CN114457071A - 一种古菌和细菌中通用的rna型毒素及其相关生物材料 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种古菌和细菌中通用的RNA型毒素及其相关生物材料。本发明提供了的RNA型毒素，其序列为SEQ ID No.7的第6‑78位、第1‑78位、第6‑107位或第1‑107位。发明人从西班牙盐盒菌中筛选到的一种双RNA型的新型TA系统，含有高效的翻译起始信号、两个稀有的精氨酸密码子和一个茎环结构，通过诱导表达，在其它模式古菌和模式细菌中再现了CreT的细胞毒性，本发明获得了一种精简、成本低、易修饰且普适的RNA型毒素，可广泛应用于古菌和细菌等不同微生物的基因工程技术中。
Description
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域中，一种古菌和细菌中通用的RNA型毒素及其相关生物材料。
背景技术
毒素-抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系统是原核生物中普遍存在的一种自私的遗传元件，包括一个稳定的毒素蛋白和一个不稳定的抗毒素(蛋白质或RNA)。最先TA系统被认为是质粒的“成瘾”元件，通过“分离后致死”效应保持质粒在子代细胞中的稳定传递。后来人们发现TA也大量存在于细菌和古菌的染色体基因组上，并在菌体面临多种胁迫压力时被激活，抑制细胞生长(抑菌效应)或诱导菌体发生程序性死亡(杀菌效应)，因此，人们认为TA同时具有重要的生理调节功能，并在工业生产中可用于维持表达质粒的稳定性，提高蛋白质产量。
TA的毒素组分在基因工程技术、基因治疗领域具有多种重要的应用场景。比如，常用的GatewayTM系统利用ccdB(ccdAB系统的毒素基因)作为反向筛选标记，筛除分子克隆过程中的空质粒转化克隆；mazF(mazEF系统的毒素基因)在大肠杆菌、芽孢杆菌、梭菌等多种细菌中被用作反向筛选标记用于微生物基因组的编辑。另外有研究表明，MazF毒素蛋白在肿瘤和HIV(人类免疫缺陷病毒)的基因治疗方面具有重要的应用潜力。
目前已知的TA系统有六类，它们的毒素均为蛋白质，这些毒素蛋白在不同的宿主细胞中表达应用时需要考虑影响蛋白质表达和活性的多种因素。例如：(1)密码子偏好性，这影响了毒素蛋白是否能足量表达产生毒性；(2)蛋白质翻译后修饰，如古菌和细菌具有不同的翻译后修饰体系，来自古菌的蛋白在细菌中时常不具有活性，反之亦然；(3)蛋白可溶性问题，可能导致毒素蛋白的表达产生包涵体，不能正常发挥其毒性；(4)胞内理化参数对蛋白活性的影响，如来源于高盐(或嗜热)微生物的蛋白在低盐(或常温)的微生物中常常失去活性，反之亦然。综上，上述因素限制了毒素蛋白质在不同微生物中的广泛适用性。因此，通过发掘毒素组分为RNA的新型TA系统，开发RNA类毒素元件具有重要意义。除此之外，RNA型毒素还具有人工合成简便、成本较低、易于修饰和偶联其它分子基团等优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种RNA分子，其名称为CreT RNA，CreT RNA含有如下A1)-A11)中的任一种：
A1)RNA分子，其结构为：其具有5′-SD片段-(N)n-AUG/GUG-rare codons-(N)m-stem-3′的基本结构，其中SD片段可以是常见SD(Shine-Dalgarno)序列，可以是在细菌或古菌中常用的SD序列，例如GGGUGAUC和AAGGAG；SD片段与起始密码子AUG/GUG之间的短序列(N)n，可以取细菌或古菌中常见长度，本领域技术人员可以根据宿主细胞以及具体SD序列进行合理调整，其中常见长度是n取0-12之间的整数，最常见的长度n可以是2-10之间的自然数；AUG/GUG是起始密码子，可以选择AUG或GUG；起始密码子后面rare codons结构是由p个稀有的密码子(例如精氨酸的稀有密码子AGA或AGG，异亮氨酸的稀有密码子ATA)组成的串联结构，例如rare codons结构可以是AGAAGA或AGGAGG或ATAATA或其它稀有密码子的串联，密码子的数目p可以根据需要调整，例如2-100或2-50或2-30或2-20或2-15或2-10或2-8或2-6或2-5等；rare codons与stem结构之间的短序列(N)m，其长度m是本领域技术人员根据细菌以及古细菌实际情况和经验合理调整的，例如m可以是0-20之间的自然数，再例如可以是3-15，再例如可以是5-10,再例如可以是8；stem结构是单链RNA分子中由一对反向重复序列发生连续的碱基匹配而形成的双链“茎”结构，茎的长度(碱基对数目)可以适当调整，例如可以是4-100之间的自然数，再例如可以是4-50，再例如可以是4-20，再例如可以是10，两段反向重复序列之间可以通过其它片段连接，从而形成“茎环”结构。
