KR20110095541A - 무등 단백질에 대한 단일클론 항체 및 그 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MUDENG 단백질 특이적인 단클론 항체 및 그 항체를 이용한 암 또는 뇌질환 진단용 조성물 및 그 질환의 진단방법 등에 관한 것이다.

Description

무등 단백질에 대한 단일클론 항체 및 그 응용 {A MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST MUDENG PROTEIN AND AN APPLICATION THEREOF}

본 발명은 인체 무등 (MUDENG) 단백질에 대한 단일클론 항체에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 인체무등 (MUDENG) 단백질의 특정 에피토프에 대한 단일클론 항체, 상기 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 진단 및 뇌질환 진단용 조성물, 무등 (MUDENG) 단백질의 분리 및 정제용 조성물 및 이를 이용한 암 및 뇌질환 관련 마커의 검출방법에 관한 것이다.

현재, 임상에서의 뇌 질환의 진단은 기계장치 즉, 자기 공명 촬영기 (MRI), 자기 공명 뇌혈관 촬영기 (MRA), 초음파를 이용한 뇌 혈류 측정 (TCD) 및 뇌파검사 (EEG) 등에 주로 의존하고 있다. 그러나 이러한 종래의 뇌 분석 방법들은 주로 뇌의 해부학적 구조 및 형상에 대한 영상 정보에만 의존하고 있기 때문에 분석 결과의 정확성과 객관성이 떨어지는 문제점이 있다. 따라서 종래의 분석방법과 병행하여 수행될 수 있는 단백질 레벨에서의 진단마커 개발이 당업계에 시급히 요청되고 있다.

한편, 인체 세포 내에 존재하는 신규한 단백질인 인간 MUDENG 단백질은 Fas-매개 에팝토시스에서 헤머헤드 리보자임을 사용한 스크리닝 방법에 의하여 제시된 신규 유전자이다 (Kawasaki, H. and Taira, K. (2002). Nucleic Acids Res 30, 3609-14). 그것은 clathrin-매개된 엔도사이토시스에서 APs의 μ2 서브유니트에서 동정된 어댑틴 도메인을 포함하는 490개의 아미노산으로 이루어져 있다 (Boehm, M. and Bonifacino, J.S. (2002). Gene 286, 175-86;Edeling, M.A., Smith, C. and Owen, D. (2006). Nat Rev Mol Cell Biol 7, 32-44). 인간 MUDENG 유전자의 호모로그들이 마우스, 랫트, 소, 개 및 조류에서도 동정되었다 (Lee, M.R. et al. (2008). Biochem Biophys Res Commun 370, 504-8).

T 세포에서 MUDENG의 이소성 발현은 그 자체로 현저한 세포사멸을 유도한다 (Lee, M.R. et al. (2008). Biochem Biophys Res Commun 370, 504-8). 에팝토틱 세포 사멸은 발생 동안 및 항상성의 보호에서 중요한 역학을 한다. 그 사멸 수용체에 리간드 결합은 수용체 응집 및 어댑터 분자의 모집을 유도하고 그것은 단백질분해 경로를 시작한다. 사멸 수용체에 의해 매개되는 에팝토시스를 겪는 세포들을 핵 응집, 막 돌출 및 핵 절편화를 가진다 (Cryns, V. and Yuan, J. (1998). Proteases to die for. Genes Dev 12, 1551-70).

현재까지 본 발명자들이 찾아낸 무등 (MUDENG)에 대한 정보는 무등 (MUDENG)이 세포내 세포질에 존재하는 단백질이라는 것과, 이러한 단백질의 기능으로서는 암세포에서 인위적인 과다발현을 시킬 때 암세포의 세포사를 유발시킨다는 것이고, 피부, 신장, 폐, 갑상샘, 가슴샘, 간 등 정상조직과, 또한 중추신경계 (대뇌, 소뇌, 뇌간, 척수)의 정상세포와 인체 뇌암유래 세포주에서도 무등 (MUDENG)이 발현된다는 점이다. 특히, 정상인의 뇌와 뇌질환 환자들에게서 무등 (MUDENG) 단백질의 발현에 차이가 있을 수 있다는 사실은 무등 (MUDENG) 단백질을 검출하는 것이 뇌질환을 진단 및 치료하는데 하나의 핵심 역할을 할 수 있을 것으로 생각된다.

이와 같이 앞으로 밝혀지게 될 인체 여러 기관에서 발현되고 있는 무등 (MUDENG)이 인체 내의 항상성 유지와 질병치료 및 예방에도 매우 중요한 인자가 될 것으로 예상되어, 인체 무등 (MUDENG)을 특이적으로 선별할 수 있는 항체 생산과 이를 이용한 인체 무등 (MUDENG)의 검출방법의 개발이 요구된다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 무등 (MUDENG) 단백질에 대한 단일클론항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암 또는 뇌질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 또는 뇌질환 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 무등 (MUDENG) 단백질의 서열 중 1 ~ 40번 사이에 존재하는 에피토프를 인식하며, 무등 (MUDENG) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.

본 발명자들은 무등 (MUDENG) 단백질을 기초로 하여 단일클론 항체를 생산하였다.

본 발명에 따른 무등 (MUDENG) 단백질에 대한 특이적인 단일클론 항체는 융합 방법 (fusion method)에 의해 만들어질 수 있다 (Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조). 단일클론 항체를 분비하는 '하이브리도마'를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 무등 (MUDENG) 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법 (limited dilution technique)에 의한 클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득하고 나서, 무등 (MUDENG) 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.

상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도 (예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.

본 발명에서 용어 "단일클론 항체"는 무등 (MUDENG) 단백질에 대한 항체로서, 전체 항체 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마 (γ),뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1 (γ1), 감마2 (γ2), 감마3 (γ3), 감마4 (γ4), 알파1 (α1) 및 알파2 (α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파 (κ) 및 람다 (λ) 타입을 가진다 (cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제 공개특허 WO 88/10649, WO88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. dsFv (이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 scFv (단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C 말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.

이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다.

또한, 중쇄 불변 영역은 감마 (γ), 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ) 또는 엡실론 (ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 키메릭 항체 또는 키메릭 항체의 면역원성을 더욱 감소시키기 위한 인간화 항체 (humanized antibody) 또는 CDR-이식항체 (CDR-grafted antibody) 일 수 있다.

키메릭 (chimeric) 항체란 항체 가변영역 (variable domain)은 인간 이외의 동물 (예를 들면, 마우스, 토끼, 가금류 등)에서 유래하고, 항체 불변 영역 (constant domain)은 인간에서 유래한 항체를 의미한다. 이러한 키메릭 항체는 당업계에 공지된 유전자 재조합 등의 방법으로 제조될 수 있다.

