JP6840222B2 - ｃｌｅｃ１４ａに特異的に結合する脱糖化抗体及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ（ｃｌｅｃ１４ａ）に特異的に結合する脱糖化抗体及びその用途に関する。特に、本発明は、特定配列のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を含み、ｃｌｅｃ１４に特異的に結合する脱糖化抗体及びその用途、例えば、前記抗体を含む血管新生関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物に関する。
腫瘍血管新生は腫瘍進行に重要な役割を担う。血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）及び上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）は血管新生において重要な因子であり、血管新生は癌治療において非常に有望なターゲットとされている。抗−ＶＥＧＦ抗体（ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ：アバスチン）は、転移性大腸癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、非小細胞性肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、及び悪性脳神経膠腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｂｒａｉｎ ｇｌｉｏｍａ）疾患を持つ患者を治療するのに用いられている。抗−ＥＧＦＲ抗体（ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるセツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）は内皮細胞間接触を阻害し、ＶＦＧＦ、インターロイキン−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）及び基本繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）のような血管新生因子の発現を抑制することができる。
しかし、アバスチンは単一製剤として臨床で効能が観察されておらず、現在色々な化学的製剤との併用治療（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）に使用されているが、併用治療の場合、色々な化学的製剤を治療に併用することから患者に様々な副作用をもたらす危険性を抱いている。また、アバスチンは、腫瘍血管の他に正常血管のＶＥＧＦ信号作用も阻害し、正常血管欠陥誘導による蛋白尿（ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ）、高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、胃腸管穿孔（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ）のような副作用を招くことが知られている。
その上、アバスチンの長期使用時には耐性誘発の可能性があり、耐性のついた大腸癌細胞の場合、高いレベルのＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、ＰＩＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ受容体−１（ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）の発現が観察されているため、ＶＥＧＦ中和抗体を処理しても、様々な親−血管生成水溶性因子（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）及び受容体の発現が増加することがある。
このようなアバスチンの副作用及び耐性を改善する新しい抗体新薬を開発する必要性が提示されている。これと関連して、本出願の発明者等は一連の上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）様ドメインであるＣ−タイプレクチン−様ドメイン（ＣＴＬＤ）及びスシ−様ドメイン（ｓｕｓｈｉ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）を構成する細胞外ドメインであるタイプＩ膜貫通蛋白質（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＣｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤが、細胞移動に重要なアクチン細胞骨格再整列（ａｃｔｉｎ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）に重要な役割を持つことを究明した。また、これに基づいてｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ特異的ヒト抗体を選別し、選別された抗体がヒト、ネズミｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤに高い交差反応性を有し、血管内皮細胞の移動阻害、チューブ形成を阻害し、内皮細胞の細胞−細胞接触を阻害することによって、腫瘍新生血管生成を抑制し得ることを確認し、国際公開第ＷＯ２０１３１８７５５６号として出願したことがある。
ただし、動物モデルにおいて開発抗体の効能及び毒性評価のためには抗体の大量生産（ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）が必要であり、抗体自体の安定性が重要であるが、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ特異的ヒト抗体では精製過程において蛋白質凝集が起き、抗体収率向上のための安定性改善過程が必要であることを確認した。
抗体の糖化は大量生産過程で抗体の安定性の他に機能にも影響を与えることがあるので、糖化予測に基づく抗体の糖化変更によって目的する効能の他にも抗体安定性を達成できることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、ｃｌｅｃ１４ａに特異的に結合する抗体であり、国際公開第ＷＯ２０１３／１８７５５６号に開示されたｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ特異的抗体であるクローン１のｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ ＩｇＧのＣＤＲが市販中の治療用抗体にグラフトされて治療用抗体のフレームワークに置き換えられ、軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列内糖化部位の一部を他のアミノ酸配列に置き換えた脱糖化抗体を提供することである。
本発明の他の目的は、前記抗体を含む血管新生関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することである。
前記目的を解決するために、本発明は、ｃｌｅｃ１４ａに特異的に結合する抗体であり、ＴＧＳＳＳＮＩＧＸＸＸＶＴ（配列番号１）のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号１の９番目、１０番目及び１１番目位置のアミノ酸ＸのそれぞれがＲ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｗ、Ｓ、Ｎ、Ｖで構成された群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする抗体を提供する。
本発明はまた、前記抗体を含む血管新生関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の他の技術的特徴及び実施例は下記する詳細な説明及び後述する請求項から一層明らかになるであろう。
治療用抗体４種（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（ｈｕｍｉｒａ）、ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）））への親抗体ＩｇＧのＣＤＲ移植を示す模式図である。 親抗体ＩｇＧ及びクローン１ ＩｇＧ製剤において抗体の凝集を視覚的に観察した結果である。 分光光度法によって測定された親抗体ＩｇＧ（緑色）及びクローン１ ＩｇＧ（オレンジ）の凝集インデクス結果である。凝集インデクスは１００Ｘ［Ａｂｓ３４０／（Ａｂｓ２８０−Ａｂｓ３４０）］で計算した。 抗体沈殿前後の親抗体ＩｇＧ（緑色）及びクローン１ ＩｇＧ（オレンジ）の定量結果である。 ファージディスプレイ技術を用いて４種の糖化ＩｇＧクローン（ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１〜Ｃ４）を選別する脱糖化過程の模式図である。 ｈｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃ、ｍｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃ及びＦｃ単独に対する４種の脱糖化ＩｇＧの結合特異度をＥＬＩＳＡで測定した結果である。 ＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイを行って、ｃｌｅｃ１４ａ媒介血管新生を抑制する最適化リード抗体に対する選別を行った結果である。クローン１ ＩｇＧを陽性対照群として用いた。 ＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイを行って、ｃｌｅｃ１４ａ媒介血管新生を抑制する最適化リード抗体に対する選別を行った結果であり、ブランチ（ｂｒａｎｃｈ）の総数は対照群（ＭＯＣＫ）チューブ形成の百分率で表示される。 傷治癒アッセイを行って、内皮細胞移動に対するｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの影響を測定した結果である。 傷治癒アッセイを行って、内皮細胞移動に対するｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの影響を測定した結果であり、傷の違いの度合は対照群（ＭＯＣＫ）移動に対する百分率で表示される。 還元条件で１次元電気泳動を用いてｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ及びクローン１ ＩｇＧの移動性を評価した結果である。 ２次元電気泳動を用いてｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ及びクローン１ ＩｇＧの同質性を評価した結果である。 Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ−ＨＲＰとｈｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃに結合する親抗体ＩｇＧを添加して競合ＥＬＩＳＡを行った結果である。 親抗体ＩｇＧ（緑色）又はＤｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ（赤色）の存在又は不在（ＭＯＣＫ、黒色）下で流細胞分析を行った結果である。 Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムでバイオレイヤー干渉計法アッセイ（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ ａｓｓａｙ）を用いてｈｃｌｅｃ１４ａ−ＥＣＤ−ｍｙｃに対する親抗体ＩｇＧ（緑色）又はＤｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ（赤色）の親和度を測定した結果である。＊ＫＤ＝ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ；Ｋｏｎ＝ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ；Ｋｏｆｆ＝ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ 親抗体ＩｇＧ（緑色）、Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ（赤色）及びベバシズマブ（青色）の存在又は不在（ＭＯＣＫ、黒色）下でＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイを行った結果である。 ＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイを行った結果であり、ブランチの総数は対照群（ＭＯＣＫ）チューブ形成の百分率で表示される。 親抗体ＩｇＧ（緑色）、Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ（赤色）及びベバシズマブ（青色）の存在又は不在（ＭＯＣＫ、黒色）下で傷治癒アッセイを行った結果である。光顕微鏡を使用して０ｈ（上段）及び８ｈ（下段）でイメージをキャプチャーした。 傷治癒アッセイを行った結果であり、傷の違いの度合いは対照群（ＭＯＣＫ）移動に対する百分率で表示される。 野生型ｃｌｅｃ１４ａで形質感染され、親抗体ＩｇＧ（緑色）又はＤｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ（赤色）の存在又は不在（ＭＯＣＫ、黒色）下で６時間培養されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、光顕微鏡を用いてカウントした結果である。 フィールド当たり凝集体の数を対照群（ＭＯＣＫ）のｃｌｅｃ１４ａ媒介細胞−細胞接触に対する百分率で示す図である。 マイクロタイタープレート上にＨＵＶＥＣｓをコートした後、親抗体ＩｇＧ（緑色）又はＤｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ（赤色）が増加する濃度で存在又は不在下でＨＵＶＥＣｓに結合するｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃ−ＨＲＰを細胞ＥＬＩＳＡで測定した結果である。 マイクロタイタープレート上にｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃをコートした後、親抗体ＩｇＧ（緑色）又はＤｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ（赤色）が増加する濃度で存在又は不在下でｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃに結合するｃｌｅｃ１４ａ−ＥＣＤ−ｍｙｃをＥＬＩＳＡで測定した結果である。 ２日間ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの不在（黒色）又は存在（赤色）下で又は５−ＦＵ（黄色）の存在下でＨＵＶＥＣｓをインキュベーションした後、４５０ｎｍで吸光度を測定して細胞生存度を評価した結果である。 ｈＴＮＦα（ピンク色）又はｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの不在（黒色）又は存在（赤色）下でＨＵＶＥＣｓを培養した結果であり、抗−ＩＣＡＭ−１（上段）又はＶＣＡＭ−１（下段）の多クローン抗体で染色した後、流細胞分析で分析した。ｈＴＮＦαは内皮細胞活性に対する陽性対照群である。 ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの不在又は存在下で培養したＨＵＶＥＣｓをローダミンファロイジン及びＤＡＰＩで染色した結果であり、形態を共焦点顕微鏡で観察した。 ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦとｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの存在又は不在（ＭＯＣＫ）下でＶＥＧＦ依存的ＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ａｋｔ及びＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化に対する免疫ブロット分析結果である。 最適化されたリード抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ毒性評価結果であり、抗体注入３０日後にＧＯＴ、ＧＰＴ、ＢＵＮ、ＣＲＥ、及びＴＢＩＬの血清濃度を測定した結果を示す。 最適化されたリード抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ毒性評価結果であり、抗体注射１日後及び２８日後にマウス体重を測定した結果を示す。 最適化されたリード抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ毒性評価結果であり、抗体注射３０日後に腎臓及び肝組織の細胞死状態を、ＴＵＮＥＬアッセイを用いて分析した結果を示す。 ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの不在（ＭＯＣＫ）又は存在（赤色）下でＶＥＧＦ依存的チューブ形成アッセイを行った結果である。 ＶＥＧＦ依存的チューブ形成アッセイを行った結果であり、ブランチの総数は対照群（ＭＯＣＫ）チューブ形成の百分率で表示される。 親抗体ＩｇＧ（緑色）、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ（赤色）及びベバシズマブ（青色）の存在又は不在（ＭＯＣＫ）下で培養された切断大動脈環におけるＶＥＧＦ依存的血管成長を示すイメージである。 成長した血管の数をカウントした結果である。 親抗体ＩｇＧ、Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ及びベバシズマブの存在又は不在（ＭＯＣＫ）下でヌードマウスのマトリゲルプラグにおいてＶＥＧＦ依存的微細血管の形成を示すイメージである。 ヘモグロビン含有量を測定して微細血管の形成程度を示した結果である。ヘモグロビン含有量は対照群（ＭＯＣＫ）ヘモグロビン含有量に対する百分率で表示される。 ＳＮＵ１８２癌細胞異種移植マウス組織の血管に対するｃｌｅｃ１４ａの特異的発現を検出するためにｃｌｅｃ１４ａ及びＣＤ３１に対する抗体を用いて免疫組織化学を行った結果である。 ＣＦＰＡＣ−１癌細胞異種移植マウス組織の血管に対するｃｌｅｃ１４ａの特異的発現を検出するためにｃｌｅｃ１４ａ及びＣＤ３１に対する抗体を用いて免疫組織化学を行った結果である。 肝癌組織の腫瘍血管からｃｌｅｃ１４ａを検出するためにｃｌｅｃ１４ａ及びＣＤ３１に対する抗体を用いて免疫組織化学染色を行った結果である。 膵癌組織の腫瘍血管からｃｌｅｃ１４ａを検出するためにｃｌｅｃ１４ａ及びＣＤ３１に対する抗体を用いて免疫組織化学染色を行った結果である。 ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの不在（ＭＯＣＫ）、存在（赤色）又はベバシズマブの存在（青色）下でＳＮＵ１８２−、ＣＦＰＡＣ−１又はＵ８７細胞由来微細血管形成を測定した結果である。 ＳＮＵ１８２−、ＣＦＰＡＣ−１又はＵ８７細胞由来微細血管形成を測定した結果であり、ヘモグロビン含有量は対照群（ＭＯＣＫ）ヘモグロビン含有量に対する百分率で表示される。 ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ及びベバシズマブの不在（ＭＯＣＫ）、又は存在下でＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１１６／Ｂｅｖａ細胞由来腫瘍による微細血管形成を、免疫組織化学ＣＤ３１を用いて測定した結果である。 フィールド当たりＣＤ３１陽性を対照群（ＭＯＣＫ）微細血管密度に対する百分率で表示した結果である。 ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの腫瘍成長に対する影響を評価した結果であり、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧが体重に影響を及ぼさないで腫瘍サイズを減らし得ることを示しており、一ヶ月間週１回腫瘍体積及び体重を測定した。 生産された最適化候補抗体の最終抗体生産量を示す図である。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで生産された最適化候補抗体の９０％精製度及び軽鎖−重鎖分子量を確認した結果である。 ＨＵＶＥＣにＶＥＧＦと最適化抗体を処理し、チューブ長変化を確認した結果である。 ＨＵＶＥＣにＶＥＧＦと最適化抗体を処理し、ブランチ数を確認した結果である。 ＶＥＧＦと最適化抗体を処理し、チューブ長変化（血管新生進行）を確認した代表イメージである。 ＥＧＭが存在する状況でＨＵＶＥＣ細胞に優れた抗−血管新生能を示したクローン１、１３、１６抗体を処理した後、チューブ形成（ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の程度を分析した結果である。 ＥＧＭが存在する状況でＨＵＶＥＣ細胞に優れた抗−血管新生能を示したクローン１、１３、１６抗体を処理した後、チューブ形成（ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の程度を分析した結果である。 ｃｌｅｃ１４ａが発現したＨＥＫ２９３細胞においてクローン１、１３、１６抗体を含む最適化抗体によってＣＬＥＣ１４ａ−媒介細胞−細胞接触抑制の有無を分析した結果である。 ｃｌｅｃ１４ａが発現したＨＥＫ２９３細胞においてクローン１、１３、１６抗体を含む最適化抗体によってＣＬＥＣ１４ａ−媒介細胞−細胞接触抑制の有無を分析した結果である。 クローン１、１３、１６抗体によって内皮移動阻害能が現れるか否かを分析した結果である。 クローン１、１３、１６抗体によって内皮移動阻害能が現れるか否かを分析した結果である。 選別された抗体の抗原結合部位を確認するための競合ＥＬＩＳＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ）の模式図である。 最適化候補抗体が選別されたｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１と競合的に抗原に結合するか否かを分析した結果である。 ＨＵＶＥＣ（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）とＭＡＥＣ（ｍｏｕｓｅ ａｏｒｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の表面にクローン１、１３、１６抗体が結合能を示すか否かを、流細胞分析機（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて確認した結果である。 血管内皮細胞の細胞−細胞接合におけるＣＬＥＣ１４ａ−ＣＴＬＤの役割及びＣＬＥＣ１４−ＣＴＬＤ結合抗体が細胞−細胞接合の阻害剤として作用する機作を示す模式図である。 ＣＬＥＣ１４ａ−ＣＬＥＣ１４ａ結合においてＣＴＬＤの役割を確認した結果である。 競合ＥＬＩＳＡを用いて、クローン１、１３、１６抗体がＣＴＬＤドメイン媒介性ＣＬＥＣ１４ａ分子結合を阻害するか否かを確認した結果である。 ＣＬＥＣ１４ａ−ＣＴＬＤ結合抗体による血管内皮細胞表面のＣＬＥＣ１４ａ減少能を示す図である。 細胞ＥＬＩＳＡ方法を用いて最適化抗体のＣＬＥＣ１４ａ減少能を確認した結果である。
本発明は一観点において、ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）に特異的に結合する抗体であり、ＴＧＳＳＳＮＩＧＸＸＸＶＴ（配列番号１）のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号１の９番目、１０番目及び１１番目位置のアミノ酸ＸのそれぞれはＲ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｗ、Ｓ、Ｎ、Ｖで構成された群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする抗体に関する。
本発明で使われた用語“抗体”は、抗原を特異的に認識して特定抗原に免疫学的に反応する免疫グロブリン分子を含む蛋白質分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）及び抗体切片を含む。また、キメラ抗体（例えば、ヒト化されたネズミ抗体）、２価又は２重特異性分子（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）（例えば、２重特異性抗体）、ダイヤボディー（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）及びテトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）は、本発明に使われる抗体の範囲に属する。
全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、軽鎖と重鎖とが二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で結合された２個の全長軽鎖及び２個の全長重鎖で構成されている。哺乳類ではＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧと知られた５個の抗体亜型があり、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の４個の亜型にさらに分類される。
用語“抗体切片（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ）”は、少なくとも抗原−結合性能を維持する切片のことを指し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖを含むことができる。Ｆａｂは抗原結合部位を持つ、重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変部位、軽鎖の不変ドメイン、及び重鎖の第１不変ドメイン（ＣＨ１）で構成されている。Ｆａｂ’は、重鎖のＣＨ１ドメインのＣ−末端に少なくとも１個のシステイン残基をさらに含むという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２は、ヒンジ部位（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）のシステイン残基間の二硫化結合を持つ２つのＦａｂ’分子で構成される。重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変部位で構成されたＦｖ（可変切片）は、親免疫グロブリンの元来の特異性を含む最小の抗体切片である。二硫化−安定化されたＦｖ（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ，ｄｓＦｖ）は、二硫化結合によって軽鎖の可変部位に重鎖の可変部位を結合させることによって形成される。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）は、重鎖と軽鎖のそれぞれの可変部位でペプチドリンカーによって共有結合的に連結されたＦｖである。プロテアーゼ（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２を提供するパパイン（ｐａｐａｉｎ）又はペブシン）で全抗体を処理してそれらの抗体切片を得ることができ、好ましくは遺伝組換え技術によって構築することができる。
ここに使われた用語“モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）”とは、実質的に同じ集団の抗体から収得し、単一エピトープに対する結合特異性及び親和性を示す、均一な分子組成を持つ抗体分子のことを指す。
一般に、免疫グロブリンは１個の重鎖及び２個の軽鎖で構成された基本構造単位を有する。重鎖のそれぞれは１個の可変領域及び３個の不変ドメインで構成されているが、それぞれの軽鎖は１個の可変領域及び１個の不変ドメインで構成されている。重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域は３個の相補性−決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ；以下、“ＣＤＲｓ”と称する。）及び４個のフレームワーク部位を含む。ＣＤＲｓは抗体のエピトープに結合するために機能する。各鎖上のＣＤＲｓはＮ末端から始まってＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の順に配列される。これらは位置している鎖によって区別される。
本発明に係る抗体は、まず、本出願の発明者によって出願されたＷＯ２０１３／１８７５５６に開示されたｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤヒト抗体（以下、親抗体）のｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ ＩｇＧクローン１の重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列の６個（配列番号１１〜１６）をＦＤＡ承認された治療用抗体４種（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））、ｔｒａｔｕｚｕｍａｂ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）））のフレームワーク部位に融合するＣＤＲグラフト（ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ）を行った。
