EA044106B1 - АНТИ-huTNFR1 ТЕРАПИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА - Google Patents
АНТИ-huTNFR1 ТЕРАПИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА Download PDFInfo
- Publication number
- EA044106B1 EA044106B1 EA202091182 EA044106B1 EA 044106 B1 EA044106 B1 EA 044106B1 EA 202091182 EA202091182 EA 202091182 EA 044106 B1 EA044106 B1 EA 044106B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- antibodies
- hutnfr1
- binding
- Prior art date
Links
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 117
- 208000008338 non-alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 claims description 89
- 206010053219 non-alcoholic steatohepatitis Diseases 0.000 claims description 65
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 claims description 54
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 53
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 46
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 45
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 15
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 13
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 10
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 claims description 2
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 claims description 2
- 201000000464 cone-rod dystrophy 2 Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 claims 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 53
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 44
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 36
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 29
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 23
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 17
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 16
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 16
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 14
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 14
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 13
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 13
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 13
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 13
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 10
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 10
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 9
- 235000009200 high fat diet Nutrition 0.000 description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 230000007863 steatosis Effects 0.000 description 9
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 8
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 8
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 7
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 7
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 7
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 7
- 101100425753 Homo sapiens TNFRSF1A gene Proteins 0.000 description 6
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 6
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 4
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 4
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000013218 HFD mouse model Methods 0.000 description 4
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 239000002451 tumor necrosis factor inhibitor Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 3
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 description 3
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 3
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 3
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000013424 sirius red staining Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 3
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-(octadecanoyloxy)propyl octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 206010018429 Glucose tolerance impaired Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102100026238 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 208000001280 Prediabetic State Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 229940121360 farnesoid X receptor (fxr) agonists Drugs 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 2
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 2
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 201000009104 prediabetes syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000022309 Alcoholic Liver disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 102000000546 Apoferritins Human genes 0.000 description 1
- 108010002084 Apoferritins Proteins 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010057573 Chronic hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061819 Disease recurrence Diseases 0.000 description 1
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 1
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000018656 Mitogen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010052006 Mitogen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 101710104937 Non-specific acid phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229940126033 PPAR agonist Drugs 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 102000003728 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000029 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101150009046 Tnfrsf1a gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 206010001584 alcohol abuse Diseases 0.000 description 1
- 208000025746 alcohol use disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000011230 antibody-based therapy Methods 0.000 description 1
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- -1 coatings Substances 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000035618 desquamation Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 229940082789 erbitux Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940074045 glyceryl distearate Drugs 0.000 description 1
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000012528 insulin ELISA Methods 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000000395 magnesium oxide Substances 0.000 description 1
- CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N magnesium oxide Inorganic materials [Mg]=O CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N magnesium;oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[Mg+2] AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000021597 necroptosis Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 208000037920 primary disease Diseases 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 239000003340 retarding agent Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000009094 second-line therapy Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical class S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 102000014898 transaminase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к новому лечению неалкогольного стеатогепатита (NASH) и связанных с ним заболеваний.
Предшествующий уровень техники
Неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) представляет собой спектр заболеваний, возникающих при отсутствии злоупотребления алкоголем, и включает неалкогольный стеатогепатит (NASH). NAFLD показывает рост заболеваемости в западных странах и вносит критический вклад в развитие гепатоцеллюлярной карциномы.
Одним из фундаментальных шагов на пути от доброкачественного стеатоза печени к прогрессирующему стеатогепатиту является появление гибели клеток гепатоцитов, классифицируемой как апоптоз. Некроптоз появился в качестве альтернативного запрограммированного пути гибели клеток, и было обнаружено, что он активируется в печени пациентов с NASH (Gautheron et al. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology 2015, 1:264-266).
Aparicio-Vergara et al. (Hepatology 2013, 57 (2): 566-576) описывают роль слущивания эктодомена TNFR1 в предотвращении развития стеатоза печени или инсулинорезистентности. Невозможность слущивания TNFR1 не приводила к ожирению, инсулинорезистентности или стеатозу печени у мышей. Однако мыши, содержащие мутацию без слущивания, показали быстрое прогрессирование в направлении NASH. Было обнаружено, что активация выделения эктодомена TNFR1 играет ключевую роль в ослаблении прогрессии в направлении NASH.
Cubero et al. (Cell Death and Differentiation 2013, 20:1580-1592) описывают, что TNFR1 в гепатоцитах и иммунных клетках играют разные роли в способе действия при хроническом заболевании печени.
Tomita et al. (Gut 2006, 55: 415-424) описывают, что усиление опосредуемого TNFa/TNFR сигнального пути может быть критически вовлечено в патогенез фиброза печени на модели животных NASH.
Yaron Ilan (AASLD Liver Learning. Ilan Y. Nov 8 2014; 60709) раскрывает пероральную иммунотерапию на основе анти-TNF для лечения жировой болезни печени. Анти-TNF гибридный белок (PRX-106), который связывает TNFa, использовали на мышиной модели с высоким содержанием жира в диете.
Было обнаружено, что антитела к TNFR1 обладают агонистическим потенциалом, вызывая ответ, имитирующий лиганд. Этот ответ предполагает, что сигнальная трансдукция инициируется агрегацией рецепторов путем связывания поливалентных тримеров TNF.
Тем не менее, TNFR1-селективное ингибирование может быть достигнуто с помощью TNFR1специфических антител. Например, моноклональное мышиное антитело, Н398 и антитело, описанное в US 5736138, с селективностью в отношении человеческого TNFR1, продемонстрировало сильное ингибирование опосредованной TNF трансдукции сигнала и цитотоксичности (Moosmayer et al. 1995, Ther. Immunol. 2:31-40).
Гуманизированная версия Н398 описана в W02008/113515A2.
В WO2012035141 раскрыто антитело против huTNFR1, которое дефицитно по опосредованию эффекторной функции.
Моновалентные антитела против huTNFR1 описаны в WO2017174586 А1.
Zettlitz et al. (LandesBioscience 2010, November/Dezember: 639-647) описывают получение гуманизированного TNFR1-специфического антагонистического моноклонального антитела.
Richter et al. (PLOS One 2013, 8 (8): 1-13) описывают применение гуманизированного антагонистического анти-TNFR1 антитела для селективного ингибирования сигнального пути TNFR1 при снижении провоспалительной активности TNF, оставляя при этом нетронутым TNFR2.
Berger et al. (Protein Engineering, Design & Selection 2013, 26(10):581-587) описывают гибридный белок анти-TNFR1 scFv-HAS как селективный антагонист действия TNF. Feagins et al. (Eur J Gastroenterol Hepatol. 2015, 27 (10): 1154-1160) описывают, что у пациентов, получавших ингибиторы фактора некроза опухоли (TNFi), развивается неалкогольная жировая болезнь печени (NASH или стеатоз).
Терапевтические возможности лечения NASH лимитированы и ограничены модификациями образа жизни, так как конкретные лекарства пока недоступны. Таким образом, существует потребность в обеспечении эффективного лечения NASH и связанных с ним заболеваний.
Сущность изобретения
Задачей изобретения является обеспечение улучшенного лечения NASH и соответствующих болезненных состояний.
Задача решается объектом изобретения.
Изобретение предусматривает новое медицинское применение антител, которые специфически распознают человеческий рецептор-1 фактора некроза опухоли (huTNFR1), для лечения пациентов, страдающих NASH и/или, в частности, любым заболеванием, связанным с NASH, среди которых стеатоз печени, активность заболевания NAFLD (NAS), апоптоз, фиброз и высокие уровни аланинтрансаминазы (ALT) и инсулина. Следовательно, изобретение обеспечивает новый способ лечения пациентов, страдающих от NASH и связанных с ним заболеваний.
В частности, изобретение относится к антителу, специфически распознающему huTNFR1, для применения при лечении неалкогольного стеатогепатита (NASH) и связанных с ним заболеваний.
- 1 044106
Согласно конкретному аспекту, антитело представляет собой выделенное антитело.
Согласно конкретному аспекту, антитело представляет собой моноклональное и/или рекомбинантное антитело.
В соответствии с конкретным аспектом, антитело специфически распознает эпитоп в мембраннодистальном CRD1 и/или субдомене A1 CRD2 из huTNFR1, предпочтительно специфически распознает эпитоп, представленный аминокислотами с 1 по 115 или с 1 по 70 в N-концевой области huTNFR1. В частности, последовательность huTNFR1 идентифицируется как SEQ ID NO: 32.
Согласно конкретному воплощению, антитело представляет собой моноспецифическое, двухвалентное полноразмерное антитело или фрагмент антигенсвязывающего антитела.
В соответствии с другим конкретным воплощением антитело представляет собой одновалентное связующее huTNFR1, содержащее только один антигенсвязывающий сайт, который обладает специфичностью связывать huTNFR1. В частности, антитело моновалентно распознает huTNFR1.
Согласно конкретному воплощению антитело выбрано из группы одновалентных антител, состоящей из молекул Fab, молекул scFv, единичных вариабельных доменов, дисульфидстабилизированных Fv (dsFv), антител полу-IgG1 и Fv-доменов или функционально активных производных любого из вышеупомянутых, предпочтительно, где конструкция антитела связана с гидрофильным полимером, таким как ПЭГ, и/или слита с полипептидом, таким как человеческий (или мышиный) сывороточный альбумин, трансферрин, альбумин-связывающие домены или пептиды, Ig-связывающие домены или пептиды, удлинения ПЭГ-миметического полипептида, Fc-фрагмент антитела, Fc-фрагмент антитела, несущий мутации для обеспечения предпочтительной гетеродимеризации (по сравнению с гомодимеризацией), или функциональный вариант любого из вышеуказанных полипептидов.
В частности, антитело представляет собой любой домен Fab, scFv, dsFv или Fv, который слит с фрагментом Fc антитела, где Fc состоит из гетеродимера доменов СН2 и СН3, где домены СН2 и/или СН3 несут одну или несколько точечных мутаций, которые допускают преимущественную гетеродимеризацию по сравнению с гомодимеризацией. В частности, один или оба домена СН3 в Fc модифицированы для изменения аминокислотной структуры, например, для получения Fc, содержащего гетеродимер доменов СН3/СН3.
В частности, конструкция антитела включает Fv-домены, слитые с Fc-областью или фрагментом антитела, с дополнительными доменами антитела или без них, при этом сохраняя моновалентную связывающую структуру антитела. Конкретный пример относится к фрагменту Fab или фрагменту Fv, слитому с Fc или модифицированным Fc.
Предпочтительное антитело включает тяжелую и легкую цепи, где тяжелая цепь состоит из домена VH, домена СН2 и СН3, необязательно дополнительно включает один или несколько линкеров, а легкая цепь состоит из домена VL, домена СН2 и СН3, необязательно дополнительно включает один или несколько линкеров.
Конкретные воплощения включают Fc из IgG1 человека, в котором домены СН2-СН3 образуют гетеродимер в результате одной или нескольких мутаций выступы-в-углубления, например, мутаций выступов, модифицирующих поверхность бета-листов СН3, присутствующих на одном мономере домена СН3, которые представляют собой T366W; и мутаций углублений, модифицирующих поверхность бета-листов СН3, присутствующих на другом мономере домена СН3, которые выбраны из группы, состоящей из T366S, L368A, Y407V.
В частности, антитело включает Fc-область, которая включает одну или несколько мутаций для снижения эффективности эффекторной функции. В соответствии с конкретным аспектом, Fc-область получена с помощью гликоинженерии так, чтобы понижать модуляцию эффекторной функции.
В соответствии с конкретным воплощением конструкция антитела включает Fc-область человеческого или искусственного IgG1, которая представляет собой функциональный вариант Fc из IgG1 человека с идентичностью последовательностей, по меньшей мере, любой из 60%, 70%, 80%, 85% или 90%, которая подвергнута мутации для понижения эффекторной функции. Предпочтительно Fc-область включает тяжелую цепь, по меньшей мере, с одной мутацией, выбранной из группы, состоящей из Е233Р, L234V, L235A, 2G236, A327G, A330S и P331S, предпочтительно, включающей A327G/A330S/P331S (нумерация индекса EU по Kabat). Предпочтительно, по меньшей мере, две из указанных мутаций, более предпочтительно, по меньшей мере, три, четыре, пять или все шесть мутаций встроены в последовательность Fc. SEQ ID NO: 31 идентифицирует последовательность Fc из IgG1 человека.
В частности, антитело является ПЭГ-илированным, ГЭК-илированным или ПСА-илированным.
В частности, антитело ПЭГ-илируется с помощью ПЭГ с молекулярной массой в диапазоне от 5000 до 150000 г/моль. Типичные конструкции антител, такие как Fab, ПЭГ-илированы с помощью ПЭГ 40000.
В частности, антитело представляет собой половинное антитело IgG1, характеризующееся только одной Fab-частью, шарнирной областью и одной Fc-частью, где шарнирная область и/или Fc-часть (в частности, Fc из IgG1 человека) включает одну или несколько мутаций для того, чтобы избежать димеризации тяжелой цепи (Gu et al. (2015) PLoS One 10(1):e0116419), например, выбранных из группы, состоящей из мутации в шарнирной области (SEQ ID NO: 33): C226S, C229S (нумерация EU) и мутации в
- 2 044106 части Fc: P395A, F405R, Y407R, K409D (нумерация EU).
В частности, антитело представляет собой гибридный белок Fv-Fc, где Fv состоит из пары доменов VH/VL, и где VH слит с первой цепью домена СН2-СН3 через первую область шарнира/линкера, a VL слит со второй цепью домена СН2-СН3 через вторую область шарнира/линкера. Предпочтительно первая и вторая доменные цепи СН2-СН3 отличаются друг от друга одной или несколькими точечными мутациями, например, для обеспечения преимущественной гетеродимеризации между первой и второй цепями домена СН2-СН3, в результате чего получают препарат Fv-Fc, который характеризуется Fcгетеродимером, например, через мутации выступы-в-углубления, как указано выше.
Конкретно, антитело включает стабилизированный дисульфидом Fv (dsFv), который характеризуется одной или несколькими дополнительными (искусственными) междоменными дисульфидными связями. Такие дисульфидные связи получают путем введения одного или нескольких дополнительных остатков цистеина в любом из доменов VH и VL в подходящих положениях, которые можно использовать в качестве мостика из дисульфидных связей, соединяющих домены VH и VL, где дисульфидные связи получают после восстановления цистеинов. Согласно конкретным примерам, дисульфидная связь может быть введена в Fv в любом из следующих положений в VH и соответствующих положениях в VL: 44C в VH и 100С в VL, 108C в VH и 55С в VL, 106C в VH и 56С в VL или 101C в VH и 46C в VL.
В частности, антитело включает
a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), включающий определяющие комплементарность области (CDR): VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3; и
b) вариабельный домен легкой цепи (VL), включающий CDR: VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где
i)
V H-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO: 1;
V H-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 2;
V H-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 3;
V L-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO: 4;
V L-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 5;
VL-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 6; или ii)
V H-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO: 23;
V H-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 24;
V H-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 25;
V L-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO: 26;
V L-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 27;
V L-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 28;
г де нумерация соответствует индексу EU по Kabat;
или функционально активный вариант любого из i) или ii) выше, который включает 0, 1 или 2 (или до 1, то есть 0 или 1) точечные мутации в каждой из последовательностей CDR и который специфически распознает huTNFR1.
