CN111212904B - 腺苷酸琥珀酸合成酶和使用其产生嘌呤核苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及腺苷酸琥珀酸合成酶变体、含有其的微生物以及使用所述微生物制备嘌呤核苷酸的方法。

Description

腺苷酸琥珀酸合成酶和使用其产生嘌呤核苷酸的方法

[技术领域]

本公开涉及新型腺苷酸琥珀酸合成酶、含有其的微生物、以及使用所述微生物制备嘌呤核苷酸的方法。

[背景技术]

5'-肌苷一磷酸(下文，IMP)是一种基于核酸的物质，其是各种领域(例如，药物、各种医学应用等)中使用的核酸生物合成代谢系统的中间体，并且与5'-鸟嘌呤一磷酸(下文，GMP)一起是广泛用作食品调味添加剂或食品的物质。已知IMP本身产生牛肉风味并增强谷氨酸钠(MSG)的风味，如同GMP一样；因此作为基于味道的基于核酸的调味料引起公众关注。

制备IMP的方法可以包括酶促降解从酵母细胞提取的核糖核酸的方法，将通过发酵产生的肌苷化学磷酸化的方法(Agri. Biol. Chem., 36, 1511(1972)等)，培养直接产生IMP的微生物且从培养的培养基回收IMP的方法等。在这些方法中，最广泛使用的方法是使用能够直接产生IMP的微生物的方法。

另外，制备GMP的方法可以包括使用棒状杆菌微生物将通过微生物发酵产生的黄苷5'-一磷酸(下文，XMP)转化为GMP的方法和使用大肠杆菌将通过微生物发酵产生的XMP转化为GMP的方法。在上述方法中，当通过其中首先产生XMP且然后转化为GMP的方法产生GMP时，必须增强XMP(即，在微生物发酵期间转化反应的前体)的生产力，且此外，产生的XMP和在转化反应的整个过程期间已经产生的GMP两者应当被保护免于损失。

同时，由于自然界中的酶在工业应用中在对光学异构体的活性、稳定性、底物特异性等方面并不总是表现出最佳特性，已经进行各种尝试以通过改变其氨基酸序列来改进酶以实现期望用途。在这些中，酶的合理设计和定点诱变在一些情况下已被应用以改进酶的功能；然而，这些方法具有缺点，因为关于靶酶的结构的信息不足或结构-功能相关性不清楚，且因此它们不能被有效地应用。在这种情况下，已报道，可以通过经定向进化方法改进酶来增强酶的活性，在所述定向进化方法中，从通过酶基因的随机变异构建的酶的突变体文库筛选具有期望性状的酶。本公开的发明人对于通过经由微生物发酵产生含有IMP或XMP的嘌呤核苷酸的方法高产率产生嘌呤核苷酸已经进行了广泛的研究。作为结果，他们已发现具有更高嘌呤核苷酸生产力的蛋白变体，由此完成本公开。

[公开内容]

[技术问题]

本公开的一个目的是提供腺苷酸琥珀酸合成酶变体。

本公开的另一个目的是提供编码腺苷酸琥珀酸合成酶变体的多核苷酸。

本公开的又另一个目的是提供含有所述多核苷酸的载体。

本公开的又另一个目的是提供能够产生嘌呤核苷酸的的微生物，其含有腺苷酸琥珀酸合成酶变体和载体。

本公开的又另一个目的是提供用于制备嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括：在培养基中培养棒杆菌属的微生物；和从微生物或培养基回收嘌呤核苷酸。

[技术方案]

在下文中，将详细描述本公开的示例性实施方案。同时，本文公开的每个解释和示例性实施方案都可以应用于其他解释和示例性实施方案。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应受下文提供的具体公开内容的限制。

为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了腺苷酸琥珀酸合成酶变体，其中从SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N-末端起第85个氨基酸被不同的氨基酸取代。修饰的腺苷酸琥珀酸合成酶在从SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N-末端起第85位的氨基酸上具有修饰。具体地，本公开提供了在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸变异的腺苷酸琥珀酸合成酶变体，其中所述修饰包括用不同的氨基酸取代从N-末端起的第85位。

如本文所用，术语“腺苷酸琥珀酸合成酶”是指在嘌呤生物合成中具有重要作用的酶。为了本公开的目的，酶是指参与嘌呤核苷酸(包括5'-肌苷一磷酸(IMP)或5'-黄苷一磷酸(XMP))的产生的蛋白。

在本公开中，SEQ ID NO:2是指具有腺苷酸琥珀酸合成酶的活性的氨基酸序列。具体地，SEQ ID NO:2是由purA基因编码的具有腺苷酸琥珀酸合成酶的活性的蛋白序列。SEQID NO:2的氨基酸序列可以从NCBI GenBank(其为已知数据库)获得。在一个实施方案中，SEQ ID NO:2的氨基酸序列可以源自棒杆菌属的微生物，但不限于此，并且可以包括且不限于具有与上述氨基酸序列相同的活性的任何序列。另外，SEQ ID NO:2的氨基酸序列的范围可以包括具有腺苷酸琥珀酸合成酶的活性的SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有80%或更高同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，上述氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同源性或同一性的氨基酸序列。具有同源性或同一性的氨基酸序列可以是上述范围中的那些，不包括具有100%同一性的序列，或者可以是具有少于100%同一性的序列。另外，显而易见的是，其具有的氨基酸序列在所述序列的一部分中具有缺失、修饰、取代或添加的任何蛋白也可以在本公开中使用，只要其具有同源性或同一性并且表现出对应于上述蛋白的效力的效力。

在本公开中，术语“腺苷酸琥珀酸合成酶变体”可以与具有嘌呤核苷酸生产力的多肽变体、产生嘌呤核苷酸的变体多肽、产生嘌呤核苷酸的多肽变体、具有腺苷酸琥珀酸合成酶活性的多肽变体、腺苷酸琥珀酸合成酶变体等互换使用。另外，所述蛋白可以源自属停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)，但所述蛋白不限于此。