인간화 항체 (humanized antibody) 또는 CDR-이식항체 (CDR-grafted antibody)는 동물유래 단일클론 항체의 높은 친화도와 특이성은 유지하도록 하고 인체 내에서의 면역유발능을 감소시키기 위하여, 동물유래 단일클론 항체의 항원결합영역 (Complementarity determining region; CDR)을 인간항체에 이식시켜 제조되는 항체를 의미하며, 항원에 대한 친화도와 인체 내에서의 면역유발 정도를 고려하여 인간화시키는 정도를 선택할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 무등 (MUDENG) 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 또는 뇌질환 진단용 조성물을 제공하다.

본 발명자들은 무등 (MUDENG) 단백질에 대한 단일클론 항체를 이용하여 암세포 조직과 정상세포 조직을 면역조직화학염색실험 (Immunohisto-chemistry staining)한 분석한 결과, 무등 (MUDENG) 단백질의 발현에 차이가 있음을 확인하였다. 또한, 정상인의 뇌 조직과 뇌질환 환자의 뇌 조직에서도 발현 양상에 차이가 있음도 확인하였다. 따라서, 이러한 무등 단백질에 대한 특이적인 항체가 무등(MUDENG) 단백질 이상 발현과 관련된 질환, 바람직하게는 암이나 뇌질환의 진단에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명에서는 무등 (MUDENG) 단백질에 대한 항체를 포함하는, 무등 (MUDENG) 이상 발현이 원인이 되거나, 또는 무등 (MUDENG) 이상 발현을 초래하는 여러 질병, 바람직하기로는 암 또는 뇌질환의 진단용 조성물 및 진단키트를 제공한다. 구체적으로, 상기 암은 신경세포 및 아교세포유래 뇌종양, 결장암 등을 예로 들 수 있으며, 뇌질환으로는 뇌염증, 뇌졸증, 뇌허혈, 뇌일혈, 중풍, 간질, 다발성 경화증, 알쯔하이머병 또는 헌팅톤병 등의 퇴행성 뇌질환을 들 수 있다.

본 발명의 암 또는 뇌질환의 진단을 위한 조성물 및 진단키트에 사용되는 항체는, 이 항체가 무등 (MUDENG) 단백질을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 다클론 항체, 단일클론 항체뿐만 아니라 단일클론 항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 암 또는 뇌질환의 진단을 위한 조성물 및 진단키트에는 무등 (MUDENG) 단백질을 선별적으로 인지하는 항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.

면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 검출 방법 및 진단키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우 (flow-through) 디바이스 등을 포함한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 무등 (MUDENG) 단백질에 대한 항체가 고정화된 고상 담체를 제공한다.

고상 담체로서는, 예컨대 기판, 수지, 플레이트 (예, 멀티웰 플레이트), 필터, 카트리지, 컬럼, 다공질재를 들 수 있다. 기판은 예컨대 니켈-PTFE (폴리테트라플루오로에틸렌) 기판이나 유리 기판, 아파타이트 (apatite) 기판, 실리콘 기판, 금, 은 또는 알루미나 기판 등으로, 이들의 기판에 폴리머 등의 코팅을 실시한 것을 들 수 있다.

수지로서는, 예컨대 아가로스 (agarose) 입자, 실리카입자, 아크릴아미드와 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌 가교 디비닐벤젠입자, 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교한 입자, 셀룰로오스파이버, 알릴덱스트란과 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교폴리머, 단분산계 합성폴리머, 단분산계 친수성폴리머, 세파로오스 (Sepharose), 토요펄 (Toyopearl) 등을 들 수 있고, 또한 이들의 수지에 각종 관능기를 결합시킨 수지도 포함된다.

본 발명의 고상 담체는, 예컨대 무등 단백질의 정제, 및 무등 단백질의 검출, 정량에 유용할 수 있다.

본 발명의 무등 단백질에 대한 항체는, 자체 공지의 방법에 의해 고상 담체에 고정할 수 있다. 예컨대, 친화성 물질이나 소정의 관능기를 본 발명의 무등 단백질에 대한 항체에 도입하고, 계속해서 이 친화성 물질이나 소정의 관능기를 이용하여 고상 담체에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 방법을 제공한다. 소정의 관능기는, 커플링 반응에 제공하는 것이 가능한 관능기일 수 있고, 예컨대 아미노기, 티올기, 히드록실기, 카르복실기를 들 수 있다.

본 발명은 또한, 무등 단백질의 정제 및 농축 방법을 제공한다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은, 본 발명의 고상 담체에 무등 단백질을 흡착시키고, 흡착한 무등 단백질을 용출액에 의해 용출시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명 고상 담체에의 무등 단백질의 흡착은 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예컨대 무등 단백질을 함유하는 시료 (예, 박테리아 또는 세포의 배양물 또는 배양상청, 혈액)를, 본 발명의 고상 담체 또는 그 함유물에 도입한다. 무등 단백질의 용출은, 중성 용액 등의 용출액을 이용하여 행할 수 있다. 중성 용출액은 특별히 한정되는 것이 아니지만, 예컨대 pH 약 6~약 9, 바람직하게는 약 6.5~약 8.5 보다 바람직하게는 약 7 ~ 약 8일 수 있다. 중성 용액은 또한, 예컨대 칼륨염 (예, NaCl, KCl), 마그네슘염 (예, MgCl), 계면활성제 (예, 트윈 20, 트리톤, NP40), 글리세린을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은 또한, 무등 단백질의 흡착 후, 세정액을 이용하여 고상 담체를 세정하는 것을 포함할 수 있다. 세정액으로서는, 예컨대 요소, 킬레이트제 (예, EDTA), Tris, 산, 알칼리를 포함하는 것 등을 들 수 있다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은 또한, 고상 담체를 가열 처리하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 공정에 의해, 고상 담체의 재생, 멸균이 가능하다.

상기 무등 단백질 분리 및 정제는 통상의 이온교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법 등에 사용되어, 시료로부터 무등 (MUDENG) 단백질을 용이하게 분리 및 정제할 수 있게 한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 무등 (MUDENG) 단백질에 대한 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜, 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 암 또는 뇌질환 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 '암 또는 뇌질환 마커'란 세포조직에서 이를 검출하고 비교분석을 통해 뇌 조직의 이상이나 암을 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 단일클론 항체를 포함하거나 이를 사용하는 조성물, 진단키트 및 방법에서 '암 또는 뇌질환 마커'는 무등 (MUDENG) 단백질을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 '생물학적 시료'란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 조직 부검 시료 (뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액 등을 들 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜서 암 진단 및 뇌질환 진단에 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 '항원-항체 복합체'는 생물학적 시료 중의 무등 (MUDENG) 단백질의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 상기 효소와 이를 인지하는 단클론항체의 결합물을 의미한다.

