CN106906174A - 产肌苷的重组菌及其制备方法与应用 - Google Patents

产肌苷的重组菌及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种产肌苷的重组菌，所述重组菌相比于出发菌具有弱化的磷酸戊糖变位酶活性或失活的磷酸变位酶，所述出发菌是能够累积肌苷的菌株。发现了新的提高肌苷的发酵产量的改造靶点并构建了相应的重组菌，并证明了可显著提高重组菌的肌苷产量并降低副产物次黄嘌呤的积累量。

Description

产肌苷的重组菌及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及产肌苷的重组菌及其制备方法与应用。
背景技术
肌苷，即次黄嘌呤核糖核苷，由核糖与次黄嘌呤通过β糖苷键连接而成。肌苷的用途非常广泛，在食品行业中，肌苷是增鲜剂肌苷酸二钠合成的前体；在医药行业中，肌苷及其衍生物是多种抗病毒药物，如利巴韦林、无环鸟苷等合成的中间体，受到医药界的极大重视。此外，肌苷还被用于农业、化工和营养保健等行业。
肌苷的生产方法主要有核糖核酸(RNA)水解法和微生物发酵法。其中，微生物发酵法由于生产成本低、能耗低、生产周期短、控制容易且产量大等优点，已成为目前工业生产肌苷的主要方法。微生物发酵法最常采用物理或化学诱变获得的枯草芽胞杆菌、产氨短杆菌和短小芽胞杆菌等的突变株发酵生产肌苷。该方法获得的菌株会积累大量的负效应突变，导致菌株生长缓慢、环境耐受性降低以及营养需求增高等问题。这些缺陷限制了菌株的工业化应用，因此亟需通过代谢工程改造的方法构建遗传背景清楚的肌苷高产菌株。
迄今为止，从遗传背景清楚的菌株出发从头构建肌苷生产菌的报道有三篇。2007年，研究者在已经失活了purA、deoD、purF、purR、add、edd、pgi和xapA等多个基因的大肠杆菌W3110中过表达脱敏的prs和purF基因，经72h发酵得到了7.5g/L的肌苷(Shimaoka,M.,et al.2007"Effect ofamplification of desensitized purF and prs on inosine accumulation inEscherichia coli."Journal of Bioscience and Bioengineering 103(3):255-261.)。2010年，Asahara等以枯草芽胞杆菌168为研究对象对肌苷生产菌的构建进行了研究。首先将编码腺苷酸琥珀酸合成酶purA和肌苷酸脱氢酶guaB的两个基因失活，然后将两个编码嘌呤核苷磷酸化酶的基因punA和deoD失活。为加强嘌呤核苷的合成，破坏了嘌呤操纵子阻遏蛋白purR和5’-UTR(5’-非翻译区)。最后对嘌呤操纵子的启动子进行了优化，发酵72h，肌苷产量达到6g/L(Asahara,T.,et al.2010."Accumulation of gene-targetedBacillus subtilis mutations that enhance fermentative inosine production."Applied Microbiology and Biotechnology 87(6):2195-2207)。2011年，李昊剑等以枯草芽胞杆菌W168为出发菌株，通过敲除purA基因和deoD基因构建得到一株肌苷工程菌，发酵72h，肌苷产量达到了7.6g/L(Li,H.,et al.2011."De novo engineering and metabolic flux analysis of inosine biosynthesisin Bacillus subtilis."Biotechnology Letters 33.8:1575-1580)。以上代谢工程改造涉及了肌苷代谢网络的前体合成途径、分支代谢途径和分解代谢途径等多个方面，但肌苷最高产量仅为7.6g/L，与实现工业化应用存在较大差距。
阻断肌苷分解途径是肌苷生产菌株构建的策略之一。嘌呤核苷磷酸化酶能将肌苷分解为核糖1-磷酸和次黄嘌呤。肌苷发酵中常用的枯草芽胞杆菌中存在两种嘌呤核苷磷酸化酶，分别由deoD和pupG(又称punA)基因编码。这两种酶的底物偏好性有所不同：deoD编码的嘌呤核苷磷酸化酶主要以腺苷为底物，而pupG编码的嘌呤核苷磷酸化酶主要以肌苷、鸟苷和黄苷为底物。本发明人前期的研究结果证实在purA缺失基础上单独敲除pupG基因的菌株仍具有部分的肌苷分解活性，而在此基础上敲除deoD基因会导致菌株生长缓慢，导致菌株的肌苷产量下降。
