KR101760465B1 - Clec14a에 특이성을 갖는 신규한 항체 및 그 용도 - Google Patents

Clec14a에 특이성을 갖는 신규한 항체 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 clec14a(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)에 특이적으로 결합하는 신규한 항체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 clec14a의 CTLD(C-타입 렉틴 유사 도메인)에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 제조하는 방법, 상기 항체를 포함하는 혈관신생 억제용 조성물, 상기 항체 또는 상기 조성물을 투여하여 혈관신생을 억제하는 방법, 상기 항체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물, 상기 항체 또는 상기 조성물을 투여하여 암을 치료하는 방법, 상기 항체를 포함하는 암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트, 상기 조성물을 사용하여 암을 진단하는 방법, clec14a의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 혈관신생 억제용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 혈관신생용 키트, 상기 조성물을 사용하여 혈관신생을 억제하거나 암을 치료하는 방법, 및 혈관신생을 억제하는 항체를 위한 에피토프로서 clec14a의 CTLD의 용도에 관한 것이다. 상기 항체는 cle14a-매개성 암 진행을 효과적으로 억제할 수 있다.

Description

CLEC14A에 특이성을 갖는 신규한 항체 및 그 용도{Novel Antibody Specific for Clec14a and Uses Thereof}
본 발명은 C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A(clec14a)에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 clec14a의 C-타입 렉틴 유사 도메인(CTLD)에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 제조하는 방법, 상기 항체를 포함하는 혈관신생 억제용 조성물, 상기 항체 또는 상기 조성물을 투여하여 혈관신생을 억제하는 방법, 상기 항체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물, 상기 항체 또는 상기 조성물을 투여하여 암을 치료하는 방법, 상기 항체를 포함하는 암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트, 상기 조성물을 사용하여 암을 진단하는 방법, clec14a의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 혈관신생 억제용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 혈관신생용 키트, 상기 조성물을 사용하여 혈관신생을 억제하거나 암을 치료하는 방법, 및 혈관신생을 억제하는 항체 제작을 위한 에피토프로써 clec14a의 CTLD의 용도에 관한 것이다.
재조합 항체 기술은 급격하게 발전하여 최근까지 약 30개의 항체가 승인되어 인간 치료에 사용되고 있으며, 광범위한 질병 치료를 위하여 전세계적으로 270개가 넘는 항체에 대한 임상연구가 진행중이다. 그러나 종래의 항체 스크리닝은 시간 및 노동력이 많이 필요하고, 비용이 비싼 단점이 있다. 일반적으로 타겟 단백질의 세포외 부분이 항체를 스크리닝하는 데에 사용된다. 결과적으로 대부분의 스크리닝된 항체는 세포에는 결합하지만, 치료 잠재력을 가지는 기능성 항체는 아닌 경우가 많다. 최근에는 분자생물학 및 단백질 생화학 기술의 발전에 따라세포 기능과 연결될 수 있는 단백질 도메인 및 모티브 상의 다량의 정보의 활용이 가능해지고 있다. 기능성 도메인(functional domain)을 재조합 항체 스크리닝에 사용하는 용도는 기능성 항체를 확인하고 근본적인 작용기전(mode of action)을 조사하는 효과적인 수단일 수 있다.
종양 혈관신생은 종양 진행에 중요한 역할을 한다. 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 상피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)는 혈관신생에서 중요한 인자이며, 혈관신생은 암 치료에 있어서 매우 유망한 타겟이다. 항-VEGF 항체(anti-VEGF antibody)인베바시주맵(bevacizumab)은 전이성 대장암(metastatic colorectal cancer), 신장암(renal cell carcinoma), 비소세포성 폐암(non-smallcell lung cancer), 및 악성 뇌신경교종(malignant brain glioma) 질환을 가진 환자를 치료하는 데에 사용되고 있다. 항-EGFR 항체(anti-EGFR antibody)인 세툭시맵(Cetuximab)은 내피세포간 접촉을 저해하고, VFGF, 인터류킨-8(interleukin-8) 및 기본 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor)와 같은 혈관신생인자의 발현을 억제할 수 있다.
그러나 태반성장인자(placental growth factor), 앤지오포이에틴(angiopoietin), 기본 섬유아세포성장인자(basic fibroblast growth factor), 및 간세포생장인자(hepatocyte growth factor)를 포함하는 종양-분비 혈관신생 인자의 다양하고 과다한 존재로 인하여 이들 약제에 대한 종양의 저항성(resistant phenotype)이 나타난다 (Kopetz S, et al., Phase II trial of infusional fluorouracil, irinotecan, and bevacizumab for metastatic colorectal cancer: efficacy and circulating angiogenic biomarkers associated with therapeutic resistance. Journal of Clinical Oncology.28(3):453-9; Lucio-Eterovic AK, et al., Mediators of glioblastoma resistance and invasion during antivascular endothelial growth factor therapy. Clinical Cancer Research. 2009;15(14):4589-99).
현재 인간 VEGF 특이적 항체인 베바시주맙(bevacizumab)은 다양한 암 환자를 치료하는 데에 사용되고 있다. 그러나 VEGF 수용체(VEGFR)는 정상 세포에서도 발현되기 때문에, 이의 사용은 고혈압, 단백뇨, 및 위장관 천공(gastrointestinal perforation)을 포함하는 부작용과 연관이 있는 것으로 보인다. 또한 부작용으로 인하여 VEGFR-2 및 앤지오포이에틴-2(angiopoietin-2)와 같은 혈관신생 전구인자(pro-angiogenic factors)에 대한 많은 치료용도에 제한이 생긴다. 결과적으로 신생혈관 생성(angiogenesis)을 억제함으로써 암 환자를 치료하는 새로운 암-특이적 타켓의 확인은 보다 부작용이 적은 치료용 항체를 개발하는 데에 있어서 결정적이다.
또한, 베바시주맙(bevacizumab) 및 세툭시맙(cetuximab)은 용해성 신생혈관 성장인자(angiogenic growth factors) 및 그 수용체의 상호작용을 저해함으로써 신생혈관 생성을 억제하는 치료용 항체이다. 그러나 이들 약제를 장기간 복용하는 경우, 종양 세포가 분비하는다양한 혈관신생 전구성장인자(pro-angiogenic growth factors)들로 인해 종양의 약제에 대한 저항성이 나타난다.이로인해 장기간의 치료를 필요로 하는 환자에 있어서 용해성 성장인자에 대한 항체를 사용하는 것은 큰 문제를 야기할 수 있다.
Clec14a는 상피성장인자(epidermal growth factor) 유사 도메인인 C-타입 렉틴-유사 도메인(CTLD) 및 스시-유사 도메인(sushi-like domain)을 구성하는 세포외 도메인인 타입 I 막관통단백질(transmembrane protein)이다. 몇몇 보고에서 종양 신생혈관 생성에 있어, clec14a가 역할을 한다고 제시한 바 있다. 로 등(Rho et al.)은 clec14a이 혈관내피세포 특이적이며, 신생혈관 생성에 있어 세포간 접촉에서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 보고하였다(Rho SS, et al., Clec14a is specifically expressed in endothelial cells and mediates cell to cell adhesion. Biochemical & Biophysical Research Communications.404(1):103-8). 뮤라 등(Mura et al)은 clec14a가 사상위족(filopodium) 형성, 세포이동(cell migration), 및 혈관내피세포 튜브 형성 (endothelial tube formation)과 관련된 혈관신생 전구 표현형(pro-angiogenic phenotypes)을 조절하는 데에 결정적이라는 것을 보고하였으며, 이 그룹 또한 clec14a가 정상 조직의 내피에서는 발현되지 않은 종양 내피세포 특이적 마커라는 점을 확인하였다(Mura M, et al., Identification and angiogenic role of the novel tumor endothelial marker CLEC14A. Oncogene.31(3):293-305).
최근 수년 동안 clec14a에 대하여 높아진 관심에도 불구하고, 그 분자 메커니즘은 명확하게 확인되지 않고 있다. 임상적으로 활용 가능한 항체를 발굴하고 개발하기 위해서는 신생혈관 생성과 관련된 clec14a의 기능성 부분(portion) 또는 도메인에 대한 연구는 반드시 수행되어야 한다. 이와 관련하여, 전임상 및 임상 연구를 위하여 마우스 및 인간 clec14a에 특이적으로 결합하고 인간화된, 항체 또는 인간 항체로 변환될 수 있는 모노클로날 항체가 강력하게 요구되고 있다. 바람직하게는 종양 신생혈관 생성의 저해에 임상적으로 적용가능하며, 궁극적으로 암을 치료할 수 있는 항체가 필요하다. 또한, 신생혈관 생성을 억제하는 것을 확인하고 암을 치료하기 위해서는 종양 신생혈관 생성을 억제하는 새로운 약제가 필요하다.
상기 기재된 내용은 본 발명의 배경에 대한 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서의 당업자에게 이미 알려진 공지기술에 해당하지 않는다.
본 발명자들은 우선 신생혈관 생성에 있어 중요한 세포 이동 및 사상위족 형성(filopodium formation)에서 CTLD 기능을 확인하였다. 파지 표면발현 기술(phage display technology)을 이용하여, 본 발명자들은 인간 및 마우스 clec14a CTLDs에 특이적인 재조합 인간 항체를 개발하였다. 기능 에세이 결과는 항체가 생존력 또는 활성화에 영향을 끼치지 않고 내피세포 이동 및 튜브 형성을 특이적으로 저해한다는 것을 보여주었다.
이에 따라, 본 발명자들은 CTLD-매개 세포간 상호결합을 조절하고 내피세포 표면 상의 elec14a 발현을 하향 조절(down-regulating)함으로써 신생혈관 생성을 억제할 수 있는 작용기전(mechanism of action)을제안한다. 이 결과들은 신생혈관 생성에서의 CTLD의 기능적 중요성 및 clec14a 매개 종양 신생혈관 생성을 방지하기 위한 CTLD-특이적 인간 항체의 잠재력을 입증한다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 clec14a (C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항체를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 벡터 또는 상기 핵산을 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항체를 생산하기 위하여 상기 핵산이 발현되도록 상기 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 상기 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항체가 상기 약물에 결합된 항체-약물 결합체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 약제학적 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항체를 포함하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 혈관신생 억제용 조성물의 제조를 위한 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 혈관신생 억제용 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 상기 약제학적 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 혈관신생 관련 질환의 생체외(in-vitro) 진단을 위한항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 혈관신생 관련 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 혈관신생 관련 질환 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료 내의 항원-항체 반응을 통하여 clec14a를 검출하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 진단방법을 제공한다.
본 발명은 또한 혈관신생을 억제하는 항체의 생성을 유도할 수 있는 에피토프로서의 clec14a의 단리 CTLD를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 혈관신생을 억제하는 항체의 생성을 유도할 수 있는 에피토프로서의 clec14a CTLD의 N-말단 또는 C-말단을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 혈관신생을 억제하는 항체의 생성을 유도할 수 있는 에피토프로서 clec14a의 CTLD 내의 1번째 아미노산으로부터 42번째 아미노산까지의 아미노산 절편 또는 clec14a의 CTLD 내의 122번째 아미노산으로부터 142번째 아미노산까지의 아미노산 절편을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 에피토프로써 사용하여 바이오패닝(biopanning)하는 단계를 포함하는 clec14a(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 clec14a의 발현을 저해하는 물질을 포함하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 혈관신생 억제용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 혈관신생 억제용 조성물의 제조를 위하여 clec14a의 발현을 억제하는 물질의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 혈관신생 억제용 clec14a의 발현을 억제하는 물질을 제공한다.
본 발명은 또한 clec14a의 CTLD 및 Fc의 융합 단백질을 포함하는, 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 clec14a의 CTLD 및 Fc의 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 clec14a의 CTLD 및 Fc의 융합 단백질 또는 상기 약제학적 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 기술적 특징 및 실시예는 하기 상세한 설명 및 후술하는 청구항에서 보다 명백하게 기술될 것이다.
clec14a의 CTLD가 세포 이동 및 필로포듐 형성에 중요한 역할을 한다는 신규 발견에 기초하여, 본 발명에서는 혈관신생을 억제하는, CTLD에 대한 신규 항체 기능을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 혈관신생을 억제하는데 이용 가능한 신규 타겟 도메인을 제공한다. 더욱이, 본 발명의 항체는 혈관신생 관련 질환 또는 clec14a 매개 암을 예방 또는 치료하는데 효과적일 수 있다.
도 1은 세포 이동에서의 clec14a CTLD의 효과를 나타낸 도면이다. a. 상처 치료 에세이에서 GFP, clec14a-GFP, 또는 clec14a△CTLD-GFP로 트랜스펙션된 COS-7 세포의 이동을 광학현미경을 이용하여 검사하였다. 이미지는 0시간(위) 및 20시간(아래)에 캡쳐하였다. b. 이동 거리는 컨트롤 이동의 퍼센트로 나타내었다. 3개의 독립적인 실험 중 하나로부터 측정한 평균값±SD의 3중 측정치이다.
도 2는 사상위족 형성에서의 clec14a CTLD의 효과를 나타낸 도면이다. GFP, clec14a-GFP 및 clec14a△CTLD-GFP으로 트랜스펙션된 (a) COS-7 세포 (a) 및 (b) HUVECs를 고정시키고 난 후에 로다민 팔로이딘(rhodamine-phalloidin) 및 훽스트(Hoechst)로 염색하고 형광현미경(fluorescence microscopy 1000X)으로 검사하였다. 화살표는 사상위족이 형성된 부위를 나타낸다. 결과는 3개의 독립적인 실험을 대표하는 것으로 나타낸다.
도 3은 인간 및 마우스 CTLDs에 특이적인 scFv 클론의 단리를 나타낸 도면이다. a. 인간 합성 scFv 항체 라이브러리는 Fc 바인더 를 사전에 제거하였으며, 재조합 hCTLD-Fc 또는 mCTLD-Fc으로 선택적인 바이오패닝(biopanning)을 하여 스크리닝하였다. b-d. scFv을 표시하는 96개의 파이지 클론(1-96)을 무작위로 선택하고,상층액을 파지 ELISA로 분석하였다. 선택된 scFv 클론의 인간 및 마우스 CTLDs에 대한 반응성은 450nm에서의 흡광도를 측정하여 검사하였다. 화살표는 hCTLD-Fc(■, 검은색) 및 mCTLD-Fc(■, 회색)에 반응하는 scFv 클론을 나타내고, Fc(□), BSA(▨)에 반응하지 않은 것은 백그라운드 조정에 사용하였다.
도 4는 인간 및 마우스 CTLDs에 대한 clec14a-CTLD IgGs의 교차-종 반응성을 나타낸 도면이다. hCTLD-Fc(■, 검은색) 및 mCTLD-Fc(■, 회색)으로 코팅된 96-웰마이크로타이터 플레이트 상에서의 정제, 선택된 scFv 클론(클론 1-4)으로 ELISA를 실시하였으며, Fc(□) 및 BSA(▨)으로 백그라운드 조정하였다. 3개의 독립적인 실험 중 하나로부터 측정한 평균값±SD의 3중 측정치이다.
도 5는 혈관내피세포 이동 및 튜브 형성에서의 clec14a-CTLD IgGs의 효과를 나타낸 도면이다. a. 상처가 난 후, clec14a-CTLD IgG(클론 1-4) 또는 세툭시맙(cetuximab)의 부재(MOCK) 또는 존재하에 인큐베이션된 HUVECs의 이동을 광현미경을 이용하여 검사하였다. 이미지는 0시간(위) 및 9시간(아래)에 캡쳐하였다. b. 이동 거리는 컨트롤(MOCK) 이동의 퍼센트로 나타내었다. 3개의 독립적인 실험 중 하나로부터 측정한 평균값±SD의 3중 측정치이다. c. clec14a-CTLD IgG(클론 1-4) 또는 세툭시맙(cetuximab)의 부재(MOCK) 또는 존재하에 튜브 형성을 검사하였다. d. 튜브 형성의 정도는 콘트롤(MOCK) 튜브 형성의 퍼센트로 나타내었다. 3개의 독립적인 실험 중 하나로부터 측정한 평균값±SD의 3중 측정치이다.
도 6은 혈관내피세포 증식 및 활성에 대한 clec14a-CTLD IgGs의 효과를 나타낸 도면이다. a. clec14a-CTLD IgGs, 세툭시맙(cetuximab), 또는 5-FU(포지티브 콘트롤)의 부재(MOCK) 또는 존재하에 HUVECs를 2일 동안 인큐베이션했다. 450nm에서 흡광도를 측정함으로써 세포의 생존력을 검사하였다. 2개의 독립적인 실험 중 하나로부터 측정한 평균값±SD의 3중 측정치이다. b. hTNFα, clec14a-CTLD IgGs 또는 세툭시맙(cetuximab)의 부재(쇄선) 또는 존재(실선)하에 HUVECs를 배양하고; 항-VCAM-1(anti-VCAM-1, 위) 또는 ICAM-1(아래) 폴리클로날 항체로 염색하고; 유세포분석기(flow cytometry)로 분석하였다. hTNFα는 내피세포 활성에 대한 포지티브 컨트롤로 사용하였다. 결과는 3개의 독립적인 실험을 대표하는 것으로 나타낸다.
도 7은 clec14a-매개성 세포간 접촉 상의 clec14a-CTLD IgGs의 효과를 나타낸 도면이다. a. GFP 및 clec14a-GFP으로 트랜스펙션된 HEK293F 세포를 clec14a-CTLD IgGs 또는 세툭시맙(cetuximab)의 부재(MOCK) 또는 존재하에 8시간 동안 인큐베이션했다. 세포 응집체(mass>4 cells, 화살표 머리)를 광학현미경을 이용하여 카운트하였다. 필드당 응집체의 수는 b에 나타내었다. b. 3개의 독립적인 실험 중 하나로부터 측정한 평균값±SD의 3중 측정치이다.
도 8은 CTLD-CTLD 상호결합에서의 clec14a-CTLD IgG의 효과를 나타낸 도면이다. a. 항-GFP 또는 항-β-액틴 항체로 면역블러팅(immunoblotting)함으로써 GFP, clec14a-GFP 또는 clec14a△CTLD-GFP으로 트랜스펙션된 COS-7 세포의 용해물(lysates)을 분석하였다. b. GFP(흰색), clec14a-GFP (검은색) 또는 clec14a△CTLD-GFP(밝은 회색)을 발현하는 COS-7 세포를 0.15㎍의 hCTLD-Fc 또는 Fc와 함께 인큐베이션하고 ELISA를 이용하여 CTLD-CTLD 상호결합을 측정하였다. c. GFP 또는 clec14a-GFP으로 트랜스펙션된 COS-7 세포의 용해액을 clec14a-CTLD IgG(클론 1)의 농도를 증가시키면서 예비 인큐베이션시킨 hCTLD-Fc으로 인큐베이션시켰다. 3개의 독립적인 실험 중 하나로부터 측정한 평균값±SD의 3중 측정치이다.
