PT1208205E - Métodos para produzir l-aminoácidos por aumento do nadph celular - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODOS PARA PRODUZIR L-AMINOÁCIDOS POR AUMENTO DO NADPH CELULAR"

Antecedentes da invenção

Campo da invenção A presente invenção refere-se, em geral, a um método para produzir L-aminoácidos e a um gene que codifica para a fosfoglucoisomerase.

Informação antecedente

As células bacterianas são utilizadas industrialmente para produzir aminoácidos por processos de fermentação (Ishino, S. et al. , J. Gen. Appl. Microbiol. 37:157-165 (1991), Kinoshita, S., Nakayama, K. e Nagasaki, S., J. Gen. Appl. Microbiol. 4:128-129 (1958)). Embora tenham surgido inúmeras descrições e revisões relacionadas com processos de fermentação e os mecanismos de acumulação de aminoácidos, é necessário desenvolver mais progressos para aumentar os rendimentos de aminoácidos a partir de microorganismos (Ishino, S. et al. , J Gen. Appl. Microbiol. 37:157-165 (1991), Aida, K. et al., eds., "Biotechnology of Amino Acid Production," Kodansha (Tokyo)/Elsevier (Nova Iorque) (1986) e Marx, A. et al., Metabolic Engineering 1:35-48 (1999)). 1

Tem havido algum sucesso na utilização de manipulação metabólica para dirigir o fluxo de carbonos derivados de glucose para a formação de aminoácidos aromáticos (Flores, N. et al.f Nature Biotechnol. 14:620-623 (1996)). No entanto, ainda não foi documentada uma aplicação bem sucedida em estirpes produtoras (Berry, A., TIBTECH 14:250-256 (1996)). A manipulação metabólica refere-se à manipulação do fluxo de carbonos do material de partida, tais como hidratos de carbono e ácidos orgânicos, através da variedade de vias metabólicas durante a fermentação. Realizaram-se estudos, por exemplo, sobre o metabolismo central de Corynebacterium glutamicum utilizando estudos de RMN de 13C (Ishino, S. et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 37:157-165 (1991), Marx, A. et al., Biotechnology and Bioengineering 49:111-129 (1996)). Adicionalmente, também utilizando RMN de 13C, Walker et al. (Walker, T. et al., J. Biol. Chem. 257:1189-1195 (1982)) analisaram a fermentação de ácido glutâmico por Microbacterium ammoníaphilum e Inbar et al. (Inbar, L. et al., Eur. J. Biochem. 149:601-601 (1985)) estudaram a fermentação de lisina por Brevibacterium flavum.

Vallino et al. (Biotechnol. Prog. 1994, 10, 327-334) descrevem um método para a produção de L-aminoácidos com uma 6-fosfoglucose isomerase mutada que apresenta uma actividade enzimática diminuída e um aumento não significativo do rendimento de L-lisina. Na página 329, segunda coluna, terceiro parágrafo, Vallino et al. descrevem que "nenhuma alteração significativa do fluxo que se divide no ponto de ramificação da GIc6P resultou de uma atenuação de 90% da actividade de gpi, apesar da mutação ter produzido alterações nas cinéticas de crescimento globais". 2 A presente invenção resolve um problema de melhorar os rendimentos de aminoácidos durante a fermentação, utilizando manipulação metabólica.

Sumário da invenção A presente invenção proporciona as seguintes formas de realização 1-16: 1. Método para produzir L-aminoácidos seleccionados do grupo consistindo de L-lisina, L-treonina e L-isoleucina, compreendendo: cultivar uma célula de Corynebacterium glutamicum alterada com fluxo de carbono aumentado através do ramo oxidativo da via das pentoses-fosfato e com actividade de 6-fosfoglucose isomerase ("pgi") reduzida, em comparação com uma célula de Corynebacterium glutamicum não alterada, em que os rendimentos de L-aminoácidos da referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada são superiores aos rendimentos de uma célula de

Corynebacterium glutamicum não alterada, em que a referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada tem um gene 6 "pgi" mutante. 2. Método da forma de realização 1, em que a referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada tem uma quantidade aumentada de NADPH em comparação com uma célula de Corynebacterium glutamicum não alterada. 3. Método da forma de realização 2, em que a referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada tem uma quantidade 3 aumentada de uma ou mais enzimas seleccionadas do grupo compreendendo glucose-6-fosfato desidrogenase, lactonase e 6-fosfogluconato desidrogenase. 4. Método da forma de realização 1, em que a referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada tem um fluxo de carbono diminuído através da via glicolítica. 5. Método da forma de realização 1, em que os referidos rendimentos de L-aminoácidos a partir da referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada são de 1% a 100% mais elevados do que a partir da referida célula de

Corynebacterium glutamicum não alterada. 6. Método da forma de realização 1, em que a referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada é produzida por (a) subclonagem de uma região interna de um gene pgi; e (b) inserção do referido vector resultante do passo (a) num genoma de Corynebacterium glutamicum, por recombinação homóloga. 7. Método da forma de realização 1, em que o referido L-aminoácido compreende L-lisina. 8. Vector obtido por subclonagem de uma região interna de um gene pgi seleccionado de replicões baseados em Col El com um marcador seleccionável e pBGS131, i. e. o vector com o N°. de depósito 37443 na ATCC. 4 9. Método para produzir uma célula de Corynebacterium glutamicum com um gene de 6-fosfoglucose isomerase ("pgi") mutado, compreendendo: (a) subclonar uma região interna do gene pgi num vector suicida; e (b) inserir o referido vector resultante do passo (a) num genoma bacteriano, sendo produzida uma célula bacteriana com um gene pgi alterado, em que uma mutação do gene pgi homólogo é causada pelo vector suicida de (a) . 10. Método de acordo com a forma de realização 9, em que o referido vector suicida é seleccionado do grupo compreendendo pBGS131, i. e., o vector com o N°. de depósito da ATCC 37443 e replicões baseados em Col EI com marcador seleccionável. 11. Célula de Corynebacterium glutamicum alterada compreendendo o vector da forma de realização 8, em que a célula bacteriana alterada não possui actividade de 6-fosfoglucose isomerase detectável. 12. Método para produzir L-aminoácidos compreendendo: cultivar uma célula bacteriana alterada que não possui actividade de 6-fosfoglucose isomerase ("pgi") detectável, em que os rendimentos de L-aminoácidos da referida célula bacteriana alterada são superiores aos rendimentos de uma célula bacteriana não alterada, em que a referida célula bacteriana alterada tem um gene pgi mutante. 5 13. Método da forma de realização 12, em que os referidos rendimentos em L-aminoácidos da referida célula bacteriana alterada são de cerca de 1% a 100% superiores aos da referida célula bacteriana não alterada. 14. Método da forma de realização 12, em que a referida célula bacteriana alterada é produzida por (a) subclonagem de uma região interna de um gene pgi; e (b) inserção do referido vector resultante do passo (a) num genoma bacteriano, por recombinação homóloga. 15. Método da forma de realização 12, em que a referida célula bacteriana é uma célula de Corynebacterium glutamicum. 16. Método da forma de realização 12, em que o referido L-aminoácido é seleccionado do grupo constituído por L-lisina, L-treonina e L-isoleucina. A invenção também proporciona um vector útil de acordo com este método. A presente invenção ilustra também moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo um polinucleótido que codifica para o polipéptido de fosfoglucose isomerase de Corynebacterium glutamicum com a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 1 (SEQ ID N°.:2), ou uma das sequências de aminoácidos codificadas pelo clone de ADN depositado num hospedeiro bacteriano com o número de depósito NRRL B-30174 em 17 de Agosto de 1999. 6 A invenção proporciona também um péptido Pgi isolado com uma sequência de aminoácidos codificada por um polinucleótido aqui descrito.

Outras vantagens da presente invenção serão óbvias a partir da descrição que se segue.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1A-1C mostra as sequências de nucleótido (SEQ ID N°.:l) e a de aminoácidos deduzida (SEQ ID N°.:2) de pgi. 0 péptido Pgi tem um peso molecular deduzido de cerca de 59 kDa.

Descrição Detalhada da Invenção

Foi aqui determinado que quantidades crescentes de NADPH numa célula bacteriana aumentam o rendimento do produto, especificamente em processos anabólicos em que o NADPH é um factor limitante. Um modo de transportar a energia química de reacções de catabolismo para as reacções de biossintese que requerem energia, tais como a formação de aminoácidos, é na forma de átomos de hidrogénio ou electrões. Para serem eficazes como agentes redutores, os átomos de hidrogénio deverão ter uma energia livre considerável. Estes átomos de hidrogénio de energia elevada são obtidos de combustíveis celulares pelas desidrogenases, que catalizam a remoção de átomos de hidrogénio de moléculas combustíveis e a sua transferência para coenzimas específicas, em particular para a forma oxidada do fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido (NADP+) . A forma reduzida, ou que transporta hidrogénio, desta coenzima, designada por NADPH é 7 um transportador de electrões ricos em energia, de reacções catabólicas para reacções biossintéticas que requerem electrões. A presente invenção proporciona um método como acima definido para produzir L-aminoácidos por cultura de células bacterianas alteradas que possuem quantidades maiores de NADPH, em comparação com células bacterianas não alteradas, em que os rendimentos em L-aminoácidos a partir das referidas células bacterianas alteradas são superiores aos rendimentos a partir de células bacterianas não alteradas. Os aminoácidos preferidos são L-lisina, L-treonina e L-isoleucina. Tal como aqui utilizado, uma célula bacteriana alterada é definida como uma célula bacteriana que tem uma quantidade aumentada de NADPH em comparação com uma célula bacteriana não alterada.

Numa forma de realização preferida, uma célula bacteriana "alterada" é uma célula bacteriana "mutada". Uma "mutação" é qualquer alteração detectável no material genético que pode ser transmitida às células filhas. Uma mutação pode ser qualquer (ou uma combinação de) alteração não natural, detectável, que afecta a constituição quimica ou fisica, mutabilidade, replicação, função fenotipica ou recombinação de um ou mais desoxirribonucleótidos; os nucleótidos podem ser adicionados, eliminados, substituidos, invertidos ou transpostos para novas posições, com ou sem inversão. As mutações podem ocorrer espontaneamente e podem ser induzidas experimentalmente por aplicação de mutagénios ou tecnologia de ADN recombinante. Uma variação mutante de uma molécula de ácido nucleico resulta de uma mutação. Um polipéptido mutante pode resultar de uma molécula de ácido nucleico mutante. 8

Adicionalmente, uma célula bacteriana alterada ou mutada pode ser geneticamente "mutada" para se obter uma quantidade aumentada de NADPH em comparação com a célula geneticamente "não mutada".

