KR102201992B1 - clec14a에 특이적으로 결합하는 탈당화 항체 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A(clec14a)에 특이적으로 결합하는 탈당화 항체 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 CDR1을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, clec14에 특이적으로 결합하는 탈당화 항체 및 이의 용도 예를 들어, 상기 항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

clec14a에 특이적으로 결합하는 탈당화 항체 및 그 용도

본 발명은 C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A(clec14a)에 특이적으로 결합하는 탈당화 항체 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 CDR1을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, clec14에 특이적으로 결합하는 탈당화 항체 및 이의 용도 예를 들어, 상기 항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

종양 혈관신생은 종양 진행에 중요한 역할을 한다. 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 상피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)는 혈관신생에서 중요한 인자이며, 혈관신생은 암 치료에 있어서 매우 유망한 타겟이 되고 있다. 항-VEGF 항체(anti-VEGF antibody)인 베바시주맵(bevacizumab: 아바스틴)은 전이성 대장암(metastatic colorectal cancer), 신장암(renal cell carcinoma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 및 악성 뇌신경교종(malignant brain glioma) 질환을 가진 환자를 치료하는 데에 사용되고 있다. 항-EGFR 항체(anti-EGFR antibody)인 세툭시맵(Cetuximab)은 내피세포간 접촉을 저해하고, VFGF, 인터류킨-8(interleukin-8) 및 기본 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor)와 같은 혈관신생인자의 발현을 억제할 수 있다.

그러나, 아바스틴은 단일 제제로서 임상에서 효능이 관찰되지 않으며, 현재 여러 화학적 제제와의 병용 치료(combination therapy)에 사용이 되고 있고, 병용 치료의 경우, 다양한 화학적 제제를 치료에 병용하기 때문에 환자에게 여러 가지 부작용을 일으키는 위험성을 안고 있다. 또한, 아바스틴은 종양 혈관 뿐 아니라 정상 혈관의 VEGF 신호작용을 저해하여 정상 혈관 결함 유도를 통한 단백뇨 (proteinuria), 고혈압 (hypertension), 출혈 (bleeding), 위장관 천공 (gastrointestinal perforation)과 같은 부작용을 초래한다고 알려져 있다.

더욱이, 아바스틴의 장기 사용시 내성 유발 가능성이 있으며, 내성이 생긴 대장암 세포의 경우, 높은 수준의 VEGF-A, -B, -C, PIGF (placental growth factor), VEGF 수용체-1 (VEGF receptor-1)의 발현이 관찰되고 있어, VEGF 중화항체를 처리해도 다양한 친-혈관생성 수용성 인자 (pro-angiogenic soluble factor) 및 수용체의 발현이 증가할 수 있다.

이러한 아바스틴의 부작용 및 내성을 개선할 새로운 항체 신약을 개발할 필요성이 제시되고 있다. 이와 관련하여, 본 출원의 발명자들은 일련의 상피성장인자(epidermal growth factor) 유사 도메인인 C-타입 렉틴-유사 도메인(CTLD) 및 스시-유사 도메인(sushi-like domain)을 구성하는 세포외 도메인인 타입 I 막관통 단백질(transmembrane protein)인 Clec14a의 CTLD가 세포 이동에 중요한 액틴 세포골격 재정렬 (actin cytoskeletal rearrangement)에 중요한 역할을 함을 규명하였다. 또한, 이를 바탕으로 clec14a-CTLD 특이적 인간 항체를 선별하고, 선별된 항체가 사람, 쥐 clec14a-CTLD에 높은 교차 반응성을 가지며, 혈관 내피세포의 이동 저해, 튜브 형성을 저해하고, 내피세포 세포-세포 접촉을 저해함으로써, 종양 신생혈관 생성을 억제할 수 있음을 확인하고, 국제공개 제WO2013187556호로 출원한 바 있다.

다만, 동물 모델에서 개발 항체의 효능 및 독성 평가를 위해서는 항체의 대량 생산 (large scale production)이 필요하며 항체 자체의 안정성이 중요하나, clec14a-CTLD 특이적 인간 항체의 경우 정제 과정에서 단백질 응집이 일어나 항체 수율 향상을 위한 안정성 개선 과정이 필요함을 확인하였다.

항체의 당화는 대량 생산 과정에서 항체의 안정성 뿐 아니라 기능에도 영향을 줄 수 있으므로, 당화 예측에 기반한 항체의 당화 변경을 통해 목적하는 효능 뿐 아니라, 항체 안정성을 달성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 clec14a에 특이적으로 결합하는 항체로, 국제공개 제WO2013/187556호에 개시된 clec14a-CTLD 특이적 항체인 클론 1의 clec14a-CTLD IgG의 CDR이 시판되는 치료용 항체에 그래프팅되어, 치료용 항체의 프레임워크로 치환되며, 경쇄 CDR1 아미노산 서열 내 당화 부위의 일부를 다른 아미노산 서열로 치환한 탈당화 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 clec14a에 특이적으로 결합하는 항체로, TGSSSNIGXXXVT (서열번호 1)의 CDR1을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, 서열번호 1의 9번째, 10번째 및 11번째 위치의 아미노산 X 각각은 R, C, G, A, T, W, S, N, V로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 기술적 특징 및 실시예는 하기 상세한 설명 및 후술하는 청구항에서 보다 명백하게 기술될 것이다.

