CN1202244C

CN1202244C - 具有天冬氨酸酶活性的蛋白和编码该蛋白的基因dna

Info

Publication number: CN1202244C
Application number: CN 98102480
Authority: CN
Inventors: 渡辺文昭; 汤不二夫
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-06-06
Publication date: 2005-05-18
Anticipated expiration: 2018-06-06
Also published as: JPH10337185A; FR2764303A1; CN1211619A; FR2764303B1

Abstract

本发明提供了一种具有天冬氨酸酶活性的新蛋白、编码该蛋白的基因DNA、包括该基因DNA的重组质粒、导入有该重组质粒的转化子、及用该转化子制备L-天冬氨酸的方法。通过使用具有多拷贝上述基因的本发明转化子微生物，可从延胡索酸和氨有效地制备L-天冬氨酸。

Description

具有天冬氨酸酶活性的蛋白和编码该蛋白的基因DNA

技术领域

本发明涉及具有天冬氨酸酶活性的新的蛋白、编码该蛋白的基因DNA、包括该基因DNA的重组质粒、该重组质粒被导入其中的转化子和用该转化子制备L-天冬氨酸的方法。

L-天冬氨酸用作药品、食物添加剂等。最近，L-天冬氨酸也作为表面活性剂和生物可降解的螯合剂的原材料而受到重视。

背景技术

L-天冬氨酸主要通过酶学方法从延胡索酸和氨用天冬氨酸酶制备，作为编码天冬氨酸酶的基因，已知的有源自大肠杆菌的基因[普通微生物学杂志，130，1271-1278(1984)]和源自黄色短杆菌MJ-233的基因(日本未审查的专利公报NO.5-30977)。

发明内容

寻找除了上述那些基因外的编码天冬氨酸酶的基因以更为有效地制备L-天冬氨酸是本发明的目的。

由于为了完成上述目的而进行深入广泛地研究，本发明者从红球菌属细菌中分离出一种具有天冬氨酸酶活性的新的蛋白和编码该蛋白的基因。这样，本发明得以完成。

本发明涉及：

(1)一种具有天冬氨酸酶活性的蛋白，其具有显示于SEQ ID NO：1中的氨基酸序列或具有显示于SED ID NO：1中氨基酸序列但具有一个或更多个氨基酸的缺失、替代或添加；

(2)编码该蛋白的基因DNA；

(3)通过连接该基因DNA与载体质粒而获得的重组质粒；

(4)通过将重组质粒导入宿主微生物而获得的转化子；

(5)用于通过培养该转化子而制备上面(1)中蛋白的方法；和

(6)在上面(4)中的转化子或(1)中的蛋白存在下通过将延胡索酸或其盐与氨或其盐起反应而制备L-天冬氨酸的方法。

附图说明

图.1为重组质粒PAR002的限制性图谱。双线代表载体PUC118，且单线代表EA4菌株的DNA区域。EA4菌株DNA区域中的黑体箭头表示由本发明发现的天冬氨酸酶基因的位置和方向。

图.2为重组质粒PAR016的限制性图谱。双线代表源自质粒PSJ034的区域，且单线代表EA4菌株的DNA区域。EA4菌株DNA区域中的黑体箭头显示由本发明发现的天冬氨酸酶基因的位置和方向。

图.3为解释质粒PSJ034的图。

图.4显示构建质粒PSJ034的步骤。

具体实施方式

作为产生具有天冬氨酸酶活性本发明蛋白及编码该蛋白基因DNA的微生物的具体实例，可给出红球菌SP·EA4(FERM BP-6231)。

用于本发明的宿主微生物没有特别的限制。具体地，可列举上述的EA4菌株及胭脂红分枝杆菌ATCC 12674、ATCC 17041、ATCC 17895、ATCC 19140及ATCC 33258。

这些菌株中，EA4菌株以上述的许可号保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，且其细菌学特征在日本未审查的专利公报NO.4-304892中加以描述。菌株ATCC 12674、ATCC 17041、ATCC 17895、ATCC 19140及ATCC 33258可容易地从美国典型培养物保藏中心获得。