Uma maior quantidade de NADPH na célula bacteriana alterada resulta numa maior produção de aminoácidos. De um modo preferido, numa célula bacteriana alterada, os rendimentos de aminoácidos estão aumentados em relação aos de uma célula não alterada em mais de cerca de 1% e, de um modo preferido, de cerca de 1% a cerca de 100%, de um modo preferido de cerca de 2% a cerca de 80% de um modo mais preferido de cerca de 5% a cerca de 60% e, de um modo ainda mais preferido, de cerca de 10% a cerca de 80%. Tal como aqui utilizado, "rendimento" é definido como gramas de aminoácido produzido, multiplicadas por 100, divididas por gramas de glucose consumidas.

De acordo com a presente invenção, a célula bacteriana alterada da presente invenção é cultivada num meio de cultura que compreende uma fonte de carbono e uma fonte de azoto. A fonte de carbono pode ser, por exemplo, arabinose, celobiose, frutose, glucose, lactose, maltose, manose, ramnose, rafinose, sorbose, sacarose, trealose, piruvato, ou succinato. A fonte de carbono está, de um modo preferido, a uma concentração inicial de 0,1 a 10%, de um modo preferido de 0,5 a 6,0% em peso. A fonte de carbono pode ser toda adicionada ao meio antes do inicio da cultura, ou pode ser adicionada passo a passo, ou continuamente durante a cultura. O meio aqui utilizado pode ser sólido ou liquido, sintético (i. e. produzido pelo homem) ou natural e contém nutrientes suficientes para a cultura da célula bacteriana alterada da 9 presente invenção. De um modo preferido, o meio utilizado é um meio liquido, de um modo mais preferido, um meio liquido sintético. 0 meio de cultura natural ou sintético utilizado nas formas de realização da invenção descritas acima e abaixo também contém uma fonte de azoto, sais inorgânicos adequados e, como adequado, vários nutrientes vestigiais, factores de crescimento e semelhantes, adequados para cultura da célula bacteriana alterada e pode também conter pelo menos uma fonte de carbono suplementar. A quantidade de cada um destes ingredientes adicionais a ser utilizados é, de um modo preferido, seleccionada para maximizar a produção de aminoácidos. Estas quantidades podem ser determinadas empiricamente por um especialista na matéria de acordo com os vários métodos e técnicas conhecidos na matéria.

Exemplos ilustrativos de fontes de carbono suplementares adequadas incluem, mas não se limitam a: outros hidratos de carbono, tais como glucose, frutose, sacarose, amido ou hidrolisado de amido, hidrolisado de celulose e melaços; ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido málico, ácido cítrico, e ácido fumárico; e álcoois, tais como glicerol, inositol, manitol e sorbitol.

Exemplos ilustrativos de fontes de azoto adequadas incluem, mas não se limitam a: amónia, incluindo amónia gasosa e amónia aquosa; sais de amónio de ácidos inorgânicos ou orgânicos, tais como cloreto de amónio, nitrato de amónio, fosfato de amónio, sulfato de amónio e acetato de amónio; ureia; sais de nitrato ou nitrito, e outros materiais contendo azoto, incluindo 10 aminoácidos quer como preparações puras, quer brutas, extracto de carne, peptona, farinha de peixe, hidrolisado de peixe, licor de milho macerado, hidrolisado de caserna, hidrolisado de bolo de soja, extracto de levedura, levedura seca, etanol-destilado de levedura, farinha de soja, farelo de semente de algodão e semelhantes.

Exemplos ilustrativos de sais inorgânicos adequados incluem, mas não se limitam a: sais de potássio, cálcio, sódio, magnésio, manganês, ferro, cobalto, zinco, cobre, molibdénio, tungsténio e outros elementos vestigiais e ácido fosfórico.

Exemplos ilustrativos de nutrientes vestigiais, factores de crescimento adequados e semelhantes incluem, mas não se limitam a: coenzima A, ácido pantoténico, piridoxina-HCl, biotina, tiamina, riboflavina, flavina mononucleótido, flavina adenina dinucleótido, ácido DL-6,8-tióctico, ácido fólico, Vitamina B12, outras vitaminas, bases, tais como adenina, uracilo, guanina, timina e citosina, L-aminoácidos, tiossulfato de sódio, ácido p-ou r-aminobenzóico, niacinamida, nitriloacetato e semelhantes, quer como compostos quimicos puros ou parcialmente purificados, ou como presentes em materiais naturais. A cultura da estirpe de microorganismos da invenção pode ser realizada utilizando qualquer das técnicas de fermentação submersas conhecidas do especialista na matéria, tais como agitação por fase gasosa, concepções pulverizado-agitado tradicionais ou em cultura com agitação.

As condições de cultura utilizadas, incluindo temperatura, pH, taxa de arejamento, velocidade de agitação, duração da cultura e semelhantes, podem ser determinadas empiricamente por um especialista na matéria para maximizar a produção de 11 aminoácidos. A selecção das condições de cultura específicas depende de factores tais como a composição e tipo de meio, técnica de cultura e considerações semelhantes.

Após a cultura durante um período de tempo suficiente, até um ou mais tipos de aminoácidos se terem acumulado nas células e/ou caldo de cultura, podem ser isolados de acordo com qualquer um dos métodos conhecidos, incluindo cromatografia de troca iónica, filtração em gel, extracção de solvente, cromatografia de afinidade ou quaisquer das suas combinações. Pode-se utilizar qualquer método que seja adequado com as condições utilizadas para a cultura.

As células bacterianas preferidas são as espécies de Corynebacteria e Escherichia coli. De entre as células bacterianas as células de Corynebacterium glutamicum são preferidas. Tal como aqui utilizado, Brevibacterium flavum e Brevibacterium lactofermentum são sinónimos de Corynebacterium glutamicum.

Na presente invenção, em geral obtém-se NADPH aumentado num microrganismo alterando a distribuição do fluxo de carbono entre as vias glicolítica e das pentoses-fosfato desse organismo. Tal como aqui utilizado, "fluxo de carbono" refere-se ao número de moléculas de glucose que prosseguem ao longo de uma via metabólica particular, em relação a vias competidoras.

De um modo preferido, a disponibilidade do NADPH é aumentada aumentando o fluxo de carbono através do ramo oxidativo da via das pentoses-fosfato. Teoricamente, são produzidos 12 NADPH por glucose, quando a glucose é exclusivamente metabolizada na via das pentoses-fosfato, mas apenas são produzidos dois NADPH por 12 glucose metabolizada no ciclo do TCA (ácido tricarboxílico, também designado por ciclo do ácido cítrico). Ishino, S. et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 37:157-165 (1991). A presente invenção proporciona um método para produzir L-aminoácidos por cultura de uma célula bacteriana alterada que tem um aumento no fluxo de carbono através da via das pentoses-fosfato. A maioria da glucose catabolizada nos organismos vivos prossegue através da glicólise resultando na formação de piruvato. A via das pentoses-fosfato, também designada por derivação de hexose monofosfato, é uma via alternativa para o catabolismo da glucose. A via das pentoses-fosfato produz NADPH e sob condições de fermentação de lisina é mais activa. Ishino, S. et al. , J. Gen. Appl. Microbiol. 37:157-165 (1991).

Na presente invenção, uma célula bacteriana alterada pode ser uma em que o fluxo de carbono através do ramo oxidativo ou via das pentoses-fosfato está aumentado. Especificamente, na presente invenção, uma célula bacteriana alterada pode ser uma que tem uma quantidade aumentada de uma ou mais enzimas envolvidas na via das pentoses-fosfato. Estas enzimas das pentoses-fosfato são seleccionadas do grupo compreendendo glucose-6-fosfato desidrogenase, transcetolase, transaldolase, ribulose 5-fosfato-3-epimerase, ribulose 5-fosfato isomerase e 6-fosfogluconato desidrogenase e 6-fosfogluconolactose.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona ainda um método para produzir L-aminoácidos como definido nas formas de realização 1-7 ou 12-16, incluindo a cultura de uma célula bacteriana alterada com uma quantidade crescente de enzima málica em relação a uma célula alterada. A 13 enzima málica cataliza a reacção de malato com NADP+ para produzir piruvato, dióxido de carbono, NADPH e H+.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona ainda um método para produzir L-aminoácidos como definido nas formas de realização 1-7 ou 12-16, incluindo cultivar uma célula bacteriana alterada com uma quantidade crescente de isocitrato desidrogenase em relação a uma célula não alterada. A isocitrato desidrogenase cataliza a reacção de isocitrato com NADP+ para produzir α-cetoglutarato, dióxido de carbono, NADPH e H+.

Quer a glicólise, quer a via das pentoses-fosfato competem para a glucose. Na presente invenção, uma célula bacteriana alterada pode ser uma em que um decréscimo ou bloqueio do fluxo de carbono através da glicólise resulta num aumento no fluxo de carbono através do ramo oxidativo da via das pentoses-fosfato. Tal como utilizado na presente invenção, uma célula bacteriana alterada pode ser uma em que uma diminuição do fluxo de carbono através da glicólise é conseguida por diminuição da quantidade de uma ou mais enzimas envolvidas na glicólise. As enzimas preferidas são a β-fosfoglucose isomerase, frutose difosfato aldolase, D-gliceraldeido fosfato desidrogenase, fofoglicerato cinase, fosfoglicerato mutase, endolase ou piruvato cinase. Uma enzima preferida é a 6-fosfoglucose isomerase.

Um método preferido para diminuir a quantidade de uma enzima glicolitica numa célula bacteriana alterada é mutar o gene que codifica para a enzima. Tal como aqui utilizado, prefere-se o bloqueio (nula) ou enfraquecimento (diminuída) da expressão do gene que codifica para 6-fosfoglucose isomerase ("pgi"). 14

Um método preferido de bloqueio (nula) ou enfraquecimento (diminuída) da expressão de genes que codificam para enzimas envolvidas na glicólise é a utilização de vectores suicida (também designados por vectores integrativos). Tal como aqui utilizado, um vector suicida é definido como um vector que não se replica autonomamente num organismo particular, que é em seguida introduzido na célula e se recombina numa região homóloga do cromossoma do organismo para provocar a inactivação de inserção do gene homólogo. A inactivação da inserção do gene é conseguida rompendo a fase de leitura do gene. A inactivação de inserção do gene ocorre apenas se uma porção interna do gene é utilizada como região homóloga.

