CN1230544C

CN1230544C - 磷酸己酮糖异构酶和编码该酶的基因

Info

Publication number: CN1230544C
Application number: CN01137985.5A
Authority: CN
Inventors: 加藤畅夫; 安枝寿
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2001-07-07
Publication date: 2005-12-07
Anticipated expiration: 2021-07-07
Also published as: US20020061578A1; EP1170371A1; JP2002017351A; US6630341B2; CN1362518A

Abstract

本发明提供了编码磷酸己酮糖异构酶的DNA，该酶是下面的(A)或(B)定义的蛋白质，同时提供了生产该酶的方法：(A)具有序列表中列出的SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质，(B)具有序列表中列出的SEQ ID NO：3氨基酸序列的蛋白质，其中包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入或增加，并且具有磷酸己酮糖异构酶的活性。

Description

磷酸己酮糖异构酶和编码该酶的基因

技术领域

本发明涉及磷酸己酮糖异构酶和编码它的DNA。更精确地说，本发明涉及起源于耐热细菌：短芽孢杆菌的磷酸己酮糖异构酶和编码它的DNA。

背景技术

在可以利用单个碳(C1)化合物如甲烷和甲醇作为碳源(甲基营养型生物中，已知存在代谢这些化合物的核酮糖单磷酸途径(RuMP)。这一途径的重要关键酶是催化核酮糖单磷酸途径的起始反应的磷酸己酮糖合成酶(HPS，3-己酮糖-6-磷酸合成酶)和催化随后的反应的磷酸己酮糖异构酶(PHI，磷酸-3-己酮糖异构酶)。

另外，靶化合物分子的特异位置用稳定的同位素，碳13(¹³C)标记的生化物质可用于研究生物代谢途径。并且，利用碳13-NMR技术研究生物体中代谢产物的行为最近在各种疾病诊断和日常健康检查中成为非常重要的技术。对于这样的新技术，提供在确定的靶位置经碳13低成本标记的化合物是必要的并且也是人们期望的。

正如生产上面提到的这样的靶化合物的一个系统，可以设想一个方法，其中可以制备利用标记的甲醛和5-磷酸核酮糖合成标记的6-磷酸-D-果糖的一系列酶，利用这些酶在反应系统中能够有效地制备标记的靶化合物。磷酸己酮糖合成酶是本反应系统中首先起作用的酶，它已经从几种微生物中分离，并且它的一些特征也已经阐明。这些微生物包括，例如：荚膜甲基单胞菌(J.R.Quayle，酶学方法，188，第314页，1990)，甲基单胞菌M15菌株(酶学方法，188，第319页，1990)，和aminofaciens甲基单胞菌77a菌株(生物化学生物物理Acta.，523，第236页，1978)，胃分枝杆菌MB19(酶学方法，188，第393页，1990)，和喜甲烷醋杆菌MB58(酶学方法，188，第401页，1990)。

另外，关于磷酸己酮糖异构酶，已经从喜甲烷甲基单胞菌77a菌株中部分地纯化(农业生物化学，41(7)，第1133页，1977)，并且纯化的酶和编码它的基因也已经从革兰氏阳性甲醇同化细菌，胃分枝杆菌中分离(日本专利Laid-open公开(kokai)号，No.11-127869)。

耐热细菌产生的酶和蛋白质通常在高温下是稳定的，它们中的大多数对pH的变化和有机溶剂也是稳定的。所以，其应用已经大大地演变成如诊断试剂，工业催化剂等等。对于耐热甲醇同化细菌的C1代谢系统的酶，只有磷酸己酮糖合成酶已经从甲醇芽孢杆菌C1菌株中纯化(酶学方法，188，393页，1990)，但它的详细的结构和其基因仍然是未知的。在另一方面，关于耐热细菌的磷酸己酮糖异构酶，不仅酶蛋白的结构和其基因，而且酶的纯化也未有报道。

发明内容

本发明的发明人发现，在克隆编码短芽孢杆菌S1菌株的磷酸己酮糖合成酶的基因(也称为“hps”)的过程中，一个编码PHI的基因(也称为”phi”)存在于含有hps的DNA片段中。并且本发明人分离了phi基因，并将这一基因导入了大肠杆菌细胞中，检测了表达产物的活性，证明了该基因编码了PHI，从而完成了本发明。

本发明提供如下内容：

(1)编码下面的(A)或(B)定义的蛋白质的DNA：

(A)具有序列表中列出的SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质，

(B)具有包括一个或几个氨基酸残基替代，缺失，插入或增加的序列表中显示的SEQ ID NO：3的氨基酸序列并具有磷酸己酮糖异构酶活性的蛋白质。

(2)根据(1)中所述的DNA，它是下面的(a)或(b)中定义的DNA：

(a)至少含有序列表中列出的SEQ ID NO：1的核苷酸序列的编号为1149-1700的核苷酸残基的核苷酸序列组成的DNA，

(b)在严格条件下与至少含有序列表中列出的SEQ ID NO：12的核苷酸序列的核苷酸编号1149-1700的核苷酸序列可杂交，并且编码具有磷酸己酮糖异构酶活性的蛋白质的DNA。

(3)以可以表达(1)或(2)中的DNA编码的磷酸己酮糖异构酶的方式，导入该DNA的细胞。

(4)生产磷酸己酮糖异构酶的方法，包括在培养基中培养(3)中的细胞，在培养基中生产和积累磷酸己酮糖异构酶，和从培养基中收集磷酸己酮糖异构酶。

(5)在下面的(A)或(B)中定义的蛋白质：

(A)具有序列表中列出SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质，

(B)具有序列表中显示的SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入或增加，并具有磷酸己酮糖异构酶活性的蛋白质。

根据本发明，得到了编码磷酸核酮糖异构酶的DNA，从而有效地生产了该酶。结果使大量廉价提供重要的并且是医药或生化基础研究中需要的标记物质成为可能。

下面将详细地说明本发明。

(1)本发明的DNA

本发明的DNA是在邻接并且位于hps基因的下游的短芽孢杆菌S1菌株的hps基因的DNA片段中发现的，该DNA可以从短芽孢杆菌的染色体DNA中分离和得到。具体地说，如下面的实施例中所示，本发明的DNA是从如下的短芽孢杆菌的染色体DNA中得到的。

