BR112019014131B1

BR112019014131B1 - Variante de sintetase de adenil succinato, polinucleotídeo, vetor, microorganismo do gênero corynebacterium e método para preparar nucleotídeos de purina

Info

Publication number: BR112019014131B1
Application number: BR112019014131-6A
Authority: BR
Inventors: Min Ji Baek; Ji Hye Lee; So-Jung Park; Jee Yeon Bae
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2018-08-23
Publication date: 2022-04-26
Also published as: KR101950141B1; TWI734995B; EP3831938A1; BR112019014131A2; JP6805353B2; US20200392478A1; MY194798A; CN111212904A; ZA201904757B; US11236321B2; US20220098569A1; AU2018402495A1; RU2770464C1; US11697810B2; TW202012428A; CN111212904B; SG11201906527WA; JP2020535787A; EP3831938A4; WO2020027362A1

Abstract

A presente revelação se refere a uma variante de sintetase de adenil succinato, um microorganismo que contém o mesmo e um método para preparar nucleotídeos de purina com uso do microorganismo.

Description

[CAMPO DA TÉCNICA]

[001] A presente revelação refere-se a uma nova sintetase de adenil succinato, um microorganismo que contém o mesmo e um método para preparar nucleotídeos de purina com o uso do microorganismo.

[ANTECEDENTES DA TÉCNICA]

[002] O monofosfato de 5'-inosina (daqui em diante, IMP), um material com base em ácido nucleico, é um intermediário do sistema metabólico biossintético de ácido nucleico usado em vários campos (por exemplo, medicamentos, várias aplicações médicas, etc.) e um material amplamente usado como um aditivo de tempero alimentar ou alimento juntamente com monofosfato de 5'-guanina (doravante, GMP). É conhecido que o próprio IMP produz um sabor de carne e aumenta o sabor do ácido glutâmico monossódico (MSG) como o GMP, atraindo assim a atenção do público como tempero à base de ácido nucleico com base no sabor.

[003] Métodos de preparação de IMP podem incluir um método de degradar enzimaticamente o ácido ribonucleico extraído de células de levedura, um método de fosforilação química de inosina produzida por fermentação (Agri. Biol. Chem., 36, 1511 (1972), etc.), um método para cultivar um microrganismo que produz diretamente IMP e para recuperar IMP do meio cultivado, etc. Entre esses métodos, o método mais amplamente usado é aquele de uso de um microrganismo com capacidade para produzir diretamente o IMP.

[004] Adicionalmente, o método de preparação de GMP pode incluir um método de conversão de monofosfato de xantosina 5' (doravante, XMP) produzido por fermentação microbiana em GMP com uso de um microrganismo corniforme e um método de conversão de XMP produzido por fermentação microbiana em GMP com uso de Escherichia coli. Nos métodos acima, quando o GMP é produzido por um método em que o XMP é produzido primeiro e depois convertido em GMP, a produtividade do XMP (isto é, um precursor da reação de conversão durante a fermentação microbiana) precisa ser aumentada, e adicionalmente, tanto o XMP produzido e o GMP já produzido durante todo o processo da reação de conversão devem ser protegidos de serem perdidos.

[005] Entretanto, visto que as enzimas na natureza nem sempre exibem propriedades ótimas em termos de atividade, estabilidade, especificidade do substrato para isômeros ópticos, etc. em aplicações industriais, várias tentativas foram feitas para melhorar enzimas para alcançar o uso desejado pela variação de suas sequências de aminoácidos. Entre esses, o projeto racional e a mutagênese sítio- dirigida de enzimas foram aplicados para melhorar as funções das enzimas em alguns casos; no entanto, esses métodos têm desvantagens em que as informações sobre a estrutura da enzima alvo não é suficiente ou a correlação entre estrutura e função não é clara e, portanto, não podem ser efetivamente aplicadas. Nesse caso, foi relatado que a atividade de uma enzima pode ser aumentada melhorando-se a enzima através de um método de evolução dirigida, em que as enzimas das características desejadas são pesquisadas a partir de uma biblioteca mutante de enzimas construídas através de variações aleatórias de genes enzimáticos. Os inventores da presente revelação efetuaram extensas pesquisas para a produção de elevado rendimento de nucleotídeos de purina através de um método para produzir nucleotídeos de purina que contêm IMP ou XMP através da fermentação microbiana. Como resultado, revelaram variantes de proteína com maior produtividade de nucleotídeos de purina, completando assim a presente revelação.

[REVELAÇÃO] [PROBLEMA TÉCNICO]

[006] Um objetivo da presente revelação é proporcionar uma variante de sintetase de adenil succinato.

[007] Outro objetivo da presente revelação é proporcionar um polinucleotídeo que codifica a variante de sintetase de adenil succinato.

[008] Ainda outro objeto da presente revelação é fornecer um vetor que contém o polinucleotídeo.

[009] Ainda outro objetivo da presente revelação é proporcionar um microrganismo com capacidade para produzir nucleotídeos de purina, que contém a variante de sintetase de adenil succinato e o vetor.

[010] Ainda outro objetivo da presente revelação é proporcionar um método para preparar nucleotídeos de purina, o qual inclui cultivar o microrganismo do gênero Corynebacterium em um meio; e recuperar os nucleotídeos de purina do microorganismo ou do meio.

[SOLUÇÃO TÉCNICA]

[011] Mais adiante neste documento, modalidades exemplificativas da presente revelação serão descritas em detalhes. Entretanto, cada uma das explicações e modalidades exemplificativas reveladas no presente documento pode ser aplicada a outras explicações e modalidades exemplificativas. Ou seja, todas as combinações de vários fatores revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela revelação específica fornecida abaixo.

[012] Para alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação proporciona uma variante de sintetase de adenil succinato na qual o 85° aminoácido do N-terminal da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituído por um aminoácido diferente. A sintetase de adenil succinato modificada tem uma modificação no aminoácido na 85° posição a partir do N-terminal da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Especificamente, a presente revelação proporciona uma variante de sintetase de adenil succinato que tem pelo menos uma variação de aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que a modificação inclui uma substituição da 85° posição do N-terminal por um aminoácido diferente.

[013] Conforme usado aqui, o termo "sintetase de adenil succinato" se refere- a uma enzima que desempenha um papel importante na biossíntese de purinas. Para o propósito da presente revelação, a enzima se refere a uma proteína envolvida na produção de nucleotídeos de purina que inclui monofosfato de 5'-inosina (IMP) ou monofosfato de 5'-xantosina (XMP).

[014] Na presente revelação, SEQ ID NO: 2 se refere a uma sequência de aminoácidos que tem a atividade de sintetase de adenil succinato. Especificamente, SEQ ID NO: 2 é uma sequência de proteínas que tem a atividade de sintetase de adenil succinato codificada pelo gene purA. A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 pode ser obtido no NCBI GenBank, que é um banco de dados conhecido. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 pode ser derivado de um microorganismo do gênero Corynebacterium, mas não está limitado a este, e pode incluir qualquer sequência que tenha a mesma atividade que a sequência de aminoácidos acima sem limitação. Adicionalmente, o escopo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 que tem a atividade de sintetase de adenil succinato ou uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais de homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, mas não se limita a isso. Especificamente, a sequência de aminoácidos acima pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e/ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. A sequência de aminoácidos que tem homologia ou identidade pode ser aquelas na faixa acima, que exclui uma sequência com 100% de identidade ou pode ser uma sequência com menos de 100% de identidade. Adicionalmente, é evidente que qualquer proteína que tem uma sequência de aminoácidos que tem deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência pode também ser usada na presente revelação desde que tenha a homologia ou identidade e exiba eficácia correspondente a essa da proteína acima.

