CN1366550A

CN1366550A - (r)－2－辛醇脱氢酶,产生此酶的方法,编码此酶的dna,以及使用此酶生产醇类的方法

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Publication number: CN1366550A
Application number: CN01800758A
Authority: CN
Inventors: 工藤真丈; 山本浩明
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2002-08-28
Anticipated expiration: 2021-02-15
Also published as: KR20010113790A; CZ20013768A3; US7202069B2; ATE479758T1; EP1179595B1; EP1179595A4; CN100413967C; JP4651896B2; US20040126857A1; WO2001061014A1; US6706507B2; EP1179595A1; DE60142949D1; TWI275645B; US20020192783A1; CZ300833B6; KR100760106B1

Abstract

以NAD⁺(NADH)作为辅酶的催化氧化/还原反应的(R)－2－辛醇脱氢酶。该酶可以从毕赤酵母属、假丝酵母属、Ogataea属等的微生物中得到。利用此(R)－2－辛醇脱氢酶还原酮类可以产生醇,尤其(S)－4－卤－3－羟基丁酸酯和(R)－丙氧基苯衍生物。而且,此(R)－2－辛醇脱氢酶的活性和立体选择性极佳。

Description

(R)-2-辛醇脱氢酶，产生此酶的方法，编码此酶的DNA，以及使用此酶生产醇类的方法

技术领域

本发明涉及新的(R)-2-辛醇脱氢酶，可用于生产醇类，酮类，特别是生产具有光学活性的醇类，例如(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯和(R)-丙氧苯衍生物；编码此酶的DNAs；此酶生产方法；用此酶生产醇类，酮类，特别是生产具有光学活性的醇类，例如(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯和(R)-丙氧苯衍生物的方法。

技术背景

化合物(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯作为中间体，用于合成HMG-CoA还原酶抑制剂，如D-肉碱等。此类化合物可用于药物和杀虫剂的合成。特别是如何(合成或分解)得到(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的光学纯的对映异构体是工业上的重要问题。如今，已知利用微生物如面包酵母进行不对称合成，结晶，和不对称还原的方法(尚未审查已公开的日本专利申请(JP-A)Sho 61-146191，JP-A Hei 6-209782等)可用于(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的生产。但是由于存在一些问题，如产品光学纯度低，产量低等，这些方法不适于工业应用。

此外，也检索了能还原4-卤乙酰乙酸酯为(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的酶。例如，下列已知的酶。已有报道采用这些酶可用于合成(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯。但是这些酶是还原酶，它们采用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为辅酶。因此，利用这些酶合成(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯需要NADPH的参与和再生，而NADPH是昂贵的和化学性不稳定的，不利于工业应用。

●一些得自面包酵母的还原酶(D-酶-1，D-酶-2，美国化学学会会志(J.Am.Chem.Soc.)107，2993-2994，1985)

●得自赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)的乙醛还原酶2(Appl.Environ.Microbiol.65，5207-5211，1999)

●得自马其顿假丝酵母(Candida macedoniensis)的酮泛酸酯还原酶(Arch.Biochem.Biophys.294，469-474，1992)

●得自白地霉(Geotrichum candium)的4-氯乙酰乙酸乙酯还原酶(EnzymeMicrob.Technol.14，731-738，1992)

●得自Candida magnoliae的羰基还原酶(WO 98/35025)

●得自乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)的羰基还原酶(JP-A Hei11-187869)

●β-酮酰基-酰基载体蛋白还原酶，作为II型脂肪酸合成酶之一(JP-A2000-189170)

尽管已知得自假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)PED的3-羟基类固醇脱氢酶(JP-A Hei 1-277494)，甘油脱氢酶(Tetrahedron Lett.29，2453-2454，1988)，和乙醇脱氢酶(有机化学杂志(J.Org.Chem.)57，1526-1532，1992)可作为以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)为电子供体的还原酶，但这些酶由于合成(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的反应活性低而不利于工业应用。

如上面指出的，采用微生物和酶生产(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的已知方法在某些方面不令人满意如光学纯度，产量，活性等。这些问题使已知方法难于进行工业应用。

在另一方面，(R)-丙氧苯衍生物(JP-A hei 02-732)作为中间体可用于合成药物，特别是氧氟沙星(ofloxacin)((S)-(-)-9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪)-7-氧代-2，3-二氢-7H-吡啶并[1，2，3-脱][1，4]苯噁嗪-6-羧酸，JP-A Sho 62-252790)这种合成抗细菌药物的光学活性物质。如何得到(合成或分解到)这些化合物的光学纯的对映异构体在工业上是一个重要问题。

已知利用脂肪酶和酯酶使丙氧苯衍生物的外消旋物不对称酰化是一种用于生产(R)-丙氧苯衍生物的方法。在此方法中，需要一种在使(R)型酰化后将剩余的原料和酰化产物分离的方法和一种使酰化产物脱酰的方法。因此，由于这些方法很复杂，此已知方法不适于工业应用。

采用微生物使丙酮氧苯衍生物不对称还原的方法已有报道。但是，由于产生的(R)-丙氧苯衍生物的光学纯度低至84-98％(JP-A Hei 03-183489)或8.8-88.4％(JP-A Hei 05-68577)，以及由于底物浓度低至0.1-0.5％，此已知方法不适于工业应用。鉴于通过不对称还原得到高光学纯度的方法，有报道可采用产生自Candida magnoliae的羰基还原酶(JP-A 2000-175693)合成光学纯度为99％或更高的(R)-丙氧苯衍生物。但是，此羰基还原酶使用NADPH作为辅酶。因此采用此酶合成(R)-丙氧苯衍生物需要添加或再生昂贵且化学性不稳定的NADPH，这在工业应用上是不利的。

发明内容

本发明的一个目的是提供利用NADH作辅酶还原4-卤乙酰乙酸酯并生产高光学纯度的(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的新型酶。此外，本发明的一个目的是提供利用此酶生产高光学纯度(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的方法。

另外，本发明的一个目的是提供以NADH作辅酶的新的酶，它可以生产用作合成抗细菌药物的中间体的光学高纯度(R)-丙氧苯衍生物。此外，本发明的一个目的是提供利用此酶生产有着高光学纯度的(R)-丙氧苯衍生物的方法。

本发明人认为可利用NADH作电子供体的乙醇脱氢酶可用于工业应用。NADH比NADPH更廉价且化学性质更稳定。为发现可以有效产生光学活性(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的酶，本发明人筛选了对(R)-2-辛醇有高活性的乙醇脱氢酶，所述(R)-2-辛醇有着与(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯相同的构型以及与4-卤乙酰乙酸酯同样长的长链。

以前的发现报道得自过滤弧菌(Comamonas terrigena)，毕赤酵母属(Pichia)NRRL-Y-11328株，和假单胞菌属(pseudomonas)SPD6株的酶作为仲醇脱氢酶，所述酶可以立体选择性氧化(R)-2-辛醇，并且有生产2-辛醇的活性。但是，没有关于这些酶可以还原4-卤乙酰乙酸酯和产生(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的报道。因为这些酶对(R)-2-辛醇的活性并不明显大于对仲醇如2-丙醇(其侧链较短)的活性，因此通过还原4-卤乙酰乙酸酯(其碳酰基结合在体积大的侧链上)生产(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的活性预计较低。

因此，本发明人大量筛选含有能优选氧化(R)-2-辛醇的酶类的微生物。结果，他们发现下类属的微生物具有优选氧化(R)-2-辛醇的能力：

毕赤氏酵母属(Pichia)

假丝酵母属(Candida)

Ogataea属

具体地，发现下列微生物具有优选氧化(R)-2-辛醇的能力：

Pichia finlandica

Pichia jadinii

产朊假丝酵母(Candida utilis)

Ogataea wicherhamii

而且，本发明人培养了这些微生物并从这些微生物中纯化得到了能氧化(R)-2-辛醇的酶。对这些酶的性质进行检测，发现这些酶对(R)-2-辛醇的氧化具有高度立体选择性，此外，与(R)-2-辛醇相比更易于立体选择性氧化仲醇。还发现这些酶不但具有还原4-氯乙酰乙酸乙酯和生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯的高活性，还具有还原2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯和生产2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯的高活性。这样，本发明得以完成。

具体地，本发明涉及新的(R)-2-辛醇脱氢酶，其可用于生产醇类，酮类，特别是生产具有光学活性的醇类，例如(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯；编码此酶的DNA；此酶生产方法；用此酶生产醇类，酮类，特别是生产具有光学活性的醇类，例如(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯和(R)-丙氧苯衍生物的方法。

[1]一种(R)-2-辛醇脱氢酶，具有下列(1)和(2)的物化性质：

(1)作用

i)以氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶，此酶通过氧化醇生产酮，且

ii)以还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶，此酶通过还原酮生产醇，且

(2)底物特异性

i)此酶优先氧化2-辛醇两种光学异构体中的(R)-2-辛醇，且

ii)此酶通过还原4-卤乙酰乙酸酯生产(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯。

[2][1]中的(R)-2-辛醇脱氢酶，其有着下列(3)和(4)的物化性质：

(3)最佳pH

用于氧化反应的最佳pH范围为8.0-11.0，还原反应的最佳pH范围为5.0-6.5，且

(4)底物特异性

i)与伯醇相比，此酶对仲醇表现出更高的活性，且

ii)与2-丙醇相比，此酶对(R)-2-辛醇表现出显著更高的活性。

[3][1]或[2]的(R)-2-辛醇脱氢酶，其中此(R)-2-辛醇脱氢酶由挑选自毕赤氏酵母属，假丝酵母属和Ogataea属的微生物衍生。

[4][3]的(R)-2-辛醇脱氢酶，其中属于毕赤酵母属的微生物是Pichiafinlandica。

[5][3]的(R)-2-辛醇脱氢酶，其中属于毕赤酵母属的微生物是Pichiajadinii。

[6][3]的(R)-2-辛醇脱氢酶，其中属于假丝酵母属的微生物是产朊假丝酵母。

[7][3]的(R)-2-辛醇脱氢酶，其中属于Ogataea属的微生物是Ogataeawickerhamii。

[8][1]或[2]的用于生产(R)-2-辛醇脱氢酶的方法，此方法包括培养从毕赤氏酵母属，假丝酵母属和Ogataea属中挑选的微生物，所述微生物生产[1]或[2]的酶。

[9]下列(a)到(e)的多核苷酸，此多核苷酸编码了具有(R)-2-辛醇脱氢酶活性的蛋白：

(a)多核苷酸，其含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，

(b)多核苷酸，其编码含有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白，

(c)多核苷酸，其编码含有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白，在此氨基酸序列中有一个或多个氨基酸的取代，缺失，插入和/或添加，

(d)多核苷酸，其在严谨条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO：1的多核苷酸杂交，且

(e)编码与SEQ ID NO：2氨基酸序列有着不少于70％同源性的氨基酸序列的多核苷酸。

[10]为[9]的多核苷酸编码的蛋白。

[11]重组载体，其中插入了[9]中的多核苷酸。

[12][11]的重组载体，其中进一步插入一种多核苷酸，其编码以β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶并能催化氧化还原反应的脱氢酶。

[13]以可表达的方式含有[9]中多核苷酸或[11]中载体的转化体。

[14]生产[10]中蛋白的方法，此方法包含培养[13]中的转化体。

[15]生产醇的方法，此方法包含将[1]或[2]的(R)-2-辛醇脱氢酶，[10]的蛋白，可生产此酶或蛋白的微生物，或该微生物的加工产物与酮反应以使酮还原。

[16][15]的方法，其中的微生物是[13]的转化体。

[17][15]的方法，其中的酮是4-卤乙酰乙酸酯的衍生物并且其中的醇是(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯衍生物。

[18][17]的方法，其中4-卤乙酰乙酸酯的衍生物是4-氯乙酰乙酸乙酯且其中的醇是(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

[19][15]的方法，其中的酮是丙酮氧苯衍生物，其由通式1表示：

通式1

其中x1和x2表示卤原子；其中的醇是丙氧苯衍生物，由通式2表示：

通式2

[20][19]的方法，其中丙酮氧苯衍生物是2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯且其中的醇是2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯。

[21][15]的方法，该方法还包括将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转换成其还原型。

[22]用于生产酮的方法，此方法包括使[1]或[2]的(R)-2-辛醇脱氢酶，[10]的蛋白，可生产此酶或蛋白的微生物，或该微生物的加工产物与醇反应以使醇氧化。

[23]生产光学活性醇的方法，该方法包含的步骤有，将[1]或[2]的(R)-2-辛醇脱氢酶，[10]的蛋白，生产该酶或蛋白的微生物，或微生物加工产物与外消旋醇反应以优先氧化任一光学异构体，并得到保留的光学活性醇。

