CN107475169A - 一种基于Ｉ型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法 - Google Patents

Abstract

本发明首次公开了一种基于Ｉ型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法，包括蛋白表达质粒、基因编辑质粒及基因编辑过程。原核生物中该双基因即可分开转录也可位于同一操纵子同时转录，故该方法对原核生物基因组可方便、灵活、有效地进行基因编辑；可望有效地应用于基础生物科学及制药、食品、农业等其它领域。

Description

一种基于I型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法

本发明涉及生物技术中的基因工程领域，确切地说是一种基于I型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中,是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统(李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞.CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J/OL].遗传,2013,35(11):1265-1273)。根据Cas基因序列及蛋白结构，可将CRISPR/Cas系统分为2类六型，目前可用于基因编辑只有是2类Ⅱ型(Cas9)及2类V型(Cpf1)Cas系统(P.Mohanraju,K.S.Makarova,B.Zetsche,F.Zhang,E.V.Koonin,J.van der Oost,Diverse evolutionary roots andmechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.Science 353,aad5147(2016))。

维吉尼亚链霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14)是我们实验室从制药厂的污泥中分离筛选得到的一株放线菌。对其全基因组测序分析发现：菌株IBL14中存在3个确定的CRISPR序列与一个临时命名的I-B-svi Cas系统。现已成功应用于IBL14自打靶基因组编辑(童望宇；雍德祥；李雪；邱彩花等一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法.CN201511002817.3；童望宇；李雪；雍德祥一种维吉尼亚链霉菌IBL14产青霉素重组菌株的构建方法.CN201510999333.4)和非自打靶基因组编辑(童望宇，许鑫，张雁，孙焰，曹素丽(20161207)一种维吉尼亚链霉菌IBL14type I-B-sv14型CAS基因编辑系统，CN201611113137.3；童望宇，邱彩花，杨兴旺，王安静一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，CN201611089333.1)。

基于cas7-5-3的原核生物的基因编辑方法本实验室已经报道(童望宇，邱彩花，杨兴旺，王安静等，一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，CN201611089333.1)。鉴于Cas5可能是一个参与crRNA加工和稳定的蛋白质，仅帮助Cas3对目标DNA进行专一性切割(G.Gasiunas,T.Sinkunas,V.Siksnys,Molecular mechanisms ofCRISPR-mediated microbial immunity.Cell Mol Life Sci 71,449-465(2014))。本实验室进一步研究发现：基于cas7-3的蛋白表达质粒plasmid-cas7-3，结合基因编辑质粒(plasmid-t/g-gene abbreviation)和/或其它质粒同样可在其它原核生物中实现非自打靶基因编辑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于I型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法，应用包含表达Cas7与Cas3的蛋白表达质粒和/或基因编辑质粒所组成的基因编辑工具应用于原核生物的基因编辑。

为达此目的，本发明解决其问题所采用的技术方案是：一种基于I型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法，其特征在于：该方法包括包含cas7与cas3两个基因所组成的蛋白表达质粒构建、基因编辑质粒的构建以及利用构建的蛋白表达质粒和/或基因编辑质粒形成基因编辑工具对原核生物进行基因编辑。

所述的一种基于I型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)蛋白表达质粒plasmid-cas7-3的构建

根据载体相关序列信息设计用于结合cas基因的引物，通过PCR反应扩增得到线性化克隆载体；根据维吉尼亚链霉菌IBL14中cas基因及相关信息序列设计引物(附表2)，以提取到的维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模板，通过PCR反应扩增得到末端带有与载体有15-25bp重叠区域及含有重叠区的cas7与cas3两个基因，并通过overlapPCR方式将cas7与cas3基因连接起来，最后再将overlapPCR产物通过一步法连接到线性质粒上，得到蛋白表达质粒plasmid-cas7-3；

(2)基因编辑质粒plasmid-t/g-gene abbreviation的构建

根据靶向基因DNA序列信息设计引物，以提取到的原核生物基因组为模板，通过PCR反应分别扩增得到末端带有限制性内切酶切割位点以及overlap PCR互补序列的靶向基因的上、下游同源臂片段，并用overlap PCR将上、下游同源臂片段结合起来构建基因编辑模板t-DNA，同时根据生物靶向基因序列信息设计并化学合成首尾分别含T7启动子和RNA终止子的靶向基因片段g-DNA，将t-DNA与g-DNA连接到质粒上得基因编辑质粒plasmid-t/g-gene abbreviation；