腺苷酸琥珀酸合成酶变体在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中从N-末端起第85位处包含氨基酸的修饰。腺苷酸琥珀酸合成酶变体是其中SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第85个氨基酸被不同氨基酸取代的变体。腺苷酸琥珀酸合成酶变体可以包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者其可以是与源自野生型微生物的非变体腺苷酸琥珀酸合成酶相比具有更弱活性的腺苷酸琥珀酸合成酶变体。这种腺苷酸琥珀酸合成酶变体表明在SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同源性或同一性的氨基酸序列中从N-末端起的第85个氨基酸的修饰，如上所解释。

具体地，腺苷酸琥珀酸合成酶变体是其中SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的第85个氨基酸被丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸取代的变体，并且与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的活性相比，腺苷酸琥珀酸合成酶变体可以具有更弱的腺苷酸琥珀酸合成酶活性，但腺苷酸琥珀酸合成酶变体不限于此。

为了本公开的目的，当微生物包含腺苷酸琥珀酸合成酶变体时，包括IMP或XMP的嘌呤核苷酸产生量增加。这是有意义的，因为本公开使得能够通过本公开的腺苷酸琥珀酸合成酶变体增加IMP或XMP产生量，而野生型棒杆菌菌株不能产生IMP或XMP，或者即使产生IMP或XMP，也仅可以产生非常少量。

腺苷酸琥珀酸合成酶变体可以包含选自如下氨基酸序列的氨基酸序列，其中从SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N-末端起第85个氨基酸被选自以下的氨基酸取代：丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。具体地，腺苷酸琥珀酸合成酶变体可以由包含氨基酸序列的多肽构成，所述氨基酸序列选自这样的氨基酸序列，其中从SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N-末端起第85个氨基酸被选自以下的氨基酸取代：丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。另外，腺苷酸琥珀酸合成酶变体可以包含这样的氨基酸序列，其中从SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N-末端起的第85个氨基酸被不同的氨基酸取代，所述氨基酸序列具有腺苷酸琥珀酸合成酶变体的氨基酸序列或与腺苷酸琥珀酸合成酶变体的氨基酸序列具有80%或更高同源性或同一性的氨基酸序列，但所述氨基酸序列不限于此。具体地，本公开的腺苷酸琥珀酸合成酶变体可以包括与所述氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同源性或同一性的多肽，其中SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的第85个氨基酸被选自以下的氨基酸取代：丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。另外，显而易见的是，具有上述序列同源性或同一性且表现出与所述蛋白的效果对应的效果的任何氨基酸序列也必须属于本发明的范围，即使氨基酸序列的部分除了第85位的氨基酸以外在序列的部分中可以具有缺失、修饰、取代或添加。

也就是说，尽管本公开描述了“具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白或多肽”，但显而易见的是，本公开中还可以使用其具有的氨基酸序列在所述序列的一部分中具有缺失、修饰、取代或添加的蛋白，只要所述蛋白具有与由相应SEQ ID NO的氨基酸序列构成的多肽的活性相同或相应的活性。例如，只要蛋白具有与多肽变体的活性相同或相应的活性，其不排除在氨基酸序列之前和之后的不改变蛋白的功能的序列添加、天然存在的突变、沉默突变或其保守取代。显而易见的是，具有这种序列添加或突变的蛋白也落在本公开的范围内。

“保守取代”意指用另一种具有相似结构和/或化学特性的氨基酸替代氨基酸。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质中的相似性来发生。例如，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；且带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；且疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

因此，在本公开中，“变体”可以进一步包含在“具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白或多肽”中的至少一个氨基酸的保守取代和/或修饰。例如，某些变体可以包括其中去除至少一个部分(诸如N-末端前导序列或跨膜结构域)的变体。其他变体可以包括其中从成熟蛋白的N-末端和/或C-末端除去一部分的变体。所述变体还可以包含其他修饰，包括氨基酸的缺失或添加，其对多肽的特性和二级结构具有最小影响。例如，所述多肽可以在蛋白的N-末端与信号(或前导)序列缀合，所述信号(或前导)序列在翻译同时或翻译后指导蛋白的转移。所述多肽还可以与另一序列或接头缀合，以便于多肽的鉴定、纯化或合成。术语“变体”可以与修饰、修饰的蛋白、修饰的多肽、突变体、突变蛋白、相异体(divergent)等互换使用，并且可以使用且不限于任何术语，只要它在被修饰的意义上使用。

同源性和同一性意指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并且可以表示为百分比。

术语“同源性”和“同一性”经常可以彼此互换使用。

保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以组合使用由待使用的程序建立的默认空位罚分。基本上，同源或相同序列可以在中等或高度严格条件下沿其整个序列或在整个长度的至少约50%、约60%、约70%、约80%或约90%杂交。关于待杂交的多核苷酸，还可以考虑包含简并密码子而不是密码子的多核苷酸。

任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以通过例如已知的计算机算法诸如使用如Pearson等人 (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]:2444)中的默认参数的“FASTA”程序来确定。或者，它们可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)来确定，如EMBOSS包的Needleman程序(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人, 2000, Trends Genet.16:276-277) (版本5.0.0或更新版本) (包括GCG程序包(Devereux, J., 等人, Nucleic Acids Research 12:387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, [S.] [F.] 等人, J Molec Biol 215]: 403 (1990); Guide to HugeComputers, Martin J. Bishop, [编,] Academic Press, San Diego, 1994, 和[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073)中所进行。例如，可以使用National Center for Biotechnology Information的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过使用GAP计算机程序(例如，Needleman等人(1970), J Mol Biol.48:443)比较序列信息来确定，如Smith和Waterman,Adv. Appl. Math (1981) 2:482中所公开。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短的符号的总数。GAP程序的默认参数可以包括：(1)Gribskov等人(1986) Nucl.Acids Res.14:6745的一元比较矩阵(对于同一性，含有值1，且对于非同一性，含有值0)和加权比较矩阵(或EDNAFULL (NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)，如Schwartz和Dayhoff, 编, Atlas Of Protein Sequence AndStructure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979)所公开；(2)每个空位的罚分为3.0，且每个空位中的每个符号的额外罚分为0.10(或空位开放罚分10，空位延长罚分0.5)；和(3)末端空位没有罚分。因此，如本文所用，术语“同源性”或“同一性”代表序列之间的相关性。

