CN114096275A - 新型bssl抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合人胆汁盐刺激的脂肪酶(hBSSL)的新型分离的抗体及其抗原结合片段。所述抗体及其抗原结合片段结合位于hBSSL的N端部分并鉴定为包含氨基酸残基7‑12和氨基酸残基42‑55的先前未表征的表位。本5发明还涉及抗体和/或其抗原结合片段的医学用途，特别是在治疗炎性病症中的医学用途，并且涉及相关的药物组合物。

Description

新型BSSL抗体
技术领域
本发明涉及新型分离的抗体及其抗原结合片段，其结合位于胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)蛋白的N端部分的BSSL的先前未表征的表位。本文还涉及抗体及其抗原结合片段的医学用途，特别是在治疗炎性病症中的医学用途，并且涉及相关的药物组合物。本文还公开了抗体或其抗原结合片段作为分子工具在检测BSSL和/或诊断BSSL相关疾病中的用途。
背景技术
炎性病症，包括自身免疫和自身炎性疾病，仍然是对人健康的重大威胁。尽管炎性病症的治疗取得了进展，但仍在寻求改进的疗法。
炎性病症包括大量以炎症为特征的疾患和疾病，包括自身免疫疾病和自身炎性疾病。炎症可以例如作为对感染、损伤、过敏原和/或毒素的反应，或作为对身体本身的反应，例如自身免疫过程而发生。当身体的免疫系统错误地攻击和破坏健康的身体组织时，发生自身免疫疾病。据报道，有超过约80种已知的自身免疫疾病。
一些炎性病症是慢性的。当炎症反应持续时发生慢性炎症，使身体处于恒定的警觉状态。包括慢性炎症的炎性疾病和病症的实例是类风湿性关节炎(RA)、幼年特发性关节炎(JIA)、银屑病关节炎(PsA)和炎性肠病(IBD)，例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。
RA是一种慢性、炎性、全身性自身免疫疾病。目前用于RA的疗法包括用于疼痛治疗的非甾体抗炎药(NSAID)、缓解疾病的抗风湿药(DMARD)和靶向特定促炎细胞因子或各种细胞类型的细胞表面受体的生物剂。
JIA，也称为幼年型类风湿性关节炎(JRA)，是儿童和青少年中最常见的关节炎形式。JIA在16岁之前发作，并且JIA的原因在很大程度上是未知的。治疗JIA的主要重点是帮助儿童恢复正常的身体和社会活动水平。大多数儿童用NSAID和关节内皮质类固醇注射治疗。甲氨蝶呤，DMARD是一种强有力的药物，在大多数患有多关节炎的JIA患者中帮助抑制关节炎症，尽管据报道它在系统性关节炎中的有用性较低，并且许多儿童接受TNFα抑制剂药物，例如依那西普。
IBD是用于描述涉及消化道中慢性炎症的疾患的术语。IBD包括UC和CD。
IBD治疗的目标是减少引发体征和症状的炎症。在最佳情况下，这不仅可导致症状缓解，而且可导致长期缓解和降低并发症的风险。IBD治疗通常涉及药物疗法，例如抗炎药(NSAID)、免疫系统抑制剂和/或生物剂以及手术。
胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)，也称为胆汁盐依赖性脂肪酶(BSDL)、羧基酯脂肪酶(CEL)或胆汁盐活化的脂肪酶(BAL)，是由CEL基因编码的脂解酶，并且在外分泌胰腺中表达并分泌到迄今研究的所有物种的肠腔中，并有助于脂质的消化。
在一些物种中，包括人、灵长类动物、狗、猫和小鼠，BSSL也在泌乳乳腺中表达并分泌到乳汁中。此外，已发现BSSL在健康个体的血清中处于低但显著的水平，并且参与脂蛋白代谢和动脉粥样硬化的调节。还发现BSSL在炎性过程中起作用。
BSSL可以从合适的组织如人乳中分离。或者，可使用标准方法通过分离编码BSSL的DNA来产生重组BSSL。
编码BSSL的DNA可使用常规分子生物学技术如文库筛选和/或聚合酶链式反应(PCR)从市售RNA、cDNA文库、基因组DNA或基因组DNA文库中方便地分离。
从不同组织和转染细胞系中纯化BSSL的方法是本领域已知的[1]。
文献[2]描述了结合BSSL或胎儿腺泡胰腺蛋白(FAPP)的抗原结合化合物。公开了识别BSSL的C端肽(J28表位)的化合物。FAPP是以J28碳水化合物依赖性表位为特征的BSSL的癌胚形式。据说抗原结合化合物诱导表达BSSL或FAPP多肽的肿瘤细胞的细胞凋亡和/或减缓其增殖。文献[2]描述了能够直接靶向肿瘤细胞，特别是表达BSSL或FAPP的胰腺肿瘤细胞，并通过细胞凋亡引起其死亡和/或停止其增殖的化合物。
文献[3,4]描述了BSSL在炎症过程中起作用并且抑制或消除BSSL防止动物模型中慢性关节炎发展的发现。文献[3,4]公开了BSSL蛋白存在于炎性细胞和发炎组织中，并且保护BSSL缺陷小鼠免于炎性疾病的发展，例如胶原诱导的关节炎(CIA)。
尽管多年来通过引入新的药物和药物种类(例如抗体)已经显著改善炎性病症(例如自身炎性疾病和自身免疫疾病)的疗法，但是大多数方案和药物仍然具有共同点，即它们旨在抑制免疫系统，例如使用所有TNFα抑制剂药物和皮质类固醇的情况。这又增加了继发感染和并发症的风险。
因此，仍然存在对用于治疗、预防和防止炎性疾病的新的选择性药物，优选生物药物的显著临床需求，这些药物针对参与炎性信号传导和过程的不同的和/或新的靶标，并且其主要不通过抑制免疫系统起作用，并且因此预期其具有较少和/或较不严重的副作用。
发明内容
一般目的是提供特异性结合胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)如人BSSL(hBSSL)的抗体或其抗原结合片段。
如本文所公开的实施方案满足了这个和其它目的。
本发明由独立权利要求限定。本发明的其它实施方案在从属权利要求中限定。
本发明的一个方面涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)的三个互补决定区(CDR)，表示为HCDR，和轻链可变区(LCVR)的三个CDR，表示为LCDR。在此方面，第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ IDNO:8具有至少75％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ IDNO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少83％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。此外，第一LCDR包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含氨基酸序列ATS或与氨基酸序列ATS具有至少66％同一性的氨基酸序列优选AAS，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
本发明的另一方面涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含由选自ZH1-[GYTFTSYN]-ZH2-[X53GVIX57PGDGX64TSYX68QKFX72]-ZH3-[ARDYYGSSPLGY]-ZH4的氨基酸序列组成的重链可变区(HCVR)和由选自ZL1-[X24ASX27SISYX39N]-ZL2-[AX57SX66LX68]-ZL3-[HQRSSX115PT]-ZL4的氨基酸序列组成的轻链可变区(LCVR)。在这方面，ZH1、ZH2、ZH3和ZH4各自独立地表示零个、一个或若干个独立选择的氨基酸残基，X53选自I和M，X57选自N和Y，X64选自A和S，X68选自A和N，且X72选自K和Q。此外，ZL1、ZL2、ZL3和ZL4各自独立地表示零个、一个或若干个独立选择的氨基酸残基，X24选自S和R，X27选自S和P，X39选自M和L，X57选自A和T，X66选自K和S，X68选自A和P，并且X115选自S、T和Y。
本发明的另一方面涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合BSSL优选hBSSL的表位。所述表位包含第一表面和第二表面，所述第一表面包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％，优选至少83％同一性的氨基酸序列，并且所述第二表面包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％，优选至少85％或至少92％同一性的氨基酸序列。
本发明的又另一方面涉及包含根据上述分离的抗体和/或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。
本发明的其它方面涉及根据上述分离的抗体或其抗原结合片段，或根据上述药物组合物，其用作药物，并用于治疗和/或预防炎性疾病。
本发明的一个相关方面限定了根据上述的分离的抗体或其抗原结合片段或根据上述的药物组合物用于制造用于治疗和/或预防炎性疾病的药物的用途。
本发明的另一个相关方面限定了用于治疗和/或改善和/或防止和/或预防炎性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据上述的分离的抗体或其抗原结合片段或根据上述的药物组合物。
本发明的其它方面涉及编码根据上述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，包含所述多核苷酸的表达载体和包含根据上述的抗体或其抗原结合片段，根据上述的多核苷酸和/或根据上述的表达载体的细胞。
本发明的另一方面涉及用于检测样品中是否存在BSSL和/或定量BSSL的量的方法。所述方法包括使样品与根据上述的分离的抗体或其抗原结合片段接触，并检测样品中是否存在BSSL和/或基于结合BSSL的分离的抗体或其抗原结合片段的量定量样品中BSSL的量。
本发明的另一方面涉及用于诊断BSSL相关疾患的方法。所述方法包括使来自受试者的样品与根据上述的分离的抗体或其抗原结合片段接触，并检测样品中是否存在BSSL和/或基于结合BSSL的分离的抗体或其抗原结合片段的量定量样品中BSSL的量。所述方法还包括基于检测和/或定量的结果，断定受试者是否患有BSSL相关疾患。
本发明的又另一方面涉及包含第一表面和第二表面的BSSL表位，所述第一表面包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％，优选至少83％同一性的氨基酸序列，并且所述第二表面包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％，优选至少85％或至少92％同一性的氨基酸序列。
本发明的抗体及其抗原结合片段结合hBSSL中不同于酶活性位点的先前未表征的表位。因此，抗体及其抗原结合片段可以结合hBSSL而不与hBSSL的酶活性竞争。本发明的抗体及其抗原结合片段可用于治疗和/或预防炎性病症，同时减轻当前疗法的上述和其它缺点。
附图说明
通过结合附图参考以下描述，可以最好地理解实施方案及其进一步的目的和优点，其中：
图1显示hBSSL和固定的AS20 mIgG1之间的相互作用。将传感图拟合到1:1结合模型。由于拟合良好，无法区分传感图和拟合线。
图2显示了mBSSL和固定的AS20 mIgG1之间相互作用的稳态分析。KD取自最大反应的一半，其中已针对高体积效应自动校正max，偏移量为-173RU(从顶部)。图中没有去除体积效应。
图3a显示了说明AS20 scFv ELISA结合非生物素化和生物素化人BSSL的图。显示的吸光度值(y轴)是重复的平均值。图3b显示了说明AS20 scFv ELISA结合小鼠和人BSSL以及非相关蛋白的图。显示的吸光度值(y轴)是重复的平均值。
图4显示了分析AS20 scFv(左条)结合人BSSL和30种不同的非相关蛋白质的能力的多重珠测定
Figure BDA0003464862550000071
的结果的条形图。预期结合b非相关蛋白_1的阳性对照scFv，非相关scFv_1(右条)也包括在测定中。
图5显示了分析AS20 scFv与小鼠和人BSSL结合的基于HTRF的竞争测定的结果。
图6是AS20、AS20 CDR移植物和AS20人源化文库支架之间的序列比较。*表示阅读框中的终止，引入LCDR3中以保证只有在此区域诱变的克隆在噬菌体上展示。X表示AS20人源化文库中诱变的位置。CDR的边界由Kabat定义，并且残基编号由IMGT命名法定义[5]。根据IMGT，eHCDR2、eLCDR1和eLCDR2表示包括在相应CDR区之外的氨基酸位置的延伸的HCDR2、LCDR1和LCDR2区。
图7是显示如实例12中所述在A)+40℃和B)+4℃下的尺寸排阻色谱数据趋势的图。
图8是显示对每个候选物绘制的平均Tm1(圆形)和Tm2(正方形)值的图。条表示标准偏差；a)+4℃b)+40℃。
图9显示来自DLS分析的结果，显示候选物的强度与大小。分别在-80℃(虚线箭头)、+4℃(点线箭头)和+40℃(实心箭头)下储存30天后分析样品。
图10是具有预先命名的抗体候选物的指定表位区的BSSL结构的图示(S-SL048-11、S-SL048-46、S-SL048-106、S-SL048-116、S-SL048-118的aa 7-12；S-SL048-11、S-SL048-46、S-SL048-106、S-SL048-116、S-SL048-118的aa 42-55；S-SL048-46的aa 84-101；S-SL048-116的aa 174-180；S-SL048-11的aa 283-295)。
图11是具有突出显示的潜在翻译后责任的S-SL048-106 svFv的表示。
图12是t-hBSSL的卡通表示，示出了“烘箱手套”视图和用虚线圈起的表位以及手套背面周围的浅灰色。链显示为箭头，螺旋显示为螺线。
图13在左图中显示了以深灰色表面表示的t-hBSSL，与AS20-Fab相互作用的序列为浅灰色。重链和轻链的可变区以带状表示显示(轻链用灰色，重链用黑色)。右图显示了相同的视图，但是t-hBSSL以“棍”表示，其中活性位点三元组以黑色突出显示。在左图中，活性位点隐藏在表面下。
图14是显示38种候选scFv之间氨基酸序列差异的表格。
图15A和15B是如实施例5所述的重链可变区的组合scFv文库的设计概述。
图16A和16B是如实施例5所述的轻链可变区的组合scFv文库的设计概述。
图17是显示根据实施例20的BSSL活性测定的图。A)和B)显示甘油三酯水解测定的结果，并且C)和D)显示胆固醇酯水解测定的结果。注意，嵌合AS20在图中表示为AS20。
图18示出了关节炎严重程度。CIA-MAB-50注射后在小鼠中发展CAIA，治疗方式：(A)从第-1天至第15天，每4天同种型对照抗NP hIgG1 LALA-PG(90mg/kg)，AS20 hIgG1LALA-PG(90、30和10mg/kg)。(B)同种型对照和AS20 hIgG1 LALA-PG 90mg/kg。(C)同种型对照和AS20 IgG1 LALA-PG 30mg/kg。(D)同种型对照和AS20hIgG1 LALA-PG 10mg/kg。出于伦理原因(高分)，在终止前(第12天)取出两只动物，一只在AS20 hIgG1 LALA-PG 10mg/kg组中，一只在同种型对照组中。这些动物包括在结果中，直至取出当天。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01。
图19示出了疾病参数图。CAIA疾病参数包括从第-1天至第15天，每4天使用同种型对照抗NP hIgG1 LALA-PG(90mg/kg)、AS20hIgG1 LALA-PG(90、30和10mg/kg)i.p.治疗的动物。(A)平均CAIA得分(实验期间得分总和除以评分天数)。(B)最大CAIA得分。(C)总疾病负担(AUC)。(D)抑制百分比。出于伦理原因(高分)，在终止前(第12天)取出两只动物，一只在AS20 hIgG1 LALA-PG 10mg/kg组中，一只在同种型对照组中。这些动物仅包括在最大得分中。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01。
图20示出了细胞子集总数的图。数据表示为平均值±SD。
图21示出了细胞子集百分比的图。数据表示为平均值±SD。
图22示出了绘制为卡通的Fab-BSSL复合物的结构。具有轻链和重链的S-SL048-116 Fab与BSSL的二聚复合物。将相同的复合体向右旋转180°。
图23BSSL和S-SL048-116 Fab之间的相互作用。具有轻链和重链的Fab的与BSSL相互作用的可变Ig结构域。将表位的两个重要氨基酸Arg 176和Gln 52绘成球和棍。
图24示出了关节炎严重程度。CIA-MAB-50注射后在小鼠中发展CAIA，治疗方式：(A)从第-1天至第15天，每4天媒介物和S-SL048-116(SOL-116)(90、30和10mg/kg)。(B)媒介物和S-SL048-116，90mg/kg。(C)媒介物和S-SL048-116，30mg/kg。(D)媒介物和S-SL048-116，10mg/kg。出于伦理原因，在终止前取出三只动物，2只在媒介物组中(第7天和第15天)，1只在90mg/kg组中(第12天)。这些动物包括在结果中直至取出当天，将第7天取出的动物从数据中完全排除。数据表示为平均值±SEM。
图25示出了CAIA疾病参数，包括以不同剂量(90、30和10mg/kg)使用媒介物和S-SL048-116(SOL-116)i.p.治疗的动物。(A)平均CAIA得分(实验期间得分总和除以评分天数)。(B)最大CAIA得分。(C)总疾病负担(AUC)。(D)抑制百分比。出于伦理原因，在终止前取出三只动物，2只在媒介物组中(第7天和第15天)，1只在90mg/kg组中(第12天)。这些动物仅包括在最大得分中。数据表示为平均值±SEM。
图26示出了(A)脾和(B)肠系膜淋巴结中的白细胞总数。数据表示为平均值±SEM。**p<0.01。
图27示出了(A)脾、(B)血液和(C)肠系膜淋巴结中CD45+细胞中NK细胞的比例。数据表示为平均值±SEM。****p<0.001。
具体实施方式
定义
术语“分离的”当与抗体结合使用时，例如在表述“分离的抗体”等中，是指抗体已经从其原始环境中移除。本文所用的分离的抗体是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体，例如，特异性结合BSSL，特别是人BSSL(hBSSL)的分离的抗体基本上不含特异性结合BSSL以外的抗原的抗体。然而，特异性结合hBSSL的分离的抗体可与其它抗原如来自其它物种的BSSL分子如小鼠或鼠BSSL(mBSSL)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。例如，分离的抗体或其抗原结合片段可以纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳，例如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳或色谱，例如离子交换或反相高效液相色谱(HPLC)测定。技术人员将理解，尽管每次使用术语“抗体或其抗原结合片段”等时没有明确提及词语“分离的”，但本文涉及分离的抗体或其抗原结合片段。
如本文所用的术语“分离的人源化抗体”等是指已经人源化的分离的抗体。
在本文的上下文中，术语“抗原结合片段”意指抗体的片段或部分，其基本上保留抗原结合特性。抗原结合片段是抗体分子或其衍生物的一部分或区域，其保留相应全长抗体的抗原结合的全部或重要部分。抗原结合片段可包含抗体的一个或多个互补决定区(CDR)序列或这些CDR序列的一部分、重链可变区(HCVR)的一部分或全部、轻链可变区(LCVR)的一部分或全部、或其组合。在一个实施方案中，抗体的抗原结合片段可以由其获得的抗体的连续氨基酸序列组成，或者可以由抗体的氨基酸序列的不同部分组成，用或不用接头连接在一起。抗原结合片段的实例是单链可变片段(scFv)、Fab片段、F(ab')2片段、F(ab’)3片段、Fab'片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)和纳米抗体。
“单链可变片段(single chain fragment variable)”或“单链可变片段(single-chain variable fragment)”(“scFv”)是免疫球蛋白重链和轻链可变区的融合蛋白，其与通常约10至25个氨基酸的短接头肽连接。相同或不同类型的scFv(对相同或不同表位具有亲和力)可以以本领域技术人员已知的不同方式组合。这种组合的非限制性实例是串联双scFv、双抗体、串联三scFv或三抗体。
术语“表位”是指被免疫系统例如抗体识别的抗原的部分。表位也称为抗原决定簇。
术语“互补位”指结合表位的抗体的部分。
如本文所用，术语“与…结合”、“对…具有亲和力”、“亲和力”等是指抗体或其抗原结合片段与靶分子结合的性质。评价抗体或抗原结合片段对靶分子的结合能力的标准测定法包括例如酶免疫测定法(EIA)，如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白质印迹、放射免疫测定法(RIA)、表面等离子体共振(SPR)、
Figure BDA0003464862550000121
多重测定法和流式细胞术分析。如在实验部分中举例说明的，抗体的结合动力学，例如结合亲和力，也可以通过本领域已知的标准测定，例如通过
Figure BDA0003464862550000122
系统分析来评估。
“特异性结合(specifically binds to)”、“特异性结合(specifically bindingto)”等是指所述分子，例如抗体或其抗原结合片段，特异性结合靶抗原，而不显著结合其它分子。抗体或其抗原结合片段的特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。由抗原与抗体或其抗原结合片段解离的平衡常数表示的亲和力(KD)是抗原决定簇(即表位)与抗体或其抗原结合片段上的抗原结合位点之间的结合强度的量度。KD值越低，抗原决定簇与抗体或其抗原结合片段之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD。如技术人员所清楚的，亲和力可以以本身已知的方式确定，这取决于感兴趣的特定抗原。
通常，抗体或其抗原结合片段将以10-5至10-12摩尔/升(M)或更小，优选10-7至10- 12M或更小，更优选10-8至10-12M的平衡解离常数(KD)，即以105至1012M-1或更大，优选107至1012M-1或更大，更优选108至1012M-1的亲和常数(KA)与其抗原结合。通常，大于10-4M的任何KD值(或低于104M-1的任何KA值)被认为指示非特异性结合。优选地，实施方案的抗体或其抗原结合片段将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，如小于5nM的亲和力结合BSSL。
术语“检测(detection)”、“检测(detecting)”等包括任何检测手段，包括直接和间接检测。
因此在本文中，可变区中的所有氨基酸，包括本文描述的CDR，根据Marie-PauleLefranc[5]所定义的IMGT唯一编号进行编号。
术语“Kabat编号”等是指基于可变区对抗体中的氨基酸残基进行编号的方案。
本文所用的术语“单克隆抗体(monoclonal antibody)”、“单克隆抗体(monoclonal antibodies)”等是指具有单价亲和力的一个或多个抗体，意指单克隆抗体样品中的每个抗体分子与抗原上的相同表位结合。单克隆抗体由相同的免疫细胞制备，所述免疫细胞是独特亲本细胞的克隆，例如杂交瘤细胞系。
本文所用的术语“多克隆抗体”是指针对特定抗原反应的抗体集合，但在所述集合中可能存在例如识别抗原上的不同表位的不同的抗体分子。多克隆抗体通常通过接种合适的哺乳动物，并从哺乳动物的血清中纯化来产生。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种剂或抗体的缀合物。
如本文所用的术语“全长抗体”指任何类别的抗体，如免疫球蛋白D(IgD)、IgE、IgG、IgA、IgM或IgY、或其任何亚类。不同类别抗体的亚基结构和三维构型是众所周知的。
本文所用的术语“嵌合抗体”是指重组或基因工程化的抗体，例如小鼠单克隆抗体，其含有引入以降低抗体免疫原性的来自不同物种例如人的多肽或结构域。
如本文所用，术语“至少一个”应解释为一个或多个。
如本领域技术人员所理解的，本文中提及“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。
如本文所用，“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是本文件的任何载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或故意的突变和/或改变，后代在形态学或总DNA互补上可能不一定与原始亲本细胞完全相同。宿主细胞包括用包含本文核酸的载体转染或感染的细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。
当与多核苷酸、多肽等结合使用时，术语“分离的”是指分子或多肽已经从其原始环境中移除。
如本文所用，如本文所用的术语“同一性％”或“相同％”可使用本领域熟知的方法测定。例如，同一性％计算如下。使用CLUSTAL W算法将查询序列与靶序列进行比对[6]。在对应于最短的比对序列的窗口上进行比较。在一些情况下，最短的比对序列可以是靶序列。在其它情况下，查询序列可以构成最短的比对序列。比较每个位置处的氨基酸残基或核苷酸，并且将查询序列中具有在靶序列中相同对应性的位置的百分比报告为同一性％。
如本文所用，剂的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗或预防结果的量。
应理解，本文所述的方面和实施方案包括“由方面和实施方案组成”和/或“基本上由方面和实施方案组成”。如本文所用，单数形式“一(a)”，“一(an)”和“所述”包括复数个指示物，除非另外指明。
“hIgG1 LALA-PG”如[7]所述。
“hIgG4 S228P，hIgG4 S241P”如[8]所述。
“G-SP140-8”，SP140结合克隆，阴性对照。
“expiHEK293细胞”，源自293细胞系的人细胞，和Expi293TM表达系统的核心组分。
本发明的目的是提供抗体和/或其抗原结合片段，其可用于治疗和/或预防炎性病症，同时减轻现有疗法的前述和其它缺点。此外，本公开的目的是提供用于诊断炎性病症和用于研究胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)蛋白的剂。
更详细地，本发明涉及新型分离的抗体及其抗原结合片段，其结合位于BSSL蛋白的N端部分的BSSL的先前未表征的表位。本文还涉及抗体及其抗原结合片段的医学用途，特别是在治疗炎性病症中的医学用途，并且涉及相关的药物组合物。本文还公开了抗体或其抗原结合片段作为分子工具在检测BSSL和/或诊断BSSL相关疾病中的用途。
在一个实施方案中，每当提及BSSL时，这也包括人BSSL(hBSSL)，除非从上下文中清楚地表明不打算包括hBSSL。
本公开描述了一组新型抗BSSL抗体，包括其抗原结合片段，其结合hBSSL上先前未识别的表位。抗体可以是人源化的或它们的CDR序列移植到非人骨架上。抗体或其抗原结合片段也可结合小鼠或鼠BSSL(mBSSL)，尽管对hBSSL和mBSSL的亲和力可能由于抗体和/或其抗原结合片段所结合的表位中的一个的氨基酸差异而不同。
众所周知，抗体是能够通过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标(抗原)，如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽或其它的免疫球蛋白分子。抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链(HC)和两条轻(L)链(LC)的糖蛋白。重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞，例如效应细胞，和经典补体系统的第一成分，即补体成分1q(C1q)。
本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于抑制或降低BSSL蛋白在与其结合时的至少一些生物活性。例如，结合可显著或完全抑制BSSL蛋白的一些生物活性。考虑到本发明的抗体或其抗原结合片段不结合BSSL的活性位点，本发明的抗体或其抗原结合片段的这些作用是非常令人惊讶的。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段优选不显著抑制或降低BSSL的酶活性，例如不显著抑制或降低BSSL水解胆固醇酯的能力(EC 3.1.1.13)。
抗体或其抗原结合片段可用于降低有需要的受试者中BSSL的促炎作用。因此，抗体或其抗原结合片段可用于治疗和/或预防如本文进一步描述的各种炎性疾病。本发明的抗体或其抗原结合片段的这些医学用途可以在不阻断BSSL的酶活性的情况下实现。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段不会导致由抑制BSSL的酶活性引起的负面影响，而其它抗BSSL抗体与BSSL活性位点结合或连接可能具有这种负面影响。
此外，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于诊断BSSL相关病症，例如BSSL相关炎性病症的诊断目的。
如实验部分所证明的，使用若干种方法来尝试开发人源化BSSL抗体或其抗原结合片段，但尽管起始数目为约1,000,000个候选scFv，发现惊人低的数目显示对hBSSL蛋白的足够结合亲和力。在1,000,000个候选物中，鉴定了68个初始候选物，然后将其减少至38个候选物，并最终减少至5个选择用于进一步评价和表征的候选物。因此，抗BSSL抗体或其抗原结合片段不能容易地使用标准方案人源化，并且仍然对hBSSL具有足够的结合亲和力。因此，抗BSSL抗体或抗原结合片段的人源化已经成为大挑战，所述挑战如本文所述已被克服以获得对hBSSL仍呈现足够结合亲和力的人源化抗体或其抗原结合片段。本发明的这些抗体或其抗原结合片段具有如本文别处所述的共同结构和功能特征。
抗体和抗原结合片段的产生
本发明的抗体及其抗原结合片段以多步方法产生，目的是发现对hBSSL具有足够好的结合亲和力的抗体及其抗原结合片段。本发明的另一个目的是提供人源化抗体及其抗原结合片段。还发现一些鉴定的抗体及其抗原结合片段以足够的结合亲和力结合mBSSL。尽管本发明不限于结合BSSL的人源化抗体，但本文公开了人源化BSSL结合抗体及其抗原结合片段。
基于非人单克隆mBSSL抗体的序列产生抗体及其抗原结合片段。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA获自表达此抗体的非人杂交瘤，并使用标准分子生物学技术进行工程改造以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。
然而，令人惊讶地发现，如实例6中所公开构建的CDR移植物不具有基于用于提供CDR序列的mBSSL抗体所预期的那样高的结合亲和力。因此，为了获得对hBSSL具有足够高结合亲和力的抗体及其抗原结合片段，如实例5中公开的，必须通过将突变引入CDR和相邻FW区域来对抗体的框架(FW)进行进一步修饰。这通过构建用于使用噬菌体展示选择和分离结合小鼠和人BSSL的scFv片段的人源化文库来实现。用于分离人抗体的这种噬菌体展示方法在本领域中建立，参见例如US 5,223,409；US 5,403,484；US 5,571,698；US 5,427,908；US5,580,717；US 5,969,108；US 6,172,197；US 5,885,793；US 6,521,404；US 6,544,731；US6,555,313；US 6,582,915和US 6,593,081。
所得分离的抗体及其抗原结合片段具有最小的动物来源的CDR含量，其中仅允许必需的非人种系残基。剩余的CDR被转化为人v基因序列，除了通过引入物种中性必需从头残基的一些新变异，例如在IMGT氨基酸残基62、64、68、27、66、68、115和116中(参见图15和16)。可以将这些CDR序列移植到人或非人框架上，以制备人源化或非人源化抗体和/或其抗原结合片段，这取决于抗体的预期用途。
在人源化抗体中，除CDR序列外，恒定区和部分可变区具有来源于人种系免疫球蛋白序列的框架。然而，在这种人源化抗体中，CDR序列来源于已经移植到人框架序列上的另一种哺乳动物物种如小鼠的种系。这样的人源化抗体在本发明的上下文中也可以表示为CDR移植物。使用人源化抗体的优点是它们降低了免疫原性反应的风险，如果将抗体注射到人受试者中，当使用来自另一物种的框架时可能发生免疫原性反应。这开辟了它们在人医学应用中的用途。如本文别处更详细公开的，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于诊断应用和用于检测不同种类样品中的BSSL蛋白，如hBSSL。
因此，本文还公开了用于生产根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法包括在允许从包含在宿主细胞中并包含编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的表达载体表达抗体或其抗原结合片段的条件下，培养表达所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞。所述方法还包括从宿主细胞或从培养宿主细胞的培养基中分离抗体或其抗原结合片段。
抗体或其抗原结合片段的表位结合
已发现分离的抗体或其抗原结合片段结合位于BSSL蛋白的N端部分的人BSSL蛋白的先前未识别的表位。表位可以形成BSSL的构象表位。
令人惊讶地发现，根据本发明产生的抗体及其抗原结合片段结合hBSSL蛋白的先前未识别的表位。更令人惊讶的是，发现所述表位不位于BSSL的脂质代谢活性位点附近，而是位于BSSL的N端部分。这具有若干个有利的效果。一个是抗体或其抗原结合片段不太可能引起负面的副作用，因为它们不显著影响BSSL的酶脂肪酶活性。另一个优点是抗体或其抗原结合片段适于研究BSSL蛋白及其脂肪酶活性，因为这不受本发明的抗体或其抗原结合片段的显著影响。
BSSL结构已经被描述为具有大核心区域，所述核心区域由被α螺旋和连接环围绕的扭曲的11链β折叠组成([9]，图12)。在N端有较小的3链β折叠。所述结构被比作左手烘箱手套(oven-glove)，手掌包含靠近“拇指”的活性部位三元组。类似地，小的N端β折叠位于靠近“小指”的手背上，参见图12。与Fab分子相互作用的BSSL结构的部分位于小的N端β折叠和αC的C端部分，αC是结构中的第三个α螺旋，参见图13。换句话说，抗体的结合区不靠近BBSL的活性位点，而是在BSSL的相对侧。
现在鉴定的表位区包含残基7-12(链1和2)和42-55(导入折叠的链3的环区)。表位相当平坦，只有少数特征性残基突出，即Tyr7、Phe12和Gln52(主要相互作用列于表25)。47-54的环区定义明确并形成均匀的表面。脯氨酸47对于与抗体的Tyr31的堆叠相互作用是重要的，但整体而言，此处的表面是平坦的。在一个优选的实施方案中，表位区还包含残基174-180(αC的C末端)。
本发明的一个方面涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合BSSL优选hBSSL的表位。表位包含第一表面，所述第一表面包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少83％同一性的氨基酸序列，或由其限定。所述表位还包含第二表面，所述第二表面包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，如至少85％或至少92％同一性的氨基酸序列，或由其限定。
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一肽限定BSSL中表位的第一表面，并且包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第二肽限定BSSL中表位的第二表面。因此，第一表面包含SEQID NO:1的氨基酸序列，或由其限定，并且第二表面包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或由限定。
在一个实施方案中，第一肽包含根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有至少80％，优选至少83％，更优选至少91％同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO:3是包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列作为其一部分的较长氨基酸序列。
分离的抗体或其抗原结合片段可进一步特异性结合BSSL如hBSSL的另一肽和表面，即第三肽和第三表面。在一个实施方案中，此第三肽包含根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有至少80％，优选至少85％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，第三肽包含根据SEQ ID NO:4的氨基酸，或与SEQ ID NO:4具有至少80％，优选至少83％，更优选至少88％，如至少94％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，第三肽包含根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6具有至少80％，优选至少84％，更优选至少92％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段可以特异性结合包含SEQ IDNO:1例如由其组成的第一肽，包含SEQ ID NO:2例如由其组成的第二肽和包含SEQ ID NO:4例如由其组成的第三肽，或与其具有本文限定的各自同一性的氨基酸序列。或者，这样的抗体或其抗原结合片段可以结合根据SEQ ID NO:3的较长氨基酸序列或与其具有本文指定同一性的氨基酸序列，而不是结合根据SEQ ID NO:1的较短氨基酸序列。
在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合包含SEQ ID NO:1例如由其组成的第一肽，包含SEQ ID NO:2例如由其组成的第二肽和包含SEQ ID NO:5例如由其组成的第三肽，或与其具有本文限定的各自同一性的氨基酸序列。或者，这样的抗体或其抗原结合片段可以特异性结合根据SEQ ID NO:3的较长氨基酸序列或与其具有本文指定同一性的氨基酸序列，而不是结合根据SEQ ID NO:1的较短氨基酸序列。
在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合包含SEQ ID NO:1例如由其组成的第一肽，包含SEQ ID NO:2例如由其组成的第二肽和包含SEQ ID NO:6例如由其组成的第三肽，或与其具有本文限定的各自同一性的氨基酸序列。或者，这样的抗体或其抗原结合片段可以结合根据SEQ ID NO:3的较长氨基酸序列或与其具有本文限定的指定同一性的氨基酸序列，而不是结合根据SEQ ID NO:1的较短氨基酸序列。
本发明的另一方面涉及BSSL表位，例如hBSSL表位，其包含第一肽，所述第一肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，优选至少83％同一性的氨基酸序列，例如由其组成。BSSL表位还包含第二肽，所述第二肽包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，优选至少85％或至少92％同一性的氨基酸序列，例如由其组成。
在一个实施方案中，第一肽包含根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有本文限定的同一性的氨基酸序列，例如由其组成。
表位还可以包含第三肽，所述第三肽包含根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与其具有本文限定的同一性的氨基酸序列，根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或与其具有本文限定的同一性的氨基酸序列，或根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与其具有本文限定的同一性的氨基酸序列，例如由其组成。
这些表位可用于开发结合BSSL蛋白如hBSSL的抗体或其抗原结合片段，例如用于治疗和/或预防BSSL相关病症和/或用作研究BSSL蛋白的分子工具。因此，本发明还涉及这些表位用于开发抗体或其抗原结合片段的用途。由于这些表位不位于BSSL蛋白脂肪酶催化中心，因此开发抗BSSL抗体或抗原结合片段是一个有吸引力的目标。
根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段可特异性结合如本文定义的表位。
抗体及其抗原结合片段的抗原结合部分
全长抗体包含通过二硫键相互连接的两条重链和两条轻链。每条重链含有重链可变区(HVCR)和第一、第二和第三恒定区(CH1、CH2和CH3)。在本公开中，术语VH、VH和HCVR可互换使用。每条轻链含有轻链可变区(LVCR)和轻链恒定区(CL)。在本公开中，术语VL、VL和LCVR可互换使用。
HCVR和LCVR区可以进一步细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR或FW)。每个HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR/FW组成，从N端到C端按以下顺序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。
如本文所用的扩展CDR(eCDR)涉及包含根据IMGT命名法定义的CDR的氨基酸以外的至少一个额外氨基酸残基的氨基酸序列。
本领域熟知，互补位，也称为抗原结合位点，是识别并结合抗原的抗体或其抗原结合片段的一部分。它是抗体Fv区域的小区域，并且包含部分抗体重链和轻链。抗体单体的Y形的每个臂尖端为互补位，互补位是6个CDR的集合。互补位由三个轻链CDR(LCDR)和三个重链CDR(HCDR)组成，它们从反平行β折叠的折叠处延伸。
在以下部分中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段由其CDR的结构特征限定，换言之，由其HCDR和/或LCDR的氨基酸序列限定，或由包含HCDR和/或LCDR的区域的氨基酸结构限定。技术人员将理解，在不影响分离的抗体或其抗原结合片段的功能特性，例如其对BSSL如hBSSL的结合能力或结合亲和力的情况下，可以在氨基酸序列中发生微小的变化，例如一个、两个、三个、四个或甚至更多个氨基酸残基的取代。应当理解，第一HCDR、第二HCDR、第三HCDR、第一LCDR、第二LCDR和第三LCDR可以独立地选自所述的氨基酸序列。