发明内容
本发明提供了一种产肌苷的重组菌及其制备方法与应用，发现了新的提高肌苷的发酵产量的改造靶点并构建了相应的重组菌，并证明了可显著提高重组菌的肌苷产量并降低副产物次黄嘌呤的积累量。
本发明的一个方面，提供一种产肌苷的重组菌，所述重组菌相比于出发菌具有弱化的磷酸戊糖变位酶活性或失活的磷酸变位酶，所述出发菌是能够累积肌苷的菌株。
以上所述的重组菌，其中，所述具有失活的磷酸戊糖变位酶具体为以下任一种情况：
(1)全部或部分缺失磷酸戊糖变位酶编码基因的开放性阅读框；
(2)磷酸戊糖变位酶编码基因进行了无义突变；
(3)缺失磷酸戊糖变位酶编码基因的启动子区。
以上所述的重组菌，其中，所述具有弱化的磷酸变位酶具体为所述出发菌的磷酸戊糖变位酶基因的表达调控元件替换为具有更弱表达调控活性的元件。
以上所述的重组菌，其中，所述磷酸戊糖变位酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No:4中第1-1182位所示，所述磷酸戊糖变位酶的氨基酸序列为SEQ ID No:5所示。
以上所述的重组菌，其中，所述出发菌为腺苷酸琥珀酸合成酶活性降低的细菌。
以上所述的重组菌，其中，所述细菌为选自芽胞杆菌属和短杆菌属的细菌，优选为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，更优选为枯草芽胞杆菌W168(B.subtilis W168)菌株。
本发明的另一个方面，提供一种构建产肌苷的重组菌的方法，其中，包括如下步骤：失活或弱化出发菌中的磷酸戊糖变位酶，得到所述重组菌。
以上所述的构建生产肌苷的重组菌的方法，其中，所述失活出发菌中的磷酸戊糖变位酶，通过如下(1)或(2)或(3)的步骤实现：
(1)全部或部分缺失磷酸戊糖变位酶编码基因的开放性阅读框；
(2)对磷酸戊糖变位酶编码基因进行无义突变；
(3)缺失磷酸戊糖变位酶编码基因的启动子区。
以上所述的构建生产肌苷的重组菌的方法，其中，所述弱化出发菌中的磷酸戊糖变位酶，通过将所述出发菌的磷酸戊糖变位酶基因的表达调控元件替换为具有更弱表达调控活性的元件。
以上所述的构建生产肌苷的重组菌的方法，其中，所述出发菌为腺苷酸琥珀酸合成酶活性降低的细菌。
以上所述的构建生产肌苷的重组菌的方法，其中，所述细菌为选自芽胞杆菌属和短杆菌属的细菌，优选为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，更优选为枯草芽胞杆菌W168(B.subtilis W168)菌株。
本发明的再一个方面，提供一种利用以上任一所述的重组菌生产肌苷的方法。
本发明所用的染色体基因敲除和定点突变的方法是采用枯草芽胞杆菌无痕遗传操作的通用型载体pWYE486，通过携带改造靶基因的同源臂，发生同源重组实现的。
本发明通过在可积累肌苷的出发菌中弱化或失活drm基因构建重组菌，使重组菌的肌苷产量显著提高且副产物次黄嘌呤的积累量显著降低，实验证明，摇瓶发酵72小时后，各工程菌的肌苷产量均在14.00g/L左右，较drm基因弱化或失活前产量提高22倍以上，而副产物次黄嘌呤的积累量下降至0.30g/L以下。从而在实践上可将本发明的重组菌用于发酵生产肌苷，提高生产效率的同时也便于肌苷的分离提纯，适于推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例中使用的枯草芽胞杆菌无痕遗传操作的通用型载体pWYE486结构示意图；
图2为本发明实施例2中肌苷工程菌IR-1中purA基因敲除PCR鉴定电泳图；
图3为本发明实施例3中肌苷工程菌IR-2中drm基因敲除PCR鉴定电泳图；
图4为本发明实施例4中肌苷工程菌IR-3中drm基因无义突变测序结果比对图；
图5为本发明实施例5中肌苷工程菌IR-4中drm基因启动子区敲除PCR鉴定电泳图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验。
本文提及的“出发菌”是指用于本发明基因改造策略的初始菌株。该菌株可以是天然存在的菌株，也可以是通过诱变或遗传工程改造等方式选育的菌株。为构建用于生产肌苷的重组菌，所述出发菌优选为可积累该种肌苷的菌株。
“表达调控元件”是指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控元件包含可操作地连接目的核苷酸序列的启动子和终止信号。通常它们也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。
