CN1171993C - 编码对n-乙酰基-l-膦丝菌素具有特异性的氨基酸脱乙酰酶的新基因，其分离和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码脱乙酰酶、或具有脱乙酰酶生物学活性的蛋白质的DNA分子，被本发明DNA分子转化了的转基因植物细胞。这些分子可以用于通过脱乙酰酶基因的特异性表达，制备局部可被有目的性破坏的植物，也即雄性或雌性不育植物。

Description

编码对N-乙酰基-L-膦丝菌素具有特异性的 氨基酸脱乙酰酶的新基因，其分离和应用
技术领域
本发明涉及编码对N-乙酰基-L-膦丝菌素具有特异性的氨基酸脱乙酰酶的新基因，其分离和应用。
背景技术
欧洲专利申请EP 531 716说明了，通过花药特异性表达一种N-乙酰基-膦丝菌素(N-乙酰基-PPT)特异性的脱乙酰酶，可化学诱导可逆性雄性植物不育的方案。其中所应用来源于绿色产色链霉菌的脱乙酰酶基因[N-乙酰基-L-膦丝菌素丙氨酰丙氨酸(N-乙酰基-PPT)脱乙酰酶，dea]，和来源于大肠杆菌的argE(N-乙酰基-L-鸟氨酸脱乙酰酶)编码对N-乙酰基-L-PPT具有特异性的蛋白质。对于这二种基因来说，在植物内的绒毡层特异性表达时，用N-乙酰基-L-PPT处理单个花蕾后，可以出现雄性不育花朵。为了使该系统的应用富有成果，尤其是在实践相关条件下用N-乙酰基-PPT处理整个植物时，应用具有较高底物亲合力的脱乙酰酶是有利的。因此要寻求对N-乙酰基-PPT具有高度亲合力的其它一些脱乙酰酶。
发明内容
本文说明的申请的目的是提供编码脱乙酰酶的DNA分子。用这些脱乙酰酶可以制备出其局部可被特异地破坏了的植物。制备雄性或雌性不育植物具有特殊意义。通过在权利要求书中描述的实施方式，达到了该目的。
本发明涉及编码脱乙酰酶或者具有脱乙酰酶生物学活性的蛋白质的DNA分子。这些蛋白质的酶促特性将在实施例中说明。本发明还涉及编码生物学活性亚片段或衍生物的DNA分子。按照本发明的分子也包括片段、衍生物或等位基因变体。片段是指仍然还具有脱乙酰酶生物学活性的部分。
具体实施方式
本发明此外还涉及被本发明DNA分子转化了的转基因植物细胞。转基因植物细胞可以按照已知的技术方法制备，然后再生成完整的植物。
本发明涉及编码具有N-乙酰基-PPT脱乙酰酶生物学活性的蛋白质的DNA分子。
本发明尤其涉及选自下列分子组的、编码具有N-乙酰基-PPT脱乙酰酶生物学活性的蛋白质的DNA分子
a)编码具有SEQ ID No 2中所给定的氨基酸序列的蛋白质及其片段和/或衍生物的DNA分子；
b)编码SEQ ID No 1中所给定的核苷酸序列的DNA分子或在遗传密码简并性范围内偏离该序列的一些序列；
c)  编码具有SEQ ID No 4中所给定的氨基酸序列的蛋白质或其片段和/或衍生物的DNA分子；和
d)编码SEQ ID No 3中所给定的核苷酸序列的DNA分子或在遗传密码简并性范围内偏离该序列的一些序列。
本发明此外还涉及按照本申请说明的方法鉴定和保藏的微生物寡养单胞菌属种(DSM9734)和食酸丛毛单胞菌(DSM11070)。
本发明尤其涉及含有本发明DNA分子的植物细胞或植物。
具有特别意义的是，通过特异性表达脱乙酰酶基因而制备带有可特异性破坏部分的植物的方法，以及通过脱乙酰酶基因的特异性表达制备雄性或雌性不育植物的方法。
因此，本申请书还涉及：
1)具有高N-乙酰基-PPT脱乙酰酶活性的微生物的特异浓缩
2)相应脱乙酰酶基因的分离
3)由这些基因编码的、具有高N-乙酰基-PPT脱乙酰酶活性的蛋白质的提纯和鉴定
4)在植物内表达脱乙酰酶基因。
本申请此外还涉及：
-编码具有高N-乙酰基-PPT脱乙酰酶活性的酶的DNA分子
-由这些基因编码的蛋白质
-植物内这些脱乙酰酶基因的表达。
在带有壳多糖作为唯一的碳源的矿质培养基内可以从土壤样品浓缩能高效切割N-乙酰基-PPT的细菌。以这种方式分离出了二个菌株的纯培养物：寡养单胞菌属种(DSM保藏号DSM 9734)和食酸丛毛单胞菌(DSM保藏号11070)。
然而，对于工业制备所需要的条件来说，更为合适的是应用提纯的酶。
本申请包括新的L-N-乙酰基-PPT特异性的脱乙酰酶、一种由土壤微生物的浓缩培养物提纯和鉴定这些酶的新的有效的方法、以及这种脱乙酰酶的应用。
因此，本发明还涉及：
1.一种脱乙酰酶，它具有
-20,000-100,000道尔顿的分子量
-最佳pH值为6.5-10.0
-对L-N-乙酰基-膦丝菌素的底物特异性。
2.制备脱乙酰酶的方法，其特征为，在含有蟹壳多糖的培养基中培养不产生孢子的微生物，以及由这种微生物分离脱乙酰酶。
3.在第1项中表征的脱乙酰酶在制备雄性不育植物以及立体选择性制备L-膦丝菌素中的用途。
本发明尤其涉及最佳温度位于30-50℃之间的酶。
制备脱乙酰酶的本发明方法，优选用选自本申请中说明的微生物组的微生物进行。
可以按照Shimahara、Kenzo和Takiguchi、Yasuyuki说明的方法(酶学方法(Methods in Enzymology)，161卷，417-423页，1988年)获得蟹壳多糖，或者在Sigma公司购得。
为了提纯脱乙酰酶，将微生物在适于它们生长的最佳营养培养基中培养。在有氧条件下进行微生物的培养，例如在振摇或搅拌下，在摇瓶中或发酵罐中，适当时注入空气或氧气的条件下，进行深层培养。可以在约20-40℃的温度范围内，优选在约25-37℃，尤其是在30-37℃的温度范围内进行发酵作用。在5-8.5的pH值范围内，优选在5.5-8.0的pH值范围内进行培养。
在这些条件下，一般在1-3天以后微生物显示明显的酶累积。脱乙酰酶的合成从对数期开始。可以借助于通过HPLC分析或光度测定法的活性试验监测酶的产量。制备转氨酶所应用的营养液含有0.2-5％，优选0.5-2％蟹壳多糖以及无机盐。
营养液中可以含有的无机盐例如是碱金属或碱土金属，铁，锌，锰的氯化物、碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐，还可以含有铵盐和硝酸盐。
按照本发明，可以应用有效量的游离形式或固定形式的脱乙酰酶进行脱乙酰化作用，优选应用于表达deac基因的植物内。
可以考虑已知的方法进行固定，例如在德国公开说明书32 37 341和32 43 591中说明的方法。
可以按照经典方法通过超声和法兰西加压法、硫酸铵沉淀法、离子交换法、亲和色谱法和凝胶渗透法进行分离，可以分离和提纯酶。
酶制剂的分子量可以为20,000-100,000道尔顿，优选为30,000-80,000，尤其是40,000-70,000道尔顿。酶产物的最佳pH值在6.0-10.0范围内，尤其是7.0-8.0范围内。酶的最佳温度在30-50℃范围内，尤其是在35-45℃范围内。
在大肠杆菌内克隆编码脱乙酰酶的基因。在寡养单胞菌属种deac1基因的情况下，对大肠杆菌中的基因组DNA噬菌粒表达库进行N-乙酰基-PPT特异性脱乙酰酶活性的筛选。通过大肠杆菌-argE突变体的互补作用，利用基因组文库克隆食酸丛毛单胞菌的deac2基因。
由二种基因的DNA序列衍生的氨基酸序列相互类似，并且还与马尿酸水解酶具有同源性，正如由蛋白质数据库已知的那样。
deac1蛋白质对N-乙酰基-L-PPT具有高底物亲和力(Km＝670μM)，这使得转基因植物组织具有对这种物质的高度敏感性的特征。这样，组成型表达deac基因时，所获植物的叶片对0.4mg/ml以下浓度的N-乙酰基-D，L-PPT(＝0.2mg/ml L-对映体)尚有敏感反应。在绒毡层特异性表达时，通过用2mg/ml N-乙酰基-D，L-PPT(＝1mg/ml L-对映体)处理花蕾，可以诱导出雄性不育花朵。所说明的结果针对的是温室植物。由于物质浓度较低，在露天条件下需要时，完全可以将剂量增加5-10倍。