As construções recombinantes podem ser introduzidas nas células bacterianas da presente invenção utilizando técnicas bem conhecidas, tais como transdução, transfecção, transvecção, conjugação, electroporação, electrotransformação, transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lípidos catiónicos e transformação ou outros métodos. Tais métodos estão descritos em muitos manuais laboratoriais convencionais, tais como Davis et al. , "Basic Methods in Molecular Biology," (1986).

Numa forma de realização preferida, a célula bacteriana alterada como definido na forma de realização 11 é produzida por (a) subclonagem da região interna do gene pgi num vector suicida; e (b) inserção do referido vector suicida num genoma bacteriano, através de recombinação homóloga. Uma região interna pode ser definida como uma sequência de ADN contígua entre, mas não incluindo o codão de iniciação e o codão final da estrutura de leitura aberta (ORF) em questão. De um modo preferido, é seleccionada uma região interna que irá facilitar a integração 15 genómica e resultar na expressão de um polipéptido não funcional da ORF em questão.

Nalgumas formas de realização preferidas, os vectores suicidas podem ser inductiveis, específicos do mutante e/ou específicos da condição. São particularmente preferidos entre estes vectores os inductiveis por factores ambientais que são fáceis de manipular, tais como temperatura e aditivos nutrientes. Outros factores ambientais adequados serão facilmente evidentes para os especialistas na matéria.

As células bacterianas alteradas da presente invenção podem ser transformadas com vectores suicida que incluem opcionalmente pelo menos um gene marcador. Estes marcadores incluem genes de resistência a amicacina, augmentin (amoxicilina mais ácido clavulónico), ampicilina, cefazolina, cefoxitina, ceftazidima, ceftiofur, cefalotina, cloranfenicol, enrofloxacina, eritromicina, florfenicol, gentamicina, imipenema, canamicina, sarafloxicina, tetraciclina, ticarcilina, estreptomicina, espectinomicina, higromicina, trimetoprim ou tilmicosina. Marcadores preferidos incluem genes de resistência a cloranfenicol e/ou canamicina. Outros marcadores adequados serão evidentes para o especialista na matéria.

Um exemplo ilustrativo da utilização de vectores suicida é como se segue: uma região interna de um gene é amplificado através de reacção em cadeia com polimerase e o fragmento resultante da amplificação é subclonado num vector suicida que inclui um gene marcador de resistência a antibiótico e o vector suicida é transformado no organismo original. A recuperação de clones resistentes a antibiótico implica a inactivação de inserção do gene homólogo. 0 vector suicida utilizado pode 16 incluir qualquer plasmídeo incapaz de replicação autónoma no organismo alvo. Nos casos em que o organismo alvo não é Escherichia coli, os replicões baseados em Col EI são preferidos. Entre os replicões baseados em Col El, o pBGS131 (American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA, N° de depósito 37443) é preferido.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona também um método para produzir uma célula bacteriana com um gene pgi mutado, como definido nas formas de realização 9 ou 10. Numa forma de realização particularmente preferida, a invenção proporciona um método para produzir uma célula bacteriana com um gene pgi mutado compreendendo (a) subclonar uma região interna do gene pgi num vector suicida; e (b) inserir o referido vector suicida num genoma bacteriano através de recombinação homóloga, sendo produzida uma célula bacteriana com um gene pgi alterado.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma célula bacteriana como definido acima, produzida de acordo com os métodos descritos acima.

Um exemplo ilustrativo da produção de uma célula bacteriana alterada é como se segue. Uma região do gene pgi de Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) que codifica para 6-fosfoglucose isomerase (uma enzima glicolitica) é amplificada por PCR utilizando iniciadores adequados. De um modo preferido, os iniciadores de PCR são os enumerados na SEQ ID N°.:3 e SEQ ID N°.:4, que contêm a sequência de reconhecimento da enzima de restrição Hind III. Após restrição com Hind III, o produto de PCR é então subclonado no vector suicida pBGS131. O subclone resultante é designado por pDPTpgi2. O subclone pDPTpgi2 é então 17 transformado em C. glutamicum e seleccionam-se colónias resistentes a canamicina num meio adequado. 0 isolamento de colónias resistentes a canamicina implica que ocorreu um fenómeno de integração. Predominantemente, a integração ocorre através de recombinação homóloga, resultando no rompimento do gene pgi.

Outro método preferido para produzir uma célula bacteriana alterada como definido acima é bloquear ou enfraquecer a expressão do gene adequado, através da alteração do promotor à frente do gene. É preferido utilizar um promotor diferente de qualquer fonte, ou alterar a sequência de nucleótidos do promotor nativo. Entre os métodos para alterar a sequência de nucleótidos do promotor nativo prefere-se a mutagénese por PCR. Entre os promotores bacterianos conhecidos adequados para esta utilização na presente invenção incluem-se os promotores de E. coli lacl e lacZ, os promotores T3 e T7, o promotor gpt, os promotores PR e PL de lambda, o promotor trp, o promotor tac ou promotores endógenos para as células bacterianas da presente invenção. Também é preferida a supra-regulação de genes que codificam para enzimas envolvidas na via das pentoses-fosfato. Isto pode ser feito por alteração do promotor que controla o gene, de modo que se utiliza um promotor mais forte do que o promotor nativo. Outro modo preferido de supra-regular os genes da via das pentoses-fosfato seria aumentar o número de cópias dos genes em questão, através da utilização de integração genómica ou plasmídeos de replicação autónoma.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção também proporciona um método para produzir L-aminoácidos, como definido acima, compreendendo cultivar uma célula bacteriana alterada, em que a referida célula bacteriana é uma célula de 18

Corynebacterium glutamicum com um gene seleccionado do grupo constituído por um gene pgi mutante.

Outro método preferido para produzir uma célula bacteriana alterada como definido acima compreende mutar um gene que codifica para uma enzima envolvida na glicólise, para produzir uma expressão bloqueada ou enfraquecida do gene que codifica para a enzima glicolítica. Exemplos ilustrativos de métodos adequados para preparar genes mutados incluem, mas não se limitam a: mutagénsese por PCR, mutagénese quimica in vitro, mutagénese de oligonucleótidos, mutagénese por irradiação com luz ultravioleta ou raios-X, ou por tratamento com um mutagénio químico, tal como nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina), metilmetanossulfonato, mostarda de azoto e

semelhantes; técnicas de integração de genes, tais como as mediadas por elementos de inserção ou transposões, ou por recombinação homóloga de transformação de moléculas de ADN lineares ou circulares; e transdução mediada por bacteriófagos, tais como PI. Estes métodos são bem conhecidos na matéria e estão descritos, por exemplo, em J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1972); J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1992); M. Singer e P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mill Valley, Califórnia (1991); J. Sambrook, E.F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989); P.B. Kaufman et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Flórida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R Glick e J. E. Thompson, eds., CRC Press, Boca Raton, Flórida (1993); e 19 P.F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, Nova Iorque, NY (1989).

Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona uma célula bacteriana isolada ou purificada como definido acima, compreendendo um gene pgi mutado. A presente invenção ilustra também moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo um polinucleótido que codifica para um polipéptido Pgi com a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 1 (SEQ ID N° . : 2) . A sequência de nucleótidos apresentada na Figura 1 (SEQ ID N° . :1) pode ser obtida por sequenciação do clone de ADN, que foi depositado em 17 de Agosto de 1999 no Agricultural Research Service Culture

Collection (NRRL) sob os termos do tratado de Budapeste, 1815

North University Street, Peoria, Illinois 61604, EUA e ao qual foi atribuído o número de acesso B-30174. O clone depositado está no plasmideo p41-13 (C01). A presente invenção ilustra uma molécula de ácido nucleico isolada seleccionada do grupo constituído por: (a) um polinucleótido que codifica para um polipéptido compreendendo os aminoácido de cerca de 1 a cerca de 540 na SEQ ID N°.:2; (b) um polinucleótido que codifica para um polipéptido compreendendo uma das sequências de aminoácidos codificada pelo clone de ADN contido no N° de depósito da NRRL B-30174; (c) o complemento de (a) ou (b); (d) uma variante do polinucleótido criada por alteração do polinucleótido de (a), em que: 20 (1) a referida alteração inclui uma inserção, eliminação ou substituição de nucleótido ou qualquer sua combinação; e (2) o número de alterações é igual ou inferior a5 % do número total de nucleótidos presente em (a); (e) uma variante do polinucleótido criada por alteração do polinucleótido de (b), em que: (1) a referida alteração inclui uma inserção, eliminação ou substituição de nucleótido ou qualquer sua combinação; e (2) o número de alterações é igual ou inferior a 5% do número total de nucleótidos presente em (b); (f) uma variante do polinucleótido criada por alteração do polinucleótido de (c), em que: (1) a referida alteração inclui uma inserção, eliminação ou substituição de nucleótido ou qualquer sua combinação; e (2) o número de alterações é igual ou inferior a 5% do número total de nucleótidos presente em (c). A presente invenção ilustra também a molécula de ácido nucleico acima, em que o referido polinucleótido tem a sequência de nucleótidos completa de SEQ ID N°.:1. A presente invenção ilustra também a molécula de ácido nucleico acima, em que o referido polinucleótido tem a sequência de nucleótidos de SEQ ID N°. : 1 que codifica para o polipéptido Pgi com a sequência de aminoácidos completa de SEQ ID N°.:2. 21 A presente invenção ilustra também a molécula de ácido nucleico acima, em que o referido polinucleótido tem uma sequência de nucleótidos que codifica para o polipéptido Pgi codificado por um clone de ADN contido no depósito N° B-30174 na NRRL. A presente invenção ilustra também uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo um polinucleótido que híbrida sob condições de hibridação rigorosas com um polinucleótido que tem uma sequência de nucleótidos idêntica a uma sequência de nucleótidos em (a) , (b) ou (c) da molécula de ácido nucleico acima, em que o referido polinucleótido que híbrida, não híbrida sob condições de hibridação rigorosas com um polinucleótido que tem uma sequência de nucleótidos que consiste de apelas resíduos A ou apenas resíduos T. A presente invenção ilustra também um método para produzir um vector recombinante compreendendo inserir a molécula de ácido nucleico isolada acima, num vector. A presente invenção ilustra também um vector compreendendo a molécula de ácido nucleico acima. A presente invenção ilustra também um método para produzir uma célula hospedeira recombinante compreendendo introduzir o vector acima numa célula hospedeira. A presente invenção ilustra também uma célula hospedeira compreendendo o vector acima. A presente invenção ilustra também um método para produzir um polipéptido Pgi, compreendendo a cultura da célula hospedeira recombinante acima, sob condições tais que o referido polipéptido é expresso, e a recuperação do referido polipéptido. 22 A presente invenção ilustra também um polipéptido isolado seleccionado do grupo constituído por: (a) um polipéptido compreendendo aminoácidos de cerca de 1 a cerca de 540 na SEQ ID N°.:2; (b) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos codificada pelo clone de ADN contido no depósito N° B-30174 na NRRL; (c) uma variante do polipéptido criada por alteração da sequência de aminoácidos de (a), em que: (1) a referida alteração inclui uma inserção, eliminação ou substituição ou qualquer sua combinação; e (2) o número de alterações é igual a, ou inferior a 5% do número total de nucleótidos presente em (a); (d) uma variante do polipéptido criada por alteração do polinucleótido de (b), em que: (1) a referida alteração inclui uma inserção, eliminação ou substituição ou qualquer sua combinação; e (2) o número de alterações é igual a, ou inferior a 5% do número total de nucleótidos presente em (b).