“启动子区”指编码区域上游非翻译的DNA序列，其包含RNA聚合酶的结合位点，并起始DNA的转录。启动子区域也可以包含作为基因表达调节物的其它元件。
“开放性阅读框”是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。
“无义突变”是指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。
实施例1.构建枯草芽胞杆菌的无痕遗传操作载体pWYE486
(1)构建携带PliaG-relE-relB基因的重组质粒pWYE448
以枯草芽胞杆菌W168(购自美国Bacillus Genetic Stock Center，货号1A308)基因组DNA为模板，P1/P2为引物PCR扩增PliaG启动子基因(片段1)；以大肠杆菌W3110(购自美国Coli Genetic Stock Center，货号4474)基因组DNA为模板，P3/P4为引物扩增毒素蛋白relE基因(片段2)；以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，P5/P6为引物扩增抗毒素蛋白relB基因(片段3)。PCR扩增结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，以片段1、片段2、片段3作为模板，P1/P6为引物进行重叠延伸聚合酶链(SOE-PCR)反应，扩增得到PliaG-relE-relB；以片段2和片段3作为模板，P7/P8为引物，扩增得到片段4。
PCR扩增结束后，将得到的片段4进行琼脂糖凝胶回收后，用限制性内切酶BamH I/Sac II进行酶切，与同样酶切的整合载体pAX01(含有红霉素和林可霉素抗性基因，购自美国Bacillus Genetic Stock Center，货号ECE137)进行连接，得到RelB-RelE毒素-抗毒素系统在枯草芽胞杆菌中的共表达元件(TCCRAS)。采用CaCl2法制备大肠杆菌EC135(菌种保藏号CGMCC NO.5925，专利号CN201210080124.6)感受态细胞，连接产物转入大肠杆菌EC135感受态细胞中，分别在加有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上筛选含有TCCRAS的枯草芽胞杆菌转化子。
以P1/P6为引物进行菌落PCR扩增，鉴定携带PliaG-relE-relB的转化子，得到大约668bp大小的目的条带的转化子为阳性，阳性转化子经质粒提取和质粒双酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中序列SEQ ID No:1所示的核苷酸插入载体pAX01中得到的重组质粒，命名为pWYE448。
(2)淀粉酶基因无痕敲除载体构建
以枯草芽胞杆菌W168基因组DNA为模板，以P9/P10为引物扩增淀粉酶基因amyE的上游同源臂，大小为516bp；以P11/P12为引物扩增淀粉酶基因amyE的下游同源臂，大小为766bp。PCR扩增结束后，将上述两个PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，并以回收的DNA产物作为模板，以P9/P12为引物进行SOE-PCR反应，将所得的PCR片段进行琼脂糖凝胶回收，并对其末端进行加A。
纯化加A反应结束的DNA片段，并与pMD19T-simple vector(购自于中国宝生物工程(大连)有限公司，货号6013)连接。采用CaCl2法制备大肠杆菌EC135感受态细胞，将连接产物转入大肠杆菌EC135感受态细胞中，并在加有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上筛选转化子。以P9/P12为引物进行菌落PCR鉴定，能够扩增得到片段大小为1282bp为阳性转化子。
利用限制性内切酶Cla I对质粒pWYE448进行酶切，琼脂糖凝胶回收获得大小约为3900bp的TCCRAS的基因片段。进一步提取上述阳性转化子的质粒DNA，用Cla I进行酶切，酶切产物纯化与同样酶切处理的TCCRAS的基因片段进行连接。连接产物转入到大肠杆菌EC135中，得到含有TCCRAS的amyE基因无痕敲除质粒，命名为pWYE469。
(3)芽胞杆菌无痕遗传操作质粒构建