[015] Na presente revelação, o termo “variante de sintetase de adenil succinato” pode ser usado indistintamente com uma variante de polipeptídeo que tem uma produtividade de nucleotídeo de purina, um polipeptídeo de purina que produz polipeptídeo variante, uma variante de polipeptídeo que produz nucleotídeos de purina, uma variante de polipeptídeo que tem a atividade de sintetase de adenil succinato, uma variante de sintetase de adenil succinato etc. Adicionalmente, a proteína pode ser derivada do gênero Corynebacterium stationis, mas a proteína não está limitada a mesma.

[016] A variante de sintetase de adenil succinato inclui uma modificação do aminoácido na 85°posição a partir do N-terminal na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. A variante de sintetase de adenil succinato é aquela em que o 85° aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituído por um aminoácido diferente. A variante de sintetase de adenil succinato pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou pode ser uma variante de sintetase de adenil succinato com atividade mais fraca em comparação com uma sintetase de adenil succinato não variante derivada de um microrganismo do tipo selvagem. Tal variante de sintetase de adenil succinato indica a modificação do 85° aminoácido do N-terminal na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, conforme explicado acima.

[017] Especificamente, a variante de sintetase de adenil succinato é aquela em que o 85° aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituído por serina, alanina, valina, leucina, metionina, isoleucina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, tirosina, lisina, ácido aspártico ou ácido glutâmico, e a variante de sintetase de adenil succinato pode ter uma atividade mais fraca de sintetase de adenil succinato em comparação com aquela de um polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, mas a variante de sintetase de adenil succinato não se limita a mesma.

[018] Para o objetivo da presente revelação, quando um microrganismo inclui a variante de sintetase de adenil succinato, a quantidade de produção de nucleotídeos de purina que inclui IMP ou XMP é aumentada. Isso é significativo na medida em que a presente revelação permite o aumento da quantidade de produção de IMP ou XMP através da variante de sintetase de adenil succinato da presente revelação enquanto que a cepa de Corynebacterium do tipo selvagem não pode produzir IMP ou XMP, ou pode produzir apenas uma quantidade muito pequena se IMP ou XMP for produzido.

[019] A variante de sintetase de adenil succinato pode incluir uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo de sequências de aminoácidos em que o 85° aminoácido a partir do N-terminal na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2 é substituído com um aminoácido selecionado do grupo que consiste em serina, alanina, valina, leucina, metionina, isoleucina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, tirosina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Especificamente, a variante de sintetase de adenil succinato pode ser constituída por um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos, que é selecionada do grupo de sequências de aminoácidos em que o 85° aminoácido do N-terminal na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituído com um aminoácido selecionado do grupo que consiste em serina, alanina, valina, leucina, metionina, isoleucina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, tirosina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Adicionalmente, a variante de sintetase de adenil succinato pode incluir uma sequência de aminoácidos em que o 85° aminoácido do N-terminal na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituído por um aminoácido diferente, que tem a sequência de aminoácidos da variante de sintetase de adenil succinato ou uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais de homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos da variante de sintetase de adenil succinato, mas a sequência de aminoácidos é não limitada a isso. Especificamente, a variante de sintetase de adenil succinato da presente revelação pode incluir um polipeptídeo com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos, em que o 85° aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituído com um aminoácido selecionado do grupo que consiste em serina, alanina, valina, leucina, metionina, isoleucina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, tirosina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Adicionalmente, é evidente que qualquer sequência de aminoácidos que tem a homologia ou identidade da sequência acima e que exibe um efeito correspondente ao da proteína precisa também pertencer ao escopo da presente revelação, mesmo que parte da sequência de aminoácidos possa ter deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência, além do aminoácido na 85° posição.

[020] Ou seja, embora a presente revelação descreva "proteína ou polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO particular", é evidente que uma proteína com uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência também pode ser usado na presente revelação, desde que a proteína tenha atividade idêntica ou correspondente aquela do polipeptídeo compreendido por uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Por exemplo, desde que uma proteína tenha a atividade idêntica ou correspondente à da variante do polipeptídeo, não exclui a adição de sequências, a mutação de ocorrência natural, a mutação silenciosa ou a sua substituição conservativa que não altera as funções da proteína antes de e depois da sequência de aminoácidos. É evidente que uma proteína que tem essa adição de sequência ou mutação também cai no escopo da presente revelação.

[021] A "substituição conservadora" significa a substituição de um aminoácido por outro aminoácido com propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes. Tal substituição de aminoácido pode geralmente ocorrer com base na similaridade na polaridade de resíduos, carga, solubilidade, hidrofobicidade, capacidade hidrofílica e/ou natureza anfipática. Por exemplo, aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácido carregados negativamente (ácidos) incluem ácido glutâmico e ácido aspártico; aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina, triptofano e tirosina; e aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina e triptofano.

[022] Consequentemente, na presente revelação, a "variante" pode ainda incluir substituição conservativa e/ou modificação de pelo menos um aminoácido na "proteína ou polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO particular". Por exemplo, certas variantes podem incluir variantes em que pelo menos uma parte, como uma sequência de iniciação de N-terminal ou domínio transmembranar, é removida. Outras variantes podem incluir variantes em que uma parte é removida do N-terminal e/ou do terminal C de uma proteína madura. A variante pode também incluir outras modificações, incluindo deleção ou adição de aminoácidos, que têm efeitos mínimos nas propriedades e uma estrutura secundária do polipeptídeo. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser conjugado com uma sequência de sinal (ou de iniciação) no N-terminal de uma proteína que direciona de forma co- translacional ou pós-translacional a transferência de uma proteína. O polipeptídeo pode também ser conjugado com outra sequência ou um ligante para facilitar a identificação, purificação ou síntese do polipeptídeo. O termo “variante” pode ser usado de forma intercambiável com modificação, proteína modificada, polipeptídeo modificado, mutante, muteína, divergente, etc., e qualquer termo pode ser usado sem limitação, desde que seja usado no sentido de ser modificado.

[023] Homologia e identidade significam um grau de relação entre duas sequências de aminoácidos dadas ou sequências de nucleotídeos e podem ser expressas como uma porcentagem.

[024] Os termos “homologia” e “identidade” podem frequentemente ser usados de forma intercambiável entre si.

[025] A homologia ou identidade de sequência de um polinucleotídeo ou polipeptídeo conservado pode ser determinada por um algoritmo de alinhamento padrão e as penalidades de intervalo de não cumprimento estabelecidas por um programa a ser usado podem ser usadas em combinação. Substancialmente, sequências homólogas ou idênticas podem hibridar sob condições moderadamente ou altamente restringentes ao longo de toda a sua sequência ou pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% de todo o comprimento. No que diz respeito aos polinucleotídeos a serem hibridados, podem também ser considerados polinucleotídeos que incluem um códon degenerado em vez de um códon.

[026] Se quaisquer duas sequências de polinucleotídeos ou de polipeptídeos têm homologia, semelhante, ou identidade podem ser determinadas, por exemplo, por um algoritmo de computador conhecido, como o programa “FASTA” com uso de parâmetros predefinidos, como em Pearson et al. (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85]: 2444). Alternativamente, podem ser determinados com uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) conforme realizado no programa de Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (versão 5.0.0 ou superior) (que inclui pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.] et al., J Molec Biol 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por exemplo, homologia, similaridade ou identidade podem ser determinadas com uso de BLAST ou ClustalW do National Center for Biotechnology Information.

[027] Homologia, similaridade ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada comparando-se informações de sequência com uso de um programa de computador GAP (por exemplo, Needleman et al. (1970), J Mol Biol 48: 443) conforme revelado em Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Brevemente, o programa GAP define semelhança como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) que são semelhantes, dividido pelo número total de símbolos na menor das duas sequências. Os parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (que contém um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada (ou matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4)) de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353 a 358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo (ou penalidade aberta de intervalo 10, penalidade por extensão de intervalo 0,5); e (3) nenhuma penalidade para intervalos finais. Portanto, o termo "homologia" ou "identidade", conforme usado no presente documento, representa a relevância entre sequências.