[24][22]或[23]的方法，该方法另外进一步包含将还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转换成其氧化型。

本发明提供具有下列(1)和(2)的物化性质的酶：

(1)作用

i)该酶通过氧化醇生产酮，其以氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)为辅酶，且

ii)该酶通过还原酮生产醇，其以还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)为辅酶，且

(2)底物特异性

i)该酶优先氧化2-辛醇两种光学异构体中的(R)-2-辛醇，且

ii)该酶通过还原4-卤乙酰乙酸酯生产(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯。

优选地，本发明的酶进一步具有下列(3)和(4)的酶性质

(3)最佳pH

氧化反应的最佳pH为8.0-11.0，还原反应的为5.0-6.5，且

(4)底物特异性

i)与伯醇相比，此酶对仲醇表现出更高的活性，且

ii)与2-丙醇相比，此酶对(R)-2-辛醇表现出显著更高的活性。

此外，本发明优选的(R)-2-辛醇脱氢酶具有下列(5)到(8)的物化性质和酶性质：

(5)最佳作用温度范围

(R)-2-辛醇的氧化反应最佳作用温度范围为45-55℃。乙基4-氯乙酰乙酸酯的还原反应范围为55-60℃。

(6)稳定pH范围

该酶在pH8-9稳定。

(7)抑制

该酶受到氯化汞和螯合剂乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA 2Na)的轻微抑制。

(8)稳定性

N-乙基马来酰亚胺，o-菲咯啉，氯化镁，氯化钙，和氯化锰可以稳定该酶。

(9)纯化方法

本发明的酶可采用通常的纯化方法从生产该酶的微生物中进行纯化。例如，可通过破坏真菌菌体后进行硫酸鱼精蛋白沉淀，用硫酸铵盐析出离心上清液，再进一步组合阴离子交换层析，疏水层析，亲和层析，凝胶过滤等方法纯化蛋白。

在此所用术语“脱氢酶”指可以催化脱氢反应的酶，所述脱氢反应指从含有氢的化合物上移去氢的氧化反应。此外，该酶具有对酮的还原活性，且在还原条件下能催化氧化反应的逆反应。因此，本发明中的“脱氢酶”具有催化还原反应的活性，所述还原反应为氧化反应的逆反应，且其中加入了氢原子。通常，当具有相同活性时，称为“脱氢酶”“氧化还原酶”“氧化酶”“还原酶”，或类似名称的酶都包括在本发明的脱氢酶中。

在本发明中，对4-氯乙酰乙酸酯的还原活性如下检测。30℃下孵育反应混合物，其中含有磷酸钾缓冲液(pH6.5，100mM)，0.2mM NADH，20mM乙基4-氯乙酰乙酸酯以及该酶，检测随着NADH的减少在340nm处吸收度的降低可以确定其活性。1U定义为1分钟时催化NADH减少1μmol的酶量。可使用蛋白质检测试剂盒(BIORAD)通过染料结合方法进行蛋白的定量。

在另一方面，对(R)-2-辛醇的氧化活性可如下测定。30℃下孵育反应混合物，其中含有Tris-HCl缓冲液(pH8.5，50mM)，2.5mM NAD⁺，5mM(R)-2-辛醇以及该酶，检测随着NADH的产生在340nm处吸收度的升高可以确定其活性。1U定义为1分钟时催化生成1μmol NADH的酶量。

本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶具有对(R)-2-辛醇的高氧化活性。此外，该酶对(R)-2-辛醇的高氧化活性显著高于对2-丙醇的活性。在此，以(R)-2-辛醇为底物，在NAD⁺的参与下，随着NADH的增加或减少每单位时间在340nm处吸收度的变化速度(相对活性)要2倍或更多倍，优选5倍或更多倍于以2-丙醇为底物的速度(作为1)，可以说该脱氢酶活性显著较高。

在本发明中，(R)-2-辛醇脱氢酶优先氧化(R)-2-辛醇是指当(R)-2-辛醇脱氢酶对R型的酶活性作为100时，对S型的活性是50或更少，优选20或更少，且更优选10或更少。

有着如上所述物化性质的(R)-2-辛醇脱氢酶可从生成此酶的微生物培养液中得到。例如，生产本发明酶的菌株可以在毕赤氏酵母属，假丝酵母属和Ogataea属中找到。特别是，毕赤氏酵母属的Pichia finlandica和Pichiajadinii，假丝酵母属的产朊假丝酵母，和Ogataea属的Ogataea wickerhamii具有较强的产生本发明(R)-2-辛醇脱氢酶的能力。可以得到本发明(R)-2-辛醇脱氢酶的菌株的例子有：

(i)Pichia finlandica：DSM 70280，DSM 1380

(ii)Pichia jadinii：DSM 2361，DSM 70167，IFO 0987

(iii)产朊假丝酵母：IFO 0988，IFO 0626

(iv)Ogataea wickerhamii：IFO 1706

对于Pichia finlandica产生的仲醇脱氢酶，有报道采用无细胞提取物表现出2-丙醇脱氢酶活性(Biochimica et Biophysica Acta，716，298-307，1982)。但是，按照本发明人的附加实验，在此菌株的无细胞提取液中包含多重2-丙醇脱氢酶。另一方面，本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶是次要成分，2-丙醇脱氢酶活性很微弱。因此，本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶与此文献所述的酶截然不同。

上述的微生物培养在用于培养真菌的普通培养基如，YM培养基中。以葡萄糖，甘油或甲醇之任一作为碳源，可从Pichia finlandica中得到所要的酶。特定地，以甲醇为碳源可从产朊假丝酵母中得到所要的酶。充分增生后，回收真菌菌体，在加入了还原剂如2-巯基乙醇等和蛋白酶抑制剂如苯甲基磺酰氟PMFS的缓冲液中破碎，制成无细胞提取液。通过根据酶蛋白的溶解性进行的分级分离和多种层析等可从无细胞提取液纯化得到该酶。作为基于溶解性分级蛋白的方法，可以使用例如用有机溶剂如丙酮或二甲亚砜的沉降，用硫酸铵盐析，或类似方法。另一方面已知的层析方法有阳离子交换层析，阴离子交换层析，凝胶过滤，疏水层析，以及使用螯合剂，色素，抗体等的多种亲和层析。更特定地，通过使用苯基-Toyopearl的疏水层析，使用DEAE-Sepharose的阴离子交换层析，使用丁基-Toyopearl的疏水层析，使用Blue-Sepharose亲和层析，Superdex 200的凝胶过滤等等，可以将酶纯化为电泳中的几乎一条带。

本发明涉及编码(R)-2-辛醇脱氢酶及同系物的多核苷酸。在本发明中，多核苷酸可以是自然存在的多核苷酸如DNA或RNA，也可以是包含人工合成的核苷酸衍生物的多核苷酸。

编码本发明(R)-2-辛醇脱氢酶的多核苷酸包含，例如SEQ ID NO：1的核苷酸序列。SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽。包含此氨基酸序列的多肽构成本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶的优选实例。

本发明的多核苷酸包括编码具有上述(1)和(2)的物化性质，及含有SEQID NO：2的氨基酸序列的多肽，所述序列有一个或多个氨基酸取代，缺失，插入，和或添加。本领域技术人员可以通过定点诱变正确地将取代，缺失，插入，和或添加突变引入含有SEQ ID NO：1核苷酸序列的DNA中(核酸研究(Nucleic Acid Res.)10页，6487(1982)，酶学方法(Methods inEnzymol.)100，448页(1983)；分子克隆(Molecular cloning)第二版，冷泉港实验室出版社(1989)，PCR：实用方法(PCR：A Practical Approach)，IRL出版社，200页(1991))。

另外，本发明的多核苷酸包括与含有SEQ ID NO：1核苷酸序列的DNA，以及编码有着上述物化性质(1)和(2)的蛋白的DNA在严谨条件下杂交的多核苷酸。“在严谨条件下杂交的多核苷酸”指与核苷酸探针采用，例如，ECL直接核酸标记和检测系统(Amersham-Pharmacia Biotech)按所附说明书的建议条件(用含有0.5×SSC的初级冲洗缓冲液在42℃下洗涤)杂交的多核苷酸，该探针有一个或多个含至少20个连续核苷酸的片段，所述片段优选至少30个连续核苷酸，例如40，60，或100个连续的核苷酸，它从核苷酸序列SEQ ID NO：1中任意挑选。

与含有SEQ ID NO：1核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交的多核苷酸包括含有与SEQ ID NO：1相似的核苷酸序列的那些。很可能这样的多核苷酸编码与含有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白功能等价的蛋白。

此外，本发明的多核苷酸包括编码下述蛋白的多核苷酸，该蛋白与SEQID NO：2氨基酸序列相比有至少70％，优选至少80％或90％，更优选95％或更高同一性。可以容易地进行蛋白的同源性检索，例如，在国际互联网上，例如在涉及蛋白的氨基酸序列的数据库，如SWISS-PROT，PIR，等等；涉及DNA的数据库，如日本的DNA Databank(DDBJ)，EMBL，GenBank等等；涉及基于DNA序列的推导的氨基酸序列的数据库；等等中使用FASTA程序，BLAST程序等进行检索。作为使用BLAST程序和SEQ ID NO：2的氨基酸序列在DDBJ中同源性检索的结果，在已知蛋白中表现出最高同源性的蛋白是枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶，其表现出43％的同一性和61％的阳性。本发明中不少于70％的同源性指示，例如，使用BLAST程序所得阳性样本的同源性值。

本发明中，编码具有上述物化性质(1)和(2)的蛋白的多核苷酸被特别称为含SEQ ID NO：1核苷酸序列的多核苷酸的“同系物”。同系物可根据SEQID NO：1的核苷酸序列从其它微生物经PCR克隆和杂交分离得到，还可以引入突变而得到。例如，SEQ ID NO：1的核苷酸序列是分离自Pichiafinlandica的基因的序列。此外，编码具有上述物化性质(1)和(2)的蛋白的多核苷酸以及那些可从例如，Pichia jadinii，假丝酵母属的产朊假丝酵母，Ogataea属的Ogataea wickerhamii，等等微生物得到的那些都包括在本发明中。

本发明的多核苷酸可用于本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶的基因工程生产。备选地，具有可用于生产酮和醇的(R)-2-辛醇脱氢酶活性的微生物能利用本发明的多核苷酸通过基因工程的方法生产。

本发明包含有着SEQ ID NO：2的氨基酸序列并具有上述物化性质(1)和(2)的(R)-2-辛醇脱氢酶，以及其同系物。包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白组成本发明优选实施方案的(R)-2-辛醇脱氢酶。

本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶同系物包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，且其中有一个或多个氨基酸的缺失，取代，插入，和/或添加。本领域的技术人员可以通过定点诱变(核酸研究，10，6487(1982)，酶学方法，100，448(1983)；分子克隆，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)，PCR：实用方法，IRL出版社，200(1991))或类似的方法正确地将取代，缺失，插入，和/或添加突变引入至包含SEQ ID NO：1核苷酸序列的DNA，从而容易地得到编码所述(R)-2-辛醇脱氢酶同系物的DNA。可通过将编码(R)-2-辛醇脱氢酶同系物的DNA引入宿主并在宿主中表达，而得到具有SEQ ID NO：2的(R)-2-辛醇脱氢酶的同系物。

此外，本发明(R)-2-辛醇脱氢酶的同系物包括表现出与SEQ ID NO：2氨基酸序列至少70％，优选至少80％或90％，更优选95％或更多同一性的蛋白。可以容易地进行蛋白的同源性检索，例如，在国际互联网，例如在涉及蛋白的氨基酸序列的数据库，如SWISS-PROT，PIR，等等；涉及DNA的数据库，如日本的DNA Databank(DDBJ)，EMBL，GenBank等等；涉及基于DNA序列的推导的氨基酸序列的数据库；等等中使用FASTA程序，BLAST程序等检索。作为使用BLAST程序和SEQ ID NO：2的氨基酸序列在DDBJ中同源性检索的结果，在已知蛋白中表现出最高同源性的蛋白是枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶，其表现出43％的同一性和61％的阳性。本发明中不少于70％的同源性指示，例如，使用BLAST程序所得阳性样本的同源性值。

编码本发明(R)-2-辛醇脱氢酶的DNA可通过，例如下列步骤进行分离。

在纯化本发明的酶后，通过分析N-端氨基酸序列，再利用酶如赖氨酰内肽酶，V8蛋白酶等等切割蛋白，通过反相液体层析等方法纯化肽段，用蛋白测序仪分析氨基酸序列来确定多重氨基酸序列。

