JP2022540859A - 新規ｂｓｓｌ抗体 - Google Patents

新規ｂｓｓｌ抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP2022540859A
JP2022540859A JP2022501270A JP2022501270A JP2022540859A JP 2022540859 A JP2022540859 A JP 2022540859A JP 2022501270 A JP2022501270 A JP 2022501270A JP 2022501270 A JP2022501270 A JP 2022501270A JP 2022540859 A JP2022540859 A JP 2022540859A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
antigen
binding fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022501270A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021010888A5 (ja
Inventor
ハーネル，オッレ
リンドキスト，スザンネ
ランドバーグ，レッナールト
ロッツホルム，ヘレナ ペルソン
Original Assignee
リプム エービー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by リプム エービー filed Critical リプム エービー
Publication of JP2022540859A publication Critical patent/JP2022540859A/ja
Publication of JPWO2021010888A5 publication Critical patent/JPWO2021010888A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、ヒト胆汁塩刺激リパーゼ（ｈＢＳＳＬ）に結合する新規単離抗体及びその抗原結合断片に関する。該抗体及びその抗原結合断片は、ｈＢＳＳＬのＮ末端部分に位置し、アミノ酸残基７～１２とアミノ酸残基４２～５５を含むとして同定された、以前に特徴付けられていないエピトープに結合する。本発明はまた、特に炎症状態の治療における抗体及び／又はその抗原結合断片の医学的使用、並びに関連する医薬組成物に関する。【選択図】図１０