A2)序列表中SEQ ID No.7的第6-78位所示的RNA分子；
A3)序列表中SEQ ID No.7的第1-78位所示的RNA分子；
A4)序列表中SEQ ID No.7的第6-107位所示的RNA分子；
A5)序列表中SEQ ID No.7的第1-107位所示的RNA分子；
A6)将A2)、A3)、A4)或A5)的所述RNA分子中除SD片段、片段1、片段2、片段3和片段4外其余序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；所述SD片段的序列为SEQ ID No.7的第6-13位，所述片段1的序列为SEQ ID No.7的第16-18位，所述片段2的序列为SEQ ID No.7的第19-24位，所述片段3的序列为SEQ ID No.7的第33-42位，所述片段4的序列为SEQ ID No.7的第61-70位；
A7)将A2)、A3)、A4)或A5)的所述片段1的序列替换为GUG得到的RNA分子；
A8)将A2)、A3)、A4)或A5)的所述片段2的序列替换为p个连续稀有密码子得到的RNA分子，2≤p，所述稀有密码子为AGA或AGG或ATA或其他稀有密码子；
A9)将A2)、A3)、A4)或A5)的所述片段3和所述片段4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的所述片段3和所述片段4处仍然保持反向互补的RNA分子；
A10)将A2)、A3)、A4)或A5)的所述SD片段替换为非西班牙盐盒菌的SD片段得到的RNA分子；
A11)将A2)、A3)、A4)或A5)的所述片段3和所述片段4之间的片段进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的RNA分子；
A12)将A2)、A3)、A4)或A5)进行上述A6)、A7)、A8)、A9)、A10)和A11)中至少两种改造得到的RNA分子。
A1)中，N为核糖核苷酸A、U、C或G。具体的，n的取值可为2-7。(N)n可为5′-AC-3′或5′-AUAUACC-3′。具体的，m的取值可为8。(N)m可为5′-UGAUACUC-3′。A1)中所述SD片段的序列可为SEQ ID No.7的第6-13位。
p的数量和毒性有关，理论上，毒性会随着数量的增加而增强，因此，这里p的具体数量，可根据需要调整，凡是可实现的情况，都在本发明的保护范围内。例如2-100；2-50；2-30；2-20；2-15；2-10；2-8；2-6；2-5等。rare codons具体可为5′-AGAAGA-3′或5′-AGGAGG-3′或5′-ATAATA-3′或5′-AGAAGAAGAAGAAGA-3′。
其中，茎(stem)二级结构的两段反向重复序列可以直接相连，也可以通过其他片段相连。茎二级结构的两段反向重复序列通过其他片段相连时，两段反向重复序列间的片段则可形成环状结构。
上述RNA分子中，一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加可为1-30个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。
在本发明的一个实施例中，A9)所述RNA分子为将所述片段3替换为5′
-UGUAUGUAAU-3′，所述片段4替换为5′-AUUACAUACA-3′得到的RNA分子。
上述RNA分子中，所述非西班牙盐盒菌SD片段可为大肠杆菌SD片段，如序列为5′-AAGGAG-3′的SD片段。
A8)具体可为将A2)、A3)、A4)或A5)的所述片段2的序列替换为5′-AGGAGG-3′或5′-AGAAGAAGAAGAAGA-3′得到的RNA分子。
上述RNA分子可如序列表中SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示。
上述RNA分子可为上述A1)-A12)中的任一种。
