KR100996486B1 - 인체 무등(ｍｕｄｅｎｇ) 단백질에 대한 단일클론 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인체 무등(MUDENG) 단백질에 대한 단일클론 항체에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 인체 무등(MUDENG) 단백질에 대한 단일클론 항체, 상기 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 진단 및 뇌질환 진단용 조성물, 무등(MUDENG) 단백질의 분리 및 정제용 조성물 및 이를 이용한 암 및 뇌질환 관련 마커의 검출방법에 관한 것이다. 한편, 본 발명의 단일클론 항체는 생물학적 시료 내의 무등(MUDENG) 단백질을 특이적으로 인식하여 이를 검출 및 정제하는데 유용하다.

무등(MUDENG), 단일클론 항체, 하이브리도마, 암 진단, 뇌질환

Description

인체 무등(ＭＵＤＥＮＧ) 단백질에 대한 단일클론 항체{Monoclonal antibody against human MUDENG protein}

본 발명은 인체 무등(MUDENG) 단백질에 대한 단일클론 항체에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 인체 무등(MUDENG) 단백질에 대한 단일클론 항체, 상기 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 진단 및 뇌질환 진단용 조성물, 무등(MUDENG) 단백질의 분리 및 정제용 조성물 및 이를 이용한 암 및 뇌질환 관련 마커의 검출방법에 관한 것이다.

현재, 임상에서의 뇌 질환의 진단은 기계장치 즉, 자기 공명 촬영기(MRI), 자기 공명 뇌혈관 촬영기(MRA), 초음파를 이용한 뇌 혈류 측정(TCD) 및 뇌파검사(EEG) 등에 주로 의존하고 있다. 그러나 이러한 종래의 뇌 분석 방법들은 주로 뇌의 해부학적 구조 및 형상에 대한 영상 정보에만 의존하고 있기 때문에 분석 결과의 정확성과 객관성이 떨어지는 문제점이 있다. 따라서 종래의 분석방법과 병행하여 수행될 수 있는 단백질 레벨에서의 진단 마커 개발이 당업계에 시급히 요청되 고 있다.

한편, 인체 세포 내에 존재하는 신규한 단백질인 무등(MUDENG)에 대한 정보는 아직까지 알려진 것이 없다. 상기 단백질은 본 발명자들이 찾아내어 이들에 대한 약간의 정보를 얻은 것이 전부이다. 현재까지 본 발명자들이 찾아낸 무등(MUDENG)에 대한 정보는 무등(MUDENG)이 세포내 세포질에 존재하는 단백질이라는 것이다. 이러한 단백질의 기능으로서는 암세포에서 인위적인 과다발현을 시킬 때 암세포의 세포사를 유발시킨다는 것이고, 피부, 신장, 폐, 갑상샘, 가슴샘, 간 등 정상조직과, 또한 중추신경계 (대뇌, 소뇌, 뇌간, 척수)의 정상세포와 인체 뇌암유래 세포주에서도 무등(MUDENG)이 발현된다는 점이다. 특히, 정상인의 뇌와 뇌질환 환자들에게서 무등(MUDENG) 단백질의 발현에 차이가 있을 수 있다는 사실은 무등(MUDENG) 단백질을 검출하는 것이 뇌질환을 진단 및 치료하는데 하나의 핵심 역할을 할 수 있을 것으로 생각된다.

이와 같이 앞으로 밝혀지게 될 인체 여러 기관에서 발현되고 있는 무등(MUDENG)이 인체 내의 항상성 유지와 질병치료 및 예방에도 매우 중요한 인자가 될 것으로 예상되어, 인체 무등(MUDENG)을 특이적으로 선별할 수 있는 항체 생산과 이를 이용한 인체 무등(MUDENG)의 검출방법의 개발이 요구된다.

본 발명은 상술한 무등(MUDENG) 단백질 이상 발현이, 원인이 될 수 있는 여 러 질병의 예방, 진단 및 치료의 필요성을 충족시키기 위하여 창안된 것으로, 본 발명의 목적은 인체 무등(MUDENG) 단백질에 대한 단일클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 무등(MUDENG) 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 및 뇌질환 진단용 조성물, 및 무등(MUDENG) 단백질의 분리 및 정제용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 무등(MUDENG) 단백질에 대한 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜, 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 암 또는 뇌질환 마커를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 무등(MUDENG) 단백질에 대한 단일클론 항체, 바람직하기로는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 무등(MUDENG) 단백질에 대한 단일클론 항체를 제공한다.

본 명세서에서 용어 '무등(MUDENG) 단백질'은 무등(MUDENG) 단백질 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체 및 돌연변이체 뿐만 아니라, 무등(MUDENG) 단백질의 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함한다.

먼저, 무등(MUDENG) 단백질에 대하여 살펴보면 다음과 같다.