下面，将参照下面的实施例对本发明加以更为详细的描述，这决不意味着限制本发明的范围。

实施例1

(1)从EA4菌株中制备染色体DNA

将EA4菌株在30℃于100ml MY培养(0.5％聚胨，0.3％bacto-酵母提取物，0.3％bacto-malt提取物，1％葡萄糖)中振荡培养72小时。然后，收获细胞并悬浮于4ml含盐的EDTA溶液中(0.1M EDTA，0.15M Nacl(PH8.0))。向悬液中加入8mg溶菌酶并于37℃振荡1-2小时。然后，将得到的悬液冷冻。随后，向其中加入10ml Tris-SDS溶液(1％SDS，0.1M Nacl，0.1M Tris-Hcl(PH9.0))并同时轻轻振荡。此外向其中加入蛋白酶K(Merck)(终浓度：0.1mg/ml)并于37℃振荡1小时。向得到的悬液中加入等体积TE-饱和的酚(TE：10mMTris-Hcl，1mm EDTA(PH 8.0))，摇匀并离心。收集上层物并向其中加入2体积的乙醇。然后，用玻棒缠绕DNA。用90％、80％及70％的乙醇以该顺序去除酚。随后，将DNA溶解于3ml TE缓冲液中。向此溶液中加入核糖核酸酶A溶液(100℃预处理15分钟)以得到10μg/ml的浓度并且于37℃振荡30分钟。此外，向其中加入蛋白酶K并于37℃振荡30分钟，然后加入TE-饱和的酚。将得到的溶液离心以分成上层和下层。对上层重复两次相同的操作。然后，向其中加入等体积氯仿和异戊醇的混合液(24∶1)，并且重复相同的提取操作(之后，此操作称为“酚处理”)。随后，向得到的上层物中加入2体积的乙醇，并且将DNA缠绕到玻棒上以获得染色体DNA样品。

(2)探针的制备

将10μl在步骤(1)中获得的染色体DNA(1/20稀释液)，10μl 10×反应缓冲液，3μl 50mM MgCl₂，2μl 10mM DNTP，1μl(相当于100pmol)每种显示于SEQ ID NO：4中的寡核昔酸作为引物#1及显示于SEQ ID NO：5中的寡核昔酸作为引物#2以及1μl Tag DNA聚合酶(GIBCO BRL)混合在一起以制备100μl的溶液。上面的每种引物根据在各种已知天冬氨酸酶中高度保守的区域加以设计。得到的溶液进行30轮孵育，每个循环由93℃变性30秒，55℃退火30秒及72℃延伸2分钟所组成。反应完成后，用氯仿抽提3次，接着通过乙醇沉淀回收扩增的DNA。用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离该DNA以获得约600bp的DNA片段，该片段被认为是编码EA4菌株天冬氨酸酶基因的一部分。这样获得的DNA片段以DIG DNA标记试剂盒(宝灵曼)标记以制备探针。

(3)DNA文库的制备

向200mlEA4菌株染色体DNA中加入40μl 10×限制酶缓冲液，145μl无菌水及15μl限制酶并于37℃反应6小时。然后，乙醇沉淀以回收DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中切下约8kb的DNA片段并且DNA PREP(DIAIATRON)进行回收。用连接试剂盒(Takara Shuzo)将此DNA片段插入到大肠杆菌载体PUC118的BamHI位点以制备重组DNA文库。

用于连接中的PUC118片段按如下制备。向10μl PUC118中，加入10μl10×限制酶溶液，77μl无菌水及2μl限制酶Bam HI并于37℃反应2小时。之后，进行酚处理和乙醇沉淀。将得到的DNA干燥且然后溶解于50μl无菌水中。向该溶液中加入1μl碱性磷酸酶，10μl 10×缓冲液及39μl无菌水并于65℃反应。之后，进行酚处理和乙醇沉淀。将得到的DNA干燥并溶于无菌水中。