(3)基因编辑重组子的构建与检验

制备原核生物细胞感受态，并将按步骤(1)得到的plasmid-cas7-3和按步骤(2)得到的plasmid-t/g-gene abbreviation同时或分别转化到感受态细胞中得到候选的基因编辑的重组子，对重组子直接进行单克隆PCR或提取基因组PCR，并进一步通过基因测序，以确证编辑后的目的重组子。

所述原核生物指大肠杆菌、枯草杆菌或其它原核微生物。

所述的基因编辑是指利用基因编辑工具对染色体基因进行敲除、插入、无痕点突变及任意组合。

本发明提供了一种基于I型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法，首次实现了CRISPR-Cas I型系统中Cas7和Cas3对其它原核生物基因组的基因编辑。原核生物中该双基因即可分开转录也可位于同一操纵子同时转录，故该方法对原核生物基因组可方便、灵活、有效地进行基因编辑；可望有效地应用于生物科学及制药、食品、农业等其它应用领域。

附图说明

图1为蛋白表达质粒pcas-cas7-3的构建。Ori/origin：DNA复制起始位点；pSC101ori:pSC101质粒的复制起始位点；Rep101：基于基因RepA控制质粒pSC101复制拷贝数；araC/L-arabinose regulatory protein:阿拉伯糖调节蛋白；native cas9promoter，起始DNA转录；KanR/Kanamycin resistance：卡那霉素抗性；T₇terminator:T₇终止子，终止DNA转录，lacI/lactose repressor：编码乳糖阻遏蛋白；aBAD promoter/promoter of theL-arabinose operon of E.coli:大肠杆菌中受阿拉伯糖调控的araB启动子；exo,bet,gam基因：Red同源重组由λ噬菌体的exo，bet,gam3个基因组成，分别编码Exo、Beta、Gam3种蛋白质。

图2为转化子筛选与验证结果。(A)大肠杆菌JM109(DE3)蓝白斑筛选结果，黑色表明为原始菌株，白色表明为重组菌株；(B)基因lacZ外部PCR电泳图，泳道M：10037bp DNAladder，泳道1：野生菌对照，泳道2：质粒pcas-cas7-3和pKC1139-lacZ-t/g-DNA转化子的lacZ基因PCR产物。

具体实施方式

为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明，旨在更好的解释本发明的内容，以下实施例不限制本发明的保护范围。此外，在所列实施例中如无特别说明均采用如下材料：

1)菌株与质粒

维吉尼亚链霉菌Streptomyces virginiae IBL14/SV IBL14；大肠杆菌Escherichia coli DH5α/EC DH5α；Escherichia coli JM109/EC JM109；枯草杆菌Bacillus subtilis168/BS 168，质粒pCas，pKC1139。

2)培养基

LB液体培养基

酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加入适量蒸馏水溶解后，定容至1L，pH调至7.0～7.2，分装包扎后,121℃/20min灭菌。

LB固体培养基

酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂20g，加入适量蒸馏水溶解后,定容至1L，pH调至7.0～7.2，分装包扎后，121℃/20min灭菌。

Spizizen基本培养基

10×Spizzen基本盐培养基100mL/L，50％(w/v)葡萄糖10mL/L，色氨酸母液(5mg/mL)10m L/L，琼脂1.5％w/v)，121℃/20min灭菌。

GM1培养基(5mL)

40％葡萄糖100μl，20mg/mL酸水解酪素100μl，50mg/m L酵母抽提物100μl，20％(w/w)MgSO4.7H2O 5μl，10×Spizzen基本培养基500μl，水3195μl，上述物质混合前需121℃/20min灭菌。

GM2培养基(5mL)

40％葡萄糖100μl，20mg/mL酸水解酪素50μl，20％(w/w)MgSO4.7H2O40μl，10×Spizzen基本培养基500μl，水3310μl，上述物质混合前需121℃/20min灭菌。