另外，显而易见的是，也可以包括这样的多核苷酸，所述多核苷酸由于密码子简并性可以被翻译成由其中从SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N-末端起第85个氨基酸被不同的氨基酸取代的氨基酸序列构成的多肽变体、或与其具有同源性或同一性的多肽变体。另外，通过在严格条件下与可以由已知基因序列(例如，与核苷酸序列的全部或部分互补的序列)制备的探针杂交，可以包括且不限于编码包含如下的氨基酸序列的腺苷酸琥珀酸合成酶变体的任何多核苷酸序列，在所述氨基酸序列中SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第85个氨基酸被选自以下的氨基酸取代：丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

本公开的另一个方面涉及编码腺苷酸琥珀酸合成酶变体的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指作为核苷酸聚合物的具有超过特定长度的DNA或RNA链，所述核苷酸聚合物为通过共价键连接的核苷酸单体的长链，更具体地，术语“多核苷酸”是指编码多肽变体的多核苷酸片段。

编码本公开的多肽变体的多核苷酸可以包括且不限于任何多核苷酸序列，只要其编码具有腺苷酸琥珀酸合成酶的活性的多肽变体。在本公开中，编码腺苷酸琥珀酸合成酶的氨基酸序列的基因是purA基因，且具体地，所述基因可以源自停滞棒杆菌，但不限于此。

具体地，由于密码子简并性或通过考虑其中能够表达多肽的微生物偏好的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内在所述多核苷酸的编码区中进行各种修饰。可以包括且不限于任何多核苷酸序列，只要其编码腺苷酸琥珀酸合成酶变体，其中SEQ IDNO:2的氨基酸序列中的第85个氨基酸被不同的氨基酸取代。

另外，通过在严格条件下与可以由已知基因序列(例如，与所述核苷酸序列的全部或部分互补的序列)制备的探针杂交，可以包括且不限于编码具有腺苷酸琥珀酸合成酶变体的活性的蛋白的任何序列，其中SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的第85个氨基酸被不同的氨基酸取代。

“严格条件”是指实现多核苷酸之间的特异性杂交的条件。此类条件在文献中详细描述(例如，J. Sambrook等人，同上)。所述严格条件可以包括具有高同源性或同一性的基因(例如，具有40%或更多、具体是90%或更多、更具体是95%或更多、又更具体是97%或更多、尤其具体是99%或更多同源性或同一性的基因)可以彼此杂交的条件；具有较低同源性或同一性的基因不能彼此杂交的条件；或作为Southern杂交的常见洗涤条件的条件(例如，对应于60℃、1× SSC、0.1% SDS；具体是60℃、0.1× SSC、0.1% SDS；更具体是68℃、0.1× SSC、0.1% SDS的盐浓度和温度，洗涤一次，具体是两次或三次)。

杂交需要两个核酸具有互补序列，尽管取决于杂交严格性，碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述可以彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括与整个序列互补的分离的核酸片段以及实质上相似的核酸序列。

具体地，可以使用包括在55℃的T_m下的杂交步骤的杂交条件且通过利用上述条件来检测具有同源性或同一性的多核苷酸。另外，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以根据目的由本领域技术人员适当地控制。

用于杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且变量是本领域众所周知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51, 11.7-11.8)。

在本公开中，编码腺苷酸琥珀酸合成酶变体的氨基酸序列的基因是purA基因，并且编码所述基因的多核苷酸与上面所解释的相同。

在本公开中，编码腺苷酸琥珀酸合成酶变体的多核苷酸也与上面所解释的相同。

如本文所用，术语“载体”是指含有编码靶多肽的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，所述核苷酸序列与适当的控制序列可操作连接，使得靶多肽在适当的宿主中表达。所述控制序列可以包括起始转录的启动子，控制此类转录的任何操纵子序列，编码mRNA上适当的核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译的终止的序列。在转化至适当的宿主后，所述载体可以独立于宿主基因组复制或发挥功能，或者可以整合至基因组本身中。

本公开中使用的载体可以没有具体限制，只要所述载体在宿主细胞中可复制，并且可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和细菌噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等，并且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。

在一个实施方案中，可以将编码靶多肽的多核苷酸通过用于染色体插入的载体插入染色体中。可以使用本领域已知的任何方法(例如通过同源重组)进行多核苷酸插入染色体，但所述方法不限于此。可以进一步包括用于证实载体插入染色体的选择标记。所述选择标记用于选择用载体转化的细胞(即，用于证实靶核酸分子的插入的存在)，并且可以使用能够提供可选择的表型(诸如耐药性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性和表面多肽的表达)的标记。在处理选择性试剂的情况下，只有能够表达选择标记的细胞才可以存活或表达其他表型性状，且因此可以容易地选择转化的细胞。

本公开的又另一个方面提供了通过含有腺苷酸琥珀酸合成酶变体或编码腺苷酸琥珀酸合成酶变体的多核苷酸产生嘌呤核苷酸的微生物。具体地，含有腺苷酸琥珀酸合成酶变体和/或编码腺苷酸琥珀酸合成酶变体的多核苷酸的微生物可以是通过使用含有多核苷酸的载体转化而制备的微生物，但微生物不限于此。