(4)转化子的制备和重组DNA的筛选

将大肠杆菌JM109菌株接种于1mlLB培养基(1％bacto-胰蛋白胨，0.5％bacto-酵母提取物，0.5％NaCl)并于37℃培养5小时。向100μl得到的培养物中加入50mlSOB培养基(2％bacto-胰蛋白胨，0.5％bacto-酵母提取物，10mM Nacl，2.5mM Kcl，1mM MgSO₄1mM MgCl₂)并于18℃培养20小时。然后，离心收获细胞。向该细胞中加入13ml冰凉的TF溶液(20mM PIPES-KOH(PH6.0)，200mM Kcl，10mM CaCl₂，40mM MnCl₂)，让其于0℃置10分钟并重新离心。去上清后，将沉淀的大肠杆菌悬于3-2ml的冰凉TF溶液中。向得到的悬液中加入0.22ml二甲基亚砜并让其于0℃放置10分钟。向200μl这样制备的感受总细胞中加入10μl含有上面步骤(3)中制备的重组质粒(即，DNA文库)溶液。然后，42℃热休克30秒，并将混合物于0℃冰凉2分钟。之后，向其中加入0.8ml SOC培养基(2％bacto-胰蛋白胨，0.5％bacto-酵母提取物，20mM葡萄糖，10MM NaCl，2.5MM KCl，1MM MgSO₄，1MM MgCl₂)。细胞于37℃振荡培养60分钟。将得到的培养物铺板于200μl等份的LB琼脂培养基上于30℃培养，培养基中含有100μl/ml氨苄青霉素。通过菌落杂交从生长于琼脂培养基一的转化子菌落中筛选具有天冬氨酸酶基因的转化子。简言之，将琼脂培养基上生长出的转化子菌落转移至尼龙膜(BIODYNEA；Nihm Pall有限公司)，接着裂解细胞并固定DNA。然后，以上面步骤(2)中制备的探针(约600kb片段)处理膜。DIG发光检测试剂盒(宝灵曼)筛选含有感兴趣重组DNA的菌落。

(5)重组质粒的制备

将上面步骤(4)中筛选出的转化子于100ml LB培养基中于37℃培养过夜。收获细胞并以无菌水洗。向该细胞中加入5ml溶液I(2mM葡萄糖，10mMEDTA，25mM Tris-Hcl(PH8.0))及25mg溶菌酶并让其于0℃放置30分钟。此外，加入10ml溶液II(1N NaOH，5％SDS)并让其于0℃放置5分钟。之后，加入7.5ml溶液III(3M醋酸钠(PH4.8))并让其于0℃放置30分钟。将得到的混合物离心。向上清中，加入50ml乙醇并再离心。然后，去上清。向沉淀中加入5ml溶液IV(10mM醋酸钠，50mMTris-Hcl(PH8.0))及2.5μl核糖核酸酶A溶液(10mg/ml)并让其于室温放置20分钟。向得到的混合物中，加入12ml乙醇。然后，离心回收质粒，以70％乙醇冲洗，干燥并溶解于0.4ml无菌水中。酚处理后，通过乙醇沉淀回收质粒，干燥并溶于0.4ml无菌水中。这样获得的重组质粒命名为PAR002。该重组质粒PAR002，已作为转化于大肠杆菌JM109/PAR002，以许可号FERM BP-6233保藏于日本通商产生省工业技术院生命工学工业技术研究所。

(6)限制性图谱的制备和探针杂交区域的测定

通过以几种限制酶消化在上面步骤(5)中获得的质粒PAR002而制备限制性图谱(图1)。此外，PAR002以限制酶Kpn I｀BgI II、Pst I、Sal I等消化并进行琼脂糖凝胶电泳。然后，进行Southern杂交以确定探针杂交的片段。

(7)核苷酸序列的测定

在上面步骤(6)中确定区域的侧翼区核昔酸序列及确定区域本身的核昔酸序列用发码西亚荧光测序议ALF II加以测定。结果，获得如SEQ ID NO：3中显示的核昔酸序列。其中发现了一个开放阅读框，其具有显示于SEQ ID NO：1中的氨基酸序列。与氨基酸序列数据库NBRF(国立生物医学研究基地)比较，发现目的基因与已知的天冬氨酸酶在氨基酸序列水平有50-60％的同源性；并且目的多肽也在已知天冬氨酸酶高度同源区具有高度同源性。因此，认为此多肽可能为一种新的天冬氨酸酶。此开放阅读框的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：2中。