2002년에 발표된 가와사키(Kawasaki) 및 타이라(Taira)의 논문에는 하이브리드-라이보자임 라이브러리 시스템(randomized hybrid-ribozyme library system)을 사용하여 FAS-매개 세포사멸 신호전달 경로(Fas-mediated death signaling pathway)에 관여할 것으로 예상되는 43개의 알려지지 않은 유전자(unknown gene)가 보고된 바 있으며, 이중 약 20개의 뉴클레오티드를 Nucleic Acids Research(v30, 3609-3614, 2002)에 개시된 바 있다. 상기한 연구결과를 기초로 하여, 본 발명자들은 선행연구에서 GenBank의 블라스터 검색 시스템(blast search program)을 이용하여 상기 유전자들의 ORF(open reading frames)를 분석하고 RT-PCR을 통해 7개의 유전자의 ORF 부위를 클로닝하였다. 다음으로, 상기 증폭된 유전자들을 세포에 형질전환시킨 후 GFP 발현 수준을 측정한 결과, 상기 7개의 유전자 중 하나의 유전자에 의해 결장암 세포주인 HCT116에서 현저히 높은 세포사멸이 유도되는 것을 확인할 수 있었다 (결과 미도시). 이에 본 발명자들은 상기 단백질을 무등(MUDENG)(Mu-2 related death-inducing gene)으로 명명하고 이의 특성을 조사하였다. 그 결과, 인체 무등(MUDENG) 단백질은 약 54kDa으로, 세포질에 주로 존재한다는 사실을 규명하였다. 이러한 무등(MUDENG) 단백질의 아미노산 서열은 본 발명에서는 서열번호 1로 나타내었다.

상기한 연구에 이어, 본 발명자들은 무등(MUDENG) 단백질을 기초로 하여 단일클론 항체를 생산하였다. 본 발명에 따른 무등(MUDENG) 단백질에 대한 특이적인 단일클론 항체는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조). 단일클론 항체를 분비하는 '하이브리도마'를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 무등(MUDENG) 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로 부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득하고 나서, 무등(MUDENG) 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.

상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.

본 발명에 따른 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 하이브리도마 M3H9로 명명하고 이를 2008년 3월 28일자로 KCTC (Korea Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 (KCTC11306BP) 로 기탁되었다. 본 명세서에서, "하이브리도마 M3H9“이 생산하는 단일클론 항체를 "M3H9"으로 명명하였다.

다음으로, 본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 생산된 단일클론 항체의 특성을 조사하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 인체 무등(MUDENG) 단백질에 결합하는 단일클론 항체는 인간뿐만 아니라 마우스, 랫(rat), 햄스터(hamster) 세포의 무등(MUDENG) 단백질에서도 강한 친화력을 나타내어 교차 인식능(cross-activity)을 가지고 있음을 알 수 있었다. 또한, 무등(MUDENG) 단백질의 에피토프(epitope)를 조사한 결과, M3H9 단일클론 항체의 인식부위가 서열번호 1의 244번째 ~ 326번 사이의 아미노산임을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 서열번호 1의 서열 중 244 ~ 326번 사이에 존재하는 에피토프를 인식하며, 무등(MUDENG) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.

본 발명에서 용어 "단일클론 항체"는 무등(MUDENG) 단백질에 대한 항체로서, 전체 항체 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed.,Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻 하며 Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제 공개특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. dsFv(이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 scFv(단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C 말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.

이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 키메릭 항체 또는 키메릭 항체의 면역원성을 더욱 감소시키기 위한 인간화 항체 (humanized antibody) 또는 CDR-이식항체 (CDR-grafted antibody) 일 수 있다.

키메릭(chimeric) 항체란 항체 가변영역(variable domain)은 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 토끼, 가금류 등)에서 유래하고, 항체 불변 영역(constant domain)은 인간에서 유래한 항체를 의미한다. 이러한 키메릭 항체는 당업계에 공지된 유전자 재조합 등의 방법으로 제조될 수 있다.

인간화 항체(humanized antibody) 또는 CDR-이식항체 (CDR-grafted antibody)는 동물유래 단일클론 항체의 높은 친화도와 특이성은 유지하도록 하고 인체 내에서의 면역유발능을 감소시키기 위하여, 동물유래 단일클론 항체의 항원결합영역(Complementarity determining region; CDR)을 인간항체에 이식시켜 제조되는 항체를 의미하며, 항원에 대한 친화도와 인체 내에서의 면역유발 정도를 고려하여 인간화시키는 정도를 선택할 수 있다.

한편, 본 발명자들은 무등(MUDENG) 단백질에 대한 단일클론 항체를 이용하여 암세포 조직과 정상세포 조직을 면역조직화학염색실험(Immunohisto-chemistry staining)한 분석한 결과, 무등(MUDENG) 단백질의 발현에 차이가 있음을 확인하였다. 또한, 정상인의 뇌 조직과 뇌질환 환자의 뇌 조직에서도 발현 양상에 차이가 있음도 확인하였다. 따라서, 이러한 무등 단백질에 대한 특이적인 항체가 무등(MUDENG) 단백질 이상 발현과 관련된 질환, 바람직하게는 암이나 뇌질환의 진단에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명에서는 무등(MUDENG) 단백질에 대한 항체를 포함하는, 무 등(MUDENG) 이상 발현이 원인이 되거나, 또는 무등(MUDENG) 이상 발현을 초래하는 여러 질병, 바람직하기로는 암 또는 뇌질환의 진단용 조성물 및 진단키트를 제공한다. 구체적으로, 상기 암은 신경세포 및 아교세포유래 뇌종양, 결장암 등을 예로 들 수 있으며, 뇌질환으로는 뇌염증, 뇌졸증, 뇌허혈, 뇌일혈, 중풍, 간질, 다발성 경화증, 알쯔하이머병 또는 헌팅톤 병 등의 퇴행성 뇌질환을 들 수 있다.