Moléculas de ácido nucleico

Salvo indicação em contrário, todas as sequências de nucleótidos determinadas por sequenciação de uma molécula de ADN aqui foram determinadas utilizando um sequenciador de ADN automático (tal como o modelo 373 da Applied Biosystems, Inc.) e todas as sequências de aminoácidos de polipétidos codificados 23 por moléculas de ADN aqui determinadas foram previstas por tradução de uma sequência de ADN determinada como acima. Assim, como é conhecido na matéria para qualquer sequência de ADN determinada por esta abordagem automatizada, qualquer sequência de nucleótidos aqui determinada pode conter alguns erros. As sequências de nucleótidos determinadas por automatização são, tipicamente, pelo menos cerca de 90% idênticas, mais tipicamente pelo menos cerca de 95% a pelo menos cerca de 99,9% idênticas à sequência de nucleótidos real da molécula de ADN sequenciada. Como também é conhecido na matéria, uma única inserção ou eliminação numa determinada sequência de nucleótidos em comparação com a sequência real irá causar uma alteração de estrutura na tradução da sequência de nucleótidos, de modo que a sequência de aminoácidos prevista codificada por uma determinada sequência de nucleótidos será completamente diferente da sequência de aminoácidos realmente codificada pela molécula de ADN sequenciada, começando no ponto dessa inserção ou eliminação.

Utilizando a informação aqui proporcionada, tal como a sequência de nucleótidos na Figura 1, uma molécula de ácido nucleico ilustrada pela presente invenção que codifica para um polipéptido Pgi pode ser obtida utilizando processos de clonagem e pesquisa convencionais.

Assim, a presente invenção ilustra uma sequência de nucleótidos que codifica para um polipéptido Pgi com a sequência de aminoácidos codificada pelo clone contido no hospedeiro identificado como N°. de depósito da NRRL N° B-30174 e como apresentado nas Figuras I (SEQ ID NoS.:l e 2). 24

Tal como será apreciado por um especialista na matéria, devido à possibilidade de erros de sequenciação, o polipéptido Pgi previsto codificado pelo clone depositado compreende cerca de 540 aminoácidos, mas pode ter quaisquer na gama de 500 a 580 aminoácidos.

Como indicado, as moléculas de ácido nucleico ilustradas pela presente invenção podem ser na forma de um ARN, tal como ARNm, ou na forma de ADN, incluindo, por exemplo, ADNc e ADN genómico obtido por clonagem ou produzido sinteticamente. O ADN pode ser de cadeia dupla ou cadeia simples. O ADN ou ARN de cadeia simples pode ser a cadeia codificante, também conhecida como cadeia de sentido, ou pode ser a cadeia não codificante, também designada por cadeia anti-sentido.

Por molécula (s) de ácido nucleico "isolada" entende-se uma molécula de ácido nucleico, ADN ou ARN, que foi removida do seu meio ambiente nativo. Por exemplo, as moléculas de ADN recombinantes contidas num vector são consideradas isoladas para os fins da presente invenção. Outros exemplos de moléculas de ADN isoladas incluem moléculas de ADN recombinante mantidas em células hospedeiras heterólogas ou moléculas de ADN em solução, purificadas (parcial ou substancialmente). Moléculas de ARN isoladas incluem moléculas de ARN transcritas in vivo ou in vitro das moléculas de ADN da presente invenção. Moléculas de ácido nucleico isoladas de acordo com a presente invenção incluem também estas moléculas produzidas sinteticamente.

Moléculas de ácido nucleico isoladas ilustradas pela presente invenção incluem moléculas de ADN compreendendo uma estrutura de leitura aberta (ORF) apresentada na Figura 1 (SEQ ID N°.:l); moléculas de ADN compreendendo a sequência 25 codificante para a proteína Pgi apresentada na Figuras 1 (SEQ ID N°.:2); e moléculas de ADN gue compreendem uma seguência substancialmente diferente das descritas acima, mas gue, devido à degenerescência do código genético, ainda codificam para a proteína Pgi. Obviamente, o código genético é bem conhecido na matéria. Assim, será de rotina para o especialista na matéria produzir estas variantes degeneradas.

Adicionalmente, a invenção ilustra moléculas de ácido nucleico com sequências de nucleótidos relacionadas com porções extensas da SEQ ID N°.:1.

Noutro aspecto, a invenção ilustra moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam para o polipéptido Pgi tendo uma sequência de aminoácidos codificada pela molécula de ácido nucleico depositada na NRRL com N°. de depósito B-30174 em 17 de Agosto, 1999. A invenção proporciona ainda uma molécula de ácido nucleico isolada que tem a sequência de nucleótidos apresentada na Figura 1 (SEQ ID N°.:l) ou a sequência de nucleótidos da sequência genómica de pgi contida no clone depositado acima descrito, ou uma molécula de ácido nucleico que tem uma sequência complementar a uma das sequências acima. Estas moléculas isoladas, em particular moléculas de ADN, são úteis como sondas para mapeamento genético, por hibridação in situ com cromossomas. A presente invenção ilustra também fragmentos das moléculas de ácido nucleico isoladas aqui descritas. Por fragmento de uma molécula de ácido nucleico isolada com a sequência de nucleótidos do clone depositado, ou a sequência de nucleótidos apresentada na Figura 1 (SEQ ID N°.:l) entende-se fragmentos de pelo menos 15 nucleótidos (nt) e, de um modo mais preferido, 26 pelo menos cerca de 20 nt, de um modo ainda mais preferido pelo menos cerca de 30 nt e de um modo ainda mais preferido, pelo menos cerca de 40 nt de comprimento, que são úteis como sondas de diagnóstico e iniciadores, como discutido aqui. Obviamente, fragmentos maiores, de 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550 nt de comprimento também são úteis de acordo com a presente invenção, tal como o são fragmentos que correspondem à maioria, senão a toda a sequência de nucleótidos do clone depositado, ou como apresentado na Figura 1 (SEQ ID N°.:l). Por um fragmento de pelo menos 20 nt de comprimento, por exemplo, entende-se fragmentos que incluem 20 ou mais bases contíguas da sequência de nucleótidos do clone depositado, ou a sequência de nucleótidos como apresentado na Figura 1 (SEQ ID N°.:l). A invenção ilustra uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo um polinucleótido que híbrida sob condições de hibridação rigorosas com uma porção do polinucleótido numa molécula de ácido nucleico ilustrada pela invenção, descrita acima, por exemplo, o clone depositado contido no depósito da NRRL B-30174. Por "condições de hibridação rigorosas" entenda-se incubação durante a noite a 42 °C, numa solução compreendendo: formamida a 50%, 5x SSC (NaCl a 150 mM, citrato trissódico a 15mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6), 5x solução de

Denhardt, sulfato de dextrano a 10% e ADN de esperma de salmão cortado a 20 g/mL desnaturado, seguido de lavagem dos filtros em 0,lx SSC a cerca de 65 °C.

Por polinucleótido que híbrida com uma "porção" de um polinucleótido entenda-se um polinucleótido (quer ADN, quer ARN) que híbrida com pelo menos cerca de 15 nucleótidos (nt) e, de um modo mais preferido, pelo menos 20 nt, de um modo ainda mais 27 preferido pelo menos cerca de 30 nt e de um modo ainda preferido cerca de 30-70 nt do polinucleótido de referência. Estes são úteis como sondas de diagnóstico e iniciadores, como discutido acima e em mais detalhe a seguir.

Por uma porção de um polinucleótido de "pelo menos 20 nt de comprimento", por exemplo, entenda-se 20 ou mais nucleótidos contíguos da sequência de nucleótidos do polinucleótido de referência (e. g. o clone depositado ou a sequência de nucleótidos, como apresentado na Figura 1 (SEQ ID N°.:l)). Obviamente, um polinucleótido que híbrida apenas com uma sequência poliA (tal como a porção poli(A) de terminal 3' do ADNc de pgi apresentado na Figura 1 (SEQ ID N°. : 1) ) , ou com uma porção complementar de resíduos T (ou U) , não será incluída num polinucleótido ilustrado pela invenção utilizado para hibridar com uma porção de um ácido nucleico ilustrado pela invenção, uma vez que este polinucleótido iria hibridar com qualquer molécula de ácido nucleico contendo uma porção complementar poli(A) ou o seu complemento (e. g. praticamente qualquer clone de ADN de cadeia dupla).