实施例2

(1)质粒PAR016的制备

将10μl PAR002(1/20稀释液)，10μl 10×反应缓冲液，3μl 50mMMgCl₂，2μl 10mM 4NTP，1μl(相当于100pmol)显示于SEQ ID NO：6中的每种寡核昔酸作为引物#3和显示于SEQ ID NO：7中的寡核昔酸作为引物#4以及1μl Tag DNA聚合酶(GIBCO BRL)混合到一起以制备100μl溶液。设计引物是为了扩增出含有EA4天冬氨酸酶ORF的片段。将这样制备的溶液进行30轮PCR循环，每个循环由93℃变性30秒，55℃退火30秒及72℃延伸2分钟所组成。反应完成后，氯仿抽提3次，接着通过乙醇沉淀以回收扩噌的DNA，随后，将回收的DNA以限制酶×baI和Sse838I消化，且然后通过0.7％琼脂糖凝胶电泳分离。从凝胶中回收1.2kb的条带并插入到红球属细菌具有强启动子活性质粒pSJ034的×baI-Sse8387I位点(图3)中以制备重组质粒PAR016(图·2)。根据图4显示的步骤根据质粒pSJ023(在日本专利申请说明书NO.9-65616中描述过)制备质粒pSJ034。质粒pSJ023作为转化子紫红红球菌ATCC 12674/pSJ023以许可号FERM BP-6232保藏于日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所。

(2)红球菌属细菌的转化及在得到转化子中的天冬氨酸酶活性

离心收集对数生长期的紫红红球菌ATCC 12674菌株的细胞，以冰凉的无菌水洗3次并悬于无菌水中。将10μl该细胞悬液与1μl质粒pAR016混合且使之冰凉。将该DNA和细胞的混合物置于小杯中。然后，且基因脉冲仪(伯乐)，向其中应用2.0kv及200Ω的电脉冲。将这样处理的液体冰凉静置10分钟，且然后37℃热休克10分钟。之后，加入500ml MYK培养基(0.5％聚胨，0.3％bacto-酵母提取物，0.3％bacto-malt提取物，0.2％K₂HPO₄，0.2％KH₂PO₄)并于30℃静置5小时。然后，将得到的混合物铺板于含有50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基上并于30℃培养3天。

将这样制备的红球菌属细菌转化子接种到10ml MYK培养基上(含有50μg/ml卡那霉素)并于30℃培养72小时作为预培养物。将1％的预培养物接种到10ml MYK培养基(含50μg/ml卡那霉素)上并于30℃培养96小时。然后，离心收获细胞，以100mM磷酸缓冲液(PH8.0)洗并悬浮于少量的缓冲液中。将该细胞悬液在冰凉条件下超声粉碎并离心以获得粗酶溶液，检测其中的天冬氨酸酶活性。作为对照，使用没有添加卡那霉素培养而获得的ATCC 12674菌株。

接下述检测天冬氨酸酶活性。简言之，将1.0M的延胡索酸铵(ammoniumfumrate)/1mM氯化镁(PH8.8)与该粗酶溶液接触。然后，用ODS柱通过HPLC定量检测于30℃60分钟产生的天冬氨酸。结果，发现天冬氨酸活性在导入质粒的转化子中增加。

产生的L-天冬氨酸(mM)

ATCC 12674/PAR 016 322

ATCC 12674 0.1

实施例3

(1)按实施例2中相同的方式将质粒PAR016导入ATCC 17895和ATCC19140以制备红球菌属细菌的转化子。这些转化子中的每种接种至10ml MYK培养基(含50μg/ml卡那霉素)于30℃培养72小时作为预培养物。将1％的该预培养物接种至100ml GGPK培养基(1.5％葡萄糖，1％谷氨酸钠，0.1％bacto-酵母提取物，0.5％K₂HPO₄，0.5％KH₂PO₄，0.5％MgSO₄.7H₂O，PH7.2)(含有50％μg/ml卡那霉素)并于30℃培养96小时。离心收获细胞，以100mM磷酸缓冲液(PH8.0)洗并悬浮于少量的缓冲液中。用得到的细胞悬液，进行天冬氨酸制备反应。简言之，将该细胞悬液添加到100ml 1.0M延胡索酸铵/1mM氯化镁(PH8.8)中并于30℃搅拌20小时。作为对照，使用没有添加卡那霉素而培养的ATCC 12674菌株。用ODS柱通过HPLC定量测定上面反应(30℃20小时)中产生的天冬氨酸而测定天冬氨酸酶活性。结果，发现天冬氨酸酶活性在导入质粒的转化子中增加。

产生的L-天冬氨酸(mM)