본 발명의 암 또는 뇌질환의 진단을 위한 조성물 및 진단키트에 사용되는 항체는, 이 항체가 무등(MUDENG) 단백질을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 다클론 항체, 단일클론 항체뿐만 아니라 단일클론 항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 암 또는 뇌질환의 진단을 위한 조성물 및 진단키트에는 무등(MUDENG) 단백질을 선별적으로 인지하는 항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.

면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같 은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 검출 방법 및 진단키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다.

다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 무등(MUDENG) 단백질에 대한 항체를 포함하는 무등(MUDENG) 단백질의 분리 및 정제용 조성물을 제공한다.

상기 항체를 포함하는 분리 및 정제용 조성물은 통상의 이온교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법 등에 사용되어, 시료로부터 무등(MUDENG) 단백질을 용이하게 분리 및 정제할 수 있게 한다.

다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 암 또는 뇌질환 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 용어 '암 또는 뇌질환 마커'란 세포조직에서 이를 검출하고 비교·분석을 통해 뇌 조직의 이상이나 암을 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 단일클론 항체를 포함하거나 이를 사용하는 조성물, 진단키트 및 방법에서 '암 또는 뇌질환 마커'는 무등(MUDENG) 단백질을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 '생물학적 시료'란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액 등을 들 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작 하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜서 암 진단 및 뇌질환 진단에 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 '항원-항체 복합체'는 생물학적 시료 중의 무등(MUDENG) 단백질의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 상기 효소와 이를 인지하는 단클론 항체의 결합물을 의미한다.

이러한 항원-항체 복합체의 형성 및 분석법은 유세포 분석법(flow cytometry), 조직면역염색, 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 단백질 칩(protein chip)등에 의해 이루어 질 수 있으며 이로 제한되지 않는다.

항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아 닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)₈ ,[Os(bpy)₃]²⁺, [RU(bpy)₃]²⁺, [MO(CN)₈]^4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 상기 단일클론 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

본 발명의 항체는 무등(MUDENG) 단백질을 특이적으로 인식할 수 있으므로, 무등(MUDENG) 이상 분비의 원인이 되는 여러 질병, 예컨데, 암이나 뇌종양 및 인체질환을 예방 및 진단하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는 시료 내의 무등(MUDENG) 단백질을 특이적으로 인식하여 이를 검출 및 정제하는데에 이용될 수 있는 효과가 있다.

이하 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서, 본 명세서에 기재된 도면 및 실시예에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1 : 항 인체 무등 ( MUDENG ) 단일클론 항체의 생산

<1-1> 무등 ( MUDENG ) 단백질의 발현

HeLa 세포로부터 RNA를 추출하고 정방향 프라이머(5'-CGCCGCTCGAGATGGCGCAGCGGGCAG-3' : 서열번호 2)와 역방향 프라이머(5'-CGTCCCCCGGGTTACAATAATAATGATCC-3' : 서열번호 3)를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 산물은 Xho1 및 Sma1 제한효소를 사용하여 pEGFP-N1에 클로닝한 다음, E.coli에서 발현시켰다.

<1-2> 무등 ( MUDENG ) 단백질 접종 및 항혈청 제조

상기 <1-1>에서 발현된, 서열번호 1로 표시되는 재조합 인체 무등(MUDENG) 단백질을 분리, 정제하였다. 정제된 인체 무등(MUDENG) 단백질에 대한 항혈청과 잡종세포 생산을 위해, 재조합 무등(MUDENG)을 10㎍/0.2㎖로 조정하여 PBS에 녹인 다음 동량의 (V/V) FCA(Freund's complete adjuvant)와 잘 섞은 후 균일한 유탁액이 되었을 때 발브씨 (BALB/C) 생쥐에 복강 주사하였다. 2주 후 처음 주사 때와 동일한 양의 재조합 인체 무등(MUDENG)을 FIA(Freund's incomplete adjuvant)와 혼합하여 동일 부위에 주사하고, 3일 후 눈에서 소량의 혈액을 채혈하여 항체 생성 여부를 엘라이자(ELISA) 방법으로 측정하고 항체의 역가가 높을 때까지 반복하였다. 마지막 주사는 직전의 재주사로부터 1주일 후에 FIA와 섞지 않은 무등(MUDENG)을 이 전의 주사 때와 동일한 양으로 꼬리정맥에 주사하였다.

