CN1372597A

CN1372597A - 通过提高细胞nadph生产l－氨基酸的方法

Info

Publication number: CN1372597A
Application number: CN00810748A
Authority: CN
Inventors: M·R·奥唐诺休; P·D·汉克
Original assignee: Archer Daniels Midland Co
Current assignee: Archer Daniels Midland Co
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2002-10-02
Also published as: NZ517295A; MXPA02000729A; EP1208205B1; WO2001007626A3; ATE340857T1; DK1208205T3; US6680190B2; US20030017557A1; CA2377693A1; US6465238B1; JP2011041582A; KR20020048928A; DE60030988T2; PT1208205E; BR0012712B1; WO2001007626A2; JP4841093B2; AU6362200A; KR100575403B1; ES2272303T3

Abstract

本发明总的涉及用于生产L－氨基酸的方法,包括培养与未改变细菌细胞相比其NADPH量增加的经改变细菌细胞,因而来自所述经改变细菌细胞的L－氨基酸产量高于来自未改变细菌细胞的产量。本发明还涉及编码磷酸葡糖异构酶的基因。

Description

通过提高细胞NADPH生产L-氨基酸的方法

发明背景

发明领域

概括的说，本发明涉及L-氨基酸的生产方法和磷酸葡糖异构酶(phosphoglucoisomerase)的编码基因。

背景资料

工业上使用细菌细胞通过发酵方法来生产氨基酸(S.Ishino等人，普通和应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37：157-165，1991；S.Kinoshita、K.Nakayama、和S.Nagasaki，普通和应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)4：128-129，1958)。虽然许多研究报告和评论已经开始关注发酵方法和氨基酸的积累机制，但是需要开发更多的方法来提高微生物的氨基酸产量(S.Ishino等人，普通和应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37：157-165，1991；K.Aida等人编，《氨基酸生产中的生物技术》(Biotechnology ofAmino Acid Production)，Kodansha(东京)/Elsevier(纽约)，1986；和A.Marx等人，代谢工程(Metabolic Engineering)1：35-48，1999)。

在通过代谢工程来引导葡萄糖衍生碳向芳香族氨基酸结构的流动中已经取得了一些成功(N.Flores等人，自然生物技术(NatureBiotechnol.)14：620-623，1996)。但是，还没有在生产者菌株中成功应用的记录(A.Berry，TIBTECH 14：250-256，1996)。

代谢工程涉及对发酵过程中流经各种代谢途径的起始材料(诸如碳水化合物和有机酸)的碳流的操作。例如，已经使用¹³C-NMR进行了关于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中心代谢的研究(S.Ishino等人，普通和应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37：157-165，1991；和A.Marx等人，生物技术和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)49：111-129，1996)。另外，使用¹³C-NMR，Walker等人(T.Walker等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)257：1189-1195，1982)通过嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)分析了谷氨酸发酵，Inbar等人通过黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)(L.Inbar等人，欧洲生化杂志(Eur.J.Biochem.)149：601-607，1985)研究了赖氨酸发酵。

本发明通过代谢工程解决了提高发酵过程中氨基酸产量的问题。

发明概述

本发明提供了L-氨基酸的生产方法，包括培养与未改变细菌细胞相比NADPH量增加的经改变细菌细胞，因而来自所述经改变细菌细胞的L-氨基酸产量高于来自未改变细菌细胞的产量。

本发明提供了用于生成具有突变型磷酸葡糖异构酶(pgi)基因的细菌细胞的方法，包括(a)将pgi基因的内部区域亚克隆到自杀载体中，并(b)通过同源重组将所述自杀载体插入细菌基因组，由此生成具有突变型pgi基因的细菌细胞。本发明还提供了按照该方法生成的经改变细菌细胞。

本发明还提供了可用于该方法的载体。

本发明还提供了包含谷氨酸棒杆菌磷酸葡糖异构酶多肽的编码多核苷酸的分离核酸分子，该多肽具有图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列或由存在于细菌宿主(NRRL保藏物编号B-30174，1999年8月17日)中的DNA克隆编码的氨基酸序列。

本发明还涉及包含本发明分离核酸分子的重组载体、包含该重组载体的宿主细胞、生成这种载体和宿主细胞的方法、以及通过重组技术将它们用于生产Pgi多肽或肽的方法。

本发明还提供了具有由本文所述多核苷酸编码的氨基酸序列的分离Pgi肽。

根据下文的描述将明确本发明的其它优势。

图的简述

图1A-1C显示了pgi的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。Pgi肽的推导分子量为大约59kDa。

发明详述

本文已经确定，增加细菌细胞中的NADPH量可提高产物的产量，特别是在NADPH作为限制性因素的合成过程中。将分解代谢反应的化学能携带至生物合成需能反应(诸如氨基酸合成)的一种方法是以氢原子或电子的形式。作为有效的还原剂，氢原子必须具有可观的自由能。这种高能氢原子是通过脱氢酶由细胞燃料获得的，所述脱氢酶催化氢原子脱离燃料分子并转移至特定辅酶，特别是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化形式(NADP⁺)。该辅酶的还原或携氢形式，称为NADPH，是来自分解代谢的高能电子流向需电子生物合成反应的载体。

本发明提供了用于生产L-氨基酸的方法，包括培养与未改变细菌细胞相比NADPH量增加的经改变细菌细胞，因而所述经改变细菌细胞的L-氨基酸产量高于来自未改变细菌细胞的产量。优选的氨基酸是L-赖氨酸、L-苏氨酸、和L-异亮氨酸。当用于本文时，经改变细菌细胞定义为与未改变细菌细胞相比其NADPH量增加的细菌细胞。

在一个优选的实施方案中，“经改变”细菌细胞是“突变”的细菌细胞。“突变”是遗传物质中可传递至子细胞的任何可检测改变。突变可以是影响一个或多个脱氧核糖核苷酸的化学或物理构造、可突变性、复制、表型功能、或者重组的可检测非天然改变的任一种或其联合；可对核苷酸进行添加、删除、替代、倒置、或转座至新的位置(伴随或不伴随倒置)。突变可自发发生，或者可通过应用诱变剂或重组DNA技术来进行实验诱导。通过突变可生成核酸分子的突变变异。可由突变核酸分子生成突变多肽。

另外，经改变或突变细菌细胞可以是遗传“突变”的，因而与遗传“朱突变”细胞相比NADPH的量增加了。

经改变细菌细胞中NADPH量的增加导致氨基酸产量增加。优选的是，与未改变细菌细胞的产量相比，经改变细菌细胞的氨基酸产量提高了大约1％以上，优选大约1％-大约100％，优选大约20％-大约80％，更优选大约5％-大约60％，甚至更优选大约10％-大约80％。当用于本文时，“产量”定义为生成的氨基酸克数，乘以100，并除以消耗的葡萄糖克数。

根据本发明，在含有碳源和氮源的培养基中培养本发明经改变细菌细胞。碳源可以是例如阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸、或琥珀酸。优选的是，碳源的最初浓度是0.1-10％，优选0.5-6.0％，以重量计算。可在开始培养前向培养基中加入所有碳源，或者在培养过程中逐步或连续加入碳源。