Como indicado, as moléculas de ácido nucleico ilustradas pela presente invenção que codificam para um polipéptido Pgi podem incluir, mas não se limitam às que codificam para a sequência de aminoácidos do polipéptido, por si só; a sequência codificante para o polipéptido e sequências adicionais, tais como as que codificam para uma sequência líder ou secretora de aminoácidos, tais como uma sequência de pre-, ou pro-, ou prepro-proteína; a sequência codificante do polipéptido, com ou sem as sequências codificantes adicionais acima mencionadas, juntamente com outras sequências não codificantes adicionais, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a sequências 5' e 28 3' não codificantes, tais como as sequências transcritas, não traduzidas que desempenham um papel na transcrição, processamento de ARNm, por exemplo - ligação ao ribossoma e estabilidade do ARNm; uma sequência codificante adicional que codifica para aminoácidos adicionais, tais como os que proporcionam funcionalidades adicionais. Assim, a sequência que codifica para o polipéptido pode ser fundida com uma sequência marcadora, tal como uma sequência que codifica para um péptido que facilita a purificação do polipéptido fundido. Opcionalmente, a sequência de aminoácidos marcadora é um péptido de hexa-histidina, tal como o marcador proporcionado num vector pQE (Qiagen, Inc.), entre outros, muitos dos quais estão disponíveis comercialmente. Tal como descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina proporciona uma purificação conveniente da proteína de fusão. 0 marcador "HA" é outro péptido útil para a purificação que corresponde a um epítopo derivado da proteína de hemaglutinina de influenza que foi descrito por Wilson et al., Cell 37: 767 (1984). Como discutido a seguir, outras proteínas de fusão deste tipo incluem Pgi fundido com Fc no terminal - ou C.

As sondas, iniciadores e/ou fragmentos de ácido nucleico descritos acima podem ser utilizados para monitorizar a expressão do gene pgi durante a fermentação. A presente invenção ilustra também variantes das moléculas de ácido nucleico da presente invenção, que codificam para porções, análogos ou derivados da proteína Pgi. As variantes podem ocorrer naturalmente, tal como uma variante alélica natural. Por "variante alélica" entenda-se uma de várias formas alternativas de um gene que ocupa um determinado locus num 29 cromossoma de um organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nova Iorque (1985). As variantes que não ocorrem naturalmente podem ser produzidas utilizando técnicas de mutagénese conhecidas na matéria.

Estas variantes incluem as que são produzidas por substituições, eliminações ou adições de nucleótidos, que podem envolver um ou mais nucleótidos. As variantes podem ser alteradas em regiões codificantes, regiões não codificantes ou ambas. As alterações nas regiões codificantes podem produzir substituições, eliminações ou adições de aminoácidos conservativas ou não conservativas. As opções entre estas são substituições, adições e eliminações silenciosas que não alteram as propriedades e actividades da proteína Pgi ou suas porções. Além disso, as opções a este respeito são substituições conservadoras. A invenção ilustra moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo um polinucleótido com uma sequência de nucleótidos pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a (a) uma sequência de nucleótidos que codifica para o polipéptido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°.:2; (b) uma sequência de nucleótidos que codifica para o polipéptido Pgi de comprimento total, tendo a sequência de aminoácidos completa codificada pelo clone contido no depósito N° B-30174 na NRRL; ou (c) uma sequência de nucleótidos complementar a qualquer das sequências de nucleótidos em (a) ou (b).

Por polinucleótido tendo uma sequência de nucleótidos pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência de nucleótidos de referência que codifica para um polipéptido Pgi, entenda-se que a sequência de nucleótidos do polinucleótido é 30 idêntica à sequência de referência, excepto que a sequência de polinucleótido pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência de nucleótidos de referência que codifica para o polipéptido Pgi. Por outras palavras, para obter um polinucleótido tendo uma sequência de nucleótidos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleótidos de referência, até 5% dos nucleótidos na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos por outro nucleótido, ou um número de nucleótidos até 5% dos nucleótidos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições de terminal 5' ou 3' da sequência de nucleótidos de referência, ou algures entre essas posições terminais, espalhadas quer individualmente entre nucleótidos na sequência de referência, ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

Em termos práticos, o facto de qualquer molécula de ácido nucleico particular ser pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, por exemplo, à sequência de nucleótidos na Figura 1 ou à sequência de nucleótidos dos clones depositados, pode ser determinado convencionalmente utilizando programas de computador conhecidos, tais como o programa Bestfit (pacote Wisconsin Sequence Analysis, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). O Bestfit utiliza o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Quando se utiliza o Bestfit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência, os parâmetros são ajustados, 31 obviamente, de modo a que a percentagem de identidade seja calculada em relação ao comprimento total do nucleótido de referência e são permitidos intervalos na homologia de até 5% do número total de nucleótidos na sequência de referência. 0 presente pedido ilustra moléculas de ácido nucleico pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência de ácido nucleico apresentada na Figura 1 (SEQ ID N°.:l), ou à sequência de ácido nucleico do clone depositado, independentemente do facto de codificarem para um polipéptido com actividade de Pgi. Isto porque mesmo quando uma molécula de ácido nucleico particular não codifica para um polipéptido com actividade de Pgi, um especialista na matéria saberá ainda como utilizar a molécula de ácido nucleico, por exemplo, como sonda de hibridação, ou um iniciador de reacção em cadeia com polimerase (PCR) . As utilizações das moléculas de ácido nucleico da presente invenção que não codificam para um polipéptido com actividade Pgi incluem, inter alia, isolamento do gene pgi ou suas variantes alélicas numa biblioteca genómica e análise de transferência Northern para detectar a expressão de ARNm de pgi. São preferidas, no entanto, moléculas de ácido nucleico com sequências pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência de ácido nucleico apresentada na Figura 1 (SEQ ID N°.:l), ou à sequência de ácido nucleico do clone depositado que codificam, de facto, para um polipéptido com actividade de proteína Pgi. Por "polipéptido com actividade de Pgi" entenda-se polipéptidos que exibem actividade semelhante, mas não necessariamente idêntica a uma actividade da proteína Pgi da invenção, como medido num teste biológico particular. 32

Obviamente, devido à degenerescência do código genético, um especialista na matéria irá imediatamente reconhecer que um grande número das moléculas de ácido nucleico com uma sequência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de ácido nucleico do clone depositado, ou à sequência de ácido nucleico apresentada na Figura 1 (SEQ ID N°.:l) irá codificar para um polipéptido "com actividade de proteína Pgi". De facto, uma vez que as variantes degeneradas destas sequências de nucleótidos codificam todas para o mesmo polipéptido, isto será claro para o especialista na matéria, mesmo sem realizar o teste de comparação acima descrito. Deve também ser reconhecido na matéria que para as moléculas de ácido nucleico que não são variantes degeneradas, um número razoável das mesmas também irá codificar para um polipéptido com actividade de proteína Pgi. Isto porque o especialista na matéria tem conhecimento de que há substituições de aminoácidos com pouca ou nenhuma probabilidade de afectar significativamente a função da proteína (e. g., substituindo um aminoácido alifático com um segundo aminoácido alifático).

Por exemplo, a linha de orientação no que respeita ao modo de fazer substituições de aminoácidos fenotipicamente silenciosas é proporcionada em Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," 1:1306-1310 (1990), em que os autores indicam que as proteínas são surpreendentemente tolerantes a substituições de aminoácidos. 33

Vectores e células hospedeiras A presente invenção também se refere a vectores como definido na forma de realização 8 que incluem as moléculas de ADN isoladas e células hospedeiras como definido na forma de realização 11, que são geneticamente manipuladas com os vectores recombinantes.

Podem-se ligar polinucleótidos a um vector contendo um marcador seleccionável para propagação num hospedeiro. Se o vector é um virus ele pode ser empacotado in vitro utilizando uma linha celular de empacotamento adequada e em seguida transduzido em células hospedeiras. A inserção de ADN deverá estar ligada de forma operacional a um promotor adequado, tal como o promotor PL do fago lambda, os promotores lac, trp e tac de E. coli, para referir alguns. Outros promotores adequados serão bem conhecidos do especialista na matéria. As construções de expressão também irão conter sitios para iniciação, terminação da transcrição e, na região transcrita, um sitio de ligação ao ribossoma, para tradução. A porção codificante das moléculas transcritas maduras, expressas pelas construções irá, de um modo preferido, incluir uma tradução que começa no inicio e um codão de terminação (UAA, UGA ou UAG) posicionado de forma adequada no final do polipéptido a ser traduzido.

Como indicado, os vectores de expressão ilustrados irão incluir opcionalmente pelo menos um marcador seleccionável. Tais marcadores incluem, mas não se limitam a genes de resistência a canamicina, cloranfenicol, tetraciclina ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias. Exemplos representativos 34 de hospedeiros adequados incluem, mas não se limitam a, células bacterianas, tais como células de E. coli, Streptomyces e Salmonella typhimurium; células de fungos, tais como células de levedura; células de insecto, tais como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9. São conhecidos na matéria meios e condições de cultura adequados para as células hospedeiras acima descritas.

Entre os promotores bacterianos conhecidos adequados para utilização na produção de proteinas ilustrada pela presente invenção, incluem-se promotores lacl e lacZ de E. coli, promotores T3 e T7, o promotor gpt, os promotores PR e PL de lambda e o promotor trp.