도 1a는 치료용 항체 4종 (adalimumab (humira), omalizumab (Xolair), tratuzumab (herceptin), bevacizumab (avastin))에 모항체 IgG의 CDR 이식을 도시한 모식도이다.
도 1b는 모항체 IgG 및 클론 1 IgG 제제 중 항체의 응집을 시각적으로 관찰한 결과이다.
도 1c는 분광광도법을 통해 측정된 모항체 IgG (녹색) 및 클론 1 IgG (오렌지)의 응집 인덱스 결과이다. 응집 인덱스는 100×[Abs340/(Abs280 - Abs340)]으로 계산하였다.
도 1d는 항체 침전 전후 모항체 IgG (녹색) 및 클론 1 IgG (오렌지)의 정량 결과이다.
도 2a는 파지 디스0플레이 기술을 사용하여 4종의 당화 IgG 클론 (deglyco C1-C4)을 선별하는 탈당화 과정에 대한 모식도이다.
도 2b는 hclec14a-CTLD-Fc, mclec14a-CTLD-Fc 및 Fc 단독에 대한 4종의 탈당화 IgG의 결합 특이도를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 HUVEC 튜브 형성 어세이를 수행하여 clec14a 매개 혈관 신생을 억제하는 최적화 선도 항체에 대한 선별을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 클론 1 IgG를 양성대조군으로 사용하였다.
도 2d는 HUVEC 튜브 형성 어세이를 수행하여 clec14a 매개 혈관 신생을 억제하는 최적화 선도 항체에 대한 선별을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 총 가지 (branch) 숫자는 대조군 (MOCK) 튜브 형성의 백분율로 표시된다.
도 2e는 상처 치유 어세이를 수행하여 내피세포 이동에 대한 deglyco C1 IgG의 영향을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2f는 상처 치유 어세이를 수행하여 내피세포 이동에 대한 deglyco C1 IgG의 영향을 측정한 결과를 나타낸 것으로 상처 차이 정도는 대조군 (MOCK) 이동에 대한 백분율로 표시된다.
도 2g는 환원 조건에서 1차원 전기영동을 사용하여 deglyco C1 IgG 및 클론 1 IgG의 이동성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 2h는 2차원 전기영동을 사용하여 deglyco C1 IgG 및 클론 1 IgG의 동질성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 Deglyco C1 IgG-HRP와 hclec14a-CTLD-Fc에 결합하는 모항체 IgG를 첨가하여 경쟁 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 모항체 IgG (녹색) 또는 Deglyco C1 IgG (적색)의 존재 또는 부재 (MOCK, 흑색)하에서 유세포분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 Octet RED96 시스템을 통해 바이오레이터 간섭계법 어세이 (biolayer interferometry assay)를 사용하여 hclec14a-ECD-myc에 대한 모항체 IgG (녹색) 또는 Deglyco C1 IgG (적색)의 친화도 측정 결과를 나타낸 것이다. * KD=equilibrium dissociation constant; K_on=association rate constant; K_off=dissociation rate constant
도 3d는 모항체 IgG (녹색), Deglyco C1 IgG (적색) 및 베바시주맙 (청색)의 존재 또는 부재 (MOCK, 흑색)하에서 HUVEC 튜브 형성 어세이를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3e는 HUVEC 튜브 형성 어세이를 수행한 결과로 총 가지 숫자는 대조군 (MOCK) 튜브 형성의 백분율로 표시된다.
도 3f는 모항체 IgG (녹색), Deglyco C1 IgG (적색) 및 베바시주맙 (청색)의 존재 또는 부재 (MOCK, 흑색)하에서 상처 치유 어세이를 수행한 결과를 나타낸 것이다. 광 현미경을 사용하여 0 h (상단) 및 8 h (하단)에서 이미지를 캡쳐하였다.
도 3g는 상처 치유 어세이를 수행한 결과를 나타낸 것으로, 상처 차이 정도는 대조군 (MOCK) 이동에 대한 백분율로 표시된다.
도 4a는 야생형 clec14a으로 형질감염되고 모항체 IgG (녹색) 또는 Deglyco C1 IgG (적색)의 존재 또는 부재 (MOCK, 흑색)하에서 6h 동안 배양된 HEK293F 세포를 광 현미경을 사용하여 카운팅한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 필드 당 응집체의 수를 대조군 (MOCK)의 clec14a 매개 세포-세포 접촉에 대한 백분율로 나타낸 것이다.
도 4c는 마이크로타이터 플레이트 상에 HUVECs를 코팅한 후, 모항체 IgG (녹색) 또는 Deglyco C1 IgG (적색)가 증가하는 농도로 존재 또는 부재하에서 HUVECs에 결합하는 clec14a-CTLD-Fc-HRP를 세포 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4d는 마이크로타이터 플레이트 상에 clec14a-CTLD-Fc를 코팅한 후, 모항체 IgG (녹색) 또는 Deglyco C1 IgG (적색)가 증가하는 농도로 존재 또는 부재하에서 clec14a-CTLD-Fc에 결합하는 clec14a-ECD-myc를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 2일간 deglyco C1 IgG의 부재 (흑색) 또는 존재 (적색)하에서 또는 5-FU (황색)의 존재하에서 HUVECs를 인큐베이션 한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존도를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 hTNFα (분홍) 또는 deglyco C1 IgG의 부재 (흑색) 또는 존재 (적색)하에서 HUVECs를 배양한 결과를 나타낸 것으로, 항-ICAM-1 (상단) 또는 VCAM-1 (하단) 다클론항체로 염색한 후 유세포분석을 통해 분석하였다. hTNFα는 내피세포 활성에 대한 양성 대조군이다.
도 5c는 deglyco C1 IgG의 부재 또는 존재하에서 배양한 HUVECs를 로다민-팔로이딘 및 DAPI로 염색한 결과를 나타낸 것이고, 형태를 공초점 현미경으로 관찰하였다.
도 5d는 VEGF 또는 VEGF와 deglyco C1 IgG 존재 또는 부재 (MOCK)하에서 VEGF 의존적 VEGFR (VEGF receptor), Akt 및 ERK (extracellular signal-regulated kinase)의 인산화에 대한 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5e는 최적화된 선도 항체의 in vitro 및 in vivo 독성 평가 결과를 나타낸 것으로, 항체 주입 30일 이후 GOT, GPT, BUN, CRE, 및 TBIL의 혈청 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5f는 최적화된 선도 항체의 in vitro 및 in vivo 독성 평가 결과를 나타낸 것으로, 항체 주사 1일 후 및 28일 후 마우스 체중을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5g는 최적화된 선도 항체의 in vitro 및 in vivo 독성 평가 결과를 나타낸 것으로, 항체 주사 30일 후 신장 및 간 조직의 세포사멸 상태를 TUNEL 어세이를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 deglyco C1 IgG의 부재 (MOCK) 또는 존재 (적색)하에서 VEGF 의존적 튜브 형성 어세이를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 VEGF 의존적 튜브 형성 어세이를 수행한 결과로 총 가지 숫자는 대조군 (MOCK) 튜브 형성의 백분율로 표시된다.
도 6c는 모항체 IgG (녹색), deglyco C1 IgG (적색) 및 베바시주맙 (청색)의 존재 또는 부재 (MOCK)하에서 배양된 절단 대동맥 고리에서 VEGF 의존적 혈관 자람의 이미지를 나타낸 것이다.
도 6d는 자란 혈관의 수를 카운팅한 결과를 나타낸 것이다.
도 6e는 모항체 IgG, Deglyco C1 IgG 및 베바시주맙의 존재 또는 부재 (MOCK)하에서 누드 마우스 중 매트리겔 플러그에서 VEGF 의존적 미세혈관의 형성을 나타낸 이미지이다.
도 6f는 헤모글로빈 함량을 측정하여 미세혈관의 형성 정도를 나타낸 결과이다. 헤모글로빈 함량은 대조군 (MOCK) 헤모글로빈 함량에 대한 백분율로 표시된다.
도 7a는 SNU182 암세포 이종이식 마우스 조직 중 혈관에 대한 clec14a의 특이적 발현을 검출하기 위해 clec14a 및 CD31에 대한 항체를 통해 면역조직화학을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 CFPAC-1 암세포 이종이식 마우스 조직 중 혈관에 대한 clec14a의 특이적 발현을 검출하기 위해 clec14a 및 CD31에 대한 항체를 통해 면역조직화학을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 7c는 간암 조직의 종양 혈관에서 clec14a을 검출하기 위해 clec14a 및 CD31에 대한 항체를 통해 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 7d는 췌장암 조직의 종양 혈관에서 clec14a을 검출하기 위해 clec14a 및 CD31에 대한 항체를 통해 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 7e는 deglyco C1 IgG의 부재 (MOCK), 존재 (적색) 또는 베바시주맙의 존재(청색)하에서 SNU182-, CFPAC-1 또는 U87 세포 유래 미세혈관 형성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7f는 SNU182-, CFPAC-1 또는 U87 세포 유래 미세혈관 형성을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 헤모글로빈 함량은 대조군 (MOCK) 헤모글로빈 함량에 대한 백분율로 표시된다.
도 7g는 deglyco C1 IgG 및 베바시주맙의 부재 (MOCK), 또는 존재하에서 HCT116 및 HCT116/Beva 세포 유래 종양에 의한 미세혈관 형성을 면역조직화학 CD31을 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7h는 필드 당 CD31 양성을 대조군 (MOCK) 미세혈관 밀도에 대한 백분율로 표시한 결과를 나타낸 것이다.
도 7i는 deglyco C1 IgG의 종양 성장에 대한 영향을 평가한 것으로 deglyco C1 IgG가 체중에 영향을 미치지 않고 종양 사이즈를 줄일 수 있음을 나타낸 것으로 1개월 동안 주 1회 종양 부피 및 체중을 측정한 결과이다.
도 8a는 생산된 최적화 후보 항체의 최종 항체 생산량을 나타낸 것이다.
도 8b는 SDS-PAGE를 통해 생산된 최적화 후보 항체의 90% 정제도 및 경쇄-중쇄 분자량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 HUVEC에 VEGF와 최적화 항체를 처리하고 튜브 길이 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9b는 HUVEC에 VEGF와 최적화 항체를 처리하고 브랜치 수를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 VEGF와 최적화 항체를 처리하고 튜브 길이 변화 (혈관신생 진행)을 확인한 대표 그림 결과를 나타낸 것이다.
도 11a 및 도 11b는 EGM이 존재하는 상황에서 HUVEC 세포에 우수한 항-혈관신생능을 보인 클론 1, 13, 16 항체를 처리한 후 튜브 형성 (tube formation) 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12a 및 도 12b는 clec14a가 발현된 HEK293 세포에서 클론 1, 13, 16 항체를 포함한 최적화 항체에 의해 CLEC14a-매개 세포-세포 접촉 억제 여부를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13a 및 도 13b는 클론 1, 13, 16 항체에 의해 내피 이동 저해능이 나타나는지 여부를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14a는 선별된 항체의 항원 결합 부위를 확인하기 위한 경쟁 ELISA (competition ELISA)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 14b는 최적화 후보 항체가 선별된 deglyco C1과 경쟁적으로 항원에 결합하는지 여부를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 HUVEC(human umbilical vein endothelial cell)과 MAEC(mouse aortic endothelial cell) 세포 표면에 클론 1, 13, 16 항체가 결합능이 있는지 유세포 분석기 (flow cytometry)를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16a는 혈관내피세포 세포-세포 접합에 CLEC14a-CTLD의 역할 및 CLEC14-CTLD 결합 항체가 세포-세포 접합의 저해제로 작용하는 기작을 나타낸 모식도이다.
도 16b는 CLEC14a-CLEC14a 결합에서 CTLD의 역할을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16c는 경쟁 ELISA를 통해 클론 1, 13, 16 항체가 CTLD 도메인 매개성 CLEC14a 분자 결합을 저해하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17a는 CLEC14a-CTLD 결합 항체에 의한 혈관내피세포 표면의 CLEC14a 감소능을 도식화한 것이다.
도 17b는 세포 ELISA 방법을 이용하여 최적화 항체의 CLEC14a 감소능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 일 관점에서, clec14a (C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)에 특이적으로 결합하는 항체로, TGSSSNIGXXXVT (서열번호 1)의 CDR1을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, 서열번호 1의 9번째, 10번째 및 11번째 위치의 아미노산 X 각각은 R, C, G, A, T, W, S, N, V로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항체에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "항체"는 항원을 특이적으로 인식하여 특정 항원에 면역학적으로 반응하는 면역글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자를 의미하며, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 전체 항체(whole antibodies) 및 항체 절편을 포함한다. 또한, 키메라 항체(e.g., 인간화된 쥐 항체), 2가 또는 2중 특이성 분자(bispecific molecules)(e.g., 2중 특이성 항체), 다이어바디(diabodies), 트리어바디(triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies)는 본 발명에 사용되는 항체의 범위에 속한다.

전체 항체(whole antibody)는 경쇄와 중쇄 사이에 이황화 결합(disulfide bond)으로 결합된 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄로 구성되어 있다. 포유류에서는 IgA, IgD, IgE, IgM, IgG, 및 IgG으로 알려진 5개의 항체 아형이 있으며, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 4개의 아형으로 추가로 분류된다.

용어 "항체 절편(antibody fragment)"은 적어도 항원-결합 성능을 유지하는 절편을 가리키며, Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv을 포함할 수 있다. Fab는 항원 결합 부위를 가진, 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 부위, 경쇄의 불변 도메인, 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)으로 구성되어 있다. Fab'는 중쇄의 CH1 도메인의 C-말단에 적어도 1개의 시스테인 잔기를 추가로 포함한다는 점에서 Fab과 다르다. F(ab')2는 힌지 부위(hinge region)의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 가진 두 개의 Fab' 분자로 구성된다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 부위로 구성된 Fv(가변 절편)는 부모 면역글로불린의 원래의 특이성을 포함하는 자강 작은 항체 절편이다. 이황화-안정화된 Fv(Disulfide-stabilized Fv, dsFv)는 이황화 결합을 통하여 경쇄의 가변 부위에 중쇄의 가변 부위를 결합시킴으로써 형성된다. 단쇄 Fv (scFV)는, 중쇄와 경쇄의 각각의 가변부위에서 펩티드 링커에 의하여 공유결합적으로 연결된 Fv이다. 프로테아제(예를 들면, Fab 또는 F(ab')2를 제공하는 파파인(papain) 또는 펩신으로 전체 항체를 프로테아제 처리하여 이들 항체 절편을 얻을 수 있으며, 바람직하게는 유전 재조합 기술에 의하여 구축할 수 있다.

여기에 사용된 용어 "모노클로날 항체(monoclonal antibody)"는 실질적으로 동일한 집단의 항체로부터 수득하고, 단일 에피토프에 대한 결합 특이성 및 친화성을 보이는, 균일한 분자 조성을 가진 항체 분자를 가리킨다.

