면역된 동물의 항체 생성 세포와 골수종 세포와의 융합 세포를 배양하여, 얻어지는 배양물로부터 상기 모노클로날 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는 방법.

(5) (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 단편을 함유하는 의약 조성물. 이 의약 조성물은, 예를 들어 세포 증식성 질환인, 류머티스 관절염, 암, 섬유증, 동맥경화, 캐슬맨병 (Castlemans disease), 다발 골수종, 크론씨병 (Crohn's disease), 전신형 소아 특발성 관절염, 뇌종양, 설암, 인두암, 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 담낭암, 십이지장암, 대장암, 간암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 신장암, 방광암, 횡문근육종, 섬유육종, 골육종, 연골육종, 피부암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 성인형 T 세포 백혈병, 악성 림프종의 치료 또는 예방을 위해 사용할 수 있다.

(6) (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 단편을 함유하는, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화 저해제.

(7) (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 단편을 함유하는, 시노비올린 함유 세포 검출용 시약.

(8) (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 단편을 함유하는, 시노비올린에 의한 세포 증식성 질환의 검출용 시약. 세포 증식성 질환으로는, 예를 들어, 류머티스 관절염, 암, 섬유증, 동맥경화, 캐슬맨병, 다발 골수종, 크론씨병, 전신형 소아 특발성 관절염, 뇌종양, 설암, 인두암, 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 담낭암, 십이지장암, 대장암, 간암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 신장암, 방광암, 횡문근육종, 섬유육종, 골육종, 연골육종, 피부암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 성인형 T 세포 백혈병, 악성 림프종 등을 들 수 있다.

또한, 상기 세포는, 활막 세포, 파골 세포, 각화 상피 세포, 혈액 세포, 암세포, 골수 세포, 섬유아 세포, 혈관 내피 세포, 진피 세포, 근세포, 신경 세포, 림프구, 혈관 평활근 세포, 간세포, 색소 세포, 지방 세포, 자궁 내피 세포, 폐포 상피 세포, 미분화 간엽계 세포, 정단 외배엽릉 (Apical Ectodermal Ridge) 으로 이루어지는 군에서 선택되어도 된다.

(9) (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 단편과, 시노비올린을 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해하는 방법.

(10) (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 단편과, 생체 시료를 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시노비올린의 발현 세포를 검출하는 방법.

(11) (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 단편과, 피험자로부터 채취된 생체 시료를 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시노비올린에 의한 세포 증식성 질환의 검출 방법. 세포 증식성 질환 및 세포의 종류는, 상기와 동일하다.

또한, 상기 세포는, 활막 세포, 파골 세포, 각화 상피 세포, 혈액 세포, 암세포, 골수 세포, 섬유아 세포, 혈관 내피 세포, 진피 세포, 근세포, 신경 세포, 림프구, 혈관 평활근 세포, 간세포, 색소 세포, 지방 세포, 자궁 내피 세포, 폐포 상피 세포, 미분화 간엽계 세포, 정단 외배엽릉으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 세포여도 된다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행 기술 문헌은, 참조로서 본 명세서에 도입된다.

도 1 은, SL-1 항체에 의한, 류머티스 관절염 환자 (RA: 2 검체) 및 변형성 관절증 환자 (OA: 2 검체) 유래 활막 세포의 웨스턴 블롯팅 결과의 사진을 나타내는 도면이다.

도 2 는, SL-1 항체에 의한 RA 환자 유래 활막 세포의 형광 면역 염색 결과의 사진을 나타내는 도면이다.

도 3 은, SL-1 항체에 의한 RA 환자 유래 활막 조직의 면역 염색 결과 및 헤마톡실린ㆍ에오신 (HE) 염색상을 나타내는 도면이다.

도 4 는, MBP-dTM Syno-His 융합 단백질의 자기 유비퀴틴화가 SL-1 항체에 의해 저해된 것을 나타내는 웨스턴 블롯팅 해석 사진이다.

도 5 는, GST-P4HA1 융합 단백질의 시노비올린에 의한 유비퀴틴화가 SL-1 항체에서는 영향을 받지 않았음을 나타내는 웨스턴 블롯팅 해석 사진이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 개요

본 발명의 항체는 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해할 수 있는, 시노비올린에 대한 항체로서, 시노비올린의 RING 핑거 영역의 일부 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 항원으로 하여 면역시킴으로써 얻어진 것이다.

유비퀴틴화란, 유비퀴틴 활성화 효소 (E1), 유비퀴틴 결합 효소 (E2) 및 유비퀴틴 리가아제 (E3) 등의 효소가 협동하여, 기질이 되는 단백질에 유비퀴틴을 차례 차례로 결합시켜 가는 과정이다. 이 유비퀴틴화의 생리적 의의는 종래, 프로테아좀 (proteasome) 계의 단백질 분해 기구로 보내기 위한 태그 수식으로서 인식되어 있었다. 그리고, 그 후의 연구에 의해 현시점에서의 유비퀴틴화의 의의는, 단백질 기능을 제어하는 가역적 단백질 수식 시스템으로서 위치지어져 있다.

본 명세서에 있어서 「자기 유비퀴틴화 (self-ubiquitination, auto ubiquitination)」란, 시노비올린이 유비퀴틴 리가아제 활성을 가짐으로써 시노비올린 자체가 유비퀴틴화의 기질 단백질이 되어, 다른 유비퀴틴 리가아제에 의하지 않고 스스로 유비퀴틴을 결합시키는 것이다. 시노비올린의 자기 유비퀴틴화는, 본 발명자에 의해 시노비올린이 유비퀴틴 리가아제 활성을 갖는 것이 발견되어 분명해졌다. 즉, 마우스에 있어서 시노비올린을 과잉 발현하는 것에 의해 활막 세포의 증식을 동반하는 관절증이 자연 발증한다 (국제 공개 제WO02/052007호 팜플렛) (Amano T, et al., Genes Dev.17(19): 2436-49, 2003). 그 한편, E3 유비퀴틴 리가아제의 RING 핑거 모티브는 효소의 활성 중심으로, 동 모티브 중의 1 아미노산이 치환된 것만으로도 완전히 효소 활성이 실활된다. 실제로, 시노비올린의 효소 활성 중심의 1 아미노산 변이체 (C307S) 를 발현시킨 마우스에서는 전혀 관절염을 나타내지 않았다 (상게, Amano. T 들). 이는 시노비올린의 기능 발현에는 자기 유비퀴틴화가 중요하며, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화야말로 시노비올린의 대표적 기능이 될 수 있음을 나타낸다. 또한, 그 자기 유비퀴틴화는, 내재성 시노비올린의 완전한 긴 분자에서 관찰될 뿐만 아니라, 시노비올린의 세포내 부분에서만 및 태그 단백질이 융합한 시노비올린에 있어서도 발생함이 분명하게 되어 있다. 본 발명자는 이상의 지견에 기초하여 예의 연구를 실시, 본 발명의 항체를 완성시켰다.

본 발명에 있어서 「항체」란, 항원인 시노비올린 또는 그 부분 단편에 결합할 수 있는 항체 분자 전체 (폴리클로날 항체여도 되고 모노클로날 항체여도 된다) 를 의미하는데, 또한, 그 단편, 즉 항원 항체 반응 활성을 갖는 활성 프래그먼트, 구체적으로는, Fab, F(ab')₂, Fv, 재조합 Fv 체, 1 개 사슬 Fv 도 포함된다.

2. 시노비올린

(1) 시노비올린 및 그 등가의 단백질

시노비올린에 대한 항체를 얻기 위해서, 면역원으로서 시노비올린 자체 외 에, 그것과 동등하거나 또는 등가의 단백질, 그들의 프래그먼트 또는 부분 펩티드 등을 사용할 수 있다. 그들 중 어느 것도 항시노비올린 항체의 항원이 될 수 있다. 그 이유는, 항체는 일반적으로 항원이 그 단백질 구조 전체의 포괄적인 인식에 의해 유도된다고 하기보다는, 오히려 에피토프 부위로서 알려진 단백질 표면의 작은 영역의 인식에 의해 유도되는 것이기 때문이다. 이러한 에피토프 부위는, 폴리펩티드 사슬의 연속된 부분 또는 불연속 부분에 의해서 형성된다. 따라서, 시노비올린에 대한 1 종류의 항체에 관해서 에피토프로서 작용하는 부위는, 시노비올린의 한정된 임의의 펩티드 부위에 대응하고 있다.

본 발명에 있어서 사용하는 시노비올린의 종 (種) 은 인간, 마우스, 래트 등에 유래하는 것이어도 되며, 특별히 한정되지는 않는다. 시노비올린으로는, 예를 들어, 서열번호 2 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 사용할 수 있다.

그리고 시노비올린과 동등하거나 또는 등가의 단백질도 또한, 항원으로서 사용할 수 있다 (후술).

(2) 생체 재료로부터의 조제

시노비올린은 RA 환자의 활막 조직로부터 얻을 수 있다. 활막 세포는 인비트로에서 배양할 수 있기 때문에, 이 배양물로부터 시노비올린을 회수하는 것이 가능하다. 구체적으로는, RA 환자로부터 활막 절제술 (synovectomy) 에 의해 외과적으로 절제된 활막 조직 등을 바탕으로, 이 조직으로부터 활막 세포를 분리한다. 분리한 세포를 배양하면, 활막 세포를 부착성 세포로서 회수할 수 있다 (Nakajima T et.al., J. Clin. Invest. 92: 186-193, 1993). 회수한 세포로부터는, 공지된 단백질 정제 기술을 조합하여 시노비올린을 추출ㆍ정제한다. 얻어진 시노비올린 또는 그 프래그먼트는 항체를 얻기 위한 면역원으로서 사용할 수 있다.

(3) 유전자 공학적 수법에 의한 조제

시노비올린은, 생체 재료뿐만 아니라, 시노비올린을 코드하는 유전자를 적당한 발현계에 편입시켜 유전자 재조합체의 발현 산물로서 입수할 수도 있다.

시노비올린을 코드하는 폴리뉴클레오티드는 그 유래에 상관하지 않는다. 즉, 게놈 DNA, cDNA 외에, 합성에 의해서 얻을 수도 있다. 또한, 핵산은 DNA 여도 되고 RNA 여도 된다. 그리고 시노비올린을 코드할 수 있는 한, 유전 암호의 축중 (縮重) 에 기초하는 임의의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 수식된 뉴클레오티드를 함유하는 것도 포함된다.

시노비올린을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 단리하기 위해서는, 상기 RA 환자의 활막 세포로부터 추출한 mRNA 를 바탕으로 cDNA 라이브러리를 얻어서, 클로닝하면 된다. 즉, cDNA 라이브러리를 PCR 등으로 증폭하고, 하이브리다이즈하는 클론을 스크리닝함으로써, 원하는 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있다 (Short J. M, et. al., Nucleic Acid Res.16: 7583-7600, 1988). 서열번호 2 로 표시되는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 의 염기 서열을 서열번호 1 에 나타낸다. 시노비올린을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 적당한 발현계에 편입시키기 위한 바람직한 호스트/벡터계로서, 발현 벡터 pGEX 와 대장균을 예시할 수 있다.