ATCC 17895/_PAR016 990

ATCC 17895 5

ATCC 19140/_pAR016 985

ATCC 19140 8

根据本发明，提供了一种编码具有天冬氨酸酶活性新蛋白的基因。通过用具有多拷贝该基因的转化子生物，可从延胡索酸和氨有效地制备L-天冬氨酸。

序列表

(2)SEQ ID NO：1信息：

(i)序列特征：

(A)长度：477个氨基酸

(8)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白

(vi)最初来源

(A)有机体：红球菌属

(B)菌株：EA4

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Met Thr Met Arg Ile Glu His Asp Leu Leu Gly Asp Arg Glu Val Pro

1 5 10 15

Ala Glu Ala Tyr Tyr Gly Ile His Thr Leu Arg Ala Leu Glu Asn Phe

20 25 30

Pro Ile Thr Gly Ile Pro Leu Ser Val His Pro Asp Met Val Ser Ala

35 40 45

Leu Ala Ala Val Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala Asn Ala Asp Leu Gly

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Glu His Ala Ala Ala Ile Glu-Gln Ala Cys Lys Glu

65 70 75 80

Ile Arg Ala Gly Arg Phe Thr Asp Gln Phe Val Val Asp Val Ile Gln

85 90 95

Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ser Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Val Ala

100 105 110

Asn Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gly Gly Glu Arg Gly Gln Tyr Gln Phe

115 120 125

Leu His Pro Leu Glu His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Val

130 135 140

Tyr Pro Thr Ala Ile Lys Ile Gly Leu Gln Gly Ala Val Thr Arg Leu

145 150 155 160

Arg Gly Ala Met Asp Glu Leu Ala Gly AIa Phe Ala Glu Lys Ala Ala

165 170 175

Glu Phe Ser His Val Leu Lys Val Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala

180 185 190

Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Ile Val Thr Phe Ala Val Met Ile

195 200 205

Lys Glu Asp Ser Gln Arg Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Ile Ser Glu

210 215 220

Ile Asn Leu Gly Gly Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Ala His Pro

225 230 235 240

Glu Tyr Ala Arg Arg Val Arg Glu His Leu Val Ser Ile Thr Gly Leu

245 250 255

Asp Ile Ser Thr Ala Ser Asp Leu Ile Glu Ala Thr Gln Asp Val Gly

260 265 270

Ala Phe Val Gln Leu Ser Gly Val Leu Lys Arg Thr Ala Val Lys Leu

275 280 285

Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg Ala

290 295 300

Gly Leu Gly Glu Ile Asn Leu Pro Ala Val Gln Ala Gly Ser Ser Ile

305 310 315 320

Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Ile Pro Glu Val Val Asn Gln Ile

325 330 335

Ala Tyr Arg Val Val Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Met Ala Ala Glu

340 345 350

Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Ala Phe Glu Pro Val Ile Ala His Ser

355 360 365

Leu Phe Glu Thr Ala Glu Leu Leu Thr Arg Gly Cys Thr Val Leu Arg

370 375 380

Glu Arg Cys Val Ile Gly Ile Thr Ala Asn Val Glu His Leu Glu Arg

385 390 395 400

Thr Val Ala Ala Ser Ile Gly Val Val Thr Ala Leu Asn Pro Tyr Ile

405 410 415

Gly Tyr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Ala Ala Asp Ala Leu Ala Ser Gly

420 425 430

Arg Thr Val Val Glu Leu Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Gly Lys Glu

435 440 445

Asp Leu Asp Ala Ile Met Glu Pro Ala Asn Leu Ala Arg Thr Ala Ile

450 455 460

Val Ser Ala Pro Asp Phe Asp Pro Leu Val Pro Ser Thr

465 470 475

(2)SEQ ID NO：2信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1434个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)最初来源：

(A)有机体：红球菌属

(B)菌株：EA4

(ix)特征

(A)名字/关键：CDS

(B)位置：1...1431

(xi)序列描述：SED ID NO：2

ATG ACG ATG CGC ATC GAG CAC GAC CTG CTC GGT GAT CGC GAA GTG CCT 48

Met Thr Met Arg Ile Glu His Asp Leu Leu Gly Asp Arg Glu Val Pro

1 5 10 15

GCG GAG GCC TAC TAC GGC ATC CAC ACG CTG AGA GCA CTG GAG AAC TTC 96

Ala Glu Ala Tyr Tyr Gly Ile His Thr Leu Arg Ala Leu Glu Asn Phe

20 25 30

CCG ATC ACC GGT ATT CCT CTC TCG GTC CAC CCG GAC ATG GTA TCG GCG 144

Pro Ile Thr Gly Ile Pro Leu Ser Val His Pro Asp Met Val Ser Ala

35 40 45

TTG GCT GCG GTC AAG CAG GCC GCT GCT CGG GCG AAC GCC GAC CTC GGA 192

Leu Ala Ala Val Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala Asn Ala Asp Leu Gly