이러한 항원-항체 복합체의 형성 및 분석법은 유세포 분석법 (flow cytometry), 조직면역염색, 면역세포화학법, 방사능면역분석법 (RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿 (Western Blotting), 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 단백질 칩 (protein chip)등에 의해 이루어 질 수 있으며 이로 제한되지 않는다.

항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제,우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이것에 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8 ,[Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법 (ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법 (ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 상기 단일 클론 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

본 발명에서 본 발명자들은 siRNA를 사용한 무등의 C22B3 MAb 검출 및 caspase-3에 의한 무등 절단 가능성을 조사하였다. 본 발명의 결과는 C22B3 MAb에 의하여 인지된 무등은 MUDENG siRNA에 의해 넉-다운되고 또한 caspase-3에 의해 절단되지만, caspase-8 및 -9에 의해서는 절단되지 아니한다는 것을 나타내었다. 또한 MUDENG은 TRAIL, TNF-알파 + CHX, 또는 sFas-L에 의한 사멸 수용체 활성화에 대해서 절단된다는 것을 알 수 있었다. 또한 본 발명자들은 caspase-3 절단된 MUDENG 절편들이 사멸 시그널에 대한 사멸 수용체의 흡수 (internalization)에서 중요한 역할을 할 가능성을 제기하였다.

본 발명자들은 54 Kda MUDENG 단백질의 N-말단 도메인 (1-40)을 인지하는 C22B3 MAb을 생성하였다.

caspase-3의 활성화 및 저해 관련한 본 발명은 명백하게 여하는 MUDENG 폴리펩타이드의 DAMDD-S 절단에 caspase-3가 관련된다; MUDENG의 caspase-3 절단이 각각 7.4 Kda and 46.5 Kda가 아니라 GFP의 N-말단에 융합된 31.8 Kda 및 22.1 Kda의 2 절편을 야기하기 때문에 DDKD-F는 아마 정확한 caspase-3에 의한 절단 부위가 아닐 수 있다 (도 3A).

또한 caspase-3 절단 부위는 인간 무등과 같이 마우스, 랫트에서 보존된다. 세포 사멸의 MUDENG 조절은 세포-타입 특이적인 것으로 나타난다; 이소성 (ectopic) MUDENG 발현은 Jurkat T 세포 또는 Hela 세포 에서 부가적인 사멸 신호 없이 세포 사멸을 유도한다 (Lee, M.R. et al. (2008). Biochem Biophys Res Commun 370, 504-8), 반면에 U251-MG 인간 성상교세포종 (astroglioma) 세포에 대하여, MUDENG 발현은 세포사멸을 유도하지 않는다.

본 발명의 항체는 무등 (MUDENG) 단백질을 특이적으로 인식할 수 있으므로, 무등 (MUDENG) 이상 분비의 원인이 되는 여러 질병, 예를 들어, 암이나 뇌종양 및 인체질환을 예방 및 진단하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는 시료 내의 무등 (MUDENG) 단백질을 특이적으로 인식하여 이를 검출 및 정제하는데에 이용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 MUDENG 단백질 발현에 대한 항-MUDENG (C22B3) 항체의 에피토프 맵핑을 나타낸다. HCT116 세포 (7.5 x 10⁵)을 pEGFP-C1 벡터 또는 pEGFP-C1 MUDENG 결손 돌연변이체 컨스트럭트(1-490, 41-490, 81-490, 121-490)로 24시간 동안 트랜지언트하게 트랜스팩션하고, 라이시스하고, SDS-PAGE를 수행하였다. 그 후 C22B3 MAb를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 그 블럿을 스트리핑하고, GFP 단백질에 대해서 재프로브하였다 (하단 패널).
도 2는 MUDENG 단백질의 Anti-hMUDENG 단클론 항체(C22B3) 인지에 관한 것이다. 도 2a는 이소성 MUDENG 발현 세포에서 siRNA 매개된 MUDENG 넉다운을 나타낸다. 무등을 가지거나 가지지 아니하는 야생형 U251-MG 세포 또는 pEGFP-C1을 안정하게 발현하는 U251-MG를 각각 대조군 siRNA (100 nM) 또는 무등 타겟팅 MUDENG (100 nM)를 사용하여 24시간 동안 트랜스팩션 시킨 후, 신선한 배지로 교환한 후 추가로 더 배양하였다. 세포 파쇄액을 얻은 후, SDS-PAGE를 수행하고, 그 다음에 C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 그 블럿을 스트리핑하고 GFP 및 액틴 단백질에 대해 재프로브하였다 (하단 패널).
도 2b는 여러 세포에서 siRNA 매개된 MUDENG 넉다운을 보여주는 사진이다. C6, HeLa 및 HCT116 세포를 각각 대조군 siRNA (100 nM) 또는 무등 타겟팅 MUDENG (100 nM)를 사용하여 24시간 동안 트랜스팩션 시킨 후, 신선한 배지로 교환한 후 추가로 더 24시간 더 배양하였다. 세포 파쇄액을 얻은 후, SDS-PAGE를 수행하고, 그 다음에 C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 그 블럿을 스트리핑하고, 액틴 단백질에 대해 재프로브하였다 (하단 패널).
도 2c는 내생적인 (endogenous) MUDENG 단백질의 동정에 관한 것이다. U251-MG, C6, 및 일차 랫트 성상교세포 (astrocytes)로부터 유래한 세포 파쇄액을 제조하고, SDS-PAGE를 수행한 후, C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
도 3은 무등 단백질이 인비트로에서 caspase-3에 의해 절단되지만, caspase-8 및 -9에 의해서 절단되지는 아니한다는 것을 보여주는 그림이다.
A는 MUDENG 단백질의 개략적인 구조와 가설적인 caspase-3 절단 부위를 나타낸다. B는 재조합 MUDENG 단백질을 각각 18시간 동안 캐스퍼레이즈 분석 버퍼에서 재조합 활성 caspase-3, -8, -9 (0.5 U/tube)로 배양하고, C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의하여 분석하였다. C는 재조합 MUDENG 단백질을 caspase 저해제 z-VAD-fmk (2.5μM)를 처리 또는 처리하지 아니하고 재조합 활성 caspase-3 (0.5 U/tube)로 배양하였다. 화살표는 전장 MUDENG을 나타내고, 화살표헤드는 caspase-3에 의해 생성된 MUDENG 절편을 나타낸다.
도 4는 MUDENG 단백질이 TRAIL 자극에 대해 절단되는 것을 나타내는 그림이다. 도 4a는 HCT116 세포를 pEGFP-N1 또는 pEGFP-N1-MUDENG로 24시간 동안 트랜지언트하게 트랜스팩션한 후 신선한 배지로 교환한 후 추가로 24시간 더 배양하였다. 그 후 그 세포들을 표시된 시간 (0-6 h) 동안 재조합 TRAIL (200 ng/ml)로 처리하였다. 세포를 파쇄한 후, SDS-PAGE를 수행하고, 그 다음에 C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 그 블럿을 스트리핑하고 GFP 및 액틴 단백질에 대해 재프로브하였다 (하단 패널). 화살표는 전장 MUDENG을 나타내고, 화살표헤드는 caspase-3에 의해 생성된 MUDENG 절편을 나타낸다.
도 4b는 트랜스팩션된 HCT116 세포를 caspase 저해제 z-VAD-fmk (2.5 μM) 존재 또는 부존재 상태에서 재조합 TRAIL (200 ng/ml)로 처리한 후, C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 그 블럿을 스트리핑하고 GFP,caspase-3 및 액틴 단백질에 대해 재프로브하였다 (하단 패널).
도 5는 MUDENG이 TRAIL, TNF-알파 또는 sFas-L에 의한 사멸 수용체 활성화에 대해 절단된다는 것을 보여주는 그림이다. pEGFP-N1-MUDENG에 의해 트랜스팩션된 HCT116 세포를 재조합 TRAIL (200 ng/ml), TNF-알파 plus CHX (50 ng/ml+10 mg/ml), 또는 sFAS-L (100 ng/ml)로 표시된 시간 동안(0-24 h)처리하였다. 세포 파쇄액을 얻은 후, C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 그 블럿을 스트리핑하고 GFP 및 액틴 단백질에 대해 재프로브하였다 (하단 패널). 전장 MUDENG-GFP 는 화살표로 절단된 형태는 화살표헤드로 표시하였다.
도 6은 본 발명의 단일클론 항체를 이용하여 인체 무등 (hMUDENG) 단백질을 분리 및 정제하여 쿠마쉬 블루 염색법 (Coomassie Blue staining)로 확인한 결과이다.