本文所用培养基可以是固体的或液体的，合成的(即人造的)或天然的，而且含有培养本发明经改变细菌细胞所需的足够营养。所用培养基优选液体培养基，更优选合成的液体培养基。

本发明上述和下述实施方案中使用的天然或合成培养基还含有适用于培养经改变细菌细胞的氮源、合适的无机盐、以及(根据需要)多种痕量养分和生长因子等，还可含有至少一种辅助碳源。这些额外成份的各自用量优选选择成可使氨基酸产量最大化。本领域熟练技术人员根据本领域知道的多种方法和技术可凭经验确定这些用量。

合适辅助碳源的例示性范例包括但不限于：其它碳水化合物，诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉或淀粉水解物、纤维素水解物、和糖蜜；有机酸，诸如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、和延胡索酸；以及醇类，诸如甘油、肌醇、甘露醇、和山梨醇。

合适氮源的例示性范例包括但不限于：氨，包括氨气和氨水；无机酸或有机酸的铵盐，诸如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵、和乙酸铵；尿素；硝酸或亚硝酸盐；以及其它含氮物质，包括氨基酸的纯制剂或粗制剂、肉羹、蛋白胨、鱼粉、鱼水解物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆饼水解物、酵母提取物、干酵母、乙醇-酵母蒸馏物、大豆粉、棉籽粉、等等。

合适无机盐的例示性范例包括但不限于：钾、钙、钠、镁、锰、铁、钴、锌、铜、钼、钨、和其它痕量元素的盐，以及磷酸。

合适痕量养分、生长因子、等等的例示性范例包括但不限于：辅酶A、泛酸、吡哆素-HCl、生物素、硫胺素、核黄素、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、DL-6，8-硫辛酸、叶酸、维生素B12、其它维生素、碱基(诸如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、和胞嘧啶)、L-氨基酸、硫代硫酸钠、p-或γ-氨基苯甲酸、烟酰胺、次氮基乙酸(酯)、等等，其或是纯或部分纯的化学化合物，或是存在于天然原料中。可使用本领域熟练技术人员知道的任何深层发酵技术进行本发明微生物菌株的培养，诸如气升式、传统的喷气搅拌设计、或摇动培养。

本领域熟练技术人员可凭经验确定所用培养条件，包括温度、pH、通气速率、搅拌速率、培养持续时间、等等，使氨基酸产量最大化。具体培养条件的选择取决于诸如培养基组成和类型、培养技术、和相似考虑等因素。

培养足够时间后，参照知道的任何方法，包括离子交换层析、凝胶过滤、溶剂萃取、亲和层析、或其组合，可分离在细胞和/或培养基中积累的一种或多种氨基酸。可使用适合于所采用培养条件的任何方法。

优选的细菌细胞是棒杆菌属物种和大肠杆菌。在细菌细胞中优选的是谷氨酸棒杆菌细胞。当用于本文时，黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)和乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)与谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamincum)是同义的。

一般而言，在本发明中，微生物中NADPH的增加是通过改变该生物体中糖酵解和戊糖磷酸途径之间的碳流分布来实现的。当用于本文时，“碳流”指相对于竞争途径而进行特定代谢途径的葡萄糖分子的数目。

优选的是，通过增加流经戊糖磷酸途径氧化支路的碳流来增加NADPH的可利用性。理论上说，当葡萄糖专一进行戊糖磷酸途径的代谢时，每个葡萄糖产生12个NADPH；而在TCA循环(三羧酸，也称为柠檬酸循环)的代谢中，每个葡萄糖只产生2个NADPH(S.Ishino等人，普通和应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37：157-165，1991)。本发明提供了通过培养流经戊糖磷酸途径的碳流增加的经改变细菌细胞来生产L-氨基酸的方法。

在活的生物体中代谢的大多数葡萄糖进行糖酵解，产生丙酮酸。戊糖磷酸途径，也称为己糖单磷酸支路，是葡萄糖分解代谢的另一途径。戊糖磷酸途径产生NADPH，而且在赖氨酸发酵条件下更活泼(S.Ishino等人，普通和应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37：157-165，1991)。

在本发明中，经改变细菌细胞可以是流经戊糖磷酸途径氧化支路的碳流增加的细胞。具体而言，在本发明中，经改变细菌细胞可以是戊糖磷酸途径中所涉及的一种或多种酶的量增加的细胞。这种戊糖磷酸酶选自：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶、核酮糖-5-磷酸异构酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、和6-磷酸葡糖酸内酯酶。

在优选的实施方案中，本发明还提供了用于生产L-氨基酸的方法，包括培养相对于未改变细菌细胞其苹果酸酶量增加的经改变细菌细胞。苹果酸酶催化苹果酸与NADP⁺反应生成丙酮酸、二氧化碳、NADPH、和H⁺。

在优选的实施方案中，本发明还提供了用于生产L-氨基酸的方法，包括培养相对于未改变细菌细胞其异柠檬酸脱氢酶量增加的经改变细菌细胞。异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸与NADP⁺反应生成α-酮戊二酸、二氧化碳、NADPH、和H⁺。

糖酵解和戊糖磷酸途径二者都竞争葡萄糖。在本发明中，经改变细菌细胞可以是流经糖酵解的碳流减小或阻断从而导致流经戊糖磷酸途径氧化支路的碳流增加的细胞。当用于本文时，经改变细菌细胞可以是通过糖酵解中涉及的一种或多种酶的量减少来实现流经糖酵解的碳流减小的细胞。优选的酶是6-磷酸葡萄糖异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、D-甘油醛磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、endolase、或丙酮酸激酶。优选的酶是6-磷酸葡萄糠异构酶。

降低经改变细菌细胞中糖酵解酶量的优选方法是突变该酶的编码基因。当用于本文时，优选阻断(无)或削弱(降低)6-磷酸葡糖异构酶编码基因(“pgi”)的表达。

阻断(无)或削弱(降低)涉及糖酵解之酶的编码基因的表达的优选方法是使用自杀载体(也称为整合型载体)。当用于本文时，自杀载体定义为在特定生物体中不进行自主复制，在导入细胞后重组进入该生物体染色体同源区从而引起同源基因插入失活的载体。基因的插入失活是通过破坏该基因读码框来实现的。只有在以该基因的内部片段作为同源区时才发生基因的插入失活。

使用众所周知的技术，诸如转导、转染、转位、缀合(conjugation)、电穿孔、电转化、磷酸钙转染、由DEAE-葡聚糖介导的转染、由阳离子脂质介导的转染、转化、或其它方法，可将重组构建物导入本发明细菌细胞。这些方法描述于许多标准实验室手册，诸如Davis等人，《分子生物学基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology)，1986。

在优选的实施方案中，经改变细菌细胞是如下生成的：(a)将pgi基因的内部区域亚克隆到自杀载体中；并(b)通过同源重组将所述自杀载体插入细菌基因组。内部区域可以定义为讨论中的开放读码框(ORF)第一个密码子与最后一个密码子之间但不包括这两个密码子的毗连DNA序列。优选可促进基因组整合且导致由讨论中的ORF表达非功能多肽的内部区域。