В частности, антитело включает VH и VL, где VH-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO: 1;
V H-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 2;
V H-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 3;
V L-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO: 4;
V L-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 5; и
V L-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 6;
г де нумерация соответствует индексу EU no Kabat;
или его функционально активный вариант, включающий до 1 (то есть, 0 или 1) точечной мутации в любой одной или нескольких или в каждой из последовательностей CDR, и который специфически распознает huTNFR1.
В частности, последовательности VH и VL характеризуются последовательностями VH- и VL-CDR, где
i)
VH-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO VH-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO
VH-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO
VL-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO VL-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO VL-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO или ii)
VH-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO: 1;
1;
10, где X в положении 5 представляет собой S;
3;
4;
5; и
11, где X в положении 3 представляет собой G;
VH-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 10, где X в положении 5 представляет собой S;
- 3 044106
VH-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 3;
VL-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO: 4;
VL-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 5; и
VL-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 11, где X в положении 3 представляет собой S.
В частности, антитело включает последовательность VH, включающую или состоящую из SEQ ID NO: 7 или 9; и последовательность VL, включающую или состоящую из SEQ ID NO: 8 или 10, или их функционально активный вариант, включающий до 1 точечной мутации в любой одной или нескольких или в каждой из последовательностей CDR и по меньшей мере 60% идентичности последовательностей в любой одной или нескольких, или в каждой из каркасных (FR) последовательностей FR1-4 из VH и VL.
Конкретные комбинации VH/VL, включающие антигенсвязывающий сайт, способный специфически узнавать и связываться с huTNFR1, представляют собой любое из:
а) последовательность VH, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 7; и последовательность VL, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 8; или
б) последовательность VL, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 9; и последовательность VL, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 10.
В частности, антитело представляет собой полноразмерный или антигенсвязывающий фрагмент антитела, включающий или состоящий из Fab, который включает:
а) последовательность тяжелой цепи (НС), включающую или состоящую из SEQ ID NO: 11; и
b) последовательность легкой цепи (LC), включающую или состоящую из SEQ ID NO: 12;
или его функционально активный вариант, включающий до 1 точечной мутации в любой одной или нескольких или в каждой из последовательностей CDR доменов VH и VL, содержащихся в НС и LC, соответственно, и по меньшей мере 60% идентичности последовательностей в любой одной или нескольких, или в каждой из FR-последовательностей FR1-4 доменов VH и VL.
В частности, антитело включает:
а) последовательность НС, включающую или состоящую из SEQ ID NO: 18; и
б) последовательность LC, включающую или состоящую из SEQ ID NO: 13;
или его функционально активный вариант, включающий до 1 точечной мутации в любой одной или нескольких или в каждой из последовательностей CDR доменов VH и VL, содержащихся в НС и LC, соответственно, и по меньшей мере 60% идентичности последовательностей в любой одной или нескольких, или в каждой из FR-последовательностей FR1-4 доменов VH и VL.
Конкретные функционально активные варианты антитела, включающего НС, идентифицированной в SEQ ID NO: 18, и LC, идентифицированной в SEQ ID NO: 13, включают
НС, состоящую из:
a) VH, включающей или состоящей из SEQ ID NO: 19 или, по меньшей мере, последовательностей CDR, содержащихся в указанной последовательности VH;
b) линкерной последовательности, состоящей из 4-10 аминокислот, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, предпочтительно состоящей из ряда глицинов, серинов или треонинов, в любой комбинации, такой как, например, линкер, состоящий из SEQ ID NO: 15;
c) домена СН2, включающего или состоящего из SEQ ID NO: 16; и
d) домена СН3, включающего или состоящего из SEQ ID NO: 20; и
LC, состоящую из:
a) VL, включающей или состоящей из SEQ ID NO: 14 или, по меньшей мере, последовательностей CDR, содержащихся в указанной последовательности VH;
b) линкерной последовательности, состоящей из 4-10 аминокислот, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, предпочтительно состоящей из ряда глицинов, серинов или треонинов, в любой комбинации, такой как, например, линкер, состоящий из SEQ ID NO: 15;
c) домена СН2, включающего или состоящего из SEQ ID NO: 16; и
d) домена СН3, включающего или состоящего из SEQ ID NO: 17.
В частности, такое антигенсвязывающее антитело кодируется одной или несколькими молекулами нуклеиновой кислоты, включающими
а) НС, кодируемую последовательностью SEQ ID NO: 22; и
б) LC, кодируемую последовательностью SEQ ID NO: 21;
или его функционально активный вариант, включающий до 1 точечной мутации в любом одном или нескольких или в каждой из последовательностей CDR доменов VH и VL, содержащихся в НС и LC, соответственно, и по меньшей мере 60% идентичности последовательностей в любой одной или нескольких, или в каждой из FR-последовательностей FR1-4 доменов VH и VL.
Согласно конкретному воплощению антитело включает антигенсвязывающий сайт, характеризующийся следующей комбинацией шести последовательностей CDR, которые включают или состоят из:
SEQ ID NO: 23: VH-CDR1;
SEQ ID NO: 24: VH-CDR2;
SEQ ID NO: 25: VH-CDR3;
SEQ ID NO: 26: VL-CDR1;
- 4 044106
SEQ ID NO: 27: VL-CDR2; и
SEQ ID NO: 28: VL-CDR3;
или его функционально активный вариант, включающий до 1 точечной мутации в любой одной или нескольких или в каждой из последовательностей CDR, и специфически распознающий huTNFR1.
В частности, антитело включает антигенсвязывающий сайт, включенный в домены VH и VL, где
а) VH включает или состоит из SEQ ID NO: 29; и
б) VL включает или состоит из SEQ ID NO: 30;
или его функционально активный вариант, включающий 0, 1 или 2 (или до 1) точечных мутаций в любой одной или нескольких или в каждой из последовательностей CDR доменов VH и VL и, по меньшей мере, 60% идентичности последовательностей в любой одной или нескольких или в каждой из FRпоследовательностей FR1 -4 доменов VH и VL.
В частности, антитело включает домен VH и VL, где по меньшей мере один из доменов VH и VL представляет собой функциональный вариант родительского домена, подвергнутого созреванию аффинности, включающий по меньшей мере одну точечную мутацию в любой из последовательностей области, определяющей комплементарность (CDR), где
a) родительский домен VH характеризуется последовательностями CDR: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25; и
b) родительский домен VL характеризуется последовательностями CDR: SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.
В частности, указанная по меньшей мере одна точечная мутация присутствует в любой из SEQ ID NO: 24 и/или SEQ ID NO: 28.
В частности, любое из типичных антител (которые представляют собой антитела, характеризующиеся последовательностями, представленными в настоящем документе), может быть использовано согласно изобретению. Аналогичным образом могут быть использованы любые альтернативные антитела, которые включают тот же антигенсвязывающий сайт и/или имеют одинаковую специфичность связывания с мишенью. Конкретными альтернативными антителами являются те, которые являются функциональными вариантами типичных антител, где любое из типичных антител можно использовать в качестве родительского для получения варианта, который обладает функцией специфического распознавания мишени huTNFR1.
В частности, антитело представляет собой антитело, полученное путем созревания аффинности у родительского антитела, которое характеризуется последовательностями, представленными в настоящем документе, в частности, где 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей CDR являются функционально активными вариантами CDR, включающими до 1 точечной мутации по сравнению с соответствующей CDR в родительском антителе.
В конкретных воплощениях функционально активное вариантное антитело включает только 0, 1, 2 или 3 точечных мутации в каждой из последовательностей CDR, предпочтительно только 0, 1 или 2 точечных мутации в каждой из последовательностей CDR, где точечная мутация представляет собой любое из числа замены, вставки или делеции одной аминокислоты.
Любой из функционально активных вариантов антитела (родительского антитела), описанных в данном документе, конкретно характеризуется специфичностью связывания huTNFR1. Функционально активный вариант может включать одну или несколько мутантных последовательностей FR, которые включают одну или несколько, например, несколько точечных мутаций, например до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 точечных мутаций для получения вариантной последовательности, по меньшей мере, с 60% идентичности последовательностей или, по меньшей мере, 70% идентичности последовательностей, или, по меньшей мере, 80% идентичности последовательностей, или, по меньшей мере, 90% идентичности последовательностей по сравнению с соответствующей последовательностью FR в родительском антителе.
В частности, антитело включает антигенсвязывающий фрагмент, который связывает huTNFR1 с KD менее 10’8 М или 5x10’9 М и koff менее 10-3 с-1. Аффинность связывания и характеристики связывания (ассоциация и диссоциация) конкретно определяются в стандартном тесте для определения моновалентного связывания, по существу исключая эффекты авидности двухвалентного связывания. Стандартный тест основан на измерении пьезоэлектрического микровзвешивания (QCM) при физиологической температуре (около 37°С или при 37°С +/- 1°С). Такое измерение аффинности, в частности, выполняется в формате Fab. Таким образом, если антитело представляет собой любое другое, отличное от Fab, антигенсвязывающий сайт, в частности, вводится в соответствующую молекулу Fab для измерения аффинности с помощью QCM при 37°С. Это обеспечивает сопоставимость результатов измерения аффинности одновалентных связующих независимо от эффектов авидности, которые могут помешать измерению аффинности. Особенно предпочтительный QCM выполняется при умеренной плотности рецепторов. В частности, аффинность связывания конструкции антитела с huTNFR1 определяют для формата Fab с помощью QCM при 37°С и умеренной плотности рецепторов в диапазоне 50-100 Гц, например, приблизительно при 50 Гц или при 50 Гц +/- 10 Гц или при 50 Гц +/- 5 Гц.
- 5 044106
В частности, KD составляет менее 4х10-9 М или менее 3х10-9 М или менее 2х10-9 М или менее 10-9
М или даже менее 10-10 М.
В частности, koff составляет менее 10-3, или менее 5х10-4 с-1, или менее 10-4 с-1, или менее 10-5 с-1.
В частности, антигенсвязывающий фрагмент распознает huTNFR1 с kon по меньшей мере 105 М-1с-1.
В соответствии с конкретным аспектом болезненные состояния представляют собой любое из числа стеатоза печени, воспаленной печени, фиброза печени (или апоптоза) и гепатоцеллюлярной карциномы. В частности, подвергают лечению пациента с NASH, который подвержен риску развития или уже страдает от какого-либо заболевания. Несколько показателей NASH или связанных с ними заболеваний включают активность болезни NAFLD (NAS) и высокие уровни ALT и инсулина в сыворотке, которые могут быть эффективно снижены при лечении, описанном в настоящем документе.
В частности, пациент также страдает от сахарного диабета II типа, сахарного диабета I типа, предиабет, инсулинорезистентности или ожирения, при этом под ожирением понимают пациента с индексом массы тела
В частности, антитело вводят пациенту в эффективном количестве. В частности, это количество эффективно для противодействия передаче сигналов TNFa/huTNFR1. Особенно предпочтительно, чтобы антитело представляло собой антагонистическое антитело, что таким образом позволяет избежать существенной передачи сигналов и трансдукции, опосредованной TNFa/TNFR, измеренной в анализе на основе клеток. Любое из антител, описанных в настоящем документе и характеризующихся последовательностями антител, приведенными в данном документе, в частности, понимается как антагонистические антитела.
Согласно конкретному аспекту, антитело непосредственно ингибирует взаимодействие рецептора TNF-huTNFR1, что определяется в анализе на основе клеток, предпочтительно посредством анализа для ингибирования опосредованной TNFR1 клеточной гибели у клеток Kym-1 или путем анализа ингибирования высвобождения IL-6 или IL-8 из клеток HeLa или клеток НТ1080, соответственно. В частности, в анализе ингибирования TNFR1-опосредованной гибели клеток в клетках Kym-1 значение IC50 составляет менее 5,0х10-9 М. В частности, в анализе ингибирования высвобождения IL-6 из клеток HeLa значение IC50 составляет менее 4,0х10-8 М или в анализе на ингибирование высвобождения IL-8 из клеток НТ1080 значение IC50 составляет менее 2,0 х10-8М.
В соответствии с конкретным воплощением используют антитело, которое связывается с huTNFR1 моновалентным взаимодействием и снижает риск проявления агонистической активности TNFмиметика. Особенно предпочтительными являются антитела с высокой аффинностью связывания с TNFR1 и низкой скоростью диссоциации, что обеспечивает превосходное ингибирование TNFR1зависимых ответов TNF.
В частности, антитело, описанное в настоящем документе, предоставляется в фармацевтическом составе, содержащем антитело и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель. Из-за антагонистических свойств антитела фармацевтический состав может содержать высокие концентрации антител, позволяя избежать при этом побочных эффектов, возникающих в результате агонистической активности.
В частности, фармацевтический состав составлен для парентерального применения, предпочтительно путем внутривенного или подкожного введения.
В частности, антитело, описанное в настоящем документе, обладает низкой иммуногенностью и может многократно использоваться без образования ингибиторов, таких как антитела к лекарственному средству (ADA).
Неожиданно оказалось, что описанные в данном документе антитела, в частности моновалентные антитела, можно использовать для лечения пациентов, у которых развивается ADA, например, которые выработали антитела против иммуноглобулина или иммунотерапевтических антител. В предшествующем уровне техники наличие таких ADA, в частности, исключало бы дальнейшую иммунотерапию антителами, направленными против TNFR1, поскольку ADA обладает способностью перекрестно связывать антитела при связывании TNFR1 на клеточной поверхности, тем самым потенциально агонистически действуя на передачу сигналов TNFR1. Однако антитела, описанные в данном документе, не действуют агонистически (или по существу не действуют агонистически) на передачу сигналов TNFR1 даже в присутствии ADA.
В частности, фармацевтический состав, описанный в данном документе, может быть введен пациентам, у которых развились ADA, например ADA против анти-huTNFR1 антител или любых структур IgG.
В частности, эффективное количество антитела вводят пациенту, страдающему NASH, для уменьшения любого одного или нескольких из числа
a) стеатоза, содержания триглицеридов, воспаления и/или апоптоза в ткани печени;
b) уровня аминотрансферазы в сыворотке;
c) инсулинорезистентности и, возможно, положительной динамики толерантности к глюкозе; и/или
- 6 044106
d) балла активности NAFLD.
В частности, антитело вводят пациенту, страдающему NASH, в дозе от 0,05 до 20 мг/кг, предпочтительно от 0,2 до 6 мг/кг. Количество, эффективное для человека, может быть выведено из терапевтически эффективной дозы, описанной в мышиной модели (20 мг/кг). HED (эквивалентная доза для человека) составляет ~ 1-2 мг/кг.
Предпочтительные дозы антител составляют, например, от 0,5 до 1000 мг, предпочтительно 1-400 мг. При введении подкожно предпочтительная доза составляет от 0,5 до 400 мг.