如果清楚了部分氨基酸序列，可以推出编码这些氨基酸序列的核苷酸序列。本发明的DNA片段可基于推出的核苷酸序列或SEQ ID NO：1的核苷酸序列设计PCR引物，采用此酶生产菌株的染色体DNA或cDNA文库作为模板通过PCR得到。

此外，用所得DNA片段作为探针，通过菌落或噬菌斑杂交可得到本发明DNA，其中采用的文库是通过将此酶生产菌株的染色体DNA的限制酶切产物引入噬菌体或质粒，然后用该噬菌体或质粒转化大肠杆菌得到的或采用cDNA文库。

另外，得到本发明DNA的步骤如下，分析PCR得到的DNA片段的核苷酸序列，基于已得到的序列设计PCR引物向外扩展该DNA，采用适合的限制酶消化目的酶生产菌株的染色体DNA，采用自我连接的环状DNA作模板进行反向PCR(遗传学120，621-623(1988))；或备选地通过RACE方法(cDNA末端的快速扩增；“PCR实验手册”pp.25-33，HBJ出版社)。

本发明的DNA不仅包括由上述方法克隆的基因组DNA和cDNA，还包括化学合成的DNA。

将如此分离得到的编码本发明(R)-2-辛醇脱氢酶的DNA插入到已知的表达载体以提供(R)-2-辛醇脱氢酶的表达载体。此外，通过培养用此表达载体转化的细胞，可从已转化的细胞中得到本发明的(R)2-辛醇脱氢酶。

在本发明中，对为表达(R)-2-辛醇脱氢酶(辅酶为NAD⁺)而进行转化的微生物没有限制，只要此生物体能用含有编码(R)-2-辛醇脱氢酶(辅酶为NAD⁺)活性多肽的DNA的载体转化，并能表达(R)-2-辛醇脱氢酶(辅酶为NAD⁺)活性。可能的微生物是具有宿主-载体系统的那些，例如包括：

细菌如埃希氏菌属，芽孢杆菌属，假单胞菌属，沙雷氏菌属，短杆菌属，棒杆菌属，链球菌属，乳杆菌属；

放线菌如红球菌属和链霉菌属；

酵母如糖酵母属，克鲁维氏酵母属，裂殖糖酵母属，接合糖酵母属，Yarrowia属，丝孢酵母属，红冬孢属，毕赤氏酵母属，假丝酵母属；及真菌如链孢霉属，曲霉属，头孢属，木霉属；等。

可运用在分子生物学，生物工程，和基因工程领域的一般方法(例如，参见Sambrook等，“分子克隆”，冷泉港实验室)进行转化体制备和构建适于宿主的重组载体。为在微生物中表达编码本发明(R)-2-辛醇脱氢酶(辅酶为NAD⁺)的基因，必须将DNA引入该微生物中稳定的质粒载体或噬菌体载体上，并使遗传信息得以转录和翻译。为此，将启动子(一种调节转录和翻译的单位)置于DNA 5’端的上游，并且优选将一个终止子放置于该DNA 3’端的下游。在被用作宿主的微生物内，所述启动子和终止子应该是有效的。可用于上述各种微生物的载体，启动子，和终止子都详述于“微生物学基本课程(8)：基因工程”，Kyoritsu Shuppan，酵母专辑，见“高等生物化学工程(Adv.Biochem.Eng.)43，75-102(1990)”和“酵母8，423-488(1992)”。

例如，对于埃希氏菌属，特别是对于大肠杆菌，有效质粒包括pBR系列和pUC系列的质粒；有效启动子包括得自lac(得自β-半乳糖苷酶基因)，trp(得自色氨酸操纵子)，tac和trc(为lac和trp的嵌合体)的启动子，λ噬菌体的P_L和P_R，等。有效终止子得自trpA，噬菌体，rrnB核糖体RNA，等。

对于芽孢杆菌，有效载体是pUB110系列和pC194系列的质粒；所述载体可以整合入宿主染色体。有效启动子和终止子得自apr(碱性蛋白酶)，npr(中性蛋白酶)，amy(α-淀粉酶)，等。

对于假单孢菌，有为恶臭假单孢菌(P.putida)和葱头假单孢菌(P.cepacia)开发的宿主载体系统。基于与甲苯化合物分解有关的TOL质粒的宽宿主范围载体，pKT240，(包含RSF1010衍生的自我复制所需的基因)也有效；得自脂酶基因的启动子和终止子(JP-A No.Hei 5-284973)也有效。

对于短杆菌属，特别是对于乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)，有效质粒载体包括pAJ43(基因39，281(1985))。用于大肠杆菌的启动子和终止子可以不经任何修饰而用于短杆菌属。

对于棒杆菌属，特别是对于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicam)，可使用质粒载体例如pCS11(JP-A Sho 57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Gennet.196，175(1984))。

对于链球菌属，可以使用质粒载体如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26，239(1985)和pGK1(应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)，50，94(1985))。

对于乳杆菌属，可利用为链球菌属开发的质粒载体pAMβ1(细菌学杂志(J.Bacteriol.)137，614(1979))；也可利用用于大肠杆菌的启动子。

对于红球菌属，可使用分离自紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)的质粒载体(普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)138，1003(1992))。

对于链霉菌属，可按照在Hopwood等的“链霉菌的遗传操作：实验室手册(Genetic Manipulation of Streptomyces：A Laboratory Manual)”(冷泉港实验室(1985))中所述方法构建质粒。特别是对于青紫链霉菌(Streptomyceslividans)，可利用pIJ486(分子普通遗传学203，468-478，1986)，pKC1064(基因，103，97-99(1991))，和pUWL-KS(基因165，149-150(1995))同样的质粒也可用于弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)。

对于糖酵母属，特别是对于酿酒酵母，YRp系列，YEp系列，YCp系列，YIp系列的质粒均有效；整合型载体(参见EP 537456，等)，通过与多拷贝核糖体基因同源重组而整合进入染色体，允许引入多个拷贝的目的基因且整合的基因可以稳定保持在微生物体内；因此，这些类型的载体也高度有效。有效启动子和终止子来自编码ADH(乙醇脱氢酶)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，PHO(酸性磷酸酶)，GAL(β-半乳糖苷酶)，PGK(磷酸甘油酸激酶)，ENO(烯醇化酶)，等的基因。

对于克鲁维氏酵母属，特别是对于乳克鲁维氏酵母，可用的质粒如得自酿酒酵母的2-μm质粒，pKD1系列质粒(细菌学杂志145，382-390(1981))，得自pGK11且参与放毒活性的质粒，KARS(克鲁维氏酵母自主复制序列)质粒，和可以通过与核糖体DNA进行同源重组被整合进入染色体的质粒(参见EP 537456，等)。可使用得自ADH，PGK等的启动子和终止子。

对于裂殖糖酵母属，可使用包含得自粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的ARS(自主复制序列)以及得自酿酒酵母的营养缺陷型互补选择标记(分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)6，80(1986))的质粒载体。可使用如得自粟酒裂殖糖酵母的ADH启动子(EMBO J.6，729(1987))。特定地，pAUR224可向TaKaRa Shuzo公司购买。

对于接合糖酵母属，可用的质粒如得自Zygosaccharomyces rouxii的pSB3(核酸研究13，4267(1985))；可使用如得自酿酒酵母的PHO5启动子和得自Zygosaccharomyces rouxii的GAP-Zr(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子(农业和生物化学(Agri.Biol.Chem.)54，2521(1990))。

对于毕赤氏酵母属，已开发出源自毕赤氏酵母的自主复制序列(PARS1，PARS2)的宿主-载体系统(分子细胞生物学5，3376(1985))，也可以运用高效的启动子如甲醇诱导型AOX启动子，其可用于高细胞密度培养(核酸研究，15，3859(1987))。已开发出用于Pichia angusta(以前称为多形汉逊氏酵母)的宿主载体系统。尽管得自Pichia angusta的自主复制序列(HARS1，HARS2)可用作载体，但它们是相当不稳定的。因此，染色体的多拷贝整合对于它们是有效的(酵母7，431-443(1991))。另外，可使用由甲醇等诱导的AOX(乙醇氧化酶)和FDH(甲酸脱氢酶)启动子。

对于假丝酵母属，已开发了用于麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)，白色假丝酵母(C.albicans)，热带假丝酵母(C.tropicalis)，产朊假丝酵母，等的宿主-载体系统。源自麦芽糖假丝酵母的自主复制序列(农业和生物化学(Agri.Biol.Chem.)51，51，(1987))已被克隆，并已针对麦芽糖假丝酵母开发了利用此序列的载体。此外，已开发用于产朊假丝酵母的带有高效启动子单元的染色体整合载体(JP-A Hei 08-173170)。

对于曲霉属，其中的黑曲霉和米曲霉已得到深入研究，发现了有效的质粒载体和染色体整合载体以及得自胞外蛋白酶基因和淀粉酶基因的启动子(生物技术趋势(Trends in Biotechnology)7，283-287(1989))。

对于木霉属，已开发出针对Tricholderma reesei的宿主载体系统，还有诸如得自胞外纤维素酶基因的启动子(生物技术7，596-603(1989))。

已开发出用于对除微生物以外的植物和动物的多种宿主-载体系统；特别是，那些对昆虫，如蚕的系统(自然315，592-594(1985))，以及对植物如油菜籽，玉米，土豆等的系统。优选运用这些系统表达大量外源蛋白。

具有生产本发明中所用4-卤乙酰乙酸酯还原酶能力的微生物包括能生产NAD⁺依赖型(R)-2-辛醇脱氢酶的属于毕赤氏酵母属，假丝酵母属，Ogataea属的所有菌株，突变体，变异体和转化体，所述转化体通过基因工程构建并获得生产本发明酶的能力。

另外，由上述方法得到的表达本发明(R)-2-辛醇脱氢酶的菌株可用于生产本发明的酶以及下述的仲醇和酮。

这样，本发明涉及上述的通过用(R)-2-辛醇脱氢酶还原酮生成仲醇的方法。本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶可以使用NADH作为辅酶，它比NADPH更便宜更稳定，因此更有利于工业应用。所要的氧化反应可如下进行，将本发明的酶，含有酶的培养液，或其加工产物与反应液接触。

酶与反应液接触的方式并不受限于这些实施例。在反应液中，底物和NADH(酶反应所必需的辅酶)溶解在合适的溶剂中，得到酶活性表达所需的环境条件。包括本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶的微生物加工产物，特别包括那些细胞膜通透性可以通过有机溶剂如去污剂，甲苯等处理而改变的微生物；通过用玻璃珠或通过酶处理破碎真菌菌体得到的无细胞提取物；其部分纯化的提取物等。

在本发明方法中可用于生产仲醇的酮，可以有苯乙酮，2-辛酮，4-卤乙酰乙酸酯衍生物，可由通式1表示的丙酮氧苯衍生物：

通式1

(其中x1和x2表示卤原子)，溴甲基环丙酮，2-乙酰丁内酯，5-氯-2-戊酮。本发明的4-卤乙酰乙酸酯衍生物是用任意卤原子取代乙酰乙酸酯的位置4得到的化合物。组成上述乙酰乙酸酯的醇可以是任意的醇。4-卤乙酰乙酸酯衍生物的卤素可以是溴，氯，和碘，特别优选氯。酯可以是含有直链，支链，和芳香取代基的醇的酯，如甲酯，乙酯，丙酯，异丙酯，丁酯，辛酯，苯酯，等，最优选甲酯。4-卤乙酰乙酸衍生物包括下述衍生物，其含有在位置2带有直链或支链的烷基，或含有卤素，如氯，溴，碘等。丙酮氧苯衍生物的卤素包括溴，氯，碘，和氟，特别优选氟。特别是，可用2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯，它生成的2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯是合成抗细菌药物氧氟沙星的中间体。

本发明还涉及用上述(R)-2-辛醇脱氢酶氧化仲醇生成酮的方法。酮是反应产物，可通过将本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶，生产该酶的微生物，或其加工产物与仲醇反应得到。在本发明中可以作为底物使用的仲醇有这样的烷基醇，其带有卤素或芳香取代基等，如2-丙醇，2-丁醇，2-辛醇，1-苯乙醇等。