在某些优选的实施方案中，自杀载体可以是可诱导的、突变体特异的、和/或条件特异的。在这些载体中，特别优选通过易操作的环境因素(诸如温度和营养添加剂)可诱导的自杀载体。其它合适的环境因素对于熟练技术人员是显而易见的。

可以用任选包含至少一种标记基因的自杀载体转化本发明的经改变细菌细胞。这种标记包括阿米卡星(amikacin)、奥格门汀(augmentin)(阿莫西林(amoxicillin)+棒酸)、氨苄青霉素、塞发查令(cefazolin)、头孢噻吩(cefoxitin)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢噻夫(ceftiofur)、头孢金素(cephalothin)、氯霉素、恩氟沙星(enrofloxacin)、红霉素、氟苯尼考(florfenicol)、庆大霉素、亚胺培南、卡那霉素、沙氟沙星(sarafloxicin)、四环素、替卡西林(ticarcillin)、链霉素、壮观霉素、潮霉素、三甲氧苄二氨嘧啶(trimethoprim)、或替米考星(tilmicosin)抗性基因。优选的标记包括氯霉素和/或卡那霉素抗性基因。其它合适标记对于熟练技术人员是显而易见的。

使用自杀载体的例示性范例如下：通过聚合酶链式反应扩增基因内部区域，将由扩增产生的片段亚克隆到包含抗生素抗性标记基因的自杀载体中，并将自杀载体转化到最初的生物体中。抗生素抗性克隆的重新获得暗示同源基因的插入失活。所用自杀载体可包括在靶生物体中不能自主复制的任何质粒。当靶生物体不是大肠杆菌时，优选基于Col E1的复制子。在基于Col E1的复制子中，优选pBGS131(美国典型培养物收藏中心ATCC，Manassas，VA，保藏物编号37443)。

在优选的实施方案中，本发明还提供了生产具有突变型pgi基因的细菌细胞的方法。在特别优选的实施方案中，本发明提供了生产具有突变型pgi基因的细菌细胞的方法，包括(a)将pgi基因的内部区域亚克隆到自杀载体中；并(b)通过同源重组将所述自杀载体插入细菌基因组，由此生成具有突变型pgi基因的细菌细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供了按照上述方法生成的细菌细胞。

生成经改变细菌细胞的例示性范例如下：使用合适引物对通过PCR扩增谷氨酸棒杆菌中编码6-磷酸葡糖异构酶(一种糖酵解酶)的pgi基因的一个区域。PCR引物对优选SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物，它们包含限制酶HindIII的识别序列。在用HindIII进行限制性消化后，将PCR产物亚克隆到自杀载体pBGS131中。将产生的亚克隆命名为pDPTpgi2。然后将亚克隆pDPTpgi2转化到谷氨酸棒杆菌中，并在适当培养基上选择卡那霉素抗性菌落。卡那霉素抗性菌落的分离暗示发生了整合事件。整合主要是通过同源重组发生的，导致pgi基因的破坏。

用于生成经改变细菌细胞的另一种优选方法是通过改变所述基因前面的启动子来阻断或削弱适当基因的表达。优选使用来自任何来源的不同启动子，或者改变天然启动子的核苷酸序列。在改变天然启动子核苷酸序列的方法中，优选PCR诱变。在已知细菌启动子中，适用于本发明这种用途的包括大肠杆菌的lacI和IacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λP_R和P_L启动子、trp启动子、tac启动子、或者本发明细菌细胞的内源启动子。同样优选上调戊糖磷酸途径所涉及的酶的编码基因。这可以通过改变控制该基因的启动子，使用比天然启动子更强的启动子来进行。上调戊糖磷酸途径中的基因的另一种优选方法是通过使用基因组整合型或自主复制型质粒来增加讨论中的基因的拷贝数。

在优选的实施方案中，本发明还提供了通过培养经改变细菌细胞来生产L-氨基酸的方法，其中所述细菌细胞是具有突变型pgi基因的谷氨酸棒杆菌细胞。

用于生成经改变细菌细胞的另一种优选方法包括突变涉及糖酵解的酶的编码基因从而阻断或削弱糖酵解酶编码基因的表达。用于制备突变基因的合适方法的例示性范例包括但不限于：PCR诱变、体外化学诱变、寡核苷酸诱变、紫外线或X射线照射诱变、或者用化学诱变剂(诸如亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)、甲磺酸甲酯、氮芥、等等)处理；基因整合技术，诸如由插入元件或转座子介导或者由转化的线性或环状DNA分子的同源重组介导的整合；以及由噬菌体(诸如P1)介导的转导。这些方法在本领域是众所周知的，且描述于例如J.H.Miller，《分子遗传学实验》(Experiments in MolecularBiology)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1972；J.H.Miller，《细菌遗传学短期课程》(A Short Course in Baterial Genetics)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1992；M.Singer和P.Berg，《基因和基因组》(Gene&Genomes)，大学科学课本，Mill Valley，加利福尼亚，1991；J.Sambrook、E.F.Fritsch、和T.Maniatis，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989；P.B.Kaufman等人，《生物学和医学中的分子和细胞方法手册》(Handbook of Molecularand Cellular Methods in Biology and Medicine)，CRC出版社，BocaRaton，佛罗里达，1995；B.R.Glick和J.E.Thompson编，《植物分子生物学和生物技术中的方法》(Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnology)，CRC出版社，Boca Raton，佛罗里达，1993；和P.F.Smith-Keary，《大肠杆菌的分子遗传学》(Molecular Geneticsof Escherichia coli)，Guilford出版社，纽约，NY，1989。

在优选的实施方案中，本发明还提供了具有突变型pgi基因的分离或纯化细菌细胞。

本发明还提供了包含编码Pgi多肽的多核苷酸的分离核酸分子，所述Pgi多肽具有图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列。通过对1999年8月17日根据布达佩斯条约的条款保藏于农业研究机构培养物保藏中心(NRRL，北方大学街1815号，Peoria，伊利诺斯，61604，美国)、指定编号B-30174的DNA克隆的测序可以获得图1(SEQ ID NO：1)所示核苷酸序列。保藏克隆在p41-13(C01)质粒中。

本发明还提供了选自下组的分离核酸分子：

(a)编码包含SEQ ID NO：2中大约第1位-大约第540位氨基酸的多肽的多核苷酸；

(b)编码包含由NRRL保藏物编号B-30174所含DNA克隆编码之氨基酸序列之一的多肽的多核苷酸；

(c)(a)或(b)的互补物；

(d)通过改变(a)的多核苷酸而生成的多核苷酸变体，其中：

(1)所述改变包括核苷酸插入、删除、或替代，或其任意组合；且

(2)改变的数目等于或小于(a)的核苷酸总数的5％；

(e)通过改变(b)的多核苷酸而生成的多核苷酸变体，其中：

(2)改变的数目等于或小于(b)的核苷酸总数的5％；

(f)通过改变(c)的多核苷酸而生成的多核苷酸变体，其中：

(2)改变的数目等于或小于(c)的核苷酸总数的5％。

本发明还提供了上述核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1中的完整核苷酸序列。

本发明还提供了上述核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1中编码具有SEQ ID NO：2中完整氨基酸序列的Pgi多肽的核苷酸序列。