本発明の一実施例によれば、ＣＤＲグラフトを行った４種の抗体配列と親抗体との凝集程度及びＤＩ（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を観察した。凝集点数は配列上の凝集程度を予測する数値であり、値が低いほど凝集が少ないと解釈し、ＤＩは溶液中の蛋白質安定性を予測する数値であり、値が低いほど抗体の溶解度及び安定性が高いと解釈する。その結果、親抗体は凝集程度及びＤＩが相対的に高い形態と予測されるのに対し、４種の抗体のうちオマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ，Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））のフレームワークに置換された抗体が凝集程度及びＤＩの両方に優れていることを確認した。
また、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ，Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））フレームワークに置換された抗体はＣＤＲグラフトした残り３種の抗体に比べて生産性が確保され、凝集は起こらないことを確認した。また、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ，Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））フレームワークに置換された抗体だけがヒト及びネズミのＣＴＬＤに対する交差反応性を示すだけでなく、親抗体と類似の抗原反応性及び親抗体と同等以上のチューブ形成阻害能を有することを確認した。
これによって、本発明に係る抗体は、配列番号１７〜２０で構成された群から選ばれる一つ以上の重鎖可変領域フレームワークを含むことができる。また、配列番号２１〜２４で構成された群から選ばれる一つ以上の軽鎖可変領域フレームワークを含むことができる。
本発明に係る抗体は脱糖化抗体であってもよい。本明細書で使われる用語“糖化”と関連して、糖蛋白質、例えば、抗体の場合、宿主細胞の種類、組換え体の操作方法、培養条件によって糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）発生の有無と糖鎖の構造や形態が異なることがある。すなわち、糖蛋白質の生産過程において糖鎖構造や糖鎖を構成する構成糖の量の差などによって種々の糖鎖（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）が生成され、生産条件の違いによる不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が存在することがある。糖鎖構造が互いに異なる糖蛋白質の場合、生体内動態や組織分布が天然型と異なったり、天然型に対して拮抗作用をして有害反応を起こしたり、長期間連続投与時に抗原として作用して免疫学的問題を引き起こしたりし得る。このように糖鎖は薬理効果と体内動態に影響を及ぼし得る重要な要素になり得る。
このような糖鎖調節の一環として、本発明に係る抗体は、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ，Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））フレームワークに置換された抗体を脱糖化した抗体であってもよい。脱糖化抗体は、糖鎖化されていない免疫グロブリンＦｃ断片を含むものを意味でき、例えば、Ｎ−連結糖化部位又はＯ−連結糖化部位を変形又は除去することができる。Ｎ−連結は、糖鎖がアスパラギン残基の側鎖に付着したものを意味でき、Ｏ−連結は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースのいずれか一つをヒドロキシアミノ酸、最も一般には、セリン又はトレオニンに付着させることを意味できる。
糖化部位の変形又は除去は、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法を利用することができ、これに制限されるものではない。本発明に係る具体的実施例では、抗体のＬ−ＣＤＲ１内に１個のＮ−糖化部位（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）が存在することを予測し、予想されるＮ−糖化部位に対して（ＮＮＫ）３を用いて無作為ｓｃＦｖライブラリーを作製した後、ファージディスプレイ技法を用いて脱糖化抗体を選別した。
これに基づいて、本発明では、ＴＧＳＳＳＮＩＧＸＸＸＶＴ（配列番号１）のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を有し、配列番号１の９番目、１０番目及び１１番目位置のアミノ酸のそれぞれはＲ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｗ、Ｓ、Ｎ、Ｖで構成された群から選ばれるいずれか一つの抗体を提供する。
一実施例において、前記配列番号１の９番目、１０番目及び１１番目位置のアミノ酸はＲＣＧ、ＡＴＡ、ＷＳＮ又はＡＶＶであってもよい。前記アミノ酸がＲＣＧの場合にＴＧＳＳＳＮＩＧＲＣＧＶＴ（配列番号２）のＣＤＲ１、ＡＴＡの場合にＴＧＳＳＳＮＩＧＡＴＡＶＴ（配列番号３）のＣＤＲ１、ＷＳＮの場合にＴＧＳＳＳＮＩＧＷＳＮＶＴ（配列番号４）のＣＤＲ１、ＡＶＶの場合にＴＧＳＳＳＮＩＧＡＶＶＶＴ（配列番号５）のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
本発明の一実施例によれば、選別された４種の脱糖化抗体Ｄｅｇｌｙｃｏ−Ｃ１〜Ｄｅｇｌｙｃｏ−Ｃ４において抗体の凝集が全く観察されず、高い最終精製収率を有することを確認した。また、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）フレームワークに置換された抗体に比べて脱糖化抗体の特性が維持されているかを確認した結果、４種の脱糖化抗体Ｄｅｇｌｙｃｏ−Ｃ１〜Ｄｅｇｌｙｃｏ−Ｃ４ともヒトとネズミのＣＴＬＤに対する交差反応性が維持されることを確認した。
前記配列番号１の９番目、１０番目及び１１番目位置のアミノ酸は好ましくはＲＣＧであってもよい。配列番号１の９番目、１０番目及び１１番目位置のアミノ酸がＲＣＧである場合、本発明に係る抗体は、ＴＧＳＳＳＮＩＧＲＣＧＶＴ（配列番号２）のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を有することができる。
本発明の一実施例によれば、配列番号２のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を有する抗体はＤｅｇｌｙｃｏ−Ｃ１と表示される。脱糖化抗体の効能が維持されているかを確認するためにチューブ形成能を観察した結果、Ｄｅｇｌｙｃｏ−Ｃ１がオマリズマブ抗体のフレームワーク部位とＣＤＲグラフトされた抗体（ｃｌｏｎｅ １ ＩｇＧ）と類似な程度のチューブ形成阻害能を示すことを確認した。さらに、Ｄｅｇｌｙｃｏ−Ｃ１の脱糖化程度を確認した結果、糖化パターンが除去されて消えたことを確認した。
“ヒト抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、ＣＤＲｓ、フレームワーク部位などを含めて、ヒト免疫グロブリンの全成分のアミノ酸配列で全体的に構成された分子である。ヒト疾患の治療法においてヒト抗体は少なくとも三つの潜在的な長所を有する。最初に、ヒト抗体はヒト兔疫体系とより好適に相互作用してより効果的にターゲット細胞を破壊するが、例えば、補体依存性細胞毒性反応（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞−媒介細胞毒性反応（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）がある。次の利点は、ヒト兔疫体系がヒト抗体を外部分子として認識しないということである。しかも、ヒト抗体の半減期は、より少量又は少ない回数で投与される時にさえ、ヒト循環系から自然的に発生する抗体に類似している。本発明に係る抗体は好ましくはヒトモノクローナル抗体であり、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−媒介血管新生を効果的に抑制するヒト内皮細胞上に発現したｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤに対する強力な親和力を有するだけでなく、重鎖及び軽鎖の両方ともヒトから由来して低い免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を有するので、血管新生関連疾患又は癌の治療に有用であり得る。
“ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）”は、Ｃ−タイプレクチン／Ｃ−タイプレクチン−様ドメイン（ＣＴＬ／ＣＴＬＤ）上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）のメンバーを意味する。Ｃｌｅｃ１４ａは一連の上皮細胞成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）様ドメインであるＣ−タイプレクチン−様ドメイン（ＣＴＬＤ）及びスシ−様ドメイン（ｓｕｓｈｉ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）を構成する細胞外ドメインであるタイプＩ膜貫通蛋白質（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。ｃｌｅｃ１４ａに関する情報はＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋのような公認データベースから得ることができる。例えば、ヒトｃｌｅｃ１４ａはＧｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ １６１１９８を有し得るが、これに限定されるものではない。“ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）のＣ−タイプレクチン様ドメイン（Ｃ−ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ，ＣＴＬＤ）”は、“ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ”又は“ｃｌｅｃ１４ａ ＣＴＬＤ”とも呼ばれ、いずれも同じ意味である。
”エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）”は抗原特異性を決定する部位であり、抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）又は抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）と同じ意味で使われる。
さらに、本発明では脱糖化抗体の親和度改善のために、ＨＣＤＲ３の抗原−抗体反応性に関連した主要アミノ酸残基を変形することができる。例えば、アラニンスキャニング（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）法で決定し、それを、無作為突然変異を誘導した無作為抗体ライブラリー（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ａｂ ｌｉｂｒａｒｙ）を作成し、親抗体に比べて反応性が高い抗体を選別した。各抗体はイースト表面ディスプレイ（ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ）とファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）技法を用いて、親抗体に比べて特性及び機能が維持された抗体を選別することができる。
一実施例において、本発明に係る抗体は、配列番号２〜５で構成された群から選ばれるＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を含むことができる。前記ＣＤＲ１の他にも配列番号１５のＣＤＲ２及び配列番号１６のＣＤＲ３をさらに含む軽鎖可変領域を含むことができる。本発明に係る抗体は、配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、又は配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
本発明に係る抗体は、配列番号７〜１０で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことができる。本発明に係る抗体は、配列番号２のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を含むことができる。配列番号７の軽鎖可変領域を含むことができる。
一実施例において、本発明に係る抗体は配列番号１３、配列番号２５〜６０で構成された群から選ばれるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができる。前記ＣＤＲ３に配列番号１１のＣＤＲ１及び配列番号１３のＣＤＲ２をさらに含む重鎖可変領域を含むことができる。本発明に係る抗体は配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３７の重鎖ＣＤＲ３又は配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４０の重鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
配列番号６、６１〜９６で構成された群から選ばれる重鎖可変領域を含むことができる。本発明に係る抗体は、配列番号１３のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号６の重鎖可変領域を含むことができる。
本発明に係る抗体は、配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３７の重鎖ＣＤＲ３、又は
配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４０の重鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
本発明に係る抗体は、配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号６の重鎖可変領域、
配列番号８の軽鎖可変領域及び配列番号６の重鎖可変領域、
配列番号９の軽鎖可変領域及び配列番号６の重鎖可変領域、
配列番号１０の軽鎖可変領域及び配列番号６の重鎖可変領域、
配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号６１の重鎖可変領域、
配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号７３の重鎖可変領域、又は