此外，以外消旋醇作底物，利用(R)-2-辛醇脱氢酶的不对称氧化能力，可用本发明的酶，生产此酶的微生物，或其加工产物生产光学活性醇。也就是说，通过用本发明的酶优选氧化任一光学异构体以及通过得到残余的光活性醇可以生产具有光学活性的醇。更特定地，本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶在NAD+的参与下与外消旋物反应，所述外消旋物中混合了2-辛醇或1-苯乙醇的(S)和(R)型。本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶(其在立体选择性上极佳)特异性作用于(R)型，将其氧化产生酮。但是，因为它不作用于该醇的(S)型，(S)型的比例逐渐变大。如果对这样积累的(S)型进行分离，可最终从外消旋物中回收该醇的(S)型。以此方法，可从(RS)-2-辛醇得到(S)-2-辛醇，从(RS)-苯乙醇得到(S)-苯乙醇。

在此所用术语“光学活性醇”指所含某一光学异构体比其它光学异构体更多的醇，或所含对映异构体过量，优选过量50％或更多，更优选过量90％或更多，进一步更优选过量95％或更多的醇。而且，本发明的“光学异构体”一般可以称为“光学活性物质”或“对映异构体”。

本发明上述生产酮的方法可与NADH的再生系统组合。NADH从NAD+产生，其伴随着由(R)-2-辛醇脱氢酶催化的氧化反应。NAD+从NADH的再生可使用微生物中所含能从NADH再生NAD+的酶(系统)来实现，或通过在反应系统中加入能从NADH生成NAD+的微生物或酶，例如谷氨酸脱氢酶，NADH氧化酶，NADH脱氢酶，等类似的酶来实现。此外，利用本发明酶的底物特异性，可将还原反应的底物，如2-辛酮，苯乙酮等，加入到反应体系中，通过酶自身的作用共同促使NAD+从NADH的再生。

同样，生产醇的方法可与NAD+的再生系统组合。NAD+从NADH产生并伴随着还原反应。微生物的NAD+还原能力(如糖酵解)可用于从NAD+再生NADH。在反应体系中加入葡萄糖或乙醇可以加强此能力。备选地，能从NAD+产生NADH的微生物，或其处理产物或酶可以加入到反应体系中。NADH的再生可用含有甲酸脱氢酶，葡萄糖脱氢酶，麦芽糖脱氢酶，甘油脱氢酶，乙醇脱氢酶，或类似酶的微生物，或其处理产物或其纯化的酶来进行。例如，在上述葡萄糖脱氢酶的情况下，可利用葡萄糖向δ-葡萄糖酸内酯的转化进行NADH的再生。利用本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶的性质，NADH可通过将氧化反应的底物，如2-辛醇加入到反应体系而利用酶自身进行再生。

NADH再生反应必需的反应物可以以它们通常的形式或它们的固定化产物加入到生成本发明醇的反应体系中。反应物也可以通过一种能进行NADH交换的膜与反应体系接触。

当用含有本发明DNA的重组载体所转化的微生物以活性状态生产上述醇时，用于NADH再生的附加反应系统可以省略。即，通过使用具有高NADH再生活性的微生物，可利用转化体进行有效的还原反应，而不添加用于NADH再生的酶。而且，通过在宿主中引入可用于NADH再生的葡萄糖脱氢酶，甲酸脱氢酶，乙醇脱氢酶，氨基酸脱氢酶，有机酸脱氢酶(例如，苹果酸脱氢酶，等)，等基因，以及同时引入编码本发明NAD+依赖型(R)-2-辛醇脱氢酶的DNA，可以进行NADH再生酶以及NAD+依赖型(R)-2-辛醇脱氢酶的更有效表达和还原反应。将这两个或多个基因引入宿主的方法有，用多个重组载体转化宿主的方法，将两个基因都引入一个单独载体的方法，和将两个基因引入染色体的方法，其中所述多个载体可通过为避免不相容而分别将基因引入具有不同复制起点的多个载体而获得。

本发明中可用于NADH再生的葡萄糖脱氢酶的例子包括得自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶。另外，甲酸脱氢酶的例子包括得自母牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶。编码这些酶的基因已经克隆。备选地，这样的基因可通过基于已知的核苷酸序列的PCR或杂交筛选从微生物中得到。

当将多个基因引入一个载体时，每个基因都连接到涉及表达调节的区域，例如启动子或终止子。多个基因也可以以包括多个顺反子的操纵子象乳糖操纵子的形式表达。

使用本发明酶的氧化或还原反应可在水中，或不溶于水的有机溶剂如乙酸乙酯，乙酸丁酯，甲苯，氯仿，正己烷，等，或在所述有机溶剂与水介质如乙醇，丙酮等的两相系统中进行。

使用固定化酶，膜反应器等可以完成本发明的反应。

本发明的用(R)-2-辛醇脱氢酶进行的酶反应可在下列条件下进行：

●反应温度：4-60℃，优选10-37℃

●pH：3-11，优选5-10，更优选6.0-9.0

●底物浓度：0.01-90％，优选0.1-30％

必要的话，可在反应体系中加入0.001-100mM或优选0.01-10mM辅酶NAD+或NADH。尽管底物可以在反应开始时马上加入，优选连续或不连续加入，这样可以使反应混合液中底物浓度不至于太高。

要加入到再生NADH反应体系的化合物，包括，例如，使用葡萄糖脱氢酶的情况下是葡萄糖，使用甲酸脱氢酶的情况下是甲酸，使用乙醇脱氢酶的情况下是乙醇或2-丙醇，加入时对底物酮的摩尔比是0.1∶20，优选比底物酮过量0.5-5倍。加入的再生NADH的酶，如葡萄糖脱氢酶，甲酸脱氢酶，或乙醇脱氢酶可以是0.1-100倍，优选0.5-20倍于本发明NAD+-依赖型(R)-2-辛醇脱氢酶的酶活性。

本发明中，通过还原酮产生的醇和不对称氧化外消旋醇产生的醇可通过适当组合对微生物细胞和蛋白的离心，经过膜处理等的分离，溶剂萃取，蒸馏等方法而纯化。

例如，对于4-卤-3-羟基丁酸酯，在用离心从包含微生物细胞体的反应混合物中除去微生物细胞后，可在上清液中加入溶剂如乙酸乙酯，甲苯等，将4-卤-3-羟基丁酸酯萃取到溶剂层。在相分离后蒸馏可以纯化得到高浓度的4-卤-3-羟基丁酸酯。

用于所述各种合成反应的本发明的酶并不限于纯化的酶，还包括部分纯化的酶，含此酶的微生物细胞，及其加工产物。在此所用术语“已加工的产物”总起来说是指微生物细胞，纯化的酶，部分纯化的酶，或由各种方法产生(fix)的类似物。构成本发明酶反应的酶可以以固定化的形式使用。酶固定化的方法并不特别受限制。例如，使用戊二醛，丙烯酰胺，κ-角叉菜聚糖，藻酸钙，离子交换树脂，硅藻土及其它来固定酶的方法是已知的。本发明的反应可利用膜反应器等进行。组成膜反应器的膜例如超滤膜，疏水膜，阳离子膜，纳米滤膜(J.Ferment.Bioeng.83，54-58(1997))等。

所有在此的引用都作为参考文献引入。

附图简述

图1表示pH变化对纯化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶活性的影响。纵轴表示以(R)-2-辛醇脱氢酶最大活性为100时的相对活性。

图2表示pH变化对纯化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶的乙基4-氯乙酰乙酸酯还原活性的影响。纵轴表示以最大活性为100时的相对活性。

图3表示温度变化对纯化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶活性的影响。纵轴表示以最大活性为100时的相对活性。

图4表示温度变化对纯化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶的乙基4-氯乙酰乙酸酯还原活性的影响。纵轴表示以最大活性为100时的相对活性。

图5表示纯化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶的残余活性。纵轴表示残余活性，其以未经处理的酶活性为100。

图6表示质粒(pSE-PFO1)的构建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脱氢酶基因已引入其中。在此质粒图谱上，简写如下表示：P(trc)，trc启动子；T(rrnB)，rrnBT1T2终止子；Amp，表现出氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因；ori，质粒的复制起点；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物。pSE-PFO1中的PfODH表示得自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶。

图7表示质粒(pSE-PFO2)的构建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脱氢酶基因已引入其中。在此质粒图谱上，简写如下表示：P(trc)，trc启动子；T(rrnB)，rrnBT1T2终止子；Amp，表现出氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因；ori，质粒的复制起点；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物。pSE-PFO2中的PfODH表示得自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶。

图8表示质粒(pSE-BSG3)的构建，得自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因已引入其中。在此质粒图谱上，简写如下表示：P(trc)，trc启动子；T(rrnB)，rrnBT1T2终止子；Amp，表现出氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因；ori，质粒的复制起点；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；BsGlcDH，得自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因。

图9表示质粒(pSG-PFO1)的构建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脱氢酶基因和得自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因已引入该质粒中。在此质粒图谱上，简写如下表示：P(trc)，trc启动子；T(rrnB)，rrnBT1T2终止子；Amp，表现出氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因；ori，质粒的复制起点；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；BsGlcDH，得自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因；PfODH，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脱氢酶基因。

图10表示质粒(pSG-PFO2)的构建，其中引入了得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脱氢酶基因和得枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因。在此质粒图谱上，简写如下表示：P(trc)，trc启动子；T(rrnB)，rrnBT1T2终止子；Amp，表现出氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因；ori，质粒的复制起点；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；BsGlcDH，得自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因；PfODH，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脱氢酶基因。

图11表示质粒(pSE-MCF15)的构建，得自母牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶基因已引入其中。在此质粒图谱上，简写如下表示：P(trc)，trc启动子；T(rrnB)，rrnBT1T2终止子；Amp，表现出氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因；ori，质粒的复制起点；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；McFDH，得自母牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶基因。

图12表示质粒(pSF-PFO2)的构建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脱氢酶基因和得自母牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶基因已引入其中。在此质粒图谱上，简写如下表示：P(trc)，trc启动子；T(rrnB)，rrnBT1T2终止子；Amp，表现出氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因；ori，质粒的复制起点；rop，ROP-蛋白基因；1aqIq，乳糖阻遏物；McFDH，得自母牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶基因；PfODH，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脱氢酶基因。

图13表示pH变化对纯化自产朊假丝酵母的(R)-2-辛醇脱氢酶活性的影响。纵轴表示相对活性，其中以最大活性为100。

图14表示pH变化对纯化自产朊假丝酵母的(R)-2-辛醇脱氢酶的乙基4-氯乙酰乙酸酯还原活性的影响。纵轴表示相对活性，其中以最大活性为100。

实施本发明的最佳模式

本发明参照下面的实施例进行详细说明，但并不限于此。实施例1：(R)-2-辛醇脱氢酶的筛选

酵母的(R)-2-辛醇脱氢酶通过电泳后的活性染色方法来筛选，底物为(R)-或(S)-2-辛醇底物，反应混合物包括NAD+，吩嗪硫酸二甲酯(PMS)，氮蓝四唑(NBT)。反应混合物的组成如下：

5mM(R)-或(S)-2-辛醇

1.3mM NAD+

0.13mM PMS

0.48m MNBT

结果，当底物是(S)-2-辛醇时没有被染色，但当底物是(R)-2-辛醇时优先被染色的酶在以下酵母菌株中发现。这些有着(R)-2-辛醇脱氢酶活性的酶也具有通过还原4-氯乙酰乙酸乙酯生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的活性。

●Pichia finlandica：DSM 70280，DSM 1380

●Pichia jadinii：DSM 2361，DSM 70167，IFO 0987

●产朊假丝酵母：IFO 0988，IFO 0626

●Ogataea wickerhamii：IFO 1706实施例2：生产(R)-2-辛醇脱氢酶的培养条件

实施例1的生产(R)-2-辛醇脱氢酶的菌株由2％葡萄糖改变为2％甘油或1％甲醇的碳源中培养。结果是，Pichia finlandica可以在所有培养液中诱导此酶。当甲醇作碳源时，产朊假丝酵母可以强烈诱导该酶。实施例3：纯化得自于Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶

Pichia finlandica DSM 70280菌株培养在4.8L培养基A中，离心制备微生物细胞。得到的微生物细胞悬浮在100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，10％甘油，1mM乙二胺四乙酸2Na(EDTA2·Na)，0.02％2-巯基乙醇，和2mM苯甲烷磺酰氟(PMSF)中，用玻璃珠搅拌器(Biospec)匀浆。然后，离心除去微生物细胞碎片，得到无细胞提取液。加入硫酸鱼精蛋白，离心除去核酸得到上清液。将硫酸铵加入上清液中，在40-75％饱和度得到沉淀的级分。将含有30％饱和度的硫酸铵的标准缓冲液加入到沉淀级分中，得到含有40％(终浓度)饱和的硫酸铵的酶液。离心该酶液得到上清液。将该上清液上样到以含有30％饱和的硫酸铵的标准缓冲液平衡的Phenyl-Toyopearl650M(5.0cm×25cm)，以30％-0％饱和的硫酸铵梯度洗脱。培养基A和标准缓冲液的组成如下：