利用限制性内切酶Kpn I对pWYE469进行酶切，琼脂糖凝胶回收获得大小约为6600bp的载体片段。将酶切获得的载体片段进行自连，得到可用于枯草芽胞杆菌无痕遗传操作的通用型载体pWYE486(图1)，该载体含有多克隆位点(Apa I、Nco I、Kpn I、Nhe I和Sph I等)、TCCRAS和红霉素抗性编码基因。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P1：TCCCCGCGGCAAAAATCAGACCAGACAAAAG(Sac II)(SEQID No:6)
P2：AAGAGCATTCACCACCTTTTCATTCATTCTATTATAAAGGAAAA(SEQ ID No:7)
P3：AAAGGTGGTGAATGCTCTTATGGCGTATTTTCTGGATTTTGACG(SEQ ID No:8)
P4：TGAACTCTGATCAGAGAATGCGTTTGACCGCCTCG(SEQ IDNo:9)
P5：CATTCTCTGATCAGAGTTCATCCAGCGTCACACGT(SEQ IDNo:10)
P6：GGAGGATCCATGGGTAGCATTAACCTGCGTAT(Bam HI)(SEQ ID No:11)
P7：TCGCAAGCTTAAAGGAGGAACCGAATGGGTAGCATTAAC(Hind III)(SEQ ID No:12)
P8：TTAAAAGCAAAGGAGGACAACCATGGCGTATTTTCTGGAT(SEQ ID No:13)
P9：GGGCCCACGCGTCCATGGGGTACCCGGCATTATGTTTGAATTT CC(Apa I-Mlu I-Nco I-Kpn I)(SEQ ID No:14)
P10：TTTGTCTGATTCAAACCGATGTGAAGACTGGAGAAT(SEQ ID No:15)
P11：ACATCGGTTTGAATCAGACAAAACTTTTCTCTTGC(SEQ IDNo:16)
P12：ATCGATGCATGCGCTAGCGGTACCCATCTACAATTTGGTCCAG CTCCT(Cla I-Sph I-Nhe I-Kpn I)(SEQ ID No:17)
实施例2.肌苷底盘工程菌IR-1的构建
为阻断肌苷合成的分支代谢途径腺苷合成支路，将从肌苷酸(Inosinemonophosphate，IMP)向腺苷合成分支的第一个关键酶腺苷酸琥珀酸合成酶(Adenylosuccinate synthetase，EC：6.3.4.4)编码基因purA基因失活。
以枯草芽胞杆菌W168基因组DNA为模板，以P13/P14为引物PCR扩增purA基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)上游同源臂，大小为611bp；以P15/P16为引物扩增purA基因下游同源臂，大小为650bp。PCR扩增结束后，将上述两个PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，并以回收的DNA产物作为模板，以P13/P16为引物进行SOE-PCR反应，扩增得到purAUD。将所得的PCR片段进行琼脂糖凝胶回收，用限制性内切酶Kpn I和Sph I进行酶切，与同样酶切的pWYE486连接。连接产物采用化学转化法转入大肠杆菌EC135，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并进行质粒双酶切鉴定，以进一步确定目的片段成功与载体连接。Kpn I和Sph I双酶切重组质粒，其产物大小与理论值(1261bp)相一致，经进一步序列测定验证，重组质粒pWYE486-purAUD构建成功。
将序列测定正确的同源重组质粒电转化至枯草芽胞杆菌W168中，在含有1％木糖和MLS抗生素(红霉素0.5μg/mL，林肯霉素12.5μg/mL)的LB平板上正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过反向筛选，得到发生第二次同源重组的阳性菌落。对构建的突变菌株进行PCR扩增鉴定(图2)，同时纯化PCR产物进行序列测定和分析，以进一步确定重组子的正确性，获得的菌株命名为IR-1。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P13：CGGGGTACCGTCTTTTCAAGCAGCACA(Kpn I)(SEQ IDNo:18)
P14：TATTCGCGTCCGACCATGTCCGTGCACCTCCG(SEQ ID No:19)