<1-3> 항 인체 MUDENG 단일클론 항체의 생산 하이브리도마 세포의 제조

하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(Hypoxanthine phosphoribosyl transferase; HPRT, EC 2.4.2.8)는 아미노프테린(aminopterin), 아자세린(azaserine) 등에 의하여 퓨린 뉴클레오티드의 합성경로가 저해되는 신생합성경로(de novo pathway)에 의하지 않고도 하이포크산틴(hypoxanthine)이나 구아닌(guanine) 염기를 각각 IMP(inosine-5'-monophosphate)나 GMP(Guanine-5'-monophosphate)로 전환시키는 재생경로 (salvage pathway)에 관여하는 효소인데, 이 HPRT가 결핍된 것으로 알려진 SP2/0-Ag14 (ATCC, CRT 1581) 골수종 세포주의 특성을 세포융합 전에 확인한 결과, 이 세포주는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium, GIBCO, Grand ISland, NY)과 10% FBS(Fatal Bovine Serum, Gibco)을 포함한 배지에 구아닌 아날로그(Guanine analog)인 10㎕/㎖의 6-티오구아닌(6-thioguanine)을 첨가한 배양액에서는 잘 자라는 반면에 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(Hypozanthine-aminopterin-thymidine: HAT), 5X10^-3M 하이포크산틴, 4X10^-5M 아미노프테린, 8X10^-4M 티미딘) 선택배지에서 이 세포주는 2∼3일 후면 모두 죽는 것으로 나타나 세포융합에 적합한 세포주임이 확인되었다. 세포융합은 먼저, 100㎜ 직경의 페틔리디쉬에 인체 무등(MUDENG)으로 면역된 생쥐의 비장(spleen)을 꺼내 무혈청 DMEM 배지에서 핀셋, 가위, 메쉬 등을 이용하여 세포를 적출해 낸 다음 50 ㎖ 원심분리관(conical tube, falcon Co.)으로 옮겨 탁상용 원심분리기 (table top centrifuge, Beckman, Somerset, NJ)에서 1,200rpm, 5분 동안 원심분리하고 0.17M NH₄Cl를 37℃에서 5분 동안 처리하여 적혈구 세포를 용출시킨 후 찬 DMEM 배지로 2회 세척하였다. 이 비장세포를 현미경하에서 세포계산판 (hematocytometer)를 이용, 세포 수를 측정하여 SP2/0-Ag14 세포주와 5:1의 비율로 10㎖씩 섞은 다음 원심 분리하였다. 원심 분리된 펠렛을 손가락으로 가볍게 두드려서 분산시키고 37℃에서 1분간 방치한 뒤 37℃ 항온수조에서 미리 데워진 50% PEG 4000(polyethylene glycol 4,000, Indianapolis, IN) 1㎖ 를 30초 동안에 걸쳐 천천히 처리하고 무혈청 DMEM 배지 9㎖을 넣어 섞어준 후 다시 50㎖이 될 때까지 DMEM을 서서히 가해 주었다. 이것을 1,200rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 세포 펠렛을 10% PBS가 포함된 HAT 배지에 1 ~ 2 X 10⁶/㎖ 정도로 섞어 96 웰 배양플레이트 (96 well flat bottomed plate)에 웰 당 두 방울씩 가하고 39℃ 습윤 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하면서 잡종세포를 선별하였다.

잡종세포클론에서 인체 무등(MUDENG)에 대한 항체의 생성 유무는 세포융합 후 약 1∼2주 경과 시, 잡종세포클론이 형성된 웰 (약 50% confluence) 배양 상층액을 취하여 간접 ELISA법으로 측정하였다. 즉, 인체 무등(MUDENG)을 코팅완충액 (0.05M carbonate buffer, PH 9.6)으로 1㎍/㎖이 되도록 희석하여 96웰 미세역가 플레이트(96 well microtitration plate, Dynatech) 100㎕씩 가하고 4℃에서 하룻밤 동안 결합시킨 후 세척 완충액 (PBST; 0.05% Tween-20 in PBS, PH 7.4)로 3회 세척 후 3% 소 혈청 알부민(BSA in PBS, Sigma)으로 상온에서 2시간 동안 코팅되지 않은 부분을 차단(blocking)하고 다시 3회 세척 후, 희석 완충액 (PBST; 0.05% Tween-20, 0.92% NaN₃, 1% BSA in PBS, PH 7.4)으로 희석한 잡종세포의 배양상청액 100㎕를 각 웰에 가하고 상온에서 2시간 반응시킨 후 3회 세척하고 1:1,000으로 희석된 HRP-콘쥬게이트된 고트(goat) 항-마우스 IgG 항체(HRP conjugated goat anti-mouse IgG (Bio-Rad, USA))를 100㎕씩 가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 3회 세척 후 H₂O₂와 0.2M Na₂HPO₄, 0.1M 시트르산을 함유하는 기질 완충액 (substrate buffer)에 1㎎/㎖로 녹인 ABTS(2.2’-Azino-bis(3-etylbenzo- thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt, Sigma)를 100㎕씩 각 웰에 가하고 엘라이자 판독기 (Bio-Tek Vermont)를 사용하여 630㎚에서 흡광도(optical density)를 측정하여 항체를 생성하는 세포클론들을 24 웰 배양 플레이트로 옮겨서 배양하고 다시 조직 배양용 플라스크 (Falcon)로 옮겨가면서 잡종세포의 수를 증식시켰다.