培养基A：

10g/L酵母提取物

20g/L蛋白胨

20g/L葡萄糖

pH6.0

标准缓冲液：

10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)

0.01％2-巯基乙醇

10％甘油

(R)-2-辛醇脱氢酶活性可以在梯度洗脱的级分中观测到。回收该峰值部分并通过超滤浓缩。

浓缩的酶液用标准缓冲液透析后，离心得到上清液。将上清液上样到Blue-Sepharose CL-6B(5cm×10cm)，以标准缓冲液洗柱，用0-1.5M氯化钠进行浓度梯度洗脱。当(R)-2-辛醇脱氢酶活性已洗脱在梯度洗脱部分中时，回收和浓缩该级分。用标准缓冲液(pH8.5)透析浓缩的酶液后，上样到DEAE-Sepharose FF(1.6cm×10cm)，以标准缓冲液冲洗，用0-1M氯化钠进行浓度梯度洗脱。当(R)-2-辛醇脱氢酶活性已洗脱至流过级分和梯度洗脱部分中时，回收和浓缩这些活性级分。对得自流过级分的酶液进行凝胶过滤，其使用Superdex 200(0.32cm×30cm，SMART系统，Amersham PharmaciaBiotech)，并使用含0.3M氯化钠的标准缓冲液。将凝胶过滤的活性级分浓缩得到酶。

所纯化的酶的最高比活性是约91U/mg-蛋白，其是氧化(R)-2-辛醇的活性。纯化概述如下表：

表1

步骤蛋白量总活性比活(mg) (U) (U/mg)
步骤蛋白量总活性比活(mg) (U) (U/mg)	无细胞提取物 26,900 603 0.0224去除的核酸 10,900 588 0.054040-75％的硫酸铵 5,560 361 0.0649Phenyl-Toyopearl 398 162 0.408Blue-Sepharose 11.7 46.9 3.59DEAE-Sepharose 0.880 4.53 5.15Superdex 200 0.00288 0.262 91.1

实施例4：(R)-2-辛醇脱氢酶分子量的测定

SDS-PAGE结果显示实施例3中得自Pichia finlandica的酶的分子量约为30,000Da。当使用Superdex200柱凝胶过滤时，分子量约为83,000Da。实施例5：(R)-2-辛醇脱氢酶的最佳pH

使用磷酸缓冲液(KPB)，Tris-HCl缓冲液，甘氨酸缓冲液改变pH，观察实施例3所得酶的(R)-2-辛醇脱氢酶活性。图1显示了相对活性，其以最大活性为100。实验结果为，此酶的最佳pH范围为8.0-11.0。

接着，使用磷酸缓冲液(KPB)，Tris-HCl缓冲液，甘氨酸缓冲液改变pH，观察实施例3所得酶的4-氯乙酰乙酸乙酯还原酶活性。图2显示了以最大活性为100时的相对活性。实验结果为，此酶的最佳pH范围为5.0-6.5。实施例6：(R)-2-辛醇脱氢酶的最佳温度

在标准反应条件下只改变温度观察得自实施例3的酶的(R)-2-辛醇氧化活性。图3显示了以最大活性为100时的相对活性。实验结果为，此酶的最佳温度范围为45-55℃。

在标准反应条件下只改变温度观察得自实施例3的酶的4-氯乙酰乙酸乙酯还原酶活性。图4显示了以最大活性为100时的相对活性。实验结果为，此酶的最佳温度范围为55-60℃。实施例7：酶稳定的pH范围

实施例3的酶在Britten-Robinson缓冲液pH3-12，30℃下孵育30分钟，测定残余活性。图5显示了残余活性，其以未处理的酶活性为100。pH8.0-9.0之间酶最稳定。实施例8：(R)-2-辛醇脱氢酶的底物特异性

使(R)-2-辛醇脱氢酶与各种醇反应，测定其氧化活性。表2表示了相对活性，其以(R)-2-辛醇在NAD+为辅酶时的氧化活性为100。

表2

底物(氧化反应)

(R)-2-辛醇 100

(S)-2-辛醇 4.73

2-丙醇 6.79

1-辛醇 1.72

乙基(R)-4-氯-3-羟基丁酸酯 0.172

乙基(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯 2.24

(R)-1-苯乙醇 255

(S)-1-苯乙醇 1.81

乙基(R)-3-羟基丁酸酯 41.1

乙基(S)-3-羟基丁酸酯 1.03

乙醇 0.668

(R)-2-丁醇 49.3

(S)-2-丁醇 7.31

环己醇 0.172

(R)-1-苯基-1，3-丙二醇 0.344

(S)-1-苯基-1，3-丙二醇 0.258

2-己醇 54.1

(R)-1，3-丁二醇 1.29

(S)-1，3-丁二醇 0.516

2-辛醇 77.8

1-苯氧基-2-丙醇 15.5

结果是，对(S)-2-辛醇的相对活性为4.7％，对2-丙醇为6.8％，对(R)-1-苯乙醇为255％。

使实施例3的酶与各种酮反应，测定其还原活性。表3显示了以NADH为辅酶的4-氯乙酰乙酸乙酯还原活性为100时的相对活性。

表3

底物(还原反应)

乙基4-氯乙酰乙酸酯 100

2-辛酮 31.2

苯乙酮 45.3

乙酰乙酸乙酯 106

1-苯氧基-2-丙酮 54.2

丙醛 18.4

4-羟基-2-丁酮 0.691

丙酮 1.82

2-丁酮 7.99

实验结果为，对2-辛酮的相对活性为31.2％，对苯乙酮为45％。实施例9：(R)-2-辛醇脱氢酶对试剂的行为

(R)-2-辛醇脱氢酶用各种试剂30℃下处理30分钟，测定(R)-2-辛醇脱氢酶活性。表4显示了所得残余活性，其以未加试剂而在30℃处理了30分钟的酶的活性为100。本发明(R)-2-辛醇脱氢酶受氯化汞和乙二胺四乙酸2Na(EDTA·2Na)的轻微抑制。用N-乙基马来酰亚胺，o-菲咯啉，氯化镁，氯化钙，和氯化锰稳定该酶。

表4

试剂浓度残余活性

(mM) (％)

对照 - 100

苯甲基磺酰氟 1 111

对氯苯甲酸汞 0.05 118

N-乙基马来酰亚胺 1 147

EDTA·2Na 1 81

O-菲咯啉 1 162

二硫苏糖醇 1 123

NH₂OH·HCl 0.01 99

五羟黄酮 0.1 99

KCl 1 106

MgCl₂·6H₂O 1 185

CaCl₂·2H₂O 1 174

MnCl₂·4H₂O 1 185

FeCl₂ 1 93

CoCl₂·6H₂O 1 99

NiCl₂·6H₂O 1 103

ZnCl₂ 1 96

BaCl₂·2H₂O 1 102

CuSO₄ 1 100

HgCl₂ 0.01 62实施例10：试剂对(R)-2-辛醇脱氢酶的活化作用

测定在各种试剂中(R)-2-辛醇脱氢酶的活化作用。表5显示了得到的活性，其以没有试剂时的活性为100。本发明(R)-2-辛醇脱氢酶被镁，锰和锌离子活化。阴离子中，硫酸离子可活化此酶活性。

表5

试剂浓度相对活性

(mM) (％)

对照 - 100

MgCl₂·6H₂O 1 122

MgSO₄ 1 125

MnCl₂·4H₂O 1 114

MnSO₄·4-5H₂O 1 121

ZnCl₂ 1 105

ZnSO₄·7H₂O 1 110实施例11：(R)-2-辛醇脱氢酶的部分氨基酸序列

采用实施例3的，但N端氨基酸已被封闭的酶通过蛋白测序仪分析N端氨基酸序列。然后，SDS-PAGE分离所纯化的酶，切下含有(R)-2-辛醇脱氢酶的凝胶。将含有胰蛋白酶的Tris缓冲液加入该凝胶中，35℃下处理20小时。然后，用反相HPLC处理样品溶液，分离肽段。用蛋白测序仪分析肽段。结果得到三种氨基酸序列。肽A，B，C的氨基酸序列分别表示在SEQID NO：3，4，5中。

SEQ ID NO：3：肽A

Val-Ala-Val-Val-Thr-Gly-Ala-Leu-Ser-Gly

SEQ ID NO：4：肽B

Leu-Ile-Ser-Glu-Thr-Leu-Ala-Thr-Phe-Gly-Gly-Leu

SEQ ID NO：5：肽C

Leu-Gly-Arg-Pro-Glu-Glu-Val-Ala-Asp-Ala实施例12：从Pichia finlandica制备染色体DNA

通过Cryer方法(细胞生物学方法(Meth.Cell Biol.)12，39-44(1975))，从Pfchia finlandica纯化染色体DNA。实施例13：对(R)-2-辛醇脱氢酶基因的核心区域的PCR克隆

合成对应于肽A的有义引物和对应于肽C的反义引物。将BamHI限制酶切位点(GTCGGATCC)加入到每一引物的5’端。每一引物的核苷酸序列表示在SEQ ID NO：6(引物A)和SEQ ID NO：7(引物C)中。

SEQ ID NO：6：引物A

GTCGGATCCGTBGCHGTBGTBACHGGHGC

SEQ ID NO：7：引物C

GTCGGATCCGCRTCNGCNACYTCYTCNGG

用50μL反应液进行PCR，其中含有引物A和C各50pmol，10nmoldNTP，100ng来自Pichia finlandica的染色体DNA，用于ExTaq的缓冲液(Takara)，和ExTaq 2U(Takara)。PCR条件为94℃变性30秒，37℃下退火30秒，70℃下延伸1分钟的30个循环。结果为特异性PCR产物得到了扩增。实施例14：对(R)-2-辛醇脱氢酶基因核心区域的PCR片段的亚克隆

PCR扩增的每一DNA片段用苯酚/氯仿提取，经乙醇沉淀回收，BamHI限制酶消化。2％琼脂糖凝胶电泳后，使用Sephaglas(Pharmacia)切下合适宽度的区带，回收。

使用Takara连接试剂盒第2版将得到的每一DNA片段与BamHI限制酶消化的pUC18(Takara)连接。然后，大肠杆菌(E.coli)菌株JM109用其转化。转化菌株在平板上孵育，该平板上含有50μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷和20μg/mL异丙基硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(IPTG)和LB培养基(1％细菌用蛋白胨，0.5％细菌用酵母提取物，1％氯化钠)。一些白色的菌落在含氨苄青霉素的液体LB培养基中培养，采用Flex-Prep(Pharmacia)纯化含有DNA片段的质粒。

利用此质粒，分析插入的DNA的核苷酸序列。用BigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction试剂盒(Applied Biosystems)进行PCR，采用PRISM 310基因分析试剂盒(Applied Biosystems)分析DNA的核苷酸序列。测定的核心区核苷酸序列表示在SEQ ID NO：8：PF-CORE中。实施例15：(R)-2-辛醇脱氢酶基因核心区附近的DNA的亚克隆

用BstYI，NspI，PstI限制性酶消化来自Pichia finlandica的染色体DNA。每一片段用T4连接酶16℃过夜使之自我连接而环化。将BamHI酶切位点(GTCGGATCC)加入到引物PfOD-c5u(SEQ ID NO：9)和PfOD-c3d(SEQ IDNO：10)的5’末端。PCR在含上述引物各50pmol，10nmol dNTP，125ng自连接的DNA，用于ExTaq的缓冲液(Takara)，ExTaq 1U(Takara)的反应液中进行。PCR条件为94℃变性30秒，55℃下退火30秒，70℃下延伸7分钟的30个循环，采用的是GeneAmp PCR系统2400(Perkin Elmer)。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测到约为3500bp，2000bp，4000bp的DNA片段，它们分别对应于模板DNA用BstYI，NspI，和PstI酶消化得到的DNA片段。

SEQ ID：9：PfOD-c5u

GTCGGATCCTCAGAGATCGTTACTTTGGC

SEQ ID：10：PfOD-c3d

GTCGGATCCCGACTCCTTTGATAGATGAG

PCR扩增的每一DNA片段用苯酚/氯仿提取，经乙醇沉淀回收，并用BamHI限制酶消化。琼脂糖凝胶电泳后，用Sephaglas(Pharmacia)切下有着适当宽度的区带，并回收。