이 밖에도, 세균을 호스트로 이용하는 경우에는, 히스티딘 태그, HA 태그, FLAG 태그 등을 이용한 융합 단백의 발현용 벡터가 시판되고 있다. 호스트/벡터계로서, Pichia 속 효모를 이용하는 발현계, 또는 곤충 세포를 호스트로 하는 버큘로바이러스 (baculovirus) 벡타를 이용한 발현계는, 당사슬을 구비한 단백질의 발현에 유효하다. 또, 포유동물의 세포를 이용하여, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 또는 SV40 등의 프로모터를 이용한 벡터의 트랜스펙션이 실시되고 있다.

또한, 본 발명에 있어서는, 상기 시노비올린 유전자 또는 상기 벡터로부터 시노비올린을 채취하는 것도 가능하다. 즉, 본 발명에서는, 생세포를 전혀 사용하지 않고서 무세포 단백질 합성계를 채용하여 시노비올린을 생성하는 것이 가능하다.

무세포 단백질 합성계란, 세포 추출액을 사용하여 시험관 등의 인공 용기 내에서 단백질을 합성하는 계이다. 또, 본 발명에 있어서 사용되는 무세포 단백질 합성계에는, DNA 를 주형으로 하여 RNA 를 합성하는 무세포 전사계도 포함된다.

이 경우, 상기 숙주에 대응하는 생물은, 하기의 세포 추출액이 유래하는 생물에 상당한다. 여기서, 상기 세포 추출액은, 진핵 세포 유래 또는 원핵 세포 유래의 추출액, 예를 들어, 밀배아, 토끼 망상 적혈구, 마우스 L-세포, HeLa 세포, CHO 세포, 출아 효모, 대장균 등의 추출액을 사용할 수 있다. 또, 이들 세포 추출액은 농축된 것이어도 되고 비농축된 것이어도 된다.

세포 추출액은, 예를 들어 한외여과, 투석, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 침전 등 에 의해서 얻을 수 있다. 또한 본 발명에 있어서, 무세포 단백질 합성은 시판되는 키트를 사용하여 실시할 수도 있다. 그와 같은 키트로는, 예를 들어 시약 키트 PROTEIOS^TM (토요보), TNT^TM System (프로메가), 합성 장치의 PG-Mate^TM (토요보), RTS (로슈ㆍ다이아그노스틱스) 등을 들 수 있다.

상기한 바와 같이 세포 단백질 합성에 의해서 얻어지는 시노비올린은, 전술한 바와 같이 적절히 크로마토그래피를 선택하여 정제할 수 있다.

(4) 시노비올린과 「기능적으로 동등한 단백질」

항시노비올린 모노클로날 항체를 조제할 때의 항원이 될 수 있는 단백질에는, 활막 세포로부터 추출되는 인간 시노비올린뿐만 아니라, 시노비올린과 기능적으로 동등한 각종 단백질도 포함된다. 이러한 단백질은, 인공적인 것이나 자연스럽게 발생한 것이나 상관없이, 인간 시노비올린의 아미노산 서열에 있어서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등에 의해 변이된 단백질, 또는 아미노산 측쇄 등이 수식되어 있는 수식 단백질, 다른 단백질과의 융합 단백질도 포함된다.

이들 단백질에 있어서의 아미노산의 변이 또는 수식의 수, 또는 변이 또는 수식의 부위는 시노비올린의 기능이 유지되는 한 제한은 없다. 예를 들어, 서열번호 2 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1 개 또는 복수 개 (예를 들어 1 개 또는 수 개) 의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등에 의해 변이된 단백질, 또는 아미노산 측쇄 등이 수식되어 있는 수식 단백질을 사용할 수 있다.

구체적으로는,

(i) 서열번호 2 에 나타내는 아미노산 서열 중 1 개 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개∼10 개, 더욱 바람직하게는 1 개∼5 개)) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열,

(ii) 서열번호 2 에 나타내는 아미노산 서열 중 1 개 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개∼10 개, 더욱 바람직하게는 1 개∼5 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열,

(iii) 서열번호 2 에 나타내는 아미노산 서열 중 1 개 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개∼10 개, 더욱 바람직하게는 1 개∼5 개)) 의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 서열, 또는

(iv) 상기 (i)∼(iii) 을 조합한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 상기 시노비올린과 동일한 작용을 갖는 변이형의 시노비올린 폴리펩티드를 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드는 시노비올린과 동등한 기능을 갖는 한, 상기한 시노비올린의 아미노산 서열과 호모폴로지를 갖는 폴리펩티드여도 된다. 상기 시노비올린 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

이러한 서열번호 2 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드 는, 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press 1989), 「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons 1987-1997), Kunkel T. A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, 1985, 등에 기재된 부위 특이적 변이 유발법 등의 방법에 따라서 조제할 수 있다.

또한, 폴리뉴클레오티드에 변이를 도입하기 위해서는, Kunkel 법이나 Gapped duplex 법 등의 공지된 수법에 의해, 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit (스트라타진사 제조), GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System (인비트로겐사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등: 다카라바이오사 제조) 등을 사용하여 실시할 수 있다.

상기 「기능적으로 동등한 단백질」로서, 첫째로 시노비올린과 면역학적으로 동등한 단백질을 개시할 수 있다. 즉 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질로서, 시노비올린을 특이적으로 인식하여 RA 환자의 혈청 중에 존재하는 항체와 반응하는 것이면, 시노비올린의 도메인을 포함하는 것이다.

둘째로, 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질은 시노비올린에 결합하는 리간드 단백질과의 결합 특성에 기초해서도 정의된다. 예를 들어, HMG-CoA Reductase Degradation 3 (Hrd3), 프로콜라겐-프롤린, 2-옥소글루탈산 4-디옥시게나아제 (프롤린 4 히드락시라아제 (hydraxylase)), α 폴리펩티드 I (P4HA1), Homocysteine-indusible endoplasmic reticulum stress-indusible ubiquitin-like domain member 1 (Herp) 등이다 (일본 특허출원 2003-295951, 일본 특허출원 2004-076931, 일본 특허출원 2003-350704).

셋째로, 인간 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질로서 활막 증생을 촉진하는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 인간 시노비올린 유전자가 도입된 트랜스제닉 마우스에서는, 유의한 빈도로 관절염을 동반하는 손가락의 팽창이 관찰되고, 조직학적으로는, 이들 손가락 관절에서 활막 증생을 동반하는 골 파괴와 비정상적인 골 신생이 확인되었다.

넷째로, 인간 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질로서, 정상적인 골 형성 또는 사지의 발달에 공헌하는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 시노비올린은 발생에 있어서 두정골 (頭頂骨), 사지, 귀 등의 뼈 및 연골이 형성되는 부위에 강하게 발현되어 있고, 사지 형성기에 있어서는 Apical Ectodermal Ridge (AER; 정단 외배엽릉) 및 연골ㆍ골원기에 강한 발현이 관찰되어 있다.

다섯째로, 본 발명에 의한 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질은, 시노비올린이 갖는 생화학적인 활성, 예를 들어 유비퀴틴 리가아제 활성에 기초하여 정의할 수도 있다. 이들의 생화학적인 활성은, 시노비올린에서 발견된 각종의 모티브, 실험 결과 등에 의해 뒷받침되고 있다.

(5) 시노비올린과의 융합 단백질 또는 수식 단백질

시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질에는, 아미노산 잔기의 수식, 보존적 치환, 결실, 부가 또는 삽입, 당사슬 등의 생리적 또는 인위적인 수식, 형광이나 방사성 물질과 같은 표지, 또는 다른 단백질과의 융합이라는 각종 수식을 가한 단 백질도 포함된다. 예를 들어 상기 서술한 유전자 재조합체에 있어서는, 발현시키는 숙주에 의해서 당사슬에 의한 수식에 차이가 생길 가능성이 있다. 그러나, 가령 당사슬의 수식에 차이를 가지고 있더라도 시노비올린과 동일한 성상을 나타내는 것이면, 모두 시노비올린 또는 그것과 기능적으로 동등한 단백질이다.

다른 단백질과의 융합 단백질의 예로서, FLAG 태그, HA 태그, 또는 히스티딘 태그 등의 부가적인 아미노산 서열이 부가되고, 상기 시노비올린에 기능적으로 동등한 단백질로서 적어도 하나의 성상을 유지한 단백질이 있다. 또는 시노비올린과는 상이한 활성을 갖고 있다고 하더라도, 시노비올린이 갖는 적어도 하나의 기능을 유지하고 있는 융합 단백질도 들 수 있다.

시노비올린은, 그 세포내 도메인뿐일지라도, 자기 유비퀴틴화되는 점에서, 본 발명에 사용하는 시노비올린은, 세포막 관통 부위를 제외한 시노비올린 dTM 이어도 된다. 예를 들어, 당해 dTM 에 상기한 태그 단백질을 융합시킨 MBP-시노비올린 dTM-His 도 본 발명에 있어서 사용할 수 있다.

또는 시노비올린과는 상이한 활성을 갖고 있더라도, 시노비올린이 갖는 적어도 하나의 기능을 유지하고 있는 융합 단백질도 들 수 있다.

3. 항원의 조제

항시노비올린 항체를 제조하기 위한 항원으로서, 전술한 바와 같이 시노비올린 또는 그것과 동등한 단백질을 사용할 수 있다. 그러나, 항체의 검출에 있어서는, 항원 분자 자체 (즉, 시노비올린 또는 그것과 등가인 단백질) 뿐만 아니라, 그러한 단백질의 프래그먼트, 단편 펩티드, 화학적으로 합성한 올리고 펩티드를 적 절한 담체와 함께 포함하는 복합체를 항원으로서 사용하는 방법이 채용되는 경우도 많다. 그 이유는, 특히 우세한 에피토프, 또는 임상적으로 어떠한 의미를 갖는 에피토프에 특이적인 분석계로 하는 편이 비특이적인 반응의 영향을 잘 받지 않게 되기 때문이다. 즉, 후술하는 하이브리도마의 클로닝 및 클론 선별을 효율적으로 실시할 수 있고, 또한 항체가(價)가 항시노비올린 모노클로날 항체를 얻을 수 있기 때문이다. 에피토프 부위로서 항원 단백질의 고차 구조에 있어서의 다수의 영역을 인식시키는 것보다는, 그보다 저차라고 해도 특정한 게다가 소수인 특정 구조를 인식시키도록 하는 것이 바람직하다.

시노비올린에 대하여 특이성 및 친화성이 높은 모노클로날 항체를 얻는 경우에 있어서도 이러한 어프로치가 유효하다. 구체적으로는, 후술하는 면역학적으로 활성인 도메인 펩티드를 얻는 방법에 기초하여, 에피토프로서 기능하는 도메인을 결정할 수 있다.

에피토프는 적어도 3 아미노산 잔기로 구성할 수 있는 경우가 알려져 있다. 또한 다른 단백질과의 면역학적인 식별은 적어도 8 아미노산 잔기에 의해 가능해지는 것으로 여겨지고 있다. 따라서, 시노비올린 또는 그것과 등가인 단백질의 아미노산 서열로부터 선택된 적어도 연속하는 8 아미노산 잔기, 통상 9 아미노산 잔기, 바람직하게는 10 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 11∼15 아미노산 잔기로 이루어지고, 특히 환자 혈청 중의 항체와 반응하는 단편은, 본 발명에서의 항체 검출용 항원으로서 바람직하다.

또, 에피토프를 구성하는 올리고 펩티드에 대하여 다영한 수식을 가하여 면 역학적인 반응성을 향상시키는 방법도 당업자에게는 공지된 방법이다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민과 같은 불활성 단백질, 또는 무의미한 아미노산 서열의 부가와 같은 수식이 면역학적인 반응성의 향상에 기여한다.