Description

本発明は、胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）タンパク質のＮ末端部分に位置し、以前に特徴付けられていないＢＳＳＬのエピトープに結合する新規単離抗体及びその抗原結合断片に関する。本明細書はまた、特に炎症状態の治療における抗体及びその抗原結合断片の医学的使用、並びに関連する医薬組成物に関する。本明細書は、ＢＳＳＬの検出における及び／又はＢＳＳＬ関連疾患の診断のための分子ツールとしての抗体又はその抗原結合断片の使用も開示する。
背景
自己免疫疾患及び自己炎症性疾患を含む炎症状態は、ヒトの健康に対して重大な脅威であり続ける。炎症状態の治療は進歩しているにもかかわらず、改善された治療法がまだ求められている。
炎症状態には、自己免疫疾患及び自己炎症性疾患を含む炎症を特徴とする膨大な数の障害及び疾患が含まれる。炎症は、例えば、感染症、傷害、アレルゲン及び／又は毒素に対する応答として、又は身体自体に対する、例えば自己免疫過程として起こり得る。自己免疫疾患は、身体の免疫系が誤って健康な身体組織を攻撃及び破壊するときに起こる。約８０以上の既知の自己免疫疾患があると報告されている。
いくつかの炎症状態は慢性である。慢性炎症は炎症反応が残ると起こり、身体を一定の警戒状態に置く。慢性炎症を含む炎症性疾患及び状態の例としては、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）並びに潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が挙げられる。
ＲＡは、慢性、炎症性、全身性の自己免疫疾患である。ＲＡの現在の治療法には、疼痛治療のための非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）及び特定の炎症性サイトカイン又は様々な細胞の種類の細胞表面受容体を標的とする生物学的薬剤が含まれる。
若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）としても知られるＪＩＡは、子供及び青年期の関節炎の最も一般的な形態である。ＪＩＡは１６歳前に発症しており、ＪＩＡの原因はほとんど分かっていない。ＪＩＡの治療の主な重点は、子どもが身体活動や社会活動の正常なレベルを取り戻すのを助けることである。ほとんどの子供は、ＮＳＡＩＤ及び関節内コルチコステロイド注射で治療される。ＤＭＡＲＤであるメトトレキサートは、多発性関節炎を有するＪＩＡ患者の大半において関節の炎症を抑制するのに役立つ強力な薬物であるが、全身性関節炎では有用ではないと報告されており、多くの子供はエタネルセプトなどのＴＮＦα阻害薬が投与される。
ＩＢＤは、消化管における慢性炎症を伴う障害を説明するために使用される用語である。ＩＢＤはＵＣ及びＣＤを含む。
ＩＢＤ治療の目的は、徴候及び症状を誘発する炎症を軽減することである。最良の場合には、これは症状緩和だけでなく、長期的な寛解及び合併症のリスクの低下につながり得る。ＩＢＤ治療には、通常、抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、免疫系抑制剤及び／又は生物学的薬剤などの薬物療法、並びに手術のいずれかを伴う。
胆汁塩依存性リパーゼ（ＢＳＤＬ）、カルボキシルエステルリパーゼ（ＣＥＬ）又は胆汁塩活性化リパーゼ（ＢＡＬ）としても知られる胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）は、ＣＥＬ遺伝子によってコードされ、これまでに調査された全ての種において膵外分泌部で発現し、腸管腔に分泌される脂肪分解酵素であり、脂質消化を助ける。
ヒト、霊長類、イヌ、ネコ及びマウスを含む一部の種では、ＢＳＳＬは、授乳乳腺でも発現し、ミルク中に分泌される。さらに、ＢＳＳＬは、健康な個人の血清において低いが有意なレベルで見出され、リポタンパク質代謝及びアテローム性動脈硬化症の調節に関与することが判明している。ＢＳＳＬは、炎症過程に役割を担うことも判明している。
ＢＳＳＬは、ヒトミルクなどの適切な組織から単離され得る。あるいは、組換えＢＳＳＬは、ＢＳＳＬをコードするＤＮＡを単離することにより、標準的な方法を用いて生成することができる。
ＢＳＳＬをコードするＤＮＡは、ライブラリースクリーニング及び／又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の分子生物学技術を用いて、市販のＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡライブラリーから簡便に単離され得る。
異なる組織及びトランスフェクト細胞株からのＢＳＳＬの精製方法は、当技術分野で知られている[１]。
文献[２]は、ＢＳＳＬ又は胎児腺房（Ｆｅｔｏ－Ａｃｉｎａｒ）膵臓タンパク質（ＦＡＰＰ）と結合する抗原結合化合物について説明している。該化合物は、ＢＳＳＬのＣ末端ペプチド（Ｊ２８エピトープ）を認識することが開示されている。ＦＡＰＰは、Ｊ２８炭水化物依存エピトープによって特徴付けられるＢＳＳＬの癌胎児性形態である。抗原結合化合物は、ＢＳＳＬ又はＦＡＰＰポリペプチドを発現する腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、かつ／又は増殖を遅らせると言われている。文献[２]は、腫瘍細胞、特にＢＳＳＬ又はＦＡＰＰ発現膵臓腫瘍細胞を直接標的とし、アポトーシスを介して死を引き起こし、かつ／又はその増殖を停止することができる化合物について説明している。
文献[３、４]は、ＢＳＳＬが炎症過程で役割を担い、動物モデルにおいてＢＳＳＬを阻害又は排除すると、慢性関節炎の発症から保護されるという発見を説明している。文献[３、４]は、ＢＳＳＬタンパク質が炎症細胞及び炎症組織に存在し、ＢＳＳＬ欠損マウスが、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）によって例示される炎症性疾患の発症から保護されることを開示している。
自己炎症性疾患及び自己免疫疾患などの炎症状態に対する治療法は、新薬及び抗体などの薬物クラスの導入によって長年にわたり大幅に改善されているが、ほとんどの投与計画及び薬物は、例えば、全てのＴＮＦα阻害薬及びコルチコステロイドの場合のように、免疫系を抑制することを目指すという共通点を有する。これは、ひいては、二次感染及び合併症のリスクを増加させる。
その結果、炎症のシグナル伝達及び過程に関与する、異なるかつ／又は新しい標的を対象とし、免疫系を抑制することによって主に作用せず、そのため、悪影響がより少なく、かつ／又はあまり重篤でないことが予想される炎症性疾患の治療、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）及び予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）のための新しい選択的、好ましくは生物学的薬物に対する臨床的に重要な必要性が依然としてある。
ヒトＢＳＳＬ（ｈＢＳＳＬ）などの胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供することが全体的な目的である。
この及び他の目的は、本明細書に開示される実施形態によって満たされる。
本発明は、独立請求項で定義される。本発明のさらなる実施形態は、独立請求項で定義される。
本発明の一態様は、ＨＣＤＲと示される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びＬＣＤＲと示される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つのＣＤＲを含む単離抗体又はその抗原結合断片に関する。この態様において、第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列、又は配列番号７と少なくとも８７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号８によるアミノ酸配列、又は配列番号８と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、かつ第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列、又は配列番号９と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。さらに、第１のＬＣＤＲは、配列番号１０によるアミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、アミノ酸配列ＡＴＳ、又はアミノ酸配列ＡＴＳ、好ましくはＡＡＳと少なくとも６６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、かつ第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列、又は配列番号１１と少なくとも８７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
本発明の別の態様は、ＺＨ１－［ＧＹＴＦＴＳＹＮ］－ＺＨ２－［Ｘ５３ＧＶＩＸ５７ＰＧＤＧＸ６４ＴＳＹＸ６８ＱＫＦＸ７２］－ＺＨ３－［ＡＲＤＹＹＧＳＳＰＬＧＹ］－ＺＨ４から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及びＺＬ１－［Ｘ２４ＡＳＸ２７ＳＩＳＹＸ３９Ｎ］－ＺＬ２－［ＡＸ５７ＳＸ６６ＬＸ６８］－ＺＬ３－［ＨＱＲＳＳＸ１１５ＰＴ］－ＺＬ４から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む単離抗体又はその抗原結合断片に関する。この態様において、ＺＨ１、ＺＨ２、ＺＨ３及びＺＨ４の各々は、独立してゼロ、１個又はいくつかの、独立して選択されるアミノ酸残基を表し、Ｘ５３はＩ及びＭから選択され、Ｘ５７はＮ及びＹから選択され、Ｘ６４はＡ及びＳから選択され、Ｘ６８はＡ及びＮから選択され、Ｘ７２はＫ及びＱから選択される。さらに、ＺＬ１、ＺＬ２、ＺＬ３及びＺＬ４の各々は、独立してゼロ、１個又はいくつかの、独立して選択されるアミノ酸残基を表し、Ｘ２４はＳ及びＲから選択され、Ｘ２７はＳ及びＰから選択され、Ｘ３９はＭ及びＬから選択され、Ｘ５７はＡ及びＴから選択され、Ｘ６６はＫ及びＳから選択され、Ｘ６８はＡ及びＰから選択され、Ｘ１１５はＳ、Ｔ及びＹから選択される。
本発明のさらなる態様は、ＢＳＳＬ、好ましくは、ｈＢＳＳＬのエピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片に関する。該エピトープは、配列番号１によるアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の表面、並びに配列番号２によるアミノ酸配列、又は配列番号２と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％若しくは少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の表面を含む。
本発明のさらに別の態様は、上記の単離抗体及び／又はその抗原結合断片並びに医薬として許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
本発明のさらなる態様は、医薬として用いるための、かつ炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用するための上記の単離抗体若しくはその抗原結合断片、又は上記の医薬組成物に関する。
本発明の関連態様は、炎症性疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、上記の単離抗体若しくはその抗原結合断片、又は上記の医薬組成物の使用を定義する。
本発明の別の関連態様は、炎症性疾患の治療及び／又は寛解及び／又は予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）及び／又は予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）のための方法を定義する。本方法は、上記の治療有効量の単離抗体若しくはその抗原結合断片、又は上記の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
本発明のさらなる態様は、上記の抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに上記の抗体又はその抗原結合断片、上記のポリヌクレオチド及び／又は上記の発現ベクターを含む細胞に関する。
本発明の別の態様は、ＢＳＳＬの有無を検出する方法及び／又は試料中のＢＳＳＬの量を定量する方法に関する。本方法は、上記の単離抗体又はその抗原結合断片と試料を接触させ、かつ試料中のＢＳＳＬの有無を検出し、かつ／又はＢＳＳＬに結合した単離抗体若しくはその抗原結合断片の量に基づいて試料中のＢＳＳＬの量を定量することを含む。
本発明のさらなる態様は、ＢＳＳＬ関連障害の診断方法に関する。本方法は、上記の単離抗体又はその抗原結合断片と対象からの試料を接触させ、かつＢＳＳＬの有無を検出し、かつ／又はＢＳＳＬに結合した単離抗体若しくはその抗原結合断片の量に基づいて試料中のＢＳＳＬの量を定量することを含む。本方法はまた、検出及び／又は定量からの結果に基づいて、対象がＢＳＳＬ関連障害に罹患しているかどうかを結論づけることを含む。
本発明のさらに別の態様は、配列番号１によるアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の表面、及び配列番号２によるアミノ酸配列、又は配列番号２と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の表面を含むＢＳＳＬエピトープに関する。
本発明の抗体及びその抗原結合断片は、酵素の活性部位とは異なるｈＢＳＳＬ内の以前に特徴付けられていないエピトープに結合する。該抗体及びその抗原結合断片は、したがって、ｈＢＳＳＬの酵素活性と競合することなくｈＢＳＳＬに結合することができる。本発明の抗体及びその抗原結合断片は、炎症状態の治療及び／又は予防に有用であり、上記の及び現在の治療法の他の欠点を軽減する。
さらなる目的及びその利点と共に、実施形態は、添付図面と共に以下の説明を参照することによって最もよく理解され得る。
図１は、ｈＢＳＳＬと固定したＡＳ２０ ｍＩｇＧ１との相互作用を示す。センサーグラムは１:１結合モデルに適合した。適合性が良いため、センサーグラムと適合線を区別できない。 図２は、ｍＢＳＳＬと固定したＡＳ２０ ｍＩｇＧ１との相互作用の定常状態分析を示す。ＫＤは、－１７３ ＲＵ（上から）のオフセットで高バルク効果について自動的に補正された最大応答の半分からのものである。バルク効果は図では削除されない。 図３ａは、非ビオチン化及びビオチン化ヒトＢＳＳＬへのＡＳ２０ ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡ結合を示すグラフを示す。表示される吸光度値（ｙ軸）は２つの平均値である。図３ｂは、マウス及びヒトＢＳＳＬ、並びに非関連タンパク質へのＡＳ２０ ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡ結合を示すグラフを示す。表示される吸光度値（ｙ軸）は２つの平均値である。 図４は、ヒトＢＳＳＬ及び３０種の異なる非関連タンパク質に結合するＡＳ２０ ｓｃＦｖ（左バー）の能力を分析するマルチプレックスビーズアッセイ（ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標））の結果の棒グラフを示す。陽性対照ｓｃＦｖで、ｂ非関連タンパク質＿１に結合すると予想される非関連ｓｃＦｖ＿１（右のバー）も、アッセイに含めた。 図５は、マウス及びヒトＢＳＳＬへのＡＳ２０ ｓｃＦｖの結合を分析するＨＴＲＦベースの競合アッセイの結果を示す。 図６は、ＡＳ２０、ＡＳ２０ ＣＤＲグラフトとＡＳ２０ヒト化ライブラリー足場の配列比較である。＊は、この領域で変異したクローンのみがファージ上に提示されることを保証するためにＬＣＤＲ３に導入された読み枠内の停止を示す。Ｘは、ＡＳ２０ヒト化ライブラリー内で変異した位置を示す。ＣＤＲの境界は、カバットによって定義されるとおりであり、残基の番号付けは、ＩＭＧＴ命名法によって定義されるとおりである[５]。ｅＨＣＤＲ２、ｅＬＣＤＲ１及びｅＬＣＤＲ２は、ＩＭＧＴに従ってそれぞれのＣＤＲ領域の外側のアミノ酸位置を含む拡張したＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２領域を示す。 図７は、実施例１２に記載のＡ）＋４０℃及びＢ）＋４℃でのサイズ排除クロマトグラフィーデータ傾向を示すグラフである。 図８は、各候補についてプロットした平均Ｔｍ１（円）及びＴｍ２（正方形）の値を示すグラフである。バーは、標準偏差；ａ）＋４℃ ｂ）＋４０℃を示す。 図９は、候補の強度対サイズを示すＤＬＳ分析の結果を示す。試料を、それぞれ－８０℃（ハッチング矢印）、＋４℃（点線矢印）及び＋４０℃（完全な矢印）での３０日間の保存後に分析した。 図１０は、予め指定した抗体候補の示したエピトープ領域を有するＢＳＳＬの構造の図である（Ｓ－ＳＬ０４８－１１、Ｓ－ＳＬ０４８－４６、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６、Ｓ－ＳＬ０４８－１１８についてはａａ７－１２；Ｓ－ＳＬ０４８－１１、Ｓ－ＳＬ０４８－４６、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６、Ｓ－ＳＬ０４８－１１８についてはａａ４２－５５；Ｓ－ＳＬ０４８－４６についてはａａ８４－１０１；Ｓ－ＳＬ０４８－１１６についてはａａ１７４－１８０；Ｓ－ＳＬ０４８－１１についてはａａ２８３－２９５）。 図１１は、可能性のある翻訳後の障害が強調されているＳ－ＳＬ０４８－１０６ ｓｖＦｖの図である。 図１２は、「オーブングローブ」ビューを示すｔ－ｈＢＳＳＬ及びグローブの後ろの周りの破線円内の薄い灰色で色を付けたエピトープの模式図である。鎖は矢印で示され、ヘリックスはらせんで示される。 図１３は、左パネルに、明るい灰色のＡＳ２０－Ｆａｂと相互作用する配列を有する暗い灰色の表面表示のｔ－ｈＢＳＳＬを示す。重鎖と軽鎖の可変領域はリボン表示（灰色で色付けした軽鎖と黒で色付けした重鎖）で示されている。右のパネルは同じビューを示すが、ｔ－ｈＢＳＳＬは「棒」で表され、活性部位の３連構造は黒で強調されている。左のパネルには、活性部位が表面の下に隠れている。 図１４は、３８個の候補ｓｃＦｖ間のアミノ酸配列の違いを示す表である。 図１５Ａ及び図１５Ｂは、実施例５に記載の重鎖可変領域のためのコンビナトリアルｓｃＦｖライブラリーの設計の概要である。 図１６Ａ及び図１６Ｂは、実施例５に記載の軽鎖可変領域のためのコンビナトリアルｓｃＦｖライブラリーの設計の概要である。 図１７は、実施例２０によるＢＳＳＬ活性アッセイを示すグラフである。Ａ）及びＢ）はトリグリセリド加水分解アッセイの結果を示し、Ｃ）及びＤ）はコレステロールエステル加水分解アッセイの結果を示す。キメラＡＳ２０は、図中でＡＳ２０として示されている。 図１８は関節炎の重症度を示す。ＣＩＡ－ＭＡＢ－５０注入後に、（Ａ）－１日から１５日目まで４日ごとのアイソタイプ対照抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（９０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（９０、３０及び１０ｍｇ／ｋｇ）、（Ｂ）アイソタイプ対照とＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ ９０ｍｇ／ｋｇ、（Ｃ）アイソタイプ対照とＡＳ２０ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ ３０ｍｇ／ｋｇ、（Ｄ）アイソタイプ対照とＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ １０ｍｇ／ｋｇ。ＣＡＩＡの発症。ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ １０ｍｇ／ｋｇのグループ内の１匹と、アイソタイプ対照グループ内の１匹の２匹の動物を、倫理的理由（ハイスコア）のために終了前（１２日目）に取り除いた。これらの動物は、除去の日までの結果に含まれている。データを平均値±ＳＥＭとして提示する。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１。 図１９は疾患パラメータグラフを示す。－１日から１５日目まで４日ごとにアイソタイプ対照抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（９０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（９０、３０及び１０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．Ｐ．投与した動物を含むＣＡＩＡ疾患パラメータ。（Ａ）平均ＣＡＩＡスコア（スコアリング日数で割った実験中のスコアの合計）。（Ｂ）ＣＡＩＡの最大スコア。（Ｃ）全疾患負荷（ＡＵＣ）。（Ｄ）阻害率。ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ １０ｍｇ／ｋｇのグループ内の１匹と、アイソタイプ対照グループ内の１匹の２匹の動物を、倫理的理由（ハイスコア）のために終了前（１２日目）に取り除いた。これらの動物は、最大スコアにのみ含まれている。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１。 図２０は、総数における細胞サブセットのグラフを示す。データを平均値±ＳＤとして提示する。 図２１は、パーセンテージでの細胞サブセットのグラフを示す。データを平均値±ＳＤとして提示する。 図２２は、描写されたＦａｂ－ＢＳＳＬ複合体の構造を示す。軽鎖及び重鎖を有するＳ－ＳＬ０４８－１１６ＦａｂとＢＳＳＬの二量体複合体。同じ複合体は右に１８０°回転する。 図２３は、ＢＳＳＬとＳ－ＳＬ０４８－１１６ Ｆａｂとの相互作用。軽鎖及び重鎖を有するＦａｂのＢＳＳＬと相互作用する可変Ｉｇドメイン。エピトープＡｒｇ １７６とＧｌｎ ５２のための２つの重要なアミノ酸が丸と棒で描かれている。 図２４は関節炎の重症度を示す。ＣＩＡ－ＭＡＢ－５０注入後に、（Ａ）－１日から１５日目まで４日ごとのビヒクルとＳ－ＳＬ０４８－１１６（ＳＯＬ－１１６）（９０、３０及び１０ｍｇ／ｋｇ）、（Ｂ）ビヒクルとＳ－ＳＬ０４８－１１６、９０ｍｇ／ｋｇ、（Ｃ）ビヒクルとＳ－ＳＬ０４８－１１６、３０ｍｇ／ｋｇ、（Ｄ）ビヒクルとＳ－ＳＬ０４８－１１６、１０ｍｇ／ｋｇで治療したマウスにおけるＣＡＩＡの発症。倫理的な理由から、ビヒクルグループ（７日目及び１５日目）の２匹と９０ｍｇ／ｋｇグループ（１２日目）の１匹の３匹の動物を終了前に取り除いた。これらの動物は、除去の日までの結果に含まれ、７日目に取り除いた動物はデータから完全に除外されている。データを平均値±ＳＥＭとして提示する。 図２５は、ビヒクルと異なる用量（９０、３０及び１０ｍｇ／ｋｇ）のＳ－ＳＬ０４８－１１６（ＳＯＬ－１１６）をｉ．ｐ．投与した動物を含むＣＡＩＡ疾患パラメータを示す。（Ａ）平均ＣＡＩＡスコア（スコアリング日数で割った実験中のスコアの合計）。（Ｂ）ＣＡＩＡの最大スコア。（Ｃ）全疾患負荷（ＡＵＣ）。（Ｄ）阻害率。倫理的な理由から、ビヒクルグループ（７日目及び１５日目）の２匹と９０ｍｇ／ｋｇグループ（１２日目）の１匹の３匹の動物を終了前に取り除いた。これらの動物は、最大スコアにのみ含まれている。データを平均値±ＳＥＭとして提示する。 図２６は、（Ａ）脾臓及び（Ｂ）腸間膜リンパ節における白血球の総数を示す。データを平均値±ＳＥＭとして提示する。＊＊ｐ＜０.０１。 図２７は、（Ａ）脾臓、（Ｂ）血液及び（Ｃ）腸間膜リンパ節におけるＣＤ４５＋細胞の中のＮＫ細胞の割合を示す。データを平均値±ＳＥＭとして提示する。＊＊＊＊ｐ＜０.００１
詳細な説明
定義
「単離抗体」などの表現で抗体に関連して使用される用語「単離」は、抗体が元の環境から除去されたことを意味する。本明細書で使用する単離抗体は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指し、例えば、ＢＳＳＬ、特にヒトＢＳＳＬ（ｈＢＳＳＬ）に特異的に結合する単離抗体を指すことを意図し、ＢＳＳＬ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。しかし、ｈＢＳＳＬに特異的に結合する単離抗体は、マウス（ｍｏｕｓｅ）又はマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＢＳＳＬ（ｍＢＳＳＬ）などの他の種からのＢＳＳＬ分子などの他の抗原に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。例えば、単離抗体又はその抗原結合断片は、例えば電気泳動、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動、又はクロマトグラフィー、例えば、イオン交換クロマトグラフィー又は逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定した時に、９５％又は９９％超の純度まで精製され得る。当業者なら、用語「抗体又はその抗原結合断片」などが使用される度に、用語「単離された」が明示的に言及されなくても、単離抗体又はその抗原結合断片が本明細書で言及されることを理解するであろう。
本明細書で使用される用語「単離されたヒト化抗体」などは、ヒト化された単離抗体を指す。
用語「抗原結合断片」は、本明細書の文脈において、実質的に抗原結合性を保持する抗体の断片又は一部を意味することを意図する。抗原結合断片は、対応する全長抗体の抗原結合の全部又はかなりの部分を保持する抗体分子若しくはその誘導体の一部又は領域である。抗原結合性断片は、抗体の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列又はこれらのＣＤＲ配列の一部、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の一部若しくは全部、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の一部若しくは全部、又はそれらの組み合わせを含んでよい。一実施形態において、抗体の抗原結合断片は、抗体の連続したアミノ酸配列で構成されてもよく、リンカー（複数可）との結合の有無にかかわらず、抗体のアミノ酸配列の異なる部分から取得されるか又は構成されてもよい。抗原結合断片の例としては、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）３断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）及びナノボディが挙げられる。
「可変の単鎖断片」又は「一本鎖可変断片」（「ｓｃＦｖ」）は、典型的には約１０～２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。同一の又は異なる種類のｓｃＦｖ（同一又は異なるエピトープに対する親和性を有する）は、当業者に知られている異なる方法で組み合わせることができる。このような組み合わせの非限定的な例としては、タンデムのジ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ、タンデムのトリ－ｓｃＦｖ又はトリ（ア）ボディが挙げられる。
用語「エピトープ」は、抗体などによって免疫系によって認識される抗原の一部を指す。エピトープは、抗原決定基とも呼ばれる。
用語「パラトープ」は、エピトープに結合する抗体の一部を指す。
本明細書で使用する用語「に結合する」、「に対する親和性を有する」、「親和性」などは、標的分子に結合する抗体又はその抗原結合断片の性質を指す。標的分子に対する抗体又は抗原結合断片の結合能を評価する標準的なアッセイには、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）マルチプレックスアッセイ及びフローサイトメトリー分析が含まれる。実験の節で例示されるように、抗体の結合動態、例えば、結合親和性はまた、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム分析などによって当技術分野で公知の標準的なアッセイによっても評価することができる。
「特異的に結合する」、「特異的に結合している」などは、抗体又はその抗原結合断片などの問題の分子が、他の分子に顕著に結合することなく標的抗原に特異的に結合することを意味する。抗体又はその抗原結合断片の特異性は、親和性及び／又は結合力に基づいて決定することができる。抗原と抗体又はその抗原結合断片の解離についての平衡定数（ＫＤ）によって表される親和性は、抗原決定基、すなわちエピトープと、抗体又はその抗原結合断片上の抗原結合部位との結合強度の尺度である。ＫＤの値が低いほど、抗原決定基と抗体又はその抗原結合断片との結合強度が強くなる。あるいは、親和性は、１／ＫＤである親和性定数（ＫＡ）として表すこともできる。当業者に明らかなように、関心のある特異的抗原に依存して、親和性は本質的に既知の方法で決定することができる。
典型的には、抗体又はその抗原結合断片は、１０－５～１０－１２モル／リットル（Ｍ）以下、かつ好ましくは１０－７～１０－１２Ｍ以下、かつより好ましくは１０－８～１０－１２Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）、すなわち、１０５～１０１２Ｍ－１以上、かつ好ましくは１０７～１０１２Ｍ－１以上、かつより好ましくは１０８～１０１２Ｍ－１の親和性定数（ＫＡ）でそれらの抗原に結合する。一般に、１０－４Ｍより大きいＫＤ値（又は１０４Ｍ－１より低いＫＡ値）は、非特異的結合を示すと見なされる。好ましくは、実施形態の抗体又はその抗原結合断片は、５００ｎＭ未満の親和性、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満などでＢＳＳＬに結合する。
用語「検出」、「検出すること」などは、直接及び間接的な検出を含む任意の検出手段を含む。
本明細書において、本明細書に記載のＣＤＲを含む可変領域内の全てのアミノ酸は、結果的に、マリー＝ポール・ルフラン（Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ）によって定義されるＩＭＧＴ固有の番号付けに従って番号が付けられる[５]。
用語「カバット番号付け」などは、可変領域に基づく抗体中のアミノ酸残基の番号付けのためのスキームを指す。
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」、「複数のモノクローナル抗体」は、一価親和性を有する抗体／複数の抗体を指し、モノクローナル抗体の試料中の各抗体分子が抗原上の同じエピトープに結合することを意味する。モノクローナル抗体は、特有の親細胞のクローンである同一の免疫細胞、例えば、ハイブリドーマ細胞株によって作られる。
本明細書で使用する用語「ポリクローナル抗体」は、特定の抗原に対して反応する抗体の集合体を指すが、そのコレクションには、例えば、抗原上の異なるエピトープを識別する異なる抗体分子が存在する可能性がある。ポリクローナル抗体は、典型的には、適切な哺乳動物の接種によって生成され、哺乳動物の血清から精製される。
用語「ヒト抗体誘導体」は、ヒト抗体の任意の修飾形態、例えば、抗体と別の薬剤又は抗体のコンジュゲートを指す。
本明細書で使用する用語「全長抗体」は、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ若しくはＩｇＹなどの任意のクラス、又はそれらの任意のサブクラスの抗体を指す。抗体の異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構成はよく知られている。
本明細書で使用する用語「キメラ抗体」は、抗体の免疫原性を低下させるために導入される、例えば、異なる種、例えば、ヒトのポリペプチド又はドメインを含むマウスモノクローナル抗体などの組換え又は遺伝子操作された抗体を指す。
本明細書で使用する用語「少なくとも１つ」は、１以上として解釈されるべきである。
当業者が理解しているように、本明細書における「約」値又はパラメータへの言及には、その値又はパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」への言及の説明は、「Ｘ」の説明を含む。
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによって、又は合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。
本明細書で使用される「宿主細胞」は、この明細書の任意のベクターのレシピエントであり得るか、又はレシピエントであった個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、形態又は全ＤＮＡ補体において、自然の、偶発的、若しくは意図的な変異及び／又は変化により元の親細胞と必ずしも完全に同一であるとは限らない場合がある。宿主細胞は、本明細書の核酸を含むベクターでトランスフェクトした又は感染させた細胞を含む。宿主細胞は原核細胞又は真核細胞であり得る。
ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどとの関連で使用される用語「単離」は、その分子又はポリペプチドがその元の環境から除去されたことを意味する。
本明細書で使用する場合、本明細書で使用する用語「％同一性」又は「％同一の」は、当技術分野で周知の方法を用いて決定され得る。例えば、％同一性は次のように計算される。クエリー配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズム[６]を用いて標的配列と整列させる。整列させた配列の最短のものに対応するウィンドウ上で比較を行う。場合によって、整列させた配列の最短のものは標的配列になり得る。他の場合では、クエリー配列は、整列配列の最短のものを構成し得る。各位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較し、標的配列内で同一の対応物を有するクエリー配列内の位置の割合を％同一性として報告する。
本明細書で使用する薬剤の「治療有効量」は、所望の治療又は予防の結果を達成するのに必要な投与量及び期間で有効な量を指す。
本明細書に記載の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「からなる」及び／又は「から本質的になる」ことを含む。本明細書で使用する単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、及び「その」は、特に示されない限り、複数の参照を含む。
[７]に記載の「ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ」
[８]に記載の「ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、ｈＩｇＧ４ Ｓ２４１ Ｐ」
「Ｇ－ＳＰ１４０－８」、ＳＰ１４０結合クローン、陰性対照
「ｅｘｐｉＨＥＫ２９３細胞」、２９３細胞株に由来するヒト細胞、及びＥｘｐｉ２９３（商標）発現系のコア成分
本発明の目的は、炎症状態の治療及び／又は予防に有用であり、また、現在の治療法の前述の及び他の欠点を軽減する抗体及び／又はその抗原結合断片を提供することである。さらに、本開示の目的は、炎症状態の診断及び胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）タンパク質の研究に使用される薬剤を提供することである。
より詳細には、本発明は、ＢＳＳＬタンパク質のＮ末端部分に位置するＢＳＳＬの以前に特徴付けられていないエピトープに結合する新規の単離抗体及びその抗原結合断片に関する。本明細書はまた、特に炎症状態の治療における抗体及びその抗原結合断片の医学的使用、及び関連する医薬組成物に関する。本明細書はまた、ＢＳＳＬの検出及び／又はＢＳＳＬ関連疾患の診断のための分子ツールとしての抗体又はその抗原結合断片の使用を開示する。
一実施形態では、ＢＳＳＬが言及される場合は常に、ｈＢＳＳＬが含まれることを意図しないことが文脈から明らかにされない限り、ＢＳＳＬはヒトＢＳＳＬ（ｈＢＳＳＬ）も含む。
本開示は、その抗原結合断片を含む、ＢＳＳＬに対する抗体の新規グループを説明し、ｈＢＳＳＬ上の以前に認識されていないエピトープに結合する。抗体は、ヒト化されるか又は非ヒト骨格上に移植されたそれらのＣＤＲ配列であり得る。抗体又はその抗原結合断片はまた、マウス（ｍｏｕｓｅ）又はマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＢＳＳＬ（ｍＢＳＳＬ）に結合してもよいが、ｈＢＳＳＬ及びｍＢＳＳＬに対する親和性は、抗体及び／又はその抗原結合断片が結合するエピトープの１つにおけるアミノ酸の違い（複数可）によって異なる場合がある。
よく知られているように、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド又は他のものなどの標的（抗原）に特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖（ＨＣ）と２つの軽（Ｌ）鎖（ＬＣ）を含む糖タンパク質である。重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、様々な免疫系の細胞、例えば、エフェクター細胞、及び古典的な補体系の第１の成分、すなわち、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）を含む宿主の組織又は因子と免疫グロブリンが結合するのを媒介し得る。
本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片は、それに結合した時に、ＢＳＳＬタンパク質の少なくとも一部の生物学的活性を阻害又は低下させるために使用され得る。この結合は、例えば、ＢＳＳＬタンパク質の生物学的活性の一部を顕著に又は完全に阻害し得る。本発明の抗体又はその抗原結合断片のこれらの作用は、抗体又はその抗原結合断片がＢＳＳＬの活性部位に結合しないことを考えると、非常に驚くべきものであった。そのため、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＢＳＳＬの酵素活性を顕著に阻害又は低下させないことが好ましく、例えば、コレステロールエステル（ＥＣ３．１．１．１３）を加水分解するＢＳＳＬの能力を顕著に阻害又は低下させない。
抗体又はその抗原結合断片は、それを必要とする対象におけるＢＳＳＬの炎症促進作用を低下させるために用いることができる。そのため、抗体又はその抗原結合断片は、さらに本明細書に記載の様々な炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用することができる。本発明の抗体の又はその抗原結合断片のこれらの医学的使用は、ＢＳＳＬの酵素活性を遮断することなく達成することができる。したがって、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＢＳＳＬの活性部位に結合する又は活性部位と関連する他の抗ＢＳＳＬ抗体が有し得るＢＳＳＬの酵素活性の阻害によって引き起こされる負の作用に寄与しない。
また、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片は、ＢＳＳＬ関連の炎症状態などのＢＳＳＬ関連状態を診断するための診断目的に使用され得る。
実験の節で実証されるように、ヒト化ＢＳＳＬ抗体又はその抗原結合断片の開発の試みにいくつかの手法が用いられたが、ｓｃＦｖの候補の最初の数が約１,０００,０００であったにもかかわらず、ｈＢＳＳＬタンパク質に対する十分な結合親和性を示すのは驚くほど少ない数であることが判明した。１,０００,０００個の候補のうち、６８個の初期候補が特定され、その後候補は３８個に減少し、最終的にはさらなる評価と特徴付けのために選ばれた５個の候補にまで減少した。したがって、抗ＢＳＳＬ抗体又はその抗原結合断片は、標準プロトコルを用いて容易にヒト化できず、依然としてｈＢＳＳＬに対する十分な結合親和性を有することができない。そのため、抗ＢＳＳＬ抗体又は抗原結合断片のヒト化は大きな課題であったが、ｈＢＳＳＬに対して十分な結合親和性を依然として示すヒト化抗体又はその抗原結合断片を達成するために本明細書に記載のように克服された。本発明のこれらの抗体又はその抗原結合断片は、本明細書の他の場所に記載の共通の構造的及び機能的特徴を共有する。
抗体と抗原結合断片の作製
ｈＢＳＳＬに対して十分に良好な結合親和性を有する抗体及びその抗原結合断片を見出すことを目的として、本発明の抗体及びその抗原結合断片を多段階法で作製した。また、ヒト化抗体及びその抗原結合断片を提供することを目的とした。同定した抗体及びその抗原結合断片の一部は、ｍＢＳＳＬに十分な結合親和性で結合することも見出された。本発明は、ＢＳＳＬに結合するヒト化抗体に限定されるものではないが、ヒト化ＢＳＳＬ結合抗体及びその抗原結合断片を本明細書に開示する。
抗体及びその抗原結合断片を、非ヒトモノクローナルｍＢＳＳＬ抗体の配列に基づいて作製した。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、この抗体を発現する非ヒトハイブリドーマから取得し、標準的な分子生物学技術を用いて、マウスではない、例えば、ヒトの免疫グロブリン配列を含むように操作した。
しかし、実施例６で開示されるように構築されたＣＤＲグラフトは、ＣＤＲ配列を提供するために使用されるｍＢＳＳＬ抗体に基づいて予想されるほど高い結合親和性を有していないことは驚くべき発見であった。そのため、ｈＢＳＳＬに対して十分に高い結合親和性を有する抗体及びその抗原結合断片を得るために、実施例５に開示されるように、ＣＤＲ領域と隣接ＦＷ領域の両方に変異を導入することによって、抗体のフレームワーク（ＦＷ）へのさらなる改変を行う必要があった。これは、ファージディスプレイを用いて、マウスとヒトのＢＳＳＬに結合するｓｃＦｖ断片の選択及び単離に使用されるヒト化ライブラリーを構築することによって達成された。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されており、例えば、米国特許第５,２２３,４０９号；同第５,４０３,４８４号；同第５,５７１,６９８号；同第５,４２７,９０８号；同第５,５８０,７１７号；同第５,９６９,１０８号；同第６,１７２,１９７号；同第５,８８５,７９３号；同第６,５２１,４０４号；同第６,５４４,７３１号；同第６,５５５,３１３号；同第６,５８２,９１５号；及び同第６,５９３,０８１号を参照されたい。
得られた単離抗体及びその抗原結合断片は、必須の非ヒト生殖系残基のみが許された最小の動物由来のＣＤＲ含量を有していた。残りのＣＤＲは、ヒトｖ遺伝子配列に変換されたが、ＩＭＧＴアミノ酸残基６２、６４、６８、２７、６６、６８、１１５及び１１６などの種中立必須デノボ残基の導入によるいくつかの新規変異を除く（図１５及び１６参照）。これらのＣＤＲ配列をヒト又は非ヒトフレームワーク上に移植して、抗体の意図された使用に応じて、ヒト化した若しくはヒト化していない抗体及び／又はその抗原結合断片を調製することができる。
ヒト化抗体において、ＣＤＲ配列を除いて、定常領域及び可変領域の一部は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来するフレームワークを有する。しかし、このようなヒト化抗体において、ＣＤＲ配列は、ヒトフレームワーク配列上に移植されているマウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来する。このようなヒト化抗体はまた、本発明の文脈において、ＣＤＲグラフトを意味し得る。ヒト化抗体を使用する利点は、抗体がヒトの対象に注入された場合に、別の種のフレームワークが使用されたときに起こり得る免疫原性反応のリスクを低下させることである。これにより、それらをヒトにおける医療用途に使用できる。本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片は、本明細書の他の場所でより詳細に開示される異なる種類の試料における診断用途及びｈＢＳＳＬなどのＢＳＳＬタンパク質の検出に有用である。
本明細書は、そのため、本発明による単離抗体又はその抗原結合断片を生成するための方法を開示する。本方法は、抗体又はその抗原結合断片の発現を許容する条件下で、宿主細胞に含まれ、抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターから抗体又はその抗原結合断片を発現する宿主細胞を培養することを含む。本方法はまた、宿主細胞から、又は宿主細胞が培養される培地から抗体又はその抗原結合断片を単離することを含む。
抗体又はその抗原結合断片のエピトープ結合
単離抗体又はその抗原結合断片は、ＢＳＳＬタンパク質のＮ末端部分に位置するヒトＢＳＳＬタンパク質の以前に認識されていないエピトープに結合することが見出された。該エピトープは、ＢＳＳＬの立体構造エピトープを形成し得る。
本発明に従って作製した抗体及びその抗原結合断片が、ｈＢＳＳＬタンパク質の以前に認識されていないエピトープに結合することは驚くべき発見であった。さらに驚くべきことに、該エピトープは、脂質代謝のためのＢＳＳＬの活性部位の近くに位置するのではなく、むしろＢＳＳＬのＮ末端部分に位置することが判明した。これにはいくつかの利点がある。１つは、抗体又はその抗原結合断片が、ＢＳＳＬの酵素リパーゼ活性に顕著に影響を及ぼさないため、負の副作用を引き起こす可能性が低いということである。別の利点は、ＢＳＳＬタンパク質が本発明の抗体又はその抗原結合断片によって著しく影響されないので、該抗体又はその抗原結合断片は、ＢＳＳＬタンパク質及びそのリパーゼ活性を研究するのに適していることである。
ＢＳＳＬ構造は、アルファヘリックスと連結ループで囲まれ、ねじれた１１個の鎖状βシートからなる大きなコア領域を有すると説明されている（[９]、図１２）。Ｎ末端では、より小さな３個の鎖状βシートがある。該構造は、「親指」の近くに活性部位の３連構造を含む手のひらを有する左側のオーブングローブにたとえられている。これと似て、小さなＮ末端βシートが、「小指」の近くの手の後ろに位置している。図１２を参照されたい。Ｆａｂ分子と相互作用するＢＳＳＬ構造の一部は、小さなＮ末端βシートと、構造中の第３のアルファヘリックスであるアルファＣのＣ末端部分に位置する。図１３を参照されたい。言い換えると、抗体の結合領域は、ＢＢＳＬの活性部位の近くではなく、ＢＳＳＬの反対側にある。
現在同定されたエピトープ領域は、残基７～１２（鎖１及び２）並びに４２～５５（シートの鎖３に通じるループ領域）を含む。該エピトープはむしろ平坦であり、ごくわずかな特徴的な残基、すなわち、Ｔｙｒ７、Ｐｈｅ１２及びＧｌｎ５２が突き出ている（表２５に列挙されている主な相互作用）。４７～５４のループ領域は、十分に定義され、均一な表面を形成する。プロリン４７は、抗体のＴｙｒ３１との積み重ね相互作用にとって重要であるが、全体として表面は平坦である。好ましい実施形態では、該エピトープ領域はまた、残基１７４～１８０（アルファＣのＣ末端）を含む。
本発明の態様は、ＢＳＳＬ、好ましくはｈＢＳＳＬのエピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片に関する。該エピトープは、配列番号１によるアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれによって画定される第１の表面を含む。該エピトープはまた、配列番号２によるアミノ酸配列又は配列番号２と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％又は少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれによって画定される第２の表面を含む。
配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のペプチドは、ＢＳＳＬ内のエピトープの第１の表面を画定し、配列番号２のアミノ酸配列を含む第２のペプチドは、ＢＳＳＬにおけるエピトープの第２の表面を画定する。したがって、第１の表面は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、又はむしろそれによって画定され、第２の表面は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又はむしろそれによって画定される。
一実施形態では、第１ペプチドは、配列番号３によるアミノ酸配列、又は配列番号３と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８３％、及びより好ましくは少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。配列番号３は、その一部として、配列番号１によるアミノ酸配列を含むより長いアミノ酸配列である。
単離抗体又はその抗原結合断片は、さらに、ｈＢＳＳＬなどのＢＳＳＬの別のペプチド及び表面、すなわち、第３のペプチド及び第３の表面に特異的に結合し得る。一実施形態では、この第３のペプチドは、配列番号５によるアミノ酸配列、又配列番号５と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第３のペプチドは、配列番号４によるアミノ酸、又は配列番号４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８８％、例えば少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、第３のペプチドは、配列番号６によるアミノ酸配列、又は配列番号６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１を含む、例えば、配列番号１からなる第１のペプチド、配列番号２を含む、例えば、配列番号２からなる第２のペプチド、及び配列番号４を含む、例えば、配列番号４からなる第３のペプチド、又は本明細書で定義されたそれらとのそれぞれの同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合し得る。あるいは、配列番号１によるより短いアミノ酸配列に結合する代わりに、そのような抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３によるより長いアミノ酸配列、又は本明細書で特定されたそれとの同一性を有するアミノ酸配列に結合し得る。
別の実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１を含む、例えば、配列番号１からなる第１のペプチド、配列番号２を含む、例えば、配列番号２からなる第２のペプチド、及び配列番号５を含む、例えば、配列番号５からなる第３のペプチド、又は本明細書で定義されたそれらとのそれぞれの同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。あるいは、配列番号１によるより短いアミノ酸配列に結合する代わりに、そのような抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３によるより長いアミノ酸配列、又は本明細書で特定されたそれとの同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合し得る。
さらなる実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１を含む、例えば、配列番号１からなる第１のペプチド、例えば、配列番号２からなる第２のペプチド、及び、例えば、配列番号６からなる第３のペプチド、又は本明細書で定義されたそれらとのそれぞれの特定された同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。あるいは、配列番号１によるより短いアミノ酸配列に結合する代わりに、そのような抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３によるより長いアミノ酸配列、又は本明細書で定義されたそれとの特定の同一性を有するアミノ酸配列に結合し得る。
本発明の別の態様は、配列番号１によるアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、例えば、それからなる第１のペプチドを含むｈＢＳＳＬエピトープなどのＢＳＳＬエピトープを対象とする。ＢＳＳＬエピトープはまた、配列番号２によるアミノ酸配列、又は配列番号２と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、例えば、それからなる第２のペプチドを含む。
一実施形態では、第１のペプチドは、配列番号３によるアミノ酸配列、又は本明細書で定義されたそれとの同一性を有するアミノ酸配列を含む、例えば、それからなる。
該エピトープは、さらに、配列番号４によるアミノ酸配列、若しくは本明細書で定義されたそれとの同一性を有するアミノ酸配列、配列番号５によるアミノ酸配列、若しくは本明細書で定義されたそれとの同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６によるアミノ酸配列、若しくは本明細書で定義されたそれとの同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
このようなエピトープは、例えば、ＢＳＳＬ関連病態の治療及び／若しくは予防のための使用並びに／又はＢＳＳＬタンパク質を研究するための分子ツールとしての使用のための、ｈＢＳＳＬなどのＢＳＳＬタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合断片の開発に有用であり得る。したがって、本発明は、抗体又はその抗原結合断片の開発のための、そのようなエピトープの使用も対象とする。これらのエピトープは、ＢＳＳＬタンパク質のリパーゼ触媒中心に位置しないので、それに対する抗ＢＳＳＬ抗体又は抗原結合断片を開発することは魅力的な目標である。
本発明による単離抗体又はその抗原結合断片は、本明細書で定義されるエピトープ（複数可）に特異的に結合し得る。
抗体及びその抗原結合断片の抗原結合部分
完全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結される２つの重鎖と２つの軽鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＶＣＲ）並びに第１、第２及び第３の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。この開示では、用語ＶＨ、ＶＨ及びＨＣＶＲは互換的に使用される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＶＣＲ）、及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。この開示では、用語ＶＬ、ＶＬ及びＬＣＶＲは互換的に使用される。
ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷ）と呼ばれるより保存された領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化することができる。各ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、Ｎ末端からＣ末端に次の順序：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４で配置されている３つのＣＤＲと４つのＦＲ／ＦＷで構成される。