使用Takara连接试剂盒第2版，将得到的每一DNA片段连接到用BamHI限制酶消化的pUC18(Takara)。然后用其转化大肠杆菌菌株JM109。转化菌株在含有LB培养基(1％细菌用蛋白胨，0.5％细菌用酵母提取物，1％氯化钠)的平板上孵育，培养基中有50μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷，和20μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。取一些白色菌落培养在含氨苄青霉素的液体培养基中，用Flex-Prep(Parmacia)纯化含DNA片段的质粒。得到的质粒是pPF-Bst，pPF-Nsp，和pPF-Pst，其分别对应于用于制备的限制酶BstYI，NspI，和PstI。

从所纯化质粒分析所插入DNA的核苷酸序列。用BigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction试剂盒(Applied Biosystems)进行PCR。DNA的核苷酸序列用PRISM310基因分析试剂盒(Applied Biosystems)分析。将分析过的，pPF-BST，pPF-Nsp，和pPF-Pst中所插入DNA的核苷酸序列分到核心区的5’上游区域和3’下游区域并表示为PF-5U(SEQ ID NO：11)和PF-3D(SEQ ID NO：12)。

合成PF-5U，PF-3D，和PF-CORE的核苷酸序列，通过开放读码框(ORF)检索确定(R)-2-辛醇脱氢酶的序列。所确定的核苷酸序列表示在SEQ IDNO：1中，核苷酸序列编码的氨基酸序列表示为SEQ ID NO：2。这些合成和ORF检索用软件Genetyx-ATSQ/WIN和Genetyx-WIN(SoftwareDeveloping Company)进行。实施例16：(R)-2-辛醇脱氢酶的克隆-1

基于(R)-2-辛醇脱氢酶结构基因的核苷酸序列合成用于构建表达载体的引物PFO-ATG1(SEQ ID No：13)和PFO-TAA1(SEQ ID NO：14)。用含上述引物各50pmol，10nmoldNTP，50ng来自Pichia finlandica的染色体DNA，用于Pfu-DNA聚合酶的缓冲液(STRATAGENE)，和Pfu-DNA聚合酶1.25U(STRATAGENE)的50μL反应液进行PCR。PCR条件为95℃变性30秒，55℃下退火1分钟，70℃下延伸1.5分钟的30个循环，采用的是GeneAmpPCR系统2400(PerkinElmer)。

SEQ ID NO：13 PFO-ATG1

TCGACATGTCTTATAATTTCCATAACAAG

SEQ ID NO：14 PFO-TAA1

GCAGAATTCCTCTAGATTACTGGGCTGTGTACCC

PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，可以检测到特异性区带。

得到的DNA片段用苯酚/氯仿提取，经乙醇沉淀回收。用AflIII和EcoRI限制酶消化所述DNA片段。琼脂糖凝胶电泳后，使用Sephaglas(Pharmacia)切下合适宽度的区带，回收。

将得到的DNA片段用Takara连接试剂盒连接到用NcoI和EcoRI限制酶消化的质粒pSE420D(Invitrogen)，但带有修饰的多克隆位点的变体(JP-A2000-189170)上。然后，用其转化大肠杆菌JM109菌株。

将转化菌株在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上培养。从一些菌落中纯化质粒，分析插入片段的核苷酸序列。将含有本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶的质粒命名为pSE-PF01。图6表示了构建该质粒的过程。实施例17：(R)-2-辛醇脱氢酶的克隆-2

用于构建表达载体的引物PFO-ATG2(SEQ ID NO：15)和PFO-TAA2(SEQ ID NO：16)根据(R)-2-辛醇脱氢酶结构基因的核苷酸序列合成。用50μL反应液进行PCR，其中包括上述引物各10pmol，10nmol dNTP，50ng来自Pichia finlandica的染色体DNA，用于Pfu-DNA聚合酶的缓冲液(STRATAGENE)，和Pfu-DNA聚合酶1.25U(STRATAGENE)。PCR条件为95℃变性30秒，50℃下退火60秒，70℃下延伸1.5分钟的30个循环，采用的是GeneAmp PCR系统2400(PerkinElmer)。

SEQ ID NO：15 PFO-ATG2

CACGAATTCTAAAATGTCTTATAATTTCCATAACAAG

SEQ ID NO：16 PFO-TAA2

AGTACTAGTATTACTGGGCTGTGTACCC

PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，可以检测到特异性区带。

得到的DNA片段用苯酚/氯仿提取，经乙醇沉淀回收，然后用EcoRI和SpeI限制酶消化。琼脂糖凝胶电泳后，使用Sephaglas(Pharmacia)切下合适宽度的区带。

将得到的DNA片段借助Takara连接试剂盒连接到SpeI和EcoRI限制酶消化的质粒pSE420D上。然后，用其转化大肠杆菌JM109菌株。

将转化菌株在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上培养。从一些菌落纯化质粒，分析插入片段的核苷酸序列。有着本发明的(R)-2-辛醇脱氢酶的质粒命名为pSE-PF02。图7表示了构建该质粒的过程。实施例18：由大肠杆菌生产重组(R)-2-辛醇脱氢酶

将用(R)-2-辛醇脱氢酶基因的表达质粒pSE-PF01和pSE-PF02转化的JM109菌株，在含氨苄青霉素的液体培养基中30℃培养过夜，加入0.1mMIPTG，再培养4小时。

离心收集微生物细胞后，用含有0.02％ 2-巯基乙醇和1mM硫酸镁的100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)悬浮菌体，用密闭超生破碎仪UCD-200TM(CosmoBio)破碎处理4分钟。上清作为提取液回收。实施例19：重组(R)-2-辛醇脱氢酶活性

测定实施例18的重组(R)-2-辛醇脱氢酶对(R)-2-辛醇的活性，并与没有质粒的无细胞提取液的活性相比。结果显示于表6中。

表6

质粒	(R)-2-辛醇脱氢酶活性U/mg-蛋白
质粒	(R)-2-辛醇脱氢酶活性U/mg-蛋白	无	0.00
pSE-PF01	4.16	无	0.00
pSE-PF01	4.16	pSE-PF02	1.95

实施例20：通过各种大肠杆菌菌株生产重组(R)-2-辛醇脱氢酶

用表达(R)-2-辛醇脱氢酶基因的质粒pSE-PF01转化菌株HB101，TG1(大肠杆菌DSM6056)，和MG1665(大肠杆菌ATCC 47076)。

将每种重组大肠杆菌在LB液体培养基中30℃培养过夜，添加0.1mMIPTG，再培养4小时。收集得到的两种大肠杆菌，测定它们的酶活性。实施例21：用质粒pSE-PF01转化的各种大肠杆菌菌株的活性

实施例20的转化的大肠杆菌(对应于2mL培养液)由实施例18的方法破碎。制备提取液，测定酶活。活性显示于表7。

宿主	(R)-2-辛醇脱氢酶活性U/mg-蛋白
宿主	(R)-2-辛醇脱氢酶活性U/mg-蛋白	JM109	4.16
HB101	8.00	JM109	4.16
HB101	8.00	TG1	11.0
MG1655	10.4	TG1	11.0

实施例22：枯草芽孢杆菌DNA的纯化

枯草芽孢杆菌BGSC 1A1菌株培养在LB培养基中。使用QiagenGenomic Tip(Qiagen)，遵循所附手册描述的方法从该菌株提取染色体DNA。实施例23：枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆

为再生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，对文献(JP-A 2000-189170)所述的枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因克隆。按照该参考中的方法得到pSE-BSG1。合成引物BSG-ATG3(SEQ ID NO：19)和BSG-TAA3(SEQ IDNO：20)，基于结构基因5’末端和3’末端的序列构建新的质粒。使用pSE-BSG1作模板进行PCR，条件为95℃变性30秒，50℃下退火60秒，75℃下延伸3分15秒的30个循环。然后，获得特异性区带。

SEQ ID NO：17：BSG-ATG3

AGACCATGGATCCAATGTATCCAGATTTAAAGGAA

SEQ ID NO：18：BSG-TAA3

GAATCTAGATTAACCGCGGCCTGCCTG

得到的DNA片段用NcoI和XbaI限制酶消化。质粒载体也用NcoI和XbaI限制酶消化。PCR扩增后用两种酶消化的DNA片段用T4 DNA连接酶连接到上述质粒中，得到pSE-BSG3。图8表示了构建该质粒的过程。实施例24：共表达Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶基因和枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的质粒pSG-PF01的构建

通过用两种限制性酶，MluI和EcoRI消化实施例15中构建的pSE-PF01制备出含有Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶基因的DNA片段。

实施例23中构建的质粒pSE-BSG1包含得自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因，用两种限制性酶，MluI和EcoRI消化该质粒，制备含有得自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因的DNA片段。用T4连接酶将该片段连接到含有Pichia finlandica的，用酶从pSE-PF01剪切得到的(R)-2-辛醇脱氢酶基因的DNA片段上，得到质粒pSG-PF01，其可同时表达葡萄糖脱氢酶和(R)-2-辛醇脱氢酶。图9表示了该质粒的构建过程。实施例25：共表达Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶基因和枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的质粒pSG-PF02的构建

用两种限制性酶，EcoRI和SpeI消化在实施例16中构建的pSE-PF02，从而制备含有Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶基因的DNA片段。

实施例23构建的质粒pSE-BSG3含有得自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因，用用两种限制性酶，EcoRI和SpeI消化该质粒。用T4 DNA连接酶将此片段连接到下述DNA片段，该DNA片段包含用酶从pSE-PF02剪切得到的来自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶基因，这样就得到了质粒pSG-PF02，其可同时表达葡萄糖脱氢酶和(R)-2-辛醇脱氢酶。图10表示了该质粒的构建过程。实施例26：枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶和Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶在大肠杆菌中的同时表达

用共表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶和Pichia finlandica(R)-2-辛醇脱氢酶的质粒pSG-PF01或pSG-PF02转化大肠杆菌菌株JM109。

将每种重组大肠杆菌菌株接种至LB液体培养基中，30℃下培养过夜。然后，加入IPTG 0.1mM，再培养大肠杆菌4小时。收集得到的两种大肠杆菌，测定酶活。实施例27：用pSG-PF01或pSG-PF02转化的大肠杆菌的酶活性

实施例26中转化的大肠杆菌(相当于2mL培养液)用实施例17的方法破碎以制备提取物。此提取物用于酶活的测定。在含100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)，2.5mM NAD+，100mM D-葡萄糖，和葡萄糖脱氢酶的反应液中30℃下进行酶活性的测定。1U为在上述条件下1分钟催化生产1μmol NADH的酶量。两者活性列于表8中。

表8

质粒	(R)-2-辛醇脱氢酶活性U/mg-蛋白	葡萄糖脱氢酶活性U/mg-蛋白
质粒	(R)-2-辛醇脱氢酶活性U/mg-蛋白	葡萄糖脱氢酶活性U/mg-蛋白	pSG-PF01	5.64	0.14

pSG-PF02

8.80

0.15

实施例28：母牛分枝杆菌甲酸脱氢酶的亚克隆

从参考文献(Appl.Microbiol.Biotechnol.44，479-483(1995))所描述的母牛分枝杆菌中克隆甲酸脱氢酶基因以再生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。

基于该参考文献中结构基因的5’端和3’核苷酸序列合成引物MCF-ATG2(SEQ ID NO：19)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：20)，以便只克隆甲酸脱氢酶的开放读码框。采用质粒pSFR415(Seimeikenjouki登记号7391(FERMBP-7391))为模板进行PCR，95℃下45秒，50℃下1分钟，75℃下7分钟共30个循环。然后得到特定的区带。得到的DNA片段用NcoI和XbaI限制酶消化。质粒pSE420D也用NcoI和XbaI限制酶消化。将用同样的酶消化的DNA片段用T4 DNA连接酶连接到载体上，得到pSE-MCF15。图11显示了构建该质粒的方法。

插入的DNA片段的核苷酸序列分析结果显示，此DNA编码的蛋白与所述文献中的氨基酸序列相同。

SEQ ID NO：19：MCF-ATG2

CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTTCTGTGTGTTC

SEQ ID NO：20：MCF-TAA3

CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTTGGCG

用pSFR415转化的大肠杆菌菌株JM109的国际保藏：

(a)保藏机构名称和地址

名称：国立生命科学和人体技术研究所，产业技术综合研究所，经济通产省(原名：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所)

地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号305-8566

(b)保藏日期：2000年11月10日

(c)保藏号码：FERM BP-7391实施例29：既表达Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶又表达分枝杆菌的甲酸脱氢酶的质粒pSF-PF02的构建