P15：GGTGCACGGACATGGTCGGACGCGAATATGGA(SEQ IDNo:20)
P16：ACATGCATGCATGGCTCTTAAAGATGTCG(Sph I)(SEQ IDNo:21)
实施例3.肌苷工程菌IR-2的构建
磷酸戊糖变位酶催化从(脱氧)核糖1-磷酸到(脱氧)核糖5-磷酸的反应。为阻断肌苷分解途径，将IR-1菌株中编码磷酸戊糖变位酶(氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示)的drm基因进行无痕敲除(删除其开放阅读框)。
以枯草芽胞杆菌W168基因组DNA为模板，以P17/P18为引物PCR扩增drm基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)上游同源臂，大小为700bp；以P19/P20为引物扩增drm基因下游同源臂，大小为561bp。PCR扩增结束后，将上述两个PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，并以回收的DNA产物作为模板，以P17/P20为引物进行SOE-PCR反应，扩增得到drmUD。将所得的PCR片段进行琼脂糖凝胶回收，用限制性内切酶Nhe I进行酶切，与经同样酶切处理并去磷酸化的pWYE486连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并进行质粒酶切鉴定，以进一步确定目的片段成功与载体连接。Nhe I酶切重组质粒，其产物大小与理论值(1261bp)相一致，经进一步序列测定验证，重组质粒pWYE486-drmUD构建成功。
将序列测定正确的同源重组质粒电转化至底盘菌IR-1中，在含有1％木糖和MLS抗生素的LB平板上正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过反向筛选，得到发生第二次同源重组的阳性菌落。对构建的突变菌株进行PCR扩增鉴定(图3)，同时纯化PCR产物进行序列测定和分析，以进一步确定重组子的正确性。获得的菌株命名为IR-2。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P17：CTAGCTAGCGAGCGGTTATTGGACACG(Nhe I)(SEQ IDNo:22)
P18：ATTCTGTCCTTCAACTTGAAAGCCTCCTTTTT(SEQ ID No:23)
P19：AGGAGGCTTTCAAGTTGAAGGACAGAATTGAA(SEQ IDNo:24)
P20：CTAGCTAGCTCCTGTCACAGCAGTGTA(Nhe I)(SEQ IDNo:25)
实施例4.肌苷工程菌IR-3的构建
本实施例与实施例3的区别在于drm基因的失活方式由删除其阅读框改为在其阅读框中引入终止密码子，具体为将drm基因的第117位密码子由GAG突变为终止密码子TAG，这样drm基因转录生成的mRNA会在翻译到该突变密码子时终止翻译，形成一条不完整的多肽链，导致其编码的磷酸戊糖变位酶失活。
以枯草芽胞杆菌W168基因组DNA为模板，P17/P21为引物PCR扩增drm基因上游同源臂，大小为1049bp；P22/P20为引物扩增drm基因下游同源臂，大小为1409bp；PCR扩增结束后，将上述两个PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，并以回收的DNA产物作为模板，P17/P20为引物进行SOE-PCR反应，扩增得到drm*。将所得的PCR片段进行琼脂糖凝胶回收，用限制性内切酶Nhe I进行酶切，与经同样酶切处理并去磷酸化的pWYE486连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并进行质粒酶切鉴定，以进一步确定目的片段成功与载体连接。Nhe I酶切重组质粒，其产物大小与理论值(2458bp)相一致，经进一步序列测定验证，重组质粒pWYE486-drm*构建成功。
将序列测定正确的同源重组质粒电转化至IR-1中，在含有1％木糖和MLS抗生素的LB平板上正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过relE致死反向筛选，得到发生第二次同源重组的阳性菌落。对构建的突变菌株进行PCR扩增，并将其产物进行序列测定和分析(图4)，以进一步确定重组子的正确性。获得的菌株命名为IR-3.