이하 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명에 사용된 세포 등은 다음과 같다.

U251-MG 인간 성상교세포종 (astroglioma) 세포, C6 랫트 성상교세포종(astrocytoma) 세포, 및 HeLa 세포 보충물을 가지고 5-10% 열 불활성화된 (HI) FBS를 포함하는 DMEM에서 성장하였다. HCT116 세포를 보충물을 가지고 10% 열 불활성화된(HI) FBS를 포함하는 McCoy's 5A 배지에서 배양하였다. 일차 신경교 (glial) 세포 배양은 전에 기재된 것과 같이 신생 랫트 대뇌 (neonatal rat cerebra)로부터 확립하였다 (Lee, S.J., 등,(2000). J Immunol 165, 4658-66). 세포를 2 mM glutamine, 0.1 mM 비필수 아미노산 혼합물, 0.1% gentamicin, 2.5 ㎍/ml amphotericin B 및 6g/L의 최종농도의 포도당으로 공급된 10% HI FBS를 포함하는 EMEM에서 배양하였다. 1차 배양 2 주 후, 희소돌기세포 (oligodendrocytes) 및 미세아교세포 (microglia)를 기계적인 디스로즈먼트 (dislodgment)로 제거하였다. 성상세포를 트립신 처리하여 수집하고 면역형광에 의하여 순도를 모니터하였다. 성상교세포 배양은 성상세포에 독특한 세포내 Ag, glial fibrillary acidic protein (GFAP)에 대하여 통상적으로 >95% 포지티브이었다 (Bignami, A., 등. (1972). Brain Res 43, 429-35).

재조합 인간(rh) TRAIL, TNF-알파 및 sFas-L는 Peprotech (Rocky Hill, NJ)로부터 구입하였다. 마우스 항-Green Fluorescent Protein (GFP) Ab 및 염소 항-actin Ab는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다. 토끼 항-GFAP은 Abcam (Cambridge science park, Cambridge, UK)로부터 구입하였다. z-VAD-fmk, caspase-3, caspase-8, 및 caspase-9은 BioVision (Mountain View, CA)로부터 구입하였다. Cycloheximide는 Calbiochem (La Jolla, CA)으로부터 구입하였다. Horseradish peroxidase (HRP)-결합된 염소 항-마우스 IgG들은 Jackson ImmunoResearch Lab (West Groove, PA)으로부터 구입하였다.

인간 항-무등 단일클론 항체의 생산에 대해서는 본 발명자의 기 출원된 발명인 공개특허 10-2009-0108937에 잘 기재되어 있으며 본 발명은 상기 공개된 발명을 참고하여 본 발명의 단일클론 항체를 제조하였다.

요약하면, rhMUDENG 단백질을 pET23dw-His-MUDENG 벡터를 사용하여 E. coli BL21 (DE3)에서 발현한 후, His-bind resin (Novagen, San Diago, CA)을 사용하여 정제하였다 (Lee, M.R. et al. (2008). Biochem Biophys Res Commun 370, 504-8). 그 정제된 rhMUDENG 단백질을 단클론 항체를 제조하기 위하여 사용하였다; 면역화, 세포 융합, 하이브리도마 클론의 선택, MAb의 생성 및 정제는 표준 방법에 따라 수행하였다 (Eshhar, Z. (1985) Monoclonal antibody strategy and techniques. In Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine ((ed), T.A.S., ed.^eds), pp. 3-41. Plenum Press, New York.).

실시예 1 : 항 인체 무등(MUDENG) 단일클론 항체의 생산

<1-1> 무등(MUDENG) 단백질의 발현

HeLa 세포로부터 RNA를 추출하고 정방향 프라이머 (CGCCGCTCGAGATGGCGCAGCGGGCAG: 서열번호 2; GenBank AK001675의 273-288번째 서열에 해당함)과 역방향 프라이머 (CGTCCCCCGGGTTACAATAATAATGATCC: 서열번호 3; GenBank AK001675의 서열번호 1728-1745에 해당함)를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 산물은 Xho1 및 Sma1 제한효소를 사용하여 pEGFP-N1에 클로닝한 다음, E.coli에서 발현시켰다.

<1-2> 무등(MUDENG) 단백질 접종 및 항혈청 제조

상기 <1-1>에서 발현된, 서열번호 1로 표시되는 재조합 인체 무등 (MUDENG) 단백질을 분리, 정제하였다.