50 55 60

ATC CTC TCG CCC GAG CAT GCA GCG GCG ATC GAG CAA GCT TGC AAG GAG 240

Ile Leu Ser Pro Glu His Ala Ala Ala Ile Glu Gln Ala Cys Lys Glu

65 70 75 80

ATT CGT GCG GGC AGG TTC ACC GAC CAG TTC GTC GTC GAC GTC ATT CAG 288

Ile Arg Ala Gly Arg Phe Thr Asp Gln Phe Val Val Asp Val Ile Gln

85 90 95

GGT GGT GCC GGC ACG TCA TCG AAC ATG AAC GCC AAC GAA GTG GTC GCG 336

Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ser Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Val Ala

100 105 110

AAC CGC GCG CTC GAA ATT CTC GGC GGC GAA CGG GGG CAG TAC CAA TTC 384

Asn Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gly Gly Glu Arg Gly Gln Tyr Gln Phe

115 120 125

CTC CAT CCG CTC GAA CAC GTC AAC ATG AGT CAG AGC ACC AAC GAC GTC 432

Leu His Pro Leu Glu His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Val

130 135 140

TAC CCC ACC GCG ATC AAA ATC GGC TTG CAA GGT GCC GTC ACC AGG CTT 480

Tyr Pro Thr Ala Ile Lys Ile Gly Leu Gln Gly Ala Val Thr Arg Leu

145 150 155 160

CGA GGT GCG ATG GAC GAA CTT GCA GGC GCA TTC GCG GAG AAA GCA GCC 528

Arg Gly Ala Met Asp Glu Leu Ala Gly Ala Phe Ala Glu Lys Ala Ala

165 170 175

GAG TTC TCC CAC GTG CTC AAG GTC GGG CGG ACT CAG TTG CAA GAC GCG 576

Glu Phe Ser His Val Leu Lys Val Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala

180 185 190

GTC CCG ATG ACT CTC GGT CAA GAG ATT GTC ACG TTC GCC GTG ATG ATC 624

Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Ile Val Thr Phe Ala Val Met Ile

195 200 205

AAG GAG GAC TCT CAG AGA CTG GAA GAG GCC GCT CGG TTG ATC TCG GAG 672

Lys Glu Asp Ser Gln Arg Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Ile Ser Glu

210 215 220

ATC AAC CTG GGA GGG ACG GCG ATA GGT ACC GGT CTC AAT GCG CAC CCG 720

Ile Asn Leu Gly Gly Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Ala His Pro

225 230 235 240

GAG TAC GCC AGA CGT GTG CGT GAG CAT CTG GTG TCG ATC ACC GGT CTC 768

Glu Tyr Ala Arg Arg Val Arg Glu His Leu Val Ser Ile Thr Gly Leu

245 250 255

GAC ATC TCG ACG GCA TCG GAT CTC ATC GAA GCA ACC CAG GAC GTC GGG 816

Asp Ile Ser Thr Ala Ser Asp Leu Ile Glu Ala Thr Gln Asp Val Gly

260 265 270

GCC TTC GTT CAG CTG TCG GGA GTG CTC AAG CGT ACC GCG GTC AAA CTG 864

Ala Phe Val Gln Leu Ser Gly Val Leu Lys Arg Thr Ala Val Lys Leu

275 280 285

TCC AAG ATC TGC AAC GAT CTG AGA TTG CTG TCC TCA GGC CCA CGA GCA 912

Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg Ala

290 295 300

GGT CTG GGT GAG ATC AAT TTA CCT GCG GTG CAG GCA GGT TCG TCG ATC 960

Gly Leu Gly Glu Ile Asn Leu Pro Ala Val Gln Ala Gly Ser Ser Ile

305 310 315 320

ATG CCC GGA AAG GTC AAT CCG GTC ATT CCG GAA GTG GTC AAT CAG ATT l008

Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Ile Pro Glu Val Val Asn Gln Ile