实施例16的pSE-PF02用EcoRI和SpeI消化，制备含Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶的DNA片段。

实施例28的质粒pSF-MCF15用EcoRI和SpeI消化，制备含分枝杆菌甲酸脱氢酶基因的DNA片段。使用T4连接酶将该DNA连接至含有用上述酶从pSE-PF01剪切得到的Pichia finlandica(R)-2-辛醇脱氢酶基因的DNA片段。于是，得到了可同时表达甲酸脱氢酶和(R)-2-辛醇脱氢酶的质粒pSF-PF02。图12显示了构建该质粒的方法。实施例30：在大肠杆菌中同时表达Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶和分枝杆菌的甲酸脱氢酶

用质粒pSF-PF02转化大肠杆菌菌株JM109，该质粒可共表达Pichiafinlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶和分枝杆菌的甲酸脱氢酶。

将此重组大肠杆菌接种至LB液体培养基中，30℃下培养过夜。然后，加入IPTG 0.1mM，再培养大肠杆菌4小时。收集得到的大肠杆菌，测定酶活。实施例31：用pSF-PF02转化的大肠杆菌的酶活性

实施例30中制备的用pSF-PF02转化的大肠杆菌(相当于2mL培养液)按照实施例17的方法进行破碎以制备提取液。提取液用于测定酶活。在30℃下进行葡萄糖脱氢酶活性的测定，反应液中含有100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)，2.5mM NAD⁺，100mM甲酸，及所述酶。1U表示为在上述条件下1分钟内催化生产1μmol NADH的酶量。由重组大肠杆菌得到的粗制酶液的(R)-2-辛醇脱氢酶活性为8.99U/mg-蛋白，甲酸脱氢酶活性为0.653U/mg-蛋白。实施例32：用Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脱氢酶合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)，139.8mg NADH，1.75U实施例3的Pichiafinlandica(R)-2-辛醇脱氢酶，和0.5％4-氯乙酰乙酸乙酯30℃下反应过夜。生产的(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯的光纯度按照下列方法确定。从反应液中用乙酸乙酯萃取出(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯，除去溶剂，使用光学离析柱进行液相色谱分析。液相色谱采用Daicel Chemical Industries，LTD的CHIRALCELOD.(4.6mm×25cm)和洗脱液(正己烷∶2-丙醇＝93∶7)以流速1mL/min进行，并进行RI检测。结果显示，本发明生产的4-氯-3-羟基丁酸乙酯中S型超过99％。实施例33：用Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脱氢酶合成2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯

将含有1％2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯的1mL甲苯加入1mL反应液中，该反应液含有200mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)，86mM葡萄糖，1mM NAD+，1mM硫酸镁，1U的实施例3的Pichia finlandica(R)-2-辛醇脱氢酶，25℃下搅拌反应15小时。

最终反应物的分析结果显示，产生了1.0g/L的2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯，其光学纯度为100％。

通过HPLC分析水相和有机相中得到的产物来定量2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯，所述HPLC在室温下，洗脱液(水/乙腈＝1/1)以流速0.5mL/min进行洗脱。260nm下进行UV检测。

使用光学离析柱(Daicel Chemical Industries，LTD的CHIRALCEL OD.0.46mm×25cm)通过HPLC进行2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯的光学纯度的检测，所述HPLC在40℃下用洗脱液(己烷∶2-丙醇＝9/1)以流速1mL/min进行洗脱。260nm下进行UV检测。实施例34：使用pSF-PF02合成2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯

收集实施例30的用pSF-PF02转化的大肠杆菌(相当于5mL培养液)。将500mg 2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯加入到5.22mL反应液中，该反应液含有500mM HEPES/NaOH缓冲液(pH6.5)，829mM甲酸钠，1mM硫酸镁，30℃下搅拌反应18小时。

最终反应液的分析结果显示，产生了486mg 2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯，其光学纯度为约100％。

2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯的定量测定按照下面方法进行：添加甲苯到反应液中以便萃取出产物，通过气相色谱分析水相和有机相中的产物。得到该合成子(synthon)的产量。气相色谱条件是：OV-21020％Chromosorb W(AW-DMCS)60/80目(G-L Science，3.2mm×200cm)，柱温170℃。使用火焰离子化检测器(FID)进行检测。

使用光学离析柱(Daicel Chemical Industries，LTD的CHIRALCEL OD.0.46mm×25cm)通过HPLC进行2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯的光学纯度的检测，所述HPLC是在40℃用洗脱液(己烷/乙醇＝9/1)以流速1mL/min进行洗脱。260nm下进行UV检测。实施例35：纯化产朊假丝酵母的(R)-2-辛醇脱氢酶

产朊假丝酵母IFO0988菌株培养在3.6L培养基B中，离心制备微生物细胞。得到的微生物细胞悬在100mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)，10％甘油，1mM乙二胺四乙酸2Na(EDTA·2Na)，0.01％2-巯基乙醇，和2mM苯甲烷磺酰氟(PMSF)中，用玻璃珠(Biospec)匀浆。然后，离心除去微生物细胞碎片，得到了无细胞提取液。将硫酸鱼精蛋白加入到此无细胞提取液中，离心除去核酸得到上清液。将硫酸铵加入到上清液中，得到的上清液是粗制酶液，为30％饱和度。用含30％饱和铵的标准缓冲液透析该溶液，上样到phenyl-Sepharose HP柱(2.6cm×10cm)，用相同缓冲液平衡。用30％到0％饱和度硫酸铵进行梯度洗脱。回收提取的级分中具有(R)-2-辛醇选择性的级分并通过超滤浓缩。

培养基B组成如下：

Medium B：

10g/L酵母提取物

20g/L蛋白胨

1％甲醇

pH6.0

已浓缩的酶液用标准缓冲液透析后，上样到Blue-Sepharose HP(1.6cm×2.5cm)，用该缓冲液洗柱。用0到1.5M氯化钠进行浓度梯度洗脱。回收具有(R)-2-辛醇脱氢酶活性的级分并浓缩。将此酶液上样到已用标准缓冲液平衡的Mono Q HR 5/5(0.5cm×5cm)柱，进行0到1M氯化钠的浓度梯度洗脱。回收具有(R)-2-辛醇脱氢酶活性的级分并浓缩。此浓缩酶液使用Superdex200(0.32cm×30cm)，以含0.3M氯化钠的标准缓冲液进行凝胶过滤。浓缩活性级分得到该酶。

该酶的比活是3.33U/mg，这是氧化(R)-2-辛醇的活性。纯化细节总结于表9中：

表9：步骤蛋白量(mg) 总活性(U) 比活(U/mg)无细胞提取物 1,220 6.58 0.00539去除的核酸 396 2.3 0.0058130％硫酸铵 471 1.14 0.00242Phenyl-Sepharose 17.7 0.757 0.0429Blue-Sepharose 10.2 0.745 0.0727MonoQ 0.776 0.386 0.497Superdex 200 0.0131 0.0434 3.33实施例36：(R)-2-辛醇脱氢酶分子量的测定

来自实施例35的产朊假丝酵母的酶经Superdex200凝胶柱测定的分子量大约是150,000Da。实施例37：(R)-2-辛醇脱氢酶的最佳pH

我们使用Tris-HCl缓冲液和甘氨酸缓冲液改变pH，以观察得自实施例35的酶的(R)-2-辛醇脱氢酶活性。图13表示了以最大活性为100时的相对活性。结果显示，此酶的最佳pH是8.5-11.0。

我们还使用磷酸缓冲液(KPB)，乙酸钠(NaOAc)改变pH，以观察得自实施例35的酶的4-氯乙酰乙酸乙酯还原酶活性。图14表示了以最大活性为100时的相对活性。结果显示，此酶的最佳pH是5.0-6.5。实施例38：(R)-2-辛醇脱氢酶的底物特异性

使(R)-2-辛醇脱氢酶与多种醇反应，测定其氧化活性。表10表示了相对活性，其以使用NAD+为辅酶对(R)-2-辛醇的氧化活性为100。结果显示，对(S)-2-辛醇的相对活性为6.7％，对2-丙醇为8.3％，对(R)-1-苯乙醇为86％。

表10

底物(氧化反应)

(R)-2-辛醇 100

(S)-2-辛醇 6.7

2-丙醇 8.3

(R)-1-苯乙醇 86.7

(S)-1-苯乙醇 6.7

实施例35的酶也与多种酮反应，测定其还原活性。表11表示了相对活性，其以使用NADH为辅酶时的4-氯乙酰乙酸乙酯还原活性为100。结果显示，对2-辛酮的相对活性为26.6％，对苯乙酮为25.3％。

表11

底物(还原反应)乙基4-氯乙酰乙酸酯2-辛酮苯乙酮

10026.625.3

实施例39：采用来自产朊假丝酵母的(R)-2-辛醇脱氢酶合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)，139.8mg NADH，0.06U来自产朊假丝酵母的(R)-2-辛醇脱氢酶，0.5％ 4-氯乙酰乙酸乙酯30℃下反应过夜。产生的4-氯-3-羟基丁酸乙酯按照实施例32所述方法测定其光学纯度。结果显示，本发明生产的4-氯-3-羟基丁酸乙酯中S型超过97％ee。

工业应用

本发明提供有利于工业生产的NADH-依赖型(R)-2-辛醇脱氢酶。使用此酶使有效生产光学活性醇如(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯成为可能。特别是，使用4-卤乙酰乙酸酯为底物经本发明的酶反应得到的(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯是合成药物和杀虫剂，如HMG-CoA还原酶抑制剂，D-肉毒碱等的中间体。因此，本发明在工业上特别有用。

综上所述，JP-A Hei 02-732中所述的(R)-丙氧苯衍生物作为中间体是特别有用的化合物，如氧氟沙星((S)-(-)-9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧-2，3-二氢-7H-吡啶并[1，2，3-脱][1，4]苯噁嗪-6-羧酸(JP-A Sho 62-252790，其为合成性抗细菌药物)的光学活性物质。已经确定，氧氟沙星的特定光学异构体具有高抗细菌活性。本发明可以得到具有高光学纯度的氧氟沙星合成中间体，这样就可以合成出氧氟沙星的光学异构体。

序列表<110>大赛璐化学工业株式会社(DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD.)<120>(R)-2-辛醇脱氢酶，产生此酶的方法，编码此酶的DNA，以及使用此酶生产醇类的方法<130>D1-A0001Y1P<140><141><150>JP 2000-43506<151>2000-02-16<150>JP 2000-374593<151>2000-12-08<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>765<212>DNA<213>Pichia finlandica<220><221>CDS<222>(1)..(765)<400>1atg tct tat aac ttc cat aac aag gtt gca gtt gtt act gga gct cta 48Met Ser Tyr Asn Phe His Asn Lys Val Ala Val Val Thr Gly Ala Leu1 5 10 15tca gga atc ggc tta agc gtc gca aaa aag ttc ctt cag ctc ggc gcc 96Ser Gly Ile Gly Leu Ser Val Ala Lys Lys Phe Leu Gln Leu Gly Ala

20 25 30aaa gta acg atc tct gat gtc agt gga gag aaa aaa tat cac gag act 144Lys Val Thr Ile Ser Asp Val Ser Gly Glu Lys Lys Tyr His Glu Thr

35 40 45gtt gtt gct ctg aaa gcc caa aat ctc aac act gac aac ctc cat tat 192Val Val Ala Leu Lys Ala Gln Asn Leu Asn Thr Asp Asn Leu His Tyr

50 55 60gta cag gca gat tcc agc aaa gaa gaa gat aac aag aaa ttg att tcg 240Val Gln Ala Asp Ser Ser Lys Glu Glu Asp Asn Lys Lys Leu Ile Ser65 70 75 80gaa act ctg gca acc ttt ggg ggc ctg gat att gtt tgt gct aat gca 288Glu Thr Leu Ala Thr Phe Gly Gly Leu Asp Ile Val Cys Ala Asn Ala

85 90 95gga att gga aag ttc gct ccc acc cat gaa aca ccc ttc gac gta tgg 336Gly Ile Gly Lys Phe Ala Pro Thr His Glu Thr Pro Phe Asp Val Trp

100 105 110aag aag gtg att gct gtg aat ttg aat gga gta ttc tta ctg gat aag 384Lys Lys Val Ile Ala Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Leu Leu Asp Lys

115 120 125cta gcc atc aat tac tgg cta gag aaa agc aaa ccc ggc gta att gtc 432Leu Ala Ile Asn Tyr Trp Leu Glu Lys Ser Lys Pro Gly Val Ile Val