정제된 인체 무등(MUDENG) 단백질에 대한 항혈청과 잡종세포 생산을 위해, 재조합 무등 (MUDENG)을 10㎍/0.2㎖로 조정하여 PBS에 녹인 다음 동량의 (V/V) FCA (Freund's complete adjuvant)와 잘 섞은 후 균일한 유탁액이 되었을 때 발브씨 (BALB/C) 생쥐에 복강 주사하였다. 2주 후 처음 주사 때와 동일한 양의 재조합 인체 무등 (MUDENG)을 FIA (Freund's incomplete adjuvant)와 혼합하여 동일 부위에 주사하고, 3일 후 눈에서 소량의 혈액을 채혈하여 항체 생성 여부를 엘라이자 (ELISA) 방법으로 측정하고 항체의 역가가 높을 때까지 반복하였다. 마지막 주사는 직전의 재주사로부터 1주일 후에 FIA와 섞지 않은 무등 (MUDENG)을 이전의 주사 때와 동일한 양으로 꼬리정맥에 주사하였다.

<1-3> 항 인체 MUDENG 단일클론 항체의 생산 하이브리도마 세포의 제조

하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (Hypoxanthine phosphoribosyl transferase; HPRT, EC 2.4.2.8)는 아미노프테린 (aminopterin), 아자세린 (azaserine) 등에 의하여 퓨린 뉴클레오티드의 합성경로가 저해되는 신생합성경로 (de novo pathway)에 의하지 않고도 하이포크산틴 (hypoxanthine)이나 구아닌 (guanine) 염기를 각각 IMP (inosine-5'-monophosphate)나 GMP (Guanine-5'-monophosphate)로 전환시키는 재생경로 (salvage pathway)에 관여하는 효소인데, 이 HPRT가 결핍된 것으로 알려진 SP2/0-Ag14 (ATCC, CRT 1581) 골수종 세포주의 특성을 세포융합 전에 확인한 결과, 이 세포주는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium, GIBCO, Grand ISland, NY)과 10% FBS (Fatal Bovine Serum, Gibco)을 포함한 배지에 구아닌 아날로그 (Guanine analog)인 10㎕/㎖의 6-티오구아닌 (6-thioguanine)을 첨가한 배양액에서는 잘 자라는 반면에 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (Hypozanthine-aminopterin-thymidine: HAT), 5X10^-3M 하이포크산틴, 4X10^-5M 아미노프테린, 8X10^-4M 티미딘) 선택배지에서 이 세포주는 23일 후면 모두 죽는 것으로 나타나 세포융합에 적합한 세포주임이 확인되었다. 세포융합은 먼저, 100㎜ 직경의 페틔리디쉬에 인체 무등 (MUDENG)으로 면역된 생쥐의 비장 (spleen)을 꺼내 무혈청 DMEM 배지에서 핀셋, 가위, 메쉬 등을 이용하여 세포를 적출해 낸 다음 50㎖ 원심분리관 (conical tube, falcon Co.)으로 옮겨 탁상용 원심분리기 (table top centrifuge, Beckman, Somerset, NJ)에서 1,200 rpm, 5분 동안 원심분리하고 0.17M NH₄Cl를 37℃에서 5분 동안 처리하여 적혈구 세포를 용출시킨 후 찬 DMEM 배지로 2회 세척하였다. 이 비장세포를 현미경하에서 세포계산판 (hematocytometer)을 이용, 세포 수를 측정하여 SP2/0-Ag14 세포주와 5:1의 비율로 10㎖씩 섞은 다음 원심 분리하였다. 원심 분리된 펠렛을 손가락으로 가볍게 두드려서 분산시키고 37℃에서 1분간 방치한 뒤 37℃ 항온수조에서 미리 데워진 50% PEG 4000 (polyethylene glycol 4,000,Indianapolis, IN) 1㎖ 를 30초 동안에 걸쳐 천천히 처리하고 무혈청 DMEM 배지 9 ㎖을 넣어 섞어준 후 다시 50 ㎖이 될 때까지 DMEM을 서서히 가해 주었다. 이것을 1,200rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 세포 펠렛을 10% PBS가 포함된 HAT 배지에 1 ~ 2 X 10⁶/㎖ 정도로 섞어 96 웰 배양플레이트 (96 well flat bottomed plate)에 웰 당 두 방울씩 가하고 37℃ 습윤 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하면서 잡종세포를 선별하였다.

잡종세포클론에서 인체 무등 (MUDENG)에 대한 항체의 생성 유무는 세포융합 후 약 12주 경과 시, 잡종세포클론이 형성된 웰 (약 50% confluence) 배양 상층액을 취하여 간접 ELISA법으로 측정하였다. 즉, 인체 무등 (MUDENG)을 코팅완충액 (0.05M carbonate buffer, PH 9.6)으로 1 ㎍/㎖이 되도록 희석하여 96 웰 미세역가 플레이트 (96 well microtitration plate, Dynatech) 100 ㎕씩 가하고 4℃에서 하룻밤 동안 결합시킨 후 세척 완충액 (PBST; 0.05% Tween-20 in PBS, pH 7.4)로 3회 세척 후 3% 소 혈청 알부민 (BSA in PBS, Sigma)으로 상온에서 2시간 동안 코팅되지 않은 부분을 차단 (blocking)하고 다시 3회 세척 후, 희석 완충액 (PBST; 0.05% Tween-20,0.92% NaN₃, 1% BSA in PBS, pH 7.4)으로 희석한 잡종세포의 배양상청액 100 ㎕를 각 웰에 가하고 상온에서 2시간 반응시킨 후 3회 세척하고 1:1,000으로 희석된 HRP-콘쥬게이트된 고트 (goat) 항-마우스 IgG 항체 (HRP conjugated goat anti-mouse IgG (Bio-Rad, USA))를 100 ㎕씩 가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 3회 세척 후 H₂O₂와 0.2M Na₂HPO₄, 0.1M 시트르산을 함유하는 기질 완충액 (substrate buffer)에 1 ㎎/㎖로 녹인 ABTS (2.2-Azino-bis(3-etylbenzo- thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt, Sigma)를 100 ㎕씩 각 웰에 가하고 엘라이자 판독기 (Bio-Tek Vermont)를 사용하여 630㎚에서 흡광도 (optical density)를 측정하여 항체를 생성하는 세포클론들을 24 웰 배양 플레이트로 옮겨서 배양하고 다시 조직 배양용 플라스크 (Falcon)로 옮겨가면서 잡종세포의 수를 증식시켰다.