本明細書で使用する拡張ＣＤＲ（ｅＣＤＲ）は、ＩＭＧＴ命名法に従って定義されるＣＤＲのアミノ酸を超える少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列に関する。
抗原結合部位としても知られるパラトープは、抗原を認識して結合する抗体又はその抗原結合断片の一部である。それは、抗体のＦｖ領域の小さな領域であり、抗体の重鎖と軽鎖の一部を含む。抗体モノマーのＹ形状の各腕は、６つのＣＤＲのセットであるパラトープが先端についている。パラトープは、逆平行ベータシートの折り畳みから伸びている３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）及び３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）で構成される。
以下の節において、本発明の単離抗体又はその抗原結合断片は、そのＣＤＲの構造的特徴、言い換えると、そのＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲのアミノ酸配列、又はＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲを含む領域のアミノ酸構造によって定義される。当業者なら、アミノ酸配列中の１、２、３、４個、又はそれ以上のアミノ酸残基の置換などの小さな変化が、単離抗体又はその抗原結合断片のｈＢＳＳＬなどのＢＳＳＬへのその結合能又は結合親和性などの機能特性に影響を及ぼすことなく生じ得ることを理解するであろう。第１のＨＣＤＲ、第２のＨＣＤＲ、第３のＨＣＤＲ、第１のＬＣＤＲ、第２のＬＣＤＲ及び第３のＬＣＤＲは、列挙されたアミノ酸配列から独立して選択され得ることが理解される。
本発明の一態様は、このように、ＨＣＶＲ（ＨＣＤＲ）の３つのＣＤＲ及びＬＣＨＶ（ＬＣＤＲ）の３つのＣＤＲを含む単離抗体又はその抗原結合断片に関する。この態様において、第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列、又は配列番号７と少なくとも８７％、例えば少なくとも８７．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号８によるアミノ酸配列、又は配列番号８と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列、又は配列番号９と少なくとも８３％、例えば少なくとも９１．６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。さらに、この態様では、第１のＬＣＤＲは、配列番号１０によるアミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、ＡＡＳなどのアミノ酸配列ＡＴＳ、又はアミノ酸配列ＡＴＳと少なくとも６６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列、又は配列番号１１と少なくとも８７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
実施例２２に示した実験データは、第２のＬＣＤＲがＢＳＳＬとの相互作用にとってそれほど重要ではない可能性を示している。したがって、実施形態では、配列番号７によるアミノ酸配列、又は配列番号７と少なくとも８７％、例えば少なくとも８７．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる第１のＨＣＤＲ、配列番号８によるアミノ酸配列、又は配列番号８と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる第２のＨＣＤＲ、配列番号９によるアミノ酸配列、又は配列番号９と少なくとも８３％、例えば少なくとも９１．６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる第３のＨＣＤＲ、配列番号１０によるアミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる第１のＬＣＤＲ、及び配列番号１１によるアミノ酸配列、又は配列番号１１と少なくとも８７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる第３のＬＣＤＲを含む単離抗体又はその抗原結合断片。
一実施形態では、第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号８、配列番号１８及び配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。一実施形態では、第１のＬＣＤＲは、配列番号１０及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、ＡＴＳ及びＡＡＳからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１、配列番号２１及び配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号８によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、かつ第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、第１のＬＣＤＲは、配列番号１０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、アミノ酸配列ＡＴＳを含み、好ましくは、それからなり、かつ第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
特定の実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１２によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＨＣＤＲ、配列番号１４によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第１のＬＣＤＲ、及び配列番号１５によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＬＣＤＲを含む。
別の特定の実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１２によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＨＣＤＲ、配列番号１６によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第１のＬＣＤＲ、及び配列番号１７によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＬＣＤＲを含む。
一実施形態では、第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号１８によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、かつ第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、第１のＬＣＤＲは、配列番号１０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、アミノ酸配列ＡＴＳを含み、好ましくは、それからなり、かつ第３のＬＣＤＲは、配列番号２１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
特定の実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２３によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＨＣＤＲ、配列番号１６によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第１のＬＣＤＲ、及び配列番号１５によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＬＣＤＲを含む。
一実施形態では、第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号８によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、かつ第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、第１のＬＣＤＲは、配列番号２０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、アミノ酸配列ＡＡＳを含み、好ましくは、それからなり、かつ第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
特定の実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２４によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＨＣＤＲ、配列番号２７によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第１のＬＣＤＲ、及び配列番号２９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＬＣＤＲを含む。
一実施形態では、第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号１９によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、かつ第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、第１のＬＣＤＲは、配列番号２０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、アミノ酸配列ＡＴＳを含み、好ましくは、それからなり、かつ第３のＬＣＤＲは、配列番号２２によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
特定の実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２５によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＨＣＤＲ、配列番号２６によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第１のＬＣＤＲ、及び配列番号２８によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＬＣＤＲを含む。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる第１のＨＣＤＲ、配列番号１２、２３、２４及び２５からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる第２のＨＣＤＲ、並びに配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる第３のＨＣＤＲを含む。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６及び配列番号２７からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第１のＬＣＤＲ、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２８及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＬＣＤＲ、並びに配列番号１１、配列番号２１及び配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる第３のＬＣＤＲ。
一実施形態では、第１のＨＣＤＲが配列番号７によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号７と少なくとも８７.５％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、第２のＨＣＤＲが配列番号８によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号８と少なくとも７５％、例えば、少なくとも８７％、又は少なくとも８７.５％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、第３のＨＣＤＲが配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号９と少なくとも８３％、例えば、少なくとも９１．６％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、第１のＬＣＤＲが配列番号１０によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、第２のＬＣＤＲがアミノ酸配列ＡＴＳ又はＡＡＳを含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、アミノ酸配列ＡＴＳ及びＡＡＳのいずれか１つと少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、第３のＬＣＤＲが配列番号１１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号１１と少なくとも８７．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、第３のＬＣＤＲが配列番号２１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号２１と少なくとも７５％、例えば、少なくとも８７．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、第３のＬＣＤＲが配列番号２２によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号２２と少なくとも７５％、例えば、少なくとも８７．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第２のＨＣＤＲが配列番号１２によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号１２と少なくとも７７．８％、例えば、少なくとも８３％、例えば、少なくとも８３．３％、例えば、少なくとも８８％、例えば、少なくとも８８.９％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９４．４％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第２のＨＣＤＲが配列番号１８によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号１８と少なくとも７５％、例えば、８７．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第２のＨＣＤＲが配列番号１９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号１９と少なくとも７５％、例えば、８７．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第２のＨＣＤＲが配列番号２３によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号２３と少なくとも７７．８％、例えば、少なくとも８３％、例えば、少なくとも８３．３％、例えば、少なくとも８８％、例えば、少なくとも８８.９％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９４．４％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第２のＨＣＤＲが配列番号２４によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号２４と少なくとも７７．８％、例えば、少なくとも８３％、例えば、少なくとも８３．３％、例えば、少なくとも８８％、例えば、少なくとも８８.９％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９４．４％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第２のＨＣＤＲが配列番号２５によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号２５と少なくとも７７．８％、例えば、少なくとも８３％、例えば、少なくとも８３．３％、例えば、少なくとも８８％、例えば、少なくとも８８.９％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９４．４％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第１のＬＣＤＲが配列番号１４によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号１４と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第１のＬＣＤＲが配列番号１６によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号１６と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第１のＬＣＤＲが配列番号２０によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号２０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第１のＬＣＤＲが配列番号２６によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号２６と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第１のＬＣＤＲが配列番号２７によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号２７と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第２のＬＣＤＲが配列番号１５によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号１５と少なくとも６６.７％、例えば、少なくとも８３％、例えば、少なくとも８３．３％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第２のＬＣＤＲが配列番号１７によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号１７と少なくとも６６.７％、例えば、少なくとも８３％、例えば、少なくとも８３．３％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第２のＬＣＤＲが配列番号２８によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号２８と少なくとも６６.７％、例えば、少なくとも８３％、例えば、少なくとも８３．３％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、拡張した第２のＬＣＤＲが配列番号２９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる場合に、これはまた、配列番号２９と少なくとも６６.７％、例えば、少なくとも８３％、例えば、少なくとも８３．３％同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書に開示される単離抗体又はその抗原結合断片はまた、又は代わりに、それらのＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲのアミノ酸配列によって構造的に説明され得る。当業者なら、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲが列挙されたアミノ酸配列から独立して選択され得ることを理解するだろう。上述したように、当業者なら、アミノ酸配列中の１、２、３、４個又はそれ以上のアミノ酸残基のアミノ酸の欠失又は付加を含む置換などの小さな変化が、単離抗体又はその抗原結合断片の、ｈＢＳＳＬに結合する能力などの機能特性に影響を与えずに起こり得ることを理解するだろう。この変化は、ＣＤＲのアミノ酸配列中、本明細書でフレームワーク領域と呼ばれるＣＤＲ領域外のアミノ酸配列中、又はＣＤＲのアミノ酸配列とＨＣＶＲ又はＬＣＶＲのＣＤＲ領域外のアミノ酸配列の両方に存在し得る。
したがって、一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４及び配列番号３６からなるアミノ酸配列、及び配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４及び配列番号３６のいずれか１つと少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなるＨＣＶＲを含む。
特定の実施形態では、ＨＶＣＲのアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３４及び配列番号３６、並びに配列番号３０、配列番号３４及び配列番号３６のいずれか１つと少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列からなる群から選択される。別の特定の実施形態では、ＨＶＣＲのアミノ酸配列は、配列番号３４及び配列番号３６、並びに配列番号３４及び配列番号３６のいずれか１つと少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列からなる群から選択される。例えば、ＨＣＶＲは、配列番号３６によるアミノ酸配列又は配列番号３６のいずれか１つと少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態では、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７及び配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７及び配列番号３８のいずれか１つと少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
特定の実施形態では、ＬＶＣＲのアミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３７及び配列番号３８並びに配列番号３１、配列番号３５、配列番号３７及び配列番号３８のいずれか１つと少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列からなる群から選択される。別の特定の実施形態では、ＬＶＣＲのアミノ酸配列は、配列番号３５、配列番号３７及び配列番号３８並びに配列番号３５、配列番号３７及び配列番号３８のいずれか１つと少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列からなる群から選択され、例えば、配列番号３７及び配列番号３８並びに配列番号３７及び配列番号３８のいずれか１つと少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列からなる群から選択される。例えば、ＨＣＶＲは、配列番号３７によるアミノ酸配列及び配列番号３７のいずれか１つと少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態では、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４及び配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４及び配列番号３６のいずれか１つと少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む。該抗体又はその抗原結合断片はまた、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７及び配列番号３８からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７及び配列番号３８のいずれか１つと少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
特定の実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３６によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなるＨＣＶＲ、及び配列番号３７によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなるＬＣＶＲを含む。
別の特定の実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３６によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなるＨＣＶＲ、及び配列番号３８によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなるＬＣＶＲを含む。
さらなる実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３０によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなるＨＣＶＲ、及び配列番号３１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなるＬＣＶＲを含む。
さらに別の実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３２によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなるＨＣＶＲ、及び配列番号３３によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなるＬＣＶＲを含む。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３４によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなるＨＣＶＲ、及び配列番号３５によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなるＬＣＶＲを含む。
本発明の態様は、ｉ）ＺＨ１－［ＧＹＴＦＴＳＹＮ］－ＺＨ２－［Ｘ５３ＧＶＩＸ５７ＰＧＤＧＸ６４ＴＳＹＸ６８ＱＫＦＸ７２］－ＺＨ３－［ＡＲＤＹＹＧＳＳＰＬＧＹ］－ＺＨ４から選択されるアミノ酸配列、又はｉ）で定義された配列と少なくとも９２％の同一性、例えば、ｉ）で定義された配列と９３％以上、例えば９４％以上、例えば９５％以上、例えば９６％以上、例えば９７％以上、例えば９８％以上、例えば９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＨＣＶＲ、及びｉｉ）ＺＬ１－［Ｘ２４ＡＳＸ２７ＳＩＳＹＸ３９Ｎ］－ＺＬ２－［ＡＸ５７ＳＸ６６ＬＸ６８］－ＺＬ３－［ＨＱＲＳＳＸ１１５ＰＴ］－ＺＬ４から選択されるアミノ酸配列、又はｉｉ）で定義された配列と少なくとも８７％の同一性、例えば、ｉｉ）で定義された配列と８８％以上、例えば８９％以上、例えば９０％以上、例えば９１％以上、例えば９２％以上、例えば９３％以上、例えば９４％以上、例えば９５％以上、例えば９６％以上、例えば９７％以上、例えば９８％以上、例えば９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＬＣＶＲを含む単離抗体又はその抗原結合断片に関する。
この態様において、ＺＨ１、ＺＨ２、ＺＨ３及びＺＨ４の各々は、独立して、ゼロ、１個又はいくつかの、独立して選択されるアミノ酸残基を表し、ＺＬ１、ＺＬ２、ＺＬ３及びＺＬ４の各々は、独立して、ゼロ、１個又はいくつかの、独立して選択されるアミノ酸残基を表す。Ｘ５３は、ＩとＭから選択され、Ｘ５７はＮとＹから選択され、Ｘ６４はＡとＳから選択され、Ｘ６８はＡとＮから選択され、Ｘ７２はＫとＱから選択され、Ｘ２４はＳとＲから選択され、Ｘ２７はＳとＰから選択され、Ｘ３９はＭとＬから選択され、Ｘ５７はＡとＴから選択され、Ｘ６６はＫとＳから選択され、Ｘ６８はＡとＰから選択され、かつＸ１１５はＳ、Ｔ及びＹから選択される。アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＴＧ番号付け基準に従い、すなわち、上記で定義した配列ｉ）又はｉｉ）の位置「Ｘｎ」については、ｎは整数であり、ＩＭＧＴ番号付けによるアミノ酸残基Ｘの位置を示す。
ＧＹＴＦＴＳＹＮは配列番号７で示され、Ｘ５３ＧＶＩＸ５７ＰＧＤＧＸ６４ＴＳＹＸ６８ＱＫＦＸ７２は、配列番号１６９で示され、ＡＲＤＹＹＧＳＳＰＬＧＹは配列番号９で示され、Ｘ２４ＡＳＸ２７ＳＩＳＹＸ３９Ｎは配列番号１７０で示され、ＡＸ５７ＳＸ６６ＬＸ６８は配列番号１７１で示され、かつＨＱＲＳＳＸ１１５ＰＴは配列番号１７２で示される。
本明細書に抗体又はその抗原結合断片が提供され、配列ｉ）中のＸｎは、以下のリストＡに列挙されている可能な残基の群から独立して選択される。当業者なら、Ｘｎが可能な残基の列挙された群のいずれか１つから選択され得ること、かつこの選択が、ｎがｍではないＸｍのアミノ酸の選択から独立していることを理解するであろう。そのため、位置Ｘｎ中の列挙されている可能な残基のいずれかは、リストＡによる任意の他の様々な位置にある列挙されている可能な残基のいずれかと独立して組み合わせることができる。
リストＡ：配列ｉ）内の可能なアミノ酸残基のリスト
Ｘ５３はＩでもよい；
Ｘ５３はＭでもよい；
Ｘ５７はＮでもよい；
Ｘ５７はＹでもよい；
Ｘ５９はＧでもよい；
Ｘ５９はＳでもよい；
Ｘ６４はＡでもよい；
Ｘ６４はＳでもよい；
Ｘ６８はＡとＴから選択され得る；
Ｘ６８はＡとＮから選択され得る；
Ｘ６８はＴとＮから選択され得る；
Ｘ６８はＡでもよい；
Ｘ６８はＮでもよい；
Ｘ６８はＴでもよい；
Ｘ７２はＫでもよい；かつ
Ｘ７２はＱでもよい。
同様の方法で、本明細書に抗体又は抗原結合断片が提供され、配列ｉｉ）中のＸｋがリストＢの以下のリストによる可能な残基の群から独立して選択される。当業者は、Ｘｋが可能な残基の列挙された群のいずれか１つから選択され得ること、かつこの選択が、ｋがｌではないＸｌのアミノ酸の選択から独立していることを理解するであろう。そのため、リストＡの位置Ｘｋの列挙されている可能な残基のいずれかは、リストＢによる任意の他の様々な位置にある列挙されている可能な残基のいずれかと独立して組み合わせることができる。
リストＢ：配列ｉｉ）内の可能なアミノ酸残基のリスト
Ｘ２４はＳでもよい；
Ｘ２４はＲでもよい；
Ｘ２７はＳでもよい；
Ｘ２７はＰでもよい；
Ｘ３９はＭでもよい；
Ｘ３９はＬでもよい；
Ｘ４０はＨでもよい；
Ｘ４０はＮでもよい；
Ｘ５７はＡでもよい；
Ｘ５７はＴでもよい；
Ｘ６６はＫとＳから選択され得る；
Ｘ６６はＲとＳから選択され得る；
Ｘ６６はＲとＫから選択され得る；
Ｘ６６はＫでもよい；
Ｘ６６はＲでもよい；
Ｘ６６はＳでもよい；
Ｘ６８はＡとＰから選択され得る；
Ｘ６８はＡとＱから選択され得る；
Ｘ６８はＰとＱから選択され得る；
Ｘ６８はＡでもよい；
Ｘ６８はＰでもよい；
Ｘ６８はＱでもよい；
Ｘ１０５はＨでもよい；
Ｘ１０５はＱでもよい；
Ｘ１１５はＳとＴから選択され得る；
Ｘ１１５はＳとＹから選択され得る；
Ｘ１１５はＴとＹから選択され得る；
Ｘ１１５はＳでもよい；
Ｘ１１５はＹでもよい；かつ
Ｘ１１５はＴでもよい。
明確にするために、リストＡからの配列ｉ）中のアミノ酸位置のアミノ酸残基の選択は、リストＢからの配列ｉｉ）中のアミノ酸位置のアミノ酸残基の選択から独立している。疑念を避けるために、リストＡ及びリストＢは各々、本開示に従っていくつかの具体的かつ個別化された例を開示し、列挙した例を自由に組み合わせてもよい。
上記に定義したように、ＺＨ１、ＺＨ２、ＺＨ３及びＺＨ４の各々は、ゼロ、１個又はいくつかの、独立して選択されるアミノ酸残基を表し得る。前記ＺＨ１、ＺＨ２、ＺＨ３及びＺＨ４の各々におけるアミノ酸残基の同一性及び数は、独立して選択され得る。
同様に、ＺＬ１、ＺＬ２、ＺＬ３及びＺＬ４の各々は、ゼロ、１個又はいくつかの、独立して選択されるアミノ酸残基を表し得る。ＺＬ１、ＺＬ２、ＺＬ３及びＺＬ４の各々におけるアミノ酸残基の同一性及び数は、独立して選択され得る。さらに、ＺＬ１は、ＺＨ１又はＺＨ４にアミノ酸リンカー又は他のリンカーを介して連結されてもよい。また、ＺＬ４は、ＺＨ１又はＺＨ４にアミノ酸リンカー又は他のリンカーを介して連結されてもよい。そのため、ｉ）で定義される配列とｉｉ）で定義される配列は、１つのアミノ酸配列の一部であり得、言い換えると、１つのポリペプチドの一部であり得る。
一実施形態では、ＺＨ１は、配列番号３９によるアミノ酸配列、又は配列番号３９と少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＨ２は、配列番号４０によるアミノ酸配列、又は配列番号４０と少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＨ３は、配列番号４１によるアミノ酸配列、又は配列番号４１と少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＨ４は、配列番号４２によるアミノ酸配列、又は配列番号４２と少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＬ１は、配列番号４３によるアミノ酸配列、又は配列番号４３と少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＬ２は、配列番号４４によるアミノ酸配列、又は配列番号４４と少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＬ３は、配列番号４５によるアミノ酸配列、又は配列番号４５と少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＬ４は、配列番号４６によるアミノ酸配列、又は配列番号４６と少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
当業者なら、上記に列挙したそれぞれの配列番号によるアミノ酸配列とのＺＨ１、ＺＨ２、ＺＨ３、ＺＨ４、ＺＬ１、ＺＬ２、ＺＬ３及びＺＬ４の各々の％同一性は、そのそれぞれの配列番号とのＺＨ１、ＺＨ２、ＺＨ３、ＺＨ４、ＺＬ１、ＺＬ２、ＺＬ３及びＺＬ４の任意の他の％同一性とは無関係であることを理解するであろう。そのため、例えば、ＺＨ１は配列番号３９と９５％の同一性を示し得、ＺＨ２は配列番号４０と９９％の同一性を示し得る。
本明細書で提示される新規抗ＢＳＳＬ抗体又はその抗原結合断片をもたらすヒト化過程の間に、ＣＤＲと隣接ＦＷ領域の両方に幾つかの変異が導入されている。本開示の目的のために、各抗体ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、３つのＣＤＲで構成され、そのうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲは、表１で定義されるように以下の順でＮ末端からＣ末端に配置される拡張したＣＤＲＳ（ｅＣＤＲＳ）、及び４つのＦＲ／ＦＷであり得る。
表１－ＩＭＧＴ番号付け
Figure 2022540859000002
ＨＣＲＶの３つのＣＤＲは、上記の領域ＺＨ１、ＺＨ２、ＺＨ３及びＺＨ４であり得るフレームワーク領域に隣接する。ＬＣＲＶの３つのＣＤＲは、上記のＺＬ１、ＺＬ２、ＺＬ３及びＺＬ４であり得るのフレームワーク領域に隣接する。
本明細書で構築した抗体又はその抗原結合断片のＨＶＣＲは、配列番号３０、３２、３４、３６及び４７～８４からなる群の中のアミノ酸配列中に列挙される。これに対応して、本明細書で構築した抗体又はその抗原結合断片のＬＶＣＲは、配列番号３１、３３、３５、３７、３８及び８６～１２３からなる群の中のアミノ酸配列中に列挙される。これらの抗体又はその抗原結合断片の特定の例は、ＨＶＣＲ及びＬＶＣＲの以下の組み合わせ：配列番号３０と３１；配列番号３２と３３；配列番号３４と３５；配列番号３６と３７；配列番号３６と３８；配列番号４７と８１；配列番号４８と８２；配列番号４９と８３；配列番号５０と８４；配列番号５１と８５；配列番号５２と８６；配列番号５３と８７；配列番号５４と８８；配列番号５５と８９；配列番号５６と９０；配列番号５７と９１；配列番号５８と９２；配列番号５９と９３；配列番号６０と９４；配列番号６１と９５；配列番号６２と９６；配列番号６３と９７；配列番号６４と９８；配列番号６５と９９；配列番号６６と１００；配列番号６７と１０１；配列番号６８と１０２；配列番号６９と１０３；配列番号７０と１０４；配列番号７１と１０５；配列番号７２と１０６；配列番号７３と１０７；配列番号７４と１０８；配列番号８５と１０９；配列番号８６と１１０；配列番号７７と１１１；配列番号７８と１１２；配列番号７９と１１３又は配列番号８０と配列番号１１４を含む、好ましくはそれらからなる。
当業者なら、本開示の範囲から逸脱することなく、抗体又はその抗原結合断片を特定の用途に合わせるために、本明細書に開示する抗体又はその抗原結合断片に対して様々な改変及び／又は付加を行うことができることを理解するであろう。例えば、抗体又はその抗原結合断片は、Ｃ末端及び／又はＮ末端で、例えば、その重鎖若しくは軽鎖のＣ末端及び／又はＮ末端で追加のアミノ酸によって拡張され、かつ／又はそれらを含むアミノ酸配列を有し得る。そのため、該抗体又はその抗原結合断片は、任意の適切な数の追加のアミノ酸残基、例えば、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含んでもよい。例えば、ポリペプチドの生成、精製、インビボ若しくはインビトロでの安定化、カップリング又は検出を改善し、かつ／又は簡素化するために、各追加のアミノ酸残基を個別又は集合的に付加してもよい。このような追加のアミノ酸残基は、化学的カップリングを目的として付加される１以上のアミノ酸残基を含んでよい。一例がシステイン残基の付加である。追加のアミノ酸残基はまた、Ｈｉｓ６タグ、（ＨｉｓＧｌｕ）３タグ、「ｍｙｃ」（ｃ－ｍｙｃ）タグ又はＦＬＡＧタグなどの、抗体若しくはその抗原結合断片の精製又は検出のための「タグ」を提供してもよい。
本発明の単離抗体又はその抗原結合断片は、それらに限定されないが、全長抗体、ＣＤＲ配列の組み合わせ、一本鎖可変断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）３断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）及びナノボディから選択され得る。
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体又はその抗原結合断片からなる群から選択される。
例えば、標的細胞死又は望ましくないサイトカイン分泌を防ぐために、抗体又はその抗原結合断片によってエフェクター機能を低下又は排除することが望ましい場合がある。これは、抗体又はその抗原結合断片が細胞表面受容体と係合して、受容体リガンド相互作用を防ぐ意図がある場合、すなわち、アンタゴニストの時に特に適し得る。低下したエフェクター機能が保証され得る他の例には、抗体薬物コンジュゲートがオフターゲット細胞毒性をもたらすＦｃ受容体（ＦｃγＲ）と相互作用するのを防ぐことが含まれる。
したがって、一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＦｃγＲとの相互作用を阻害する少なくとも１つのＦｃサイレンシング変異を含む。例えば、ＩｇＧ１アイソタイプクラスに基づく抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇのうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは全３つを含んでよい。
また、ＩｇＧ４アイソタイプの抗体又はその抗原結合断片は、低下したエフェクター機能が望ましい場合に、免疫療法の可能性のある候補と考えられる。ＩｇＧ４抗体は、Ｆａｂアーム交換（ＦＡＥ）として知られる過程を受けることができる動的分子であることが知られており、理論に縛られることなく、これは未知の特異性を有する機能的に一価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）をもたらし、したがって、潜在的に治療効果を低下させると考えられている。これは、ヒト免疫療法に望ましくない薬力学的な予測不能をもたらし得る。
したがって、一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、インビボでのＦａｂアーム交換を防ぐか又は低下させる少なくとも１つの安定化変異を含む。例えば、ＩｇＧ４コアヒンジ領域における単一アミノ酸変異（Ｓ２２８Ｐ）がインビボＦＡＥを防ぐのに十分であることが当技術分野で示唆されている[８]。特定の実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ４アイソタイプサブクラスのものであり、少なくとも１つの安定化変異はＳ２２８Ｐである。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプクラスを有する。特定の実施形態では、アイソタイプクラスはＩｇＧである。例えば、該単離抗体又はその抗原結合断片は、アイソタイプサブクラスＩｇＧ１及びＩｇＧ４からなる群から選択され得る。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、又はその抗原断片である。モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が好ましい。
現在好ましい抗体又はその抗原結合断片は、Ｓ－ＳＬ０４８－１１（本明細書ではクローン１１とも示される、重鎖配列番号１１９及び軽鎖配列番号１２０）、Ｓ－ＳＬ０４８－４６（本明細書ではクローン４６とも示される、重鎖配列番号１２１及び軽鎖配列番号１２２）、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６（本明細書ではクローン１０６とも示される、重鎖配列番号１２３及び軽鎖配列番号１２４）、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６（本明細書ではクローン１１６とも示される、重鎖配列番号１２５及び軽鎖配列番号１２６）並びにＳ－ＳＬ０４８－１１８（本明細書ではクローン１１８とも示される、重鎖配列番号１２７及び軽鎖配列番号１２８）と示される。
これら５つの候補の安定性を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ナノ示差走査蛍光定量（ナノ－ＤＳＦ）、及び差動光散乱法によって評価した。これらのデータを総合ランキングに組み合わせることで、ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ形式で最も安定した候補が候補１０６、１１８及び１１６であると結論付けた。
結合親和性
一実施形態では、本明細書による単離抗体又はその抗原結合断片は、ＫＤ １×１０－７Ｍ以下、好ましくは、ＫＤ １×１０－８Ｍ以下のｈＢＳＳＬに対する親和性を有し得る。例えば、単離抗体又はその抗原結合断片は、ＫＤ ３ｎＭ以下などのＫＤ ５ｎＭ以下のｈＢＳＳＬに対する親和性を有し得る。
実験の節で示すように、単離抗体又はその抗原結合断片は、ＫＤ １.７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７以下又は０．６以下などのＫＤ １.７以下のｈＢＳＳＬに対する親和性を有し得る。一例では、本開示によるｈＢＳＳＬに結合する単離抗体又はその抗原結合断片は、ＫＤ ０．６～１．０、０．７～０．９、０．８～１．６、０．９～１．５、１．０～１．７、１．１～１．６、１．２～１．７、１．３～１．５、１．０～１．４、０．７～１．５、０．７～１．６又は１．０～１．７ｎＭなどのＫＤ ０．６～１．７ｎＭのｈＢＳＳＬに対する親和性を有する。
医薬組成物
用語「医薬組成物」は、その中に含まれる有効成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象に対して容認できないほど毒性のある追加の成分を含まない調製物を指す。本明細書の医薬組成物は、本明細書で定義した抗体、及び／又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片、並びに医薬として許容される担体又は賦形剤を含む。
本明細書で定義した抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片は、本技術分野で公知の手段によって、例えば、錠剤、カプセル剤、水性又は油性溶液、懸濁液、乳剤、クリーム、軟膏、ゲル、鼻スプレー、坐剤、吸入用の細かく分割された粉末又はエアゾールの形態、非経口使用（静脈内、皮下又は筋肉内注入を含む）のために、滅菌水溶液若しくは油性溶液又は懸濁液又は滅菌エマルジョンに製剤化され得る。
そのため、本明細書に記載の単離抗体又はその抗原結合断片、及び少なくとも１種の医薬として許容される賦形剤又は担体を含む組成物が本明細書に提供される。例えば、賦形剤は希釈剤であり得る。一例では、該医薬組成物は、少なくとも１つの追加の活性剤、少なくとも２つの追加の活性剤など、少なくとも３つの追加の活性剤などをさらに含んでもよい。このような組み合わせにおいて有用であることが証明され得る追加の活性剤の非限定的な例は、免疫応答修飾剤である。
「医薬として許容される担体」は、医薬品製剤中で有効成分以外の、対象に対して毒性が無い成分を指す。医薬として許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、医薬として許容される担体には、生理学的に適合性のある任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、経口並びに静脈内、筋肉内、皮下、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適している。
本明細書に開示される医薬組成物は、医薬として許容される抗酸化剤を含み得る。医薬として許容される抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化物質；（２）アスコルビルパルミチン酸塩、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、α－トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；並びに（３）クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が挙げられる。
本開示の医薬組成物に採用され得る適切な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の存在を防ぐことは、殺菌手順と様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの両方の含有によって保証され得る。また、該組成物に糖、塩化ナトリウムなどの等張性剤を含めることも望ましい場合がある。加えて、注射用医薬品形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらされ得る。
医薬として許容される単体には、無菌水溶液又は分散液及び無菌の注入溶液又は分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。医薬活性物質のためのそのような培地及び薬剤の使用は、当技術分野で知られている。
本発明による抗体若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物、抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を投与する手段、及び必要に応じて、使用のための説明書を含むパッケージインサートを含むキットオブパーツも本明細書に提供される。抗体若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物を投与する手段は、例えば、注射器であってよい。用語「パッケージインサート」は、適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌に関する情報及び／又はそのような治療製品の使用に関する警告を含む、治療製品の市販パッケージに慣習的に含まれる説明書を指すために使用される。
単離抗体又はその抗原結合断片の医療用途
本発明による抗体又はその抗原結合断片は、ヒトなどの対象におけるＢＳＳＬの炎症促進効果を効果的に低減するために使用され得る。
本発明の抗体及びその抗原結合断片を用いる利点は、ＢＳＳＬのリパーゼ活性を担うＢＳＳＬタンパク質上の活性部位に結合しないことである。これについては、実験の節で実証し、さらに詳しく説明する。そのため、リパーゼ活性が著しく影響されないので、負の副作用のリスクが減少する。
本発明は、そのため、医薬として用いるための、本明細書で定義される単離抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片、又は医薬組成物を対象とする。
本明細書はまた、炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用するための、本明細書で定義される単離抗体又はその抗原結合断片、又は医薬組成物を対象とする。本発明はまた、炎症性疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、本明細書で定義される単離抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片、又は医薬組成物の使用を対象とする。本明細書はまた、炎症性疾患の治療及び／又は寛解及び／又は予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）及び／又は予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）のための方法を対象とする。本方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の単離抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片、又は医薬組成物を投与することを含む。
異なるインビボモデルは、炎症性疾患の治療及び／又は予防における抗体の及び抗原結合性断片の効果を予測するために使用され得る。典型的には、マウスがこれらのモデルで使用され、異なる物質が、免疫応答を誘発するために注入される。そのような免疫応答に対する抗体又はその抗原結合断片の効果は、そのため、抗体／抗原結合断片の投与後に調べることができる。
使用され得る１つのモデルは、いわゆる「コラーゲン誘発性関節炎」（ＣＩＡ）モデルである。このモデルでは、完全なフロイントアジュバント（ＣＦＡ）のコラーゲンＩＩ型（ＣＩＩ）が、典型的には、不完全なフロイントアジュバント（ＩＦＡ）のＣＩＩのブーストと共に２１日目に注入される。このモデルは、自己免疫性関節炎を誘発する。関節炎は、典型的には、ＣＩＩでの最初の注入の２１～２８日後に現れる。このモデルは、Ｂ細胞及びＴ細胞依存性（適応免疫）である。
別のモデルは、「コラーゲン抗体誘発性関節炎」（ＣＡＩＡ）である。このモデルでは、ＣＩＩ抗体のカクテルが、典型的には５日目にリポ多糖（ＬＰＳ）のブーストと共に注入される。このモデルはＢ細胞及びＴ細胞に依存しない（自然免疫）。ＣＡＩＡモデルを用いた炎症性疾患の治療及び／又は予防における本明細書の抗体及びその抗原結合断片のインビボ有効性を試験するためのプロトコルは、本明細書の実験の節に開示される。
さらに別のモデルは、「グルコース－６－リン酸イソメラーゼ誘発性関節炎」モデルである。グルコース－６－リン酸イソメラーゼ中の配列に相当するペプチドを注入して免疫応答を惹起する。このモデルはＴ細胞依存性である。
別のモデルは、プリスタンが注入される「プリスタン誘発性関節炎」（ＰＩＡ）モデルである。このモデルはＴ細胞依存性である。
また、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を飲料水に入れる「デキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎」モデルが使用され得る。
上記の方法の全ては、当業者にはよく知られている。本方法は、本明細書の抗体又はその抗原結合断片のインビボ有効性を試験するために使用され得る。
本明細書による治療及び／又は予防すべき炎症性疾患は、例えば、慢性炎症性疾患であり得る。炎症性疾患は、局所的又は全身性の炎症性疾患であり得る。
炎症性疾患は、例えば、自己免疫疾患又は自己炎症性疾患であり得る。別の種類の炎症性疾患は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性炎症性疾患である。そのようなＮＫ細胞媒介性炎症性疾患には、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が含まれる。
一実施形態では、炎症性疾患は、ＲＡ、ＪＩＡ、乾癬性関節炎、クローン病又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などのＩＢＤ、脂肪肝（ｌｉｖｅｒ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）とも呼ばれる脂肪肝（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、及び過剰炎症からなる群から選択される。
特定の実施形態では、炎症性疾患は、細菌又はウイルスなどの病原体によって誘発される炎症状態である。そのようなウイルスの例としては、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスが挙げられる。後者のウイルスは、コロナウイルス病２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こす。重度のＣＯＶＩＤ－１９患者は、インターロイキン２（ＩＬ－２）、ＩＬ－７、ＩＬ－６、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ－１０）、単球化学誘引物質タンパク質１（ＭＣＰ－１）、マクロファージ炎症タンパク質１－α（ＭＩＰ－１α）、及びＴＮＦ－αなどのレベルが上昇した様々な炎症性サイトカインを含む全身性過剰炎症に苦しむ場合多い。
ＲＡは、主に関節に影響を与えるが、いくつかの臓器で関節外症状を起こす可能性のある全身性炎症性疾患でもあり得る。したがって、ＲＡは全身性炎症性疾患と考えられ得る。
さらに、本明細書に開示される単離抗体、又はｓｃＦｖ断片などのその抗原結合断片、又は医薬組成物は、コルチコステロイド及び／又は免疫抑制剤及び／又は医薬を投与する必要性を低下させる現在の腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）阻害剤に応答しないか、一時的に応答する患者のための現在の生物学的治療に代わり得る。そのため、本明細書に開示される単離抗体又はｓｃＦｖ断片などのその抗原結合断片の使用は、患者における代替治療投与計画の悪影響及び／又は副作用を止め、かつ／又は低下させ、これは一般的に質的ケアにおいて重要な課題であり、特に若い患者及び子供、並びに免疫抑制された患者及び／又は高齢患者において重要である。
