CN1185812A - 表达胆汁盐刺激脂酶(bssl)的dna分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中表达胆汁盐刺激脂酶的方法中使用的DNA分子,重组载体和细胞培养物。DNA分子包含:(a)编码为人BSSL或其生物活性变异体的多肽的区域;(b)与所述多肽编码区相连的,编码能操纵所述多肽从用所述DNA分子转化的巴斯德毕赤酵母细胞分泌的信号肽的区域;(c)可操作性地与(a)和(b)中定义的所述编码区相连的巴斯德毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子或功能等价的启动子。

Description

表达胆汁盐刺激脂酶(BSSL)的DNA分子
技术领域
本发明涉及用于在甲基营养酶母巴斯德毕赤酵母中表达胆汁盐刺激脂酶(BSSL)的方法中的DNA分子，重组载体和细胞培养物。背景技术
胆汁盐刺激脂酶(BSSL；EC3.1.1.1)(综述见Wang和Hartsuck，1993)提供大部分人乳汁脂裂解活性。该脂酶的一个特点是需要初级胆汁盐来提供抗乳化的长链三酰基甘油的活性。至今为止，仅在来自人，大猩猩，猫和狗的奶中发现了BSSL(Hernell等，1989)。
BSSL在母乳喂养婴儿的肠中的乳汁脂肪的消化中起着关键性的作用(Fredrikzon等，1978)。BSSL在人分泌乳汁的乳腺中合成并随乳汁一起分泌(Bickberg等，1987)。它占全部乳汁蛋白的约1％(Blckberg和Hernell，1981)。
已认为BSSL是脂肪吸收和随后的生长中主要速率限制因素，尤其是未成年的在其自身合成BSSL有缺陷的婴儿。补充纯化酶的办法明显改善了这些婴儿的消化和生长(U.S.4,944,944；Oklahoma医学研究基金)。这在制备含有高百分比的三甘油酯和基于植物或非人类乳汁蛋白来源的婴儿配制剂的生产中具有临床学重要性，因为用这些配制剂喂养的婴儿在没有外加的BSSL时不能消化脂肪。
已鉴定出乳汁BSSL和胰羧酸酯水解酶(CEH)的cDNA结构(Baba等，1991；Hui和Kissel，1991；Nilsson等，1991，Reue等，1991)，并已作出结论，即乳汁酶和胰酶为相同基因，CEL基因的产物。CEL基因的cDNA序列(SEQ ID NO：1)公开在US5,200,183(Oklahoma医学研究基金)；WO 91/18293(Aktiebolaget Astra)；Nilsson等(1990)；和Baba等(1991)中。推测的BSSL蛋白的氨基酸序列，包括23个氨基酸的信号肽，示于序列表中的SEQ ID NO：2，同时722个氨基酸的天然蛋白质的序列示于SEQ ID NO：3。
蛋白质的C末端区含有各为11个氨基酸残基的16个重复单元，接着是11个氨基酸的保守区段。天然蛋白质为高度糖基化，并已报道了宽范围的观察到的分子量。这可通过糖基化的变化程度来解释(Abouakil等，1988)。该的N末端的一半与乙酰胆碱酯酶和一些其它的酯酶同源(Nilsson等，1990)。
可通过在适宜宿主，例如大肠杆菌，啤酒糖酵母或哺乳动物细胞系中的表达来制备重组BSSL。为了扩大这种制备费用为商业上可接受的BSSL表达体系，可设想使用异源表达体系。如上面所提到的，人BSSL在C末端具有11个氨基酸的16个重复单元。为了确定这一重复区域的生物重要性，已构建了部分缺少或全部缺少重复区的人BSSL各种突变体(Hansson等，1993)。变异体BSSL-C(SEQ ID NO：4)，例如缺失氨基酸残基536-568以及残基591-711。使用哺乳动物细胞至C127宿主和牛乳头状瘤病毒表达载体的表达研究表明各种变异体可以活性形式表达(Hansson等，1993)。从表达研究中还可总结出人BSSL中的富含脯氨酸的重复对于BSSL的催化活性或胆汁盐活性是非必需的。然而，在哺乳动物表达体系中制备BSSL或其突变体对于常规治疗用途来说可能太昂贵。
与使用原核体系相比，真核体系，例如酵母对于制备由重组DNA编码的一些多肽可提供明显的优点。例如，酵母可通常比细菌生长的细胞密度高，并可证实能糖基化表达的多肽，而这种糖基化对于生物活性是重要的。然而，使用啤酒糖酵母作为宿主器官通常导致不良的表达水平和重组蛋白的不良分泌(Cregg等，1987)。啤酒糖酵母中的异源蛋白质的最高水平为占全部细胞蛋白质5％的范围(Kingsman等，1985)。使用啤酒糖酵母作为宿主的另一个缺点是重组蛋白质可能被过度糖基化，这样可能影响糖基化的哺乳动物蛋白质的活性。
巴斯德毕赤酵母是以甲醇作为唯一碳源和能源而生长的甲基营养酵母，因为它包含高度调控的甲醇利用途径(Ellis等，1985)。毕赤酵母还可适合于有效的高细胞密度发酵技术。因此，重组DNA技术和有效的酵母转化的方法使得有可能开发巴斯德毕赤酵母作为使用基于甲醇氧化酶启动子的表达体系高产量地表达异源蛋白质的宿主(Cregg等，1987)。
现有技术业已知使用巴斯德毕赤酵母作为用于表达例如下面的异源蛋白质的宿主：人肿瘤坏死因子(EP-A-0263311)；博德特氏杆菌属pertactin抗原(WO 91/15571)；乙型肝炎表面抗原(Cregg等，1987)；人溶菌酶蛋白(WO 92/04441)；抑蛋白酶肽(WO 92/01048)。然而，活性，可溶及分泌形式的异源蛋白质的成功表达取决于各种因素，例如信号肽的正确选择，信号肽和成熟蛋白质之间的融合连接的适宜构建，生长条件等。发明目的
本发明的目的是克服前面体系的缺陷，提供一种高效且可与在其它生物中的制备相比，或优于它的制备人BSSL的方法。该目的已通过提供在巴斯德毕赤酵母细胞中表达BSSL的方法而实现。
通过本发明因而表明人BSSL和突异体BSSL-C可从巴斯德毕赤酵母中以活性形式分泌。天然信号肽以及来自啤酒糖酵母转化酶蛋白质的异源信号肽被用于将成熟蛋白质以具活性的，适当的加工形式转移到培养基中。发明描述
第一方面，本发明提供了DNA分子，它包含：(a)编码人BSSL或其生物活性变异体的多肽的区域；(b)与所述多肽编码区的5′末端相连的，编码能指导所述多肽分泌的信号肽，所述多肽来自经所述DNA分子转化的巴斯德毕赤酵母细胞；(c)可操作性地与(a)和(b)中定义的所述编码区相连的巴斯德毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子或功能相同的启动子。
术语BSSL的“生物活性变异体”应理解为具有BSSL活性并包含序列表中SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的一部分的多肽。本文中术语“具有BSSL活性的多肽”应理解为包含下面性质的多肽：(a)适宜于口服施用；(b)由特定的胆汁盐活化；和(c)在小肠内含物中起非特异性脂酶的作用，即能水解脂肪而相对与它们的化学结构和物理状态(乳化的，分子团，可溶的)无关。
所述BSSL变异体可例如为包含少于16个重复“单元”的变异体，其中“重复单元”应理解为11个氨基酸的重复单元，由在序列表“SEQID NO：1”的“(ix)特点”标题下的指明为“重复单元”的核苷酸序列编码。尤其是，BSSL变异体可为变异体BSSL-C，其中缺失氨基酸536-568以及591-711(序列表SEQ ID NO：4)。
因此，根据本发明的DNA分子优选为编码BSSL(SEQ ID NO：3)或BSSL-C(SEQ ID NO：4)的DNA分子。
然而，根据本发明的DNA分子不应严格限制为编码具有与序列表中SEQ ID NO：3或4相同的氨基酸序列的多肽的DNA分子。而且本发明包括编码带有修饰，例如取代，小的缺失，插入或倒位的多肽的DNA分子，其中这些多肽仍基本上具有BSSL的生物活性。因此，本发明包括编码上述BSSL变异体的DNA分子以及还包括编码其氨基酸序列与序列表中SEQ3或4所示的氨基酸序列至少90％同源，优选至少95％同源的多肽的DNA分子。
上面提到的信号肽可为与具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸-20至-1所示的氨基酸序列的肽相同或基本相似的肽。另一方面，它可为包含啤酒糖酵母转化酶信号肽。
另一方面，本发明提供包含上面定义的DNA分子的载体。优选地，该载体为可复制表达载体，它带有并且能介导毕赤酵母属细胞中的编码人BSSL或其生物活性变异体的DNA序列的表达。该载体可例如为质粒载体pARC 5771(NCIMB 40721)，pARC 5799(NCIMB 40723)或pARC 5797(NCIMB 40722)。
另一方面，本发明提供了包括用DNA分子或上面定义的载体转化的毕赤酵母属细胞的宿主细胞培养物。优选地，该宿主细胞为例如PPF-1或GS115菌株的巴斯德毕赤酵母细胞，所述细胞培养物可例如为培养物PPF-1[pARC 5771](NCIMB 40721)，或GS115[pARC 5799](NCIMB40723)或GS115[pARC 5797](NCIMB 40722)。
另一方面，本发明提供一种制备人BSSL或其生物活性变异体的多肽的方法，它包括在使所述多肽被分泌至培养基中的条件下，培养根据本发明的宿主细胞，并从培养基中回收所述多肽。本发明实施例实施例1：巴斯德毕赤酵母PPF-1中的BSSL的表达1.1.pARC 0770的构建
将编码BSSL蛋白质，包括天然信号肽(下面称为NSP)的cDNA序列以EcoRI-SacI片段克隆至pTZ19R中(Pharmacia)。两步完成将NSP-BSSL cDNA克隆至啤酒糖酵母表达载体pSCW 231中(从L.Prakash教授获得，Rochester大学，NY，USA)，该表达载体为低拷贝数的酵母表达载体，其中表达且受组成型ADH1启动子控制。开始将NSP-BSSL cDNA以来自pTZ19R-SP-BSSL的EcoRI-SphI片段克隆至pYES 2.0中(Invitrogen，USA)。通过产生EcoRI/Ncol(89)融合和重新产生EcoRI位点除去在信号肽编码序列开始处的EcoRI和NcoI之间的过剩的89个碱基对产生的克隆pARC 0770含有起初编码在NcoI位点，并紧接框内带有剩余NSP-BSSL序列的重新产生的EcoRI位点的ATG密码子。1.2.pARC 5771质粒的构建
为了构建表达BSSL的适宜的表达载体，将编码BSSL蛋白质和其天然信号肽的cDNA片段用巴斯德毕赤酵母表达载体pDM 148克隆。载体pDM 148(从Dr.S.Subramani，UCSD)按如下构建：甲醇氧化酶(MOX1)基因的上游非翻译区(5′-UTR)和下游非翻译区(3′-UTR)通过PCR而被分离，并串联放入大肠杆菌载体pSK+(可从Stratagene，USA购得)的多克隆序列(MCS)中。