首先，从短芽孢杆菌中纯化HPS。关于短芽胞杆菌可以提到的是短芽孢杆菌的S1菌株。该菌株是NCIMB(国家工业和海洋细菌收藏中心)的传代培养物，登记号为NCIMB12524。

通过Q-琼脂糖柱层析，丁基-东洋珍珠柱层析和Superdex200柱层析从S1菌株的无细胞提取物中可以纯化HPS直到在SDS-PAGE中检测到单一的谱带的程度。在每个纯化步骤中，通过《酶学方法》第188卷，第397-401页(1990)中叙述的方法，可以检测到HPS活性。

纯化的HPS的部分氨基酸序列已经测定，根据获得的氨基酸序列的信息，已经合成用于PCR(聚合酶链式反应)的寡核苷酸引物。然后，利用从短芽孢杆菌S1菌株制备的基因组DNA作为模板进行PCR。利用Saito等人的方法(《生物化学生物物理Acta》，72卷第619-629页(1963)中叙述)可以得到该基因组DNA。如果将具有序列表中表示的SEQ ID NOS：7和8的核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，通过上面的PCR，将得到约400个碱基对的DNA片段。

然后，在如上所述获得的hps片段的核苷酸序列的基础上，通过例如逆转的PCR方法(遗传学，第120卷，第621-623页，1988)，利用具有SEQ ID NOS：9和10的核苷酸序列作为模板，从短芽胞杆菌S1菌株的染色体DNA获得了含有全长的hps基因的DNA片段。

首先，本发明的发明人试图利用前面提到的约400碱基对的hps片段作为探针，筛选短芽胞杆菌S1菌株的基因组文库。但是，虽然并未知道可能的原因，但可能是因为染色体DNA片段与载体的连接中存在的问题，没有形成具有足以用于筛选的基因组文库的量的菌落，所以发明人不得不放弃利用普通的方法。

因此，发明人尝试利用如上所述的反转的PCR技术的克隆，成功地得到了含有hps基因的DNA片段。对于如上所述获得的约3kb长度的克隆片段中的约1.8kb的核苷酸序列的测序结果表示在序列表中的SEQ ID NO：1。在这一区域中含有两个开放读码框架(orfs)。每个orf编码的氨基酸序列从5’末端开始表示为SEQ ID NO：2和3。因为其中的第一个orf与HPS的部分氨基酸序列完全相同，因而证明它是hps。另一方面，通过研究表达第二个orf得到的蛋白质的活性，证明该orf是phi，即本发明的DNA。

当利用购买到的软件(GENETYX)对phi的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列进行同源性研究时，表明在核苷酸水平，他们与枯草芽胞杆菌的yckF有65.6％的同源性，在氨基酸水平，他们有64.3％的同源性。同源性被计算为在yckF和phi中完全相同的氨基酸残基的数目与yckF编码的氨基酸残基的总数的比例。

如上所述，在HPS的纯化和hps的分离中偶然发现了本发明的DNA，在第二个orf应该编码phi的概念的基础上，通过表达第二个orf和证明表达产物的活性，获得本发明的DNA。

如上所述获得了本发明的DNA。但是，因为本发明阐明了本发明的DNA的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，因此，从通过根据核苷酸序列或氨基酸序列生产的寡核苷酸作为探针的杂交，从芽胞杆菌属的耐热细菌，例如短芽胞杆菌S1菌株的基因组DNA文库可以获得本发明的DNA。通过前面提到的寡核苷酸作为引物，芽胞杆菌属的耐热细菌的基因组DNA作为模板，进行PCR，也可以得到本发明的DNA。

构建基因组DNA文库，杂交，PCR，制备质粒DNA，消化和连接DNA，转化等等的方法在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港实验室出版，1.21(1989)中有叙述。

携带包含本发明的DNA的质粒pKPS1，和在tac启动子的控制下表达PHI，并且在后面提到的实施例中得到，给定的特定编号为AJ13707的大肠杆菌JM109/pKPS1于2000年7月5日以登记号FERM P-17952，保藏于工业技术院，生命工学工业技术研究所(现在的，国际专利生物体保藏处，国家现代工业科学和技术研究所，独立管理公司)(Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编：305-5466)，并且根据布达佩斯条约2001，6月25日从原始保藏转移到国际保藏，保藏的登记号为FERM BP-7639。

本发明的DNA可以编码的PHI，包括在编码的PHI的活性没有破坏的前提下，在一个或多个位置具有一个或几个氨基酸残基的取代，缺失，插入或增加。根据蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的位置或类型，“几个”氨基酸残基的数目是不同的。但是，编码的PHI可以是与构成PHI和具有PHI活性的总的氨基酸序列具有65％或更多，优选地具有80％或更多的同源性的一个PHI。明确地说，“几个”氨基酸残基的数目优选地是2-60，更优选地说是2-30个，进一步优选的是2-10个。

通过修饰核苷酸序列，例如，采用定点诱变方法以致于氨基酸序列中在特定位点含有一个或多个氨基酸残基的取代，缺失，插入或增加，可以得到如上所述的编码与PHI基本上相同的蛋白质的DNA。这样的如上所述修饰的DNA也可以通过常规的已知的突变处理得到。这样的突变处理包括在体外处理编码PHI的DNA的方法，例如，用羟胺，和处理微生物的方法，例如，用紫外辐射，或常用的突变试剂，如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸进行突变处理微生物，例如含有编码PHI的DNA的大肠杆菌属的细菌的方法。

如上所述的核苷酸的取代，缺失，插入，增加或颠换也包括在个体差异或含有phi的微生物的种类或属的不同的基础上天然存在的突变体或变异体。

编码如上所述的与PHI基本上相同的蛋白质的DNA可以通过在适当的细胞中，表达如上所述的具有突变的DNA，和检测表达产物的PHI的活性得到。从编码具有突变的PHI的DNA或含有该DNA的细胞中，分离在严格条件下，与具有例如对应于SEQ ID NO：1中显示的核苷酸序列的核苷酸编号1149-1700的核苷酸序列的DNA，或可以从该核苷酸序列制备的探针杂交，并且编码具有PHI活性的蛋白质的DNA也可以得到编码与PHI基本相同的蛋白质的DNA。本文的“严格条件”指形成所谓的特异杂交，而不形成非特异杂交的条件。利用数值表示这一条件是困难的。但是，例如，严格条件包括同源性高的DNA，例如同源性不低于70％的DNA可以相互杂交，同源性低于上面的水平的DNA相互不杂交的条件。或者说，严格条件是在对应于Southern杂交洗涤的普通条件，即，1×SSC，0.1％SDS，优选地，0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度下，60℃下DNA相互杂交的条件。