本明細書に開示される単離抗体及び／又はその抗原結合断片又は医薬組成物を用いた治療及び／又は予防は、典型的には受動免疫療法であり、抗体若しくはその抗原結合断片、又はそのような抗体及び／若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物は、それを必要とする対象に投与される。しかし、抗体又はその抗原結合断片を直接投与する代わりに、そのような抗体又はその抗原結合断片を発現することができる遺伝子構築物が対象に投与される遺伝子治療などの他の種類の免疫治療法も採用してよい。
本開示による対象は、いずれのヒト又は非ヒト動物であってよい。用語「非ヒト動物」には、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、羊、犬、猫、馬、牛、鶏、両生類、爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物が含まれる。哺乳動物には、家畜動物（例えば、牛、羊、猫、イヌ、及び馬）、霊長類（例えば、サルなどのヒト及び非ヒト霊長類）、ウサギ、並びにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。用語「対象」は、本明細書において用語「患者」と互換的に使用され得る。該対象はヒトであり得る。
本明細書で使用する「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」などのその文法的変形）は、治療される個人の疾患の自然経過を変えようとする臨床介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過中に行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和（生活の質の向上）、疾患の直接的又は間接的な任意の病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の寛解若しくは緩和、及び緩解又は予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。本発明による抗体又はその抗原結合断片を用いて、疾患の発症を遅らせるか、又は疾患の進行を遅くしてもよい。
「低下」又は「阻害」とは、全体の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。低下又は阻害は、治療されている障害の症状を指すことができる。低下又は阻害はまた、疾患、特に炎症性疾患の発症を遅らせることを包含する。
投与様式
本発明による単離抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片、又は医薬組成物は、例えば、経口、局所、非経口、静脈内、皮下、頬、鼻腔、又は直腸投与によって若しくは吸入によって治療及び／又は予防することが望ましい状態のための標準的な方法で投与され得る。例えば、本明細書に記載の使用のための抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片、又は医薬組成物は、静脈内又は皮下投与などの非経口投与、特に皮下投与用に製剤化され得る。
典型的には、本明細書で定義される単離抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片、又は医薬組成物は、全身的に投与される。投与様式は、例えば、静脈内投与又は皮下投与などによる非経口投与、特に皮下投与であり得る。
投与計画は、治療される特定の疾患及び対象のために調整され得るが、典型的には、本明細書で定義される単離抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片、又は医薬組成物は、他の投与計画も可能であるが、週に１～３回、例えば、週に１～２回、例えば、週に１回投与される。
本発明の抗体、その抗原結合断片、及び／又は医薬組成物はまた、併用療法で、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗炎症剤又は免疫抑制剤と組み合わせた本発明による抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片を含むことができる。併用療法は、逐次投与と同時投与を包含することが理解される。用語「同時」は、投与の少なくとも一部が時間内に重なる２以上の治療薬の投与を指すために本明細書で使用される。したがって、同時投与は、１以上の他の薬剤（複数可）の投与を中止した後に、１以上の薬剤（複数可）の投与が継続する投与計画を含む。
投与計画は、最適な所望の応答、例えば、治療的応答を提供するように調整され得る。例えば、単一ボーラスが投与され得るか、いくつかの分割された用量が時間の経過とともに投与され得るか、又は用量は、治療状況の緊急事態によって示されるように、比例的に低下若しくは増加され得る。投与の容易さと投与量の均一性のための投与単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に都合がよい。
治療有効量の抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片は、個人の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに対象に所望の応答を誘発する抗体又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片の能力などの要因によって変化し得る。治療有効量はまた、投与される物質の毒性又は有害な影響よりも治療上有益な効果が上回る量である。抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片が、典型的には、病態の予防（予防目的）に使用されるが、予防用量は疾患に先立って又は疾患の初期段階で対象に用いられるので、必ずしも予防有効量が治療有効量よりも少ないわけではない。
本発明による抗体、又はｓｃＦｖなどのその抗原結合断片の医薬有効量、すなわち、用量は、典型的には、約０．０００１～１００ｍｇ／宿主の体重ｋｇ、より通常は０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲である。しかし、正確な用量は、例えば、治療又は予防されるべき状態、対象の年齢及び／又は性別、並びに病態を治療若しくは予防することを意図しているかどうかに応じて調整されなければならない。
発現システム
本発明はまた、単離ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドであって、本発明による抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドに関する。
実施形態によるポリヌクレオチドの例は、５つの異なる抗体断片のＨＣ及びＬＣ：Ｓ－ＳＬ０４８－１１ ＨＣ（配列番号１７４；１８５；１９６）及びＬＣ（配列番号１７５；１８６；１９７）、Ｓ－ＳＬ０４８－４６ ＨＣ（配列番号１７６；１８７）及びＬＣ（配列番号１７７；１８８）、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６ ＨＣ（配列番号１７８；１８９；１９８）及びＬＣ（配列番号１７９；１９０；１９９）、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６ ＨＣ（配列番号１８０；１９１；２００）及びＬＣ（配列番号１８１；１９２；２０１）、並びにＳ－ＳＬ０４８－１１８ ＨＣ（配列番号１８０；１９１；２００）及びＬＣ（配列番号１８２；１９３；２０２）並びにＡＳ２０ ＨＣ （配列番号１８３）及びＬＣ（配列番号１８４）並びにＣＤＲグラフト ＨＣ（配列番号１９４）及びＬＣ（配列番号１９５）をコードするＤＮＡ配列を示す配列番号１７４～２０２に示される。
したがって、一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１７４～２０２、及びその任意の組み合わせ及び／又は変異体からなる群から選択される。本明細書で使用する配列番号１７４～２０２のいずれかの変異体は、配列番号１７４～２０２のいずれかで定義されるポリヌクレオチドとして、同じ抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むが、少なくとも１つの同義置換、すなわち、生成されるアミノ酸配列が変更されないような、少なくとも１つの塩基と別の塩基の置換を有し得る。したがって、そのような同義置換は、両方ともアミノ酸残基をコードする、ポリヌクレオチド中のコドンの少なくとも１つの塩基を別のコドンに変える。例えば、配列番号１７４～２０２のいずれかによるポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせは、特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化できる。
本明細書で開示される抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに導入されてもよい。発現ベクターは、そこに導入されるポリヌクレオチドの増加を可能にする。該ベクターは、自己複製核酸構造で、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターであり得る。本発明は、そのため、抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むそのような発現ベクターも対象とする。
発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結された抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、調節エレメントは、プロモーターであるか、又はそれを含む。プロモーターは、タンパク質が結合し、その下流のＤＮＡ（遺伝子）からＲＮＡ分子の転写を開始するＤＮＡの配列である。調節エレメントの別の例はエンハンサーである。エンハンサーは、特定の遺伝子の転写が起こる可能性を高めるために、活性化因子が結合できるＤＮＡの短い領域である。
発現ベクターの例としては、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、プラスミド、エピソームプラスミド及びウイルスベクターが挙げられる。限定されないが例示的なウイルスベクターの例としては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、セムリキフォレストウイルス、ポリオウイルス及びハイブリッドベクターが挙げられる。
発現ベクターは、ポリヌクレオチドを含むベクターの発現及び／又は増加のために宿主細胞に導入され得る。特に、発現ベクターは、対象で発現し、それによって抗体又はその抗原結合断片を対象内で生成することによって炎症性疾患を治療及び／又は予防するのに使用するためのものである。
そのため、発現ベクターを含む宿主細胞も本明細書に提供される。使用される宿主細胞は、真核生物と原核生物の宿主細胞の両方を含む任意の種類の宿主細胞であり得る。宿主細胞は、継代の回数に関係なく、初代形質転換細胞及びそこから派生する子孫を含む「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。
本発明はまた、本発明による抗体又はその抗原結合断片、本発明によるポリヌクレオチド及び／又は本発明による発現ベクターを含む細胞に関する。
該細胞は、細胞株の細胞を含む単離された細胞であり得る。該細胞は、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞などの真核細胞又は非ヒト細胞から選択され得る。
抗体又はその抗原結合断片は、それらの配列を発現ベクターに導入し、宿主細胞内で発現ベクターが抗体又はその抗原結合断片を発現するのを可能にすることによって生成され、その後、生成された抗体又はその抗原結合断片は、例えば、本明細書の他の場所に開示される医療処置の目的又は診断目的のために使用する前に単離／精製される。また、該ベクター自体は、治療対象における抗体又はその抗原結合断片の直接発現のために対象に導入され得る。次いで、発現ベクターは、抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドのプロモーター制御発現を含むことが好ましい。
したがって、本発明はまた、抗体又はその抗原結合断片を生成する方法に関する。本方法は、抗体又はその抗原結合断片が細胞によって発現される条件下で、本発明による発現ベクターを含む本発明による細胞を培養することを含む。一実施形態では、本方法は、必要に応じて、細胞又は細胞が培養される培地から抗体又はその抗原結合断片を単離することを含む。
単離抗体又はその抗原結合断片の診断用途
本発明の抗体又はその抗原結合断片はまた、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及びフローサイトメトリー分析などの標準的な技術を用いて、試料中のｈＢＳＳＬなどのＢＳＳＬの検出に使用することもできる。
本発明の抗体又はその抗原結合断片を用いる利点は、それらがＢＳＳＬの活性部位に結合せず、それによってタンパク質のリパーゼ活性を阻害しないことである。そのため、実験の節で実証されるように、リパーゼ活性に顕著に影響を及ぼすことなく、抗体又はその抗原結合断片を使用して、ＢＳＳＬタンパク質を研究することが可能である。抗体又はその抗原結合断片は、そのため、インビトロ／エクソビボ及び／若しくはインビボでＢＳＳＬタンパク質並びに／又はその酵素活性を研究する際の分子ツールとして有用である。
本発明は、そのため、試料中のｈＢＳＳＬなどのＢＳＳＬの有無を検出する方法及び／又はＢＳＳＬの量を定量するための方法を開示する。本方法は、本発明による単離抗体又はその抗原結合断片と試料を接触させることを含む。本方法はまた、ＢＳＳＬの有無を検出し、ＢＳＳＬに結合した単離抗体又はその抗原結合断片の量に基づいて試料中のＢＳＳＬの量を定量することを含む。検出又は定量は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）又はフローサイトメトリー分析を用いて行ってよい。本発明の抗体又はその抗原結合断片の１つ又は複数、すなわち、少なくとも２種類をそのような検出に用いてもよい。
上記の方法は、エクソビボ法又はインビトロ法の形態であり得る。そのような場合、本方法は、本発明による単離抗体又はその抗原結合断片と試料をエクソビボ又はインビトロで接触させることを含む。
一実施形態では、本方法はまた、ＢＳＳＬを潜在的に含む試料を提供することを含む。
本発明はまた、ＢＳＳＬ関連障害の診断法を開示する。本方法は、ａ）本発明による単離抗体又はその抗原結合断片と試料を接触させること、及びｂ）ＢＳＳＬの有無を検出し、かつ／又はＢＳＳＬに結合した単離抗体又はその抗原結合断片の量に基づいて試料中のＢＳＳＬの量を定量することを含む。検出又は定量は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、ＳＰＲ、ＰＬＡ又はフローサイトメトリー分析を用いて行ってよい。本方法はまた、ｃ）ステップｂ）の結果に基づいて、対象がＢＳＳＬ関連障害を有すると診断されるか否かを結論付けることを含む。
一実施形態では、本方法はまた、ＢＳＳＬ関連障害に罹患していると疑われる対象からの試料を提供することを含む。
特定の実施形態では、本方法は、試料中のＢＳＳＬの定量した量と閾値を比較することを含む。そのような特定の実施形態では、ステップｃ）は、試料中のＢＳＳＬの定量した量と閾値の比較に基づかずに、対象がＢＳＳＬ関連障害を有すると診断されるか否かを結論付けることを含む。例えば、ＢＳＳＬ中のＢＳＳＬの量が閾値を超える場合、対象はＢＳＳＬ関連障害を有するか否かが診断され、結論づけられる。
閾値の値は、特定のＢＳＳＬ関連障害に依存し、特定のＢＳＳＬ関連障害を有すると既に診断された対象から採取された試料中のＢＳＳＬの量を定量することによって、かつ／又は特定のＢＳＳＬ関連障害を罹っていない健康な対象から採取された試料中のＢＳＳＬの量を定量することによって定義することができる。閾値は、特定のＢＳＳＬ関連障害に罹患している対象からのＢＳＳＬのこれらの定量された量に基づいて、好ましくは健康な対象からのＢＳＳＬの定量された量に基づいて決定することができる。
ＢＳＳＬ関連障害は、典型的には、本明細書の他の場所に開示される炎症状態である。炎症状態は、例えば、炎症性疾患、自己炎症性疾患及び／若しくは自己免疫疾患などの慢性又は全身性の炎症性疾患であり得る。炎症状態は、例えば、関節リウマチ、若年性関節炎、乾癬性関節炎、アテローム発生、クローン病、又は潰瘍性大腸炎であり得る。
ＢＳＳＬを潜在的に含む試料は、対象から得られた試料などの任意の種類の試料であり得る。したがって、一実施形態では、試料は生体試料である。そのような生体試料の一例は、体液試料、例えば、血液試料、血漿試料又は血清試料である。生体試料の別の例は、生検などの体組織試料である。試料は、天然試料又はＢＳＳＬを潜在的に含むインビトロ試料であり得る。ＢＳＳＬの検出方法及び／又はＢＳＳＬ関連状態の診断方法には、インビトロ法と、インサイツハイブリダイゼーションなどのインビボ法の両方が含まれる。
本明細書の他の場所で述べたように、該抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化されるか、又は非ヒト骨格上に移植されたそれらのＣＤＲ配列（若しくはそれらの一部）であり得る。後者は、例えば、該抗体及び／又は抗原結合断片に対する負の免疫原性応答を減少させるために、ヒト以外の種におけるＢＳＳＬタンパク質を研究する分子ツールとして該抗体又はその抗原結合断片を用いる場合に有利であり得る。
例示的な実施形態
一実施形態は、ヒトＢＳＳＬ（ｈＢＳＳＬ）などの胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片に関する。該抗体又はその抗原結合断片は、ＢＳＳＬ上の同定された第１のエピトープ及び第２のエピトープの少なくとも１つに結合する。第１のエピトープは、配列番号１によるアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２エピトープは、配列番号２によるアミノ酸配列又は配列番号２と少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、第１のエピトープは、配列番号３によるアミノ酸配列又は配列番号３と少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該抗体又はその抗原結合断片は、第１のエピトープと第２のエピトープの両方に特異的に結合する。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、さらに配列番号４によるアミノ酸配列又は配列番号４と少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、さらに配列番号５によるアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、さらに配列番号６によるアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。
一実施形態は、単離抗体又はその抗原結合断片に関する。該単離抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ）を含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列、若しくは配列番号７と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号８によるアミノ酸配列、若しくは配列番号８と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列、若しくは配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。該単離抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号１０によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、第２のＬＣＤＲは、アミノ酸配列ＡＴＳ、若しくはＡＡＳなどのアミノ酸配列ＡＴＳと少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１１と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
一実施形態では、第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号８、１８及び１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、第１のＬＣＤＲは、配列番号１０及び２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、ＡＴＳ及びＡＡＳからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１、２１及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号１８によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号１０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、アミノ酸配列ＡＴＳを含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号２１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号８によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号１０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、アミノ酸配列ＡＴＳを含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号１９によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号２０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、アミノ酸配列ＡＴＳを含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号２２によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号８によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号２０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、アミノ酸配列ＡＡＳを含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列、若しくは配列番号７と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号２３によるアミノ酸配列、若しくは配列番号２３と少なくとも７７％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列、若しくは配列番号９と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号１６によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、配列番号１５によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１５と少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号２１によるアミノ酸配列、若しくは配列番号２１と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列、若しくは配列番号７と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号２４によるアミノ酸配列、若しくは配列番号２４と少なくとも７７％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列、若しくは配列番号９と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つのＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号２７によるアミノ酸配列、若しくは配列番号２７と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、配列番号２９によるアミノ酸配列、若しくは配列番号２９と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１１と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列、若しくは配列番号７と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号２５によるアミノ酸配列、若しくは配列番号２５と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列、若しくは配列番号９と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号２６によるアミノ酸配列、若しくは配列番号２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、配列番号２８によるアミノ酸配列、若しくは配列番号２８と少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号２２によるアミノ酸配列、若しくは配列番号２２と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列、若しくは配列番号７と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号１２によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１２と少なくとも７７％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列、若しくは配列番号９と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号１４によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１４と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、配列番号１５によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１５と少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１１と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列、若しくは配列番号７と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号１２によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１２と少なくとも７７％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列、若しくは配列番号９と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号１６によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、配列番号１７によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１７と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列、若しくは配列番号１１と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号１２、２３、２４及び２５からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号１４、１６、２６及び２７からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、配列番号１５、１７、２８及び２９からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１、２１及び２２からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号２３によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号１６によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、配列番号１５によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号２１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号２４によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号２７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、配列番号２９によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号２５によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号２６によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、配列番号２８によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号２２によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号１２によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号１４によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、配列番号１５によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲの３つのＨＣＤＲを含む。第１のＨＣＤＲは、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＨＣＤＲは、配列番号１２によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＨＣＤＲは、配列番号９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。この実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＶＲの３つのＬＣＤＲを含む。第１のＬＣＤＲは、配列番号１６によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第２のＬＣＤＲは、配列番号１７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、第３のＬＣＤＲは、配列番号１１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号３０、３２、３４、及び３６又はそれらと少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列からなる群；例えば、配列番号３０、３４及び３６又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群；例えば、配列番号３４及び３６又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号３６によるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
一実施形態では、ＬＣＶＲは、配列番号３１、３３、３５、３７及び３８又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群；例えば、配列番号３１、３５、３７及び３８又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群；例えば、配列番号３５、３７及び３８又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群；例えば、配列番号３７及び３８又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＬＣＶＲは、配列番号３７によるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
一実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号３０、３２、３４及び３６又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、ＬＣＶＲは、配列番号３１、３３、３５、３７及び３８又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号３０、３４及び３６又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、ＬＣＶＲは、配列番号３１、３５、３７及び３８又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。別の特定の実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号３４及び３６又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、ＬＣＶＲは、配列番号３５、３７及び３８又はそれらと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。さらなる特定の実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号３６又はそれと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、ＬＣＶＲは、配列番号３７及び３８又はそれと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３６によるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、並びに配列番号３７又は３８によるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む。該ＨＣＶＲとＬＣＶＲは、アミノ酸配列のペアの配列番号３０と３１；アミノ酸配列のペアの配列番号３２と３３；アミノ酸配列のペアの配列番号３４と３５；アミノ酸配列のペアの配列番号３６と３７；及びアミノ酸配列のペアの配列番号３６と３８からなる群から選択されるアミノ酸配列のペア；例えば、アミノ酸配列のペアの配列番号３６と３７；及びアミノ酸配列のペアの配列番号３６と３８からなる群から選択されるアミノ酸配列のペアと少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列のペアである。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。重鎖可変領域は、アミノ酸配列ＺＨ１－［ＣＤＲ－Ｈ１］－ＺＨ２－［ｅＣＤＲ－Ｈ２］－ＺＨ３－［ＣＤＲ－Ｈ３］－ＺＨ４を含み、ＺＨ１、ＺＨ２、ＺＨ３及びＺＨ４の各々がゼロ、１個又はいくつかの、独立して選択されるアミノ酸残基を表す。一実施形態では、重鎖可変領域は、ｉ）ＺＨ１－［ＧＹＴＦＴＳＹＮ］－ＺＨ２－［Ｘ５３ＧＶＩＸ５７ＰＧＤＧＸ６４ＴＳＹＸ６８ＱＫＦＸ７２］－ＺＨ３－［ＡＲＤＹＹＧＳＳＰＬＧＹ］－ＺＨ４、式中、互いに独立して、Ｘ５３はＩ及びＭから選択され；Ｘ５７はＮ及びＹから選択され；Ｘ６４はＡ及びＳから選択され；Ｘ６８はＡ及びＮから選択され；Ｘ７２は、Ｋ及びＱから選択され、かつｉｉ）ｉ）で定義される配列と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる。軽鎖可変領域は、ＺＬ１－［ｅＣＤＲ－Ｌ１］－ＺＬ２－［ｅＣＤＲ－Ｌ２］－ＺＬ３－［ＣＤＲ－Ｌ３］－ＺＬ４を含むアミノ酸配列を含み、ＺＬ１、ＺＬ２、ＺＬ３及びＺＬ４の各々がゼロ、１個又はいくつかの、独立して選択されるアミノ酸残基を表す。一実施形態では、軽鎖可変領域は、ｉｉｉ）ＺＬ１－［Ｘ２４ＡＳＸ２７ＳＩＳＹＸ３９Ｎ］－ＺＬ２－［ＡＸ５７ＳＸ６６ＬＸ６８］－ＺＬ２－［ＨＱＲＳＳＸ１１５ＰＴ］－ＺＬ４、式中、互いに独立して、Ｘ２４はＳ及びＲから選択され；Ｘ２７はＳ及びＰから選択され；Ｘ３９はＭ及びＬから選択され；Ｘ５７はＡ及びＴから選択され；Ｘ６６はＫ及びＳから選択される；Ｘ６８はＡ及びＰから選択され；並びにＸ１１５は、Ｓ、Ｔ及びＹから選択され、かつｉｖ）ｉｉｉ）で定義される配列と少なくとも８７％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる。
一実施形態では、ＺＨ１は、配列番号３９によるアミノ酸配列又は配列番号３９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＨ２は、配列番号４０によるアミノ酸配列又は配列番号４０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＨ３は、配列番号４１によるアミノ酸配列又は配列番号４１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＨ４は、配列番号４２によるアミノ酸配列又は配列番号４２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＬ１は、配列番号４３によるアミノ酸配列又は配列番号４３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＬ２は、配列番号４４によるアミノ酸配列又は配列番号４４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＬ３は、配列番号４５によるアミノ酸配列又は配列番号４５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、ＺＬ４は、配列番号４６によるアミノ酸配列又は配列番号４６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、抗体は、全長抗体である。
一実施形態では、該抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体からなる群から選択される。
一実施形態では、該抗原結合断片は、一本鎖可変断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）３断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）及びナノボディなどの抗原結合断片である。特定の実施形態では、該抗原結合断片はｓｃＦｖ断片である。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体又はその抗原断片である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合である。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧなどのアイソタイプクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群から選択される。特定の実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、アイソタイプサブクラスＩｇＧ１及びＩｇＧ４からなる群から選択される。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、１以上のＦｃサイレンシング変異を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧ１は、Ｆｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、インビボＦａｂアーム交換を防ぐか又は低下させる１以上の安定化変異を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧ４は、安定化変異Ｓ２２８Ｐを含む。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ｈＢＳＳＬに特異的に結合し、それぞれ配列番号７、配列番号８、及び配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる第１のＨＣＤＲ、第２のＨＣＤＲ及び第３のＨＣＤＲを含むＨＣＶＲドメイン、並びにそれぞれ配列番号１０、アミノ酸配列ＡＴＳ、及び配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる第１のＬＣＤＲ、第２のＬＣＤＲ及び第３のＬＣＤＲを含むＬＣＶＲドメインを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
一実施形態では、第１のＨＣＤＲ、第２のＨＣＤＲ及び第３のＨＣＤＲは、それぞれ配列番号７、配列番号８、及び配列番号９によるアミノ酸配列からなり、かつ第１のＬＣＤＲ、第２のＬＣＤＲ及び第３のＬＣＤＲは、それぞれ配列番号１０、アミノ酸配列ＡＴＳ、及び配列番号１１によるアミノ酸配列からなる。
一実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、ＫＤ１．７ｎＭ以下のｈＢＳＳＬに対する親和性を有する。
一実施形態では、該単離抗体又はその抗原結合断片は、単球、好ましくはＣＤ１４＋単球へのｈＢＳＳＬの結合を変位させることができる。
実施形態は、本発明による単離抗体及び／又はその抗原結合断片並びに医薬として許容される担体若しくは賦形剤を含む医薬組成物に関する。
実施形態は、医薬として使用するための本発明による単離抗体及び／若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物に関する。
実施形態は、炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用するための本発明による単離抗体及び／若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物に関する。
実施形態は、炎症性疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物の製造のための、本発明による単離抗体及び／若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物の使用に関する。
実施形態は、炎症性疾患の治療及び／又は寛解及び／又は予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）及び／又は予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）のための方法に関する。この方法では、治療有効量の本発明による単離抗体及び／若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物が、それを必要とする対象に投与される。
一実施形態では、炎症性疾患は慢性炎症性疾患である。
一実施形態では、炎症性疾患は全身性炎症性疾患である。
一実施形態では、炎症性疾患は自己免疫疾患である。特定の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ又は若年性関節リウマチである。別の特定の実施形態では、自己免疫疾患は、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。
一実施形態では、炎症性疾患は、自己炎症性疾患である。特定の実施形態では、自己炎症性疾患は乾癬性関節炎である。
一実施態様では、炎症性疾患は脂肪肝である。
一実施形態では、該単離抗体及び／若しくはその抗原結合断片、又は該医薬組成物が、全身投与される。
一実施形態では、該単離抗体及び／若しくはその抗原結合断片、又は該医薬組成物は、非経口投与、例えば、皮下投与される。したがって、特定の実施形態では、該単離抗体及び／若しくはその抗原結合断片、又は該医薬組成物は、非経口投与、例えば、皮下投与用に製剤化される。
一実施形態では、該単離抗体及び／又はその抗原結合断片又は該医薬組成物は、週に１～３、例えば、週に１～２回、例えば、週に１回投与される。
一実施形態では、治療及び／又は予防は、受動免疫療法によるものである。
実施形態は、本発明に従って定義される単離抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明による発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
実施形態は、本発明による単離抗体又はその抗原結合断片を生成する方法に関する。本方法は、抗体又はその抗原結合断片の発現、及び該抗体又はその抗原結合断片の単離を許容する条件下で本発明による宿主細胞を培養することを含む。
実施形態は、試料中のＢＳＳＬの有無を検出する方法及び／又はＢＳＳＬの量を定量する方法に関する。本方法は、ａ）ＢＳＳＬを潜在的に含む試料を提供する工程、ｂ）本発明による単離抗体又はその抗原結合断片と試料を接触させる工程、及びｃ）前記試料中のＢＳＳＬの有無を検出し、かつ／又はＢＳＳＬの量を定量する工程を含む。
実施形態は、ＢＳＳＬ関連障害の診断法に関する。本方法は、ａ）ＢＳＳＬ関連障害に罹患していると疑われる対象からの試料を提供する工程、ｂ）本発明による単離抗体又はその抗原結合断片と前記試料を接触させる工程、ｃ）試料中のＢＳＳＬの有無を検出し、かつ／又はＢＳＳＬの量を定量する工程、及びｄ）工程ｃ）の結果に基づいて、対象がＢＳＳＬ関連障害と診断されるか否かを結論付ける工程を含む。
一実施形態では、ＢＳＳＬ関連障害は、慢性炎症性疾患、全身性炎症性疾患などの炎症性疾患；関節リウマチ、若年性関節リウマチなどの自己免疫疾患；クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；乾癬性関節炎などの自己炎症性疾患；又は脂肪肝である。
実施形態は、ＢＳＳＬの酵素活性を決定する方法に関する。本方法は、a)ＢＳＳＬを含む試料を提供する工程、ｂ）本発明による単離抗体又はその抗原結合断片と試料を接触させる工程、及びｃ）試料中のＢＳＳＬの酵素活性を決定する工程を含む。
実施形態は、第１のエピトープ及び第２のエピトープを含むか、又はそれらからなるＢＳＳＬエピトープに関する。第１のエピトープは、配列番号１によるアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。第２のエピトープは、配列番号２によるアミノ酸配列又は配列番号２と少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる第２の表面からなる。
一実施形態では、第１のエピトープは、配列番号３によるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
一実施形態では、該エピトープは、さらに、配列番号４によるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、該エピトープは、さらに、配列番号５によるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、該エピトープは、さらに、配列番号６によるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明は様々な例示的な態様及び実施形態を参照して説明されているが、当業者なら、様々な変更が行われ得ること、かつ本発明の範囲から逸脱することなく、等価物がそれらの要素と置換され得ることを理解するであろう。加えて、その本質的な範囲から逸脱することなく、本発明の教示に特定の状況又は分子を適合させるために多くの改変を行ってよい。したがって、本発明は、企図される特定の任意の実施形態に限定されるものではないが、本発明は、添付の特許請求の範囲内に入る全ての実施形態を含むことが意図される。
実施例
表２－実施例で使用されるＢＳＳＬ材料
Figure 2022540859000003
実施例１－ＡＳ２０ ＩｇＧのヒト及びマウスＢＳＳＬへの結合（ＳＰＲ）
この実施例では、ヒトとマウスの両方のＢＳＳＬへの抗体ＡＳ２０マウス－ＩｇＧ１（ＡＳ２０ ｍＩｇＧ）の結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により調べた。ＡＳ２０ ｍＩｇＧ（重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列番号８０及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列番号１１４）は、ヒトミルクから精製される全長ＢＳＳＬタンパク質（配列番号１３８）に対してマウス内で作製された。マウスＢＳＳＬに対する反応性は不明であった。
材料と方法
ｈＢＳＳＬ及びｍＢＳＳＬ（表２）を、この実施例に記載の実験でＡＳ２０マウスＩｇＧ１（ＡＳ２０ ｍＩｇＧ１）（研究室で生成、ＨＣＶＲ配列番号８０及びＬＣＶＲ配列番号１１４）と共に使用した。
ＳＰＲ測定を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。結合力作用を最小限に抑えるために、抗体をセンサー表面に固定化し、ＢＳＳＬを検体として注入した。ＡＳ２０ ｍＩｇＧ１の固定化を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＣＭ５（カルボキシル化デキストラン表面）センサーチップへのアミンカップリングによって行った。チップを、７分の接触時間で、０．２ＭのＮ－エチル－Ｎ’－［（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と０．０５ＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の１：１混合物を注入することによって活性化した。抗体を１０ｍＭのアセテート－ＨＣｌ ｐＨ５．０（セット１）又はｐＨ６．０（セット２）で１４～５０μｇ／ｍｌに希釈して、５６０～８３０ ＲＵの最終固定化レベルに達するまで０．２～２．８分間注入した。センサー表面に残存する活性化カルボキシル基を、１Ｍのエタノールアミンを７分間注入して不活性化した。
実験の第１のセットでのランニング緩衝液は、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４（１０ｍＭのリン酸、２．５ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ）であった。実験の第２のセットでは、ランニング緩衝液は、２５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌであった。１４６ｍＭのＨ３ＰＯ４を標準再生溶液として使用した。動態研究と非線形回帰分析を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００計測器及び評価ソフトウェアの単一サイクル動態（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｙｃｌｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ（ＳＣＫ））法に従って行った。ｍＢＳＳＬとＡＳ２０ ｍＩｇＧ１の相互作用を、定常状態親和性モデルを用いて解析した。
実験セット１では、それぞれ３００、１００及び５０ｎＭである濃度シリーズ内で３つのＳＣＫ実験を最高のｈＢＳＳＬ濃度で行った。濃度シリーズは、１：３、１：３．１６（ハーフログ）及び１：２希釈で作った。
実験の第２のセットでは、ｈＢＳＳＬをランニング緩衝液で２０ｎＭの開始濃度に希釈し、続いて、同じ緩衝液で１：１の連続希釈を行い、２０ｎＭから１．２５ｎＭの範囲の５点の濃度を得た。ｍＢＳＳＬをランニング緩衝液で２０００ｎＭの開始濃度に希釈し、続いて、同じ緩衝液で１：１の連続希釈を行い、２０００ｎＭから１２５ｎＭの範囲の５点の濃度を得た。
結果
ＡＳ２０ ｍＩｇＧ１は、ヒトとマウスの両方のＢＳＳＬに結合することが判明した。ヒトＢＳＳＬへの親和性は、ナノモル親和性が低いと強かった。相互作用は、１：１の結合モデルによって十分に特徴付けられた（図１）。ＳＣＫ実験の非線形回帰分析からの結合速度定数と解離速度定数及び平衡解離定数を表３に示す。実験の第１のセットでは、測定を三重に行い、そのため、平均と標準偏差が提示されている。
マウスＢＳＳＬも、固定したＡＳ２０ ｍＩｇＧ１と相互作用することが判明したが、ほぼ１００倍弱い親和性であった。親和性を決定するために、定常状態解析を行った（図２及び表３）。
表３－ＡＳ２０ ｍＩｇＧ１とｈＢＳＳＬ、及びＡＳ２０ ｍＩｇＧ１とｍＢＳＳＬの相互作用の動態パラメータ
Figure 2022540859000004
 ＊単一サイクル動態
＊＊定常状態解析
Ｎ．Ｄ 決定せず
１実験の第１のセット
２実験の第２セット
実施例２－ＡＳ２０ ｓｃＦｖの生成及びＡＳ２０ ｓｃＦｖのヒトとマウスのＢＳＳＬへの結合特性（ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ及びＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標））
この実施例では、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＳＰＲ及びＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）によって評価した場合に、ヒトＢＳＳＬに対する結合を保持している、ＡＳ２０ ｓｃＦｖという名称で、ＡＳ２０ ｍＩｇＧ１に基づく一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）バージョン（ＨＣＶＲ 配列番号８０及びＬＣＶＲ 配列番号１１４を含む）を作製した。
材料と方法
小規模生成と精製
グリシン－セリンリンカーを介してＨＣＶＲ（配列番号８０）をＬＣＶＲ（配列番号１１４）に融合させることにより、対応するｓｃＦｖ構築物をコードする遺伝子を形成した。ｓｃＦｖ遺伝子を、Ｃ末端のトリプルＦＬＡＧタグ及びヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグと共にｓｃＦｖの分泌シグナルを提供するｐＨＡＴ－６スクリーニングベクター（ＳｃｉＬｉｆｅＬａｂ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）にサブクローニングした。その後、構築物をＴＯＰ１０大腸菌に形質転換した。溶解した細胞の細菌上清を、α－ＦＬＡＧ抗体コンジュゲート磁気ビーズ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，♯Ｍ８８２３）を用いて精製した。精製したｓｃＦｖを還元条件下でゲル電気泳動により分析し、その純度と完全性を決定し、タンパク質濃度をＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）により決定した。