为了适当地选择预计的巴斯德毕赤酵母转化体，将编码啤酒糖酵母ARG4基因和其本身启动子序列的DNA序列插入到pSK-中的5′-和3′-UTR之间。产生的构建物pDM 148具有下面特征：在pSK-的MCS区中，MOX的5′-UTR，啤酒糖酵母ARG4基因组序列和MOX的3′-UTR被克隆。在MOX的5′-UTR和ARG4基因组序列之间，一系列单一的限制性位点(SalI，ClaI，EcoRI，PstI，SmaI和BamHI)被定位，其中任何异源蛋白质编码序列在巴斯德毕赤酵母中的MOX启动子的控制下可被克隆用于表达。为了便于将该表达盒整合到巴斯德毕赤酵母染色体中的MOX1基因座中，可通过用NotI限制性酶消化将表达盒从pSK-载体的其余部分中酶切。
在pDM148中克隆的巴斯德毕赤酵母的MOX1的5′-UTR长度约为500bp，而克隆至pDM 148的来自巴斯德毕赤酵母的MOX1的3′-UTR长度为约1000bp。为了在pDM148中MOX1的5′-UTR和啤酒糖酵母ARG4编码序列之间插入NSP-BSSL cDNA序列，通过用EcoRI和BamHII消化从pARC 0770中分离cDNA插入片段(SP-BSSL)(约2.2kb DNA片段)，并在pDM 148的EcoRI和BamHII位点之间克隆。
产生的构建物pARC 5771(NCIMB 40721)包含巴斯德毕赤酵母MOX1 5′-UTR，接着是NSP-BSSL编码序列，随后是啤酒糖酵母ARG4基因序列和巴斯德毕赤酵母的MOX1基因的3′-UTR，同时在pSK-的MCS克隆从MOX1的5′-UTR到MOX1的3′-UTR的全部DNA片段。1.3巴斯德毕赤酵母宿主PPF-1中的BSSL的转化
为在巴斯德毕赤酵母宿主PPF-1(his4，Arg4；从PhillipsPetroleum公司获得)表达BSSL，用NotI消化质粒pARC 5771，将全部消化的混合物(10μg的总的DNA)用于转化PPF-1。接下来的转化方法基本上是Cregg等(1987)描述的酵母原生质球方法。在缺乏精氨酸的基本培养基上再生转化体，这样可选择Arg+克隆。取出含有转化体的再生顶部琼脂，在水中均化，在缺乏精氨酸的基本葡萄糖平板上以每板约250个克隆平板接种酵母细胞。接着通过影印培养至最低甲醇平板来鉴定突变克隆。所有转化体的约15％表现为MutS(甲醇缓慢生长)表型。1.4.表达BSSL的转化体的筛选
为了迅速筛选大量的表达脂酶的转化体，研究了一种脂酶平板分析方法。制备这些平板的方法如下：向2％琼脂糖溶液(最终浓度)中加入10×胆酸钠的水溶液至最终浓度为1％。向混合物中加入脂底物trybutine至最终浓度为1％(v/v)。为了支持转化体的生长，对混合物进一步补充0.25％酵母氮基(最终)和0.5％甲醇(最终)。适当混合各组分，并倒入3-5mm厚的平板中。一旦混合物变为固体，将转化体划线至平板上，再将平板在37℃下培养12小时。产生脂酶的克隆在克隆周围显示出清楚的晕圈。在一常规实验中，全部93个转化体中的7个被鉴定为产生BSSL转化体。挑出围绕划线菌落的产生最大晕圈的两个克隆(39和86号)用于进一步鉴别。1.5来自PPF-1[pARC 5771]的BSSL的表达
挑出1.4节描述的两个转化体39和86号，30℃下，在BMGY液体培养基(1％酵母提取液，2％细菌胨，1.34％无氨基酸的酵母氮基，100mM KPO4缓冲液，pH6.0，400μg/l生物素，和2％甘油)中生长24小时直至培养基的A600接近40。沉淀培养物，重新悬浮A600＝300的BMMY(在BMGY中用0.5％甲醇代替2％甘油)培养基中。30℃下，将诱导的培养基摇荡培养120小时。在不同的时间点提取培养物上清液通过酶活性分析，SDS-PAGE分析和蛋白质印迹法来分析BSSL的表达。1.6在克隆号38和86的培养物上清液中BSSL酶活性的检测
为了检测1.5节中描述的号39和86的诱导培养物的无细胞培养物上清液中的酶活性，离心培养物，根据Hernell和Olivecrona(1974)描述的方法分析2μl无细胞上清液的BSSL酶活性。如表1所示，在保温96小时后，在两种培养基中发现包含具有最大活性的BNSSL酶活性。1.7.PPF-1：pARC 5771转化体(号39和86)的培养物上清液的蛋白质印迹分析
为了确定号39和86 PPF-1[pARC 5771]转化体的培养物上清液中重组BSSL的存在，如1.5节描述的培养并诱导培养物。在诱导之后不同的时间点提取培养物，并使用抗BSSL多克隆抗体进行蛋白质印迹分析。结果表明在培养物上清液中BSSL以116kDa的带存在。实施例2：毕赤酵母GS115中BSSL的表达2.1.pARC 5799的构建
由于末完全确定5′-MOX UTR和3′-MOX UTR。并且由于pDM148载体缺乏任何其它的监测整合在巴斯德毕赤酵母属染色体中的BSSL的拷贝数的适宜的标记(例如G418抗性基因)，因此将天然BSSL的cDNA与其信号肽一起克隆至另一个巴斯德毕赤酵母表达载体pHIL D4中。整合的质粒pHIL D4从Petroleum公司获得。该质粒含有5′-MOX1，约1000bp的醇氧化酶启动子片段和一个EcoRI克隆位点。在EcoRI位点之后它还包含含有醇氧化酶终止序列的约250 bp的3′-MOX1区。“终止”区之后是包含在与宿主GS115的缺损HIS4基因互补的2.8kb片段中的巴斯德毕赤酵母组氨醇脱氢酶基因HIS4(见下文)。含有3′-MOX1 DNA的650bp区在HIS4基因的3′末端融合，它与5′-MOX1区一起对于定点整合是必需的。来自pUC-4K(PL-Biochemicals)的细菌卡那霉素抗性基因在HIS4和HIS4基因的3′处的3′-MOX1区之间的唯一的NaeI位点被插入。
为了将NSP-BSSL编码cDNA片段克隆在pHIL D4的唯一的EcoRI位点上，将具有BamHI-EcoRI酶切位置的双链寡接头与BamHI消化的质粒PARC 5771连接，分离2.2kb EcoRI片段的全部NSP-BSSL编码序列。将该片段克隆在pHIL D-4的EcoRI位点，该正确定向的质粒称为pARC 5799(NCIMB 40723)。2.2.pARC 5799的转化
为了便于整合位于巴斯德毕赤酵母的MOX1的基因组基因座的NSP-BSSL编码序列，根据节1.5描述的方法将质粒pARC 5799用BglII消化，用于巴斯德毕赤酵母菌株GS115(his4)(Phillips Petroleum公司的转化。然而，这种筛选是His原养型。在再生上面琼脂上进行系列稀释平板接种之后，挑出转化体，如节1.4描述的直接检测脂酶平板分析。根据脂酶分析平板上的晕圈的大小挑出两个转化体克隆(号9和21)，进一步检测BSSL的表达。发现这些克隆为Mut+。2.3.GS115[pARC 5799]转化体号9和21的培养上清液中的BSSL酶活性的检测。
基本上根据节1.5描述的方法培养GS115[pARC 5799]的两个转化克隆号9和21。如节1.6描述的，在诱导之后的不同时间点分析培养上清的BSSL酶活性。如表1所示，发现两培养上清中均含有BSSL酶活性，并且保温72小时之后的酶活性最高。与PPF-1[pARC 5771]克隆相比，两个克隆均显示出极好的BSSL表达。2.4 GS115[pARC 5799]转化体号9和21的培养上清的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
将如节2.3中描述的在不同时间点收集的培养上清进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。从SDS-PAGE图谱中，估计诱导培养物的培养上清中存在的全部蛋白质60-75％为BSSL。该蛋白质的分子量为约116kDa蛋白质免迹数据也证实存在于培养上清中的主要蛋白质为BSSL。该蛋白质显然具有与天然BSSL相同的分子量。实施例3：BSSL表达的放大3.1.来自转化克隆GS115[pARC 5799](号21)的BSSL表达的放大
使用23升容量的B.Braun发酵罐。121℃下，将5升含有1％YE，2％胨，1.34YNB和4％w/v甘油的培养基高压灭菌30分钟，在滤器灭菌之后，在接种期间加入生物素(最终浓度为400μg/l。对于接种物，使用接种到含有YNB(67％)加上2％甘油(150ml)的合成培养基上，并在30℃下生长36小时的GS115[pARC 5799](号21)的甘油贮液。发酵条件如下，温度为+30℃；使用3.5N NH4OH和2N HCl维持pH5.0；溶解的氧为空气饱和度的20-40％；聚丙二醇2000被用作消沫剂。
在固定的间隔通过测定600nm的OD来监测生长。24小时A600达到最大值50-60。此时，分批生长期结束，这由增加的溶解氧水平得以说明。
紧接生长期为诱导期。在此期间，加入含12ml/L PTM1盐的甲醇。在起初10-12小时期间，甲醇进料率为6μl/小时，此后每7-8小时以6μl/小时的增加量逐渐增加至最大为36ml/小时。用于pH控制的氨用作氮源。通过使用溶解氧的高峰，每6-8小时检测甲醇的累积，发现在诱导全期期间它是有限的，在甲醇进料86小时期间，600nm的OD从50-60增加至150-170。每隔24小时加入酵母提取物和胨，使得最终浓度分别为0.25％和0.5％。
每24小时间隔取出样品，检测无细胞发酵液中的BSSL酶活性，还将发酵液进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。3.2.从发酵罐生长培养物GS115[pARC 5799](号21)分泌的BSSL的蛋白质分析
无细胞发酵液中的BSSL酶活性从24小时处的40-70mg/l(天然蛋白质当量)增加到最后86-90小时处的最高200-227.0mg/l(天然蛋白质当量)。无细胞发酵液的SDS-PAGE分析显示出分子量为116kDa的显著的考马斯兰染色的带。通过进行如节1.7所描述的蛋白质印迹证实了这条带对于天然BSSL的同一性。3.3.分泌到GS115[pARC 5799](号21)克隆的培养上清中的重组BSSL的纯化
如节3.1所描述的，在发酵罐中培养和诱导巴斯德毕赤酵母克隆GS115[pARC 5799]。为了纯化重组BSSL，以12,000×g将250ml培养基(诱导90小时)离心30分钟以除去所有颗粒物质。在Amicon装置中，使用10KDa分离膜超过滤无细胞培养上清。在过滤期间，通过重复稀释去除培养上清中的盐和低分子量蛋白质和肽。用于稀释的缓冲液为5mMBarbitol pH7.4。浓缩培养上清后，使用5mM Barbitol，pH7.4和5mMNaCl使截留物重新恢复为250ml，并上样至用相同缓冲液预平衡的Heparin-琼脂糖柱(15ml床体积)。以10ml/小时的流速进行样品上样。上样后，将柱用5mM Barbitol，pH7.4和0.1M NaCl(200μl洗涤缓冲液)直至250nm处的吸光率低于检测水平。用200ml Barbitol缓冲液(5mM，pH7.4)和线性梯度为0.1M-0.7M的NaCl洗脱BSSL收集级分(2.5ml)，并通过监测200nm处的吸光率来检测被洗脱蛋白。分析含有蛋白质的级份的BSSL酶活性。用检测纯化的8.0％SDS-PAGE图谱分析适当的级份。3.4.分泌在GS115[pARC 5799]培养上清中的纯化的重组BSSL的鉴定