<1-4> 하이브리도마의 클로닝( Singel cell cloning )

다음으로, 인체 무등(MUDENG)에 대하여 특이적인 항체만을 생성하는 잡종세포를 선별하여 단일클론을 얻기 위해 한계희석법(limiting dilution)에 의한 단일세포 클로닝(single cell cloning)을 수행하였다. 즉, 선별된 잡종세포 클론을 10% FBS가 포함된 HAT 배지하에서 1 cell/100㎕/well로 희석하여 96-웰 배양플레이트에 100㎕씩 가하고 클로닝의 효율성을 높이기 위해 면역시키지 않은 발브씨 생쥐의 비장세포를 분리하여 영양공급세포(feeder cell)로써 이용하였는데, 세포수를 1~ 2 X 10⁵/㎖로 조정하여 각 웰에 100㎕씩 가해주었다. 한계희석법(Limiting dilution)에 의해 클로닝된 단일클론으로부터 항체를 얻기 위해서 배양 상층액들을 얻었다.

<1-5> 단일클론 항체의 생산 및 정제

단일클론 항체의 대량생산을 위해 약 10주령의 발브씨 생쥐에 0.5㎖ FIA를 복강주사하여 프라이밍(priming)시키고 7일 후, 각각의 단일클론들을 PBS 0.5㎖로 5 X 10⁶으로 현탁시켜 복강 내로 주사하였다. 약 1주 후 복강이 부풀은 생쥐에서 18 게이지 주사바늘을 사용하여 복수를 채취하고 4℃에서 1시간 동안 방치하여 침전물과 부유물들을 제거한 후 5,000 X g에서 20분간 원심분리하여 세포와 상층의 지방질을 제거하였다. 이 복수로부터 단일클론 항체의 정제는 복수와 PBS(phosphate buffered saline)를 1대 1로 혼합한 후에 PBS로 평형화(equilibration)된 프로테인-G 컬럼(protein-G column, Pharmacia)에 로딩(loading)하였다. 그 후 컬럼 부피의 10배 양인 PBS로 컬럼을 세척한 후에 0.1M 글리신(pH 2.6)으로 결합된 단일클론 항체를 용출시켜 분획당 900㎕의 용출물을 모으고 각 분획마다 100㎕의 1M Tris PH 8.0을 즉시 가해주어 용출물의 pH를 중화시켰다. 그 후 280㎚에서 흡광도를 측정하여 항체를 함유한 분획들을 모았다. 이를 각 1㎍씩 10% SDS-PAGE 겔에 걸어 그 정제 순수도를 측정하였는데 대조군인 생쥐 IgG_l, 1㎍과 비교하여 거의 95% 이상 순수 한 항체를 정제하였다 (도 1 참조).

상기와 같은 방법으로 무등 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였고, 최종적으로 선별된 하이브리도마 M3H9에서 생산된 단일클론 항체를 M3H9라 명명하였으며, 이하 실험예에서는 M3H9 단일클론 항체를 가지고 실험하였다.

실시예 2 : 항 인체 무등 ( MUDENG ) 다클론 항체의 생산

통상의 방법에 따라, 서열번호 1로 표시되는 재조합 인체 무등(MUDENG) 단백질을 E. coli에서 발현시키고 정제하였다. 정제된 인체 무등(MUDENG)을 250㎍/㎖의 농도로 FCA 1㎖과 동량으로 3-방향 스톱콕(3-way stopcock)을 사용하여 잘 섞은 후 균일한 유탁액이 되었을 때 토끼에 피하와 근육의 여러 부위에 나누어 주사하였다. 3주 후 처음 주사 때와 동일한 양의 인체 무등(MUDENG)을 FIA와 혼합하여 같은 방법으로 주사하고 1주일 후 귀 정맥으로부터 소량의 혈액을 채취하여 항체생성 여부를 엘라이자 방법으로 측정하고 항체의 역가가 높을 때까지 2주 간격으로 면역화를 반복하였다. 마지막 주사는 직전의 추가접종으로부터 1주일 후 FIA와 섞지 않은 인체 무등(MUDENG)을 10㎍/0.2㎖로 PBS에 녹여 귀 정맥에 주사하였다. 다시 1주일 후 토끼의 심장으로부터 혈액을 얻어 상온에서 3～4시간 방치한 다음 탁상용 원심분리기로 3,000rpm, 30분 동안 원심분리시켜 혈청을 분리하였다. 또한 항체의 역가와 활성도는 간접 엘라이자와 웨스턴 블랏으로 각각 측정하였다.