Согласно конкретному аспекту антитело вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве путем системного введения, предпочтительно путем внутривенной инфузии или болюсной инъекции.
В соответствии с конкретным воплощением антитело вводят пациенту многократно, например, еженедельно, в.в. или п.к. инъекциями в дозе, например, 0,5-5 мг/кг, в частности, около 2 мг/кг. Частоту и дозу вводимого лекарственного средства можно адаптировать к состоянию болезни и реакции на тера пию.
В частности, антитело вводят пациенту, страдающему NASH, в сочетании с диетической обработкой. Лечение антителами может, в частности, сочетаться с противовоспалительными лекарственными средствами, такими как NSAP/NSAID, или с терапией с применением агониста фарнезоидного Хрецептора (FXR), агониста рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (GLP1R) или агониста рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPAR).
Если не указано иное, положения в данном документе нумеруются в соответствии с индексом EU по Kabat. Объяснение схемы нумерации Kabat можно найти в Kabat, EA, et al, Sequences of proteins of immunological interest (NIH publication no. 91-3242, 5th edition (1991)).
Чертежи
Фиг. 1: B6-huTNFR1-k/i-мыши получали диету с высоким содержанием жира (HFD) в течение 32 недель, включая лечение анти-TNFR1 или контрольным антителом (Ab) в течение последних 8 недель. Ткани печени мышей HFD, получавших анти-TNFR1-Ab, показали значительное снижение стеатоза (А), содержания триглицеридов (В) и показателя активности NAFLD (С) в тканях печени по сравнению с тканями печени от мышей, обработанных контрольным антителом. * Р <0,05; ** р <0,01.
Фиг. 2: B6-huTNFR1-k/i-мыши получали диету с высоким содержанием жира (HFD) в течение 32 недель, включая обработку анти-TNFR1 или контрольным антителом (Ab) в течение последних 8 недель. Ткани печени мышей HFD, обработанных анти-TNFR1-Ab, показали улучшение фиброза печени, оцененное окрашиванием Сириусом красным (А), которое было значительным по сравнению с тканями печени от мышей, обработанных контрольным антителом (В). *р<0,05.
Фиг. 3: мыши B6-huTNFR1-k/i получали диету с высоким содержанием жира (FIFD) в течение 20 недель, включая обработку анти-TNFR1 или контрольным антителом (Ab) в течение последних 4 недель. По сравнению с контрольным антителом обработка анти-TNFR1 антителом приводила к значительному снижению активации каспазы-3 в тканях печени. *р<0,05.
Фиг. 4: B6-huTNFR1-k/i-мыши получали диету с высоким содержанием жира (FIFD) в течение 32 недель, включая лечение анти-TNFR1 или контрольным антителом (Ab) в течение последних 8 недель. По сравнению с контрольным антителом лечение анти-TNFR1-Ab привело к значительному улучшению уровней ALT и сывороточного инсулина. * р <0,05
Фиг. 5: Последовательности
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
SEQ ID NO
1: VH-CDR1;
2: VH-CDR2;
3: VH-CDR3;
4: VL-CDR1;
5: VL-CDR2;
6: VL-CDR3;
7: VH из IgG13.7/Fab13.7;
8: VL IgG13.7/Fab13.7;
9: VH ATROSAB/IZI06.1;
10: VL ATROSAB/IZI06.1;
11: (Fab13.7 тяжелая цепь [полужирный шрифт = VH]);
12: (Fab13.7 легкая цепь [полужирный шрифт = VL]);
13: VL1C (VL13.7-CH2-CH31; VL- и СШ-содержащая цепь):
14: VL13.7;
15: Линкер;
16: CH2;
SEQ ID NO: 17: CH31: CH31 представляет собой перемежающийся по последовательности константный домен Ig, который включает в основном остатки, происходящие из СН3, но также и остатки из СН1;
SEQ ID NO: 18: VHkC (VH13.7-CH2-CH3-каппа; цепь, содержащая VH и CLk):
SEQ ID NO: 19: VH13.7;
- 7 044106
SEQ ID NO:20: CH3k;
SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO
21: VL1C (VL13.7-CH2-CH31; цепь, содержащая VL и СН1):
22: VHkC (VH13.7-CH2-CH3-каппа; цепь, содержащая VH и CLk):
23: VH-CDR1 из ATROSAB;
24: VH-CDR2 из ATROSAB;
25: VH-CDR3 из ATROSAB;
26: VL-CDR1 из ATROSAB;
27: VL-CDR2 из ATROSAB;
28: VL-CDR3 из ATROSAB;
29: ATROSAB VH;
30: ATROSAB VL;
31: IgG1 Fc человека;
32: последовательность huTNFR1:
33: шарнирная область.
Фиг. 6: Биохимическая характеризация атросимаба (НС: SEQ ID NO: 18, LC: SEQ ID NO: 13). (а) репрезентативное изображение молекулярного состава атросимаба (белый: константные домены Ig, происходящие из Fc; ярко-серый: VH и последовательности, происходящие из СН1; темно-серый: VL и по следовательности, происходящие из CLk). Атросимаб характеризовался с помощью SEC (b) TSKgel SuperSW mAb HR, скорость потока 0,5 мл/мин, подвижная фаза Na2HPO4/NaH2PO4) и SDS-PAGE (с) NuPAGETM 4-12% Bis-TRIS Midi Gel) в восстанавливающих (R) и невосстанавливающих условиях (HP). М: Маркер, (d) Термостабильность атросимаба анализировали путем динамического рассеяния света и визуальной интерпретации полученных данных. Стабильность атросимаба после инкубации в плазме человека анализировали путем определения остаточной активности связывания с TNFR1 человека в ELISA (е). Столбцы представляют значения ЕС50 трех отдельных экспериментов (среднее значение ± стандартное отклонение). Один образец, инкубированный в PBS при 4°С, и один образец, замороженный до -20°С непосредственно после разведения в плазме человека, служили в качестве контролей.
Фиг. 7: Связывание антигена и взаимодействие с рецепторами Fc и белком комплемента Clq. Равновесное связывание атросимаба с TNFR1 человека-Fc анализировали с помощью ELISA ((a) n = 3, среднее значение ± SD). Fab 13.7 (включает идентичные VH и VL) и ATROSAB (бивалентная версия с более низкой аффинностью) служили в качестве контролей. (b) Кинетику связывания в реальном времени регистрировали с помощью QCM при пяти концентрациях от 128 нМ до 4 нМ (с шагом разведения 1:2) с применением алгоритма связывания 1:1 для анализа данных. (с) Взаимодействие иммобилизованного атросимаба, а также двух контрольных белков ATROSAB (недействующий Fc) и ритуксимаб (Fc-часть дикого типа) с человеческими FcyRI, IIb и III, а также с белком комплемента Clq анализировали с помощью ELISA (n = 2, среднее значение ± стандартное отклонение).
Фиг. 8: Антагонистическая биологическая активность атросимаба и отсутствие агонизма. Атросимаб продемонстрировал полное отсутствие агонистической активности в трех различных анализах in vitro: (а) высвобождение IL-6 из клеток HeLa, (b) высвобождение IL-8 из клеток НТ1080 и в анализе индукции гибели клеток с применением клеток Kym 1 (с). Родительский Fab 13.7, который продемонстрировал полностью агонистические свойства, и двухвалентный IgG ATROSAB, продемонстрировавший незначительные агонистические эффекты в (а) и (b), служили в качестве контрольных белков. Тот же набор белков был проанализирован на предмет способности ингибировать активацию TNFR1 на клеточной поверхности в клетках HeLa, НТ1080 и Kym-1, что определялось по высвобождению IL-6 (d), высвобождению IL-8 (е) и индукции гибели клеток (f), соответственно. TNFR1 активировали с применением 0,1 нМ TNF (d и е) или 0,01 нМ TNF (f). Все графики представляют среднее из трех отдельных экспериментов, планки погрешностей указывают SD.
Фиг. 9: Отсутствие агонизма атросимаба в присутствии антител против IgG человека. Активация TNFR1 на поверхности клеток НТ1080 атросимабом в присутствии постоянной концентрации (прибл. 15,8 нМ) антител, специфичных для лекарственного средства, анализировали в анализе высвобождения IL-8 с применением трех различных мышиных сывороток против IgG человека (a, b и с). Контролем служили мышиные сыворотки против IgG человека, нестимулированные клетки и TNF (33 нМ). Показано среднее ± SD трех отдельных экспериментов.
Фиг. 10: Фармакокинетический анализ атросимаба. Циркулирующие концентрации атросимаба определяли в мышиной сыворотке после болюсной инъекции 400 мкг белка у мышей, нокаутированных по C57BL/6J, которые экспрессируют внеклеточный домен человеческого TNFR1, связанный с трансмембранным и внутриклеточным доменом мыши, вместо полностью мышиного белка. Интактный белок определяли при связывании с человеческим TNFR1-Fc в ELISA. График показывает среднее значение ± SD для пяти мышей.
Подробное описание изобретения
Применение единственного числа и ему подобных, используемые в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения далее), охватывают как форму единственного числа, так
- 8 044106 и множественного, до тех пор, пока в данном документе не указано иное или это очевидно не противоречит контексту.
Термины содержащий, имеющий, включающий и вмещающий следует толковать как открытые термины (то есть означающие включающий, без ограничения указанным), если не указано иное. Для целей настоящего изобретения термин состоящий из считается предпочтительным воплощением термина включающий. Если в данном документе и далее определено, что группа включает, по меньшей мере, определенное количество воплощений, это подразумевает также включение группы, которая предпочтительно состоит только из этих воплощений.
Под термином антитело в данном контексте понимают полипептиды или белки, которые состоят из доменов антител или включают их, которые понимаются как константные и/или вариабельные домены тяжелых и/или легких цепей иммуноглобулинов с линкерной последовательностью или без нее. Под полипептидами понимаются домены антител, если они включают структуру бета-бочки, состоящую, по меньшей мере, из двух бета-цепей доменной структуры антитела, соединенных последовательностью петли.
Домены антител могут иметь нативную структуру или модифицированы мутагенезом или дериватизацией, например, для модификации антигенсвязывающих свойств или любых других свойств, такие как стабильность или функциональные свойства, такие как связывание с Fc-рецепторами FcRn и/или Fcgamma-рецептором.
Используемое в данном документе антитело включает по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, который специфически распознает huTNFR1 или эпитоп huTNFR1. Таким образом, связывание антитела с рецептором huTNFR1 может происходить моновалентно только через один сайт связывания, специфичный для huTNFR1, на антитело, или двухвалентно через два сайта связывания, специфичных для huTNFR1. В частности, антигенсвязывающий сайт состоит из одного или двух доменов антител. Любой из вариабельных доменов антител один или в комбинации, такой как один домен VH или комбинация доменов VH и VL, можно использовать для создания антигенсвязывающего сайта. В частности, антигенсвязывающий сайт образован комбинацией последовательностей CDR. Такая комбинация последовательностей CDR также понимается как сайт связывания CDR, например, антигенсвязывающий карман, образованный тремя последовательностями CDR одного вариабельного домена, такими как комбинация CDRH1, CDRH2 и CDRH3, или комбинацией CDRL1, CDRL2 и CDRL3 или еще шестью последовательностями CDR двух вариабельных доменов, такими как комбинация CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3. Альтернативно, можно использовать антигенсвязывающий сайт, который происходит из природного лиганда к рецептору или из искусственной конструкции. Упомянутые в данном документе последовательности CDR обозначены следующим образом:
CDR домена VH:
VH-CDR1 = CDRH1,
VH-CDR2 = CDRH2,
VH-CDR3 = CDRH3, CDR домена VL:
VL-CDR1 = CDRL1,
VL-CDR2 = CDRL2,
VL-CDR3 = CDRL3.
В частности, сайт связывания CDR одного вариабельного домена антитела может быть использован в качестве антигенсвязывающего сайта, такого как сайт связывания вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей (таких как dAb, Fd, VL, Vкаппа, Vлямбда, VH, VHH), или сайт связывания пар вариабельных доменов антител, такой как пара VH/VL.
Таким образом, антитело, содержащее сайт связывания CDR, может содержать один вариабельный домен антитела или пару вариабельных связывающих доменов и необязательно дополнительно содержать другие вариабельные домены с одинаковой или различной антигенсвязывающей специфичностью, например биспецифическое или полиспецифичное антитело, где только один антигенсвязывающий сайт нацелен на huTNFR1, и по меньшей мере один другой антигенсвязывающий сайт нацелен на мишень, отличную от huTNFR1. Необязательно, конструкция антитела дополнительно включает константные домены антитела или комбинации вариабельных и/или константных доменов антитела с или без линкерной последовательности или шарнирной области.
Конкретные форматы антител могут быть использованы, как описано в настоящем документе, например, антитело, включающее или состоящее из одного вариабельного домена антитела, такого как VH, VL или VHH, или комбинаций вариабельных и/или константных доменов антитела с или без связывающей последовательности или шарнирной области, включая пары вариабельных доменов антител, таких как пара VL/VH, антитело, содержащее или состоящее из пары доменов VL/VH и константных доменов антител, таких как антитела с тяжелой цепью, Fab, F (ab'), (Fab)2, scFv, Fd, Fv или полноразмерное антитело, например, типа IgG (например, подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), антитела IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM. Термин полноразмерное антитело можно использовать для обозначения любой молекулы антитела, содержащей, по меньшей мере, большую часть Fc-домена и других доменов, обычно встречаю- 9 044106 щихся в природном мономере антитела. Эта фраза используется в данном документе, чтобы подчеркнуть, что конкретная молекула антитела не является фрагментом антитела.
Примерами моновалентных моноспецифических связующих являются Fab, scFv, Fv, доменные антитела, полу-антитела IgG или моновалентные IgG, такие как одноплечевой IgG, состоящий из полной легкой цепи, одной полной тяжелой цепи и дополнительной цепи Fc, в которой отсутствует Fd (Fd = VHCH1), который может быть получен в соответствии с методикой выступ-в-углубление (или другими асимметричными частями Fc), чтобы избежать гомодимеризации доменов Fc.
Типичными двух- или поливалентными связующими являются полноразмерные антитела любого из типов иммуноглобулинов или фрагмент антигенсвязывающего антитела любого из полноразмерных антител, который включает по меньшей мере два антигенсвязывающих сайта, например, любой один или несколько Fab, F (ab'), (Fab)2, scFv или Fv.
Термин Fv в данном документе понимается как область вариабельных доменов, которая включает сайт связывания CDR, например, VH, VL или VH/VL. Термин Fv, таким образом, в частности относится к VH, VL или VH/VL, который является доменом VH, связанным с доменом VL взаимодействием между структурой бета-листа обоих вариабельных доменов, с линкером или без него.
Используемый в данном документе термин антитело, в частности, включает антитела в выделенной форме в препарате антитела, которые по существу не содержат других антител, нацеленных против других антигенов-мишеней или содержащих другое структурное расположение доменов антител. Тем не менее, выделенное антитело может содержаться в комбинированном препарате, содержащем комбинацию выделенного антитела, например, по меньшей мере, с одним другим антителом, таким как моноклональные антитела или фрагменты антител, имеющие другие специфичности.