配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号７６の重鎖可変領域を含むことができる。
本発明の抗体が一定のドメインを含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はそれらの組合せ又はハイブリッドから由来し得る。
ここに使われた“組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）”は、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ切片をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合されてダイマー又はマルチマーを生成することを意味する。これは、ダイマー又はマルチマーがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの不変ドメインで構成された群から選ばれる２個又はそれ以上の不変ドメインから形成され得るということを示す。
ここに使われた用語“ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）”は、異なる起源の２個又はそれ以上の重鎖不変ドメインをコードする配列が単鎖免疫グロブリン重鎖不変ドメイン内に存在するということを意味する。例えば、ドメインハイブリッドは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２，ＣＨ３及びＣＨ４で構成された群から選ばれる１個〜４個のドメインで構成され得る。また、ハイブリッドの組合せは、ＩｇＧ亜型であるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の重鎖不変ドメインから生成され得る。ハイブリッドの組合せは上記に定義した通りである。
また、本発明の抗体は軽鎖不変部位をさらに含むことができ、ラムダ（λ）又はカッパ（κ）軽鎖から由来し得る。
好ましくは、前記抗体はヒトｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤだけでなく、ネズミ科ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤに特異的に結合して血管新生を抑制し得るヒトモノクローナル抗体であってもよい。ヒト及びマウスのいずれにおいても機能するヒト抗体の能力、言い換えれば交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）は、ヒト抗体をマウス内で臨床前に研究可能にする利点を提供する。
本発明は他の観点において、前記抗体を含む血管新生抑制用組成物又は血管新生関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物に関する。
本発明による抗体が血管新生を効果的に抑制し得るので、前記抗体を有効成分として含む組成物も血管新生を抑制するのに有用であり、さらには血管新生関連疾患を予防又は治療するのに有用であり得る。
ここに使われた用語“血管新生の抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）”は、以前に存在した管から新しい血管の形成又は成長を抑制することを意味する。本発明の目的のために、血管新生の抑制は細胞移動、細胞間接触を抑制、より好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−媒介細胞移動、ｃｌｅｃ１４ａ−媒介細胞間接触、ＨＵＶＥＣ移動、又はチューブ形成、ｃｌｅｃ１４ａ ＣＬＴＤ−ＣＬＴＤ複合体形成を抑制することによって達成される。
ここに使われた用語“血管新生関連疾患（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）”は、血管新生の発生又は進行に関連した疾患を意味する。前記抗体で治療し得るものであれば、その疾病はいずれも血管新生関連疾患の範囲に含まれ得る。血管新生関連疾患の例には、癌、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、糖尿病網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、角膜移植拒否（ｃｏｒｎｅａｌ ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、血管新生緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｇｌａｕｃｏｍａ）、全身紅皮症（ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｓ）、増殖性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、血友病性股関節炎（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、動脈硬化性プラーク（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）の毛細血管形成、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、傷顆粒化（ｗｏｕｎｄ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、血管癒着（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、リューマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、退行性関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レステノシス（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、粥状動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、腸狭窄（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）、猫ひっかき病（ｃａｔ ｓｃｒａｔｃｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、肝硬変症（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、腎臓炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、糖尿病性腎臓疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、真性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、炎症疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）及び神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）を含むが、これに限定されるものではない。また、前記癌は、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、直膓癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａ
ｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、結合組織癌（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）及び多発性骨髄血液癌（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）で構成された群から選ばれるが、これに限定されるものではない。
ここに使われた用語“予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｒ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）”は、本発明の抗体又は組成物を投与して、関心疾患の開始を抑制又は遅延させる全ての措置を指す。用語“治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ）”は、本発明の抗体又は組成物を投与して、関心疾患の症状を改善又は好転させる全ての措置を指す。
本発明の抗体を含む組成物は好ましくは、薬学的組成物であり、本分野において典型的に使用されるビヒクル、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。
薬学的に許容可能なビヒクルを含む薬学的組成物は、錠剤、丸薬、粉末、顆粒剤、カプセル剤、サスペンション、内服液、エマルジョン、シロップ、滅菌水溶液、非水溶液、サスペンション、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅｓ）及び坐薬のような様々な経口又は非経口服用の形態であってもよい。これと関連して本発明の薬学的組成物は、フィラー、増粘剤、バインダー、湿潤剤、錠剤分解物質（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）、界面活性剤などのような希釈剤又は賦形剤で組み合せて剤形化することができる。経口投与のための固相製剤は、錠剤、丸薬、粉末、顆粒剤、カプセル剤などのような形態であってもよい。それら固相剤と関連して、本発明の化合物は、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、又はゼラチンのような一つ以上の賦形剤を組み合せて剤形化することができる。簡単な賦形剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤をさらに使用することができる。経口投与のための液体製剤は、サスペンション、内服液、エマルジョン、シロップなどであってもよい。水又は液体パラフィンのような簡単な希釈剤、湿潤剤、甘味剤、芳香族、防腐剤などのような様々な賦形剤を液体製剤中に含めることができる。また、本発明の薬学的組成物は、滅菌水溶液、非水溶性溶媒、サスペンション、エマルジョン、凍結乾燥物、坐薬などのような非経口服用の形態であってもよい。注入可能なプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油及びオレイン酸エチルのようなエステルが非水溶性溶媒及びサスペンションに適合し得る。坐薬の基本物質は、ウィテップゾール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール（ｍａｃｒｏｇｏｌ）、ツイン６１（Ｔｗｅｅｎ ６１）、カカオバター（ｃａｃａｏ ｂｕｔｔｅｒ）、ラウリンバター（ｌａｕｒｉｎ ｂｕｔｔｅｒ）及びグリセロゼラチン（ｇｌｙｃｅｒｏｇｅｌａｔｉｎ）を含む。
本発明の組成物は薬学的に有効な量で投与される。ここに使われた用語“薬学的に有効な量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）”は、いずれの医学的治療にも適用可能なリーズナブルな利益と危険との比率（ｂｅｎｅｆｉｔ／ｒｉｓｋ ｒａｔｉｏ）であり、十分の疾患治療用薬学的組成物の量のことを指す。有効量は、治療すべき疾患の重症度、患者の年齢及び性別、疾患の種類、薬剤の活性度、薬剤に対する敏感度、投与時間、投与経路、分泌速度、治療期間、薬剤の共投与及び本分野で知られた他のパラメータを含む様々な要因によって変わる。本発明の組成物は単独で又は他の治療法と組み合せて投与し得る。この場合に、従来の治療法と共に順に又は同時に投与できる。また、前記組成物は１回量又は複数回量で分けて投与できる。これらの要因を完全に考慮する時、副作用無しで最大の効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要であり、この服用量は分野の専門家によって容易に決定され得る。本発明の薬学的組成物の服用量は特別に限定されないが、患者の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬の種類、投与経路及び投与時間を含む様々な要因によって変更される。組成物は１日に１回量又は多回容量でラット、ネズミ、家畜、ヒトなどを含む哺乳類内に典型的に許容された経路、例えば、経口で、直腸で、静脈で（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）、皮下で（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、子宮内に（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅｌｙ）又は脳血管内に（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｌｙ）投与され得る。
本発明は他の観点において、前記抗体又は前記組成物を必要とする個体に投与する段階を含む血管新生を抑制する方法、血管新生関連疾患予防又は治療方法に関する。
前記抗体、前記組成物及び血管新生抑制は、上述した通りである。
さらにいうと、本発明の抑制方法は、血管新生の抑制を必要とする個体に薬学的に有効な量の薬学的組成物を投与する段階を含む。前記個体はイヌ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ及びヒトのような哺乳類であるが、これに限定されるものではない。薬学的組成物は非経口的に（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）、皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、腹腔内に（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）、肺内に（ｉｎｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｉｌｙ）又は鼻内に（ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ）、必要ならば、局所治療のために病巣内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ）投与を含む適切な方法によって投与できる。本発明の薬学的組成物の好ましい服用量は個体の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬剤の種類、投与経路及び投与時間を含む様々な要因によって変わり、本分野の当業者によって容易に決定され得る。
本発明はさらに他の観点において、前記抗体を含む癌予防又は治療用薬学的組成物、又は前記抗体又は前記組成物を必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防又は治療方法に関する。用語‘抗体’、‘予防’及び‘治療’は上述した通りである。