<1-4> 하이브리도마의 클로닝 (Single cell cloning)

다음으로, 인체 무등 (MUDENG)에 대하여 특이적인 항체만을 생성하는 잡종세포를 선별하여 단일클론을 얻기 위해 한계희석법 (limiting dilution)에 의한 단일세포 클로닝 (single cell cloning)을 수행하였다. 즉, 선별된 잡종세포 클론을 10% FBS가 포함된 HAT 배지 하에서 1 cell/100㎕/well로 희석하여 96-웰 배양플레이트에 100 ㎕씩 가하고 클로닝의 효율성을 높이기 위해 면역시키지 않은 발브씨 생쥐의 비장세포를 분리하여 영양공급 세포 (feeder cell)로써 이용하였는데, 세포수를 1~ 2 X 10⁵/㎖로 조정하여 각 웰에 100 ㎕씩 가해주었다. 한계희석법 (Limiting dilution)에 의해 클로닝된 단일클론으로부터 항체를 얻기 위해서 배양상층액들을 얻었다.

<1-5> 단일클론 항체의 생산 및 정제

단일클론 항체의 대량생산을 위해 약 10주령의 발브씨 생쥐에 0.5 ㎖ FIA를 복강주사하여 프라이밍 (priming)시키고 7일 후, 각각의 단일클론들을 PBS 0.5㎖로 5 X 10⁶으로 현탁시켜 복강 내로 주사하였다. 약 1주 후 복강이 부풀은 생쥐에서 18 게이지 주사바늘을 사용하여 복수를 채취하고 4℃에서 1시간 동안 방치하여 침전물과 부유물들을 제거한 후 5,000g에서 20 분간 원심분리하여 세포와 상층의 지방질을 제거하였다. 이 복수로부터 단일클론 항체의 정제는 복수와 PBS (phosphate buffered saline)를 1대 1로 혼합한 후에 PBS로 평형화 (equilibration)된 프로테인-G 컬럼 (protein-G column, Pharmacia)에 로딩 (loading)하였다. 그 후 컬럼 부피의 10배 양인 PBS로 컬럼을 세척한 후에 0.1M 글리신 (pH 2.6)으로 결합된 단일클론 항체를 용출시켜 분획당 900 ㎕의 용출물을 모으고 각 분획마다 100 ㎕의 1M Tris pH 8.0을 즉시 가해주어 용출물의 pH를 중화시켰다. 그 후 280 ㎚에서 흡광도를 측정하여 항체를 함유한 분획들을 모았다. 이를 각 1 ㎍씩 10% SDS-PAGE 겔에 걸어 그 정제순수도를 측정하였는데 대조군인 생쥐 IgGl, 1 ㎍과 비교하여 거의 95% 이상 순수한 항체를 정제하였다.

상기와 같은 방법으로 무등 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였고, 최종적으로 선별된 하이브리도마 C22B3에서 생산된 단일클론 항체를 C22B3라 명명하였으며, 이하 실험 예에서는 C22B3 단일클론 항체를 가지고 실험하였다.

실시예 2: MUDENG 의 cDNA 클로닝과 안정한 세포주의 생성

pEGFP-C1-hMUDENG 및 pEGFP-N1-hMUDENG의 생성은 전에 기재한 것에 따라 수행하였다 (Lee, M.R. et al. (2008). Biochem Biophys Res Commun 370, 504-8). GFP-태그된 hMUDENG 결손 돌연변이체 (pEGFP-C1-hMUDENG 41-490 잔기, 81-490 잔기, 121-490 잔기)를 PCR에 의해 생성하였다. 모든 cDNA 컨스트럭트들을 DNA 시퀀싱에 의하여 확인하고, Lipofectamine2000 (Invitrogen, Gaithersburg, MD)을 사용한 트랜지언트 트랜스팩션에 의하여 HCT116 세포에서 발현하였다. pEGFP-C1 및 pEGFP-C1-MUDENG를 안정하게 발현하는 U251-MG 세포를 Lipofectamine 2000을 사용한 트랜스팩션에 의해서 생성하고 200 ㎍/ml G418 sulfate (Invitrogen, Gaithersburg, MD)를 사용하여 선별하였다.

실시예 3: 웨스턴 블럿

그 세포를 세척하고 스크래핑에 의해서 수확하였다. 그 후, 세포를 1 mM PMSF, 2 mg/ml aprotinin, 1 mg/ml leupeptin, 1 mg/ml pepstatin A, 2 mM sodium fluoride, 및; 1 mM sodium orthovanadate로 보충된 라이시스 버퍼 (M-PER mammalian protein extraction reagent (Pierce, Rockfold, IL))에서 라이시스하였다. 수용성 라이세이트 (30 μg)를 SDS-PAGE를 수행하고, 나이트로셀루로스 막으로 트랜스퍼하였다. 그 후, 그 막을 C22B3 하이브리도마 배양 상등액 또는 정제된 C22B3 MAb로 배양하고, HRP-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgGs Ab로 배양하고 enhanced chemoluminescence (ECL)로 디벨로프하였다.

실시예 4: Small interfering RNA 트랜스팩션

인간 MUDENG (siRNA #1 센스 가닥: 5'CACUUGGGCUCAUUUUAGA-3' (서열번호 4) siRNA #2 센스 가닥: GUAGAUAAUGUGCAAGAUA (서열번호 5); siRNA #3 센스 가닥: 5'GAGCAAGUUAUGUGCCUGU-3' (서열번호 6), 타겟팅 및 랫트 MUDENG (siRNA #1 센스 가닥: 5'CAGGAUAUAGCAGACACAU-3' (서열번호 7) siRNA #2 센스 가닥: 5'UGAUCUGUGAUUACGUAGU-3' (서열번호 8) 티겟팅하는 small interfering RNA (siRNA) 이중가닥을 Bioneer (Daejeon, Korea)로부터 구입하였다. 단 상기 무등 siRNA 제조 시에 각 siRNA의 3'말단에 'dTdT'를 부가하여 제조하였다. 트랜스팩션을 위해서 세포를 24웰 플레이트에서 5 x 10⁴ 세포의 밀도로 시드하였다. 다음 날에, 50 nM의 siRNA duplexes를 Lipofectamine2000 Reagent를 사용하여 트랜스팩션하였다. 배지를 트랜스팩션 후에 24시간에 교환하고 24시간 동안 더 배양하였다. 세포 라이세이트를 제조하고, 타겟의 사일런싱을 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다.