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P21：TCTTTTCCAGCTATTGAAGCAATTCATCA(SEQ ID No:26)
P22：GAATTGCTTCAATAGCTGGAAAAGAGATC(SEQ ID No:27)
实施例5.肌苷工程菌IR-4的构建
本实施例与实施例3、4的区别在于失活drm基因的方式为将drm基因的启动子区和5’端删除，该方法的结果会导致drm及与其位于同一操纵子的编码嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase，EC 2.4.2.1)的pupG基因同时失活。
以枯草芽胞杆菌W168基因组DNA为模板，以P23/P24引物PCR扩增drm基因上游同源臂，大小为622bp；以P25/P26为引物扩增drm基因下游同源臂，大小为594bp；PCR扩增结束后，将上述两个PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，并以回收的DNA产物作为模板，P23/P26为引物进行SOE-PCR反应，扩增得到PdrmUD。将所得的PCR片段进行琼脂糖凝胶回收，用限制性内切酶Kpn I和Sph I进行酶切，与经同样双酶切处理的pWYE486连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并进行质粒酶切鉴定，以进一步确定目的片段成功与载体连接。Kpn I和Sph I双酶切重组质粒，其产物大小与理论值(1216bp)相一致，经进一步序列测定验证，重组质粒pWYE486-PdrmUD构建成功。
将序列测定正确的同源重组质粒电转化至IR-1中，在含有1％木糖和MLS抗生素的LB平板上正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过relE致死反向筛选，得到发生第二次同源重组的阳性菌落。对构建的突变菌株进行PCR扩增鉴定(图5)，同时纯化PCR产物进行序列测定和分析，以进一步确定重组子的正确性，获得的菌株命名为IR-4。
上述所用引物如下：
P23：CGGGGTACCGAGCGGTTATTGGACACG(Kpn I)(SEQ IDNo:28)
P24：CTCCCAGCGTATCCCCGTTGACAATGTATTTG(SEQ ID No:29)
P25：ACATTGTCAACGGGGATACGCTGGGAGAAGAT(SEQ IDNo:30)
P26：ACATGCATGCCCTTCAACAGTA(Sph I)(SEQ ID No:31)
实施例6.肌苷工程菌的摇瓶发酵实验
对工程菌IR-1、IR-2、IR-3、IR-4与枯草芽胞杆菌W168在相同条件下进行500mL摇瓶发酵试验。
摇瓶发酵采用的发酵培养基具体如下：葡萄糖120g/L，味精10g/L，豆饼水解液50g/L，药用酵母粉14g/L，(NH4)2SO415g/L，MgSO4·7H2O 4g/L，K2HPO44g/L，MnSO40.005g/L，生物素0.1mg/L，FeSO40.01g/L，CaCO320g/L，pH 7.0。葡萄糖单独灭菌，115℃高压灭菌15min。MgSO4·7H2O单独灭菌，121℃高压灭菌20min。生物素采用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。其余组分在121℃高压灭菌20min。
活化斜面培养基具体如下：葡萄糖5g/L，味精5g/L，氯化钠5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0-7.2。121℃高压灭菌20min。
种子培养基具体如下：葡萄糖20g/L，味精10g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉20g/L，玉米浆5g/L，氯化钠2.5g/L，尿素l g/L，pH 7.2。葡萄糖单独灭菌，115℃高压灭菌15min。其余组分在121℃高压灭菌20min。
(1)种子液的获得
将上述实施例制备的工程菌IR-1、IR-2、IR-3、IR-4与枯草芽胞杆菌W168分别接种到活化斜面培养基中，37℃恒温静置培养20～24h。接一环生长良好的菌体至装有30mL种子培养基的500mL摇瓶中，置于旋转式摇床上，摇床转速为140rpm，培养温度为36℃，培养时间8～10h，得到种子液。
(2)发酵
将种子液按照体积百分含量为10％接种到发酵培养基(500mL挡板三角瓶装液量为30mL)中，36℃，220rpm，培养72h，间歇补加浓氨水控制发酵液的pH在7.0-7.2之间，根据残糖情况，补加浓度为500g/L的葡萄糖母液，控制发酵液残糖不低于5g/L。
收集发酵产物12000×g，离心5min，收集上清液。
(3)检测肌苷和次黄嘌呤的含量
采用高效液相色谱法(HPLC)，具体方法如下：取10μL上述上清液于990μL去离子水中，0.22μm无菌滤膜过滤后可进样，进样量为10μL。