本発明の抗体で治療可能であれば癌に制限はない。ｃｌｅｃ１４ａ−媒介腫瘍進行が発生する癌が好ましい。詳細には、本発明の抗体は血管新生を抑制することによって癌の発生又は進行を予防することができる。癌の例には、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、直膓癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、結合組織癌（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）及び多発性骨髄血液癌（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）を含むが、これに限定されるものではない。
また、本発明の抗体は、他の抗体又は生物学的活性剤又は様々な目的のための物質と組み合せて使用することができる。
以下、実施例を参照して本発明をより具体的に説明する。このような実施例は例示のためのもので、本発明の範囲を制限するためのものではないことは、当業者にとって明らかである。
実施例１：ｉｎ ｓｉｌｉｃｏベースのＣＤＲグラフトを用いた安定性改善抗体の作製
ＷＯ２０１３／１８７５５６において、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ親抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に血管新生特性を調節し得ることを報告したことがある。ただし、親抗体（ＷＯ２０１３／１８７５５６のクローン１）の場合、精製過程で凝集が著しく起きることを確認し、抗体収率向上のための追加最適化過程が必要だった。このため、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏベースのＣＤＲグラフトを行った。親抗体の重鎖及び軽鎖可変領域内の６個のＣＤＲ（表１）をＦＤＡ承認された治療用抗体４種（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））、ｔｒａｔｕｚｕｍａｂ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）））のそれぞれのフレームワーク部位にグラフトした（図１Ａ）。
Figure 0006840222
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏベースの分析及びＡｃｃｅｌｒｙｓ社から提供するＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ｓｔｕｄｉｏ ３．１ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ＣＤＲグラフトを行った４種の抗体（クローン１〜４のＩｇＧ）と親抗体のＤＩ（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）をそれぞれ比較した。ＤＩは凝集特性によって単クローン抗体を評価するのに用いられる迅速なｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測指標である。ＤＩが高いほど、凝集度がより高いことを示す。
表２に示すように、親抗体及びＣＤＲグラフトを行った４種の抗体のうち、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ，Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））のフレームワーク部位（フレームワーク部位の具体的配列は表３）を持つクローン１ ＩｇＧが、親抗体及びＣＤＲグラフトを行ったその他抗体（クローン２〜４のＩｇＧ）に比べて低いＤＩを示し、これはクローン１ ＩｇＧの安定性が優れることを意味する。
Figure 0006840222
クローン１ ＩｇＧの改善された凝集度を確認するために、視覚的観察によって精製された親抗体ＩｇＧ及びクローン１ ＩｇＧの凝集を比較し、その後、分光光度法を用いて確認した。凝集は親抗体ＩｇＧのみから観察され、クローン１ ＩｇＧからは視覚的に観察されなかった（図１Ｂ）。分光光度法によって測定された親抗体ＩｇＧ及びクローン１ ＩｇＧの凝集インデクスはそれぞれ約２３．４及び１．５であり、これはクローン１ ＩｇＧが親抗体ＩｇＧに比べて溶解度が高いことを意味する（図１Ｃ）。
親抗体ＩｇＧ及びクローン１ ＩｇＧの安定性をさらに比較するために、凝集体を沈殿させ、遠心分離で除去した後、水溶性抗体を定量した。親抗体ＩｇＧ製剤では約９５％の抗体が凝集されたが、クローン１ ＩｇＧではいかなる抗体凝集体も観察されなかった（図１Ｄ）。この結果は、安定性の向上した抗体プラットホーム製造にｉｎ ｓｉｌｉｃｏベースのＣＤＲグラフトが効果的な方法であることを提示する。
実施例２：連続的脱糖化工程及び機能的分離を用いた最適化された抗体の選別
治療用蛋白質における糖化異質性はバイオ医薬品の開発及び生産において特性品質に重要な影響を及ぼし得る。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏベースのクローン１ ＩｇＧの糖化評価によってクローン１ ＩｇＧの軽鎖ＣＤＲ１内の推定的なＮ−糖化部位を確認した。このような予想されるＮ−糖化部位を除去するために、Ｎ−糖化部位に無作為変異を有する半合成抗体ライブラリーを作製し、脱糖化工程を行った。具体的に、ＮＮＫトリヌクレオシドオリゴヌクレオシドでランダム化された半合成ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を作製し、磁性ビーズのコートされたヒト及びマウスｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤを含むファージディスプレイ技術を用いて連続的にバイオパンニングを行った。最後に、選別されたｓｃＦｖクローンのＤＮＡをシーケンシングした後、ヒト及びマウスｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤｓ（ｈｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ及びｍｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ）の両方に強く反応する４種のクローン及び予想Ｎ−糖化部位から、異なるアミノ酸配列を無作為的に選択した（図２Ａ）。
Figure 0006840222
その後、ｓｃＦｖクローンをＩｇＧに転換し、ＨＥＫ（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）２９３細胞で発現させた後、精製した。ＥＬＩＳＡ分析によれば、全ての精製された脱糖化ＩｇＧ（ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１〜Ｃ４ ＩｇＧｓ）は、ｈｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃ及びｍｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃの両方に特異的に結合するが、Ｆｃ単独には結合しないことを確認した。これはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ特異的に結合する抗体であることを意味する（図２Ｂ）。
また、表４のように、４種の脱糖化ＩｇＧ（ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１〜Ｃ４ ＩｇＧｓ）は、凝集が全く観察されず、特に、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１及びｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ２が高い最終精製収率を有することを確認した。
Figure 0006840222
抗体エンジニアリングにおいて導入された遺伝的変異は予想し得ない欠陥を誘導し、結果的に抗体機能を減少させる。ｃｌｅｃ１４ａ媒介血管新生を抑制する抗体を分離するために、クローン１ ＩｇＧ及びｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１〜Ｃ４ ＩｇＧの存在又は不在下でチューブ形成及びＨＵＶＥＣｓ（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を用いた内皮移動アッセイを行った。４種のｄｅｇｌｙｃｏ ＩｇＧの中からｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧをリード抗体として選別したが、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧがＨＵＶＥＣチューブ形成（図２Ｃ及び図２Ｄ）及び移動（図２Ｅ及び図２Ｆ）に最も優れた阻害効果を示したためである。また、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧが軽鎖ＣＤＲ１においてアミノ酸配列に目的する変化（Ｎ３２Ｒ／Ｎ３３Ｃ／Ｓ３４Ｇ）を含んでいることを確認した。
Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの生化学的特性を分析するために、還元条件で１次元電気泳動を用いてｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ及びクローン１ ＩｇＧの移動性をまず評価した。Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＶＬの分子量は予想した分子量と類似に２５ｋＤａだったが、脱糖化前の糖化形態であるクローン１ ＶＬの分子量は、より高かった（図２Ｇ）。
２次元電気泳動もまた、等電点（ｐＩ）よりも低い範囲に存在するクローン１ ｓｃＦｖの異種パターンがｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ｓｃＦｖでは存在しないことを示しており、これはｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの向上した同質性を意味する（図２Ｈ）。
要するに、これらの結果は、選別されたリード抗体は病理学的血管新生を効果的に抑制し、均質性の向上した抗−血管新生抗体であることを提示する。
実施例３：最適化されたリード抗体の生化学的及び機能的特性
Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧのｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ結合位置を確認するために、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）がコンジュゲーションされたｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ（ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ−ＨＲＰ）を作製した後、競合ＥＬＩＳＡを実施した。
ｈｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃに結合するｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ−ＨＲＰは親抗体ＩｇＧ添加によってずば抜けて競合的であり、これは、親抗体及びｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１が類似のｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ結合位置を有することを意味し得る（図３Ａ）。
Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧがヒト内皮細胞に結合するかを確認するために、ＨＵＶＥＣｓで流細胞分析を行った。Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧは親抗体ＩｇＧと同様にＨＵＶＥＣｓ表面に特異的に結合した。また、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧのｈｃｌｅｃ１４ａ−ＥＣＤ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｌｅｃ１４ａ）に対する結合親和度を測定するために抗体−抗原結合に対する実時間測定を行い、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧは親抗体ＩｇＧと類似の約６ｎＭのＫＤ定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）を有することを確認した（図３Ｃ）。
要するに、この結果から、２段階の最適化工程にもかかわらず、最適化リード抗体の結合特性は親抗体ＩｇＧと類似の程度に維持されることが確認できる。
Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ及びベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生抑制効果を比較するために、親抗体ＩｇＧ、ｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ又は陽性対照群としてベバシズマブの存在又は不在下でチューブ形成及び移動アッセイを行った。Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧはＨＵＶＥＣチューブ形成を顕著に阻害し（図３Ｄ及び３Ｅ）、ベバシズマブ ｉｎ ｖｉｔｒｏと同等程度に移動を抑制した（図３Ｆ及び３Ｇ）。これは、リード抗体の抗−血管新生活性効能がベバシズマブに相当することを意味する。
実施例４：最適化されたリード抗体の新規作用機作
血管新生においてｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの作用機作を確認するために、野生型ｃｌｅｃ１４ａで形質感染され、親抗体ＩｇＧ又はｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの存在又は不在下で培養されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いて、形成された細胞凝集体の数をモニタし、ｃｌｅｃ１４ａ媒介細胞−細胞接触に対する機能的アッセイを行った。
ｃｌｅｃ１４ａ媒介細胞−細胞接触を特異的に遮断する陽性対照群として親抗体ＩｇＧを使用した。Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧは親抗体ＩｇＧと同様に、野生型ｃｌｅｃ１４ａで形質感染された細胞の凝集を抑制する効能を示した。これは、血管新生においてｃｌｅｃ１４ａ媒介細胞−細胞接触に対するｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの阻害効能を提示する（図４Ａ及び図４Ｂ）。