至于探针，也可以用phi基因的部分序列。利用根据每个基因的核苷酸序列产生的寡核苷酸为引物，和含有每个基因的DNA片段为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)可以生产这样的探针。当长度约为300bp的DNA片段用作探针时，杂交的洗涤条件可以是50℃，2×SSC和0.1％SDS。

在如上所述的条件下可以杂交的基因包括在基因的编码区存在终止密码的基因，和由于活性中心的突变而失去活性的基因。但是，通过将各个基因连接到购买到的活性表达载体，和通过如上所述的方法测量PHI活性可容易地除去这些突变体。

<2>磷酸己酮糖异构酶的生产

可以通过利用适当的寄主-载体系统，允许前面提到的本发明的DNA的表达来进行生产PHI。

关于表达phi基因的宿主，可以提到的是各种原核生物的细胞，包括大肠杆菌，各种真核生物的细胞，包括啤酒酵母，动物细胞和植物细胞。在这些细胞中，原核生物细胞，特别是大肠杆菌细胞是优选的宿主。

关于在前面提到的宿主中导入phi基因的载体，可以提到的是，例如pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218等等。除了这些，也可以利用噬菌体DNA的载体。通过连接phi基因与这些载体中的任何一个得到的重组载体转化宿主可以将phi导入宿主。通过利用转导，转座(Berg，D.E.和Berg C.M.，生物/技术，1卷，第417页，(1983))，Mu噬菌体(日本公开专利，专利号2-109985/1990)或同源重组(分子遗传学实验，冷泉港实验室，(1972))在宿主的基因组中导入phi基因。

另外，为了达到有效地表达phi基因，可以将在宿主细胞中起作用的启动子，如lac，trp和P_L，与在启动子的上游区域编码PHI的DNA序列连接。如果将含有启动子的载体用作载体，可以马上进行phi基因，载体，和启动子的连接。关于这样的载体，可以提到的有含有tac启动子的pKK223-3(Pharmacia)。

关于转化，可以利用的方法有，例如，用氯化钙处理受体细胞使DNA的渗透增加的方法，这在大肠杆菌K-12已有报道(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物学杂志，第53卷，第159页(1970))；和从生长期的细胞制备感受态的细胞，然后将DNA导入其中，这在枯草芽孢杆菌中已有报道(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，基因，1卷，153页(1977))。除了这些，同样可利用的方法是，在能够容易地吸收重组DNA的原生质体或原生质球中生成DNA-受体细胞，然后在这些细胞中导入重组DNA，该方法已知可用于枯草芽孢杆菌，放线菌和酵母中(Chang，S.和Cheon，S.N.，分子遗传学168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，自然，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，美国科学院年报，75卷，1929页(1978))。转化的方法可以根据用作宿主的细胞，从这些方法中适当挑选。

虽然，只要表达时显示PHI活性，phi基因可以是任何一个，但含有编码序列表中表示的SEQ ID NO：3的氨基酸序列的DNA，或含有序列表中表示的SEQID NO：1的核苷酸序列的1149-1700个核苷酸残基的DNA的基因是优选的。进一步，如上所述，该基因还可以是含有编码，在一个或多个位置，具有一个或几个氨基酸残基的取代，缺失，插入，增加或颠换的PHI，而编码的PHI活性没有破坏的DNA的一个基因。

通过在培养基中培养用如上所述的phi基因导入的细胞，在培养物中生产和积累PHI，并且从培养物中收集PHI，可以生产PHI。用于培养的培养物可以根据利用的宿主适当地选择。当利用大肠杆菌作为宿主，和tac启动子辅助表达phi，如果在37℃，如LB培养基中培养宿主，在开始培养后几小时，加入tac启动子的诱导物IPTG(异丙基-α-D-硫代吡喃半乳糖苷)到最后浓度为0.5毫摩尔/升，继续培养，细胞中就积累了PHI。当利用适当的分泌系统，允许PHI分泌到细胞外，培养基中就积累了PHI。

利用常见的用于酶的纯化方法如，离子交换层析，凝胶过滤层析，吸收层析和溶剂沉淀等等要求的方法可以从细胞提取物或培养基中纯化如上所述产生的PHI。

本发明得到的PHI可以用于从碳13标记的从甲醇生产的[1-¹³C]D-葡萄糖6-磷酸盐。根据下面的实施例可以进行[1-¹³C]6-磷酸D-葡萄糖的制备。甲醇是利用从同化甲醇酵母博伊丁氏假丝酵母制备的乙醇氧化酶，氧化成甲醛的。通过醛醇缩合和HPS的作用，将得到的甲醛与5磷酸核酮糖一起浓缩形成阿拉伯基-3-核酮糖6-磷酸。在这样的情况下，由于5-磷酸核酮糖并不稳定，在同样的反应系统中，通过磷酸核糖异构酶的作用，将5-磷酸核糖异构化成5-磷酸核酮糖才可用于HPS反应。由于PHI的作用，可以将前面提到的反应中产生的3-阿拉伯-6-磷酸核酮糖转换成6-磷酸果糖，进一步在6-磷酸葡萄糖异构酶的作用下转换成6-磷酸葡萄糖。因为通常PHI的含量明显比HPS低，大多数情况下，利用PHI进行前面提到的反应是困难的。另外，应该考虑，利用耐热细菌的PHI，反应可以进行相当长的时期。因为耐热细菌的phi已经分离，本发明也已经提供了有效地生产PHI的方法，在实际应用中稳定地进行前面的反应已经成为可能。

具体实施方式

参考下面的实施例，本发明将被更详细地说明。

首先将说明的是用于实施例中的HPS活性的测量方法(酶学方法，188卷，第397-401页(1990))。

[测量HPS活性的方法]