ＥＬＩＳＡ
非ビオチン化ヒトＢＳＳＬ（ｈＢＳＳＬ）及びビオチン化ヒトＢＳＳＬ（ｂ－ｈＢＳＳＬ）を、一晩４℃で、３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート内で、ＰＢＳ中２つの異なる濃度１μｇ／ｍｌ及び０．５μｇ／ｍｌで直接コーティングするか、又はストレプトアビジンを介してコーティングした。精製したＡＳ２０ ｓｃＦｖを、１μｇ／ｍｌ～４ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ブロッキング緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で３倍連続希釈した。結合の検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートα－ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を介して有効にし、続いて、色素原基質ウルトラ３，３'，５，５'－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ＥＬＩＳＡとインキュベートした。シグナルの発色を１Ｍの硫酸の添加により停止し、吸光度を４５０ｎＭで測定した。
第２のＥＬＩＳＡアッセイでは、１μｇ／ｍｌのヒト及びマウスＢＳＳＬ、並びに陰性対照タンパク質を、３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートに直接コーティングし、一晩４℃でインキュベートした。精製したＡＳ２０ ｓｃＦｖ及び陰性対照ｓｃＦｖを、１μｇ／ｍｌ及び０．２μｇ／ｍｌの２つの異なる濃度で添加した。結合シグナルの検出を上記のように行った。全ての試料を、両方のＥＬＩＳＡ設定で、重複してアッセイした。ｈＢＳＳＬ、ｂ－ｈＢＳＳＬ及びｍＢＳＳＬ（表２）を、この実施例で行った実験においてＡＳ２０ ｓｃＦｖ（研究室で生成、ＨＣＶＲ 配列番号８０及びＬＣＶＲ 配列番号１１４）と共に使用した。
ＳＰＲ測定
ｓｃＦｖクローンの親和性評価を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＳＰＲにより行った。α－ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を、ＮＨＳ－ＥＤＣ化学を用いて一級アミンカップリングを介してＣＭ５ Ｓチップ上に固定化し、その３×ＦＬＡＧタグを介してＡＳ２０ ｓｃＦｖの捕捉を可能にした。ｈＢＳＳＬ及びｂ－ｈＢＳＳＬの２００ｎＭから２ｎＭの５つの異なる濃度で構成される３倍希釈系列をフローセル上に順次注入し、捕獲したＡＳ２０ ｓｃＦｖへの結合を可能にした。表面の再生は、ｐＨ２．２の１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌを用いて酸性条件下で達成した。得られた単一サイクル動態データを、１：１のラングミュア結合モデルに適合させ、動態パラメータのＫａ（１／Ｍｓ）、ｋｄ（１／ｓ）及びＫＤ（Ｍ）は、ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いて取得した。
ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）分析
ビオチン化ｈＢＳＳＬをニュートラアビジン結合ＬＵＭＩＮＥＸＥＸ（登録商標）ビーズとインキュベートし、それぞれ非関連タンパク質とコンジュゲートした３０種類の異なるビーズＩＤと混合した。混合ビーズプールを、アッセイ緩衝液（３％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１０μｇ／ｍｌのニュートラアビジンを補充したＰＢＳ）で１：１０希釈した、細菌上清中に存在するＡＳ２０ ｓｃＦｖとインキュベートした。１つの陽性ｓｃＦｖ対照、すなわち、非関連タンパク質の１つでコーティングしたビーズに結合すると予想されるｓｃＦｖも含めた。特定のタンパク質コンジュゲートビーズへのｓｃＦｖクローンの結合を、Ｒ－ＰＥコンジュゲート抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を介して有効にし、続いて、ＦｌｅｘＭＡＰ ３Ｄ機器にて分析した。
結果
小規模生成と精製
細菌で発現させ、精製したＡＳ２０ ｓｃＦｖのゲル電気泳動は、ｓｃＦｖの予想分子量によく対応する１つの主なタンパク質バンドで高純度を示した（データ示さず）。
ＥＬＩＳＡ
ＡＳ２０ ｓｃＦｖは、非ビオチン化ヒトＢＳＳＬとビオチン化ヒトＢＳＳＬの両方に対して濃度依存的結合を示した（図３ａ）。次いで、特定のｓｃＦｖ濃度でのシグナル強度は、非ビオチン化ＢＳＳＬよりもビオチン化ＢＳＳＬに対する方がはるかに高く、これはコーティング条件の違いによる可能性がある。
ＡＳ２０ ｓｃＦｖもマウスＢＳＳＬに対する結合を示したが、シグナル強度はヒトＢＳＳＬ（図３ｂ）よりもはるかに弱く、マウスＢＳＳＬに対してＡＳ２０ ｓｃＦｖはより弱い親和性を示し得る。陰性対照へのＡＳ２０ ｓｃＦｖの結合は検出されなかった。
ＳＰＲ測定
単一サイクル動態手法を用いて、非ビオチン化ヒトＢＳＳＬ及びビオチン化ヒトＢＳＳＬへのＡＳ２０ ｓｃＦｖの親和性を決定した。ＡＳ２０ ｓｃＦｖは、非ビオチン化ヒトＢＳＳＬ（ＫD＝０．６ｎＭ）及びビオチン化ヒトＢＳＳＬ（ＫD＝０．８ｎＭ）に非常に類似した親和性を示した（表４）。
表４－ＡＳ２０ ｓｃＦｖと天然ｈＢＳＳＬ及びビオチン化ｈＢＳＳＬ間の相互作用の動態パラメータ
Figure 2022540859000005
Ｌｕｍｉｎｅｘ分析
ＡＳ２０ ｓｃＦｖが非関連タンパク質との非特異的相互作用を起こしやすいかどうかを判断するために、ＡＳ２０ ｓｃＦｖを３０種の異なる非関連タンパク質及びその同族標的にて分析するＬｕｍｉｎｅｘアッセイを行った。ＡＳ２０ ｓｃＦｖのみがヒトＢＳＳＬへの結合を示し、アッセイに含まれる他の全てのタンパク質に結合しないか、又は結合が非常に低かった（図４）。
結論
ＡＳ２０ ｓｃＦｖは、非ビオチン化ヒトＢＳＳＬとビオチン化ヒトＢＳＳＬの両方に、サブナノモル範囲の類似の親和性（類似のＫＤ値）で結合することが判明した。非ビオチン化ＢＳＳＬに対する得られたＫＤ値は、全長ＩｇＧ抗体について実施例１で報告されているものとよく一致している。ＡＳ２０ ｓｃＦｖはまた、Ｌｕｍｉｎｅｘベースの手法でアッセイした場合に、３０種の非関連タンパク質に対して低いオフターゲット結合を示した。ＥＬＩＳＡの結果によって示されるように、ＡＳ２０ ｓｃＦｖはマウスＢＳＳＬに対する結合を示し、これは実施例１において全長ＩｇＧについて示された。
実施例３－ＨＴＲＦによるマウスＢＳＳＬへのＡＳ２０ ｓｃＦｖの結合特性
均質な時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）は、それぞれドナーとアクセプターとして知られる２つの異なる分子間の蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）の現象に基づく分光光度法である。この実施例は、ＡＳ２０ ｓｃＦｖとマウスＢＳＳＬの相互作用を特徴付けるための代替方法として、ＨＴＲＦベースの競合アッセイの開発と使用について説明する。
材料と方法
ＡＳ２０ ｓｃＦｖと天然マウスＢＳＳＬの相互作用を研究するために、競合アッセイを開発した。結合の検出は、ｓｃＦｖのＣ末端に位置するＦＬＡＧタグと相互作用するドナー分子テルビウムコンジュゲートα－ＦＬＡＧ抗体（Ｃｉｓｂｉｏ ♯６１１ＦＧ２ＴＬ）及びヒトＢＳＳＬ上のビクチン部分と相互作用するアクセプター分子ストレプトアビジンコンジュゲートＸＬ６６５（Ｃｉｓｂｉｏ ♯６１０ＳＡＸＬ）を介して可能になった。実験を、非ビオチン化タンパク質；ｍＢＳＳＬについては０～５００ｎＭ及びｈＢＳＳＬについては０～８０ｎＭの濃度の範囲を用いて行った。ｈＢＳＳＬ、ｂ－ｈＢＳＳＬ及びｍＢＳＳＬ（表２）を、この実施例で行った実験においてＡＳ２０ ｓｃＦｖ（研究室で生成、ＨＣＶＲ 配列番号８０及びＬＣＶＲ 配列番号１１４）と共に使用した。
２．５ｎＭのＡＳ２０ ｓｃＦｖを、ＢＳＳＬのマウス又はヒトのオルソログと２時間プレインキュベートし、その後、５ｎＭのｂ－ｈＢＳＳＬ及びＦＲＥＴドナー及びアクセプター分子を添加した。最後に、この混合物を室温で１６時間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、結合シグナル（６６５ｎｍ）とバックグラウンド／ノイズシグナル（６１５ｎｍ）を測定した。実験の出力であるデルタＲを、４つの反復と２つのブランクを用いて各点について計算した。
結果
マウスＢＳＳＬが、ＡＳ２０ ｓｃＦｖへの結合についてヒトＢＳＳＬビオチンと濃度依存的に競合することをデータが示した（図５）。同じ観察が、ヒトの天然ＢＳＳＬについて見られた。デルタＲの５０％の低下が、１５０～２００ｎＭのマウスＢＳＳＬ及びおよそ２ｎＭのヒトＢＳＳＬで達成され、ＡＳ２０ ｓｃＦｖは、ヒトオルソログと比較してマウスＢＳＳＬに対しておよそ１００倍低い親和性を有することが示唆された。
結論
得られたデータは、ＡＳ２０ ｓｃＦｖがヒトオルソログと比較してマウスＢＳＳＬに対しておよそ１００倍低い親和性を有することを示した。これは、ＳＰＲを用いて同じクローンの全長抗体フォーマット；ＡＳ２０ ｍＩｇＧ１（実施例１）及びキメラＡＳ２０（実施例４）について得られた親和性と非常に一致していた。
実施例４－キメラＡＳ２０の生成
この実施例では、キメラＡＳ２０を生成する。より具体的には、ヒトＩｇＧ４サブクラスのキメラを構築した。
材料と方法
材料の生成は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に委託した。それぞれ配列番号８０及び配列番号１１４に対応するマウスＡＳ２０抗体の重（ＶＨ）鎖及び軽（ＶＬ）鎖の可変ドメインの配列を用いた。重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を合成し、ヒトＩｇＧ４サブクラスをコードするベクターにクローニングした。構築物をフリースタイル２９３－Ｆ細胞にトランスフェクションし、一過的に発現させた。その後、発現させた抗体を、プロテインＡを用いた親和性クロマトグラフィーによって精製し、続いて、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行い、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）によって純度を決定し、２８０ｎＭで、分光光度計で濃度を測定した。
結果
純度をＨＰＬＣによって９８％超と決定した。キメラＡＳ２０の配列は、重鎖の配列番号１３９及び軽鎖の配列番号１４０であると決定した。
キメラＡＳ２０は、マウス及びヒトＢＳＳＬに対して、実施例１のＡＳ２０マウスＩｇＧ１抗体と同じ結合親和性を保持した（データ示さず）。
実施例５－ＡＳ２０ ＣＤＲグラフト抗体及びＡＳ２０ヒト化ライブラリーの設計と構築
ＡＳ２０は、マウス抗体のＡＳ２０ ｍＩｇＧであり、実施例１を参照されたい。非ヒト抗体は、ヒト免疫応答を誘導することが示されており、これは投与した抗体の中和をもたらすことができ、ひいては疾患の治療における抗体の効果を制限する。この潜在的な問題を克服するために、抗体のヒト化を行った。この実施例に、ＡＳ２０のヒト化のための２つの戦略、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）移植及びライブラリーベースの手法について記載した。得られたＣＤＲグラフト抗体を本明細書ではＡＳ２０ ＣＤＲグラフト又はＣＤＲグラフトと呼び、作製したライブラリーを本明細書ではＡＳ２０ヒト化ライブラリーと呼ぶ。ライブラリーを、その後、ファージディスプレイを用いるＡＳ２０結合ｓｃＦｖ断片の選択及び分離に使用した（実施例６参照）。
材料と方法
図１５Ａ及び図１５Ｂは、重鎖可変領域のコンビナトリアルｓｃＦｖライブラリーの設計の概要であり、図１６Ａ及び図１６Ｂは、軽鎖可変領域のコンビナトリアルｓｃＦｖライブラリーの設計の概要である。
ｓｃＦｖフォーマットは、ＣＤＲグラフトとヒト化ライブラリーの両方の足場として選択した。実施例２で示したデータは、ＡＳ２０ ｓｃＦｖが全長の親のＩｇＧ対応物の結合能を完全に保持していることを示し、ｓｃＦｖ遺伝子がＣＤＲグラフト及びコンビナトリアルライブラリー構築の両方に良好な足場フォーマットとなることが示唆された。
ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域生殖系列遺伝子（ＩＨＧＶ）は、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉ）によると、ＡＳ２０重鎖可変領域に対して最も配列相同性が高く、７３．５％（残基１～１０４）の相同性を有するＩＧＨＶ１－４６を、ＩＨＧＶフレームワークとして選択した。軽鎖配列の選択については、相同性を考慮したが、良好な生物物理学的性質を有する重鎖及び軽鎖のペア形成も考慮に入れた[１０]。まとめると、この結果からヒト生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ１－３９を選択した。またＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎドメイン検索に基づいて、ＩＧＨＪ４とＩＫＶＪ２を、それぞれ完全な可変重鎖ドメインと軽鎖ドメインを得るために結合断片として選択した。
ＡＳ２０ ＣＤＲグラフトを、６つのマウスＣＤＲループをヒト生殖系列遺伝子に移植することによって得た。重鎖の場合、次の領域をＩＧＨＶ１－４６フレームワークに移植した：重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）（配列番号７）；拡張ＨＣＤＲ２（ｅＨＣＤＲ２）（配列番号１４１）；ＨＣＤＲ３（配列番号９）。これにより、配列番号１４４によるＨＣＶＲを有するＣＤＲグラフトが得られた。軽鎖については、次の領域の拡張軽鎖相補性領域１（ｅＬＣＤＲ１）（配列番号１４２）、ｅＬＣＤＲ２（配列番号１４３）及びＬＣＤＲ３（配列番号２１）をＩＧＫＶ１－３９フレームワークに移植し、配列番号１４５によるＬＣＶＲが得られた。グリシン－セリンリンカー（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）を介してＨＣＶＲをＬＣＶＲに融合させることにより、対応するｓｃＦｖ構築物をコードする遺伝子を形成した。ＢｓｉＷＩ制限部位を含めるために、２つの追加のアミノ酸（Ａｒｇ及びＴｈｒ、ＣＬドメインの両方の部分）をＬＣＶＲの末端に付加した。ｓｃＦｖ遺伝子の合成及びサブクローニングを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に外注した。合成後、制限酵素ＳｆｉＩ及びＢｓｉＷＩＩを用いて、ｓｃＦｖ遺伝子を研究室のファージミドにクローニングした。
ＣＤＲグラフトで使用したのと同じＨＣＶＲ及びＬＣＶＲフレームワークを用いて、ＡＳ２０ヒト化ライブラリーの足場を構築した（図６）。ＡＳ２０ヒト化ライブラリーの変異誘発戦略を表５にまとめた。ＨＣＤＲ３は、抗原結合にとって最も重要な領域と考えられる。このループは、ＡＳ２０－ＢＳＳＬ相互作用にも重要である可能性が最も高く、したがって一定に保たれていると判断した。代わりに、多様性のために、他の５つのＣＤＲ領域でＡＳ２０とＡＳ２０ヒト化足場の間で異なる２２個の位置を選択した（図６）。本明細書では、主として二重多様性を試みた。すなわち、ＡＳ２０と、特定の位置でヒト化の足場を構築するヒト生殖系遺伝子に見られる残基を許容した。しかし、追加のアミノ酸を導入することなくＮＮＳオリゴによってアミノ酸の全てのペアを確立できるわけではなく、したがって、６つの位置（ＶＨで３つ：６２、６４、６８及びＶＬで３つ：２７、６６、６８）に追加の化学的多様性を加えた。ＬＣＤＲ３では、代替戦略を取った。本明細書では、ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ｌｉｇｍｄｂ／）に見られるような生殖系列遺伝子ＩＧＶＫ１－３９／ＩＫＶ１Ｄ－３９によってコードされる再配置機能性抗体に見られる多様性を考慮した。より具体的には、ＡＳ２０におけるＬＣＤＲ３の長さである８個のアミノ酸長のＬＣＤＲ３を有する抗体の配列を、導入するための多様性の指針として用いた。得られたコンセンサス配列は、ＱＱＳＹＳＴＰＴ（ａａ１０５～１１７、配列番号１７３）であった。マウスＡＳ２０とヒトコンセンサス配列に基づいて、１０５、１０７及び１０８の位置に二重多様性を導入した。１１５位では、再びＮＮＳオリゴの制限により、４つのアミノ酸を導入した。ＶＪ遺伝子結合過程の結果として、ＬＣＤＲ３における多様性のほとんどは１１６位に見られる。この変動を模倣する試みにおいて、ＮＮＳコドンの使用によっても制限されているが、本明細書では６個のアミノ酸を可能にした（Ｐ、Ｈ、Ｌ、Ｙ、Ｓ及びＦ）。この戦略により、この位置にある抗体の中で見つかった多様性の５０％超を捕捉することができる。全体として、上記の手順により、理論的には約１．２×１０９の異なる変異体の組み合わせ多様性がもたらされる。
表５－ＡＳ２０ヒト化ライブラリーにおける変異誘発の標的となる位置。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの位置は、表の上部と下部にそれぞれ列挙されている。太字で印を付けたアミノ酸はＡＳ２０に見られるものであるが、下線付きアミノ酸はヒト生殖系列遺伝子に見られる対応する多様性である。番号付けは、ＩＭＧＴ命名法によって定義されるとおりであり、コドン定義については、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードを使用する。５つの標的領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）について各々１つのプライマーを用いて多様性を導入した（表６）。
Figure 2022540859000006
基本的に[１１]に記載されるように最適化したクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）変異誘発法を用いてライブラリー足場遺伝子に多様性を導入し、ＡＳ２０ヒト化ライブラリー足場遺伝子（図６）を５つの変異原性オリゴヌクレオチドと共に利用した（表６）。意図した多様性が組み込まれたかどうかを評価するために、ＴＯＰ１０大腸菌細胞を、クンケル変異誘発法によって作製したＤＮＡの少しのアリコートで化学的に形質転換し、９６個のクローンを選択し、配列決定に送った（ＧＡＴＣ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。残りのＤＮＡを、その後ＳＳ３２０細胞(Ｌｕｃｉｇｅｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ)にエレクトロポレーションし、形質転換後に得られた細菌コロニーの数によって測定すると、約１．７×１０１０個のクローンを含む非常に多様なライブラリーが得られた。形質転換ＳＳ３２０細胞を収集し、－８０℃で、１５％グリセロールで保存した。細菌グリセロールストックを用いて、ファージミドとＦ’エピソームの両方に選択的な抗生物質を用いて合計６００ｍｌの２×ＹＴに接種した。細菌を対数期まで増殖させ、次いで、５の感染倍数（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を用いて、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を感染させた。培養物を一晩増殖させ、ｓｃＦｖ提示ファージを標準ポリエチレングリコールＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿により収集した。最終ライブラリーストックを、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を補充したＰＢＳに溶解した。
表６－ＡＳ２０ヒト化ライブラリーの構築に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー。ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードを用いて配列をフォーマットする。
Figure 2022540859000007
結果
ＡＳ２０ ＣＤＲグラフト及びＡＳ２０ヒト化ライブラリー足場をコードする遺伝子を合成し、ｐＨＡＴ４ファージミドベクターにクローニングした。ＡＳ２０ヒト化ライブラリーを最適化したクンケルの手順の使用によって構築し、１．７×１０１０個の形質転換体を得た。９６個の無作為に選択したクローンの配列決定により、意図した多様性の導入を確認した（データ示さず）。
結論
ＡＳ２０ ＣＤＲグラフト及びＡＳ２０ヒト化ライブラリーの構築に成功した。どちらの場合も、ＩＧＨＶ１－４６及びＩＧＫＶ１－３９をヒトフレームワーク足場遺伝子として使用した。ＢＳＳＬへのＡＳ２０ ＣＤＲグラフトの結合を、ｓｃＦｖ（実施例６）及びＩｇＧフォーマット（実施例９及び１１）の両方で評価した。ＡＳ２０ヒト化ライブラリーをファージディスプレイ及び各種結合スクリーニングアッセイによるヒト化ＢＳＳＬ結合ｓｃＦｖ断片の単離に使用した（実施例６）。選択したクローンのいくつかは、同族標的（ヒトＢＳＳＬ）に対する親ＩｇＧと同等の親和性と特異性で結合を示し、マウスオルソログに対してはさらに良好な親和性で結合を示した（実施例９）。選択クローンの配列を解析する場合（実施例１１）、ある位置に特異的な残基が多く含まれることは明らかである。興味深いことに、いくつかの位置（例えば、ＶＨ：６２、６４及びＶＬ：１１５）には、二重多様性を超えるアミノ酸の優先的な選択があり、追加の多様性の導入戦略は成功したことを示す。
実施例６－ヒト及びマウスのＢＳＳＬ上でのファージディスプレイ選択及びそれに続くスクリーニングと配列決定
この実施例では、ファージディスプレイ選択を行い、ヒト及びマウスＢＳＳＬに特異的なｓｃＦｖ断片の単離を可能にした。
材料と方法
抗原
ファージディスプレイ選択の間、標的抗原として、マウスＢＳＳＬ及び非ビオチン化ヒトＢＳＳＬ及びビオチン化ヒトＢＳＳＬを使用した。より具体的には、異なる程度のビオチン化と結合化学を有する２つの変異体を作製した。これらは、ＢＳＳＬ－ｂアミン及びＢＳＳＬ－ｂ糖鎖であった。ｈＢＳＳＬ、ｂ－ｈＢＳＳＬ、ｈＢＳＳＬ－ｂアミン及びｍＢＳＳＬ（表２）を、この実施例でファージディスプレイ選択の標的として用いた。
ファージディスプレイ選択
全ての抗原について、研究室で構築した２つのヒト合成ｓｃＦｖファージライブラリー、ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ２及びＡＳ２０ヒト化ライブラリーを採用する４ラウンドの濃縮を用いてファージディスプレイを行った（実施例５参照）。ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ２は、以前に報告されたもの[１２]と設計及び構造が類似している天然ヒト合成ｓｃＦｖライブラリーである。抗原量を徐々に減少させ、異なるラウンド間で洗浄の回数及び強度を増加させることによって選択圧を増加させた。ヒトＢＳＳＬの２つのビオチン化試料については、ストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，♯１１２０６Ｄ）にそれらを固定化することによって選択を行い、選択過程の大部分の工程はキングフィッシャーフレックスロボット（Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ ｒｏｂｏｔ）を用いて自動化で実行した。９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ♯４４２４０４）上にそれらをコーティングすることによって、天然抗原上での選択を行った。いくつかのトラックでは、交差種反応性ｓｃＦｖについて優先的に選択するために、異なるラウンドでヒトとマウスのＢＳＳＬの間で抗原を交換した。トリプシンを用いて又はヒトＢＳＳＬ上での選択のためのマウスＢＳＳＬを用いる競合溶出、及びその逆によって、ファージの溶出を行った。これらの異なるパラメータの組み合わせにより、ＳｃｉｌｉｆｅＬｉｂ２については合計５つの異なる選択トラック及びＡＳ２０ヒト化ライブラリーについては９つをカバーするスキームをもたらした。収集したファージを、一晩３７℃の寒天プレート上（ラウンド１と２）又は一晩３０℃の溶液中（ラウンド３及び４）のいずれかでＴｏｐ１０Ｆ’大腸菌内で増殖させた。ファージのストックを、過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，♯Ｎ０３１５Ｓ）で感染させ、ＩＰＴＧの添加によって誘導されるｓｃＦｖ発現によって作製した。一晩培養物をＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させ、選択緩衝液に再懸濁し、次の選択ラウンドに使用した。表７にファージディスプレイ選択トラックをまとめる。
表７－ファージディスプレイトラック
Figure 2022540859000008
 １－磁気ＳＡＶビーズ（Ｍ２８０）と結合させたビオチン化ＢＳＳＬ（アミン結合、１０×）上で行った選択
２－磁気ＳＡＶビーズ（Ｍ２８０）と結合させたビオチン化ＢＳＳＬ（炭水化物上、ＢＨ８５２０）上で行った選択
３－免疫チューブの表面にコーティングした天然抗原上で行った選択
４－他の種のＢＳＳＬ（マウス又はヒト）による競合を用いたファージ溶出（トリプシンが他の全ての場合において溶出に使用される）
再クローニング
可溶性ｓｃＦｖの生成を可能にするために、各選択トラックの第３及び第４ラウンドからファージミドＤＮＡを単離した。プールでは、ｓｃＦｖ断片をコードする遺伝子をスクリーニングベクターにサブクローニングし、Ｃ末端にあるトリプルＦＬＡＧタグ及びヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグと共にｓｃＦｖの分泌シグナルを設けた。その後、構築物をＴＯＰ１０大腸菌に形質転換した。
一次ＥＬＩＳＡと配列決定
各選択トラックについて、ラウンド３と４から合計８９～２２２個のコロニーを選び、９６ウェルプレート中で培養し、一晩増殖させた。発現させたｓｃＦｖ（上清）を、それぞれの選択標的の天然形態への結合についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。このスクリーニング過程における実験には、以前に構築され、生成され、ヒトとマウスの両方のＢＳＳＬへの結合に関して特徴付けられたＡＳ２０ ｓｃＦｖを含めた（実施例２参照）。また、ｓｃＦｖとしてのＡＳ２０ＣＤＲグラフトも含めた（実施例５参照）。ＥＬＩＳＡにおいて陽性と考えられるクローンを、ＤＮＡ配列決定（ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に供した。
二次ＥＬＩＳＡ及びＨＴＲＦ
各選択トラックについて同定した全ての配列固有クローンを、ＥＬＩＳＡによる二次スクリーニングでさらに分析した。本明細書では、抗原の数を、天然のヒト及びマウスＢＳＳＬ並びにビオチン化ヒトＢＳＳＬを含むように増加させた。ストレプトアビジンを非関連抗原として使用した。全てのｓｃＦｖの結合もＨＴＲＦ（均質時間分解蛍光測定）によって評価した。
結果
ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ２とＡＳ２０ヒト化ライブラリーを用いて、４つの形態のＢＳＳＬにて、合計１４のファージ選択トラックを並行して行った。８９～２２２個のクローンを１４トラックの各々から選び、分析した。ＥＬＩＳＡ及びＨＴＲＦ結合スクリーニング及び配列決定により、それらが選択されたＢＳＳＬのオルソログに結合することができる合計６８個の固有のｓｃＦｖクローンが得られた。予想外に、ＡＳ２０ ＣＤＲグラフトｓｃＦｖの結合は検出できなかった。
結論
ＥＬＩＳＡによる合計２３６５個のクローンの一次スクリーニングにより、ヒト及びマウスＢＳＳＬに対する潜在的な結合親和性を有する合計４６７個のｓｃＦｖ断片が得られ、これらは配列決定のために送られている。二次ＥＬＩＳＡスクリーニングの後にＨＴＲＦ及び再配列決定を行った結果、合計６８個の配列固有のｓｃＦｖクローンが得られた。これらの結合データから、ヒト及びマウスＢＳＳＬに対するそれらの相対的結合は、これらのオルソログの一方又は両方を認識する特徴を有する３つの群に分けられることが示唆される。
６４個の分離株ｓｃＦｖはＡＳ２０ヒト化ライブラリーに由来し、そのうち４つだけがＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ２に由来した。これは、ＢＳＳＬがナイーブ抗体ライブラリーを用いたファージディスプレイ選択の挑戦的な標的であることを示した。
実施例７－６８個の抗ＢＳＳＬ ｓｃＦｖのＳＰＲによるＥＬＩＳＡ及び親和性ランキング
この実施例では、実施例６で作製した６８個の固有のｓｃＦｖをＥＬＩＳＡで分析し、ＳＰＲを用いた親和性に基づいてさらにランク付けした。以前の結合データ（ＥＬＩＳＡ及びＨＴＲＦ）と共に、これらの結果をさらなる開発のための候補を選択するための決定点として使用した。
材料と方法
ｈＢＳＳＬ及びｍＢＳＳＬ（表２）を、この実施例でＢＳＳＬ試薬として用いた。
ＥＬＩＳＡ
ヒト及びマウスＢＳＳＬをＰＢＳ中１μｇ／ｍｌで、一晩４℃で、３８４－ＥＬＩＳＡウェルプレートにコーティングした。２つの陰性対照タンパク質であるストレプトアビジン及びＢＳＡも含めた。細菌上清に存在するＦＬＡＧタグ付きｓｃＦｖクローンをアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１：２及び１：２０希釈し、コーティングしたタンパク質に結合させた。全ての試料を重複してアッセイした。結合の検出は、ＨＲＰコンジュゲートα－ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ａ８５９２）を介して可能になり、その後、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ♯３４０２９）とインキュベートした。１Ｍの硫酸を添加することによって、比色シグナルの発色を停止させ、プレートを４５０ｎｍで分析した。
ＳＰＲ
動態スクリーニングをＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００バイオセンサー装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて行った。捕捉リガンドとして機能するα－ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｆ１８０４）を、製造業者の推奨に従って、ＣＭ５－Ｓアミンセンサーチップの全４つの表面上に固定した。
細菌上清中に存在するＦＬＡＧタグ付きｓｃＦｖクローンを注入し、チップ表面上に捕捉し、続いて、それぞれ５０ｎＭ及び２００ｎＭでヒト又はマウスＢＳＳＬのいずれかを注入した。表面を１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．２で再生した。全ての実験を、ランニング緩衝液（ヒトＢＳＳＬについてはＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０ ｐＨ７．５及びマウスＢＳＳＬについて２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．５）中で、２５℃で行った。
結果
ＥＬＩＳＡ
直接コーティングしたヒト及びマウスＢＳＳＬへの６８個のｓｃＦｖクローンの結合は、クローンの大部分について確認できた。実施例６で観察されるように、ＢＳＳＬ結合クローンを、ヒトＢＳＳＬ、マウスＢＳＳＬ、又はヒトとマウスの両方のＢＳＳＬのいずれかを認識する特徴を有する３つの群に分けることができる。クローンの大部分は、ヒトＢＳＳＬに対して優先的結合を示す（データ示さず）。
ＳＰＲ
データの解析を、センサーグラムの目視検査によって行った（図示せず）。これらを研究する際に、クローンの大多数はマウスＢＳＳＬに対してよりもヒトＢＳＳＬに対してかなり高い親和性、より低いＫＤ値（Ｍ）を有することが明らかであった。センサーグラムの検査も、ヒト化クローンの多くがＡＳ２０ ｓｃＦｖについて観察されたのと同じ範囲で親和性を示したことを示した。そのようなクローンの例は、Ｓ－ＳＬ０４８－１１（ＨＣＶＲ 配列番号３０及びＬＣＶＲ 配列番号３１を含む）、Ｓ－ＳＬ０４８－１４（ＨＣＶＲ 配列番号５０及びＬＣＶＲ 配列番号８４を含む）、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６（ＨＣＶＲ 配列番号３４及びＬＣＶＲ 配列番号３５を含む）、Ｓ－ＳＬ０４８－１０８（ＨＣＶＲ配列番号７２、ＬＣＶＲ 配列番号１０６を含む）、Ｓ－ＳＬ０４８－１０９（ＨＣＶＲ 配列番号７３及びＬＣＶＲ 配列番号１０７を含む）、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６（ＨＣＶＲ配列番号３６及びＬＣＶＲ 配列番号３７を含む）並びにＳ－ＳＬ０４８－１２５（ＨＣＶＲ 配列番号７７、ＬＣＶＲ 配列番号１１１を含む）である。これらの特定のクローンに対するマウスＢＳＳＬの親和性も、ＡＳ２０に対して見られるものと類似していた。
マウスＢＳＳＬに対してパニングしたファージディスプレイ選択トラック由来のいくつかのクローンは、ヒトＢＳＳＬよりもマウスＢＳＳＬに対して優先的な結合を示し、クローンＳ－ＳＬ０４８－６６（ＨＣＶＲ 配列番号６１及びＬＣＶＲ 配列番号９５を含む）によって例示される。
結論
この実施例で、以前に同定した６８個のｓｃＦｖクローンのＢＳＳＬへの結合をＥＬＩＳＡによって確認した。動態スクリーニングも、単一濃度のヒト及びマウスＢＳＳＬを用いて、全６８個のクローンに対して行った。ＡＳ２０について見られたように、はるかに大部分のクローンは、マウスＢＳＳＬに対してよりもヒトＢＳＳＬに対して解離定数ＫＤ（Ｍ）の平衡として定義されるより高い推定結合親和性を示した。ヒトＢＳＳＬに対する推定親和性は、低いナノモルからナノモルの範囲内にあり、基準ＡＳ２０ ｓｃＦｖは２ｎＭのＫＤ値を示した。ｓｃＦｖクローンの小さなセットは、ヒトＢＳＳＬよりもマウスＢＳＳＬに対してより高い親和性を示し、最高の親和性は４３ｎＭのＫＤ値に対応した。
収集した全てのデータから、３８個のクローン（ＨＣＶＲ 配列番号３０、３２、３４、３６及び４７～７９並びにＬＣＶＲ 配列番号３１、３３、３５、３７、３８及び８１～１１３を含む）並びに基準ＡＳ２０ ｓｃＦｖ（ＨＣＶＲ 配列番号８０及びＬＣＶＲ 配列番号１１４）を、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐへの変換のために選択した。全候補クローンはＡＳ２０ヒト化ライブラリーに由来し、ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂには由来しない。
実施例８－３８個のヒト化ＢＳＳＬ特異的抗体のｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐフォーマットへの変換及び小規模な一過的発現
この実験では、実施例７におけるファージ選択及びその後の結合スクリーニングからの３８個の最も有望なヒト化ｓｃＦｖクローン（ＨＣＶＲ 配列番号３０、３２、３４、３６及び４７～７９並びにＬＣＶＲ 配列番号３１、３３、３５、３７、３８及び８１～１１３を含む）をヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ抗体フォーマットに変換した。加えて、ＡＳ２０（親クローン）（ＨＣＶＲ 配列番号８０及びＬＣＶＲ 配列番号１１４）並びにＡＳ２０ ＣＤＲグラフト（ＨＣＶＲ 配列番号１４４及びＬＣＶＲ 配列番号１４５を含む）も同様にＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐに変換した。
簡単に説明すると、ヒトＩｇＧ４は、ヒトにおいて最もＦｃサイレントな天然ＩｇＧサブクラスであると考えられ、すなわち、抗体のＦｃ部分を介して主要なエフェクター機能を媒介しない。ＩｇＧ１と同様に、ＩｇＧ４は２１日の血清半減期を有する。しかし、ＩｇＧ４は、自然にインビボで半分のＩｇＧ４分子に分離する傾向があり、次いで、他の循環ＩｇＧ４分子と組み合わせることができる。この半分子交換は、ヒンジ領域内に安定化変異、すなわちＳ２２８Ｐ（Ｅｕ番号付け；これはカバット番号付けＳ２４１Ｐと同一である）の導入によって回避することができる[１３]。
３８個のｓｃＦｖクローンＡＳ２０及びＡＳ２０ ＣＤＲグラフトのＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐサブクラスをコードするベクターに正常に移した。ＥｘｐｉＨＥＫ２９３細胞を一過的にトランスフェクトし、抗体を小規模で４ｍｌ）で発現させ、プロテインＡで精製した。純度と完全性／単量体含有量を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した。
材料と方法
配列解析
ＩｇＧ変換のために選択したｓｃＦｖのＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのアミノ酸配列を、抗ハプテン（４－ヒドロキシ－３－ニトロフェニルアセチル、ＮＰ）抗体（抗ＮＰ）と共に表８の配列表に、明確にするために提示する。
表８－この実施例で使用する抗体
Figure 2022540859000009
図１４は、ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐに変換した３８個のヒト化クローン間の配列の違いを示す。ＡＳ２０ヒト化ライブラリーでは、計２０個の位置を、重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２、並びに軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の多様化のために標的とした。比較のために、ＡＳ２０及びＣＤＲグラフト構築物を図に含める。
インフュージョン（Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ）クローニング
３８ＢＳＳＬ特異的ｓｃＦｖ及びＡＳ２０のプラスミドＤＮＡを、標準的なミニプレップ手順により細菌培養物から精製した。ＡＳ２０ ＣＤＲグラフトの遺伝子をＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。ＶＨ領域及びＶＬ領域をＰＣＲ増幅し、インフュージョンＨＤプラスクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ♯６３８９０９）を用いて、研究室で構築したベクターｐＨＡＴ－ｈＩｇＧ４－Ｓ２４１Ｐに挿入した。結果として得られた全長ＩｇＧ配列の代表的な一例は、配列番号１１９に対応するＳ－ＳＬ０４８－１１ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）及び配列番号１２０に対応するＳ－ＳＬ０４８－１１ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）のものである。
ＨＥＫ２９３へのトランスフェクション、発現と精製
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３トランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ♯Ａ１４５２５）を用いて、２４ディープウェルプレート中の４ｍｌ培養物中のｅｘｐｉＨＥＫ２９３細胞へのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションを行った。３７℃、６％ＣＯ２、８０％ｒＨ及び４００ｒｐｍで５日間の培養後、培地の上清をプロテインＡコンジュゲート磁気ビーズと混合し、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ装置で精製した。０．１ＭのグリシンｐＨ２．７での溶出直後に、１ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．８の添加によって中和を行い、９６ウェルスピン脱塩プレートの使用によりＰＢＳへの緩衝液交換を行った。精製したＩｇＧの純度と完全性を決定するためにＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、Ｉｍｐｌｅｎ ＮＰ８０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて濃度を決定した。
結果
インフュージョンクローニング
３８個の固有のｓｃＦｖＳ、ＡＳ２０及びＡＳ２０ ＣＤＲグラフトは、配列決定によって確認すると、全長ヒトＩｇＧ４抗体に正常に変換された。
ＨＥＫ２９３へのトランスフェクション、発現及び精製
この抗体をｅｘｐｉＨＥＫ２９３細胞で発現させ、プロテインＡ精製により上清から精製した。精製したＩｇＧの純度及び完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した（データ示さず）。
結論
全てのＢＳＳＬ結合抗体をｈＩｇＧ４フォーマットにうまく再クローニングし、ＨＥＫ２９３細胞で発現させ、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ装置にてプロテインＡコンジュゲート磁気ビーズによって精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した場合に、全てが許容されるレベルの純度を示した。
実施例９－３８個のｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐクローンのヒト及びマウスＢＳＳＬへの結合
ヒト及びマウスＢＳＳＬへの結合が、ｓｃＦｖからＩｇＧフォーマットに変換された後に保持されることを確認するために行った表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による３８個のｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐクローンの標的結合分析についてこの実施例で説明する（実施例８、表８）。
材料と方法
ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐクローンの動態パラメータを、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるＳＰＲにより決定した。単一サイクル動態を用いて、精製したｈＩｇＧ４分子のヒト及びマウスＢＳＳＬに対する親和性を測定した。抗Ｆａｂ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２８９５８３２５）を、ＮＨＳ－ＥＤＣ化学を用いた一級アミンカップリングによってＣＭ５ Ｓセンサーチップに固定した。ｈＩｇＧ４を抗Ｆａｂ抗体によって捕捉し、その後、５つの異なる濃度のｈＢＳＳＬ（５０ｎＭから始める１：５希釈）又はｍＢＳＳＬ（５００ｎＭから始める１：５希釈）を表面に注入した。センサーチップ表面を１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．１で再生した。表２に列挙したＢＳＳＬ試薬を用いた。ヒトＢＳＳＬへの結合については、単一サイクル動態データを１：１の結合モデルに適合させ、動態パラメータを、ソフトウェアのＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いて取得した。マウスＢＳＳＬについては、各濃度に対する平衡での応答レベルをプロットすることによって定常状態解析を行い、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアによってＫＤ値を取得した。
結果
単一サイクル動態手法を用いて、変換した抗体の非ビオチン化ヒトＢＳＳＬ及びマウスＢＳＳＬに対する親和性を決定した。得られた平衡解離定数（ＫＤ）を表９に列挙する。ｈＢＳＳＬの場合、データは一般に１：１結合モデルにうまく適合した。マウスＢＳＳＬについては、データは必ずしも１：１結合モデルに非常にうまく適合するわけではなかった。代わりに、定常状態解析を用いてデータを解析した。ヒト及びマウスＢＳＳＬへの結合について決定したＫＤ値は、ｓｃＦｖフォーマット内の同じクローンについて決定したＫＤ値と同じ範囲内にあった（実施例７参照）。ＡＳ２０ ＣＤＲグラフトクローンについて、ヒトＢＳＳＬへの低い程度の結合が観察された（データ示さず）。しかし、モデル適合は正確とは見なされないため、この特定のクローンについてのＫＤ値は取得されなかった。
表９－測定した平衡解離定数（ＫＤ）。いくつかの場合では、データの品質が低すぎて信頼性が低いと考えられ、ここでは「ｎ．ｄ.」（決定せず）と示した。
Figure 2022540859000010
結論
全体として、結果は、ヒト及びマウスＢＳＳＬに対する抗体の結合親和性が、ｈＩｇＧ４フォーマットへの再クローニングの影響を受けないことを示す。しかし、ＡＳ２０ ＣＤＲグラフトは異なる挙動をした。実施例６に示すように、ＡＳ２０ ＣＤＲグラフトは、ｓｃＦｖフォーマットで発現させた場合に、ＢＳＳＬへの結合を示さなかった。しかし、ＩｇＧフォーマットでは、ヒトＢＳＳＬへの結合シグナルが観察された。
実施例１０－フローサイトメトリー置換アッセイを用いた２８個のｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐクローンの機能試験
この実施例では、実施例９でヒト及び／又はマウスＢＳＳＬに対する結合親和性が最も高い２８個のｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ抗体（ＨＣＶＲ 配列番号３０、３２、３４、３６、４７、５０～５６、５９～６５、６８、６９、７１～７３、７５、７７及び７８並びにＬＣＶＲ 配列番号３１、３３、３５、３７、３８、８１、８４～９０、９３～９９、１０２、１０３、１０５～１０７、１０９、１１１及び１１２を含む）を、フローサイトメトリーベースの置換アッセイを用いてヒトＢＳＳＬのＣＤ１４＋単球への結合を阻止する能力について試験した。５つの抗体を基準として含めた；ＡＳ２０ ｍＩｇＧ１（ＨＣ 配列番号１３５及びＬＣ 配列番号１３６）、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ４（ＨＣ 配列番号１２９及びＬＣ 配列番号１３０）、ＡＳ２０ ＣＤＲグラフト（ＨＣ 配列番号１３１及びＬＣ 配列番号１３２）、抗ヒトα－シヌクレインｍＩｇＧ１及び抗ＮＰ ｈＩｇＧ４（ＨＣ 配列番号１３３及びＬＣ 配列番号１３４）。
材料と方法
バフィーコートの調製
クエン酸抗凝固剤（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）を補ったバキュテナーチューブに一人に健常ドナーからヒト血液を採取した。白血球と血小板からなるバフィーコートを、スイングアウトバケットローターで、１３００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した後に単離した。
フローサイトメトリー置換アッセイ
異なる濃度（反応あたり０．５μｇ～３．０μｇの範囲；表１０参照）の２８個のＢＳＳＬ特異的ｈＩｇＧ４抗体及び５種の基準抗体を、丸底ポリスチレンチューブ内でｂ－ｈＢＳＳＬ（１反応あたり１μｇ、表２参照）に添加し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を最終体積２０μｌまで添加し、抗体／ｂ－ｈＢＳＳＬ混合物を＋４℃で３０分間インキュベートして、ＢＳＳＬへの抗体の結合を促進させた。次いで、各抗体／ｂ－ｈＢＳＳＬ混合物にバフィーコート（５０μｌ）を添加し、＋４℃でさらに３０分間インキュベーションを続けた。その後、２ｍｌのＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、赤血球を溶解し、白血球を固定するために、細胞を室温で１０分間インキュベートした。次いで、細胞を２００×ｇで５分間遠心分離し、得られたペレットを２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（１％のＦＣＳ及び０．１％のＮａＮ３を補充した１×ＰＢＳ）を添加することによって洗浄し、再び遠心分離した。最後に、上清を廃棄し、細胞を約５０μｌの最後の液滴に再懸濁した。
５μｌのＢＶ４２１－標識抗ヒトＣＤ１４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び５μｌのＢＢ５１５標識ストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を各チューブに添加し、＋４℃で３０分間インキュベートし、光から保護した。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて実行した。最後に、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを解析した。
結果
単球集団を詳しく調べるために、ＣＤ１４＋細胞を最初にゲートアウトした。次いで、ゲーティングしたＣＤ１４＋単球へのｂ－ｈＢＳＳＬの結合をＢＢ５１５標識ストレプトアビジンで検出し、ＢＢ５１５チャネルにおける中央値蛍光強度（ＭＦＩ）として定量した。ＣＤ１４＋単球へのｂ－ｈＢＳＳＬの結合を置換するＢＳＳＬ特異的ｈＩｇＧ４及び基準抗体の能力を、ＢＳＳＬ特異的ｈＩｇＧ４又は基準抗体の濃度を増加させながらインキュベートした後に、単球におけるＢＢ５１５ ＭＦＩの低下として定量した。
表１０－ヒトＣＤ１４＋単球へのＢＳＳＬ結合を阻止する２８個のＢＳＳＬ特異的ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ及び基準抗体の能力。全ての抗体を全ての濃度で試験したわけではないことに留意されたい。
Figure 2022540859000011
結論
ｈＢＳＳＬ（７６ｋＤ）の分子質量はＩｇＧ分子（１５０ｋＤ）の約半分である。したがって、この実施例では、１μｇのＢＳＳＬと２μｇのＩｇＧは、およそ１：１モル比に対応した。最も高い抗体濃度を使用して（反応あたり３μｇ）、２８個のＢＳＳＬ特異的ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ抗体のうちの９個が、ＢＳＳＬ（反応あたり１μｇ）の単球への結合を少なくとも６０％阻害（置換）したことを示した。結合を置換する最も有効な抗体はＡＳ２０ ｍＩｇＧ１であったのに対し、ＡＳ２０ ＣＤＲグラフトｈＩｇＧ４、抗ＮＰ ｈＩｇＧ４及び抗αシヌクレインｍＩｇＧ１は結合に全く影響を与えなかった。
実施例１１－５つの予め指定したｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ抗体及び対照の生成
実施例９で実施した結合アッセイ及び実施例１０のインビトロ機能試験から得られた結果並びに配列内容に基づいて、５つのヒト化ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐクローン、すなわちＳ－ＳＬ０４８－１１、Ｓ－ＳＬ０４８－４６、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６及びＳ－ＳＬ０４８－１１８を、より大規模な生成（１０ｍｇ）のために選択した。
２つの対照；ＡＳ２０、及びＡＳ２０ ＣＤＲグラフトクローンも含めた。加えて、アイソタイプ対照を含めた。この目的のために、抗ハプテン（４－ヒドロキシ－３－ニトロフェニルアセチル、ＮＰ）抗体（クローンＢ１－８）をＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙから注文した。選択したサブクラスフォーマット ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐは、実施例８で以前に３８個のＢＳＳＬ特異的クローンの評価に使用したものと同じである。
材料と方法
抗体の生成
材料の生成を、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）に外注した。７個のクローンのＶＨとＶＬの配列情報をこの会社に送り、そこで遺伝子が合成され、ヒトＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐサブクラスをコードするベクターにクローニングされた。抗体を哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞内で一過的に発現させ、その後、プロテインＡを用いた親和性クロマトグラフィーによって精製した。純度と完全性を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＬＡＬ発色性エンドトキシンアッセイによって決定したエンドトキシンレベルによって評価した。
８個の抗体のアミノ酸配列は表１１に示す配列番号に対応する。
表１１－この実施例で使用した抗体
Figure 2022540859000012
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐクローンの動態パラメータを、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＳＰＲによって決定した。抗Ｆａｂ抗体（ＧＥ ＃２８９５８３２５）を、ＮＨＳ－ＥＤＣ化学を用いた一級アミンカップリングによりＣＭ５ Ｓセンサーチップに固定した。ｈＩｇＧ４抗体を抗Ｆａｂ抗体によって捕捉し、その後、５つの異なる濃度のｈＢＳＳＬ（１：５希釈、０．０８～５０ｎＭ）又はｍＢＳＳＬ（１：２希釈、５０～８００ｎＭ）を表面に注入した。センサーチップ表面を１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．１で再生した。ヒトＢＳＳＬへの結合の場合には、単一サイクル動態データを１：１結合モデルに適合させ、ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いて動態パラメータを取得した。マウスＢＳＳＬの場合には、各濃度に対して平衡での応答レベルをプロットすることによって定常状態解析を行い、ＢＩＡｅｖａｌｕｔｉｏｎソフトウェアによってＫＤ値を取得した。
結果
抗体の生成
２５ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰ８０（ｐＨ６．０）中の８種の抗体の４．６～５ｍｇ／ｍｌの濃度で１０ミリグラムをＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙから受け取った。純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって９８％超であると決定し、エンドトキシンレベルをＬＡＬ発色性エンドトキシンアッセイによって０．０５ＥＵ／ｍｇ未満であると決定した。各クローンの単量体含有量を、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって９８％超であると決定した。
ＳＰＲ
ＳＰＲを用いて、ヒト及びマウスＢＳＳＬに対する抗体の親和性を決定した。表１２に、ｈＢＳＳＬ及びｍＢＳＳＬ結合について予め指定したクローンの異なるＫＤ値をまとめる。比較のために、研究室で生成した同じクローンについて決定したＫＤ値も含める（これらの実験は実施例９に記載する）。
表１２－ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐフォーマットの抗体のＳＰＲ分析結果のまとめ。＊これらの値は、実施例９で報告した実験から得られたものである。＃で印を付けた数は信頼できないと考えられ、注意して見る必要がある。場合によっては、データの品質が低すぎて信頼性が低いと考えられ、ここでは「ｎ．ｄ．」（決定せず）と示した。
Figure 2022540859000013