[028] Adicionalmente, é evidente que um polinucleotídeo que pode ser traduzido, devido à degenerescência de códons, em uma variante de polipeptídeo compreendida de uma sequência de aminoácidos em que o 85° aminoácido a partir do N-terminal da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituído com um aminoácido diferente, ou uma variante de polipeptídeo que tem homologia ou identidade da mesma também pode ser incluída. Adicionalmente, por hibridização sob condições rigorosas com uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de genes conhecida (por exemplo, uma sequência complementar à totalidade ou parte da sequência de nucleotídeos), qualquer sequência de polinucleotídeos que codifique uma variante de sintetase de adenil succinato que inclui uma sequência de aminoácidos, em que o 85° aminoácido da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituído com um aminoácido selecionado do grupo que consiste em serina, alanina, valina, leucina, metionina, isoleucina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, tirosina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico, pode ser incluído sem limitação.

[029] Outro aspecto da presente revelação se refere a um polinucleotídeo que codifica a variante de sintetase de adenil succinato, ou um vetor que inclui o polinucleotídeo.

[030] Conforme usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo” se refere a uma cadeia de DNA ou RNA com mais de um certo comprimento como um polímero nucleotídico, que é uma cadeia longa de monômeros nucleotídicos ligados por ligações covalentes e, mais especificamente, a um fragmento polinucleotídico que codifica a variante de polipeptídeo.

[031] O polinucleotídeo que codifica a variante de polipeptídeo da presente revelação pode incluir qualquer sequência de polinucleotídeos sem limitação, desde que codifique a variante de polipeptídeo que tem a atividade de sintetase de adenil succinato. Na presente revelação, o gene que codifica a sequência de aminoácidos de sintetase de adenil succinato é o gene purA e, especificamente, o gene pode ser derivado de Corynebacterium stationis, mas não se limita ao mesmo.

[032] Especificamente, devido à degenerescência dos códons ou considerando- se códons preferidos por um microrganismo no qual o polipeptídeo tem capacidade para ser expresso, podem ser feitas várias modificações na região de codificação do polinucleotídeo dentro do escopo que não altera a sequência de aminoácidos do polipeptídeo. Qualquer sequência de polinucleotídeo pode ser incluída sem limitação desde que codifique a variante de sintetase de adenil succinato, em que o 85° aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituído por um aminoácido diferente.

[033] Adicionalmente, por hibridização sob condições rigorosas com uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência genética conhecida (por exemplo, uma sequência complementar à totalidade ou parte da sequência de nucleotídeos), qualquer sequência que codifique uma proteína que tem a atividade de uma variante de sintetase de adenil succinato, o 85° aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituído com um aminoácido diferente, pode ser incluído sem limitação.

[034] As “condições rigorosas” se referem a condições que permitem a hibridização específica entre polinucleotídeos. Tais condições são descritas em detalhes na literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., supra). As condições estringentes podem incluir condições sob as quais genes que têm alta homologia ou identidade (por exemplo, genes com 40% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, ainda mais especificamente 97% ou mais, particularmente especificamente 99% ou mais de homologia ou identidade) podem se hibridizar entre si; condições sob as quais genes que têm baixa homologia ou identidade não podem se hibridizar entre si; ou condições que são condições comuns de lavagem para hibridização Southern (por exemplo, uma concentração de sal e uma temperatura correspondente a 60 °C, 0,1 x SSC, 0,1% de SDS; especificamente 60 °C, 0,1 x SSC, 0,1% de SDS; mais especificamente 68 °C, 0,1 x SSC, 0,1% de SDS, uma vez, especificamente, duas ou três vezes).

[035] A hibridização requer que dois ácidos nucleicos tenham sequências complementares, embora divergências entre bases possam ser possíveis dependendo da severidade de hibridização. O termo "complementar" é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeos que podem se hibridizar entre si. Por exemplo, em relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Consequentemente, a presente revelação pode também incluir fragmentos de ácido nucleico isolados complementares a toda a sequência, bem como a sequências de ácido nucleico substancialmente semelhantes.

[036] Especificamente, um polinucleotídeo que tem homologia ou identidade pode ser detectado com uso de condições de hibridização que incluem uma etapa de hibridização a Tm de 55 °C e utilizando-se as condições acima descritas. Adicionalmente, o valor de Tm pode ser 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não está limitado a isso, e pode ser apropriadamente controlado pelos especialistas na técnica de acordo com o propósito.

[037] A severidade apropriada para polinucleotídeos de hibridização depende do comprimento dos polinucleotídeos e do grau de complementação e as variáveis bem conhecidas na técnica (consulte Sambrook et al., supra, 9,50 a 9,51, 11,7 a 11,8).

[038] Na presente revelação, o gene que codifica a sequência de aminoácidos da variante de sintetase de adenil succinato é o gene purA e o polinucleotídeo que codifica o gene é o mesmo conforme explicado acima.

[039] Na presente revelação, o polinucleotídeo que codifica a variante de sintetase de adenil succinato é também o mesmo conforme explicado acima.

[040] Conforme usado no presente documento, o termo "vetor" se refere a uma construção de DNA que contém a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo alvo que está operacionalmente ligado a uma sequência de controle apropriada de modo que o polipeptídeo alvo é expresso em um hospedeiro apropriado. A sequência de controle pode incluir um promotor para iniciar a transcrição, qualquer sequência operadora para controlar essa transcrição, uma sequência que codifica um sítio de ligação a ribossoma apropriado no mRNA e uma sequência para controlar a terminação da transcrição e tradução. Após a transformação em um hospedeiro apropriado, o vetor pode se replicar ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode se integrar no próprio genoma.

[041] O vetor usado na presente revelação pode não ser particularmente limitado desde que o vetor seja replicável na célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos do vetor comumente usados podem incluir plasmídeos, cosmídeos, vírus e bacteriófagos naturais ou recombinantes. Por exemplo, como vetor de fago ou vetor de cosmídeo, podem ser usados pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc., e como vetor de plasmídeo, aqueles com base em pBR, podem ser usados pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc. Especificamente, podem ser utilizados pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, vetor pCC1BAC, etc.

[042] Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo alvo pode ser inserido no cromossoma através de um vetor para inserção cromossômica. A inserção de polinucleotídeo no cromossoma pode ser realizada com uso de qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, por recombinação homóloga), mas o método não está limitado ao mesmo. Um marcador de seleção para confirmar a inserção do vetor no cromossomo pode ainda ser incluído. O marcador de seleção foi usado para seleção de células transformadas com o vetor (isto é, para confirmação da presença da molécula de ácido nucleico alvo) e marcadores com capacidade para fornecer fenótipos selecionáveis (por exemplo, resistência a drogas, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos e expressão de polipeptídeos de superfície) podem ser usados. Nas circunstâncias em que agentes seletivos são tratados, somente as células com capacidade para expressar os marcadores de seleção podem sobreviver ou expressar outras características fenotípicas, e assim as células transformadas podem ser facilmente selecionadas.

[043] Ainda outro aspecto da presente revelação proporciona um microrganismo que produz nucleotídeos de purina contendo-se a variante sintetase de adenil succinato ou um polinucleotídeo que codifica a variante de sintetase de adenil succinato. Especificamente, o microrganismo que contém a variante de sintetase de adenil succinato e/ou o polinucleotídeo que codifica a variante de sintetase de adenil succinato pode ser um microrganismo preparado por transformação com uso de um vetor que contém o polinucleotídeo, mas o microrganismo não está limitado ao mesmo.

[044] Conforme usado no presente documento, o termo "transformação" se refere a um processo de introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira de modo que a proteína codificada pelo polinucleotídeo possa ser expressa na célula hospedeira. Não importa se o polinucleotídeo transformado é inserido no cromossoma da célula hospedeira e localizado no mesmo ou localizado fora do cromossoma, desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode incluir DNA e RNA que codifica a proteína alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido em qualquer forma, desde que o polinucleotídeo possa ser introduzido na célula hospedeira e aí expresso. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é uma construção de gene que inclui todos os elementos necessários para a sua expressão autônoma. A cassete de expressão pode incluir um promotor, um sinal de terminação de transcrição, um sítio de ligação a ribossoma e um sinal de terminação da translação que pode estar operativamente ligado ao polinucleotídeo. A cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão que realiza auto replicação. Além disso, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira como está operacionalmente ligado à sequência requerida para a expressão na célula hospedeira, mas não se limita a mesma.