Термин антитело должен применяться к антителам животного происхождения, включая человеческие антитела, такие как антитела млекопитающих, таких как человек или мышь, или антитела птиц, таких как курица, причем этот термин должен, в частности, включать рекомбинантные антитела, основанные на последовательности животного происхождения, например, человеческие последовательности, подобные человеческим антителам. Человеческие антитела обычно содержат вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Предпочтительно используемые человеческие антитела, описанные в данном документе, могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, введенные путем случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматической мутацией in vivo), например, в CDR. Человеческие антитела включают антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или животных, трансгенных по одному или нескольким иммуноглобулинам человека.
Тем не менее, термин антитело далее применяется к химерным антителам с последовательностями, происходящими из различных видов, например, с последовательностями мышиного и человеческого происхождения, или к гуманизированным антителам, которые содержат аминокислотные последовательности человеческого происхождения и аминокислотные последовательности, не принадлежащие человеку, например, из грызунов.
Термин антитело в частности относится к антителам любого класса или подкласса. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей антитела могут быть отнесены к основным классам антител IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть далее разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.
Термин кроме того применяется к моноклональным или поликлональным антителам, в частности к рекомбинантному антителу, которое включает все антитела и структуры антител, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами, такие как антитела, происходящие от животных, например млекопитающих, включая человека, которые включает гены или последовательности различного происхождения, например мышиные, химерные, гуманизированные антитела или антитела, полученные из гибридомы. Дополнительные примеры относятся к антителам, выделенным из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, или к антителам, выделенным из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител или доменов антител, или к антителам, полученным, экспрессированным, созданным или выделенным любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей гена антитела к другим последовательностям ДНК.
Домены антител могут иметь нативную структуру или модифицироваться мутагенезом или дериватизацией, например, для модификации антигенсвязывающих свойств или любых других свойств, таких как стабильность или функциональные свойства, такие как связывание с Fc-рецепторами FcRn и/или Fcgamma-рецептором (FCGR).
Конкретные примеры относятся к не встречающимся в природе антителам, которые являются искусственными конструкциями, сконструированными для специфического распознавания целевого huTNFR1, по меньшей мере, одним антигенсвязывающим сайтом, который включает одну или несколько искусственных последовательностей CDR, или сконструированными для получения не встречающихся в природе конструкций антител, которые имеют структуру, отличную от любой встречающейся в природе структуры иммуноглобулина.
- 10 044106
Конкретные примеры антител, описанных далее, не встречаются в природе, например, как предусмотрено в комбинированном составе с другим антителом или активным агентом, комбинация которых не встречается в природе. Конкретные дополнительные примеры относятся к искусственному производному или варианту встречающегося в природе антитела, или оптимизированному или аффинно-зрелому варианту встречающегося в природе антитела, или к антителу с каркасной областью, которая разработана для улучшения стабильности антитела. Посредством такой оптимизации или конструирования антитело включает одну или несколько синтетических структур или последовательностей или характеристик, которые не обнаруживаются в контексте антитела в природе.
Понятно, что термин антитело, используемый в данном документе, также относится к производным антитела, в частности, к функционально активным производным, в настоящем документе также упоминаемым как функциональные варианты антител.
Функционально активные производные, в частности, получают путем слияния или ковалентной химической модификации, которая не изменяет первичную аминокислотную последовательность самого антитела. Производные могут, например, иметь искомые свойства, включая, например, продление периода полувыведения из кровотока, повышение стабильности, уменьшение клиренса или изменение иммуногенности. Под производными конкретных антител понимают любую комбинацию одного или нескольких доменов антител или антител и/или гибридного белка, где любой домен антитела может быть слит в любом положении одного или нескольких других белков, таких как другие антитела, например, связывающая структура, включающая петли CDR, полипептид рецептора, а также лиганды, каркасные белки, ферменты, токсины и т.п. Производное антитела может быть получено путем ассоциации или связывания с другими веществами различными химическими методами, такими как ковалентное связывание, электростатическое взаимодействие, дисульфидное связывание и т.д. Другими веществами, связанными с антителом, могут быть липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты, органические и неорганические молекулы или любая их комбинация (например, ПЭГ, пролекарства или лекарственные средства). В конкретном воплощении антитело представляет собой производное, содержащее лекарственное средство, например, для получения конъюгата антитело-лекарственное средство.
Термин производное также включает фрагменты, варианты, аналоги или гомологи антител, например, со специфическим паттерном гликозилирования, например, продуцируемым гликоинженерией, которые являются функциональными и могут служить функциональными вариантами, например, связываться с конкретной мишенью.
Термин гликоинженерный в отношении последовательностей антител должен относиться к вариантам гликозилирования, имеющим модифицированные иммуногенные свойства, ADCC и/или CDC как результат гликоинженерии. Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных положениях в константных областях тяжелой цепи, причем каждый изотип обладает различным набором Nсвязанных углеводных структур, которые по-разному влияют на сборку белка, секрецию или функциональную активность. Антитела типа IgG1 представляют собой гликопротеины, которые имеют консервативный N-связанный сайт гликозилирования в Asn297 в каждом домене СН2. Два сложных двухантенных олигосахарида, прикрепленных к Asn297, погружены между доменами СН2, образуя обширные контакты с полипептидным остовом, и их присутствие необходимо для того, чтобы антитело обеспечивало эффекторные функции, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC). Удаление Nгликана в N297, например, путем мутации N297, например, на А или Т299, обычно приводит к агликозилированным антителам со сниженным ADCC.
Существенные различия в гликозилировании антител происходят между клеточными линиями, и даже незначительные различия наблюдаются для данной клеточной линии, выращенной в различных условиях культивирования. Экспрессия в бактериальных клетках обычно обеспечивает агликозилированное антитело.
Антитела могут быть лишены активного фрагмента Fc и, таким образом, либо состоят из доменов антител, которые не имеют сайта связывания FCGR, в частности включая любое антитело, лишенное цепи доменов СН2 и СН3, либо содержат домены антител, лишенные эффекторной функции Fc, например модификациями для снижения эффекторных функций Fc, в частности, для отмены или снижения активности ADCC и/или CDC. Такие модификации могут быть вызваны мутагенезом, например, мутациями в сайте связывания FCGR или производными или агентами, которые влияют на ADCC-и/или CDC-активность антитела, чтобы достичь снижения эффекторной функции Fc или отсутствия эффекторной функции Fc, что обычно понимается как относящаяся к эффекторной функции Fc менее чем 10% немодифицированного антитела (дикого типа), предпочтительно менее 5%, что измеряется по активности ADCC и/или CDC.
Типичные антитела могут содержать фрагмент Fc или, по меньшей мере, часть фрагмента Fc, например, для поддержания сайта связывания с FcRn, тем самым получая антитело с существенным периодом полувыведения in vivo.
Тем не менее, Fc может быть модифицирован для получения снижения возможной активности ADCC и/или CDC, например, путем переключения IgG1 на подтип IgG2 или модификациями для уменьшения связывания с рецептором Fc, например, Е233Р, и/или L234V, и/или L235A, и/или D265G, и/или
- 11 044106
A327Q, и/или АЗЗОА, и/или G236, делецией и/или A327G, и/или A330S в Fc IgG1 человека, где нумерация соответствует Kabat [EU-индекс].
Дополнительные примеры относятся к модификации для снижения иммуногенности, например, посредством нокаута сайта гликозилирования, такого как N297Q, что обеспечивает нарушенное связывание с рецептором лектина.
Понятно, что термин антитело также относится к вариантам антитела, включая антитела с функционально активными вариантами CDR родительской последовательности CDR и функционально активными вариантами антител родительского антитела. Например, функциональные варианты тех антител, которые характеризуются связывающими последовательностями CDR и/или последовательностями тяжелой и легкой цепи, представленными в настоящем документе, могут быть сконструированы и использованы, как описано далее в настоящем документе.
В частности, вариант антитела родительского антитела может быть получен путем конструирования по меньшей мере одной из последовательностей антитела родительского антитела, такой как любой из приведенных в данном документе примеров антител, например, где вариант антитела включает по меньшей мере 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи и, необязательно, дополнительно по меньшей мере 3 CDR вариабельной области легкой цепи, по меньшей мере, с одной точечной мутацией, по меньшей мере, в одной из CDR или в областях FR, или в константной области тяжелой цепи (НС) или легкой цепи (LC), и при этом все еще сохраняет функциональную активность, что измеряется по специфическому связыванию с мишенью huTNFR1.
В частности, вариант антитела представляет собой мутантное антитело или фрагмент антитела, например, полученный методами мутагенеза, в частности, для удаления, обмена, введения вставок в специфическую аминокислотную последовательность или область антитела или для химической дериватизации аминокислотной последовательности, например, в константных доменах для формирования стабильности, эффекторной функции или периода полувыведения антитела или в вариабельных доменах для улучшения антигенсвязывающих свойств, например, с помощью методов созревания аффинности, доступных в данной области. Можно использовать любой из известных способов мутагенеза, включая точечные мутации в искомых положениях, например, полученных методами рандомизации. В некоторых случаях положения выбираются случайным образом, например, с любой из возможных аминокислот или с помощью выбора предпочтительных аминокислот для рандомизации последовательностей антител. Термин мутагенез относится к любому признанному в данной области методу для изменения полинуклеотидной или полипептидной последовательности. Предпочтительные типы мутагенеза включают мутагенез на основе ПЦР с внесением ошибок, насыщенный мутагенез или другой сайт-направленный мутагенез.
Точечную мутацию конкретно понимают как создание полинуклеотида, который приводит к экспрессии аминокислотной последовательности, которая отличается от аминокислотной последовательности, не подвергнутой конструированию, заменой или обменом, делецией или вставкой одной или нескольких единичных (непоследовательных) или пар аминокислот в отношении различных аминокислот.
В частности, функционально активное вариантное антитело получают путем модификации родительского антитела или последовательности родительского антитела с помощью любой одной или нескольких из числа вставки, делеции или замены одной или нескольких аминокислот или химической дериватизации одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности или нуклеотидов в нуклеотидной последовательности или на одном или обоих дистальных концах последовательности, например, N-концевых и/или С-концевых 1, 2, 3 или 4 аминокислот в последовательности CDR и/или центральных 1, 2, 3 или 4 аминокислот (то есть в середине последовательности CDR), и при этом модификация не влияет, в частности, не ухудшает активность этой последовательности. В случае, когда сайт связывания обладает специфичностью к выбранному антигену-мишени, функционально активный вариант антитела будет по-прежнему обладать заранее определенной специфичностью связывания или практически такой же биологической активностью, хотя это можно изменить, например, для изменения тонкой специфичности к определенному эпитопу, аффинности, авидности, скорости Kon или Koff и т.д. Например, аффинно-зрелое антитело определенно понимается как функционально активный вариант антитела. Следовательно, модифицированная последовательность CDR в аффинно-зрелом антителе понимается как функционально активный вариант CDR.
Созревание аффинности - это процесс, при котором образуются антитела с повышенной аффинностью к целевому антигену. Любой один или несколько способов получения и/или применения библиотек аффинного созревания, доступных в данной области, могут быть использованы для того, чтобы получить аффинно-зрелые антитела в соответствии с различными воплощениями изобретения, раскрытого в данном документе. Примерами таких способов и применений созревания аффинности являются неспецифический мутагенез, пассирование бактериальных мутаторных штаммов, сайт-направленный мутагенез, направленное воздействие на горячие точки мутагенеза, экономный мутагенез, шафлинг антител, шафлинг легких цепей, шафлинг тяжелых цепей, мутагенез CDR1 и/или CDR1, и способы получения и применения библиотек аффинного созревания, подходящих для реализации способов и применений в соответствии с различными воплощениями изобретения, раскрытого в данном документе, включают, напри- 12 044106 мер, те, которые раскрыты в: Wark & Hudson, 2006, Advanced Drug Delivery Reviews 58: 657-670.
С помощью структурных изменений антитела, включая аминокислотный мутагенез или как следствие соматическую мутацию в сегментах гена иммуноглобулина, создаются варианты сайта связывания с антигеном и отбираются для большей аффинности. Аффинно-зрелые антитела могут проявлять в несколько раз большую аффинность, чем родительское антитело. Одиночные родительские антитела могут подвергаться созреванию аффинности. Альтернативно, пулы антител со сходной аффинностью связывания с антигеном-мишенью могут рассматриваться как родительские структуры, которые варьируют для получения аффинно-зрелых отдельных антител или аффинно-зрелых пулов таких антител.
Предпочтительный вариант аффинно-зрелого антитела, описанный в настоящем документе, демонстрирует, по меньшей мере, 2-кратное увеличение аффинности связывания, предпочтительно, по меньшей мере, 5-кратное, предпочтительно, по меньшей мере, 10-кратное, предпочтительно, по меньшей мере, 50-кратное или предпочтительно, по меньшей мере, 100-кратное увеличение. Созревание аффинности может быть использовано в ходе кампаний селекции с применением соответствующих библиотек родительских молекул, с антителами, обладающими средней аффинностью связывания, для получения антитела, описанного в данном документе. Альтернативно, аффинность может быть еще более увеличена путем созревания аффинности антитела, описанного в настоящем документе, для получения высоких значений, соответствующих KD, составляющих менее 10-10 М или даже менее 10-11 М.
В некоторых воплощениях аффинность связывания определяют с помощью анализа аффинного ELISA. В некоторых воплощениях аффинность связывания определяют с помощью анализов BIAcore, ForteBio или MSD. В некоторых воплощениях аффинность связывания определяют кинетическим способом. В некоторых воплощениях аффинность связывания определяют способом равновесия/растворения. В некоторых воплощениях аффинность связывания определяют с помощью стандартных измерений пьезоэлектрического микровзвешивания (QCM), в частности, при заданных условиях, которые напоминают физиологические условия (около 37°С, плотность около 50 Гц).
Специфическая функция антител, описанная в данном документе, представляет собой функцию в качестве ингибитора (также называемого антагонистом) взаимодействия TNF-huTNFR1. Термин ингибитор, как он понимается в данном документе, представляет собой вещество, обладающее способностью
a) модулировать (например, уменьшать или устранять) передачу сигналов TNFR1 in vitro и/или in vivo, и/или
b) ингибировать опосредованную TNFR1 гибель клеток in vitro и/или in vivo, и/или
c) ингибировать опосредованную TNF клеточную стимуляцию для высвобождения воспалительных цитокинов in vitro и/или in vivo,
d) путем ингибирования передачи сигналов TNFR1 посредством другого механизма.
В частности, антитело в том виде, в котором оно используется в данном документе, препятствует связыванию одной или нескольких молекул TNF с одной или несколькими молекулами TNFR1 на поверхности клетки. Для терапевтического применения, не желая быть связанными теорией, полагаем, что ингибиторы взаимодействия TNF-huTNFR1 могут обладать способностью ингибировать передачу сигналов huTNFR1 в присутствии TNF или опосредованную huTNFR1 гибель клеток в присутствии TNF или ингибировать клеточную стимуляцию для высвобождения воспалительных цитокинов в присутствие TNF.