因此，本发明的一个方面涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR的三个CDR(HCDR)和LCHV的三个CDR(LCDR)。在此方面，第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7具有至少87％，例如至少87.5％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8具有至少75％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:9具有至少83％，例如至少91.6％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。此外，在此方面，第一LCDR包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含氨基酸序列ATS或与氨基酸序列ATS具有至少66％同一性的氨基酸序列如AAS，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
实施例22中呈现的实验数据表明第二LCDR对于与BSSL的相互作用可能不是重要的。因此，在实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含第一HCDR，所述第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7具有至少87％，例如至少87.5％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；第二HCDR，所述第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8具有至少75％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；第三HCDR，所述第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9具有至少83％，例如至少91.6％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；第一LCDR，所述第一LCDR包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；以及第三LCDR，所述第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19组成的组的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，第一LCDR包含选自由SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:20组成的组的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含选自由ATS和AAS组成的组的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含选自由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22组成的组的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，第一LCDR包含根据SEQ IDNO:10的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含氨基酸序列ATS，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含延伸的第二HCDR，所述延伸的第二HCDR包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列，优选由其组成；延伸的第一LCDR，所述延伸的第一LCDR包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列，优选由其组成，以及延伸的第二LCDR，所述延伸的第二LCDR包含根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列，优选由其组成。
在另一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含延伸的第二HCDR，所述延伸的第二HCDR包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列，优选由其组成；延伸的第一LCDR，所述延伸的第一LCDR包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列，优选由其组成；以及延伸的第二LCDR，所述延伸的第二LCDR包含根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:18的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，第一LCDR包含根据SEQ IDNO:10的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含氨基酸序列ATS，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含延伸的第二HCDR，所述延伸的第二HCDR包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列，优选由其组成；延伸的第一LCDR，所述延伸的第一LCDR包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列，优选由其组成；以及延伸的第二LCDR，所述延伸的第二LCDR包含根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，第一LCDR包含根据SEQ IDNO:20的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含氨基酸序列AAS，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含延伸的第二HCDR，所述延伸的第二HCDR包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列，优选由其组成；延伸的第一LCDR，所述延伸的第一LCDR包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列，优选由其组成；以及延伸的第二LCDR，所述延伸的第二LCDR包含根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:19的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，第一LCDR包含根据SEQ IDNO:20的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含氨基酸序列ATS，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含延伸的第二HCDR，所述延伸的第二HCDR包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列，优选由其组成；延伸的第一LCDR，所述延伸的第一LCDR包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列，优选由其组成；以及延伸的第二LCDR，所述延伸的第二LCDR包含根据SEQ ID NO:28的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含第一HCDR，所述第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成；延伸的第二HCDR，所述延伸的第二HCDR包含选自由SEQ ID NO:12、23、24和25组成的组的一个氨基酸序列，优选由其组成；以及第三HCDR，所述第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含延伸的第一LCDR，所述延伸的第一LCDR包含选自由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27组成的组的一个氨基酸序列，优选由其组成；延伸的第二LCDR，所述延伸的第二LCDR包含选自由SEQ ID NO:15、SEQID NO:17、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列，优选由其组成；以及第三LCDR，所述第三LCDR包含选自由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22组成的组的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，当第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:7具有至少87.5％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:8具有至少75％，例如至少87％，或至少87.5％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:9具有至少83％，例如至少91.6％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当第一LCDR包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当第二LCDR包含氨基酸序列ATS或AAS，优选由其组成时，其还包含与氨基酸序列ATS或AAS中任一个具有至少66％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:11具有至少87.5％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当第三LCDR包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:21具有至少75％，例如至少87.5％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当第三LCDR包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:22具有至少75％，例如至少87.5％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第二HCDR包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:12具有至少77.8％、例如至少83％、例如至少83.3％、例如至少88％、例如至少88.9％、例如至少94％、例如至少94.4％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第二HCDR包含根据SEQ ID NO:18的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:18具有至少75％，例如至少87.5％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第二HCDR包含根据SEQ ID NO:19的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:19具有至少75％，例如至少87.5％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第二HCDR包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:23具有至少77.8％、例如至少83％、例如至少83.3％、例如至少88％、例如至少88.9％、例如至少94％、例如至少94.4％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第二HCDR包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:24具有至少77.8％、例如至少83％、例如至少83.3％、例如至少88％、例如至少88.9％、例如至少94％、例如至少94.4％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第二HCDR包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:25具有至少77.8％、例如至少83％、例如至少83.3％、例如至少88％、例如至少88.9％、例如至少94％、例如至少94.4％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第一LCDR包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:14具有至少80％，例如至少90％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第一LCDR包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:16具有至少80％，例如至少90％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第一LCDR包含根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:20具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第一LCDR包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:26具有至少80％，例如至少90％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第一LCDR包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:27具有至少80％，例如至少90％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第二LCDR包含根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:15具有至少66.7％，例如至少83％，例如至少83.3％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第二LCDR包含根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:17具有至少66.7％，例如至少83％，例如至少83.3％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第二LCDR包含根据SEQ ID NO:28的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:28具有至少66.7％，例如至少83％，例如至少83.3％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当延伸的第二LCDR包含根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列，优选由其组成时，其还包含与SEQ ID NO:29具有至少66.7％，例如至少83％，例如至少83.3％同一性的氨基酸序列。
如本文所公开的分离的抗体或其抗原结合片段也可或替代地在结构上通过其HCVR和/或LCVR的氨基酸序列来描述。技术人员将理解HCVR和LCVR可以独立地选自所述的氨基酸序列。如上所述，技术人员可以理解，在不影响分离的抗体或其抗原结合片段的功能特性(例如其结合hBSSL的能力)的情况下，可以发生氨基酸序列中一个、两个、三个、四个或甚至更多个氨基酸残基的微小变化，例如氨基酸的取代，包括缺失或添加。变化可以在CDR的氨基酸序列中，在本文称为框架区的CDR区外的氨基酸序列中，或在CDR的氨基酸序列中和在HCVR或LCVR的CDR区外的氨基酸序列中。
因此，在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR包含选自由SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36以及与SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36中的任一个具有至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个特定的实施方案中，HVCR的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36、以及与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36中的任一个具有至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列组成的组。在另一个特定的实施方案中，HVCR的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36，以及与SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36中的任一个具有至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列组成的组。例如，HCVR可包含根据SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:36的任一个具有至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含LCVR，所述LCVR包含选自由SEQID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38以及与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38中的任一个具有至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
在一个特定实施方案中，LVCR的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38以及与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQID NO:38中的任一个具有至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列组成的组。在另一个特定实施方案中，LVCR的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38以及与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38中的任一个具有至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列组成的组；例如选自由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38以及与SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38中的任一个具有至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列组成的组。例如，HCVR可包含根据SEQ ID NO:37的氨基酸序列和与SEQ ID NO:37的任一个具有至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR包含选自由SEQID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36以及与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36中的任一个具有至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。抗体或其抗原结合片段还包含LCVR，所述LCVR包含独立地选自由SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQID NO:37和SEQ ID NO:38以及与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38中的任一个具有至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
在特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含根据SEQ ID NO:36的氨基酸序列，优选由其组成，所述LCVR包含根据SEQ ID NO:37的氨基酸序列，优选由其组成。
在另一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含根据SEQ ID NO:36的氨基酸序列，优选由其组成，所述LCVR包含根据SEQ IDNO:38的氨基酸序列，优选由其组成。
在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列，优选由其组成，所述LCVR包含根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列，优选由其组成。
在又另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列，优选由其组成，所述LCVR包含根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列，优选由其组成，所述LCVR包含根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列，优选由其组成。
本发明的一个方面涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR，所述HCVR由选自以下的氨基酸序列组成：i)ZH1-[GYTFTSYN]-ZH2-[X53GVIX57PGDGX64TSYX68QKFX72]-ZH3-[ARDYYGSSPLGY]-ZH4，或与i)中限定的序列具有至少92％同一性，与i)中限定的序列具有例如93％或更高，例如94％或更高，例如95％或更高，例如96％或更高，例如97％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高同一性的氨基酸序列，和所述LCVR由选自以下的氨基酸序列组成：ii)ZL1-[X24ASX27SISYX39N]-ZL2-[AX57SX66LX68]-ZL3-[HQRSSX115PT]-ZL4，或与ii)中限定的序列具有至少87％同一性，与ii)中限定的序列具有例如88％或更高，例如89％或更高，例如90％或更高，例如91％或更高，例如92％或更高，例如93％或更高，例如94％或更高，例如95％或更高，例如96％或更高，例如97％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高同一性的氨基酸序列。
在此方面，ZH1、ZH2、ZH3和ZH4各自独立地代表零个、一个或若干个独立选择的氨基酸残基，并且ZL1、ZL2、ZL3和ZL4各自独立地代表零个、一个或若干个独立选择的氨基酸残基。X53选自I和M，X57选自N和Y，X64选自A和S，X68选自A和N，X72选自K和Q，X24选自S和R，X27选自S和P，X39选自M和L，X57选自A和T，X66选自K和S，X68选自A和P，并且X115选自S、T和Y。氨基酸残基的编号根据IMTG编号标准，即对于如上限定的序列i)或ii)中的位置“Xn”，n是整数并且表示根据IMGT编号的氨基酸残基X的位置。
GYTFTSYN在SEQ ID NO:7中呈现，X53GVIX57PGDGX64TSYX68QKFX72在SEQ ID NO:169中呈现，ARDYYGSSPLGY在SEQ ID NO:9中呈现，X24ASX27SISYX39N在SEQ ID NO:170中呈现，AX57SX66LX68在SEQ ID NO:171中呈现以及HQRSSX115PT在SEQ ID NO:172中呈现。
本文提供了抗体或其抗原结合片段，其中序列i)中的Xn独立地选自以下列表A中列出的可能残基的组。技术人员将理解，Xn可以选自所列可能残基组中的任一个，并且此选择独立于Xm中氨基酸的选择，其中n≠m。因此，位置Xn中的列出的任何可能残基可以独立地与根据列表A的任何其它可变位置的任何列出的可能残基组合。
列表A：序列i)中可能的氨基酸残基的列表
X53可以是I；
X53可以是M；
X57可以是N；
X57可以是Y；
X59可以是G；
X59可以是S；
X64可以是A；
X64可以是S；
X68可以选自A和T；
X68可以选自A和N；
X68可以选自T和N；
X68可以是A；
X68可以是N；
X68可以是T；
X72可以是K；以及
X72可以是Q。
以类似的方式，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其中文中序列ii)中的Xk独立地选自根据以下列表B中列出的可能残基的组。技术人员将理解，Xk可以选自所列可能残基组中的任一个，并且此选择独立于Xl中氨基酸的选择，其中k≠l。因此，列表A中位置Xk中的列出的任何可能残基可以独立地与根据列表B的任何其它可变位置的任何列出的可能残基组合。
列表B：序列ii)中可能的氨基酸残基的列表
X24可以是S；
X24可以是R；
X27可以是S；
X27可以是P；
X39可以是M；
X39可以是L；
X40可以是H；
X40可以是N；
X57可以是A；
X57可以是T；
X66可以选自K和S；
X66可以选自R和S；
X66可以选自R和K；
X66可以是K；
X66可以是R；
X66可以是S；
X68可以选自A和P；
X68可以选自A和Q；
X68可以选自P和Q；
X68可以是A；
X68可以是P；
X68可以是Q；
X105可以是H；
X105可以是Q；
X115可以选自S和T；
X115可以选自S和Y；
X115可以选自T和Y；
X115可以是S；
X115可以是Y；以及
X115可以是T。
为清楚起见，从列表A中选择序列i)中氨基酸位置的氨基酸残基独立于从列表B中选择序列ii)中氨基酸位置的氨基酸残基。为了避免疑问，列表A和列表B各自公开了根据本公开的若干具体和个别化的实例，并且所列出的实例可以自由组合。
如上所限定，ZH1、ZH2、ZH3和ZH4可以各自代表零个、一个或若干个独立选择的氨基酸残基。可以独立地选择所述ZH1、ZH2、ZH3和ZH4中每一个的氨基酸残基的同一性和数目。
类似地，ZL1、ZL2、ZL3和ZL4可以各自代表零个、一个或若干个独立选择的氨基酸残基。可以独立地选择ZL1、ZL2、ZL3和ZL4中每一个的氨基酸残基的同一性和数目。另外，ZL1可以通过氨基酸接头或其它接头与ZH1或ZH4连接。此外，ZL4可通过氨基酸接头或其它接头与ZH1或ZH4连接。因此，如i)中限定的序列和如ii)中限定的序列可以是一个氨基酸序列的一部分，换句话说，可以是一个多肽的一部分。
在一个实施方案中，ZH1包含根据SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:39具有至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZH2包含根据SEQ ID NO:40的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:40具有至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZH3包含根据SEQ ID NO:41的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:41具有至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZH4包含根据SEQ ID NO:42的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42具有至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZL1包含根据SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:43具有至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZL2包含根据SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:44具有至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZL3包含根据SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:45具有至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZL4包含根据SEQ ID NO:46的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:46具有至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
技术人员将理解，ZH1、ZH2、ZH3、ZH4、ZL1、ZL2、ZL3和ZL4中的每一个与根据上述各自的SEQ ID NO:的氨基酸序列的同一性％独立于ZH1、ZH2、ZH3、ZH4、ZL1、ZL2、ZL3和ZL4中的任何其他与其各自的SEQ ID NO:的同一性％。因此，例如，ZH1可以表现出与SEQ ID NO:39的95％同一性，并且ZH2可以表现出与SEQ ID NO:40的99％同一性。
在产生本发明新型抗BSSL抗体或其抗原结合片段的人源化方法中，在CDR和相邻的FW区中引入若干突变。出于本公开的目的，每个抗体HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR/FW组成，其中一个、两个或三个CDR可以是延伸的CDR(eCDR)，所述FR/FW以表1中限定的以下顺序从N端到C端排列。
表1-IMGT编号
Figure BDA0003464862550000391
HCRV中的三个CDR侧接框架区，其可以是上述的ZH1、ZH2、ZH3和ZH4区。LCRV中的三个CDR侧接框架区，其可以是如上所述的ZL1、ZL2、ZL3和ZL4。
本文构建的抗体或其抗原结合片段的HVCR列于由SEQ ID NO:30、32、34、36和47-84组成的组中的氨基酸序列中。相应地，本文构建的抗体或其抗原结合片段的LVCR列于由SEQ ID NO:31、33、35、37、38和86-123组成的组中的氨基酸序列中。这些抗体或其抗原结合片段的特定实例包括以下HVCR和LVCR的组合，优选由其组成：SEQ ID NO:30和31；SEQ IDNO:32和33；SEQ ID NO:34和35；SEQ ID NO:36和37；SEQ ID NO:36和38；SEQ ID NO:47和81；SEQ ID NO:48和82；SEQ ID NO:49和83；SEQ ID NO:50和84；SEQ ID NO:51和85；SEQ IDNO:52和86；SEQ ID NO:53和87；SEQ ID NO:54和88；SEQ ID NO:55和89；SEQ ID NO:56和90；SEQ ID NO:57和91；SEQ ID NO:58和92；SEQ ID NO:59和93；SEQ ID NO:60和94；SEQ IDNO:61和95；SEQ ID NO:62和96；SEQ ID NO:63和97；SEQ ID NO:64和98；SEQ ID NO:65和99；SEQ ID NO:66和100；SEQ ID NO:67和101；SEQ ID NO:68和102；SEQ ID NO:69和103；SEQ ID NO:70和104；SEQ ID NO:71和105；SEQ ID NO:72和106；SEQ ID NO:73和107；SEQID NO:74和108；SEQ ID NO:85和109；SEQ ID NO:86和110；SEQ ID NO:77和111；SEQ IDNO:78和112；SEQ ID NO:79和113或SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:114。
技术人员将理解，可以对如本文公开的抗体或其抗原结合片段进行各种修饰和/或添加，以使抗体或其抗原结合片段适应特定应用，而不脱离本公开的范围。例如，抗体或其抗原结合片段可具有在C端和/或N端，例如其重链或轻链的C端和/或N端通过额外氨基酸延伸和/或包含额外氨基酸的氨基酸序列。因此，抗体或其抗原结合片段可包含任何合适数量的额外氨基酸残基，例如至少一个额外氨基酸残基。可以单独地或共同地添加每个额外的氨基酸残基，以便例如改善和/或简化多肽的生产、纯化、体内或体外稳定、偶联或检测。这些额外的氨基酸残基可以包含一个或多个出于化学偶联目的而添加的氨基酸残基。一个实例是添加半胱氨酸残基。额外的氨基酸残基也可以提供用于纯化或检测抗体或其抗原结合片段的“标签”，例如His6标签、(HisGlu)3标签、“myc”(c-myc)标签或FLAG标签。
本发明的分离的抗体或其抗原结合片段可以选自全长抗体、CDR序列的组合、单链可变片段、Fab片段、F(ab')2片段、F(ab’)3片段、Fab'片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)和纳米抗体，但不限于此。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自由人抗体、人源化抗体和嵌合抗体或其抗原结合片段组成的组。
可能需要降低或消除抗体或其抗原结合片段的效应功能，例如以防止靶细胞死亡或不需要的细胞因子分泌。当抗体或其抗原结合片段旨在接合细胞表面受体并防止受体-配体相互作用，即拮抗剂时，这可能是特别合适的。可以保证降低的效应功能的其它实例包括防止抗体-药物缀合物与Fc受体(FcγR)相互作用，导致脱靶细胞毒性。
因此，在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含至少一个抑制与FcγR相互作用的Fc沉默突变。例如，基于IgG1同种型类别的抗体或其抗原结合片段可包含至少一个，优选至少两个，更优选所有三个Fc沉默突变L234A、L235A和P329G。
而且，当需要降低的效应功能时，IgG4同种型的抗体或其抗原结合片段被认为是免疫疗法的潜在候选物。已知IgG4抗体是能够经历称为Fab臂交换(FAE)的过程的动态分子，并且不受理论的束缚，认为这导致具有未知特异性并因此潜在地降低的治疗功效的功能性单价双特异性抗体(bsAb)。这可能为人免疫疗法引入不期望的药效学不可预测性。
因此，在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含至少一个防止或减少体内Fab臂交换的稳定突变。例如，本领域已经提出，IgG4核心铰链区中的单个氨基酸突变(S228P)足以防止体内FAE[8]。在一个特定实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型亚类，且至少一个稳定突变是S228P。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段具有选自由IgG、IgA、IgM、IgD和IgE组成的组的同种型类别。在一个特定实施方案中，同种型类别是IgG。例如，分离的抗体或其抗原结合片段可以选自由同种型亚类IgG1和IgG4组成的组。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原片段。单克隆抗体或其抗原结合片段优选是人源化单克隆抗体或其抗原结合片段。
目前优选的抗体或其抗原结合片段表示为S-SL048-11(本文也表示为克隆11，重链SEQ ID NO:119和轻链SEQ ID NO:120)、S-SL048-46(本文也表示为克隆46，重链SEQ IDNO:121和轻链SEQ ID NO:122)、S-SL048-106(本文也表示为克隆106，重链SEQ ID NO:123和轻链SEQ ID NO:124)、S-SL048-116(本文也表示为克隆116，重链SEQ ID NO:125和轻链SEQ ID NO:126)和S-SL048-118(本文也表示为克隆118，重链SEQ ID NO:127和轻链SEQ IDNO:128)。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)、SDS-PAGE、纳米差示扫描荧光测定法(纳米-DSF)和差示光散射评价这5种候选物的稳定性。通过将这些数据与总体排名相结合，可以得出结论，hIgG4 S228P形式中最稳定的候选物是候选物106、118和116。
结合亲和力
在一个实施方案中，根据本文的分离的抗体或其抗原结合片段可具有不超过KD 1×10-7M，优选不超过KD 1×10-8M的对hBSSL的亲和力。例如，分离的抗体或其抗原结合片段可具有不超过KD 5nM，例如不超过KD 3nM的对hBSSL的亲和力。
如实验部分所示，分离的抗体或其抗原结合片段可具有不超过KD 1.7nM，例如不超过KD 1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7或不超过0.6nM的对hBSSL的亲和力。在一个实例中，根据本公开结合hBSSL的分离的抗体或其抗原结合片段可具有KD0.6-1.7nM，例如KD 0.6-1.0、0.7-0.9、0.8-1.6、0.9-1.5、1.0-1.7、1.1-1.6、1.2-1.7、1.3-1.5、1.0-1.4、0.7-1.5、0.7-1.6或1.0-1.7nM的对hBSSL的亲和力。
药物组合物
术语“药物组合物”是指这样的制剂，其形式使得其中所含的活性成分的生物活性是有效的，并且其不含对将施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。本文的药物组合物包含如本文所定义的抗体和/或其抗原结合片段(例如scFv)以及药学上可接受的载剂或赋形剂。
如本文定义的抗体或其抗原结合片段如scFv可通过本领域已知的方法配制成例如片剂、胶囊、水性或油性溶液、悬浮液、乳液、乳膏、软膏、凝胶、鼻喷雾剂、栓剂、用于吸入和用于肠胃外使用(包括静脉内，皮下或肌内输注)的细分散粉末或气溶胶、无菌水性或油性溶液或悬浮液或无菌乳液的形式。
因此，本文提供了包含如本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段和至少一种药学上可接受的赋形剂或载剂的组合物。例如，赋形剂可以是稀释剂。在一个实例中，药物组合物可以进一步包含至少一种另外的活性剂，例如至少两种另外的活性剂，例如至少三种另外的活性剂。可以证明在这种组合中有用的另外的活性剂的非限制性实例是免疫反应调节剂。
“药学上可接受的载剂”是指药物制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，药学上可接受的载剂包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载剂适于口服以及静脉内、肌内、皮下、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。
如本文公开的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本公开的药物组合物中的合适的水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌程序和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物的存在。也可能需要在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可通过包含延迟吸收的剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。
药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。
本文还提供了组件的试剂盒，其包括根据本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，用于施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物的装置，以及任选地包括使用说明书的包装插页。用于施用抗体或其抗原结合片段或药物组合物的装置可以是例如注射器。术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。
分离的抗体或其抗原结合片段的医学用途
根据本发明的抗体或其抗原结合片段可用于有效降低受试者如人中BSSL的促炎作用。
本发明的抗体及其抗原结合片段的优点是它们不结合BSSL蛋白上负责BSSL的脂肪酶活性的活性位点。这在实验部分中得到证明和进一步阐述。因此，负面副作用的风险降低，因为脂肪酶活性没有受到显著影响。
因此，本发明涉及如本文定义的分离的抗体或其抗原结合片段如scFv或药物组合物，其用作药物。
本文还涉及如本文定义的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其用于治疗和/或预防炎性疾病。本发明还涉及如本文定义的分离的抗体或其抗原结合片段如scFv或药物组合物用于制造用于治疗和/或预防炎性疾病的药物的用途。本文还涉及用于治疗和/或改善和/或防止和/或预防炎性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的抗体或其抗原结合片段如scFv或药物组合物。
不同的体内模型可用于预测抗体和抗原结合片段在治疗和/或预防炎性疾病中的作用。通常在这些模型中使用小鼠并注射不同的物质以引发免疫反应。因此可以在施用抗体/抗原结合片段后研究抗体或其抗原结合片段对这种免疫反应的影响。
可以使用的一种模型是所谓的“胶原诱导的关节炎”(CIA)模型。在此模型中，注射完全弗氏佐剂(CFA)中的II型胶原(CII)，通常在第21天加强注射不完全弗氏佐剂(IFA)中的CII。此模型诱导自身免疫性关节炎。关节炎通常在第一次注射CII后21-28天后出现。此模型依赖于B细胞和T细胞(适应性免疫)。
另一个模型是“胶原抗体诱导的关节炎”(CAIA)。在此模型中，注射CII抗体混合物，通常在第5天加强注射脂多糖(LPS)。此模型不依赖于B细胞和T细胞(先天免疫)。在本文的实验部分中公开了使用CAIA模型测试本文的抗体及其抗原结合片段在治疗和/或预防炎性疾病中的体内功效的方案。
又另一个模型是“葡萄糖-6-磷酸异构酶诱导的关节炎”模型。此处注射对应于葡萄糖-6-磷酸异构酶中序列的肽以引发免疫反应。此模型依赖于T细胞。
另一个模型是注射姥鲛烷的“姥鲛烷诱导的关节炎”(PIA)模型。此模型依赖于T细胞。
此外，可以使用“葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎”模型，其中在饮用水中给予葡聚糖硫酸钠(DSS)。