도 9는 혈관내피세포의 표면에서 clec14a의 하향조절에 대한 clec14a-CTLD IgG의 효과를 나타낸 도면이다. a. clec14a-CTLD IgG(클론 1)의 존재(점선) 또는 부재(실선)하에 고정 및 고정하지 않은HUVECs를 인큐베이션하고 유세포분석기로 분석하였다. b. 지정시간 동안 clec14a-CTLD IgG(흰색) 또는 Fc(검은색)와 함께 인큐베이션된 HUVECs의 표면의 clec14a를 세포 ELISA방법으로 검사하였다. 3개의 독립적인 실험 중 하나로부터 측정한 평균값±SD의 3중 측정치이다.
도 10은 clec14a CTLD의 부분 절편에 대한 clec14a-CTLD IgGs의 특이성을 나타낸 도면이다. a. Fc 및 clec14a CTLD의 부분 절편의 융합 단백질. b. Fc 및 clec14a CTLD의 부분 절편의 융합 단백질, wtCTLD-Fc 및 Fc에 대한 클론 1(위쪽 그래프) 및 클론 2(아래쪽 그래프)에 대한 clec14a-CTLD IgGs의 특이성을 각각 나타낸 그래프이다.
도 11은 튜브 형성에 대한 hCTLD-Fc의 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 clec14a(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
바람직하게는 clec14a(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)의 CTLD(C-타입 렉틴 유사 도메인)에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "항체"는 항원을 특이적으로 인식하여 특정 항원에 면역학적으로 반응하는 면역글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자를 의미하며, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 전체 항체(whole antibodies) 및 항체 절편을 포함한다. 또한, 키메라 항체(e.g., 인간화된 쥐 항체), 2가 또는 2중 특이성 분자(bispecific molecules)(e.g., 2중 특이성 항체), 다이어바디(diabodies), 트리어바디(triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies)는 본 발명에 사용되는 항체의 범위에 속한다.
전체 항체(whole antibody)는 경쇄와 중쇄 사이에 이황화 결합(disulfide bond)으로 결합된 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄로 구성되어 있다. 포유류에서는 IgA, IgD, IgE, IgM, 및 IgG로 알려진 5개의 항체 아형이 있으며, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 4개의 아형으로 추가로 분류된다.
용어 "항체 절편(antibody fragment)"은 적어도 항원-결합 성능을 유지하는 절편을 가리키며, Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv을 포함할 수 있다. Fab는 항원 결합 부위를 가진, 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 부위, 경쇄의 불변 도메인, 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)으로 구성되어 있다. Fab'는 중쇄의 CH1 도메인의 C-말단에 적어도 1개의 시스테인 잔기를 추가로 포함한다는 점에서 Fab과 다르다. F(ab')2는 힌지 부위(hinge region)의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 가진 두 개의Fab' 분자로 구성된다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 부위로 구성된 Fv(가변 절편)는 부모 면역글로불린의 원래의 특이성을 포함하는 자강 작은 항체 절편이다. 이황화-안정화된 Fv(Disulfide-stabilized Fv, dsFv)는 이황화 결합을 통하여 경쇄의 가변 부위에 중쇄의 가변 부위를 결합시킴으로써 형성된다. 단쇄 Fv (scFV)는, 중쇄와 경쇄의 각각의 가변부위에서 펩티드 링커에 의하여 공유결합적으로 연결된 Fv이다. 프로테아제(예를 들면, Fab 또는 F(ab')2를 제공하는 파파인(papain) 또는 펩신으로 전체 항체를 프로테아제 처리하여 이들 항체 절편을 얻을 수 있으며, 바람직하게는 유전자 재조합 기술에 의하여 구축할 수 있다.
일반적으로, 항체 스크리닝은 타겟 단백질의 전체 세포외 부위를 이용하여 실시하기 때문에 항체의 분리에 문제점이 발생한다. 본 발명에서는 항체 스크리닝의 타겟 단백질의 기능성 도메인을 사용하여 보다 신속하게 항체를 생성하게 한다. 본 발명의 일 실시예에서, clec14a CTLD가 혈관신생에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였으며, 항체 스크리닝에 사용하였다. 항체 스크리닝의 공정을 도 3a에 도식적으로 도시하였다.
여기에 사용된 용어 "모노클로날 항체(monoclonal antibody)"는 실질적으로 동일한 집단의항체로부터 수득하고, 단일 에피토프에 대한 결합 특이성 및 친화성을 보이는, 균일한 분자 조성을 가진 항체 분자를 의미한다.
일반적으로, 면역글로불린은 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 기본 구조 단위를 가진다. 중쇄 각각은 1개의 가변 부위("부위(region)"로 알려짐) 및 3개의 불변 도메인으로 구성되어 있는 반면에 각각의 경쇄는 1개의 가변 부위 및 1개의 불변 도메인으로 구성되어 있다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 부위는 3개의 상보성-결정 부위(complementarity-determining regions, 이후, "CDRs"로 칭함) 및 4개의 프레임워크 부위를 포함한다. CDRs은 항체의 에피토프에 결합하기 위하여 기능한다. 각 사슬 상의 CDRs는 N 말단으로부터 시작해서 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 순서대로 배열된다. 이들은 위치한 사슬에 의하여 구별된다.
여기에 사용된 용어 "인간 항체(human antibody)"는 CDRs, 프레임워크 부위 등을 포함하여, 전체적으로 인간 면역글로불린의 모든 성분의 아미노산 서열로 구성된 분자이다. 인간 질환의 치료법에서 인간 항체는 적어도 3가지의 잠재적인 장점을 가지고 있다. 첫째, 인간 항체는 인간 면역체계와 보다 바람직하게 상호작용하여 보다 효과적으로 타겟 세포를 파괴하는데, 예를 들면, 보체의존성 세포독성반응(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체의존성 세포-매개 세포독성반응(antibodydependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)이 있다. 또 다른 이점은 인간 면역체계가 인간 항체를 외부 분자로 인식하지 않는다는 것이다. 더욱이 인간 항체의 반감기는 보다 소량 또는 적은 횟수로 투여될 때 조차 인간 순환계에서 자연적으로 발생하는 항체와 유사하다. 그러므로 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간 모노클로날 항체일 수 있으며, clec14a, 바람직하게는 clec14a-매개 혈관신생을 효과적으로 억제하는 인간 내피세포 상에 발현된 clec14a-CTLD에 대한 강력한 친화력을 가질 뿐만 아니라 중쇄 및 경쇄 모두 인간으로부터 유래되어서 낮은 면역원성(immunogenicity)를 가지기 때문에 혈관신생 관련 질환 또는 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
여기에 사용된 용어 "clec14a (C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)"는 C-타입 렉틴/C-타입 렉틴-유사 도메인(CTL/CTLD) 상과(superfamily)의 멤버를 의미한다. Clec14a는 일련의 상피세포성장인자(epidermal growth factor) 유사 도메인인 C-타입 렉틴-유사 도메인(CTLD) 및 스시-유사 도메인(sushi-like domain)을 구성하는 세포외 도메인인 타입 I 막관통단백질(transmembrane protein)이다. clec14a에 대한 정보는 NCBI GenBank와 같은 공인 데이타베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 clec14a는 Gene ID No 161198을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. Clec14a는 세포간 융합 및 혈관신생에 연관되는 것으로 알려져 있으나, 그 구체적인 메커니즘 및 혈관신생의 실질적인 도메인은 아직 확인되지 않고 있다. 본 발명자들은 clec14a의 아미노산 서열 상에서 31번째 아미노산으로부터 172번째 아미노산을 포함하는 도메인이 혈관신생에 중요한 역할을 수행한다는 것을 처음으로 발견하였다.
여기에 사용된 용어 "clec14a(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)의 C-타입 렉틴 유사 도메인(C-type lectin-like domain, CTLD)"은 "clec14a-CTLD" 또는 "clec14a CTLD"로도 기술되며, 모두 동일한 의미이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 혈관신생의 억제에 유용한 에피토프로써 clec14a(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)-CTLD(C-타입 렉틴 유사 도메인)의 단리 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는 clec14a는 인간, 침팬지 또는 마우스로부터 유래할 수 있다.
여기에 사용된 용어 "에피토프(epitope)"는 항원 특이성을 결정하는 부위로, 항원결정기(antigenic determinant) 또는 항원결정부위(antigen determining site)도 동일한 의미로 사용된다. 본 발명의 목적 달성을 위하여, 에피토프는 clec14a의 아미노산 서열 상에서 31번째 아미노산으로부터 172번째 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 가진 CTLD을 가리키는데, 이는 혈관신생의 억제에 유용하거나 또는 CTLD를 가진 동일한 기능을 가진 폴리펩티드를 가리킨다. 따라서, CTLD의 추가 부위를 포함할 수 있다. CTLD와 동일한 역할을 하기만 하면, 모든 폴리펩티드, 예를 들면 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 경우 에피토프로 사용될 수 있다. 인간, 마우스 및 침팬지 CTLDs의 31번째 아미노산으로부터 172번째 아미노산의 아미노산 서열을 표 1에 나타내고, 각각 SEQ ID NOS: 9, 10 및 133로 표시하였다. 본 발명자들은 SEQ ID NOS: 9, 10 및 133의 아미노산 서열이 혈관신생을 억제하는 항체를 생산하는 데에 사용될 수 있는 에피토프로 작용할 수 있다는 것을 처음으로 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, CTLD의 N-말단 또는 C-말단 부위는 혈관신생을 억제하는 항체를 생성하는 데에 사용될 수 있는 에피토프로 작용할 수 있다는 것을 시사하고 있다(도 10b). 바람직하게는 CLTD의 N-말단 부위는 CTLD 내의 1번째 아미노산으로부터 42번째 아미노산까지의 아미노산 절편 또는 CTLD 내의 1번째 아미노산으로부터 62번째 아미노산까지의 아미노산 절편을 포함하는 부위일 수 있다. 바람직하게는 CLTD의 C-말단 부위는 CTLD 내의 82번째 아미노산으로부터 142번째 아미노산까지의 아미노산 절편, CTLD 내의 62번째 아미노산으로부터 142번째 아미노산까지의 아미노산 절편 또는 CTLD 내의 122번째 아미노산으로부터 142번째 아미노산까지의 아미노산 절편을 포함하는 부위일 수 있다.
항체는 clec14a-CTLD 또는 혈관신생을 억제하기 위하여 유효 절편에 특이적으로 결합할 수 있으며, 본 발명자들은 clec14a-CTLD가 CTLD-CTLD 상호결합 의존적인 방식으로 혈관신생을 조절하는 유일한 도메인이라는 것을 시사한다. 첫째, clec14a-CTLD, 특히 31-172의 아미노산은 액틴 세포골격 재배열을 조절함으로써 clec14a-매개 세포 이동에서 중요한 역할을 한다. 둘째, clec14a-CTLD IgG가 clec14a-매개 세포간 접촉을 특이적으로 억제한다는 결과와 일치한다. 셋째, clec14a-CTLD IgG에 의한 clec14a 매개는 HUVEC 이동 및 튜브 형성을 특이적으로 억제한다. 마지막으로, clec14a CTLD-CTLD 복합체의 형성은 clec14a-CTLD IgG에 의하여 특이적으로 억제되었다.
고친화성 clec14a-CTLD IgGs는 혈관내피세포 생존능력 및 활성에 영향을 미치지 않고, 혈관내피세포의 이동 및 튜브 형성을 특이적으로 억제하였다. clec14a는 혈관내피세포 상에 배타적으로 발현되며, 종양 혈관내피세포 특이적인 마커일 수 있다. clec14a-CTLD 항체는 종양 혈관내피 상에 배타적으로 발현되는 clec14a를 표적으로 하여 정상 혈관내피에서는 적은 부작용을 초래하고, clec14a-매개 종양 진행시 혈관신생을억제하는 것으로 보는 것으로 생각된다.
또한, 베바시주맙(bevacizumab) 및 세툭시맙(cetuximab)은 용해성 혈관신생 유발 성장인자(soluble angiogenic growth factors) 및 그 수용체의 상호작용을 억제함으로써 혈관신생을 억제하는 치료용 항체이다. 그러나 상기한 약제의 장기간의 이용은 종양 세포-분비 혈관신생 유발전구성장인자의 과잉으로 인하여 종양에 대한 내성을 나타낸다.이로인해 장기간의 치료를 요하는 환자에게 용해성 성장인자에 대한 항체를 사용하는 것은 최대의 과제로 남아 있다. Clec14a는 내피세포간 접촉을 위하여 결정적인 타입 I 막관통단백질(transmembrane protein)이다. 여기서 개발된 clec14a-CTLD IgG는 농도 의존적인 방식으로 CTLD-CTLD 상호작용을 특이적으로 억제하고, IgG에 의하여 가교결합된 clec14a는 내피세포막 상에 clec14a 하향 조절을 유도하였다. 가교결합 2시간 동안 clec14a-CTLD IgG는 HUVECs 내부의 점 유사 패턴을 보이는데, 이는 항체-유도 내포작용(antibody-induced endocytosis)을 나타낸다. 그래서 clec14a-CTLD IgG는 혈관신생을 억제하는 데에 있어서 2단계에 걸친 작용기전을 가질 수 있다.
따라서, 상기 항체는 바람직하게는 세포 이동, 튜브 형성 또는 세포간 접촉을 억제함으로써, 바람직하게는 clec14a-매개 세포 이동, 튜브 형성 또는 혈관내피세포 표면 상의 clec14a의 하향조절을 유도함으로써 혈관신생을 억제할 수 있다.
혈관내피세포의 생존능력 및 활성에 대한 영향이 없어(도 6A 및 6B), 본 발명의 항체는 치료용 항체로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 clec14a-CTLD IgG는 혈관내피세포 이동(도 5a 및 5b) 및 튜브 형성(도 5c 및 5d)을 억제하고, clec14a-매개 세포간 접촉(도 7a 및 7b)을 특이적으로 억제하는 것을 확인되었으며, 이는 상기 항체가 종양 혈관신생시 혈관내피세포간 접촉을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한 clec14a CTLD-CTLD 상호작용은 clec14a-CTLD IgG에 의하여 억제되었다(도 8a, 8b 및 8c). 더욱이 본 발명의 항체는 HUVEC의 표면 상에서 clec14a의 하향조절을 유도하는 것으로 나타났다(도 9a 및 9b), 이들 결과는 본 발명의 항체가 clec14a-매개 혈관신생을 효과적으로 억제하여 혈관신생 관련 질환 또는 암을 치료하는 데에 적용될 수 있다는 것을 시사하고 있다.
바람직하게는, 본원 발명의 항체는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위, 및 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항체를 코딩하는 핵산은 상기 핵산은 SEQ ID NO: 70의 중쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 72의 중쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 74의 중쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 중쇄 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 77의 경쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 79의 경쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 81의 경쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 경쇄 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위로 구성되며, 이를 클론 1이라 정한다. 상기 항체를 코딩하는 핵산은 중쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 133의 핵산 서열 및 경쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 134의 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 일 실시예에서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위, 및 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 51의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO: 126의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 130의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항체를 코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 84의 중쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 86의 중쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 88의 중쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 중쇄 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 91의 경쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 93의 경쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 95의 경쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 경쇄 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 인간 모노클로날 항체는 SEQ ID NO: 126의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 130의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위를 포함하는 항체; SEQ ID NO: 127의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 131의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위를 포함하는 항체; 및 SEQ ID NO: 128의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 132의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위로 구성되며, 이를 클론 2라 정한다. 상기 항체를 코딩하는 핵산은 중쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 135의 핵산 서열 및 경쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 136의 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위, 및 SEQ ID NO: 56의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 127의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 131의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 항체를 코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 98의 중쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 100의 중쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 102의 중쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 중쇄 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 105의 경쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 107의 경쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 109의 경쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 경쇄 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 인간 모노클로날 항체는 SEQ ID NO: 127의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 131의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위로 구성되며, 이를 클론 3이라 정한다. 상기 항체를 코딩하는 핵산은 중쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 137의 핵산 서열 및 경쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 138의 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위, 및 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 128의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 132의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 항체를 코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 112의 중쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 114의 중쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 116의 중쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 중쇄 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 119의 경쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 121의 경쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 123의 경쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 경쇄 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 인간 모노클로날 항체는 SEQ ID NO: 128의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 132의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위로 구성되며, 이를 클론 4라 정한다. 상기 항체를 코딩하는 핵산은 중쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 139의 핵산 서열 및 경쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 140의 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기와 같이, clec14a-CTLD을 특이적으로 인식하는 한, 이종 서열(heterogeneous sequences)로 구성된 항체가 혈관신생을 억제하는 것으로 나타났다. 그러므로 혈관신생 관련 질환 또는 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 작용하는 것을 확인하였다. 본 발명의 항체가 일정한 도메인을 포함할 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 또는 이들의 조합 또는 하이브리드로부터 유래할 수 있다.