Entre os vectores adequados para utilização em bactérias incluem-se pQE70, pQE60 e pQE-9, disponíveis da Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponíveis da Stratagene; e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponíveis da Pharmacia. Outros vectores adequados serão facilmente evidentes para o especialista na matéria. A introdução da construção na célula hospedeira pode ser realizada por transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lípidos catiónicos, electroporação, transdução, infecção ou outros métodos. Estes métodos estão descritos em muitos manuais de laboratório convencionais, tais como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986). 0 polipéptido pode ser expresso numa forma modificada, tal como uma proteína de fusão e pode incluir não só sinais de secreção, mas também regiões funcionais heterólogas, adicionais. 35

Por exemplo, pode-se adicionar uma região de aminoácidos adicionais, em particular aminoácidos carregados, ao terminal-N do polipéptido para melhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira, durante a purificação ou durante o manuseamento e armazenamento subsequentes. Além disso, podem-se adicionar porções de péptido ao polipéptido para facilitar a purificação. Estas regiões podem ser removidas antes da preparação final do polipéptido. A adição de porções de péptido aos polipéptidos para originar a secreção ou excreção, para melhorar a estabilidade e para facilitar a purificação, entre outros, é uma técnica familiar e de rotina na matéria. A proteína Pgi pode ser recuperada e purificada de culturas de células recombinantes por métodos bem conhecidos, incluindo sulfato de amónio ou precipitação com etanol, extracção com ácido, cromatografia de troca aniónica ou catiónica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatite e cromatografia de lectina. De um modo muito preferido, utiliza-se cromatografia líquida de alta eficiência ("HPLC") para purificação. Os polipéptidos da presente invenção incluem produtos purificados naturalmente, produtos de processos sintéticos químicos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariota ou eucariota, incluindo, por exemplo, células bacterianas, de levedura, plantas superiores, insecto e mamífero. Dependendo do hospedeiro utilizado num processo de produção recombinante, os polipéptidos da presente invenção podem ser glicosilados ou não glicosilados. Além disso, os polipéptidos da invenção podem também incluir um resíduo de metionina modificado, inicial, nalguns casos como resultado de processos mediados pelo hospedeiro. 36

Polipéptidos e fragmentos Pgi A invenção ilustra também um polipéptido Pgi isolado com a sequência de aminoácidos codificada pelo clone depositado, ou a sequência de aminoácidos na Figura 1 (SEQ ID N°.:2), ou um péptido ou polipéptido compreendendo uma porção dos polipéptidos acima.

Será reconhecido na matéria que algumas sequências de aminoácidos do polipéptido Pgi podem ser variadas sem efeito significativo na estrutura ou função da proteína. Se estas diferenças na sequência são contempladas, deve relembrar-se que haverá áreas críticas na proteína que determinam a actividade.

Assim, a invenção ilustra também variações do polipéptido Pgi que apresentam uma actividade de polipéptido Pgi substancial, ou que incluem regiões de proteína Pgi, tais como as porções de proteína discutidas a seguir. Tais mutantes incluem eliminações, inserções, inversões, repetições e substituições tipo. Como indicado acima, a linha de orientação em relação a quais as alterações de aminoácidos que serão provavelmente silenciosas fenotipicamente, pode ser encontrada em Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, " Science 247:1306-1310 (1990).

Deste modo, o fragmento, derivado, ou análogo do polipéptido da Figura I (SEQ ID N°.:2) ou o polipéptido Pgi codificado pelo clone depositado pode ser (i) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácido são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de um modo preferido, um resíduo de aminoácido conservado) e o tal resíduo de aminoácido 37 conservado substituído pode ser ou não um que é codificado pelo código genético, ou (ii) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácido incluem um grupo substituinte, ou (iii) um em que o polipéptido está fundido com outro composto, tal como um composto para aumentar a semi-vida do polipéptido (por exemplo, polietilenoglicol), ou (iv) um em que os aminoácidos adicionais estão fundidos com o polipéptido maduro, tal como um péptido da região de fusão de Fc de IgG ou uma sequência líder ou secretora, ou uma sequência que é utilizada para purificação do polipéptido, ou uma sequência de pró proteína.

Como indicado, as alterações são de um modo preferido de uma natureza menor, tal como substituições de aminoácidos conservadoras que não afectam de forma significativa o enrolamento ou actividade da proteína (ver Tabela 1).

Tabela 1. Substituições de aminoácidos conservadoras

Aromático Fenilalanina Triptofano Tirosina Hidrófobo Leucina Isoleucina Valina Polar Glutamina Asparagina Básico Arginina Lisina Histidina Acidico Ácido aspártico Ácido glutâmico Pequeno Alanina Serina Treonina Metionina Glicina 38

Obviamente, o número de substituições de aminoácidos que um especialista na matéria pode fazer depende de muitos factores, incluindo os descritos acima. Em termos gerais, o número de substituições de aminoácidos para um determinado polipéptido Pgi não será superior a 50, 40, 30, 20, 10, 5 ou 3.

Os aminoácidos na proteína Pgi ilustrada pela presente invenção que são essenciais para a função podem ser identificados por métodos conhecidos na matéria, tais como mutagénese dirigida para o local, ou mutagénese de varrimento de alanina (Cunningham e Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). O último processo introduz mutações de alanina individuais, em cada resíduo na molécula. As moléculas mutantes resultantes são então testadas quanto a actividade de fosfoglucose isomerase.

Os polipéptidos ilustrados pela presente invenção são, de um modo preferido, proporcionados numa forma isolada e, de um modo preferido, são substancialmente purificados. Por "polipéptido isolado" entenda-se um polipéptido removido do seu meio ambiente nativo. Assim, um polipéptido produzido e/ou contido numa célula hospedeira recombinante é considerado isolado para os fins da presente invenção. Também estão incluídos no termo "polipéptido isolado" os polipéptidos que foram purificados, parcial ou substancialmente, a partir de uma célula hospedeira recombinante. Por exemplo, uma versão do polipéptido Pgi produzida de forma recombinante pode ser substancialmente purificada pelo método de um passo descrito em Smith e Johnson, Gene 67:31-40 (1988) .

Os polipéptidos ilustrados pela presente invenção incluem o polipéptido Pgi codificado pelo ADN depositado e polipéptidos que são pelo menos 95% idênticos, de um modo ainda mais 39 preferido pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas aos polipéptidos codificados pelo clone depositado, ao polipéptido da Figura 1 (SEQ ID N°.:2) e também incluem porções destes polipéptidos com pelo menos 30 aminoácidos e, de um modo mais preferido, pelo menos 50 aminoácidos.

Por polipéptido com uma sequência de aminoácidos pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência de aminoácidos de referência de um polipéptido Pgi, entenda-se que a sequência de aminoácidos do polipéptido é idêntica à sequência de referência, excepto que a sequência de polipéptido pode incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos dos aminoácidos de referência do polipéptido Pgi. Por outras palavras, para obter para se obter um polipéptido com uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos de referência, até 5% dos resíduos de aminoácido na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos por outro aminoácido, ou um número de aminoácidos de até 5% dos resíduos de aminoácido totais na sequência de referência pode ser inserido na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições de terminal amino ou carboxilo da sequência de aminoácidos de referência ou algures entre essas posições terminais, espalhadas quer individualmente entre os resíduos na sequência de referência, ou num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

Em termos práticos, o facto de um polipéptido particular ser pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a, por exemplo, a sequência de aminoácidos apresentada nas Figuras 1 (SEQ ID N°.:2) ou à sequência de aminoácidos codificada pelos clones depositados, pode ser determinado convencionalmente utilizando programas de computador conhecidos, tais como o programa Bestfit 40 (Wisconsin Sequence Analysis Package, versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . Quando se utiliza o Bestfit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, os parâmetros são ajustados, obviamente, de modo que a percentagem de identidade seja calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência e são permitidos intervalos na homologia de até 5% do número total de residuos de aminoácido na sequência de referência. 0 polipéptido ilustrado pela presente invenção pode ser utilizado como marcador de peso molecular em geles de SDS-PAGE ou em colunas de filtração em gel com crivo molecular, utilizando métodos bem conhecidos dos especialistas na matéria.

Mutantes de eliminação de terminal-N e terminal-C

Numa forma de realização, a presente invenção ilustra polipéptidos com um ou mais residuos eliminados do terminal amino da sequência de aminoácidos do polipéptido Pgi apresentado na Figura 1, ou codificado pelo ADN do clone depositado. Em particular, as eliminações do terminal N do polipéptido Pgi podem ser descritas pela fórmula geral m a 540, em que m é qualquer inteiro de 2 a 539 correspondendo à posição do resíduo de aminoácido identificado na SEQ ID N°.:2 e, opcionalmente, corresponde a um dos resíduos de aminoácido do terminal N, identificados nas eliminações de terminal-N aqui especificadas. 41 A invenção ilustra eliminações de terminal-C dos polipéptidos Pgi da invenção, descritos pela fórmula geral 1 a n, em que n é qualquer inteiro de 2 a 539 correspondendo à posição do residuo de aminoácido identificado na SEQ ID N°.:2 e opcionalmente corresponde a um residuo identificado numa das eliminações de terminal-C aqui especificadas. Os polinucleótidos que codificam para estes polipéptidos também são abrangidos pela invenção. A invenção ilustra fragmentos de polipéptido compreendendo ou, alternativamente, consistindo em residuos de aminoácido descritos pela fórmula geral m a n, em que m e n correspondem a qualquer dos residuos de aminoácido acima especificados por estes símbolos, respectivamente.

Os exemplos seguintes são ilustrativos apenas e não pretendem limitar o âmbito da invenção, tal como definido pelas reivindicações aneAS.

Exemplos

Exemplo 1: Isolamento e purificação de ADN 0 ADN foi isolado de culturas de células NRRL B-11474. As células NRRL B-11474 foram recolhidas de meio CM (Tabela B) e suspensas em 1,0 mL de TE pH 8 (Tris*Cl a 10 mM, EDTA a 1 mM) . Adicionaram-se 40 microgramas de ARNase A e 10 miligramas de lisozima por mililitro de suspensão e a suspensão foi incubada a 37 °C durante 30 minutos. A suspensão foi acertada para 1,0% em dodecilsulfato de sódio (SDS) e adicionou-se proteinase K a 0,1 mg/L e as células foram lisadas por incubação a 37 °C, durante 42 10 minutos. Os ácidos nucleicos foram purificados por três extracções com fenol saturado com TE (pH 7), seguido de precipitação com etanol. Os precipitados de ácido nucleico foram lavados duas vezes com etanol a 80% e redissolvidos em TE pH 8. As concentrações de ADN foram quantificadas espectrofotometricamente a 260 nm. A pureza das preparações de ADN foi determinada espectrofotometricamente (razões A260/A280 e A260/A230) e por electroforese em gel de agarose (agarose a 0,8% em 1 x TAE). A sequenciação de ADN genómico foi realizada, como é conhecido pelo especialista na matéria, criando bibliotecas de plasmideos e cosmideos utilizando pGEM3 e Loristô, respectivamente. O gene de pgi de C. glutamicum foi identificado por homologia com glucose-6-fosfato isomerase de Mycobacterium tuberculosis (número de acesso da Swiss Prot P77895, Swiss Prot ID G6PI MYCTU).