所有上述方法都是本领域技术人员公知的。所述方法可用于测试本文的抗体或其抗原结合片段的体内效率。
根据本文待治疗和/或预防的炎性疾病可以例如是慢性炎性疾病。炎性疾病可以是局部或全身炎性疾病。
炎性疾病可以例如是自身免疫性疾病或自身炎性疾病。另一种类型的炎性疾病是自然杀伤(NK)细胞介导的炎性疾病。此类NK细胞介导的炎性疾病包括类风湿性关节炎(RA)、全身性幼年特发性关节炎(sJIA)、巨噬细胞活化综合征(MAS)、系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬化症、多发性硬化症(MS)、干燥综合征和炎性肠病(IBD)。
在一个实施方案中，炎性疾病选自由RA、JIA、银屑病关节炎、IBD如克罗恩病或溃疡性结肠炎(UC)、肝脂肪变性(也称为肝脂肪变性)和过度炎症组成的组。
在一个特定实施方案中，炎性疾病是由病原体如细菌或病毒诱导的炎性病症。这种病毒的实例包括冠状病毒，例如严重急性呼吸综合征冠状病毒1(SARS-CoV-1)或SARS-CoV-2。后一种病毒引起冠状病毒疾病2019(COVID-19)。严重的COVID-19患者通常患有全身性过度炎症，包括升高水平的各种炎性细胞因子，如白介素2(IL-2)、IL-7、IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ诱导蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP-1α)和TNF-α。
RA主要影响关节，但也可以是全身性炎性疾病，其可以在若干器官中给出关节外表现。因此，RA可被认为是全身性炎性疾病。
此外，本文公开的分离的抗体或其抗原结合片段如scFv片段或药物组合物可以是对当前肿瘤坏死因子α(TNFα)抑制剂不反应或瞬时反应的患者的当前生物治疗的替代物，这减少了施用皮质类固醇和/或免疫抑制剂和/或药物的需要。因此，本文公开的分离的抗体或其抗原结合片段如scFv片段的使用阻止和/或减少患者中替代治疗方案的不良作用和/或副作用，这通常是定性护理中的关键问题，特别是在年轻患者和儿童以及免疫抑制患者和/或老年患者中是重要的。
使用如本文公开的分离的抗体和/或其抗原结合片段或药物组合物的治疗和/或预防通常是被动免疫疗法，意味着向有需要的受试者施用抗体或其抗原结合片段，或包含此类抗体和/或其抗原结合片段的药物组合物。然而，也可以使用其它类型的免疫治疗方法，例如基因治疗，其中向受试者不是直接施用抗体或其抗原结合片段，而是施用能够表达这种抗体或其抗原结合片段的基因构建体。
根据本公开的受试者可以是任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，例如猴)、兔和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。术语“受试者”在本文中可与术语“患者”互换使用。受试者可以是人。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，例如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然过程的临床干预，并且可用于预防或在临床病理学过程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状(改善生活质量)、减少疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展率、改善或减轻疾病状态、以及缓解或改善预后。根据本发明的抗体或其抗原结合片段可用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
“减少”或“抑制”是指引起20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更大的总体降低的能力。减少或抑制可指所治疗的疾患的症状。减少或抑制还包括延迟疾病，特别是炎性疾病的发作。
施用方式
根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段如scFv或药物组合物可以以用于需要治疗和/或预防的病症的标准方式施用，例如通过口服、局部、肠胃外、静脉内、皮下、口腔、鼻、或直肠施用或通过吸入。例如，如本文所述使用的抗体或其抗原结合片段如scFv或药物组合物可以配制用于肠胃外施用，例如静脉内或皮下施用，特别是皮下施用。
通常，全身施用如本文所定义的分离的抗体或其抗原结合片段如scFv或药物组合物。施用模式可以是例如肠胃外，例如通过静脉内或皮下施用，特别是皮下施用。
尽管施用方案可根据特定疾病和待治疗的受试者进行调整，但通常每周1-3次，例如每周1-2次，例如每周1次施用如本文定义的分离的抗体或其抗原结合片段如scFv或药物组合物，尽管其它施用方案也是可能的。
本发明的抗体、其抗原结合片段和/或药物组合物也可在联合治疗中施用，即与其它药剂组合。例如，联合疗法可包括与至少一种其它抗炎剂或免疫抑制剂组合的根据本发明的抗体或其抗原结合片段如scFv。应当理解，联合治疗包括顺序施用以及同时施用。术语“同时”在本文中用于指两种或更多种治疗剂的施用，其中至少部分施用在时间上重叠。因此，同时施用包括当一种或多种剂的施用在中断一种或多种其它剂的施用之后继续时的给药方案。
可调整剂量方案以提供最佳的所需反应，例如治疗反应。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用若干个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。尤其有利的是将肠胃外组合物配制成易于施用和剂量均匀的剂量单位形式。
抗体或其抗原结合片段如scFv的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或其抗原结合片段如scFv在受试者中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过所施用物质的任何毒性或有害效果的量。当抗体或其抗原结合片段如scFv用于预防病症(预防目的)时，通常但不是必需的，预防有效量小于治疗有效量，因为预防剂量在疾病之前或早期阶段用于受试者。
根据本发明的抗体或其抗原结合片段如scFv的药学有效量(即剂量)通常在约0.0001至100mg/kg，更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。然而，精确剂量必须根据例如待治疗或预防的病症、受试者的年龄和/或性别以及其是否旨在治疗或预防病症来调整。
表达系统
本发明还涉及多核苷酸，例如分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段。
根据实施方案的多核苷酸的实例示于SEQ ID NO:174至202中，其显示了编码五种不同抗体片段的HC和LC的DNA序列：S-SL048-11 HC(SEQ ID NO:174；185；196)和LC(SEQ IDNO:175；186；197)、S-SL048-46 HC(SEQ ID NO:176；187)和LC(SEQ ID NO:177；188)、S-SL048-106 HC(SEQ ID NO:178；189；198)和LC(SEQ ID NO:179；190；199)、S-SL048-116 HC(SEQ ID NO:180；191；200)和LC(SEQ ID NO:181；192；201)、以及S-SL048-118 HC(SEQ IDNO:180；191；200)和LC(SEQ ID NO:182；193；202)、以及AS20 HC(SEQ ID NO:183)和LC(SEQID NO:184)以及CDR移植物HC(SEQ ID NO:194)和LC(SEQ ID NO:195)。
因此，在一个实施方案中，多核苷酸选自由SEQ ID NO:174至202及其任何组合和/或变体组成的组。本文所用的SEQ ID NO:174至202中任一个的变体包括与SEQ ID NO:174至202中任一个限定的多核苷酸编码相同的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，但可具有至少一个同义取代，即至少一个碱基取代为另一个，使得产生的氨基酸序列不被修饰。因此，这种同义取代将多核苷酸中密码子中的至少一个碱基改变为另一个密码子，这两个都编码氨基酸残基。例如，根据SEQ ID NO:174至202中任一个或其组合的多核苷酸可以针对在特定宿主细胞中表达进行密码子优化。
可以将编码如本文公开的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸引入表达载体中。表达载体允许引入其中的多核苷酸的增殖。载体可以是自我复制的核酸结构，以及整合到其所引入的宿主细胞基因组中的载体。因此，本发明还涉及包含编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的表达载体。
表达载体优选包含与至少一个调控元件可操作地连接的编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。在一个实施方案中，调控元件是或包含启动子。启动子是DNA序列，蛋白质与其结合，启动RNA分子从其下游的DNA(基因)的转录。调控元件的另一个实例是增强子。增强子是DNA的短区域，其可被激活剂结合以增加特定基因的转录发生的可能性。
表达载体的实例包括DNA分子、RNA分子、质粒、附加型质粒和病毒载体。病毒载体的非限制性但说明性实例包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、Semliki Forest病毒、脊髓灰质炎病毒和杂合载体。
可以将表达载体引入宿主细胞，用于表达和/或增殖包含多核苷酸的载体。特别地，表达载体通过在受试者中表达从而在受试者中产生抗体或其抗原结合片段而用于治疗和/或预防炎性疾病。
因此，本文还提供了包含表达载体的宿主细胞。所用的宿主细胞可以是任何类型的宿主细胞，包括真核和原核宿主细胞。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和来源于其的后代，而不考虑传代次数。
本发明还涉及包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段，根据本发明的多核苷酸和/或根据本发明的表达载体的细胞。
细胞可以是分离的细胞，包括细胞系的细胞。细胞可选自细菌细胞、真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞、人细胞或非人细胞。
抗体或其抗原结合片段可以通过将它们的序列引入表达载体并使表达载体在宿主细胞中表达抗体或其抗原结合片段而产生，此后，所产生的抗体或其抗原结合片段被分离/纯化，之后用于如本文别处所公开的例如医学治疗目的或用于诊断目的。此外，可以将载体本身引入受试者以在待治疗的受试者中直接表达抗体或其抗原结合片段。表达载体优选包含控制编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸表达的启动子。
因此，本发明还涉及产生抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法包括在抗体或其抗原结合片段由细胞表达的条件下培养包含根据本发明的表达载体的根据本发明的细胞。在一个实施方案中，所述方法任选地包括从细胞或培养细胞的培养基中分离抗体或其抗原结合片段。
分离的抗体或其抗原结合片段的诊断用途
本发明的抗体或其抗原结合片段也可用于使用标准技术检测样品中的BSSL，例如hBSSL，所述标准技术例如但不限于ELISA、蛋白质印迹、RIA、表面等离子体共振(SPR)和流式细胞术分析。
使用本发明的抗体或其抗原结合片段的优点是它们不结合BSSL的活性位点，因此不抑制蛋白质的脂肪酶活性。因此，可以使用抗体或其抗原结合片段来研究BSSL蛋白，而不显著影响脂肪酶活性，如实验部分所表明的。因此，当在体外/离体和/或体内研究BSSL蛋白和/或其酶活性时，抗体或其抗原结合片段可用作分子工具。
因此，本发明公开了一种用于检测样品中是否存在BSSL和/或用于定量样品中BSSL如hBSSL的量的方法。所述方法包括使样品与根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段接触。所述方法还包括检测样品中是否存在BSSL和/或基于结合BSSL的分离的抗体或其抗原结合片段的量定量样品中BSSL的量。检测或定量可以例如通过使用ELISA、蛋白质印迹、RIA、表面等离子体共振(SPR)、邻近连接测定(PLA)或流式细胞术分析来进行。本发明的一种或多种，即至少两种抗体或其抗原结合片段可用于这种检测。
上述方法可以是离体或体外方法的形式。在这种情况下，所述方法包括离体或体外使样品与根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段接触。
在一个实施方案中，所述方法还包括提供可能包含BSSL的样品。
本发明还公开了用于诊断BSSL相关疾患的方法。所述方法包括a)使样品与根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段接触，和b)检测样品中是否存在BSSL和/或基于结合BSSL的分离的抗体或其抗原结合片段的量定量样品中BSSL的量。检测或定量可以例如通过使用ELISA、蛋白质印迹、RIA、SPR、PLA或流式细胞术分析来进行。所述方法还包括c)基于步骤b)中的结果，得出受试者是否被诊断为患有BSSL相关疾患。
在一个实施方案中，所述方法还包括提供来自疑似患有BSSL相关疾患的受试者的样品。
在特定实施方案中，所述方法包括将样品中BSSL的量化量与阈值进行比较。在这样的特定实施方案中，步骤c)包括基于样品中BSSL的量化量和阈值之间的比较得出受试者是否被诊断为患有BSSL相关疾患。例如，如果BSSL中BSSL的量超过阈值，则得出受试者被诊断为患有BSSL相关疾患或不是。
阈值的值取决于特定的BSSL相关疾患，并且可以通过定量取自已经诊断患有特定BSSL相关疾患的受试者的样品中BSSL的量和/或通过定量取自未患有特定BSSL相关疾患的健康受试者的样品中BSSL的量来定义。然后可以基于来自患有特定BSSL相关疾患的受试者的BSSL的这些量化量并且优选地基于来自健康受试者的BSSL的量化量来确定阈值。
BSSL相关疾患通常是如本文别处所公开的炎性病症。炎性病症可以例如是慢性或全身性炎性病症，例如炎性疾病、自身炎性疾病和/或自身免疫疾病。炎性病症可以是例如类风湿性关节炎、幼年型关节炎、银屑病关节炎、动脉粥样硬化形成、克罗恩病或溃疡性结肠炎。
可能含有BSSL的样品可以是任何种类的样品，例如从受试者获得的样品。因此，在一个实施方案中，样品是生物样品。此生物样品的实例是体液样品，例如血液样品、血浆样品或血清样品。生物样品的另一个实例是身体组织样品，例如活组织检查。样品可以是天然样品或可能含有BSSL的体外样品。检测BSSL和/或诊断BSSL相关疾患的方法包括体外方法和体内方法，例如原位杂交。
如本文别处所述，抗体或其抗原结合片段可以是人源化的或它们的CDR序列(或它们的部分)移植到非人骨架上。当使用抗体或其抗原结合片段作为分子工具来研究除人以外的其它物种中的BSSL蛋白以例如降低对抗体和/或其抗原结合片段的阴性免疫原性反应时，后者可能是有利的。
说明性实施方案
一个实施方案涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)，例如人BSSL(hBSSL)。抗体或其抗原结合片段结合BSSL上鉴定的第一表位和第二表位中的至少一个。第一表位包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，以及第二表位包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一表位包含根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ IDNO:3具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合第一表位和第二表位两者。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段进一步特异性结合根据SEQ IDNO:4的氨基酸序列或与其具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段进一步特异性结合根据SEQ IDNO:5的氨基酸序列或与其具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段进一步特异性结合根据SEQ IDNO:6的氨基酸序列或与其具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
一个实施方案涉及分离的抗体或其抗原结合片段。分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)的三个互补决定区(CDR)(HCDR)。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少87％同一性的氨基酸序列或由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少75％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成。分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(LCVR)的三个CDR(LCDR)。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成，第二LCDR包含氨基酸序列ATS或与氨基酸序列ATS具有至少66％同一性的氨基酸序列如AAS或由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少87％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含选自由SEQ ID NO:8、18和19组成的组的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，第一LCDR包含选自由SEQ ID NO:10和20组成的组的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含选自由ATS和AAS组成的组的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含选自由SEQ ID NO:11、21和22组成的组的一个氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:18的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含氨基酸序列ATS，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含氨基酸序列ATS，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:19的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含氨基酸序列ATS，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQID NO:20的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含氨基酸序列AAS，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少77％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少83％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15具有至少66％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与SEQ IDNO:21具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)的三个重链互补决定区(HCDR)。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少77％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少83％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(LCVR)的三个CDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少70％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少50％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少83％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少83％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含根据SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28具有至少66％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与SEQ IDNO:22具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少77％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少83％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少70％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15具有至少66％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ IDNO:11具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少77％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少83％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17具有至少50％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ IDNO:11具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含选自由SEQ ID NO:12、23、24和25组成的组的一个氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ IDNO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含选自SEQ ID NO:14、16、26和27的一个氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含选自由SEQ ID NO:15、17、28和29组成的组的一个氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含选自由SEQ ID NO:11、21和22组成的组的一个氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含根据SEQ ID NO:28的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个HCDR。第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成，第二HCDR包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成。在此实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR的三个LCDR。第一LCDR包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列，优选由其组成，第二LCDR包含根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列，优选由其组成，并且第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，HCVR包含选自由SEQ ID NO:30、32、34和36组成的组的一个氨基酸序列或与其具有至少98％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；例如由SEQ ID NO:30、34和36组成的组或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列；例如由SEQ ID NO:34和36组成的组或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，HCVR包含根据SEQ ID NO:36的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
在一个实施方案中，LCVR包含选自由SEQ ID NO:31、33、35、37和38组成的组的一个氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；例如由SEQ IDNO:31、35、37和38组成的组或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列；例如由SEQ ID NO:35、37和38组成的组或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列；例如由SEQ ID NO:37和38组成的组或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，LCVR包含根据SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，HCVR包含独立地选自由SEQ ID NO:30、32、34和36组成的组的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且LCVR包含独立地选自由SEQ ID NO:31、33、35、37和38组成的组的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，HCVR包含独立地选自由SEQ ID NO:30、34和36组成的组的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，以及LCVR包含独立地选自由SEQ ID NO:31、35、37和38组成的组的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。在另一个特定实施方案中，HCVR包含独立地选自由SEQID NO:34和36组成的组的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且LCVR包含独立地选自由SEQ ID NO:35、37和38组成的组的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。在另一个特定实施方案中，HCVR包含根据SEQ ID NO:36的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列，优选由其组成，并且LCVR包含独立地选自由SEQ ID NO:37和38组成的组的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体或抗原结合片段包含HCVR和LCVR，优选由其组成，所述HCVR包含根据SEQ ID NO:36的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列，所述LCVR包含根据SEQ ID NO:37或38的氨基酸序列或与其具有至少96％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR。HCVR和LCVR是与选自由氨基酸序列对SEQ ID NO:30和31、氨基酸序列对SEQ ID NO:32和33；氨基酸序列对SEQ ID NO:34和35；氨基酸序列对SEQ ID NO:36和37；以及氨基酸序列对SEQ ID NO:36和38组成的组的氨基酸序列对具有至少96％同一性的氨基酸序列对；例如选自由氨基酸序列对SEQ ID NO:36和37；和氨基酸序列对SEQ ID NO:36和38组成的组的氨基酸序列对。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区。重链可变区包含氨基酸序列ZH1-[CDR-H1]-ZH2-[eCDR-H2]-ZH3-[CDR-H3]-ZH4，其中ZH1、ZH2、ZH3和ZH4各自表示零个、一个或若干个独立选择的氨基酸残基。在一个实施方案中，重链可变区由选自以下的氨基酸序列组成：i)ZH1-[GYTFTSYN]-ZH2-[X53GVIX57PGDGX64TSYX68QKFX72]-ZH3-[ARDYYGSSPLGY]-ZH4，其中彼此独立地，X53选自I和M；X57选自N和Y；X64选自A和S；X68选自A和N；且X72选自K和Q，和ii)与i)中限定的序列具有至少92％同一性的氨基酸序列。轻链可变区包含氨基酸序列ZL1-[eCDR-L1]-ZL2-[eCDR-L2]-ZL3-[CDR-L3]-ZL4，其中ZL1、ZL2、ZL3和ZL4各自表示零个、一个或若干个独立选择的氨基酸残基。在一个实施方案中，轻链可变区由选自以下的氨基酸序列组成：iii)ZL1-[X24ASX27SISYX39N]-ZL2-[AX57SX66LX68]-ZL2-[HQRSSX115PT]-ZL4，其中彼此独立地，X24选自S和R；X27选自S和P；X39选自M和L；X57选自A和T；X66选自K和S；X68选自A和P；以及X115选自S、T和Y，和iv)与iii)中限定的序列具有至少87％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，ZH1包含根据SEQ ID NO:39的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZH2包含根据SEQ ID NO:40的氨基酸序列或与SEQ ID NO:40具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZH3包含根据SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZH4包含根据SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与SEQ ID NO:42具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZL1包含根据SEQ ID NO:43的氨基酸序列或与SEQ ID NO:43具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZL2包含根据SEQ ID NO:44的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZL3包含根据SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与SEQ ID NO:45具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，ZL4包含根据SEQ ID NO:46的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，抗体是全长抗体。
在一个实施方案中，抗体选自由人抗体、人源化抗体和嵌合抗体组成的组。
在一个实施方案中，抗原结合片段是抗原结合片段，例如单链可变片段、Fab片段、F(ab')2片段、F(ab’)3片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)和纳米抗体。在一个特定实施方案中，抗原结合片段是scFv片段。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原片段。在特定实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段是人源化单克隆抗体或其抗原结合。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段选自由同种型类别IgG、IgA、IgM、IgD和IgE组成的组；例如IgG。在特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段选自由同种型亚类IgG1和IgG4组成的组。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含一个或多个Fc沉默突变。在一个特定实施方案中，IgG1包含Fc沉默突变L234A、L235A和P329G。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含一个或多个防止或减少体内Fab臂交换的稳定突变。在一个特定实施方案中，IgG4包含稳定突变S228P。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段是单链可变片段(scFv)，其特异性结合hBSSL并且包含HCVR结构域和LCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别包含与SEQID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成的第一HCDR、第二HCDR和第三HCDR，所述LCVR结构域包含分别包含与SEQ ID NO:10、氨基酸序列ATS和SEQ ID NO:11具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成的第一LCDR、第二LCDR和第三LCDR。
在一个实施方案中，第一HCDR、第二HCDR和第三HCDR分别由根据SEQ ID NO:7、SEQID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成，并且第一LCDR、第二LCDR和第三LCDR分别由根据SEQ ID NO:10、氨基酸序列ATS和SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，抗体是人源化抗体。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段对hBSSL的亲和力不超过KD1.7nM。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段能够置换hBSSL与单核细胞，优选CD14+单核细胞的结合。
一个实施方案涉及包含根据本发明的分离的抗体和/或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。
一个实施方案涉及根据本发明的分离的抗体和/或其抗原结合片段或药物组合物，其用作药物。
一个实施方案涉及根据本发明的分离的抗体和/或其抗原结合片段或药物组合物，其用于治疗和/或预防炎性疾病。
一个实施方案涉及根据本发明的分离的抗体和/或其抗原结合片段或药物组合物用于制造用于治疗和/或预防炎性疾病的药物组合物的用途。
一个实施方案涉及用于治疗和/或改善和/或防止和/或预防炎性疾病的方法。在所述方法中，向有需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的分离的抗体和/或其抗原结合片段或药物组合物。
在一个实施方案中，炎性疾病是慢性炎性疾病。
在一个实施方案中，炎性疾病是全身性炎性疾病。
在一个实施方案中，炎性疾病是自身免疫疾病。在一个特定实施方案中，自身免疫疾病是类风湿性关节炎或幼年型类风湿性关节炎。在另一个特定实施方案中，自身免疫疾病是炎性肠病(IBD)，例如克罗恩病或溃疡性结肠炎。
在一个实施方案中，炎性疾病是自身炎性疾病。在一个特定实施方案中，自身炎性疾病是银屑病关节炎。
在一个实施方案中，炎性疾病是肝脂肪变性。
在一个实施方案中，全身施用分离的抗体和/或其抗原结合片段或药物组合物。
在一个实施方案中，胃肠外施用分离的抗体和/或其抗原结合片段或药物组合物，例如皮下施用。因此，在一个特定实施方案中，将分离的抗体和/或其抗原结合片段或药物组合物配制成用于肠胃外施用，例如皮下施用。
在一个实施方案中，分离的抗体和/或其抗原结合片段或药物组合物每周施用1-3次，例如每周1-2次，例如每周1次。
在一个实施方案中，治疗和/或预防通过被动免疫疗法进行。
实施方案涉及编码根据本发明定义的分离的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，包含根据本发明的多核苷酸的表达载体和包含根据本发明的表达载体的宿主细胞。
一个实施方案涉及生产根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法包括在允许抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养根据本发明的宿主细胞，并分离抗体或其抗原结合片段。
一个实施方案涉及用于检测样品中是否存在BSSL和/或定量样品中BSSL的量的方法。所述方法包括以下步骤：a)提供可能含有BSSL的样品，b)使所述样品与根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段接触，和c)检测所述样品中是否存在BSSL和/或定量所述样品中BSSL的量。
一个实施方案涉及用于诊断BSSL相关疾患的方法。所述方法包括以下步骤：a)提供来自疑似患有BSSL相关疾患的受试者的样品，b)使所述样品与根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段接触，c)检测样品中是否存在BSSL和/或定量样品中BSSL的量，和d)基于步骤c)中的结果，得出受试者是否被诊断患有BSSL相关疾患。
在一个实施方案中，BSSL相关疾患是炎性疾病，例如慢性炎性疾病；全身性炎性疾病；自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、炎性肠病，例如克罗恩病和溃疡性结肠炎；自身炎性疾病，例如银屑病关节炎；或肝脂肪变性。
一个实施方案涉及用于测定BSSL的酶活性的方法。所述方法包括以下步骤：a)提供含有BSSL的样品，b)使所述样品与根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段接触，以及c)测定样品中BSSL的酶活性。
一个实施方案涉及包含第一表位和第二表位或由其组成的BSSL表位。第一表位包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。第二表位由第二表面组成，所述第二表面包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
在一个实施方案中，第一表位包含根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在一个实施方案中，表位进一步包含根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与其具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，表位进一步包含根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或与其具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，表位进一步包含根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与其具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
虽然已经参考各种示例性方面和实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物替换其元件。此外，在不脱离本发明的基本范围的情况下，可以进行许多修改以使特定情况或分子适应本发明的教导。因此，本发明不限于所考虑的任何特定实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求的范围内的所有实施方案。
实施例
表2-实施例中使用的BSSL材料
Figure BDA0003464862550000691
实施例1-AS20 IgG与人和小鼠BSSL的结合(SPR)
在本实施例中，通过表面等离子体共振(SPR)研究抗体AS20小鼠-IgG1(AS20mIgG)与人和小鼠BSSL的结合。AS20 mIgG(重链可变区(HCVR)SEQ ID NO:80和轻链可变区(LCVR)SEQ ID NO:114)已在小鼠中针对从人乳纯化的全长BSSL蛋白(SEQ ID NO:138)产生。对小鼠BSSL的反应性未知。
材料和方法
hBSSL和mBSSL(表2)与AS20小鼠IgG1(AS20 mIgG1)(内部生产，HCVR SEQ ID NO:80和LCVR SEQ ID NO:114)一起用于本实施例所述的实验中。
使用
Figure BDA0003464862550000701
T200仪器(GE Healthcare)进行SPR测量。为了使亲合力效应最小化，将抗体固定在传感器表面上，并注射BSSL作为分析物。通过胺偶联到
Figure BDA0003464862550000702
CM5(羧化葡聚糖表面)传感器芯片进行AS20 mIgG1的固定。通过注射0.2MN-乙基-N’-[(二甲氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的1:1混合物活化芯片，接触时间为7分钟。将抗体注射0.2-2.8分钟，在10mM乙酸盐-HCl pH5.0(组1)或pH6.0(组2)中稀释至14-50μg/ml，以达到560至830RU的最终固定水平。通过注入1M乙醇胺7分钟使传感器表面上剩余的活化羧基失活。
第一组实验中的运行缓冲液是添加了0.05％(v/v)Tween 20的PBS缓冲液pH7.4(10mM磷酸盐，2.5mM KCl，137mM NaCl)。在第二组实验中，运行缓冲液是25mM TrisHCl，pH7.5，150mM NaCl。146mM H3PO4用作标准再生溶液。根据
Figure BDA0003464862550000703