如本文所用，术语“转化”是指这样的过程：将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞，使得由所述多核苷酸编码的蛋白可以在宿主细胞中表达。转化的多核苷酸是否插入宿主细胞的染色体并位于其上或位于染色体外是无关紧要的，只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达。进一步，所述多核苷酸可以包括编码靶蛋白的DNA和RNA。所述多核苷酸可以以任何形式引入，只要可以将所述多核苷酸引入宿主细胞并在其中表达。例如，所述多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是包含其自主表达所需的所有元件的基因构建体。所述表达盒可以包含启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和可与所述多核苷酸可操作连接的翻译终止信号。所述表达盒可以呈进行自我复制的表达载体的形式。另外，可以将所述多核苷酸引入宿主细胞中，以便与宿主细胞中表达所需的序列可操作连接，但不限于此。

另外，术语“可操作连接”是指基因序列和启动子序列之间的功能性连接，所述启动子序列启动和介导编码本公开的靶多肽的多核苷酸的转录。

如本文所用，术语“包含多肽变体的微生物”或“包含腺苷酸琥珀酸合成酶变体的微生物”是指在天然具有弱IMP生产力或其亲本菌株不具有IMP生产力或XMP生产力的微生物中提供有IMP生产力或XMP生产力的微生物。具体地，所述微生物可以是表达在SEQ IDNO:2的氨基酸序列中包含至少一个氨基酸变异的腺苷酸琥珀酸合成酶变体的微生物，并且氨基酸修饰可以包括用不同的氨基酸取代从SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N-末端起的第85个氨基酸。另外，所述微生物可以是表达具有腺苷酸琥珀酸合成酶活性的多肽变体的微生物，其中SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的第85个氨基酸被不同的氨基酸取代，但微生物不限于此。

所述微生物可以是含有编码腺苷酸琥珀酸合成酶变体的多核苷酸的细胞或微生物，或用载体转化且能够表达腺苷酸琥珀酸合成酶变体的细胞或微生物。为了本公开的目的，宿主细胞或微生物可以是可以通过含有腺苷酸琥珀酸合成酶变体而表达嘌呤核苷酸的任何微生物。

在本公开中，术语“产生嘌呤核苷酸的微生物(microorganism producing purinenucleotides)”可以与“产生嘌呤核苷酸的微生物(purine nucleotide-producingmicroorganism)”或“具有嘌呤核苷酸生产力的微生物”互换使用。

对于本公开的目的，术语“嘌呤核苷酸”是指包括基于嘌呤的结构的核苷酸，例如IMP或XMP，但是嘌呤核苷酸不限于此。

在本公开中，术语“产生嘌呤核苷酸的微生物”可以是其中已发生遗传修饰或对于产生期望的嘌呤核苷酸已增强活性的微生物，包括野生型微生物或其中天然或人工遗传修饰已发生的微生物，并且所述微生物可以是其中由于原因诸如插入外源基因、内源基因的活性增强或失活等而增强或弱化特定机制的微生物。对于本公开的目的，产生嘌呤核苷酸的微生物的特征在于，其通过含有腺苷酸琥珀酸合成酶变体而具有期望的嘌呤核苷酸的增加生产力，且具体地，所述微生物可以是棒杆菌属的微生物。具体地，产生嘌呤核苷酸的微生物或具有嘌呤核苷酸生产力的微生物可以是其中参与嘌呤核苷酸生物合成途径的一部分基因被增强或弱化或者参与嘌呤核苷酸降解途径的一部分基因被增强或弱化的微生物。例如，所述微生物可以是其中编码磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶的purF的表达增强或编码对应于IMP降解途径的肌苷-5'-单磷酸脱氢酶的guaB的表达弱化的微生物，但所述微生物不限于此。

如本文所用，术语“产生5'-嘌呤核苷酸的棒杆菌属的微生物”是指天然或通过修饰而具有嘌呤核苷酸生产力的棒杆菌属的微生物。具体地，如本文所用，具有嘌呤核苷酸生产力的棒杆菌属的微生物可以是棒杆菌属的微生物，其通过增强或弱化编码腺苷酸琥珀酸合成酶的purA基因的活性而具有提高的嘌呤核苷酸生产力。更具体地，如本文所用，具有嘌呤核苷酸生产力的棒杆菌属的微生物可以是棒杆菌属的微生物，其通过包含本公开的腺苷酸琥珀酸合成酶变体或编码其的多核苷酸或通过用包含编码腺苷酸琥珀酸合成酶变体的多核苷酸的载体转化而具有提高的嘌呤核苷酸生产力。“具有提高的嘌呤核苷酸生产力的棒杆菌属的微生物”意指与转化前的其亲本菌株或未变异的微生物相比具有提高的嘌呤核苷酸生产力的微生物。“未变异的微生物”是指野生型菌株本身，不包含产生嘌呤核苷酸的蛋白变体的微生物，或未用含有编码腺苷酸琥珀酸合成酶变体的多核苷酸的载体转化的微生物。

如本文所用，“棒杆菌属的微生物”可以具体地是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)等，但所述微生物不限于此。

本公开的又另一个方面提供了制备嘌呤核苷酸的方法，其包括在培养基中培养产生嘌呤核苷酸的棒杆菌属的微生物；和从微生物或培养基回收嘌呤核苷酸。

在上述方法中，培养微生物可以通过已知的分批培养、连续培养、补料分批培养等进行，但培养方法不具体限于此。具体而言，培养条件可以没有具体限制，但可以使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)调节最佳pH(例如，pH 5至pH 9，具体是pH 6至pH 8，并且最具体是pH 6.8)，并且可以通过向培养物中添加氧气或含氧气体混合物来维持需氧条件。培养温度可以维持在20℃至45℃，且具体在25℃至40℃，并且培养可以进行约10小时至约160小时，但所述条件不限于此。通过培养产生的5'-肌苷酸可以分泌至培养基中或可以保留在细胞内。