시노비올린의 단편은, 트립신, 키모트립신, 펩신 등의 프로테아제를 사용한 효소 소화 또는 브로모시안 등을 사용하는 화학적 절단, 또는 그들을 조합함으로써 얻을 수 있다. 생성된 펩티드 혼합물로부터 목적하는 펩티드를 분리 정제하기 위해서는, 크로마토그래피, 전기 영동법 등의 공지된 분리 기술을 이용하면 된다.

다른 방법으로, 시노비올린을 코드하는 DNA 를 랜덤하게 절단하고, 그것을 파지 벡터에 삽입하여 도메인 펩티드를 제시한 파지 라이브러리를 작성하는 것에 의해서도 얻을 수 있다. 이들 라이브러리를, 시노비올린을 인식하는 항체로 면역 스크리닝하면, 면역학적으로 활성인 도메인을 결정할 수 있다.

상기 서술한 전략적 관점에서, 시노비올린의 친수성 프로파일과 그 밖의 항원성 지표를 검색하는 해석법에 의해, 우선 아미노산 잔기수 14 개 이상의 바람직한 것으로 상정되는 펩티드 부분이 결정된다. 면역원 후보로서의 이들 펩티드는, 공지 기술인 액상법 또는 고상법에 의한 펩티드 합성 기술에 의해 합성할 수 있다. Merrifield 법으로 대표되는 고상 합성법이, 간편하며 단시간에 실시할 수 있다.

α-아미노 보호기로서, 표준적으로는 제 3 부틸옥시카르보닐 (Boc) 이 사용되지만, Sheppard 들이 개발한 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 기 (Atherton, E & Sheppard, R. C, J. Chem. Soc. Chem. Comm. 165, 1985) 도 이용가능하다 (이 즈미야 노부오, 외 저 「펩티드 합성의 기초와 실험」194∼233페이지, 마루젠, 1985년을 참조).

본 발명에서는, 고상 합성법에 기초하는 자동화 펩티드 합성기를 이용해도 된다. 합성된 펩티드는, 트리플루오로아세트산 등의 존재하에서 수지로부터 분리되고, 이어서 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제한다. 정제 펩티드는 85% 이상의 순도를 갖는 것이 바람직하다.

상기 후보 펩티드 중, 면역 감작(感作) 동물로부터 채취되는 폴리클로날 항체와 시노비올린을 반응시켜, 효소 표지 항 IgG 항체에 의한 검출 반응에서 양성을 나타내는 펩티드를, 본 발명의 항체 작출용 면역 항원으로 한다.

면역원으로서 특히 유용한 시노비올린의 단편으로서, 이하의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 1 개의 펩티드를 들 수 있다.

Syno-P3 (SLALTGAVVAHAYYC/서열번호: 3),

Syno-P2 (TCRMDVLRASLPAQS/서열번호: 4), 및

Syno-P1 (GAATTTAAGTSATAC/서열번호: 5)

이들 펩티드를 담체 단백질과 결합시켜 조제된 면역원은, 시노비올린에 대하여 특이적이고, 또한 충분한 결합 친화성을 갖는 항체를 제공한다. 면역원으로서 유용한 시노비올린의 상기 펩티드를 구멍삿갓조개 (Macroschisma sinense) 헤모시아닌 (KLH) 을 담체 단백질로서 결합시키고 나서, 동물에게 감작시킨다.

면역원을 얻기 위해서 사용할 수 있는 그 밖의 담체 물질로서, 투베르쿨린 (tuberculin) 정제 단백질 유도체, 파상풍 변성 독소, 콜레라 독소 및 그 B 서브 유닛, 디프테리아 독소, 오보알부민, 소혈청 알부민, 대두 트립신 인히비터, 무라밀 디펩티드 (muramyl dipeptide), 브라운의 리포단백질 등을 들 수 있다. 펩티드를 담체 단백질에 결합시키기 위한 반응, 시약 등은 공지된 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 오오우미 시노부, 외저 세포 공학 별책 실험 프로토콜 시리즈 신판 항펩티드 항체 실험 프로토콜 「유전자 산물의 동정에서 단백질 기능 해석까지」슈쥰사 1994년 ; Coligan J. E et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Vol.1, p.9.4.1-9.4.11, 1991).

4. 면역

(1) 시노비올린에 대한 폴리클로날 항체의 제조

상기한 바와 같이 제조한 항원을 포유동물에 투여한다. 포유동물은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 래트, 마우스, 토끼 등을 들 수 있지만, 토끼가 바람직하다.

항원의 동물 1 마리당 투여량은, 아주반트를 사용하지 않을 때는 토끼에서 1∼10㎎ 이고, 아주반트를 사용할 때는 0.1∼1㎎ 이다. 아주반트로는, 프로인드 완전 아주반트 (FCA), 프로인드 불완전 아주반트 (FIA), 수산화알루미늄 아주반트 등을 들 수 있다. 면역은, 주로 정맥내, 피하, 복강내 등에 주입함으로써 실시한다. 또한, 면역의 간격은 특별히 한정되지 않고, 수 일∼수 주 간격, 바람직하게는 2∼5 주 간격으로, 1∼10 회, 바람직하게는 2∼5 회 면역을 실시한다. 그리고, 최종 면역일로부터 6∼60 일 후에, 효소 면역 측정법 (ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 EIA (enzyme immunoassay)), 방사성 면역 측정 법 (RIA; radio immuno assay) 등으로 항체가를 측정하고, 최대 항체가를 나타낸 날에 채혈하여 항혈청을 얻는다.

그 후에는, 이들 단백질에 대한 항혈청 중의 폴리클로날 항체의 반응성을 ELISA 법 등으로 측정한다.

(2) 시노비올린에 대한 모노클로날 항체의 제조

(i) 항체 생성 세포의 채취

모노클로날 항체의 조제를 위해서는, 면역용 항원이 되는 시노비올린 또는 면역학적으로 동등한 단백질, 또는 그 프래그먼트 또는 단편 펩티드를 면역원으로 하여 포유동물의 항체 생성이 가능한 부위에, 단독으로, 또는 담체 및 희석제와 함께 투여한다. 그 때, 항체 생성 능력을 높이기 위해서, 아주반트 등을 혼합하여 투여해도 된다 (Adv. Tubercl. Res., 1: 130-148, 1956). 아주반트로는, FCA, FIA, 수산화알루미늄 아주반트 등을 들 수 있다.

모노클로날 항체는, 면역 담당 세포 (구체적으로는 항체 생성 세포) 와 골수종 세포 (미엘로머 세포) 사이에 융합 세포를 형성시키고, 당해 세포를 클로닝하여, 시노비올린에 특이적인 항체를 생성하는 클론을 선택함으로써 얻을 수 있다 (Kohler, G. & Milstein, C, Nature 256: 495-7, 1975).

면역에는, 면역원으로서 상기 펩티드를 포함하는 복합체 (또는 시노비올린 또는 그것과 면역학적으로 동등한 단백질, 또는 그들의 단편) 를 사용하여, 1 회당, 예를 들어 20㎍∼1㎎, 적당한 아주반트와 용해 또는 혼화하여 면역 동물에 면역 감작시킨다.

면역 동물로서 사용하는 포유동물은, 마우스, 몰모트, 토끼, 래트, 양, 염소, 원숭이, 개 등을 들 수 있지만, 일반적으로 취급하기 쉽다는 점 등에서 특히 마우스 또는 토끼가 바람직하게 사용된다. 항체 생성 세포와 골수종 세포는 동종 동물 유래인 쪽이 바람직하다. 투여는, 통상 3∼6 개월간의 기간에 있어서, 2∼6 주마다 1 회씩 2∼10 회 정도 실시된다.

항체 생성 세포의 채취는, 항원 감작된 상기 동물로부터 항체가가 인정된 개체를 선택하여, 최종 면역의 2∼5 일 후에 비장 세포, 림프절 세포 또는 B-림프구를 채취한다. 그들에 포함되는 항체 생성 세포와 자립 증식능을 갖는 골수종 세포를 융합시킨다. 생성되는 하이브리도마로부터 본 발명의 항시노비올린 모노클로날 항체를 생성하는 클론을 선택함으로써, 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 조제할 수 있다. 그 수순은, 기본적으로는 케일러의 방법에 준하여 실시하면 된다 ("Immunological Method", Academic Press, New York, 391, 1979).

(ii) 세포 융합

융합 조작은 공지된 기술을 사용할 수 있고, 예를 들어, 상기 케일러와 밀스타인의 방법을 들 수 있다. 골수종 세포 (미엘로머) 로서, P3U1, NS-1, SP2/0 과 같은 마우스 골수종 유래의 세포주 또는 그 변이주 등을 들 수 있지만, 특히 P3U1 이 바람직하게 사용된다. 융합 촉진제로서 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 센다이 바이러스 등을 들 수 있고, 바람직하게는 PEG 가 사용된다. 융합은, 혈청을 함유하지 않은 RPMI 1640 배지 등에 골수종 세포를 부유시키고, 이 부유액에 상기에서 조제한 비장(脾) 세포 등의 항체 생성 세포를 함유하는 액을 첨가하여 잠시 정치한다. 가볍게 원심분리하여 세포를 회수하고, PEG 를 함유하는 RPMI 1640 배지를 첨가하여, 37℃ 에서 2∼4 분간 인큐베이트함으로써 세포 융합이 완료된다.

반응물을 원심분리하여 회수한 하이브리도마는 HAT (히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 배지로 옮기고, 예를 들어 96 웰 마이크로플레이트에 분주한 후, 소정 기간 배양한다. 배양은, 통상 5% 의 탄산 가스하, 인큐베이터 중에서 20∼40℃, 바람직하게는 34∼38℃ 이다. 통상 1 주 후에는, 하이브리도마가 생육하여 콜로니 형성이 관찰된다. 배양 기간은 통상 5 일∼3 주, 바람직하게는 1∼2 주이다.

(iii) 항체 스크리닝 및 클로닝

모노클로날 항체의 선별은, 통상은 HAT 를 첨가한 동물 세포 배양기 등에 의해 실시할 수 있다. 선별 및 육종용 배지로는 하이브리도마가 생육할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없다. 예를 들어 하이브리도마 배양용 무혈청 배지, 소태아 혈청 (fetal calf serum; FCS) 을 함유하는 RPMI 배지, GIT 배지 등을 사용할 수 있다.

증식이 관찰된 웰의 배양 상청 중의 펩티드에 대한 항체가를 효소 항체법 등에 의해서 측정하고, 예를 들어 한계 희석법에 의해서 하이브리도마의 클로닝을 실시하여 본 발명의 하이브리도마의 클론을 얻는다.

형성된 본 발명의 하이브리도마를 스크리닝하는 조작은, 일반적으로 다음과 같다. 면역원으로서 사용한 펩티드를 직접 또는 담체와 함께 흡착시킨 마이크로플레이트 등의 고상에 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 이어서 방사성 물질, 효소 등으로 표지한 항 면역 글로불린 항체 또는 프로테인 A 를 첨가하여, 고상에 결합된 모노클로날 항체를 검출하는 방법이 편리하다. 또는 항 면역 글로불린 항체 또는 프로테인 A 를 흡착시킨 고상에 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 이어서 표지 항원을 첨가하여, 고상에 결합된 모노클로날 항체를 검출해도 된다.