結論
Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙが生成した５つの予め指定した候補及び３つの対照を、ＢＳＳＬ結合についてＥＬＩＳＡ（データ示さず）及びＳＰＲで分析した。結果から、ＢＳＳＬへの結合が、一般的に、同じＩｇＧフォーマットで、研究室で生成したそれぞれのクローンについて観察されたものと非常に似ていることが示された（実施例９参照）。結果はまた、アイソタイプ対照抗ＮＰ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８ＰがＢＳＳＬに結合せず、今後の分析において陰性対照として使用するのに適していなければならない。これらの抗体バッチの機能性も、置換アッセイで評価した（実施例１０）。実施例１０で報告した異なるクローンについて非常に類似した結果が得られた（データ示さず）。
この実施例で、最初にＣＤＲグラフトの親和性を測定することができた。ここで、ＡＳ２０ ＣＤＲグラフトｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ（ＨＣ 配列番号１３１及びＬＣ 配列番号１３２を含む）は、より高い濃度でｈＢＳＳＬへの明確な結合を示したが、ＡＳ２０ ｈｓＩｇＧ Ｓ２２８Ｐ（ＨＣ 配列番号１２９及びＬＣ 配列番号１３０を含む）と比較して、結合は大幅に低下した。ここで測定した親和性の低下は、ｈＢＳＳＬについては約１００倍であり、ｍＢＳＳＬについては、親和性が低すぎて決定できなかった。そのため、ＣＤＲを新しいフレームワークに移植したときに、標的に対する親和性が顕著に低下した。ｓｃＦｖ ＡＳ２０ ＣＤＲグラフト（ＨＣＶＲ 配列番号１４４及びＬＣＶＲ 配列番号１４５を含む、実施例６参照）と比較して、ＡＳ２０ ＣＤＲグラフトｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐの、観察されたより強いＢＳＳＬ結合は、異なる抗体フォーマットに起因する可能性がある。
実施例１２－５種の候補抗体の安定性試験
この実施例では、抗体の生物物理的安定性を調べるために、ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８ＰフォーマットのＳ－ＳＬ０４８－１１、Ｓ－ＳＬ０４８－４６、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６及びＳ－ＳＬ０４８－１１８の安定性研究について説明する。比較のために、ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ及びｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（実施例１７参照）としてＡＳ２０の両方を含めた。ＡＳ２０ ＣＤＲグラフトｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ及び抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧアイソタイプ対照も含めた。分析をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、分析ＳＥＣ、ナノＤＳＦ、及びＤＬＳによって行った。
材料と方法
安定性試験に含まれる９種の異なる抗体とそれらの対応する配列番号を表１３に列挙する。抗体をバイアルに分注し、２５ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰ８０、ｐＨ６．０中５ｍｇ／ｍｌで、－８０℃、＋４℃、及び＋４０℃でインキュベートした。０日が開始日である表１４のスケジュールに従って、試料を取り出し、分析した。
表１３－この実施例で使用する抗体
Figure 2022540859000014
表１４－試料分析のスケジュール
Figure 2022540859000015
Ａｇｉｌｅｎｔ １１００システムに連結したＢｉｏＳＥＣカラム（３００Ａ、７．８×３００ｍｍ；πＰ．Ｎ．５１９０－２５１１，Ａｇｉｌｌｅｎｔ）を用いて、及び流速１ｍｌ／分で０．１５Ｍのリン酸ナトリウム（ＮａｘＨｙＰＯ４）ｐＨ６．８のランニング緩衝液を用いて分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。Ａ２８０とＡ２２０で吸光度を測定することによりタンパク質を検出した。各試料の２０μｇをカラムにロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、製造業者の説明書に従ってＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳランニング緩衝液（ＩｎＶＩｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０００２０２）を用いて、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ビス－トリスゲル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０３２１ＢＯＸ）を用いて実行した。試料を、還元条件下又は非還元条件下で実行した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ６０６５）を用いてバンドを視覚化し、濃度測定スキャナ（Ｏｄｄｙｓｓｅｙ，Ｌｉ－ｃｏｒ）を用いてバンドを定量した。ウェルあたり各試料５μｇをロードした。
１度／分の傾斜で２０～９５℃の温度勾配を適用するプロメテウス装置（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）を用いてナノＤＳＦ（微分走査蛍光測定）を行った。３００ｎｍ及び３５０ｎｍの蛍光発光を、後方散乱シグナルと同様に記録した。各試料について５ｍｇ／ｍｌの濃度の１０μＬの試料をロードした。データを、Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ社製のＰＲ安定性解析ｖ１．０２を用いて解析した。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて動的光散乱を行った。散乱光を記録し、ＺＳ Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェアｖ １．０．０．４３６と組み込みアルゴリズムを用いて解析した。試料を５ｍｇ／ｍｌで分析した。
結果
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
表１４に示したスケジュールに従って、各試料のクロマトグラムを得た。経時的に現れる追加のピークはより低い分子量のものであり、材料の分解が示唆されることに留意されたい。経時的に合計積分面積をプロットすると、プレフィルター中又はカラム上で材料が失われなかったことが示された。
サイズ排除クロマトグラフィーデータを図７に示す。メインピークで構成される総面積の割合を見ると、＋４℃では小さな変化しか観察できなかった。＋４０℃では、より顕著な効果が見られた。
Ｓ－ＳＬ０４８－４６ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ及び抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧについて最高の減少が観察された。Ｓ－ＳＬ０４８－１１８ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ中のＡＳ２０及びＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧは、中程度の減少を示したが、ＣＤＲグラフトは実質的に減少を示さなかった。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
表１４に概要を示すように、還元条件下及び非還元条件下の点で試料を分析した。－８０℃の試料は、Ｓ－ＳＬ０４８－４６ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ及び抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧを除いて、追加のバンドを示さず、還元条件下で各々１％未満を構成する１つの弱いバンドを示した。これは、０日の試料について観察されたものと同一に近かった。実際、０日の試料は、３０日目に分析した－８０℃で見られなかった追加のバンドを示し、これは分析のばらつきを反映する。非還元試料は、０日の試料と同一に近かった。＋４℃では、還元条件下又は非還元条件下で９日目又は３０日目に追加の顕著なバンドは見られなかった。＋４０℃で、全ての試料は、９日目と３０日目に現れる追加のバンドを示した。還元条件下では、全ての候補が低分子量、すなわち、２５ｋＤより低いバンドを示したが、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ及び抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの全ては、より高いＭｗ（すなわち、９日目と３０日目に５０ｋＤａ超）のバンドを示した。どちらの場合も、これらのバンドは時間の経過とともにより顕著になった。非還元条件下では、全ての試料に追加のバンドが現れ、明確な違いが見られた。この結果は、候補Ｓ－ＳＬ０４８－４６及びＳ－ＳＬ０４８－１０６がより劣化しやすい可能性があることを示唆している。
ナノＤＳＦ
試料を表１４のスケジュールに従って分析し、結果を図８に示す。ナノＤＳＦデータからなされ得る主な観察は、主要な融解温度Ｔｍシフトが＋４０℃での貯蔵時に可視化されるＡＳ２０ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧフォーマット、及び抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧで生じる変化であった。
候補の場合、主な観察は、抗体のＦａｂ部分からの主な寄与を反映し得る第２のＴmの振幅の低下であった（データ示さず）。候補Ｓ－ＳＬ０４８－４６及びＳ－ＳＬ０４８－１０６はわずかにより大きな変化を示し、Ｓ－ＳＬ０４８－１１、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６及びＳ－ＳＬ０４８－１１８は類似しているがわずかにより小さい効果を示した。これらの違いは、全ての候補にとって軽微であると考えられる。ＣＤＲグラフトは、試験した試料の中で最も安定しているように見えた。
動的光散乱（ＤＬＳ）
試料を３０日目にＤＬＳによって分析した。各試料の３つの異なる温度での結果を図９に示す。－８０℃及び＋４℃で、全試料は、単量体抗体の予想結果に沿って約１０～１１ｎｍの見かけの直径を有する１つのピークを示す。いずれの試料でもより大きな粒子は観察できず、すなわち、タンパク質分子のみが検出できた。
＋４０℃で、より大きな粒子は様々な程度で明らかに見られる。Ｚ平均の平均値及び多分散度の数値をサイズ均質性の指標（データ示さず）として用いて、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６は、最低量のより高いＭｗの粒子を示した。対照的に、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ及び抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧは最高数のより高いＭｗの粒子を示し、これら２つの分子がより凝集しやすいことが示された。
結論
結論として、このデータとｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐフォーマットの最も安定した候補の総合ランキングを組み合わせると、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６、Ｓ－ＳＬ０４８－１１８及びＳ－ＳＬ０４８－１１６の順であると思われる。
実施例１３－ＨＤＸ－ＭＳによるＡＳ２０のエピトープマッピング
この実施例では、そのエピトープをマッピングするために、ヒトＢＳＳＬと共にキメラＡＳ２０ ＩｇＧ４抗体に対して水素重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）を実施した。
方法と材料
ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬのヒトＢＳＳＬ（配列番号１３８）溶液４０μＬを、１．７ｍｇ／ｍｌのキメラＡＳ２０ ｈＩｇＧ４抗体９２．５μｌ（ＨＣ 配列番号１３９及びＬＣ 配列番号１４０を含む）と１：１モル比で混合した。ＢＳＳＬ／抗体複合体を、１０Ｋ遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ，Ｍｅｒｃｋ）を用いて４０μＬに濃縮した。並行して、抗体を添加しないＢＳＳＬのみを含む試料を同様に調製した。試料が自動的に標識され、クエンチされ、消化され、洗浄され、２℃で分離される自動ＨＤＸ－ＭＳシステム（ＣＴＣ ＰＡＬ／Ｂｉｏｍｏｔｉｆ ＨＤＸ）で試料を分析した。より具体的には、試料を３μＬのＢＳＳＬ（又はＢＳＳＬ／抗体複合体）と２２μＬの重水素化ＰＢＳと混合し、４つの標識時点：５分、３０分、９０分及び１８０分の間４℃でインキュベートした。６Ｍの尿素、１００ｍＭのＴＣＥＰ及び０．５％のＴＦＡを含む溶液２０μＬを添加して、ｐＨを約２．３に、温度を約４℃に下げることで、標識反応を停止／クエンチした。２５０μｌ／分で固定化ペプシンカラム（２．１カラム（２．１×３０ｍｍ）を用いて試料を消化し、続いて、３５０μｌ／分で３分間、０．０５％ＴＦＡを用いて、２ｍｍのＩ．Ｄ×１０ｍｍ長のＣ－１８プレカラム（ＡＣＥ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎｓ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫ）を用いてオンライン脱塩工程を行った。次いで、９５μＬ／分で作動する２ｍｍのＩ．Ｄ×５０ｍｍ長のＨＡＬＯ Ｃ１８／１．８μｍ分析カラムを用いて、１８分間の０．１％ギ酸中８～５５％のＡＣＮの直線勾配によって消化ペプチドを分離した。分析のために７０,０００解像度、ｍ／ｚ４００で動作するＯｒｂｉｔｒａｐ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。ソフトウェアのＭａｓｃｏｔをペプチド同定に使用し、ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，ＵＳＡ）を用いて、全てのＨＤＸ－ＭＳデータを処理した。統計解析は９５％の信頼区間を用いて行われた。
結果
６６個のペプチドの重水素化動態の後にＨＤＸ－ＭＳを行い、タンパク質の５７．９％がカバーされた。重水素標識（５、３０、９０及び１８０分）並びにＢＳＳＬ単独とＡＳ２０の存在下での差分重水素化取り込み動態を計算した。Ｎ末端に近いいくつかのペプチドは、ＡＳ２０抗体の存在下で統計的により低い重水素取り込みを示し、この領域にエピトープが明確にマッピングされた。重なり合うペプチドを考慮することにより、空間分解能を低減することができ、結果として表１５に示す３つのペプチド領域が生じた。
表１５－ＨＤＸ－ＭＳ実験によって示唆されるＡＳ２０エピトープ領域のリスト
Figure 2022540859000016
結論
まとめると、ＡＳ２０エピトープは、ＢＳＳＬのＮ末端領域に正常にマッピングされた。３つの不連続ペプチド領域のクラスターを、ＡＳ２０の存在下で顕著により低い重水素取り込みで同定した。これらの領域は、ＢＳＳＬの三次元構造に一緒にマッピングされ、これらのペプチドが共にＡＳ２０の立体構造エピトープを構成することが示される。実施例２１では、ｈＢＳＳＬとの複合体中のＡＳ２０ Ｆａｂ断片の結晶構造について説明する。３次元構造の解析により、ＨＤＸ－ＭＳデータからの結果を確認し、相互作用に関与するアミノ酸を具体的に定義することができる。
実施例１４－ＨＤＸ－ＭＳによる予め指定した抗体候補のエピトープマッピング
この実施例では、５つの予め指定した抗体候補であるＳ－ＳＬ０４８－１１ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ（ｍＡｂ１１、ＨＣ 配列番号１１９、ＬＣ 配列番号１２０）、Ｓ－ＳＬ０４８－４６ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ（ｍＡｂ４６、ＨＣ 配列番号１２１、ＬＣ 配列番号１２２）、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ（ｍＡｂ１０６、ＨＣ 配列番号１２３、ＬＣ 配列番号１２４）、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ（ｍＡｂ１１６、ＨＣ 配列番号１２５、ＬＣ 配列番号１２６）及びＳ－ＳＬ０４８－１１８ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ（ｍＡｂ１１，８ ＨＣ 配列番号１２７、ＬＣ配列番号１２８）のＢＳＳＬエピトープをマッピングするために、水素重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）を実施した。
方法と材料
ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬのＢＳＳＬ溶液を、１：１のモル比で異なる抗体（２５ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰ８０、ｐＨ６．０中５ｍｇ／ｍＬ）と混合した。試料を濃縮し、１０Ｋ遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ，Ｍｅｒｃｋ）を用いて緩衝液をＰＢＳに交換した。並行して、抗体を添加しないＢＳＳＬのみを含む試料を、同様の手順に供した。
試料が自動的に標識され、クエンチされ、消化され、洗浄され、２℃で分離される自動ＨＤＸ－ＭＳシステム（ＣＴＣ ＰＡＬ／Ｂｉｏｍｏｔｉｆ ＨＤＸ）で試料を分析した。より具体的には、試料を３μＬのＢＳＳＬ（又はＢＳＳＬ／抗体複合体）と２２μＬの重水素化ＰＢＳと混合し、４つの標識時点：５分、３０分、９０分及び１８０分の間、４℃でインキュベートした。２Ｍの尿素、１００ｍＭのＴＣＥＰ及び０．５％のＴＦＡを含む溶液２０μＬを添加して、ｐＨを約２．３に、温度を約４℃に下げることで、標識反応を停止／クエンチした。２５０μｌ／分で固定化ペプシンカラム（２．１カラム（２．１×３０ｍｍ）を用いて試料を消化し、続いて、３５０μｌ／分で３分間、０．０５％ＴＦＡを用いて、２ｍｍのＩ．Ｄ×１０ｍｍ長のＣ－１８プレカラム（ＡＣＥ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎｓ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫ）を用いてオンライン脱塩工程を行った。次いで、９５μＬ／分で作動する２ｍｍのＩ．Ｄ×５０ｍｍ長のＨＡＬＯ Ｃ１８／１．８μｍ分析カラムを用いて、１５分間の０．１％ギ酸中８～６０％のＡＣＮの直線勾配によって消化ペプチドを分離した。分析のために７０,０００解像度、ｍ／ｚ４００で動作するＯｒｂｉｔｒａｐ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。ソフトウェアのＭａｓｃｏｔをペプチド同定に使用し、ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，ＵＳＡ）を用いて、全てのＨＤＸ－ＭＳデータを処理した。統計解析は９５％の信頼区間を用いて行われた。
結果
５４個のペプチドの重水素化動態の後にＨＤＸ－ＭＳを行い、タンパク質の６４％がカバーされた。重水素標識（５、３０、９０及び１８０分）並びにＢＳＳＬ単独と５つの抗体のいずれかの存在下での差分重水素化取り込み動態を計算した。Ｎ末端に近いいくつかのペプチドは、予め指定した候補の各々について、抗体の存在下で統計的により低い重水素取り込みを示した。重なり合うペプチドを考慮することにより、空間分解能を低減することができ、結果として表１６に示す２つのペプチド領域が生じた。
表１６－ＨＤＸ－ＭＳ実験によって示唆される共通するエピトープ領域のリスト
Figure 2022540859000017
全ての予め指定した抗体に共通するエピトープ領域に加えて、１つの余分なペプチドが、３つの抗体、すなわち、Ｓ－ＳＬ０４８－４６についてはペプチド１０（アミノ酸８４～１０１；ＮＩＷＶＰＱＧＲＫＱＶＳＲＤＬＰＶＭ（配列番号４））、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６についてはペプチド２４（アミノ酸１７４－１８０；ＶＫＲＮＩＡＡ（配列番号５））及びＳ－ＳＬ０４８－１１についてはペプチド３９（アミノ酸２８３～２９５；ＨＹＶＧＦＶＰＶＩＤＧＤＦ（配列番号６））において統計的により低い重水素取り込みを有するとして同定された（表１７）。しかし、これらのシグナルは比較的弱かった。
なお、一次配列では広がっているが、５つの抗体全てに共通する２つのエピトープ領域（アミノ酸１～１２及びアミノ酸４２～５５）は３次元構造中で共にクラスター化する（図１０）。ペプチド２４（アミノ酸１７４～１８０）は、このコア領域に比較的近いが、ペプチド１０（アミノ酸８４～１０１）及び３９（アミノ酸２８３～２９５）はより広がっている。
表１７－ＢＳＳＬ単独と５つの抗体のいずれかの存在下での差分重水素化取り込み動態を有するペプチドの概要
Figure 2022540859000018
結論
５つの予め指定した抗体候補のエピトープをＢＳＳＬのＮ末端領域に正常にマッピングした。２つの不連続ペプチド領域を、５つの抗体の存在下で顕著に低い重水素取り込みと同定した。
重複するペプチドは、空間分解能の低下を可能にすることができる。例えば、ＡＳ２０実験（実施例１３）では、アミノ酸１～６に対応するペプチドは重水素交換で変化がないことが判明したが、より長い重複ペプチドは変化した（ＡＫＬＧＡＶＹＴＥＧＧＦ、アミノ酸１～１２、配列番号３）。言い換えると、エピトープ残基をＹＴＥＧＧＦ（アミノ酸７～１２）（配列番号１）に減らすことができた。対照的に、本実施例では、アミノ酸１～６に対応するペプチドが検出されなかったため、そのような低下を行えなかった。
２つの共通エピトープ領域に加えて、１つの追加のペプチドの各々を、予め指定した候補のうちの３つ（Ｓ－ＳＬ０４８－４６、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６及びＳ－ＳＬ０４８－１１）において可能性のあるエピトープ領域として同定した。統計的に有意であるが、これらのペプチドのシグナル変化の大きさは比較的低く、相互作用にとって重要ではない可能性がある。それでも、ペプチドＶＫＲＮＩＡＡ（アミノ酸１７４～１８０、配列番号５）が３次元空間のコア領域にクラスター化するという事実は、この領域もエピトープの一部であることを示唆し得る。なお、このペプチドはまた、ＡＳ２０の元のマッピングで検出された１つのペプチドとも重なっている。さらに２つの周辺のペプチド１０（アミノ酸８４～１０１、配列番号４）及びペプチド３９（アミノ酸２８３～２９５、配列番号６）のシグナル変化は、抗体結合時の安定化（「アロステリック」効果）によって説明することができる。
まとめると、データは、全ての予め指定した候補について、配列１～１２（配列番号３）及び４２～５５（配列番号２）のどこかの２つのペプチド領域からなる共有される共通コアを強く示唆する。これらの領域は、実施例１３に記載のＡＳ２０の以前のエピトープマッピング実験でも同定され、実施例２１に記載のＡＳ２０複合体の結晶構造における相互作用にとって重要であることが分かる。
実施例１５－免疫原性評価
この実施例では、Ａｂｚｅｎａ社によって行われた候補ＳＬ０４８－１１（ＨＣ 配列番号１１９及びＬＣ 配列番号１２０）、Ｓ－ＳＬ０４８－４６（ＨＣ 配列番号１２１及びＬＣ 配列番号１２２）、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６（ＨＣ 配列番号１２３及びＨＣ 配列番号１２４）、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６（ＨＣ 配列番号１２５及びＬＣ 配列番号１２６）並びにＳ－ＳＬ０４８－１１８（ＨＣ 配列番号１２７及びＨＣ 配列番号１２８）並びにＡＳ２０ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ（ＨＣ 配列番号１２９及びＬＣ 配列番号１３０）の免疫原性評価について説明する。
方法と材料
Ａｂｚｅｎａ社のｉＴｏｐｅ（商標）ＭＨＣクラスＩＩ予測インシリコアルゴリズムを用いて、Ｌｉｐｕｍが提供する配列を免疫原性の可能性について分析した。ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、ペプチドのアミノ酸側鎖と３４個のヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のオープンエンドの結合溝内の特異的結合ポケット（ポケット位置；ｐ１、ｐ４、ｐ６、ｐ７及びｐ９）との間の好ましい相互作用を予測する。これらの対立遺伝子は、あらゆる民族集団で最も一般的に見られるものに起因する重み付けなく、世界中で見出される最も一般的なＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子を表す。対立遺伝子のうちの２０個は「開いた」ｐ１立体配置を含み、１４個は８３位のグリシンがバリンに置き換えられた「閉じた」立体配置を含む。重要な結合残基の配置は、試験タンパク質配列に広がる８個のアミノ酸が重なり合う９ｍｅｒのペプチドのインシリコ作製によって達成される。
結果は、ＭＨＣクラスＩＩ結合の全ての予測方法が、タンパク質／ペプチド処理、Ｔ細胞受容体による認識又はペプチドに対するＴ細胞耐性などの、抗原提示中に他の重要な過程を可能にしないため、本質的にＴ細胞エピトープの数を過剰に予測するという事実を考慮して評価されるべきである。
Ｓ－ＳＬ０４８－１１、Ｓ－ＳＬ０４８－４６、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６、Ｓ－ＳＬ０４８－１１８及びｈＩｇＧ Ｓ２２８ＰフォーマットのＡＳ２０中のｐ１アンカー残基の位置（ＭＨＣクラスＩＩコア９ｍｅｒリガンドの最初の残基を含む）を明らかにした。
ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの５０％以上（すなわち、３４個中１７個以上の対立遺伝子）が高い結合親和性（スコア０．６超）を有する場合、そのようなペプチドを「偶然の高親和性」ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドとして定義した。
スコアが０．５５超（ただし、大多数が０．６超でない）で対立遺伝子の５０％以上が結合するＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを、「偶然の中親和性」と定義した。
３４個中２０個の対立遺伝子の開いたｐ１ポケットが大きな芳香族残基の結合を可能にするｐ１アンカー位置に大きな芳香族アミノ酸（すなわち、Ｆ、Ｗ、Ｙ）が生じる場合には、これらの基準を変更した。これが生じる場合、偶然のペプチドは、２０個の対立遺伝子のサブセットのうちの１０個以上に結合すると定義される。
生殖系列の中程度の及び高い親和性結合ペプチドのｐ１アンカー位置も分析し、これらはＴ細胞耐性が原因で健常個体では問題になることは予想されない。
陽性のｉＴｏｐｅ（商標）ヒットを、既知の陽性ペプチドのＴＣＥＤ（商標）データベースに対してＢＬＡＳＴ検索し、Ｔ細胞エピトープデータベースからの密接に相同なペプチド（すなわち、エクソビボＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングアッセイでＴ細胞活性化を誘導することが知られているペプチド）を表す領域を示した。抗体配列を標識するために、カバット番号付けを使用した。
結果
以前にエクソビボＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞アッセイで試験したペプチドのＴＣＥＤ（商標）分析により、いくつかのｉＴｏｐｅ（商標）ＭＨＣ結合ペプチドに対する強い相同性が明らかになった。表１８では、＋は、置換が類似の物理化学的性質を有するアミノ酸であるミスマッチ残基を示し、－は他のミスマッチ残基を示す。ｉＴｏｐｅ（商標）とＴＣＥＤ（商標）の両方の配列の重要なＭＨＣクラスＩＩポケット位置の位置を表１８の下の行に示す。
表１８－ＴＣＥＤ（商標）分析の結果
Figure 2022540859000019
表１９は、各候補配列についてのｉＴｏｐｅ（商標）での偶然の中程度の及び高い親和性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド及びＴＣＥＤ（商標）ヒットの合計数を示す（ＡＳ２０を参照のみのために示す）。
表１９－免疫原性解析結果の概要
Figure 2022540859000020
全５つの候補のヒト化クローンには、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐと比較して、非生殖系列の偶然のＭＨＣクラスＩＩペプチドがほとんど含まれなかった。全ての変異体配列は、少なくとも２つのＴＣＥＤ（商標）ヒットを含み、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）エクソビボアッセイでＴ活性化を誘導することが知られているペプチドに対して相同性が部分的であった（最小で９個中６個の位置）を含んでいた。５つの変異体のうち、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐは、非生殖系列の偶然の高い及び中程度の親和性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの数に基づいて最低の免疫原性リスクを表した。候補を以下に従ってランク付けした：より少ない偶然のヒット１０６＜４６＜１１＝１１８＜１１６より多い偶然のヒット。
インシリコ免疫原性解析は本質的に過剰に予測することに留意されたい。
実施例１６－製造可能性評価
この実施例では、Ａｂｚｅｎａ社によって行われた候補Ｓ－ＳＬ０４８－１１（ＨＣ 配列番号１１９及びＬＣ 配列番号１２０）、Ｓ－ＳＬ０４８－４６（ＨＣ 配列番号１２１及びＬＣ 配列番号１２２）、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６（ＨＣ 配列番号１２３及びＬＣ 配列番号１２４）、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６（ＨＣ 配列番号１２５及びＬＣ 配列番号１２６）並びにＳ－ＳＬ０４８－１１８（ＨＣ 配列番号１２７及びＬＣ 配列番号１２８）のインシリコ製造可能性評価について説明する。
方法と材料
ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８ＰフォーマットのＳ－ＳＬ０４８－１１、Ｓ－ＳＬ０４８－４６、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６及びＳ－ＳＬ０４８－１１８のアミノ酸配列を、Ａｂｚｅｎａ社のインシリコ信頼度予測アルゴリズムを用いて解析した。その後、特定した信頼度を構造的な内容で解析する。簡単に説明すると、各Ｖドメインの配列について、以下を解析した：
・脱アミド化部位の存在；
・異性化部位の存在；
・可能性のある酸化部位；
・Ｎ結合型グリコシル化部位の存在；
・遊離システインの存在。
本明細書において、ＩＭＧＴ ＣＤＲ定義及び番号付けを、特に示さない限り全体にわたって使用する。
脱アミド化部位の存在
アスパラギン残基の脱アミド化は、構造変化、薬物動態の変化及び有効性並びに可能性のある免疫原性につながり得る。可能性のある脱アミド化部位としてのアスパラギン残基を、[１４]に基づく方法を用いてアミノ隣接アミノ酸とカルボキシ隣接アミノ酸の両方の内容で分析した。
異性化部位の存在
アスパラギン酸異性化部位を、ＣＤＲ領域に焦点を当てた既知の異性化モチーフ（ＤＧ、ＤＳ、ＤＴ又はＤＤ）の配列を解析することによって予測した。
可能性のある酸化部位
重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインの構造モデルを作製し、メチオニン及びトリプトファン残基を同定し、それらが曝露される表面であるため、酸化の候補である可能性があるか否かを判断するために評価した。個々の残基の酸化は、抗体の生物活性に影響を与え、生物学的影響、例えば、有効性の低下又は薬物動態の変化を有する可能性がある。
Ｎ結合型グリコシル化部位の存在
ＶＨ及びＶκ配列を、コンセンサスＮ結合型グリコシル化モチーフ：－Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ－（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり得る）に基づいて解析した。
遊離システインの存在
配列を解析し、非対システイン残基を同定した。ＶＨ及びＶκドメインは各々、典型的には、折り畳まれた分子に鎖内ジスルフィド結合を形成する２つの基準のシステインを含む。追加のシステインは、折りたたみに有害であり、凝集などの問題を引き起こす可能性があると予想される。
結果
解析を行い、５つの候補抗体のＶＨ又はＶκ配列のいずれかの中には可能性のあるＮ結合型グリコシル化部位が同定されなかった。５つの候補抗体のＶＨ又はＶκ配列のいずれかの中には非対システインは同定されなかった。５つの候補抗体のＶＨ又はＶκ配列の中には可能性のある酸化部位は同定されず、５つの候補抗体のいずれに対してもＶＨ又はＶκの中には、脱アミドの可能性が高い（Ｔ１／２＜１０日）又は中程度（Ｔ１／２＜２５日）の部位は同定されなかった。
ＣＤＲ又はＣＤＲに近い領域内の全５つのクローンについて、ＶＨ内で２つの可能性のある異性化部位を同定した。
・Ａｓｐ５４（ＤＧ）は、ＶＨ ＣＤＲ２内に位置しているので、異性化は抗原結合に影響を与える可能性がある。
・Ａｓｐ７２は、時々「ＣＤＲ４」とも呼ばれる領域のＣＤＲの近くに位置するので、異性化は抗原結合に影響を及ぼす可能性がある。
表２０－配列の信頼度の概要
Figure 2022540859000021
 翻訳後に信頼度が明らかにされる可能性を有するＳ－ＳＬ０４８－１０６ Ｆｖの代表を図１１に示す。
要約すると、５つのリード候補のいずれにも、遊離システイン、酸化部位又はＮ結合型グリコシル化部位は同定されなかった。Ｓ－ＳＬ０４８－１１、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６又はＳ－ＳＬ０４８－１１８では、可能性が高い脱アミド化部位は同定されなかった。Ｓ－ＳＬ０４８－４６及びＳ－ＳＬ０４８－１０６は、ＶＨＣＤＲ２内の可能性のある脱アミド化部位を含む。５つのリード変異体の各々の重鎖内に２つの可能性のある異性化部位を同定した。
実施例１７－ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ及び抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの生成並びに結合特性
この実施例では、以下でＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（ＨＣ 配列番号１１５及びＬＣ 配列番号１１６を含む）並びに抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（ＨＣ 配列番号１１７及びＬＣ 配列番号１１８を含む））と呼ばれるヒトＩｇＧ１－ＬＡＬＡ－ＰＧサブクラスのＡＳ２０及び抗ＮＰ（クローンＢ１－８）抗体の生成及び結合特性について説明する。抗ＮＰ抗体をアイソタイプ対照として含めた。
材料と方法
発現と精製
ＩｇＧ４は、最もＦｃ不活性な天然のヒトサブクラスである。しかし、いくつかの出版物は、ＩｇＧ４がマウス[１５]及びヒトにおいてＦｃＲ及び補体と相互作用できることを示している。したがって、利用可能な最もＦｃサイレントな変異体であること、すなわち免疫エフェクター機能を有していないことが報告されているので[７、１６]、３つの位置、すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（略してｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ）に変異を有するヒトＩｇＧ１をこの研究で選択した。
材料の生成は、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）に外注した。ＡＳ２０のＶＨ及びＶＬの配列情報をこの会社に送り、そこで遺伝子が合成され、ヒトＩｇＧ１－ＬＡＬＡ－ＰＧサブクラスをコードするベクターにクローニングされた。該抗体を哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞で一過的に発現させ、その後プロテインＡを用いて親和性クロマトグラフィーにより精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって純度と完全性を評価し、エンドトキシンレベルをＬＡＬ発色性エンドトキシンアッセイによって決定した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
単一サイクル動態を用いて、抗体の親和性を測定した。ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ及び抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧを、ＮＨＳ－ＥＤＣ化学を用いた一級アミンカップリングによってＣＭ５ Ｓセンサーチップ上に固定した。５つの異なる抗原濃度（ｈＢＳＳＬの場合は５０ｎＭから始まる１：３希釈、ｍＢＳＳＬの場合は８００ｎＭから始まる１：２希釈）を表面に注入した。センサーチップ表面を１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．１で再生した。得られた単一サイクル動態データをＬａｎｇｍｕｉｒ １：１の結合モデルに適合させ、ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いて動態パラメータを取得した。ｍＢＳＳＬの場合、各濃度に対する平衡での応答レベルをプロットすることによって定常状態解析も行い、ＫＤ値をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアによって取得した。
結果
ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ及び抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの生成に成功した（データ示さず）。
ＩｇＧの親和性を決定するために、単一サイクル動態ＳＰＲ手法を用いた。ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧのｈＢＳＳＬへの結合について、０．９１ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。ｍＢＳＳＬについては、ＫＤは３６１ｎＭと決定した。予想通り、抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧについて、ＢＳＳＬへの結合は見られなかった。
結論
この実施例では、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧが機能していること、すなわち、ＢＳＳＬへの結合が、ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８ＰフォーマットのＡＳ２０のそれと同等であることを確認するために実行される品質チェックについて説明する。
ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧのＳＰＲ分析により、ＢＳＳＬへの結合が他のＩｇＧフォーマットのＡＳ２０について観察されるものと非常に似ていることが示された。ｈＢＳＳＬのＫＤをＳＰＲによって０．９１ｎＭであると決定し、これは、ＡＳ２０の他のＩｇＧフォーマットについて決定した０．６ｎＭ～３ｎＭのＫＤ値に匹敵する（実施例１、２及び４に記載）。定常状態親和性分析で、ｍＢＳＳＬに対するＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの親和性は３６１ｎＭのＫＤ値であると推定され、これは、同じ分析によって以前に推定されたＫＤと同じ桁（１５５ｎＭ、実施例１）であり、センサーグラムの外観は類似していた（示さず）。
そのため、データから、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの結合がサブクラスの変化によって影響を受けないことが示された。結果はまた、アイソタイプ対照抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧがＢＳＳＬに結合せず、したがって、将来の分析で陰性対照として使用するのに適し得ることを示した。
実施例１８－関節リウマチのマウスモデルにおけるＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの有効性検証
この実施例では、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（重鎖配列番号１１５及び軽鎖配列番号１１６）の効果を、関節リウマチ（ＲＡ）、すなわちコラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ）のインビボマウスモデルで調べた。抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ抗体（重鎖配列番号１１７及び軽鎖配列番号１１８）をアイソタイプ対照として研究に含めた。
モデルの説明－マウスのＣＡＩＡ
マウスにおけるコラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）は、Ｂ細胞とＴ細胞の両方に依存しない関節炎モデルである。疾患は、静脈内（ｉ．ｖ．）投与されるコラーゲンＩＩ型（ＣＩＩ）に対する抗体で誘導され、その後、疾患の発症を促進するために、３～５日後にＬＰＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。注入された抗体は軟骨に結合し、それによって免疫系を活性化し、関節にマクロファージ及び顆粒球を集める。ＬＰＳのブースト注入は、顕著な重症度及び疾患の発生率に達するのに必要とされる。疾患過程は非常に予測可能であり、ＬＰＳブースト後に開始される。該疾患は、１５日目頃に最大の重症度に達し、その後、最終的に治癒するまで重症度が減少する。この研究は、地元の動物倫理委員会Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ」（Ｍ１１８－１５）によって承認された。
材料と方法
疾患の誘導
ＤＢＡ／１マウス（雄、８～９週）に、０日目に、２ｍｇ／マウスのモノクローナル抗ＣＩＩ抗体（ＣＩＡ－ＭＡＢ－５０、ＭＤ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）のカクテルをｉ．ｖ．注入した。５日目に、マウスに、疾患を促進するためにＬＰＳ（５０μｇ／マウス）をｉ．ｐ．注入した。
実験グループと試験品の投与
ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ及びアイソタイプ対照抗体を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で送達し、さらにビヒクル（２５ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰ８０、ｐＨ６．０）で希釈した。試験品（抗体）を、疾患の誘発の１日前（－１日）から始め、次いで、３日目、７日目、１１日目及び１５日目の４日毎にｉ．ｐ．投与した。－２日目の動物の平均重量に基づいて、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧを、３つの異なる用量、すなわち、１０、３０及び９０ｍｇ／ｋｇで、並びにアイソタイプ対照（抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ）を９０ｍｇ／ｋｇで投与した。実施例１７に記載のように、ヒトＢＳＳＬと比較してマウスＢＳＳＬに対するＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの低い親和性を補うために、比較的高用量を選択した。実験グループを表２１にまとめる。－１日目の最初の投与をボーラス用量、すなわち、全ての試験品を２回の注射に分けて二重投与として与え、最初の注入を午前中に行い、第２の注入を午後に行った。以下の投与（３日目、７日目、１１日目及び１５日目）を単回用量として行った。各投与前に動物を秤量し、用量体積２０ｍｌ／ｋｇは動物の個々の重量に基づいていた。
表２１－実験グループ
Figure 2022540859000022
疾患評価
０～１５の範囲の４本の手足の肉眼でのスコア化システム（腫れた又は赤いつま先の場合は１ポイント、腫れた若しくは赤い中足の指又は指関節の場合は１ポイント、腫れた足首の場合は５ポイント）を用いて、３日目から盲検方法で疾患を毎日評価し、各マウスの最大合計スコアは６０になった。倫理的な制限により、スコアが４５を超える動物を実験から取り除いた。
血液採取
１９日目の研究中止日に、深部麻酔下での心臓穿刺によって（１５日目の最後の注射の９６時間後）全てのマウスから、ＬｉＨｅｐａｒｉｎを含むマイクロチューブに採血した。試料を、すぐに氷上に置き、採血から２０分以内に遠心分離した（４℃で５分間、２０００×ｇ）。血漿試料を一定分量に分け、ドライアイス上で凍結させた。ＡＳ２０ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ曝露及び抗薬物抗体（ＡＤＡ）（全てのグループ、ｎ＝７０）及び一連の安全バイオマーカー（グループ１～３、ｎ＝４２）の分析まで、一定分量を－８０℃で保存した。
サテライト動物のＰＫ採取
ＰＫプロファイルとＡＤＡに関する情報を得るために、抗体処理動物の投与グループあたり２匹のサテライト動物を含めた。血液試料を、７日目の投与の１時間前及び投与後２４時間の時点（すなわち、８日目）に舌下静脈から採取した（投与グループあたり２匹の動物）。血液試料も、１５日目の投与の１時間前及び投与後２４時間の時点（すなわち、１６日目）に採取した（投与グループあたり２匹の動物）。
組織収集
研究中止の際、全ての動物から脾臓を摘出し、秤量した。アイソタイプ対照治療グループ（グループ２）からの１４の脾臓及び９０ｍｇ／ｋｇのＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧグループ（グループ３）の１４匹の動物からの脾臓を均質化し、実施例１９に記載のようにＦＡＣＳによって分析した。
血漿中の薬物暴露
液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて、研究中止（１９日目）の際にサテライト動物（上記参照）及び全ての動物から収集した血漿試料におけるＡＳ２０ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの曝露を分析した。
抗薬物抗体（ＡＤＡ）
研究中止（１９日目）の際に、サテライト動物（上記参照）から及び全ての動物から収集した血漿試料中のＡＤＡを分析することによって免疫原性評価を行った。
ＡＤＡを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。簡単に説明すると、マキシソーププレートをＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－２０又はアイソタイプ対照抗体でコーティングし、１×ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０でブロッキングした。血漿試料、又は陽性対照抗体でスパイクしたマウスの血漿を添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、二次抗体ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、室温で１時間インキュベーションした後に、プレートを十分に洗浄し、最終的にＴＭＤ基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を検出に使用した。
安全バイオマーカーの測定
グループ１（ビヒクル対照）、グループ２（アイソタイプ対照、９０ｍｇ／ｋｇ）及びグループ３（ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ、９０ｍｇ／ｋｇ）から収集した血漿試料を、１４種の安全バイオマーカー（アルブミン、アラニンアミノトランスファーゼ、アルカリホスファターゼ、アミラーゼ、ビリルビン、血中尿素窒素、カルシウム、クレアチニン、グロブリン、グルコース、リン酸、カリウム、ナトリウム及び全タンパク質）の臨床化学的方法を用いて分析した。カセット＃５００－００３８とＡｂａｘｉｓ Ｖｅｔｓｃａｎシステムを用いて、化学物質及び医薬品安全部署、ＲＩＳＥ，Ｓｏｄｅｒｔａｌｊｅ，Ｓｗｅｄｅｎで分析を行った。
結果
関節炎の重症度
ＣＡＩＡ誘導動物及びビヒクル治療動物は、１００％の発症率で中程度から重度の疾患を発症した。同様の結果が、アイソタイプ対照治療動物で見られた。－１日目から終了まで４日毎にｉ．ｐ．投与したＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの有効性を、３つの用量（１０、３０及び９０ｍｇ／ｋｇ）で評価した。９０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇのＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧは、それぞれ７～１４、１６、１８及び７～１２日目にアイソタイプ対照と比較して疾患に対して著しい寛解効果を示した。ビヒクルと比較すると９０ｍｇ／ｋｇで投与したＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧにおいて、統計的に有意ではないものの、疾患重症度のわずかな減少が見られた（図１８及び１９）。
ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ １０ｍｇ／ｋｇグループの１匹、アイソタイプ対照グループの１匹の２匹の動物を、倫理的理由（ハイスコア）のために終了前（１２日目）に取り除いた。これらの動物は、最大スコアに含めたが、平均、ＡＵＣ及び％阻害から除外した（図１９、表２２）。
疾患パラメータの統計を表２２にまとめる。
表２２－ＣＡＩＡ重症度パラメータの統計
Figure 2022540859000023
 １累積発症率。スコア化の連続２日に１以上のポイントを獲得した場合に、マウスは疾患を発症したとみなした。２全てのスコア化時点での平均ＣＡＩＡスコア。３曲線下面積。４アイソタイプ対照治療グループに対する各動物における疾患全体の負荷の変化の割合。アイソタイプ対照グループの平均ＡＵＣと各個々の動物のＡＵＣの差を求め、アイソタイプ対照グループのＡＵＣで割って、１００をかけて計算した＊（－１）。アイソタイプ対照と比較して＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
健康評価
一般的な健康評価を、３日目から終了まで、疾患の評価と併せて毎日実施した。マウスを、一般的な健康評価の一環として週に２回秤量した。動物において治療による有害作用は認められなかった（データ示さず）。
血漿中の薬物暴露
１９日目の研究終了時のＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの血漿暴露は、以前の単一用量薬物動態評価に基づいて全体的に予想される濃度範囲内にあった。１０ｍｇ／ｋｇ用量グループの平均濃度は１９９μｇ／ｍＬ（約１．３μＭ、５８～３０９μｇ／ｍＬ）であり、３０ｍｇ／ｋｇ用量グループの場合は６１４μｇ／ｍＬ（約４．１μＭ、２２９～９７０μｇ／ｍＬ）、及び９０ｍｇ／ｍＬ用量グループの場合は、対応する平均濃度は１４０８μｇ／ｍＬ（約９．４μＭ、５２０～２５５７μｇ／ｍＬ）であると決定された。そのため、わずかに非線形用量曝露関係が観察された。免疫原性による治療時間に対する血漿暴露の変化の兆候は検出されなかった。アイソタイプ対照を投与したマウスからの血漿試料中のｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの平均濃度は、１８１５（約１２μＭ、１２２４～２５１１μｇ／ｍＬ）であると決定された。
抗薬物抗体（ＡＤＡ）
研究試料には気がかりなＡＤＡは検出されなかった。試料の大半は試験で陽性と判定されたが、力価は、対照グループよりもＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧグループでは高くはなかった。応答の早期発症（約７日目）と経時的に変化しない薬物曝露を考慮すると、試料中の検出される抗薬物シグナルは主に非特異的／低親和性のＩｇＭによって引き起こされた可能性がある。
安全バイオマーカー
ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧとアイソタイプ対照抗体の両方による治療後の血漿中でグルコースが増加した。肝傷害バイオマーカーのいずれも高用量ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧによって増加しなかった。アイソタイプ対照グループと比較してＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療グループでは、統計的に有意ではないものの（ｐ＜０．０６）、血漿クレアチニンが増加する傾向があった。他の腎臓マーカー、すなわち血液尿素、電解質又は全タンパク質は、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧとアイソタイプ対照治療マウスとの間で違いはなかった。
結論
ＣＡＩＡ誘導アイソタイプ対照治療マウスは、１００％の発症率で中程度から重度の疾患を発症した。同じ結果が、ビヒクル治療マウスでも見られた。
９０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇで投与されるＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧは、それぞれ７～１４、１６～１８及び７～１２日目に、アイソタイプ対照と比較して、疾患に対する顕著な改善効果を示した。統計的に有意ではないが、ビヒクルと比較すると９０ｍｇ／ｋｇで投与されるＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧでは、疾患重症度のわずかな減少が見られた。
研究終了時のＡＳ２０ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧの血漿暴露は、全体的に予想される濃度範囲内にあった。免疫原性による治療時間の経過に伴う血漿暴露の変化の兆候は検出されなかった。研究試料には気がかりなＡＤＡは検出されなかった。
肝傷害バイオマーカーのいずれも高用量ＡＳ２０ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧによって増加しなかった。統計的に有意ではないが、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療グループでは血漿クレアチニンが増加する傾向があった。他の腎臓マーカー、すなわち、血液尿素、電解質又は全タンパク質は、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬの間で違いはなかった。