以下实施例进一步阐述本发明。如果没有另作说明，则百分数均指重量。本发明在权利要求书中进行了进一步定义。
实施例1：具有N-乙酰基-PPT特异性的脱乙酰酶活性的土壤微生物的分离和鉴定
用10mM氯化钠、10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)，将每1g土壤(砂质粘土、Schwanheimer沙丘)在室温下萃取1小时。为了筛选各组微生物，将土壤上清液接种至以下液体培养基中：
1)MS1培养基(用于真细菌)：        5mM葡萄糖
                                 5mM琥珀酸盐
                                 10mM甘油
                                 1g/l NH4Cl
                                 50ml/l溶液A
                                 25ml/l溶液B
                                 溶液A：50g/l K2HPO4
                                 溶液B：2.5g/l MgSO4
                                 0.5g/l NaCl
                                 25ml/l微量元素
2)壳多糖培养基(适于放线菌和链霉菌以及壳质细菌)：
                                 10g/l蟹壳多糖
                                 1g/l(NH4)2SO4
                                 0.5g/l MgSO4
                                 50ml/l溶液A
                                 1ml/l微量元素
3)抗生素培养基(适于较高级真菌)： 20g/l麦芽提取物
                                 10g/l葡萄糖
                                 2g/l酵母提取物
                                 0.5g/l(NH4)2SO4
                                 50μg/ml四环素
所有的培养基中均含有5mM N-乙酰基-PPT，并且在细菌接种后在28℃下培养3-5天。
然后测试各浓缩培养物对N-乙酰基-PPT的脱乙酰化作用。为此，将细胞在10000rpm下离心，并在氨基酸分析仪(Biotronic LC 5001)中检测上清液中PPT的形成。结果是仅有壳多糖培养基培养物显示脱乙酰酶阳性。在壳多糖琼脂上铺板后，从这些培养物总共分离出40个菌落，在壳多糖液体培养基中再次培养这些菌落并重新测试脱乙酰酶活性。其间发现6个阳性分离物，由此可以通过在琼脂平板上重复划线并继续培养单个菌落，即可以获得活性纯培养物。具有最高脱乙酰酶活性的菌株被鉴定为寡养单胞菌属种(DSM保藏号DSM 9734)。
实施例2：寡养单胞菌属种的N-乙酰基-PPT脱乙酰酶基因的克隆和测序
该工作所应用的分子生物学标准方法，已经由Maniatis等，1982年，分子克隆：  实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港(MolecularCloning：a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor)，N.Y.进行了描述。
按照Meade等，1982年，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，149期，114-122页中的方法，制备寡养单胞菌属种的基因组DNA。用Sau3A部分消化后，分离出5-10 kb大小的部分，连接到已用BamHI切割的来自Stratagene的λ-ZAP表达载体中，(ZAP表达载体试剂盒，索引号239201，指导手册(Instruction Manual))连接。用包装好的连接物制备原代λ噬菌体文库，然后扩增。借助于Stratagene的pBK-CMV噬菌粒系统(索引号212209，指导手册)，由此制备大肠杆菌中的噬菌粒表达文库。用[14C]-N-乙酰基-L-PPT作为底物，通过活性筛选检测该基因文库中脱乙酰酶基因的存在。为此，将2000个单克隆接种至微滴定板中，并且在含有0.2mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导物和50μg/ml卡那霉素作为抗性标记的LB-培养基中在37℃下培养过夜。将细胞离心，28℃下在10μl 1mM[14C]-N-乙酰基-L-PPT中培养过夜。接着分成8群，通过薄层层析和放射自显影分析各批将N-乙酰基-PPT转变成PPT的情况(参见EP 531 716，实施例8)，在阳性结果时再次测定各个克隆。用这种方法，可以从1920个转化子选择出带有6kb插入物的一个阳性克隆。通过限制性作图更详细鉴定这一DNA片段。通过将插入物的限制性片段亚克隆至pUC18/19中，并将重组质粒转化至大肠杆菌内，就可以借助于以上说明的活性试验，将deac结构基因定位于2.5kb(2487个碱基对)Sall/Smal片段上(图1)。其活性取决于该片段相对于载体的lac启动子的方向。
用Sanger方法(Sanger等，1977年，美国国家科学院学报，74期，5463-5468页)对该2.5kb片段在两条链上测序。整个片段长为2487个核苷酸(见SEQ ID NO.1)。长为1494个核苷酸的开放阅读框开始于第367位核苷酸，终止于第1860位核苷酸。
此范围内的PCR亚片段在大肠杆菌内的表达研究表明，活性脱乙酰酶蛋白质由具有1365个核苷酸的一个区域所编码，该区始于496位的ATG起始密码子，终于1860位的TGA终止密码子。由该DNA序列衍生的氨基酸序列为具有454个氨基酸(SEQ ID NO 2)的多肽，其计算分子量为48.1kDa。
在EMBL、DNA和蛋白质数据库内进行的同源性检索显示与以下物质有相似性：本申请中首次说明的来源于食酸丛毛单胞菌的N-乙酰基-PPT脱乙酰酶(37.4％的氨基酸相同)、来源于空肠弯曲杆菌的马尿酸水解酶(33.9％)和来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的N-酰基-L-酰氨基水解酶(33.7％)。下面将由寡养单胞菌分离出来的基因称为deac1。相应的蛋白质称为Deac1。由于具有同源性，所以可以推测，可以将所列举的马尿酸水解酶和酰氨基水解酶与组织特异性的启动子联合，接着进行处理以制备具有可选择性破坏的组织的植物，尤其是雄性和/或雌性不育植物。
实施例3：Deac1蛋白质的鉴定
为了过表达和提纯来源于寡养单胞菌属种的脱乙酰酶(deac1)，应用Pharmacia(目录号27-4581-01、目录号27-4570-01)的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合载体系统。方法已经在Smith和Johnson，1988年，基因(Gene)67∶31中说明。通过用谷胱甘肽-Sepharose 4B进行亲和层析，将融合蛋白提纯。