여기에 사용된 "조합(combination)"은 동일한 기원의 단쇄 면역글로불린 Fc 절편을 코딩하는 폴리펩티드가 다른 기원의 단쇄 폴리펩티드에 결합되어 다이머 또는 멀티머를 생성하는 것을 의미한다. 이는 다이머 또는 멀티머는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 도메인으로 구성된 군에서 선택된 2개 또는 그 이상의 불변 도메인으로부터 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
여기에 사용된 용어 "하이브리드(hybrid)"는 다른 기원의 2개 또는 그 이상의 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열이 단쇄 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 내에 존재한다는 것을 의미한다. 예를 들면, 도메인 하이브리드는 CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 구성된 군에서 선택된 1개 내지 4개의 도메인으로 구성될 수 있다. 또한, 하이브리드의 조합은 IgG 아형인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄 불변 도메인으로부터 생성될 수 있다. 하이브리드의 조합은 상기에 정의한 바와 같다.
또한, 본 발명의 항체는 경쇄 불변 부위를 더욱 포함할 수 있으며, 람다(λ) 또는 카파(κ) 경쇄로부터 유래할 수 있다.
바람직하게는 상기 항체는 인간 clec14a-CTLD 뿐만 아니라 쥐과 clec14a-CTLD에 특이적으로 결합하여 혈관신생을 억제할 수 있는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 인간 및 마우스 모두에서 기능하는 인간 항체의 능력, 다시 말해서 교차 반응성(cross-reactivity)은 인간 항체가 마우스 내에서 임상 전 연구가 가능하게 해 주는 이점을 제공한다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 또는 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, clec14a (C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A), 바람직하게는 인간 clec14a-CTLD(C-타입 렉틴 유사 도메인) 또는 인간 및 쥐과 clec14a-CTLD에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 항체는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 상기 항체를 제조하는 방법은 기능성 도메인을 사용하여 바이오패닝(biopanning)하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 숙주 세포를 배양하여 상기 항체를 생산하도록 핵산이 발현되는 단계를 포함하는 상기 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 모노클로날 항체는 공지의 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 실례를 들자면, 모노클로날 항체는 면역화된 동물의 B 림프구(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495)로 제작한 하이브리도마, 또는 파지 디스플레이지 기술(phage display technology)에 의하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명의 모노클로날 항체는 파지 디스플레이 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명에 의한 방법은 예를 들면, Barbas et al. (METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119, 1991 and J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9), 및 Winter et al. (Ann. Rev. Immunol. 12:433, 1994)를 참고하여 단계별로 실시될 수 있다. 항체 라이브러리를 제작하는 데에 유용한 파지는 사상파지(filamentous phage)일 수 있으며, 예를 들면, fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 및 Pf3이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사상 파지의 표면 상에 외부 유전자(exogenous genes)를 발현하기 위하여 사용할 수 있는 벡터의 예로는 fUSE5, fAFF1, fdCAT1 및 fdtetDOG와 같은 파지 벡터, 또는 pHEN1, pComb3, pComb8 및 pSEX와 같은 파지미드(phagemid) 벡터를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 증폭용 재조합 파지의 성공적인 재감염을 위해 필요한 코트 단백질의 야생형 버전을 공급하는 데 헬퍼 파지(helper phage)를 사용하며, M13K07 및 VSCM13를 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 하이브리도마-유래 모노클로날 항체 또는 파지 디스플레이 클론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일반적인 공정에 의하여 용이하게 단리 및 시퀀싱할 수 있다. 예를 들면, 하이브리도마 또는 파지 템플레이트 DNA의 중쇄 및 경쇄 코딩 부위를 특이적으로 증폭시키기 위하여 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용될 수 있다. 일단 단리되면, 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있으며, 이후 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 그 결과 제조된 숙주 세포(즉, 형질전환체)는 목적하는 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 제조방법은 상기 항체를 위해 폴리뉴클레오티드 코딩을 수행할 발현벡터를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게 재조합 항체는 인간 scFv 라이브러리로부터 Fc 바인더를 선제거(pre-clearing)하고, 기능성 도메인으로 바이오패닝 기술을 수행함으로써, 특정 클론을 선택하여 제조할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 에피토프 또는 상기 항체용 폴리뉴클레오티드 코딩, 상기 폴리뉴클레오티드를 전달하는 발현벡터, 및 상기 벡터 내로 고정시키는 형질전환체를 제공한다.
항체는 상기에서 기술한 바와 같다.
본 발명에 의하여 상기 에피토프 또는 상기 항체를 전달하는 발현벡터는 포유세포(예를 들면, 인간, 원숭이, 토끼, 쥐, 햄스터, 마우스 등), 식물세포, 이스트, 곤충세포 및 박테리아세포(예를 들면, E. coli)와 같은 진핵 또는 원핵세포 내에 폴리뉴클레오티드의 복제 및/또는 발현을 하도록 하는 벡터를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게, 벡터는 관심 유전자의 발현을 유도하도록 하기 위하여 폴리뉴클레오티드로 사용 가능하게 연결된 적절한 프로모터, 및 적어도 하나 이상의 선택마커를 가질 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 파지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체(mini-chromosome), 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 내로 도입될 수 있다.
항체에 대한 폴리뉴클레오티드 코딩을 수행하는 발현벡터는 상기 항체의 중쇄 및 상기 항체의 경쇄 각각에 대한 폴리뉴클레오티드 코딩을 수행하는 발현벡터, 또는 상기 항체의 중쇄 및 상기 항체의 경쇄에 대한 폴리뉴클레오티드 코딩을 전달하는 발현벡터의 조합일 수 있다.
본 발명에 따른 발현벡터의 도입으로 생성된 형질전환체의 예로는 대장균, 스트렙토마이세스(streptomyces), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)와 같은 박테리아 세포; 이스트; 피치아 파스토리아(Pichia pastoria)와 같은 균류; 초파리(drosophila), 스포도프테라 Sf9(spodoptera Sf9)와 같은 곤충세포; CHO (중국 햄스터 난소세포주, Chinese hamster ovary cells), SP2/0 (마우스 골수종, mouse myeloma), 인간 림프아구성(human lymphoblastoid), COS, NSO (마우스 골수종, mouse myeloma), 293T, 악성 흑색종 세포(melanoma cells), HT-1080, BHK (새끼 햄스터 신장 세포, baby hamster kidney cells), HEK (인간 배아 신장 세포, human embryonic kidney cells), 및 PERC.6 (인간 망막 세포, human retina cell)와 같은 동물세포; 및 식물세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
여기에 사용된 용어 "도입(introduction)"은 세포 내로 상기 에피토프 또는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전달을 의미한다. 칼슘 포스페이트-DNA 공침법(calcium phosphate-DNA co-precipitation), DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션(DEAE-dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개 트랜스펙션(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 미세주입법(microinjection), 리포솜 융합법(liposome fusion), 리포펙타민 트랜스펙션(Lipofectamine transfection) 및 원형질 융합법(protoplast fusion)을 포함한 본 분야에서의 다양한 공지기술을 사용하여 도입을 실시할 수 있다. 형질도입(transduction)은 외래 DNA가 감염을 근거로 바이러스 벡터를 통하여 다른 세포로 전달되는 공정을 가리킨다. 또한, 숙주 세포 내로 벡터의 전달은 유전자 충격(gene bombardment)에 의하여 달성될 수 있다. 본 발명에서, 도입은 형질전환(transformation)과 교체하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체를 포함하는 혈관신생 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의한 항체가 혈관신생을 효과적으로 억제할 수 있기 때문에, 상기 항체를 유효성분으로서 포함하는 조성물도 혈관신생을 억제하는 데에 유용하며, 추가로 혈관신생 관련 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용할 수 있다.
여기에 사용된 용어 "혈관신생의 억제(suppression of angiogenesis)"는 이전에 존재한 관으로부터 새로운 혈관의 형성 또는 성장을 억제하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적을 위하여, 혈관신생의 억제는 세포 이동, 세포간 접촉을 억제, 보다 바람직하게는 clec14a-매개 세포 이동, clec14a-매개 세포간 접촉, HUVEC 이동, 또는 튜브 형성, clec14a CLTD-CLTD 복합체 형성을 억제함으로써 달성된다.
여기에 사용된 용어 "혈관신생 관련 질환(angiogenesis-related disease)"은 혈관신생의 발생 또는 진행과 관련된 질환을 의미한다. 상기 항체로 치료될 수 있다면, 그 질병은 한정 없이 혈관신생 관련 질환의 범위에 포함될 수 있다. 혈관신생 관련 질환의 예로는 암, 전이(metastasis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성(macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맹경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 암은 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)으로 구성된 군에서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
여기에 사용된 용어 "예방(prevention or prophylaxis)"은 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여하여 관심 질환의 시작을 억제 또는 지연하게 하는 모든 조치를 가리킨다. 용어 "치료(treatment or therapy)"는 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여하여 관심 질환의 증상이 개선되거나 증상이 호전되게 하는 모든 조치를 가리킨다.
본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 바람직하게는 약제학적 조성물이고, 본 분야에서 전형적으로 사용되는 적절한 비히클, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약제학적 조성물은 정제, 알약, 분말, 과립제, 캡슐제, 서스펜션, 내복용액, 에멀젼, 시럽, 멸균수용액, 비수용액, 서스펜션, 동결건조물(lyophilizates) 및 좌약과 같은 다양한 경구 또는 비경구 복용형태일 수 있다. 관련하여 본 발명의 약제학적 조성물은 필러, 증점제, 바인더, 습윤제, 정제분해물질(disintegrant), 계면활성제 등과 같은 희석제 또는 부형제로 조합하여 제형화될 수 있다. 경구 투여를 위한 고상 조제는 정제, 알약, 분말, 과립제, 캡슐제 등과 같은 형태일 수 있다. 이들 고상제와 관련하여 본 발명의 화합물은 녹말, 칼슘 카보네이트, 수크로즈, 락토오즈, 또는 젤라틴과 같은 하나 이상의 부형제를 조합하여 제형화될 수 있다. 간단한 부형제, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제를 추가로 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 조제는 서스펜션, 내복용액, 에멀젼, 시럽 등일 수 있다. 물 또는 액체 파라핀과 같은 간단한 희석제, 습윤제, 감미제, 방향족, 방부제 등과 같은 다양한 부형제를 액체 조제 내에 포함시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균수용액, 비수용성 용매, 서스펜션, 에멀젼, 동결건조물, 좌약 등과 같은 비경구 복용 형태일 수 있다. 주입가능한 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름 및 에틸 올레에이트와 같은 에스테르가 비수용성 용매 및 서스펜션에 적합할 수 있다. 좌약의 기본 물질은 위텝졸(Witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈 61(Tween 61), 카카오버터(cacao butter), 라우린버터(laurin butter) 및 글리세로젤라틴(glycerogelatin)을 포함한다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다.
여기에 사용된 용어 "약제학적으로 유효한 양(pharmaceutically effective amount)"은 모든 의학적 치료에 적용가능한 합당한 이익과 위험 비율(benefit/risk ratio)로 충분한 질환 치료용 약제학적 조성물의 양을 가리킨다. 유효량은 치료해야 할 질환의 중증도, 환자의 나이 및 성별, 질환의 종류, 약제의 활성도, 약제에 대한 민감도, 투여시간, 투여경로, 분비속도, 치료기간, 약제의 공투여 및 본 분야에서 알려진 다른 파라미터를 포함한 다양한 요인에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 투여될 수 있다. 이와 같은 경우에, 종래의 치료법과 함께 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1회량 또는 다회 용량으로 나누어서 투여될 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 복용량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경된다. 조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 랫, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유류 내로 전형적으로 허용된 경로, 예를 들면, 경구로, 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체 또는 상기 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생을 억제하는 방법에 관한 것이다.
상기 항체, 상기 조성물 및 혈관신생 억제는 상기에 기술한 바와 같다.
상세하게 설명하자면, 본 발명의 억제방법은 혈관신생의 억제를 필요로 하는 개체에 약제학적으로 유효한 양의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫, 닭 및 인간과 같은 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약제학적 조성물은 비경구적으로(parenterally), 피하로(subcutaneously), 복강내로(intraperitoneally), 폐내로(intrapulmonarily) 또는 코내로(intranasally), 필요하다면, 국소치료를 위해 병변내(intralesional) 투여를 포함하는 적절한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 복용량은 개체의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변하며, 본 분야의 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
용어 '항체', '예방' 및 '치료'는 상기에 언급한 바와 같다.
본 발명의 펩티드로 치료 가능하다면, 암은 제한되지 않는다. clec14a-매개 종양 진행이 발생되는 암이바람직하다. 상세하게는 본 발명의 항체는 혈관신생을 억제함으로써 암의 발생 또는 진행을 예방할 수 있다. 암의 예로는 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), `고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 항체는 다른 항체 또는 생물학적 활성제 또는 다양한 목적을 위한 물질과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 항체는 혈관신생을 억제하여 암의 발생 또는 진행을 지연시키거나 예방하는 것으로 나타났다. 그렇기 때문에, 본 발명의 항체는 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 적용가능하다.