[045] Adicionalmente, o termo “operacionalmente ligado” se refere a uma ligação funcional entre a sequência de gene e uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídio alvo da presente revelação.

[046] O termo “microorganismo que inclui uma variante de polipeptídeo” ou “microorganismo que inclui uma variante de sintetase de adenil succinato”, conforme usado no presente documento, se refere a um microorganismo dotado de produtividade IMP ou produtividade XMP em um microorganismo, que naturalmente tem uma produtividade IMP fraca ou sua cepa mãe sem produtividade IMP ou produtividade XMP. Especificamente, o microrganismo pode ser um microrganismo que expressa uma variante de sintetase de adenil succinato que inclui pelo menos uma variação de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, e a modificação de aminoácidos pode incluir a substituição do 85° aminoácido do N- terminal da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 com um aminoácido diferente. Adicionalmente, o microorganismo pode ser um microorganismo que expressa uma variante de polipeptídeo que tem a atividade de sintetase de adenil succinato, em que o 85° aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituído por um aminoácido diferente, mas o microorganismo não está limitado ao mesmo.

[047] O microrganismo pode ser uma célula ou microrganismo que contém um polinucleotídeo que codifica uma variante de sintetase de adenil succinato, ou uma célula ou microrganismo que é transformado com um vetor e tem capacidade para expressar uma variante de sintetase de adenil succinato. Para o objetivo da presente revelação, a célula hospedeira ou microorganismo pode ser qualquer microorganismo que possa expressar nucleotídeos de purina contendo-se a variante de sintetase de adenil succinato.

[048] Na presente revelação, o termo "microrganismo que produz nucleotídeos de purina" pode ser usado indistintamente com "microrganismo que produz nucleotídeos de purina" e "microrganismo que tem produtividade de nucleotídeos de purina".

[049] Para o propósito da presente revelação, o termo “nucleotídeo de purina” se refere a um nucleotídeo que inclui uma estrutura com base em purina, por exemplo, IMP ou XMP, mas o nucleotídeo de purina não está limitado ao mesmo.

[050] Na presente revelação, o termo "microrganismo que produz nucleotídeos de purina" pode ser um microrganismo em que ocorreu uma modificação genética ou foi intensificada a atividade para a produção de nucleotídeos de purina desejada, que inclui tanto um microrganismo de tipo selvagem como microrganismos em que uma modificação genética natural ou artificial ocorreu e o microrganismo pode ser um microrganismo em que um mecanismo particular é melhorado ou enfraquecido devido a razões como a inserção de um gene exógeno, aumento ou inativação da atividade de um gene exógeno, etc. Para o objetivo da presente revelação, o microrganismo que produz nucleotídeos de purina é caracterizado em que tem uma produtividade aumentada dos nucleotídeos de purina desejados, contendo-se a variante de sintetase de adenil succinato e, especificamente, o microrganismo pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium. Especificamente, o microrganismo produtor de nucleotídeos ou microrganismos purínicos com produtividade nucleotídica de purina pode ser um microrganismo em que parte do gene envolvido na via de biossíntese de nucleotídeos de purina é aumentada ou enfraquecida, ou parte do gene envolvido na via de degradação de nucleotídeos de purina é aumentada ou enfraquecida. Por exemplo, o microorganismo pode ser um microorganismo em que a expressão de purF que codifica a amidotransferase de fosforribosilpirofosfato é aumentada ou a expressão de guaB que codifica a des-hidrogenase de monofosfato de 5'-inosina correspondente à via de degradação do IMP é enfraquecida, mas o microorganismo não está limitado a mesma.

[051] Conforme usado no presente documento, o termo "microrganismo do gênero Corynebacterium que produz 5’-nucleotídeos de purina" se refere a um microorganismo do gênero Corynebacterium que tem produtividade de nucleotídeos de purina naturalmente ou por modificação. Especificamente, conforme usado no presente documento, o microrganismo do gênero Corynebacterium que tem produtividade de nucleotídeos de purina pode ser um microorganismo do gênero Corynebacterium que melhorou a produtividade de nucleotídeos de purina aumentando-se ou enfraquecendo-se a atividade do gene purA que codifica sintetase de adenil succinato. Mais especificamente, conforme usado no presente documento, o microrganismo do gênero Corynebacterium com produtividade de nucleotídeos de purina pode ser um microorganismo do gênero Corynebacterium que melhorou a produtividade de nucleotídeos de purina que incluem a variante de sintetase de adenil succinato da presente revelação ou o polinucleotídeo que codifica o mesmo, ou por ser transformado com um vetor que inclui o polinucleotídeo que codifica a variante de sintetase de adenil succinato. O "microrganismo do gênero Corynebacterium que tem uma produtividade de nucleotídeos de purina melhorada" se refere a um microorganismo que tem uma produtividade de nucleotídeos de purina melhorada, em comparação com a sua cepa mãe antes da transformação ou um microrganismo não variante. O “microrganismo não variante” se refere a uma cepa do tipo selvagem, um microrganismo que não inclui a proteína variante que produz nucleotídeos de purina, ou um microrganismo que não é transformado com o vetor que contém o polinucleotídeo que codifica a variante de sintetase de adenil succinato.

[052] Conforme usado no presente documento, o “microorganismo do gênero Corynebacterium” pode ser especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium stationis, etc., mas o microorganismo não está limitado aos mesmos.

[053] Ainda outro aspecto da presente revelação proporciona um método de preparação de nucleotídeos de purina, que inclui a cultura do microrganismo do gênero Corynebacterium que produz nucleotídeo de purina em um meio e que recupera os nucleotídeos de purina do microorganismo ou do meio.

[054] No método acima, a cultura do microorganismo pode ser realizada por uma cultura descontínua conhecida, cultura contínua, cultura em batelada alimentada, etc., mas o método de cultivo não é particularmente limitado aos mesmos. Em particular, as condições de cultura podem não ser particularmente limitadas, mas um pH ideal (por exemplo, pH 5 a pH 9, especificamente pH 6 a pH 8, e mais especificamente pH 6,8) pode ser ajustado com uso de um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), e uma condição aeróbica pode ser mantida pela adição de oxigênio ou mistura de gás que contêm oxigênio à cultura. A temperatura de cultura pode ser mantida entre 20 °C e 45 °C, e especificamente entre 25 °C e 40 °C, e a cultura pode ser realizada durante cerca de 10 horas a cerca de 160 horas, mas as condições não são limitadas às mesmas. O ácido 5'-inosínico produzido pelo cultivo pode ser secretado no meio ou pode permanecer dentro das células.

[055] Além disso, no meio de cultura a ser usado, como fonte de carbono, açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), alcoóis (por exemplo, glicerol e etanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético), etc. ou em combinação, mas a fonte de carbono não está limitada a isso. Como fonte de nitrogênio, um composto orgânico que contém nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de milho, farinha de soja e uréia) ou um composto inorgânico (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio), etc. podem ser usados sozinhos ou em combinação, mas a fonte de nitrogênio não está limitada aos mesmos. Como uma fonte de fósforo, di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, um sal que contém sódio correspondente, etc. podem ser usados sozinhos ou em combinação, mas a fonte de fósforo não está limitada aos mesmos. Adicionalmente, o meio pode também incluir materiais que promovem crescimento essenciais, como outros sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas.