本发明还提供了上述核酸分子，其中所述多核苷酸具有编码由NRRL保藏物编号B-30174所含DNA克隆编码的Pgi多肽的核苷酸序列。

本发明还提供了包含在严谨杂交条件下与具有与上述核酸分子(a)、(b)、或(c)中核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸发生杂交的多核苷酸的分离核酸分子，其中发生杂交的所述多核苷酸在严谨杂交条件下与具有只由A残基或只由T残基构成的核苷酸序列的多核苷酸不发生杂交。

本发明还提供了用于生成重组载体的方法，包括将上述分离核酸分子插入载体。

本发明还提供了包含上述核酸分子的载体。本发明还提供了用于生成重组宿主细胞的方法，包括将上述载体导入宿主细胞。本发明还提供了包含上述载体的宿主细胞。本发明还提供了用于生产Pgi多肽的方法，包括在所述多肽得以表达的条件下培养上述重组宿主细胞并回收所述多肽。

本发明还提供了选自下组的分离多肽：

(a)包含SEQ ID NO：2中大约第1位-大约第540位氨基酸的多肽；

(b)包含由NRRL保藏物编号B-30174所含DNA克隆编码的氨基酸序列的多肽；

(c)通过改变(a)的氨基酸序列而生成的多肽变体，其中：

(1)所述改变包括插入、删除、或替代，或其任意组合；且

(2)改变的数目等于或小于(a)的氨基酸总数的5％；

(d)通过改变(b)的多核苷酸序列而生成的多肽变体，其中：

(1)所述改变包括插入、删除、或替代，或其任意组合；且

(2)改变的数目等于或小于(b)的氨基酸总数的5％。

核酸分子

除非另有说明，由本文DNA分子测序获得的所有核苷酸序列是使用自动化DNA测序仪(诸如Applied Biosystems公司的373型)测定的，而且由本文测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列是通过翻译如上测定的DNA序列来预测的。因此，正如本领域关于通过这种自动化方法测定的任何DNA序列所知，本文测定的任何核苷酸序列可能有一些误差。自动测序获得的核苷酸序列与所测DNA分子的真实核苷酸序列通常至少大约90％，更通常至少大约95％-至少大约99.9％相同。正如本领域知道的，所测定的核苷酸序列中与真实序列相比的一个插入或删除将在该核苷酸序列的翻译中引起读码框移位，使得由测定的核苷酸序列编码的预测氨基酸序列与由所测DNA分子真正编码的氨基酸序列自这个插入或删除位点开始完全不同。

使用本文提供的信息，诸如图1所示核苷酸序列，可通过标准克隆和筛选流程获得编码Pgi多肽的本发明核酸分子。

因此，本发明提供了编码Pgi多肽的核苷酸序列，该多肽具有由确定为NRRL保藏物编号B-30174的宿主所含克隆编码且如图1(SEQ ID NO：1和2)所示的氨基酸序列。

正如普通技术人员将领会的，由于测序误差的可能性，由保藏克隆编码的预测Pgi多肽包含大约540个氨基酸，但可能是500-580范围内的任一值。

正如指出的，本发明核酸分子可以是RNA形式，诸如mRNA，或是DNA形式，包括例如通过克隆或合成生成的cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链或单链。单链DNA或RNA可以是编码链，也称为有义链；或是非编码链，也称为反义链。

“分离”核酸分子指脱离其天然环境的核酸分子，DNA或RNA。例如，对于本发明，认为包含于载体中的重组DNA分子是分离的。分离DNA分子的其它范例包括维持于异源宿主细胞中的重组DNA分子或溶液中的(部分或基本)纯化DNA分子。分离RNA分子包括本发明DNA分子的体内或体外RNA转录本。本发明分离核酸分子还包括合成法生成的这种分子。

本发明分离核酸分子包括包含图1(SEQ ID NO：1)所示开放读码框(ORF)的DNA分子；包含图1(SEQ ID NO：2)所示Pgi蛋白质的编码序列的DNA分子；和包含与上述序列基本不同、但由于遗传密码子简并性仍编码Pgi蛋白质的序列的DNA分子。当然，遗传密码子在本领域是众所周知的。因此，生成这种简并变体对于本领域熟练技术人员是常规的。

另外，本发明提供了具有与SEQ ID NO：1广泛部分有关的核苷酸序列的核酸分子。

在另一个方面，本发明提供了编码Pgi多肽的分离核酸分子，该多肽具有由1999年8月17日以NRRL保藏物编号B-30174保藏的核酸分子编码的氨基酸序列。本发明还提供了具有图1(SEQ ID NO：1)所示核苷酸序列或上述保藏克隆所含pgi基因组核苷酸序列的分离核酸分子，或者具有与上述序列之一互补的序列的核酸分子。这种分离分子，特别是DNA分子，可作为探针通过与染色体的原位杂交用于基因作图。

本发明还致力于本文所述分离核酸分子的片段。具有保藏克隆的核苷酸序列或图1(SEQ ID NO：1)所示核苷酸序列的分离核酸分子的片段指长度为至少大约15个核苷酸(nt)、更优选至少大约20nt、仍更优选至少大约30nt、甚至更优选至少大约40nt，可作为本文所述诊断性探针和引物的片段。当然，长度为50、75、100、125、150、175、200、225、250、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550nt的较大片段也可用于本发明，对应于保藏克隆或图1(SEQ IDNO：1)所示的大部分(如果不是所有)核苷酸序列的片段同样也可用于本发明。例如，长度为至少20nt的片段指包含来自保藏克隆核苷酸序列或图1(SEQ ID NO：1)所示核苷酸序列的20个或更多毗连碱基的片段。

在另一个方面，本发明提供了包含在严谨杂交条件下与本发明上述核酸分子(例如NRRL保藏物B-30174所含保藏克隆)中的多核苷酸部分发生杂交的多核苷酸的分离核酸分子。“严谨杂交条件”指在含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt氏液、10％硫酸葡聚糖、和20g/mL变性剪切鲑鱼精DNA的溶液中于42℃保温过夜，随后于大约65℃用0.1x SSC清洗膜。

与多核苷酸“部分”可发生杂交的多核苷酸指与参考多核苷酸的至少大约15个核苷酸(nt)、更优选至少大约20nt、仍更优选至少大约30nt、甚至更优选大约30-70nt可发生杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。它们可作为上文所述诊断性探针和引物使用，下文将更详细的讨论。

例如，“长度为至少20nt”的多核苷酸部分指来自参考多核苷酸(如保藏克隆或图1(SEQ ID NO：1)所示核苷酸序列)的核苷酸序列的20个或更多毗连核苷酸。当然，与本发明核酸的部分进行杂交的本发明多核苷酸将不包含只与polyA序列(诸如图1(SEQ ID NO：1)所示pgi cDNA的3’端polyA序列)或一段T(或U)残基互补序列发生杂交的多核苷酸，因为这种多核苷酸将与包含polyA序列或其互补序列的任何核酸分子(如实际应用中的任何双链cDNA克隆)发生杂交。