Используемый в данном документе термин активация сигнального пути и передача сигналов представляет собой биохимический процесс, включающий передачу внеклеточных стимулов через рецепторы клеточной поверхности через определенный и последовательный ряд молекул к генам в ядре, что приводит к специфическим клеточным реакциям на стимулы.
Ингибирование взаимодействия huTNFR1 может привести к понижающей модуляции эффектов передачи сигналов TNFR1 или трансдукции сигнала, измеренной ех vivo в анализе на основе клеток или in vivo, в зависимости от дозы. Функциональная активность антитела, описанного в настоящем документе, конкретно характеризуется ингибирующей функцией, которая ингибирует взаимодействие TNFhuTNFR1 или взаимодействие LTa-huTNFR1 in vivo, что определяется в анализе на основе клеток ех vivo. Дополнительный анализ может быть использован для исключения существенных побочных эффектов, связанных с перекрестным связыванием рецептора TNFR1, которое может действовать агонистически на взаимодействие TNF-TNFR1. Подходящим анализом является определение активности антитела или варианта на клетках HeLa или НТ1080 по отсутствию стимулирующей активности по выработке воспалительных цитокинов IL-6 или IL-8, соответственно. Примерный тест описан в разделе примеров ниже.
Ингибирование обычно приводит к снижению эффектов взаимодействия или активности huTNFR1 по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или на максимальный уровень. Способы получения и характеризации антител, описанные в данном документе, хорошо известны в данной области. В предпочтительном воплощении варианты антител получают и подвергают скринингу на предварительно опреде- 13 044106 ленные свойства, используя один или несколько клеточных анализов с применением клеток, экспрессирующих huTNFRl, или анализов in vivo. Для таких анализов антитело обычно добавляют экзогенно, так что клетки могут быть связаны, например, в присутствии и отсутствии TNF для определения антагонистической и агонистической активности. Эти анализы обычно основаны на функции иммуноглобулина; то есть способности антитела связываться с huTNFR1 и опосредовать некоторое биохимическое событие, например блокирование связывания TNF с указанными клетками, например, в конкурентном анализе связывания, ингибирование связывания TNF/рецептора, снижение экспрессии цитокинов в присутствии или отсутствии TNF, в частности, воспалительных интерлейкинов, таких как IL-6 или IL-8, апоптоз и т.п.
Описанное в настоящем документе антитело предпочтительно обладает только антагонистической активностью в отношении TNF (в частности, без обнаруживаемой агонистической активности), таким образом, уменьшая воспалительную реакцию, вызванную повышенным уровнем TNF в кровообращении, что может привести к нежелательным воспалительным реакциям, апоптозу и некрозу или органной недостаточности. Предпочтительное антитело обладает антагонистической активностью, соответствующей IC50 менее 100 нМ, предпочтительно менее 20 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, наиболее предпочтительно в наномолярном диапазоне с однозначным числом или менее, что измерено в анализе на основе клеток с применением TNF или LT-альфа с полумаксимальной концентрацией насыщения, предпочтительно в диапазоне 0,01-0,1 нМ TNF и LT-альфа, соответственно.
Потенциальная агонистическая активность миметика TNF может быть измерена в том же клеточном анализе, но без использования TNF. Описанное в данном документе антитело предпочтительно не обладает значительной агонистической активностью, если инкубация клеток HeLa или НТ1080 в отсутствие TNF приводит к отсутствию или только незначительной индукции цитокина, например, повышенные уровни IL-6 или IL-8 менее 0,5 нг/мл при концентрации, по меньшей мере, 5 нМ или около 10 нМ антитела. Предпочтительно отсутствует или имеется только незначительная или отрицательная продукция цитокинов, которая может быть определена количеством менее 10 пг/105 клеток. В предпочтительном примере экспрессия и высвобождение цитокинов составляет менее 2,5 пг/100000 клеток в течение 18 часов. Предпочтительно агонистическая активность, таким образом, ниже базового уровня или менее 2% ответа от сопоставимой концентрации TNF, предпочтительно менее 1% эквивалентного или максимального ответа TNF.
Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности по отношению к последовательностям антител, описанным в настоящем документе, определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в конкретной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и введение пропусков, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, при этом не рассматривая какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
Используемый в данном документе термин антиген является взаимозаменяемым с терминами мишень или антиген-мишень и относится к целой молекуле-мишени или фрагменту такой молекулы, распознаваемой сайтом связывания антитела. В частности, субструктуры антигена, например, структура полипептида или углевода, обычно называемая эпитопами, например, вирусные эпитопы или Тклеточный эпитоп, которые являются иммунологически релевантными, могут распознаваться по такому сайту связывания. Антиген huTNFR1 представляет собой антиген, включающий рецепторные структуры, который способен специфически связывать тримерный TNF или LTa в качестве моно- или мультимерного рецептора цитокинов на поверхности большинства клеток человека.
Используемый в данном документе термин huTNFR1 относится к рецептору TNF, CD120а TNFR1 (р55/60, суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей TNFRSF1A, представитель 1А [Homo sapiens (человек)], ID гена: 7132), экспрессируемого повсеместно в большинстве клеток человека. Конкретная примерная последовательность huTNFR1 представлена в виде SEQ ID NO: 32.
Используемый в данном документе термин эпитоп, в частности, относится к молекулярной структуре, которая может полностью составлять специфического партнера по связыванию или быть частью конкретного партнера по связыванию с сайтом связывания антитела. Эпитоп может состоять из углевода, пептидной структуры, жирной кислоты, органического, биохимического или неорганического вещества, или его производных и любых их комбинаций. Если эпитоп включен в пептидную структуру, такой как пептид, полипептид или белок, он обычно будет включать, по меньшей мере, 3 аминокислоты, предпочтительно от 5 до 40 аминокислот и более предпочтительно от 10 до 10 аминокислот. Эпитопы могут быть линейными или конформационными. Линейный эпитоп состоит из одного сегмента первичной последовательности полипептидной или углеводной цепи. Линейные эпитопы могут быть смежными или перекрывающимися.
Конформационные эпитопы состоят из аминокислот или углеводов, соединенных вместе путем сворачивания полипептида с образованием третичной структуры, и аминокислоты необязательно соседствуют друг с другом в линейной последовательности.
- 14 044106
В частности, и касательно полипептидных антигенов, конформационный или прерывистый эпитоп характеризуется наличием двух или более отдельных аминокислотных остатков, разделенных в первичной последовательности, но собирающихся в последовательную структуру на поверхности молекулы, когда полипептид складывается в нативный белок/антиген.
В данном документе термин эпитоп будет, в частности, относиться к эпитопу, содержащемуся в huTNFR1, который представляет собой эпитоп, включенный в мембранно-дистальный CRD1 и субдомен А1 из CDR2 в huTNFR1.
Термин выделенный или выделение, используемый в данном документе в отношении нуклеиновой кислоты, антитела или другого соединения, должен относиться к такому соединению, которое было достаточно отделено от среды, с которой оно было бы естественным образом связано, чтобы существовать по существу в чистой форме. Выделенный не обязательно означает исключение искусственных или синтетических смесей с другими соединениями или материалами, или присутствие примесей, которые не влияют на фундаментальную активность, и которые могут присутствовать, например, из-за неполной очистки.
Касательно полипептидов или белков, таких как выделенные антитела, описанные в данном документе, термин выделенный будет в частности относиться к соединениям, которые не содержат или практически не содержат материал, с которым они связаны в природе, такие как другие соединения, с которыми они встречаются в их естественной среде или среде, в которой они получены (например, культуре клеток), когда при таком получении используют технологию рекомбинантных ДНК, практикуемую in vitro или in vivo. Выделенные соединения могут быть включены в состав с разбавителями или адъювантами и, тем не менее, для практических целей могут быть выделены - например, полипептиды или полинуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми носителями или наполнителями при использовании в диагностике или терапии.
Используемый в данном документе термин рекомбинантный означает получаемый с помощью генной инженерии или полученный в результате генной инженерии. Рекомбинантный хозяин, в частности, включает экспрессирующий вектор экспрессии или клонирующий вектор, или рекомбинантный хозяин был генетически сконструирован так, чтобы содержать последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты, в частности, с применением нуклеотидной последовательности, чужеродной для хозяина. Рекомбинантный белок получают путем экспрессии соответствующей рекомбинантной нуклеиновой кислоты в хозяине.
Антитело, дополнительно описанное в данном документе, может представлять собой рекомбинантное антитело. С этой целью термин рекомбинантное антитело в контексте настоящего описания включает антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами, такими как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным для генов иммуноглобулина человека или полученных из них гибридом, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека или библиотеки антигенсвязывающих последовательностей антитела и (d) антител, полученных, экспрессированных, созданных или выделенных любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела включают антитела, сконструированные так, чтобы включать перестройки и мутации, которые происходят, например, во время созревания антител. В соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантных ДНК, известные специалистам в данной области. Такие методы в полной мере описаны в литературе. См., например, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982).
Описанное в данном документе антитело предпочтительно предлагается в виде рекомбинантного белка, продуцируемого рекомбинантной системой экспрессии, использующей клетку-хозяина, например, путем экспрессии в периплазматическом пространстве E.coli или путем экспрессии в качестве секретируемого белка в эукариотической системе экспрессии, такой как дрожжи или млекопитающие, например, СНО, HEK или в линиях продуцирующих человеческих клеток-хозяев.
Клетки яичника китайского хомячка (СНО) чаще всего используются для выработки антител. В дополнение к предоставлению подходящих паттернов гликозилирования, эти клетки обеспечивают последовательную генерацию генетически стабильных, высокопродуктивных клональных клеточных линий. Они могут культивироваться до высоких плотностей в простых биореакторах с применением бессывороточных сред и позволяют разрабатывать безопасные и воспроизводимые биологические процессы.
Клетки-хозяева являются наиболее предпочтительными, когда они создаются, адаптируются и полностью культивируются в бессывороточных условиях и, необязательно, в средах, не содержащих какоголибо белка/пептида животного происхождения.
Специфическое связывание, распознавание или нацеливание в контексте настоящего описания означает, что связующее, например антитело или антигенсвязывающий сайт антитела, проявляет заметную аффинность к антигену-мишени или соответствующему эпитопу в гетерогенной популяции моле- 15 044106 кул. Таким образом, при определенных условиях (например, при иммуноанализе) связующее специфически связывается с антигеном-мишенью и не связывается в значительном количестве с другими молекулами, присутствующими в образце. Специфическое связывание означает, что связывание является селективным с точки зрения идентификации цели, с высокой, средней или низкой аффинностью или авидностью связывания, в зависимости от выбора. Селективное связывание обычно достигается, если константа связывания или динамика связывания, по меньшей мере, в 10 раз отличаются (понимается как разница, по меньшей мере, в 1 log), предпочтительно, отличаются, по меньшей мере, в 100 раз (понимается как разница, по меньшей мере, в 2 log) и более предпочтительнее отличаются, по меньшей мере, в 1000 раз (понимается как разница не менее 3 log) по сравнению с другой мишенью. Дифференциальное связывание может быть определено иммуноанализом, предпочтительно иммуноблоттингом, ELISA или другими иммунологическими способами. Специфичность молекулы антитела к конкретной мишени можно определить с помощью конкурентных анализов, например, как описано в Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). Селективное связывание может быть разработано или улучшено методами оптимизации рекомбинантных антител, известными в данной области. Например, некоторые области вариабельных областей цепей иммуноглобулина, описанных в настоящем документе, могут подвергаться одной или нескольким стратегиям оптимизации, включая шафлинг легкой цепи, направленный мутагенез, слияние CDR и направленный мутагенез выбранных областей CDR и/или каркасных областей.
Применение термина обладающие одинаковой специфичностью, имеющие один и тот же сайт связывания или связывающие один и тот же эпитоп указывает на то, что эквивалентные моноклональные антитела проявляют одинаковые или, по существу, одинаковые, то есть сходные иммунореакционные (связывающие) характеристики и конкурируют за связывание с предварительно выбранной последовательностью связываемой мишени. Относительная специфичность молекулы антитела для конкретной мишени может быть относительно определена конкурентными анализами, например, как описано в Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988).
Конкуренция в настоящем документе означает относительное ингибирование более чем около 30%, определенное анализом конкурентного ELISA или анализом ForteBio. Целесообразным может быть установление более высокого порога относительного ингибирования в качестве критерия того, что является подходящим уровнем конкуренции в конкретном контексте, например, когда конкурентный анализ используется для выбора или скрининга новых антител, разработанных с предполагаемой функцией связывания антигена. Таким образом, например, можно установить критерии конкурентного связывания, при которых обнаруживается относительное ингибирование по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или даже по меньшей мере 100%, прежде чем антитело будет считаться достаточно конкурентным.
Используемый в данном документе термин пациент относится к людям и другим млекопитающим. В частности, медицинское применение, описанное в настоящем документе, или соответствующий способ лечения применяется к объекту, нуждающемуся в профилактике или лечении NASH, или заболевании, связанном с NASH. Объектом может быть пациент с риском развития или страдающим от NASH, в том числе на ранней или поздней стадии заболевания. Термин пациент конкретно включает субъектов, которые получают профилактическое и/или терапевтическое лечение. Таким образом, термин лечение включает как профилактическое, так и терапевтическое лечение.
В частности, термин терапия относится к терапевтическим мерам, которые предназначены для охвата введения для лечения заболевания или уменьшения симптомов заболевания.
В частности, термин профилактика относится к профилактическим мерам, которые предназначены для снижения риска возникновения заболевания или рецидива заболевания.
Термин терапевтически эффективное количество используется в данном документе взаимозаменяемо с любым из терминов эффективное количество или достаточное количество соединения, например, антитело, описанное в настоящем документе, представляет собой количество или активность, достаточные для того, чтобы при введении субъекту оказывать полезные или желаемые результаты, включая клинические результаты, и, в силу этого, его эффективное количество или синоним зависит от контекста, в котором оно применяется.
Под эффективным количеством подразумевается такое количество соединения, которое достаточно для лечения, профилактики или ингибирования таких заболеваний или расстройств. В контексте заболевания терапевтически эффективные количества антитела, описанного в настоящем документе, специально используются для лечения, модуляции, ослабления, реверсии или воздействия на заболевание или состояние, которое выигрывает от ингибирования взаимодействия TNF-TNFR1.
Количество соединения, которое будет соответствовать такому эффективному количеству, будет варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как данное лекарственное средство или соединение, фармацевтическая композиция, способ введения, тип заболевания или расстройства, отличительные особенности объекта или хозяина, подвергаемого лечению, и т.п., но, тем не менее, может быть определен обычным специалистом в данной области.
- 16 044106
Как дополнительно описано в настоящем документе, способ лечения пациента включает стадию введения терапевтически эффективного количества определенного выше антитела huTNFR1 пациенту, нуждающемуся в этом. Терапевтически эффективное количество обычно находится в диапазоне 0,5-500 мг, предпочтительно 1-400 мг, еще более предпочтительно до 300 мг, до 200 мг, до 100 мг или до 10 мг, хотя могут быть указаны более высокие дозы, например для лечения пациентов с ожирением или острых состояний заболеваний.