실시예 5: In - vitro 절단 분석

상기 rhMUDENG 단백질을 활성 caspase-3, caspase-8, 및 caspase-9를 사용한 인비트로 절단 분석에 사용하였다. 2백 나노그램의 rhMUDENG는 50 mM HEPES, pH 7.2, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM EDTA, 5% Glycerol, 및 10 mM DTT를 포함하는 최종 부피 20 μl의 캐스페이즈 분석 버퍼에서 z-VAD-fmk (2.5 μM)를 가지거나 또는 가지지 않은 각 재조합 캐스페이즈 (0.5 Unit/ml)로 18시간 동안 배양하였다. 반응은 샘플 버퍼에서 가열하여 중지하고 10% SDS-PAGE를 수행하였다. rhMUDENG 단백질의 절단은 C22B3 MAb로 웨스턴 블럿에 의하여 분석하였다.

상기 실시예의 결과는 다음과 같다.

선택된 하이브리도마로부터 생성된 새로운 C22B3 MAb의 인지에 해당하는 에피토프 맵핑을 조사하기 위하여, pEGFP-C1-wild type (wt) hMUDENG (1-490) 및 그것의 결손 돌연변이체 (41-490, 81-490, 121-490)들을 트랜지언트 트랜스팩션에 의하여 HCT116 세포에서 발현하고 웨스턴 블럿팅에 의하여 분석하였다. GFP-wt hMUDENG (1-490) 및 그것의 결손 돌연변이체 융합단백질들을 C22B3 MAb 또는 항-GFP Ab로 프로브하였다 (도 1A). 그 결과는 단지 GFP-wt hMUDENG (1-490)만이 C22B3 MAb에 의해서 인식되었고 (도 1A; lane 2), MUDENG (41-490), MUDENG (81-490), 또는 MUDENG (121-490)은 인식되지 않았고(도 1A 상단; lane 3-5), 그것은 C22B3 MAb에 의해서 인지된 실질적인 에피토프는 1-40 잔기의 hMUDENG 폴리펩티드 사이에 걸쳐있다는 것을 암시한다. 해당 결과는 항-GFP Ab로 재프로브하였을 때도 얻었다 (도 1A 하단; lane 2-5).

MUDENG 유전자 발현이 siRNA 트랜스팩션에 의하여 영향을 받는지 조사하기 위하여, wt U251-MG 세포 및 wt hMUDENG (1-490)을 가지거나 가지지 않은 GFP tagged-pEGFP-C1를 안정하게 발현하는 U251-MG 세포를 대조군 siRNA 또는 MUDENG 특이적인 siRNA로 트랜스팩션하였다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, GFP-MUDENG (1-490)은 C22B3 MAb를 프로브할 때 대조군 siRNA (상단; lane 7-8)와 비교할 때 MUDENG siRNA (상단; lane 9)에 의해서 다운-레귤레이션되었다. 더 구별되는 차이는 항-GFP Ab를 사용하였을 때도 얻었다 (도 2a 하단; lane7-9). 흥미롭게도, 내생적인 MUDENG 단백질일 밴드도 검출되고 MUDENG 특이적인 siRNA에 의해 다운-레귤레이션되었다 (도 2a 상단; lane 3, 6, 9). 추가적인 실험을 C6, HeLa, 또는 HCT116 세포에서 MUDENG 특이적인 siRNA로 수행하였다. 생각한 것과 같이, U251-MG 세포에서 관찰된 것과 같이 내생적인 MUDENG은 검출되고, 다운-레귤레이션되었다 (도 2b; lane 3, 6, 9). 다음, 본 발명자들은 C22B3 MAb가 내생적인 MUDENG 단백질을 검출할 수 있는지를 알기를 원하였다. 따라서 본 발명자들은 U251-MG, C6, 또는 랫트 성상교세포로 웨스턴 블럿팅에 의해서 C22B3 MAb를 조사하였다. 본 발명자들은 테스트된 세포 모두로부터 유래한 내생적인 MUDENG 단백질이 각각 C22B3 MAb에 의해 인식된 것을 관찰할 수 있었다 (도 2c; lane1-3). 이 결과는 C22B3 MAb가 인간 및 랫트 세포 모두로부터 유래한 내생적인 MUDENG을 인지하는 것을 나타낸다.

Caspase-3는 에팝토시스의 유도 동안 DXXD 서열에서 많은 구조 및 신호 단백질을 단백질분해한다 (Cryns, V. and Yuan, J. (1998). Genes Dev 12, 1551-70;Cohen, G.M. (1997). Biochem J 326 ( Pt 1), 1-16). 캐스페이즈-3에 의해 선호된 두 DXXD 컨센서스 부위는 MUDENG 폴리펩타이드에서; DDKD-F 및 DAMDD-S로 동정되었다 (도 3A). 이것들이 caspase-3에 대한 특이적인 절단 부위인지를 조사하기 위해서, 본 발명자들은 인 비트로에서 rhMUDENG에 대하여 캐스페이즈-3, -8 및 -9를 처리한 후 C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 도 3B에서 알 수 있는 바와 같이, rhMUDENG는 caspase-3에 의해 절단되었지만 (lane 2), caspase-8 및 -9에 의해서는 절단되지 않았다 (lane 3, 4). 특이성을 분석하기 위해서, caspase 저해제 z-VAD-fmk를 각 튜브에 전 처리한 후 추가적인 반응을 수행하였다. 사실, rhMUDENG은 저해제의 특이성을 나타내면서 캐스패이즈 저해에 대해 회복하였다 (도 3C; lane 3). MUDENG이 사멸수용체 활성화 (death receptor activation)에 대하여 절단될 수 있는지 더 테스트하기 위해서, HCT116 세포를 GTP의 N-말단과 융합된 wt MUDENG (1-490) 컨스트럭트로 또는 없이 트랜스팩션하였다. 다음에 TRAIL을 지시된 시간 동안 (0-6h) 처리하고 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. 도 4a에서 나타낸 바와 같이, C22B3 MAb에 의해서 검출된 일부 절단된 MUDENG 융합단백질 (1-289)은 TRAIL 처리 3시간에 증가되었고, 처리 후 6 시간에 피크였다 (상단; lane 5-6). 또한 GTP의 N-말단과 융합된 MUDENG 절편들 (290-490)은 3시간과 6시간에 GFP Ab에 의해서 검출되고 증가되었다 (하단; lane 5-6). 또한 caspase 저해제의 특이성을 테스트하기 위해서, 세포를 6시간 동안 200 ng/ml TRAIL 자극 전에 caspase 저해제 2.5 μM z-VAD-fmk로 전처리하였다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, MUDENG 절단 (1-289)은 z-VAD-fmk에 의해 저해되었다 (상단; lane 6). 절단된 MUDENG (290-490)-GFP의 밴드는 또한 GFP Ab에 의해서도 검출되었다 (중앙; lane 5).