正如指出的，编码Pgi多肽的本发明核酸分子可包含但不限于那些自身编码多肽氨基酸序列的核酸分子；多肽和额外序列的编码序列，诸如那些氨基酸前导序列或分泌序列的编码序列，诸如前-、原-、或前原-蛋白质序列；含或不含上述额外编码序列，同时具有额外非编码序列的多肽编码序列，所述非编码序列包括但不限于5’和3’非编码序列，诸如转录但不翻译、在转录和mRNA加工(例如核糖体结合和mRNA稳定性)中起作用的序列；编码额外氨基酸的额外编码序列，诸如那些提供额外功能的氨基酸。因此，多肽编码序列可融合标记序列，诸如可便于纯化融合多肽的肽的编码序列。在本发明这个方面的某些优选实施方案中，标记氨基酸序列是6个组氨酸的肽，诸如在pQE载体(Qiagen公司)等中提供的标签，它们中的许多是商品化的。His6为融合蛋白的纯化提供了便利(例如Gentz等人，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：821-824，1989)。“HA”标签是另一种可用于纯化的肽，对应于由流感血凝素蛋白质衍生的表位(Wilson等人，细胞(Cell)37：767，1984)。正如下文讨论的，其它这种融合蛋白包括N端或C端融合了Fc的Pgi。

上述探针、引物、和/或核酸片段可用于监控发酵过程中pgi基因的表达。

本发明还涉及本发明核酸分子的变体，它们编码Pgi蛋白质的片段、类似物、或衍生物。变体可以是天然发生的，诸如天然等位基因变体。“等位基因变体”指占据生物体染色体中指定基因座的基因的几种可变形式之一(《基因》(Gene)，第2版，B.Lewin编，JohnWiley&Sons，纽约，1985)。可使用本领域知道的诱变技术生成非天然发生的变体。

这样的变体包括那些通过可能涉及一个或多个核苷酸的核苷酸替代、删除、或添加而生成的变体。可改变变体的编码区、非编码区、或二者兼之。编码区的改变可产生保守性或非保守性氨基酸替代、删除、或添加。在这些改变中尤其优选沉默替代、添加、和删除，它们不改变Pgi蛋白质或其片段的特性和活性。在这方面同样尤其优选保守性替代。

本发明的其它实施方案包括包含具有与下述核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的核苷酸序列的多核苷酸的分离核酸分子：(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽的编码核苷酸序列；(b)具有由NRRL保藏物编号B-30147所含克隆编码的完整氨基酸序列的全长Pgi多肽的编码核苷酸序列；或(c)与(a)或(b)中任何核苷酸序列互补的核苷酸序列。

例如，具有与编码Pgi多肽的参考核苷酸序列至少95％“相同”的核苷酸序列的多核苷酸指除了在编码Pgi多肽的参考核苷酸序列的每100个核苷酸中所述多核苷酸序列可包含多达5个点突变之外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可删除参考序列中多达5％的核苷酸，用其它核苷酸替代参考序列中多达5％的核苷酸，或者在参考序列中插入占其核苷酸总数多达5％的核苷酸。参考序列的这些突变可发生于参考核苷酸序列的5’或3’末端的位置，或者两末端之间的任何位置，它们以单个或者以毗邻的一组或几组散布于参考序列的核苷酸间。

实际的情况是，使用已知的电脑程序，诸如Bestfit程序(威斯康星序列分析软件包，用于Unix的第8版，遗传学电脑小组，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)，可常规测定任何特定核酸分子是否与例如图1所示核苷酸序列或保藏克隆的核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同。Bestfit使用Smith和Waterman(应用数学进展(Advances in AppliedMathematics)2：482～489，1981)的局部同源性算法来寻找两种序列间的最佳同源区段。在使用Bestfit或任何其它序列比对程序来测定特定序列是否与本发明参考序列例如95％相同时，参数当然应设成在参考核苷酸序列全长基础上计算同一性百分率，且允许参考序列中存在占核苷酸总数的多达5％的同源性缺口。

本发明致力于与图1(SEQ ID NO：1)所示核酸序列或保藏克隆的核酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的核酸分子，而不管它们是否编码具有Pgi活性的多肽。这是因为，即使特定核酸分子不编码具有Pgi活性的多肽，本领域熟练技术人员仍然知道如何使用该核酸分子，例如作为杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有Pgi活性的多肽的本发明核酸分子的应用包括但不限于在基因组文库中分离pgi基因或其等位基因变体，以及用于检测pgimRNA表达的Northern印迹分析。

然而，优选具有与图1(SEQ ID NO：1)所示核酸序列或保藏克隆的核酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同，并且事实上确实编码具有Pgi蛋白质活性之多肽的序列的核酸分子。“具有Pgi活性的多肽”指通过特定生物学测定法测量，展示与本发明Pgi蛋白质的活性相似(但不必要相同)的活性的多肽。

当然，由于遗传密码的简并性，本领域普通技术人员将立即认识到，具有与保藏克隆的核酸序列或图1(SEQ ID NO：1)所示核酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列的许多核酸分子将编码“具有Pgi蛋白质活性”的多肽。事实上，熟练技术人员甚至在没有进行上述比较测定时也清楚的知道，这些核苷酸序列的简并变体都编码相同多肽。本领域还认识到，对于不是简并变体的那些核酸分子，其中有相当数目也将编码具有Pgi蛋白质活性的多肽。这是因为，熟练技术人员完全知道不大可能或不可能显著影响蛋白质功能的氨基酸替代(如用一种脂肪族氨基酸替代另一种脂肪族氨基酸)。

例如，J.U.Bowie等人(蛋白质序列信息的解码：氨基酸替代的耐受性”，科学(Science)247：1306-1310，1990)提供了关于如何产生表型沉默的氨基酸替代的指导，其中指出蛋白质出人意料的耐受氨基酸替代。载体和宿主细胞

本发明还涉及包含本发明分离DNA分子的载体、经遗传工程改造包含重组载体的宿主细胞、和Pgi多肽或其片段的重组技术生产。

可将多核苷酸连接含可选择标记的载体从而得以在宿主中扩增。若载体是病毒，则可使用适当包装细胞系进行体外包装，然后转导到宿主细胞中。

DNA插入片段应当可操作连接适当启动子，诸如噬菌体λP_L启动子、大肠杆菌lac、trp、和tac启动子，这是其中的一些。熟练技术人员将知道其它的合适启动子。表达构建物还包含起始和终止转录的位点，以及在转录区内用于翻译的核糖体结合位点。由构建物表达的成熟转录本的编码部分优选在待翻译多肽的起点包含起始密码子，而在终点的适当位置包含终止密码子(UAA、UGA、或UAG)。