所用色谱柱为SB-AQ反相色谱柱(ZORBAX SB-AQ，4.6×250mm，Agilent，USA)，以0.5％KH2PO4缓冲液(pH 4.5)-甲醇(90∶10，V/V)作流动相，在流速为1.0mL/min，色谱柱温度为33℃时，于紫外波长254nm处检测嘌呤核苷类标品和发酵液中的嘌呤核苷类物质含量。
以菌株枯草芽胞杆菌W168为对照，测定肌苷工程菌IR-1、IR-2、IR-3和IR-4摇瓶发酵72h时肌苷和副产物次黄嘌呤产量。
表1肌苷工程菌摇瓶发酵72h时肌苷和次黄嘌呤产量
菌株编号 基因型 肌苷(g/L) 次黄嘌呤(g/L)
WT W168 0.01±0.01 0.00±0.00
IR-1 W168ΔpurA 0.62±0.16 4.63±0.22
IR-2 W168ΔpurAΔdrm 13.98±0.41 0.26±0.07
IR-3 W168ΔpurAdrm* 14.47±0.55 0.21±0.06
IR-4 14.44±1.12 0.22±0.07
摇瓶发酵实验中，发酵72h，枯草芽胞杆菌W168几乎未检测到肌苷的积累，阻断了支路代谢途径的底盘菌IR-1的肌苷产量仅为0.62g/L，同时积累副产物次黄嘌呤4.63g/L。在此基础上进一步失活drm基因，不论其失活方式是开放阅读框删除(IR-2)、无义突变(IR-3)还是启动子删除(IR-4)，各工程菌的肌苷产量均在14.00g/L左右，较失活前产量提高22倍以上，而副产物次黄嘌呤的积累量下降至0.30g/L以下。实验结果表明，drm基因失活可以显著提高菌株的肌苷产量，同时有效降低副产物次黄嘌呤的积累。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (12)

1.一种产肌苷的重组菌，其特征在于，所述重组菌相比于出发菌具有弱化的磷酸戊糖变位酶活性或失活的磷酸变位酶，所述出发菌是能够累积肌苷的菌株。
2.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述具有失活的磷酸戊糖变位酶具体为以下任一种情况：
(1)全部或部分缺失磷酸戊糖变位酶编码基因的开放性阅读框；
(2)磷酸戊糖变位酶编码基因进行了无义突变；
(3)缺失磷酸戊糖变位酶编码基因的启动子区。
3.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述具有弱化的磷酸变位酶具体为所述出发菌的磷酸戊糖变位酶基因的表达调控元件替换为具有更弱表达调控活性的元件。
4.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述磷酸戊糖变位酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No:4中第1-1182位所示，所述磷酸戊糖变位酶的氨基酸序列为SEQ ID No:5所示。
5.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述出发菌为腺苷酸琥珀酸合成酶活性降低的细菌。
6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述细菌为选自芽胞杆菌属和短杆菌属的细菌，优选为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，更优选为枯草芽胞杆菌W168(B.subtilis W168)菌株。
7.一种构建产肌苷的重组菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：失活或弱化出发菌中的磷酸戊糖变位酶，得到所述重组菌。
8.如权利要求7所述的构建生产肌苷的重组菌的方法，其特征在于，所述失活出发菌中的磷酸戊糖变位酶，通过如下(1)或(2)或(3)的步骤实现：
(1)全部或部分缺失磷酸戊糖变位酶编码基因的开放性阅读框；
(2)对磷酸戊糖变位酶编码基因进行无义突变；
(3)缺失磷酸戊糖变位酶编码基因的启动子区。
9.如权利要求7所述的构建生产肌苷的重组菌的方法，其特征在于，所述弱化出发菌中的磷酸戊糖变位酶，通过将所述出发菌的磷酸戊糖变位酶基因的表达调控元件替换为具有更弱表达调控活性的元件。
10.如权利要求7所述的构建生产肌苷的重组菌的方法，其特征在于，所述出发菌为腺苷酸琥珀酸合成酶活性降低的细菌。
11.如权利要求10所述的构建生产肌苷的重组菌的方法，其特征在于，所述细菌为选自芽胞杆菌属和短杆菌属的细菌，优选为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，更优选为枯草芽胞杆菌W168(B.subtilis W168)菌株。
12.一种利用权利要求1至6中任一所述的重组菌生产肌苷的方法。
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