分子レベルで具体的に血管新生におけるｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ作用機作を分析するために、親抗体ＩｇＧ又はｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの不存在下、またはこれらの濃度を増加させる条件下において、ｈｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃ−ＨＲＰ（ＨＲＰ−ｌａｂｅｌｅｄ ｈｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃ）でＨＵＶＥＣｓを処理した。Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧは、親抗体ＩｇＧと同様に、ＨＵＶＥＣｓに結合するｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤを濃度依存的に顕著に抑制した（図４Ｃ）。
また、親抗体ＩｇＧ又はｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの不存在下、またはこれらの濃度を増加させる条件下において、ｈｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ−Ｆｃ−ＨＲＰを精製されたｈｃｌｅｃ１４ａ−ＥＣＤと共にインキュベーションした。ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧは親抗体ＩｇＧと同様に、ｈｃｌｅｃ１４−ＣＴＬＤとｈｃｌｅｃ１４ａ−ＥＣＤとの分子的相互作用を濃度依存的に直接阻害した（図４Ｄ）。
要するに、この結果は、作製された抗体がｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ媒介ｃｌｅｃ１４ａ分子間の分子的相互作用を直接遮断し、血管新生の間に内皮細胞−細胞接触を特異的に阻害する相互作用遮断剤として役割を持つことを提示する。
実施例５：内皮細胞毒性及び内皮細胞におけるＶＥＧＦ信号作用に対する最適化されたリード抗体の影響
内皮細胞毒性に対するｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの影響を評価するために、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ処理後にＨＵＶＥＣｓ生存度を測定した。生存度はＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（＃ＣＫ０４−１３，Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてメーカーのマニュアルに従って測定した。
ＨＵＶＥＣｓはこのような細胞に対して細胞毒性効果を示さなかったのに対し、５−ＦＵ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）はＨＵＶＥＣｓの生存度を顕著に減少させた（図５Ａ）。
また、免疫細胞化学を用いてｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの存在又は不在下でＨＵＶＥＣの形態を評価した。Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧはＨＵＶＥＣの形態を変更することはなかった（図５Ｂ）。有害な刺激に対する初期炎症反応であるｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの内皮細胞活性に対する影響を評価するために、ＨＵＶＥＣｓをｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧで処理し、ＶＣＡＭ−１（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）及びＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）を含む内皮細胞活性マーカーの発現を測定してＨＵＶＥＣ活性をモニタした。ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦα）を内皮細胞活性に対する陽性対照群として用いた。ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧはＨＵＶＥＣ活性への影響がほとんどないのに対し、ｈＴＮＦαは予想の通りＨＵＶＥＣ活性を誘導した（図５Ｃ）。
内皮細胞におけるＶＥＧＦ依存的信号作用に対するｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの効果を確認するために、ＶＥＧＦ処理されたＨＵＶＥＣｓをｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの存在又は不在下で免疫ブロット分析し、ＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ａｋｔ及びＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化に対する変化をモニタした。Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧはＨＵＶＥＣｓにおいてＶＥＧＦＲ、Ａｋｔ及びＥＲＫのＶＥＧＦ依存的リン酸化に対する影響がほとんどなかった（図５Ｄ）。
ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧのｉｎ ｖｉｖｏ毒性を確認するために週２回正常マウスにｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧを静脈注射した後、対照群と実験群間の肝及び腎臓機能及び体重、肝及び腎臓組織の細胞死状態を比較した。肝機能はＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ−ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｐｙｒｕｖｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、及びＴＢＩＬ（ｔｏｔａｌ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ）の血清濃度を測定して確認し、腎臓機能はＢＵＮ（ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）及びＣＲＥ（ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）濃度を測定して確認した。細胞死はＴＵＮＥＬ染色を用いて測定した。
その結果、肝機能及び腎臓機能において有意の変化はなかった（図５Ｄ）。体重においても有意の変化はないことを確認した（図５Ｅ）。また、細胞死状態が観察された（図５Ｆ）。この結果は、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧが重症のｉｎ ｖｉｖｏ毒性を誘発しないことを提示する。
要するに、この結果は、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧが深刻な内皮細胞毒性を誘発し、正常内皮細胞ｉｎ ｖｉｖｏでＶＥＧＦ媒介信号作用に否定的影響を及ぼさないことを提示する。
実施例６：最適化されたリード抗体のＶＥＧＦ依存的血管新生に対する効果
Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧのＶＥＧＦ依存的血管新生に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を確認するために、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの存在又は不在下でＨＵＶＥＣｓをＶＥＧＦで処理した後、ＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイを行った。１５０μｌのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を４８ウェルプレートに入れて、３０分間３７℃でインキュベーションした。ＥＧＭ−２で培養されたＨＵＶＥＣ（１０５）を収穫し、マトリゲルのコートされたプレートに接種し、クローン１ ＩｇＧ、親抗体ＩｇＧ、脱糖化ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ ＩｇＧ又はベバシズマブの存在又は不在下で、３７℃で１８時間インキュベーションした。ＶＥＧＦ含むＥＢＭ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）で培養されたＨＵＶＥＣｓを、マトリゲルのコートされたプレートに接種し、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ（２０μｇ ｍｌ−１）の存在又は不在下で、３７℃で１８時間インキュベーションした。
Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧは顕著にほとんど完璧なレベルにＶＥＧＦ依存的チューブ形成を除去した（図６Ａ）。
ＶＥＧＦ依存的血管新生に対するｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの効果をさらに確認するために、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧとベバシズマブの存在又は不在下でｅｘ ｖｉｖｏラット大動脈環アッセイを行った。ラット大動脈において血管はＥＢＭ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）でほとんど成長しないが、ＶＥＧＦ発現条件で大部分の血管がラット大動脈において成長した。さらに、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧはＶＥＧＦと共に培養する時、ベバシズマブと類似程度の効果でラット大動脈において成長する血管の数を減少させることを観察した（図６Ｂ及び図６Ｃ）。
ＶＥＧＦ依存的血管新生にｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ ｉｎ ｖｉｖｏ効能を観察するために、マウスマトリゲルモデル（ｍｏｕｓｅ Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｍｏｄｅｌ）を確立し、ヘモグロビンレベルを微細血管形成の標識子として測定して、マウスマトリゲルプラグアッセイで微細血管形成に対するｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ及びベバシズマブの阻害効果を比較した。Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧはベバシズマブと同様にヘモグロビン含有量を顕著に減少させた（図６Ｄ及び図６Ｅ）。
要するに、この結果は、作製された抗体がＶＥＧＦ依存的異常血管新生をｉｎ ｖｉｖｏで抑制する効能があることを提示する。
実施例７：腫瘍血管新生に対する最適化されたリード抗体の効果
腫瘍血管新生においてｃｌｅｃ１４ａの連関性を確認するために、まず、ＳＮＵ１８２ヒト肝細胞又はＣＦＰＡＣ−１ヒト膵癌細胞癌腫を含む異種移植腫瘍モデル（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ）を確立し、ｃｌｅｃ１４ａ及び公知の内皮マーカー蛋白質であるＣＤ３１に対する商業的に入手可能な抗体を用いて免疫組織化学を行った。免疫組織化学は０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチンコートされたガラスカバースリップで成長したＨＵＶＥＣｓ（５Ｘ１０４）をｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの存在又は不在下で、２４時間３７℃でインキュベーションした。４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡで細胞を固定させ、１時間３７℃で５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳで遮断した後、ローダミンファロイジン（１ｕｎｉｔ／ｗｅｌｌ）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色薬で１時間インキュベーションした。
ＣＤ３１と類似に、ＳＮＵ１８２−及びＣＦＰＡＣ−１腫瘍異種移植の血管でｃｌｅｃ１４ａが発現し、これは、腫瘍血管でｃｌｅｃ１４ａが特異的に発現することを意味する（図７Ａ及び図７Ｂ）。
免疫組織化学を用いて臨床サンプルにおける腫瘍血管でｃｌｅｃ１４ａの特異的発現を評価するために、正常及び肝癌と膵癌患者の組織血管においてｃｌｅｃ１４ａの発現を比較した。その結果、癌患者組織の血管でｃｌｅｃ１４ａが明確に特異的に増加することを確認したが、正常血管ではそうでなかった（図７Ｃ及び図７Ｄ）。
腫瘍血管新生ｉｎ ｖｉｖｏに対するｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの影響を確認するために、胸腺除去ヌードマウスにおいて腫瘍細胞由来マトリゲルプラグ血管新生アッセイを行った。マトリゲルを含むＳＮＵ１８２−、ＣＦＰＡＣ−１細胞及びＵ８７ヒト膠腫細胞を１０ｍｇ／ｋｇ単回投与し、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ及びベバシズマブの存在又は不在下で胸腺除去ヌードマウスに移植した。２週後、マトリゲルプラグを除去し、各群における総ヘモグロビン含有量をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。Ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧはＳＮＵ１８２−、ＣＦＰＡＣ−１及びＵ８７ヒト膠腫細胞由来ヘモグロビンをベバシズマブと同等程度に著しく減少させた（図７Ｅ及び図７Ｆ）。
Ｕ８７ヒト神経膠腫に対しても、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧは体重に影響を与えず、ベバシズマブと同様にＵ８７細胞の腫瘍サイズを有意に減少させることを確認した（図７Ｉ）。ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧがｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＵＶＥＣの生存、形状又は活性化に大きく影響を及ぼさないことを確認した。これは、最適化された抗体がｉｎ ｖｉｖｏで有意の内皮毒性を起こさないことを意味する。