본 발명은 또 다른 관점에서 항체 또는 약제학적 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
항체, 조성물 및 암은 상기에 언급한 바와 같다.
치료법에서, 상기 약제학적 조성물은 암 의심 개체에 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫, 닭 및 인간과 같은 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약제학적 조성물은 비경구적으로(parenterally), 피하로(subcutaneously), 복강내로(intraperitoneally), 폐내로(intrapulmonarily) 또는 코내로(intranasally), 필요하다면, 국소치료를 위해 장애내(intralesional) 투여를 포함하는 적절한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 복용량은 개체의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변하며, 본 분야의 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 항체 및 암은 상기에 기술한 바와 같다.
clec14a이 특이적으로 발현된 암이 바람직하다.
여기에 사용된 용어 "진단(diagnosis)"은 병리적 상태의 존재 또는 성질의 평가를 가리킨다. 본 발명의 목적과 관련하여 진단은 암의 발생을 결정하는 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 진단용 조성물을 포함하는 암 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 암, clec14a, 바람직하게는 clec14a CTLD의 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 검출 키트는 분석법에 적합한 하나 또는 그 이상의 조성물, 용액, 또는 기기뿐만 아니라, 상기 마커를 선택적으로 인식하는 항체를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 진단 키트는 매트릭스, 적절한 버퍼 용액, 컬러링 효소 (coloring enzyme) 또는 형광물질로 라벨링된 2차 항체, 항체의 면역학적 검출을 위한 칼라링 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 매트릭스에 대해서는, 니트로셀룰로오스 멤브레인, 폴리비닐수지로 제조된 96웰 플레이트, 폴리스티렌수지로 제조된 96웰 플레이트, 및 슬라이드 글라스가 사용될 수 있다. 컬러링 효소에 대해서는 퍼옥시다아제 및 염기성 포스파타제가 사용될 수 있다. 형광물질에 대해서는 FITC 및 RITC가 사용될 수 있으며, 컬러링 기질 용액에 대해서는 ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)), OPD (o-phenylenediamine), 또는 TMB (tetramethyl benzidine)이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암 의심 개체로부터 단리된 생물학적 시료 내의 항원-항체 복합체를 통하여 clec14a 바람직하게는 clec14a-CLTD를 검출하는 단계를 포함하는 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
항체, 암, 및 진단은 상기에 기술한 바와 같다.
더욱 상세하게는 생물학적 시료로부터 단백질을 단리하는 것은 공지의 방법을 사용하여 달성할 수 있다.
여기에 사용된 용어 "생물학적 시료(biological sample)"는 암 마커 clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD의 발현 정도에서의 차이를 표시하는 시료를 포함하고. 예를 들어 조직, 세포, 전혈, 혈청, 플라스마, 침, 가래, 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 또는 소변일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
검출법에 대해서는 정상 대조군과 암 의심 환자의 clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD 발현 정도를 비교함으로써 암의 발생을 진단할 수 있다. 이는 정상 세포와 암 의심 세포에서 본 발명에 따른 마커의 발현정도를 비교하는 것이다. 만약에 암 의심 세포에서 마커 발현정도가 상당히 증가하는 것으로확인되었다면, 추측된 암은 암으로 진단할 수 있다.
단백질 레벨을 측정하는 분석법으로는 웨스턴 블로팅(Western blotting), ELISA, 방사성면역측정법(radioimmunoassay), 방사성면역확산법(radialimmunodiffusion), 오크터로니 면역확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로켓면역전기영동법(rocket immunoelectrophoresis), 이뮤노히스토스테이닝(immunohistostaining), 면역침강반응 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 분석법에 대해서는 형성된 항원-항체 복합체의 양에 대하여 정상 컨트롤과 암 의심 환자를 비교하고, 암 마커 유전자의 단백질의 발현 정도에 있어서 상당하게 증가한 것을 평가함으로써 암 의심 환자를 진단한다.
여기에 사용된 "항원-항체 복합체(antigen-antibody complexes)"는 거기에 특이적인 항체에 암 마커 단백질의 생성물이 결합하는 것을 가리킨다. 검출 라벨의 신호 강도를 측정함으로써 형성된 항원-항체 복합체의 양을 정량적으로 결정할 수 있다.
상기 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 마이크로입자, 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 본 발명은 상기 실례에 한정되는 것은 아니다. 검출 라벨로 사용가능한 효소의 예로는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase), β-D-글루코시다아제(β-D-glucosidase), β-D-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 유라제(urase), 퍼옥시다아제(peroxidase) 또는 염기성 포스파타아제(alkaline phosphatase), 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase), 글루코즈 옥시다아제(glucose oxidase), 헥소키나아제(hexokinase) 및 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다아제(glucose oxidase) 및 루시페라아제(luciferase), 포스포프룩토키나아제(phosphofrutokinase), 포스포에놀피루브산 카르복실화효소(phosphoenolpyruvate carboxylase), 아스파르트산 아미노기전달효소(aspartate aminotransferase), 포스포에놀피루브산 탈탄산효소(phosphenolpyruvate decarboxylase) 및 β-락타마아제(β-latamase)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형광물질의 예로는 플루오레세인(fluorescein), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin), 오프타알데히드(ophthaldehyde) 및 플루오레사민(fluorescamine)을 포함하나, 이에한정되는 것은 아니다. 리간드의 예로는 비오틴 유도체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 발광물질은 아크리디늄에스테르(acridinium esters), 루시페린(luciferin) 및 루시페라아제(luciferase)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 마이크로입자의 예로는 금콜로이드(colloidal gold) 및 유색 라텍스(colored latex)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 레독스 분자의 예로는 페로센(ferrocene), 광전하 발생체(ruthenium complexes), 비올로겐(viologen), 퀴논(quinone), Ti 이온, Cs 이온, 디아미드(diimide), 1,4-벤조퀴논(1,4-benzoquinone), 하이드로퀴논(hydroquinone), K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, 및 [MO(CN)8]4-을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 방사성 동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 186Re를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게, 단백질 발현정도는 ELISA에 의하여 측정된다. ELISA의 예로는 고상 지지체 상에 고정화된 항원을 인식하는 라벨링된 항체를 이용하는 직접 ELISA, 고상 지지체 상에 고정화된 항원과 복합체를형성하는 캡쳐 항체를 인식하는 라벨링된 항체를 이용하는간접 ELISA, 고상 지지체 상에 고정화된 항원-항체 복합체의 항원을 인식하는 다른 라벨링된 항체를 이용하는 직접 샌드위치 ELISA, 및 고상 지지체 상에 고정화된 항원-항체 복합체의 항원을 인식하는 다른 라벨링된 항체를 반응시키고, 다른 라벨링된 항체를 인식하는 2차 라벨링된 항체를 사용하는 간접 샌드위치 ELISA를 포함한다. 더욱 바람직하게,단백질 발현 정도는 샌드위치 ELISA에 의해 검출되는데, 시료가 고상 지지체 상에 고정화된 항체와 반응하고, 제조된 항원-항체 복합체는 항원에 특이적인 라벨링된 항체를 첨가한 다음 효소발색(enzymatic color development)하거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인식하는 항체에 특이적인 2차 라벨링된 항체를 첨가한 다음 효소발색하여 검출된다. 암 마커 단백질 및 이에 대한 항체의 복합체 형성 정도를 측정함으로써 암의 발생을 진단할 수 있다.
또한, 단백질의 발현정도는 바람직하게 하나 또는 그 이상의 항체를 상기 암 마커에 사용하는 웨스턴 블로팅에 의하여 측정된다. 총 단백질은 시료로부터 단리되고, 전기영동하여 사이즈 별로 분리하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인 상으로 이동시킨 다음, 항체와 반응시킨다. 유전자 발현에 의하여 생성되는 단백질의 양은 라벨링된 항체를 사용하여 생성된 항원-항체 복합체의 양을 측정함으로써 결정하고, 암의 발생을 진단한다. 검출법은 컨트롤의 마커 유전자와 암이 발생하는 세포의 발현정도를 평가하는 방법으로 구성되어 있다. mRNA 또는 단백질 정도는 마커 단백질의 양에 있어서 절대적인(예를 들면, ㎍/㎖) 또는 상대적인(예를 들면, 신호의 상대적인 강도) 차로 나타낼 수 있다.
또한, 단백질 발현 정도는 암 마커에 대한 하나 또는 그 이상의 항체를 사용하는 면역조직염색에 의하여 바람직하게 측정된다. 정상 내피조직 및 암 의심 조직을 수집하고 고정시키고 나서 파라핀 포매 블록을 공지된 방법에 의하여 준비하였다. 블록을 작은 섹션(수 ㎛의 두께)으로 자르고, 공지된 방법에 따라 선택된 하나 또는 그 이상의 항체와 반응하게 될 글라스 슬라이드에 부착시켰다.
이어서, 미반응된 항체를 세척하고, 반응한 항체를 상기 언급된 라벨에서 선택된 검출 라벨로 라벨링하고 현미경으로 관찰하였다.
암 마커에 대한 하나 또는 그 이상의 항체가 배열되고, 기질 상에 예정된 위치에서 고밀도로 고정되는 단백질 칩을 이용하여 단백질 레벨을 분석하는 것 또한 바람직하다. 이와 관련하여, 단백질을 시료에서 분리하고, 단백질 칩으로 하이브리제이션하여 항원-항체 복합체를 형성하고, 관심 단백질의 존재 또는 발현 정도를 검사하기 위하여 해독하여 암의 발생을 진단한다.
본 발명은 또 다른 관점에서 clec14a의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 혈관신생 억제용 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는 상기 물질은 clec14a CTLD의 발현을 억제하는 물질일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 세포 이동 및 튜브 형성(예를 들면, 사상위족 형성)을 억제하는 데에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다(도 1a, 1b, 2a 및 2b). 이러한 결과는 clec14a 바람직하게는 clec14a CTLD의 발현을 억제하는 물질이 혈관신생을 억제한다는 것을 시사한다.
clec14a 바람직하게는 clec14a CTLD의 발현을 억제하는 물질은 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides), siRNA 올리고뉴클레오티드, 항체, 압타머(aptamers), 단쇄 가변부위 절편(single chain variable region fragments), 펩티드, 저분자량 화합물 및 자연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, clec14a 바람직하게 clec14a CTLD의 발현을 억제하는 물질은 clec14a 유전자, 바람직하게 clec14a CTLD 유전자의 발현을 억제하는 물질에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 올리고뉴클레오티드이다.
여기에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)"는 특정 mRNA 서열에 대하여 상보적인 핵산 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 또는 이의 유도체를 의미하며, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA에서 단백질로의 번역을 억제한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD mRNA에 상보적인 DNA 또는 RNA 서열일 수 있고, clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD mRNA에 결합할 수 있고, clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD mRNA의 번역, 세포질 전위(cytoplasmic translocation) 또는 성숙 또는 전체 생물학적 기능에 대하여 필수적인 다른 모든 활성을 억제할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 6~100 염기, 바람직하게는 8~60 염기, 더욱 바람직하게는 10~40 염기의 길이를 가진다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 효율을 향상시키기 위하여 하나 또는 그 이상의 염기, 당 또는 백본 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 올리고뉴클레오티드 백본은, 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioates), 포스포트리에스테르(phosphotriesters), 메틸 포스포네이트(methyl phosphonates), 단쇄 알킬(short chain alkyl), 사이클로알킬(cycloalkyl) 또는 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 당내 결합(short chain heteroatomic or heterocyclic intersugar linkages)으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 치환된 당 작용기를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한, 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형 염기의 예로는 하이포크산틴(hypoxanthine), 6-메틸아데닌(6-methyladenine), 5-메틸-피리미딘(5-methyl-pyrimidines) (특히, 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(5-hydroxymethylcytosine, HMC), 글리코실 HMC(glycosyl HMC), 젠티오바이오실 HMC(gentiobiosyl HMC), 2-아미노아데닌(2-aminoadenine), 2-티오우라실(2-thiouracil), 2-티오티민(2-thiothymine), 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-하이드록시메틸우라실(5-hyroxymethyluracil), 8-아자구아닌(8-azaguanine), 7-데아자구아닌(7-deazaguanine), N6 (6-아미노헥실) 아데닌, 및 2,6-디아미뉴퓨린(2,6-diaminopurine)을 포함한다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 작용기 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성 및 세포 업테이크를 증강시키는 콘쥬게이트에 화학적으로 결합될 수 있다. 예를 들면, 친유성 작용기(liphophilic moieties)는 콜레스테롤 작용기(cholesterol moiety), 콜레스테릴 작용기(cholesteryl moiety), 콜린산(cholic acid), 티오에테르(thioether), 티오콜레스테롤(thiocholesterol), 지방쇄(aliphatic chain), 인지질(phospholipid), 폴리아민 사슬(polyamine chain), 폴리에틸렌글리콜 사슬(polyethylene glycol chain), 아다만탄 아세트산(adamantane acetic acid), 팔미틸 작용기(palmityl moiety), 옥타데실아민 작용기(octadecylamine moiety) 및 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 작용기(hexylamino-carbonyl-oxycholesterol moiety)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 지질 작용기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법은 본 분야에서 공지되었다(미국특허 Nos. 5,138,045, 5,218,105 및 5,459,255). 변형된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제의 존재하에 증강된 안정성 및 타겟 mRNA에 대한 증강된 결합 친화도를 가질 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 일반적인 방법으로 생체외에서 합성되어 신체에 투여될 수 있으며, 생체내에서 합성될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생체외에서 합성하는 방법은 RNA 폴리머라아제 I를 이용한다. 안티센스 RNA를 생체내에서 합성하는 방법은 반대 방향으로 멀티클로닝 부위(multicloning site, MCS)를 포함하는 벡터를 이용하여 안티센스 RNA의 전사를 실시하는 것을 포함한다. 상기 안티센스 RNA는 바람직하게는 펩티드 서열 내로의 번역을 차단하기 위하여 그 서열 내에 번역 정지 코돈(translation stop codon)를 포함한다.
본 발명에서 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인은 clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD의 뉴클레오티드 서열을 참고하여 본 분야의 공지의 방법에 의하여 용이하게 수행될 수 있다(Weiss, B. (ed.): Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA: Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997; Weiss, B., et al., Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. Cell. Mol. Life Sci., 55:334-358(1999)).
여기에 사용된 용어 "siRNA"는 RNA 간섭 또는 유전자 침묵화(gene silencing)를 매개할 수 있는 핵산 분자를 가리킨다(참고문헌: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 and WO 00/44914). siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에, 유전자 넉다운(gene knockdown) 또는 유전자 치료법의 효과적인 방법을 제공한다. 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견된 siRNA는 최근 개발되어 포유류 세포의 연구에 사용되고 있다.
본 발명의 siRNA 분자가 사용되는 경우에, 센스 스트랜드(clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD mRNA 서열에 대응되는 서열) 및 그 안티센스 스트랜드(clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD mRNA 서열에 상보적인 서열)이 이중 스트랜드를 형성하는 구조를 가질 수 있다. 그렇지 않으면 자기-상보적인 센스 및 안티센스 스트랜드를 가진 단일 스트랜드 구조를 가질 수 있다.
siRNA는 이중 스트랜드 RNA 작용기가 완전한 쌍을 구성하는 것에 한정되지 않고, 미스매치(mismatch, 상보적이지 않은 염기에 대응됨), 벌지(bulge, 한 사슬 내의 염기에 대응되지 않음)와 같은 쌍을 형성하지 않는 작용기를 포함한다. siRNA의 총 길이는 10~100 염기, 바람직하게는 15~80 염기, 더욱 바람직하게는 20~70 염기일 수 있다.