所用试剂均为市售品。

实施例1双质粒一步共转化法敲除EC JM109lacZ基因

(1)蛋白表达质粒pCas-cas7-3的构建

根据SV IBL14全基因组测序信息及质粒pCas序列信息，设计带有质粒pCas互补序列的cas7，cas3基因特异性引物cas7-F和cas3-R及用于连接cas7，cas3基因的overlap PCR上下引物。提取SV IBL14基因组DNA，使用全式金生物技术有限公司生产的TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase进行cas7，cas3，以及线性质粒片段(pCas质粒片段)基因PCR扩增，反应条件：95℃5min，95℃20s，63℃30s，72℃1min，30个循环，72℃10min(pCas质粒片段扩增退火温度为60℃，延伸时间为5min，其余反应条件一样)。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的cas7，cas3基因及pCas线性质粒片段。通过overlapPCR将cas7，cas3基因连接起来，反应条件：95℃5min，95℃20s，63℃30s，72℃1min，30个循环，72℃10min。产物再经1％琼脂糖电泳检测回收，通过一步法将overlapPCR扩增得到的cas7-3基因序列与pCas线性质粒片段连接，得到pCas-cas7-3蛋白表达质粒，见图1。

(2)基因编辑质粒pKC1139-t/g-ΔlacZ的构建

(A)基因lacZ引物设计与lacZ全长基因的扩增

根据EC JM109基因组测序信息，设计基因lacZ特异性引物lacZ-F和lacZ-R。提取EC JM109基因组DNA，使用TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase进行lacZ基因PCR扩增，反应条件：95℃5min，95℃20s，52℃30s，72℃2min，30个循环，72℃10min。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的lacZ全长基因片段备用。

(B)上、下游同源臂的制备

根据lacZ基因全序列设计lacZ基因上游同源臂引物lacZ-UF和lacZ-UR、下游同源臂引物lacZ-DF和lacZ-DR，且上同源臂上游引物含BamHⅠ限制性内切酶酶切位点，下同源臂下游引物含HindⅢ限制性内切酶酶切位点。以纯化的lacZ基因DNA为模板，先分别扩增上、下游同源臂，反应条件为：95℃5min，95℃20s，58℃30s，72℃45s，，30个循环，72℃10min。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化后的上、下游同源臂DNA片段备用。

(C)基因编辑模板载体pKC1139-t-ΔlacZ的构建

取上同源臂纯化产物与下同源臂纯化产物各0.5μl混合作为模板，25μl反应体系进行overlap PCR，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性l min，58℃退火1min，72℃延伸30s，一个循环后加人引物UF与DR各1μl，继续PCR，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸45s，进行30个循环，72℃10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化，得基因编辑模板t-ΔlacZ；将获得的t-ΔlacZ通过BamHⅠ限制性内切酶酶、HindⅢ限制性内切酶切出粘性末端，然后通过全式金生物技术有限公司生产的T4连接酶将其连接到pKC1139质粒上，得基因编辑模版载体pKC1139-t-ΔlacZ。

t-ΔlacZ序列为：

其中波浪线为保护碱基。

(D)基因编辑质粒pKC1139-t/g-ΔlacZ的构建

含乳糖操纵子启动子的靶向基因片段g-lacZ由滁州通用生物公司化学合成，首尾分别加上BamHI及EcoRI酶切位点，中间依次是启动子，重复序列(repeat)，间隔序列(spacer)，重复序列(repeat)及终止子；将合成的靶向基因片段g-lacZ通过BamHI和EcoRI限制性内切酶切出粘性末端，然后通过T4连接酶将其连接到得基因编辑模版载体pKC1139-lacZ-t-DNA上得基因编辑质粒pKC1139-t/g-ΔlacZ。

靶向基因片段g-lacZ的序列为：

GGATCCtaatacgactcactatagggaatatt GAATTC其中大写字母为酶切位点，波浪线为保护碱基，单下划线为启动子promoter，斜体为spacer，黑体加粗为repeat，双下划线为终止子terminator。

(3)重组子的获取与检验

(A)EC JM109电转感受态一步法制备

在超净台中，用已灭过菌的牙签挑取平板上的EC JM109单克隆于30ml LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养；取过夜培养的菌液100μl转接至新的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养约2h，至菌液OD600值为0.5～1.0；取上述菌液至50ml EP管中，冰浴10-15min；4℃下5000rpm×g离心15min，除去上清液；取灭菌冰水35ml重悬细胞，之后按前述方法离心收集细胞沉淀，共四次；取已经在冰上预冷的10％甘油2ml将菌体沉淀吹打均匀，分装100μl/管即得EC JM109的电转感受态细胞，-80℃下保存备用(此过程全程在冰上进行)。