如上所述，表达载体优选包含至少一种可选择标记。这样的标记包括但不限于用于培养大肠杆菌和其它细菌的卡那霉素、氯霉素、四环素、或氨苄青霉素抗性基因。适当宿主的代表性范例包括但不限于细菌细胞，诸如大肠杆菌、链霉菌、和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞；昆虫细胞，诸如果蝇S2细胞和Spodoptera Sf9细胞。适用于上述宿主细胞的培养基和条件在本领域是知道的。

在已知细菌启动子中，适用于生产本发明蛋白质的包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λP_R和P_L启动子、以及trp启动子。

因此，本发明还致力于可用于生产本发明蛋白质的表达载体。

在载体中，优选用于细菌的包括pQE70、pQE60、和pQE-9(Qiagen)；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、和pNH46A(Stratagene)；以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、和pRIT5(Pharmacia)。其它合适载体对熟练技术人员是显而易见的。

可通过磷酸钙转染、由DEAE-葡聚糖介导的转染、由阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染、或其它方法将构建物导入宿主细胞。这些方法描述于许多标准实验室手册，诸如Davis等人，《分子生物学基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology)，1986。

可以经修饰形式(诸如融合蛋白)表达多肽，该多肽可不仅包含分泌信号，还包含额外的异源功能区。例如，可在多肽N端添加额外氨基酸(特别是带电荷氨基酸)区域以改进在宿主细胞中、在纯化过程中、或在随后的处理和储存过程中的稳定性和持久性。同样，可向多肽中添加肽模块以便于纯化。可在多肽的最终制剂前除去这些区域。向多肽中添加肽模块以造成分泌或排泄、改进稳定性、或便于纯化等等，在本领域是熟悉的常规技术。

可通过众所周知的方法由重组细胞培养物回收并纯化Pgi蛋白质，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、和凝集素层析。更优选的是，采用高效液相层析(“HPLC”)进行纯化。本发明多肽包括自然纯化产物、化学合成流程的产物、和通过重组技术由原核或真核宿主(包括但不限于例如细菌、酵母、高等植物、昆虫、和哺乳动物细胞)生成的产物。根据在重组生产流程中采用的宿主，本发明多肽可以是糖基化的，或是未糖基化的。另外，本发明多肽还可包含经修饰起始甲硫氨酸残基，在有些情况中这是宿主介导过程的结果。Pgi多肽及片段

本发明还提供了具有由保藏克隆编码的氨基酸序列或图1(SEQ IDNO：2)所示氨基酸序列的分离Pgi多肽，或者包含上述多肽一部分的肽或多肽。

在本领域可以理解，可以改变Pgi多肽的一些氨基酸序列而不显著影响蛋白质的结构或功能。若在序列中尝试了这样的差异，则应当记住蛋白质上存在决定活性的关键区域。

因此，本发明还包括显示基本Pgi多肽活性或包含Pgi蛋白质区域(诸如下述蛋白质部分)的Pgi多肽变异。这些突变体包括删除、插入、倒置、重复、和类型替代。如上所述，可以在J.U.Bowie等人，“蛋白质序列信息的解码：氨基酸替代的耐受性”，科学(Science)247：1306-1310，1990中找到关于哪些氨基酸变化有可能是表型沉默的指导。

因此，图1(SEQ ID NO：2)所示Pgi多肽或由保藏克隆编码的Pgi多肽的片段、衍生物、或类似物，可以是(1)用保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)替代一个或多个氨基酸残基的类型，其中替代氨基酸残基可以是或者不是由遗传密码子编码的，或者(2)一个或多个氨基酸残基包含取代基团的类型，或者(3)多肽融合了另一种化合物，诸如增加多肽半寿期的化合物(例如聚乙二醇)的类型，或者(4)成熟多肽融合了额外氨基酸，诸如IgG Fc融合区肽、前导序列或分泌序列、用于多肽纯化的序列的类型、或者前蛋白质序列。根据本文的教学，认为这样的片段、衍生物、和类似物属于本领域熟练技术人员的范围之内。

如上所述，变化优选较小本质，诸如不显著影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸替代(见表1)。表1.保守氨基酸替代芳香族苯丙氨酸

色氨酸

酪氨酸疏水亮氨酸

异亮氨酸

缬氨酸极性谷氨酰胺

天冬酰胺碱性精氨酸

赖氨酸

组氨酸酸性天冬氨酸

谷氨酸小型丙氨酸

丝氨酸

苏氨酸

甲硫氨酸

甘氨酸

当然，熟练技术人员将根据许多因素(包括上文所述)来决定氨基酸替代的数目。一般而言，任何给定Pgi多肽的氨基酸替代的数目不会超过50、40、30、20、10、5、或3个。

可通过本领域知道的方法来鉴定本发明Pgi蛋白质中的功能必需氨基酸，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学(Science)244：1081-1085，1989)。后一种方法是在分子中的每一个残基处引入一个丙氨酸突变。然后对产生的突变分子测试磷酸葡糖异构酶活性。

优选以分离形式提供本发明多肽，且优选基本纯化的。“分离多肽”指脱离其天然环境的多肽。因此，对于本发明，认为由重组宿主细胞生成和/或包含的多肽是分离的。已经由重组宿主细胞部分或基本纯化的多肽同样是 “分离多肽”。例如，可通过Smith和Johnson(基因(Gene)67：31-40，1988)描述的一步法基本纯化重组生产形式的Pgi多肽。

本发明多肽包括由保藏DNA编码的Pgi多肽，与由保藏克隆编码的多肽或图1(SEQ ID NO：2)所示多肽至少95％、仍更优选至少96％、97％、98％、或99％相同的多肽，还包括这些多肽具有至少30个氨基酸，更优选至少50个氨基酸的片段。

具有与Pgi多肽参考氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽指除了在Pgi多肽参考序列的每100个氨基酸中所述多肽序列可包含多达5个氨基酸的改变之外，该多肽的氨基酸序列与参考序列相同。换言之，为了获得具有与参考氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，可删除参考序列中多达5％的氨基酸残基，用其它氨基酸替代参考序列中多达5％的氨基酸残基，或者在参考序列中插入占其氨基酸总数多达5％的氨基酸。参考序列的这些改变可发生于参考氨基酸序列的氨基或羧基末端的位置，或者两末端之间的任何位置，它们以单个或者以毗邻的一组或几组散布于参考序列的氨基酸间。

实际的情况是，使用已知的电脑程序，诸如Bestfit程序(威斯康星序列分析软件包，用于Unix的第8版，遗传学电脑小组，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)，可常规测定任何特定多肽是否与例如图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列或由保藏克隆编码的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同。在使用Bestfit或任何其它序列比对程序来测定特定序列是否与本发明参考序列例如95％相同时，参数当然应设成在参考氨基酸序列全长基础上计算同一性百分率，且允许参考序列中存在占氨基酸总数的多达5％的同源性缺口。