[056] Um método para recuperar nucleotídeos de purina produzidos na etapa de cultivo da presente revelação é recolher os nucleotídeos de purina desejados da cultura com uso de um método apropriado conhecido na técnica de acordo com o método de cultivo. Por exemplo, podem ser utilizados centrifugação, filtração, cromatografia de permuta aniônica, cristalização, HPLC, etc., e os nucleotídeos de purina desejados podem ser recuperados do meio ou microorganismo com uso de um método apropriado conhecido na técnica.

[057] Adicionalmente, a etapa de recuperação pode incluir um processo de purificação. O processo de purificação pode ser realizado com uso de um método apropriado conhecido na técnica. Portanto, os nucleotídeos de purina recuperados podem estar em uma forma purificada ou em um líquido de fermentação microbiana que inclui nucleotídeos de purina (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair, 2008).

[EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO]

[058] Quando um microorganismo do gênero Corynebacterium que produz nucleotídeos de purina com uso da variante de sintetase de adenil succinato da presente revelação, é possível produzir nucleotídeos de purina com elevado rendimento. [DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO]

[059] Doravante, a presente revelação é descrita em detalhes através de modalidades exemplificativas. No entanto, será evidente para os especialistas na técnica à qual a presente revelação pertence que essas modalidades exemplificativas são fornecidas apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da presente revelação.

Exemplo 1: PREPARAÇÃO DE CEPA DE PRODUÇÂO IMP COM BASE NO TIPO SELVAGEM

[060] A cepa de tipo selvagem do gênero Corynebacterium não pode produzir IMP de todo ou pode produzir apenas uma quantidade muito pequena, mesmo que seja possível. Consequentemente, uma cepa de produção de IMP foi preparada com base em Corynebacterium stationis ATCC6872. Mais especificamente, a cepa de produção de IMP foi preparada aumentando-se a atividade do gene purF que codifica a amidotransferase fosforibosilpirofosfato, que é a primeira enzima da biossíntese de purina, e enfraquecendo-se a atividade do gene guaB que codifica a des-hidrogenase de ácido 5'-inosínico que corresponde à via de degradação de IMP.

EXEMPLO 1-1: PREPARAÇÃO DE CEPA MELHORADA COM PURF

[061] Para preparar uma cepa na qual o códon inicial do gene purF é modificado, um vetor de inserção que contém o gene purF da SEQ ID NO: 3 foi preparada. Para clonar o gene purF em um vetor de inserção, especificamente, a PCR foi realizada com uso do DNA genômico de Corynebacterium stationis ATCC6872 como um modelo e os iniciadores das SEQ ID NOS: 4 e 5 e das SEQ ID NOS: 6 e 7 durante 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 s, anelamento a 55 °C durante 30 s e extensão a 72 °C durante 2 min. PCR foi realizada novamente com uso de dois fragmentos de DNA obtidos pela PCR acima como modelo e iniciadores das SEQ ID NOS: 4 e 72 durante 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 s, anelamento a 55 °C durante 30 s e extensão a 72 °C durante 2 min para obter fragmentos de DNA. Os fragmentos de DNA obtidos foram digeridos com uma enzima de restrição XbaI e clonados no vetor pDZ (Patente número KR 10-0924065 e Publicação Internacional número 2008-033001) digeridos com a mesma enzima. O vetor assim preparado foi denominado pDZ-purF-g1a.

[062] O vetor recombinante pDZ-purF-g1a foi transformado em Corynebacterium stationis ATCC6872 por eletroporação, e cepas nas quais o vetor foi inserido no DNA genômico por recombinação homóloga foram selecionadas em meio que contém 25 mg/l de canamicina. As cepas primárias selecionadas foram submetidas a interseção secundária, e essas cepas selecionadas foram submetidas a sequenciação, e assim a cepa desejada na qual a mutação foi introduzida foi selecionada. A cepa foi denominada como cepa ATCC6872::purF (g1a).

EXEMPLO 1-2: PREPARAÇÃO DE CEPA ENFRAQUECIDA POR GUAB

[063] Para preparar uma cepa na qual o códon inicial do gene guaB é modificado, um vetor de inserção que contém o gene guaB da SEQ ID NO: 8 foi preparado. Para clonar o gene guaB no vetor de inserção, especificamente, PCR foi realizada com uso do DNA genômico de Corynebacterium stationis ATCC6872 como modelo e iniciadores das SEQ ID NOS: 9 e 10 e das SEQ ID NOS: 11 e 12. Os produtos de PCR foram clonados como no Exemplo 1-1 e o vetor preparado foi denominado pDZ- guaB-a1t. O vetor foi introduzido no ATCC6872::purF (g1a) e a cepa na qual a mutação acima foi introduzida foi finalmente selecionada.

[064] A cepa com base em Corynebacterium stationis ATCC6872 do tipo selvagem finalmente selecionada que produz o IMP e foi denominada CJI2330.

EXEMPLO 1-3: TESTE DE TITULAÇÃO DE FERMENTAÇÃO DE CJI2330

[065] Depois de dispensar um meio de cultura de semente (2 ml) em tubos de ensaio (diâmetro: 18 mm), os tubos foram auto clavados. Cada um dentre ATCC6872 e CJI2330 foi inoculado e incubado a 30 °C durante 24 h com agitação e usado como cultura de semente. Um meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em cada frasco Erlenmeyer de agitação de 250 ml, e autoclavado a 121 °C por 15 min. A cultura de semente (2 ml) foi inoculada no meio e cultivada durante 3 dias. As condições de cultura foram ajustadas para 170 rpm, 30 °C e pH 7,5.

[066] Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de IMP foi medida por HPLC (SHIMAZDU LC20A), e os resultados da cultura são como na Tabela 3 abaixo. Os resultados a seguir sugerem que a cepa melhorada por purF e enfraquecida por guaB tem produtividade IMP.

[067] - Meio de cultura de sementes: 1% de glicose, 1% de peptona, 1% de extrato de carne, 1% de extrato de levedura, 0,25% de cloreto de sódio, 100 mg/l de adenina, 100 mg/l de guanina, pH 7,5

[068] - Meio de fermentação: Glutamato de sódio a 0,1%, cloreto de amônio a 1%, sulfato de magnésio a 1,2%, cloreto de cálcio a 0,01%, sulfato de manganês a 20 mg/l, sulfato de manganês a 20 mg/l, sulfato de zinco a 5 mg/l, 23 mg/l L-cisteína, 24 mg/l de alanina, 8 mg/l de ácido nicotínico, 45 μg/l de biotina, 5 mg/l de cloridrato de tiamina, 30 mg/l de adenina, 1,9% de ácido fosfórico (85%), 2,55% de glicose 1,45% de frutose

EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE VARIANTE ENFRAQUECIDA DE SINTETASE DE ADENIL SUCCINATO

[069] Para descobrir uma variante de sintetase de adenil succinato com capacidade para melhorar a produtividade de nucleotídeos de purina, foi preparada uma biblioteca mutante de gene purA que codifica sintetase de adenil succinato.

EXEMPLO 2-1: PREPARAÇÃO DE VETOR QUE CONTÉM GENE PURA

[070] Para preparar uma biblioteca mutante do gene purA, preparou-se primeiro um vetor recombinante que contém o gene purA. A PCR foi realizada com uso do DNA genômico de Corynebacterium stationis ATCC6872 como modelo e os iniciadores da SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, e o produto de PCR foi clonado no vetor pCR2.1 de E. coli com uso de um kit de clonagem TOPO (Invitrogen) para obter pCR-purA.