显示最大BSSL酶活性的级份(如节3.3描述)的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析证明重组蛋白质纯度为约90％。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析证实纯化蛋白质的分子量为约116kDa。当样品在SDS-PAGE分析中过载时，用考马斯亮兰染色可检测到一低分子量蛋白带，这条带在蛋白质印迹中未被检出。将纯化蛋白在自动蛋白质序列分析仪上进行N末端分析。结果表明该蛋白质从天然信号肽经过了恰当的加工，重组蛋白质具有AKLGAVY的N末端序列。纯化的重组蛋白质的比活被发现类似于天然蛋白质。实施例4：巴斯德毕赤酵母GS115中的BSSL表达4.1.pARC 5797的构建
将BSSL突异体BSSL-C的cDNA编码序列在其5′末端与啤酒糖酵母SUC2基因产物(转化酶)的信号肽编码序列融合，同时保持转化酶信号肽的第一个ATG密码子开始的开放读框的完整性。一开始将该融合基因构建物克隆至啤酒糖酵母表达载体pSCW231(pSCW231为低拷贝数酵母表达载体，表达受组成型ADH1启动子控制)的EcoRI和BamHI位点之间以产生表达载体PARC 0788。
通过EcoRI和BamHI消化pARC 0788释放适宜的1.8Kb片段并将该片段亚克隆至用EcoRI和BamHI消化的pDM148中，进一步将融合基因的cDNA亚克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pDM 148中(第1.2中描述的)。在如节2.1描述的方法之后将产生的构建物pARC 5790用BamHI消化，连接物质结构物BamHI-EcoRI-BamHI的双链寡核苷酸接头以产生分离融合基因的cDNA片段所必需的构建物pARC 5796。
最后通过EcoRI消化从pARC 5796释放含有转化酶信号肽/BSSL-C融合基因的1.8kb片段。并克隆至pHIL D4的EcoRI位点。通过对表达的适宜的限制性分析，鉴别出在合适定位上含有插入片段的载体，称为pARC 5797(NCIMB 40722)。4.2.巴斯德毕赤酵母的重组BSSL-C的表达
为了从巴斯德毕赤酵母表达重组BSSL-C，通过如节1.3和2.2描述的方法，用pARC 5797转化巴斯德毕赤酵母宿主GS115。用节1.4和2.2中描述的方法，检测转化体的脂酶产生，构建高脂酶产生活性，用脂酶平板分析检测法挑出-转化体(号3)，并进一步通过基本上根据如1.6和2.3中描述的方法分析培养上清中的BSSL酶活性的产生。如表1所示，GS115[pARC 5797](号3)的培养上清含有BSSL酶活性，并直至诱导后72小时，其含量逐步增加。4.3.GS115[pARC 5797]转化体(号3)的培养上清的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
如节1.7和2.4描述的将在如节4.2描述的不同时间点收集的培养上清进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。从SDS-PAGE图谱估测占全部细胞外蛋白75-80％的为BSSL-C，从SDS-PAGE估测的该蛋白的分子量为约66KDa，蛋白质印迹分析中，发现仅有66kDa周围的两条带(双联体)具有免疫反应性，从而证实了重组BSSL-C的表达。比较实施例，啤酒糖酵母中的BSSL的表达
曾尝试在啤酒糖酵母中表达BSSL。在啤酒糖酵母中BSSL分泌不佳，天然信号肽不能有效地起作用。此外，在啤酒糖酵母中天然信号肽没有从成熟蛋白质中切割。参考文献
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转化到巴斯德毕赤酵母培养物的下面质粒已根据布达佩斯条约保藏在国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，Aberdeen，苏格兰，联合王国保藏日期为1995年5月2日。
菌株[质粒] NCIMB号
PPF-[pARC 5771] 40721
GS115[pARC 5799] 40723
GS115[pARC 5797] 40722
表1毕赤酵母转化体培养上清中的酶活性
  诱导后的小时数                    天然BSSL的酶活性(mg/L当量)
PPF-1[pARC 5771] GS115[pARC 5799] GS115[pARC 5797]
    No.39     No.86     No.9     No.21     No.3
    24     0.254     0.135     1.53     1.72     0.37
    48     2.69     3.12     17.28     34.70     40.9
    72     3.96     8.25     37.37     50.60     44.9
    96     11.26     13.60     26.34     50.60     35.6
    120     8.42     13.13     13.60     22.30     17.8
                    序列表(1)一般信息：(i)申请人：
 (A)名称：ASTRA AB
 (B)街道：Vāstra Mālarehamnen 9
 (C)城市：Sōdertālje
 (E)国家：瑞典
 (F)邮编(ZIP)：S-15185
 (G)电话：+46-8-553 260 00
 (H)电传：+46-8-553 288 20
 (I)电报：19237astras(ii)发明名称：用于表达多肽的DNA序列(iii)序列数目：4(iv)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPC)(2)SEQ ID NO：1：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：2428碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA to mRMA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(vi)初始来源：
  (A)生物：人类
  (F)组织类型：乳腺
(ix)特征：
   (A)名称/键：CDS
(B)位置：82..2319
(D)其它信息：/产物＝“胆汁盐刺激脂酶”(ix)特征：
(A)名称/键：外显子
(B)位置：985..1173(ix)特征：
(A)名称/键：外显子
(B)位置：1174..1377(ix)特征：
(A)名称/键：外显子
(B)位置：1378..1575(ix)特征：
(A)名称/键：外显子
(B)位置：1576..2415(ix)特征：
(A)名称/键：成熟肽
(B)位置：151..2316(ix)特征：
(A)名称/键：聚腺苷酸_信号
(B)位置：2397..2402(ix)特征：
(A)名称/键：重复区
(B)位置：1756..2283(ix)特征：
(A)名称/键：5′UTR
(B)位置：1..81(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：1756..1788(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：1789..1821(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：1822..1854(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：1855..1887(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：1888..1920(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：1921..1953(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：1954..1986(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：1987..2019(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：2020..2052(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：2053..2085(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：2086..2118(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
(B)位置：2119..2151(ix)特征：
(A)名称/键：重复_单元
      (B)位置：2152..2184
  (ix)特征：
      (A)名称/键：重复_单元
      (B)位置：2185..2217
  (ix)特征：
      (A)名称/键：重复_单元
      (B)位置：2218..2250
  (ix)特征：
      (A)名称/键：重复_单元
      (B)位置：2251..2283
  (x)公开信息：
      (A)作者：Nilsson，Jeanette
               Blckberg，Lars
               Carlsson，Peter
               Enerbck，Sven
               Hernell，Olle
               Bjursell，Gunnar
      (B)题目：人乳汁胆汁盐刺激脂酶的cDNA克隆以及与胰羧
         酸酯水解酶相同的证据
      (C)杂志：欧洲生物化学杂志
      (D)卷号：192
      (F)页数：543-550
      (G)日期：9月-1990
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：信息：ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTTTTAAGA TAATGCAAAG    60AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG CAA CTG GTT     111