在0.15毫升水中，加入下面的溶液A和B各0.05毫升，在小杯(d＝1.0厘米)中混合，然后，在30℃首先加热约3分钟。在小杯中加入0.1毫升10毫摩尔/升的甲醛溶液，开始反应。允许在30℃反应5分钟，然后混合物中加入0.1毫升0.5当量/毫升的盐酸终止反应。将反应混合物稀释20倍，加入2毫升的纳氏试剂(生物化学杂志，第55卷，第416页，1953)，可以检测到反应混合物中甲醛减少。在对照实验中，利用水而不是5-磷酸核糖溶液。

[试剂]

A：500毫摩尔/升磷酸钾缓冲液，pH7.5

B：50毫摩尔/升的氯化镁水溶液

C：50毫摩尔/升5-磷酸核糖水溶液

D：100单位/毫升的磷酸核酮糖异构酶溶液

E：酶制备液(含有1毫摩尔/升的DTT的50毫摩尔/升磷酸缓冲液(pH7.5))

实施例1：纯化短芽孢杆菌S1菌株产生的磷酸己酮糖合成酶(HPS)

首先，为了纯化HPS，在含有500毫升下面成分的培养基A的2升的烧瓶中加入短芽也杆菌S1菌株(NCIMB 12524)到1升的体积，并且在45℃振摇培养16小时。

[培养基A的成份]

甲醇 2毫升/升

磷酸氢二钾 4.65克/升

磷酸氢钠单水化合物 1.5克/升

硫酸铵 1.5克/升

七水硫酸镁 0.2克/升

酵母提取物 0.5克/升

蛋白胨 0.5克/升

酪蛋白氨基酸 0.5克/升

维生素溶液^*1 1毫升/升

痕量金属溶液^*2 20.2毫升/升

(pH7)

^*1：在100毫升中，含有10毫克泛酸，10毫克核黄素，1毫克维生素B12，1毫克硫辛酸，1毫克叶酸，10毫克生物素，10毫克硫胺素，10毫克尼克酰胺，2毫克对氨基苯甲酸和10毫克磷酸吡哆醛。

^*2：在100毫升中，含有0.55克CaCl₂.2H₂O，0.51克MnCl₂.4H₂O，2.2克ZnSO₄.7H₂O，0.16克CuSO₄.5H₂O，0.50克FeSO₄.7H₂O，0.16克CoCl₂.6H₂O，0.011克(NH₄)Mo₇O₂₄.4H₂O，和5.0克EDTA(乙二胺四乙酸)。

在培养后，收集细胞，约11.3克。将细胞悬浮于含有1毫摩尔/升的DTT的106毫升的50毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，用超声波裂解。在12000rpm，4℃，离心裂解的细胞悬浮液20分钟，上清液为无细胞提取液。然后，在含有1毫摩尔/升的DTT，0.15毫摩尔/升的PMSF(氟化磺酰甲苯)和5毫摩尔/升MgCl₂的20毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中透析，加到用同样的缓冲液平衡好的Q琼脂糖柱(Pharmacia)，用0摩尔/升到0.5摩尔/升的氯化钾线性梯度洗脱，得到显示HPS活性的组分(16毫升)。通过这一纯化步骤，HPS纯化了约2.9倍。

然后，在前面提到的纯化的组分中加入固体硫酸铵，搅拌直到浓度为1.7摩尔/升，在8000rpm下离心10分钟，收集上清液。进一步，将上清液通过孔大小为0.22微米的过滤器，除去微小颗粒，然后，加到用含有1毫摩尔/升DTT，0.15毫摩尔/升的PMSF和5毫摩尔/升的MgCl₂的50毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)平衡过的丁基-东洋珍珠(TOSOH公司)柱上，用1.7摩尔/升到0摩尔/升的硫酸铵的线性梯度洗脱(洗脱速度：2毫升/分钟)。经过这步骤，得到了HPS活性高的组分(12毫升)。

随后，将上面得到的组分在Centriprep(Millipore公司)中浓缩到2毫升的体积，然后，加到用含有1毫摩尔/升DTT，0.15毫摩尔/升的PMSF和5毫摩尔/升MgCl₂的100毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡过的Superdex 200(Pharmacia)，用同样的缓冲液洗脱(洗脱速度：2毫升/分钟)，得到高活性的组分。通过这些纯化步骤，可以纯化目的产物HPS。

当纯化的样品进行SDS-PAGE，在15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，只检测到确定的单一的谱带，这样的事实证明了酶的均一化。经SDS-PAGE确定的分子量为25000。

实施例2：短芽孢杆菌S1菌株产生的磷酸己酮糖合成酶(HPS)的部分结构

随后，确定实施例1中得到的HPS的部分氨基酸序列。用常规的方法，将SDS-PAGE展开的HPS的蛋白带影印到PVDF(聚氟乙烯)膜上，切下该谱带。然后，用Edman降解方法分析蛋白质的N末端氨基酸序列。结果发现，是MQLQLALDLVNIEEAKQVVAEVQEYVDIVE(SEQ ID NO：4)。另外，对于该蛋白质的内部氨基酸序列，用V8蛋白酶部分降解蛋白质，进行SDS-PAGE，同样影印到PVDF膜上。然后，切下所有的可以检测到的肽片段的谱带，用Edman降解方法分析其氨基酸序列，结果，序列确定为VAKAAEHGADIVTILAAAEDVSIKGAVEEAKKLGXK(SEQ ID NO：5)和MGVDYIXVHAGYDLQAVGKN(SEQ ID NO：6)。

实施例3：得到短芽孢杆菌S1菌株的基因组DNA

在5毫升培养基B(CM129培养基(OXOID公司))中接种短芽孢杆菌S1菌株，45℃过夜培养。将这一培养物以1％的比例接种到500毫升的培养基B中，直到培养物的OD(610nm)达到1.0，然后将培养肉汤离心收集细胞。用盐-EDTA溶液(组成：0.15摩尔/升NaCl，0.01摩尔/升的EDTA，pH8.0)洗涤细胞，然后，悬浮于500毫升相同的溶液，在悬浮液中加入80毫克的溶菌酶，在37℃下保留3小时。

然后，在悬浮液中加入2毫升25％的SDS，和10毫升的蛋白酶K(10毫克/毫升)，在37℃下，振摇过夜。然后，在60℃下处理悬浮液20分钟，加入14毫升5摩尔/升的高氯酸钠和30毫升的氯仿/异戊醇混合物(混合的比例：24∶1)，温和搅拌30分钟。在20℃，3000rpm下离心悬浮液30分钟，收集水层，加入30毫升酚/氯仿混合物，温和搅拌30分钟。然后，在20℃，3000rpm下离心30分钟。收集水层。