상기 조작에 의해 양성 웰을 선택하고, 수 일이 지난 후, 1 주(株)에 대해서 96 웰 플레이트 1 장에, 예를 들어 100 세포/플레이트가 되도록 뿌리고, 10∼14 일간 배양한다. 콜로니를 판정하고, 배양 상청을 상기 스크리닝용 항원 고상화 플레이트에 적용하여, 검정을 동시에 실시한다. 선택한 콜로니는, 배양 후 리클로닝하고, 10∼14 일간 배양하여 콜로니 판정 및 배양 상청의 검정을 상기와 동일하게 실시한다. 신주 (新株) 별로 웰을 선택하여, 24 웰 플레이트에서 배양하고, 상청을 회수하여 클론을 체크하여, 항체의 서브클래스 및 항체 생성을 검정한다.

(iv) 모노클로날 항체의 생성 및 그 분리

상기한 바와 같이 하여 선별된 클론 SL-1 을 생체 내외에서 배양하면, 본 발명의 모노클로날 항체인 SL-1 항체가 생성된다. 그 배양에는, 당해 기술분야에서 관용되고 있는 방법을 사용할 수 있다.

하이브리도마 SL-1 을 생체 외의 배양 배지에서 배양한 경우, 그 배양물로부터 SL-1 항체를 분리하면 된다. 증식 속도, 항체 생성 효율의 향상에는, 배지 종류의 선택과 유지, 배양 조건의 관리 (예를 들어 배지내 산소 농도, 교반 속도, 오염) 가 요구된다.

인간을 제외한 온혈동물을 이용하여 클론을 배양한 경우, 그 복수 및/또는 혈액으로부터 모노클로날 항체를 채취한다. 예를 들어 소정의 세포 밀도가 되 도록 클론을, 소태아 혈청을 보충한 RPMI 1640 배지 등에 접종한 후, 인큐베이터 중, 5% 탄산 가스의 존재하, 37℃ 에서 배양한다. 이어서 그 배양물을, 미리 프리스테인을 투여해 둔 마우스의 복강 내에 접종하고, 소기의 기간, 통상의 방법으로 사육한다. 통상 1∼2 주가 지난 후, 복수 (腹水) 를 채취하고, 여기에 황산암모늄을 첨가하여 염석 침전을 얻는다. 그 분획으로부터 크로마토그래피 등을 이용하여 모노클로날 항체를 분리 정제한다.

배양물 또는 복수 및/또는 혈액으로부터 모노클로날 항체를 단리하는 방법은 통상의 폴리클로날 항체의 정제 방법과 동일하고, 면역 글로불린의 분리 정제법에 따른다. 즉, 염석법, 투석법, 여과법, 농축, 알코올 침전법, 등전점 침전법, 각종 전기 영동법, 이온 교환체 (DEAE 수지 등) 에 의한 흡탈착법, 초원심법, 겔 여과법, 특이적 어피니티 정제법 등을 적절히 조합하여 이용하는 것에 따른다. 생성된 모노클로날 항체는, 그 후 농축, 건조시켜, 용도에 따라 액상 또는 고체상으로 한다.

(iv) 인간화 또는 인간형화 항체

본 발명에 있어서, 항체는 인간형화 또는 인간화된 것도 포함된다.

인간 항체는, 면역계를 인간의 것과 교체한 포유동물을 면역시키면, 통상적인 모노클로날 항체와 동일하게 하여 제조할 수 있다.

인간형화 항체는, 정상 영역과 가변 영역의 일부가 인간형의 항체이고, 가변 영역에 있어서, 프레임 워크 영역 (FR) 은 인간 유래의 것을, CDR 이라고 불리는 상보성 결정 영역 (complementarity determining region) 은 마우스 유래의 것으로 이루어지는 재구성한 항체이다. 인간형화 항체를 제조하는 경우에는, 마우스 항체의 가변 영역으로부터 CDR 를 인간 가변 영역에 이식하고, 다음으로 이들 인간형화된 재구성 인간 가변 영역을 인간 정상 영역에 연결한다. 인간형화 항체의 제조법은 유전자 공학적 수법에 의해 얻을 수 있으며, 당 분야에 있어서 확립되어 있다 (스기무라 카즈히사 「본격화하는 항체 의료! 항체 엔지니어링과 항체 의약의 모든것」 Bio 벤처 Vol.2 No.4 요도(羊土)사 2002년).

(3) 본 발명 항체의 특징

(i) 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해할 수 있다.

즉, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화가 원인이 되는 질환의 치료에 사용할 수 있다.

(ii) 시노비올린의 기질 단백질 P4HA1 의 유비퀴틴화에는 영향을 주지 않는다.

즉, P4HA1 의 유비퀴틴화에 관계하는 생리 기능에는 영향을 미치지 않는다.

(iii) 본 발명의 항체의 아이소타입은 IgG1 이다.

5. 본 발명 모노클로날 항체의 용도

본 발명의 항체 (예를 들어 SL-1 항체) 는 시노비올린 또는 그 부분 펩티드를 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 다양한 이용 형태가 있다. 이하에, SL-1 항체를 예로 들어, 전형적인 이용의 양태를 몇 가지 나타낸다.

(1) 시노비올린의 자기 유비퀴틴화 반응의 저해

유비퀴틴화는, 유비퀴틴 활성화 효소 (E1), 유비퀴틴 결합 효소 (E2) 및 유비퀴틴 리가아제 (E3) 가 협동하여 기질 단백질에 유비퀴틴을 차례 차례로 결합시켜 가는 과정이다. 전술한 바와 같이, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화란, 시노비올린이 유비퀴틴 리가아제 활성을 가짐으로써, 시노비올린 자체가 유비퀴틴화의 기질 단백질이 되어, 다른 유비퀴틴 리가아제가 아니라 스스로 유비퀴틴을 결합시키는 것이다.

상기한 유비퀴틴 활성화 효소 (E1), 유비퀴틴 결합 효소 (E2) 등의 효소류는 시판되고 있으며, 이들을 적절히 사용할 수 있다. 96 마이크로플레이트의 웰당, E1 은 10∼50ng 의 범위, 바람직하게는 20∼40ng 의 범위에서, E2 는 0.1∼0.5㎍ 의 범위, 바람직하게는 0.2∼0.3㎍ 의 범위에서 사용된다.

유비퀴틴화에 필요한 저분자 반응 인자로서, MgCl₂, MgSO₄ 등의 Mg 염, ATP, EDTA, NAF, DTT (디티오트레이톨), 오카다산 등을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 이들의 화합물도 시판되고 있어, 입수가 용이하다.

또 효소류 또는 시약을 용해하는 완충액, 세정용 완충액, 측정용 완충액, 반응 정지 완충액 등은, 효소를 실활시키거나 또는 반응을 저해하지 않는 것이면, 임의의 공지 완충액 (예를 들어, Tris-HCl) 을 사용할 수 있다.

His 태그 융합 단백질 MBP-dTM Syno-His 를 사용하여, 상기한 바와 같이 제조한 모노클로날 항체, 항 FLAG 항체 또는 마우스 IgG 과 혼합시키고, 4℃ 에서 1.5 시간, 항원 항체 반응을 실시한다.

그 후, 자기 유비퀴틴화 반응을 실시한다. 시노비올린의 자기 유비퀴틴화 반응은, 통상적으로 이하의 조건에서 실시할 수 있다. 반응 용매가 되는 완충액 (pH6∼8) 의 일정량에, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화에 필요한 반응 물질 (시노비올린 또는 그 활성 유도체를 제외) 을 각각 상기한 소정량 첨가하고, 실온에서 5∼30 분간 인큐베이트한다. 이어서 시노비올린 또는 그 활성 유도체, 또는 고정화된 시노비올린의 활성 유도체를 첨가하여, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화 반응을 시작한다. 실온∼37℃ 의 일정 온도를 바탕으로, 20∼120 분의 일정 시간 인큐베이션을 실시하고, 정지 완충액 (0.2M 붕산 완충액, TritonX-100 및 EDTA 를 함유) 을 일정량 첨가함으로써 반응을 정지시킨다. 그리고, 시노비올린에 결합된 유비퀴틴 또는 결합하지 않은 유비퀴틴의 양을 측정하여, 자기 유비퀴틴화의 정도를 구한다.

(2) 검사ㆍ진단, 치료 효과 또는 약효의 판정에 대한 이용

시노비올린은 RA 환자의 활막 조직에 있어서 강하게 발현되어 있다. 또한, RA 환자의 혈중에 있어서는, 시노비올린을 인식하는 항체 (자기 항체) 가 높은 빈도로 검출된다. 한편, 건강한 일반인의 혈중에서는, 시노비올린의 항체는 실질적으로 검출하기가 불가능하다. 또 시노비올린은 인비트로에 있어서 배양 활막 세포의 증식을 억제한다. 이것은, 활막 세포의 증식을 촉진하는 리간드에 대하여, 시노비올린이 경합하기 때문인 것으로 생각된다. 이러한 정보를 기초로, 다음과 같은 분자적 기전을 상정할 수 있다. 즉, 시노비올린의 활막 세포 에 있어서의 강발현이, 활막 세포에 대하여 증식 촉진 작용을 갖는 시노비올린의 리간드와의 결합을 재촉하여, 결과적으로 활막 세포의 증식이 촉진된다. 그리고 이 활막 세포의 이상 증식이야말로 RA 의 병태임이 분명하다.

이러한 지견에 따라서, SL-1 항체의 면역학적인 특성을 이용함으로써 세포 증식성 질환의 검출 방법 또는 진단 방법이 제공된다. 세포 증식성 질환은, 예를 들어, 류머티스 관절염, 암, 섬유증, 동맥경화, 캐슬맨병, 다발 골수종, 크론씨병, 전신형 소아 특발성 관절염, 뇌종양, 설암, 인두암, 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 담낭암, 십이지장암, 대장암, 간암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 신장암, 방광암, 횡문근육종, 섬유육종, 골육종, 연골육종, 피부암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 성인형 T 세포 백혈병, 악성 림프종 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 또한, 암에 관해서는 원발성, 전이성을 상관하지 않는다. 또한, 세포는, 활막 세포, 파골 세포, 각화 상피 세포, 혈액 세포, 암세포, 골수 세포, 섬유아 세포, 혈관 내피 세포, 진피 세포, 근세포, 신경 세포, 림프구, 혈관 평활근 세포, 간세포, 색소 세포, 지방 세포, 자궁 내피 세포, 폐포 상피 세포, 미분화 간엽계 세포, 정단 외배엽릉 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

이들의 방법은,

(i) 피검자의 생체 시료와 본 발명의 항체를 반응시켜, 시료 중에 존재하는 질환의 마커를 검출하는 공정, 및

(ii) 공정 (i) 의 검출 결과를, 질환과 연관시키는 공정

을 포함한다.

상기 마커는, 이하의 (a)∼(d) 에 나타내는 어느 하나의 마커를 사용할 수 있다. 이들 마커의 측정 방법은 후술한다.

(a) 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질,

(b) 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 펩티드,

(c) 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질에 결합하는 항체, 및

(d) 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 펩티드에 결합하는 항체

예를 들어, 피검자로부터 채취된 혈액 시료 중에, 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩티드와 반응하는 항체가 발견되면, 그 피검자는 RA 일 가능성이 높다.