(B)质粒pCas-cas7-3与pKC1139-t/g-ΔlacZ的共转化

将质粒pCas-cas7-3与pKC1139-t/g-ΔlacZ各10μl充分混匀后转入80μl ECJM109电转感受态中，冰浴约5min，按照参数：2.5kv、2mm、电击1次，电击时间常数＞3ms进行电击，立即添加200μl LB液体培养基至电转杯中，将菌体混匀后转移至1.5ml EP管中，在30℃，200rpm摇床中培养45min，然后将菌液涂布在含有5μl异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG200mg/ml)、40μl 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal 20mg/ml)和20μl阿拉伯糖(10mM/L)的安普霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中30℃过夜培养，得候选的白色单克隆转化子，见图2(A)。

(C)重组子染色体PCR电泳及基因测序分析

提取白色单克隆基因作为模板，再以lacZ基因验证引物lacZ-UF/lacZ-R进行PCR扩增反应，反应条件：95℃5min，95℃20s，58℃30s，72℃140s，30个循环，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测(图2(B))及DNA测序分析，证明重组子正确。

各步骤所涉及的引物及其序列如表1所示，大写字母为酶切位点。

表1引物及其序列

实施例2二质粒两步法转化敲除EC JM109lacZ基因

(1)蛋白表达质粒pCas-cas7-3的构建

同实施例1步骤(1)。

(2)基因编辑质粒pKC1139-t/g-ΔlacZ的构建

同实施例1步骤(2)。

(3)重组子的获取与检验

(A)质粒pCas-cas7-3转化

除将8μl质粒pCas-cas7-3转化到92μl EC JM109电转感受态中,通过卡那霉素抗性筛选及质粒PCR电泳确证转化子外，其余同实施例1步骤(3)。

(B)质粒pKC1139-t/g-ΔlacZ的转化

除将8μl质粒pKC1139-t/g-ΔlacZ转化到92μl EC JM109-pCas-cas7-3电转感受态中，在涂有5μl IPTG、40μl X-gal和20μl阿拉伯糖的卡那霉素和安普霉素的LB固体培养基中30℃过夜培养，得候选转化子外，其余同实施例1步骤3(A)、3(B)。

(C)重组子染色体PCR电泳及基因测序分析

同实施例1步骤3(C)。

实施例3单质粒转化敲除EC JM109lacZ基因

(1)蛋白表达质粒pCas-cas7-3的构建

同实施例1步骤(1)。

(2)蛋白表达与基因编辑单质粒pCas-cas7-3-t/g-ΔlacZ的构建

除temple-DNA-ΔlacZ::cm靶基因片段含Cm基因外，其余步骤同实施例1中步骤(2)。

(3)重组子的获取与检验

(A)EC JM109电转感受态的制备

同实施例1步骤(3A)。

(B)质粒pCas-cas7-3-t/g-ΔlacZ的转化

除抗性平板仅含卡那霉素外，其余同实施例1步骤(3B)。

(C)重组子染色体PCR电泳和基因测序分析

除引物外，其余步骤同实施例1步骤(3C)。

各步骤所涉及的引物及其序列如表2所示。

表2引物及其序列

实施例4双质粒共转化敲除BS 168基因phoP

(1)蛋白表达质粒pHT304-cas7-3的构建

除将质粒改换成pHT304外，其余方法同实施例1步骤(1)。

(2)基因编辑质粒pKC1139-t/g-ΔphoP的构建

除根据基因phoP序列信息设计并合成t-ΔphoP、g-phoP及引物外，其它同实施例1步骤(2)。

合成的t-ΔphoP序列为：

其中波浪线为保护碱基。

合成的g-phoP序列为：

GGATCCtaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtg gaattgtgagcggataacaa GAATTC其中大写字母为酶切位点，波浪线为保护碱基，单下划线为启动子promoter，斜体为spacer，黑体加粗为repeat，双下划线为终止子terminator。

(3)重组子的获取与检验

(A)BS168感受态的制备

挑取BS168单克隆于5ml GM1培养基中，37℃，130rpm过夜培养。次日转接1ml于9mlGM1培养基中，37℃，200rpm培养3.5h。转接5ml GM1培养液于45ml GM2培养基中，37℃，130rpm培养1.5h。4℃，4000rpm，离心10min。留适量上清重悬细胞，分装到2ml EP管中得BS168感受态备用。