Предпочтительная фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, включает терапевтически эффективное количество антитела huTNFR1 и необязательно один или несколько дополнительных компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемого носителя, фармацевтически приемлемых солей, вспомогательного агента, стабилизатора, разбавителя и растворителя, или любой их комбинации.
В одном воплощении антитело, описанное в данном документе, является единственным терапевтически активным агентом, вводимым пациенту. Альтернативно, антитело, описанное в данном документе, вводят в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими агентами, включая, без ограничения указанным, антагонисты TNF, противовоспалительные агенты, цитокины, факторы роста или другие терапевтические агенты. Антагонистическое антитело к TNFR1 можно вводить одновременно или последовательно с одной или несколькими другими схемами лечения, предпочтительно с терапией против TNF, такой как антитела против TNF. Антитело, описанное в данном документе, предпочтительно вводят пациенту в качестве лечения первой линии или в качестве терапии второй линии, когда анти-TNFтерапия неэффективна, как неотложного, так и длительного лечения. Особенно предпочтительным медицинским применением является лечение хронического заболевания.
Кроме того, режим лечения или профилактики объекта с помощью терапевтически эффективного количества антитела, описанного в данном документе, может состоять из однократного введения или, альтернативно, включать ряд применений. Например, антитело можно вводить, по меньшей мере, один раз в год, по меньшей мере один раз в полгода или по меньшей мере один раз в месяц. Однако в другом воплощении антитело может вводиться субъекту от примерно одного раза в неделю до примерно ежедневного введения для данного лечения. Продолжительность периода лечения зависит от множества факторов, таких как тяжесть заболевания, острого или хронического заболевания, возраст пациента, концентрация и активность формы антитела. Также должно быть понятно, что эффективная дозировка, используемая для лечения или профилактики, может увеличиваться или уменьшаться в течение определенного режима лечения или профилактики. Изменения в дозировках могут иметь результат и становятся очевидными с помощью стандартных диагностических анализов, известных в данной области. В некоторых случаях может потребоваться долговременное введение.
Неалкогольный стеатогепатит (NASH) представляет собой заболевание печени, не связанное с употреблением алкоголя, характеризующееся жировым перерождением гепатоцитов, сопровождающимся внутрилобулярным воспалением и фиброзом. NASH является распространенным, часто тихим заболеванием печени. Это заболевание напоминает алкогольное заболевание печени, но встречается у людей, которые пьют мало или вообще не употребляют алкоголь. Три основных признака характеризуют NASH и отличают его от других заболеваний печени метаболического происхождения: аномальное накопление жира или отложение в печени (стеатоз печени), воспаление печени и повреждение печени или повреждение ткани печени (фиброз).
NASH является потенциально серьезным заболеванием, которое несет существенный риск прогрессирования до терминальной стадии заболевания печени, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы. Некоторые пациенты, у которых развивается цирроз печени, подвержены риску печеночной недостаточности и в конечном итоге им может потребоваться пересадки печени. NAFLD может отличаться от NASH по шкале активности NAFLD (NAS), сумме баллов гистопатологии биопсии печени при стеатозе (от 0 до 3), лобулярном воспалении (от 0 до 2) и гепатоцеллюлярном баллонировании (от 0 до 2). NAS <3 соответствует NAFLD, 3-4 соответствует пограничному NASH и> 5 соответствует NASH. Биопсия также оценивается на фиброз (от 0 до 4).
При использовании в настоящем документе пациент, страдающий от NASH, является пациентом с NASH, или ему был поставлен диагноз NASH, или пациент генетически предрасположен к развитию NASH, или пациент может быть предрасположен к развитию NASH, потому что он или она страдает от метаболического синдрома, ожирения, диабета или преддиабета. В других воплощениях пациент, страдающий от NASH, является пациентом, который был протестирован и у которого были обнаружены клинические признаки, характерные для NASH (ненормальное накопление жира в печени, воспаление печени и фиброз печени), даже если он или она могут пока не проявлять никаких физических симптомов NASH. В некоторых случаях у пациента, страдающего NASH, появляются симптомы NASH, хотя диагноз еще не поставлен.
Лечение NASH может привести к замедлению или остановке прогрессирования NASH в цирроз печени. Некоторые схемы лечения направлены на задержку появления физического симптома или набора физических симптомов или клинических проявлений, или признаков, связанных с NASH. В некоторых воплощениях лечение приводит к улучшению, по меньшей мере, одного измеримого физического сим
- 17 044106 птома NASH, такого как, например, потеря массы, слабость или усталость. В других воплощениях лечение приводит к улучшению, по меньшей мере, одного клинического параметра или признака NASH, такого как, например, ненормальное накопление жира в печени, фиброз печени, определяемый по биопсии, воспалению печени, аномальным уровням ферментов печени (например, ALT) аномальные уровни воспалительных цитокинов или балл NAS. В других воплощениях лечение приводит к снижению, ингибированию или замедлению прогрессирования NASH, либо физически, например, путем стабилизации измеримого симптома или набора симптомов (таких как усталость, потеря массы или слабость), либо клинически/физиологически, например, посредством стабилизации измеряемого параметра, такого как ненормальное накопление жира в печени, аномальные уровни ферментов печени, аномальные уровни маркеров воспаления печени, аномальные результаты при биопсии печени, оценка NAS или то и другое. В другом воплощении лечение также может приводить к предотвращению причины и/или последствий или клинического проявления NASH или одного из симптомов, возникших в результате NASH, до того, как заболевание или расстройство полностью проявится. В некоторых воплощениях лечение приводит к увеличению выживаемости или времени выживания у пациента с NASH. В некоторых воплощениях лечение приводит к снижению вероятности для пациента с NASH потребности в пересадке печени. В других воплощениях лечение приводит к устранению необходимости для пациента NASH подвергаться пересадке печени. В других воплощениях лечение приводит к снижению вероятности развития цирроза у пациента с NASH. В других воплощениях лечение приводит к предотвращению прогрессирования цирроза печени, определяемого гистологией.
Конкретные воплощения, описанные в данном документе, относятся к моноклональным антителам (mAb). Моноклональные антитела получают путем клонирования генов антител в моноклональную клетку-хозяина или соответствующие клеточные линии. Моноклональные антитела могут быть получены любым способом, который продуцирует молекулы антител клеточными линиями в культуре, например культивирование рекомбинантных эукариотических (млекопитающих или насекомых) или прокариотических (бактериальных) клеток-хозяев. Примеры подходящих способов получения моноклональных антител включают гибридомные способы Kohler & Milstein (1975, Nature 256: 495-497) и способ гибридом с В-клетками человека (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; и Brodeur et al, 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63).
Антитела, описанные в данном документе, могут быть идентифицированы или получены с применением гибридомного способа. В таком способе мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомяк, иммунизируют, чтобы извлечь лимфоциты, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфично связываться с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы с применением подходящего агента слияния, такого как полиэтиленгликоль, для образования клетки гибридомы.
Культуральную среду, в которой растут клетки гибридомы, анализируют на продуцирование моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяется иммунопреципитацией или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).
Моноклональные антитела могут быть затем очищены от надосадочных жидкостей гибридомы для дальнейшего тестирования на их специфическое связывание с антигеном-мишенью и для конструирования антител, например, для различных диагностических или терапевтических целей.
huTNFR1-специфичные антитела, в некоторых случаях, появляются путем скрининга против антигена huTNFR1. Чтобы увеличить вероятность выделения дифференциально связывающихся клонов, следует применять множественное давление отбора путем процессивного скрининга в отношении различных антигенов или эпитопов.
Способы скрининга для идентификации антител с искомыми свойствами селективного связывания могут быть реализованы с помощью дисплейных технологий, использующих библиотеку, презентирующую последовательности антител или их антигенсвязывающие последовательности (например, с применением фагов, бактериальных, дрожжевых клеток или клеток млекопитающих; или дисплейных систем in vitro, транслирующих информацию нуклеиновых кислот в соответствующие (поли)пептиды). Реакционную способность можно оценивать на основе ELISA, вестерн-блоттинга или окрашивания поверхности с помощью проточной цитометрии, например используя стандартные анализы.
Выделенный(ые) антиген(ы) можно, например, использовать для отбора антител из библиотеки антител, например, библиотеки антител, презентируемых фагами, фагемидами или дрожжами.
Конкретные воплощения, описанные в настоящем документе, относятся к фармацевтическим композициям, такие композиции могут включать антитело, описанное в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель, в частности, для получения искусственной, не встречающейся в природе композиции. Эти фармацевтические композиции можно вводить в соответствии с настоящим изобретением в виде болюсной инъекции или инфузии или путем непрерывной инфузии. Фармацевтические носители, подходящие для облегчения таких способов введения, хорошо известны в
- 18 044106 данной области.
Фармацевтически приемлемые носители обычно включают любые подходящие растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и фунгицидные агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и т.п., которые физиологически совместимы с антителом или связанной композицией, или комбинацией, описанными в данном документе. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых носителей включают стерильную воду, физиологический раствор, физиологический раствор с фосфатным буфером, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., а также комбинации любых из них.
В одном таком аспекте антитело может быть объединено с одним или несколькими носителями, подходящими для искомого пути введения, антитела могут быть, например, смешаны с любым из числа лактозы, сахарозы, крахмала, сложных эфиров целлюлозы и алкановых кислот, стеариновой кислоты, талька, стеарата магния, оксида магния, натриевых и кальциевых солей фосфорной и серной кислот, акациевой камеди, желатина, альгината натрия, поливинилпирролидина, поливинилового спирта и необязательно, дополнительно таблетированы или инкапсулированы для обычного введения. Альтернативно, антитело может быть растворено в солевом растворе, воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, коллоидных растворах карбоксиметилцеллюлозы, этаноле, кукурузном масле, арахисовом масле, хлопковом масле, кунжутном масле, трагакантовой камеди и/или различных буферах. Носитель может включать материал с контролируемым высвобождением или материал с высвобождением с задержкой по времени, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, отдельно или с воском, или другие материалы, хорошо известные в данной области.
Дополнительные фармацевтически приемлемые носители известны в данной области и описаны, например, в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES. Жидкие составы могут представлять собой растворы, эмульсии или суспензии и могут включать наполнители, такие как суспендирующие агенты, солюбилизаторы, поверхностно-активные вещества, консерванты и хелатирующие агенты.
Предполагается фармацевтические композиции, в которые включены антитело, описанное в данном документе, и один или несколько терапевтически активных агентов. Стабильные составы антитела, описанные в данном документе, готовят для хранения путем смешивания указанного антитела, имеющего искомую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Составы, используемые для введения in vivo, являются стерильными. Это легко достигается путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны или другими способами. Антитело и другие терапевтически активные агенты, раскрытые в данном описании, также могут быть составлены в виде иммунолипосом и/или заключены в микрокапсулы.
Введение фармацевтической композиции, содержащей антитело, описанное в настоящем документе, может осуществляться различными способами, включая перорально, подкожно, внутривенно, интраназально, интраотически, трансдермально, через слизистую, местно, например, гели, мази, лосьоны, кремы и т.д., внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрилегочно, например, используя ингаляционные технологии или системы доставки в легкие, вагинально, парентерально, ректально или интраокулярно.
Примеры составов, используемых для парентерального введения, включают составы, подходящие для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций, такие как, например, стерильный раствор, эмульсия или суспензия.
В одном воплощении антитело, описанное в настоящем документе, является единственным терапевтически активным агентом, вводимым объекту, например, как монотерапия, изменяющая или предотвращающая болезнь.
В другом воплощении антитело, описанное в данном документе, комбинируют с другими активными веществами, например, в смеси или наборе частей для лечения объекта, нуждающегося в терапии или профилактике, такой как модифицирующее или предотвращающее заболевание комбинированное лечение.
Комбинация с одним или несколькими другими терапевтическими или профилактическими агентами может включать стандартное лечение, например, антибиотики, стероидные и нестероидные ингибиторы воспаления и/или другую терапию на основе антител. Комбинация может, в частности, включать агенты, которые используются для лечения первичного заболевания, где воспалительные процессы могут привести к вторичным воспалительным, дегенеративным или злокачественным заболеваниям. Основным заболеванием является, например, NASH и комбинация будет, например, включать NSAID или другие новые лекарственные средства, такие как агонисты FXR, агонисты GLP1R или агонисты PPAR.
В комбинированной терапии антитело может вводиться в виде смеси или одновременно с одной или несколькими другими схемами лечения, например или до, одновременно или после сопутствующей терапии.
Биологические свойства антитела или соответствующего фармацевтического препарата, описанного в данном документе, могут быть охарактеризованы ex vivo в экспериментах на клетках, тканях и целом организме. Как известно в данной области, лекарства часто тестируют in vivo на животных, включая, без ограничения указанных, мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и обезьян, чтобы измерить эффективность лекарства для лечения заболевания или модели заболевания, или для измерения фармакокине
- 19 044106 тики, фармакодинамики, токсичности и других свойств лекарственного средства. Животных можно назвать моделями заболевания. Терапевтические средства часто тестируют на мышах, включая, без ограничения указанных, голых мышей, мышей SCID, мышей с ксенотрансплантатом и трансгенных мышей (включая нокины и нокауты). Такой эксперимент может дать значимые данные для определения потенциала антитела, которое будет использоваться в качестве терапевтического или профилактического средства с соответствующим периодом полувыведения, эффекторной функцией, активностью ингибитора и/или иммунным ответом при пассивной иммунотерапии. Для тестирования может быть использован любой организм, предпочтительно млекопитающие. Например, из-за своего генетического сходства с людьми приматы, обезьяны могут быть подходящими терапевтическими моделями и, таким образом, могут использоваться для проверки эффективности, токсичности, фармакокинетики, фармакодинамики, периода полувыведения или других свойств рассматриваемого агента или композиции. Тесты на людях в конечном счете необходимы для одобрения в качестве лекарственных средств и, поэтому, конечно, такие эксперименты предполагаются. Таким образом, антитело и соответствующие фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут быть испытаны на людях для определения их терапевтической или профилактической эффективности, токсичности, иммуногенности, фармакокинетики и/или других клинических свойств.
Следовательно, изобретение предусматривает новый способ лечения NASH, и, в частности, те заболевания, которые связаны с NASH. Удивительно, что анти-TNFR1 антитело демонстрировало значительную положительную динамику стеатоза печени и гистологической активности заболевания при NASH, что продемонстрировано на мышиной модели. Ингибирование TNFR1 приводило к значительному снижению процента стеатоза печени, а также содержания триглицеридов. Кроме того, оценка активности NAFLD, которая учитывает стеатоз, баллонирование и лобулярное воспаление, была значительно снижена при лечении анти-TNFR1 антителом. Было неожиданным, что селективное ингибирование TNFR1 демонстрировало положительную динамику фиброза печени на мышиной модели с NAFLD и даже было способно лечить фиброз печени путем уменьшения фиброза в ткани печени. Далее было показано, что обработка анти-TNFR1 антителом способна снижать апоптоз в тканях печени. Кроме того, было достигнуто значительное снижение уровня ALT и сывороточного инсулина. Таким образом, лечение антиTNFR1 антителом привело к значительной положительной динамике воспаления и резистентности к инсулину при NAFLD.