                    Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val
                    -23         -20                 -15GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG     159Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu
        -10                  -5                   1GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG     207Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys
  5                  10                  15CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC     255Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe20                  25                  30                  35GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG     303Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp
             40                  45                  50CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGI CTG CAG GCC     351Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala
         55                  60                  65ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC     399Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu
     70                  75                  80AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG GAC CTG CCC     447Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro
 85                  90                  95GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT     495Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His100                 105                 110                 115GGG CCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC     543Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala
            120                 125                 130ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC     591Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro
        135                 140                 145CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC     639Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly
    150                 155                 160CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG AAT ATC GCG     687Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala
165                 170                 175GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG GAG TCT GCT     735Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala180                 185                 190                 195GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC     783Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly
            200                 205                 210CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT CCC TGG     831Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp
        215                 220                 225GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG GTG GCT GAG AAG     879Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys
    230                 235                 240GTG GGT TGC CCT GTG GGT GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG     927Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys
245                 250                 255GTT ACT GAT CCC CGA GCC CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA     975Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala260                 265                 270                 275GGC CTG GAG TAC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT GTC ATT     1023Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile
            280                 285                 290GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC AAC GCC     1071Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala
        295                 300                 305GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC CAC ATC    1119Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile
    310                 315                 320TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG AAA GTC    1167Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val
325                 330                 335ACG GAG GAG GAC TTC TAC AAG CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG    1215Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys340                 345                 350                 355GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG    1263Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp
            360                 365                 370GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT    1311Ala Gln Aap Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe
        375                 380                 385GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG    1359Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln
    390                 395                 400CAC AGA GCC AAT GCC AAG AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC    1407His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser
405                 410                 415CAT CCC TCT CGG ATG CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT    1455His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His420                 425                 430                 435GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG    1503Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr
            440                 445                 450GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC    1551Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr
        455                 460                 465TGG ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TGG GCT    1599Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala
    470                 475                 480GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTG    1647Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu
485                 490                 495GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CTG AGA    1695Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg500                 505                 510                 515ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CTG CCC ACA    1743Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr
            520                 525                 530GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG    1791Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu
        535                 540                 545GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCC    1839Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro
    550                 555                 560CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC    1887Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
565                 570                 575GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG   1935Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val580                 585                 590                 595CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC   1983Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
            600                 605                 610TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC   2031Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro
        615                 620                 625GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT   2079Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly
    630                 635                 640GAC GCC GGG CCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC   2127Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro
645                 650                 655CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG ACC CCC ACG   2175Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Thr Pro Thr660                 665                 670                 675GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC   2223Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
            680                 685                 690CCC CCT GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCT GAG GCT GCC CCT GTG CCC CCC   2271Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro Val Pro Pro
        695                 700                 705ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT GCA GTC ATT AGG TTT TAG   2319Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe  *
    710                 715                 720CGTCCCATGA GCCTTGGTAT CAAGAGGCCA CAAGAGTGGG ACCCCAGGGG CTCCCCTCCC 2379ATCTTGAGCT CTTCCTGAAT AAAGCCTCAT ACCCCTAAAA AAAAAAAAA             2428(2)SEQ ID NO：2：信息：(i)序列特征：
 (A)长度：746氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：信息：Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys-23         -20                 -15                 -10Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu
        -5                   1                   5Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp
    10                  15                  20              25Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala
             30                  35                  40Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala
         45                  50                  55Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala Tnr Ile Thr Gln Asp Ser
     60                  65                  70Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln
 75                  80                  85Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr90                  95                 100                 105Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn
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    140                 145                 150Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met
155                 160                 165Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro170                 175                 180                 185Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser
            190                 195                 200Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile
        205                 210                 215Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro
    220                 225                 230Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly
235                 240                 245Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala250                 255                 260                 265Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met
            270                 275                 280Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro
        285                 290                 295Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile
    300                 305                 310Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met
315                 320                 325Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr330                 335                 340                 345Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys
            350                 355                 360Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln
        365                 370                 375Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe
    380                 385                 390Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln His Arg ALa Asn Ala Lys
395                 400                 405Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro410                 415                 420                 425Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr
            430                 435                 440Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp
        445                 450                 455Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys
    460                 465                 470Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu
475                 480                 485Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met490                 495                 500                 505Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr
            510                 515                 520Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala
        525                 530                 535Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro
    540                 545                 550Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly
555                 560                 565Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro570                 575                 580                 585Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
            590                 595                 600Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
        605                 610                 615Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
    620                 625                 630Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro
635                 640                 645Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly650                 655                 660                 665Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala
            670                 675                 680Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr
        685                 690                 695Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu
    700                 705                 710Ala Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe  *
715                 720(2) SEQ ID NO：3：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：722氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：无
(vi)初始来源：
  (A)生物：人类
  (F)组织类型：乳腺
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1               5                   10                  15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
        20                  25                  30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His
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50                  55                  60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg
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    115                 120                 125Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130                 135                 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145                 150                 155                 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
           165                  170                 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly
        180                 185                 190Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr
    195                 200                 205Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu
210                 215                 220Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val225                 230                 235                 240Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln
            245                 250                 255Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val
        260                 265                 270Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val
    275                 280                 285Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290                 295                 300Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp305                 310                 315                 320Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn
            325                 330                 335Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr
        340                 345                 350Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr
    355                 360                 365Glu Ser Trp Ala Gln Aep Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val
370                 375                 380Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala385                 390                 395                 400Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
            405                 410                 415Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly
        420                 425                 430Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala
    435                 440                 445Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met
450                 455                 460Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly465                 470                 475                 480Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
            485                 490                 495Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
        500                 505                 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
    515                 520                 525Leu Prc Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly
530                 535                 540Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala545                 550                 555                 560Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr
            565                 570                 575Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
        580                 585                 590
Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro
         595                600                 605
Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly
    610                 615                 620
Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro
625                 630                 635                 640
Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
                645                 650                 655
Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
            660                 665                 670
Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
        675                 680                 685
Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro
    690                 695                 700
Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile
705                 710                 715                 720
Arg Phe(2) SEQ ID NO：4：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：568氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：无
(vi)初始来源：
  (A)生物：人类
  (F)组织类型：乳腺
(ix)特征：
  (A)名称/键：肽
  (B)位置：1..568
  (D)其它信息：/标记＝变异体_C
(x)公开信息：
  (A)作者：Hansson，Lennart
           Blackberg，Lars
           EdlundMichael
           Lundberg，Lennart
         Stromqvist，Mats
         Hernell，Olle
(B)题目：重组人乳汁胆汁盐刺激脂酶
(C)杂志：生物化学杂志
(D)卷号：268
(E)出版：35
(F)页数：2669226698
(G)日期：1993.12.15(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1               5                   10                  15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