일반적으로, 면역글로불린은 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 기본 구조 단위를 가진다. 중쇄 각각은 1개의 가변영역 및 3개의 불변 도메인으로 구성되어 있는 반면에 각각의 경쇄는 1개의 가변영역 및 1개의 불변 도메인으로 구성되어 있다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변영역은 3개의 상보성-결정 부위(complementarity-determining regions, 이후, "CDRs"로 칭함) 및 4개의 프레임워크 부위를 포함한다. CDRs은 항체의 에피토프에 결합하기 위하여 기능한다. 각 사슬 상의 CDRs는 N 말단으로부터 시작해서 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 순서대로 배열된다. 이들은 위치한 사슬에 의하여 구별된다.

본 발명에 따른 항체는 먼저, 본 출원의 발명자에 의해 출원된 WO2013/187556에 개시된 clec14a-CTLD 인간항체 (이하, 모항체)의 clec14a-CTLD IgG 클론 1의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3 서열 6개 (서열번호 11 내지 16)를 FDA 승인된 치료용 항체 4종 (adalimumab (humira), omalizumab (Xolair), tratuzumab (herceptin), bevacizumab (avastin))의 프레임워크 부위와 융합하는 CDR 그래프팅 (CDR grafting)을 진행하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, CDR 그래프팅을 진행한 4종의 항체 서열과 모항체와의 응집 정도 및 DI index (developability index)를 관찰하였다. 응집 점수는 서열상의 응집 정도를 예측하는 수치로 값이 낮을수록 응집이 적은 것으로 해석하고, DI index는 용액 중 단백질 안정성을 예측하는 수치로 값이 낮을수록 항체의 용해도 및 안정성이 높은 것으로 해석한다. 그 결과, 모항체는 응집 정도 및 DI index가 상대적으로 높은 형태로 예측이 되는 반면, 4종의 항체 중 오말리주맙 (omalizumab, Xolair)의 프레임워크로 치환된 항체가 응집 정도 및 DI index 모두 우수함을 확인하였다.

또한, 오말리주맙 (omalizumab, Xolair) 프레임워크로 치환된 항체가 CDR 그래프팅한 나머지 3종 항체와 대비하여 생산성이 확보되었으며, 응집은 일어나지 않음을 확인하였다. 또한, 오말리주맙 (omalizumab, Xolair) 프레임워크로 치환된 항체만이 사람 및 쥐의 CTLD에 대한 교차 반응성을 나타내면서도, 모항체와 유사한 항원 반응성 및 모항체와 동등 이상의 튜브 형성 저해능을 가짐을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 17 내지 20으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 가변영역 프레임워크를 포함할 수 있다. 또한, 서열번호 21 내지 24로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 가변영역 프레임워크를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 탈당화 항체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "당화"와 관련하여, 당단백질 예를 들어, 항체의 경우 숙주세포의 종류, 재조합체의 조작방법, 배양 조건에 따라 당화(glycosylation) 여부와 당사슬의 구조나 형태가 달라질 수 있다. 즉, 당단백질의 생산과정에서 당사슬 구조나 당사슬을 구성하는 성분당의 양의 차이 등에 따라 다양한 종류의 당사슬(glycoform)이 생성되어 생산조건의 차이에 따른 불균일성(heterogeneity)이 존재할 수 있게 된다. 당사슬 구조가 서로 다른 당단백질의 경우 생체 내 동태나 조직분포가 천연형과 다르거나, 천연형에 대하여 길항작용을 하여 유해 반응을 일으키기도 하고 장기간 연속 투여 시 항원으로 작용하여 면역학적 문제를 일으킬 수도 있다. 이와 같이 당사슬은 약리효과와 체내동태에 영향을 미칠 수 있는 중요한 요소가 될 수 있다.

이러한 당사슬 조절의 일환으로, 본 발명에 따른 항체는 오말리주맙 (omalizumab, Xolair) 프레임워크로 치환된 항체를 탈당화한 항체일 수 있다. 탈당화 항체는 당쇄화가 되지 않은 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 예를 들어 N-연결 당화 부위 또는 O-연결 당화 부위를 변형 또는 제거할 수 있다. N-연결은 당쇄가 아스파라진 잔기의 측쇄에 부착된 것을 의미할 수 있고, O-연결은 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미할 수 있다.

당화 부위 변형 또는 제거는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 구체적 실시예에서는 항체의 L-CDR1 내에 1개의 N-당화 부위 (N-glycosylation site)가 존재함을 예측하고 예상되는 N-당화 부위에 대하여 (NNK)₃를 이용하여 무작위 scFv 라이브러리를 제작한 다음, 파지디스플레이 기법을 이용하여 탈당화 항체를 선별하였다.

이를 바탕으로, 본 발명에서는 TGSSSNIGXXXVT (서열번호 1)의 CDR1을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, 서열번호 1의 9번째, 10번째 및 11번째 위치의 아미노산 각각은 R, C, G, A, T, W, S, N, V로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 항체를 제공한다.

하나의 실시예에서, 상기 서열번호 1의 9번째, 10번째 및 11번째 위치의 아미노산은 RCG, ATA, WSN 또는 AVV일 수 있다. 상기 아미노산이 RCG인 경우 TGSSSNIGRCGVT (서열번호 2)의 CDR1, ATA인 경우 TGSSSNIGATAVT (서열번호 3)의 CDR1, WSN인 경우 TGSSSNIGWSNVT (서열번호 4)의 CDR1, AVV인 경우 TGSSSNIGAVVVT (서열번호 5)의 CDR1을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 선별된 4종의 탈당화 항체 Deglyco-C1 내지 Deglyco-C4에서 항체의 응집이 전혀 관찰되지 않았으며, 높은 최종 정제 수율을 가짐을 확인하였다. 또한, Xolair 프레임워크로 치환된 항체 대비 탈당화 항체의 특성이 유지되고 있는지 확인한 결과, 4종의 탈당화 항체 Deglyco-C1 내지 Deglyco-C4 모두 사람과 쥐의 CTLD에 대한 교차 반응성이 유지됨을 확인하였다.

상기 서열번호 1의 9번째, 10번째 및 11번째 위치의 아미노산은 바람직하게 RCG일 수 있다. 서열번호 1의 9번째, 10번째 및 11번째 위치의 아미노산이 RCG인 경우, 본 발명에 따른 항체는 TGSSSNIGRCGVT (서열번호 2)의 CDR1을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 2의 CDR1을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체는 Deglyco-C1으로 표시된다. 탈당화 항체의 효능이 유지되고 있는지를 확인하기 위하여 튜브 형성능을 관찰한 결과, Deglyco-C1가 omalizumab 항체의 프레임워크 부위와 CDR 그래프팅된 항체 (clone 1 IgG)와 유사한 정도의 튜브 형성 저해능을 나타냄을 확인하였다. 더욱이, Deglyco-C1의 탈당화 정도를 확인한 결과 당화 패턴이 제거되어 사라짐을 확인하였다.

"인간 항체(human antibody)"는 CDRs, 프레임워크 부위 등을 포함하여, 인간 면역글로불린의 모든 성분의 아미노산 서열로 전체적으로 구성된 분자이다. 인간 질환의 치료법에서 인간 항체는 적어도 3가지의 잠재적인 장점을 가지고 있다. 첫째, 인간 항체는 인간 면역체계와 보다 바람직하게 상호작용하여 보다 효과적으로 타겟 세포를 파괴하는데, 예를 들면, 보체 의존성 세포독성반응(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체의존성 세포-매개 세포독성반응(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)이 있다. 또 다른 이점은 인간 면역체계가 인간 항체를 외부 분자로 인식하지 않는다는 것이다. 더욱이 인간 항체의 반감기는 보다 소량 또는 적은 횟수로 투여될 때 조차 인간 순환계에서 자연적으로 발생하는 항체와 유사하다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간 모노클로날 항체일 수 있으며, clec14a, 바람직하게는 clec14a-매개 혈관신생을 효과적으로 억제하는 인간 내피세포 상에 발현된 clec14a-CTLD에 대한 강력한 친화력을 가질 뿐만 아니라 중쇄 및 경쇄 모두 인간으로부터 유래되어서 낮은 면역원성(immunogenicity)를 가지기 때문에 혈관신생 관련 질환 또는 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

"clec14a (C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)"는 C-타입 렉틴/C-타입 렉틴-유사 도메인(CTL/CTLD) 상과(superfamily)의 멤버를 의미한다. Clec14a는 일련의 상피세포성장인자(epidermal growth factor) 유사 도메인인 C-타입 렉틴-유사 도메인(CTLD) 및 스시-유사 도메인(sushi-like domain)을 구성하는 세포외 도메인인 타입 I 막관통단백질(transmembrane protein)이다. clec14a에 대한 정보는 NCBI GenBank와 같은 공인 데이타베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 clec14a는 Gene ID No 161198을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. "clec14a(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 14, 멤버 A)의 C-타입 렉틴 유사 도메인(C-type lectin-like domain, CTLD)"은 "clec14a-CTLD" 또는 "clec14a CTLD"로도 기술되며, 모두 동일한 의미이다.

"에피토프(epitope)"는 항원 특이성을 결정하는 부위로, 항원결정기(antigenic determinant) 또는 항원결정부위(antigen determining site)도 동일한 의미로 사용된다.

추가적으로, 본 발명에서는 탈당화 항체의 친화도 개선을 위하여, HCDR3의 항원-항체 반응성에 관련된 주요 아미노산 잔기를 변형할 수 있다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 (alanine scanning)법으로 결정하고 이를 무작위 돌연변이를 유도한 무작위 항체 라이브러리 (randomized ab library)를 작성하여 모항체 대비 반응성이 높은 항체를 선별하였다. 각 항체는 이스트 표면 디스플레이 (yeast surface display)와 파지 디스플레이 (phage display) 기법을 이용하여 모항체 대비 특성 및 기능이 유지된 항체를 선별할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 2 내지 5로 구성된 군에서 선택된 CDR1을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 상기 CDR1에 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3를 추가로 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 서열번호 2의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 3의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 또는 서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 서열번호 7 내지 10으로 구성된 군에서 선택된 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 서열번호 2의 CDR1을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 서열번호 7의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 13, 서열번호 25 내지 60으로 구성된 군에서 선택된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 상기 CDR3에 서열번호 11의 CDR1 및 서열번호 13의 CDR2를 추가로 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 13의 중쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 25의 중쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 37의 중쇄 CDR3 또는 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 40의 중쇄 CDR3를 포함할 수 있다.