EXEMPLO 2-2: PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECA MUTANTE DE GENE PURA

[071] Uma biblioteca mutante do gene purA foi preparada com base no vetor preparado no Exemplo 2-1. A biblioteca foi preparada com uso de um kit de PCR sujeito a erros (Clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit). Sob condições em que mutações podem ocorrer, a PCR foi realizada com uso de iniciadores da SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16. Especificamente, sob condições em que 0 a 3 mutações por 1.000 bp podem ocorrer, o pré-aquecimento foi realizado a 94 °C por 30 s, seguido por 25 ciclos de 94 °C por 30 s e 68 °C por 1 min 30 s. Um produto de PCR assim obtido foi submetido a PCR com uso de um mega iniciador (500 ng a 125 ng) durante 25 ciclos de 95 durante 50 s, 60 durante 50 s e 68 durante 12 min, tratados com DpnI e transformados em E. coli DH5α e espalhados em um meio sólido LB que contém canamicina (25 mg/l). Depois de selecionar 20 tipos diferentes de colônias transformadas, plasmídeos foram obtidos das mesmas e submetidos a análise de sequenciamento. Como resultado, foi confirmado que as mutações foram introduzidas em diferentes sítios com uma frequência de 2 mutações/kb. Cerca de 20.000 colônias de E. coli transformadas foram recolhidas e os plasmídeos foram extraídos e denominados como uma biblioteca pTOPO-purA.

EXEMPLO 3: AVALIAÇÃO DE BIBLIOTECA PREPARADA E SELEÇÃO DE CEPA EXEMPLO 3-1: AVALIAÇÃO DE BIBLIOTECA

[072] A biblioteca pTOPO-purA preparada no Exemplo 2-2 foi transformada na cepa CJI2330 preparada no Exemplo 1 por eletroporação, e a cepa foi espalhada em um meio nutriente que contém 25 mg/l de canamicina para obter 10.000 colônias nas quais o gene mutante foi inserido. Cada uma das colônias foi denominada como CJI2330::pTOPO_purA (mt) 1 a CJI2330::pTOPO_purA (mt) 10.000.

[073] - Meio nutriente: 1% de peptona, 1% de extrato de carne, 0,25% de cloreto de sódio, 1% de extrato de levedura, 2% de ágar, pH 7,2

[074] Cada uma das 10.000 colônias obtidas foi inoculada em 200 μl de um meio de cultura de semente autoclavado e cultivada em uma placa de 96 poços profundos com agitação a 30 °C, 1.200 rpm durante 24 horas com uso de um agitador de microplacas (TAITEC) e usada como uma cultura de semente. O meio de fermentação autoclavado (290 μl) foi dispensado em uma placa de 96 poços profundos e 20 μl de cada uma das culturas de sementes foram inoculadas para o mesmo, seguido de cultura com agitação nas mesmas condições que acima durante 72 horas.

[075] Para analisar o ácido 5'-inosinico produzido no meio de cultura, após o término da cultura, 3 μl do sobrenadante de cultura foram transferidos para uma placa UV de 96 poços, em que cada poço continha 197 μl de água destilada e agitado por 30 segundos com uso de um leitor de microplacas e a absorvância foi medida a 270 nm a 25 °C com uso de um espectrofotômetro. A absorbância foi comparada com a da cepa CJI2330, e 50 colônias de cepas mutantes que mostram um aumento de 10% ou mais na absorbância foram selecionadas. Outras colônias mostraram absorbância similar ou diminuída em comparação ao controle.

[076] A absorvância das 50 cepas selecionadas foi medida da mesma maneira que acima para examinar repetidamente a quantidade de produção de ácido 5'- inosinico. Uma cepa, CJI2330::pTOPO_purA (mt) 333, que mostrou uma melhoria significativa na produtividade de ácido 5'-inosinico em comparação com a cepa CJI2330, foi selecionada.

[077] Para confirmar a validade de mutantes selecionados, foi realizado um teste de titulação de fermentação.

[078] Depois de dispensar um meio de cultura de semente (2 ml) em tubos de ensaio (diâmetro: 18 mm), os tubos foram auto clavados. Cada um dos CJI2330 e CJI2330::pTOPO_purA (mt) 333 foi inoculado e incubado a 30 °C durante 24 h com agitação e usado como uma cultura de semente. Um meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em cada frasco Erlenmeyer de agitação de 250 ml, e autoclavado a 121 °C por 15 min. A cultura de semente (2 ml) foi inoculada no meio e cultivada durante 3 dias. As condições de cultura foram ajustadas para 170 rpm, 30 °C e pH 7,5.

[079] Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de IMP foi medida por HPLC (SHIMAZDU LC20A), e os resultados da cultura são como na Tabela 6 abaixo.

[080] Conforme pode ser visto a partir dos resultados acima, foi confirmado que a quantidade de IMP foi aumentada em cerca de 122% na cepa em que um vetor que contém uma mutação do gene purA em comparação com a cepa CJI2330. Consequentemente, foi determinado que a mutação selecionada na biblioteca era válida.

EXEMPLO 3-2: CONFIRMAÇÃO DE VARIAÇÃO DE PURA

[081] Para confirmar a variação de gene da cepa mutante, a PCR foi realizada na cepa CJI2330::pTOPO_purA (mt) 333 com uso de iniciadores das SEQ ID NOS: 17 e 18, e o produto de PCR foi submetido a sequenciamento, confirmando assim a presença de variação no gene purA.

[082] Especificamente, foi confirmado que o gene purA da cepa CJI2330::pTOPO_purA (mt) 333 inclui uma variação em que o 85° aminoácido (isto é, glicina) da sequência de aminoácidos purA representada pela SEQ ID NO: 2 é substituído por serina (isto é, o 253° nucleotídeo, "g", é substituído por um nucleotídeo "a"). Consequentemente, nos Exemplos aqui a seguir, foram feitas tentativas para confirmar se a variação acima pode afetar a quantidade de produção de nucleotídeos de purina em cada microrganismo do gênero Corynebacterium.

EXEMPLO 4: CONFIRMAÇÃO DE PRODUÇÃO DE IMP EM CEPA DE PRODUÇÃO DE IMP DERIVADA DE ATCC6872

[083] Uma cepa produtora de IMP derivada de ATCC6872 foi preparada, e a variação confirmada no Exemplo 3 foi introduzida na cepa e a produtividade IMP da cepa foi confirmada.

EXEMPLO 4-1: SELEÇÃO DE CEPA DE PRODUÇÃO DE IMP DERIVADA DE ATCC6872

[084] Para preparar uma cepa produtora de IMP derivada da cepa ATCC6872, a cultura de ATCC6872 foi suspensa em um tampão de fosfato (pH 7,0) ou tampão de citrato (pH 5,5) a uma densidade de 107 células/ml a 108 células/ml e tratado com UV à temperatura ambiente ou 32 °C durante 20 min a 40 min para induzir uma mutação. A cepa foi lavada com uma solução salina a 0,85% duas vezes e espalhada, após diluição, em um meio mínimo que contém 1,7% de agar que foi suplementado com um material que proporciona resistência a uma concentração apropriada, e assim foram obtidas colônias. Cada colônia foi cultivada em meio nutriente e então cultivada em meio de cultura de semente por 24 horas. Após a cultura de cada colônia em meio de fermentação por 3 a 4 dias, foram selecionadas colônias que apresentaram excelente produção de IMP acumulada no meio de cultura. Para preparar uma cepa que produz IMP em alta concentração, a adenina-auxotrofo, do tipo com vazamento de guanina, sensibilidade à lisozima, resistência à 3,4-des-hidroprolina, resistência à estreptomicina, resistência à sulfaguanidina, resistência à norvalina e resistência à trimetoprima foram fornecidas pela realização dos procedimentos correspondentes de maneira sequencial. Como resultado, a cepa CJI2335 dotada de resistência aos materiais acima e que tem excelente produtividade IMP foi finalmente selecionada. As resistências da cepa CJI2332 em relação às da ATCC6872 foram comparadas e os resultados são apresentados na Tabela 8 seguinte.

[085] - Meio mínimo: 2% de glicose, 0,3% de sulfato de sódio, 0,1% de fosfato monopotássico, 0,3% de fosfato dipotássico, 0,3% de sulfato de magnésio, 10 mg/l de cloreto de cálcio, 10 mg/l de sulfato de ferro, 1 mg/l de sulfato de zinco, 3,6 mg/l de manganês cloreto, 20 mg/l de L-cisteína, 10 mg/l de pantotenato de cálcio, 5 mg/l de cloridrato de tiamina, 30 μg/l de biotina, 20 mg/l de adenina, 20 mg/l de guanina, ajustado para pH 7,3.