T200仪器的单循环动力学(SCK)方法和评价软件进行动力学研究和非线性回归分析。用稳态亲和力模型分析mBSSL和AS20 mIgG1之间的相互作用。
在第一组实验中，进行三个SCK实验，浓度系列中的最高hBSSL浓度分别为300、100和50nM。以1:3、1:3.16(半对数)和1:2稀释制备浓度系列。
在第二组实验中，将hBSSL在运行缓冲液中稀释至20nM起始浓度，然后在相同缓冲液中1:1连续稀释，得到20nM至1.25nM的5点浓度。将mBSSL在运行缓冲液中稀释至2000nM起始浓度，然后在相同缓冲液中1:1连续稀释，得到2000nM至125nM的5点浓度。
结果
发现AS20 mIgG1与人和小鼠BSSL两者结合。对人BSSL的亲和力强，具有低纳摩尔亲和力。通过1:1结合模型很好地表征相互作用(图1)。来自SCK实验的非线性回归分析的缔合和解离速率常数和平衡解离常数呈现于表3中。在第一组实验中，测量一式三份进行，因此呈现平均值和标准偏差。
还观察到小鼠BSSL与固定的AS20 mIgG1相互作用，然而，亲和力弱了近100倍。进行稳态分析以确定亲和力(图2和表3)。表3-AS20 mIgG1和hBSSL以及AS20 mIgG1和mBSSL之间的相互作用的动力学参数
Figure BDA0003464862550000711
*单循环动力学
**稳态分析
N.D未确定
1第一组实验
2第二组实验
实施例2-AS20 scFv对人BSSL和小鼠BSSL的产生和结合表征(ELISA，SPR和
Figure BDA0003464862550000721
)
在本实施例中，产生了基于AS20 mIgG1的单链可变片段(scFv)形式，表示为AS20scFv(包含HCVR SEQ ID NO:80和LCVR SEQ ID NO:114)，其保留了与人BSSL的结合，如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、SPR和
Figure BDA0003464862550000722
评估。
材料和方法
小规模生产和纯化
通过经由甘氨酸-丝氨酸接头将HCVR(SEQ ID NO:80)与LCVR(SEQ ID NO:114)融合，形成编码相应scFv构建体的基因。将scFv基因亚克隆到pHAT-6筛选载体(SciLifeLab,Stockholm,Sweden)中，提供scFv分泌的信号以及C端的三重FLAG标签和六组氨酸(His)标签。随后将所述构建体转化到TOP10大肠杆菌中。使用α-FLAG抗体缀合磁珠(SigmaAldrich,#M8823)纯化裂解细胞的细菌上清液。在还原条件下通过凝胶电泳分析纯化的scFv以测定其纯度和完整性，并通过BCA(二喹啉甲酸)测定试剂盒(Pierce)测定蛋白质浓度。
ELISA
将非生物素化人BSSL(hBSSL)和生物素化人BSSL(b-hBSSL)直接包被或通过链霉亲和素包被，以两种不同的浓度，1μg/ml和0.5μg/ml的PBS溶液，加入384孔ELISA板中，4℃过夜。将纯化的AS20 scFv在封闭缓冲液(补充有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％Tween20的磷酸盐缓冲盐水(PBS))中连续稀释3倍，浓度范围为1μg/ml至4ng/ml。通过辣根过氧化物酶(HRP)缀合的α-FLAG M2(Sigma-Aldrich)，随后与色原底物Ultra 3,3’,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)ELISA孵育来检测结合。通过加入1M硫酸终止信号产生，并在450nm测量吸光度。
在第二ELISA测定中，将1μg/ml人和小鼠BSSL以及阴性对照蛋白直接包被到384孔ELISA板中，并在4℃孵育过夜。以两种不同的浓度，1μg/ml和0.2μg/ml，加入纯化的AS20scFv和阴性对照scFv。如上所述进行结合信号的检测。在两种ELISA设置中，所有样品均一式两份测定。hBSSL、b-hBSSL和mBSSL(表2)与AS20scFv(内部生产，HCVR SEQ ID NO:80和LCVR SEQ ID NO:114)一起用于此实施例中进行的实验。
SPR测量
使用
Figure BDA0003464862550000733
T200(GE Healthcare)通过SPR进行scFv克隆的亲和力评定。使用NHS-EDC化学通过伯胺偶联将α-FLAG M2抗体固定在CM5 S芯片上，允许通过其3xFLAG标签捕获AS20 scFv。将由5种不同浓度(200nM至2nM)的hBSSL和b-hBSSL组成的3倍稀释系列依次注射到流动池上，使其与捕获的AS20 scFv结合。在酸性条件下使用pH2.2的10mM甘氨酸-HCl实现表面的再生。将获得的单循环动力学数据拟合到1:1Langmuir结合模型，并使用软件BIAevaluation检索动力学参数ka(1/Ms)、kd(1/s)和KD(M)。
Figure BDA0003464862550000731
分析
将生物素化hBSSL与中性抗生物素蛋白偶联的
Figure BDA0003464862550000732
珠粒孵育并与30个不同的珠粒ID混合，每个珠粒与不相关蛋白质缀合。将混合珠粒池与存在于细菌上清液中的AS20 scFv一起孵育，所述细菌上清液在测定缓冲液(补充有3％BSA，0.05％Tween20和10μg/ml中性抗生物素蛋白的PBS)中以1:10稀释。还包括一个阳性scFv对照，即预期结合包被有一种不相关蛋白质的珠粒的scFv。通过R-PE-缀合的抗-FLAG M2抗体使scFv克隆与特定的蛋白缀合珠粒结合，随后在FlexMAP 3D仪器上进行分析。
结果
小规模生产和纯化
细菌表达和纯化的AS20 scFv的凝胶电泳显示高纯度，其中一条主要蛋白带与scFv的预期分子量完全对应(数据未显示)。
ELISA
AS20 scFv显示对非生物素化和生物素化人BSSL的浓度依赖性结合(图3a)。特定scFv浓度下，对生物素化BSSL的信号强度远高于非生物素化BSSL，这可能是由于包被条件的差异。
AS20 scFv也显示对小鼠BSSL的结合，但信号强度比对人BSSL弱得多(图3b)，这可表明AS20 scFv对小鼠BSSL的亲和力较弱。未检测到AS20 scFv与阴性对照的结合。
SPR测量
使用单循环动力学方法测定AS20 scFv对非生物素化和生物素化人BSSL的亲和力。AS20 scFv对非生物素化人BSSL(KD＝0.6nM)和生物素化人BSSL(KD＝0.8nM)显示出非常相似的亲和力(表4)。
表4-AS20 scFv与天然和生物素化hBSSL之间的相互作用的动力学参数
Figure BDA0003464862550000741
Luminex分析
为了确定AS20 scFv是否易于与非相关蛋白发生非特异性相互作用，进行Luminex测定，其中对30种不同的非相关蛋白以及其同源靶标分析AS20 scFv。AS20 scFv仅显示与人BSSL的结合，而不与测定中包括的所有其它蛋白质结合或结合非常低(图4)。
结论
发现AS20 scFv在亚纳摩尔范围内以相似的亲和力(相似的KD值)结合非生物素化人BSSL和生物素化人BSSL。获得的非生物素化BSSL的KD值与实施例1中报道的全长IgG抗体的KD值完全一致。当在基于Luminex的方法中测定时，AS20 scFv还显示与30种非相关蛋白的低脱靶结合。如ELISA结果所示，AS20 scFv显示对小鼠BSSL的结合，在实施例1中对于全长IgG也如此显示。
实施例3-通过HTRF进行的AS20 scFv与小鼠BSSL的结合表征
均相时间分辨荧光(HTRF)是基于分别称为供体和受体的两种不同分子之间的荧光共振能量转移(FRET)现象的分光光度法。本实施例描述了开发和使用基于HTRF的竞争测定法作为表征AS20 scFv与小鼠BSSL之间相互作用的替代方法。
材料和方法
为了研究AS20 scFv与天然小鼠BSSL之间的相互作用，开发了竞争测定。通过供体分子铽缀合的α-FLAG抗体(Cisbio#611FG2TL)(其与scFv的C端定位的FLAG标签相互作用)和受体分子链霉亲和素缀合的XL665(Cisbio#610SAXL)(其与人BSSL上的生物素部分相互作用)能够检测结合。使用一系列浓度的非生物素化蛋白质进行实验；mBSSL为0-500nM，hBSSL为0-80nM。hBSSL、b-hBSSL和mBSSL(表2)与AS20 scFv(内部生产，HCVR SEQ ID NO:80和LCVR SEQ ID NO:114)一起用于此实施例中进行的实验。
将2.5nM AS20 scFv与小鼠或人BSSL直向同源物预孵育2小时，之后加入5nM b-hBSSL和FRET供体和受体分子。最后将混合物在室温下孵育16小时，并使用EnVision(PerkinElmer)测量结合信号(665nm)和背景/噪声信号(615nm)。使用四个重复和两个空白计算每个点的实验输出ΔR。
结果
数据表明小鼠BSSL以浓度依赖性方式与人BSSL-生物素竞争结合AS20 scFv(图5)。对于人天然BSSL观察到相同的观察结果。用150-200nM小鼠BSSL和约2nM人BSSL实现ΔR的50％降低，表明与人直向同源物相比，AS20 scFv对小鼠BSSL的亲和力低约100倍。
结论
所得数据表明，与人直向同源物相比，AS20 scFv对小鼠BSSL的亲和力低约100倍。这与使用SPR获得的相同克隆的全长抗体形式的亲和力非常一致；AS20 mIgG1(实施例1)和嵌合AS20(实施例4)。
实施例4-嵌合AS20的产生
在此实施例中，产生嵌合AS20。更具体地，构建人IgG4亚类的嵌合体。
材料和方法
材料的生产外包给GenScript(Piscataway,NJ,USA)。使用分别对应于SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:114的小鼠AS20抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域的序列。合成编码重链和轻链的基因并克隆到编码人IgG4亚类的载体中。将构建体在FreeStyle 293-F细胞中转染和瞬时表达。随后通过使用蛋白A的亲和色谱，随后制备型尺寸排阻色谱(SEC)纯化表达的抗体，通过高效液相色谱(HPLC)测定纯度并在280nm通过分光光度法测定浓度。
结果
通过HPLC测定纯度为>98％。嵌合AS20的序列确定为重链的SEQ ID NO:139和轻链的SEQ ID NO:140。
嵌合AS20对小鼠和人BSSL保留与实施例1中AS20小鼠IgG1抗体相同的结合亲和力(数据未显示)。
实施例5-AS20 CDR移植抗体和AS20人源化文库的设计和构建
AS20是小鼠抗体，AS20 mIgG，参见实施例1。非人抗体已显示诱导人免疫反应，这可导致施用的抗体的中和，并进而限制抗体在疾病治疗中的作用。为了克服这个潜在的问题，进行抗体的人源化。本实施例描述了AS20人源化的两种策略，即互补决定区(CDR)移植和基于文库的方法。所得CDR移植抗体在本文中称为AS20 CDR移植物或CDR移植物，并且产生的文库在本文中称为AS20人源化文库。所述文库随后用于使用噬菌体展示来选择和分离AS20结合scFv片段(参见实施例6)。
材料和方法
图15A和15B是重链可变区的组合scFv文库设计的概述，并且图16A和16B是轻链可变区的组合scFv文库设计的概述。
选择scFv形式作为CDR移植物和人源化文库的支架。实施例2中呈现的数据显示AS20 scFv完全保留了其全长亲本IgG对应物的结合能力，表明scFv基因对于CDR移植物和构建组合文库都是良好的支架形式。
根据IMGT/DomainGapAlign(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)，与AS20重链可变区具有最高序列同源性的人免疫球蛋白重链可变区种系基因(IHGV)，IGHV1-46，同源性为73.5％(位于1-104)，被选为IHGV框架。对于轻链序列的选择，考虑同源性，但也考虑具有有利生物物理特性的重链和轻链配对[10]。总之，这导致选择人种系基因IGKV1-39。同样基于IMGT/DomainGap Align结构域搜索，选择IGHJ4和IKVJ2作为连接片段以分别获得完整的可变重链和轻链结构域。
通过将6个小鼠CDR环移植到人种系基因中获得AS20 CDR移植物。对于重链，将以下区域移植到IGHV1-46框架中：重链互补决定区1(HCDR1)(SEQ ID NO:7)；延伸的HCDR2(eHCDR2)(SEQ ID NO:141)；HCDR3(SEQ ID NO:9)。这产生了具有根据SEQ ID NO:144的HCVR的CDR移植物。对于轻链，将下列区域延伸的轻链互补决定区1(eLCDR1)(SEQ ID NO:142)，eLCDR2(SEQ ID NO:143)和LCDR3(SEQ ID NO:21)移植到IGKV1-39框架中，产生根据SEQ ID NO:145的LCVR。通过经由甘氨酸-丝氨酸接头((Gly4Ser)3)将HCVR与LCVR融合，形成编码相应scFv构建体的基因。在LCVR的末端添加两个额外的氨基酸(Arg和Thr，均为CL结构域的一部分)以包括BsiWI限制性位点。scFv基因的合成和亚克隆外包给GenScript(Piscataway,NJ,USA)。合成后，使用限制酶SfiI和BsiWII将scFv基因克隆到内部噬菌粒中。
使用与CDR移植物中所用相同的HCVR和LCVR框架来构建AS20人源化文库支架(图6)。AS20人源化文库的诱变策略总结于表5中。HCDR3被认为是抗原结合的最重要区域。有理由认为，此环对于AS20-BSSL相互作用很可能也是重要的，因此保持恒定。相反，选择其它5个CDR区中AS20和AS20人源化支架之间不同的22个位置用于变异(图6)。这里，主要尝试双重多样性，即允许在AS20和人种系基因中发现在特定位置构建人源化支架的残基。然而，并非所有的氨基酸对都可以在不引入额外氨基酸的情况下由NNS寡核苷酸建立，因此在6个位置(VH中的三个：62、64、68和VL中的三个：27、66、68)添加了额外的化学多样性。在LCDR3中，采用了另一种策略。在此，考虑了在IMGT数据库(http://www.imgt.org/ligmdb/)中发现的由种系基因IGVK1-39/IKV1D-39编码的重排功能抗体中发现的多样性。更具体地，具有8个氨基酸的LCDR3长度(AS20中LCDR3的长度)的抗体序列用作引入什么多样性的指导。获得的共有序列是QQSYSTPT(aa 105-117，SEQ ID NO:173)。基于小鼠AS20和人共有序列，在位置105、107和108引入双重多样性。在位置115，同样由于NNS寡核苷酸的限制，引入了4个氨基酸。由于VJ基因连接过程，发现LCDR3中的大多数多样性在位置116处。为了模拟这种可变性，但也受到NNS密码子使用的限制，这里允许6个氨基酸(P、H、L、Y、S和F)。此策略允许捕获抗体中在此位置发现的>50％的多样性。总之，上述过程产生了约1.2x109个不同变体的组合理论多样性。表5-AS20人源化文库中用于诱变的靶向位置。HCVR和LCVR中的位置分别列于表的上部和下部。以粗体标记的氨基酸是在AS20中发现的那些，而加下划线的氨基酸是在人种系基因中发现的相应多样性。编号如IMGT命名法所定义，并且对于密码子定义，使用IUPAC核苷酸代码。5个靶向区域(HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2和LCDR3)的各自引物用于引入多样性(表6)。
靶位置HCVR 设计的多样性 密码子
38 N,Y WAT
53 I,M ATR
55 V,I RTA
57 Y,N WAC
59 G,S RGT
62 N,G,S,D RRT
64 D,S,A,Y KMC
68 N,A,T,D RMT
72 K,Q MAG
靶位置LCVR 设计的多样性 密码子
24 S,R AGK
27 S,Q,P,Stop YMG
39 M,L WTG
40 H,N MAT
56 D,A GMT
57 T,A RCA
66 K,S,N,R ARS
68 A,Q,P,E SMA
105 H,A CAS
107 R,S AGK
108 S,Y TMT
115 Y,T,N,S WMT
116 P,H,L,Y,S,F YHC
使用基本上如[11]中所述的优化的Kunkel诱变方法，利用AS20人源化文库支架基因(图6)和五种诱变寡核苷酸(表6)，将多样性引入文库支架基因中。为了评估是否引入了预期的多样性，将TOP10大肠杆菌细胞用由Kunkel诱变方法产生的一小部分DNA进行化学转化，挑选96个克隆并送去测序(GATC，Germany)。随后将剩余的DNA电穿孔到SS320细胞(Lucigen,Middleton,WI,USA)中，产生含有约1.7×1010个克隆的高度多样化文库，如通过转化后获得的细菌菌落数所测量。收获转化的SS320细胞并用15％甘油在-80℃储存。使用细菌甘油原液接种总共600ml 2×YT，其中含有对噬菌粒和F'附加体都具有选择性的抗生素。使细菌生长至指数期，然后用M13KO7辅助噬菌体(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)感染，感染复数为5。使培养物繁殖过夜，并通过标准聚乙二醇PEG/NaCl沉淀收获展示scFv的噬菌体。将最终文库原液溶解于补充有0.5％BSA，0.05％吐温-20的PBS中。
表6-用于构建AS20人源化文库的寡核苷酸引物。使用IUPAC核苷酸代码格式化序列
Figure BDA0003464862550000801
结果
合成编码AS20 CDR移植物和AS20人源化文库支架的基因并克隆到pHAT4噬菌粒载体中。通过使用优化的Kunkel程序构建AS20人源化文库，产生1.7×1010个转化体。对96个随机挑选的克隆进行测序证实引入了预期的多样性(数据未显示)。
结论
成功地构建了AS20 CDR移植物和AS20人源化文库。在这两种情况下，IGHV1-46和IGKV1-39用作人框架支架基因。以scFv(实施例6)和IgG形式(实施例9和11)评价AS20 CDR移植物与BSSL的结合。AS20人源化文库用于通过噬菌体展示和各种结合筛选测定分离人源化BSSL结合scFv片段(实施例6)。若干个选择的克隆显示出以与亲本IgG相当的亲和力和特异性与同源靶标(人BSSL)结合，甚至与小鼠直向同源物的亲和力更好(实施例9)。当分析所选克隆的序列时(实施例11)，显然在某些位置富集特定残基。有趣的是，在几个位置(例如VH：62、64和VL：115)，优先选择双多样性以外的氨基酸，表明引入额外的多样性是成功的策略。
实施例6-在人和小鼠BSSL上的噬菌体展示选择和随后的筛选和测序
在本实施例中，进行噬菌体展示选择以能够分离对人BSSL和小鼠BSSL特异的scFv片段。
材料和方法
抗原
在噬菌体展示选择期间，使用小鼠BSSL和非生物素化和生物素化人BSSL作为靶抗原。更具体地，制备具有不同程度生物素化和偶联化学的两种变体。这些是BSSL-b胺和BSSL-b糖。hBSSL、b-hBSSL、hBSSL-b胺和mBSSL(表2)用作本实施例中噬菌体展示选择的靶标。
噬菌体展示选择
对于所有抗原，使用两个内部构建的人合成scFv噬菌体文库SciLifeLib2和AS20人源化文库进行四轮富集来进行噬菌体展示(参见实施例5)。SciLifeLib2是天然人合成scFv文库，其设计和构建与先前报道的相似[12]。通过逐渐减少抗原量和增加不同轮次之间的洗涤次数和强度来增加选择压力。对于两个生物素化人BSSL样品，通过将它们固定在链霉亲和素包被的顺磁珠(Dynabeads M-280,ThermoFisher Scientific,#11206D)上进行选择，并且选择过程中的大多数步骤是自动化的，并且用Kingfisher Flex机器人进行。通过将天然抗原包被在96孔板(NUNC Maxisorp#442404)上进行天然抗原的选择。在一些轨迹中，为了优先选择跨物种反应性scFv，抗原在不同轮次中在人和小鼠BSSL之间交替。用胰蛋白酶或通过使用小鼠BSSL的竞争性洗脱进行噬菌体的洗脱以在人BSSL上进行选择，反之亦然。这些不同参数的组合产生覆盖ScilifeLib2的总共五个不同的选择轨迹和AS20人源化文库的九个不同的选择轨迹的方案。使回收的噬菌体在Top10F’大肠杆菌中繁殖，在琼脂平板上在37℃过夜(第1和2轮)或在溶液中在30℃过夜(第3和4轮)。通过用过量的M13K07辅助噬菌体(New England Biolabs,#N0315S)感染并通过加入IPTG诱导scFv表达来制备噬菌体原液。过夜培养物经PEG/NaCl沉淀，重悬于选择缓冲液中并用于下一轮选择。表7总结了噬菌体展示选择轨迹。
表7-噬菌体展示轨迹
Figure BDA0003464862550000821
Figure BDA0003464862550000831
1-在与磁性SAV珠粒(M280)偶联的生物素化BSSL(胺偶联，10X)上进行选择
2-在与磁性SAV珠粒(M280)偶联的生物素化BSSL(对碳水化合物，BH8520)上进行选择
3-在包被在免疫试管表面的天然抗原上进行选择
4-通过BSSL的其他物种(小鼠或人)使用竞争进行噬菌体洗脱(胰蛋白酶将在所有其他情况下用于洗脱)
再克隆
为了产生可溶性scFv，从每个选择轨迹的第三轮和第四轮分离噬菌粒DNA。在集合中，将编码scFv片段的基因亚克隆到筛选载体中，提供scFv分泌的信号以及C端的三重FLAG标签和六组氨酸(His)标签。随后将构建体转化到TOP10大肠杆菌中。
初级ELISA和测序
对于每个选择轨迹，从第3轮和第4轮中挑选总共89-222个菌落并在96孔板中培养并生长过夜。用ELISA筛选表达的scFv(上清液)与各自选择靶标的天然形式的结合。此筛选方法中的实验包括关于与人和小鼠BSSL结合的先前已经构建、生产和表征的AS20scFv(参见实施例2)。还包括作为scFv的AS20 CDR移植物(参见实施例5)。对ELISA中认为阳性的克隆进行DNA测序(GATC Biotech,Cologne,Germany)。
第二次ELISA和HTRF
用ELISA在第二次筛选中进一步分析为每个选择轨迹鉴定的所有序列独特克隆。这里，增加抗原的数量以包括天然人和小鼠BSSL以及生物素化人BSSL。链霉亲和素用作非相关抗原。所有scFv的结合也通过HTRF(均相时间分辨荧光)评估。
结果
使用SciLifeLib 2和AS20人源化文库对四种形式的BSSL平行进行总共14个噬菌体选择轨迹。从14个轨迹中的每一个中挑选并分析89-222个克隆。ELISA和HTRF结合筛选和测序产生总共68个独特的scFv克隆，其能够结合它们被选择用于的BSSL的直向同源物。出乎意料的是，没有检测到AS20 CDR移植物scFv的结合。
结论
通过ELISA初步筛选总共2365个克隆，得到总共467个对人和小鼠BSSL具有潜在结合亲和力的scFv片段，送去测序。进行第二次ELISA筛选，然后进行HTRF和再测序，得到总共68个序列独特的scFv克隆。这些的结合数据表明，它们与人和小鼠BSSL的相对结合可以分成三组，其特征是识别这些直向同源物中的一种或两种。
64个分离物scFv来源于AS20人源化文库，而其中只有4个来源于SciLifeLib2。这表明BSSL是使用天然抗体文库进行噬菌体展示选择的挑战性靶标。
实施例7-68个抗BSSL scFv的ELISA和通过SPR进行的亲和力排序
在本实施例中，在ELISA中分析实施例6中产生的68个独特的scFv，并使用SPR基于亲和力进一步排序。连同早期的结合数据(ELISA和HTRF)，结果用作选择候选物用于进一步开发的决策点。
材料和方法
hBSSL和mBSSL(表2)用作本实施例中的BSSL试剂。
ELISA
将人和小鼠BSSL在4℃下以1μg/ml的PBS溶液包被到384-ELISA孔板中过夜。还包括两种阴性对照蛋白，链霉亲和素和BSA。将存在于细菌上清液中的FLAG标记的scFv克隆在测定缓冲液(PBS+0.5％BSA+0.05％Tween20)中以1:2和1:20稀释，并使其与包被蛋白结合。所有样品一式两份测定。通过HRP缀合的α-FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich#A8592)，随后与TMB ELISA底物(ThermoFisher Scientific#34029)孵育来检测结合。通过加入1M硫酸终止比色信号产生，并在450nm下分析板。
SPR
在
Figure BDA0003464862550000851
T200生物传感器仪器(GE Healthcare)上进行动力学筛选。根据制造商的建议，将作为捕获配体的α-FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich#F1804)固定在CM5-S胺传感器芯片的所有4个表面上。
将存在于细菌上清液中的FLAG标记的scFv克隆注射并捕获到芯片表面上，然后分别注射50nM和200nM的人或小鼠BSSL。用10mM甘氨酸-HCl pH2.2再生表面。所有实验均在25℃下在运行缓冲液(对于人BSSL，PBS+0.1％BSA+0.05％Tween20 pH 7.5，对于小鼠BSSL，25mM Tris-HCl+150mM NaCl pH 7.5)中进行。
结果
ELISA
对于大多数克隆，可以证实68个scFv克隆与直接包被的人和小鼠BSSL的结合。如实施例6中观察到的，BSSL结合克隆可以分成具有识别人BSSL、小鼠BSSL或人和小鼠BSSL的特征的三组。大多数克隆显示对人BSSL的优先结合(数据未显示)。
SPR
通过目视检查传感图(未示出)进行数据分析。当研究这些时，显然大多数克隆对人BSSL比对小鼠BSSL具有相当更高的亲和力，更低的KD值(M)。对传感图的检查也显示，许多人源化克隆显示与对AS20 scFv观察到的相同范围内的亲和力。这样的克隆的实例是S-SL048-11(包括HCVR SEQ ID NO:30和LCVR SEQ ID NO:31)、S-SL048-14(包括HCVR SEQ IDNO:50和LCVR SEQ ID NO:84)、S-SL048-106(包括HCVR SEQ ID NO:34和LCVR SEQ ID NO:35)、S-SL048-108(包括HCVR SEQ ID NO:72、LCVR SEQ ID NO:106)、S-SL048-109(包括HCVR SEQ ID NO:73和LCVR SEQ ID NO:107)、S-SL048-116(包括HCVR SEQ ID NO:36和LCVR SEQ ID NO:37)和S-SL048-125(包括HCVR SEQ ID NO:77、LCVR SEQ ID NO:111)。这些特定克隆对小鼠BSSL的亲和力也与对AS20所见的相似。
来源于针对小鼠BSSL淘选的噬菌体展示选择轨迹的少数克隆显示与人BSSL相比对小鼠BSSL的优先结合，如克隆S-SL048-66(包含HCVR SEQ ID NO:61和LCVR SEQ ID NO:95)。
结论
在本实施例中，通过ELISA证实了先前鉴定的68个scFv克隆与BSSL的结合。还使用单一浓度的人和小鼠BSSL对所有68个克隆进行了动力学筛选。如对于AS20所发现的，与对小鼠BSSL相比，大多数克隆对人BSSL显示出更高的估计结合亲和力，定义为解离平衡常数KD(M)。对人BSSL的估计亲和力在低纳摩尔至纳摩尔范围内，参考AS20 scFv显示出2nM的KD值。一小组scFv克隆显示对小鼠BSSL的亲和力高于对人BSSL的亲和力，其中最高亲和力对应于43nM的KD值。
从收集的所有数据中，选择38个克隆(包含HCVR SEQ ID NO:30、32、34、36和47-79以及LCVR SEQ ID NO:31、33、35、37、38和81-113)和参考AS20 scFv(HCVR SEQ ID NO:80和LCVR SEQ ID NO:114)用于转化为人IgG4 S228P。所有的候选克隆来源于AS20人源化文库，没有一个来源于SciLifeLib。
实施例8-38个人源化BSSL特异性抗体转化为hIgG4 S228P形式和小规模瞬时表达
在此实验中，将来自实施例7中的噬菌体选择和随后的结合筛选的38个最有希望的人源化scFv克隆(包含HCVR SEQ ID NO:30、32、34、36和47-79以及LCVR SEQ ID NO:31、33、35、37、38和81-113)转化为人IgG4 S228P抗体形式。此外，AS20(亲本克隆)(包含HCVRSEQ NO:80和LCVR SEQ ID NO:114)和AS20 CDR移植物(包含HCVR SEQ NO:144和LCVR SEQID NO:145)类似地转化为IgG4S228P。
简单地说，人IgG4被认为是人中Fc沉默最多的天然IgG亚类，即它不通过抗体的Fc部分介导主要效应功能。与IgG1相似，IgG4的血清半衰期为21天。然而，IgG4自然倾向于在体内解离成半个IgG4分子，然后可以与其它循环IgG4分子组合。这种半分子交换可通过在铰链区引入稳定突变来避免，即S228P(Eu编号；这与Kabat编号S241P相同)[13]。
将编码38个scFv克隆、AS20和AS20 CDR移植物的VH和VL的基因成功转移到编码人IgG4 S228P亚类的载体中。瞬时转染ExpiHEK293细胞，小规模(4ml)表达抗体并蛋白A纯化。在SDS-PAGE和分析尺寸排阻色谱(SEC)中分析纯度和完整性/单体含量。
材料和方法
序列分析
选择用于IgG转化的scFv的HCVR和LCVR的氨基酸序列显示在序列表中，并为了清楚可见，与抗半抗原(4-羟基-3-硝基苯基乙酰基，NP)抗体(抗NP)一起列于表8中。
表8-本实施例中使用的抗体
Figure BDA0003464862550000881
Figure BDA0003464862550000891
图14显示了转化为hIgG4 S228P的38个人源化克隆之间的序列差异。在AS20人源化文库中，靶向重链的CDR1和CDR2以及轻链的CDR1、CDR2和CDR3中总共20个位置用于多样化。为了比较，图中包括AS20和CDR移植构建体。
无缝克隆
通过标准小量制备程序从细菌培养物中纯化38个BSSL特异性scFv和AS20的质粒DNA。AS20 CDR移植物的基因由Genscript合成。使用In-Fusion HD Plus克隆试剂盒(Clontech#638909)，将VH和VL区进行PCR扩增并插入内部构建的载体pHAT-hIgG4-S241P中。产生的全长IgG序列的一个代表性实例是对应于SEQ ID NO:119的S-SL048-11 hIgG4S228P重链(VH-CH1-铰链-CH2-CH3)和对应于SEQ ID NO:120的S-SL048-11 hIgG4 S228P轻链(VL-CL)。
转染到HEK293中，表达和纯化
使用ExpiFectamineTM 293转染试剂盒(ThermoFisher Scientific#A14525)在24深孔板中的4ml培养物中将质粒DNA转染到expiHEK293细胞中。在37℃，6％CO2，80％rH和400rpm下培养5天后，将培养基上清液与蛋白A缀合的磁珠混合并在KingFisher Flex仪器上纯化。在0.1M甘氨酸pH2.7中洗脱后，立即通过加入1M Tris-HCl，pH8.8进行中和，并通过使用96孔旋转脱盐板将缓冲液更换为PBS。进行SDS-PAGE以测定纯化的IgG的纯度和完整性，并使用Implen NP80紫外-可见分光光度计(Fisher Scientific)测定浓度。
结果
无缝克隆
如通过测序证实，38个独特的scFv、AS20和AS20 CDR移植物成功转化为全长人IgG4抗体。
转染到HEK293中，表达和纯化
抗体在expiHEK293细胞中表达并通过蛋白A纯化从上清液中纯化。通过SDS-PAGE证实纯化的IgG的纯度和完整性(数据未显示)。
结论
将所有BSSL结合抗体成功地再克隆成hIgG4形式，在HEK293细胞中表达，并在Kingfisher Flex仪器上通过蛋白A缀合的磁珠纯化。如通过SDS-PAGE评估的，所有均显示出可接受的纯度水平。
实施例9-38个hIgG4 S228P克隆与人和小鼠BSSL的结合
本实施例描述了通过表面等离子体共振(SPR)对38个hIgG4 S228P克隆(实施例8，表8)进行的靶结合分析，所述分析是为了验证在从scFv转化为IgG形式后保留了与人和小鼠BSSL的结合。
材料和方法
使用
Figure BDA0003464862550000901
T200(GE Healthcare)通过SPR测定hIgG4 S228P克隆的动力学参数。单循环动力学用于测量纯化的hIgG4分子与人和小鼠BSSL的亲和力。使用NHS-EDC化学通过伯胺偶联将抗Fab抗体(GE Healthcare,#28958325)固定在CM5 S传感器芯片上。hIgG4被抗Fab抗体捕获，随后将5种不同浓度的hBSSL(从50nM开始1:5稀释)或mBSSL(从500nM开始1:5稀释)注射到表面上。用10mM甘氨酸-HCl pH2.1再生传感器芯片表面。使用如表2中所列的BSSL试剂。对于与人BSSL的结合，将单循环动力学数据拟合至1:1结合模型并使用软件BIAevaluation检索动力学参数。对于小鼠BSSL，通过将平衡时的反应水平对各浓度作图来进行稳态分析，并且通过BIAevalution软件检索KD值。
结果
使用单循环动力学方法测定转化的抗体对非生物素化人BSSL和小鼠BSSL的亲和力。所得平衡解离常数(KD)列于表9中。对于hBSSL，将数据通常成功地拟合到1:1结合模型。对于小鼠BSSL，数据并不总是很好地拟合1:1结合模型。相反，使用稳态分析来分析数据。测定的与人和鼠BSSL结合的KD值与对scFv形式的相同克隆测定的KD值在相同的范围内(参见实施例7)。对于AS20 CDR移植克隆，观察到与人BSSL的结合程度低(数据未显示)。然而，认为模型拟合不准确，因此没有检索到这个特定克隆的KD值。
表9-测量的平衡解离常数(KD)在一些情况下，数据的质量被认为太低而不可靠，在此表示为“n.d.”(未确定)。
Figure BDA0003464862550000911
Figure BDA0003464862550000921
结论
总之，结果表明抗体对人和鼠BSSL的结合亲和力不受再克隆成hIgG4形式的影响。然而，AS20 CDR移植物表现不同。如实施例6所示，当以scFv形式表达时，AS20 CDR移植物不显示与BSSL的任何结合。然而，在IgG形式中，观察到与人BSSL的结合信号。
实施例10-使用流式细胞术置换测定法对28个hIgG4 S228P克隆的功能测试
在本实施例中，使用基于流式细胞术的置换测定法测试实施例9中对人和/或小鼠BSSL具有最高结合亲和力的28个hIgG4 S228P抗体(包含HCVR SEQ ID NO:30、32、34、36、47、50-56、59-65、68、69、71-73、75、77和78以及LCVR SEQ ID NO:31、33、35、37、38、81、84-90、93-99、102、103、105-107、109、111和112)阻断人BSSL与CD14+单核细胞结合的能力。包括5种抗体作为参考；AS20mIgG1(HC SEQ ID NO:135和LC SEQ ID NO:136)、AS20 hIgG4(HCSEQ ID NO:129和LC SEQ ID NO:130)、AS20 CDR移植物(HC SEQ ID NO:131和LC SEQ IDNO:132)、抗人α突触核蛋白mIgG1和抗NP hIgG4(HC SEQ ID NO:133和LC SEQ ID NO:134)。
材料和方法
血沉棕黄层的制备
从一名健康供体抽取人血在补充有柠檬酸盐抗凝血剂(BD Vacutainer)的真空采血管中。在室温下在摇动式桶转子中1300×g离心10分钟后分离由白细胞和血小板组成的血沉棕黄层。
流式细胞术置换测定法
将不同浓度的28种BSSL特异性hIgG4抗体和5种参考抗体(每个反应0.5μg至3.0μg；参见表10)加入圆底聚苯乙烯管中的b-hBSSL(每个反应1μg，参见表2)中，加入将1×PBS(pH7.4)至20μl的终体积，并将抗体/b-hBSSL混合物在+4℃孵育30分钟以促进抗体与BSSL的结合。然后将血沉棕黄层(50μl)加入每个抗体/b-hBSSL混合物中，并在+4℃下再继续孵育30分钟。此后，加入2ml FACS裂解液(BD Biosciences)并将细胞在室温下孵育10分钟以裂解红细胞并固定白细胞。然后将细胞在200×g下离心5分钟，通过加入2ml FACS缓冲液(补充有1％FCS和0.1％NaN3的1×PBS)洗涤所得沉淀并再次离心。最后，弃去上清液，并将细胞重悬于最后一滴约50μl液体中。
将5μl BV421标记的抗人CD14(BD Biosciences)和5μl BB515标记的链霉亲和素(BD Biosciences)加入每个管中，并在+4℃下避光孵育30分钟。此后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于500μl FACS缓冲液中，并在BD LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上运行。最后，使用FlowJo软件(BD Biosciences)分析数据。
结果
首先对CD14+细胞进行设门以描绘单核细胞群体。然后，通过BB515标记的链霉亲和素检测b-hBSSL与设门CD14+单核细胞的结合，并定量为BB515通道中的中值荧光强度(MFI)。将BSSL特异性hIgG4和参考抗体置换b-hBSSL与CD14+单核细胞结合的能力定量为与增加浓度的BSSL特异性hIgG4或参考抗体孵育后单核细胞中BB515 MFI的减少。
表10-28种BSSL特异性hIgG4 S228P和参考抗体阻断BSSL与人CD14+单核细胞结合的能力。注意不是所有抗体都在所有浓度下测试。
Figure BDA0003464862550000941
Figure BDA0003464862550000951
结论
hBSSL的分子量(76kD)约为IgG分子的一半(150kD)。因此，在此实施例中，1μgBSSL和2μg IgG大致对应于1:1摩尔比。使用最高抗体浓度(每个反应3μg)，我们显示28种BSSL特异性hIgG4 S228P抗体中的9种抑制(置换)至少60％的BSSL(每个反应1μg)与单核细胞结合。置换结合的最有效抗体是AS20 mIgG1，而AS20 CDR移植物hIgG4、抗NP hIgG4和抗α-突触核蛋白mIgG1根本不影响结合。
实施例11-5种预先命名的hIgG4 S228P抗体和对照的产生
基于从实施例9中进行的结合测定法和实施例10中的体外功能研究获得的结果和序列内容，选择5种人源化hIgG4 S228P克隆用于更大规模生产(10mg)，即S-SL048-11、S-SL048-46、S-SL048-106、S-SL048-116和S-SL048-118。
还包括两个对照；AS20和AS20 CDR移植物克隆。此外，还包括同种型对照。为此，从Absolute Antibody订购抗半抗原(4-羟基-3-硝基苯基乙酰基，NP)抗体(克隆B1-8)。所选亚类形式hIgG4 S228P与先前在实施例8中用于评估38种BSSL特异性克隆的相同。
材料和方法
抗体的产生
材料的生产外包给Absolute Antibody(Oxford,UK)。将7种克隆的VH和VL的序列信息送到公司，在那里合成基因并克隆到编码人IgG4-S228P亚类的载体中。抗体在哺乳动物HEK293细胞中瞬时表达，随后使用蛋白A通过亲和色谱纯化。通过SDS-PAGE评估纯度和完整性，并通过LAL显色内毒素测定法测定内毒素水平。
8种抗体的氨基酸序列对应于表11所示的SEQ ID NO。
表11-本实施例中使用的抗体
Figure BDA0003464862550000961
表面等离子体共振(SPR)
使用
Figure BDA0003464862550000962
T200(GE Healthcare)通过SPR测定hIgG4 S228P克隆的动力学参数。使用NHS-EDC化学通过伯胺偶联将抗Fab抗体(GE#28958325)固定在CM5 S传感器芯片上。hIgG4抗体被抗Fab抗体捕获，随后将5种不同浓度的hBSSL(1:5稀释，0.08-50nM)或mBSSL(1:2稀释，50-800nM)注射到表面上。用10mM甘氨酸-HCl pH2.1再生传感器芯片表面。对于与人BSSL的结合，将单循环动力学数据拟合至1:1结合模型并使用软件BIAevaluation检索动力学参数。对于小鼠BSSL，通过将平衡时的反应水平对各浓度作图来进行稳态分析，并且通过BIAevalution软件检索KD值。
结果
抗体的产生
从Absolute Antibody接收10毫克浓度为4.6-5mg/ml的八种抗体在25mM组氨酸、150mM NaCl、0.02％P80(pH6.0)中的溶液。通过SDS-PAGE测定纯度>98％，并且通过LAL显色内毒素测定法测定内毒素水平<0.05EU/mg。通过分析尺寸排阻色谱测定每个克隆的单体含量>98％。
SPR
SPR用于测定抗体与人和小鼠BSSL的亲和力。表12总结了预先命名克隆对hBSSL和mBSSL结合的不同KD值。为了比较，还包括对内部生产的相同克隆测定的KD值(这些实验在实施例9中描述)。
表12-hIgG4 S228P形式的抗体的SPR分析结果总结。*这些值从实施例9中报道的实验获得。标有#的数字被视为不可靠，应谨慎查看。在一些情况下，认为数据的质量太低而不可靠，在此表示为“n.d.”(未确定)。
Figure BDA0003464862550000971
结论
在ELISA(数据未显示)和SPR中分析由Absolute Antibody产生的5个预先命名的候选物和3个对照的BSSL结合。结果显示，与BSSL的结合通常与内部产生的相同IgG形式的各个克隆所观察到的非常相似(参见实施例9)。结果还显示同种型对照抗NP hIgG4 S228P不结合BSSL，因此应适合用作未来分析中的阴性对照。这些抗体批次的功能性也在置换测定法中评估(实施例10)。如实施例10中报道的，不同克隆获得了非常相似的结果(数据未显示)。
在此实施例中，我们可以第一次测量CDR移植物的亲和力。在此，AS20 CDR移植物hIgG4 S228P(包含HC SEQ ID NO:131和LC SEQ ID NO:132)在较高浓度下表现出与hBSSL的明显结合，尽管与AS20 hsIgG S228P(包含HC SEQ ID NO:129和LC SEQ ID NO:130)相比结合大大降低。此处测得的对hBSSL的亲和力降低约100倍，而对mBSSL的亲和力太低而不能测定。因此，当CDR移植到新的框架上时，对靶标的亲和力显著降低。所观察到的AS20 CDR移植物hIgG4 S228P与scFv AS20 CDR移植物(包含HCVR SEQ ID NO:144和LCVR SEQ ID NO:145，参见实施例6)相比更强的BSSL结合可能是由于不同的抗体形式。
实施例12-五种候选抗体的稳定性研究
本实施例描述了hIgG4 S228P形式的S-SL048-11、S-SL048-46、S-SL048-106、S-SL048-116和S-SL048-118的稳定性研究，以研究抗体的生物物理稳定性。为了比较，包括作为hIgG4 S228P和hIgG1 LALA-PG的AS20(参见实施例17)。还包括AS20 CDR移植物hIgG4S228P和抗NP hIgG1 LALA-PG同种型对照。通过SDS-PAGE、分析SEC、纳米DSF和DLS进行分析。
材料和方法
稳定性研究中包括的9种不同抗体及其相应的SEQ ID NO列于表13中。将抗体等分到小瓶中并在-80℃、+4℃和+40℃下以5mg/ml在25mM组氨酸、150mM NaCl、0.02％P80，pH6.0中孵育。根据表14中的时间表抽取样品并进行分析，其中第0天是起始日。
表13-本实施例中使用的抗体
Figure BDA0003464862550000981