Fas/CD95, TNF-receptor 1/2, 또는 death receptor 4/5를 포함하는 사멸 수용체는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼 훼밀리의 멤버이고, TRAIL, Fas-L, 또는 TNF-알파를 포함하는 그들의 코그네이트 리간드에 의하여 활성화되었다 (Guicciardi, M.E. and Gores, G.J. (2009).Faseb J 23, 1625-37). 본 발명자들은 MUDENG이 TRAIL, sFas-L, TNF-알파 자극에 대해 절단되는지를 아는 것이 궁금하였다. 이 질문에 답하기 위하여, HCT116 세포를 24시간 동안 pEGFP-N1-MUDENG으로 일시적으로 트랜스팩션하고 24시간 더 배양하고 그 후 재조합 TRAIL (200 ng/ml, 0-6 h), TNF-알파 plus CHX (50 ng/ml + 10 mg/ml, 0-6 h), 또는 sFAS-L (100 ng/ml, 0-24 h)로 처리한 후 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 사멸 수용체 자극에 대한 MUDENG (1-490)-GFP의 절단이 관찰되었고, 절단된 MUDENG (1-490)-GFP의 수준은 증가하고, 처리 후 6 시간에 피크가 되었다 (상단; lane 3, 5, 6). 이들 결과들은 caspase-3에 의한 MUDENG 절단은 사멸 수용체 활성화를 통하여 일어난다는 것을 나타낸다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST MUDENG PROTEIN AND AN APPLICATION THEREOF <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 490 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Arg Ala Val Trp Leu Ile Ser His Glu Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Cys Gly Thr Val Arg Phe Ser Arg Arg Tyr Pro Thr Val Glu Lys 20 25 30 Arg Ala Arg Val Phe Asn Gly Ala Ser Tyr Val Pro Val Pro Glu Asp 35 40 45 Gly Pro Phe Leu Lys Ala Leu Leu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Asp Asp 50 55 60 Asp Lys Asp Phe Val Glu Ser Arg Asp Ser Cys Ser Arg Ile Asn Lys 65 70 75 80 Thr Ser Ile Tyr Gly Leu Leu Ile Gly Gly Glu Glu Leu Trp Pro Val 85 90 95 Val Ala Phe Leu Lys Asn Asp Met Ile Tyr Ala Cys Val Pro Leu Val 100 105 110 Glu Gln Thr Leu Ser Pro Arg Pro Pro Leu Ile Ser Val Ser Gly Val 115 120 125 Ser Gln Gly Phe Glu Phe Leu Phe Gly Ile Gln Asp Phe Leu Tyr Ser 130 135 140 Gly Gln Lys Asn Asp Ser Glu Leu Asn Thr Lys Leu Ser Gln Leu Pro 145 150 155 160 Asp Leu Leu Leu Gln Ala Cys Pro Phe Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn 165 170 175 Leu Gln Asn Ser Leu Asp Asn Thr Asn Phe Ala Ser Val Thr Gln Pro 180 185 190 Gln Lys Gln Pro Ala Trp Lys Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Gln 195 200 205 Val Ser Ile Ser Ile Thr Glu Lys Val Lys Ser Met Gln Tyr Asp Lys 210 215 220 Gln Gly Ile Ala Asp Thr Trp Gln Val Val Gly Thr Val Thr Cys Lys 225 230 235 240 Cys Asp Leu Glu Gly Ile Met Pro Asn Val Thr Ile Ser Leu Ser Leu 245 250 255 Pro Thr Asn Gly Ser Pro Leu Gln Asp Ile Leu Val His Pro Cys Val 260 265 270 Thr Ser Leu Asp Ser Ala Ile Leu Thr Ser Ser Ser Ile Asp Ala Met 275 280 285 Asp Asp Ser Ala Phe Ser Gly Pro Tyr Lys Phe Pro Phe Thr Pro Pro 290 295 300 Leu Glu Ser Phe Asn Leu Cys Phe Tyr Thr Ser Gln Val Pro Val Pro 305 310 315 320 Pro Ile Leu Gly Phe Tyr Gln Met Lys Glu Glu Glu Val Gln Leu Arg 325 330 335 Ile Thr Ile Asn Leu Lys Leu His Glu Ser Val Lys Asn Asn Phe Glu 340 345 350 Phe Cys Glu Ala His Ile Pro Phe Tyr Asn Arg Gly Pro Ile Thr His 355 360 365 Leu Glu Tyr Lys Thr Ser Phe Gly Gln Leu Glu Val Phe Arg Glu Lys 370 375 380 Ser Leu Leu Ile Trp Ile Ile Gly Gln Lys Phe Pro Lys Ser Met Glu 385 390 395 400 Ile Ser Leu Ser Gly Thr Val Thr Phe Gly Ala Lys Ser His Glu Lys 405 410 415 Gln Pro Phe Asp Pro Ile Cys Thr Gly Glu Thr Ala Tyr Leu Lys Leu 420 425 430 His Phe Arg Ile Leu Asp Tyr Thr Leu Thr Gly Cys Tyr Ala Asp Gln 435 440 445 His Ser Val Gln Val Phe Ala Ser Gly Lys Pro Lys Ile Ser Ala His 450 455 460 Arg Lys Leu Ile Ser Ser Asp Tyr Tyr Ile Trp Asn Ser Lys Ala Pro 465 470 475 480 Ala Pro Val Thr Tyr Gly Ser Leu Leu Leu 485 490 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgccgctcga gatggcgcag cgggcag 27 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgtcccccgg gttacaataa taatgatcc 29 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 4 cacuugggcu cauuuuaga 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 5 guagauaaug ugcaagaua 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 6 gagcaaguua ugugccugu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 7 caggauauag cagacacau 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 8 ugaucuguga uuacguagu 19

Claims (6)

1. 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 무등(MUDENG) 단백질의 서열 중 1 ~ 40번 사이에 존재하는 에피토프를 인식하며, 무등(MUDENG) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
2. 제 1항의 무등(MUDENG) 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 또는 뇌질환 진단용 조성물.
3. 제 1항의 무등(MUDENG) 단백질에 대한 항체가 고정화된 고상 담체.
4. 제 3항에 있어서, 상기 고상 담체는 기판, 수지, 플레이트, 필터, 카트리지, 컬럼, 또는 다공질재인 것을 특징으로 하는 고상 담체.
5. 제 1항의 무등(MUDENG) 단백질에 대한 항체를 포함하는 무등 단백질 분리 및 정제용 조성물.
6. 제 1항의 무등(MUDENG) 단백질에 대한 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜, 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 암 또는 뇌질환 마커를 검출하는 방법.
   

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