EXEMPLO 4-2: TESTE DE TITULAÇÃO DE FERMENTAÇÃO DE CJI2332

[086] Depois de dispensar um meio de cultura de semente (2 ml) em tubos de ensaio (diâmetro: 18 mm), os tubos foram auto clavados. Cada um dos ATCC6872 e CJI2332 foi inoculado e incubado a 30 °C durante 24 horas com agitação e utilizado como cultura de semente. Um meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em cada frasco Erlenmeyer de agitação de 250 ml, e autoclavado a 121 °C por 15 min. A cultura de semente (2 ml) foi inoculada no meio e cultivada durante 3 dias. As condições de cultura foram ajustadas para 170 rpm, 30 °C e pH 7,5.

[087] Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de IMP foi medida por HPLC (SHIMAZDU LC20A), e os resultados da cultura são como na Tabela 9 abaixo.

EXEMPLO 4-3: PREPARAÇÃO DE VETOR DE INSERÇÃO QUE CONTÉM VARIAÇÃO DE PURA

[088] Para introduzir as variações selecionadas no Exemplo 3 nas cepas, um vetor de inserção foi preparado. O processo de preparação do vetor para introdução da variação de purA (G85S) é o seguinte. A PCR foi realizada com uso do CJI2330::Topo_purA (G85S) como modelo e os iniciadores da SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20. A PCR foi realizada como se segue: desnaturação a 94 durante 5 min; 20 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, emparelhamento a 55 °C durante 30 s e polimerização a 72 °C durante 1 min; e polimerização a 72 durante 5 min. Os fragmentos de genes assim obtidos foram digeridos com XbaI. Cada fragmento de gene foi clonado em um vetor pDZ linear digerido com XbaI com uso de ligase T4 e, desse modo, foi preparado o vetor pDZ-purA (G85S).

EXEMPLO 4-4: INTRODUÇÃO DE VARIANTES EM CEPAS CJI2330 E CJI2332 DERIVADAS DE ATCC6872 E SUA AVALIAÇÃO

[089] A variação de purA foi introduzida em cada uma das cepas CJI2330 produtoras de IMP derivadas de tipo selvagem preparadas no Exemplo 1 e na cepa CJI2332 selecionada no Exemplo 4-1, e a quantidade de IMP produzida por cada cepa foi avaliada. Para confirmar a presença de uma variação no gene purA, o DNA cromossômico da cepa CJI2332 foi amplificado por PCR. Especificamente, em primeiro lugar, os fragmentos do gene purA foram amplificados por PCR com uso do DNA cromossômico da cepa CJI2332 como modelo e os iniciadores das SEQ ID NOS: 17 e 18, em que a PCR foi realizada por 28 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 1 min; anelamento a 58 °C durante 30 s e polimerização a 72 °C durante 2 min com uso de DNA polimerase Taq. As sequências de nucleotídeos dos fragmentos purA amplificados foram analisadas com uso dos mesmos iniciadores e, como resultado, foi confirmado que não houve variação no gene purA da cepa CJI2332.

[090] Em seguida, o vetor pDZ-purA (G85S) foi transformado na cepa CJI2330 e na cepa CJI2332, e as cepas nas quais o vetor foi inserido no DNA genômico por recombinação de sequências homólogas foram selecionadas em meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a interseção secundária, e assim as cepas nas quais uma variação do gene alvo foi introduzida foram selecionadas. Para confirmação da introdução da variação do gene nas cepas transformadas desejadas, o PCR foi realizado com uso de iniciadores da SEQ ID NO: 17 e da SEQ ID NO: 18 e os produtos PCR foram confirmados por análise de sequências. Como resultado, foi confirmado que a variação genética foi introduzida nas cepas. As cepas assim preparadas foram nomeadas como CJI2330::purA (G85S) e CJI2332::purA (G85S), respectivamente.

[091] A produtividade do IMP para cada uma das cepas CJI2330, CJI2332, CJI2330::purA (G85S) e CJI2332::purA (G85S) foi avaliada. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de IMP por cada cepa foi medida por um método que usa HPLC, e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 11 abaixo.

[092] Nos resultados acima, foi confirmado que a cepa na qual a variação do gene purA foi introduzida mostrou um aumento na quantidade de produção de IMP em cerca de 122% e cerca de 116% em comparação com as cepas CJI2330 e CJI2332 produtoras de IMP derivadas do tipo selvagem, respectivamente.

[093] A cepa CJI2332 foi depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 22 de junho de 2018, sob as provisões do Tratado de Budapeste e recebeu o número de acesso KCCM12277P. Adicionalmente, a cepa CJI2332::purA (G85S) preparada, também denominada CJI2348, foi depositada na KCCM em 22 de junho de 2018, sob as provisões do Tratado de Budapeste e atribuiu o número de acesso KCCM12280P.

Exemplo 5: CONFIRMAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DO ÁCIDO 5'- XANTÍLICO PELA VARIAÇÃO DO GENE PURA EXEMPLO 5-1: SELEÇÃO DE CEPAS DE PRODUÇÃO DE XMP DERIVADAS DE ATCC6872

[094] Para preparar uma cepa que produz de monofosfato de 5'-xantosina (XMP) derivada de ATCC6872, a cepa ATCC6872 Corynebacterium stationis foi suspensa em tampão de fosfato (pH 7,0) ou tampão de citrato (pH 5,5) a uma densidade de 107 células/ml a 108 células/ml e tratadas com UV a temperatura ambiente ou 32 °C durante 20 min a 40 min para induzir uma mutação. A cepa foi lavada com uma solução salina a 0,85% duas vezes e espalhada, após diluição, em um meio mínimo que contém 1,7% de agar que foi suplementado com um material que proporciona resistência a uma concentração apropriada, e assim foram obtidas colônias. Cada colônia foi cultivada em meio nutriente e então cultivada em meio de cultura de sementes por 24 h. Após a cultura de cada colônia em meio de fermentação por 3 a 4 dias, foram selecionadas colônias que apresentaram excelente produção de XMP acumulada no meio de cultura. Especificamente, as cepas foram selecionadas daquelas que podem crescer em um meio onde fluorotriptofano é adicionado de acordo com as concentrações (meio de adição), e mais especificamente, daqueles que podem crescer em um meio com uma concentração de fluorotriptofano de 100 mg/l e melhorou concentração de ácido 5'-xantílico. A cepa selecionada foi nomeada como CJX1664.

[095] - Meio mínimo: glucose 20 g/l fosfato monopotássico 1 g/l fosfato dipotássico 1 g/l ureia 2 g/l sulfato de amónio 3 g/l sulfato de magnésio 1 g/l cloreto de cálcio 100 mg/l sulfato de ferro 20 mg/l, sulfato de manganês 10 mg/l, sulfato de zinco 10 mg/l, biotina 30 μg/l, cloridrato de tiamina 0,1 mg/l, sulfato de cobre 0,8 mg/l, adenina 20 mg/l, guanina 20 mg/l, pH 7,2

[096] - Meio de adição: um meio em que fluorotriptofano a uma concentração de 10 mg/l, 20 mg/l, 50 mg/l, 70 mg/l, 100 mg/l e 200 mg/l é adicionado a um meio mínimo

[097] As características bioquímicas da cepa CJX1664 são mostradas na Tabela 12 abaixo. Com referência à Tabela 12, a cepa CJX1664 pode ser cultivada em um meio de adição em que é adicionado um fluorotriptofano a uma concentração de 100 mg/l.

EXEMPLO 5-2: TESTE DE TITULAÇÃO DE FERMENTAÇÃO DE CJX1664

[098] Depois de dispensar um meio de cultura de semente (2 ml) em tubos de ensaio (diâmetro: 18 mm), os tubos foram auto clavados. Cada um dentre ATCC6872 e CJX1664 foi inoculado e incubado a 30 °C durante 24 h com agitação e usado como cultura de semente. Um meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em cada frasco Erlenmeyer de agitação de 250 ml, e autoclavado a 121 °C por 15 min. A cultura de semente (2 ml) foi inoculada no meio e cultivada durante 3 dias. As condições de cultura foram ajustadas para 170 rpm, 30 °C e pH 7,5.