Figure BDA0003464862550000991
表14-样品分析时间表
Figure BDA0003464862550000992
使用连接到Agilent 1100系统的BioSEC柱(300A,7.8×300mm；πP.N.5190-2511,Agillent)并使用0.15M磷酸钠(NaxHyPO4)pH6.8的运行缓冲液以流速1ml/min进行分析尺寸排阻色谱(SEC)。通过测量A280和A220处的吸光度检测蛋白质。将20μg各样品加载到柱上。使用NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(InVitrogen NP0321BOX)，使用NuPAGE MES SDS运行缓冲液(InVItrogen NP000202)，根据制造商的说明书进行SDS-PAGE。样品在还原或非还原条件下运行。使用SimplyBlue染色(Invitrogen LC6065)显现条带，并使用光密度扫描仪(Oddyssey,Li-cor)定量条带。每孔装载5μg各样品。
使用Prometheus仪器(NanoTemper)以1度/分钟的升温速率施加20-95℃的温度梯度来进行纳米-DSF(差示扫描荧光法)。记录300nm和350nm处的荧光发射以及反向散射信号。每个样品加载10μL浓度为5mg/ml的样品。使用来自Nanotemper的PR.Stabilityanalysis v1.02分析数据。
使用Zetasizer Pro(Malvern)进行动态光散射。使用ZS Explorer软件v1.0.0.436和内置算法记录并分析散射光。以5mg/ml分析样品。
结果
尺寸排阻色谱(SEC)
根据表14中所呈示的方案获得每个样品的色谱图。注意到随时间出现的另外的峰具有较低的分子量，表明材料降解。绘制随时间的总积分面积表明在预过滤器或柱上没有材料损失。
尺寸排阻色谱数据示于图7中。观察由主峰构成的总面积的百分比，在+4℃下仅可观察到小变化。在+40℃下可以看到更显著的效果。
对于S-SL048-46 hIgG4 S228P和抗NP hIgG1 LALA-PG观察到最大的减少。S-SL048-118 hIgG4 S228P、hIgG4 S228P的AS20和AS20 hIgG1 LALA-PG显示中等减少，而CDR移植物显示几乎没有减少。
SDS-PAGE
如表14所示，在还原和非还原条件下分析样品。-80℃样品除了S-SL048-46 hIgG4S228P和抗NP hIgG1 LALA-PG外没有显示出另外的条带，这两个在还原条件下显示出一个弱条带，每个构成小于1％。这与第0天样品所观察到的几乎相同。事实上，第0天样品显示在第30天分析的-80℃未看到的额外条带，反映分析的可变性。非还原样品与第0天样品几乎相同。在+4℃下，在还原或非还原条件下，在第9天或第30天没有观察到另外的显著条带。在+40℃下，所有样品在第9天和第30天显示出额外的条带。在还原条件下，所有候选物均显示较低分子量条带，即低于25kD，而AS20 hIgG4 S228P、AS20 hIgG1 LALA-PG和抗NP hIgG1LALA-PG均显示较高Mw条带(即在第9天和第30天大于50kDa)。在这两种情况下，这些条带随着时间变得更加显著。在非还原条件下，可以看到明显的差异，在所有样品中出现另外的条带。结果表明候选物S-SL048-46和S-SL048-106可能更易于降解。
纳米DSF
根据表14中的时间表分析样品，并且将结果呈示于图8中。可从纳米DSF数据得到的主要观察结果是AS20 hIgG4 S228P、AS20 hIgG1 LALA-PG形式和抗NP hIgG1 LALA-PG中发生的变化，其中主要解链温度Tm偏移在+40℃下储存时可见。
对于候选物，主要观察结果是第二Tm的幅度降低(数据未显示)，其可以反映来自抗体Fab部分的主要贡献。候选物S-SL048-46和S-SL048-106显示稍大的变化，而S-SL048-11、S-SL048-116和S-SL048-118显示相似但稍小的作用。对于所有候选物，这些差异被认为是微小的。CDR移植物似乎是测试样品中最稳定的。
动态光散射(DLS)
在第30天通过DLS分析样品。每个样品在三种不同温度下的结果示于图9中。在-80和+4℃下，所有样品均显示出一个表观直径约10-11nm的峰，与单体抗体的预期结果一致。在任何样品中都没有观察到较大的颗粒，即只能检测到蛋白质分子。
在+40℃下，在不同程度上清楚地看到较大的颗粒。使用Z均数和多分散性数作为尺寸均匀性的指标(数据未显示)，S-SL048-106显示最低量的较高Mw颗粒。相反，AS20hIgG1 LALA-PG和抗NP hIgG1 LALA-PG显示最高数量的较高Mw颗粒，表明这两种分子更倾向于聚集。
结论
总之，将数据与总体排名相结合，hIgG4 S228P形式的最稳定的候选物似乎依次是：S-SL048-106、S-SL048-118和S-SL048-116。
实施例13-通过HDX-MS的AS20的表位作图
在本实施例中，对嵌合AS20 IgG4抗体与人BSSL一起进行氢氘交换质谱(HDX-MS)以对其表位作图。
材料和方法
将40μL 2mg/mL人BSSL(SEQ ID NO:138)的PBS溶液与92.5μL 1.7mg/ml嵌合AS20hIgG4抗体(包含HC SEQ ID NO:139和LC SEQ ID NO:140)以1:1摩尔比混合。使用10K离心过滤装置(Amicon Ultra,Merck)将BSSL/抗体复合物浓缩至40μL。同时，类似地制备仅含有BSSL而不添加抗体的样品。在自动HDX-MS系统(CTC PAL/Biomotif HDX)中分析样品，其中将样品在2℃下自动标记、淬灭、消化、清洁和分离。更具体地，通过将3μL BSSL(或BSSL/抗体复合物)与22μL氘化PBS混合来标记样品，并在4℃下孵育四个标记时间点：5分钟、30分钟、90分钟和180分钟。通过加入20μL含有6M尿素、100mM TCEP和0.5％TFA的溶液将pH降低至约2.3并将温度降低至约4℃来停止/淬灭标记反应。使用固定的胃蛋白酶柱(2.1柱(2.1×30mm)以250μl/min消化样品，随后使用2mm I.D×10mm长度C-18预柱(ACE HPLCColumns,Aberdeen,UK)，使用0.05％TFA，以350μl/min进行在线脱盐步骤，持续3分钟。然后使用以95μL/min运行的2mm I.D×50mm长度HALO C18/1.8μm分析柱，通过18min 8-55％线性梯度的ACN的0.1％甲酸分离胃蛋白酶肽。使用在m/z 400下以70,000分辨率运行的Orbitrap Q Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行分析。软件Mascot用于肽鉴定，并且HDExaminer(Sierra Analytics,USA)用于处理所有HDX-MS数据。使用95％置信区间进行统计分析。
结果
通过覆盖57.9％蛋白质的HDX-MS跟踪66个肽的氘化动力学。计算氘标记(5、30、90和180分钟)和单独BSSL和存在AS20之间的差别氘化摄取动力学。在AS20抗体存在下，靠近N端的若干种肽显示统计学上较低的氘摄取，清楚地将表位作图到此区域。通过考虑重叠肽，可以降低空间分辨率，得到表15所示的三个肽区域。
表15-HDX-MS实验提出的AS20表位区域列表
Figure BDA0003464862550001031
结论
总之，将AS20表位成功地作图到BSSL的N端区域。鉴定了在AS20存在下具有显著较低氘摄取的三个不连续肽区域簇。将这些区域一起作图在BSSL的三维结构中，表明这些肽一起构成AS20的构象表位。在实施例21中，我们描述了与hBSSL复合的AS20 Fab片段的晶体结构。三维结构的分析证实了来自HDX-MS数据的结果，并且可以具体地限定参与相互作用的氨基酸。
实施例14-通过HDX-MS对预先命名的抗体候选物的表位作图
在本实施例中，进行氢氘交换质谱(HDX-MS)以对5种预先命名的候选抗体S-SL048-11 hIgG4 S228P(mAb11,HC SEQ ID NO:119,LC SEQ ID NO:120)、S-SL048-46hIgG4 S228P(mAb46,HC SEQ ID NO:121,LC SEQ ID NO:122)、S-SL048-106 hIgG4 S228P(mAb106,HC SEQ ID NO:123,LC SEQ ID NO:124)、S-SL048-116 hIgG4 S228P(mAb116,HCSEQ ID NO:125,LC SEQ ID NO:126)和S-SL048-118hIgG4 S228P(mAb11,8HC SEQ ID NO:127,LC SEQ ID NO:128)的BSSL表位进行作图。
材料和方法
将2mg/mL BSSL的PBS溶液与不同抗体(在25mM组氨酸、150mM NaCl、0.02％P80，pH6.0中的5mg/mL)以1:1摩尔比混合。使用10K离心过滤装置(Amicon Ultra,Merck)将样品浓缩并将缓冲液更换为PBS。同时，对仅含有BSSL而不添加抗体的样品进行相同的程序。
在自动HDX-MS系统(CTC PAL/Biomotif HDX)中分析样品，其中将样品在2℃下自动标记、淬灭、消化、清洁和分离。更具体地，通过将3μL BSSL(或BSSL/抗体复合物)与22μL氘化PBS混合来标记样品，并在4℃下孵育四个标记时间点：5分钟、30分钟、90分钟和180分钟。通过加入20μL含有2M尿素、100mM TCEP和0.5％TFA的溶液将pH降低至约2.3并将温度降低至约4℃来停止/淬灭标记反应。使用固定的胃蛋白酶柱(2.1柱(2.1×30mm)以250μl/min消化样品，随后使用2mm I.D×10mm长度C-18预柱(ACE HPLC Columns,Aberdeen,UK)，使用0.05％TFA，以350μl/min进行在线脱盐步骤，持续3分钟。然后使用以95μL/min运行的2mmI.D×50mm长度HALO C18/1.8μm分析柱，通过15min 8-60％线性梯度的ACN的0.1％甲酸分离胃蛋白酶肽。使用在m/z 400下以70,000分辨率运行的Orbitrap Q Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行分析。软件Mascot用于肽鉴定，并且HDExaminer(SierraAnalytics,USA)用于处理所有HDX-MS数据。使用95％置信区间进行统计分析。
结果
通过覆盖64％蛋白质的HDX-MS跟踪54个肽的氘化动力学。计算氘标记(5、30、90和180分钟)和单独BSSL和存在五种抗体中任一种之间的差别氘化摄取动力学。观察到，在每个预先命名的候选抗体存在下，靠近BSSL的N端的若干种肽显示统计学上较低的氘摄取。通过考虑重叠肽，可以降低空间分辨率，得到表16所示的两个肽区域。
表16-HDX-MS实验提出的共同表位区域列表
Figure BDA0003464862550001051
除了所有预先命名的抗体共有的表位区域之外，一种额外的肽被鉴定为在三种抗体中具有统计学上较低的氘摄取，即S-SL048-46的肽10(aa 84-101；NIWVPQGRKQVSRDLPVM(SEQ ID NO:4))，S-SL048-116的肽24(aa 174-180；VKRNIAA(SEQ ID NO:5))和S-SL048-11的肽39(aa 283-295；HYVGFVPVIDGDF(SEQ ID NO:6))(表17)。然而，这些信号相对较弱。
可以注意到，尽管在一级序列中展开，但所有五种抗体共有的两个表位区(aa 1-12和aa 42-55)在三维结构中聚集在一起(图10)。肽24(aa 174-180)相对靠近此核心区，而肽10(aa 84-101)和39(aa 283-295)更分散。
表17-在单独BSSL和存在五种抗体中的任一种之间具有差异氘化摄取动力学的肽的总结
Figure BDA0003464862550001052
Figure BDA0003464862550001061
结论
5个预先命名的候选抗体的表位被成功地作图到BSSL的N端区域。在所有5种抗体存在下，两个不连续肽区域被鉴定为具有显著较低的氘摄取。
重叠肽可允许降低空间分辨率。例如，在AS20实验(实施例13)中，发现对应于aa1-6的肽在氘交换中没有变化，而较长的重叠肽有变化(AKLGAVYTEGGF，aa 1-12，SEQ IDNO:3)。换句话说，表位残基可以被缩减为YTEGGF(aa 7-12)(SEQ ID NO:1)。相反，在本实施例中，由于没有检测到对应于aa 1-6的肽，所以不能进行这种缩减。
除了两个共同的表位区域之外，在三个预先命名的候选物(S-SL048-46、S-SL048-116和S-SL048-11)中，一个额外的肽各自被鉴定为潜在的表位区域。尽管具有统计学显著性，但是这些肽的信号变化的幅度相对较低，并且对于相互作用可能不太重要。而且，肽VKRNIAA(aa 174-180,SEQ ID NO:5)聚集在三维空间的核心区域的事实表明此区域也是表位的一部分。值得注意的是，此肽也与AS20的原始作图中检测到的一种肽重叠。另外两个外周肽10(aa 84-101，SEQ ID NO:4)和肽39(aa 283-295，SEQ ID NO:6)的信号变化可以通过抗体结合后的稳定化(“变构”效应)来解释。
总之，这些数据有力地表明共享的共同核心，由所有预先命名的候选物的序列1-12(SEQ ID NO:3)和42-55(SEQ ID NO:2)中某处的两个肽区域组成。这些区域也在如实施例13中所述的AS20的先前表位作图实验中鉴定，并且被认为对于实施例21中所述的AS20复合物的晶体结构中的相互作用是重要的。
实施例15-免疫原性评估
本实施例描述了由Abzena进行的候选物SL048-11(HC SEQ ID NO:119和LC SEQID NO:120)、S-SL048-46(HC SEQ ID NO:121和LC SEQ ID NO:122)、S-SL048-106(HC SEQID NO:123和HC SEQ ID NO:124)、S-SL048-116(HC SEQ ID NO:125和LC SEQ ID NO:126)以及S-SL048-118(HC SEQ ID NO:127和HC SEQ ID NO:128)和AS20 hIgG4 S228P(HC SEQID NO:129和LC SEQ ID NO:130)的免疫原性评估。
材料和方法
使用Abzena’s iTopeTMMHC II类计算机预测算法，分析由Lipum提供的序列的免疫原性潜力。iTopeTM软件预测肽的氨基酸侧链与34个人MHC II类等位基因的开放式结合凹槽内的特定结合口袋(口袋位置；p1、p4、p6、p7和p9)之间的有利相互作用。这些等位基因代表在世界范围内发现的最常见的HLA-DR等位基因，没有权重归因于在任何种族群体中最普遍发现的那些。20个等位基因包含“开放”p1构型，14个包含“闭合”构型，其中第83位的甘氨酸被缬氨酸替换。关键结合残基的定位通过计算机产生9-mer肽来实现，所述9-mer肽与跨越测试蛋白质序列的8个氨基酸重叠。
应根据以下事实评估结果：MHC II类结合的所有预测方法固有地过度预测T细胞表位的数量，因为它们不允许抗原呈递期间的其它重要过程，如蛋白质/肽加工、T细胞受体识别或T细胞对肽的耐受性。
在hIgG4 S228P形式的S-SL048-11、S-SL048-46、S-SL048-106、S-SL048-116、S-SL048-118和AS20中突出显示p1锚定残基(包含MHC II类核心9-mer配体的第一个残基)的位置。
如果≥50％的MHC II类结合肽(即34个等位基因中的≥17个)具有高结合亲和力(得分>0.6)，则将此类肽定义为“混杂高亲和力”MHC II类结合肽。
将以得分>0.55(但大多数不>0.6)结合≥50％的等位基因的MHC II类结合肽定义为“混杂中等亲和力”。
在p1锚定位置出现大芳香族氨基酸(即F、W、Y)的情况下，这些标准发生了变化，其中34个等位基因中20个的开放p1口袋允许结合大芳香族残基。当发生这种情况时，将混杂肽定义为与20个等位基因子集中的10个或更多个结合。
还分析了种系中等和高亲和力结合肽的p1锚定位置，并且预计这些在健康个体中不会由于T细胞耐受性而产生问题。
针对已知阳性肽的TCEDTM数据库对阳性iTopeTM命中进行BLAST搜索，并指出代表来自T细胞表位数据库的紧密同源肽的区域(即，已知在离体EpiScreenTMT细胞表位作图测定中诱导T细胞激活的肽)。Kabat编号用于标记抗体序列。
结果
先前在离体EpiScreenTMT细胞测定中测试的肽的TCEDTM分析揭示了与许多iTopeTMMHC结合肽的强同源性。在表18中，+表示错配残基，其中替换是具有相似生理化学性质的氨基酸，并且-表示其它错配残基。iTopeTM和TCEDTM序列的关键MHC II类口袋位置的位置示于表18的底行中。
表18-TCEDTM分析的结果
Figure BDA0003464862550001091
表19显示每个候选序列的iTopeTM混杂中等亲和力和高亲和力MHC II类结合肽和TCEDTM命中的总数(示出AS20仅供参考)。
表19-免疫原性分析的汇总结果
Figure BDA0003464862550001101
当与AS20 hIgG4 S228P相比时，所有5个候选人源化克隆含有较少的非种系混杂MHC II类肽。所有变体序列包含至少两个TCEDTM命中，与已知在EpiScreenTM离体测定中诱导T激活的肽具有部分同源性(9个位置中最少6个)。在这5个变体中，基于非种系混杂高和中等亲和力MHC II类结合肽的数量，S-SL048-106 hIgG4 S228P代表最低的免疫原性风险。根据以下对候选物进行排名：较少的混杂命中106<46<11＝118<116较多的混杂命中。
需要注意的是，计算机免疫原性分析本质上是过度预测的。
实施例16-可制造性评估
本实施例描述了由Abzena进行的hIgG4 S228P形式的候选物S-SL048-11(HC SEQID NO:119和LC SEQ ID NO:120)、S-SL048-46(HC SEQ ID NO:121和LC SEQ ID NO:122)、S-SL048-106(HC SEQ ID NO:123和LC SEQ ID NO:124)、S-SL048-116(HC SEQ ID NO:125和LC SEQ ID NO:126)以及S-SL048-118(HC SEQ ID NO:127和LC SEQ ID NO:128)的计算机可制造性评估。
材料和方法
使用Abzena的计算机责任预测算法分析hIgG4 S228P形式的S-SL048-11、S-SL048-46、S-SL048-106、S-SL048-和116S-SL048-118的氨基酸序列。随后在结构上下文中分析所确定的责任。简言之，对于每个V结构域的序列，分析如下项：
·存在脱酰胺位点；
·存在异构化位点；
·潜在氧化位点；
·存在N连接的糖基化位点
·存在游离半胱氨酸。
本文中，除非另有说明，否则通篇使用IMGT CDR定义和编号。
存在脱酰胺位点
天冬酰胺残基的脱酰胺可导致结构变化、药代动力学和功效以及潜在免疫原性的变化。使用基于[14]的方法在氨基和羧基相邻氨基酸的上下文中分析作为潜在脱酰胺位点的天冬酰胺残基。
存在异构化位点
通过分析已知异构化基序(DG、DS、DT或DD)的序列来预测天冬氨酸异构化位点，重点是CDR区。
潜在氧化位点
产生重链和轻链可变区的结构模型，并且鉴定和评估甲硫氨酸和色氨酸残基，以确定它们是否可能是表面暴露的，因此是氧化的候选物。单个残基的氧化可能影响抗体的生物活性，并且可能具有生物后果，例如降低的效力或改变的药代动力学。
存在N连接的糖基化位点
基于共有N连接糖基化基序-N-X-S/T-分析VH和Vκ序列，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。
存在游离半胱氨酸
分析序列以鉴定未配对的半胱氨酸残基。VH和Vκ结构域通常各自含有在折叠分子中形成链内二硫键的两个典型半胱氨酸。预期另外的半胱氨酸对折叠是有害的并且可能引起诸如聚集的问题。
结果
进行分析，并且在5种候选抗体的VH或Vκ序列中没有鉴定出潜在的N连接糖基化位点；在5种候选抗体的VH或Vκ序列中没有鉴定到未配对的半胱氨酸；在5种候选抗体的VH或Vκ序列中没有鉴定出潜在的氧化位点，而在5种候选抗体中的任一种的VH或Vκ内没有鉴定出具有高(t1/2<10天)或中等(t1/2<25天)脱酰胺潜力的位点。
所有5种克隆的VH中的CDR或接近CDR的区域鉴定了两个潜在的异构化位点。
·Asp54(DG)位于VH CDR2内，因此异构化可影响抗原结合；
·Asp72位于有时称为“CDR4”的区域中的CDR附近，因此异构化可能影响抗原结合。
表20-序列责任总结
Figure BDA0003464862550001131
具有突出显示的潜在翻译后责任的S-SL048-106 Fv的表示显示在图11中。
总之，在5种先导候选物中的任一种中没有鉴定出游离半胱氨酸、氧化位点或N连接的糖基化位点。在S-SL048-11、S-SL048-116或S-SL048-118中没有鉴定到高潜在脱酰胺位点。S-SL048-46和S-SL048-106在VH CDR2中含有潜在的脱酰胺位点。在5种前导变体中的每一种的重链中鉴定到两个潜在的异构化位点。
实施例17-AS20 hIgG1 LALA-PG和抗NP hIgG1 LALA-PG的产生和结合表征
在本实施例中，描述了AS20和人IgG1-LALA-PG亚类的抗NP(克隆B1-8)抗体(下文称为AS20 hIgG1 LALA-PG(包含HC SEQ ID NO:115和LC SEQ ID NO:116)和抗NP hIgG1LALA-PG(包含HC SEQ ID NO:117和LC SEQ ID NO:118))的产生和结合表征。包括作为同种型对照的抗NP抗体。
材料和方法
表达和纯化
IgG4是Fc惰性最强的天然人亚类。然而，若干出版物已经显示，IgG4可以在小鼠[15]和人中与FcR以及补体相互作用。因此，在本研究中选择在三个位置具有突变的人IgG1，即L234A、L235A和P329G(简称hIgG1 LALA-PG)，因为据报道可得到Fc最沉默变体[7，16]，即不具有免疫效应功能。
材料的生产外包给Absolute Antibody(Oxford,UK)。AS20的VH和VL的序列信息被送至公司，在那里合成基因并克隆到编码人IgG1-LALA-PG亚类的载体中。抗体在哺乳动物HEK293细胞中瞬时表达，随后使用蛋白A通过亲和色谱纯化。通过SDS-PAGE评估纯度和完整性，并通过LAL显色内毒素测定法测定内毒素水平。
表面等离子体共振(SPR)
单循环动力学用于测量抗体的亲和力。使用NHS-EDC化学通过伯胺偶联将AS20hIgG1 LALA-PG和抗NP hIgG1 LALA-PG固定在CM5 S传感器芯片上。在表面上注射5种不同浓度的抗原(对于hBSSL，从50nM开始1:3稀释，对于mBSSL，从800nM开始1:2稀释)。用10mM甘氨酸-HCl pH2.1再生传感器芯片表面。将获得的单循环动力学数据拟合至Langmuir 1:1结合模型，并使用软件BIAevaluation检索动力学参数。对于mBSSL，还通过将平衡时的应答水平对各浓度作图来进行稳态分析，并且通过BIAevalution软件检索KD值。
结果
成功地产生了AS20 hIgG1 LALA-PG和抗NP hIgG1 LALA-PG(数据未显示)。
使用单循环动力学SPR方法测定IgG的亲和力。对于AS20 hIgG1 LALA-PG与hBSSL的结合，计算出0.91nM的平衡解离常数(KD)。对于mBSSL，测定的KD为361nM。如所预期的，对于抗NP hIgG1 LALA-PG，没有观察到与BSSL的结合。
结论
本实施例描述了为了验证AS20 hIgG1 LALA-PG具有功能性，即与BSSL的结合与hIgG4 S228P形式的AS20的结合相当而进行的质量检查。
AS20 hIgG1 LALA-PG的SPR分析显示，与BSSL的结合非常类似于对其它IgG形式的AS20观察到的结合。通过SPR测定的hBSSL的KD为0.91nM，这与对其它IgG形式的AS20测定的0.6nM-3nM的KD值相当(如实施例1、2和4所述)。AS20 hIgG1 LALA-PG对mBSSL的亲和力在稳态亲和力分析中估计为KD值361nM，其与先前通过相同分析估计的KD(155nM，实施例1)具有相同的数量级，并且传感图的外观是相似的(未显示)。
因此，数据显示AS20 hIgG1 LALA-PG的结合不受亚类变化的影响。结果还显示同种型对照抗NP hIgG1 LALA-PG不结合BSSL，因此可适合用作未来分析中的阴性对照。
实施例18-AS20 hIgG1 LALA-PG在类风湿性关节炎小鼠模型中的功效验证
在本实施例中，在类风湿性关节炎(RA)，即胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)的体内小鼠模型中研究AS20 hIgG1 LALA-PG(重链SEQ ID NO:115和轻链SEQ ID NO:116)的作用。抗NP hIgG1 LALA-PG抗体(重链SEQ ID NO:117和轻链SEQ ID NO:118)作为同种型对照包括在研究中。
模型描述-小鼠中的CAIA
小鼠中的胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)是不依赖于B和T细胞的关节炎模型。用静脉内(i.v.)施用的对抗II型胶原(CII)的抗体诱导疾病，随后在3-5天后腹膜内(i.p.)施用LPS以促进疾病发展。注射的抗体与软骨结合，从而激活免疫系统并将巨噬细胞和粒细胞募集到关节。需要加强注射LPS以达到疾病发展的显著严重性和发病率。所述疾病过程是高度可预测的并且在LPS加强后发作。所述疾病在第15天左右达到最大严重程度，此后严重程度降低直至最终治愈。研究经瑞典马尔默/隆德
Figure BDA0003464862550001161
当地动物伦理委员会(M118-15)批准。
材料和方法
疾病诱导
在第0天，向DBA/1小鼠(雄性，8-9周)静脉内注射2mg/小鼠的单克隆抗CII抗体混合物(CIA-MAB-50，MD Bioproducts)。第5天，用LPS(50μg/小鼠)腹膜内注射小鼠，以加重疾病。
实验组和测试项目的施用
AS20 hIgG1 LALA-PG和同种型对照抗体以5mg/ml的浓度递送，并进一步在媒介物(25mM组氨酸，150mM NaCl，0.02％P80，pH6.0)中稀释。腹膜内施用测试项目(抗体)，在疾病诱导前一天(第-1天)开始每4天施用，然后在第3、7、11和15天施用。基于第-2天动物的平均体重，将AS20 hIgG1 LALA-PG以三种不同剂量施用，即10、30和90mg/kg，同种型对照(抗NPhIgG1 LALA-PG)以90mg/kg施用。选择相对高的剂量以补偿与人BSSL相比AS20 hIgG1LALA-PG对小鼠BSSL的低亲和力，如实施例17所述。实验组概述于表21中。第-1天的第一次施用是推注剂量，即，所有测试项目作为分成两次注射的双剂量给予，第一次注射在早晨给予，第二次注射在下午给予。以下施用(第3、7、11和15天)作为单剂量给予。在每次施用前对动物称重，并且剂量体积20ml/kg基于动物的个体重量。
表21-实验组
Figure BDA0003464862550001171
*每组两只卫星动物。
疾病评价
从第3天每天以盲法方式使用0至15范围内的四肢宏观评分系统评价疾病(每个肿胀或红色脚趾为1分，肿胀或红色中足指或指节为1分，肿胀脚踝为5分)，导致每个小鼠的最大总分为60。由于伦理限制，从实验中去除评分超过45的动物。
血液取样
在第19天研究终止，在深度麻醉下(在第15天最后一次注射后96小时)通过心脏穿刺将所有小鼠的血液收集到含有LiHeparin的微管中。将样品立即置于冰上并在取样后20分钟内离心(2000×g，5分钟，4℃)。将血浆样品等分并在干冰上冷冻。将等分试样储存在-80℃下直至分析AS20 IgG1 LALA-PG暴露和抗药物抗体(ADA)(所有组，n＝70)和一组安全生物标记(组1-3，n＝42)。
卫星动物的PK采样
为了获得关于PK概况和ADA的信息，每个抗体处理的动物的给药组包括两只卫星动物。在第7天施用前1小时和施用后24小时(即在第8天)从舌下静脉取血样(每个给药组两只动物)。还在第15天给药前1小时和施用后24小时(即第16天)采集血样(每个给药组两只动物)。
组织收集
在研究终止时，将所有动物的脾解剖出来并称重。将来自同种型对照处理组(第2组)和来自90mg/kg AS20 hIgG1 LALA-PG组(第3组)中的14只动物的14只脾均质化，并如实施例19所述通过FACS分析。
血浆中的药物暴露
使用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析从卫星动物(参见上文)和研究终止时(第19天)从所有动物收集的血浆样品中AS20 IgG1 LALA-PG的暴露。
抗药物抗体(ADA)
通过分析从卫星动物(参见上文)和研究终止时(第19天)从所有动物收集的血浆样品中的ADA进行免疫原性评估。
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量ADA。简言之，用AS20hIgG1 LALA-20或同种型对照抗体包被maxisorp板，并用含5％BSA，0.05％吐温-20的1×PBS封闭。加入血浆样品或掺有阳性对照抗体的小鼠血浆，并将板在室温下孵育2小时。洗涤板，加入第二抗体过氧化物酶AffiniPure山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)(Jackson ImmunoResearch)，并在室温下孵育1小时后，彻底洗涤板，最后使用TMD底物(Sigma-Aldrich)进行检测。
安全性生物标记物的测量
使用临床化学方法分析从第1组(媒介物对照)、第2组(同种型对照，90mg/kg)和第3组(AS20 hIgG1 LALA-PG，90mg/kg)收集的血浆样品的14种安全性生物标记物(白蛋白、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、淀粉酶、胆红素、血尿素氮、钙、肌酐、球蛋白、葡萄糖、磷酸盐、钾、钠和总蛋白)。在瑞典南泰利耶RISE的化学和药物安全部(unit of Chemical andpharmaceutical Safety,RISE,
Figure BDA0003464862550001191
Sweden)，使用带卡盒#500-0038的AbaxisVetscan系统进行分析。
结果
关节炎严重程度
CAIA诱导的和媒介物处理的动物发展中度至重度疾病，发病率为100％。同种型对照处理的动物观察到类似的结果。从第-1天到终止每4天腹膜内给药的AS20 hIgG1 LALA-PG的功效以三种剂量(10、30和90mg/kg)进行评估。与同种型对照相比，90mg/kg和30mg/kg的AS20 hIgG1 LALA-PG分别在第7-14、16、18和7-12天显示对疾病的显著改善作用。与媒介物相比，当以90mg/kg给药AS20 hIgG1 LALA-PG时，观察到疾病严重程度的小幅降低，尽管没有统计学显著性(图18和19)。
出于伦理原因(高分)，在终止前(第12天)取出两只动物，一只在AS20 hIgG1LALA-PG 10mg/kg组中，一只在同种型对照组中。这些动物包括在最大评分中，但不包括平均值、AUC和％抑制(图19，表22)。
疾病参数统计概述于表22中。
表22-CAIA严重程度参数统计
Figure BDA0003464862550001201
1累积发病率。如果在连续2个评分日的评分为1分或更高，则认为小鼠已发生疾病。2所有评分时间点的平均CAIA评分。3曲线下面积。4相对于同种型对照治疗组，每个动物的总体疾病负荷的变化百分比。通过测定同种型对照组平均AUC和每个个体动物的AUC之间的差异，除以同种型对照组AUC并乘以100*(-1)来计算。*p<0.05；**与同种型对照相比p<0.01。
健康评估
从第3天到终止，每天进行一般健康评估并结合疾病评估。将小鼠每周称重两次，作为一般健康评估的一部分。在动物中没有观察到治疗的副作用(数据未显示)。
血浆中的药物暴露
在第19天研究结束时AS20 hIgG1 LALA-PG的血浆暴露总体上在基于先前单剂量药代动力学评估的预期浓度范围内。确定10mg/kg剂量组的平均浓度为199μg/mL(约1.3μM，58-309μg/mL)，30mg/kg剂量组为614μg/mL(约4.1μM，229-970μg/mL)，90mg/mL剂量组相应的平均浓度为1408μg/mL(约9.4μM，520-2557μg/mL)。因此观察到轻微非线性的剂量-暴露关系。未检测到因免疫原性而导致治疗时间内血浆暴露改变的迹象。来自接受同种型对照的小鼠的血浆样品中hIgG1 LALA-PG的平均浓度测定为1815(约12μM，1224-2511μg/mL),
抗药物抗体(ADA)
研究样品中未检测到令人担忧的ADA。尽管大多数样品测试为阳性，但AS20 hIgG1LALA-PG组中的滴度不高于对照组。考虑到反应的早期发作(约第7天)和随时间的未改变的药物暴露，样品中检测到的抗药物信号可能主要由非特异性/低亲和力IgM引起。
安全性生物标记物
用AS20 hIgG1 LALA-PG和同种型对照抗体治疗后，血浆中的葡萄糖增加。高剂量AS20 hIgG1 LALA-PG没有增加肝损伤生物标记物。与同种型对照组相比，AS20 hIgG1LALA-PG治疗组的血浆肌酐有增加的趋势，尽管没有统计学显著性(p<0.06)。其它肾标记物，即血尿素、电解质或总蛋白，在AS20 hIgG1 LALA-PG和同种型对照治疗的小鼠之间没有差异。
结论
CAIA诱导的同种型对照处理的小鼠发展中度至重度疾病，发病率为100％。媒介物处理的小鼠观察到相同的结果。
与同种型对照相比，以90mg/kg和30mg/kg给药的AS20 hIgG1 LALA-PG分别在第7-14、16-18和7-12天显示对疾病的显著改善作用。与媒介物相比，当以90mg/kg给药AS20hIgG1 LALA-PG时，观察到疾病严重程度的小幅降低，尽管没有统计学显著性。
研究结束时AS20 IgG1 LALA-PG的血浆暴露总体在预期浓度范围内。未检测到因免疫原性而导致治疗时间内血浆暴露改变的迹象。研究样品中未检测到令人担忧的ADA。
高剂量AS20 IgG1 LALA-PG没有增加肝损伤生物标记物。AS20hIgG1 LALA-PG治疗组的血浆肌酐有增加的趋势，尽管没有统计学显著性。其它肾标志物，即血尿素、电解质或总蛋白，在AS20 hIgG1 LAL之间没有差异。
实施例19-来自CAIA实验的脾的FACS分析
在本实施例中，通过荧光激活细胞分选(FACS)研究AS20 hIgG1 LALA-PG(重链SEQID NO:115和轻链SEQ ID NO:116)对来自患有胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)的小鼠的脾中细胞亚群的影响。包括作为同种型对照的抗NP hIgG1 LALA-PG(重链SEQ ID NO:117和轻链SEQ ID NO:118)。
材料和方法
本研究是上述实验性体内研究(实施例18)的一部分。简言之，通过静脉内(i.v.)施用对抗II型胶原的抗体在DBA/1小鼠(雄性，8-9周)诱导CAIA，随后腹膜内(i.p.)施用LPS以促进疾病发展。通过腹膜内施用AS20 hIgG1 LALA-PG或同种型对照抗体(抗NP hIgG1LALA-PG)，在疾病诱导前一天(第-1天)开始每4天施用来治疗小鼠。在研究终止时(第19天)，如下所述将来自用最高剂量AS20 hIgG1 LALA-PG(90mg/kg)或同种型对照(90mg/kg)治疗的动物的脾解剖出，称重并均质化。设计FACS板以鉴定T细胞、B细胞、NKT细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。
单细胞悬浮液
使脾在RPMI-1640培养基(Thermo Fisher,HyClone)中通过70-μm细胞过滤器以获得单细胞悬浮液。将细胞沉淀并重悬于1ml MilliQ水中以裂解红细胞(10秒)，加入1ml 2×PBS，然后加入10ml 1×PBS。用10ml HBSS(Thermo Fisher,HyClone)洗涤细胞，最后重浮于适当体积的HBSS中，得到10×106个细胞/ml。
FACS方案
将1×106个细胞接种到96孔圆底板的每个孔中，并在850×g，4℃下离心1分钟，用FACS缓冲液(1×PBS，3％FBS，2mM EDTA)洗涤，并再次沉淀。将在FACS缓冲液中1:50稀释的纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32(Fc阻断)加入到每个孔中，并将细胞孵育15分钟，然后再次用FACS缓冲液洗涤。通过将以下抗体添加到适当体积的FACS缓冲液中来制备抗体混合物：
FITC仓鼠抗小鼠CD3ε(1:100)
PE大鼠抗小鼠CD86(1:100)
PE-CF594大鼠抗小鼠Ly-6C(1:50)
PE-Cy7大鼠抗小鼠Ly-6G(1:200)
Biotin仓鼠抗小鼠CD49b(1:200)
APC-Cy7仓鼠抗小鼠CD11c(1:50)
Alexa Fluor 647大鼠抗小鼠I-A/I-E(MHCII)(1:200)
Alexa Fluor 700小鼠抗小鼠CD45.2(1:100)
BV421大鼠抗小鼠Siglec-F(1:200)
BV605大鼠抗CD11b(1:200)
BV650大鼠抗小鼠CD19(1:100)
BV786仓鼠抗小鼠CD80(1:200)
eF506可固定的活力染料(1:400)
将25μl抗体混合物加入到每个孔中的细胞中并在冰上避光孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，加入25μl二抗混合物(PerCP-Cy5.5链霉亲和素，在FACS缓冲液中1:200稀释)，并将细胞在冰上避光孵育20分钟。然后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬于250μlFACS缓冲液中，转移到FACS管中，最后在CytoFLEX流式细胞仪平台(Beckman Coulter)上分析。
设门策略
如下鉴定细胞子集：
T细胞：CD45.2+、CD11b-、CD3+
B细胞：CD45.2+、CD11b-、CD19+
NKT细胞：CD45.2+、CD11b-、CD3+、CD49b+
中性粒细胞：CD45.2+、CD11b+、Ly6G+
嗜酸性粒细胞：CD45.2+、CD11b+、Ly6G-、Siglec F+
NK细胞：CD45.2+、CD11b+、Ly6G-、Siglec F-、CD49b+
树突细胞：CD45.2+、CD11b+、Ly6G-、Siglec F-、CD11c+、MHCII+
单核细胞：CD45.2+、CD11b+、Ly6G-、Siglec F-、CD11C-、Ly6C+
巨噬细胞：CD45.2+、CD11b+、Ly6G-、Siglec F-、CD11C-、Ly6C-、MHCII+
此外，分析CD80和CD86在树突细胞上的表达。
结果
AS20 hIgG1 LALA-PG治疗组(第3组，实施例18)和同种型对照组(第2组，实施例18)之间的体重没有显著差异，无论疾病诱导前两天(AS20，23.9±1.4g；同种型对照，23.8±1.2g)还是第19天研究终止(AS20，22.5±1.7g；同种型对照，22.1±1.0g)。但是，与同种型对照组相比，AS20 hIgG1 LALA-PG治疗组的脾重量显著更高(110±23mg与88±21mg；p＝0.02)，并且与同种型对照组相比，AS20组的CD45+白细胞总数也更高(44.5×106与39.0×106；p＝0.008)。
与同型对照治疗的小鼠相比，AS20 hIgG1 LALA-PG治疗脾中B细胞总数更高(27.1±3.5×106与21.0±5.8×106；p＝0.004)。相反，与同种型对照治疗的小鼠相比，AS20hIgG1 LALA-PG治疗中NK细胞的总数减少(0.44±0.09×106与0.54±0.09×106；p＝0.01)。与同种型对照治疗的小鼠相比，AS20 hIgG1 LALA-PG治疗中NKT细胞总数也减少，尽管没有统计学显著性(0.14±0.03×106与0.16±0.03×106；p＝0.08)。在AS20 IgG1 LALA-PG治疗的小鼠和同种型对照治疗的小鼠之间在中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或T细胞的总数方面没有发现显著差异(图20)。
与同种型对照治疗的小鼠相比，AS20 IgG1 LALA-PG治疗中脾中CD45+细胞中B细胞的比例更高(60.9±5.4％与53.0±10.0％，p＝0.02)。相反，发现与同种型对照治疗的小鼠相比，AS20 hIgG1 LALA-PG治疗的CD45+细胞中T细胞、NKT细胞和NK细胞的比例更低(T细胞：15.2±3.3％与18.9±4.1％，p＝0.02；NKT细胞：0.31±0.05％与0.40±0.07％，p＝0.0003；NK细胞：0.99±0.22％与1.4±0.23％，p＝0.0001)。在AS20 IgG1 LALA-PG治疗的小鼠和同种型对照治疗的小鼠之间没有发现CD45+白细胞中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的比例有显著差异(图21)。在CD45+细胞中表达CD80或CD86的细胞方面，AS20 IgG1 LALA-PG治疗的小鼠和同种型对照治疗的小鼠之间没有显著差异，无论总数还是比例(数据未显示)。
结论
用AS20 hIgG1 LALA-PG(90mg/kg剂量)治疗显著减少了患有CAIA的小鼠脾中的CD45+细胞中的NK细胞总数和T细胞、NKT细胞和NK细胞的比例。
实施例20-预先命名的抗体候选物对BSSL酶活性的影响的分析
在本实施例中，研究了hIgG4 S228P形式的5种预先命名的候选抗体对BSSL酶活性的影响，所述预先命名的候选抗体即S-SL048-11(重链SEQ ID NO:119和轻链SEQ ID NO:120)、S-SL048-46(重链SEQ ID NO:121和轻链SEQ ID NO:122)、S-SL048-106(重链SEQ IDNO:123和轻链SEQ ID NO:124)、S-SL048-116(重链SEQ ID NO:125和轻链SEQ ID NO:126)和S-SL048-118(重链SEQ ID NO:127和轻链SEQ ID NO:128)。与hIgG4S228P形式的AS20CDR移植物(重链SEQ ID NO:131和轻链SEQ ID NO:132)、嵌合AS20(重链SEQ ID NO:129和轻链SEQ ID NO:130)和同种型对照抗NP抗体(重链SEQ ID NO:133和轻链SEQ ID NO:134)进行比较。
材料和方法
BSSL与预先命名的候选抗体的预孵育
本实施例中使用天然人BSSL(SEQ ID NO:138；表2)。将BSSL储液在MilliQ(MQ)-H2O中10×稀释至0.42mg/ml的浓度。
将抗体在MQ-H2O中稀释至0.3μg/μl起始浓度，然后在MQ-H2O中1:1连续稀释，得到6点浓度，范围为0.3μg/μl至0.009μg/μl。从各抗体稀释液中，将20μl加入到2.4μl BSSL(1μg)中，并将抗体/BSSL混合物在+4℃下孵育1小时。孵育后，向每个BSSL/抗体反应中加入20μl MQ-H2O。
甘油三酯水解测定