ＨＣＴ１１６ヒト大腸癌細胞及びベバシズマブが適用されたＨＣＴ１１６ヒト大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１１６／Ｂｅｖａ）を用いてｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ又はベバシズマブ５ｍｇ／ｋｇ単一容量の存在又は不在下でマトリゲルプラグ血管新生アッセイを行った。１４日後にマトリゲルプラグを除去し、ＣＤ３１及び微細血管マーカーに対する免疫組織化学を行った。微細血管密度は、共焦点顕微鏡によって得られたイメージのそれぞれからフィールド当たりＣＤ３１陽性を定量化して測定した。ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ又はベバシズマブは同様にＨＣＴ１１６細胞の微細血管形成能を有意の程度に減少させることを確認した。同様に、ＨＣＴ１１６／Ｂｅｖａ細胞による微細血管形成はｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧによって有意に抑制されたが、ベバシズマブによっては阻害されなかった（図７Ｇ、図７Ｈ）。これは、ベバシズマブ耐性大腸癌細胞において腫瘍の血管新生を抑制し得るｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧの優れた能力を示す。
要するに、この結果は、作製した抗体がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍血管新生を抑制する効能を有することを提示する。
実施例８：最適化リード抗体の選別及び効能分析
実施例８−１．最適化リード抗体の選別
追加最適化抗体を選別するために、抗体３６種をさらに選別し、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１に比べて親和度が改善された抗体を選別した。表５の３６種の抗体（ＩｇＧ抗体形態）が含まれたほ乳動物発現ベクターを、それぞれＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞に形質感染後、７日間４０ｍｌずつ培養した。遠心分離を用いて培養液を得た後、蛋白質Ａ親和度クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ）によって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて９０％の精製度を確認し、軽鎖及び重鎖の分子量を同時に確認した（図８Ａ）。
リットル培養に換算した時、生産性に優れたクローン（約５０ｍｇ／Ｌ以上）Ｏｐｔｉ１、Ｏｐｔｉ３及びＯｐｔｉ１６（クローン１、３及び１６）をまず選定した。
Figure 0006840222
Figure 0006840222
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実施例８−２．選別された抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ効能分析
血管新生の主要因子のＶＥＧＦ依存性血管新生（ＶＥＧＦ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に対する最適化リード抗体の血管新生抑制能を確認するために、実時間血管新生分析が可能なＩｎｃｕＣｙｔｅ ＦＬＲ ｌｉｖｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ）を用いて抗血管新生能を比較分析した。まず、ＧＦＰ−形質感染されたＨＵＶＥＣを９４ウェルプレートに撒いて３６種の抗体を２０ｕｇ／ｍｌの濃度で処理し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効能を比較した。この時、ｐａｒｅｎｔａｌ ＩｇＧ（親抗体：ＷＯ２０１３／１８７５５６のクローン１）、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１及びベバシズマブ（ａｖａｓｔｉｎ）を陽性対照群として使用して最適化抗体との効能を比較分析した。
その結果を図９Ａ及び図９Ｂにそれぞれ示した。チューブ長（ｔｕｂｅ ｌｅｎｇｔｈ：図９Ａ）及びブランチポイント（ｂｒａｎｃｈ ｐｏｉｎｔ：図９Ｂ）両方とも、処理した抗体が抗−血管新生能を有することが確認でき、特にクローン１、３及び１６の強い効能を確認した。
ＶＥＧＦと最適化抗体を処理し、チューブ長変化（血管新生進行）を確認した代表的な結果を示した図１０によれば、ＶＥＧＦだけを単独処理した群から見られるようにチューブ長が増加すること（血管新生進行）が確認でき、ｈＩｇＧ（ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、対照群抗体）は投与抗体の陰性対照群であって、無反応であることを確認した。また、ｓｕｒａｍｉｎ（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ阻害剤、ｓｍａｌｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ａｖａｓｔｉｎ（ＩｇＧ）は陽性対照群として用いた。特に、最適化抗体クローン１、３及び１６が陽性対照群であるｓｕｒａｍｉｎ、ａｖａｓｔｉｎと同じ効能を有することが確認できた。
ＥＧＭは様々な血管新生因子が含まれた一種の複合物であり、血管内皮細胞を用いた強い血管新生誘導に用いられてきた。したがって、最適化抗体のＶＥＧＦ依存性血管新生だけでなくＥＧＭのような様々な血管新生因子が存在する状況においても抗−血管新生能があるかを確認するために、ＥＧＭが存在する状況でＨＵＶＥＣ細胞を４８ウェルマイクロタイタープレートに撒き、親抗体（ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｃ１）、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１を一種の陽性対照群にし、優れた抗−血管新生能を示したクローン１、１３、１６をそれぞれ２０ｕｇ／ｍｌ濃度で処理した後、チューブ形成（ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）程度を比較分析した。
その結果を図１１Ａ及び図１１Ｂに示しており、選定抗体がＥＧＭ依存性血管新生を著しく抑制することを最終確認した。したがって、クローン１、１３、１６抗体を含む最適化抗体は、様々な血管新生因子によって起き得る血管新生を効率的に抑制させ得ることが確認できた。
血管新生の主要機転は、前述したチューブ長、ブランチ数（ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｅｓ）、チューブ形成の他にも、内皮細胞−細胞接触（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ｃｏｎｔａｃｔ）が主要機転として理解されている。したがって、ＣＬＥＣ１４ａ−媒介細胞−細胞接触（ｃｌｅｃ１４ａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ｃｏｎｔａｃｔ）を進行するために、ＨＥＫ２９３細胞にｃｌｅｃ１４ａの含まれたほ乳動物発現ベクターを形質感染させた後、ＨＥＫ２９３細胞の細胞−細胞接触（ａｇｇｒｅｇａｔｅ、ｃｌｅｃ１４ａ媒介性細胞接合の標識子として活用）が増加することが確認できる。Ａｇｇｒｅｇａｔｅは、顕微鏡下で、マニュアルで直接計数（ｃｏｕｎｔｉｎｇ）して処理抗体に対する効能を比較分析した。この条件で処理抗体の抗−血管新生能を確認するために２０ｕｇ／ｍｌの抗体をそれぞれ処理した。この時、親抗体（ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｃ１）及びｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１をそれぞれ陽性対照群として用いた。その結果を図１２Ａ及び図１２Ｂに示しており、最終的に全ての抗体がＣＬＥＣ１４ａ−媒介細胞−細胞接触を格段に抑制することが確認できた。
血管新生の他の機能の一つである内皮移動（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に対する最適化リード抗体の効能をｉｎ ｖｉｔｒｏで分析するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＦＬＲ ｌｉｖｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ）を用いてＨＵＶＥＣ移動アッセイ（ＨＵＶＥＣ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。この時、傷（ｗｏｕｎｄ）はＩｎｃｕｃｙｔｅ社から提供する傷マーカー（ｗｏｕｎｄ ｍａｋｅｒ）を用いて均一な傷を生成し、２０ｕｇ／ｍｌ抗体をそれぞれ処理して移動抑制能を比較評価した。その結果を図１３Ａ及び図１３Ｂに示しており、クローン１、１３、１６を含む最適化抗体が親抗体（ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｃ１）、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧ、及びａｖａｓｔｉｎと同じ内皮移動（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）阻害能を有することを最終確認した。
実施例８−３．選別された抗体の抗原結合部位の確認
選別された抗体の抗原結合部位を確認するために競合ＥＬＩＳＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的に、まずＣＴＬＤ抗原を９６ウェルマイクロタイタープレートにコートし、ＨＲＰ−接合されたｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧと結合を誘導した（図１４Ａ）。同時にそれぞれの３６種の抗体を処理し、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１と競合的に抗原に結合するかどうかを確認することによってｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧと３６種抗体の抗原結合部位を確認した。その結果を図１４Ｂに示しており、全３６種の抗体はｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１ ＩｇＧと類似の抗原結合部位を有することが確認できた。
実施例８−４．最適化抗体の種間交差反応性の確認
最適化抗体の種間交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｙ）を確認するために、ＨＵＶＥＣ（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）とＭＡＥＣ（ｍｏｕｓｅ ａｏｒｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）をそれぞれ培養し、両細胞に２０ｕｇ／ｍｌ親抗体（ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｃ１）、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１、クローン１、１３、１６をそれぞれ処理して、両細胞表面に結合能があるかを、流細胞分析機（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて確認した。その結果を図１５に示した。結論的に、最適化抗体の３種クローン１、１３、１６はヒト及びネズミＣＬＥＣ１４ａに結合し得る種間交差反応性があることを確認した。
実施例８−５．最適化抗体の作用機転の分析
最適化抗体の作用機転分析のためにまず、最適化抗体の血管内皮細胞の細胞−細胞接合阻害能を確認した。本出願の発明者等は血管内皮細胞の細胞−細胞接合にＣＬＥＣ１４ａにおいて特にＣＴＬＤドメインが重要な役割を担うことと、ＣＬＥＣ１４−ＣＴＬＤ結合抗体（ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｃ１）がそれらの相互作用阻害剤としての役割を担うことを明らかにしたことがある（図１６Ａ）。
これを証明するために、ＣＯＳ−７細胞に野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）ＣＬＥＣ１４ａとＣＴＬＤドメインが欠損されたＣＬＥＣ１４ａ ＤＣＴＬＤをそれぞれ形質感染させた後、それらの細胞破砕物を９６ウェルマイクロタイタープレートにコートした。また、精製されたＨＲＰ−接合されたＣＴＬＤ−Ｆｃをインキュベーションし、ＣＴＬＤ結合を確認した。その結果を図１６Ｂに示した。結論的に、ＣＴＬＤドメインがＣＬＥＣ１４ａ−ＣＬＥＣ１４ａ結合に重要であることを確認した。図１６Ｃは、競合ＥＬＩＳＡを用いて、抗原：抗体のモル比を０：１、１：１、１：２と増加させながら、ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＣＴＬＤ−ＦｃがＣＬＥＣ１４ａに結合する程度を比較分析した結果であり、このとき、抗体は、親抗体（ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｃ１）、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１をそれぞれ陽性対照群として使用し、３種の最適化抗体代表クローン１、１３、１６を対照群として処理した。その結果、全ての処理抗体が濃度依存的にＣＴＬＤドメイン媒介性ＣＬＥＣ１４ａ分子結合（ＣＴＬＤ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＣＬＥＣ１４ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を各段に阻害することを確認した。
また、最適化抗体の作用機転分析のために血管内皮細胞表面のＣＬＥＣ１４ａ減少能（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を確認した。図１７Ａは既存ＣＬＥＣ１４ａ−ＣＴＬＤ結合抗体（親抗体：ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｃ１）による血管内皮細胞表面のＣＬＥＣ１４ａ減少能を図式化したものである。最適化抗体のＣＬＥＣ１４ａ減少能を確認するために、ＨＵＶＥＣを９６ウェルマイクロタイタープレートにコートし、２０ｕｇ／ｍｌ親抗体（ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｃ１）、ｄｅｇｌｙｃｏ Ｃ１、及び３種のクローン１、１３、１６最適化抗体を処理した後、時間別にＨＵＶＥＣ表面に存在するＣＬＥＣ１４ａの量的レベルを細胞ＥＬＩＳＡ（ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ）方法を用いて最終確認した。ＣＬＥＣ１４ａの量的レベルは商業的に入手可能な（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ）ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）の抗−ＣＬＥＣ１４ａ抗体（ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ−ＣＬＥＣ１４ａ Ａｂ）を使用し、２次抗体としてＨＲＰ−接合された抗−ヒツジ抗体を使用した後、ＴＭＢを用いて発色をし、吸光度４５０ｎｍで、ＥＬＩＳＡリーダーで確認した。その結果を図１７Ｂに示しており、処理抗体が血管内皮細胞表面のＣＬＥＣ１４ａ減少能を示すことを確認した。