325 330 335

GCC TAC CGG GTG GTG GGA AAC GAT CTG ACC ATC ACC ATG GCT GCC GAG 1056

Ala Tyr Arg Val Val Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Met Ala Ala Glu

340 345 350

GCG GGT CAA CTG CAG CTC AAC GCA TTC GAA CCG GTC ATT GCA CAC AGC l104

Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Ala Phe Glu Pro Val Ile Ala His Ser

355 360 365

TTG TTC GAG ACT GCA GAA CTC CTC ACG CGG GGC TGC ACT GTG TTG CGC 1152

Leu Phe Glu Thr Ala Glu Leu Leu Thr Arg Gly Cys Thr Val Leu Arg

370 375 380

GAG CGA TGC GTG ATC GGC ATT ACC GCC AAC GTC GAG CAT CTC GAA CGA 1200

Glu Arg Cys Val Ile Gly Ile Thr Ala Asn Val Glu His Leu Glu Arg

385 390 395 400

ACG GTC GCG GCT TCG ATC GGT GTC GTG ACC GCG CTC AAT CCC TAC ATC 1248

Thr Val Ala Ala Ser Ile Gly Val Val Thr Ala Leu Asn Pro Tyr Ile

405 410 415

GGC TAC ACA GCC GCG ACG GAA TTG GCG GCG GAC GCG CTT GCT TCC GGT 1296

Gly Tyr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Ala Ala Asp Ala Leu Ala Ser Gly

420 425 430

CGT ACC GTC GTG GAG TTG GTG CTC GAA CGC GGG TTG TTG GGC AAG GAG 1344

Arg Thr Val Val Glu Leu Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Gly Lys Glu

435 440 445

GAT TTG GAC GCG ATC ATG GAG CCT GCG AAT TTG GCA CGA ACT GCG ATC 1392

Asp Leu Asp Ala Ile Met Glu Pro Ala Asn Leu Ala Arg Thr Ala Ile

450 455 460

GTG TCG GCT CCC GAT TTC GAT CCA CTC GTC CCG TCG ACC TGA 1434

Val Ser Ala Pro Asp Phe Asp Pro Leu Val Pro Ser Thr

465 470 475

(2)SED ID NO：3信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1912个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)最初来源：