실험예 1 : 항 MUDENG 항체에 의한 인체 무등(MUDENG)의 검정( ELISA )

재조합 무등(MUDENG)을 코팅 완충액 (0.1M NaHCO₃, PH 9.6)으로 10㎍/㎖이 되도록 희석하여 96웰 미세역가 플레이트에 100㎕씩 가하고 4℃에서 하룻밤 동안 결합시킨 후 세척 완충액으로 3회 세척한 후 3% PBS로 상온에서 2시간 동안 코팅되지 않은 부분을 차단하고 다시 3회 세척한다. 이후 상기 실시예 1에서 제조된 항 무등(MUDENG) 단일클론 항체를 희석 완충액으로 8.15㎍/㎖~0까지 5배 희석법으로 연속해서 6번 희석하여 100㎕씩 각각의 웰에 가하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 세척 완충액으로 3회 세척 후, 1:5,000으로 희석된 goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase(Bio-Rad, USA)를 100㎕씩 가한 후 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 3회 세척 후 H₂O₂와 0.2M Na₂HPO₄, 0.1M 시트르산을 함유하는 기질 완충액에 1㎎/㎖로 녹인 2.2’ABST(Azino-bis(3-etylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt), Sigma)를 100㎕씩 각 웰에 가하고 엘라이자 판독기 (Bio-Tek, Vermont)를 사용하여 630㎚에서 흡광도 (optical density)를 측정하였다. 네가티브 대조군으로 생쥐 면역항체 (MIgG₁)를 사용하였다.

실험결과, 도 2의 A에 나타난 바와 같이, 대조군인 MIgG₁은 전혀 인체 무등(MUDENG)을 인식하지 못했으나 M3H9 항체는 2-8.15㎍/㎖의 농도에 따라 인체 무등(MUDENG)을 잘 인식함을 확인할 수 있었다.

실험예 2 : 항 무등 ( MUDENG ) 항체에 의한 자연 인체 무등 단백질 및 동물 무 등 단백질의 검출( 웨스턴 블랏 )

Bradford 단백질 정량방법에 의해 인체 무등(MUDENG)을 정량하여 동일한 양의 단백질 (20㎍/lane)을 SDS 시료 완충액을 가하여 끓인 다음 10% SDS-PAGE를 실행하였다. SDS-PAGE 겔 (10%)에 인체 무등(MUDENG)을 로딩하고서 20mA에서 1시간 30분 동안 전기영동한 후 0.2A에서 1시간 30분 동안 니트로셀룰로즈 멤브레인(NCM)으로 단백질의 전이를 행하였다. 전이 후에 NCM을 비닐 백에 넣고 블럭킹 용액 (5% skin milk in PBS) 5㎖ 넣은 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 세척 완충액(TBST; 50mM Tris, PH 7.4, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20)으로 세척한 후 HRP-콘쥬게이트된 고트(goat) 항-마우스 IgG 항체를 1:5000 희석하여 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 위와 같이 세척을 재실시한 후에 ECL (Enhanced Chemiluminescence) 시스템으로 X-레이 필름에 감광하였다.

실험결과, 웨스턴 블랏으로, 대장균에서 분리된 재조합 인체 무등(MUDENG)에 대한 항체 인식을 살펴보았다(도 2의 B). M3H9 항체는 대장균에서 분리된 재조합 인체 무등(MUDENG)을 10㎍까지도 정확하게 인식하였다.

한편, 세포에서 발현되는 천연형의 인체 및 동물 무등(MUDENG) 인식도를 상기와 동일한 방법으로 M3H9 항체를 가지고 측정하였다. 세포주로는 인체 세포주인 A549, 햄스터 세포주인 CHO-K1, 생쥐 세포주인 H9c2, 쥐 세포주인 CT26을 사용하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, M3H9 무등(MUDENG) 단일클론 항체는 인간뿐만 아니라 마우스, 랫(rat) 및 햄스터(hamster)의 무등(MUDENG) 단백질에 대하 여 교차 인식능(cross-activity)을 가지고 있음을 알 수 있었다.

실험예 3 : 항 무등 항체에 의한 조직에서의 자연 무등 검출 및 뇌조직에서의 발현양상 조사(면역조직화학염색)

먼저, 정상생쥐 난소와 자궁조직을 이용하여, 항 무등(MUDENG) 단일클론 항체가 각각의 조직에 분포하는 무등 단백질을 인식하는지를 조사하기 위하여 항 무등 단일클론 항체를 사용하여 마이크로웨이크법으로 단일면역조직화학염색법을 실시하였다. 구체적으로, 정상생쥐 난소와 자궁조직을 5㎛ 두께로 박절하여 포르말린에 고정시킨 조직을 0.01 M 구연산 나트륨, pH 6.0, 2,450MHz, 800W 조건 하에서 5분간 2회 마이크웨이브를 조사하여 세포질 내 항원복구를 촉진하였다. 조직 절편을 10% FCA(fetal calf serum)와 10% 정상 고트 혈청(noraml goat serum)을 첨가한 PBS(phosphate buffered saline)에 20분 동안 전처리한 후, 60분 동안 항 무등 단일클론 항체를 표지하고 PBS로 세 번 세척하였다. 내인성 과산화효소(endogenous peroxidase)를 불활성화시키기 위해 0.3% H₂O₂(메탄올에 희석된)로 처리하였다. PBS로 세척한 후, HRP-콘쥬게이트된 고트(goat) 항-마우스 IgG 항체와 60분간 반응시키고 다시 PBS로 세척 후, 0.05% DAB(3.3‘-diaminobenzidine-tetrahydrochloride-0.01%) 과산화수소(H₂O₂) 혼합액으로 정색하였다.