서열번호 6, 61 내지 96로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 서열번호 13의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호 6의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 서열번호 2의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 13의 중쇄 CDR3;

서열번호 3의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 13의 중쇄 CDR3;

서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 13의 중쇄 CDR3;

서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 13의 중쇄 CDR3;

서열번호 2의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 25의 중쇄 CDR3,

서열번호 2의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 37의 중쇄 CDR3, 또는

서열번호 2의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 40의 중쇄 CDR3를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 서열번호 7의 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 중쇄 가변영역;

서열번호 8의 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 중쇄 가변영역;

서열번호 9의 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 중쇄 가변영역;

서열번호 10의 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 중쇄 가변영역;

서열번호 7의 경쇄 가변영역 및 서열번호 61의 중쇄 가변영역;

서열번호 7의 경쇄 가변영역 및 서열번호 73의 중쇄 가변영역; 또는

서열번호 7의 경쇄 가변영역 및 서열번호 76의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체가 일정한 도메인을 포함할 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 또는 이들의 조합 또는 하이브리드로부터 유래할 수 있다.

여기에 사용된 "조합(combination)"은 동일한 기원의 단쇄 면역글로불린 Fc 절편을 코딩하는 폴리펩티드가 다른 기원의 단쇄 폴리펩티드에 결합되어 다이머 또는 멀티머를 생성하는 것을 의미한다. 이는 다이머 또는 멀티머는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 도메인으로 구성된 군에서 선택된 2개 또는 그 이상의 불변 도메인으로부터 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.

여기에 사용된 용어 "하이브리드(hybrid)"는 다른 기원의 2개 또는 그 이상의 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열이 단쇄 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 내에 존재한다는 것을 의미한다. 예를 들면, 도메인 하이브리드는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 군에서 선택된 1개 내지 4개의 도메인으로 구성될 수 있다. 또한, 하이브리드의 조합은 IgG 아형인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄 불변 도메인으로부터 생성될 수 있다. 하이브리드의 조합은 상기에 정의한 바와 같다.

또한, 본 발명의 항체는 경쇄 불변 부위를 더욱 포함할 수 있으며, 람다(λ) 또는 카파(κ) 경쇄로부터 유래할 수 있다.

바람직하게는 상기 항체는 인간 clec14a-CTLD 뿐만 아니라 쥐과 clec14a-CTLD에 특이적으로 결합하여 혈관신생을 억제할 수 있는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 인간 및 마우스 모두에서 기능하는 인간 항체의 능력, 다시 말해서 교차 반응성(cross-reactivity)은 인간 항체가 마우스 내에서 임상 전 연구가 가능하게 해 주는 이점을 제공한다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체를 포함하는 혈관신생 억제용 조성물 또는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 관한 것이다.

본 발명에 의한 항체가 혈관신생을 효과적으로 억제할 수 있기 때문에, 상기 항체를 유효성분으로서 포함하는 조성물도 혈관신생을 억제하는 데에 유용하며, 추가로 혈관신생 관련 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용할 수 있다.

여기에 사용된 용어 "혈관신생의 억제(suppression of angiogenesis)"는 이전에 존재한 관으로부터 새로운 혈관의 형성 또는 성장을 억제하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적을 위하여, 혈관신생의 억제는 세포 이동, 세포간 접촉을 억제, 보다 바람직하게는 clec14a-매개 세포 이동, clec14a-매개 세포간 접촉, HUVEC 이동, 또는 튜브 형성, clec14a CLTD-CLTD 복합체 형성을 억제함으로써 달성된다.

여기에 사용된 용어 "혈관신생 관련 질환(angiogenesis-related disease)"은 혈관신생의 발생 또는 진행과 관련된 질환을 의미한다. 상기 항체로 치료될 수 있다면, 그 질병은 한정 없이 혈관신생 관련 질환의 범위에 포함될 수 있다. 혈관신생 관련 질환의 예로는 암, 전이(metastasis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성(macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맥경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 암은 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)으로 구성된 군에서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

여기에 사용된 용어 "예방(prevention or prophylaxis)"은 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여하여 관심 질환의 시작을 억제 또는 지연하게 하는 모든 조치를 가리킨다. 용어 "치료(treatment or therapy)"는 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여하여 관심 질환의 증상이 개선되거나 증상이 호전되게 하는 모든 조치를 가리킨다.

본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물이고, 본 분야에서 전형적으로 사용되는 적절한 비히클, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약학적 조성물은 정제, 알약, 분말, 과립제, 캡슐제, 서스펜션, 내복용액, 에멀젼, 시럽, 멸균수용액, 비수용액, 서스펜션, 동결건조물(lyophilizates) 및 좌약과 같은 다양한 경구 또는 비경구 복용형태일 수 있다. 관련하여 본 발명의 약학적 조성물은 필러, 증점제, 바인더, 습윤제, 정제분해물질(disintegrant), 계면활성제 등과 같은 희석제 또는 부형제로 조합하여 제형화될 수 있다. 경구 투여를 위한 고상 조제는 정제, 알약, 분말, 과립제, 캡슐제 등과 같은 형태일 수 있다. 이들 고상제와 관련하여 본 발명의 화합물은 녹말, 칼슘 카보네이트, 수크로즈, 락토오즈, 또는 젤라틴과 같은 하나 이상의 부형제를 조합하여 제형화될 수 있다. 간단한 부형제, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제를 추가로 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 조제는 서스펜션, 내복용액, 에멀젼, 시럽 등일 수 있다. 물 또는 액체 파라핀과 같은 간단한 희석제, 습윤제, 감미제, 방향족, 방부제 등과 같은 다양한 부형제를 액체 조제 내에 포함시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 멸균수용액, 비수용성 용매, 서스펜션, 에멀젼, 동결건조물, 좌약 등과 같은 비경구 복용 형태일 수 있다. 주입가능한 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름 및 에틸 올레에이트와 같은 에스테르가 비수용성 용매 및 서스펜션에 적합할 수 있다. 좌약의 기본 물질은 위텝졸(Witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈 61(Tween 61), 카카오버터(cacao butter), 라우린버터(laurin butter) 및 글리세로젤라틴(glycerogelatin)을 포함한다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 여기에 사용된 용어 "약학적으로 유효한 양(pharmaceutically effective amount)"은 모든 의학적 치료에 적용가능한 합당한 이익과 위험 비율(benefit/risk ratio)로 충분한 질환 치료용 약학적 조성물의 양을 가리킨다. 유효량은 치료해야 할 질환의 중증도, 환자의 나이 및 성별, 질환의 종류, 약제의 활성도, 약제에 대한 민감도, 투여시간, 투여경로, 분비속도, 치료기간, 약제의 공투여 및 본 분야에서 알려진 다른 파라미터를 포함한 다양한 요인에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 투여될 수 있다. 이와 같은 경우에, 종래의 치료법과 함께 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1회량 또는 다회 용량으로 나누어서 투여될 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 복용량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경된다. 조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 랫, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유류 내로 전형적으로 허용된 경로, 예를 들면, 경구로, 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체 또는 상기 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생을 억제하는 방법, 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

상기 항체, 상기 조성물 및 혈관신생 억제는 상기에 기술한 바와 같다.

상세하게 설명하자면, 본 발명의 억제방법은 혈관신생의 억제를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫, 닭 및 인간과 같은 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적 조성물은 비경구적으로(parenterally), 피하로(subcutaneously), 복강내로(intraperitoneally), 폐내로(intrapulmonarily) 또는 코내로(intranasally), 필요하다면, 국소치료를 위해 병변내(intralesional) 투여를 포함하는 적절한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 복용량은 개체의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변하며, 본 분야의 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 상기 항체 또는 상기 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 용어 '항체', '예방' 및 '치료'는 상기에 언급한 바와 같다.

본 발명의 항체로 치료 가능하다면, 암은 제한되지 않는다. clec14a-매개 종양 진행이 발생되는 암이 바람직하다. 상세하게는 본 발명의 항체는 혈관신생을 억제함으로써 암의 발생 또는 진행을 예방할 수 있다. 암의 예로는 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), `고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 항체는 다른 항체 또는 생물학적 활성제 또는 다양한 목적을 위한 물질과 조합하여 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이러한 실시예는 예시의 목적일 뿐 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아님은 당업자에 자명하다.

실시예 1: in silico 기반 CDR 그래프팅을 통한 안정성 개선 항체의 제작

WO2013/187556를 통해 clec14a-CTLD 모항체가 in vitro에서 특이적으로 혈관신생 특성을 조절할 수 있음을 보고한 바 있다. 다만, 모항체 (WO2013/187556의 클론 1)의 경우 정제 과정에서 응집이 현저히 일어남을 확인하고, 항체 수율 향상을 위한 추가 최적화 과정이 필요하였다. 따라서, in silico 기반 CDR 그래프팅을 수행하였다. 모항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 내 6개의 CDR (표 1)을 FDA 승인된 치료용 항체 4종 (adalimumab (humira), omalizumab (Xolair), tratuzumab (herceptin), bevacizumab (avastin)) 각각의 프레임워크 부위에 그래프팅하였다 (도 1a).

in silico 기반 분석 및 Accelrys사에서 제공하는 Discovery studio 3.1 software를 이용하여, CDR 그래프팅을 진행한 4종의 항체 (클론 1 내지 4 IgG)와 모항체의 DI index (developability index)를 각각 비교하였다. DI는 응집 특성에 따라 단클론항체를 평가하는데 사용되는 신속한 in silico 예측 지표이다. DI가 높을수록, 응집도가 더 높음을 나타낸다.