(A)有机体：红球菌属

(B)菌株：EA4

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

TTCGAAGCCA CGCCCGTTCA GGTGACCTGC GTGCGGCGAA GTTCGGTGGA GCCGAACTAC 60

CGTGGGGCGA GATCCCGGTG GCGGCAAACC TCAAATGACG ATGCGCATCG AGCACGACCT 120

GCTCGGTGAT CGCGAAGTGC CTGCGGAGGC CTACTACGGC ATCCACACGC TGAGAGCACT 180

GGAGAACTTC CCGATCACCG GTATTCCTCT CTCGGTCCAC CCGGACATGG TATCGGCGTT 240

GGCTGCGGTC AAGCAGGCCG CTGCTCGGGC GAACGCCGAC CTCGGAATCC TCTCGCCCGA 300

GCATGCAGCG GCGATCGAGC AAGCTTGCAA GGAGATTCGT GCGGGCAGGT TCACCGACCA 360

GTTCGTCGTC GACGTCATTC AGGGTGGTGC CGGCACGTCA TCGAACATGA ACGCCAACGA 420

AGTGGTCGCG AACCGCGCGC TCGAAATTCT CGGCGGCGAA CGGGGGCAGT ACCAATTCCT 480

CCATCCGCTC GAACACGTCA ACATGAGTCA GAGCACCAAC GACGTCTACC CCACCGCGAT 540

CAAAATCGGC TTGCAAGGTG CCGTCACCAG GCTTCGAGGT GCGATGGACG AACTTGCAGG 600

CGCATTCGCG GAGAAAGCAG CCGAGTTCTC CCACGTGCTC AAGGTCGGGC GGACTCAGTT 660

GCAAGACGCG GTCCCGATGA CTCTCGGTCA AGAGATTGTC ACGTTCGCCG TGATGATCAA 720

GGAGGACTCT CAGAGACTGG AAGAGGCCGC TCGGTTGATC TCGGAGATCA ACCTGGGAGG 780

GACGGCGATA GGTACCGGTC TCAATGCGCA CCCGGAGTAC GCCAGACGTG TGCGTGAGCA 840

TCTGGTGTCG ATCACCGGTC TCGACATCTC GACGGCATCG GATCTCATCG AAGCAACCCA 900

GGACGTCGGG GCCTTCGTTC AGCTGTCGGG AGTGCTCAAG CGTACCGCGG TCAAACTGTC 960

CAAGATCTGC AACGATCTGA GATTGCTGTC CTCAGGCCCA CGAGCAGGTC TGGGTGAGAT 1020

CAATTTACCT GCGGTGCAGG CAGGTTCGTC GATCATGCCC GGAAAGGTCA ATCCGGTCAT 1080

TCCGGAAGTG GTCAATCAGA TTGCCTACCG GGTGGTGGGA AACGATCTGA CCATCACCAT 1140

GGCTGCCGAG GCGGGTCAAC TGCAGCTCAA CGCATTCGAA CCGGTCATTG CACACAGCTT 1200

GTTCGAGACT GCAGAACTCC TCACGCGGGG CTGCACTGTG TTGCGCGAGC GATGCGTGAT 1260

CGGCATTACC GCCAACGTCG AGCATCTCGA ACGAACGGTC GCGGCTTCGA TCGGTGTCGT 1320

GACCGCGCTC AATCCCTACA TCGGCTACAC AGCCGCGACG GAATTGGCGG CGGACGCGCT 1380

TGCTTCCGGT CGTACCGTCG TGGAGTTGGT GCTCGAACGC GGGTTGTTGG GCAAGGAGGA 1440

TTTGGACGCG ATCATGGAGC CTGCGAATTT GGCACGAACT GCGATCGTGT CGGCTCCCGA 1500

TTTCGATCCA CTCGTCCCGT CGACCTGACC AGGTCTTCAG GGCGGTTGAC ACCGCACATG 1560

TGGGCGGTAT CGTTTAGTGA TACGTATAAC TACTTGCAGT CCTGTTGTGT CAGGATTGAC 1620

AGAAGCTGAG TCGGCACGGT TCAAGGACGT ACCGCGCCAA GCCAGCCAGG AGACGGAAAC 1680

CATGTTCGAA AAGACACGAA TGGACAGTCA TCCCCCCTGT AAGAGCAACT ACGACGTCAT 1740

CGTCGTGGGA AGCGGAATGG GGGGTGGAAC GATGGCATAC GCTCTCAAGG ATTCCGGCCT 1800

CGATGTGCTC TTGATCGAGA GGGGAGACTT CCTTCCACAG GAACGTCAGA ATTGGGACCC 1860

CCGAGCGGTG TTCGAGAAAG ATCGGTACAA GAACGCCGAA AAATGGGTCG AC 1912

(2)SEQ ID NO：4信息

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc：合成DNA”

(xi)序列描述：SED ID NO：4：

AACATGAACA CTAACGAGGT 20

(2)SED ID NO：5信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成DNA”

(xi)序列描述：SED ID NO：5：

AGGTCGTTGC AGATCTTGGA 20

(2)SEQ ID NO：6信息：

(i)序列特征；

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/des＝“合成DNA”

(xi)序列描述：SED ID NO：6：

AATCTAGAAT GACGATGCGC ATCGAGCACG ACC 33

(2)SED ID NO：7信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

(B)名字/关键：CDS

CTCTAGACCT GCGTACGGCG AAGTTCG 27

Claims

1、一种蛋白质，它具有天冬氨酸酶活性且具有SED ID NO：1的氨基酸序列。

2、编码权利要求1的蛋白质的基因DNA。

3、权利要求2的基因DNA，其中的DNA具有SED ID NO：2的核苷酸序列。

4、权利要求2的基因DNA，其中的DNA源自红球菌属细菌。

5、权利要求4的基因DNA，其中所述的红球菌属细菌为EA4菌株。

6、一种重组质粒，它包含权利要求2的基因DNA。

7、权利要求6的重组质粒，其中还包含能在红球菌属细菌中复制和扩增的DNA区域。

8、一种转化子，它是通过将权利要求6或7的重组质粒导入宿主微生物中而获得的。

9、权利要求8的转化子，其中的宿主微生物为红球菌属细菌。

10、一种制备权利要求1的蛋白质的方法，其中包括培养权利要求9的转化子。

11、一种制备L-天冬氨酸的方法，其中包括在权利要求9的转化子或权利要求1的蛋白质存在下将延胡索酸或其盐与氨或其盐反应。