실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 항 무등(MUDENG) 항체는 생쥐의 난소와 자궁에 존재하는 특히 과립층(granulosa) 세포에서 무등(MUDENG)이 선명하게 인식 되고 있음을 알 수 있어, 상기 항체를 사용할 경우, 조직에서 발현되는 천연형의 무등 단백질을 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 그 발현위치를 확인할 수 있었다.

다음으로, 정상인의 뇌와 뇌질환 환자들의 조직에서 M3H9 항체를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 면역조직화학염색(immunohistochemistry staining)을 실시하였다.

실험결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 정상인의 대뇌피질 (normal cerebral cortex, 도 5의 A)과 해마 (normal hippocampus, 도 5의 B)에서는, 신경세포(neurons) (화살표(검정))의 경우, 무등 단백질이 시토졸(cytosol)에서 발현되고 있으며, 신경아교세포(glial cells) (화살표(빨강)) 경우, 시토졸(cytosol)에서 발현이 거의 없는 것으로 보인다. 반면, DNT 환자의 대뇌피질 (cerebral cortex, 도 5의 C)과 피질 이형성증의 해마(abnormal hippocampus, 도 5의 D)에서는, 신경세포(neurons, 화살표(검정))의 경우, 무등 단백질이 시토졸(cytosol) 전체에서 발현되며, 신경아교세포(glial cells, 화살표(빨강)) 경우도, 정상 뇌조직에서와는 달리 시토졸(cytosol)에서도 발현되는 것처럼 보인다. 이는 정상인의 뇌와 뇌질환 환자들 사이에서 무등(MUDENG) 단백질의 발현에 차이가 있을 수도 있다는 것을 의미한다.

실험예 4 : 인체 무등 단백질의 결손 돌연변이( deletion mutant )를 이용한 항 무등 ( MUDENG ) 항체가 인식하는 에피토프( epitope ) 결정

항 무등(MUDENG) 항체 M3H9가 인식하는 에피토프(epitope) 결정하기 위하여 먼저, 도 6의 A에 나타난 바와 같은 인체 무등(1-490 a.a.)과 각각의 무등(MUDENG) 조각 절편들(deletion mutants)을 pEGFPc1 벡타를 이용하여 세포에서 발현되도록 만든 다음, 인체 대장암 세포주인 HCT116에 트랜스펙션 (transfection)법을 통해 세포 안에서 발현되도록 하였다. 이렇게 발현된 각각의 무등(MUDENG) 단백질을 상기 실험예 2에서 서술한 방법과 동일하게 항 인체 무등 단일클론 항체 M3H9를 이용하여 웨스턴블랏을 실시하였다.

실험결과, 도 6의 B에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 무등 단일클론 항체 M3H9는 M-말단 부분(164 번째 ~ 327 번째 아미노산)만을 특이적으로 인식하는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 실제적으로 에피토프로 작용하는 부위를 알기 위해서, 세분화된 무등 단백질의 조각 절편들을 사용하여 웨스턴 블럿을 실시하였다. 그 결과, 실제적 에피토프는 무등 단백질의 244 ~ 326번 사이임을 확인할 수 있었다(도 6의 C). 이러한 인식부위 확인은 앞으로의 실험에서 M3H9 항체의 응용범위를 짐작케 한다.

도 1은 단일클론 항체를 이용하여 인체 무등(hMUDENG) 단백질을 분리 및 정제하여 쿠마쉬 블루 염색법(Coomassie Blue staining)로 확인한 결과이다.

도 2의 A는 항 무등 단일클론 항체가 대장균에서 생산된 재조합 인체 무등을 인식하는 엘라이자 (ELISA) 결과를 나타낸 것이고, 도 2의 B는 항 무등 단일클론 항체가 대장균에서 생산된 재조합 인체 무등의 인식 한계를 보여주는 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 항 무등 단일클론 항체가 인체뿐만 아니라 생쥐, 랫, 햄스터의 무등을 인식한다는 것을 웨스턴 블롯으로 보여주는 그림이다.

도 4는 항 무등 단일클론 항체로 생쥐의 정상조직을 염색시, 항 무등 단일클론 항체가 특이적으로 인식함으로서, 생쥐의 난소와 자궁조직에서 무등의 발현이 왕성함을 보여주는 것으로, 조직에서 무등 단백질의 발현양상을 확인한 결과이다.

도 5는 항 무등 단일클론 항체로 인체의 정상조직과 암조직을 염색시, 항 무등 단일클론 항체의 특이적 인식으로, 무등의 발현이 정상조직과 암조직에서 차이점이 있다는 것을 보여주는 그림이다.