        20                  25                  30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His
    35                  40                  45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50                  55                  60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg
            85                  90                  95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly
        100                 105                 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
    115                 120                 125Glu Ile Ala Thr Arg GLy Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Thr Arg
130                 135                 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145                 150                 155                 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
            165                 170                 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly
        180                 185                 190Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr
    195                 200                 205Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu
 210                215                 220Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val225                 230                 235                 240Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln
            245                 250                 255Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val
        260                 265                 270Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val
    275                 280                 285Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290                 295                 300Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp305                 310                 315                 320Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn
            325                 330                 335Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr
        340                 345                 350Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr
    355                 360                 365Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val
370                 375                 380Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala385                 390                 395                 400Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
            405                 410                 415Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly
        420                 425                 430Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala
    435                 440                 445Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met
450                 455                 460Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly465                 470                 475                 480Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
            485                 490                 495Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
        500                 505                 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
    515                 520                 525Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly
530                 535                 540Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Lys Glu Ala545                 550                 555                 560Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe
            565

Claims (14)

1.一种DNA分子，包括
(a)编码为人BSSL或其生物活性变异体的多肽的区域；
(b)与所述多肽编码区的5′末端相连的，编码能操纵所述多肽从用所述DNA分子转化的巴斯德毕赤酵母细胞分泌的信号肽的区域；
(c)可操作性地与(a)和(b)中定义的所述编码区相连的巴斯德毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子或功能相同的启动子。
2.根据权利要求1的DNA分子，其中所述信号肽与序列表中SEQ IDNO：2的氨基酸-20至-1所示的氨基酸序列相同或基本类似。
3.根据权利要求1的DNA分子，其中所述信号肽包含啤酒糖酵母转化酶信号肽。
4.根据权利要求1-3任一项的编码人BSSL生物活性变异体的DNA分子，其中缺失至少一个11个氨基酸的重复单元，所述重复单元示于SEQ ID NO：1中。
5.根据权利要求1-4任一项的DNA分子，其编码具有BSSL活性并具有与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的序列存在至少95％同源性的氨基酸序列的多肽。
6.根据权利要求1-5任一项的DNA分子，其编码具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽。
7.一种载体，包含根据权利要求1-6任一项的DNA分子。
8.根据权利要求7的可复制表达载体，它能介导巴斯德毕赤酵母细胞中人BSSL或其生物活性变异体的表达。
9.根据权利要求8的载体，其为质粒载体pARC 5771(NCIMB40721)，pARC 5799(NCIMB，40723)或pARC 5797(NCIMB40722)。
10.用根据权利要求7-9任一项的载体转化的毕赤酵母属的宿主细胞。
11.根据权利要求10的宿主细胞，为巴斯德毕赤酵母细胞。
12.根据权利要求11的宿主细胞，巴斯德毕赤酵母细胞GS115株。
13.根据权利要求12的宿主细胞，为PPF-1[pARC 5771](NCIMB40721)，GS115[pARC 5799](NCIMB 40723)或GS115[pARC 5797](NCIMB 40722)。
14.一种制备人BSSL或其生物活性变异体的多肽的方法，包括在使所述多肽分泌到培养基中的条件下培养根据权利要求10-13任一项的宿主细胞，并从培养基中回收所述多肽。
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