実施例１９－ＣＡＩＡ実験からの脾臓のＦＡＣＳ分析
この実施例では、コラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ）を有するマウスの脾臓中の細胞サブセットに対するＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（重鎖配列番号１１５及び軽鎖配列番号１１６）の効果を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により調べた。抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（重鎖配列番号１１７及び軽鎖配列番号１１８）をアイソタイプ対照として含めた。
材料と方法
本研究は、上記のインビボ実験研究（実施例１８）の一部である。簡単に説明すると、コラーゲンＩＩ型への抗体の静脈内（ｉ．ｖ．）投与によってＣＡＩＡをＤＢＡ／１マウス（雄、８～９週齢）において誘導し、その後、疾患の発症を促進するために、ＬＰＳの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を行った。マウスを、疾患の誘導の１日前（－１日）から開始して４日ごとにＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ又はアイソタイプ対照抗体（抗ＮＰ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ）のｉ．ｐ．投与によって治療した。研究中止（１９日目）に、以下に説明するように、最高用量のＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（９０ｍｇ／ｋｇ）又はアイソタイプ対照（９０ｍｇ／ｋｇ）で治療した動物の脾臓を摘出し、秤量し、均質化した。ＦＡＣＳパネルを設計し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、好酸球、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球及びマクロファージを同定した。
単一細胞懸濁液
単一細胞懸濁液を得るために、脾臓を、ＲＰＭＩ－１６４０培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＨｙＣｌｏｎｅ）中で７０μｍ細胞ストレーナーを通過させた。細胞をペレット化し、１ｍｌのミリＱ水に再懸濁し、赤血球を溶解し（１０秒）、１ｍｌの２×ＰＢＳを添加した後、１０ｍｌの１×ＰＢＳを添加した。細胞を１０ｍｌのＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＨｙＣｌｏｎｅ）で洗浄し、最後に適切な量のＨＢＳＳに再懸濁して、１０×１０６細胞／ｍｌを得た。
ＦＡＣＳプロトコル
１×１０６細胞を９６ウェルの丸底プレートの各ウェルに播種し、８５０×ｇで、４℃で１分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、３％ＦＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、再びペレット化した。ＦＡＣＳ緩衝液で１：５０希釈した精製済みラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｆｃブロック）を、各ウェルに添加し、細胞を１５分間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄した。以下の抗体を適切な量のＦＡＣＳ緩衝液に添加することによって、抗体ミックスを調製した：
ＦＩＴＣハムスター抗マウスＣＤ３ε（１：１００）
ＰＥラット抗マウスＣＤ８６（１：１００）
ＰＥ－ＣＦ５９４ラット抗マウスＬｙ－６Ｃ（１：５０）
ＰＥ－Ｃｙ７ラット抗マウスＬｙ－６Ｇ（１：２００）
ビオチンハムスター抗マウスＣＤ４９ｂ（１：２００）
ＡＰＣ－Ｃｙ７ハムスター抗マウスＣＤ１１ｃ（１：５０）
アレクサフルオロ６４７ラット抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ（ＭＨＣＩＩ）（１：２００）
アレクサフルオロ７００マウス抗マウスＣＤ４５．２（１：１００）
ＢＶ４２１ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ－Ｆ（１：２００）
ＢＶ６０５ラット抗ＣＤ１１ｂ（１：２００）
ＢＶ６５０ラット抗マウスＣＤ１９（１：１００）
ＢＶ７８６ハムスター抗マウスＣＤ８０（１：２００）
ｅＦ５０６固定可能な生死判別染料（１：４００）
各ウェルの細胞に２５μｌの抗体ミックスを添加し、氷上で２０分間インキュベートし、光から保護した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２５μｌの二次抗体ミックス（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ストレプトアビジン、ＦＡＣＳ緩衝液で１：２００希釈した）を添加し、細胞を氷上で２０分間インキュベートし、光から保護した。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳチューブに移し、最後にＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメータープラットフォーム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）にて分析した。
ゲーティング戦略
細胞サブセットを以下のように識別した：
Ｔ細胞：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ－、ＣＤ３＋
Ｂ細胞：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ－、ＣＤ１９＋
ＮＫＴ細胞：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ－、ＣＤ３＋、ＣＤ４９ｂ＋
好中球：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ＋
好酸球：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ－、ＳｉｇｌｅｃＦ＋
ＮＫ細胞：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ－、ＳｉｇｌｅｃＦ－、ＣＤ４９ｂ＋
樹状細胞：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ－、ＳｉｇｌｅｃＦ－、ＣＤ１１ｃ＋、ＭＨＣＩＩ＋
単球：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ－、ＳｉｇｌｅｃＦ－、ＣＤ１１Ｃ－、Ｌｙ６Ｃ＋
マクロファージ：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ－、ＳｉｇｌｅｃＦ－、ＣＤ１１Ｃ－、Ｌｙ６Ｃ－、ＭＨＣＩＩ＋
さらに、樹状細胞上でのＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を分析した。
結果
疾患誘導の２日前（ＡＳ２０、２３．９±１．４ｇ；アイソタイプ対照、２３．８±１．２ｇ）でも、１９日目の研究中止の時点（ＡＳ２０、２２．５±１．７ｇ；アイソタイプ対照、２２．１±１．０ｇ）でも、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療グループ（グループ３、実施例１８）とアイソタイプ対照グループ（グループ２、実施例１８）の間で体重に有意差はなかった。しかし、脾臓重量は、アイソタイプ対照グループと比較してＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療グループでは顕著により高く（１１０±２３ｍｇ対８８±２１ｍｇ；ｐ＝０．０２）、ＣＤ４５＋白血球の総数も、アイソタイプ対照グループと比較してＡＳ２０グループにおいてより高かった（４４．５×１０６対３９．０×１０６；ｐ＝０．００８）。
脾臓中のＢ細胞の総数は、アイソタイプ対照治療マウスと比較してＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療マウスにおいてより高かった（２７．１±３．５×１０６対２１．０±５．８×１０６；ｐ＝０．００４）。対照的に、ＮＫ細胞の総数は、アイソタイプ対照治療マウスと比較してＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療マウスにおいて低下した（０．４４±０．０９×１０６対０．５４±０．０９×１０６；ｐ＝０．０１）。ＮＫＴ細胞の総数も、統計的に有意ではないが、アイソタイプ対照と比較してＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療マウスにおいて低下した（０．１４±０．０３×１０６対０．１６±０．０３×１０６；ｐ＝０．０８）。ＡＳ２０ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療マウスとアイソタイプ対照治療マウスの間で、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、樹状細胞又はＴ細胞の全数に有意差は見られなかった（図２０）。
脾臓中のＣＤ４５＋細胞の中のＢ細胞の割合は、アイソタイプ対照治療マウスと比較してＡＳ２０ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療マウスにおいてより高かった（６０．９±５．４％対５３．０±１０．０％、ｐ＝０．０２）。対照的に、ＣＤ４５＋細胞の中のＴ細胞、ＮＫＴ細胞及びＮＫ細胞の割合は、アイソタイプ対照治療マウスと比較してＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療マウスにおいてより低いことが判明した（Ｔ細胞：１５．２±３．３％対１８．９±４．１％、ｐ＝０．０２；ＮＫＴ細胞：０．３１±０．０５％対０．４０±０．０７％、ｐ＝０．０００３；ＮＫ細胞：０．９９±０．２２％対１．４±０．２３％、ｐ＝０．０００１）。ＡＳ２０ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療マウスとアイソタイプ対照治療マウスの間で、ＣＤ４５＋白血球の中の好中球、好酸球、単球、マクロファージ又は樹状細胞の割合に有意差は見られなかった（図２１）。ＣＤ８０又はＣＤ８６を発現する細胞においてＡＳ２０ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ治療マウスとアイソタイプ対照治療マウスの間に有意差はなく、ＣＤ４５＋細胞の中の総数や割合にも有意差はなかった（データ示さず）。
結論
ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（９０ｍｇ／ｋｇ投与量）での治療は、ＣＡＩＡを有するマウスの脾臓におけるＮＫ細胞の総数及びＴ細胞、ＮＫＴ細胞及びＮＫ細胞の割合を顕著に低下させた。
実施例２０－ＢＳＳＬ酵素活性に対する予め指定した抗体候補の効果の分析
この実施例では、ＢＳＳＬ酵素活性に対するｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐフォーマットの５つの予め指定した抗体候補、すなわちＳ－ＳＬ０４８－１１（重鎖の配列番号１１９と軽鎖配列番号１２０）、Ｓ－ＳＬ０４８－４６（重鎖配列番号１２１と軽鎖配列番号１２２）、Ｓ－ＳＬ０４８－１０６（重鎖配列番号１２３と軽鎖配列番号１２４）、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６（重鎖配列番号１２５と軽鎖配列番号１２６）及びＳ－ＳＬ０４８－１１８（重鎖配列番号１２７及び軽鎖配列番号１２８）の効果を検討した。ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８ＰフォーマットのＡＳ２０ ＣＤＲグラフト（重鎖配列番号１３１及び軽鎖配列番号１３２）、キメラＡＳ２０（重鎖配列番号１２９及び軽鎖配列番号１３０）とアイソタイプ対照抗ＮＰ抗体（重鎖配列番号１３３及び軽鎖配列番号１３４）との比較を行った。
方法と材料
予め指定した抗体候補とのＢＳＳＬのプレインキュベーション
天然ヒトＢＳＳＬ（配列番号１３８；表２）をこの実施例で使用した。ＢＳＳＬストック溶液を、０．４２ｍｇ／ｍｌの濃度にミリＱ（ＭＱ）－Ｈ２Ｏで１０倍希釈した。
抗体をＭＱ－Ｈ２Ｏで０．３μｇ／μｌの開始濃度に希釈し、続いてＭＱ－Ｈ２Ｏで１：１の連続希釈を行って、０．３μｇ／μｌから０．００９μｇ／μｌまでの６つの濃度を得た。各抗体希釈物から、２０μｌを２．４μｌのＢＳＳＬ（１μｇ）に添加し、抗体／ＢＳＳＬ混合物を＋４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、各ＢＳＳＬ／抗体反応に２０μｌのＭＱ－Ｈ２Ｏを添加した。
トリグリセリド加水分解アッセイ
超音波治療に適する丸底の直径３０ｍｍのガラス容器内で、５０μｌの３Ｈ標識トリオレイン（トリオレイン［９，１０－３Ｈ（Ｎ）］，９１ＣＩ／ｍｍｏｌ）ＮＥＴ４３１００１ＭＣ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と２５ｍｇの未標識トリオレイン（Ｓｉｇｍａ カタログ番号９２８６０）を混合し、室温で、窒素ガス（Ｎ２）下で溶媒を蒸発させ、容器に１．０ｍｌの１０％アラビアゴム（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｇ－９７５２）、１．２５ｍｌの１．０Ｍのトリス－ＨＣｌ ｐＨ９．０及び２．０ｍｌのＭＱ－Ｈ２Ｏを添加し、氷水で容器を冷やし、液体の表面下数ｍｍに置いた媒体設定で直径９ｍｍの平らな先端プローブ付きのＳｏｎｉｐｒｅｐ １５０（ＭＳＥ，ＵＫ）を用いて、エマルジョンが得られるまで、５０％パルスモードで１０分間超音波処理し、２．５ｍｌの１８．７％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ａ７９０６）、２．５ｍｌの１．０Ｍ ＮａＣｌ、及び３．２５ｍｌのＭＱ－Ｈ２Ｏを前記エマルジョンに添加することによってトリグリセリド（ＴＧ）エマルジョンを調製した。エマルジョンは、調製した同じ日に使用した。次に、１０μｌのプレインキュベートしたＢＳＳＬ／抗体溶液（上記参照）を、１３×１００ｍｍのガラスチューブ内で合計容量２００μｌ中１５０μｌのＴＧエマルジョンと１０ｍＭのコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ－１２５４）とＭＱ－Ｈ２Ｏを混合した。試料を重複して調製した。チューブを３７℃で１５分間インキュベートし、その後３．２５ｍｌのメタノール／クロロホルム／ヘプタン（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ，７６０／６８０／５４０）と１．０ｍｌの０．１Ｍの炭酸ナトリウム ｐＨ１０．５を添加することによって反応を停止し、その後、３５００×ｇで１０分間遠心分離を行った。加水分解した遊離脂肪酸を含む上部の水溶性相から１４００μｌを取り出し、６ｍｌのポリエチレンバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）内で２．０ｍｌのＯｐｔｉｐｈａｓｅ Ｈｉｓａｆｅ３シンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と混合し、加水分解した３Ｈ標識遊離脂肪酸の量を、ＷｉｎＳｐｅｃｔｒａｌ １４１４（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）での液体シンチレーション計数によって測定した。
コレステロールエステル加水分解アッセイ
超音波処理に適する丸底の直径３０ｍｍのガラス容器に４０μｌの１４Ｃ標識オレイン酸コレステリル（オレエート－１－１４Ｃ、ＮＥＣ６３８００５０ＵＣ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し、室温で、窒素ガス下で溶媒を蒸発させ、容器に２．０ｍｌの０．２Ｍのトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．５及び０．８５ｍｌのＭＱ－Ｈ２Ｏを添加し、氷水で容器を冷やし、液体の表面下数ｍｍに置いた媒体設定で直径９ｍｍの平らな先端プローブ付きのＳｏｎｉｐｒｅｐ １５０（ＭＳＥ）を用いて、エマルジョンが得られるまで５０％パルスモードで１０分間超音波処理し、２００ｍＭのコール酸ナトリウム１．６５ｍｌと１．０ｍｌのＭＱ－Ｈ２Ｏをエマルジョンに添加することによってコレステロールエステル（ＣＥ）エマルジョンを調製した。エマルジョンは、調製した同じ日に使用した。次に、１０μｌのプレインキュベートしたＢＳＳＬ／抗体溶液（上記参照）を、１３×１００ｍｍのガラスチューブ内で１００μｌのＣＥエマルジョンとＭＱ－Ｈ２Ｏを合計容量２００μｌまで混合した。試料を重複して調製した。チューブを３７℃で３０分間インキュベートし、その後３．２５ｍｌのメタノール／クロロホルム／ヘプタン（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ、７６０／６８０／５４０）と１．０ｍｌの０．１Ｍの炭酸ナトリウム ｐＨ１０．５を添加することによって反応を停止し、その後、３５００×ｇで１０分間遠心分離を行った。加水分解した遊離脂肪酸を含む上部の水溶性相から４００μｌを取り出し、６ｍｌのポリエチレンバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）内で２．０ｍｌのＯｐｔｉｐｈａｓｅ Ｈｉｓａｆｅ３シンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）と混合し、加水分解した３Ｈ標識遊離脂肪酸の量を、ＷｉｎＳｐｅｃｔｒａｌ １４１４（Ｗａｌｌａｃ）での液体シンチレーション計数によって測定した。
結果
それぞれ１５分のインキュベーション（トリグリセリド加水分解アッセイ）又は３０分のインキュベーション（コレステロールエステル加水分解アッセイ）の後に遊離脂肪酸（放射性標識した）の放出を測定することによって酵素活性を評価した。図１７を参照されたい。技術的な理由から、試料を２つの連続したセットで分析しなければならなかったが、２つの抗体（ＡＳ２０とアイソタイプ対照抗ＮＰ抗体）を両方のセットに含めた。データを、１００％に設定した反応に抗体を加えずに得られた値との相対値として表す（表２３及び２４）。
表２３－ＢＳＳＬ酵素活性に対する５つのＢＳＳＬ特異的ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ及びｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐサブタイプの対照抗体の効果（トリグリセリドの加水分解）
Figure 2022540859000024
表２４－ＢＳＳＬ酵素活性に対する５つのＢＳＳＬ特異的ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ及びｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐサブタイプの対照抗体の効果（コレステロールエステルの加水分解）
Figure 2022540859000025
結論
試験した抗体、すなわち、５つの予め指定した候補薬であるｈＩｇＧ４ Ｓ２２８ＰフォーマットのＡＳ２０、ＡＳ２０ ＣＤＲグラフト及び抗ＮＰのいずれも、ＢＳＳＬの酵素活性に顕著な効果を示さなかった。
実施例２１－Ｘ線結晶学によるＡＳ２０のエピトープマッピング
Ｘ線結晶学を用いて、ｈＢＳＳＬとの複合体中のＡＳ２０の三次元構造を決定した。この実験では、抗体を切断してＦａｂ断片を生成し、ｈＢＳＳＬのアミノ酸１～５３０に対応し、その後にＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号１４６）が続く新しいＣ末端切断ｈＢＳＳＬ（ｔ－ｈＢＳＳＬ）構築物を作製した。
材料と方法
ｔ－ｈＢＳＳＬのクローニング、発現及び精製
以前に、ヒトＢＳＳＬが、フレキシブルなＣ末端部を欠いた切断形態で結晶化された。そのため、ＡＳ２０ ＦａｂとｈＢＳＳＬの結晶を生成できるように、精製のためのＣ末端ｈｉｓタグを含む新しい切断型のＢＳＳＬ構築物を作製した。構築物ｇｐ６７－ＢＳＳＬ－６×Ｈは、アミノ酸１－５３０＋ＡＨＨＨＨＨＨ（シグナルペプチドを除去した後の配列に基づくＢＳＳＬ番号付け）からなり、ＧｅｎｅＡｒｔから注文し、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）用に調製したｐＦａｓｔＢａｃ ｔＧＦＰ Ｄｕａｌベクターにクローニングした。ＬＩＣを、ＩｎＦｕＳｉｏｎクローニングキットを用いて行い、Ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細胞に変換した。
組換えバクミド（ｂａｃｍｉｄ）ＤＮＡを、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌細胞内で作製した。Ｓｆ９細胞へのバクミドのトランスフェクションを２７℃で１２０時間行った。Ｐ１ウイルスを増殖培地から収集し、その後、Ｐ２ウイルスストックを作製するために使用した。９６時間後、Ｐ２ウイルスストックを遠心分離により収集した。４００ｍｌのＳｆ９細胞（１．５×１０６細胞／ｍｌ）を、２ｍｌのＰ２ウイルスストックに感染させ、感染後７２時間増殖させた。培地（Ｐ３ストック）を遠心分離により収集し、濾過した。大規模発現の場合には、３５ｍｌのＰ３ストックウイルスを、トムソン最適増殖フラスコ（５Ｌ）中の２１３０ｍｌのＳｆ９細胞（１．６×１０６細胞／ｍｌ）に添加した。発現を、２７℃で７２時間行った。収集時に、細胞密度は２．３４×１０６細胞／ｍｌであり、７５％がＧＦＰを発現し、生存率は８９％であった。培養物を遠心分離し、細胞を除去した。ｔ－ｈＢＳＳＬを、ＮｉセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂を用いてバッチＩＭＡＣにより培地から精製し、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾールで溶出した。さらに、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．０、５００ｍＭＮａＣｌで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。タンパク質を単一の単量体ピークとして溶出し、プールして、濃縮した。
ＡＳ２０Ｆａｂ断片とｔ－ｈＢＳＳＬの複合体形成
ＡＳ２０抗体の生成を、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）で行った。Ｆａｂ断片を、固定したパパインサプライヤー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，製品番号２０３４１）からのパパイン消化プロトコルに従って作製した。合計１５ｍｇのＡＳ２０を１７ｍｇ／ｍｌに濃縮し、緩衝液を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ７、２０ｍＭのシステインに交換した。抗体を固定したパパイン（０．６ｍｌのスラリー）と３７℃で３時間インキュベートし、続いて４℃で一晩インキュベートした。切断が完了しなかったので、試料をさらに３時間３７℃でインキュベートし、次いで、週末にＲＴでインキュベートした。抗体を１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５で溶出し、精製したｔ－ｈＢＳＳＬを添加した。この混合物をＲＴで約３０分間インキュベートし、その後５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．０、５００ｍＭのＮａＣｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにロードした。約６０ｍｌの溶出量での最初の主要なピークは、ｔ－ｈＢＳＳＬとＡＳ２０ Ｆａｂ断片の複合体を含んでいた。関連する画分を濃縮し（１０Ｋ ＭＷＣＯ）、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．０の緩衝液で希釈して、塩濃度を２５０ｍＭに低下させた。
ｔ－ｈＢＳＳＬと複合体を形成したＡＳ２０ Ｆａｂの結晶化と構造の解析
Ｆａｂ ｔ－ｈＢＳＳＬ複合体を精製した後に、試料を実験室間で輸送している間、約３６時間、氷上で４℃に保った。次いで、複合体を、４ｍｇ／ｍＬから最終濃度１７．３ｍｇ／ｍＬまでの３００００ＭＷＣＯ（ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＶｉｖａｓｐｉｎ ５００、ＶＳ０１２２）で５００μＬのＶｉｖａｓｐｉｎを用いて濃縮した。消衰係数１７４,３７５と１０６．２４２ｋＤａのＭｗを用いて、ナノドロップ上で、Ａ２８０で濃度を測定した。
結晶化実験を、Ｍｏｓｑｕｉｔｏ液体取り扱いロボットを用いて、３５μＬリザーバー溶液と１５０＋５０、１００＋１００、５０＋１５０ｎＬのタンパク質の液滴＋リザーバーを有するＳｗｉｓｓ ＣＩ ＸＴＡＬ ＳＤ－３ ３－ウェルプレート内に設定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ社のｓｃｒｅｅｎ Ｍｏｒｐｈｅｕｓにより、条件Ｂ９とＢ１０で、２０度で結晶が得られた。棒様形態の結晶が最初の１２時間に出現し、次の２４時間の間により大きく成長した。これらを、クライオ冷却し、追加の１０％グリセロールを含むリザーバー溶液に迅速に移した後、液体窒素に入れた。データをＭａｘＩＶで、バイオマックスビームラインで収集した。自動処理データファイルを、１ｆ６ｗ．ｐｄｂ（ｈＢＳＳＬ）と４ｎ０ｙ．ｐｄｂ（Ｆａｂ断片）を検索モデルとして用いて、Ｐｈａｓｅｒで分子置換によって構造を解析するために使用した。水分子はＢＳＳＬの非常にＣ末端部分に存在するので除去し、４ｎ０ｙ．ｐｄｂについては、ポリアラニンモデルに作られたＦａｂ鎖のみを保持した。手動モデル構築をＣｏｏｔで行い、このモデルはＲｅｆｍａｃ ５（ＣＣＰ４スーツの全て）で洗練させた。
結果
ＡＳ２０ Ｆａｂ ｔ－ｈＢＳＳＬの結晶化と構造決定
ＡＳ２０ Ｆａｂ断片を、３０ｍＭのＮａＢｒ、３０ｍＭのＮａＦＩ、３０ｍＭのＮａＩ、０．１ＭのＴｒｉｓ（塩基）、０．１Ｍのビシン（これら２つの緩衝液でｐＨ８．５に設定した緩衝液）、２０％ＰＥＧ５５０ ＭＭＥ及び１０％ ＰＥＧ ２０Ｋを含むＭｏｒｐｈｅｕｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ Ｂ９でｔ－ｈＢＳＳＬと一緒に結晶化することができた。結晶は、ユニットセルサイズが３２３、６７、１２３、９０、１０１．７、９０で、２．５Åに回折した空間グループＣ２に属した。この構造を分子置換によって解析し、非対称単位に２つの完全な複合体が存在した。２つのコピーの周りに詰まっている結晶は異なり、ｔ－ｈＢＳＳＬ構造の小さなバリエーションをもたらす。特に、６－Ｈｉｓタグを含む最後の残基は分子Ａでは見られるが、Ｂはこの領域で結晶接触が少なく、Ｃ末端が柔軟になる余地が多いため、分子Ｂには見られない。残基２７２と２８３の間の領域もＢで非常に乱れており、モデル化することはできない。これらの不一致とは別に、２つのｔ－ｈＢＳＳＬモデルは非常にうまく重ね合わされる。
ＡＳ２０ Ｆａｂとｔ－ｈＢＳＳＬの相互作用インタフェースの解析
ＢＳＳＬ構造は、アルファヘリックスと連結ループ[９]で囲まれたねじれた１１鎖βシートからなる大きなコア領域を有すると説明されている。Ｎ末端には、より小さい３本鎖βシートがある。該構造は「親指」に近い活性部位三連構造を含む手のひらを有する左手のオーブングローブにたとえられている。この類似から、小さなＮ末端βシートは、「小指」の近くの手の後ろに位置する。図１２を参照されたい。Ｆａｂ分子と相互作用するＢＳＳＬ構造の一部は、小さなＮ末端βシートと構造中の第３のαヘリックスであるアルファＣのＣ末端部に位置する[１７]。言い換えると、抗体の結合領域は、活性部位の近くではないが、抗原の反対側にある。図１３は、ＡＳ２０の可変鎖が、ライトグレーで強調されたエピトープ配列を有するｔ－ｈＢＳＳＬに結合する方法を示す。
エピトープ領域は表２５に記載されており、残基７～１２（鎖１及び２、配列番号１）、４２～５５（シートの鎖３に通じるループ領域、配列番号２の一部）、及び１７４～１８０（アルファＣのＣ末端部、配列番号５）を含む。該エピトープは、むしろ平坦で、わずかに特徴的な残基、すなわちＴｙｒ７、Ｐｈｅ１２及びＧｌｎ５２（表２４５に記載の主な相互作用）のみが突き出ている。４７～５４のループ領域は、明確に定義され、均一な表面を形成する。プロリン４７は、ＦａｂのＴｙｒ３１との相互作用の積み重ねに重要であるが、全体として表面はここでは平坦である。エピトープ配列内の残基の多くは、ＢＳＳＬの折り畳みにとって重要であるが、ＡＳ２０と特異的に相互作用しない。
表２５－最も重要な相互作用を一番上の列にランク付けしたＢＳＳＬとＦａｂ ＡＳ２０の相互作用に関与するＢＳＳＬ残基のリスト。エピトープ領域におけるＢＳＳＬ折り畳みに重要なＢＳＳＬ残基も列挙されている。
Figure 2022540859000026
結論
この実施例は、ＡＳ２０ Ｆａｂ及びｔ－ｈＢＳＳＬの結晶化並びに構造解析について説明する。該構造は、エピトープ領域が実施例１３に記載のＨＤＸ－ＭＳによって以前に同定した領域と同じ領域に位置することを明らかにする。これは、小さなベータシート、シートの鎖３に通じる整ったループ領域及び隣接するヘリックスのＣ末端部からなる三次元エピトープである。エピトープの配列は、７～１２（ＹＴＥＧＧＦ、配列番号１）、４２～５５（ＬＥＮＰＱＰＨＰＧＷＱＧＴＬ、配列番号２）及び１７４～１８０（ＶＫＲＮＩＡＡ、配列番号５）であり、配列では広がっているが、構造では共に近づく。最も明確な残基は、表面から突き出たＴｙｒ７、Ｐｈｅ１２及びＧｌｎ５２である。
５つの予め指定した抗体の配列を、ＡＳ２０ Ｆａｂ ｔ－ｈＢＳＳＬ構造の内容で解析した。主に保存的である配列の違い及びＨＤＸ－ＭＳマッピング（実施例１４）の結果から、全５つの抗体がＢＳＳＬ上の同じエピトープに結合することが示される。
実施例２２－Ｓ－ＳＬ０４８－１１６ Ｆａｂ－ＢＳＳＬ複合体の複合体形成、結晶化、構造決定及びエピトープ解析
材料と方法
ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲによるＳ－ＳＬ０４８－１１６切断
ＰＢＳ中のＳ－ＳＬ０４８－１１６抗体（重鎖配列番号１２５と軽鎖配列番号１２６）を切断し、製造業者の説明書に従って、ＦｒａｇＩＴキット（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を用いてＦ（ａｂ’）２を精製した。
Ｆ（ａｂ’）２断片の縮小とＦａｂ’断片の精製
精製したＦ（ａｂ’）２断片の大規模縮小を、５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ ｐＨ７．２中５０ｍＭの最終濃度でシステアミンを用いて室温で２時間行った。得られた試料の５分の４は、移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．２、２ｍＭのＥＤＴＡを用いるＨｉＬｏａｄ ２６／６０スーパーデックス２００ ｐｒｅｐグレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製した。興味のピークからの画分をプールし、濃縮し、下流の適用のために－８０℃で保存した。総収量は７．２ｍｇであった。
Ｆａｂ’断片のアルキル化とその後の精製
縮小した試料の残りの５分の１を、アルキル化によって遊離システインを遮断するために、室温で３０分間、等量の３７５ｍＭのヨードアセトアミドで処理した。得られたアルキル化試料を、非アルキル化試料と全く同様に精製した。総収量は２ｍｇであった。
ＢＳＳＬの発現と精製
発現に使用されるＰ２ウイルスストックは、ＳｃｉＬｉｆｅＬａｂ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。ＥｘｐｉＳｆ ＣＤ培地でＥｘｐｉＳｆ９昆虫細胞株を使用した。ＥｘｐｉＳｆタンパク質発現キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる発現は、ＳｃｉＬｉｆｅ Ｌａｂが推奨するウイルス負荷を用いて製造業者の推奨に従って行った。
２Ｌ発現からの培養上清に、ＥＤＴＡ含まないプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＮｉＳＯ４及びイミダゾール（最終濃度１５ｍＭ）を補った。いずれの粒子も１３０００×ｇでの遠心分離により除去した。上清を、２ｍｌ／分の流速で一晩、４℃で５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。カラムを、１５ｍＭのイミダゾールを含む６カラム容積（ＣＶ）ＩＭＡＣ緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．５）で洗浄した。カラムを２５ｍＭのイミダゾールを含むＩＭＡＣ緩衝液Ａの１０ＣＶで再度洗浄した。結合タンパク質を、１００％ＩＭＡＣ緩衝液Ｂ（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのイミダゾール、ｐＨ７．５）への２０ＣＶ線形勾配で溶出した。溶出したタンパク質を濃縮し、遠心分離し、ＳＥＣ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ７）で事前に平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｒｅｐグレードゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。興味のピークからの画分（１Ｅ６－１Ｆ８）をプールし、濃縮した。総収量は６．２ｍｇであり、試料の純度は約８５％であった。
ＢＳＳＬ：Ｆａｂ’複合体形成と精製
複合体作製の前に、ＢＳＳＬを、濃度／貯蔵によってオリゴマー化が誘導されないことを確立するために、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐグレードカラムでＳＥＣによって評価した。この複合体を１：１．３のＢＳＳＬ：Ｆａｂ’のモル比で混合し、氷上で１時間インキュベートした。インキュベートした複合体を、ＢＳＳＬの場合と同じ緩衝液を用いて同じＳＥＣカラムにかけた。興味の画分（Ｂ３－Ｃ４）をプールし、緩衝液を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ７に交換した。緩衝液交換した試料を１７ｍｇ／ｍｌに濃縮し、液体窒素で急速冷凍し、結晶化の準備が整うまで－８０℃で保存した。試料の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から推定すると、９０％超であった。
ＢＳＳＬ：Ａｌｋ－Ｆａｂ’複合体形成と精製
複合体を１．１：１のＢＳＳＬ：Ａｌｋ－Ｆａｂ’のモル比で混合し、氷上で１時間インキュベートした。インキュベートした複合体を、ＢＳＳＬ：Ｆａｂ’複合体の場合と同じ緩衝液を用いて同じＳＥＣカラムにかけた。興味の画分をプールし、緩衝液を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ７に交換した。緩衝液交換した試料を１４．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、液体窒素で急速凍結し、結晶化の準備が整うまで－８０℃で保存した。
Ｆａｂ－ＢＳＳＬ複合体の結晶化と凍結
最高に回折している結晶を、緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中の１４．５ｍｇ／ｍｌのＦａｂ－ＢＳＳＬ複合体から２０℃で成長させ、リザーバー（１６％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、０．１Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ５及び６％（ｖ／ｖ）エタノール）及び以下の種溶液：１５０ｎｌの複合体＋３７ｎｌの種（０．１Ｍのクエン酸ナトリウム ｐＨ５．０、２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４０００及び０．２Ｍの硫酸アンモニウム中の砕いた結晶）＋１１３ｎｌのリザーバーと混合した。
座滴を４０μｌのリザーバーを有するＭＲＣプレートにピペットで入れた。結晶は数日内に出現し、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１６％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、０．１Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ５．０及び３％（ｖ／ｖ）エタノールを含むクライオ溶液で凍結させた。
データ収集
Ｅｉｇｅｒ １６Ｍハイブリッドピクセル検出器を搭載したＢｉｏＭＡＸ ｓｔａｔｉｏｎ，ＭＡＸ ＩＶ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ(λ＝０．９７６２５Å）で、１００Ｋでデータセットを収集した。データセットは、露光時間０．０１１秒及び画像当たり０．１°の振動を用いて収集し、合計で３６０°を収集した。ａｕｔｏＰＲＯＣパイプラインを用いて、データを空間グループＰ２１において２．５Åに処理した。
結果
構造決定
ヒト胆汁塩活性化リパーゼＢＳＳＬ（ＰＤＢ：１Ｆ６Ｗから）の触媒ドメインの２．３Å構造と鋳型としての相同２．８６ÅＦａｂ構造（ＰＤＢ：３ＮＦＰから）と共にＰｈａｓｅｒソフトウェアを用いる分子置換を用いてＦａｂ－ＢＳＳＬ構造を決定した。非対称ユニットに１つの複合体が見いだされた。該構造をＲｅｆｍａｃ５、続いてＢｕｓｔｅｒで洗練し、モデル構築をＣｏｏｔで行った。最終モデルには、ＢＳＳＬ（鎖Ａ）及びＳ－ＳＬ０４８－１１６ Ｆａｂの重鎖（Ｈ）と軽鎖（Ｌ）を有する３つのタンパク鎖が含まれた（図２２）。最終モデルには、電子密度に見られない柔軟なループ（アミノ酸１１７～１２３）を除き、鎖Ａのアミノ酸１～５３１が含まれた。該モデルには、鎖Ｈのアミノ酸１～２２７及び鎖Ｌのアミノ酸は１～２１１が含まれた。鎖Ｈの最初のアミノ酸であるＧｌｎ １は、ＰＣＡ、ピログルタミン酸として電子密度に最も適合するようにモデル化されている。Ｓ－ＳＬ０４８－１１６ Ｆａｂのアルキル化治療が結晶化に必要であったが、鎖Ｈでは、２つの遊離システイン（Ｃｙｓ１３３及びＣｙｓ２２５）が非アルキル化システインとしてモデル化されている。システインの硫黄原子に付着したと思われるメチルアミド基に適合する余分な密度は存在しなかった。おそらく、システイン残基は少なくとも部分的にアルキル化されていたが、付着した原子は非常に柔軟で、電子密度マップでははっきりとは見られなかった。加えて、８７個の水分子がモデル化されている。
エピトープ解析
Ｆａｂ－ＢＳＳＬ複合体の座標を用いてエピトープ解析を行った。プログラムのＣＣＰ４スイートのＣＯＮＴＡＣＴソフトウェアを用いて解析を行った。Ｓ－ＳＬ０４８－１１６－Ｆａｂは、重鎖と軽鎖の両方を介してＢＳＳＬに結合する。重鎖では、３つのＣＤＲループ全てが関与している（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）が、軽鎖ではＣＤＲ１とＣＤＲ３のみがＢＳＳＬに接触する（図２３、表２６）。また、軽鎖のＮ末端に近いＩｌｅ２は、ＢＳＳＬと疎水性ファンデルワールス相互作用を行う。水素結合のネットワークは、ＰＩＳＡ（ＱＴ）解析を用いて計算した重鎖とＢＳＳＬ（全７水素結合）間及びＢＳＳＬと軽鎖（全５水素結合）間の相互作用を安定化させる。ＰＩＳＡ（ＱＴ）解析から、溶媒のアクセス可能な領域の４２６Å２がＢＳＳＬと重鎖の界面に埋もれており、４６８Å２はＢＳＳＬと軽鎖の界面に埋もれている。
表２６－０～４ÅのＳ－ＳＬ０４８－１１６－ＦａｂとＢＳＳＬの間の全ての相互作用残基の概要
Figure 2022540859000027
結論
Ｓ－ＳＣＬ０４８－１１６に関する本実施例で得られた結果は、実施例１４におけるＨＤＸ－ＭＳ研究から得られた結果と一致している。
実施例２３－関節リウマチのマウスモデルにおけるＳ－ＳＬ０４８－１１６の有効性検証
この実施例では、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６（重鎖配列番号１２５及び軽鎖配列番号１２６）の効果を、関節リウマチ（ＲＡ）、すなわちコラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ）のインビボマウスモデルで調べた。ＣＡＩＡモデルについては、実施例１８で説明する。この研究は、地元の動物倫理委員会Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ（０２８９６－２０）によって承認された。
材料と方法
疾患の誘導
ＤＢＡ／１マウス（雄、８週齢）に、０日目にモノクローナル抗ＣＩＩ抗体（ＣＩＡ－ＭＡＢ－５０，ＭＤ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）のカクテルを２ｍｇ／マウスでｉ．ｖ．注入した。疾患を促進するために、５日目に、マウスにＬＰＳ（５０μｇ／マウス）をｉ．ｐ．注入した。
実験グループと試験品の投与
Ｓ－ＳＬ０４８－１１６を５ｍｇ／ｍｌの濃度で送達し、さらにビヒクル（２５ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％Ｐ８０、ｐＨ６．０）で希釈した。試験品（抗体及びビヒクル）を、疾患の誘発の１日前（－１日）から始まり、３日目、７日目、１１日目及び１５日目の４日毎にｉ．ｐ．投与した。－２日目の動物の平均重量に基づいて、Ｓ－ＳＬ０４８－１１６を、３つの異なる用量、すなわち、１０、３０及び９０ｍｇ／ｋｇで投与した。実施例１１に記載のように、ヒトＢＳＳＬ（ＫＤ＝０．５ｎＭ）と比較してマウスＢＳＳＬに対するＳ－ＳＬ０４８－１１６の低い親和性（ＫＤ＝４０ｎＭ）を補うために、比較的高用量を選択した。実験グループを表２７にまとめる。－１日目の最初の投与はボーラス用量であり、すなわち、試験品を２回の注射に分けて二重投与として与え、最初の注入を午前中に行い、第２の注入を午後に行った。以下の投与（３日目、７日目、１１日目及び１５日目）を単回用量として行った。各投与前に動物を秤量し、用量体積２０ｍｌ／ｋｇは動物の個々の重量に基づいていた。
表２７－実験グループ
Figure 2022540859000028
疾患評価
０～１５の範囲の４本の手足の肉眼でのスコア化システム（腫れた又は赤いつま先の場合は１ポイント、腫れた若しくは赤い中足の指又は指関節の場合は１ポイント、腫れた足首の場合は５ポイント）を用いて、３日目から盲検方法で疾患を毎日評価し、各マウスの最大合計スコアは６０になった。倫理的な制限により、スコアが４５を超える動物を実験から取り除いた。
結果
関節炎の重症度
ＣＡＩＡ誘導動物及びビヒクル治療動物は、１００％発症率で中程度から重度の疾患を発症した。３つの用量（１０、３０及び９０ｍｇ／ｋｇ）で－１日目から終了まで４日毎にｉ．ｐ．投与したＳ－ＳＬ０４８－１１６（ＳＯＬ－１１６）の有効性を評価した。９０ｍｇ／ｋｇで投与したＳ－ＳＬ０４８－１１６は、ビヒクルと比較して疾患重症度に寛解効果を示した（図２４及び２５）。
倫理的な理由（ハイスコア）から、ビヒクルグループ（１５日目）の１匹と９０ｍｇ／ｋｇグループ（１２日目）の１匹の２匹の動物を終了前に取り除いた。これらの動物は、最大スコアに含まれるが、平均、ＡＵＣ及び％阻害から除外される（図２５、表２８）。ビヒクルグループの１匹のマウスはＬＰＳブーストから回復せず、すなわち、低体温で、脊柱後弯症姿勢であり、体重は非常に軽かった。このマウスは、疾患の発症の前に取り除いたため（７日目）、全ての結果から除外される。
疾患パラメータの統計を表２８にまとめる。
表２８－ＣＡＩＡ重症度パラメータの統計
Figure 2022540859000029
 １累積発症率。スコア化の連続２日に１以上のポイントを獲得した場合に、マウスは疾患を発症したとみなした。２全てのスコア化時点での平均ＣＡＩＡスコア。３曲線下面積。４ビヒクル対照治療グループに対する各動物における疾患全体の負荷の変化の割合。ビヒクル対照グループの平均ＡＵＣと各個々の動物のＡＵＣの差を求め、ビヒクル対照グループＡＵＣで割り、１００をかけることによって計算した＊（－１）。
健康評価
一般的な健康評価を、３日目から終了まで、疾患の評価と併せて毎日実施した。マウスを、一般的な健康評価の一環として週に２回秤量した。動物において治療による有害作用は認められなかった。
結論
ＣＡＩＡ誘導ビヒクル治療マウスは、１００％の発症率で中程度から重度の疾患を発症した。治療開始日－１に、３つの異なる用量、すなわち１０、３０及び９０ｍｇ／ｋｇ用量でｉ．Ｐ．投与したＳ－ＳＬ０４８－１１６の有効性を評価した。９０ｍｇ／ｋｇで投与したＳ－ＳＬ０４８－１１６は、ビヒクルと比較して、疾患の重症度に対する寛解効果が見られた。Ｓ－ＳＬ０４８－１１６又はビヒクル単独での治療による有害作用は認められなかった。
実施例２４－ＢＳＳＬノックアウト（ＫＯ）と野生型（ＷＴ）マウスを比較した血液、脾臓及び腸間膜リンパ節における細胞充実性の分析
この実施例では、ＢＳＳＬ欠損ノックアウト（ＫＯ）マウス及び野生型同腹仔から採取した血液、脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）における異なる白血球サブセットの量を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって調べた。
材料と方法
１０匹のＢＳＳＬ ＫＯマウス及び１０匹の野生型同腹仔（１５～１９週齢）からの血液、脾臓及びＭＬＮの分析のために白血球を単離した。総白血球数を、バーチャー（Ｂｕｒｃｈｅｒ）チャンバー内で、手動計数を用いて脾臓及びＭＬＮについて決定した。血液、脾臓及びＭＬＮから単離した細胞を、ＦＣ－Ｂｌｏｃｋ（ＣＤ１６／Ｃ０３２クローン２．４Ｇ２）とインキュベートし、続いて２つの異なる抗体カクテルの染色Ａ及び染色Ｂとインキュベートした。
染色Ａ
染色Ａに使用した抗体／クローン／フルオロクロムは、ＣＤ１９（ＩＤ３／ＢＢ５１５）、γδＴＣＲ（ＧＬ３／ＰＥ）、ＣＤ８ａ（５３－６．７／ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＣＤ４５．２（１０４／ＰＥ－Ｃｙ７）、ＮＫ１．１（ＰＫ１３６／ＡＰＣ）、ＣＤ４（ＧＫ１．５／ＡＰＣ－Ｈ７）、ＴＣＲβ（Ｈ５７－５９７/ＢＶ４２１）及び固定可能な生死判別色素（ＦＶＤ）（Ｈｏｒｉｚｏｎ ５１０）であった。
染色Ａによって同定した細胞集団は、
αβ Ｔ細胞：ＣＤ４５．２＋、ＴＣＲβ＋
ＣＤ４ αβ Ｔ細胞：ＣＤ４５．２＋、ＴＣＲβ＋、ＣＤ４＋
ＣＤ８ αβ Ｔ細胞：ＣＤ４５．２＋、ＴＣＲβ＋、ＣＤ８＋
γδＴ細胞：ＣＤ４５．２＋、ＴＣＲγδ＋
ＮＫＴ細胞：ＣＤ４５．２＋、ＴＣＲβ＋、ＮＫ１．１＋
Ｂ細胞：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１９＋
ＮＫ細胞：ＣＤ４５．２＋、ＴＣＲβ－、ＴＣＲγδ-、ＮＫ１．１＋
であった。
染色Ｂ
染色Ｂに使用した抗体／クローン／フルオロクロムは、ＭＨＣ ＩＩ（ＭＳ／１１４．１５．２／Ａｌｅｘａ４８８）、ＦｃεＲｌα（ＭＡＲ－１／ＰＥ）、Ｓｉｇｌｅｃ Ｆ（Ｅ５０－２４４０／ＰＥ－ＣＦ５９４）、Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８／ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＣＤ４５．２（１０４／ＰＥ－Ｃｙ７）、Ｌｙ６Ｃ（ＡＬ－２１／ＡＰＣ）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０／ＡＰＣ－Ｃｙ７）、ＣＤ１１７（２Ｂ８／ＢＶ４２１）及び固定可能な生死判別色素（ＦＶＤ）（Ｈｏｒｉｚｏｎ ５１０）であった。
染色Ｂによって同定した細胞集団は、
骨髄細胞：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋
好中球：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ＋
好酸球：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ－、Ｓｉｇｌｅｃ Ｆ＋、ＳＳＣ高
単球：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ－、Ｓｉｇｌｅｃ Ｆ－、ＳＳＣ低、Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ－
マクロファージ：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ－、Ｓｉｇｌｅｃ Ｆ-、ＳＳＣ低、Ｌｙ６Ｃ－、ＭＨＣＩＩ＋
マスト細胞：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＦｃεＲｌα＋、ＣＤ１１７＋
好塩基球：ＣＤ４５．２＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＦｃεＲｌα＋、ＣＤ１１７－
であった。
インキュベーション（氷上２０分）後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、異なる細胞サブセットをＦＡＣＳによって同定した。
結果
脾臓及びＭＬＮにおける白血球の総数
ＫＯマウスの脾臓における白血球の数は、ＷＴマウスにおける数のおよそ５０％に顕著に減少することが判明した。ＭＬＮにおいて、ＫＯマウスとＷＴマウス間に白血球数に有意差は認められなかった（図２６）。
αβ Ｔ細胞
脾臓内のαβ Ｔ細胞の総数は、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスで減少することが判明した。この減少は、総ＣＤ４５＋白血球について観察されたものと類似している。ＭＬＮでは、αβ Ｔ細胞の数に有意差は認められなかった。総ＣＤ４５＋細胞の中のαβ Ｔ細胞の割合は、ＷＴマウスと比較してＫＯの脾臓及び血液においてより高いことが判明したが、ＭＬＮでは差は認められなかった。脾臓では、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比は、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスにおいてより高かった。
γδ Ｔ細胞
脾臓中のγδ Ｔ細胞の総数は、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスで減少することが判明した。この減少は、総ＣＤ４５＋白血球について観察されたものと類似していた。ＭＬＮでは、この減少は脾臓でさらにより顕著であった。ＭＬＮにおけるＣＤ４５＋細胞の中のγδ Ｔ細胞の割合も、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスにおいてより低いことが判明した。脾臓と血液にはそのような差は認められなかった。
ＮＫＴ細胞
脾臓中のＮＫＴ細胞の総数は、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスで減少することが判明した。この減少は、総ＣＤ４５＋白血球について観察されたものと類似していた。ＭＬＮでは、ＮＫＴ細胞の数に有意差は認められなかった。血液中のＣＤ４５＋細胞の中のＮＫＴ細胞の割合は、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスにおいてより低いことが判明した。脾臓とＭＬＮではそのような差は認められなかった。
Ｂ細胞
脾臓内のＢ細胞の総数は、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスで減少することが判明した。この減少は、総ＣＤ４５＋白血球について観察されたものと類似していた。ＭＬＮでは、Ｂ細胞の数に有意差は認められなかった。脾臓及び血液中のＣＤ４５＋細胞の中のＢ細胞の割合は、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスにおいてより低いことが判明した。ＭＬＮではそのような差は認められなかった。
ＮＫ細胞
脾臓中のＮＫ細胞の総数は、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスで減少することが判明した。この減少は、総ＣＤ４５＋白血球及び他のリンパ球サブセットについて観察されたものと比較して、ＮＫ細胞においてより顕著であることが判明した。ＭＬＮでは、ＮＫ細胞数に有意差は認められなかった。脾臓及び血液中では、ＣＤ４５＋細胞の中のＮＫ細胞の割合は、ＷＴマウスと比較して、ＫＯマウスにおいてより低いことが判明した。ＭＬＮではそのような差は認められなかった（図２７）。
骨髄細胞
骨髄細胞の総数は、脾臓とＭＬＮの両方で、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスで減少した。脾臓及びＭＬＮでは、ＣＤ４５＋細胞の中の骨髄細胞の割合は、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスにおいてより低いことが判明した。血液中ではそのような差は認められなかった。
好中球
ＫＯマウス及びＷＴマウスと比較して、脾臓又はＭＬＮでは、好中球の数に有意差は認められなかった。血液中の好中球の割合は、ＫＯマウスにおいてより高かったが、脾臓及びＭＬＮでは有意差は示されなかった。
好酸球
ＫＯマウス及びＷＴマウスと比較して、脾臓又はＭＬＮでは好酸球数に有意差は認められなかった。血液中の好酸球の割合は、ＫＯにおいてより高いことが判明したが、脾臓及びＭＬＮでは有意差は示されなかった。
単球
単球の総数は、脾臓とＭＬＮの両方において、ＷＴマウスと比較してＫＯにおいてより低いことが判明した。調べたいずれの臓器でもＫＯマウスとＷＴマウスの間で単球の割合に有意差は認められなかった。
マクロファージ
マクロファージの総数は、脾臓とＭＬＮの両方において、ＷＴマウスと比較してＫＯにおいてより低いことが判明した。調べたいずれの臓器でもＫＯマウスとＷＴマウスの間でマクロファージの割合に有意差は認められなかった。
マスト細胞
ＫＯマウスとＷＴマウスの間で、脾臓及びＭＬＮにおけるマスト細胞の数に有意差は認められなかった。脾臓におけるマスト細胞の割合は、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスにおいてより高かった。血液又はＭＬＮでは差は認められなかった。
好塩基球
脾臓の好塩基球の総数は、ＷＴマウスと比較してＫＯにおいてより低いことが判明した。ＭＬＮでは、好塩基球数の差は認められなかった。血液中の好塩基球の割合は、ＷＴマウスと比較してＫＯにおいてより高いことが判明した。脾臓又はＭＬＮではそのような差は認められなかった。
結論
ＣＤ４５＋白血球に対する全体的な影響に加えて、データは、特にＮＫ細胞におけるさらなる影響を示唆しており、すなわち、ＣＤ４５＋細胞の中のＮＫ細胞の総数と割合の両方が、野生型の同腹仔と比較して、未処置ＢＳＳＬ欠損マウスの血液及び脾臓においてより低かった。これらのデータは、ＡＳ２０ ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－ＰＧ（９０ｍｇ／ｋｇ投与量）による治療が、ＣＡＩＡを有するマウスの脾臓中のＣＤ４５＋細胞の中のＮＫ細胞の総数並びにＴ細胞、ＮＫＴ細胞及びＮＫ細胞の割合を顕著に減少させたことを裏付ける（実施例１９）。
表２９－本明細書で使用する配列と配列番号のリスト
Figure 2022540859000030
Figure 2022540859000031