此外，在待使用的培养基中，作为碳源，糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇类(例如，甘油和乙醇)、有机酸(例如，乙酸)等可以单独或组合使用，但碳源不限于此。作为氮源，含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等可以单独或组合使用，但氮源不限于此。作为磷源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、与其对应的含钠盐等可以单独或组合使用，但磷源不限于此。另外，所述培养基还可以包含必需的生长促进物质，诸如其他金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。

回收在本公开的培养步骤中产生的嘌呤核苷酸的方法是根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养物收集期望的嘌呤核苷酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物回收期望的嘌呤核苷酸。

另外，所述回收步骤可以包括纯化过程。可以使用本领域已知的适当方法进行纯化过程。因此，回收的嘌呤核苷酸可以是纯化形式或包含嘌呤核苷酸的微生物发酵液(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008)。

[发明的有利效果]

当产生嘌呤核苷酸的棒杆菌属的微生物使用本公开的腺苷酸琥珀酸合成酶变体时，可以以高产率产生嘌呤核苷酸。

[发明详述]

在下文中，将通过示例性实施方案详细地描述本公开。然而，对于本公开所属领域的技术人员将显而易见的是，这些示例性实施方案仅出于说明的目的而提供，并且不旨在限制本公开的范围。

实施例1：基于野生型的产生IMP的菌株的制备

棒杆菌属的野生型菌株完全不能产生IMP，或者即使可以，可能也仅产生非常少的量。因此，基于停滞棒杆菌ATCC6872制备产生IMP的菌株。更具体地，产生IMP的菌株通过增强编码磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase)(其为嘌呤生物合成的第一种酶)的purF基因的活性和弱化编码对应于IMP降解途径的5'-肌苷酸脱氢酶的guaB基因的活性来制备。

实施例1-1：purF-增强的菌株的制备

为了制备其中修饰purF基因的起始密码子的菌株，制备含有SEQ ID NO:3的purF基因的插入载体。为了将purF基因克隆至插入载体中，具体地，使用作为模板的停滞棒杆菌ATCC6872的基因组DNA和SEQ ID NO:4和5以及SEQ ID NO:6和7的引物进行PCR，30个循环：在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。使用作为模板的通过上述PCR获得的两个DNA片段和SEQ ID NO:4和72的引物再次进行PCR，30个循环：在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟，以获得DNA片段。获得的DNA片段用限制酶XbaI消化，并克隆至用同一酶消化的pDZ载体(韩国专利号10-0924065和国际公开号2008-033001)中。将因此制备的载体命名为pDZ-purF-g1a。

[表1]

将重组载体pDZ-purF-g1a通过电穿孔转化至停滞棒杆菌ATCC6872中，并在含有25mg/L卡那霉素的培养基上选择其中通过同源重组将载体插入基因组DNA的菌株。对选择的初始菌株进行二次交换，并对这些选择的菌株进行测序，且由此选择其中引入突变的期望菌株。将该菌株命名为ATCC6872::purF(g1a)菌株。

实施例1-2：guaB-弱化的菌株的制备

为了制备其中修饰guaB的起始密码子的菌株，制备含有SEQ ID NO:8的guaB基因的插入载体。为了将guaB基因克隆至插入载体中，具体地，使用作为模板的停滞棒杆菌ATCC6872的基因组DNA和SEQ ID NO:9和10以及SEQ ID NO:11和12的引物进行PCR。如实施例1-1中那样克隆PCR产物，并将制备的载体命名为pDZ-guaB-a1t。将载体引入ATCC6872::purF(g1a)，且最终选择其中引入上述突变的菌株。

将最终选择的基于野生型停滞棒杆菌ATCC6872的产生IMP的菌株命名为CJI2330。

[表2]

实施例1-3：CJI2330的发酵滴度测试

在将种子培养基(2 mL)分配至试管(直径: 18 mm)中之后，将管高压灭菌。接种ATCC6872和CJI2330中的每一种并在30℃下在振荡下孵育24小时并用作种子培养物。将发酵培养基(29 mL)分配至每个250 mL摇动锥形瓶中，并在121℃下高压灭菌15分钟。接种种子培养物(2 mL)至培养基中并培养3天。将培养条件调节至170 rpm，30℃，和pH 7.5。

在完成培养之后，通过HPLC (SHIMAZDU LC20A)测量IMP产生量，且培养结果如下表3中所示。以下结果表明purF-增强和guaB-弱化的菌株具有IMP生产力。

[表3]

- 种子培养基：1%葡萄糖，1%蛋白胨，1%肉提取物，1%酵母提取物，0.25%氯化钠，100 mg/L腺嘌呤，100 mg/L鸟嘌呤，pH 7.5

-发酵培养基：0.1%谷氨酸钠，1%氯化铵，1.2%硫酸镁，0.01%氯化钙，20 mg/L硫酸铁，20 mg/L硫酸锰，20 mg/L硫酸锌，5 mg/L硫酸铜，23 mg/L L-半胱氨酸，24 mg/L丙氨酸，8 mg/L烟酸，45 μg/L生物素，5 mg/L盐酸硫胺素，30 mg/L腺嘌呤，1.9%磷酸(85%)，2.55%葡萄糖，1.45%果糖

实施例2：腺苷酸琥珀酸合成酶弱化的变体的制备

为了发现能够提高嘌呤核苷酸生产力的腺苷酸琥珀酸合成酶变体，制备编码腺苷酸琥珀酸合成酶的purA基因的突变体文库。

实施例2-1：含有purA基因的载体的制备

为了制备purA基因的突变体文库，首先制备含有purA基因的重组载体。使用作为模板的停滞棒杆菌ATCC6872的基因组DNA和SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物进行PCR，并使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物克隆至大肠杆菌载体pCR2.1中以获得pCR-purA。

[表4]