在上面的水层上清液中加入2倍量的冷乙醇，使DNA缠绕在巴斯德移液器吸头上收集之。用70％的乙醇洗涤DNA，空气干燥，然后，溶解于5毫升TE溶液(10毫摩尔/升含有1毫摩尔/升的EDTA的Tris-HCl缓冲液(pH7.5))中。然后，在溶液中加入50毫升的10毫克/毫升的RNase，允许在37℃下反应30分钟。在溶液中加入30毫升0.1×SSC溶液，并用酚/氯仿处理。收集水层，加入0.5-倍量的冷异丙醇。在巴士德管中离心收集DNA，用70％的乙醇洗涤，空气干燥，在10毫升的TE溶液中溶解，得到基因组DNA片段(浓度：0.12微克/微升)。

实施例4：通过PCR克隆短芽孢杆菌S1菌株的磷酸己酮糖合成酶基因hps的部分序列

根据实施例2阐述的氨基酸序列，用常规方法合成N末端区的混合核苷酸引物，HPS-BaN2(5’-GARGTNCARGARTAYGTNGAYATHGTNGA-3’，SEQ ID NO：7)，和蛋白质的内部区域的混合核苷酸引物，HPS-BaI3(5’-TTYTTNCCNACNGCYTGNARRTCRTAQ-3’，SEQ ID NO：8)。然后，利用实施例3中制备的基因组DNA作为模板，和上述DNA引物，HPS-BaN2和HPS-BaI3进行PCR反应(25个循环反应，每个循环的步骤为在95℃1分钟，52℃1分钟和72℃3分钟)。

将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化PCR扩增的DNA片段(约400bp)。然后，利用第二套的连接试剂盒(Takara Shuzo)将上面的DNA片段与pT7Blue连接，用连接溶液转化大肠杆菌DH5α得到转化体。将其中包含的一个质粒命名为pTHS1。用常规方法确定pTHS1中插入的DNA片段部分的核苷酸序列，后来，在应用BLAST检索进行同源性检索中，发现插入的DNA片段具有376个碱基对的长度并且与含有hps的其它甲基营养生物的序列高度同源。

实施例5：克隆短芽孢杆菌S1菌株的hps的磷酸己酮糖合成酶的基因和检测phi基因的存在。

首先，利用Southern分析检测了基因组中hps基因的存在位置。按照Southern方法，用各种限制酶消化如上所述制备的基因组，进行电泳，影印到尼龙膜上(分子生物学杂志，第98卷，第503页，1975年)。将含有hps基因部分，长度约为400bp的DNA片段作为探针，该探针是用限制酶BamHI和SpeI消化实施例4中生产的，含有hps部分的pTHS1，并且在2％的琼脂糖凝胶上电泳分离得到的。

用常规的方法预杂交固定DNA的膜，加入标记的探针，允许在55℃过夜杂交。用Alk.Phos.DIRECT试剂(Amersham)标记探针。用第一和第二洗涤溶液，在55℃洗涤膜两次，探针的标记物在X光胶片上曝光。结果，用EcoRI，BamHI和SalI消化基因组DNA得到的产物分别在6.0kb，5.5kb和3.0kb处形成单一的谱带。

根据上面的结果，本发明人尝试将BamHI或SalI消化的S1菌株的基因组与用同样的限制酶消化的载体pUC19连接生产质粒文库。但是，这一方法还不能得到连接的质粒转化的大量大肠杆菌细胞。所以，用常见的克隆方法还不能得到目的产物hps基因。

所以，本发明人决定用倒转的PCR方法(遗传学，第120卷，第621-623页，1988年)克隆靶基因。为了用于例转的PCR反应中，本发明人根据hps片段的核苷酸序列，合成了来自HPS到N末端的内部区域的引物，hps-ivB1(5’-TAACCGGAGTACCGATTTCC-3’，SEQ ID NO：9)，和来自HPS到C末端之间的内部区域引物hps-ivS1(5’-CACGTGGATACGATCTCCA-3’，SEQ ID NO：10)。

在另一方面，利用SalI消化的基因组DNA，通过倒转PCR方法获得了含有hps基因的上游和下游区的约3000个碱基对的片段，然后自我连接成模板。PCR的条件如下：每个循环包括，在95℃1分钟，56℃1分钟，和72℃3分钟，重复25个循环。通过电泳纯化PCR产物，并且与pGEM-T载体(Promega)连接。用连接的溶液转化大肠杆菌DH5α菌株。从转化体收集质粒，验证它们的结构，得到目标pGHS1。

然后，为了研究hps基因周围的结构，将pGHS1亚克隆。首先，用限制酶SalI消化pGHS1，通过琼脂糖凝胶电泳分离两个DNA片段(约2kb和4kb)。用SalI消化较小的DNA片段，然后与用CIAP处理的pBluescriptII SK+(Stratagene)连接产生pGHS1-HN。在另一方面，将较大的4kbp的片段自我连接，用于转化大肠杆菌得到质粒pGHS1-HC。利用这些质粒，确定插入在载体中的序列的核苷酸序列。结果证实，在前面提到的倒转PCR得到的约3kb的片段中存在hps的上游和下游区，从而阐明了hps周围的结构。序列表示在SEQ ID NO：1。

在如上所述得到的DNA片段的核苷酸序列推测的氨基酸序列中，本发明人发现了部分实施例2中确定的酶蛋白的氨基酸序列，并且发现这一基因刚好编码HPS。这一氨基酸序列表示在SEQ ID NO：2。

在另一方面，本发明人注意到了存在于前面提到的hps基因的下游的另一个开放读码框架(缩写为“orf”)。研究了已知的序列中与该orf推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)同源的序列，结果表明，这样的序列与枯草芽孢杆菌的yckF基因有64％的同源性，并且证实它编码的是PHI(细菌学杂志，181卷，第7154页，1999)。所以，本发明人通过表达这一基因，试图证明这一orf是否编码PHI。