通过以下方式来制备甘油三脂(TG)乳液：将25mg未标记的三油酸甘油酯(Sigma目录号92860)与50μl 3H标记的三油酸甘油酯(三油酸甘油酯[9,10-3H(N)]，91CI/mmol)NET431001MC Perkin Elmer(Waltham,MA)在适合超声处理的圆底30mm直径玻璃容器中混合；在室温下在氮气(N2)下蒸发溶剂；向容器中加入1.0ml 10％阿拉伯树胶(Sigma目录号G-9752)，1.25ml 1.0M Tris-HCl pH 9.0和2.0ml MQ-H2O；将容器在冰水中冷却并使用具有9mm直径平头探针的Soniprep 150(MSE,UK)以50％脉冲模式在中等设置下超声处理10分钟，所述探针放置在液体表面下几毫米，直到获得乳液；并向所述乳液中加入2.5ml 18.7％BSA(Sigma目录号A7906)、2.5ml 1.0M NaCl和3.25ml MQ-H2O。乳液在制备当天使用。接着，将10μl预孵育的BSSL/抗体溶液(参见上文)与150μl TG乳液与10mM胆酸钠(Sigma目录号C-1254)和MQ-H2O在13×100mm玻璃管中混合，总体积为200μl。一式两份制备样品。将试管在37℃下孵育15分钟，随后通过加入3.25ml甲醇/氯仿/庚烷(体积/体积/体积，760/680/540)和1.0ml 0.1M碳酸钠pH10.5终止反应，随后以3500×g离心10分钟。从含有水解的游离脂肪酸的上层水溶性相中取出1400μl，并与2.0ml Optiphase Hisafe 3闪烁混合物(PerkinElmer,Waltham,MA)在6ml聚乙烯小瓶(Perkin Elmer)中混合，并通过在WinSpectral 1414(Wallac,Turku,Finland)上进行液体闪烁计数来测量水解的3H标记的游离脂肪酸的量。
胆固醇酯水解测定
通过以下方式来制备胆固醇酯(CE)乳液：将40μl 14C-标记的胆固醇油酸酯(油酸酯-1-14C,NEC6380050UC,Perkin Elmer)加入适合超声处理的圆底30mm直径玻璃容器，并在室温下在氮气下蒸发溶剂；向容器中加入2.0ml 0.2M Tris-HCl pH 7.5和0.85ml MQ-H2O；将容器在冰水中冷却并使用具有9mm直径平头探针的Soniprep 150(MSE)以50％脉冲模式在中等设置下超声处理10分钟，所述探针放置在液体表面下几毫米，直到获得乳液；并且向所述乳液中加入1.65ml 200mM胆酸钠和1.0ml MQ-H2O。乳液在制备当天使用。接着，将10μl预孵育的BSSL/抗体溶液(参见上文)与100μl CE乳液和MQ-H2O在13×100mm玻璃管中混合，总体积为200μl。一式两份制备样品。将试管在37℃下孵育30分钟，随后通过加入3.25ml甲醇/氯仿/庚烷(体积/体积/体积，760/680/540)和1.0ml 0.1M碳酸钠pH10.5终止反应，随后以3500×g离心10分钟。从含有水解的游离脂肪酸的上层水溶性相中取出400μl，并与2.0ml Optiphase Hisafe 3闪烁混合物(Perkin Elmer)在6ml聚乙烯小瓶(PerkinElmer)中混合，并通过在WinSpectral 1414(Wallac)上进行液体闪烁计数来测量水解的14C标记的游离脂肪酸的量。
结果
通过分别在15分钟孵育(甘油三酯水解测定)或30分钟孵育(胆固醇酯水解测定)后测量游离脂肪酸(放射性标记)的释放来评价酶活性，参见图17。出于技术原因，必须在连续两组中分析样品，但两组中均包括两种抗体(AS20和同种型对照抗NP抗体)。数据表示为相对值，其中将未向反应中加入抗体而获得的值设为100％(表23和24)。表23-五种BSSL特异性hIgG4 S228P和hIgG4 S228P亚型的对照抗体对BSSL酶活性(甘油三酯的水解)的影响
Figure BDA0003464862550001281
Figure BDA0003464862550001291
表24-五种BSSL特异性hIgG4 S228P和hIgG4 S228P亚型的对照抗体对BSSL酶活性(胆固醇酯的水解)的影响
Figure BDA0003464862550001292
结论
hIgG4 S228P形式的所测试的抗体，即五种预先命名的候选药物、AS20、AS20 CDR移植物和抗NP，均未显示出对BSSL的酶活性有任何显著影响。
实施例21-通过X射线晶体学对AS20的表位作图
使用X射线晶体学确定AS20与hBSSL的复合物的三维结构。对于此实验，将抗体裂解以产生Fab片段，并制备新的C端截短的hBSSL(t-hBSSL)构建体，其对应于hBSSL的氨基酸1至530，随后是AHHHHHH(SEQ ID NO:146)。
材料和方法
t-hBSSL的克隆、表达和纯化
人BSSL先前已经结晶为缺乏柔性C端部分的截短形式。因此，为了能够产生AS20Fab和hBSSL的晶体，制备了新的截短的BSSL构建体，其包括用于纯化的C端his标签。由氨基酸1-530+AHHHHHH(BSSL编号基于除去信号肽后的序列)组成的构建体gp67-BSSL-6×H从GeneArt订购并克隆到pFastBac tGFP Dual载体中，所述载体已被制备用于连接非依赖性克隆(LIC)。使用InFusion克隆试剂盒进行LIC并转化至Stellar感受态细胞。
在DH10Bac大肠杆菌细胞中产生重组杆粒DNA。将杆粒转染到Sf9细胞中在27℃进行120小时。从生长培养基中收获P1病毒，随后用于产生P2病毒原液。96小时后，通过离心收获P2病毒原液。将400ml Sf9细胞(1.5×106个细胞/ml)用2ml P2病毒原液感染并在感染后生长72小时。通过离心收获培养基(P3原液)并过滤。对于大规模表达，将35ml P3病毒原液添加到Thomson最佳生长烧瓶(5L)中的2130ml Sf9细胞(1.6×106个细胞/ml)中。在27℃下进行表达72小时。收获时，细胞密度为2.34×106个细胞/ml，75％表达GFP，89％具有活力。离心培养物以除去细胞。使用Ni琼脂糖快速流动树脂通过分批IMAC从培养基中纯化t-hBSSL，并用50mM Tris pH7.5、500mM NaCl、500mM咪唑洗脱。使用Superdex 200 16/60柱在50mM Hepes pH 7.0、500mM NaCl中通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。蛋白质作为单个单体峰洗脱，将其合并并浓缩。
AS20 Fab片段与t-hBSSL的复合物形成
在Absolute Antibody(Oxford,UK)进行AS20抗体的生产。通过遵循来自固定木瓜蛋白酶供应商(Thermo Scientific,产品编号20341)的木瓜蛋白酶消化方案产生Fab片段。将总共15mg的AS20浓缩至17mg/ml，并将缓冲液更换为20mM磷酸钠、10mM EDTA pH 7、20mM半胱氨酸。将抗体与固定的木瓜蛋白酶(0.6ml浆液)在37℃孵育3小时，然后在4℃孵育过夜。由于切割未完成，将样品在37℃下再孵育3小时，然后在室温下孵育过周末。用10mMTris pH 7.5洗脱抗体并加入纯化的t-hBSSL。将混合物在室温下孵育约30分钟，之后将其加载到在50mM Hepes pH 7.0、500mM NaCl中的Superdex 200柱上。约60ml洗脱体积的第一个主峰含有t-hBSSL和AS20 Fab片段的复合物。将相关级分浓缩(10K MWCO)并通过用50mMHepes pH 7.0缓冲液稀释将盐浓度降至250mM。
AS20 Fab与t-hBSSL复合物的结晶和结构解析
纯化Fab t-hBSSL复合物后，将样品在实验室之间运输期间在4℃下在冰上保持约36小时。然后使用具有30 000MWCO的500μL Vivaspin(来自Sartorius的Vivaspin 500，VS0122)将复合物从4mg/mL浓缩至17.3mg/mL的最终浓度。在A280下在Nanodrop上使用消光系数174,375和106.242kDa的Mw测量浓度。
使用Mosquito液体处理机器人在Swiss CI XTAL SD-3 3孔板中设置结晶实验，所述板具有35μL储藏溶液和150+50、100+100、50+150nL蛋白质+储藏溶液的液滴。来自Molecular Dimensions的筛选Morpheus在条件B9和B10下在20度下得到晶体。棒状形态的晶体在前12小时出现并在接下来的24小时内生长得更大。在快速转移至含有另外10％甘油的储藏溶液后，通过投入液氮将其低温冷却。在MaxIV的Biomax光束线收集数据。以1f6w.pdb(hBSSL)和4n0y.pdb(Fab片段)作为检索模型，在Phaser中通过分子置换将自动处理的数据文件用于结构解析。水分子与BSSL的C端部分一样被去除，并且对于4n0y.pdb，仅保留制成聚丙氨酸模型的Fab链。在Coot中进行手动模型构建，并使用Refmac5(所有CCP4套装)对模型进行改进。
结果
AS20 Fab t-hBSSL的结晶和结构测定
AS20 Fab片段可以在Morpheus条件B9中与t-hBSSL一起结晶，所述条件B9含有30mM NaBr、30mM NaFl、30mM NaI、0.1M Tris(碱)、0.1M Bicine(用这两种缓冲液将缓冲液设定为pH8.5)、20％PEG550 MME和10％PEG 20K。晶体属于晶胞尺寸为323、67、123、90、101.7、90且衍射为
Figure BDA0003464862550001321
的空间群C2。通过分子置换解析结构，并且在不对称单元中存在两个完整的复合物。两个拷贝周围的晶体堆积是不同的，导致t-hBSSL结构的小变化。特别地，包括6-His标签的最后残基在分子A中可见，但在分子B中不可见，因为B在此区域中具有较少的晶体接触和更多的C端柔性空间。残基272和283之间的区域在B中也是高度无序的并且不能建模。除了这些差异之外，两个t-hBSSL模型非常好地重叠。
AS20 Fab与t-hBSSL的相互作用界面的分析
BSSL结构已经被描述为具有大的核心区域，所述核心区域由被α螺旋和连接环包围的扭曲的11链β折叠组成[9]。在N端有较小的3链β折叠。所述结构被比作左手烘箱手套，手掌包含靠近“拇指”的活性部位三元组。类似地，小的N端β折叠位于靠近“小指”的手背上，参见图12。与Fab分子相互作用的BSSL结构的部分位于小的N端β折叠和αC[17]的C端部分，αC[17]是所述结构中的第三个α螺旋。换句话说，抗体的结合区不靠近活性位点，而是在抗原的相对侧。图13显示了AS20的可变链如何与t-hBSSL结合，其中表位序列以浅灰色突出显示。
表位区列于表25中，并包含残基7-12(链1和2，SEQ ID NO:1)、42-55(引入折叠中链3的环区，SEQ ID NO:2的一部分)和174-180(αC的C端，SEQ ID NO:5)。表位相当平坦，仅有少数特征性残基突出，即Tyr7、Phe12和Gln52(表245中所列的主要相互作用)。47-54的环区被很好地限定并形成均匀的表面。脯氨酸47对于与Fab的Tyr31的堆积相互作用是重要的，但总的来说，这里的表面是平坦的。表位序列内的许多残基对于BSSL折叠是重要的，但不以特异性方式与AS20相互作用。
表25-涉及BSSL和Fab AS20之间相互作用的BSSL残基的列表，在顶行中排序为最重要的相互作用。也列出了对于表位区域中BSSL折叠重要的BSSL残基。
Figure BDA0003464862550001331
结论
本实施例描述了AS20 Fab和t-hBSSL的结晶和结构解析。结构显示表位区位于与先前实施例13所述通过HDX-MS鉴定的相同区域。它是三维表位，由小的β折叠，引入折叠的链3的有序环区和相邻螺旋的C端部分组成。表位的序列是7-12(YTEGGF，SEQ ID NO:1)、42-55(LENPQPHPGWQGTL，SEQ ID NO:2)和174-180(VKRNIAA，SEQ ID NO:5)；按顺序分布但在结构中靠在一起。最明确的残基是从表面突出的Tyr7、Phe12和Gln52。
在AS20 Fab t-hBSSL结构的上下文中分析了5种预先命名的抗体的序列。序列差异(主要是保守的)和来自HDX-MS作图(实施例14)的结果表明所有5种抗体将结合BSSL上的相同表位。
实施例22-S-SL048-116 Fab-BSSL复合物的复合物形成、结晶、结构测定和表位分析
材料和方法
S-SL048-116用FabRICATOR裂解
将PBS中的S-SL048-116抗体(重链SEQ ID NO:125和轻链SEQ ID NO:126)裂解，并使用FragIT试剂盒(Genovis)按照制造商的说明书纯化F(ab’)2。
F(ab’)2片段的还原和Fab’片段的纯化
纯化的F(ab’)2片段的大规模还原是在室温下使用最终浓度为50mM的半胱胺在含有5mM EDTA的PBS pH7.2中进行2小时。在HiLoad 26/60Superdex 200制备级(GEHealthcare)上纯化五分之四的所得样品，用PBS pH 7.2，2mM EDTA作为流动相。将来自目的峰的级分合并，浓缩并且储存在-80℃下用于下游应用。总产量为7.2mg。
Fab'片段的烷基化和随后的纯化
将剩余五分之一的还原样品用等体积的375mM碘乙酰胺在室温下处理30分钟以通过烷基化阻断游离半胱氨酸。将得到的烷基化样品与未烷基化样品完全一样纯化。总产量为2mg。
BSSL的表达和纯化
用于表达的P2病毒原液获自SciLifeLab(Stockholm,Sweden)。ExpiSf9昆虫细胞系用于ExpiSf CD培养基。使用ExpiSf蛋白表达试剂盒(ThermoFisher Scientific)根据制造商的建议使用SciLife Lab推荐的病毒负载进行表达。
用不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂(Merck Millipore)、NiSO4和咪唑(最终浓度15mM)补充来自2L表达的培养上清液。通过以13000×g离心除去任何颗粒。将上清液在4℃下以2ml/min的流速加载到5ml HisTrap Excel柱(GE Healthcare)上过夜。用含有15mM咪唑的6倍柱体积(CV)IMAC缓冲液A(50mM Tris-HCl，500mM NaCl；pH 7.5)洗涤柱。再次用含有25mM咪唑的10CV的IMAC缓冲液A洗涤柱。用20CV线性梯度至100％IMAC缓冲液B(50mMTris-HCl，500mM NaCl，0.5M咪唑，pH 7.5)洗脱结合的蛋白质。将洗脱的蛋白质浓缩，离心并在用SEC缓冲液(50mM HEPES，500mM NaCl，2mM EDTA；pH 7)预平衡的HiLoad 26/600Superdex 200制备级凝胶过滤柱(GE Healthcare)上运行。将来自目的峰(1E6-1F8)的级分合并并浓缩。总产量为6.2mg，样品纯度为约85％。
BSSL：Fab’复合物形成和纯化
在复合物产生之前，通过在HiLoad 26/600Superdex 200制备级柱上进行SEC评价BSSL以确定不存在浓缩/储存诱导的寡聚化。将复合物以1:1.3BSSL：Fab’的摩尔比混合，并在冰上孵育1小时。使用与BSSL相同的缓冲液在相同的SEC柱上运行孵育的复合物。合并目的级分(B3-C4)并将缓冲液更换为50mM HEPES，250mM NaCl，2mM EDTA；pH 7。将缓冲液更换的样品浓缩至17mg/ml，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下以备结晶。根据SDS-PAGE分析估计，样品的纯度为>90％。
BSSL：Alk-Fab’复合物的形成和纯化
将复合物以1.1:1BSSL:Alk-Fab’的摩尔比混合，并在冰上孵育1小时。使用与BSSL:Fab’复合物相同的缓冲液在相同的SEC柱上运行孵育的复合物。合并目的级分并将缓冲液更换为50mM HEPES，250mM NaCl，2mM EDTA；pH 7。将缓冲液更换的样品浓缩至14.5mg/ml，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下以备结晶。
Fab-BSSL复合物的结晶和冷冻
使最佳衍射晶体在20℃下从14.5mg/ml Fab-BSSL复合物在缓冲液(50mM HEPES，250mM NaCl，2mM EDTA，pH 7.0)中生长，并如下与储藏溶液(16％(w/v)PEG 4000，0.1M柠檬酸钠pH 5和6％(v/v)乙醇)和晶种溶液混合：
150nl复合物+37nl晶种(在0.1M柠檬酸钠pH5.0，20％(w/v)PEG4000和0.2M硫酸铵中的粉碎晶体)+113nl储藏溶液
将静置的液滴移吸到具有40μl储藏溶液的MRC板上。晶体在几天内出现并在含有20％(v/v)甘油，16％(w/v)PEG4000，0.1M柠檬酸钠pH5.0和3％(v/v)乙醇的冷冻溶液中冷冻。
数据收集
在100K下在配备有Eiger 16M混合像素检测器的BioMAX站,MAX IV,Lund,
Figure BDA0003464862550001361
收集数据集。使用0.011s的曝光时间和0.1°/图像的振荡收集数据集，总共收集360°。使用autoPROC流水线将数据处理为空间群P21中的
Figure BDA0003464862550001362
结果
结构确定
通过使用Phaser软件用人胆汁盐活化的脂肪酶BSSL的催化结构域的
Figure BDA0003464862550001363
结构(来自PDB:1F6W)和同源
Figure BDA0003464862550001364
Fab结构(来自PDB:3NFP)作为模板的分子置换确定Fab-BSSL结构。在不对称单元中发现了一种复合物。结构在Refmac5中改进，随后在Buster中改进，并在Coot中进行建模。最终模型包括具有BSSL的三条蛋白链(链A)和S-SL048-116 Fab的重链(H)和轻链(L)(图22)。最终模型包括链A中的氨基酸1-531，除了在电子密度中未看到的柔性环(氨基酸117-123)。所述模型包括链H中的氨基酸1-227和链L中的氨基酸1-211。链H中的第一个氨基酸Gln1已被建模为PCA，焦谷氨酸以最佳地拟合电子密度。在链H中，两个游离半胱氨酸(Cys133和Cys225)已被建模为非烷基化半胱氨酸，尽管S-SL048-116 Fab的烷基化处理对于结晶是必需的。不存在额外的密度以拟合推测与半胱氨酸的硫原子连接的甲基酰胺基团。可能半胱氨酸残基被至少部分烷基化，但是连接的原子是如此柔韧以至于在电子密度图中不能清楚地看到它们。另外，建模了87个水分子。
表位分析
使用Fab-BSSL复合物的坐标进行表位分析。使用CCP4程序套件中的CONTACT软件进行分析。S-SL048-116-Fab通过重链和轻链与BSSL结合。在重链中涉及所有三个CDR环(CDR1、CDR2和CDR3)，而在轻链中仅有CDR1和CDR3与BSSL接触(图23，表26)。靠近轻链的N端的Ile 2也与BSSL发生疏水性范德华相互作用。氢键网络稳定了使用PISA(QT)分析计算的重链和BSSL(总共7个氢键)以及BSSL和轻链(总共5个氢键)之间的相互作用。PISA(QT)分析表明，
Figure BDA0003464862550001371
的溶剂可及区域包埋在BSSL和重链之间的界面中，并且
Figure BDA0003464862550001372
包埋在BSSL和轻链之间的界面中。
表26-S-SL048-116-Fab和BSSL之间
Figure BDA0003464862550001373
之间的所有相互作用残基的总结
Figure BDA0003464862550001374
Figure BDA0003464862550001381
结论
本实施例中获得的S-SCL048-116的结果与从实施例14中HDX-MS研究获得的结果一致。
实施例23-S-SL048-116在类风湿性关节炎小鼠模型中的功效验证
在此实施例中，在类风湿性关节炎(RA)，即胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)的体内小鼠模型中研究S-SL048-116(重链SEQ ID NO:125和轻链SEQ ID NO:126)的作用。CAIA模型描述于实施例18中。本研究获得了瑞典马尔默/隆德当地动物伦理委员会(02896-20)的批准。
材料和方法
疾病诱导
在第0天给DBA/1小鼠(雄性，8周)静脉内注射2mg/小鼠的单克隆抗CII抗体混合物(CIA-MAB-50，MD Bioproducts)。第5天，用LPS(50μg/小鼠)腹膜内注射小鼠，以加重疾病。
实验组和测试项目的施用
S-SL048-116以5mg/ml的浓度递送，并进一步在媒介物(25mM组氨酸，150mM NaCl，0.02％P80，pH6.0)中稀释。腹膜内施用测试项目(抗体和媒介物)，在疾病诱导前一天(第-1天)开始每4天施用，然后在第3、7、11和15天施用。基于第-2天动物的平均体重，S-SL048-116以三种不同剂量施用，即10、30和90mg/kg。选择相对高的剂量以补偿与人BSSL(KD＝0.5nM)相比S-SL048-116对小鼠BSSL的低亲和力(KD＝40nM)，如实施例11所述。实验组概述于表27中。第-1天的第一次施用是推注剂量，即，测试项目作为分成两次注射的双剂量给予，第一次注射在早晨给予，第二次注射在下午给予。以下施用(第3、7、11和15天)作为单剂量给予。在每次施用前对动物称重，并且剂量体积20ml/kg基于动物的个体重量。
表27-实验组
Figure BDA0003464862550001391
疾病评价
从第3天每天以盲法方式使用0至15范围内的四肢宏观评分系统评价疾病(每个肿胀或红色脚趾为1分，肿胀或红色中足指或指节为1分，肿胀脚踝为5分)，导致每个小鼠的最大总分为60。由于伦理限制，从实验中去除评分超过45的动物。
结果
关节炎严重程度
CAIA诱导的和媒介物处理的动物发展中度至重度疾病，发病率为100％。从第-1天到终止每4天腹膜内给药的S-SL048-116(SOL-116)的功效以三种剂量(10、30和90mg/kg)进行评估。与媒介物相比，以90mg/kg给药S-SL048-116显示出对疾病严重程度的改善作用(图24和25)。
出于伦理原因(高分)，在终止前取出两只动物，一只在媒介物组中(第15天)，一只在90mg/kg组中(第12天)。将这些动物包括在最大评分中，但不包括平均值、AUC和％抑制(图25，表28)。媒介物组中的一只小鼠没有从LPS增强中恢复，即体温过低、具有后凸姿势和非常低的体重。在疾病发作之前(第7天)取出此小鼠，因此将其从所有结果中排除。
疾病参数统计概述于表28中。
表28-CAIA严重程度参数统计
Figure BDA0003464862550001401
1累积发病率。如果在连续2个评分日的评分为1分或更高，则认为小鼠已发生疾病。2所有评分时间点的平均CAIA评分。3曲线下面积。4相对于媒介物对照治疗组，每个动物的总体疾病负荷的变化百分比。通过测定媒介物对照组平均AUC和每个个体动物的AUC之间的差异，除以媒介物对照组AUC并乘以100*(-1)来计算。
健康评估
从第3天到终止，每天进行一般健康评估并结合疾病评估。将小鼠每周称重两次，作为一般健康评估的一部分。在动物中没有观察到治疗的副作用。
结论
CAIA诱导的媒介物处理的小鼠发展中度至重度疾病，发病率为100％。评估了S-SL048-116在三个不同剂量下的功效，即10、30和90mg/kg腹膜内剂量，从第-1天开始治疗。与媒介物相比，使用90mg/kg剂量的S-SL048-116观察到对疾病严重程度有改善作用。用S-SL048-116或仅用媒介物治疗没有观察到有害作用。
实施例24-比较BSSL敲除(KO)和野生型(WT)小鼠的血液、脾和肠系膜淋巴结中的细胞结构分析
在本实施例中，通过荧光激活细胞分选(FACS)研究从BSSL缺陷敲除(KO)小鼠和野生型同窝小鼠收集的血液、脾和肠系膜淋巴结(MLN)中不同白细胞子集的数量。
材料和方法
从10只BSSL KO小鼠和10只野生型同窝小鼠(15-19周)的血液、脾和MLN中分离白细胞用于分析。在Burcher室中使用手动计数测定脾和MLN中的总白细胞计数。将从血液、脾和MLN分离的细胞与FC-Block(CD16/C032克隆2.4G2)一起孵育，随后与两种不同的抗体混合物，染色A和染色B一起孵育。
染色A
用于染色A的抗体/克隆/荧光染料为：CD19(ID3/BB515}、γδTCR(GL3/PE)、CD8a(53-6.7/PerCP-Cy5.5)、CD45.2(104/PE-Cy7)、NK1.1(PK136/APC)、CD4(GK1.5/APC-H7)、TCRβ(H57-597/BV421)和可固定的活力染料(FVD)(Horizon 510)。
通过染色A鉴定的细胞群体为：
αβT细胞：CD45.2+、TCRβ+
CD4αβT细胞：CD45.2+、TCRβ+、CD4+
CD8αβT细胞：CD45.2+、TCRβ+、CD8+
γδT细胞：CD45.2+、TCRγδ+
NKT细胞：CD45.2+、TCRβ+、NK1.1+
B细胞：CD45.2+、CD19+
NK细胞：CD45.2+、TCRβ-、TCRγδ-、NK1.1+
染色B
用于染色B的抗体/克隆/荧光染料为：MHCII(MS/114.15.2/Alexa488)、FcεRlα(MAR-1/PE)、SiglecF(E50-2440/PE-CF594)、Ly6G(1A8/PerCP-Cy5.5)、CD45.2(104/PE-Cy7)、Ly6C(AL-21/APC)、CD11b(M1/70/APC-Cy7)、CD117(2B8/BV421)和可固定的活力染料(FVD)(Horizon 510)。
通过染色B鉴定的细胞群体为：
骨髓细胞：CD45.2+、CD11b+
中性粒细胞：CD45.2+、CD11b+、Ly6G+
嗜酸性粒细胞：CD45.2+、CD11b+、Ly6G-、Siglec F+、SSC高
单核细胞：CD45.2+、CD11b+、Ly6G-、Siglec F-、SSC低、Ly6C+、MHCII-
巨噬细胞：CD45.2+、CD11b+、Ly6G-、Siglec F-、SSC低、Ly6C-、MHCII+
肥大细胞：CD45.2+、CD11b+、FcεRlα+、CD117+
嗜碱性粒细胞：CD45.2+、CD11b+、FcεRlα+、CD117-
孵育(冰上20分钟)后，洗涤细胞，重悬于FACS缓冲液中，并通过FACS鉴定不同的细胞子集。
结果
脾和MLN中的白细胞总数
发现KO小鼠脾中的白细胞数量显著减少至WT小鼠的约50％。在KO和WT小鼠之间MLN中没有观察到白细胞数量的显著差异(图26)。
αβT细胞
发现与WT小鼠相比，KO小鼠脾中αβT细胞的总数减少。所述减少与对总CD45+白细胞观察到的类似。在MLN中没有观察到αβT细胞数量的显著差异。发现在KO脾和血液中αβT细胞占总CD45+细胞的百分比高于WT小鼠，但在MLN中没有观察到差异。在脾中，KO小鼠的CD4+/CD8+比率高于WT小鼠。
γδT细胞
发现与WT小鼠相比，KO小鼠脾中γδT细胞的总数减少。所述减少与对总CD45+白细胞观察到的类似。在MLN中，这种减少甚至比在脾中更明显。也发现在KO小鼠中MLN中γδT细胞占CD45+细胞的比例低于WT小鼠。在脾和血液中没有观察到这种差异。
NKT细胞
发现与WT小鼠相比，KO小鼠脾中NKT细胞的总数减少。所述减少与对总CD45+白细胞观察到的类似。在MLN中没有观察到NKT细胞数量的显著差异。发现在KO小鼠血液中NKT细胞占CD45+细胞的比例低于WT小鼠。在脾和MLN中没有观察到这种差异。
B细胞
发现与WT小鼠相比，KO小鼠脾中B细胞的总数减少。所述减少与对总CD45+白细胞观察到的类似。在MLN中没有观察到B细胞数量的显著差异。发现在KO小鼠脾和血液中B细胞占CD45+细胞的比例低于WT小鼠。在MLN中没有观察到这种差异。
NK细胞
发现与WT小鼠相比，KO小鼠脾中NK细胞的总数减少。发现NK细胞的减少比对总CD45+白细胞和其他淋巴子集观察到的更明显。在MLN中没有观察到NK细胞数量的显著差异。发现在KO小鼠脾和血液中NK细胞占CD45+细胞的比例低于WT小鼠。在MLN中没有观察到这种差异(图27)。
骨髓细胞
与WT小鼠相比，KO小鼠脾和MLN中骨髓细胞的总数减少。发现在KO小鼠脾和MLN中骨髓细胞占CD45+细胞的比例低于WT小鼠。在血液中没有观察到这种差异。
中性粒细胞
KO和WT小鼠相比，在脾或MLN中未观察到中性粒细胞数量的显著差异。KO小鼠血液中中性粒细胞的比例较高，但脾和MLN中没有显著差异。
嗜酸性粒细胞
KO和WT小鼠相比，在脾或MLN中未观察到嗜酸性粒细胞数量的显著差异。发现KO血液中嗜酸性粒细胞的比例较高，但脾和MLN中没有显著差异。
单核细胞
与WT小鼠相比，发现在KO小鼠脾或MLN中单核细胞总数更低。在所研究的任何器官中，在KO和WT小鼠之间没有观察到单核细胞比例的显著差异。
巨噬细胞
与WT小鼠相比，发现在KO小鼠脾或MLN中巨噬细胞总数更低。在所研究的任何器官中，在KO和WT小鼠之间没有观察到巨噬细胞比例的显著差异。
肥大细胞
在KO和WT小鼠之间没有观察到脾和MLN中肥大细胞数量的显著差异。与WT小鼠相比，KO小鼠脾中肥大细胞的比例更高。在血液或MLN中没有观察到差异。
嗜碱性粒细胞
与WT小鼠相比，发现KO小鼠脾中的嗜碱性粒细胞总数更低。在MLN中未观察到嗜碱性粒细胞数量的差异。与WT小鼠相比，KO小鼠血液中嗜碱性粒细胞的比例更高。在脾或MLN中没有观察到这种差异。
结论
除了对CD45+白细胞的总体作用外，数据表明对NK细胞的额外特异性作用，即与野生型同窝小鼠相比，天然BSSL缺陷小鼠的血液和脾中CD45+细胞中NK细胞的总数和比例均较低。这些数据支持以下发现：用AS20 hIgG1 LALA-PG(90mg/kg剂量)治疗显著减少了CAIA小鼠脾中CD45+细胞中NK细胞的总数以及T细胞、NKT细胞和NK细胞的比例(实施例19)。
表29-本文中使用的序列和SEQ ID NO:的列表
Figure BDA0003464862550001461
Figure BDA0003464862550001471
Figure BDA0003464862550001481
Figure BDA0003464862550001491
Figure BDA0003464862550001501
Figure BDA0003464862550001511
Figure BDA0003464862550001521
Figure BDA0003464862550001531
Figure BDA0003464862550001541
Figure BDA0003464862550001551
Figure BDA0003464862550001561
Figure BDA0003464862550001571
Figure BDA0003464862550001581
Figure BDA0003464862550001591
Figure BDA0003464862550001601
Figure BDA0003464862550001611
Figure BDA0003464862550001621
Figure BDA0003464862550001631
Figure BDA0003464862550001641
Figure BDA0003464862550001651
Figure BDA0003464862550001661
Figure BDA0003464862550001671
Figure BDA0003464862550001681
Figure BDA0003464862550001691
Figure BDA0003464862550001701
Figure BDA0003464862550001711
Figure BDA0003464862550001721
Figure BDA0003464862550001731
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<210> 1
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Tyr Thr Glu Gly Gly Phe
1 5
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro
1 5 10 15
Val Met
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Val Lys Arg Asn Ile Ala Ala
1 5
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe
1 5 10
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR2
<400> 8
Ile Asn Pro Gly Asp Gly Ala Thr
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR3
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<212> PRT
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Pro Ser Ile Ser Tyr
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<220>
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His Gln Arg Ser Ser Ser Pro Thr
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的 HCDR2
<400> 12
Met Gly Val Ile Asn Pro Gly Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Gln Lys
1 5 10 15
Phe Lys
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala Ala
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的LCDR1
<400> 14
Arg Ala Ser Pro Ser Ile Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的LCDR2
<400> 15
Ala Thr Ser Ser Leu Ala
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的LCDR1
<400> 16
Ser Ala Ser Pro Ser Ile Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的LCDR2
<400> 17
Ala Thr Ser Ser Leu Pro
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR2
<400> 18
Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ala Thr
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR2
<400> 19
Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR1
<400> 20
Ser Ser Ile Ser Tyr
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3
<400> 21
His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Thr
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3
<400> 22
His Gln Arg Ser Ser Thr Pro Thr
1 5
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的HCDR2
<400> 23
Met Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Gln Lys
1 5 10 15
Phe Lys
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的HCDR2
<400> 24
Met Gly Val Ile Asn Pro Gly Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys
1 5 10 15
Phe Gln
<210> 25
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的HCDR2
<400> 25
Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys
1 5 10 15
Phe Gln
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的LCDR1
<400> 26
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的LCDR1
<400> 27
Arg Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的LCDR2
<400> 28
Ala Thr Ser Lys Leu Pro
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的LCDR2
<400> 29
Ala Ala Ser Ser Leu Ala
1 5
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HVCR
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LVCR
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Pro Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HVCR
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCVR
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Ser Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HVCR
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCVR
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Lys Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Thr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HVCR
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCVR
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Ser Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCVR
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Pro Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Ser Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Ser Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZH1
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZH2
<400> 40
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
1 5 10
<210> 41
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZH3
<400> 41
Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met
1 5 10 15
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZH4
<400> 42
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 43
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZL1
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZL2
<400> 44
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 45
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZL3
<400> 45
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
1 5 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
20 25 30
Cys
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZL4
<400> 46
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 47
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Asp Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Asp Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 55
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ala Thr Ser Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180 185 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195 200 205
Arg Gly Glu Cys
210
<210> 131
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hIgG4 S228P HC
<400> 131
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
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165 170 175
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195 200 205
Arg Gly Glu Cys
210
<210> 133
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hIgG4 S228P HC