siRNA의 말단은 RNA 간섭(RNAi)을 통하여 clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD 유전자의 발현을 억제할 수 있다면 끝이 무디거나 응집성일 수 있다. 응집성 말단은 3'- 또는 5'- 응집성 말단 중 하나일 수 있다.
본 발명에서, siRNA 분자는 자기-상보적인 센스 및 안티센스 스트랜드 사이에 삽입된 짧은 뉴클레오티드 서열(예를 들면, 약 5-15개의 뉴클레오티드)을 가질 수 있다. 이 경우에 뉴클레오티드 서열의 발현으로부터 형성된 siRNA 분자는 분자간 하이브리다이제이션을 통하여 헤어핀 구조(hairpin structure)를 형성하고, 결국 전체적으로 스템-룹 구조(stem-and-loop structure)를 형성한다. 스템-룹 구조(stem-and-loop structure)는 생체외 또는 생체내에서 가공되어 RNAi을 조절할 수 있는 활성화된 siRNA 분자를 생성한다.
여기에 사용된 용어 "압타머(aptamer)"는 특정 타겟 분자에 대하여 결합 친화도를 가진 핵산 분자를 가리킨다. 또한, 압타머는 특정 타겟 분자에 결합함으로써 특정 타겟 분자의 활성을 억제할 수 있다. 본 발명의 압타머는 RNA, DNA, 변형 핵산 또는 그 혼합물일 수 있다. 본 발명의 압타머는 또한, 선형 또는 환상형(circular form)일 수 있다. 본 발명의 압타머는 특히 그 길이에 한정되지 않는다. 전형적으로 약 15~200개, 예를 들면, 약 100개 이하의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 80개 이하의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 60개 이하의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 약 45개 이하의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 압타머는 또한, 약 18, 20 또는 25개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 뉴클레오티드의 총 수가 보다 작을수록, 화학 합성 및 대량 생산이 보다 쉬우며, 비용 면에서도 주요한 장점이 있다. 화학변형 또한 용이하고, 체내의 안정성이 높고 독성은 낮다.
본 발명의 압타머는 SELEX법 또는 그 개정판을 이용하여 제조할 수 있다(예를 들면, Ellington et al., Nature, 1990 346, 818-822; Tuerk et al., Science, 1990 249, 505-510). SELEX법은10~14개의 다른 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드 풀(oligonucleotide pool)로부터 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 선택하는 방법이다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 약 40 잔기의 무작위 서열을 가지며, 프라이머 서열의 측면에 위치해 있다(flanked by). 이 올리고뉴클레오티드 풀은 타겟 분자와 혼합되도록 되어 있으며, 타겟 분자에 결합된 RNA만을 필터 등을 이용하여 수집된다. 수집된 올리고뉴클레오티드는 RT-PCR에 의하여 증폭되고, 이것은 차회를 위해 템플레이트로 사용된다. 상기 조작을 약 10회 반복함으로써 타겟 분자에 특이적으로 결합한 압타머를 얻을 수 있다. 라운드 수를 증가시키거나 경쟁물질을 사용함으로써 타겟 분자에 대해 강력한 결합 포텐셜을 보이는 압타머는 농축 및 선택된다. 그리하여 SELEX의 라운드 수를 조절하고/하거나 경쟁 조건을 조절시킴으로써 다른 결합력 또는 결합 모드를 가진 압타머, 및 동일한 결합력 또는 결합 모드를 가지나 다른 염기 서열을 가진 압타머를 몇몇 경우에서 얻을 수 있다. SELEX법은 PCT에 의한 증폭 공정을 포함한다; 공정 중에 망간 이온 등을 이용하여 돌연변이를 일으킴으로써 보다 높은 다양성을 가진 SELEX을 수행하는 것이 가능하다.
공지의 SELEX법에 더하여, 복합체 타겟, 생세포 또는 조직에 대한 압타머 세포-셀렉스 방법(Cell-SELEX method)을 이용하여 압타머 또한 얻을 수 있고(Guo et al. Int. J. Mol. Sci., 9(4): 668, 2008), 세포-셀렉스 방법은 표면 상의 타겟 분자의 예전 지식 없이 질환에 대하여 압타머를 직접 선택하는 장점이 있다. 더욱이 단리될 때 고유의 성질을 보이지 않을 수 있으므로, 선택과정 중에 생리학적 상태에서의 타겟 단백질에 대한 기능적인 접근이 가능하다는 측면에서 세포-셀렉스 방법은 종래의 셀렉스 방법에 비하여 유리하다.
한편, 압타머는 포스페이트기의 음전하를 기초로 한 이온결합, 리보스를 기초로 한 수소결합 및 핵산 염기를 기초로 한 수소결합 및 적층결합(stacking interaction)과 같은 다양한 결합 모드로 타겟 분자와 결합한다. 특히, 포스페이트기의 음전하를 기초로 한 이온결합은 구성 뉴클레오티드의 수와 동일한 수로 존재하며, 강하고, 단백질의 양전하 표면에 존재할 리신 및 아르기닌과 결합한다. 이와 같은 이유로 인하여, 핵산은 치환될 수 있는 타겟 분자에 직접 결합하는 것에 관여하지 않는다. 특히, 줄기 구조의 부위는 염기쌍을 이미 형성하며, 이중 나선 구조의 내면에 직면하고, 핵산 염기는 타겟 분자에 직접 결합하지 않을 것으로 보인다. 그러므로 염기쌍이 다른 염기쌍과 교체될 때 조차도 때때로 압타머의 활성은 감소하지 않는다. 루프 구조와 같이 염기쌍이 형성되지 않는 구조에서는 핵산 염기가 타겟 분자직접 결합하는 데에 관여하지 않고, 염기 치환은 가능하다. 예를 들면, 리보스의 2'-위치에서 하이드록시기는 모든 원소 또는 작용기로 치환된다. 원소 또는 작용기의 예로는 수소원자, 불소원자 또는 -O-알킬기(예를 들면, -O-CH3), -O-아실기(예를 들면, -O-CHO), 및 아미노기(예를 들면, -NH2)를 포함할 수 있다. 타겟 분자에 직접 결합하는 것에 관여하는 작용기가 치환되거나 제거되지 않는다면, 압타머는 흔히 그 활성을 유지한다.
또한, 압타머는 화학합성을 허용하므로, 용이하게 변형가능하다. 압타머에 대하여 MFOLD 프로그램을 이용하여 2차 구조를 예측하거나 X-선 분석 또는 NMR 분석으로 입체구조를 예측함으로써 뉴클레오티드가 치횐되거나 제거될 수 있는 정도로 예측하는 것이 가능하다. 새로운 서열을 가진 예측된 압타머는 용이하게 화학적으로 합성될 수 있으며, 현존하는 에세이 시스템을 이용하여 압타머가 활성을 유지할지 아닌지를 결정할 수 있다.
본 발명의 압타머는 각 뉴클레오티드의 당 잔기(예를 들면, 리보스)가 변형되어 결합 활성, 안정성, 약제 전달성 등을 증가시키는 것일 수 있다. 당의 잔기에서의 변형의 예로는 당의 잔기의 2'-위치, 3'-위치 및/또는 4'-위치에서 산소를 다른 원자로 치환시키는 것 등을 들 수 있다. 변형의 한 종류로서, 불소화(fluorination), O-알킬화(O-alkylation, 예를 들면, O-메틸화, O-에틸화), O-아릴화(O-arylation), S-알킬화(S-alkylation, 예를 들면, S-메틸화, S-에틸화), S-아릴화(S-arylation), 및 아미노화(amination, 예를 들면, -NH)를 들 수 있다. 상기 당의 잔기에서의 변경(alterations)은 공지방법 그 자체에 의하여 수행될 수 있다(e.g., Sproat et al., Nucle. Acid. Res. 1991 19, 733-738; Cotton et al., Nucl. Acid. Res. 1991 19, 2629-2635; Hobbs et al., Biochemistry 1973 12, 5138-5145).
본 발명의 압타머는 또한 핵산 염기(예를 들면, 퓨린 또는 피리미딘)를 가질 수 있으며, 결합 활성을 증가시키기 위하여 변형될 수 있다(예를 들면, 화학 치환에 의해). 상기 변형의 예로는 5'-위치에서의 피리미딘 변경, 6- 및/또는 8-위치(들)에서의 퓨린의 변경, 엑스트라사이클릭 아민(extracyclic amine)으로 변경, 4-티오우리딘(4-thiouridine)으로 치환, 및 5-브로모 또는 5-요오도-우라실로 치환을 들 수 있다.
본 발명의 압타머에 포함된 포스페이트기는 핵산가수분해효소(nuclease) 및 가수분해에 내성을 주기 위하여 변형될 수 있다. 예를 들면, P(O)O 작용기는 P(O)S (티오에이트, thioate), P(S)S (디티오에이트, dithioate), P(O)NR2 (아미데이트, amidate), P(O)R, R(O)OR', CO or CH2 (포름아세탈, formacetal) 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)[여기에서 R 또는 R'의 각각의 유닛은 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 알킬기이다(예를 들면, 메틸, 에틸)]으로 치환될 수 있다. 연결기(joining group)는 예를 들면 -O-, -N- 또는 -S- 및 이들 연결기를 거쳐 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있는 뉴클레오티드이다.
또한, 변형은 3' 및 5'에서의 캡핑과 같은 변형을 포함할 수 있다. 변형은 말단에 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, 역dT(inverted dT), 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(Myristoyl), 리토콜릭산-올레일(Lithocolic-oleyl), 도코사닐(Docosanyl), 라우로일(Lauroyl), 스테아로일(Stearoyl), 팔미토일(Palmitoyl), 올레일(Oleoyl), 리놀레오일(Linoleoyl), 기타 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 안료, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 첨가함으로써 추가로 실시될 수 있다.
상기 변형에 대해서는 예를 들면, 미국특허 Nos. 5,660,985 및 5,756,703를 참고한다.
또한 압타머는 리포솜 또는 나노입자의 표면에 결합하여 항암제, 독소, 종양 억제 유전자, 및 상기 리포솜 또는 나노입자 내에 캡슐화된 siRNA (소간섭 RNA, small interfering RNA)을 타겟 세포로 전달한다.
본 발명에서, clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD의 발현, 특히 그 활성을 억제하는 물질은 clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 저분자량 화합물, 또는 자연 추출물이다.
clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 상기에 기술한 바와 같다.
clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD에 특이적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 펩티드는 본 분야에서 공지된 전형적인 방법, 예를 들면, 파지 디스플레이(phage display)에 의하여 얻을 수 있다(Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228 (4705):1315-1317(1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2):391-410(1997)).
바람직하게는 혈관신생 억제용 조성물은 혈관신생을 억제함으로써 암을 치료할 수 있다.
바람직하게는 혈관신생 억제용 조성물은 혈관신생을 억제함으로써 혈관신생 관련 질환을 치료할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 조성물을 포함하는 혈관신생 억제용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, clec14a, 바람직하게는 clec14a-CTLD의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체와 약물이 결합된 항체-약물 결합체에 관한 것이다. 상기 약물은 독소, 화학치료제(chemotherapeutic agent), 항암제, 항생제, ADP-리보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 방사성동위원소 및 핵산분해효소(nucleolytic enzyme)로 구성된 군에서 1종 선택된 하나일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 항체-약물 결합체는 세포 내로 내재화될 수(internalized) 있다. 본 발명의 일 실시예에서 clec14a-CTLD IgG가 암세포와 같은 clec14a를 발현하는 세포 내로 내재화될 수 있다(도 9a, 9b).
본 발명은 또 다른 관점에서 clec14a의 CTLD 및 Fc의 융합 단백질을 포함하는, 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서 hCTLD-Fc는 농도에 의존하는 방식으로 튜브 형성을 억제하였다(도 11).
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이러한 실시예는 예시의 목적일 뿐 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아님은 당업자에 자명하다.
실시예 1: 세포 배양 및 형질감염
HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells, Lonza, Baltimore, MD, USA)을 EGM-2(endothelial growth medium-2)에 두었다. MAEC (Mouse aortic endothelial cells) 및 COS-7 세포는 10% (v/v) FBS (fetal bovine serum) 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) 중에서 배양하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2로습도 및 CO2가 조절된 인큐베이터 (Sanyo, Panasonic Healthcare Company, Secaucus, NJ, USA)에 유지하였다. HEK293F 세포는 습도 조절된 Multitron 인큐베이션 쉐이커 (Infors HT, Bottmingen (Switzerland))중에 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 FreestyleTM 293 발현 배지 (Invitrogen)에서 37℃ 및 8% CO2로 유지하였다. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 제조자의 지시에 따라, GFP, clec14a-GFP (야생형 clec14a) 또는 clec14aΔCTLD-GFP (clec14a CTLD 제거 변이체)를 코딩하는 벡터로 HUVECs 및 COS-7 세포를 형질감염하였다.
실시예 2: 인간 및 마우스 CTLD Fc 융합 단백질의 구축 및 제작
프라이머 5'-TCGCGCGGCCGCTGCTCGGCCTCGGGGGCCTGC-3' (서열번호 1) 및 5'-TCGCCTCGAGCTTGCACAGGTAGCCGTTGG-3' (서열번호 2)를 사용하여 hCTLD의 31-172번 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA를 증폭하였다. mCTLD의 동일한 잔기를 코딩하는 DNA는 프라이머 5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCTGTTCGGCCTCGGGGGCTTG-3' (서열번호 3) 및 5'- TCGCGGCCGGCCTGGCCCTTGCATAGGTAGCCATCGG-3' (서열번호 4)를 사용하여 증폭하였다. SfiI (NEB, Ipswich, MA, USA)를 처리하여 PCR 단편을 제작하고, 힌지 및 인간 IgG1의 CH2-CH3 도메인을 코딩하는 변형 포유동물 발현 벡터 pCEP4 (Invitrogen)의 3' 부위의 클로닝 사이트에 클로닝하였다 (gift of Dr. Chung, Seoul National University, Seoul, South Korea). 라이게이션된 산물을 반응성 Escherichia coli DH5α 세포에 형질전환하였고, 플라스미드 DNA를 제작하였다. 1.5 mg 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine: Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA)을 사용하여, 각 DNA 0.75 mg으로 HEK293F 세포 (6 X 108 cells)를 형질감염하였다. 형질감염된 세포를 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 FreestyleTM 293 발현 배지에 유지하였다. 7일 배양한 이후, 배양배지를 수거하고 단백질 A 세파로스 (RepliGen, Waltham, MA, USA)의 친화도 크로마토그래피를 통해 융합 단백질을 정제하였다. NanoDrop 분광광도계 (Wilmington, DE, USA)를 사용하여 단백질 농도를 정량하였다. 샘플을 PBS로 투석하고 SDS-PAGE 및 쿠마쉬 브릴리언트 블루 염색(Coomassie brilliant blue staining)을 통해 분석하였다. 최종 수집된 분획의 분액(aliquot)을 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: 인간 합성 scFv 라이브러리의 사전 제거 (Pre-clearing)
인간 합성 scFv 라이브러리(Barbas CF. Phage display : a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001)를 재증폭하였다. Fc 바인더를 사전 제거하기 위하여, 단백질 A 세파로스 상에 인간 이뮤노글로불린-G (Green Cross Pharma Derivatives Corp, Yong-in, Korea)를 고정시키고, 37℃에서 항체-단백질A 복합체를 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 간단한 원심분리 이후, 상층액을 수집하고, 펠렛은 제거하였다. 이러한 과정을 2회 반복하였다. 최종 상층액을 파지 ELISA로 분석하여 제거의 정도를 평가하였다.
실시예 4: 파지 디스플레이를 사용한 CTLD 특이적 scFv의 선별
4 ㎍ 재조합 인간 (hCTLD-Fc) 또는 마우스 (mCTLD-Fc) 융합 단백질로 코팅된 이뮤노튜브 (Immuno™tube maxisorp, Nunc, Rochester, NY, USA) 또는 마그네틱 비드 (Dynabeads M-270 epoxy, Invitrogen)로 3회의 바이오패닝을 수행하여, Barbas CF. Phage display : a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001; Vestweber D. Lymphocyte trafficking through blood and lymphatic vessels: more than just selectins, chemokines and integrins. European Journal of Immunology. 2003;33(5):1361-4에 기술된 바와 같이 종 교차 반응성을 가지는 클론을 선별하였다. 아웃풋 플레이트에서 자란 콜로니에서 무작위로 96개의 파지 클론을 선별하여, 파지 효소 면역어세이를 통해 인간과 마우스 CTLD에 대한 반응성을 테스트하였다. 최종 scFv 클론의 DNA를 시퀀싱하여, 상이한 상보성 결정 영역 서열을 가지는 것으로 확인된 4개의 scFv 클론으로 분류하였다.
실시예 5: clec14a-CTLD IgG의 제작
프라이머 5'-CGGGAATTCGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCTCTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTG-3' (서열번호 5) 및 5'-GGCGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGCTCACGGTGACCAGTGCCCTTGGCCCC-3'(서열번호 6)을 사용하여 선별된 scFv 클론 (클론 1-4)의 중쇄 가변영역(VH) 유전자를 증폭하였다. 클론의 경쇄 가변영역(VL)은 프라이머 5'-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGAAGGACCAGTCTGTGCTGACTCAGCC-3'(서열번호 7) 및 5'-GGCCGTACGTAGGACCGTCAGCTTGGTGCCTCCGCCTAAGACATAACCACC-3'(서열번호 8)을 사용하여 증폭하였다. 5' 및 3' 양 말단에 EcoRI 및 ApaI 제한효소 사이트를 추가하여, VH 프라이머를 설계하였다. 양 말단에 HindIII 및 BsiWI 사이트를 추가하여, VL 프라이머를 설계하였다. PCR 단편을 적절한 제한 효소 (NEB, Ipswich, MA, USA)로 처리하여, 힌지 및 인간 IgG1의 CH2-CH3 도메인을 코딩하는 pCDNA3.1 (bicistronic mammalian expression vector, Invitrogen) (gift of Dr. Hong, Kangwon National University, Chuncheon, Kangwon, South Korea)의 3' VH 클로닝 사이트에 클로닝하였다 (Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning : a laboratory manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001). Clec14a-CTLD IgG를 생산하고, Kim HY, Tsai S, Lo SC, Wear DJ, Izadjoo MJ. Production and characterization of chimeric monoclonal antibodies against Burkholderia pseudomallei and B. mallei using the DHFR expression system. PLoS ONE [Electronic Resource].6(5):e19867에 기술된 바와 같이 정제하였다.