또는, 환자로부터 채취된 활막 조직에 있어서의 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질의 발현은, RA 에 기인하는 활막 조직의 증성을 나타내고 있다. 단백질의 발현은, 일반적으로 단백질 자체 또는 그 정보를 담당하는 mRNA 의 존재를 지표로서 검출할 수 있다. 시노비올린의 검출을 위해서는, 본 발명의 SL-1 항체가 바람직하게 이용된다. 활막 세포, 활막 조직 등, 또는 체액 중에 있어서의 시노비올린이 검출되는 경우에는, RA 가 진행되고 있는 것으로 생각된다.

본 발명의 항체를 함유하는 면역학적 분석용 시약은, RA 의 진단 이외에 치 료 효과 또는 약효의 판정에도 유용하다. RA 의 치료 효과 또는 약효의 판정도 또한, 기본적으로는 RA 의 진단과 동일한 방법으로 실시된다. 활막 조직이나 혈액 중에 있어서의 시노비올린 또는 그 항체의 레벨이 그들의 단백질을 코드하는 유전자의 발현의 성함과 쇠함에 관계되어 있어, 그들의 검출은, 증상의 추이, 질환의 관해 (寬解) 를 나타내는 지표로서의 의의를 갖기 때문이다.

또한 본 발명의 SL-1 항체는, 시노비올린을 발현하는 세포의 분리 또는 검출에 이용할 수 있다. 활막 세포, 파골 세포, 각화 상피 세포, 혈액 세포, 암세포, 골수 세포, 섬유아 세포, 혈관 내피 세포, 진피 세포, 근세포, 신경 세포, 림프구, 혈관 평활근 세포, 간세포, 색소 세포, 지방 세포, 자궁 내피 세포, 폐포 상피 세포, 미분화 간엽계 세포, 정단 외배엽릉 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 시노비올린은, 발생에 있어서는 정단 외배엽릉에서 발현이 관찰되는 것 외에, 류머티즘 활막 세포, 그리고 활막, 뼈ㆍ연골 및 팔다리의 원기가 되는 미분화 간엽계 세포에 있어서 강하게 발현되어 있다. 따라서 시노비올린은, 특히, 정단 외배엽릉, 류머티즘 활막 세포 및 미분화 간엽계 세포의 마커로서 사용하는 것이 바람직하다.

즉, 시노비올린의 발현을 지표로,

활막 세포, 파골 세포, 각화 상피 세포, 혈액 세포, 암세포, 골수 세포, 섬유아 세포, 혈관 내피 세포, 진피 세포, 근세포, 신경 세포, 림프구, 혈관 평활근 세포, 간세포, 색소 세포, 지방 세포, 자궁 내피 세포, 폐포 상피 세포, 미분화 간엽계 세포, 정단 외배엽릉, 특히, 정단 외배엽릉, 류머티즘 활막 세포 및 미분화 간엽계 세포를 검출 또는 분리할 수 있다. 예를 들어, 시노비올린에 대한 항시노비올린 모노클로날 항체를 적절히 형광 등에 의해 표지하고 세포와 반응시켜, 셀 소팅 등에 의해 시노비올린을 발현하는 세포를 분리할 수 있다. 분리된 미분화 간엽계 세포는, 인비트로 또는 인비보에 있어서, 조직, 예를 들어, 근육, 힘줄, 지방, 및 골수 등의 간질 (stroma), 뼈ㆍ연골의 형성, 또는 관절의 재구축에 유용하다. 재구축된 조직이나 기관은, 기초적 연구의 이용 외에 재생 의학적 응용이 기대된다.

본 발명의 항체는, 시노비올린을 정제하기 위한 항체 칼럼의 작성, 정제시의 각 분획 중에 존재하는 그 단백질의 검출에 이용해도 된다. 다만, 본 발명에 관련된 특이적인 항시노비올린 모노클로날 항체의 이용은, 이들 용도에만 한정되는 것은 아니다.

(3) 면역학적 분석용 시약을 사용한 분석

다음으로, SL-1 항체를 함유하는 면역학적 분석용 시약은, 상기 용도를 위해 어떠한 양태로 사용되는지에 관해서 구체적으로 서술한다.

샘플 중의 항원 또는 항체에 대한 면역학적 분석 방법에는 다수의 수법이 일반적으로 보급되어 있다. 시노비올린 또는 그 프래그먼트 등에 대하여 모노클로날 항체를 사용하는 측정법은 특별히 특정한 방법에 한정되는 것은 아니고, 검체 중의 항원량, 즉 시노비올린의 양에 대응한 항체 또는 항원-항체 복합체의 양을 화학적 또는 물리적 수단에 의해 검출하고, 이것을 양을 미리 알고 있는 항원을 함유하는 표준 용액을 사용하여 작성한 검량선으로부터 산출하는 측정 방법이면, 어떠 한 방법이나 사용할 수 있다. 항원-항체 복합체의 양의 검출 방법으로서, 구체적으로는 경합법, 이뮤노메트릭 (immunometric) 법, 네펠로메트리 (nephelometry), 샌드위치법 등이 바람직하게 사용되며, 감도 및 특이성의 견지에서 다음의 샌드위치법이 특히 바람직하다.

샌드위치법 (예를 들어 ELISA 법) 에서는, 고상화한 본 발명의 SL-1 항체에 검체 (정량 대상인 시노비올린을 함유) 를 반응시키고 (1 차 반응), 또한 표지화한 항시노비올린 항체를 반응시킨 (2 차 반응) 후, 고상화 담체 상의 표지제의 활성을 측정함으로써, 검체 중의 시노비올린 등의 양을 정량할 수 있다. 이 경우, 1 차 반응과 2 차 반응은 역순서로 실시해도 되고, 동시에 실시해도 되며, 시간을 어긋나게 하여 실시해도 된다. 2 차 반응에 사용되는 항체는, 시노비올린이 결합하는 부위가 본 발명의 SL-1 항체와 상이한 항체가 바람직하게 사용된다.

본 발명의 모노클로날 항체를 사용하는 이뮤노메트릭법에서는, 검체 중의 항원과 고상화 항원을 일정량의 표지화 모노클로날 항체에 대하여 경합 반응을 시킨 후에, 고상과 액상을 분리한다. 또는 검체 중의 항원과 과잉량의 표지화 모노클로날 항체를 반응시키고, 이어서 고상화 항원을 첨가하여 미반응의 표지화 항체를 고상에 결합시킨 후, 고상과 액상을 분리한다. 다음으로 임의의 하나의 상의 표지량을 측정하여 검체 중의 항원량을 정량한다.

경합법에서는, 검체 중의 항원과 표지 항원을 항체에 대하여 경합적으로 반응시킨 후, 미반응의 표지 항원 (F) 과, 항체와 결합한 표지 항원 (B) 을 분리하여 (B/F 분리), B, F 중 어느 하나의 표지량을 측정해서 검체 중의 항원량을 정량한 다. 별도의 방법으로서, 항체에는 가용성 항체를 사용하여, B/F 분리를 폴리에틸렌글리콜, 상기 항체에 대한 제 2 항체 등을 사용하는 액상법, 제 1 항체로서 고상화 항체를 사용하거나, 또는 제 1 항체는 가용성인 것을 사용하고, 제 2 항체로서 고상화 항체를 사용해도 된다. 예를 들어, 담체 상에 고상화한 본 발명의 항시노비올린 모노클로날 항체 및 표지화된 항체와 검체를 동시 또는 연속적으로 경합 반응시킨 후, 고상화 담체 상의 표지제의 활성을 측정하는 것도 가능하다.

네펠로메트리에서는 겔 내 또는 용액 중에서 항원 항체 반응의 결과 생긴 불용성의 침강물량을 측정한다. 검체 중의 항원량이 소량이기 때문에 미량의 침강물밖에 얻어지지 않는 경우에는, 레이저 산란을 이용하는 레이저 네펠로메트리 등이 바람직하게 사용된다.

샘플 중의 항체를 검출ㆍ분석하기 위해서는 항원 감작 플레이트를 샘플 중의 항체와 반응시키고, 플레이트 표면에 포착되는 검출 대상이 되는 항체를 특이적인 항원으로 하는 표지 항체로 검출하는 방법이, 항체의 면역학적 분석 방법으로서 가장 일반적인 방법이다 (Immunochemistry, 8: 871-879, 1971). 또는 플레이트상의 미결합 항원을 검출하기 위한 표지 항체로서, 본 발명의 SL-1 항체를 사용해도 된다. 또 항원을 흡착시킨 라텍스 입자를 샘플과 혼합하여, 면역학적인 응집 반응으로서 항체를 검출하는 방법도 공지이다 (Plotz C. M & Singer J. M, Am. J. Med., 21: 888-892, 1956). 면역학적 입자 응집 반응은 1 시약으로 신속한 분석이 가능한 방법으로, 대규모 스크리닝에는 바람직한 방법이다.

본 발명의 SL-1 항체를 세포의 분리 또는 검출용 시약으로서 사용하는 경우 에는, 항시노비올린 모노클로날 항체를 다른 용매나 용질과 조합하여 조성물로 할 수 있다. 예를 들어, 증류수, pH 완충 시약, 염, 단백질, 계면 활성제 등을 조합할 수 있다.

반응 시약은 적당한 화학적 또는 물리적 검출 수단에 의해 검출가능한 표지를 갖는다. 그와 같은 표지 물질을 사용하는 측정법에 사용되는 표지제로서, 예를 들어 형광 물질, 효소, 방사성 동위 원소, 발광 물질 등이 사용된다. 특히 표지에 효소를 사용한 경우에는 ELISA 법이라고 불리며, 널리 이용되고 있다.

형광 물질로서, 플루오레스 카민, 플루오레세인 이소티오시아네이트 등, 효소로서, 퍼옥시다아제, 알카리 포스파타아제, 말산 탈수 효소, α-글루코시다아제, α-갈락토시다아제 등, 방사성 동위 원소로서, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H, ¹⁴C 등, 발광 물질로서, 루시페린, 루시게닌, 루미놀, 루미놀 유도체 등이 예시된다.

또 본 발명의 SL-1 항체 또는 항원과 표지제와의 결합에 비오틴-아비딘계를 사용해도 된다. 항원 또는 모노클로날 항체의 고상화에는, 물리적 흡착을 사용해도 되고, 또는 통상 단백질 또는 효소 등을 고상화, 고정화하기 위해서 사용되는 화학 결합을 사용하는 방법이어도 된다. 담체로서, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 규소 등의 합성 수지, 아갈로오스, 덱스트란, 셀룰로오스 등의 불용성 다당류, 또는 유리 등이 사용된다.

반응 매체로서, 반응의 지적 조건을 부여하거나, 반응 생성 물질의 안정화 등에 유용한 완충액, 반응 물질의 안정화제 등이 포함된다.

검출 수단으로는, 분광기, 방사선 검출기, 광산란 검출기와 같은 상기 표지를 검출가능한 것이다.

(4) 검사 진단용 키트

본 발명의 SL-1 항체를 면역학적 측정 방법에 적용하는 경우, 특별한 조건, 조작 등은 필요하지 않다. 각각의 방법에 있어서의 통상적인 조건, 조작에 준하여 실시되고, 필요하다면 약간의 수식을 가하여 바람직한 측정계를 구축할 수 있다.