<400> 133
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Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
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165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
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Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG HC
<400> 135
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys
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130 135
<210> 136
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG LC
<400> 136
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Leu Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Val
20 25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
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Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg
100 105 110
Ser Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 137
<211> 579
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 137
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1 5 10 15
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20 25 30
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65 70 75 80
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115 120 125
Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130 135 140
Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly
145 150 155 160
Asn Phe Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
165 170 175
Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asp Asn Ile Thr Ile Phe Gly
180 185 190
Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr
195 200 205
Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Met Ala Leu
210 215 220
Ser Pro Trp Ala Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ala Lys Lys Val Gly Cys Pro Thr Glu Asp Thr Gly Lys Met Ala Ala
245 250 255
Cys Leu Lys Ile Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Leu
260 265 270
Pro Val Lys Lys Gln Glu Tyr Pro Val Val His Tyr Leu Ala Phe Ile
275 280 285
Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Asp Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290 295 300
Asn Asn Thr Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Ile Asn Asn Met Asp
305 310 315 320
Gly His Leu Phe Ala Thr Ile Asp Val Pro Ala Val Asp Lys Thr Lys
325 330 335
Gln Thr Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Arg Leu Val Ser Gly His Thr
340 345 350
Val Ala Lys Gly Leu Lys Gly Ala Gln Ala Thr Phe Asp Ile Tyr Thr
355 360 365
Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Met Lys Lys Thr Val
370 375 380
Val Ala Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Ile Pro Thr Glu Ile Ala
385 390 395 400
Leu Ala Gln His Lys Ala His Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ser Tyr
405 410 415
Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Ile Tyr Pro Lys Trp Met Gly
420 425 430
Ala Asp His Ala Asp Asp Leu Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala
435 440 445
Thr Pro Leu Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Ala Val Ser Lys Ala Met
450 455 460
Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Arg Ser Gly Asp Pro Asn Met Gly
465 470 475 480
Asn Ser Pro Val Pro Thr His Trp Tyr Pro Tyr Thr Leu Glu Asn Gly
485 490 495
Asn Tyr Leu Asp Ile Thr Lys Thr Ile Thr Ser Ala Ser Met Lys Glu
500 505 510
His Leu Arg Glu Lys Phe Leu Lys Phe Trp Ala Val Thr Phe Glu Val
515 520 525
Leu Pro Thr Val Thr Gly Asp Gln Asp Thr Leu Thr Pro Pro Glu Asp
530 535 540
Asp Ser Glu Val Ala Pro Asp Pro Pro Ser Asp Asp Ser Gln Val Val
545 550 555 560
Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Val Glu Ala Gln Met Pro Ala Thr
565 570 575
Ile Gly Phe
<210> 138
<211> 722
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 138
Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val
1 5 10 15
Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
20 25 30
Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His
35 40 45
Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50 55 60
Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly
100 105 110
Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
115 120 125
Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130 135 140
Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly
145 150 155 160
Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
165 170 175
Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly
180 185 190
Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr
195 200 205
Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu
210 215 220
Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val
225 230 235 240
Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln
245 250 255
Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val
260 265 270
Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val
275 280 285
Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290 295 300
Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp
305 310 315 320
Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn
325 330 335
Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr
340 345 350
Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr
355 360 365
Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val
370 375 380
Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala
385 390 395 400
Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
405 410 415
Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly
420 425 430
Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala
435 440 445
Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met
450 455 460
Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly
465 470 475 480
Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
485 490 495
Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
500 505 510
Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
515 520 525
Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly
530 535 540
Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala
545 550 555 560
Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr
565 570 575
Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
580 585 590
Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro
595 600 605
Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly
610 615 620
Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro
625 630 635 640
Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
645 650 655
Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
660 665 670
Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
675 680 685
Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro
690 695 700
Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile
705 710 715 720
Arg Phe
<210> 139
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4 HC
<400> 139
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 140
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4 LC
<400> 140
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Val Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180 185 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195 200 205
Arg Gly Glu Cys
210
<210> 141
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的HCDR2
<400> 141
Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys
1 5 10 15
Phe Lys
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的LCDR1
<400> 142
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 143
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 延伸的LCDR2
<400> 143
Asp Thr Ser Lys Leu Ala
1 5
<210> 144
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCVR
<400> 144
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 145
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCVR
<400> 145
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 146
<211> 537
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> t-hBSSL
<400> 146
Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val
1 5 10 15
Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
20 25 30
Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His
35 40 45
Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50 55 60
Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly
100 105 110
Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
115 120 125
Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130 135 140
Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly
145 150 155 160
Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
165 170 175
Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly
180 185 190
Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr
195 200 205
Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu
210 215 220
Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val
225 230 235 240
Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln
245 250 255
Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val
260 265 270
Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val
275 280 285
Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290 295 300
Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp
305 310 315 320
Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn
325 330 335
Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr
340 345 350
Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr
355 360 365
Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val
370 375 380
Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala
385 390 395 400
Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
405 410 415
Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly
420 425 430
Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala
435 440 445
Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met
450 455 460
Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly
465 470 475 480
Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
485 490 495
Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
500 505 510
Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
515 520 525
Leu Pro Ala His His His His His His
530 535
<210> 147
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 147
Tyr Thr Glu Gly Gly
1 5
<210> 148
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 148
Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr
1 5
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 149
Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly
1 5 10
<210> 150
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 150
Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val
1 5 10 15
Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp
20 25
<210> 151
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 151
Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val
1 5 10 15
Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser
20 25
<210> 152
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 152
Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val
1 5 10 15
Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp
20 25
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> iTope残基
<400> 153
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met
1 5
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> iTope残基
<400> 154
Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala
1 5
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> iTope残基
<400> 155
Tyr Ala Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val
1 5
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> iTope残基
<400> 156
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> iTope残基
<400> 157
Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser
1 5
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> iTope残基
<400> 158
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser
1 5
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> iTope残基
<400> 159
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser
1 5
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> iTope残基
<400> 160
Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Lys Leu
1 5
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> iTope残基
<400> 161
Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> iTope残基
<400> 162
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> iTope残基
<400> 163
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
1 5
<210> 164
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 164
gatacacctt caccagctac watatgcact gggtgcg 37
<210> 165
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 165
Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr Gly
1 5 10 15
Gly Ala Thr Arg Gly Gly Ala Arg Thr Ala Ala Thr Cys Trp Ala Cys
20 25 30
Cys Cys Thr Arg Gly Thr Arg Arg Thr Gly Gly Thr Lys Met Cys Ala
35 40 45
Cys Ala Ala Gly Cys Thr Ala Cys Arg Met Thr Cys Ala Gly Ala Ala
50 55 60
Gly Thr Thr Cys Met Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys
65 70 75 80
Ala Cys Cys
<210> 166
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 166
cgtcaccatc acctgcagkg caagtymgag cattagctat wtgmattggt atcagcagaa 60
ac 62
<210> 167
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 167
cctaagctcc tgatctatgm trcatccars ttgsmaagtg gggtcccatc ac 52
<210> 168
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 168
gattttgcaa cttattactg tcascagagk tmtagtwmty hcacttttgg ccagggg 57
<210> 169
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HVCR部分2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=I或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=N或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=A或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X=A或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=K或Q
<400> 169
Xaa Gly Val Ile Xaa Pro Gly Asp Gly Xaa Thr Ser Tyr Xaa Gln Lys
1 5 10 15
Phe Xaa
<210> 170
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LVCR部分1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=S或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X=S或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=M或L
<400> 170
Xaa Ala Ser Xaa Ser Ile Ser Tyr Xaa Asn
1 5 10
<210> 171
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LVCR部分2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=A或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X=K或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=A或 P
<400> 171
Ala Xaa Ser Xaa Leu Xaa
1 5
<210> 172
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LVCR部分 3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=S、T或Y
<400> 172
His Gln Arg Ser Ser Xaa Pro Thr
1 5
<210> 173
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 173
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Thr
1 5
<210> 174
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 174
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctacaata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagta atctaccctg gtgatggtgc cacaagctac 180
gctcagaagt tcaagggccg cgtcaccatg acccgcgaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgcg ctctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagattac 300
tacggtagta gcccccttgg ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 175
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 175
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60
atcacctgca gtgcaagtcc gagcattagc tatatgaatt ggtatcagca gaaaccaggg 120
aaagccccta agctcctgat ctatgctaca tccagcttgg caagtggggt cccatcacgt 180
ttcagtggca gtggaagcgg gacagatttc actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa 240
gattttgcaa cttattactg tcaccagagg tctagttatc ccacttttgg ccaggggacc 300
aagctggaga tcaaa 315
<210> 176
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 176
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctacaata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagta atcaaccctg gtgatggtgc cacaagctac 180
aatcagaagt tccagggccg cgtcaccatg acccgcgaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgcg ctctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagattac 300
tacggtagta gcccccttgg ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 177
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 177
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60
atcacctgca gggcaagttc gagcattagc tatttgaatt ggtatcagca gaaaccaggg 120
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ttcagtggca gtggaagcgg gacagatttc actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa 240
gattttgcaa cttattactg tcaccagagg tctagttctc ccacttttgg ccaggggacc 300
aagctggaga tcaaa 315
<210> 178
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
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caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60
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<210> 180
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
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caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
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<223> LC
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 183
caagttcagc tgcagcagcc cggtgccgag ctggtgaaac ccggtgcctc tgtgaagatg 60
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tcgctgagcc tcggaaag 1338
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<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 184
cagatcgtgc tgacccagag ccccgctgtg atgagcgcct ctcccggtga gaaggtgacc 60
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<210> 185
<211> 1340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 185
ctcaagttca gctcgtgcag agcggtgctg aagtgaagaa gcccggtgcc tctgtgaagg 60
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tgtcgctgag cctcggaaag 1340
<210> 186
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 186
gacatccaga tgacccagag ccctagctct ttaagcgcct ctgtgggcga tcgtgtgacc 60
atcacttgta gcgccagccc cagcatcagc tacatgaact ggtaccagca gaagcccggc 120
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<210> 187
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 187
caagttcagc tcgtgcagag cggtgctgaa gtgaagaagc ccggtgcctc tgtgaaggtg 60
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<210> 188
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 188
gacatccaga tgacccagag ccctagctct ttaagcgcct ctgtgggcga tcgtgtgacc 60
atcacttgtc gtgccagcag cagcatcagc tatttaaact ggtaccagca gaagcccggc 120
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tccccggtga ccaaatcctt caatagaggc gaatgc 636
<210> 189
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 189
caagttcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaaaaagc ccggtgcctc tgtgaaggtg 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
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<210> 191
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<220>
<223> HC
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gtggtcgtgg acgtgtcgca ggaagatccg gaggtccagt tcaattggta cgtggatggg 840
gtggaggtcc acaacgccaa gacgaagccg agagaagaac agttcaactc aacttaccgg 900
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
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gaacagctta agtccggcac ggcgtctgtg gtctgcctgc tcaataactt ttaccctagg 420
gaagctaaag tccaatggaa agtggataac gccctgcagt caggaaacag ccaggaatcg 480
gttaccgaac aggacagcaa ggacagcact tactccttgt cgtcgactct tactctgagc 540
aaggccgatt acgagaagca caaggtctac gcctgcgagg tcacccatca gggactctcg 600
tccccggtga ccaaatcctt caatagaggc gaatgc 636
<210> 193
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 193