(B)质粒pHT304-cas7-3和pKC1139-phoP-t/g-DNA的共转化

将质粒pHT304-cas7-3和pKC1139-t/g-ΔphoP各8μl充分混匀后加入到制备好的84μl BS168感受态中，37℃静置1h，37℃，220rpm培养3-4h。吸取10-50μl菌液涂布到含有红霉素,安普霉素抗性的双抗LB培养基上，于37℃培养箱培养。

(C)重组子染色体PCR电泳和基因测序分析

除引物外，其余步骤同实施例1步骤(3C)。

各步骤所涉及的引物及其序列如表3所示，其中大写字母为酶切位点，波浪线为保护碱基。

表3引物及其序列

实施例5二质粒两步法转化敲除BS 168基因phoP

(1)蛋白表达质粒pHT304-cas7-3的构建

方法同实施例4步骤(1)。

(2)基因编辑质粒pKC1139-t/g-ΔphoP的构建

方法同实施例4步骤(2)。

(3)重组子的获取与检验

(A)质粒pHT304-cas7-3的转化

除将8μl pHT304-cas7-3质粒加入到制备好的92μl BS168感受态中，通过红霉素抗性筛选外，其余步骤同实施例4步骤(3)。

(B)质粒pKC1139-t/g-ΔphoP转化

除取8μl pKC1139-t/g-ΔphoP质粒加入到制备好的92μl BS168-pHT304-cas7-3感受态中，通过红霉素和安普霉素筛选得候选转化子外，其余同实施例4步骤(3A-B)。

(C)重组子染色体PCR电泳和基因测序分析

除引物外，其余步骤同实施例4步骤(3C)。

以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

序列表

<110> 安徽大学

<120> 一种基于Ｉ型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> S. virginiae IBL14

<400> 1

gtggtcgccg gtgccccgaa caacggggag ggcgaggaca acacggggcg tgtgaagaag 60

ctgagggtcg ggcgggagga gttcccgtac gtgtccgcgc aggcgttccg tcggtggttg 120

cgtgactcgc tgccggcgca ggagccgcgt tcggtggtca ctcgctcggg cagcggtgcc 180

aagcagcagg cacacaccgc gggccggccg gacctgcacc tggacgatga tctgttcggc 240

tacatggtcg cggtgaaggg gaagggggga agctaccagc gggacaccgt gctggctacc 300

gggactttag tttcagtggt gccgcagcgt ccgacgttgg acttcggcac gatgagccgg 360

gacttcccgg ctggtgagca cccggtgatt cactcgcacg agctgtacag cgcgaccctg 420

gccggcgatg ttctgctgga tctgccgcgg gctggggtct tcgagacgga cggcaacggg 480

ttgcgcgtgg cgatcagccc tgccgtcgct gaggaagcgg cgaagaacgg ggcggaggtc 540

accacgctgc ggggcagtgc ggccattcgg ttgccgctta ctgagcggca ccggcggatc 600

ggcacgctgt tgcggacgct ggcgtcggtg cgtggtgggg ccaagcaggc tctgcactac 660

ggggaccggg ccccttcatt ggtcttgttg gctcctctca agggtggcgt caatccgttc 720

acccgtgttc tgggcgcccg cgacggtaag cctgtgttcc tgagcgatgt cctgcgcgag 780

gagctcgagg cgtgggcgga tgagctggac gggccggtgc tgctgggctg ggccccgggg 840

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ggtgatcatg acgcgtggtt cgaggactcc gcggcgtga 999

<210> 2

<211> 2316

<212> DNA

<213> S. virginiae IBL14

<400> 2

gtgggccgtc tggacgcggt ggaggacgtc ttcggcggca ggttctggcc cgtcgtggaa 60

ctcgctggcc tcacccacga cgccggcaag attcccgaag gcttccagcg gatgctggcg 120

ggatacagcc gtgcctgggg tgagcgtcac gaagtcgcct cgttgggctt cctgcccgcg 180

ctcatcggcg acccggacgt gctgttgtgg gtggcgaccg cggtcgccac ccaccatcgt 240

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tgggcagacc gtgtgaggcc tgaggtgggc ttggccgctg tactgctgca gggggcggtc 540