使用本领域熟练技术人员众所周知的方法，本发明多肽可在SDS-PAGE或分子筛凝胶过滤柱上作为分子量标准。N端和C端删除突变体

在一个实施方案中，本发明提供了在图1(SEQ ID NO：2)所示或保藏克隆所含DNA编码的Pgi多肽的氨基酸序列氨基末端删除了一个或多个残基的多肽。具体而言，在一个实施方案中，Pgi多肽的N端删除可用一般通式m-540描述，其中m是由2至539的任一整数，对应于在SEQID NO：2中确定的氨基酸残基位置，优选对应于在本文说明的N端删除中确定的一个N端氨基酸残基。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一个实施方案致力于本发明Pgi多肽的C端缺失体，由一般通式1-n描述，其中n是由2至539的任一整数，对应于在SEQ ID NO：2中确定的氨基酸残基位置，优选对应于在本文说明的C端删除中确定的一个残基。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一个实施方案致力于包含由一般通式m-n描述的氨基酸残基或由其构成的多肽片段，其中m和n分别对应于上文为这些符号说明的任一氨基酸残基。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。

实施例

下列实施例只是例示性的，而非限制由所附权利要求确定的本发明范围。本领域熟练技术人员将领会，可在本发明方法中进行多种修饰和变化而不脱离本发明的精神和范围。因此，本发明意欲覆盖本发明的这些修改和变化，只要它们属于所附权利要求及其等同的范围之内。实施例1-分离并纯化DNA

由NRRL B-11474细胞的培养物分离DNA。由CM(表B)培养基收获NRRL B-11474细胞，并悬浮于10ml TE(10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8)。每毫升悬浮液加入40μg RNA酶和10mg溶菌酶，并将悬浮液于37℃保温30分钟。加入十二烷基硫酸钠(SDS)至1.0％和蛋白酶K至0.1mg/L，并通过于37℃保温10分钟来裂解细胞。通过TE饱和酚(pH7)抽提3次及随后的乙醇沉淀来纯化核酸。用80％乙醇清洗核酸沉淀物2次，并重新溶解于TE(pH8)。通过分光光度法(260nm)测定DNA浓度。通过分光光度法(A260/A280和A260/A230比率)和琼脂糖凝胶电泳(0.8％1xTAE琼脂糖)测定DNA制剂的纯度。

正如本领域普通技术人员所知道的，分别使用pGEM3和Lorist6生成质粒和粘粒文库，以进行基因组DNA测序。通过与结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)葡萄糖-6-磷酸异构酶(Swiss Prot瑞士蛋白质数据库编号P77895，Swiss Prot ID G6PI_MYCTU)的同源性来鉴定谷氨酸棒杆菌pgi基因。实施例2-通过破坏pgi来增加NADPH的可利用性

通过破坏编码6-磷酸葡糖异构酶的pgi基因来获得流经戊糖磷酸途径氧化支路的碳流的增加。由上述基因组DNA序列设计了两种PCR引物来扩增谷氨酸棒杆菌pgi基因的680bp内部区域。这两种引物是：pgif^*(SEQ ID NO：3)5′gctgatgtccacgaagctttgggac 3′pgir^*(SEQ ID NO：4)3′gctgagaaccttggaataaggtagg 3′

引物对pgif*和pgir*包含限制酶HindIII的识别序列。对于pgir*，需要在谷氨酸棒杆菌核苷酸序列中进行3处改变以掺入HindIII识别序列。这两个HindIII限制性位点有助于亚克隆。

采用如下PCR扩增条件。每个PCR反应的终体积是100μl。使用两种引物各100ng，以及50ng高分子量谷氨酸棒杆菌ATCC 21799基因组DNA和2.5U Taq DNA聚合酶。以制造商(Stratagene)推荐的浓度加入反应缓冲液，并加入dNTP至终浓度200μM。循环参数如下：94℃1min；94℃30sec、60℃30sec、和72℃1min，30个循环；72℃7min；随后冻存。

在用HindIII进行限制性消化后，PCR产物的大小降至大约660bp。然后将该片段亚克隆到自杀载体pBGS131中。将产生的亚克隆命名为pDPTpgi2。

在电转化感受态谷氨酸棒杆菌(NRRL B-11474)后，在含卡那霉素(终浓度10μg/ml)的CM(表B)琼脂平板上选择整合体。通过酶测定法确认了突变株中不存在磷酸葡糖异构酶活性，表明这些菌株中的pgi基因已遭到破坏。

摇瓶实验表明与谷氨酸棒杆菌(NRRL B-11474)相比谷氨酸棒杆菌(NRRL B-11474)pgi突变体的赖氨酸效价和产量获得了提高(表A)。表A：FM3培养基(表C)上的赖氨酸生产菌株生长效价产量NRRL B11474 46 25 42NRRL B1474：：pgi2A 40 31 52生长＝于660nm的光密度效价＝赖氨酸克数/培养基升数产量＝(赖氨酸克数/葡萄糖消耗克数)×100表B：CM培养基体积：1000ml ％琼脂：0蔗糖 50gKH₂PO₄ 0.5gK₂HPO₄ 1.5g尿素 3gMgSO₄·7H₂O 0.5g聚蛋白胨 20g牛肉浸膏 5g生物素 12.5ml(60mg/L)硫胺素 25ml(120mg/L)烟酰胺 25ml(5g/L)L-甲硫氨酸 0.5gL-苏氨酸 0.25gL-丙氨酸 0.5g定容：加入蒸馏水至1000mlpH：大约7.1表C：FM3培养基(每升)(NH₄)₂SO₄ 50gKH₂PO₄ 1gMgSO₄·7H₂O 0.4gMnSO₄H₂O 0.01gFeSO₄·7H₂O 0.01g生物素 0.03mg玉米浆 4％干固体终浓度葡萄糖 6％终浓度CaCO₃ 50g实施例3-破坏编码6-磷酸果糖激酶的基因(pfkA)

以与实施例2中关于pgi基因所述相似的方法，破坏了编码6-磷酸果糖激酶的基因(pfkA)。通过突变体提取物的酶测定法确认了对pfkA基因的破坏并显示缺乏6-磷酸果糖激酶活性。出乎意料的是，谷氨酸棒杆菌(NRRL B-11474)pfkA突变体不能利用葡萄糖。

* * * * *

本文明白的、完整的收入文中提及的所有专利和发表物作为参考。

在为了澄清和理解目的而详细描述了上述发明之后，本领域熟练技术人员在阅读本说明书之后将领会，可以在形式和细节上进行多种变化而不脱离本发明和所附权利要求的真实范围。

序列表<110>O′Donohue，Michael R.