将功能性deac基因作为1.4kb BamHI/Sall-PCR片段，重新克隆至GST融合载体pGEX-4T-2中，处于lac启动子的控制下。通过添加0.1mMIPTG诱导重组融合蛋白质的表达。通过对大肠杆菌转化体的粗提取物进行SDS/聚丙烯酰胺电泳，可以检测到融合蛋白质，这是一条74kDa条带。
为了提纯蛋白质，用超声，将经诱导的表达阳性的大肠杆菌转化体的2升培养物的细胞分解，接着通过添加1％Triton X-100使提取液溶解。将上清液与谷胱甘肽-Sepharose 4B结合。用PBS缓冲液(140mMNaCl，3mM KCL，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH＝7.3)多次洗涤后，用凝血酶切割结合于Sepharose基质的融合蛋白质。洗脱液含有48kDa切割产物这条唯一的蛋白质带(变性SDS/聚丙烯酰胺电泳后)，它在酶测定法(见下文)中被证实为N-乙酰基-PPT脱乙酰酶。按照说明的方法，由2升细菌培养物可以提纯出200μg均质的脱乙酰酶蛋白质。
用以下二种测定法测定脱乙酰酶蛋白质的活性：
1)放射活性试验：将2.5μg各提纯酶在PBS缓冲液中的10μl溶液内与0.1mM[14C]-N-乙酰基-L-PPT在37℃下温育15分钟。接着将样品按1∶6在5mM KH2PO4、10％甲醇，pH＝1.92中稀释，并在HPLC中用放射活性检测仪分析(分离柱：Spherisorb SAX，洗脱剂：5mM KH2PO4，10％甲醇，pH＝1.92，流速：0.5毫升/分钟)。在此条件下，[14C]-L-PPT在4.5分钟洗脱下来，[14C]-N-乙酰基-L-PPT在6.5分钟洗脱下来。以[纳摩尔[14C]-L-PPT/分钟/毫克蛋白质]测定脱乙酰酶比活性。为了测得最佳pH值，将各份溶液在pH6-9范围之间的40mMbis-tris，tris和Caps缓冲液系统中温育。为了测定Km值，在1mM CoCl2存在的条件下，用浓度在0.01mM-1mM之间的[14C]-N-乙酰基-L-PPT，在pH8.0进行3次测定。
2)非放射活性试验：为了检测底物特异性，将各5μg提纯酶，在20μl含25mM某种N-乙酰基-氨基酸或N-酰基-氨基酸的PBS缓冲液的体积中，在28℃下温育60分钟。接着将样品在氨基酸分析仪(Biotronic LC5001)中测定游离氨基酸的产生。以[纳摩尔氨基酸/分钟/毫克蛋白质]测定比活性。对于N-乙酰基-PPT脱乙酰酶，测得其最佳pH值为8(参见表1)，最佳温度为37℃(参见表2)。动力学测定得出Km值为670μM。通过添加1mM CoCl2，酶活性可以提高约20％。
表1：N-乙酰基-PPT脱乙酰酶的最佳pH值
pH值       比活性[摩尔/分钟/毫克蛋白质]
6          2.4
7          7.2
8          12.0
9          8.5
表2：N-乙酰基-PPT脱乙酰酶的最佳温度
温度[℃]   比活性[纳摩尔/分钟/毫克蛋白质]
28         9.6
37         16.8
50         14.9
60         4.3
底物特异性的测定结果见于表3。
该酶具有相对较宽的底物范围。对马尿酸(N-苯甲酰基甘氨酸)和N-乙酰基-L-谷氨酸获得最高转化。对N-乙酰基-L-PPT的亲和力约低于对上述两种底物亲和力的50％。该脱乙酰酶对N-乙酰基-L-氨基酸具有唯一的特异性。用相应的D-对映体则观察不到反应。
表3：N-乙酰基-PPT脱乙酰酶的底物特异性
底物1                         相对活性2[％]
马尿酸(N-苯甲酰基-甘氨酸)      100
N-乙酰基-膦丝菌素              43
N-乙酰基-鸟氨酸                37
N-乙酰基-甲硫氨酸              0
N-乙酰基-色氨酸                0.4
N-乙酰基-苯丙氨酸              24
N-乙酰基-酪氨酸                11
N-乙酰基-谷氨酸                100
N-乙酰基-谷氨酰胺              30
N-乙酰基-甘氨酸                59
N-乙酰基-组氨酸                43
N-乙酰基-亮氨酸                33
N-乙酰基-缬氨酸                2
N-乙酰基-丝氨酸                4
N-乙酰基-脯氨酸                0
1：所有的化合物均为L-对映体。
2：用马尿酸测定的比活性假设为100％，其它数值为其相对值。
实施例4：烟草内deac1基因的组成型表达
将deac1结构基因作为1.4kb BamHI/Sall PCT片段，重新克隆至二元载体pPCV801(Koncz和Schell，1986年，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)，204期，383-396页)内，处于35S启动子的控制之下。将所形成的带有表达载体35S启动子-deac1结构基因-35S终止子的质粒pPCVKDEAC1(附图2)通过标准方法转化至根瘤土壤杆菌(ATHV菌株)中。将烟草(Nicotiana tabacum)的叶片按照Horsch等，1985年，科学(Science)，227期，1229-1231页中的方法用重组土壤杆菌转化，然后在卡那霉素培养基上选择，再生18个独立的烟草转化体，测定叶片内的脱乙酰酶表达。在转基因植物内蛋白质有活性的情况下，预期叶片对N-乙酰基-PPT具有敏感性，这是因为，由于脱乙酰酶的酶催活性，在植物内该物质被转化成除草剂活性物质膦丝菌素。
在点滴试验中，分别用5μl以下浓度的N-乙酰基-D，L-PPT处理转基因植物以及多种非转基因的对照植物的叶片：4mg/ml(＝15mM)、1mg/ml(＝3.75mM)、0.4mg/ml(＝1.5mM)、0.1mg/ml(＝0.38mM)。1-2周后在处理部位检查是否颜色变浅或有坏死。同时在粗提取液中测定转化体以及对照植物的N-乙酰基-PPT特异性脱乙酰酶活性。为此，分别将100mg叶片材料在200μl PBS缓冲液中匀浆，将细胞碎片离心除去，将含有蛋白质的上清液在4℃下对相同的缓冲液透析过夜。将10μl每一样品与0.1mM[14C]-N-乙酰基-L-PPT在37℃温育过夜。接着在如上说明的HPLC中分析[14C]-L-PPT的产生。
所选择植物的点滴试验和活性试验的结果列于表4中。结果表明，约60％转化体表达功能性脱乙酰酶蛋白质，并显示相应的表型。
表4：pPCVKDEAC1植物对N-乙酰基-PPT的敏感性，以及粗提取液中的脱乙酰酶活性
植物 点滴试验，用：    粗提取液中的脱乙酰酶活性N-乙酰基-D，      1mg/ml  0.4mg/ml  0.1mg/ml  [％L-PPT]1L-PPT 4mg/ml
观察结果(叶片：)
对照 - - - - 0
pPCVK9 +++ + - - 14.2
pPCVK14 卷曲 + + - - 12.1
pPCVK15 卷曲 ++ + + - 36.0
pPCVK16 卷曲 + + - - 4.7
pPCVK17 卷曲 + + - - 4.3