도 6의 A 는 무등 단백질을 원래 상태의 형태(wild type)와 다양한 조각 절편 형태(deletion fragment)로 디자인한 것이고, B는 항 무등 단일클론항체가 무등의 가운데 부분만을 인식하는 결과를 보여주는 그림이고, C는 A에서 보여준 조각들 중에서 항 무등 단일클론 항체가 특이적으로 인식하는 부위를 보여주는 그림이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Monoclonal antibody against human MUDENG protein <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 490 <212> PRT <213> human MUDENG protein <400> 1 Met Ala Gln Arg Ala Val Trp Leu Ile Ser His Glu Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Cys Gly Thr Val Arg Phe Ser Arg Arg Tyr Pro Thr Val Glu Lys 20 25 30 Arg Ala Arg Val Phe Asn Gly Ala Ser Tyr Val Pro Val Pro Glu Asp 35 40 45 Gly Pro Phe Leu Lys Ala Leu Leu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Asp Asp 50 55 60 Asp Lys Asp Phe Val Glu Ser Arg Asp Ser Cys Ser Arg Ile Asn Lys 65 70 75 80 Thr Ser Ile Tyr Gly Leu Leu Ile Gly Gly Glu Glu Leu Trp Pro Val 85 90 95 Val Ala Phe Leu Lys Asn Asp Met Ile Tyr Ala Cys Val Pro Leu Val 100 105 110 Glu Gln Thr Leu Ser Pro Arg Pro Pro Leu Ile Ser Val Ser Gly Val 115 120 125 Ser Gln Gly Phe Glu Phe Leu Phe Gly Ile Gln Asp Phe Leu Tyr Ser 130 135 140 Gly Gln Lys Asn Asp Ser Glu Leu Asn Thr Lys Leu Ser Gln Leu Pro 145 150 155 160 Asp Leu Leu Leu Gln Ala Cys Pro Phe Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn 165 170 175 Leu Gln Asn Ser Leu Asp Asn Thr Asn Phe Ala Ser Val Thr Gln Pro 180 185 190 Gln Lys Gln Pro Ala Trp Lys Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Gln 195 200 205 Val Ser Ile Ser Ile Thr Glu Lys Val Lys Ser Met Gln Tyr Asp Lys 210 215 220 Gln Gly Ile Ala Asp Thr Trp Gln Val Val Gly Thr Val Thr Cys Lys 225 230 235 240 Cys Asp Leu Glu Gly Ile Met Pro Asn Val Thr Ile Ser Leu Ser Leu 245 250 255 Pro Thr Asn Gly Ser Pro Leu Gln Asp Ile Leu Val His Pro Cys Val 260 265 270 Thr Ser Leu Asp Ser Ala Ile Leu Thr Ser Ser Ser Ile Asp Ala Met 275 280 285 Asp Asp Ser Ala Phe Ser Gly Pro Tyr Lys Phe Pro Phe Thr Pro Pro 290 295 300 Leu Glu Ser Phe Asn Leu Cys Phe Tyr Thr Ser Gln Val Pro Ala Pro 305 310 315 320 Pro Ile Leu Gly Phe Tyr Gln Met Lys Glu Glu Glu Val Gln Leu Arg 325 330 335 Ile Thr Ile Asn Leu Lys Leu His Glu Ser Val Lys Asn Asn Phe Glu 340 345 350 Phe Cys Glu Ala His Ile Pro Phe Tyr Asn Arg Gly Pro Ile Thr His 355 360 365 Leu Glu Tyr Lys Thr Ser Phe Gly Gln Leu Glu Val Phe Arg Glu Lys 370 375 380 Ser Leu Leu Ile Trp Ile Ile Gly Gln Lys Phe Pro Lys Ser Met Glu 385 390 395 400 Ile Ser Leu Ser Gly Thr Val Thr Phe Gly Ala Lys Ser His Glu Lys 405 410 415 Gln Pro Phe Asp Pro Ile Cys Thr Gly Glu Thr Ala Tyr Leu Lys Leu 420 425 430 His Phe Arg Ile Leu Asp Tyr Thr Leu Thr Gly Cys Tyr Ala Asp Gln 435 440 445 His Ser Val Gln Val Phe Ala Ser Gly Lys Pro Lys Ile Ser Ala His 450 455 460 Arg Lys Leu Ile Ser Ser Asp Tyr Tyr Ile Trp Asn Ser Lys Ala Pro 465 470 475 480 Ala Pro Val Thr Tyr Gly Ser Leu Leu Leu 485 490 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 cgccgctcga gatggcgcag cgggcag 27 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 cgtcccccgg gttacaataa taatgatcc 29

Claims (7)

1. 기탁번호 KCTC11306BP인 하이브리도마에 의해 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 무등(MUDENG) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
2. 제1항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 1의 서열 중 244 ~ 326번 사이에 존재하는 에피토프를 인식하며, 무등(MUDENG) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
3. 삭제
4. 제1항의 단일클론 항체를 생산하는 기탁번호 KCTC11306BP인 하이브리도마 M3H9.
5. 제1항에 따른 항체를 포함하는 암 또는 뇌질환 진단용 조성물.
6. 제1항에 따른 항체를 포함하는 무등(MUDENG) 단백질의 분리 및 정제용 조성물.
7. 제1항에 따른 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜, 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 암 또는 뇌질환 마커를 검출하는 방법.

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