실시예 6: 손상 복구 및 세포 이동성 어세이
제조자의 지시에 따라, CytoSelectTM 24-well 손상 복구 어세이 키트 (wound healing assay kit: Cell Biolabs Inc, San Diego, CA, USA)를 사용하였다. 간략하게, 손상 복구 삽입구의 맨 위에 개방된 말단을 통해 파이펫 팁을 주의깊게 삽입하여, GFP로 형질감염된 COS-7 세포, clec14a-GFP 또는 clec14aΔCTLD-GFP을 각 웰에 넣었다. 세포가 자라 합류하면, 삽입구를 웰에서 제거하고, 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 2회 세정하였다. 손상 20시간이 지난 후, 이미지를 캡쳐하였다.
내피세포 이동성을 분석하기 위해, 단일층이 형성될 때까지 HUVEC를 삽입구에서 배양하고, 20 ㎍/ml의 clec14a-CTLD IgG 또는 cetuximab의 존재 혹은 부재하에서 9 hr 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 2회 PBS로 세척하고, 크리스탈 바이올렛 (Sigma, St. Louis, MO, USA)으로 염색하였다. 정량분석을 위해, 광학 현미경(Nikon TS 100, Melville, NY, USA)하에서 플레이트 당 5개 필드를 촬영하였으며, 이동 거리를 매뉴얼에 따라 측정하였다.
실시예 7: 면역세포화학
Lee S, et al., Hydrogen peroxide increases human leukocyte adhesion to porcine aortic endothelial cells via NFkappaB-dependent up-regulation of VCAM-1. Int Immunol. 2007 Dec;19(12):1349-5926에 기술된 바와 같이, 면역세포화학을 수행하였다. 간략하게, GFP, clec14a-GFP, 또는 clec14aΔCTLD-GFP로 형질감염되어, 1일 동안 콜라겐으로 코팅된 커버슬립에서 성장한 COS-7 세포 및 HUVEC을 30분 동안 37℃에서 4% (w/v) 파라포름알데히드로 고정하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 5% (w/v) BSA (bovine serum albumin) 및 0.1% TX-100을 포함한 PBS에서 1시간 동안 37℃로 인큐베이션하여 차단하였다. 0.1 unit/well 로다민 팔로이딘 및 2 ㎍/ml 훽스트(Hoechst)와 함께 1시간 동안 세포를 인큐베이션하고, 형광 현미경(Leica DM2500, Wetzlar, Germany)하에서 관찰하였다.
실시예 8: ELISA
PBS에 담긴 25 nM의 재조합 hCTLD-Fc, mCTLD-Fc 또는 IgG1의 Fc 단편을 마이크로타이터 플레이트의 96웰에 넣었다. 37℃에서 오버나이트로 인큐베이션한 이후, 0.05% (v/v) Tween 20 (PBST)을 포함한 PBS로 3회 세척하고, PBST에 3% (w/v) BSA를 포함하여 1시간 동안 37℃로 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 3% (w/v) BSA를 포함한 PBST에 67 nM clec14a-CTLD IgG를 포함하여, 3시간 동안 37℃로 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 2회 세척하고, 3% (w/v) BSA를 포함하는 PBST 중에서 HRP (horseradish peroxide)가 접합된 항-인간 람다 경쇄 항체 (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) (1:1000로 희석)와 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다.
CTLD-CTLD 상호작용을 측정하기 위해, GFP, clec14a-GFP 또는 clec14aΔCTLD-GFP로 형질감염된 COS-7 세포의 용해물 (20 ㎍)을 96-well 플레이트의 웰에 넣고, 3% (w/v) BSA를 포함한 PBST에서 1시간 동안 37℃로 인큐베이션한 다음, 동일한 버퍼에 0.15 ㎍의 hCTLD-Fc 또는 Fc를 첨가하고, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. clec14a-CTLD IgG와의 경쟁 여부를 어세이하기 위해, 3% (w/v) BSA를 포함하는 PBST 중 clec14a-CTLD IgG의 농도를 증가시켜, hCTLD-Fc와 2시간 동안 37℃에서 미리 인큐베이션 하였다. 이후, 단백질 복합체를 웰에 넣고 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다. 웰을 PBST로 3회 세척하고, HRP가 접합된 당나귀 항-인간 Fc IgG (1:5000; Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)을 넣고, 1시간 동안 37℃로 인큐베이션 하였다. 웰을 PBST로 3회 세척하고, 100μl TMB 기질 용액 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 각 웰에 넣었다. 마이크로타이터 플레이트 리더(microtiter plate reader: VICTOR™ X4, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
실시예 9: 유세포 분석
6-well 마이크로타이터 플레이트에서 자란 HUVEC (3 X 105)를 20 ng/ml hTNFα (Millipore, Billerica, MA, USA), 또는 20 ㎍/ml clec14a-CTLD IgG 또는 cetuximab의 존재 또는 부재하에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 수확하고, 유세포 분석 버퍼 중에서 1시간 동안 37℃로 20㎍/ml 항-VCAM-1 또는 ICAM-1 다클론항체와 함께 염색하였다. 세포를 유세포 분석 버퍼로 3회 세척하고, 1000 X g에서 10분 동안 원심분리하였으며, 유세포 분석 버퍼 중에서 Alexa Fluor 488로 라벨링된 항-토끼 항체 (1:1000; Jackson ImmunoResearch)와 1시간 동안 37℃로 인큐베이션하였다.
6웰 마이크로타이터 플레이트에서 자란 HUVEC(3 X 105)를 4% (w/v) 파라포름알데히드로 고정하였다. 고정된 세포와 고정되지 않은 세포를 PBS로 2회 세척하고, 20 ㎍/ml clec14a-CTLD IgG 존재 또는 부재하에서 2시간 동안 37℃로 인큐베이션하였다. 7.5 ㎍/ml 양 항-clec14a 다클론항체로 2시간 동안 37℃에서 세포를 염색하였다. 세포를 유세포 분석 버퍼로 3회 세척하고, 유세포 분석 버퍼 중에서 NL493 (Northern LightsTM 493 Fluorochrome)으로 라벨링된 항-양 항체 (1:200; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)와 함께 인큐베이션한 다음, 유세포 분석기(BD FACSCalibur, BD Bioscience, Miami, FL, USA)로 분석하였다.
실시예 10: 튜브 형성
Rho SS, et al., Clec14a is specifically expressed in endothelial cells and mediates cell to cell adhesion. Biochemical & Biophysical Research Communications.404(1):103-8에 기술된 바와 같이, 튜브 형성 어세이를 수행하였다. 간략하게, 250 ㎕ Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA)을 24-well 플레이트의 웰에 넣고, 37℃에서 20분 동안 중합되도록 하였다. EGM-2에서 배양된 HUVEC를 수확하고, EGM-2에 재현탁한 다음, Matrigel (1 X 105 cells/well)에 접종하였다. 배양물을 clec14a-CTLD IgG 또는 cetuximab의 존재 또는 부재하에서 37℃로 인큐베이션하고, 21시간 후에 촬영하였다. 튜브는 매뉴얼에 따라 카운팅하였다.
실시예 11: HUVEC 세포 생존능 어세이
HUVEC(104)를 96-well 마이크로타이터 플레이트에 접종하고, 20 ㎍/ml clec14a-CTLD IgG, cetuximab 또는 5-FU (Sigma)와 2일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 생존능은 셀 카운팅 키트-8 (Cell Counting Kit-8 : Dojindo, Kumamoto, Japan)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다. VICTOR™ X4 분광광도계 (Perkin Elmer)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 12: 세포-세포 접촉 측정
세포-세포 접촉법을 Rho SS, et al., Clec14a is specifically expressed in endothelial cells and mediates cell to cell adhesion. Biochemical & Biophysical Research Communications.404(1):103-8에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 현탁액 중 1.5 X 107 HEK293F 세포를 GFP, Clec14a-GFP 및 Clec14aΔCTLD-GFP를 발현하는 플라스미드로 형질감염하고, FreestyleTM 293 발현 배양액에서 오버나이트 동안 배양한 다음, 6웰 플레이트에 접종하였다 (5 X 105 cells/well). 20 ㎍/ml clec14a-CTLD IgG 또는 cetuximab의 존재 또는 부재하에서 8시간 동안 세포를 유지하였다. 세포 응집체 (mass >4 cells)를 10개 이상의 필드에서 카운팅하였으며, 평균±표준편차(SD)를 계산하였다.
실시예 13: 면역블롯 분석
Van Meter KE, et al., A monoclonal antibody that inhibits translation in Sf21 cell lysates is specific for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 2008;69(3):107-17에 기술된 바와 같이 면역블롯 분석을 수행하였다. 간략하게, 12% 폴리아크릴아마이드 겔을 통해 전기영동하여 GFP-, clec14a-GFP-, 또는 clec14aΔCTLD-GFP를 분리하였다. 왯 트랜스퍼 시스템 (wet transfer system: GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)을 사용하여 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 이동하였다. 5% (w/v) 탈지유(skim milk)를 포함하여, 10 mM Tris/HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 및 0.05 (v/v)% Tween 20 (TTBS)에서 1시간 동안 실온으로 인큐베이션한 다음, 동일한 용액에서 항-GFP 단클론항체 (1:5000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 또는 항-β-액틴 단클론항체 (1:5000; Applied Biological Materials, Richmond, BC, Canada)와 함께 4℃에서 오버나이트로 인큐베이션하였다. TTBS로 막을 세정하고, 5% (w/v) 탈지유를 포함하는 TTBS에서 HRP-접합된 어피티퓨어 염소 항-마우스 IgG (HRP-conjugated Affinipure goat anti-mouse IgG: 1:5000; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)와 함께 1시간 동안 실온으로 인큐베이션하였다. TTBS로 수회 세정한 다음, 제조자의 지시에 따라 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 단백질 밴드를 시각화하였다.
실시예 14: 세포 ELISA
96웰 플레이트에 놓인 HUVECs (104)를 20 ㎍/ml clec14a-CTLD IgG 또는 Fc와 함께 0, 10, 30, 60, 120, 또는 180분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 1시간 동안 4℃에서 3% (w/v) BSA 포함 PBS로 차단한 다음, 차단 용액 중 양(sheep)의 항-clec14a 다클론항체 (1:1000)와 2시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 빙냉 PBS로 세포를 3회 세척하고, HRP와 접합된 항-양 IgG (1:5000; Santa Cruz Biotechnology)와 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. PBS로 수회 세척 후, 100 μl TMB 기질 용액을 각 웰에 추가하였다. 마이크로타이터 플레이트 리더를 사용하여, 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
실시예 15: 에피토프 매핑에 대한 ELISA
PBS에 있는 10μg/ml hCTLD-Fc, Fc 또는 hCTLD-Fc의 N-말단 또는 C-말단 단편 각각을 96웰 플레이트에 넣었다. 플레이트를 37℃에서 오버나이트로 인큐베이션하고, 0.05% (v/v) Tween 20 (PBST)을 포함하는 PBS로 3회 세척한 후, 3% (w/v) BSA를 포함한 PBST와 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다. 3% (w/v) BSA를 포함하는 PBST 중 10 μg/ml clec14a-CTLD IgG와 함께 2시간 동안 37℃에서 플레이트를 인큐베이션하였다. PBST로 2회 세척한 다음, 3% (w/v) BSA를 포함하는 PBST 중 HRP (horseradish peroxide)로 접합된 항-인간 람다 경쇄 항체 1:1000; Bethyl Laboratories, TX, USA)를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
실시예 16: hCTLD-Fc의 존재 또는 부재하에서 튜브 형성 어세이
250μl의 Matrigel (BD Biosciences)을 24웰 플레이트에 넣고, 20분 동안 37℃에서 중합되도록 하였다. EGM-2에서 배양된 HUVEC를 수확하고, EGM-2에 재현탁한 다음, Matrigel 에 접종하였다 (1X105 cells/well). 10μg/ml 및 25 μg/ml hCTLD Fc 또는 Fc의 존재 또는 부재하에서 배양물을 37℃인큐베이션하고, 8시간 후에 촬영하였다.
시험예 1: Clec14a CTLD는 세포 이동 및 필로포듐 형성에 중요한 역할을 할 수 있음
clec14a 매개 세포 이동에서 CTLD의 역할을 설명하기 위해, COS-7세포를 GFP (green fluorescent protein), clec14a-GFP (wild-type clec14a fused to GFP) 또는 clec14aΔCTLD-GFP (clec14a CTLD deletion mutant fused to GFP)로 형질감염하고, 0시간 및 20시간이 되었을 때 손상 복구 어세이에서의 이동을 분석하였다. 야생형 clec14a을 발현하는 세포의 이동 정도는 GFP 단독 발현 세포에 비해 약 1.6배 높은 반면, clec14aΔCTLD 결실 변이체의 발현은 이동에 거의 영향을 주지 않았다 (도 1a 및 1b).
세포 이동은 액틴 세포골격 재배열에 의해 정교하게 조절되기 때문에, 면역세포화학을 사용하여 GFP, clec14a-GFP 또는 clec14aΔCTLD-GFP 를 발현하는 COS-7 세포 및 HUVEC (human umbilical vein endothelial cells)에서의 액틴 네트워크 조직을 조사하였다. 2개의 세포 유형에서 모두, clec14a-GFP 발현은 현저하게 필로포듐 형성을 증가시킨 반면, GFP 또는 clec14aΔCTLD-GFP는 최소의 영향을 나타내었다 (도 2a 및 2b).
종합하여 보면, 이러한 결과는 액틴 세포골격 재배열을 통해 CTLD가 내피 세포 이동에 중요한 역할을 할 수 있음을 제시한다.
시험예 2: CTLD 특이적 scFv (single-chain variable fragments)의 분리
인간, 마우스 또는 침팬지 clec14a (표 1)의 CTLD는 Fc 융합 단백질이기 때문에, 인간 합성 scFv 라이브러리로부터 Fc 바인더를 제거하기 위해, 2단계의 연속적 사전 제거 과정을 수행하였다; 파지 효소 결합 면역 흡착법에 의해 약 90%가 제거되었음을 확인하였다.
clec14a-CTLD의 아미노산 서열
인간 clec14a-렉틴 (a.a
31-172)		 CSASGACYSLHHATMKRQAAEEACILRGGALSTVRAGAELRAVLALLRAGPGPGGGSKDLLFWVALERRRSHCTLENEPLRGFSWLSSDPGGLESDTLQWVEEPQRSCTARRCAVLQATGGVEPAGWKEMRCHLRANGYLCK 서열번호 9
마우스 clec14a-렉틴 (a.a
31-172)		 CSASGACYSLHHATFKRRAAEEACSLRGGTLSTVHSGSEFQAVLLLLRAGPGPGGGSKDLLFWVALERSISQCTQEKEPLRGFSWLHPDSEDSEDSPLPWVEEPQRSCTVRKCAALQATRGVEPAGWKEMRCHLRTDGYLCK 서열번호 10
침팬지 clec14a-렉틴 (a.a
31-172)		 CSASGACYSLHHATMKRQAAEEACILRGGALSTVRAGAELRAVLALLRAGPGPGGGSKDLLFWVALERRRSHCTLENEPLRGFSWLSSDPGGLESDTLQWVEEPQRSCTARRCAVLQATGGVEPAGWKEMRCHLRANGYLCK 서열번호 141
clec14a-CTLD의 뉴클레오티드 서열
인간 clec14a-렉틴 (nt
91-516)		 tgctcggcctcgggggcctgctacagcctgcaccacgctaccatgaagcggcaggcggccgaggaggcctgcatcctgcgaggtggggcgctcagcaccgtgcgtgcgggcgccgagctgcgcgctgtgctcgcgctcctgcgggcaggcccagggcccggagggggctccaaagacctgctgttctgggtcgcactggagcgcaggcgttcccactgcaccctggagaacgagcctttgcggggtttctcctggctgtcctccgaccccggcggtctcgaaagcgacacgctgcagtgggtggaggagccccaacgctcctgcaccgcgcggagatgcgcggtactccaggccaccggtggggtcgagcccgcaggctggaaggagatgcgatgccacctgcgcgccaacggctacctgtgcaag 서열번호 11
마우스 clec14a-렉틴 (nt
91-516)		 tgttcggcctcgggggcttgctacagccttcaccacgctaccttcaagagaagggcggcggaggaggcctgcagcctaaggggcgggactctcagcaccgtgcactcaggctcggagtttcaagctgtgctcctgctcttgcgtgcaggtcccgggcctggcggaggctccaaagatcttctgttctgggtggctctggaacgcagcatctcacagtgcactcaggagaaagagcctttaaggggtttctcctggttgcacccggactcagaagactcagaggacagcccactaccgtgggtggaagagccacaacgttcctgtacagtgagaaagtgcgctgcgctccaggccaccaggggagtggagcctgctggttggaaggagatgcgctgtcatctgcgcaccgatggctacctatgcaag 서열번호 12
침팬지 clec14a-렉틴 (nt
91-516)		 tgctcggcctcgggggcctgctacagcctgcaccacgctaccatgaagcggcaggcggccgaggaggcctgcatcctgcgaggtggggcgctcagcaccgtgcgtgcgggcgccgagctgcgcgctgtgctcgcgctcctgcgggcaggcccagggcccggagggggctccaaagacctgctgttctgggtcgcactggagcgcaggcgttcccactgcaccctggagaacgagcctttgcggggtttctcctggctgtcctccgaccccggcggtctcgaaagcgacacgctgcagtgggtggaggagccccaacgctcctgcaccgcgcggagatgcgcggtactccaggccaccggtggggtcgagcccgcaggctggaaggagatgcgatgccacctgcgcgccaacggctacctgtgcaag 서열번호 142
본 발명에서 사용된 아미노산 서열에 대한 아미노산 잔기는 IUPAC-IUB 명명법에 따라 약자로 표현된다:
Alanine: A Arginine: R
Asparagine: N Aspartic acid: D
Cysteine: C Glutamic acid: E
Glutamine: Q Glycine: G
Histidine: H Isoleucine: I
Leucine: L Lysine: K
Methionine: M Phenylalanine: F
Proline: P Serine: S
Threonine: T Tryptophane: W
Tyrosine: Y Valine: V
이후, CTLD-Fc 코딩된 면역튜브 및 마그네틱 비드를 사용하여, 인간 (hCTLD-Fc) 또는 마우스 (mCTLD-Fc) CTLD 융합 단백질과 라이브러리를 선택적으로 바이오패닝함으로써, 종 교차 CTLD 반응성을 가지는 클론을 분리하였다 (도 3a); 이러한 몇몇 클론을 비드로만 구별하였다 (도 3b-3d). 96개의 파지 클론을 무작위적으로 선별하고, 파지 효소 면역어세이로 선별하였다. 클론 DNA를 시퀀싱하고, 인간 및 마우스 CTLD 둘 다를 인식하면서 다른 상보성 결정 영역 서열을 가지는 4개의 클론 (클론 1-4)을 선별하였다 (표 2-9). 한편, 4개의 클론은 침팬지 CTLD를 특이적으로 인지하고, 침팬지 clec14a-렉틴의 아미노산 서열은 인간 clec14a-렉틴의 아미노산 서열과 동일하기 때문에 교차 반응성을 가진다.
clec14a-CTLD IgG의 VH 도메인에 대한 아미노산 서열
클론 1