1：相对于所应用的放射活性([14C]-N-乙酰基-L-PPT)
+++：严重坏死
++：明显损伤
+：颜色稍变浅
-：没有症状
实施例5：烟草中deac1基因的绒毡层特异性表达
应用标准方法，将金鱼草(Antirrhinum majus)tap1基因的绒毡层特异性启动子作为2.2kb EcoRI/BamHI片段，与deac1结构基因(1.4kb BamHI/Sall PCR片段)和35S终止子融合于载体pUC18中。将这样形成的表达盒tap1启动子-deac结构基因-35S终止子作为3.8kb EcoRI片段代替35S启动子/终止子区域而克隆入二元载体pPCV801中(质粒pPCVTDEAC1，附图3)。按照实施例4说明的方法转化烟草。
在脱乙酰酶的绒毡层特异性表达情况下，通过用N-乙酰基-PPT处理花蕾应可以诱发雄性不育花朵。PPT衍生物转化成除草活性物质膦丝菌素，导致选择性破坏绒毡层组织，由此抑制功能性花粉的产生。
每种情形下，将每个花序(生长花蕾的整个区)的仅仅一面用N-乙酰基-PPT处理，花序的另一面不作处理，以确保所观察到的现象不是因为植物的畸形发育所引起的。处理是在各个花蕾不大于5mm(绒毡层启动子活性期)时进行的。将烟草转化株以及多个NT Sam NN对照植物在1周内用0.2％N-乙酰基-D，L-PPT(＝7.5mM)/0.1％Genapol(润湿剂)处理3次。花蕾开花以后(处理结束后约9-11天)，检查植物出现雄性不育花朵的情况。
同时测定转化株以及对照植物未成熟花药内的N-乙酰基-PPT特异性脱乙酰酶活性。为此，将约5mm大小的花蕾的未成熟花药剥离下来，并且在室温下分别在50μM[14C]-N-乙酰基-L-PPT溶液内温育过夜。接着将花药在500μl PBS缓冲液中洗涤一次，然后在50μl PBS缓冲液中匀浆。细胞碎屑离心除去后，将上清液在Speed-Vac中浓缩，将沉淀各溶解于30μl HPLC缓冲液(5mM KH2PO4，10％甲醇，pH1.92)中。正如上面说明过的，在HPLC中分析各样品中[14C]-L-PPT的产生。
对所选择出来的植物进行花朵处理和活性试验的结果列于表5。几乎在所有的转化株中，可以证实有花药特异性脱乙酰酶活性。在3个转化株中，在花序的用N-乙酰基-PPT处理过的一面上，观察到雄性不育花朵(也即没有形成花粉)，或者花粉明显减少的花朵。对新的成熟花蕾的作用持续约3周的时间。转化株的未处理花朵、以及对照植物的处理花朵全部可育。在雄性不育花朵中未测得种子生成。然而，可以对雄性不育花朵进行异花授粉，由此已证实，其雌性花朵部分保存了完整的功能(Nacken等，1991年，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)，229期，129-136页)。
表5：通过用N-乙酰基-PPT处理pPCVTDEAC1植物花朵后诱导的雄性不育，和花药的脱乙酰酶活性
植物 不育花朵以及花粉减少花朵的数目 花药中的脱乙酰酶活性[％L-PPT]1
处理过的 未处理过的
对照 0 0 0
pPCVT14 18 0 70.0
pPCVT15 0 0 13.8
pPCT16 10 0 20.4
1：基于所应用的放射活性([14C]-N-乙酰基-L-PPT)
实施例6：从食酸丛毛单胞菌中分离对N-乙酰基-膦丝菌素具有特异性的脱乙酰酶并进行鉴定
将来源于曼谷的土壤样品悬浮于含有壳多糖(2g/l)作为唯一碳源的矿质盐培养基(0.5g K2HPO4，0.2g MgSO4，2g(NH4)2SO4、0.01g FeSO4，于980ml H2O中)中，接着在30℃下培养48小时。然后将细菌接种至新鲜的矿质盐培养基中，继续培养48小时后，将各稀释度铺板于LB培养基上(Miller，分子遗传学实验，冷泉港实验室出版社(Experimentsin molecular genetics，Cold Spring Harbour LaboratoryPress))。
在长成的菌落中有一种细菌菌株，其特征为，在纯培养基中能充分利用作为唯一碳源的N-乙酰基-谷氨酸(在含有N-乙酰基-谷氨酸(2g/l，作为无菌过滤溶液加至含有14g/l琼脂的经高压灭菌的矿质盐培养基中)的矿质盐培养基上划线，在30℃下培养12小时，产生明显可见的菌落)。如上述检测N-乙酰基-PPT的去乙酰化作用。实验室描述为B6的细菌菌株由DSM鉴定为食酸丛毛单胞菌(DSM11070)。
实施例7：对来源于食酸丛毛单胞菌的脱乙酰酶基因进行克隆
由食酸丛毛单胞菌分离出总DNA，用EcoRI消化，然后与载体pACYC184(Cang和Cohen，1978年，细菌学杂志(J.Bacteriol)，134期，1141-1156页)的同样经EcoRI消化过的DNA连接。连接液用于电穿孔转化大肠杆菌argE突变体XSID2(Mountain等，1984年，分子普通遗传学，197期，82-89页)。通过对精氨酸营养缺陷型的互补作用进行筛选，可以由食酸丛毛单胞菌基因组分离出8.9kb大小的EcoRI片段，它对互补作用已经足够。通过亚克隆，可以将互补区域限定于1.4kb大小的片段。它存在于测序载体pSVB30(Arnold和Puehler，1988年，基因(Gene)，70期，172-178页)的被称为pGK83的衍生物中。
实施例8：对来源于食酸丛毛单胞菌的脱乙酰酶基因进行测序
按照已知的方法对起互补作用的该1.4kb(1387个碱基对)片段通过双链完整测序。
实施例9：对测序区域进行编码区分析和同源性比较
编码区域分析显示有一个从位置1至1206(SEQ ID NO.3)的开放阅读框，其编码一种402个氨基酸大小的蛋白质(SEQ ID NO.4)。
与数据库内的已知基因进行同源性比较，结果显示与嗜热脂肪芽孢杆菌的N-酰基-L-酰氨基水解酶(ama，Sakanyan等，1993年，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)，59期，3878-3888页)明显同源，与来源于空肠弯曲杆菌的马尿酸水解酶(迄今尚无公开)明显同源。在蛋白质比较中，马尿酸水解酶具有43％的相同氨基酸(见表6)。此外，该基因在DNA水平和蛋白质水平与由寡养单胞菌属种分离的脱乙酰酶基因具有非常明显的同源性。根据由寡养单胞菌属种分离的该基因的命名，将来自食酸丛毛单胞菌的鉴定的所述基因称为deac2。
表6：与已知序列的同源性比较
基因 生物 功能 相同氨基酸 保守氨基酸
n.n 空肠弯曲杆菌 马尿酸水解酶(383AS) 43.1％ 60.0％
deac2 嗜热脂肪芽孢杆菌 N-酰基-L-酰氨基水解酶(370AS) 37.0％ 49.5％
实施例10：食酸丛毛单胞菌deac2基因的植物构建体的过量表达
为了分析来源于食酸丛毛单胞菌的deac2基因产物的底物特异性，将它过量表达。为此，将此基因克隆至高拷贝数载体中处于lacZ启动子的控制下。但是表达效率却因为在另外一种阅读框中同时进行的lacZ-α翻译而受到限制。因此，通过导入一个终止密码子而中断该过程，使载体pGK81能够进行不被lacZ基因破坏的deac2基因的过量表达。还可以根据表型进行检测，因为这种构建体对大肠杆菌argE突变体的互补作用更为显著。
为了转化植物，利用二元载体pROK1(Baulcombe等，1986年，自然，321期，446-449页)，将deac2结构基因重新克隆，处于组成型35S启动子或绒毡层特异性启动子TA-29之后。所获得的表达质粒pGK83和pMF9显示于附图中。
实施例11：来源于食酸丛毛单胞菌的deac2基因产物的底物特异性分析