표 2에서와 같이, 모항체 및 CDR 그래프팅을 진행한 4종의 항체 중, 오말리주맙 (omalizumab, Xolair)의 프레임워크 부위 (프레임워크 부위의 구체적 서열은 표 3)를 가진 클론 1 IgG가 모항체 및 CDR 그래프팅을 진행한 기타 항체 (클론 2-4의 IgG)보다 상대적으로 더 낮은 DI를 나타내었으며, 이는 클론 1 IgG의 안정성이 우수함을 의미한다.

클론 1 IgG의 개선된 응집도를 확인하기 위하여, 시각적 관찰을 통해 정제된 모항체 IgG 및 클론 1 IgG의 응집을 비교하고, 이후 분광광도법을 통해 확인하였다. 응집은 모항체 IgG에서만 관찰되었고, 클론 1 IgG에서는 시각적으로 관찰되지 않았다 (도 1b). 분광광도법을 통해 측정된 모항체 IgG 및 클론 1 IgG의 응집 인덱스는 각각 약 23.4 및 1.5이었으며, 이는 클론 1 IgG가 모항체 IgG 보다 더 용해도가 높음을 의미한다 (도 1c).

모항체 IgG 및 클론 1 IgG의 안정성을 추가로 비교하기 위해, 응집체를 침전시키고 원심분리로 제거한 다음, 수용성 항체를 정량하였다. 모항체 IgG 제제 중 약 95%의 항체가 응집된 반면, 클론 1 IgG에서는 어떠한 항체 응집체도 관찰되지 않았다 (도 1d). 이러한 결과는 안정성이 향상된 항체 플랫폼 제조에 in silico 기반 CDR 그래프팅이 효과적 방법임을 제시한다.

실시예 2: 연속적 탈당화 공정 및 기능적 분리를 통한 최적화된 항체의 선별

치료용 단백질에서 당화 이질성은 바이오 의약품의 개발 및 생산 중 특성 품질에 중요한 영향을 미칠 수 있다. in silico 기반 클론 1 IgG의 당화 평가를 통해 클론 1 IgG의 경쇄 CDR1 내에 추정적인 N-당화 부위를 확인하였다. 이러한 예상되는 N-당화 부위를 제거하기 위하여, N-당화 부위에 무작위 변이를 가지는 반합성 항체 라이브러리를 제작하여 탈당화 공정을 수행하였다. 구체적으로, NNK 트리뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드로 랜덤화된 반합성 scFv (single chain variable fragment)를 제작하고, 자성 비드가 코팅된 인간 및 마우스 clec14a-CTLD를 포함하는 파지 디스플레이 기술을 사용하여 연속적으로 바이오패닝을 수행하였다. 마지막으로, 선별된 scFv 클론의 DNA를 시퀀싱한 이후, 인간 및 마우스 clec14a-CTLDs (hclec14a-CTLD 및 mclec14a-CTLD) 모두에 강하게 반응하는 4종의 클론 및 예상 N-당화 부위에서 상이한 아미노산 서열을 무작위적으로 선택하였다 (도 2a).

이후, scFv 클론을 IgG로 전환하고, HEK (human embryonic kidney) 293 세포에서 발현시킨 다음, 정제하였다. ELISA 분석에 따르면, 모든 정제된 탈당화 IgG (deglyco C1-C4 IgGs)들은 hclec14a-CTLD-Fc 및 mclec14a-CTLD-Fc 둘 다에 특이적으로 결합하나, Fc 단독에는 결합하지 않음을 확인하였으며, 이는 clec14a-CTLD 특이적으로 결합하는 항체임을 의미한다(도 2b).

또한, 표 4에서와 같이 4종의 탈당화 IgG (deglyco C1-C4 IgGs)들은 응집이 전혀 관찰되지 않았으며, 특히 deglyco C1 및 deglyco C2가 높은 최종 정제 수율을 가짐을 확인하였다.

항체 엔지니어링 중 도입된 유전적 변이는 예상하지 못한 결함을 유도하며, 결과적으로 항체 기능을 감소시킨다. clec14a 매개 혈관 신생을 억제하는 항체를 분리하기 위해서, 클론 1 IgG 및 deglyco C1-C4 IgG의 존재 또는 부재하에서 튜브 형성 및 HUVECs (human umbilical vein endothelial cells)를 이용한 내피 이동 어세이를 수행하였다. 4종의 deglyco IgG 중에서 deglyco C1 IgG를 선도 항체로 선별하였는데, deglyco C1 IgG가 HUVEC 튜브 형성 (도 2c 및 도 2d) 및 이동 (도 2e 및 도 2f)에 가장 우수한 저해 효과를 나타내었기 때문이다. 또한, deglyco C1 IgG이 경쇄 CDR1 내에 아미노산 서열에 목적하는 변화를 포함 (N32R/N33C/S34G)하고 있음을 확인하였다.

Deglyco C1 IgG의 생화학적 특성을 분석하기 위하여, 환원 조건에서 1차원 전기영동을 사용하여 deglyco C1 IgG 및 클론 1 IgG의 이동성을 먼저 평가하였다. Deglyco C1 VL의 분자량은 예상한 분자량과 유사하게 25 kDa인 반면, 탈당화 전 당화 형태인 클론 1 VL의 분자량은 더 높았다 (도 2g).

2차원 전기영동 또한, 등전점 (pI)보다 낮은 범위에 존재하는 클론 1 scFv의 이종 패턴이 deglyco C1 scFv에서는 존재하지 않음을 나타내고 있으며, 이는 deglyco C1 IgG의 향상된 동질성을 의미한다 (도 2h).

종합적으로, 이러한 결과들은 선별된 선도 항체는 병리학적 혈관 신생을 효과적으로 억제하고, 균질성이 향상된 항-혈관신생 항체임을 제시한다.

실시예 3: 최적화된 선도항체의 생화학적 및 기능적 특성

Deglyco C1 IgG의 clec14a-CTLD 결합 위치를 확인하기 위하여, HRP (horseradish peroxidase)가 컨쥬게이션된 deglyco C1 IgG (deglyco C1 IgG-HRP)를 제작한 후, 경쟁 ELISA를 실시하였다.

hclec14a-CTLD-Fc에 결합하는 deglyco C1 IgG-HRP는 모항체 IgG 첨가에 의해 탁월하게 경쟁적이었으며, 이는 모항체 및 deglyco C1은 유사한 clec14a-CTLD 결합 위치를 가짐을 의미할 수 있다 (도 3a).

Deglyco C1 IgG가 인간 내피세포에 결합하는지 확인하기 위하여, HUVECs으로 유세포분석을 수행하였다. Deglyco C1 IgG는 모항체 IgG와 유사한 방식으로 HUVECs 표면에 특이적으로 결합하였다. 또한, deglyco C1 IgG의 hclec14a-ECD (extracellular domain of human clec14a)에 대한 결합 친화도를 측정하기 위하여 항체-항원 결합에 대한 실시간 측정을 수행하였으며, deglyco C1 IgG는 모항체 IgG와 유사한 약 6nM의 KD (equilibrium dissociation constant) 상수를 가짐을 확인하였다 (도 3c).

종합적으로, 이러한 결과를 통해 2단계의 최적화 공정에도 불구하고, 최적화 선도 항체의 결합 특성은 모항체 IgG와 유사한 정도로 유지됨을 확인할 수 있다.

Deglyco C1 IgG 및 베바시주맙 (bevacizumab)의 in vitro 혈관신생 억제 효과를 비교하기 위하여, 모항체 IgG, deglyco C1 IgG 또는 양성대조군으로 베바시주맙의 존재 또는 부재하에서 튜브 형성 및 이동 어세이를 수행하였다. Deglyco C1 IgG는 HUVEC 튜브 형성을 현저하게 저해하였고 (도 3d 및 3e), 베바시주맙 in vitro와 유사한 정도로 이동을 억제하였다 (도 3f 및 3g). 이는 선도 항체의 항-혈관신생 활성 효능이 베바시주맙에 상당함을 의미한다.

실시예 4: 최적화된 선도항체의 신규 작용 기작

혈관신생에서 deglyco C1 IgG의 작용 기작을 확인하기 위해, 야생형 clec14a으로 형질감염되고 모항체 IgG 또는 deglyco C1 IgG의 존재 또는 부재하에서 배양된 HEK293F 세포를 통해 형성된 세포 응집체의 숫자를 모니터링하여, clec14a 매개 세포-세포 접촉에 대한 기능적 어세이를 수행하였다.

clec14a 매개 세포-세포 접촉을 특이적으로 차단하는 양성대조군으로 모항체 IgG를 사용하였다. Deglyco C1 IgG는 모항체 IgG와 유사한 방식으로 야생형 clec14a으로 형질감염된 세포의 응집을 억제하는 효능을 보였으며, 이는 혈관신생에서 clec14a 매개 세포-세포 접촉에 대한 deglyco C1 IgG의 저해 효능을 제시한다 (도 4a 및 도 4b).

분자 수준에서 구체적으로 혈관신생에서의 deglyco C1 IgG 작용 기작을 분석하기 위해 모항체 IgG 또는 deglyco C1 IgG를 증가하는 농도로 포함하거나 또는 부재하에서 hclec14a-CTLD-Fc-HRP (HRP-labeled hclec14a-CTLD-Fc)로 HUVECs를 처리하였다. Deglyco C1 IgG는 모항체 IgG와 유사하게 농도 의존적 방식으로 HUVECs에 결합하는 clec14a-CTLD를 현저하게 억제하였다 (도 4c).

또한, 모항체 IgG 또는 deglyco C1 IgG를 증가하는 농도로 포함하거나 또는 부재하에서 hclec14a-CTLD-Fc-HRP를 정제된 hclec14a-ECD와 함께 인큐베이션하였다. deglyco C1 IgG는 모항체 IgG와 유사하게 농도 의존적 방식으로 hclec14-CTLD와 hclec14a-ECD 사이의 분자적 상호작용을 직접적으로 저해하였다 (도 4d).

종합적으로, 이러한 결과는 제작된 항체가 clec14a-CTLD 매개 clec14a 분자 사이의 분자적 상호작용 직접적으로 차단하여 혈관신생 동안 내피세포-세포 접촉을 특이적으로 저해하는 상호작용 차단제로서 역할함을 제시한다.