Exemplo 2 - Aumento da disponibilidade de NADPH por ruptura de pgi

Obteve-se um aumento no fluxo de carbono através do ramo oxidativo da via das pentoses-f osf ato por ruptura do gene pgi que codifica para 6-fosfoglucose isomerase. Construiram-se dois iniciadores de PCR a partir da sequência de ADN genómica descrita acima, para facilitar a amplificação de uma região interna de 680 pb do gene pgi de C. glutamicum. Estes iniciadores eram: pgif* (SEQ ID N°.:3) 5' gctgatgtccacgaagctttgggac 3' 43 pgir* (SEQ ID N°.:4) 3' gctgagaaccttggaataaggtagg 3'

Os iniciadores pgif* e pgir* contêm a sequência de reconhecimento para a enzima de restrição Hind III. No caso de pgir*, era necessário fazer três alterações a partir da sequência de nucleótidos de C. glutamicum para incorporar a sequência de reconhecimento de Hind III. Estes sitios de restrição de Hind III facilitaram a subclonagem.

As condições de amplificação por PCR foram utilizadas como se segue. 0 volume final de cada reacção de PCR era de 100 pL. Utilizaram-se 100 ng de cada iniciador juntamente com 50 ng de ADN genómico de C. glutamicum ATCC 21799 de peso molecular elevado e 2,5 unidades de polimerase de ADN Taq. Incluiu-se tampão de reacção a uma concentração recomendada pelo fabricante (Stratagene) e também se incluíram dNTPs a uma concentração final de 200 μΜ. Os parâmetros de ciclização eram como se segue: 94 °C durante 1 minuto, seguido de 94 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 1 minuto (30 ciclos) , 72 °C durante 7 minutos, seguido de refrigeração.

Aquando da restrição com HindIII, o produto de PCR foi reduzido em tamanho para aproximadamente 660 pb. Este fragmento foi então subclonado no vector suicida pBGS131. O subclone resultante foi designado por pDPTpgi2.

Após electrotransformação em células de C. glutamicum (NRRL B11474) competentes, os integrantes foram seleccionados em placas de agar CM (Tabela B) contendo canamicina a uma concentração final de 10 pg/mL. O teste de enzima confirmou a ausência de actividade de fosfoglucose isomerase nas estirpes 44 mutantes, indicando que o gene pgi nestas estirpes tinha sido rompido.

Experiências em frascos com agitação indicaram que os mutantes de pgi de C. glutamicum (NRRL B 11474) têm titulos e rendimentos de lisina melhorados, em comparação com C. glutamicum (NRRL B11474) (Tabela A).

Tabela A. Produção de lisina em meio FM3 (Tabela C)

Estirpe Crescimento Titulo Rendimento NRRL B11474 46 25 42 NRRL B11474: :pgi2A 40 31 52 Crescimento = densidade óptica a 660 nm

Titulo = gramas de lisina/litro de meio

Rendimento = (gramas de lisina/gramas de glucose consumida)*100

Tabela B: Meio CM Volume: 1000 mL % Agar: Sacarose 50 g KH2 P04 0,5 g K2 HP04 1,5 g Ureia 3 g MgS04 * 7H20 0,5 g Polipeptona 20 g Extracto de carne 5 g Biotina 12,5 mL (60mg/L) Tiamina 2 5 mL (12 Omg/L) Niacinamida 25 mL (5g/L) L-Metionina 0,5 g L-Treonina 0,25 g 45 0,5 g 1000 mL com água Dl L-Alanina

Perfazer até ao volume pH - cerca de 7,1

Tabela C: meio FM3

Por litro (NH4)2S04 50g kh2 po4 lg MgS04*7H20 0,4g MnS04*H20 0, Olg FeS04*7H20 0, Olg Biotina 0,03mg Licor de milho macerado 4% concentração final de sólidos secos Glucose 6% concentração final CaC03 50g

Exemplo 3 - rompimento do gene que codifica para 6-fosfofrutocinase (pfkA) O gene que codifica para 6-fosfofrutocinase (pfkA) foi rompido num método semelhante ao descrito para o gene pgi no Exemplo 2. O rompimento do gene pfkA foi verificado por teste de enzima de extractos dos mutantes e mostrou que a actividade de 6-fosfofrutocinase estava ausente. Inesperadamente, os mutantes de pfkA de C. glutamicum (NRRL B-11474) não conseguiram utilizar glucose. 46

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> 0'Donohue, Michael R. Hanke, Paul D. <120> Métodos para produzir L-aminoácidos <130> 1533.101PC02 <140> <141> <150> US 60/150017 <151> 1999-08-20 <150> US 60/145217 <151> 1999-07-23 <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 1623 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (1620 <4 0 0> 1 47 atg gcg gac att tcg acc acc cag gct tgg caa gac ctg acc gat cat 48 Met 1 Ala Asp Ile Ser 5 Thr Thr Gin Ala Trp 10 Gin Asp Leu Thr Asp 15 His tac tca aac ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa 96 Tyr Ser Asn Phe 20 Gin Ala Thr Thr Leu 25 Arg Glu Leu Phe Lys 30 Glu Glu aac cgc gcc gag aag tac acc ttc tcc gcg gct ggc ctc cac gtc gac 144 Asn Arg Ala 35 Glu Lys Tyr Thr Phe 40 Ser Ala Ala Gly Leu 45 His Vai Asp ctg tcg aag aat ctg ctt gac gac gcc acc ctc acc aag ctc ctt gca 192 Leu Ser 50 Lys Asn Leu Leu Asp 55 Asp Ala Thr Leu Thr 60 Lys Leu Leu Ala ctg acc gaa gaa tct ggc ctt cgc gaa cgc att gac gcg atg ttt gcc 240 Leu 65 Thr Glu Glu Ser Gly 70 Leu Arg Glu Arg Ile 75 Asp Ala Met Phe Ala 80 ggt gaa cac ctc aac aac acc gaa gac cgc gct gtc ctc cac acc gcg 288 Gly Glu His Leu Asn 85 Asn Thr Glu Asp Arg 90 Ala Vai Leu His Thr 95 Ala ctg cgc ctt cct ccc gaa gct gat ctg tca gta gat ggc caa gat gtt 336 Leu Arg Leu Pro 100 Pro Glu Ala Asp Leu 105 Ser Vai Asp Gly Gin 110 Asp Vai gct gct gat gtc cac gaa gtt ttg gga cgc atg cgt gac ttc gct act 384 48

Ala Ala Asp 115 Val His Glu Val Leu 120 Gly Arg Met Arg Asp 125 Phe Ala Thr gcg ctg ege tea ggc aac tgg ttg gga cac acc ggc cac acg ate aag 432 Ala Leu 130 Arg Ser Gly Asn Trp 135 Leu Gly His Thr Gly 140 His Thr Ile Lys aag ate gtc aac att ggt ate ggt ggc tet gac ctc gga cca gee atg 480 Lys 145 Ile Val Asn Ile Gly 150 Ile Gly Gly Ser Asp 155 Leu Gly Pro Ala Met 160 gct acg aag gct ctg cgt gea tac gcg acc gct ggt ate tea gea gaa 528 Ala Thr Lys Ala Leu 165 Arg Ala Tyr Ala Thr 170 Ala Gly Ile Ser Ala 175 Glu ttc gtc tcc aac gtc gac cca gea gac ctc gtt tet gtg ttg gaa gac 576 Phe Vai Ser Asn 180 Val Asp Pro Ala Asp Leu 185 Val Ser Val Leu 190 Glu Asp ctc gat gea gaa tcc aca ttg ttc gtg ate gct teg aaa act ttt acc 624 Leu Asp Ala 195 Glu Ser Thr Leu Phe 200 Val Ile Ala Ser Lys 205 Thr Phe Thr acc cag gag acg ctg tet aac gct cgt gea gct cgt gct tgg ctg gta 672 Thr Gin 210 Glu Thr Leu Ser Asn 215 Ala Arg Ala Ala Arg 220 Ala Trp Leu Val gag aag ctc ggt gaa gag gct gtc gcg aag cat ttc gtc gea gtg tcc 720 Glu 225 Lys Leu Gly Glu Glu 230 Ala Val Ala Lys His 235 Phe Val Ala Val Ser 240 acc aat gct gaa aag gtc gea gag ttc ggt ate gac acg gac aac atg 768 Thr Asn Ala Glu Lys 245 Val Ala Glu Phe Gly 250 Ile Asp Thr Asp Asn 255 Met ttc ggc ttc tgg gac tgg gtc gga ggt cgt tac tcc gtg gac tcc gea 816 Phe Gly Phe Trp 260 Asp Trp Val Gly Gly Arg 265 Tyr Ser Val Asp 270 Ser Ala gtt ggt ctt tcc ctc atg gea gtg ate ggc cct ege gac ttc atg cgt 864 Vai Gly Leu 275 Ser Leu Met Ala Val 280 Ile Gly Pro Arg Asp 285 Phe Met Arg ttc ctc ggt gga ttc cac gcg atg gat gaa cac ttc ege acc acc aag 912 Phe Leu 290 Gly Gly Phe His Ala 295 Met Asp Glu His Phe 300 Arg Thr Thr Lys ttc gaa gag aac gtt cca ate ttg atg gct ctg ctc ggt gtc tgg tac 960 Phe 305 Glu Glu Asn Val Pro 310 Ile Leu Met Ala Leu 315 Leu Gly Val Trp Tyr 320 tcc gat ttc tat ggt gea gaa acc cac gct gtc cta cct tat tcc gag 1008 Ser Asp Phe Tyr Gly 325 Ala Glu Thr His Ala 330 Val Leu Pro Tyr Ser 335 Glu gat ctc age cgt ttt gct gct tac ctc cag cag ctg acc atg gaa tea 1056 Asp Leu Ser Arg 340 Phe Ala Ala Tyr Leu Gin 345 Gin Leu Thr Met 350 Glu Ser aac ggc aag tea gtc cac ege gac ggc tcc cct gtt tcc act ggc act 1104 Asn Gly Lys 355 Ser Val His Arg Asp 360 Gly Ser Pro Val Ser 365 Thr Gly Thr 49 ggc gaa att tac tgg ggt gag cct ggc aca aat ggc cag cac gct ttc 1152 Gly Glu Ile Tyr Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gin His Ala Phe 370 375 380 ttc cag ctg ate cac cag ggc act ege ctt gtt cca gct gat ttc att 1200 Phe Gin Leu Ile His Gin Gly Thr Arg Leu Vai Pro Ala Asp Phe Ile 385 390 395 400 ggt ttc gct cgt cca aag cag gat ctt cct gee ggt gag ege acc atg 1248 Gly Phe Ala Arg Pro Lys Gin Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met 405 410 415 cat gac ctt ttg atg age aac ttc ttc gea cag acc aag gtt ttg gct 1296 His Asp Leu Leu Met Ser Asn Phe Phe Ala Gin Thr Lys Vai Leu Ala 420 425 430 ttc ggt aag aac gct gaa gag ate gct gcg gaa ggt gtc gea cct gag 1344 Phe Gly Lys Asn Ala Glu Glu Ile Ala Ala Glu Gly Vai Ala Pro Glu 435 440 445 ctg gtc aac cac aag gtc atg cca ggt aat ege cca acc acc acc att 1392 Leu Vai Asn His Lys Vai Met Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile 450 455 460 ttg gcg gag gaa ctt acc cct tet att ctc ggt gcg ttg ate gct ttg 1440 Leu Ala Glu Glu Leu Thr Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu 465 470 475 480 tac gaa cac ate gtg atg gtt cag ggc gtg att tgg gac ate aac tcc 1488 Tyr Glu His Ile Vai Met Vai Gin Gly Vai Ile Trp Asp Ile Asn Ser 485 4 90 4 95 ttc gac caa tgg ggt gtt gaa ctg ggc aaa cag cag gea aat gac ctc 1536 Phe Asp Gin Trp Gly Vai Glu Leu Gly Lys Gin Gin Ala Asn Asp Leu 500 505 510 gct ccg gct gtc tet ggt gaa gag gat gtt gac teg gga gat tet tcc 1584 Ala Pro Ala Vai Ser Gly Glu Glu Asp Vai Asp Ser Gly Asp Ser Ser 515 520 525 act gat tca ctg att aag tgg tac ege gea aat agg tag 1623 Thr Asp Ser Leu Ile Lys Trp Tyr Arg Ala Asn Arg 530 535 540