为了分析来源于食酸丛毛单胞菌的deac2基因产物的底物特异性，应用经过甲苯/乙醇透化处理后带有或不带有载体pGK81的大肠杆菌菌株XL1 Blue细胞。通过IPTG处理，可以对受到该菌株中存在的Laci阻遏物阻遏的deac2基因进行诱导。将透化处理过的细胞与各种不同的N-乙酰化氨基酸(终浓度25mM)在30℃下温育3小时，然后借助于氨基酸分析仪分析上清液。结果表明：20％以上所应用的N-乙酰基-鸟氨酸被转化。对于N-乙酰基-膦丝菌素，同样发现，相应于所应用的N-乙酰基-膦丝菌素浓度，有增加的脱乙酰化作用生成膦丝菌素(表7)。
表7：通过deac2基因产物进行的N-乙酰化氨基酸的转化
N-乙酰基-鸟氨酸(25mM) N-乙酰基-苯丙氨酸(25mM) N-乙酰基-膦丝菌素(12.5mM)             (25mM)               (50mM)
5860nM ＜5nM 8.0nM 20.0nM 44.7nM
其中给出了所应用的N-乙酰化氨基酸的浓度和由脱乙酰化作用形成的氨基酸。
附图说明
附图1：介导N-乙酰基-PPT特异性脱乙酰酶活性的2.5kbSall/BamHI片段的限制性图谱。deac1结构基因的位置和方向以箭头标示(BP＝碱基对)。
附图2：用于deac基因在植物内组成型表达的质粒pPVCKDEAC1的图谱。
附图3：用于deac基因在植物内的绒毡层特异性表达的质粒pPCVTDEAC1的图谱。
附图4：质粒pGK83的图谱。
附图5：质粒pMF9的图谱。
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条目I中标识的微生物还附有()科学说明(X)所建议的分类名称(若有则打叉)
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IV.接受转换的请求
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名称：DSM-德国微生物和细胞培养物保藏有限公司地址：Mascheroder Weg 1b D-38124不伦瑞克 有权代表该国际保藏机构的个人或官员的签名(难以辨认的签名)日期：16-07-1996
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                        序列表
1)一般资料：
  (i)申请人：
     (A)名称：赫彻斯特-舍林农业发展有限公司
     (B)街道：-
     (C)城市：法兰克福
     (D)州名：-
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     (F)邮政编码：65926
     (G)电话：069-305-5596
     (E)传真：(+69)357175
     (F)电传：-
(ii)申请名称：编码对N-乙酰基-L-膦丝菌素具有特异性的氨基酸脱乙
              酰酶的新基因，其分离和应用
(iii)序列数：4
(iv)计算机可读形式
    (A)数据载体：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release #1.0，版本#1.25(EPO)
2)关于SEQ ID NO：1的资料：
    (i)序列特征：
       (A)长度：1365个碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (ix)特征：
        (A)名称/关键词：外显子
        (B)位置：1..1365
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1
ATGATCCGCA AGACCGTTCT GTTGACTGCG CTGTCCTGCG CCCTGGCCTC CGCGACAGCC     60
ACCGCCGCCG AAGGCCAGCG GCCCGAGGTG GAGGCCGCCG CCGCGCGCCT GCAGCGGCAG     120
GTGGTGGAGT GGCGCCGCGA TTTCCACCAG CATCCGGAGC TGTCCAACCG CGAGGTGCGC     180
ACCGCCGCCA AGGTGGCCGA GCGCCTGCGC GCGATGGGCC TGCAACCGCA GACCGGCGTC     240
GCCGTGCACG GCGTGGTGGC GATCATCAAG GGCGCCCTGC CGGGGCCGAA GATCGCCCTG     300
CGCGCGGACA TGGACGCGCT GCCGGTGACC GAACAGACCG GGCTGCCGTT CGCCTCCACC     360
GCCACGGCCG AGTACCGCGG CGAGAAGGTC GGGGTGATGC ATGCCTGCGG CCACGACGCC     420
CATACCGCCA CCCTGCTCGG CGTGGCCGAC GCGCTGGTGG CCATGCGCGA CACGCTGCCC     480
GGCGAAGTAA TGCTGATCTT CCAGCCGGCC GAGGAAGGCG CGCCGCCGCC GGAGCAGGGC     540
GGTGCCGAGC TGATGCTCAA GGAGGGGCTG TTCAAGGAGT TCAAGCCGGA GGCGGTGTTC     600
GGCCTGCACG TGTTCTCCAG CGTCCAGGCC GGGCAGATCG CCGTGCGCGG CGGCCCGCTG     660
ATGGCCGCCT CCGACCGCTT CGCCATCACC GTCAACGGCC GCCAGACCCA TGGCTCGGCG     720
CCCTGGAACG GCATCGATCC GATTGTCGCC GCCTCCGACC TGATCGGCAC CGCGCAGACC     780
ATCGTCAGCC GCCGCGCCAA CCTGTCCAAG CAGCCGGCGG TGCTGACCTT CGGCGCGATC     840
AAGGGCGGCA TCCGCTACAA CATCATCCCC GACTCGGTGG AGATGGTCGG CACCATCCGC     900
ACCTTCGACC CGGACATGCG CAAGCAGATC TTCGCCGACT TGCGCAACGT CGCCGAGCAC     960
ACCGCTGCCG CATGGCGCCA CCGCCACCAC CGACATCTAC GAGAAGGACG GCAACCCGGC     1020
CACGGTCAAC GACCCGGCGC TGACCGCGCG CATGCTGCCC AGCCTGCAGG CCGTGGTCGG     1080
CAAGGACAAC GTCTACGAGC CGCCGCTGCA GATGGGCTCG GAGGACTTCT CGCTGTATGC     1140
GCAGCAGGTG CCGGCGATGT TCTTCTTCGT CGGCTCCACC GGCGCGGGCA TCGACCCGGC     1200
CACCGCGCCC AGCAACCACT CGCCGAAGTT CCTGCTCGAC GAGAAGGCGC TGGACGTGGG     1260