实施例6：在大肠杆菌中表达新的短芽孢杆菌S1菌株的磷酸己酮糖异构酶基因phi

通过PCR，从短芽胞杆菌S1菌株(NCIMB12524)的基因组DNA得到phi基因。用常规方法合成了5’末端的引物PHI-ESDN(5’-GGAATTCCTAAGGAGGTTTTTATATGATGCAGACAACTGATTC-3’，SEQ ID NO：11)和3’末端引物PHI-EcCl(5’-GGAATTCCCTACTCGAGATTGGCATGTCT-3’，SEQ IDNO：12)。在95℃将DNA热变性处理5分钟，利用短芽孢杆菌S1菌株的基因组DNA作为模板，上面的引物和ExTaq-DNA聚合酶(Takara Shuzo)，用常规的方法进行PCR(循环反应：95℃1分钟，56℃1分钟，和72℃2分钟，重复30个循环，然后在72℃下将反应系统停留3分钟)。从而得到了含有phi基因的DNA片段。

然后，pGEM-T easy载体(Promega)中导入前面提到的DNA片段，产生pGPS1。进一步用限制酶NotI消化这一pGPS1，然后用T4-DNA聚合酶将消化的末端平齐化得到末端平齐化的phi基因片段。另一方面，用限制酶SmaI消化表达载体pKK223-3(Pharmacia)。利用DNA连接酶连接phi基因片段和载体片段产生含有载体的启动子控制下的phi基因的目标质粒pKPS1。用常规方法，用这一pKPS1转化大肠杆菌JM109得到转化体JM109/pKPS1。将这一菌株命名为AJ13707，以登记号FERM P-17952，在2000年7月5号保藏于工业技术院，生命工学工业技术研究所(现在，国际专利生物体保藏处，国家现代工业科学和技术研究所，独立管理公司)(Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编：305-5466)，并根据布达佩斯条约于2001年6月25日，从原始保藏转为国际保藏，保藏的登记号是FERM BP-7639。

在37℃，在含有氨苄青霉素(50微克/毫升)的LB琼脂培养基上培养AJ13707，将出现的菌落接种到含有相同量的氨苄青霉素的5毫升LB液体培养基中。在37℃开始培养。在4-5小时后，在培养基中加入0.5毫摩尔/升IPTG(异丙基-α-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导从pKPS1上存在的tac启动子开始的转录。更进一步，在培养14小时后，离心3毫升培养肉汤收集细胞。用50毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液(pH7.5)洗涤这些细胞2次，然后悬浮于100微升含有1毫摩尔/升的DTT(二硫苏糖醇)的相同的缓冲液。然后，将细胞悬浮液加载到搅拌器上裂解，离心裂解的细胞悬浮液(15000rpm，40分钟)，将上清液用作粗细胞提取液。

实施例7：短芽孢杆菌S1菌株的phi基因产物的活性测量

利用实施例6中得到的粗细胞提取液进行PHI的活性的检测。关于活性测量的方法，可以以测量甲醛的同化作为用6-磷酸葡萄糖脱氢酶对氧化的磷酸二核苷酸腺嘌呤尼克酰胺的最后还原。

如下所述，混合试剂制备试剂溶液。1毫升溶液A，0.5毫升溶液B，0.5毫升溶液C，和1毫升溶液D混合，制备3毫升反应缓冲液。另一方面，混合各1毫升溶液G，H，I和J制备总体积4毫升的酶溶液。

(试剂)

A：1摩尔/升的磷酸钾缓冲液，pH7.5

B：100毫摩尔/升NADP水溶液

C：100毫摩尔/升升的氯化镁水溶液

D：50毫摩尔/升的5-磷酸核糖水溶液

E：酶制备液(50毫摩尔/升的磷酸缓冲液，含有1毫摩尔/升的DTT，pH7.5)

F：50毫摩尔/升的甲醛水溶液

G：100单位/毫升的磷酸核酮糖异构酶(PRI)

H：100单位/毫升的磷酸葡萄糖异构酶(PGI)

I：100单位/毫升的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)

J：100单位/毫升的纯化的HPS(酶学方法，第188卷，397-401页，1990)

在0.55毫升水中加入0.15毫升前面提到的反应缓冲液和0.20毫升酶溶液，加入小杯(d＝1.0)中，进一步加入0.05毫升前面提到的酶制备液E，搅拌并在30℃加热2分钟。在混合物中加入0.05毫升溶液F，充分混合，用分光光度计测量混合物在340纳米处的吸光值的增加，将水作为空白。从吸光值曲线的开始的线性部分可以得到每分钟的吸光变化值(这值表示为“Δ测试”)。对于空白测试，进行了同样的如上所述的过程，除了加入的是0.05毫升稀释的酶溶液而不是酶制备液，得到了每分钟的变化的吸光值(这一值表示为“Δ空白”)。

一个单位的酶活性为根据下面的方程计算每分钟1微摩尔NADP还原成NADPH的酶量：

PHI活性(单位/毫升)＝(Δ测试-Δ空白)×D×V/6.22×L

D：酶的稀释比例

V：反应混合物的量(这种情况下是1毫升)

L：反应混合物中酶制备液的量(这时为0.05毫升)

NADPH的分子淬灭系数(30mm)＝6.22×103M^-1cm^-1

结果，在用含有载体pKK223-3，不携带phi基因的大肠杆菌JM109制备的粗提取液中不能检测到PHI活性，而在含有pKPS1的大肠杆菌(AJ13707)制备的粗细胞提取液中发现了高的PHI活性(187个单位/毫克蛋白质)。这证明了本发明人得到的基因编码PHI。

序列表

<110>Ajinomoto公司

<120>磷酸己酮糖异构酶和其基因

<130>OP1187

<140>

<141>2000-07-07

<150>JP 2000-

<151>2000-07-07

<160>12

<170>PatentIn第二版

<210>1

<1830>

<212>DNA

<213>短芽孢杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(508)...(1140)

<220>

<221>CDS

<222>(1149)...(1700)