 FR1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 서열번호13
CDR1 GFTFSGYDMS 서열번호14
FR2 WVRQAPGKGLEWVS 서열번호15
CDR2 GIYPDGGNTYYADSVKG 서열번호16
FR3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 서열번호17
CDR3 GATWWVLGPFDY 서열번호18
FR4 WGQGTLVTVSS 서열번호19
clec14a-CTLD IgG의 VH 도메인에 대한 아미노산 서열
클론 2





 FR1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 서열번호20
CDR1 GFTFSSYDMS 서열번호21
FR2 WVRQAPGKGLEWVS 서열번호22
CDR2 VISPDSSSTYYADSVKG 서열번호23
FR3 RFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYYCAR 서열번호24
CDR3 HTGWQSRPHTYYDYGMDV 서열번호25
FR4 WGQGTLVTVSS 서열번호26
clec14a-CTLD IgG의 VH 도메인에 대한 아미노산 서열
클론 3





 FR1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 서열번호27
CDR1 GFTFSDYYMS 서열번호28
FR2 WVRQAPGKGLEWVS 서열번호29
CDR2 LISYDGGSTYYADSVKG 서열번호30
FR3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 서열번호31
CDR3 SNDWFDY 서열번호32
FR4 WGQGTLVTVSS 서열번호33
clec14a-CTLD IgG의 VH 도메인에 대한 아미노산 서열
클론 4





 FR1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 서열번호34
CDR1 GFTFSGYYMS 서열번호35
FR2 WVRQAPGKGLEWVS 서열번호36
CDR2 VIYSGDGSTYYADSVKG 서열번호37
FR3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 서열번호38
CDR3 GLNSSSALPFDY 서열번호39
FR4 WGQGTLVTVSS 서열번호40
clec14a-CTLD IgG의 VL 도메인에 대한 아미노산 서열
클론 1





 FR1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC 서열번호41
CDR1 TGSSSNIGNNSVT 서열번호42
FR2 WYQQLPGTAPKLLIY 서열번호43
CDR2 ADSHRPS 서열번호44
FR3 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC 서열번호45
CDR3 GAWDDSLSGYV 서열번호46
FR4 FGGGTKLTVL 서열번호47
clec14a-CTLD IgG의 VL 도메인에 대한 아미노산 서열
클론 2





 FR1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC 서열번호48
CDR1 SGSSSNIGNNAVT 서열번호49
FR2 WYQQLPGTAPKLLIY 서열번호50
CDR2 SDNHRPS 서열번호51
FR3 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC 서열번호52
CDR3 GTWDASLSGYV 서열번호53
FR4 FGGGTKLTVL 서열번호54
clec14a-CTLD IgG의 VL 도메인에 대한 아미노산 서열
클론 3





 FR1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC 서열번호55
CDR1 SGSSSNIGSNNVY 서열번호56
FR2 WYQQLPGTAPKLLIY 서열번호57
CDR2 YDSQRPS 서열번호58
FR3 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC 서열번호59
CDR3 GAWDDSLSAYV 서열번호60
FR4 FGGGTKLTVL 서열번호61
clec14a-CTLD IgG의 VL 도메인에 대한 아미노산 서열
클론 4





 FR1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC 서열번호62
CDR1 SGSSSNIGSNAVN 서열번호63
FR2 WYQQLPGTAPKLLIY 서열번호64
CDR2 ADSNRPS 서열번호65
FR3 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC 서열번호66
CDR3 GSWDYSLSAYV 서열번호67
FR4 FGGGTKLTVL 서열번호68
또한, 클론 1-4의 핵산 서열은 표 10-17에서와 같다.
clec14a-CTLD IgG의 VH 도메인에 대한 뉴클레오티드 서열
클론 1





 FR1 gaggtgcagctgttggagtctgggggaggctt
ggtacagcctggggggtccctgagactctcct
gtgcagcctct 		서열번호69
CDR1 ggattcacctttagcggttatgatatgagc 서열번호70
FR2 tgggtccgccaggctccagggaaggggctgga
gtgggtctca 		서열번호71
CDR2 gggatctatcctgatggtggtaatacatatt
acgctgattctgtaaaaggt 		서열번호72
FR3 cggttcaccatctccagagacaattccaagaa
cacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagag
ccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaga 		서열번호73
CDR3 ggtgctacgtggtgggtgcttggtcctttcga
ctac 		서열번호74
FR4 tggggccagggtacactggtcaccgtgagct
ca		 서열번호75
clec14a-CTLD IgG의 VL 도메인에 대한 뉴클레오티드 서열
클론 1





 FR1 cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtct
gggacccccgggcagagggtcaccatctcttgt 		서열번호76
CDR1 actggctcttcatctaatattggcaataattct
gtcacc 		서열번호77
FR2 tggtaccagcagctcccaggaacggcccccaaa
ctcctcatctat 		서열번호78
CDR2 gctgatagtcatcggccaagc 서열번호79
FR3 ggggtccctgaccgattctctggctccaagtc
tggcacctcagcctccctggccatcagtgggc
tccggtccgaggatgaggctgattattactgt 		서열번호80
CDR3 ggtgcttgggatgatagcctgagtggttatgtc 서열번호81
FR4 ttcggcggaggcaccaagctgacggtccta 서열번호82
clec14a-CTLD IgG의 VH 도메인에 대한 뉴클레오티드 서열
클론 2





 FR1 gaggtgcagctgttggagtctgggggaggctt
ggtacagcctggggggtccctgagactctcct
gtgcagcctct 		서열번호83
CDR1 ggattcacctttagcagttatgatatgagc 서열번호84
FR2 tgggtccgccaggctccagggaaggggctgga
gtgggtctca 		서열번호85
CDR2 gtgatctctcctgatagtagtagtacatatta
cgctgattctgtaaaaggt		 서열번호86
FR3 cggttcaccatctccagagacaattccaagaa
cacgctgcatctgcaaatgaacagcctgagag
ccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaga 		서열번호87
CDR3 catactggttggcagagtcggcctcatacgta
ttatgattatggtatggacgtc 		서열번호88
FR4 tggggccagggtacactggtcaccgtgagctca 서열번호89
clec14a-CTLD IgG의 VL 도메인에 대한 뉴클레오티드 서열
클론 2





 FR1 cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtc
tgggacccccgggcagagggtcaccatctctt
gt 		서열번호90
CDR1 agtggctcttcatctaatattggcaataatgc
tgtcacc 		서열번호91
FR2 tggtaccagcagctcccaggaacggcccccaa
actcctcatctat 		서열번호92
CDR2 tctgataatcatcggccaagc 서열번호93
FR3 ggggtccctgaccgattctctggctccaagtct
ggcacctcagcctcnctggccatcagtgggctc
cggtccgaggatgaggctgattattactgt 		서열번호94
CDR3 ggtacttgggatgctagcctgagtggttatgtc 서열번호95
FR4 ttcggcggaggcaccaagctgacggtccta 서열번호96
clec14a-CTLD IgG의 VH 도메인에 대한 뉴클레오티드 서열
클론 3





 FR1 gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttg
gtacagcctggggggtccctgagactctcctgt
gcagcctct 		서열번호97
CDR1 ggattcacctttagcgattattatatgagc 서열번호98
FR2 tgggtccgccaggctccagggaaggggctgg
agtgggtctca		 서열번호99
CDR2 ttgatctcttatgatggtggtagtacatatta
cgctgattctgtaaaaggt		 서열번호100
FR3 cggttcaccatctccagagacaattccaagaa
cacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagag
ccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaga 		서열번호101
CDR3 agtaatgattggttcgactac 서열번호102
FR4 tggggccagggtacactggtcaccgtgagct
ca 		서열번호103
clec14a-CTLD IgG의 VL 도메인에 대한 뉴클레오티드 서열
클론 3






 FR1 cagtctgtgctgactcagccaccctcagcg
tctgggacccccgggcagagggtcaccatc
tcttgt 		서열번호104
CDR1 agtggctcttcatctaatattggcagtaat
aatgtctac		 서열번호105
FR2 tggtaccagcagctcccaggaacggctccc
aaactcctcatctat 		서열번호106
CDR2 tatgatagtcagcggccaagc 서열번호107
FR3 ggggtccctgaccgattctctggctccaag
tctggcacctcagcctccctggccatcagt
gggctccggtccgaggatgaggctgattat
tactgt 		서열번호108
CDR3 ggtgcttgggatgatagcctgagtgcttat
gtc 		서열번호109
FR4 ttcggcggaggcaccaagctgacggtccta 서열번호110
clec14a-CTLD IgG의 VH 도메인에 대한 뉴클레오티드 서열
클론 4





 FR1 gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctct 서열번호111
CDR1 ggattcacctttagcggttattatatgagc 서열번호112
FR2 tgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctca 서열번호113
CDR2 gtgatctattctggtgatggtagtacatattacgctgattctgtaaaaggt 서열번호114
FR3 cggttcaccatctccagagacaactccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaga 서열번호115
CDR3 ggtcttaattcgtcttcggctctgccgttcgactac 서열번호116
FR4 tggggccagggtacactggtcaccgtgagctca 서열번호117
clec14a-CTLD IgG의 VL 도메인에 대한 뉴클레오티드 서열
클론 4