实施例2-2：purA基因的突变体文库的制备

基于实施例2-1中制备的载体制备purA基因的突变体文库。使用易错PCR试剂盒(Clontech Diversify® PCR随机诱变试剂盒)制备文库。在可以发生突变的条件下，使用SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物进行PCR。具体地，在可以发生每1000 bp 0至3个突变的条件下，在94℃下进行预热30秒，随后进行25个循环的94℃持续30秒和68℃持续1分30秒。对因此获得的PCR产物使用大引物(500 ng至125 ng)进行PCR，25个循环：95℃持续50秒，60℃持续50秒和68℃持续12分钟，用DpnI处理，并转化至大肠杆菌DH5α中，并在含有卡那霉素(25 mg/L)的LB固体培养基上涂布。在选择20种不同转化菌落之后，从其中获得质粒，并进行测序分析。结果证实，突变以2个突变/kb的频率在不同位点引入。收集约20,000个转化的大肠杆菌菌落并提取质粒，并命名为pTOPO-purA-文库。

[表5]

实施例3：制备的文库的评估和菌株的选择

实施例3-1：文库的评估

将实施例2-2中制备的pTOPO-purA-文库通过电穿孔转化至实施例1中制备的CJI2330菌株中，并将菌株涂布在含有25 mg/L卡那霉素的营养培养基上，以获得其中插入突变体基因的10,000个菌落。将每个菌落命名为CJI2330::pTOPO_purA(mt)1至CJI2330::pTOPO_purA(mt)10000。

- 营养培养基：1%蛋白胨，1%肉提取物，0.25%氯化钠，1%酵母提取物，2%琼脂，pH7.2

将获得的10,000个菌落各自接种于200 μL高压灭菌的种子培养基中，并在96-深孔板中使用微孔板振荡器(TAITEC)在30℃、1200 rpm下在振荡下培养24小时，并用作种子培养物。将高压灭菌的发酵培养基(290 μL)分配至96-深孔板中，并将20 μL每种种子培养物接种至其中，随后在与上述相同的条件下在振荡下培养72小时。

为了分析培养基中产生的5'-肌苷酸，在完成培养之后，将3 μL培养上清液转移至96-孔UV板中，其中每个孔含有197 μL蒸馏水，并使用微孔板阅读器振荡30秒，并使用分光光度计在25℃下测量270 nm处的吸光度。将吸光度与CJI2330菌株的吸光度进行比较，并选择显示吸光度的10%或更多增加的50个突变菌株菌落。与对照相比，其他菌落显示相似或降低的吸光度。

以与上述相同的方式测量50个所选菌株的吸光度，以重复检查5'-肌苷酸产生量。选择一种菌株，CJI2330::pTOPO_purA(mt)333，其与CJI2330菌株相比显示5'-肌苷酸生产力的显著提高。

为了证实所选突变体的有效性，进行发酵滴度测试。

将种子培养基(2 mL)分配至试管(直径: 18 mm)之后，将管高压灭菌。接种CJI2330和CJI2330::pTOPO_purA(mt)333每一者并在30℃下在振荡下孵育24小时并用作种子培养物。将发酵培养基(29 mL)分配至每个250 mL摇动锥形瓶中，并在121℃下高压灭菌15分钟。将种子培养物(2 mL)接种至培养基中并培养3天。将培养条件调节至170 rpm，30℃，和pH 7.5。

在完成培养之后，通过HPLC (SHIMAZDU LC20A)测量IMP产生量，且培养结果如下表6中所示。

[表6]

如从以上结果可见，证实了在其中载体含有purA基因突变的菌株中的IMP的量与CJI2330菌株相比增加约122%。因此，确定文库中选择的突变是有效的。

实施例3-2：purA变异的证实

为了证实突变菌株的基因变异，使用SEQ ID NO:17和18的引物在CJI2330::pTOPO_purA(mt)333菌株中进行PCR，并对PCR产物进行测序，由此证实在purA基因中存在变异。

[表7]

具体地，证实CJI2330::pTOPO_purA(mt)333菌株的purA基因包含其中由SEQ IDNO:2代表的purA氨基酸序列的第85个氨基酸(即甘氨酸)被丝氨酸取代(即，第253个核苷酸‘g’被核苷酸‘a’取代)的变异。因此，在下文的实施例中，进行尝试以证实上述变异是否可以影响棒杆菌属的每种微生物中嘌呤核苷酸产生的量。

实施例4：源自ATCC6872的产生IMP的菌株中IMP产生的证实

制备源自ATCC6872的产生IMP的菌株，并将实施例3中证实的变异引入菌株中，并证实菌株的IMP生产力。

实施例4-1：源自ATCC6872的产生IMP的菌株的选择

为了制备源自ATCC6872菌株的产生IMP的菌株，将ATCC6872的培养物以10⁷个细胞/mL至10⁸个细胞/mL的密度悬浮于磷酸盐缓冲液(pH 7.0)或柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中，并在室温或32℃下用UV处理20分钟至40分钟以诱导突变。将菌株用0.85%盐水溶液洗涤两次，并在稀释之后涂布在含有1.7%琼脂的基本培养基上，所述培养基补充有适当浓度的提供抗性的物质，且由此获得菌落。将每个菌落在营养培养基中培养，且然后在种子培养基中培养24小时。在发酵培养基中培养每种菌落3至4天之后，选择显示出培养基中积累的IMP的优异产生的菌落。为了制备以高浓度产生IMP的菌株，通过进行对应程序以依次方式提供腺嘌呤-营养缺陷型、鸟嘌呤-泄漏型、溶菌酶敏感性、3,4-脱氢脯氨酸抗性、链霉素抗性、磺胺胍抗性、正缬氨酸抗性、和三甲氧苄二氨嘧啶抗性。作为结果，最终选择提供有对上述物质的抗性并具有优异IMP生产力的CJI2335菌株。比较CJI2332菌株的抗性与ATCC6872的抗性且结果显示于下表8中。

[表8]