실시예 5: 내피세포 독성 및 내피세포 중 VEGF 신호작용에 대한 최적화된 선도 항체의 영향

내피세포 독성에 대한 deglyco C1 IgG의 영향을 평가하기 위해, deglyco C1 IgG 처리 후 HUVECs 생존도를 측정하였다. 생존도는 Cell Counting Kit-8 (#CK04-13, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)를 통해 제조자의 매뉴얼에 따라 측정하였다.

HUVECs는 이러한 세포에 대하여 세포독성 효과를 나타내지 않은 반면, 5-FU (5-fluorouracil)은 HUVECs의 생존도를 현저하게 감소시켰다 (도 5a).

또한, 면역세포화학을 사용하여 deglyco C1 IgG의 존재 또는 부재하에서 HUVEC의 형태를 평가하였다. Deglyco C1 IgG은 HUVEC의 형태를 변경하지는 않았다 (도 5b). 해로운 자극에 대한 초기 염증 반응인 deglyco C1 IgG의 내피세포 활성에 대한 영향을 평가하기 위해, HUVECs를 deglyco C1 IgG로 처리하고 VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) 및 ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule-1)을 포함하는 내피세포 활성 마커의 발현을 측정하여 HUVEC 활성을 모니터링하였다. 인간 종양 괴사 인자 (hTNFα)를 내피세포 활성에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. deglyco C1 IgG는 HUVEC 활성에 영향이 거의 없는 반면, hTNFα는 예상했던 바와 같이 HUVEC 활성을 유도하였다 (도 5c).

내피세포 내 VEGF 의존적 신호작용에 대한 deglyco C1 IgG의 효과를 확인하기 위해 VEGF 처리된 HUVECs를 deglyco C1 IgG 존재 또는 부재하에서 면역블롯 분석하여 VEGFR (VEGF receptor), Akt 및 ERK (extracellular signal-regulated kinase)의 인산화에 대한 변화를 모니터링하였다. Deglyco C1 IgG는 HUVECs에서 VEGFR, Akt 및 ERK의 VEGF 의존적 인산화에 대한 영향이 거의 없었다 (도 5d).

deglyco C1 IgG의 in vivo 독성을 확인하기 위해 주 2회 정상 마우스에 deglyco C1 IgG를 정맥주사 한 다음, 대조군과 실험군 사이의 간 및 신장 기능, 체중 및 간 및 신장 조직의 세포사멸 상태를 비교하였다. 간 기능은 GOT (glutamic-oxaloacetic transaminase), GPT (glutamic pyruvic transaminase), 및 TBIL(total bilirubin)의 혈청 농도를 측정하여 확인하였고, 신장 기능은 BUN(blood urea nitrogen) 및 CRE(creatinine) 농도를 측정하여 확인하였다. 세포사멸은 TUNEL 염색을 통해 측정하였다.

그 결과, 간 기능 및 신장 기능에서 유의한 변화는 없었다 (도 5d). 체중에서도 유의한 변화는 없음을 확인하였다 (도 5e). 또한, 세포사멸 상태가 관찰되었다 (도 5f). 이러한 결과는 deglyco C1 IgG가 중증의 in vivo 독성을 유발하지 않음을 제시한다.

종합적으로, 이러한 결과를 통해 deglyco C1 IgG는 심각한 내피세포독성을 유발하거나, 정상 내피세포 in vivo에서 VEGF 매개 신호작용에 부정적 영향을 미치지 않음을 제시한다.

실시예 6: 최적화된 선도항체의 VEGF 의존적 혈관신생에 대한 효과

Deglyco C1 IgG의 VEGF 의존적 혈관신생에 대한 in vitro 효과를 확인하기 위해, deglyco C1 IgG 존재 또는 부재하에서 HUVECs를 VEGF로 처리한 후, HUVEC 튜브 형성 어세이를 수행하였다. 150μl의 Matrigel을 48웰 플레이트에 넣고, 30분 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다. EGM-2에서 배양된 HUVEC(10⁵)를 수확하고, Matrigel이 코팅된 플레이트에 접종하고 클론 1 IgG, 모항체 IgG, 탈당화 clec14a-CTLD IgG 또는 베바시주맙의 존재 또는 부재하에서 37℃ 18시간 동안 인큐베이션하였다. VEGF 포함 EBM (endothelial cell basal medium)에서 배양된 HUVECs를 Matrigel이 코팅된 플레이트에 접종하고 deglyco C1 IgG (20 μg ml^-1)의 존재 또는 부재하에서 37℃ 18시간 동안 인큐베이션하였다.

Deglyco C1 IgG은 현저하게 거의 완벽한 수준으로 VEGF 의존적 튜브 형성을 제거하였다 (도 6a).

VEGF 의존적 혈관신생에 대한 deglyco C1 IgG의 효과를 추가로 더 확인하기 위해 deglyco C1 IgG와 베바시주맙의 존재 또는 부재하에서 ex vivo 랫 대동맥 고리 어세이를 수행하였다. 랫 대동맥에서 혈관은 EBM (endothelial basal medium)으로 거의 자라지 않지만, VEGF 발현 조건에서 대부분의 혈관이 랫 대동맥에서 자랐다. 더욱이, deglyco C1 IgG은 VEGF와 함께 배양할 때 베바시주맙과 유사한 정도의 효과로 랫 대동맥에서 자라는 혈관의 수를 감소시킴을 관찰하였다 (도 6b 및 도 6c).

VEGF 의존적 혈관신생에 deglyco C1 IgG in vivo 효능을 관찰하기 위해, 마우스 매트리겔 모델 (mouse Matrigel model)을 정립하고, 헤모글로빈 레벨을 미세혈관 형성의 표지자로 측정하여, 마우스 매트리겔 플러그 어세이에서 미세혈관 형성에 대한 deglyco C1 IgG 및 베바시주맙의 저해 효과를 비교하였다. Deglyco C1 IgG은 베바시주맙과 유사한 방식으로 헤모글로빈 함량을 현저하게 감소시켰다 (도 6d 및 도 6e).

종합적으로, 이러한 결과는 제작된 항체가 VEGF 의존적 비정상적 혈관신생을 in vivo에서 억제하는 효능이 있음을 제시한다.

실시예 7: 종양 혈관신생에 대한 최적화된 선도항체의 효과

종양 혈관신생에서 clec14a의 연관성을 확인하기 위해, 먼저 SNU182 인간 간세포 또는 CFPAC-1 인간 췌장암 세포 암종을 포함한 이종이식 종양 모델 (xenograft tumor models)을 정립하고, clec14a 및 공지의 내피 마커 단백질인 CD31에 대한 상업적으로 입수 가능한 항체를 통해 면역조직화학을 수행하였다. 면역조직화학은 0.1% (w/v) 젤라틴 코팅된 글라스 커버슬립에서 자란 HUVECs (5×10⁴)를 deglyco C1 IgG 존재 또는 부재하에서 24시간 37℃로 인큐베이션하였다. 4% (w/v) PFA로 세포를 고정시키고, 1시간 동안 37℃로 5% (w/v) BSA 및 0.1% (v/v) Triton X-100을 포함하는 PBS로 차단한 다음 로다민-팔로이딘 (1 unit/well) 및 Hoechst 33258 염색약으로 1시간 동안 인큐베이션하였다.

CD31과 유사하게 SNU182- 및 CFPAC-1 종양 이종이식의 혈관에서 clec14a이 발현되었고, 이는 종양 혈관에서 clec14a이 특이적으로 발현함을 의미한다 (도 7a 및 도 7b).

면역조직화학을 사용하여 임상 샘플 중 종양 혈관에서 clec14a의 특이적 발현을 평가하기 위해, 정상 및 간암과 췌장암 환자 조직 혈관 중 clec14a의 발현을 비교하였다. 그 결과 암 환자 조직의 혈관에서 clec14a이 뚜렷하게 특이적으로 증가함을 확인하였으나, 정상 혈관에서는 그러하지 않았다 (도 7c 및 도 7d).

종양 혈관신생 in vivo에 대한 deglyco C1 IgG의 영향을 확인하기 위해, 흉선 제거 누드 마우스에서 종양 세포 유래 매트리겔 플러그 혈관신생 어세이를 수행하였다. 매트리겔을 포함하는 SNU182-, CFPAC-1 세포 및 U87 인간 교종세포를 10 mg/kg 단회 투여 deglyco C1 IgG 및 베바시주맙의 존재 또는 부재하에서 흉선 제거 누드 마우스에 이식하였다. 2주 후, 매트리겔 플러그를 제거하고, 각 군에서의 총 헤모글로불린 함량을 ELISA 리더기로 측정하였다. Deglyco C1 IgG은 SNU182-, CFPAC-1 및 U87 인간 교종세포 유래 헤모글로빈을 베바시주맙과 유사한 정도로 현저하게 감소시켰다 (도 7e 및 도 7f).

U87 인간 신경교종에 대하여도, deglyco C1 IgG는 체중에 영향을 주지 않고 베바시주맙과 마찬가지로 U87 세포의 종양 크기를 유의하게 감소시키는 것을 확인 하였다 (도 7i). deglyco C1 IgG가 in vitro에서 HUVEC의 생존, 모양 또는 활성화에 크게 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 이는 최적화된 항체가 in vivo에서 유의한 내피 독성을 일으키지 않음을 의미한다.

HCT116 인간 대장암 세포 및 베바시주맙이 적용된 HCT116 인간 대장암 세포 (HCT116 및 HCT116/Beva)를 이용하여 deglyco C1 IgG 또는 베바시주맙 5 mg/kg 단일 용량의 존재 또는 부재하에서 매트리겔 플러그 혈관 신생 어세이를 수행하였다. 14일이 지난 후 매트리겔 플러그를 제거하였고, CD31 및 미세혈관 마커에 대한 면역조직화학을 수행하였다. 미세혈관 밀도는 공초점 현미경에 의해 얻어진 이미지 각각에서 필드 당 CD31 양성을 정량화하여 측정하였다. deglyco C1 IgG 또는 베바시주맙은 HCT116 세포의 미세혈관 형성능을 유사하게 유의한 정도로 감소시킴을 확인하였다. 유사하게 HCT116/Beva 세포에 의한 미세혈관 형성은 deglyco C1 IgG에 의해 유의하게 억제되었으나, 베바시주맙에 의해 저해되지 않았다 (도 7g, 도 7h). 이는 베바시주맙 내성 대장암 세포에서 종양의 혈관신생을 억제할 수 있는 deglyco C1 IgG의 뛰어난 능력을 보여준다.