CCTGCGCGCG CTGCTGCAGG TGTCGCTGGA CTATCTGCAC GGTGGCAAGG CGGGGTGACC     1320
CCTGCCAGTA TCGTGCCCCC GATACGGAAG AAGGACCTCC CATGA                     1365
2)关于SEQ ID NO：2的资料：
  (i)序列特征：
     (A)长度：454个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
  (ix)特征：
      (A)名称/关键词：蛋白质
      (B)位置：1..454
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2
Met Ile Arg Lys Thr Val Leu Leu Thr Ala Leu Ser Cys Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
Ser Ala Thr Ala Thr Ala Ala Glu Gly Gln Arg Pro Glu Val Glu Ala
            20                  25                  30
Ala Ala Ala Arg Leu Gln Arg Gln Val Val Glu Trp Arg Arg Asp Phe
        35                  40                  45
His Gln His Pro Glu Leu Ser Asn Arg Glu Val Arg Thr Ala Ala Lys
    50                  55                  60
Val Ala Glu Arg Leu Arg Ala Met Gly Leu Gln Pro Gln Thr Gly Val
65                  70                  75                  80
Ala Val His Gly Val Val Ala Ile Ile Lys Gly Ala Leu Pro Gly Pro
                85                  90                  95
Lys Ile Ala Leu Arg Ala Asp Me  Asp Ala Leu Pro Val Thr Glu Gln
            100                 105                 110
Thr Gly Leu Pro Phe Ala Ser Thr Ala Thr Ala Glu Tyr Arg Gly Glu
        115                 120                 125
Lys Val Gly Val Met His Ala Cys Gly His Asp Ala His Thr Ala Thr
    130                 135                 140
Leu Leu Gly Val Ala Asp Ala Leu Val Ala Met Arg Asp Thr Leu Pro
145                 150                 155                 160
Gly Glu Val Met Leu Ile Phe Gln Pro Ala Glu Glu Gly Ala Pro Pro
                165                 170                 175
Pro Glu Gln Gly Gly Ala Glu Leu Met Leu Lys Glu Gly Leu Phe Lys
            180                 185                 190
Glu Phe Lys Pro Glu Ala Val Phe Gly Leu His Val Phe Ser Ser Val
        195                 200                 205
Gln Ala Gly Gln Ile Ala Val Arg Gly Gly Pro Leu Met Ala Ala Ser
    210                 215                 220
Asp Arg Phe Ala Ile Thr Val Asn Gly Arg Gln Thr His Gly Ser Ala
225                 230                 235                 240
Pro Trp Asn Gly Ile Asp Pro Ile Val Ala Ala Ser Asp Leu Ile Gly
                245                 250                 255
Thr Ala Gln Thr Ile Val Ser Arg Arg Ala Asn Leu Ser Lys Gln Pro
            260                 265                 270
Ala Val Leu Thr Phe Gly Ala Ile Lys Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Ile
        275                 280                 285
Ile Pro Asp Ser Val Glu Met Val Gly Thr Ile Arg Thr Phe Asp Pro
    290                 295                 300
Asp Met Arg Lys Gln Ile Phe Ala Asp Leu Arg Asn Val Ala Glu His
305                 310                 315                 320
Thr Ala Ala Ala Trp Arg His Arg His His Arg His Leu Arg Glu Gly
                325                 330                 335
Arg Gln Pro Gly His Gly Gln Arg Pro Gly Ala Asp Arg Ala His Ala
            340                 345                 350
Ala Gln Pro Ala Gly Arg Gly Arg Gln Gly Gln Arg Leu Arg Ala Ala
        355                 360                 365
Ala Ala Asp Gly Leu Gly Gly Leu Leu Ala Val Cys Ala Ala Gly Ala
    370                 375                 380