Figure 2022540859000032

Figure 2022540859000033

Figure 2022540859000034

Figure 2022540859000035

Figure 2022540859000036

Figure 2022540859000037

Figure 2022540859000038

Figure 2022540859000039

Figure 2022540859000040

Figure 2022540859000041

Figure 2022540859000042

Figure 2022540859000043

Figure 2022540859000044

Figure 2022540859000045

Figure 2022540859000046

Figure 2022540859000047

Figure 2022540859000048

Figure 2022540859000049

Figure 2022540859000050

Figure 2022540859000051

Figure 2022540859000052
参考文献
Figure 2022540859000053
Figure 2022540859000054

Claims (49)

  1. 胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）、好ましくはヒトＢＳＳＬ（ｈＢＳＳＬ）に特異的に結合し、
    重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ）；及び
    軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ）
    を含む単離抗体又はその抗原結合断片であって、
    前記第１のＨＣＤＲが、配列番号７によるアミノ酸配列、又は配列番号７と少なくとも８７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＨＣＤＲが、配列番号８によるアミノ酸配列、又は配列番号８と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第３のＨＣＤＲが、配列番号９によるアミノ酸配列、又は配列番号９と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第１のＬＣＤＲが、配列番号１０によるアミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＬＣＤＲが、アミノ酸配列ＡＴＳ、又はアミノ酸配列ＡＴＳ、好ましくはＡＡＳと少なくとも６６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；かつ
    前記第３のＬＣＤＲが、配列番号１１によるアミノ酸配列、又は配列番号１１と少なくとも８７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、
    単離抗体又はその抗原結合断片。
  2. 前記第１のＨＣＤＲが、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＨＣＤＲが、配列番号８、配列番号１８及び配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第３のＨＣＤＲが、配列番号９によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第１のＬＣＤＲが、配列番号１０及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＬＣＤＲが、ＡＴＳ及びＡＡＳからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；かつ
    前記第３のＬＣＤＲが、配列番号１１、配列番号２１及び配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなる、
    請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  3. 前記第１のＨＣＤＲが、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＨＣＤＲが、配列番号８によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第３のＨＣＤＲが、配列番号９によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第１のＬＣＤＲが、配列番号１０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＬＣＤＲが、アミノ酸配列ＡＴＳを含み、好ましくは、それからなり；かつ
    前記第３のＬＣＤＲが、配列番号１１によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなる、
    請求項２に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  4. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、
    配列番号１２によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＨＣＤＲ；
    配列番号１４によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第１のＬＣＤＲ；かつ
    配列番号１５によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＬＣＤＲ
    を含む、請求項３に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記ＨＣＶＲが、配列番号３６によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；かつ／又は
    前記ＬＣＶＲが、配列番号３７によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、
    請求項３又は４に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、
    配列番号１２によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＨＣＤＲ；
    配列番号１６によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第１のＬＣＤＲ；かつ
    配列番号１７によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＬＣＤＲ
    を含む、請求項３に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  7. 前記ＨＣＶＲが、配列番号３６によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；かつ／又は
    前記ＬＣＶＲが、配列番号３８によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、
    請求項３又は６に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  8. 前記第１のＨＣＤＲが、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＨＣＤＲが、配列番号１８によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第３のＨＣＤＲが、配列番号９によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第１のＬＣＤＲが、配列番号１０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＬＣＤＲが、アミノ酸配列ＡＴＳを含み、好ましくは、それからなり；かつ
    前記第３のＬＣＤＲが、配列番号２１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、
    請求項２に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  9. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、
    配列番号２３によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＨＣＤＲ；
    配列番号１６によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第１のＬＣＤＲ；
    配列番号１５によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＬＣＤＲ
    を含む、請求項８に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  10. 前記ＨＣＶＲが、配列番号３０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；かつ／又は
    前記ＬＣＶＲが、配列番号３１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、
    請求項８又は９に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  11. 前記第１のＨＣＤＲが、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＨＣＤＲが、配列番号８によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第３のＨＣＤＲが、配列番号９によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第１のＬＣＤＲが、配列番号２０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＬＣＤＲが、アミノ酸配列ＡＡＳを含み、好ましくは、それからなり；かつ
    前記第３のＬＣＤＲが、配列番号１１によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、
    請求項２に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  12. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、
    配列番号２４によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＨＣＤＲ；
    配列番号２７によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第１のＬＣＤＲ；
    配列番号２９によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＬＣＤＲ
    を含む、請求項１１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  13. 前記ＨＣＶＲが、配列番号３２によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；かつ／又は
    前記ＬＣＶＲが、配列番号３３によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、
    請求項１１又は１２に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  14. 前記第１のＨＣＤＲが、配列番号７によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＨＣＤＲが、配列番号１９によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第３のＨＣＤＲが、配列番号９によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第１のＬＣＤＲが、配列番号２０によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    前記第２のＬＣＤＲが、アミノ酸配列ＡＴＳを含み、好ましくは、それからなり；かつ
    前記第３のＬＣＤＲが、配列番号２２によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、
    請求項２に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  15. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、
    配列番号２５によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＨＣＤＲ；
    配列番号２６によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第１のＬＣＤＲ；
    配列番号２８によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる拡張した第２のＬＣＤＲ
    を含む、請求項１４に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  16. 前記ＨＣＶＲが、配列番号３４によるアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；かつ／又は
    前記ＬＣＶＲが、配列番号３５によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、
    請求項１４又は１５に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  17. 前記ＨＣＶＲが、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、及び配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、請求項１又は２に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  18. 前記ＬＣＶＲが、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７及び配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、請求項１又は２に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  19. 胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）、好ましくはヒトＢＳＳＬ（ｈＢＳＳＬ）に特異的に結合し、
    ＺＨ１－［ＧＹＴＦＴＳＹＮ］－ＺＨ２－［Ｘ５３ＧＶＩＸ５７ＰＧＤＧＸ６４ＴＳＹＸ６８ＱＫＦＸ７２］－ＺＨ３－［ＡＲＤＹＹＧＳＳＰＬＧＹ］－ＺＨ４から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）であって、式中、
    ＺＨ１、ＺＨ２、ＺＨ３及びＺＨ４の各々が、独立してゼロ、１個又はいくつかの独立して選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ５３がＩ及びＭから選択され；
    Ｘ５７がＮ及びＹから選択され；
    Ｘ６４がＡ及びＳから選択され；
    Ｘ６８がＡ及びＮから選択され；かつ
    Ｘ７２がＫ及びＱから選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び
    ＺＬ１－［Ｘ２４ＡＳＸ２７ＳＩＳＹＸ３９Ｎ］－ＺＬ２－［ＡＸ５７ＳＸ６６ＬＸ６８］－ＺＬ３－［ＨＱＲＳＳＸ１１５ＰＴ］－ＺＬ４から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）であって、式中、
    ＺＬ１、ＺＬ２、ＺＬ３及びＺＬ４の各々が、独立してゼロ、１個又はいくつかの独立して選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２４がＳ及びＲから選択され；
    Ｘ２７がＳ及びＰから選択され；
    Ｘ３９がＭ及びＬから選択され；
    Ｘ５７はＡ及びＴから選択され；
    Ｘ６６がＫ及びＳから選択され；
    Ｘ６８がＡ及びＰから選択され；かつ
    Ｘ１１５がＳ、Ｔ及びＹから選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、
    を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
  20. ＺＨ１が、配列番号３９によるアミノ酸配列、又は配列番号３９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    ＺＨ２が、配列番号４０によるアミノ酸配列、又は配列番号４０と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    ＺＨ３が、配列番号４１によるアミノ酸配列、又は配列番号４１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    ＺＨ４が、配列番号４２によるアミノ酸配列、又は配列番号４２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    ＺＬ１が、配列番号４３によるアミノ酸配列、又は配列番号４３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    ＺＬ２が、配列番号４４によるアミノ酸配列、又は配列番号４４と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；
    ＺＬ３が、配列番号４５によるアミノ酸配列、又は配列番号４５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり；かつ／又は
    ＺＬ４が、配列番号４６によるアミノ酸配列、又は配列番号４６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、
    請求項１９に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  21. 胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）、好ましくはヒトＢＳＳＬ（ｈＢＳＳＬ）のエピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、
    前記エピトープが、
    配列番号１によるアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の表面、及び
    配列番号２によるアミノ酸配列、又は配列番号２と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％若しくは少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の表面、
    を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
  22. 前記第１の表面が、配列番号３によるアミノ酸配列、又は配列番号３と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは、少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  23. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、さらに、
    配列番号５によるアミノ酸配列、又は配列番号５と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列；
    配列番号４によるアミノ酸配列、又は配列番号４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８８％、少なくとも９４％などの同一性を有するアミノ酸配列、並びに
    配列番号６によるアミノ酸配列、又は配列番号６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８４％、及びより好ましくは少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列、
    からなる群から選択される表面に特異的に結合する、請求項２１又は２２に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  24. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、ヒト抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体又はそれらの抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  25. 前記抗原結合断片が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）３断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、単離相補性決定領域（ＣＤＲ）及びナノボディ、好ましくはｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  26. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  27. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、好ましくはＩｇＧ、及びより好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４からなる群から選択されるアイソタイプクラスである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  28. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、Ｆｃ受容体との相互作用を阻害する少なくとも１つのＦｃサイレンシング変異を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  29. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、ＩｇＧアイソタイプクラスのものであり、少なくとも１つのＦｃサイレンシング変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇからなる群から選択される、請求項２９に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  30. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、インビボＦａｂアーム交換を防ぐ又は低下させる少なくとも１つの安定化変異を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  31. 前記単離抗体又はその抗原結合断片が、ＩｇＧ４アイソタイプサブクラスのものであり、少なくとも１つの安定化変異がＳ２２８Ｐである、請求項３１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  32. 請求項１～３１のいずれか一項に記載の単離抗体及び／又はその抗原結合断片、並びに医薬として許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
  33. 医薬として使用するための請求項１～３１のいずれか一項に記載の単離抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項３２に記載の医薬組成物。
  34. 炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用するための請求項１～３１のいずれか一項に記載の単離抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項３２に記載の医薬組成物。
  35. 前記炎症性疾患が慢性炎症性疾患である、請求項３４に記載の使用のための単離抗体若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物。
  36. 前記炎症性疾患が全身性炎症性疾患である、請求項３４に記載の使用のための単離抗体若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物。
  37. 前記炎症性疾患が自己免疫疾患である、請求項３４に記載の使用のための単離抗体若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物。
  38. 前記炎症性疾患が自己炎症性疾患である、請求項３４に記載の使用のための単離抗体若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物。
  39. 前記炎症性疾患がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性炎症性疾患である、請求項３４に記載の使用のための単離抗体若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物。
  40. 前記炎症性疾患が、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、乾癬性関節炎、クローン病又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、及び肝性脊椎症からなる群から選択される、請求項３４に記載の使用のための単離抗体若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物。
  41. 請求項１～３１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
  42. 請求項４１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  43. 請求項１～３１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項４１に記載のポリヌクレオチド、及び／又は請求項４２に記載の発現ベクターを含む細胞。
  44. 抗体又はその抗原結合断片を生成する方法であって、
    前記抗体又はその抗原結合断片が前記細胞によって発現される条件下で、請求項４２に記載の発現ベクターを含む請求項４３に記載の細胞を培養すること；及び
    必要に応じて、前記細胞又は前記細胞が培養される培地から前記抗体又はその抗原結合断片を単離すること、
    を含む方法。
  45. 試料中の胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）の有無を検出する方法及び／又はＢＳＳＬの量を定量する方法であって、
    請求項１～３１のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片と前記試料を接触させること；並びに
    前記試料中のＢＳＳＬの有無を検出すること及び／又はＢＳＳＬに結合した単離抗体又はその抗原結合断片の量に基づいて前記試料中のＢＳＳＬの量を定量すること
    を含む方法。
  46. 胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）関連障害の診断方法であって、
    ａ）請求項１～３１のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片と対象からの試料を接触させること；
    ｂ）前記試料中のＢＳＳＬの有無を検出すること及び／又はＢＳＳＬに結合した単離抗体又はその抗原結合断片の量に基づいてＢＳＳＬの量を定量すること；並びに
    ｃ）工程ｂ）の結果に基づいて、前記対象がＢＳＳＬ関連障害に罹患しているかどうかを結論付けること、
    を含む方法。
  47. 配列番号１によるアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の表面；及び
    配列番号２によるアミノ酸配列、又は配列番号２と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の表面、
    を含む胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）エピトープ。
  48. 前記第１の表面が、配列番号３によるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる、請求項４７に記載のＢＳＳＬエピトープ。
  49. さらに、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる表面を含む、請求項４７又は４８に記載のＢＳＳＬエピトープ。
JP2022501270A 2019-07-12 2020-07-10 新規ｂｓｓｌ抗体 Pending JP2022540859A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1950888 2019-07-12
SE1950888-6 2019-07-12
PCT/SE2020/050728 WO2021010888A1 (en) 2019-07-12 2020-07-10 Novel bssl antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022540859A true JP2022540859A (ja) 2022-09-20
JPWO2021010888A5 JPWO2021010888A5 (ja) 2022-12-27

Family

ID=74210559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022501270A Pending JP2022540859A (ja) 2019-07-12 2020-07-10 新規ｂｓｓｌ抗体

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220267469A1 (ja)
EP (1) EP3999115A4 (ja)
JP (1) JP2022540859A (ja)
KR (1) KR20220034775A (ja)
CN (1) CN114096275A (ja)
AU (1) AU2020315684A1 (ja)
BR (1) BR112022000391A2 (ja)
CA (1) CA3146193A1 (ja)
IL (1) IL289639A (ja)
MX (1) MX2022000484A (ja)
WO (1) WO2021010888A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023060137A2 (en) * 2021-10-05 2023-04-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising b7-h3 binding polypeptides
WO2024080920A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 Lipum Ab Anti-bssl antibodies for the treatment of cancer

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9501939D0 (sv) * 1995-05-24 1995-05-24 Astra Ab DNA molecules for expression of polypeptides
CA2558754C (fr) * 2004-03-31 2015-09-22 Universite De La Mediterranee Glycopeptides derives de structures pancreatiques, anticorps et leurs applications en diagnostic et therapeutique
EP1840573A1 (en) * 2006-03-27 2007-10-03 Institut Pasteur Secreted proteins as early markers and drug targets for autoimmunity, tumorigenesis and infections
AU2008258503A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-11 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Compositions and methods for treating pancreatic tumors
US8597650B2 (en) * 2009-04-08 2013-12-03 Olle Hernell Methods for treating rheumatoid arthritis with anti-bile salt-stimulated lipase (BSSL) antibodies
ES2692268T3 (es) * 2011-03-29 2018-12-03 Roche Glycart Ag Variantes de Fc de anticuerpo
UA118028C2 (uk) * 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
BR112016009919A2 (pt) * 2013-11-04 2017-12-05 Glenmark Pharmaceuticals Sa imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma e método para produzir in vitro uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma

Also Published As

Publication number Publication date
BR112022000391A2 (pt) 2022-03-03
EP3999115A4 (en) 2023-11-22
IL289639A (en) 2022-03-01
WO2021010888A1 (en) 2021-01-21
US20220267469A1 (en) 2022-08-25
CA3146193A1 (en) 2021-01-21
AU2020315684A1 (en) 2021-12-16
MX2022000484A (es) 2022-02-03
EP3999115A1 (en) 2022-05-25
CN114096275A (zh) 2022-02-25
KR20220034775A (ko) 2022-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2010270241B2 (en) Humanised antibodies to Toll-like Receptor 2 and uses thereof
US10266607B2 (en) Antibody binding to TFPI and composition comprising the same
JP2014511378A (ja) Ｐｃｓｋ９アンタゴニスト
KR20140003467A (ko) 항il-18 항체 및 그의 용도
TW201726731A (zh) 對TNF-α、IL-17A及IL-17F具特異性之多重特異性抗體分子
US20160159922A1 (en) Novel Antibodies for the Diagnosis and Treatment of Rheumatoid Arthritis
KR102602564B1 (ko) 인터루킨-6의 인간 수용체에 결합가능한 항체 또는 항원 결합성 단편
US20220267469A1 (en) Novel bssl antibodies
WO2017114230A1 (zh) Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2022136685A1 (en) Antibody compositions for treatment of corona virus infection
WO2018228406A1 (zh) Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2013109185A1 (en) Novel antibodies
JP2019508415A (ja) 抗シトルリン化ｈｌａポリペプチド抗体及びその使用
WO2021087462A1 (en) Rage antibodies, fragments and uses thereof
WO2023143564A1 (en) Antibody against btla and uses thereof
IL311153A (en) Bispecific antibody and its use
OA19502A (en) Antibody Or An Antigen-Binding Fragment Thereof Capable Of Binding To A Human Receptor Of Interleukin-6.
TW201702263A (zh) 抗－ｃｄ２０－／抗－ｂａｆｆ雙特異性抗體

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221215

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230621