Было особенно удивительно, что анти-TNFR1 антитело демонстрировало значительную положительную динамику стеатоза печени и гистологической активности заболеваний при NASH в свете предшествующего уровня техники, поскольку развитие NASH или стеатоза было зарегистрировано как побочный эффект терапии TNFi. Feagins et al. сообщили, что у пациентов с болезнью Крона, ревматоидным артритом, псориатическим артритом и анкилозирующим спондилитом, которых лечили инфликсимабом, адалимумабом или этанерцептом, развились аномальные уровни ALT во время лечения TNFi, и они показали NAFLD (NASH или стеатоз) при биопсии печени (Eur J Gastroenterol Hepat. 2015, 27(10): 11541160). Таким образом, было совершенно неожиданно, что селективное ингибирование TNFR1 эффективно против NASH.
Примерами антител, описанных в данном документе, являются, например, полноразмерные антитела, полученные в соответствии с WO2012035141, и/или их родительское мышиное антитело Н398, описанное в WO2008113515A2, функционально активные варианты с аффинно-зрелыми вариантами и/или фрагменты антител любого из вышеупомянутых или те антитела, которые являются моновалентными связующими анти-huTNFR1 и содержат антигенсвязывающий сайт любого из вышеуказанных, таких как моновалентные антитела, описанные в WO2017174586 А1.
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, без ограничения ими.
Примеры
Пример 1: Положительная динамика стеатоза печени и гистологической активности заболевания у мышей с экспериментальной NAFLD.
Методы:
B6-huTNFR1-k/i-мыши получали диету с высоким содержанием жира (HFD), состоящую из 60% ккал жира + фруктоза/сахароза в питьевой воде (Kohli R et al, Hepatology 2010) в течение 24 недель, дополненную либо анти-TNFR1 (атросаб), либо контрольным антителом (цетуксимаб, анти-EGFR антитело, Erbitux®, ImClone Systems, Bristol-Myers Squibb und Merck KGaA) (20 мг/кг массы тела, 2x/w) в течение последующих 8 недель.
Антитело атросаб, используемое в настоящем документе, представляет собой полноразмерное антитело, полученное в соответствии с WO2012035141, и содержит антигенсвязывающий сайт, включенный в комбинацию домена VH и VL, содержащее шесть последовательностей CDR, которые представляют собой:
SEQ ID NO: 23: VH-CDR1;
SEQ ID NO: 24: VH-CDR2;
SEQ ID NO: 25: VH-CDR3;
- 20 044106
SEQ ID NO: 26: VL-CDR1;
SEQ ID NO: 27: VL-CDR2;
SEQ ID NO: 28: VL-CDR3.
В конце обработки ткани печени у мышей с дифференцированным лечением сравнивали на предмет стеатоза печени, показателя активности NAFLD, апоптоза и фиброза.
Процент стеатоза, а также показатель активности NAFLD (NAS) по Kleiner et al. (Hepatology 2005) оценивал патолог. Содержание триглицеридов определяли в гомогенизированных тканях печени с помощью ферментного теста (Roche Diagnostics). Апоптоз исследовали иммуногистохимией с применением антитела для активированной каспазы-3 (Cell Signaling). Фиброз определяли окрашиванием Sirius Red в соответствии с протоколом производителя (Sigma Aldrich) и количественно определяли, как описано (Schindelin J et al., Nat Methods 2012).
Сыворотки были проанализированы на уровни ALT с помощью кинетического УФ-теста (Beckman Coulter), а уровни инсулина были измерены с применением набора ELISA для сверхчувствительного мышиного инсулина (Crystal Chem.) в соответствии с инструкциями производителя.
Результаты:
Обработка атросабом привела к значительной положительной динамике стеатоза печени и гистологической активности заболевания у мышей с экспериментальной NAFLD.
Ткани печени мышей HFD, получавших анти-TNFR1 антитело (атросаб) или контрольное антитело (цетуксимаб), гистологически анализировали на процент стеатоза печени, содержания триглицеридов и активности заболевания, оцениваемых по шкале активности NAFLD (NAS). По сравнению с мышами, получавшими контрольное антитело, ингибирование TNFR1 приводило к значительному снижению процента стеатоза печени (р <0,05; Фиг. 1А), а также содержания триглицеридов (р <0,01; Фиг. 1В). Кроме того, показатель активности NAFLD (NAS), который учитывает стеатоз, баллонирование и лобулярное воспаление, значительно (р <0,05) снизился у обработанных Атросабом по сравнению с контрольными мышами (Фиг. 1С).
Пример 2. Селективное ингибирование TNFR1 связано с положительной динамикой фиброза печени на мышиной модели с NAFLD.
Продемонстрировав, что селективное ингибирование TNFR1 демонстрирует положительную динамику стеатоза печени и NAS, проанализировали влияние атросаба на редуцирование фиброза. Положительная динамика фиброза печени была продемонстрирована при оценке окрашиванием Сириусом красным у мышей, получавших анти-TNFR1-антитело, по сравнению с мышами, получавшими контрольное антитело (Фиг. 2А). Количественное определение фиброзной области выявило значительное (р <0,05) снижение фиброза в тканях печени у мышей, получавших анти-TNFR1-антитело, по сравнению с контрольными мышами (Фиг. 2В).
Пример 3. Пониженный апоптоз в тканях печени мышей с NAFLD, обработанных анти-TNFR1 антителом.
В начальных экспериментах мыши получали HFD в течение 20 недель, включая 4-недельную обработку анти-TNFR1 антителом или контрольным антителом. Было продемонстрировано, что обработка анти-TNFR1 антителом способна снижать апоптоз, что оценивалось иммуногистохимическим анализом активной каспазы-3 уже в течение 4-недельного периода обработки. По сравнению с контрольным антителом, значительное (р <0,05) снижение активной каспазы-3 может наблюдаться в тканях печени мышей, получавших анти-TNFR1 антитело (Фиг. 3).
Пример 4. Положительная динамика уровней ALT и инсулина в сыворотке мышей с NAFLD, обработанных анти-TNFR1 антителом.
Наряду с наблюдением положительной динамики гистологии у мышей, получавших анти-TNFR1антитело (Фиг. 1 и 2), было продемонстрировано значительное (р <0,05) снижение уровней ALT (Фиг. 4А) и инсулина (Фиг. 4В) в сыворотке мышей обработанные анти-TNFR1 антителом, по сравнению с обработанными контрольным антителом. Таким образом, селективное анти-TNFR1 ингибирование приводило к значительной положительной динамике воспаления и инсулинорезистентности.
Пример 5: Описание атросимаба - получение и характеризация.
Материалы.
Антитело атросаб получали, как описано в Примере 1. Рекомбинантный гибридный белок TNFR1Fc человека получали, как описано в WO2012035141. Атросимаб (НС: SEQ ID NO: 18; LC: SEQ ID NO: 13) получали и очищали после лентивирусной трансдукции в клетках СНО с помощью Catalent (Catalent Pharma Solutions, Сомерсет, Юинг, Нью-Джерси, США). Анти-His-HRP (HIS-6 His-Probe-HRP, sc-8036) приобретали у Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния, США). Антитело против IgG А человека (козьи, поликлональные, 2010-01) приобретали у SouthernBiotech, а антитело против IgG В человека (козьи, поликлональные, MBS571163), а также антитело против IgG В человека (козьи, поликлональные, MBS571678) - у MyBioSource (Сан-Диего, Калифорния, США). Кроме того, антитело против IgG человека (Fab-специфичное, А 0293) и антитело против IgG человека (Fc-специфичное, А 0170) приобретали у Sigma-Aldrich (Тауфкирхен, Германия).
Получение белков.
- 21 044106
Референсный белок Fab 13.7 получали, как описано в WO2017174586 A1, в транзиторно трансфицированных клетках HEK 293Е с применением полиэтиленимина (линейный, 25 кДа, Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) и очищали с помощью аффинной хроматографии белка строго в соответствии с рекомендациями производителя (CaptureSelect™ IgG- CH1 Affinity Matrix, 194320005, Thermo Fisher Scientific, Драйайх, Германия).
Характеризация белка.
Чистоту и правильную сборку атросимаба анализировали с помощью SDS-PAGE с применением 4 мкг очищенного белка в присутствии и в отсутствие бета-меркаптоэтанола в качестве восстановителя. Белки в геле окрашивали с применением кумасси-бриллиантового синего, и удаляли краситель из гелей водой. Интактный белок анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии с применением ВЭЖХ Waters 2695 и колонки Phenomenex Yarra SEC-2000 (300x7,8 мм). Стандартные белки: тиреоглобулин (669 кДа), апоферритин (443 кДа), алкогольдегидрогеназа (150 кДа), BSA (66 кДа), карбоновая ангидраза (29 кДа), пептид FLAG (1 кДа).
Термическая стабильность.
Температуру плавления/агрегации (Tm) атросимаба определяли динамическим рассеянием света (ZetaSizer Nano ZS, Malvern, Herrenberg, Germany) с применением 100 мкг очищенного белка в PBS. Применяемую температуру увеличивали с интервалом 1°С с 35 до 80°С со временем уравновешивания 2 минуты перед каждым измерением. Tm определяли путем визуальной интерпретации возрастающего сигнала (килоимпульсов в секунду).
Стабильность в плазме.
Образцы очищенного атросимаба разводили в плазме человека до концентрации 100 нМ и инкубировали при 37°С в течение 1, 3 и 7 дней. Последующий анализ остаточной способности связывания с человеческим TNFR1 проводили с помощью ELISA после серийного разведения в 2% обезжиренном молоке в PBS (2% MPBS) с шагами от 1 до 3,16 (квадратный корень из 10). Контрольные образцы инкубировали при 4°С в PBS в течение 7 дней или непосредственно замораживали после разведения в плазме человека.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).
Планшеты для микротитрования покрывали 100 мкл гибридного белка TNFR1-Fc (1 мкг/мл в PBS) и инкубировали при 4°С в течение ночи. Остаточные сайты связывания блокировали 2% MPBS (обезжиренное молоко в PBS, 200 мкл на лунку) при комнатной температуре в течение 2 часов и затем дважды промывали PBS. 100 мкл образцов, разведенных в 2% MPBS, инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа перед последней стадией инкубации со 100 мкл антител, конъюгированных с HRP, в 2% MPBS. Связанный белок определяли с помощью 100 мкл раствора субстрата ТМВ (1 мг/мл 3,3',5,5'тетраметилбензидина [ТМВ], 0,006% Н2О2 в 100 мМ Na-ацетатном буфере, рН 6 при комнатной температуре), HRP-реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М H2SO4 и поглощение при длине волны 450 нм измеряли с применением устройства для считывания планшетов для микротитрования Infinite (TECAN, Меннедорф, Швейцария). Между каждой стадией инкубации и перед детекцией планшеты дважды промывали PBST и дважды PBS.
Измерения аффинности с применением пьезоэлектрического микровзвешивания.
Динамика связывания в реальном времени в межбелковых взаимодействиях определялась с помощью измерений пьезоэлектрического микровзвешивания (Cell-200 C-Fast, Attana, Стокгольм, Швеция). Один из партнеров по связыванию (TNFR1-Fc) химически иммобилизовали на чипе LNB Carboxyl Sensor (3623-3103, Attana, Стокгольм, Швеция) в соответствии с протоколом производителя при умеренной плотности ~ 94 АГц. Эксперименты по связыванию проводили с образцами (анализируемым веществом), разведенными в PBST (PBS, 0,1% Твин 20) в интервале от 128 нМ до 4 нМ (стадии разведения 1:2) при рН 7,4 со скоростью потока 25 мкл/мин при 37°С. Чип регенерировали с помощью 25 мкл 20 мМ глицина, рН 2,0. Каждое третье измерение измеряли инъекцию рабочего буфера, которую вычитали из кривой связывания перед анализом данных. Данные собирали с применением программного обеспечения, предоставленного Attana, и анализировали с помощью программного обеспечения Attache Office Evaluation (Attana, Стокгольм, Швеция) и TraceDrawe (ridgview instruments, Vange, Швеция).
Анализ высвобождения интерлейкина 2x104 клеток HeLa или НТ1080 на лунку высевали в 96луночный планшет для микротитрования и выращивали в 100 мкл RPMI 1640 + 5% FCS в течение ночи. На следующий день надосадочные жидкости заменяли для удаления конститутивно продуцируемых цитокинов. Клетки инкубировали с сериями разведений образцов в RPMI 1640 + 5% FCS при 37°С, 5% CO2. В случае конкурентных экспериментов оба образца анализируемого белка готовили по отдельности (либо титровали, либо разбавляли до одной концентрации), а затем добавляли в планшет. Нестимулированные клетки служили контролем. Через 16-20 часов планшеты центрифугировали при 500 g в течение 5 минут и клеточные надосадочные жидкости анализировали непосредственно методом ELISA, который проводили в соответствии с протоколом производителя. Надосадочные жидкости разводили в RPMI 1640 (без FCS), а антитела разводили в разбавителе для реагентов (0,1% BSA, 0,05% Tween 20, 20 мМ TRIS, 150 мМ NaCl, рН 7,5). Микротитрационные планшеты с покрытием блокировали, используя 1% BSA
- 22 044106 (бычий сывороточный альбумин) в PBS, и промывали, а также обнаружение и измерение проводили, как описано выше для ELISA. Наборы для сэндвич-ELISA для определения IL-6 и IL-8 в надосадочной жидкости клеточной культуры приобретали у ImmunoTools (Friesoythe, Германия).
Цитотоксичность/анализ жизнеспособности клеток.
Клетки (1х104 на лунку) высевали в 96-луночные планшеты для микротитрования и инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% CO2. Белки разбавляли RPMI 1640 + 10% FCS и добавляли к клеткам. При анализе цитотоксичности проводили инкубацию при 37°С, 5% СО2 в течение 24 часов, затем отбрасывали надосадочную жидкость и в лунки добавляли 50 мкл раствора кристаллического фиолетового. Затем планшеты промывали в ddH2O в течение 20 раз и сушили. Оставшийся фиолетовый краситель, полученный из живых и адгерентных клеток, которые были зафиксированы метанолом, содержащимся в окрашивающем растворе, растворяли путем добавления 100 мкл метанола при встряхивании при комнатной температуре в течение 10 минут. Планшеты измеряли с применением устройства для считывания микропланшетов Infinite (Tecan, Maennedorf, Switzerland).
Фармакокинетика.