 FR1 cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgt 서열번호118
CDR1 agtggctcttcatctaatattggcagtaatgctgtcaac 서열번호119
FR2 tggtaccagcagctcccaggaacggcccccaaactcctcatctat 서열번호120
CDR2 gctgatagtaatcggccaagc 서열번호121
FR3 ggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccggtccgaggatgaggctgattattactgt 서열번호122
CDR3 ggttcttgggattatagcctgagtggttatgtc 서열번호123
FR4 ttcggcggaggtaccaagctgacggtccta 서열번호124
시험예 3: 인간 및 마우스 clec14a-CTLD를 특이적으로 인지하는 Clec14a-CTLD IgG
scFv 클론을 IgG로 변환하고, HEK293F (human embryonic kidney 293F) 세포에서 발현한 다음, 정제하였다. 4개의 IgG 클론은 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 및 쿠마시 염색에 의해 90% 초과의 순도임을 보여주었다. ELISA는 정제된 CTLD 특이적 IgG (clec14a-CTLD IgGs)가 인간 및 마우스 CTLD-Fc 둘 다에 특이적으로 결합하나, Fc 단독은 그러하지 않음을 보여주었다. 클론 1 및 2는 클론 3 및 4보다 훨씬 더 큰 친화도를 보였다 (도 4).
시험예 4: Clec14a-CTLD IgG는 내피 세포 이동 및 튜브 형성을 특이적으로 억제함
clec14a-CTLD IgG가 내피세포 이동에 저해 작용을 하는지 조사하기 위해, HUVEC와 함께 clec14a-CTLD IgG의 존재 또는 부재하에서 손상 복구 어세이를 수행하였다. Cetuximab, 항-EGFR 항체를 대조 IgG로 사용하였다. 선별된 clec14a-CTLD IgG 중에서, 클론 1 및 2는 각각 약 44% 및 54%로 HUVEC 세포 이동을 현저하게 억제한 반면, 클론 3 및 4와 cetuximab 단독은 거의 효과가 없었다 (도 5a 및 5b).
clec14a-CTLD IgG가 튜브 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, clec14a-CTLD IgG 및 cetuximab의 존재 또는 부재하에서 튜브 형성을 어세이하였다. 클론 1 및 2와 cetuximab은 앞서 기재된 바와 같이 HUVEC 튜브 형성을 현저하게 차단하는 반면, 나머지 클론은 큰 영향이 없었다 (도 5c 및 5d).
이러한 결과는 clec14a-CTLD IgG가 종양 혈관신생을 현저하게 억제함을 강하게 제시한다.
시험예 5: Clec14a-CTLD IgG의 내피세포 생존능 및 활성에의 영향
clec14a-CTLD IgG가 내피세포 생존능에 미치는 영향을 조사하기 위하여, clec14a-CTLD IgG, cetuximab 또는 5-FU (5-fluorouracil), 아폽토시스 유도제 존재 또는 부재하에서 2일 동안 HUVEC를 배양하고, 세포 카운팅 키트를 사용하여 세포 생존가능성을 확인하였다. 항체는 HUVEC 생존능에 영향을 거의 미치지 않은 반면, 5-FU는 특이적으로 생존능을 감소시켰다 (도 6a).
내피세포 활성에 clec14a-CTLD IgG가 미치는 영향을 확인하기 위하여, clec14a-CTLD IgGs, cetuximab 또는 hTNFα (human tumor necrosis factor alpha)의 존재 또는 부재하에서 HUVEC를 배양하였다. 활성은 유세포 분석에 의해 측정된 VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) 및 ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule-1)의 발현에 기초하여 결정되었다. 세포를 hTNFα로 처리하여 양성 대조군으로 VCAM-1 및 ICAM-1의 상향 조절을 유도하였다. 항체 및 cetuximab은 HUVEC 활성에 영향이 거의 없었다 (도 6b).
종합하면, 이러한 결과는 clec14a-CTLD IgG가 내피세포 생존능 또는 활성에 영향을 거의 미치지 않음을 제시한다.
시험예 6: Clec14a-CTLD IgG는 특이적으로 clec14a에 의해 매개된 세포-세포 접촉을 억제함
내피세포-세포 접촉에서 clec14a-CTLD IgG의 역할을 확인하기 위하여, GFP 또는 clec14a-GFP로 형질감염된 HEK293F 세포에 의해 형성되고 clec14a-CTLD IgG 또는 cetuximab의 존재 또는 부재하에서 배양되어, clec14a 매개 세포-세포 접촉의 표지자인 세포 응집체의 수를 측정하였다. 세포 응집체의 수는 GFP 단독 발현 세포보다 clec14a-GFP 발현 세포에서 약 4배 이상 더 많았다 (도 7a 및 7b). 더욱이, 클론 1 및 2는 clec14a-GFP로 형질감염된 세포의 응집을 크게 억제한 반면, 다른 클론 및 cetuximab은 거의 영향이 없었다.
종합하면, 이러한 결과는 clec14a-CTLD IgG는 종양 혈관신생동안 clec14a 매개 내피세포-세포 접촉에서 저해 작용을 할 수 있음을 제시한다.
시험예 7: Clec14a-CTLD IgG는 clec14a CTLD-CTLD 상호작용을 특이적으로 차단함
면역분석을 사용하여, 형질감염된 COS-7 세포의 용해물 중 GFP, clec14a-GFP 및 clec14aΔCTLD-GFP의 발현을 확인하였다 (도 8a). 이후, 용해물을 hCTLD-Fc 또는 Fc와 함께 인큐베이션하여, CTLD 사이의 상호작용을 관찰하였다. hCTLD-Fc가 COS-7 세포 용해물 중 몇몇 다른 단백질과 상호작용할 수 있을지라도, clec14aΔCTLD-GFP가 아닌 clec14a-GFP에 강하게 결합하였고, 이는 내피세포에서 특이적 CTLD-CTLD 상호작용을 제시한다 (도 8b).
clec14a-CTLD IgG가 CTLD-CTLD 상호작용을 차단하는지 여부를 결정하기 위해, hCTLD-Fc는 증가하는 농도의 clec14a-CTLD IgG (클론 1)와 인큐베이션 하였고, 단백질 복합체는 GFP- 또는 clec14a-GFP- 형질감염된 세포의 용해물과 인큐베이션하였다. 경쟁적 ELISA를 통해, clec14a-CTLD IgG가 농도 의존적 방식으로 CTLD-CTLD 상호작용을 특이적으로 저해함을 보였으며 (도 8c), 이는 clec14a-CTLD IgG가 내피세포에서 clec14a CTLD-CTLD를 특이적으로 차단할 수 있음을 제시한다.
시험예 8: HUVEC 표면에서 clec14a-CTLD IgG로 하향 조절된 clec14a에 교차 결합함
신생혈관형성 표현형 (pro-angiogenenic phenotype)을 억제하는데 clec14a-CTLD IgG의 가능한 역할을 조사하기 위해, 유세포 분석법을 사용하여 clec14a-CTLD IgG (클론 1)로 처리 전후에 HUVEC 막에서 clec14a 발현 레벨을 비교하였다. IgG 처리시 생세포에서 clec14a는 현저하게 감소하였으나, 파라포름알데히드에 고정된 세포는 그렇지 않았다 (도 9a).
clec14a-CTLD IgG에 의해 HUVEC 막에서의 clec14a 하향 조절을 확인하기 위하여, 세포를 IgG (클론 1) 또는 Fc로 처리하고, clec14a 막을 세포 ELISA로 측정하였다. Clec14a-CTLD IgG는 HUVEC 막에서 clec14a를 시간 의존적 방식으로 하향 조절하였다 (도 9b).
이러한 결과는 clec14a에 대한 clec14a-CTLD IgG의 교차 반응이 내피세포막에서의 clec14a를 특이적으로 하향 조절함을 강력하게 제시한다. 또한, 이러한 결과는 clec14a-CTLD IgG가 암세포와 같은 clec14a 발현 세포에 내재화될 수 있음을 제시한다.
시험예 9: 에피토프의 세부 매핑
에피토프의 세부 매핑을 위하여, ELISA로 Clec14awtCTLD 및 hCTLD-Fc 단편에 대한 clec14a-CTLD IgG의 특이도 (도 10a)를 시험하였다.
그 결과, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 클론 1 및 2 둘 다의 clec14a-CTLD IgG는 wthCTLD 뿐 아니라, hCTLD의 N-말단 및 C-말단에 결합하였다.
이러한 결과는 CTLD의 N-말단 또는 C-말단에 예를 들어 클론 1 및 2 모두의 clec14a-CTLD IgG와 같이, hCTLD에서 1번 아미노산 내지 42번 아미노산의 아미노산 단편을 포함하는 융합 단백질, hCTLD에서 1번 아미노산 내지 62번 아미노산의 아미노산 단편을 포함하는 융합 단백질, hCTLD에서 82번 아미노산 내지 142번 아미노산의 아미노산 단편을 포함하는 융합 단백질, hCTLD에서 62번 아미노산 내지 142번 아미노산의 아미노산 단편을 포함하는 융합 단백질, hCTLD에서 122번 아미노산 내지 142번 아미노산의 아미노산 단편을 포함하는 융합 단백질에 특이적으로 결합하여, 에피토프로 사용될 수 있음을 강하게 제시한다.
시험예 10: CTLD-Fc가 튜브 형성을 억제하는지 여부를 관찰하기 위한 시험
혈관신생에 hCTLD-Fc의 억제 효과를 확인하기 위해, 실시예 16에 따라 hCTLD-Fc 또는 Fc의 존재하에서 튜브 형성을 어세이하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, hCTLD-Fc가 농도 의존적 방식으로 튜브 형성을 억제하였다.
이러한 결과는 확실히 hCTLD-Fc가 종양 혈관신생을 특이적으로 억제함을 제시하고 있다.
구체적 구성을 참조하여 본 발명을 상세하게 기재하였으나, 이러한 기재는 바람직한 구현예에 관한 것이고, 발명의 범위를 제한하지 않음은 당업자에 자명한 것이다. 이에, 본 발명의 실질적 범위는 출원된 청구항 및 그 등가물에 의해 정의된다 할 것이다.
<110> Scripps Korea Antibody Institute <120> NOVEL ANTIBODY SPECIFIC FOR CLEC14A AND USES THEREOF <130> PP-B1229 <150> US 61/659654 <151> 2012-06-14 <150> PCT/KR 2012/008618 <151> 2012-10-19 <160> 142 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hCTLD <400> 1 tcgcgcggcc gctgctcggc ctcgggggcc tgc 33 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hCTLD <400> 2 tcgcctcgag cttgcacagg tagccgttgg 30 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mCTLD <400> 3 tcgcggccca ggcggcctgt tcggcctcgg gggcttg 37 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mCTLD <400> 4 tcgcggccgg cctggccctt gcataggtag ccatcgg 37 <210> 5 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for VH <400> 5 cgggaattcg ccgccaccat ggaatggagc tgggtctttc tcttcttcct gctgtcagta 60 actacaggtg tcctctccga ggtgcagctg ttggagtctg 100 <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial 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Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Ser Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Asn Ser Ser Ser Ala Leu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 129 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of clone1 <400> 129 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ser Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 130 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of clone2 <400> 130 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 131 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of clone3 <400> 131 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asn Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 132 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of clone4 <400> 132 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 133 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH domains of clec14a-CTLD IgGs of Clone 1 <400> 133 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctatcctg atggtggtaa tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggtgct 300 acgtggtggg tgcttggtcc tttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tca 363 <210> 134 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domains of clec14a-CTLD IgGs of Clone 1 <400> 134 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc aataattctg tcacctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagtc atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatg atagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 135 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH domains of clec14a-CTLD IgGs of Clone 2 <400> 135 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtg atctctcctg atagtagtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgcat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagacatact 300 ggttggcaga gtcggcctca tacgtattat gattatggta tggacgtctg gggccagggt 360 acactggtca ccgtgagctc a 381 <210> 136 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domains of clec14a-CTLD IgGs of Clone 2 <400> 136 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc aataatgctg tcacctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tctgataatc atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctcnc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt acttgggatg ctagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 137 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH domains of clec14a-CTLD IgGs of Clone 3 <400> 137 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattattata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcattg atctcttatg atggtggtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaagtaat 300 gattggttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348 <210> 138 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domains of clec14a-CTLD IgGs of Clone 3 <400> 138 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc agtaataatg tctactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg ctcccaaact cctcatctat tatgatagtc agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatg atagcctgag tgcttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 139 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH domains of clec14a-CTLD IgGs of Clone 4 <400> 139 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggttattata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtg atctattctg gtgatggtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca actccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggtctt 300 aattcgtctt cggctctgcc gttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tca 363 <210> 140 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domains of clec14a-CTLD IgGs of Clone 4 <400> 140 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc agtaatgctg tcaactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagta atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt tcttgggatt atagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gtaccaagct gacggtccta 330 <210> 141 <211> 142 <212> PRT <213> Pan troglodytes <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(142) <223> Chimpanzee clec14a-lectin (a.a 31-172) <400> 141 Cys Ser Ala Ser Gly Ala Cys Tyr Ser Leu His His Ala Thr Met Lys 1 5 10 15 Arg Gln Ala Ala Glu Glu Ala Cys Ile Leu Arg Gly Gly Ala Leu Ser 20 25 30 Thr Val Arg Ala Gly Ala Glu Leu Arg Ala Val Leu Ala Leu Leu Arg 35 40 45 Ala Gly Pro Gly Pro Gly Gly Gly Ser Lys Asp Leu Leu Phe Trp Val 50 55 60 Ala Leu Glu Arg Arg Arg Ser His Cys Thr Leu Glu Asn Glu Pro Leu 65 70 75 80 Arg Gly Phe Ser Trp Leu Ser Ser Asp Pro Gly Gly Leu Glu Ser Asp 85 90 95 Thr Leu Gln Trp Val Glu Glu Pro Gln Arg Ser Cys Thr Ala Arg Arg 100 105 110 Cys Ala Val Leu Gln Ala Thr Gly Gly Val Glu Pro Ala Gly Trp Lys 115 120 125 Glu Met Arg Cys His Leu Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Cys Lys 130 135 140 <210> 142 <211> 426 <212> DNA <213> Pan troglodytes <220> <221> exon <222> (1)..(426) <223> Chimpanzee clec14a-lectin (nt 91-516) <400> 142 tgctcggcct cgggggcctg ctacagcctg caccacgcta ccatgaagcg gcaggcggcc 60 gaggaggcct gcatcctgcg aggtggggcg ctcagcaccg tgcgtgcggg cgccgagctg 120 cgcgctgtgc tcgcgctcct gcgggcaggc ccagggcccg gagggggctc caaagacctg 180 ctgttctggg tcgcactgga gcgcaggcgt tcccactgca ccctggagaa cgagcctttg 240 cggggtttct cctggctgtc ctccgacccc ggcggtctcg aaagcgacac gctgcagtgg 300 gtggaggagc cccaacgctc ctgcaccgcg cggagatgcg cggtactcca ggccaccggt 360 ggggtcgagc ccgcaggctg gaaggagatg cgatgccacc tgcgcgccaa cggctacctg 420 tgcaag 426

Claims (55)

  1. clec14a (C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)에 특이적으로 결합하는 항체로, clec14a의 CTLD(C-타입 렉틴 유사 도메인)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체이고,
    (a) SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위, 및 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 부위; 또는
    (b) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위, 및 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 51의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.

  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위를 포함하는 항체; 또는 SEQ ID NO: 126의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변부위 및 SEQ ID NO: 130의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변부위를 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  6. 제1항의 항체를 코딩하는 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 상기 핵산은
    (a) SEQ ID NO: 70의 중쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 72의 중쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 74의 중쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 중쇄 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 77의 경쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 79의 경쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 81의 경쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 경쇄 핵산 서열; 또는
    (b) SEQ ID NO: 84의 중쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 86의 중쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 88의 중쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 중쇄 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 91의 경쇄 CDR1 핵산 서열, SEQ ID NO: 93의 경쇄 CDR2 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 95의 경쇄 CDR3 핵산 서열을 포함하는 경쇄 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 핵산.
  8. 제6항에 있어서, 상기 핵산은, 중쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 133의 핵산 서열 및 경쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 134의 핵산 서열을 포함하는 핵산; 또는 중쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 135의 핵산 서열 및 경쇄 가변 부위에 대한 SEQ ID NO: 136의 핵산 서열을 포함하는 핵산인 것을 특징으로 하는 핵산.
  9. 제6항의 핵산을 포함하는 벡터.
  10. 제9항의 벡터 또는 제6항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  11. 제10항의 숙주 세포를 배양하여 상기 항체를 생산하도록 핵산이 발현되는 단계를 포함하는 clec14a (C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법.
  12. 독소, 화학치료제(chemotherapeutic agent), 항암제, 항생제, ADP-리보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 방사성동위원소 및 핵산분해효소(nucleolytic enzyme)로 구성된 군에서 1종 선택된 약물에 결합된 제1항의 항체를 포함하는 항체-약물 결합체.
  13. 삭제
  14. 제1항의 항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 전이(metastasis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성(macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맹경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 제1항의 항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환 진단용 조성물로, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 전이(metastasis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성(macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맹경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
  18. 제17항의 진단용 조성물을 포함하는 혈관신생 관련 질환 진단용 키트로, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 전이(metastasis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성(macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맹경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 키트.

  19. 삭제
  20. 혈관신생을 억제하는 항체의 생성을 유도할 수 있는 에피토프로서 clec14a의 CTLD 내의 1번째 아미노산으로부터 42번째 아미노산까지의 아미노산 절편 또는 clec14a의 CTLD 내의 122번째 아미노산으로부터 142번째 아미노산까지의 아미노산 절편을 포함하는 폴리펩티드를 에피토프로서 사용하여 바이오패닝(biopanning)하는 단계를 포함하는 clec14a(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)에 특이적으로 결합하는 제1항의 항체를 제조하는 방법.


  21. 삭제
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