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gcaacacggc tgggtgacac tctcggcgat ggtgaggctg tcggcgttgc ccactcccgc 900

gccgcctcct accaccttgc ccaggccatc gccccgcagg acggcgacga ggaggacgaa 960

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gccgggccgg cccactccgg catcctcatc gacgccgcga actcggtgtt catcctggac 1140

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gaacgcctcg gtggacggat cacagtcctg tccgcgaccc tgcccagggc cctggccgac 1260

ctgttcgaga gcaccctcac cgcccccatc accttcctcg acacccccga cctcgggctg 1320

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gtcgttgcca cgcaggtggt cgaggtcagt ctcgacgtcg acttcgatgt gctgttcact 1680

ggagcggctc cgctcgaggc cctcctgcag cgcttcggcc ggaccaaccg cgtcggggcc 1740

cgcccgccgg ccgacgtcat cgtccaccat cccgcctgga ccacacgccg ccgacagccc 1800

ggcgagtacg ccgacggcat ctacccacgg gagccggtcg agtccgcgtg gcacatcctc 1860

acccgcaatc acgggcgagt catcgacgaa gcggacgcca ccgcgtggct ggacgaggtc 1920

tacgccacgg actggggcag gcaatggcac cgcgaggtgc tggagcggcg agaaagattc 1980

gaccgtgcgt tcctgcagtt ccgctacccc ttcgaagacc gcactgacct ggccgatacc 2040

ttcgacgaac tcttcgacgg ctccgaagcc atcctcgccg aagaccagga cgcctactca 2100

gccgcactgg ccgcaccaga cggcgaccac cccggagctg gccggctcct cgcagaggaa 2160

tacctcatcc ccgttcccca ctgggccagc cccctcagcc gctacgagaa gcagctcaaa 2220

gtccgcgtca tcaacggcga ctaccacccc gaccacggcc tcatggcggt ccgggggctg 2280

ccccagcccg cctaccgcgc cggggaggtc ttgtga 2316

Claims (4)

1.一种基于Ｉ型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法，其特征在于：该方法包括含有cas7与cas3两个基因所组成的蛋白表达质粒的构建、基因编辑质粒的构建以及利用构建的蛋白表达质粒和/或基因编辑质粒形成基因编辑工具对原核生物进行基因编辑。

2.根据权利要求1所述的一种基于Ｉ型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

（1）蛋白表达质粒plasmid-cas7-3的构建

根据载体相关序列信息设计用于结合cas基因的引物，通过PCR反应扩增得到线性化克隆载体；根据维吉尼亚链霉菌IBL14 中cas基因及相关信息序列设计引物，以提取到的维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模板，通过PCR反应扩增得到末端带有与载体有15-25 bp重叠区域及含有重叠区的cas7与cas3两个基因，并通过overlapPCR方式将cas7与cas3基因连接起来，最后再将overlapPCR产物通过一步法连接到线性质粒上，得到蛋白表达质粒plasmid-cas7-3；

（2）基因编辑质粒plasmid-t/g-gene abbreviation的构建

根据靶向基因DNA序列信息设计引物，以提取到的原核生物基因组为模板，通过PCR反应分别扩增得到末端带有限制性内切酶切割位点以及overlap PCR互补序列的靶向基因的上、下游同源臂片段，并用overlap PCR将上、下游同源臂片段结合起来构建基因编辑模板t-DNA，同时根据生物靶向基因序列信息设计并化学合成首尾分别含T7启动子和RNA终止子的靶向基因片段g-DNA，将t-DNA与g-DNA连接到质粒上得基因编辑质粒plasmid-t/g-gene abbreviation；

（3）基因编辑重组子的构建与检验

制备原核生物细胞感受态，并将按步骤（1）得到的plasmid-cas7-3和按步骤（2）得到的plasmid-t/g-gene abbreviation同时或分别转化到感受态细胞中得到候选的基因编辑的重组子，对重组子直接进行单克隆PCR或提取基因组PCR，并进一步通过基因测序，以确证编辑后的目的重组子。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于Ｉ型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法，其特征在于：所述的原核生物指大肠杆菌、枯草杆菌或其它原核微生物。

4.根据权利要求1所述的一种基于Ｉ型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法，其特征在于：所述的基因编辑是指利基因编辑工具对染色体基因进行敲除、插入、无痕点突变及任意组合。