이를 위한 가장 간편하고 또한 효율적으로 측정의 실시를 가능하게 하는 것은, 상기 시약을 키트화하는 것이다. 그러한 키트화에 의해, 통상의 검사실 또는 실험실에서, 특수한 분석 기기, 숙련한 조작, 고도의 지식은 필요로 하지 않고서 효율적으로 정량을 실시할 수 있다. 상기한 각종 진단 방법 또는 치료의 판정 방법을 실시하기 위한 어세이 키트의 구성 및 형태는 특별히 한정되지 않고, 소정의 목적을 달성할 수 있는 것이면 그 내용은 한정되지 않는다. 일반적으로는 상기 검체 시료에 관해서 어세이 방법을 실행하여 얻어진 결과를 해석하기 위한 사용 설명서, 반응 시약, 반응이 실시되는 장소가 되는 반응 매체, 어세이 장소를 제공하는 기재 등으로 구성된다. 또한 원한다면, 비교 기준으로 하기 위한 또는 검량선을 작성하기 위한 대조 샘플, 검출기 등도 포함해도 된다.

(5) 의약 조성물

본 발명의 항체는, 세포 증식성 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물로서 유용하다. 세포 증식성 질환으로는, 예를 들어, 류머티스 관절염, 암, 섬유 증, 동맥경화, 캐슬맨병, 다발 골수종, 크론씨병, 전신형 소아 특발성 관절염, 뇌종양, 설암, 인두암, 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 담낭암, 십이지장암, 대장암, 간암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 신장암, 방광암, 횡문근육종, 섬유육종, 골육종, 연골육종, 피부암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 성인형 T 세포 백혈병, 악성 림프종 등을 들 수 있으며 이들에 한정되지 않는다. 또한, 암에 관해서는 원발성, 전이성을 상관하지 않는다.

본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 항체 또는 그 단편을 유효 성분으로서 함유하고, 추가로 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물의 형태로 제공하는 것이 바람직하다.

여기서 「약학적으로 허용될 수 있는 담체」란, 부형제, 희석제, 증량제, 붕괴제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미제, 용해 보조제 또는 그 밖의 첨가제 등을 들 수 있다. 그와 같은 담체의 하나 이상을 사용함으로써, 주사제, 액제, 캡슐제, 현탁제, 유제 또는 시럽제 등의 형태의 의약 조성물을 조제할 수 있다. 이러한 의약 조성물은, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구 투여를 위한 그 밖의 형태로는, 하나 또는 그 이상의 활성 물질을 함유하고, 통상적인 방법에 의해 처방되는 주사제 등이 포함된다.

본 발명의 약제의 투여량은, 환자의 연령, 성별, 체중 및 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간, 또는 그 약제에 함유되는 활성 성분인 고친화성 항체의 종류 등에 따라 다르지만, 통상 성인 1 인당, 1 회에 대해 600㎍∼6000㎎, 바람직하게는 6∼600㎎ 의 범위에서 투여할 수 있지만, 이 범위에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어, 주사제의 경우에는, 예를 들어 생리 식염수 또는 시판되는 주사용 증류수 등의 약학적으로 허용되는 담체 중에 1㎎ 항체/㎖ 담체∼100㎎ 항체/㎖ 담체의 농도가 되도록 용해 또는 현탁함으로써 제조할 수 있다. 이렇게 해서 제조된 주사제는, 처치를 필요로 하는 인간 환자에게 대하여 1 회의 투여에 있어서 1kg 체중당 10㎍∼100㎎ 의 비율로, 바람직하게는 100㎍∼10㎎ 의 비율로, 1 일당 1 회∼수 회 투여할 수 있다. 투여의 형태로는, 정맥내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육내 주사 혹은 복강내 주사 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 정맥내 주사이다. 또, 주사제는 경우에 따라서, 비수성의 희석제 (예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에탄올과 같은 알코올류 등), 현탁제 혹은 유탁제로서 조제할 수도 있다. 그와 같은 주사제의 무균화는, 필터에 의한 여과 멸균, 살균제의 배합 등에 의해 실시할 수 있다. 주사제는, 용시 조제의 형태로서 제조할 수 있다. 즉, 동결 건조법 등에 의해서 무균의 고체 조성물로 하고, 사용전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는, 당업자에 있어서 다종 다양하게 개변이 가능하지만, 본 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다. 또, 특별히 언급하지 한, % 는 중량% 를 나타낸다.

〔실시예 1〕

본 실시예는, 항시노비올린 모노클로날 항체의 제조를 목적으로 한다.

항시노비올린 모노클로날 항체의 조제를 위해, 면역용의 펩티드로서, 이하에 나타내는 인간 시노비올린의 부분 아미노산 서열을 포함하는 3 종류의 펩티드를 합성하였다. 이들 아미노산 서열은, 항원성을 갖는 것으로 추측된 영역에서 선택된 것이다.

Syno-P3 (SLALTGAVVAHAYYC) (서열번호 3),

Syno-P2 (TCRMDVLRASLPAQS) (서열번호 4), 및

Syno-P1 (GAATTTAGTSATAC) (서열번호 5)

각 합성 펩티드에, 아미노산 서열 중의 Cys 를 통하여 구멍삿갓조개 헤모시아닌 (KLH) 을 결합시켰다. KLH 를 결합한 각 합성 펩티드의 50㎍ 을 0.1㎖ 생리 식염수에 용해하고, 프로인드의 완전 아주반트 (FCA) 0.1㎖ 를 첨가하여 면역원을 제조하였다. 각 면역원을 각각 8 마리의 마우스 (BALB/c 암컷, 5주령) 등부 피하에 0.2㎖ 주사하여 면역시켰다. 면역은 2 주마다 합계 4 회 실시하고, 그 1 주 후에 추가로 1 회 면역시켰다. 최종 면역의 8 일 후에, 심장에서 채혈하여 혈청 200㎕ 이상을 분취하였다. ELISA 에 의해서 항체가의 상승을 확인할 수 있었던 개체로부터 비장 세포를 채취하여, 세포 융합을 실시하였다.

각 면역원에 관하여 3 개체의 마우스 혈청에 대해, ELISA 에 의한 항체가의 측정을 실시하였다. 어느 쪽 면역원을 사용한 경우에서도, 항체가가 상승한 개체가 확인되었다. 이들 면역원이 모두 시노비올린의 면역원으로서 유용함이 확인되었다.

골수종 세포주 (P3U1) 와 마우스 비장 세포를 1:10 으로 혼화하고, 50% 의 PEG (와코 쥰야쿠사 PEG1540) 존재하에서 세포 융합시켰다. 융합 후, 비장 세포수가 5×10⁵ 개/㎖ 가 되도록 96 웰 플레이트에 심었다. HAT 배지 중에서 10∼14 일 배양한 후, 세포의 증식을 확인하고, 배양 상청을 검정하였다.

배양 상청의 검정에는, 각 합성 펩티드를 고상화한 ELISA 플레이트를 사용하였다. 검정의 조작은 다음과 같다. ELISA 플레이트에 배양 상청을 반응시킨 후, 항마우스 IgG 염소-파옥시다아제 (POX) 를 사용하여 양성 웰을 선택하였다. 클로닝시킬 웰을 선택하고, 그 밖의 양성 웰의 세포에 관해서는 동결 저장하였다.

수 일 후, 1 주에 관하여 96 웰 플레이트 1 장, 100 세포/플레이트 (20 세포/㎖) 가 되도록 뿌리고, 10∼14 일간 배양하였다. 콜로니를 판정하고, 배양 상청을 검정하였다. 배양 상청의 검정은, 상청 50㎕ 를 상기 스크리닝용 항원 고상화 ELISA 플레이트에 적용하여 실시하였다. 제 2 항체는, 항마우스 IgG 염소-POX 를 사용하였다. 선택한 콜로니는, 배양 후, 리클로닝하고, 10∼14 일간 배양하여 콜로니 판정 및 배양 상청의 검정을 상기와 동일하게 실시하였다. 신주 별로 웰을 선택하여, 24 웰 플레이트에서 배양한 후, 상청을 회수하고 클론을 체크해서, 항체의 서브클래스 및 항체 생성을 검정하였다. 클로닝 결과, 시노비올린에 대하여 매우 높은 친화성을 갖는 모노클로날 항체를 높은 효율로 생성하는 하이브리도마로서, Syno-P2 를 면역원으로 하여 얻어진 클론 SL-1 이 선택되었다.

〔실시예 2〕

본 실시예는, 항시노비올린 모노클로날 항체를 사용한 환자 시료의 시노비올린의 검출을 목적으로 한다.

(1) 항시노비올린 모노클로날 항체에 의한 환자 유래 활막 세포의 웨스턴 블롯팅

실시예 1 에서 얻은, Syno-P2 를 인식하는 SL-1 항체를 사용하여, 만성 류머티스 관절염 환자 (RA) 유래 활막 세포의 단백질을 SDS-PAGE 로 분리하고, 웨스턴 블롯팅법을 실시하였다. 웨스턴 블롯팅법의 조작은, 항체로서 실시예 1 의 SL-1 항체를, 그리고 표지 항체로서 항마우스 IgG 양-HRP 를 사용하였다.

대조로서, 변형성 관절증 환자 (OA) 유래의 활막 세포도 해석하였다. 그 결과, RA 환자 유래의 활막 세포에서 특이적인 시그널이 검출되었다 (도 1 「RA」 레인 1, 2 의 85kDa 부근의 밴드). 실시예 1 에서 얻어진 SL-1 항체는, 시노비올린을 보다 특이적으로 인식하는 것이 확인되었다.

(2) 항시노비올린 모노클로날 항체에 의한 RA 환자 유래 활막 세포의 형광 면역 염색

SL-1 항체를 사용하여, RA 환자 유래 활막 세포의 형광 면역 세포 화학 해석을 실시하였다. 면역 염색의 조작은, 항체로서 실시예 1 의 SL-1 항체를, 그리고 표지 항체로서 항마우스 IgG 양-FITC 를 사용하는 것 외에는, 국제 공개 제WO02/052007호 팜플렛의 실시예 9 에 기재된 것과 같다. 시노비올린의 시그널은, RA 환자 유래 활막 세포에서 강하게 검출되었으나 (도 2 상 패널), 2 차 항체 만을 반응시킨 대조에서는 검출되지 않았다 (도 2 하 패널).

(3) 항시노비올린 모노클로날 항체에 의한 RA 환자 유래 활막 조직의 면역 염색

SL-1 항체를 사용하여, RA 환자로부터 채취한 활막 조직 절편의 면역 염색을 실시하였다. 면역 염색의 조작은, 항체로서 실시예 1 의 SL-1 항체를, 그리고 표지 항체로서 항마우스 IgG 양-HRP 를 사용하는 것 외에는, 국제 공개 제WO02/052007호 팜플렛의 실시예 9 에 기재된 것과 같다. 시노비올린은, RA 환자 유래 활막 조직에서 강하게 발현되어 있었다 (도 3 SL-1 항체의 패널). 동시에 실시한 HE 염색에 의해 활막 세포의 증식층이 관찰되어, 그 부분이 모노클로날 항체로 염색되어 있음이 확인되었다. 이들 결과로부터, 본 발명의 SL-1 항체는, RA 환자의 활막 조직 중의 시노비올린을 특이적으로 인식하는 것이 확인되었다 (도 3, HE 염색의 패널).