Gly Asp Val Leu Leu Arg Arg Leu His Arg Arg Gly His Arg Pro Gly
385                 390                 395                 400
His Arg Ala Gln Gln Pro Leu Ala Glu Val Pro Ala Arg Arg Glu Gly
                405                 410                 415
Ala Gly Arg Gly Pro Ala Arg Ala Ala Ala Gly Val Ala Gly Leu Ser
            420                 425                 430
Ala Arg Trp Gln Gly Gly Val Thr Pro Ala Ser Ile Val Pro Pro Ile
        435                 440                 445
Arg Lys Lys Asp Leu Pro
    450
2)关于SEQ ID NO：3的资料：
  (i)序列特征：
     (A)长度：1273个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (ix)特征：
      (A)名称/关键词：外显子
      (B)位置：1..1273
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：3
ATGGCCTTGC TGCAGGAGCT GCTGGACAGC GCACCCGAGA TCACCGCGCT GCGCCGCGAC    60
ATACATGCCC ATCCCGAACT GTGCTTCGAG GAACTGCGCA CCGCCGACCT GGTGGCCCGG    120
CAGCTCGAAG GCTGGGGCAT TGCCGTGCAC CGCGGCCTGG GCCGCACGGG CGTGGTGGGC    180
ACCATCCACG GCCGTGACGG CGGCGCCAGC GGCCGGGCCA TCGGGCTGCG CGCCGACATG     240
GACGCCCTGC CCATGCAGGA GTTCAACACC TTCGAGCACG CCAGCCGCCA CGCCGGAAAA     300
ATGCATGCCT GCGGACATGA CGGCCATGTC GCCATGCTGC TGGCCGCCGC GCAGTACCTG     360
GCCGTGCACC GCGACAGCTT CGAGGGCACG GTGCACCTGA TCTTCCAGCC GGCCGAAGAG     420
GGCGGCGGCG GGGCGCGCGA GATGGTCGAG GACGGCCTGT TCACCCAGTT CCCCATGCAG     480
GCCGTGTTCG GCATGCACAA CTGGCCGGGC ATGAAGGCCG GCACCATGCC GTGGGCCCCG     540
GGCCCGGCCA TGGCGTCGAG CAACGAGTTC CGCATCGTCG TGCGCGGCAA GGGCGGCCAC     600
GCGGCCATGC CGCACATGGT GATCGACCCG CTGCCCGTGG CGGCCCAGCT CATCCTGGGC     660
CTGCAGACCA TCGTCAGCCG CAACGTCAAG CCCATCGAGG CGGGCGTGGT CTCGGTCACC     720
ATGGTCCATG CGGGCGAGGC CACGAACGTG GTGCCCGACA GCGTGGAGCT GCAGGGCACG     780
GTGCGCACCT TCACGCTGGA GGTGCTGGAC CTGATCGAGC GGCGCATGAA GGCCCTGGCC     840
GAGAGCATCT GCGCGGCGCA TGACACGCGC TGCGAGTTCG AGTTCGTGCG CAACTACCCG     900
CCCACCATCA ACTCCGCCCC GGAGGCCGAG TTCGCACGCC GCGTCATGGC CGAGGTCGTG     960
GGCGAGGCCA ACGTGCTGCC CCAGGAGCCG TCCATGGGCG CCGAGGACTT CGCCTTCATG    1020
CTGCTGGAAA AGCCCGGCGC CTACTGCTTC ATCGCCAATG GCGACGGCGA CCACCGCGCC    1080
ATCGGCCACG GCGGCGGTCC CTGCACGCTG CACAACCCCA GCTACGACTT CAACGACCAG    1140
CTGATTCCGC AGGGCGCCAC GTTCTGGGTG AAGCTGGCCC AGCGCTGGCT GAGCGAGCCC    1200
ACGCGCTGAG GCCTTGCGGG GTCCGGCCGA CACCGGCATG TCACACACCG CACCTAGCAT    1260
GCGGTCCCTG TGA                                                       1273
2)关于SEQ ID NO：4的资料：
  (i)序列特征：
     (A)长度：402个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
  (ix)特征：
      (A)名称/关键词：蛋白质
      (B)位置：1..402
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：4
Met Ala Leu Leu Gln Glu Leu Leu Asp Ser Ala Pro Glu Ile Thr Ala
1               5                   10                  15
Leu Arg Arg Asp Ile His Ala His Pro Glu Leu Cys Phe Glu Glu Leu
            20                  25                  30
Arg Thr Ala Asp Leu Val Ala Arg Gln Leu Glu Gly Trp Gly Ile Ala
        35                  40                  45
Val His Arg Gly Leu Gly Arg Thr Gly Val Val Gly Thr Ile His Gly
    50                  55                  60
Arg Asp Gly Gly Ala Ser Gly Arg Ala Ile Gly Leu Arg Ala Asp Met
65                  70                  75                  80
Asp Ala Leu Pro Met Gln Glu Phe Asn Thr Phe Glu His Ala Ser Arg
                85                  90                  95