Трансгенные мыши C57BL/6J, несущие ген внеклеточного домена человеческого TNFR-1 в локусе конкретного гена мыши (C57BL/6J-huTNFRSF1Aecdtm1UEG/izi, Dong et al., 2016), получали внутривенную инъекцию 400 мкг атросимаба. Образцы крови собирали через 3 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч и 6 ч, а также через 3 и 7 дней и немедленно инкубировали на льду. Сыворотку отделяли центрифугированием (13000 г, 4°С, 10 минут) и хранили при -20°С. Оставшийся белок в сыворотке крови определяли путем связывания ELISA, как описано выше. Сигнал ELISA интерполировали по свежеприготовленной стандартной кривой связывания анализируемого белка. Определенные концентрации наносили на график в зависимости от времени, и фармакокинетические константы получали при анализе с применением надстройки PKsolver для Microsoft Excel.
Пример 5.1: Биохимическая характеризация Атросимаба.
Моновалентный антагонист, специфичный к рецептору-1 (TNFR1) фактора некроза опухоли, обозначенный как атросимаб, получали путем слияния вариабельных доменов Fab 13.7 с N-концом гетеродимеризующего Fc-модуля Fclk (one/kappa). Этот процесс привел к получению Fab-подобной одновалентной молекулы увеличенного размера, обладающей способностью взаимодействовать с неонатальным Fc-рецептором для обеспечения увеличенной циркуляции в сыворотке (Фиг. 6а). Полученный кандидат лекарственного средства атросимаб получали в клетках СНО после нескольких циклов лентивирусной трансдукции, очищали аффинной хроматографией с протеином А и последовательной эксклюзионной хроматографией (SEC) с помощью Catalent Pharma Solutions (Catalent Pharma Solutions, Сомерсет, Юинг, Нью-Джерси, США).
Атросимаб продемонстрировал единственный пик в SEC при времени удерживания 17,9 минут с интерполированной молекулярной массой 81 кДа и радиусом Стокса rS 3,5 нм (Фиг. 6b). В SDS-PAGE в восстанавливающих условиях были обнаружены две полосы 38 кДа и 43 кДа, а также одна полоса 70 кДа в невосстанавливающих условиях (Фиг. 6с). Эти данные хорошо соответствуют расчетной молекулярной массе 72 кДа (состоящей из цепей 35 кДа и 36 кДа), и указывают на правильную экспрессию обеих полипептидных цепей и правильную сборку функционального гетеродимерного белка. Кроме того, атросимаб продемонстрировал точку агрегации (Tm), равную 64°С, которую определили динамическим рассеянием света (DLS, Фиг. 6d), что сопоставимо с таковым у интактных молекул IgG, проанализированных также с помощью DLS (Martin et al., 2014, Brader et al., 2015)). Наконец, связывающая активность атросимаба с человеческим TNFR1-Fc оставалась неизменной после инкубации в плазме человека в течение вплоть до 7 дней, что указывает на хорошую стабильность в плазме (Фиг. 6е).
Пример 5.2: связывание атросимаба с TNFR1, рецепторами Fcy и белком комплемента Clq.
Взаимодействие атросимаба с его рецептором-мишенью TNFR1 анализировали с помощью ELISA в условиях равновесия, в результате чего значение ЕС50 составляло 0,4 нМ (Фиг. 7а), что представляет двукратное снижение активности связывания по сравнению с родительским Fab 13.7 и четырехкратное снижение по сравнению с двухвалентным IgG ATROSAB. Кроме того, атросимаб связывался в исследовании связывания в реальном времени с применением пьезоэлектрического микровзвешивания с человеческим TNFR1, иммобилизованным при умеренной плотности рецепторов ~ 94 АГц, с кажущимся значением KD 2,7 нМ и kon 3,7x105 М-1 с-1 и koff 9,8х10’4 с-1 (Фиг. 7b), что было проанализировано с помощью алгоритма связывания 1:1. Следует отметить, что атросимаб включает Fc-область, которая модифицирована для снижения опосредованных антителами эффекторных функций (Armor et al, 1999). Соответственно, атросимаб продемонстрировал почти полное отсутствие связывания с человеческими рецепторами Fcy Ia, IIb и IIIa, а также с белком комплемента Clq, что продемонстрировано с помощью ELISA (Фиг. 7с). Связывание было снижено до такой же степени (FcyRI и FcyRIII) или даже более выражено (FcyRIIb и Clq) по сравнению с ранее описанным анти-TNFR1 человека IgG ATROSAB (Zettlitz et al., 2010), который несет идентичные модификации Fc в отношении к Fcy-рецептора и Clq-связывания.
Пример 5.3: Атросимаб ингибирует активацию TNFR1 in vitro и не обладает какой-либо агонистической активностью.
- 23 044106
Атросимаб продемонстрировал полное отсутствие какой-либо агонистической биоактивности в пределах анализируемого диапазона концентраций между 50 пМ и 500 нМ в экспериментах по высвобождению интерлейкина (IL) с применением клеток HeLa для анализа на IL-6 и клеток НТ 1080 на IL-8, а также в анализах индукции гибели клеток с применением клеток Kym-1 (Фиг. 3а-с). Идентичная утрата агонистической активности была обнаружена в случае родительского Fab 13.7. Напротив, двухвалентный IgG ATROSAB индуцировал предельное высвобождение IL-6 и IL-8 в концентрациях от 1 нМ до 100 нМ (Фиг. 8а и b), что подтверждает ранее опубликованные данные (Richter et al., 2013). Напротив, предельная агонистическая активность ATROSAB не может быть обнаружена в анализе индукции гибели клеток Kym-1 (Фиг. 8с).
Кроме того, атросимаб ингибировал активацию TNFR1, индуцированную 0,1 нМ TNF, в анализе высвобождения IL-6 из HeLa и в анализе высвобождения IL-8 из НТ1080 со значениями ЕС50 54,5 нМ и 24,2 нМ, соответственно (Фиг. 8d и е). Более того, гибель клеток, индуцированная 0,1 нМ TNF в клетках Kym-1, ингибировалась атросимабом со значением IC50 16,2 нМ (Фиг. 8f). По сравнению с родительским Fab 13.7 эти данные представляют снижение биологической активности в 1,5-1,9 раза (Табл. 1). Однако по сравнению с биоактивностью двухвалентного IgG ATROSAB атросимаб продемонстрировал в 3,0 раза, в 3,5 раза и 4,0 раза более сильное ингибирование TNF-опосредованной активации TNFR1, что определено в анализе высвобождения IL6, анализе высвобождения IL-8 и анализе индукции гибели клеток, соответственно (табл. 1).
Таблица 1 Биоактивность атросимаба1
Атросимаб | Fab 13.7 | ATROSAB | |
IC50, IL-6 [нМ] | 54,5 | 37,1 | 164,7 |
IC50, IL-8 [нМ] | 24,2 | 12,7 | 84,1 |
IC50, индукция гибели клеток [нМ] | 16,2 | 9.5 | 64,4 |
С целью устранения потенциального риска вторичного сшивания атросимаба, опосредованного, например, антителами против лекарственного средства (ADA), агонистический потенциал атросимаба анализировали в присутствии трех различных мышиных сывороток против человеческого IgG в анализах высвобождения IL-8 с применением клеток НТ1080 (Richter et al. 2013). ELISA продемонстрировала связывание мышиных сывороток против IgG человека с атросимабом, Fab 13.7 и ATROSAB (данные не представлены). Примечательно, что атросимаб не вызывал какого-либо высвобождения IL-8 в пределах анализируемого диапазона концентраций (от 50 пМ до 500 нМ), что также наблюдалось для родительского Fab 13.7 (Фиг. 9а-с). Напротив, двухвалентный IgG ATROSAB индуцировал явно повышенное высвобождение IL-8 (Фиг. 9а-с) по сравнению с предельным высвобождением, наблюдаемым на Фиг. 8, что указывает на явно сниженную склонность Атросимаба опосредовать любую активацию TNFR1 даже при наличии антител, специфических к лекарственному средству, по сравнению с ATROSAB.
Пример 5.4: Фармакокинетика атросимаба.
Наконец, фармакокинетические свойства атросимаба регистрировали после болюсной инъекции 400 мкг белка с использованием мышей C57BL/6J-huTNFRSF1Aecdtm1UEG/izi (Dong et al., 2016), которые несут трансген внеклеточного домена человеческого TNFR1 (Фиг. 10, табл. 2). Атросимаб удалялся из кровообращения у мышей с начальным периодом полувыведения 2,2 ± 1,2 часа и конечным периодом полувыведения 41,8 ± 18,1 часа, что привело к площади под кривой 5856,0 ± 1369,9 мкг/мл х ч.
Таблица 2
Фармакокинетический анализ атросимаба2
11/2α (ч) | 2,2 = | 1,2 | |
11/2β (ч) | 41,8 | Z | 18,1 |
СО (мкг/мл) | 324,7 | Z | 53,5 |
AUC 0-т (мкг/мл х ч) θ | 5856, | Z | 1369,9 |
Vss (мкг/(мкг/мл)) | 3,4 | Z | 1,3 |
CL ((мкг)/(мкг/мл)/ч) | 0.29 | Z | 0.20 |
ti/2a, начальный период полувыведения; t1/2e, конечный период полувыведения; С0, интерполированная начальная концентрация; AUC 0-t, площадь под кривой до момента обнаружения лазером временной точки; Vss, объем распределения (в устойчивом состоянии); CL, клиренс.
-
Claims (9)
- Список литературыArmour KL, Clark MR, Hadley AG, Williamson LM. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur JImmunol. 1999 Aug;29(8):2613-24.Brader ML, Estey T, Bai S, Alston RW, Lucas KK, Lantz S, Landsman P, Maloney KM.Examination of thermal unfolding and aggregation profiles of a series of developable therapeutic monoclonal antibodies. Mol Pharm. 2015 Apr 6;12(4): 1005-17. doi: 10.1021/mp400666b.Dong Y, Fischer R, Naude PJ, Maier O, Nyakas C, Duffey M, Van der Zee EA, DekensD, Douwenga W, Herrmann A, Guenzi E, Kontermann RE, Pfizenmaier K, Eisel UL. Essential protective role of tumor necrosis factor receptor 2 in neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci U SA2016; 113:12304-9; PMID:27791020; https://doi.org:10.1073/pnas,1605195113Martin N, Ma D, Herbet A, Boquet D, Winnik FM, Tribet C. Prevention of thermally induced aggregation of IgG antibodies by noncovalent interaction with poly(acrylate) derivatives. Biomacromolecules. 2014 Aug ll;15(8):2952-62. doi: 10.1021/bm5005756.Zettlitz KA, Lorenz V, Landauer K, Miinkel S, Herrmann A, Scheurich P, Pfizenmaier K, Kontermann R. ATROSAB, a humanized antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor onespecific antibody. MAbs. 2010 Nov-Dec;2(6):639-47. Epub 2010 Nov 1.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Применение антитела, специфически распознающего человеческий рецептор-1 фактора некроза опухоли (huTNFR1), при лечении неалкогольного стеатогепатита (NASH) и фиброза печени.
- 2. Применение по п.1, где антитело специфически распознает эпитоп в мембранно-дистальном CRD1 и/или субдомене A1 CRD2 в huTNFR1, предпочтительно специфически распознавая эпитоп, представленный аминокислотами 1-115 в N-концевой области huTNFR1.
- 3. Применение по п.1 или 2, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
- 4. Применение по любому из пп.1-3, где антитело представляет собой моноспецифическое, двухвалентное полноразмерное антитело.
- 5. Применение по п.4, где антитело включает Fc-домен IgG1, который является недостаточным для обеспечения эффекторной функции, предпочтительно включающий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из Е233Р, L234V, L235A, AG236, A327G, A330S и P331S, предпочтительно включает A327G/A330S/P331S, причем нумерация соответствует индексу EU по Kabat.
- 6. Применение по любому из пп.1-3, где антитело моновалентно распознает huTNFR1.
- 7. Применение по любому из пп.1-6, где антитело включаетa) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), включающий определяющие комплементарность области (CDR): VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3; иb) вариабельный домен легкой цепи (VL), включающий CDR: VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, гдеi) VH-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO: 1; VH-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 2, VH-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 3, VL-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO: 4, VL-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 5, VL-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 6; или ii) VH-CDR1 включает или состоит из SEQ ID NO: 23, VH-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 24, VH-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 25, VL-CDR1 включает или состоит из SEQ ID N0: 26, VL-CDR2 включает или состоит из SEQ ID NO: 27, VL-CDR3 включает или состоит из SEQ ID NO: 28, где нумерация соответствует индексу EU по Kabat;или функционально активный вариант любого из i) или ii), как указано выше, который включает 0, 1 или 2 точечные мутации в каждой из последовательностей CDR и который специфически распознает huTNFR1.
- 8. Применение по любому из пп.1-7, где антитело включает последовательность VH, включающую или состоящую из SEQ ID NO: 7 или 9; и последовательность VL, включающую или состоящую из SEQ ID NO: 8 или 10, или их функционально активный вариант, включающий до 1 точечной мутации в каждой из последовательностей CDR, и с по меньшей мере 60% идентичностью последовательностей в каркасных (FR) последовательностях FR1-4 из VH и VL.
- 9. Применение по любому из пп.1-8, где антитело используют в эффективном количестве для противодействия передаче сигналов TNFa/huTNFR1.-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17203853.1 | 2017-11-27 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044106B1 true EA044106B1 (ru) | 2023-07-24 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11655296B2 (en) | Anti-CD47 antibody and use thereof | |
US8734798B2 (en) | Function modifying NAv 1.7 antibodies | |
BR112019014694A2 (pt) | anticorpos anti-cd47 e usos dos mesmos | |
AU2019201141B2 (en) | Novel antibody binding to TFPI and composition comprising the same | |
CA3056972A1 (en) | Anti-ox40 antibody and use thereof | |
CN112469735B (zh) | 用于治疗自发性疾病和癌症的抗cxcl13抗体 | |
KR20140019375A (ko) | 인간 조직 인자 항체 및 이의 용도 | |
IL303174A (en) | Multispecific antibodies with specificity for IL-4R and IL-31 | |
JP2024501657A (ja) | Il-31に結合する抗体可変ドメイン | |
ES2903412T3 (es) | Anticuerpos anti-IL-22R | |
WO2015083978A1 (ko) | 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체 | |
KR20230004659A (ko) | 항-인간 신경 성장 인자 항체 | |
JP7080352B2 (ja) | 糖タンパク質viを標的とする抗体 | |
JP2022540859A (ja) | 新規bssl抗体 | |
CN114667296B (zh) | 一种双特异性抗体及其用途 | |
JP7280259B2 (ja) | 非アルコール性脂肪性肝炎の抗huTNFR1治療 | |
CN114437227A (zh) | 双特异抗体及其应用 | |
EA044106B1 (ru) | АНТИ-huTNFR1 ТЕРАПИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА | |
US20170183401A1 (en) | Hypoglycemic agent containing anti-ang2 antibody | |
WO2023145844A1 (ja) | 抗ヒトcxcl1抗体 | |
JP6840222B2 (ja) | clec14aに特異的に結合する脱糖化抗体及びその用途 | |
WO2023180533A1 (en) | Anti-gal3 antibodies and compositions | |
JP2018515437A (ja) | 抗cd20/抗baff二重特異性抗体 |