이상과 같이, 항시노비올린 항체를 사용하여 환자 시료 중의 시노비올린을 검출함으로써, RA 의 검사 및 진단을 실시할 수 있다.

〔실시예 3〕

본 실시예는, 시노비올린 검출용 ELISA 법 검사약을 개발하는 것을 목적으로 한다.

실시예 1 의 방법에 의해 얻어진 SL-1 항체를 적량 취하여, PBS 에 20㎍/㎖ 가 되도록 용해하였다. 용액을 효소 면역 분석법 (EIA) 용 96 웰 평저 마이크로플레이트에 100㎕/웰 씩 분주하고, 실온하에서 수 시간, 정치하였다. 웰로부 터 용액을 제거하고, 0.05(V/V)% Tween20 을 함유하는 PBS 로 세정한 후, 1(V/V)%-소태아 알부민 (BFA) 을 함유하는 PBS, 100㎕/웰을 첨가하여, 4℃ 에서 하룻밤 정치시켜 모노클로날 항체를 블록한 후, PBS 를 제거하여 항체 플레이트를 얻었다.

이와는 별도로, 통상적인 방법에 따라서 시노비올린에 의한 토끼의 면역 감작에 의해 폴리클로날 항체를 조제하였다. 이 폴리클로날 항체를, 과요오드산 산화 방법에 의해 양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 로 표지하고, PBS 로 예비 평형화한 세파크릴 S-300HR (Pharmacia 사) 을 사용하는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제하여 표지 항체를 얻었다. 이 2 차 표지 항체는, 염, 안정화제, 방부제 등을 함유하는 완충 시약의 조성물로 하였다.

이렇게 해서 얻어진 고상 SL-1 항체를 갖는, 상기 96 웰 마이크로플레이트에, 통상의 EIA 에 준하여, 적절히 희석한 환자의 혈액, 뇨 등의 체액 또는 조직 등을 분주하고 실온에서 1 시간, 작용시켰다. 이 때, 희석액만을 첨가하여 웰을 대조로 하였다. 0.05% Tween20 함유 인산 완충액으로 세정 후, HRP 표지 항마우스 IgG 토끼 항체를 추가하여, 실온에서 30 분간 반응시켰다. 미반응의 2 차 표지 항체를 0.05% Tween20 함유 인산 완충액으로 세정 후, 기질 완충액으로서 0.015% 과산화 수소를 함유하는 0.1M 시트르산 완충액, 및 염색제로서 O-페닐렌디아민-시트르산염 완충액 (10㎎/㎖) 을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 2M 황산을 첨가하여 발색 반응을 정지시켰다. 이어서 정색 (呈色) 은, 492㎚ 의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 측정함으로써 피검체 중의 시노비올린량을 구하였다.

〔실시예 4〕

본 실시예는, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 검토하는 것을 목적으로 한다.

시노비올린은 RING 핑거 모티브를 갖는 E3 유비퀴틴-단백질 리가아제이고, RING 핑거 모티브는 E2 유비퀴틴 결합 효소의 결합 부위로 생각되고 있다. 또한, E3 유비퀴틴-단백질 리가아제는, 자기 유비퀴틴화를 하는 것이 알려져 있으며, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화에 관해서도 실험적으로 확인되어 있다.

마우스 모노클로날 항체인 SL-1 은, 시노비올린 단백질의 RING 핑거 영역의 328∼342번째 아미노산에 대응하는 펩티드를 항원으로 하여 제조하였다 (실시예 1). His 태그 융합 단백질 MBP-dTM Syno-His 를 사용하여, 일정 농도의 SL-1 항체, 항 FLAG 항체 또는 마우스 IgG 과 혼합시키고, 4℃ 에서 1.5 시간, 항원 항체 반응을 실시하였다.

그 후, 인비트로에서의 유비퀴틴화 반응계를 사용하여 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 검토하였다. E1 (효모 유래), E2 (UbcH5c), ATP, GST-HA-유비퀴틴 그리고 미리 항체와 반응시킨 각 MBP-dTM Syno-His 를 혼합하여, 37℃, 120 분간 반응시켰다. 반응후의 각 샘플에 4xSDS-PAGE 완충액을 첨가하여, 5 분간 끓인후, 10% SDS-PAGE 상에서 전개시켰다. 그리고, 웨스턴 블롯팅 해석법으로, 시노비올린의 유비퀴틴화된 밴드를 SL-1 항체를 사용해서 검출하였다.

결과적으로, SL-1 항체의 양에 의존하여 250kDa 의 밴드가 저해되어 있는 것에서, MBP-dTM Syno-His 의 자기 유비퀴틴화가 2㎍ 의 SL-1 항체에 의해 저해되는 것이 관찰되었다. 그러나, 동량의 항 FLAG 항체나 마우스 IgG 에서는 250kDa 의 밴드의 저해 작용이 발견되지 않았다 (도 4 상 패널). 또한, 같은 실험에서, SL-1 항체량을 8∼44㎍/L 까지 검토한 경우에도 250kDa 부근의 밴드가 저해되어, SL-1 항체에 의해서 MBP-dTM Syno-His 의 자기 유비퀴틴화가 저해되는 것이 개시되었다 (도 4 하 패널). 따라서, MBP-dTM Syno-His 의 자기 유비퀴틴화는 SL-1 항체에 의해 특이적으로 저해됨이 분명해졌다.

〔실시예 5〕

본 실시예는, SL-1 항체가 시노비올린에 의한 유비퀴틴화에 대해서도 영향을 주는지 여부에 관해서 검토하는 것을 목적으로 한다.

유비퀴틴은 활성화 효소 (E1), 결합 효소 (E2), 리가아제 (E3) 로 이루어지는 유비퀴틴계에 의해 표적 단백질 (기질) 에 공유 결합하고, 이 반응이 반복됨으로써 형성되는 폴리유비퀴틴 사슬이, 기질의 프로테아좀에 의한 분해 마커로서 작용한다. 콜라겐 생성에 있어서 필수적인 콜라겐의 프롤린 잔기의 수산화를 촉매하는 효소인 프롤릴 히드락시라아제의 α 서브 유닛인 P4HA1 은 시노비올린의 기질임이 확인되어 있다. SL-1 항체가 시노비올린의 자기 유비퀴틴화 활성을 저해하는 작용이 알려져 있기 때문에, 이 항체가 P4HA1 의 시노비올린에 의한 유비퀴틴화에 대해서도 영향을 주는지 여부에 관해서 검토하였다.

우선, MBP-dTM Syno-His 를 일정 농도의 SL-1 항체, 항 FLAG 항체 또는 마우스 IgG 과 혼합시키고, 4℃ 에서 1.5 시간, 항원 항체 반응을 실시하였다. 그 후, 인비트로의 유비퀴틴화 반응계에서, 2㎍ 의 GST 융합 P4HA1 단백질 GST-P4HA1 을 E1 (효모 유래), E2 (UbcH5c), ATP, GST-HA-유비퀴틴 그리고 미리 항체와 반응시킨 각 MBP-dTM Syno-His 와 혼합시켜, 37℃, 120 분간 반응시켰다. 반응후의 각 샘플에 4xSDS-PAGE 완충액을 첨가하여, 5 분간 끓인후, 10% SDS-PAGE 상에서 전개시켰다. 그리고, 웨스턴 블롯팅 해석법으로, P4HA1 의 유비퀴틴화된 밴드를 항 GST 항체에 의해 검출하였다.

결과적으로, MBP-dTM Syno-His 의 자기 유비퀴틴화가 4㎍ 의 SL-1 항체에 의해 분명히 저해되었지만, GST-P4HA1 의 유비퀴틴화에서는 8㎍ 의 SL-1 항체에 의해서도 거의 저해되지 않음이 분명해졌다 (도 5). 여기서, 도 5 에 있어서, -E3 은 시노비올린을 함유하지 않은 샘플, α-SL1 은 항체를 첨가한 샘플, IgG 은 네거티브 컨트롤로 해 둔 샘플을 각각 나타내고 있고, GST-P4HA1-Ubn 에 나타낸 250kDa 부근의 밴드가 유비퀴틴화된 GST-P4HA1 을 나타내고 있다. 따라서, SL-1 항체는 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 특이적으로 저해하고, GST-P4HA1 의 유비퀴틴화에는 영향을 주지 않음이 분명해졌다.

본 발명의 항체에 의하면, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 조절할 수 있다.

또한, RA 환자의 혈중에 시노비올린을 인식하는 자기 항체가 발견됨으로써, RA 의 진단에 있어서 전혀 새로운 어프로치를 가져온다. 따라서, 본 발명의 항체를 함유하는 의약 조성물은, RA 의 치료 방법 등의 개발에 있어서도 지금까지 없던 새로운 어프로치를 제시할 수 있다.

또한, 본 발명에 의해, 상기 항체를 생성하는 세포, 및 상기 모노클로날 항 체를 이용한 시노비올린 함유 세포 검출 키트도 제공된다.

활막의 발달 및 뼈ㆍ연골 및 사지의 발달에 관여하는 시노비올린의 유전자는 RA 의 병태에 관여하고 있어, RA 환자에서는 이 유전자 산물에 대한 항체가 생성되어 있다. 본 발명의 SL-1 항체는, RA 의 진단에 유용한 마커가 되는 시노비올린 및 환자 혈청 중에 고빈도로 발견되는 그 항체의 특이적 검출, 정량에 이용할 수 있어, RA 질환의 진단이나 치료 효과의 판정에 공헌하는 것이다.

본 발명의 SL-1 항체는 그 높은 특이성을 이용함으로써, 시노비올린을 세포마커로서 사용하여 배의 세포 등으로부터 미분화 간엽계 세포를 회수할 수 있어, 그 재생 의학적인 응용에도 기여할 수 있다.