-基本培养基：2%葡萄糖，0.3%硫酸钠，0.1%磷酸二氢钾，0.3%磷酸氢二钾，0.3%硫酸镁，10 mg/L氯化钙，10 mg/L硫酸铁，1 mg/L硫酸锌，3.6 mg/L氯化锰，20 mg/L L-半胱氨酸，10 mg/L泛酸钙，5 mg/L盐酸硫胺素，30 μg/L生物素，20 mg/L腺嘌呤，20 mg/L鸟嘌呤，调节至pH 7.3。

实施例4-2：CJI2332的发酵滴度测试

在将种子培养基(2 mL)分配至试管(直径: 18 mm)中之后，将管高压灭菌。接种ATCC6872和CJI2332每一者并在30℃下在振荡下孵育24小时并用作种子培养物。将发酵培养基(29 mL)分配至每个250 mL摇动锥形瓶中，并在121℃下高压灭菌15分钟。将种子培养物(2 mL)接种至培养基中并培养3天。将培养条件调节至170 rpm，30℃，和pH 7.5。

在完成培养之后，通过HPLC (SHIMAZDU LC20A)测量IMP产生量，且培养结果如下表9中所示。

[表9]

实施例4-3：含有purA变异的插入载体的制备

为了将实施例3中选择的变异引入菌株，制备插入载体。用于制备用于引入purA(G85S)变异的载体的方法如下。使用作为模板的CJI2330::Topo_purA(G85S)和SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物进行PCR。如下进行PCR：在94℃下变性5分钟；20个循环的在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下聚合1分钟；在72℃下聚合5分钟。将因此获得的基因片段各自用XbaI消化。将每个基因片段使用T4连接酶克隆至用XbaI消化的线性pDZ载体中，且由此制备pDZ-purA(G85S)载体。

[表10]

实施例4-4：将变体引入源自ATCC6872的CJI2330和CJI2332菌株及其评估

将purA变异引入实施例1中制备的源自野生型的产生IMP的CJI2330菌株和实施例4-1中选择的CJI2332菌株中的每一种中，并评估每种菌株产生的IMP的量。为了证实purA基因中存在变异，通过PCR扩增CJI2332菌株的染色体DNA。具体地，首先，使用作为模板的CJI2332菌株的染色体DNA和SEQ ID NO:17和18的引物通过PCR扩增purA基因片段，其中通过28个循环的在94℃下变性1分钟；在58℃下退火30秒和在72℃下聚合2分钟使用Taq DNA聚合酶进行PCR。使用相同的引物分析扩增的purA片段的核苷酸序列，并且作为结果，证实CJI2332菌株的purA基因中没有变异。

然后，将pDZ-purA(G85S)载体转化至CJI2330菌株和CJI2332菌株中，并在含有卡那霉素(25 mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入基因组DNA上的菌株。对选择的初始菌株进行二次交换，且由此选择其中引入靶基因的变异的菌株。为了证实在期望的转化菌株中引入基因变异，使用SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物进行PCR，并通过序列分析证实PCR产物。作为结果，证实了将基因变异引入菌株中。将因此制备的菌株分别命名为CJI2330::purA(G85S)和CJI2332::purA(G85S)。

评估了CJI2330、CJI2332、CJI2330::purA(G85S)和CJI2332::purA(G85S)菌株各自的IMP生产力。在完成培养之后，通过使用HPLC的方法测量每种菌株的IMP产生量，且培养结果显示于下表11中。

[表11]

在上述结果中，证实其中引入purA基因变异的菌株显示与源自野生型的产生IMP的CJI2330和CJI2332菌株相比IMP产生量分别增加约122%和约116%。

根据布达佩斯条约的规定，CJI2332菌株在2018年6月22日保藏在Korean CultureCenter of Microorganisms (KCCM)，并指定检索号KCCM12277P。另外，根据布达佩斯条约的规定，制备的CJI2332::purA(G85S)菌株，也称为CJI2348，在2018年6月22日保藏在KCCM，并指定检索号KCCM12280P。

实施例5：证实通过purA基因变异的5'-黄苷酸生产力

实施例5-1：源自ATCC6872的产生XMP的菌株的选择

为了制备源自ATCC6872的产生5'-黄苷一磷酸(XMP)的菌株，将停滞棒杆菌ATCC6872菌株以10⁷个细胞/mL至10⁸个细胞/mL的密度悬浮于磷酸盐缓冲液(pH 7.0)或柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中，并在室温或32℃下用UV处理20分钟至40分钟以诱导突变。将菌株用0.85%盐水溶液洗涤两次，且在稀释之后，涂布在含有1.7%琼脂的基本培养基上，所述培养基补充有适当浓度的提供抗性的物质，且由此获得菌落。将每个菌落在营养培养基中培养，且然后在种子培养基中培养24小时。在发酵培养基中培养各菌落3至4天之后，选择显示出培养基中积累的XMP的优异产生的菌落。具体地，菌株选自可以在其中根据浓度添加氟色氨酸的培养基(添加培养基)中生长的那些，且更具体地，选自可以在氟色氨酸浓度为100mg/L的培养基中生长且具有提高浓度的5'-黄苷酸的那些。将选择的菌株命名为CJX1664。

-基本培养基：葡萄糖20 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，尿素2 g/L，硫酸铵3 g/L，硫酸镁1 g/L，氯化钙100 mg/L，硫酸铁20 mg/L，硫酸锰10 mg/L，硫酸锌10 mg/L，生物素30 μg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，硫酸铜0.8 mg/L，腺嘌呤20 mg/L，鸟嘌呤20 mg/L，pH 7.2

-添加培养基：其中将浓度为10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、70 mg/L、100 mg/L和200mg/L的氟色氨酸添加至基本培养基的培养基

CJX1664菌株的生物化学特征显示于下表12中。参见表12，CJX1664菌株可以在其中以100 mg/L的浓度添加氟色氨酸的添加培养基中生长。

[表12]