130 135 140aac atg gga tca gtc cac tct ttt gta gca gct cct ggc ctt gcg cat 480Asn Met Gly Ser Val His Ser Phe Val Ala Ala Pro Gly Leu Ala His145 150 155 160tat gga gct gca aaa ggc ggt gtc aaa ctg tta aca caa aca ttg gct 528Tyr Gly Ala Ala Lys Gly Gly Val Lys Leu Leu Thr Gln Thr Leu Ala

165 170 175cta gag tac gca tct cat ggt att aga gta aat tct gtc aat ccg ggg 576Leu Glu Tyr Ala Ser His Gly Ile Arg Val Asn Ser Val Asn Pro Gly

180 185 190tac att tcg act cct ttg ata gat gag gtt ccg aaa gag cgg ttg gat 624Tyr Ile Ser Thr Pro Leu Ile Asp Glu Val Pro Lys Glu Arg Leu Asp

195 200 205aaa ctt gta agc ttg cac cct att ggg aga cta ggt cgt cca gag gaa 672Lys Leu Val Ser Leu His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Arg Pro Glu Glu

210 215 220gtt gct gat gca gtc gca ttt ctg tgt tcc cag gag gcc act ttc atc 720Val Ala Asp Ala Val Ala Phe Leu Cys Ser Gln Glu Ala Thr Phe Ile225 230 235 240aac ggc gtt tct ttg ccg gtt gac ggg ggg tac aca gcc cag taa 765Asn Gly Val Ser Leu Pro Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250 255<210>2<211>254<212>PRT<213>Pichia finlandica<400>2Met Ser Tyr Asn Phe His Asn Lys Val Ala Val Val Thr Gly Ala Leu1 5 10 15Ser Gly Ile Gly Leu Ser Val Ala Lys Lys Phe Leu Gln Leu Gly Ala

20 25 30Lys Val Thr Ile Ser Asp Val Ser Gly Glu Lys Lys Tyr His Glu Thr

35 40 45Val Val Ala Leu Lys Ala Gln Asn Leu Asn Thr Asp Asn Leu His Tyr

50 55 60Val Gln Ala Asp Ser Ser Lys Glu Glu Asp Asn Lys Lys Leu Ile Ser65 70 75 80Glu Thr Leu Ala Thr Phe Gly Gly Leu Asp Ile Val Cys Ala Asn Ala

85 90 95Gly Ile Gly Lys Phe Ala Pro Thr His Glu Thr Pro Phe Asp Val Trp

100 105 110Lys Lys Val Ile Ala Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Leu Leu Asp Lys

115 120 125Leu Ala Ile Asn Tyr Trp Leu Glu Lys Ser Lys Pro Gly Val Ile Val

130 135 140Asn Met Gly Ser Val His Ser Phe Val Ala Ala Pro Gly Leu Ala His145 150 155 160Tyr Gly Ala Ala Lys Gly Gly Val Lys Leu Leu Thr Gln Thr Leu Ala

165 170 175Leu Glu Tyr Ala Ser His Gly Ile Arg Val Asn Ser Val Asn Pro Gly

180 185 190Tyr Ile Ser Thr Pro Leu Ile Asp Glu Val Pro Lys Glu Arg Leu Asp

195 200 205Lys Leu Val Ser Leu His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Arg Pro Glu Glu

210 215 220Val Ala Asp Ala Val Ala Phe Leu Cys Ser Gln Glu Ala Thr Phe Ile225 230 235 240Asn Gly Val Ser Leu Pro Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250<210>3<211>10<212>PRT<213>Pichia finlandica<400>3Val Ala Val Val Thr Gly Ala Leu Ser Gly1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>Pichia finlandica<400>4Leu Ile Ser Glu Thr Leu Ala Thr Phe Gly Gly Leu1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>Pichia finlandica<400>5Leu Gly Arg Pro Glu Glu Val Ala Asp Ala1 5 10<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<220><221>misc feature<222>(1)..(9)<223>BamHI位点<400>6gtcggatccg tbgchgtbgt bachgghgc 29<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>BamHI位点<220><221><222>(15)<223>N：a，c，t或g<220><221><222>(18)<223>N：a，c，t或g<220><221><222>(27)<223>N：a，c，t或g<400>7gtcggatccg crtcngcnac ytcytcngg 29<210>8<211>623<212>DNA<213>Pichia finlandica<400>8gctctatcag gaatcggctt aagcgtcgca aaaaagttcc ttcagctcgg cgccaaagta 60acgatctctg atgtcagtgg agagaaaaaa tatcacgaga ctgttgttgc tctgaaagcc 120caaaatctca acactgacaa cctccattat gtacaggcag attccagcaa agaagaagat 180aacaagaaat tgatttcgga aactctggca acctttgggg gcctggatat tgtttgtgct 240aatgcaggaa ttggaaagtt cgctcccacc catgaaacac ccttcgacgt atggaagaag 300gtgattgctg tgaatttgaa tggagtattc ttactggata agctagccat caattactgg 360ctagagaaaa gcaaacccgg cgtaattgtc aacatgggat cagtccactc ttttgtagca 420gctcctggcc ttgcgcatta tggagctgca aaaggcggtg tcaaactgtt aacacaaaca 480ttggctctag agtacgcatc tcatggtatt agagtaaatt ctgtcaatcc ggggtacatt 540tcgactcctt tgatagatga ggttccgaaa gagcggttgg ataaacttgt aagcttgcac 600cctattggga gactaggtcg tcc 623<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>BamHI位点<400>9gtcggatcct cagagatcgt tactttggc 29<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>BamHI位点<400>10gtcggatccc gactcctttg atagatgag 29<210>11<211>599<212>DNA<213>Pichia finlandica<400>11tgggctgaac ctggctgtgc tactgggcag agcaaaatca gatagaagag cttgtgtttt 60tgtagcaccc ctcttttttt ttgaaattct ctacagctca attacctgtt cacattcaat 120acagagtact atcttttcga tttcttatca gataagcaat tgacaatatt agtagcacct 180gatgcacttt tcgagaacac acctgagtac aaaacaatat atatcattat attagaacag 240tgacattgag aacaattttc cagcatataa tgtaattagg tgcatcaaca accaggaaaa 300acacctgatt aaaaaatccg gatattaaga atcatgaaac aaaattcaat gttaccctac 360ccattccttc tcggaacctc ctgatgactt attaatagtg aggttgttcc gataaaaatc 420gcgaatttct ccattccata aattctccta taacttggct tactatacac acacactatt 480atcgatatgt cttataactt ccataacaag gttgcagttg ttactggagc tctatcagga 540atcggcttaa gcgtcgcaaa aaagttcctt cagctcggcg ccaaagtaac gatctctga 599<210>12<211>581<212>DNA<213>Pichia finlandica<400>12cgactccttt gatagatgag gttccgaaag agcggttgga taaacttgta agcttgcacc 60ctattgggag actaggtcgt ccagaggaag ttgctgatgc agtcgcattt ctgtgttccc 120aggaggccac tttcatcaac ggcgtttctt tgccggttga cggggggtac acagcccagt 180aaattggaca ctttttgctc tttattatct tccccgcgtt tcaccaatta tccggtgtac 240gtaggttgca gtgactttct ggtttctgca cttgaatgaa actctctttt accccacaaa 300atcagctcag taaattatct tgtgtatata taaataagac agaaaccctg tggactccta 360gtatggtgtt ctactttcat taaggcagtc acaaaagcaa tggcgaaatc aactgatgga 420aagatagtta cactggagga gcaggcctac aatggcccac ccgcacggat cataggagaa 480gctatcgcca ttaaagcgaa gctggctgcc aatcggacac tcccagttaa gtttgaaaga 540aagcgtggtc ttcaaccacc accagggatg tctagacaag a 581<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>13tcgacatgtc ttataatttc cataacaag 29<210>14<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>14gcagaattcc tctagattac tgggctgtgt accc 34<210>15<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>15cacgaattct aaaatgtctt ataatttcca taacaag 37<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>16agtactagta ttactgggct gtgtaccc 28<210>17<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>17agaccatgga tccaatgtat ccagatttaa aaggaa 36<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>18gaatctagat taaccgcggc ctgcctg 27<210>19<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>19ctttctagag gaattcaacc atggcaaaag ttctgtgtgt tc 42<210>20<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>20cagtctagat tagaccgctt ttttgaattt ggcg 34

Claims

1.一种(R)-2-辛醇脱氢酶，其具有下列(1)和(2)的物化性质：

(1)作用

i)此酶以氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶通过氧化醇而

生产酮，且

ii)此酶以还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶通过还原酮而

生产醇，且

(2)底物特异性

i)此酶优先氧化2-辛醇的两种光学异构体中的(R)-2-辛醇，且

ii)此酶通过还原4-卤乙酰乙酸酯生产(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯。

2.权利要求1中的(R)-2-辛醇脱氢酶，其有着下列(3)和(4)的物化性质：

(3)最佳pH

(4)底物特异性

i)与伯醇相比，此酶对仲醇表现出更高的活性，且

ii)与2-丙醇相比，此酶对(R)-2-辛醇表现出显著更高的活性。

3.权利要求1或2的(R)-2-辛醇脱氢酶，其中此(R)-2-辛醇脱氢酶由选自毕赤氏酵母属，假丝酵母属和Ogataea属的微生物衍生。

4.权利要求3的(R)-2-辛醇脱氢酶，其中属于毕赤酵母属的微生物是Pichia finlandica。

5.权利要求3的(R)-2-辛醇脱氢酶，其中属于毕赤酵母属的微生物是Pichia jadinii。

6.权利要求3的(R)-2-辛醇脱氢酶，其中属于假丝酵母属的微生物是产朊假丝酵母。

7.权利要求3的(R)-2-辛醇脱氢酶，其中属于Ogataea属的微生物是Ogataea wickerhamii。

8.权利要求1或2的用于生产(R)-2-辛醇脱氢酶的方法，此方法包括培养从毕赤氏酵母属，假丝酵母属和Ogataea属中挑选的微生物，该微生物生产权利要求1或2的酶。

9.下列(a)到(e)的多核苷酸，此多核苷酸编码了具有(R)-2-辛醇脱氢酶活性的蛋白：

(a)一种多核苷酸，其含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，

(b)一种多核苷酸，其编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白，

(c)一种多核苷酸，其编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白，在此氨基酸序列中有一个或多个氨基酸的取代，缺失，插入和/或添加，

(d)一种多核苷酸，其在严谨条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO：1的多核苷酸杂交，且

(e)编码与SEQ ID NO：2的氨基酸序列有着不少于70％同源性的氨基酸序列的多核苷酸。

10.由权利要求9的多核苷酸编码的蛋白。

11.重组载体，其中插入了权利要求9的多核苷酸。

12.权利要求11的重组载体，其中进一步插入一种多核苷酸，其编码以β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶并能催化氧化还原反应的脱氢酶。

13.以可表达的方式含有权利要求9中多核苷酸或权利要求11中载体的转化体。

14.生产权利要求10中蛋白的方法，此方法包括培养权利要求13中的转化体。

15.生产醇的方法，此方法包括将权利要求1或2的(R)-2-辛醇脱氢酶，权利要求10的蛋白，可生产所述酶或蛋白的微生物，或该微生物的加工产物与酮反应以使该酮还原。

16.权利要求15的方法，其中的微生物是权利要求13的转化体。

17.权利要求15的方法，其中的酮是4-卤乙酰乙酸酯的衍生物并且其中的醇是(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯衍生物。

18.权利要求17的方法，其中4-卤乙酰乙酸酯的衍生物是4-氯乙酰乙酸乙酯且其中的醇是(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

19.权利要求15的方法，其中的酮是丙酮氧苯衍生物，其由通式1表示：

通式1

其中x1和x2表示卤原子；且其中的醇是由通式2表示的丙氧苯衍生物：

通式2

20.权利要求19的方法，其中丙酮氧苯衍生物是2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯且其中的醇是2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羟丙基]氧]苯。

21.权利要求15的方法，该方法还包括将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转换成其还原型。

22.用于生产酮的方法，此方法包括使权利要求1或2的(R)-2-辛醇脱氢酶，权利要求10的蛋白，可生产所述酶或蛋白的微生物，或该微生物的加工产物与醇反应以使该醇氧化。

23.生产光学活性醇的方法，该方法包含的步骤有，将权利要求1或2的(R)-2-辛醇脱氢酶，权利要求10的蛋白，生产所述酶或蛋白的微生物，或该微生物的加工产物与外消旋醇反应以优先氧化任一光学异构体，并得到保留的光学活性醇。

24.权利要求22或23的方法，该方法另外进一步包含将还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转换成其氧化型。