<400>1

agccaatgac ggaaaatgat tgaggcattt tttgatccag aaataaatta tacaaagcag 60

gatagatttt ccttttagct aaatcccctg tcgcgccaaa caagacaaag gtcatcgaat 120

ccacttttca tacctccaca ttaacatttg ttgcggcaaa tattagtata atatgtatat 180

tttttatatg taagtacgca cttattaatc ttatagttac aaatttatat aaagtataaa 240

taatatacta taaaaaatct tatggaaagt gatggatcat tcataccttt ttttcccgta 300

ttgtttacat tttctatagg aattttttct taatagtata ctttttatac tatgtgttaa 360

taaagtgcgt actttttaaa aaatttgata gatagtatat taacagtgta caggcaaaag 420

aaggaataca cacatttgct tgtacaatac aaagttacat aattgtaaca aaaaaaacta 480

aaaattttga aaaggagtgt ataattt atg caa ctt caa tta gct cta gat ttg 534

Met Gln Leu Gln Leu Ala Leu Asp Leu

1 5

gta aac att gaa gaa gca aaa caa gta gta gct gag gtt cag gag tat 582

Val Asn Ile Glu Glu Ala Lys Gln Val Val Ala Glu Val Gln Glu Tyr

10 15 20 25

gtc gat atc gta gaa atc ggt act ccg gtt att aaa att tgg ggt ctt 630

Val Asp Ile Val Glu Ile Gly Thr Pro Val Ile Lys Ile Trp Gly Leu

30 35 40

caa gct gta aaa gaa gtt aaa gac gca ttc cct cat tta caa gtt tta 678

Gln Ala Val Lys Glu Val Lys Asp Ala Phe Pro His Leu Gln Val Leu

45 50 55

gct gac atg aaa act atg gat gct gca gca tat gaa gtt gct aaa gca 726

Ala Asp Met Lys Thr Met Asp Ala Ala Ala Tyr Glu Val Ala Lys Ala

60 65 70

gct gag cat ggc gct gat atc gta aca att ctt gca gca gct gaa gat 774

Ala Glu His Gly Ala Asp Ile Val Thr Ile Leu Ala Ala Ala Glu Asp

75 80 85

gta tca att aag ggt gct gta gaa gaa gcg aaa aaa ctt ggc aaa aaa 822

Val Ser Ile Lys Gly Ala Val Glu Glu Ala Lys Lys Leu Gly Lys Lys

90 95 100 105

atc ctt gtt gac atg atc gca gtt aaa aat tta gaa gag cgt gca aaa 870

Ile Leu Val Asp Met Ile Ala Val Lys Asn Leu Glu Glu Arg Ala Lys

110 115 120

caa gtg gat gaa atg ggt gta gac tac att tgt gtt cac gct gga tac 918

Gln Val Asp Glu Met Gly Val Asp Tyr Ile Cys Val His Ala Gly Tyr

125 130 135

gat ctc caa gca gta ggt aaa aac cca tta gat gat ctt aag aga att 966

Asp Leu Gln Ala Val Gly Lys Asn Pro Leu Asp Asp Leu Lys Arg Ile

140 145 150

aaa gct gtc gtg aaa aat gca aaa act gct att gca ggc gga atc aaa 1014

Lys Ala Val Val Lys Asn Ala Lys Thr Ala Ile Ala Gly Gly Ile Lys

155 160 165

tta gaa aca ttg cct gaa gtt atc aaa gca gaa ccg gat ctt gtc att 1062

Leu Glu Thr Leu Pro Glu Val Ile Lys Ala Glu Pro Asp Leu Val Ile

170 175 180 185

gtc ggc ggc ggt att gct aac caa act gat aaa aaa gca gca gct gaa 1110

Val Gly Gly Gly Ile Ala Asn Gln Thr Asp Lys Lys Ala Ala Ala Glu

190 195 200

aaa ata aat aaa tta gtt aaa caa ggg tta tgatcagc atg cag aca act 1160

Lys Ile Asn Lys Leu Val Lys Gln Gly Leu Met Gln Thr Thr

205 210 1

gaa ttc tta tct gaa atc gta aaa gaa tta agt aat tcg gtt aac caa 1208

Glu Phe Leu Ser Glu Ile Val Lys Glu Leu Ser Asn Ser Val Asn Gln

5 10 15 20

atc gce gat gaa gaa gcg gaa gca ctg gta aac gga att ctt caa tca 1256

Ile Ala Asp Glu Glu Ala Glu Ala Leu Val Asn Gly Ile Leu Gln Ser

25 30 35

aag aaa gta ttt gtt gcc ggt gca gga aga tcc ggt ttt atg gca aaa 1304

Lys Lys Val Phe Val Ala Gly Ala Gly Arg Ser Gly Phe Met Ala Lys

40 45 50

tcc ttt gcg atg cgc atg atg cac atg gga att gat gcc tat gtc gtt 1352

Ser Phe Ala Met Arg Met Met His Met Gly Ile Asp Ala Tyr Val Val

55 60 65

ggc gaa acc gta act cct aac tat gaa aaa gaa gac att tta att att 1400

Gly Glu Thr Val Thr Pro Asn Tyr Glu Lys Glu Asp Ile Leu Ile Ile

70 75 80

gga tcc ggc tct gga gaa aca aaa ggt ctc gtt tcc atg gct caa aaa 1448

Gly Ser Gly Ser Gly Glu Thr Lys Gly Leu Val Ser Met Ala Gln Lys

85 90 95 100

gca aaa agc ata ggt gga acc att gcg gct gta acg att aat cct gaa 1496

Ala Lys Ser Ile Gly Gly Thr Ile Ala Ala Val Thr Ile Asn Pro Glu

105 110 115

tca aca atc gga caa tta gcg gat atc gtt att aaa atg cca ggt tcg 1544

Ser Thr Ile Gly Gln Leu Ala Asp Ile Val Ile Lys Met Pro Gly Ser

120 125 130

cct aaa gat aaa tca gaa gca agg gaa act att caa cca atg gga tcc 1592

Pro Lys Asp Lys Ser Glu Ala Arg Glu Thr Ile Gln Pro Met Gly Ser

135 140 145

ctt ttc gag caa aca tta tta tta ttc tat gat gct gtc att ttg aga 1640

Leu Phe Glu Gln Thr Leu Leu Leu Phe Tyr Asp Ala Val Ile Leu Arg

150 155 160

ttc atg gag aaa aaa ggc ttg gat aca aaa aca atg tac gga aga cat 1688