本发明还提供了与CreT RNA相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)转录CreT RNA的DNA分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，B1)所述DNA分子可为如下b1)-b6)中的任一种：
b1)序列表中SEQ ID No.2的第113-185位所示的DNA分子；
b2)序列表中SEQ ID No.2的第108-185位所示的DNA分子；
b3)序列表中SEQ ID No.2的第113-214位所示的DNA分子；
b4)序列表中SEQ ID No.2的第108-214位所示的DNA分子；
b5)与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且转录CreT RNA的DNA分子；
b6)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)或b5)限定的核苷酸序列杂交，且转录CreT RNA的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述表达盒，是指能够在宿主细胞中转录CreT RNA的DNA，该DNA不但可包括启动CreT RNA转录的启动子，还可包括终止CreT RNA转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
上述生物材料B2)所述表达盒中，启动子的序列可为SEQ ID No.2的第58-107位或SEQ ID No.5的第11-233位。
上述生物材料B2)所述表达盒中，终止子的序列可为SEQ ID No.2的第207-214位或SEQ ID No.5的第312-319位。
所述载体可为质粒(如pWL502、pTA1228载体或pET28a(+)载体)、黏粒、噬菌体或病毒载体。可用现有的表达载体构建B3)所述重组载体。
B3)所述重组载体可为pTX或pTA或pTA1228-creT或pET28a-creT，
所述pTX为将pWL502的BamH I和Kpn I间的识别序列替换为SEQ ID No.1的第11-214位得到的重组载体，pTX能转录SEQ ID No.7所示的creT的RNA；
所述pTA为将pWL502的BamH I和Kpn I间的识别序列替换为SEQ ID No.2的第11-321位得到的重组载体，pTA能转录SEQ ID No.7所示的creT RNA与SEQ ID No.8所示的creARNA；
所述pTA1228-creT为将pTA1228载体的BamH I和Kpn I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.5的BamH I和Kpn I识别序列间的DNA片段得到的重组载体，
所述pET28a-creT为将pET28a(+)载体的BamH I和Xba I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.6的BamH I和Xba I识别序列间的DNA片段得到的重组载体。
上述生物材料中，所述微生物可为古菌或细菌。其中，所述古菌可为西班牙盐盒菌或沃氏富盐菌。所述细菌可为大肠杆菌、梭菌、芽孢杆菌、埃希氏菌、放线菌或乳酸菌。
本发明还提供了CreT RNA的下述任一应用：
X1、在作为毒素中的应用；
X2、在作为反向筛选标记中的应用；
X3、在作为原核生物毒素中的应用；
X4、在基因工程中的应用；
X5、在制备基因工程产品中的应用；
X6、在基因工程中作为毒素或反向筛选标记中的应用；
X7、在制备基因治疗产品中的应用；
X8、在基因治疗中作为毒素中的应用。
上述应用中，所述原核生物可为古细菌或细菌。所述古菌可为西班牙盐盒菌或沃氏富盐菌。所述细菌可为大肠杆菌、梭菌、芽孢杆菌、埃希氏菌、放线菌或乳酸菌。
本发明还提供了所述生物材料的下述任一应用：
Y1、在制备CreT RNA中的应用；
Y2、在制备TA毒素中的应用；
Y3、在基因工程中的应用；
Y4、在制备基因工程产品中的应用；
Y5、在制备基因治疗产品中的应用。
本发明还提供了一种组合物，由CreT RNA与creA RNA分子组成，所述creA RNA分子的序列为序列表中SEQ ID No.8。
本发明还提供了一种生物材料组合，所述生物材料组合由所述与CreT RNA相关的生物材料和与creA RNA分子相关的生物材料组成，所述与creA RNA分子相关的生物材料为下述C1)至C4)中的任一种：