종합적으로, 이러한 결과는 제작한 항체가 in vivo에서 종양 혈관신생을 억제하는 효능을 가짐을 제시한다.

실시예 8: 최적화 선도항체의 선별 및 효능 분석

실시예 8-1. 최적화 선도항체의 선별

추가 최적화 항체를 선별하기 위하여, 항체 36종을 추가 선별하였으며, deglyco C1 대비 친화도가 개선된 항체를 선별하였다. 표 5의 36종의 항체들 (IgG 항체 형태)이 포함된 포유동물 발현 벡터들을 각각 PEI (polyethylenimine)를 이용하여 HEK293 세포에 형질감염 후, 7일 동안 40 ml씩 배양하였다. 원심분리를 이용하여 배양액을 획득한 후 단백질 A 친화도 크로마토그래피 (affinity column chromatography with protein A sepharose column)을 통해 정제하였다. SDS-PAGE를 통해 90%의 정제도를 확인하였으며, 경쇄 및 중쇄의 분자량을 동시에 확인하였다 (도 8a).

리터 배양으로 환산하였을 때, 생산성이 우수한 클론 (약 50 mg/L 이상) Opti 1, Opti 3 및 Opti 16 (클론 1, 3 및 16)을 1차로 선정하였다.

실시예 8-2. 선별된 항체의 in vitro 효능 분석

혈관신생의 주요 인자의 VEGF 의존성 혈관신생(VEGF-dependent angiogenesis)에 최적화 선도항체의 혈관신생 억제능을 확인하기 위해, 실시간 혈관신생 분석이 가능한 IncuCyte FLR live content imaging system (Essen Bioscience Inc)을 이용하여 항 혈관신생능을 비교 분석하였다. 먼저 GFP-형질감염된 HUVEC을 94 웰 플레이트에 깔고 36종의 항체를 20 ug/ml의 농도로 처리하여 in vitro 효능을 비교하였다. 이 때 parental IgG(모항체: WO2013/187556의 클론 1), deglyco C1 및 베바시주맙(avastin)을 양성대조군으로 사용하여 최적화 항체와의 효능을 비교 분석하였다.

그 결과를 도 9a 및 도 9b 각각에 나타내었으며, 튜브 길이 (tube length: 도 9a) 및 브랜치 포인트 (branch point: 도 9b) 모두 처리한 항체들이 항-혈관신생능을 가짐을 확인할 수 있었으며, 특히 클론 1, 3 및 16의 강한 효능을 확인하였다.

VEGF와 최적화 항체를 처리하고 튜브 길이 변화 (혈관신생 진행)을 확인한 대표적 결과를 나타낸 도 10에 따르면, VEGF만을 단독처리군에서 보듯이 튜브 길이가 길어짐(혈관신생 진행)을 확인할 수 있었으며, hIgG (human IgG, 대조군 항체)는 투여 항체의 음성 대조군으로 무반응임을 확인하였다. 또한, suramin (angiogenesis 저해제, small chemical), avastin(IgG)는 양성대조군으로 사용하였다. 특히, 최적화 항체 클론 1, 3 및 16이 양성대조군인 suramin, avastin과 동일한 효능을 가짐을 확인할 수 있었다.

EGM은 다양한 혈관신생 인자가 포함된 일종의 복합물로 혈관내피세포를 이용한 강한 혈관신생 유도에 사용되어 왔다. 따라서, 최적화 항체의 VEGF 의존성 혈관신생 뿐만 아니라 EGM과 같은 다양한 혈관신생 인자들이 존재하는 상황에서도 항-혈관신생능이 있는지를 확인하기 위해, EGM이 존재하는 상황에서 HUVEC 세포를 48 웰 마이크로타이터 플레이트에 깔고 모항체 (original C1), deglyco C1을 일종의 양성대조군으로 하고, 우수한 항-혈관신생능을 보인 클론 1, 13, 16을 각각 20 ug/ml 농도로 처리한 후 튜브 형성 (tube formation) 정도를 비교 분석하였다.

그 결과를 도 11a 및 도 11b에 나타내었으며, 선정 항체들이 EGM 의존성 혈관신생을 현저히 억제함을 최종 확인하였다. 따라서, 클론 1, 13, 16 항체를 포함한 최적화 항체들은 다양한 혈관신생 인자들에 의해 일어날 수 있는 혈관신생을 효율적으로 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

혈관신생의 주요 기전은 앞서 설명한 튜브 길이, 브랜치 수 (numbers of branches), 튜브 형성 이외에도 내피세포-세포 접촉 (endothelial cell-cell contact)이 주요 기전으로 이해되고 있다. 따라서, CLEC14a-매개 세포-세포 접촉 (clec14a-mediated cell-cell contact)을 진행하기 위해 HEK293 세포에 clec14a가 포함된 포유동물 발현 벡터를 형질감염 시킨 후, HEK293 세포의 세포-세포 접촉 (aggregate, clec14a 매개성 세포 접합의 표지자로 활용)가 증가됨을 확인할 수 있다. Aggregate는 현미경하에서 매뉴얼로 직접 계수 (counting) 하여 처리 항체에 대한 효능을 비교 분석하였다. 이 조건에서 처리 항체의 항-혈관신생능을 확인하기 위해 20 ug/ml의 항체를 각각 처리하였고 이 때 모항체 (original C1) 및 deglyco C1을 각각 양성 대조군으로 사용하였다. 그 결과를 도 12a 및 도 12b에 나타내었으며, 최종적으로 모든 항체가 CLEC14a-매개 세포-세포 접촉을 탁월하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

혈관신생의 다른 기능 중의 하나인 내피 이동 (endothelial migration)에 대한 최적화 선도항체의 효능을 in vitro서 분석하기 위해, IncuCyte FLR live content imaging system (Essen Bioscience Inc)을 이용하여 HUVEC 이동 어세이 (HUVEC migration assay)를 진행하였다. 이 때 상처 (wound)는 Incucyte사에서 제공하는 상처 마커 (wound maker)를 이용하여 균일한 상처를 생성하였고, 20 ug/ml 항체를 각각 처리하여 이동 억제능을 비교 평가하였다. 그 결과를 도 13a 및 도 13b에 나타내었으며, 클론 1, 13, 16을 포함한 최적화 항체들이 모항체 (original C1), deglyco C1 IgG, 및 avastin과 동일한 내피 이동 (endothelial migration) 저해능을 가짐을 최종 확인하였다.

실시예 8-3. 선별된 항체의 항원 결합 부위 확인

선별된 항체의 항원 결합 부위를 확인하기 위해 경쟁 ELISA (competition ELISA)를 진행하였다. 구체적으로, 먼저 CTLD 항원을 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 코팅을 하고 HRP-접합된 deglyco C1 IgG과 결합을 유도하였다 (도 14a). 동시에 각각의 36종의 항체를 처리하여 deglyco C1과 경쟁적으로 항원에 결합을 하는지를 확인함으로서 deglyco C1 IgG와 36종 항체의 항원 결합부위를 확인하였다. 그 결과를 도 14b에 나타내었으며, 모든 36종의 항체는 deglyco C1 IgG와 유사한 항원 결합 부위를 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 8-4. 최적화 항체의 종간 교차반응성 확인

최적화 항체의 종간 교차 반응성(cross-species reactivitiy)을 확인하기 위해 HUVEC(human umbilical vein endothelial cell)과 MAEC(mouse aortic endothelial cell)을 각각 배양하고 두 세포에 20 ug/ml 모항체 (original C1), deglyco C1, 클론 1, 13, 16을 각각 처리하여 두 세포 표면에 결합능이 있는지를 유세포 분석기 (flow cytometry)를 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다. 결론적으로, 최적화 항체의 3종 클론 1, 13, 16은 사람 및 쥐 CLEC14a에 결합할 수 있는 종간 교차 반응성이 있음을 확인하였다.

실시예 8-5. 최적화 항체의 작용 기전 분석

최적화 항체들의 작용 기전 분석을 위해 먼저 최적화 항체의 혈관내피세포의 세포-세포 접합 저해능을 확인하였다. 본 출원의 발명자들은 혈관내피세포 세포-세포 접합에 CLEC14a 중 특히 CTLD 도메인이 중요한 역할을 함과 CLEC14-CTLD 결합 항체(original C1)가 이들의 상호작용 저해제로서 역할을 하는 것을 밝힌 바 있다 (도 16a).

이를 증명하기 위해 COS-7 세포에 야생형 (wild-type) CLEC14a와 CTLD 도메인이 결손된 CLEC14a DCTLD을 각각 형질감염 시킨 후, 이들의 세포 파쇄물을 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 코팅하였다. 또한 정제된 HRP-접합된 CTLD-Fc를 인큐베이션하여 CTLD 결합을 확인하였다. 그 결과를 도 16b에 나타내었다. 결론적으로 CTLD 도메인이 CLEC14a-CLEC14a 결합에 중요함을 확인하였다. 도 16c은 경쟁 ELISA를 통해 항원:항체의 몰비를 0:1, 1:1, 1:2로 증가시키면서 HRP-conjugated CTLD-Fc가 CLEC14a에 결합하는 정도를 비교 분석한 결과로, 이 때 항체는 모항체 (original C1), deglyco C1을 각각 양성 대조군으로 사용하고 3종의 최적화 항체 대표 클론 1, 13, 16을 대조군으로 처리하였다. 그 결과, 모든 처리 항체가 농도 의존적으로 CTLD 도메인 매개성 CLEC14a 분자 결합(CTLD-mediated interaction between CLEC14a molecules)을 탁월하게 저해함을 확인하였다.