<210> 2 <211> 540 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 50

Met 1 Ala Asp Ile Ser 5 Thr Thr Gin Ala Trp 10 Gin Asp Leu Thr Asp 15 His Tyr Ser Asn Phe 20 Gin Ala Thr Thr Leu 25 Arg Glu Leu Phe Lys 30 Glu Glu Asn Arg Ala 35 Glu Lys Tyr Thr Phe 40 Ser Ala Ala Gly Leu 45 His Vai Asp Leu Ser 50 Lys Asn Leu Leu Asp Asp 55 Ala Thr Leu Thr 60 Lys Leu Leu Ala 51

Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala 75 80 Asp Arg Ala Vai Leu His Thr Ala 90 95 Leu Ser Vai Asp Gly Gin Asp Vai 105 110 Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr 125 Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys 140 Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met 155 160 Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu 170 175 Asp Leu Vai Ser Vai Leu Glu Asp 185 190 Vai Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr 205 Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu vai 220 Ala Lys His Phe Vai Ala Vai Ser 235 240 Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met 250 255 Gly Arg Tyr Ser Vai Asp Ser Ala 265 270 Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg 285 Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys 300 Met Ala Leu Leu Gly Vai Trp Tyr 315 320 His Ala Vai Leu Pro Tyr Ser Glu 330 335 Leu Gin Gin Leu Thr Met Glu Ser 345 350 Gly Ser Pro Vai Ser Thr Gly Thr 365 Gly Thr Asn Gly Gin His Ala Phe 380 Arg Leu Vai Pro Ala Asp Phe Ile 395 400

Leu Thr Glu Glu Ser Gly Leu Arg 65 70

Gly Glu His Leu Asn Asn Thr Glu 85

Leu Arg Leu Pro Pro Glu Ala Asp 100

Ala Ala Asp Vai His Glu Vai Leu 115 120

Ala Leu Arg Ser Gly Asn Trp Leu 130 135

Lys Ile Vai Asn Ile Gly Ile Gly 145 150

Ala Thr Lys Ala Leu Arg Ala Tyr 165

Phe Vai Ser Asn Vai Asp Pro Ala 180

Leu Asp Ala Glu Ser Thr Leu Phe 195 200

Thr Gin Glu Thr Leu Ser Asn Ala 210 215

Glu Lys Leu Gly Glu Glu Ala Vai 225 230

Thr Asn Ala Glu Lys Vai Ala Glu 245

Phe Gly Phe Trp Asp Trp Vai Gly 260

Vai Gly Leu Ser Leu Met Ala Vai 275 280

Phe Leu Gly Gly Phe His Ala Met 290 295

Phe Glu Glu Asn Vai Pro Ile Leu 305 310

Ser Asp Phe Tyr Gly Ala Glu Thr 325

Asp Leu Ser Arg Phe Ala Ala Tyr 34 0

Asn Gly Lys Ser Vai His Arg Asp 355 360

Gly Glu Ile Tyr Trp Gly Glu Pro 370 375

Phe Gin Leu Ile His Gin Gly Thr 385 390 52

Gly Phe Ala Arg Pro 405 Lys Gin Asp Leu Pro 410 Ala Gly Glu Arg Thr 415 Met His Asp Leu Leu 420 Met Ser Asn Phe Phe Ala 425 Gin Thr Lys Vai 430 Leu Ala Phe Gly Lys 435 Asn Ala Glu Glu Ile 440 Ala Ala Glu Gly Vai 445 Ala Pro Glu Leu Vai 450 Asn His Lys Vai Met 455 Pro Gly Asn Arg Pro Thr 460 Thr Thr Ile Leu 465 Ala Glu Glu Leu Thr 470 Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu 475 Ile Ala Leu 480 Tyr Glu His Ile Vai 485 Met Vai Gin Gly Vai 490 Ile Trp Asp Ile Asn 495 Ser Phe Asp Gin Trp 500 Gly Vai Glu Leu Gly Lys 505 Gin Gin Ala Asn 510 Asp Leu Ala Pro Ala 515 Vai Ser Gly Glu Glu 520 Asp Vai Asp Ser Gly 525 Asp Ser Ser Thr Asp 530 Ser Leu Ile Lys Trp 535 Tyr Arg Ala Asn Arg 540

<210> 3 <211> 25 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 gctgatgtcc acgaagcttt gggac 25

<210> 4 <211> 25 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum 53 <4Ο0> 4 gctgagaacc ttggaataag gtagg 25

Lisboa, 8 de Novembro de 2006 54

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para produzir L-aminoácidos seleccionados do grupo consistindo de L-lisina, L-treonina e L-isoleucina, compreendendo: cultivar uma célula de Corynebacterium glutamicum alterada com um fluxo de carbono aumentado através do ramo oxidativo da via das pentoses-fosfato e tendo actividade de 6-fosfoglucose isomerase ("pgi") reduzida, em comparação com uma célula de Corynebacterium glutamicum não alterada, em que os rendimentos de L-aminoácido da referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada são maiores que os rendimentos de uma célula de Corynebacterium glutamicum não alterada, em que a referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada tem um gene 6 "pgi" mutante.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que a referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada tem uma quantidade aumentada de NADPH em comparação com uma célula de Corynebacterium glutamicum não alterada.
3. 3. Método da reivindicação 2, em que a referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada tem uma quantidade aumentada de uma ou mais enzimas seleccionadas do grupo compreendendo glucose-6-fosfato desidrogenase, lactonase e 6-fosfogluconato desidrogenase. 1
4. 4. Método da reivindicação 1, em que a referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada tem um fluxo de carbono diminuído através da via glicolitica.
5. 5. Método da reivindicação 1, em que os referidos rendimentos em L-aminoácido da referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada são de 1% a 100% mais elevados do que os da referida célula de Corynebacterium glutamicum não alterada.
6. 6. Método da reivindicação 1, em que a referida célula de Corynebacterium glutamicum alterada é produzida por (a) subclonagem de uma região interna de um gene pgi; e (b) inserção do referido vector resultante do passo (a) num genoma de Corynebacterium glutamicum, por recombinação homóloga.
7. 7. Método da reivindicação 1, em que o referido L-aminoácido compreende L-lisina.
8. 8. Vector obtido por subclonagem de uma região interna de um gene pgi seleccionado de replicões baseados em Col EI com um marcador seleccionável e pBGS131, i. e. o vector com o N°. de depósito da ATCC 37443.
9. 9. Método para produzir uma célula de Corynebacterium glutamicum com um gene de 6-fosfoglucose isomerase ("pgi") mutado, compreendendo: (a) subclonar uma região interna do gene pgi num vector suicida; e 2 (b) inserir o referido vector resultante do passo (a) num genoma bacteriano, sendo produzida uma célula bacteriana com um gene pgi alterado em que uma mutação do gene pgi homólogo é causada pelo vector suicida de (a).
10. 10. Método da reivindicação 9, em que o referido vector suicida é seleccionado do grupo compreendendo pBGS131, i. e., o vector com o N°. de depósito 37443 na ATCC e replicões baseados em Col EI com marcador seleccionável.
11. 11. Célula de Corynebacterium glutamicum alterada compreendendo o vector da reivindicação 8, em que a célula bacteriana alterada não possui actividade de 6-fosfoglucose isomerase detectável.
12. 12. Método para produzir L-aminoácidos compreendendo: cultivar uma célula bacteriana alterada que não possui actividade de 6-fosfoglucose isomerase ("pgi") detectável, em que os rendimentos de L-aminoácido da referida célula bacteriana alterada são superiores aos rendimentos de uma célula bacteriana não alterada, em que a referida célula bacteriana alterada tem um gene pgi mutante.
13. 13. Método da reivindicação 12, em que os rendimentos em L-aminoácido da referida célula bacteriana alterada são de cerca de 1% a 100% mais elevados do que os da referida célula bacteriana não alterada.
14. 14. Método da reivindicação 12, em que a referida célula bacteriana alterada é produzida por 3 (a) subclonagem de uma região interna de um gene pgi; e (b) inserção do referido vector resultante do passo (a) num genoma bacteriano, por recombinaçao homóloga.
15. 15. Método da reivindicação 12, em que a referida célula bacteriana é uma célula de Corynebacterium glutamicum.
16. 16. Método da reivindicação 12, em que o referido L-aminoácido é seleccionado do grupo constituido por L-lisina, L-treonina e L-isoleucina. Lisboa, 8 de Novembro de 2006 4