本発明に係るｃｌｅｃ１４ａに特異的に結合する脱糖化抗体は、優れた生産量を示し、ヒトとネズミに対する交差反応性を維持し、目的する抗原反応性を示しながらも、凝集が少ないため抗体の溶解度及び安定性に優れるだけでなく、改善されたチューブ形成阻害能を有するので、改善された抗体特性及び効能を示す改良抗体を提供することができる。
具体的な構成を参照して本発明を詳細に記載してきたが、このような記載は好ましい具現例に関するもので、発明の範囲を制限するものではないということは当業者に自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は出願する請求項及びその等価物によって定義されるであろう。
本発明は一態様において、以下を提供する。
（項目１）
ｃｌｅｃ１４ａに特異的に結合する抗体であって、
ＴＧＳＳＳＮＩＧＸＸＸＶＴ（配列番号１）のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を含み、
配列番号１の９番目、１０番目及び１１番目位置のアミノ酸Ｘのそれぞれは、Ｒ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｗ、Ｓ、Ｎ、Ｖで構成された群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする抗体。
（項目２）
前記配列番号１の９番目、１０番目及び１１番目位置のアミノ酸は、ＲＣＧ、ＡＴＡ、ＷＳＮ又はＡＶＶであることを特徴とする、項目１に記載の抗体。
（項目３）
脱糖化されたことを特徴とする、項目１に記載の抗体。
（項目４）
配列番号２１〜２４で構成された群から選ばれる一つ以上のフレームワーク部位を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、項目１に記載の抗体。
（項目５）
配列番号７〜１０で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、項目１に記載の抗体。
（項目６）
配列番号１３、２５〜６０で構成された群から選ばれるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことを特徴とする、項目１に記載の抗体。
（項目７）
配列番号６、６１〜９６で構成された群から選ばれる重鎖可変領域を含むことを特徴とする、項目１に記載の抗体。
（項目８）
配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３７の重鎖ＣＤＲ３、又は
配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４０の重鎖ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、項目１に記載の抗体。
（項目９）
配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号６の重鎖可変領域、
配列番号８の軽鎖可変領域及び配列番号６の重鎖可変領域、
配列番号９の軽鎖可変領域及び配列番号６の重鎖可変領域、
配列番号１０の軽鎖可変領域及び配列番号６の重鎖可変領域、
配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号６１の重鎖可変領域、
配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号７３の重鎖可変領域、又は
配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号７６の重鎖可変領域を含むことを特徴とする、項目１に記載の抗体。
（項目１０）
項目１〜９のいずれかに記載の抗体を含む、血管新生関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
（項目１１）
前記血管新生関連疾患は、癌、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、糖尿病網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、角膜移植拒否（ｃｏｒｎｅａｌ ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、血管新生緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｇｌａｕｃｏｍａ）、全身紅皮症（ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｓ）、増殖性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、血友病性股関節炎（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、動脈硬化性プラーク（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）の毛細血管形成、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、傷顆粒化（ｗｏｕｎｄ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、血管癒着（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、リューマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、退行性関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄ
ｉｓｅａｓｅ）、レステノシス（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、粥状動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、腸狭窄（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）、猫ひっかき病（ｃａｔ ｓｃｒａｔｃｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、肝硬変症（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、腎臓炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、糖尿病性腎臓疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、真性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、炎症疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）及び神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）で構成された群から選ばれることを特徴とする、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記癌は、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、直膓癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、結合組織癌（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）及び
多発性骨髄血液癌（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）で構成された群から選ばれることを特徴とする、項目１１に記載の組成物。

Claims (9)

  1. ｃｌｅｃ１４ａに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
    配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３；
    配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３；
    配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３７の重鎖ＣＤＲ３；または
    配列番号２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４０の重鎖ＣＤＲ３を含むことを特徴とする抗体。
  2. 脱糖化されたことを特徴とする、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 前記抗体が配列番号２１〜２４で構成された群から選ばれる一つ以上のフレームワーク部位を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. 前記抗体が配列番号７の軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. 前記抗体が配列番号６、６１、７３および７６で構成された群から選ばれる重鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. 前記抗体が
    配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号６の重鎖可変領域、
    配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号６１の重鎖可変領域、
    配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号７３の重鎖可変領域、又は
    配列番号７の軽鎖可変領域及び配列番号７６の重鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  7. 請求項１〜６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、血管新生関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
  8. 前記血管新生関連疾患は、癌、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、糖尿病網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、角膜移植拒否（ｃｏｒｎｅａｌ ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、血管新生緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｇｌａｕｃｏｍａ）、全身紅皮症（ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｓ）、増殖性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、血友病性股関節炎（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、動脈硬化性プラーク（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）の毛細血管形成、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、傷顆粒化（ｗｏｕｎｄ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、血管癒着（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、リューマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、退行性関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄ
    ｉｓｅａｓｅ）、レステノシス（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、粥状動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、腸狭窄（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）、猫ひっかき病（ｃａｔ ｓｃｒａｔｃｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、肝硬変症（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、腎臓炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、糖尿病性腎臓疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、真性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、炎症疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）及び神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）で構成された群から選ばれることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記癌は、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、直膓癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、結合組織癌（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）及び
    多発性骨髄血液癌（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）で構成された群から選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
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