또한, 최적화 항체들의 작용 기전 분석을 위해 혈관내피세포 표면의 CLEC14a 감소능(down-regulation)을 확인하였다. 도 17a는 기존 CLEC14a-CTLD 결합 항체(모항체: original C1)에 의한 혈관내피세포 표면의 CLEC14a 감소능을 도식화 한 것이다. 최적화 항체의 CLEC14a 감소능을 확인하기 위해 HUVEC을 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 코팅하고 20 ug/ml 모항체 (original C1), deglyco C1, 및 3종의 클론 1, 13, 16 최적화 항체를 처리한 후 시간별 HUVEC 표면에 존재하는 CLEC14a의 양적 레벨을 세포 ELISA (cell ELISA) 방법을 이용하여 최종 확인하였다. CLEC14a의 양적 레벨은 상업적으로 입수 가능한 (commercially available) 양(sheep)의 항-CLEC14a 항체 (sheep anti-CLEC14a Ab)를 사용하고 2차 항체로 HRP-접합된 항-양 항체를 사용 후, TMB를 이용하여 발색을 하고 흡광도 450 nm에서 ELISA reader를 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 17b에 나타내었으며, 처리 항체가 혈관내피세포 표면의 CLEC14a 감소능을 나타냄을 확인하였다.

본 발명에 따른 clec14a에 특이적으로 결합하는 탈당화 항체는 우수한 생산량을 나타내고, 사람과 쥐에 대한 교차반응성을 유지하며, 목적하는 항원 반응성을 나타내면서도, 응집이 적어 항체의 용해도 및 안정성이 우수할 뿐 아니라, 개선된 튜브 형성 저해능을 가지는 바, 개선된 항체 특성 및 효능을 나타내는 개량 항체를 제공할 수 있다.

구체적 구성을 참조하여 본 발명을 상세하게 기재하였으나, 이러한 기재는 바람직한 구현예에 관한 것이고, 발명의 범위를 제한하지 않음은 당업자에 자명한 것이다. 이에, 본 발명의 실질적 범위는 출원된 청구항 및 그 등가물에 의해 정의된다 할 것이다.

서열목록 자유텍스트

전자파일 첨부하였음.

<110> SCRIPPS KOREA ANTIBODY INSTITUTE <120> Deglycosyalted Antibody Binding Specifically to clec14a and Uses Thereof <130> PP-B1950 <150> KR 10-2016-0115577 <151> 2016-09-08 <160> 96 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 <400> 1 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Xaa Xaa Xaa Val Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 <400> 2 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Cys Gly Val Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 <400> 3 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Thr Ala Val Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 <400> 4 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Trp Ser Asn Val Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 <400> 5 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Val Val Val Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Deg C1 VH <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Thr Trp Trp Val Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Deg C1 VL <400> 7 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg 20 25 30 Cys Gly Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Deg C2 VL <400> 8 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala 20 25 30 Thr Ala Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Deg C3 VL <400> 9 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Trp 20 25 30 Ser Asn Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Deg C4 VL <400> 10 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala 20 25 30 Val Val Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR1 <400> 11 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Asp Met Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR2 <400> 12 Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 13 Gly Ala Thr Trp Trp Val Leu Gly Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 <400> 14 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ser Val Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR2 <400> 15 Ala Asp Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR3 <400> 16 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH FR1 <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser 20 25 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH FR2 <400> 18 Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH FR3 <400> 19 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH FR4 <400> 20 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL FR1 <400> 21 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL FR2 <400> 22 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL FR3 <400> 23 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL FR4 <400> 24 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 25 Gly Ala Ala Thr Lys Val Leu Gly Lys Phe Asp Cys 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 26 Gly Ala Ala Ser Pro Val Leu Gly Pro Phe Asp Glu 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 27 Gly Ala Thr Trp Trp Val Leu Gly Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 28 Gly Ala Glu Phe Val Val Leu Gly Ser Phe Asp Met 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 29 Gly Ala Ala Arg Cys Val Leu Gly Asn Phe Asp His 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 30 Gly Ala Ser Arg Thr Val Leu Gly Asn Phe Asp Asp 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 31 Gly Ala His Leu Thr Val Leu Gly Ile Phe Asp Thr 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 32 Gly Ala His Ile Tyr Val Leu Gly Gln Phe Asp Gly 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 33 Gly Ala Asn Leu Gly Val Leu Gly Glu Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 34 Gly Ala Val Pro Pro Val Leu Gly Ala Phe Asp Thr 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 35 Gly Ala Arg Ile Asp Val Leu Gly Pro Phe Asp Ala 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 36 Gly Ala Lys Pro Pro Val Leu Gly Gln Phe Asp Arg 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 37 Gly Ala Met Glu Gln Val Leu Gly Pro Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 38 Gly Ala Arg Ser Trp Val Leu Gly Glu Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 39 Gly Ala Glu Cys Ala Val Leu Gly Asn Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 40 Gly Ala Arg Arg Gln Val Leu Gly Cys Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 41 Gly Ala Ser Ala Pro Val Leu Gly Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 42 Gly Ala Ser Thr Pro Val Leu Gly Ser Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 43 Gly Ala His Tyr Asn Val Leu Gly Pro Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 44 Gly Ala Arg Thr Cys Val Leu Gly Pro Phe Asp His 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 45 Gly Ala Ile Ala Pro Val Leu Gly Gly Phe Asp Arg 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 46 Gly Ala Arg Gln Ser Val Leu Gly Pro Phe Asp Ala 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 47 Gly Ala His Tyr Asn Val Leu Gly Pro Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 48 Gly Ala Lys Tyr Tyr Val Leu Gly His Phe Asp Glu 1 5 10 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 49 Gly Ala Ala Leu Arg Val Leu Gly Met Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 50 Gly Ala His Arg Arg Val Leu Gly Trp Phe Asp Asp 1 5 10 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 51 Gly Ala Tyr His Thr Val Leu Gly Gln Phe Asp Gln 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 52 Gly Ala Gln Ser Thr Val Leu Gly Asn Phe Asp Thr 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 53 Gly Ala His Met Arg Val Leu Gly Pro Phe Asp Gly 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 54 Gly Ala Ala Leu His Val Leu Gly Pro Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 55 Gly Ala His Gly Gln Val Leu Gly Asp Phe Asp Gln 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 56 Gly Ala Ser Gln Glu Val Leu Gly Asp Phe Asp Val 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 57 Ser Ala Thr Trp Trp Met Ser Glu Pro Arg Ser Tyr 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 58 Gly Ala Asp Asn His Val Leu Gly Asp Phe Asp Val 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 59 Gly Ala His Lys Pro Val Leu Gly Asp Phe Asp Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 60 Gly Ala His His Ala Val Leu Gly Pro Phe Asp Arg 1 5 10 <210> 61 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ala Thr Lys Val Leu Gly Lys Phe Asp Cys Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ala Ser Pro Val Leu Gly Pro Phe Asp Glu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Thr Trp Trp Val Leu Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 64 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Glu Phe Val Val Leu Gly Ser Phe Asp Met Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 65 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ala Arg Cys Val Leu Gly Asn Phe Asp His Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 66 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ser Arg Thr Val Leu Gly Asn Phe Asp Asp Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala His Leu Thr Val Leu Gly Ile Phe Asp Thr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 68 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 68 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala His Ile Tyr Val Leu Gly Gln Phe Asp Gly Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Asn Leu Gly Val Leu Gly Glu Phe Asp Lys Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Val Pro Pro Val Leu Gly Ala Phe Asp Thr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 71 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 71 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Arg Ile Asp Val Leu Gly Pro Phe Asp Ala Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 72 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Lys Pro Pro Val Leu Gly Gln Phe Asp Arg Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 73 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Met Glu Gln Val Leu Gly Pro Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 74 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 74 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Arg Ser Trp Val Leu Gly Glu Phe Asp Lys Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 75 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 75 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Glu Cys Ala Val Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gln Val Leu Gly Cys Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 77 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ser Ala Pro Val Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 78 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 78 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ser Thr Pro Val Leu Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 79 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala His Tyr Asn Val Leu Gly Pro Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Arg Thr Cys Val Leu Gly Pro Phe Asp His Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 81 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 81 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ile Ala Pro Val Leu Gly Gly Phe Asp Arg Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 82 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Arg Gln Ser Val Leu Gly Pro Phe Asp Ala Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 83 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 83 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala His Tyr Asn Val Leu Gly Pro Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 84 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Lys Tyr Tyr Val Leu Gly His Phe Asp Glu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 85 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 85 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ala Leu Arg Val Leu Gly Met Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 86 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 86 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala His Arg Arg Val Leu Gly Trp Phe Asp Asp Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 87 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr His Thr Val Leu Gly Gln Phe Asp Gln Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 88 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 88 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Gln Ser Thr Val Leu Gly Asn Phe Asp Thr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 89 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala His Met Arg Val Leu Gly Pro Phe Asp Gly Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 90 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 90 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ala Leu His Val Leu Gly Pro Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 91 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala His Gly Gln Val Leu Gly Asp Phe Asp Gln Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 92 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ser Gln Glu Val Leu Gly Asp Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 93 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 93 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ala Thr Trp Trp Met Ser Glu Pro Arg Ser Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 94 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 94 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Asp Asn His Val Leu Gly Asp Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 95 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 95 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala His Lys Pro Val Leu Gly Asp Phe Asp Ala Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 96 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 96 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala His His Ala Val Leu Gly Pro Phe Asp Arg Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (12)

1. clec14a에 특이적으로 결합하는 항체로,
   서열번호 2의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 13의 중쇄 CDR3;
   서열번호 2의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 25의 중쇄 CDR3;
   서열번호 2의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 37의 중쇄 CDR3; 또는
   서열번호 2의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2 및 서열번호 40의 중쇄 CDR3를 포함하는 항체.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 탈당화된 것을 특징으로 하는 항체.
4. 제1항에 있어서,
   서열번호 21 내지 24로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프레임워크 부위를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
5. 제1항에 있어서,
   서열번호 7의 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
6. 삭제
7. 제1항에 있어서,
   서열번호 6, 61, 73 및 76으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
8. 삭제
9. 제1항에 있어서,
   서열번호 7의 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 중쇄 가변영역;
   서열번호 7의 경쇄 가변영역 및 서열번호 61의 중쇄 가변영역;
   서열번호 7의 경쇄 가변영역 및 서열번호 73의 중쇄 가변영역; 또는
   서열번호 7의 경쇄 가변영역 및 서열번호 76의 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
   
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제

Images