Phe Met Glu Lys Lys Gly Leu Asp Thr Lys Thr Met Tyr Gly Arg His

165 170 175 180

gcc aat ctc gag taggcgtgga attaagaaaa ggaagaccgc gatgctttgc 1740

Ala Asn Leu Glu

ggtctttcct tgtttttttt acattacatg atgtttatat agtgtcgacc atatgggaga 1800

gctcccaacg cgttggatgc ata 1823

<210>2

<211>211

<212>PTR

<213>芽孢杆菌

<400>2

Met Gln Leu Gln Leu Ala Leu Asp Leu Val Asn Ile Glu Glu Ala Lys

1 5 10 15

Gln Val Val Ala Glu Val Gln Glu Tyr Val Asp Ile Val Glu Ile Gly

20 25 30

Thr Pro Val Ile Lys Ile Trp Gly Leu Gln Ala Val Lys Glu Val Lys

35 40 45

Asp Ala Phe Pro His Leu Gln Val Leu Ala Asp Met Lys Thr Met Asp

50 55 60

Ala Ala Ala Tyr Glu Val Ala Lys Ala Ala Glu His Gly Ala Asp Ile

65 70 75 80

Val Thr Ile Leu Ala Ala Ala Glu Asp Val Ser Ile Lys Gly Ala Val

85 90 95

Glu Glu Ala Lys Lys Leu Gly Lys Lys Ile Leu Val Asp Met Ile Ala

100 105 110

Val Lys Asn Leu Glu Glu Arg Ala Lys Gln Val Asp Glu Met Gly Val

115 120 125

Asp Tyr Ile Cys Val His Ala Gly Tyr Asp Leu Gln Ala Val Gly Lys

130 135 140

Asn Pro Leu Asp Asp Leu Lys Arg Ile Lys Ala Val Val Lys Asn Ala

145 150 155 160

Lys Thr Ala Ile Ala Gly Gly Ile Lys Leu Glu Thr Leu Pro Glu Val

165 170 175

Ile Lys Ala Glu Pro Asp Leu Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ala Asn

180 185 190

Gln Thr Asp Lys Lys Ala Ala Ala Glu Lys Ile Asn Lys Leu Val Lys

195 200 205

Gln Gly Leu

210

<210>3

<211>184

<212>PRT

<213>短芽孢杆菌

<400>3

Met Gln Thr Thr Glu Phe Leu Ser Glu Ile Val Lys Glu Leu Ser Asn

1 5 10 15

Ser Val Asn Gln Ile Ala Asp Glu Glu Ala Glu Ala Leu Val Asn Gly

20 25 30

Ile Leu Gln Ser Lys Lys Val Phe Val Ala Gly Ala Gly Arg Ser Gly

35 40 45

Phe Met Ala Lys Ser Phe Ala Met Arg Met Met His Met Gly Ile Asp

50 55 60

Ala Tyr Val Val Gly Glu Thr Val Thr Pro Asn Tyr Glu Lys Glu Asp

65 70 75 80

Ile Leu Ile Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Thr Lys Gly Leu Val Ser

85 90 95

Met Ala Gln Lys Ala Lys Ser Ile Gly Gly Thr Ile Ala Ala Val Thr

100 105 110

Ile Asn Pro Glu Ser Thr Ile Gly Gln Leu Ala Asp Ile Val Ile Lys

115 120 125

Met Pro Gly Ser Pro Lys Asp Lys Ser Glu Ala Arg Glu Thr Ile Gln

130 135 140

Pro Met Gly Ser Leu Phe Glu Gln Thr Leu Leu Leu Phe Tyr Asp Ala

145 150 155 160

Val Ile Leu Arg Phe Met Glu Lys Lys Gly Leu Asp Thr Lys Thr Met

165 170 175

Tyr Gly Arg His Ala Asn Leu Glu

180

<210>4

<211>30

<212>PTR

<213>短芽孢杆菌

<400>4

Met Gln Leu Gln Leu Ala Leu Asp Leu Val Asn Ile Glu Glu Ala Lys

1 5 10 15

Gln Val Val Ala Glu Val Gln Glu Tyr Val Asp Ile Val Glu

20 25 30

<210>5

<211>36

<212>PRT

<213>短芽孢杆菌

<400>5

Val Ala Lys Ala Ala Glu His Gly Ala Asp Ile Val Thr Ile Leu Ala

1 5 10 15

Ala Ala Glu Asp Val Ser Ile Lys Gly Ala Val Glu Glu Ala Lys Lys

20 25 30

Leu Gly Xaa Lys

35

<210>6

<211>20

<212>PRT

<213>短芽孢杆菌

<400>6

Met Gly Val Asp Tyr Ile Xaa Val His Ala Gly Tyr Asp Leu Gln Ala

1 5 10 15

Val Gly Lys Asn

20

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>7

gargtncarg artaygtnga yathgtnga

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>8

ttyttnccna cngcytgnar rtcrta

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>9

taaccggagt accgatttcc

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>11

ggaattcctaa ggaggttttt atatgatgca gacaactgaa ttc

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>12

ggaattccct actcgagatt ggcatgtct

Claims

1.编码下面的(A)或(B)中定义的蛋白质的DNA：

(A)具有序列表中显示的SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质，

(B)具有序列表中显示的SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中包括一个或几个氨基酸残基的取代，缺失，插入或叠加和具有磷酸己酮糖异构酶活性的蛋白质，并且其中所述蛋白质显示与SEQ ID NO：3的序列有80％或更多的同源性。

2.根据权利要求1所述的DNA，它是下面的(a)或(b)中定义的DNA：

(a)至少包括序列表中表示的SEQ ID NO：1的核苷酸序列中1149-1700号核苷酸残基的核苷酸序列的DNA，

(b)在严格条件下，与至少包括序列表中列出的SEQ ID NO：1的核苷酸1149-1700的核苷酸序列可杂交，并且编码具有磷酸己酮糖异构酶活性的蛋白质的DNA。

3.用可以表达权利要求1所述的DNA编码的磷酸己酮糖异构酶的方式导入该DNA的细胞。

4.生产磷酸己酮糖的异构酶的方法，包括步骤：在培养基中培养权利要求3所述的细胞，在培养基中生产和积累磷酸己酮糖异构酶，从培养基中收集磷酸己酮糖异构酶。

5.一种蛋白质，具有下面的(A)或(B)中定义的蛋白质：

(A)具有序列表中列出的SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质，

(B)具有序列表中列出的SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中包括一个或几个氨基酸残基的取代，缺失，插入或叠加，和具有磷酸己酮糖异构酶活性的蛋白质，并且所述蛋白质显示与SEQ ID NO：3的序列有80％或更多的同源性。