<110> Locomogene Inc. <120> Anti-Synoviolin antibody <130> G06-0076 <150> JP2004-197010 <151> 2004-07-02 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3374 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (403)..(2253) <400> 1 gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg 60 ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa 120 gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat 180 tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca 240 ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag 300 tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga 360 gcgggctcgc ggcgctgggt tcctggtctc cgggccaggg ca atg ttc cgc 411 Met Phe Arg 1 acg gca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg gct gtg gtg 459 Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val 5 10 15 gct cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act gtg gtg tac 507 Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr Val Val Tyr 20 25 30 35 ctg acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc cag gcc ttt 555 Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln Ala Phe 40 45 50 gtc ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg ttc ttt ggg 603 Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val Phe Phe Gly 55 60 65 caa ctg agg gca gca gag atg gag cac ctt ctg gaa cgt tcc tgg tac 651 Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg Ser Trp Tyr 70 75 80 gcc gtc aca gag act tgt ctg gcc ttc acc gtt ttt cgg gat gac ttc 699 Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg Asp Asp Phe 85 90 95 agc ccc cgc ttt gtt gca ctc ttc act ctt ctt ctc ttc ctc aaa tgt 747 Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe Leu Lys Cys 100 105 110 115 ttc cac tgg ctg gct gag gac cgt gtg gac ttt atg gaa cgc agc ccc 795 Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu Arg Ser Pro 120 125 130 aac atc tcc tgg ctc ttt cac tgc cgc att gtc tct ctt atg ttc ctc 843 Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu Met Phe Leu 135 140 145 ctg ggc atc ctg gac ttc ctc ttc gtc agc cac gcc tat cac agc atc 891 Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr His Ser Ile 150 155 160 ctg acc cgt ggg gcc tct gtg cag ctg gtg ttt ggc ttt gag tat gcc 939 Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe Glu Tyr Ala 165 170 175 atc ctg atg acg atg gtg ctc acc atc ttc atc aag tat gtg ctg cac 987 Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr Val Leu His 180 185 190 195 tcc gtg gac ctc cag agt gag aac ccc tgg gac aac aag gct gtg tac 1035 Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys Ala Val Tyr 200 205 210 atg ctc tac aca gag ctg ttt aca ggc ttc atc aag gtt ctg ctg tac 1083 Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val Leu Leu Tyr 215 220 225 atg gcc ttc atg acc atc atg atc aag gtg cac acc ttc cca ctc ttt 1131 Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe Pro Leu Phe 230 235 240 gcc atc cgg ccc atg tac ctg gcc atg aga cag ttc aag aaa gct gtg 1179 Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys Lys Ala Val 245 250 255 aca gat gcc atc atg tct cgc cga gcc atc cgc aac atg aac acc ctg 1227 Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met Asn Thr Leu 260 265 270 275 tat cca gat gcc acc cca gag gag ctc cag gca atg gac aat gtc tgc 1275 Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp Asn Val Cys 280 285 290 atc atc tgc cga gaa gag atg gtg act ggt gcc aag aga ctg ccc tgc 1323 Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg Leu Pro Cys 295 300 305 aac cac att ttc cat acc agc tgc ctg cgc tcc tgg ttc cag cgg cag 1371 Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe Gln Arg Gln 310 315 320 cag acc tgc ccc acc tgc cgt atg gat gtc ctt cgt gca tcg ctg cca 1419 Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro 325 330 335 gcg cag tca cca cca ccc ccg gag cct gcg gat cag ggg cca ccc cct 1467 Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly Pro Pro Pro 340 345 350 355 gcc ccc cac ccc cca cca ctc ttg cct cag ccc ccc aac ttc ccc cag 1515 Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn Phe Pro Gln 360 365 370 ggc ctc ctg cct cct ttt cct cca ggc atg ttc cca ctg tgg ccc ccc 1563 Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu Trp Pro Pro 375 380 385 atg ggc ccc ttt cca cct gtc ccg cct ccc ccc agc tca gga gag gct 1611 Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Gly Glu Ala 390 395 400 gtg gct cct cca tcc acc agt gca gca gcc ctt tct cgg ccc agt gga 1659 Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Ser Gly 405 410 415 gca gct aca acc aca gct gct ggc acc agt gct act gct gct tct gcc 1707 Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ala 420 425 430 435 aca gca tct ggc cca ggc tct ggc tct gcc cca gag gct ggc cct gcc 1755 Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly Pro Ala 440 445 450 cct ggt ttc ccc ttc cct cct ccc tgg atg ggt atg ccc ctg cct cca 1803 Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu Pro Pro 455 460 465 ccc ttt gcc ttc ccc cca atg cct gtg ccc cct gcg ggc ttt gct ggg 1851 Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe Ala Gly 470 475 480 ctg acc cca gag gag cta cga gct ctg gag ggc cat gag cgg cag cac 1899 Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg Gln His 485 490 495 ctg gag gcc cgg ctg cag agc ctg cgt aac atc cac aca ctg ctg gac 1947 Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu Leu Asp 500 505 510 515 gcc gcc atg ctg cag atc aac cag tac ctc acc gtg ctg gcc tcc ttg 1995 Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala Ser Leu 520 525 530 ggg ccc ccc cgg cct gcc act tca gtc aac tcc act gag ggg act gcc 2043 Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly Thr Ala 535 540 545 act aca gtt gtt gct gct gcc tcc tcc acc agc atc cct agc tca gag 2091 Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser Ser Glu 550 555 560 gcc acg acc cca acc cca gga gcc tcc cca cca gcc cct gaa atg gaa 2139 Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu Met Glu 565 570 575 agg cct cca gct cct gag tca gtg ggc aca gag gag atg cct gag gat 2187 Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro Glu Asp 580 585 590 595 gga gag ccc gat gca gca gag ctc cgc cgg cgc cgc ctg cag aag ctg 2235 Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln Lys Leu 600 605 610 gag tct cct gtt gcc cac tgacact gccccagccc agccccagcc tctgctcttt 2290 Glu Ser Pro Val Ala His 615 tgagcagccc tcgctggaac atgtcctgcc accaagtgcc agctccctct ctgtctgcac 2350 cagggagtag tacccccagc tctgagaaag aggcggcatc ccctaggcca agtggaaaga 2410 ggctggggtt cccatttgac tccagtccca ggcagccatg gggatctcgg gtcagttcca 2470 gccttcctct ccaactcttc agccctgtgt tctgctgggg ccatgaaggc agaaggttta 2530 gcctctgaga agccctcttc ttcccccacc cctttccagg agaaggggct gcccctccaa 2590 gccctacttg tatgtgcgga gtcacactgc agtgccgaac agtattagct cccgttccca 2650 agtgtggact ccagaggggc tggaggcaag ctatgaactt gctcgctggc ccacccctaa 2710 gactggtacc catttccttt tcttaccctg atctccccag aagcctcttg tggtggtggc 2770 tgtgccccct atgccctgtg gcatttctgc gtcttactgg caaccacaca actcagggaa 2830 aggaatgcct gggagtgggg gtgcaggcgg gcagcactga gggaccctgc cccgcccctc 2890 cccccaggcc cctttcccct gcagcttctc aagtgagact gacctgtctc acccagcagc 2950 cactgcccag ccgcactcca ggcaagggcc agtgcgcctg ctcctgacca ctgcaatccc 3010 agcgcccaag gaaggccact tctcaactgg cagaacttct gaagtttaga attggaatta 3070 cttccttact agtgtctttt ggcttaaatt ttgtcttttg aagttgaatg cttaatcccg 3130 ggaaagagga acaggagtgc cagactcctg gtctttccag tttagaaaag gctctgtgcc 3190 aaggagggac cacaggagct gggacctgcc tgcccctgtc ctttcccctt ggttttgtgt 3250 tacaagagtt gttggagaca gtttcagatg attatttaat ttgtaaatat tgtacaaatt 3310 ttaatagctt aaattgtata tacagccaaa taaaaacttg cattaacaaa aaaaaaaaaa 3370 aaaa 3374 <210> 2 <211> 617 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly 1 5 10 15 Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr 20 25 30 Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile 35 40 45 Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val 50 55 60 Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg 85 90 95 Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe 100 105 110 Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu 115 120 125 Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu 130 135 140 Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr 145 150 155 160 His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe 165 170 175 Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr 180 185 190 Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys 195 200 205 Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val 210 215 220 Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe 225 230 235 240 Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys 245 250 255 Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met 260 265 270 Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp 275 280 285 Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg 290 295 300 Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe 305 310 315 320 Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala 325 330 335 Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly 340 345 350 Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn 355 360 365 Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu 370 375 380 Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser 385 390 395 400 Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg 405 410 415 Pro Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala 420 425 430 Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala 435 440 445 Gly Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro 450 455 460 Leu Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly 465 470 475 480 Phe Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu 485 490 495 Arg Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr 500 505 510 Leu Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu 515 520 525 Ala Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu 530 535 540 Gly Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro 545 550 555 560 Ser Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro 565 570 575 Glu Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met 580 585 590 Pro Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu 595 600 605 Gln Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His 610 615 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro Ala Gln Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Cys 1 5 10 15

Claims (18)

1. 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해할 수 있는, 시노비올린에 대한 항체 또는 그 단편.
2. 제 1 항에 있어서,

   시노비올린의 기질 단백질의 유비퀴틴화에는 영향을 주지 않는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   항체가 모노클로날 항체인 항체 또는 그 단편.
4. 서열번호 3∼5 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 항원으로 하여 면역된 동물의 항체 생성 세포와 골수종 세포와의 세포 융합에 의해서 얻어지는 하이브리도마에 의해 생성되는, 시노비올린에 대한 모노클로날 항체 또는 그 단편으로서, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해할 수 있는 상기 항체 또는 그 단편.
5. 서열번호 3∼5 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 항원으로 하여 면역된 동물의 항체 생성 세포와 골수종 세포와의 세포 융합에 의해서 얻어지는 하이브리도마로서, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해할 수 있는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마.
6. 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해할 수 있는, 시노비올린에 대한 모노클로날 항체의 제조 방법으로서, 서열번호 3∼5 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 항원으로 하여 면역된 동물의 항체 생성 세포와 골수종 세포와의 융합 세포를 배양하여, 얻어지는 배양물로부터 상기 모노클로날 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 함유하는 의약 조성물.
8. 제 7 항에 있어서,

   류머티스 관절염, 암, 섬유증, 동맥경화, 캐슬맨병, 다발 골수종, 크론씨병, 전신형 소아 특발성 관절염, 뇌종양, 설암, 인두암, 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 담낭암, 십이지장암, 대장암, 간암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 신장암, 방광암, 횡문근육종, 섬유육종, 골육종, 연골육종, 피부암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 성인형 T 세포 백혈병, 악성 림프종의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 함유하는, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화 저해제.
10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 함유하는, 시노비올린 함유 세포 검출용 시약.
11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 함유하는, 시노비올린에 의한 세포 증식성 질환의 검출용 시약.
12. 제 11 항에 있어서,

    세포 증식성 질환이, 류머티스 관절염, 암, 섬유증, 동맥경화, 캐슬맨병, 다발 골수종, 크론씨병, 전신형 소아 특발성 관절염, 뇌종양, 설암, 인두암, 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 담낭암, 십이지장암, 대장암, 간암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 신장암, 방광암, 횡문근육종, 섬유육종, 골육종, 연골육종, 피부암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 성인형 T 세포 백혈병, 악성 림프종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 시약.
13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,

    세포가, 활막 세포, 파골 세포, 각화 상피 세포, 혈액 세포, 암세포, 골수 세포, 섬유아 세포, 혈관 내피 세포, 진피 세포, 근세포, 신경 세포, 림프구, 혈관 평활근 세포, 간세포, 색소 세포, 지방 세포, 자궁 내피 세포, 폐포 상피 세포, 미분화 간엽계 세포, 정단 외배엽릉으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 세포인 시약.
14. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편과, 시노비올린을 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시노비올린의 자기 유비퀴틴화를 저해하는 방법.
15. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편과, 생체 시료를 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시노비올린의 발현 세포를 검출하는 방법.
16. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편과, 피험자로부터 채취된 생체 시료를 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시노비올린에 의한 세포 증식성 질환의 검출 방법.
17. 제 16 항에 있어서,

    세포 증식성 질환이, 류머티스 관절염, 암, 섬유증, 동맥경화, 캐슬맨병, 다발 골수종, 크론씨병, 전신형 소아 특발성 관절염, 뇌종양, 설암, 인두암, 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 담낭암, 십이지장암, 대장암, 간암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 신장암, 방광암, 횡문근육종, 섬유육종, 골육종, 연골육종, 피부암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 성인형 T 세포 백혈병, 악성 림프종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 방법.
18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,

    세포가, 활막 세포, 파골 세포, 각화 상피 세포, 혈액 세포, 암세포, 골수 세포, 섬유아 세포, 혈관 내피 세포, 진피 세포, 근세포, 신경 세포, 림프구, 혈관 평활근 세포, 간세포, 색소 세포, 지방 세포, 자궁 내피 세포, 폐포 상피 세포, 미분화 간엽계 세포, 정단 외배엽릉으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 세포인 방법.

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