实施例5-2：CJX1664发酵滴度测试

在将种子培养基(2 mL)分配至试管(直径:18 mm)中之后，将管高压灭菌。接种ATCC6872和CJX1664中的每一种并在30℃下在振荡下孵育24小时并用作种子培养物。将发酵培养基(29 mL)分配至每个250 mL摇动锥形瓶中，并在121℃下高压灭菌15分钟。将种子培养物(2 mL)接种至培养基中并培养3天。将培养条件调节至170 rpm，30℃，和pH 7.5。

在完成培养之后，通过HPLC (SHIMAZDU LC20A)测量的XMP产生量，且培养结果如下表13中所示。

[表13]

实施例5-3：将变体引入CJX1664菌株及其评估

为了证实实施例5-1中选择的CJX1664菌株的purA基因的变异的存在，通过PCR扩增CJX1664菌株的染色体DNA PCR。具体地，首先，使用作为模板的CJX1664菌株的染色体DNA和SEQ ID NO:17和18的引物通过PCR扩增purA片段，其中通过28个循环的在94℃下变性1分钟；在58℃下退火30秒和在72℃下聚合2分钟使用Taq DNA聚合酶进行PCR。使用相同的引物分析扩增的purA基因片段的核苷酸序列，并且作为结果，证实CJX1664菌株的purA基因中没有变异。

将实施例4-3中制备的载体转化至CJX1664菌株中，并在含有25 mg/L卡那霉素的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入基因组DNA上的菌株。对选择的初始菌株进行二次交换，且由此选择其中引入靶基因的变异的那些菌株。通过序列分析证实期望的转化菌株中基因变异的引入。

评估CJX1664和CJX1664::purA(G85S)菌株中每一种的XMP生产力。在完成培养之后，通过使用HPLC的方法测量每种菌株的XMP产生量，且培养结果显示于下表14中。

[表14]

如从上表14中可见，与CJX1664菌株(即基于ATCC6872的产生XMP的菌株)相比，CJX1664::purA(G85S)菌株显示出XMP产生量增加约109%。

根据布达佩斯条约的规定，CJX1664菌株在2018年7月6日保藏在Korean CultureCenter of Microorganisms (KCCM)，并指定检索号KCCM12285P。另外，根据布达佩斯条约的规定，制备的CJX1664::purA(G85S)菌株，也称为CJX1665，在2018年7月6日保藏在KCCM，并指定检索号KCCM12286P。

实施例6：用不同的氨基酸取代purA变异中的氨基酸

实施例6-1：用于在purA变异中插入氨基酸的载体的制备

通过上述实施例，证实purA(G85S)变异可以提高嘌呤核苷酸的生产力。在这方面，为了证实purA变异的位置重要性，检查用不同氨基酸取代第85个氨基酸对嘌呤核苷酸生产力的影响。制备用于插入purA(G85S)变异的载体的方法如下。使用实施例4中制备的pDZ-purA(G85S)载体作为骨架进行定点诱变。具体地，在以下条件下使用表15中所示的序列作为引物进行PCR：18个循环的在94℃下变性30秒、在55℃下退火30秒和在68℃下延伸12分钟。将获得的PCR产物用DpnI消化，转化至DH5α菌株中，并从其中获得菌落。通过已知的质粒提取方法获得因此获得的菌落的质粒，并且获得的质粒的信息显示于下表15中。

[表15]

[表16]

实施例6-2：其中根据purA变体的变异的位置将一个氨基酸用不同的氨基酸取代的菌株的制备以及5'-肌苷酸生产力的比较

将实施例6-1中制备的用于引入变体的18种载体中的每一种转化至CJI2332菌株中，并且在含有25 mg/L卡那霉素的培养基上选择其中通过同源重组将这些载体插入基因组DNA中的那些菌株。对选择的初始菌株进行二次交换，且由此选择其中引入靶基因的变异的那些菌株。为了证实在期望的转化菌株中引入基因变异，使用SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18的引物进行PCR，并通过序列分析证实PCR产物。根据插入的变异命名菌株，如表17中所示。

[表17]

通过以与实施例1中相同的方式培养菌株来分析5'-肌苷酸的浓度。

[表18]

参照上表18，证实含有purA的菌株(其中purA基因编码的氨基酸序列的第85个氨基酸被不同的氨基酸取代)与不含上述变异的其他菌株相比显示出IMP产生量的显著变化。也就是说，证实purA基因编码的氨基酸序列的第85个氨基酸是与嘌呤核苷酸的产生相关的变异的重要位置，并且当purA基因编码的氨基酸序列的第85个氨基酸用选自丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸取代时，具有变异的微生物可以显著增加嘌呤核苷酸的产生。

从前述内容，本公开所属领域的技术人员将能够理解，本公开可以以其他特定形式体现而不修改本公开的技术概念或本质特征。在这方面，本文公开的示例性实施方案仅用于说明目的，并且不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开不仅旨在涵盖示例性实施方案，而且还涵盖可以包括在由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的各种替代方案、修改、等同方案和其他实施方案。

Claims (7)

1.腺苷酸琥珀酸合成酶变体，其中从SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N-末端起第85个氨基酸被不同的氨基酸取代，其中所述不同的氨基酸选自丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

2.多核苷酸，其编码权利要求1的腺苷酸琥珀酸合成酶变体。

3.载体，其包含权利要求2的多核苷酸。

4.棒杆菌属的微生物，其通过包含权利要求1的腺苷酸琥珀酸合成酶变体或权利要求3的载体而产生嘌呤核苷酸。

5.根据权利要求4所述的微生物，其中所述棒杆菌属的微生物是停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)。

6.用于制备IMP、XMP或GMP的方法，其包括：

在培养基中培养权利要求4的棒杆菌属的微生物；和

从所述微生物或培养基回收IMP、XMP或GMP。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述棒杆菌属的微生物是停滞棒杆菌。