His Ala Gly Lys Met His Ala Cys Gly His Asp Gly His Val Ala Met
            100                 105                 110
Leu Leu Ala Ala Ala Gln Tyr Leu Ala Val His Arg Asp Ser Phe Glu
        115                 120                 125
Gly Thr Val His Leu Ile Phe Gln Pro Ala Glu Glu Gly Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Ala Arg Glu Met Val Glu Asp Gly Leu Phe Thr Gln Phe Pro Met Gln
145                 150                 155                 160
Ala Val Phe Gly Met His Asn Trp Pro Gly Met Lys Ala Gly Thr Met
                165                 170                 175
Pro Trp Ala Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser Ser Asn Glu Phe Arg Ile
            180                 185                 190
Val Val Arg Gly Lys Gly Gly His Ala Ala Met Pro His Met Val Ile
        195                 200                 205
Asp Pro Leu Pro Val Ala Ala Gln Leu Ile Leu Gly Leu Gln Thr Ile
    210                 215                 220
Val Ser Arg Asn Val Lys Pro Ile Glu Ala Gly Val Val Ser Val Thr
225                 230                 235                 240
Met Val His Ala Gly Glu Ala Thr Asn Val Val Pro Asp Ser Val Glu
                245                 250                 255
Leu Gln Gly Thr Val Arg Thr Phe Thr Leu Glu Val Leu Asp Leu Ile
            260                 265                 270
Glu Arg Arg Met Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Cys Ala Ala His Asp
        275                 280                 285
Thr Arg Cys Glu Phe Glu Phe Val Arg Asn Tyr Pro Pro Thr Ile Asn
    290                 295                 300
Ser Ala Pro Glu Ala Glu Phe Ala Arg Arg Val Met Ala Glu Val Val
305                 310                 315                 320
Gly Glu Ala Asn Val Leu Pro Gln Glu Pro Ser Met Gly Ala Glu Asp
                325                 330                 335
Phe Ala Phe Met Leu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Tyr Cys Phe Ile Ala
            340                 345                 350
Asn Gly Asp Gly Asp His Arg Ala Ile Gly His Gly Gly Gly Pro Cys
        355                 360                 365
Thr Leu His Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Asn Asp Gln Leu Ile Pro Gln
    370                 375                 380
Gly Ala Thr Phe Trp Val Lys Leu Ala Gln Arg Trp Leu Ser Glu Pro
385                 390                 395                 400
Thr Arg

Claims (9)

1.编码具有N-乙酰基-膦丝菌素脱乙酰酶生物学活性的蛋白质的DNA分子，其中包含选自下组的编码序列：
a)从保藏号为DSM9734的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)分离的DNA分子的编码序列；和
b)从保藏号为DSM11070的食酸丛毛单胞菌(Comamonasacidovorans)分离的DNA分子的编码序列。
2.根据权利要求1的DNA分子，其编码具有SEQ ID No.4氨基酸序列的蛋白质。
3.根据权利要求2的DNA分子，其含有SEQ ID NO.3的核苷酸序列。
4.由权利要求1-3中任一项的DNA分子编码的蛋白质。
5.保藏号为DSM 9734的寡养单胞菌。
6.保藏号为DSM 11070的食酸丛毛单胞菌。
7.含有权利要求1-3中任一项的DNA分子的植物细胞。
8.通过脱乙酰酶基因的特异性表达制备其具有可被特异性地破坏之部分的植物的方法，所述方法包括：
a)用脱乙酰酶基因转化植物细胞，所述基因包含权利要求1-3中任何一项的DNA分子，处于能指导其在特异植物部分中表达的启动子控制之下；
b)由该植物细胞再生出所述植物；和
c)通过脱乙酰酶基因的表达，由所述再生的转化植物获得具有可被特异性地破坏之部分的转化植物。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于通过所述脱乙酰酶基因的特异性表达而得到条件性雄性或雌性不育植物。
CNB971806055A 1996-12-16 1997-12-03 编码对n-乙酰基-l-膦丝菌素具有特异性的氨基酸脱乙酰酶的新基因，其分离和应用 Expired - Fee Related CN1171993C (zh)

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