Hanke，Paul D.<120>用于生产L-氨基酸的方法<130>1533.101PC02<140><141><150>US 60/150,017<151>1999-08-20<150>US 60/145,217<151>1999-07-23<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1623<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(1)..(1620)<400>1atg gcg gac att tcg acc acc cag gct tgg caa gac ctg acc gat cat 48Met Ala Asp Ile Ser Thr Thr Gln Ala Trp Gln Asp Leu Thr Asp His1 5 10 15tac tca aac ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa 96Tyr Ser Asn Phe Gln Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu

20 25 30aac cgc gcc gag aag tac acc ttc tcc gcg gct ggc ctc cac gtc gac 144Asn Arg Ala Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp

35 40 45ctg tcg aag aat ctg ctt gac gac gcc acc ctc acc aag ctc ctt gca 192Leu Ser Lys Asn Leu Leu Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala

50 55 60ctg acc gaa gaa tct ggc ctt cgc gaa cgc att gac gcg atg ttt gcc 240Leu Thr Glu Glu Ser Gly Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala65 70 75 80ggt gaa cac ctc aac aac acc gaa gac cgc gct gtc ctc cac acc gcg 288Gly Glu His Leu Asn Asn Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala

85 90 95ctg cgc ctt cct ccc gaa gct gat ctg tca gta gat ggc caa gat gtt 336Leu Arg Leu Pro Pro Glu Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val

100 105 110gct gct gat gtc cac gaa gtt ttg gga cgc atg cgt gac ttc gct act 384Ala Ala Asp Val His Glu Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr

115 120 125gcg ctg cgc tca ggc aac tgg ttg gga cac acc ggc cac acg atc aag 432Ala Leu Arg Ser Gly Asn Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys

130 135 140aag atc gtc aac att ggt atc ggt ggc tct gac ctc gga cca gcc atg 480Lys Ile Val Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met145 150 155 160gct acg aag gct ctg cgt gca tac gcg acc gct ggt atc tca gca gaa 528Ala Thr Lys Ala Leu Arg Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu

165 170 175ttc gtc tcc aac gtc gac cca gca gac ctc gtt tct gtg ttg gaa gac 576Phe Val Ser Asn Val Asp Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp

180 185 190ctc gat gca gaa tcc aca ttg ttc gtg atc gct tcg aaa act ttt acc 624Leu Asp Ala Glu Ser Thr Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr

195 200 205acc cag gag acg ctg tct aac gct cgt gca gct cgt gct tgg ctg gta 672Thr Gln Glu Thr Leu Ser Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val

210 215 220gag aag ctc ggt gaa gag gct gtc gcg aag cat ttc gtc gca gtg tcc 720Glu Lys Leu Gly Glu Glu Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser225 230 235 240acc aat gct gaa aag gtc gca gag ttc ggt atc gac acg gac aac atg 768Thr Asn Ala Glu Lys Val Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met

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530 535 540<210>2<211>540<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Met Ala Asp Ile Ser Thr Thr Gln Ala Trp Gln Asp Leu Thr Asp His1 5 10 15Tyr Ser Asn Phe Gln Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu

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530 535 540<210>3<211>25<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<400>3gctgatgtcc acgaagcttt gggac 25<210>4<211>25<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<400>4gctgagaacc ttggaataag gtagg 25

申请人或代理机构文档号 1533.10IPC02

国际申请号PCT/US00/I9914

有关保藏微生物的信息

(PCT Rule 13bls)

A.下述信息涉及说明书中所示处指示的微生物第 2 页，第22 行。
A.下述信息涉及说明书中所示处指示的微生物第 2 页，第22 行。		B.保藏物鉴定其它保藏物的鉴定见下页□
保藏机构名称农业研究机构保藏中心(NRRL)		B.保藏物鉴定其它保藏物的鉴定见下页□
保藏机构名称农业研究机构保藏中心(NRRL)		保藏机构地址(包括邮编和国家)1815 N.University StreetPeoria.Illinois 61604United States of America
保藏日1999年8月17日	保藏号NRRL B-30174
保藏日1999年8月17日	保藏号NRRL B-30174	C.其它信息(若无请保持空白) 此信息在下页有续□
大肠杆菌DH5αp41-13(CO1)		C.其它信息(若无请保持空白) 此信息在下页有续□
大肠杆菌DH5αp41-13(CO1)		D.各信息针对的指定国(若信息并非针对所有指定国)
		D.各信息针对的指定国(若信息并非针对所有指定国)
		E.信息的单独提供(若无请保持空白)
下述信息将在以后提交到国际局(说明信息的一般性质，如“保藏号”)		E.信息的单独提供(若无请保持空白)

Claims

1.L-氨基酸的生产方法，包括：培养与未改变的细菌细胞相比其NADPH量有所增加的经改变细菌细胞，其中所述经改变细菌细胞的L-氨基酸产量高于来自未改变细菌细胞的产量。

2.权利要求1的方法，其中所述经改变细菌细胞中流经戊糖磷酸途径氧化支路的碳流增加了。

3.权利要求2的方法，其中所述经改变细菌细胞中选自下组的一种或多种酶的量增加了：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、内酯酶、和6-磷酸葡糖酸脱氢酶。

4.权利要求1的方法，其中所述经改变细菌细胞中流经糖酵解途径的碳流减小了。

5.权利要求4的方法，其中所述经改变细菌细胞中6-磷酸葡糖异构酶酶促活性降低了。

6.权利要求1的方法，其中来自所述经改变细菌细胞的所述L-氨基酸产量比所述未改变细菌细胞高大约1％-大约100％。

7.权利要求1的方法，其中所述经改变细菌细胞具有突变型pgi基因。

8.权利要求1的方法，其中所述经改变细菌细胞是如下生成的：(a)亚克隆pgi基因的内部区域；并(b)通过同源重组将由步骤(a)产生的载体插入细菌基因组。

9.权利要求1的方法，其中所述经改变细菌细胞中苹果酸酶的量增加了。

10.权利要求1的方法，其中所述经改变细菌细胞中异柠檬酸脱氢酶的量增加了。

11.权利要求1的方法，其中所述经改变细菌细胞是谷氨酸棒杆菌细胞。

12.权利要求11的方法，其中所述谷氨酸棒杆菌细胞具有突变型pgi基因。

13.权利要求1的方法，其中所述L-氨基酸包括L-赖氨酸。

14.包含pDPTpgi2的载体。

15.生产具有突变型pgi基因的细菌细胞的方法，包括：(a)将pgi基因的内部区域亚克隆到自杀载体中；并(b)将由步骤(a)产生的载体插入细菌基因组，由此生成具有突变型pgi基因的细菌细胞。

16.权利要求15的方法，其中所述自杀载体选自包括pBGS131和含可选择标记的基于Col E1的复制子。

17.按照权利要求15的方法生成的经改变细菌细胞。

18.L-氨基酸的生产方法，包括：培养与未改变细菌细胞相比其6-磷酸葡糖异构酶酶促活性有所降低的经改变细菌细胞，其中来自所述经改变细菌细胞的L-氨基酸产量高于来自未改变细菌细胞的产量。

19.权利要求18的方法，其中来自所述经改变细菌细胞的所述L-氨基酸产量比所述未改变细菌细胞高大约1％-100％。

20.权利要求18的方法，其中所述经改变细菌细胞具有突变型pgi基因。

21.权利要求18的方法，其中所述经改变细菌细胞是如下生成的：(a)亚克隆pgi基因的内部区域；并(b)通过同源重组将由步骤(a)产生的载体插入细菌基因组。

22.权利要求18的方法，其中所述经改变细菌细胞是谷氨酸棒杆菌细胞。

23.权利要求18的方法，其中所述L-氨基酸包括L-赖氨酸。