gacatccaga tgacccagag ccctagctct ttaagcgcct ctgtgggcga tcgtgtgacc 60
atcacttgta gcgccagccc cagcatcagc tacatgaact ggtaccagca gaagcccggc 120
aaggccccca agctgctgat ctacgccaca agctctttac ccagcggcgt gcctagcaga 180
ttcagcggca gcggaagcgg caccgacttc actttaacca tcagctcttt acagccagaa 240
gacttcgcca cctactactg ccaccagaga agcagcagcc ccaccttcgg ccaaggtaca 300
aagctcgaga tcaagagaac tgtggccgcg ccgtcagtgt ttatcttccc tccatcggat 360
gaacagctta agtccggcac ggcgtctgtg gtctgcctgc tcaataactt ttaccctagg 420
gaagctaaag tccaatggaa agtggataac gccctgcagt caggaaacag ccaggaatcg 480
gttaccgaac aggacagcaa ggacagcact tactccttgt cgtcgactct tactctgagc 540
aaggccgatt acgagaagca caaggtctac gcctgcgagg tcacccatca gggactctcg 600
tccccggtga ccaaatcctt caatagaggc gaatgc 636
<210> 194
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 194
caagttcagc tggtgcagag cggtgctgag gtgaaaaaac ccggtgcttc cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacaaca tgcactgggt gagacaagcc 120
cccggtcaag gtttagagtg gatcggcgtg atctaccccg gcaacggcga cacctcttac 180
aaccagaagt tcaagggtcg tgtgaccatg actcgtgaca cctccaccag caccgtgtac 240
atggagctga gctctttaag gagcgaggac acagccgtgt actactgcgc tcgtgactac 300
tacggcagca gccctctggg ctattggggc caaggtactt tagtgaccgt ctcgagcgcc 360
tcaaccaaag gaccctccgt gtttcccctc gccccctgtt cccgctccac atccgagtca 420
accgcggcgc tgggctgcct cgtgaaggac tacttccctg agcccgtcac tgtgtcgtgg 480
aactccgggg ccctgacctc cggcgtgcac accttccctg ccgtgcttca atcctccgga 540
ctgtactccc tgtcctcggt ggtcaccgtg ccgtcgagct cgttgggaac caagacttac 600
acttgcaacg tggaccacaa gccaagcaac accaaagtgg acaagagagt cgaatctaag 660
tacggaccgc cctgcccgcc ttgccccgcc cctgagtttc tcggcggtcc tagcgtgttc 720
ctgttcccac ccaagcccaa ggacactctg atgatctccc ggacccctga agtgacctgt 780
gtggtcgtgg acgtgtcgca ggaagatccg gaggtccagt tcaattggta cgtggatggg 840
gtggaggtcc acaacgccaa gacgaagccg agagaagaac agttcaactc aacttaccgg 900
gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcatcag gattggctca acggaaagga gtacaagtgc 960
aaagtgtcca acaagggcct gcctagctca atcgaaaaga ccatttccaa ggccaagggc 1020
cagccgaggg aaccacaggt ctatactctg ccaccgagcc aagaagagat gaccaagaac 1080
caagtgtccc tgacttgcct ggtcaagggg ttctacccgt cggacatcgc agtggagtgg 1140
gagagcaacg gacagcctga aaacaattac aagaccaccc cgcccgtgct ggatagcgac 1200
ggttccttct tcctttactc gcgcctcacc gtcgacaaga gccggtggca ggagggcaac 1260
gtgttctcct gctccgtgat gcacgaagct ctgcataacc actacactca gaagtccttg 1320
tcgctgagcc tcggaaag 1338
<210> 195
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 195
gacatccaga tgacccagag ccctagctct ttaagcgcct ctgtgggcga tcgtgtgacc 60
atcacttgta gcgccagcag cagcatcagc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120
aaggccccca agctgctgat ctacgacacc agcaagctgg ccagcggcgt gcctagcaga 180
ttcagcggca gcggaagcgg caccgacttc actttaacca tcagctcttt acagccagaa 240
gacttcgcca cctactactg ccaccagagg agcagctacc ccaccttcgg ccaaggtacc 300
aagctcgaga tcaagagaac tgtggccgcg ccgtcagtgt ttatcttccc tccatcggat 360
gaacagctta agtccggcac ggcgtctgtg gtctgcctgc tcaataactt ttaccctagg 420
gaagctaaag tccaatggaa agtggataac gccctgcagt caggaaacag ccaggaatcg 480
gttaccgaac aggacagcaa ggacagcact tactccttgt cgtcgactct tactctgagc 540
aaggccgatt acgagaagca caaggtctac gcctgcgagg tcacccatca gggactctcg 600
tccccggtga ccaaatcctt caatagaggc gaatgc 636
<210> 196
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 196
caagtgcagc tcgtgcagtc cggagccgaa gtcaagaagc ccggagcgtc agtgaaagtg 60
tcctgcaagg cctcgggcta cactttcaca agctacaaca tgcactgggt cagacaggca 120
cctgggcagg gtctggagtg gatgggagtg atctacccgg gcgacggcgc cacttcctac 180
gcccaaaagt tcaagggccg cgtgaccatg actagggaca cctcgacctc aaccgtgtac 240
atggaactga gctccctgcg gtccgaggat accgccgtgt actattgtgc tcgggactac 300
tacgggtcca gcccactggg atactgggga cagggtaccc ttgtcacggt gtcgtcagct 360
tccaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420
acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 600
acctgcaatg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 660
tatggtcccc catgcccacc atgcccagca cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc 720
ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1320
tccctgtctc tgggtaaa 1338
<210> 197
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 197
gacatccaaa tgactcagtc cccgtcatcc ctgtcggcat ccgtgggaga cagagtcacc 60
attacgtgca gcgcgagccc gagcatttcc tatatgaact ggtaccagca gaagcccggg 120
aaagccccta agctgttgat ctacgccact tcctcactgg cttccggcgt gccatcccgg 180
ttctcgggtt ccggctcggg aaccgatttt acccttacta tctcgtccct gcaacccgag 240
gacttcgcca cctactactg tcaccagcgc tctagctacc ctacattcgg acagggcacc 300
aagctcgaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 360
gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 420
gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 480
gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 540
aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 600
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgt 636
<210> 198
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 198
caagtgcagc tcgtgcagtc cggagccgaa gtcaagaagc ccggagcgtc agtgaaagtg 60
tcctgcaagg cctcgggcta cactttcaca agctacaaca tgcactgggt cagacaggca 120
cctgggcagg gtctggagtg gattggagtg atctacccgg gcgacggctc cacttcctac 180
aaccaaaagt tccagggccg cgtgaccatg actagggaca cctcgacctc aaccgtgtac 240
atggaactga gctccctgcg gtccgaggat accgccgtgt actattgtgc tcgggactac 300
tacgggtcca gcccactggg atactgggga cagggtaccc ttgtcacggt gtcgtcagct 360
tccaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420
acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 600
acctgcaatg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 660
tatggtcccc catgcccacc atgcccagca cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc 720
ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1320
tccctgtctc tgggtaaa 1338
<210> 199
<211> 635
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 199
acatccaaat gactcagtcc ccgtcatccc tgtcggcatc cgtgggagac agagtcacca 60
ttacgtgcag cgcgagctca agcatttcct atatgaactg gtaccagcag aagcccggga 120
aagcccctaa gctgttgatc tacgccactt ccaagctgcc gtccggcgtg ccatcccggt 180
tctcgggttc cggctcggga accgatttta cccttactat ctcgtccctg caacccgagg 240
acttcgccac ctactactgt caccagcgct ctagcacccc tacattcgga cagggcacca 300
agctcgaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg 360
agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag 420
aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg 480
tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca 540
aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct 600
cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 635
<210> 200
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 200
caagtgcagc tcgtgcagtc cggagccgaa gtcaagaagc ccggagcgtc agtgaaagtg 60
tcctgcaagg cctcgggcta cactttcaca agctacaaca tgcactgggt cagacaggca 120
cctgggcagg gtctggagtg gatgggagtg atcaacccgg gcgacggcgc cacttcctac 180
gcccaaaagt tcaagggccg cgtgaccatg actagggaca cctcgacctc aaccgtgtac 240
atggaactga gctccctgcg gtccgaggat accgccgtgt actattgtgc tcgggactac 300
tacgggtcca gcccactggg atactgggga cagggtaccc ttgtcacggt gtcgtcagct 360
tccaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420
acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 600
acctgcaatg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 660
tatggtcccc catgcccacc atgcccagca cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc 720
ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1320
tccctgtctc tgggtaaa 1338
<210> 201
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 201
gacatccaaa tgactcagtc cccgtcatcc ctgtcggcat ccgtgggaga cagagtcacc 60
attacgtgcc gcgcgagccc gagcatttcc tatatgaact ggtaccagca gaagcccggg 120
aaagccccta agctgttgat ctacgccact tcctcactgg cttccggcgt gccatcccgg 180
ttctcgggtt ccggctcggg aaccgatttt acccttacta tctcgtccct gcaacccgag 240
gacttcgcca cctactactg tcaccagcgc tctagcagcc ctacattcgg acagggcacc 300
aagctcgaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 360
gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 420
gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 480
gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 540
aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 600
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgt 636
<210> 202
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 202
gacatccaaa tgactcagtc cccgtcatcc ctgtcggcat ccgtgggaga cagagtcacc 60
attacgtgca gcgcgagccc gagcatttcc tatatgaact ggtaccagca gaagcccggg 120
aaagccccta agctgttgat ctacgccact tcctcactgc cgtccggcgt gccatcccgg 180
ttctcgggtt ccggctcggg aaccgatttt acccttacta tctcgtccct gcaacccgag 240
gacttcgcca cctactactg tcaccagcgc tctagcagcc ctacattcgg acagggcacc 300
aagctcgaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 360
gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 420
gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 480
gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 540
aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 600
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgt 636

Claims (50)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区(HCVR)的三个互补决定区(CDR)(HCDR)；和
轻链可变区(LCVR)的三个CDR(LCDR)，其中
第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；
第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少75％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；
第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少83％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；
第一LCDR包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；
第二LCDR包含氨基酸序列ATS或与所述氨基酸序列ATS具有至少66％同一性的氨基酸序列优选AAS，优选由其组成，以及
第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少87％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第二HCDR包含选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19组成的组的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第一LCDR包含选自由SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:20组成的组的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第二LCDR包含选自由ATS和AAS组成的组的氨基酸序列，优选由其组成；以及
所述第三LCDR包含选自由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22组成的组的氨基酸序列，优选由其组成。
3.根据权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第一LCDR包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第二LCDR包含氨基酸序列ATS，优选由其组成；以及
所述第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列，优选由其组成。
4.根据权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
延伸的第二HCDR，其包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列，优选由其组成；
延伸的第一LCDR，其包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列，优选由其组成；以及
延伸的第二LCDR，其包含根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列，优选由其组成。
5.根据权利要求3或4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述HCVR包含根据SEQ ID NO:36的氨基酸序列，优选由其组成；和/或
所述LCVR包含根据SEQ ID NO:37的氨基酸序列，优选由其组成。
6.根据权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
延伸的第二HCDR，其包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列，优选由其组成；
延伸的第一LCDR，其包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列，优选由其组成；以及
延伸的第二LCDR，其包含根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列，优选由其组成。
7.根据权利要求3或6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述HCVR包含根据SEQ ID NO:36的氨基酸序列，优选由其组成；和/或
所述LCVR包含根据SEQ ID NO:38的氨基酸序列，优选由其组成。
8.根据权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第二HCDR包含根据SEQ ID NO:18的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第一LCDR包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第二LCDR包含氨基酸序列ATS，优选由其组成；以及
所述第三LCDR包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列，优选由其组成。
9.根据权利要求8所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
延伸的第二HCDR，其包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列，优选由其组成；
延伸的第一LCDR，其包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列，优选由其组成；以及
延伸的第二LCDR，其包含根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列，优选由其组成。
10.根据权利要求8或9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述HCVR包含根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列，优选由其组成；和/或
所述LCVR包含根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列，优选由其组成。
11.根据权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第二HCDR包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第一LCDR包含根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第二LCDR包含氨基酸序列AAS，优选由其组成；以及
所述第三LCDR包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列，优选由其组成。
12.根据权利要求11所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
延伸的第二HCDR，其包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列，优选由其组成；
延伸的第一LCDR，其包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列，优选由其组成；以及
延伸的第二LCDR，其包含根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列，优选由其组成。
13.根据权利要求11或12所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述HCVR包含根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列，优选由其组成；和/或
所述LCVR包含根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列，优选由其组成。
14.根据权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述第一HCDR包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第二HCDR包含根据SEQ ID NO:19的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第三HCDR包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第一LCDR包含根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列，优选由其组成；
所述第二LCDR包含氨基酸序列ATS，优选由其组成；以及
所述第三LCDR包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列，优选由其组成。
15.根据权利要求14所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
延伸的第二HCDR，其包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列，优选由其组成；
延伸的第一LCDR，其包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列，优选由其组成；以及
延伸的第二LCDR，其包含根据SEQ ID NO:28的氨基酸序列，优选由其组成。
16.根据权利要求14或15所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述HCVR包含根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列，优选由其组成；和/或
所述LCVR包含根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列，优选由其组成。
17.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述HCVR包含选自由SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36组成的组的氨基酸序列，优选由其组成。
18.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述LCVR包含选自由SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38组成的组的氨基酸序列，优选由其组成。
19.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
由选自ZH1-[GYTFTSYN]-ZH2-[X53GVIX57PGDGX64TSYX68QKFX72]-ZH3-[ARDYYGSSPLGY]-ZH4的氨基酸序列组成的重链可变区(HCVR)，其中
ZH1、ZH2、ZH3和ZH4各自独立地表示零个、一个或若干个独立选择的氨基酸残基，
X53选自I和M；
X57选自N和Y；
X64选自A和S；
X68选自A和N；以及
X72选自K和Q；以及
由选自ZL1-[X24ASX27SISYX39N]-ZL2-[AX57SX66LX68]-ZL3-[HQRSSX115PT]-ZL4的氨基酸序列组成的轻链可变区(LCVR)，其中
ZL1、ZL2、ZL3和ZL4各自独立地表示零个、一个或若干个独立选择的氨基酸残基，
X24选自S和R；
X27选自S和P；
X39选自M和L；
X57选自A和T；
X66选自K和S；
X68选自A和P；以及
X115选自S、T和Y。
20.根据权利要求19所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
ZH1包含根据SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:39具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；
ZH2包含根据SEQ ID NO:40的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:40具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；
ZH3包含根据SEQ ID NO:41的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:41具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；
ZH4包含根据SEQ ID NO:42的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；
ZL1包含根据SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:43具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；
ZL2包含根据SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:44具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；
ZL3包含根据SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:45具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；和/或
ZL4包含根据SEQ ID NO:46的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:46具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
21.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)，优选人BSSL(hBSSL)。
22.一种特异性结合胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)，优选人BSSL(hBSSL)的表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含：
第一表面，其包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％，优选至少83％同一性的氨基酸序列；以及
第二表面，其包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％，优选至少85％或至少92％同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求23所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一表面包含根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有至少80％，优选至少83％，并且更优选至少91％同一性的氨基酸序列。
24.根据权利要求23或24所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段进一步特异性结合选自由以下组成的组的表面：
根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有至少80％，优选至少85％同一性的氨基酸序列；
根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4具有至少80％，优选至少83％，更优选至少88％，例如至少94％同一性的氨基酸序列；和
根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6具有至少80％，优选至少84％，并且更优选至少92％同一性的氨基酸序列。
25.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由人抗体、人源化抗体和嵌合抗体或其抗原结合片段组成的组。
26.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自由单链可变片段(scFv)、Fab片段、F(ab')2片段、F(ab’)3片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)和纳米抗体组成的组，优选scFv。
27.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
28.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中具有选自由IgG、IgA、IgM、IgD和IgE组成的组的同种型类别，优选IgG，并且更优选IgG1或IgG4。
29.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含至少一个抑制与Fc受体(FcγR)相互作用的Fc沉默突变。
30.根据权利要求30所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中分离的抗体或其抗原结合片段属于IgG同种型类别并且所述至少一个Fc沉默突变选自由L234A、L235A和P329G组成的组。
31.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含至少一个防止或减少体内Fab臂交换的稳定突变。
32.根据权利要求32所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型亚类并且所述至少一个稳定突变是S228P。
33.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体和/或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂或赋形剂。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求34所述的药物组合物，其用作药物。
35.根据权利要求1至33中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求34所述的药物组合物，其用于治疗和/或预防炎性疾病。
36.根据权利要求36所述使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述所述炎性疾病为慢性炎性疾病。
37.根据权利要求36所述使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述炎性疾病为全身性炎性疾病。
38.根据权利要求36所述使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述炎性疾病为自身免疫疾病。
39.根据权利要求36所述使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述炎性疾病是自身炎性疾病。
40.根据权利要求36所述使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述炎性疾病是自然杀伤(NK)细胞介导的炎性疾病。
41.根据权利要求36所述使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述炎性疾病选自由类风湿性关节炎(RA)、幼年特发性关节炎(JIA)、银屑病关节炎、炎性肠病(IBD)如克罗恩病或溃疡性结肠炎(UC)、以及肝脂肪变性组成的组。
42.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
43.一种表达载体，其包含根据权利要求43所述的多核苷酸。
44.一种细胞，其包含根据权利要求1至33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求43所述的多核苷酸和/或根据权利要求44所述的表达载体。
45.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
在所述抗体或其抗原结合片段由所述细胞表达的条件下培养包含根据权利要求44所述的表达载体的根据权利要求45所述的细胞；以及
任选地，从所述细胞或培养所述细胞的培养基中分离所述抗体或其抗原结合片段。
46.一种用于检测样品中是否存在胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)和/或定量样品中BSSL的量的方法，所述方法包括：
使所述样品与根据权利要求1至33中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段接触；以及
检测所述样品中是否存在BSSL和/或基于结合BSSL的分离的抗体或其抗原结合片段的量定量所述样品中BSSL的量。
47.一种用于诊断胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)相关疾患的方法，所述方法包括：
a)使来自受试者的样品与根据权利要求1至33中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段接触；
b)检测所述样品中是否存在BSSL和/或基于结合BSSL的分离的抗体或其抗原结合片段的量定量所述样品中BSSL的量；以及
c)基于步骤b)中的结果，断定所述受试者是否患有BSSL相关疾患。
48.一种胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)表位，其包含：
第一表面，其包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％，优选至少83％同一性的氨基酸序列；以及
第二表面，其包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％，优选至少85％或至少92％同一性的氨基酸序列。
49.根据权利要求49所述的BSSL表位，其中所述第一表面包含根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列，优选由其组成。
50.根据权利要求49或50所述的BSSL表位，其进一步包含表面，所述表面包含选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列，优选由其组成。
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