[099] Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de XMP foi medida por HPLC (SHIMADZU LC20A), e os resultados da cultura são como na Tabela 13 abaixo.

EXEMPLO 5-3: INTRODUÇÃO DE VARIANTE EM CEPA CJX1664 E SUA AVALIAÇÃO

[0100] Para confirmar a presença de uma variação do gene purA da cepa CJX1664 selecionada no Exemplo 5-1, a PCR de ADN cromossômico da cepa CJX1664 foi amplificada por PCR. Especificamente, primeiro, os fragmentos purA foram amplificados por PCR com uso do DNA cromossômico da cepa CJX1664 como modelo e os iniciadores das SEQ ID NOS: 17 e 18, em que a PCR foi realizada por 28 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 1 min; anelamento a 58 °C durante 30 s e polimerização a 72 °C durante 2 min com uso de DNA polimerase Taq. As sequências de nucleotídeos dos fragmentos do gene purA amplificado foram analisadas com uso dos mesmos iniciadores e, como resultado, foi confirmado que não houve variação no gene purA da cepa CJX1664.

[0101] O vetor preparado no Exemplo 4-3 foi transformado na cepa CJX1664, e as cepas nas quais o vetor foi inserido no DNA genômico por recombinação de sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém 25 mg/l de canamicina. As cepas primárias selecionadas foram submetidas a interseção secundária, e assim as cepas nas quais uma variação do gene alvo foi introduzida foram selecionadas. A introdução da variação de gene nas cepas transformadas desejadas foi confirmada por análise de sequências.

[0102] A produtividade XMP para cada uma das cepas CJX1664 e CJX1664::purA (G85S) foi avaliada. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de XMP por cada cepa foi medida por um método com uso de HPLC, e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 14 abaixo.

[0103] Conforme pode ser visto em tabela 14 acima, a cepa CJX1664::purA (G85S) mostrou um aumento na quantidade de produção de XMP em cerca de 109% em comparação com a cepa CJX1664 (isto é, uma cepa produtora de XMP com base em ATCC6872).

[0104] A cepa CJX1664 foi depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em sexta-feira, 6 de julho de 2018, sob as provisões do Tratado de Budapeste e recebeu o número de acesso KCCM12285P. Adicionalmente, a cepa CJX1664::purA (G85S) preparada, também denominada CJX1665, foi depositada na KCCM em sexta-feira, 6 de julho de 2018, sob as provisões do Tratado de Budapeste e atribuiu o número de acesso KCCM12286P.

EXEMPLO 6: SUBSTITUIÇÃO DE AMINOÁCIDO EM VARIAÇÃO DE PURA POR AMINOÁCIDO DIFERENTE EXEMPLO 6-1: PREPARAÇÃO DE VETOR PARA INSERÇÃO DE AMINOÁCIDO EM VARIAÇÃO DE PURA

[0105] Através dos Exemplos acima, foi confirmado que a variação de purA (G85S) pode melhorar a produtividade dos nucleotídeos de purina. Nesse sentido, para confirmar a importância posicional da variação de purA, foi examinado o efeito da substituição do 85° aminoácido com um aminoácido diferente na produtividade dos nucleotídeos de purina. O processo de preparação do vetor para a inserção da variação de purA (G85S) é o seguinte. A mutagênese sítio-dirigida foi realizada com uso do vetor pDZ-purA (G85S) preparado no Exemplo 4 como um esqueleto. Especificamente, a PCR foi realizada utilizando as sequências mostradas na Tabela 15 como iniciadores nas seguintes condições: 18 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 s, emparelhamento a 55 °C durante 30 segundos e extensão a 68 °C durante 12 min. Os produtos de PCR resultantes foram digeridos com DpnI, transformados numa cepa DH5a, e as colônias foram obtidas a partir do mesmo. Os plasmídeos das colônias assim obtidas foram obtidos por um método de extração de plasmídeo conhecido e as informações dos plasmídeos obtidos são mostradas abaixo na Tabela 15.

EXEMPLO 6-2: PREPARAÇÃO DE CEPA EM QUE UM AMINOÁCIDO É SUBSTITUÍDO POR UM AMINOÁCIDO DIFERENTE DE ACORDO COM A POSIÇÃO DE VARIAÇÃO DE UMA PURA VARIANTE, E COMPARAÇÃO ENTRE PRODUTIVIDADES DE ÁCIDO 5'-INOSINICO

[0106] Cada um dentre os 18 tipos de vetores, para a introdução de variantes, preparados no Exemplo 6-1 foi transformado na cepa CJI2332, e as cepas em que esses vetores foram inseridos no DNA genômico por recombinação homóloga foram selecionadas em um meio que contém 25 mg/l de canamicina. As cepas primárias selecionadas foram submetidas à interseção secundária e, assim, as cepas nas quais uma variação do gene alvo foi introduzida foram selecionadas. Para confirmação da introdução da variação do gene nas cepas transformadas desejadas, o PCR foi realizado com uso de iniciadores da SEQ ID NO: 17 e da SEQ ID NO: 18 e os produtos PCR foram confirmados por análise de sequências. As cepas foram nomeadas de acordo com as variações inseridas, conforme mostrado na Tabela 17.

[0107] A concentração de ácido 5'-inosinico foi analisada cultivando-se as cepas da mesma maneira que no Exemplo 1.

[0108] Em referência à Tabela 18 acima, foi confirmado que as cepas que contêm a purA, em que o 85° aminoácido da sequência de aminoácidos que codifica o gene purA é substituído por um aminoácido diferente, foi mostrado uma alteração significativa na quantidade de produção de IMP, em comparação com outras cepas que não continham a variação acima. Ou seja, foi confirmado que o 85° aminoácido da sequência de aminoácidos que codifica o gene purA é uma posição importante para a variação associada à produção de nucleotídeos de purina, e quando o 85° aminoácido da sequência de aminoácidos que codifica o gene purA é substituído por um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em serina, alanina, valina, leucina, metionina, isoleucina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, tirosina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico, o microorganismo que tem a variação pode aumentar significativamente a produção de nucleotídeos de purina.

[0109] A partir do que foi mencionado anteriormente, uma pessoa versada na técnica a quem a presente revelação se refere terá a capacidade de entender que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente revelação. Nesse aspecto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente revelação. Pelo contrário, a presente revelação é destinada a abranger não só as modalidades exemplificativas, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes, e outras modalidades que podem estar incluídas dentro do espírito e escopo da presente revelação conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Variante de adenilossuccinato sintetase caracterizada por o 85° aminoácido da terminação N da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ser substituído por um aminoácido, selecionado do grupo que consiste em serina, alanina, valina, leucina, metionina, isoleucina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, tirosina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico.

2. Polinucleotídeo que codifica a variante de adenilossuccinato sintetase, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou sua sequência degenerada, o códon consistindo de 253° a 255° nucleotídeos ser substituído por um códon que codifica um aminoácido, selecionado do grupo que consiste em serina, alanina, valina, leucina, metionina, isoleucina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, tirosina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico.

3. Vetor recombinante caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 2.

4. Micro-organismo do gênero Corynebacterium caracterizado por produzir nucleotídeos de purina por compreender a variante de adenilossuccinato sintetase, conforme definido na reivindicação 1, ou o vetor, conforme definido na reivindicação 3.

5. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 4, sendo que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é caracterizado por ser Corynebacterium stationis.

6. Método para preparar IMP, XMP ou GMP caracterizado por compreender: cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium, conforme definido na reivindicação 4, em um meio; e recuperar o IMP, XMP ou GMP do micro-organismo ou do meio.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o micro-organismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium stationis.