C1)转录所述creA RNA分子的DNA分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物。
C1)所述DNA分子可如SEQ ID No.2的第226-315位所示。
所述生物材料组合还可为所述pTA。
发明人从西班牙盐盒菌中筛选到了一种双RNA型的新型TA系统，通过对其全新的RNA型毒素CreT进行分子机制解析，鉴定了其毒性作用的关键分子模块，即高效的翻译起始信号(但不编码蛋白质)、两个稀有的精氨酸密码子(紧邻起始密码子)和一个茎环结构。通过诱导表达，在其它模式古菌(沃氏富盐菌)和模式细菌(大肠杆菌)中再现了CreT的细胞毒性，从而获得了一种精简、成本低、易修饰且普适的RNA型毒素，可广泛应用于古菌和细菌等不同微生物的基因工程技术中。
附图说明
图1为西班牙盐盒菌中RNA型毒素CreT的质粒表达和毒性验证。A，毒素基因creT的基因环境和序列；B，CreT单独表达和与CreA共同表达的质粒构建过程示意；C，CreT单独表达质粒和与CreA共同表达质粒在不同菌株中的转化效率；D，质粒转化平板示例。
图2为CreT RNA的高效翻译起始信号的突变分析。A，CreT RNA的序列、二级结构(SD，Shine-Dalgarno序列)信息及其与16S rRNA的碱基匹配；B，SD序列和翻译起始密码子AUG的突变对CreT毒性的影响。
图3为CreT RNA关键稀有密码子的同义突变分析。A，CreT RNA有两个连续的稀有精氨酸密码子紧跟起始密码子；B，稀有精氨酸密码子同义突变对CreT毒性的影响和六种精氨酸密码子在西班牙盐盒菌中的使用频率。
图4为CreT RNA茎环结构的突变破坏和互补突变恢复。A，CreT RNA茎环碱基的突变和互补突变(突变碱基以斜体显示)；B，茎环结构破坏和恢复对CreT毒性的影响。
图5为CreT在另一株模式古菌中的诱导表达。A，利用诱导型启动子在沃氏富盐菌中进行诱导表达的实验设计；B，CreT诱导表达对菌体生长的影响，诱导物为色氨酸；C，对诱导培养过程的菌液进行间隔取样，并在不含诱导物的平板上进行梯度稀释涂板，计算菌落形成单位(CFU)。
图6为利用CreT毒素作为反向筛选标记加速质粒消除的实验。A，质粒消除实验流程，诱导物为色氨酸；B，梯度稀释涂板测定每毫升菌液中总细胞数和质粒未消除的细胞数。
图7为CreT毒素在大肠杆菌中的改造和诱导表达实验。A，CreT在大肠杆菌中的改造和表达设计；B，CreT诱导表达对大肠杆菌转化效率的影响；C，转化结果示例。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的质粒pHAR(Hailong Liu et al.,Development of pyrF-basedgene knockout systems for genome-wide manipulation of the archaea Haloferaxmediterranei and Haloarcula hispanica,J Genet Genomics.2011,38(6):261-9)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的西班牙盐盒菌DF60菌株(Hailong Liu et al.,Development ofpyrF-based gene knockout systems for genome-wide manipulation of the archaeaHaloferax mediterranei and Haloarcula hispanica,J Genet Genomics.2011,38(6):261-9)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的质粒pWL502(Shuangfeng Cai et al.,Identification of thehaloarchaeal phasin(PhaP)that functions in polyhydroxyalkanoate accumulationand granule formation in Haloferax mediterranei,Appl Environ Microbiol.,2012,78(6):1946-52.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pTA1228载体(Jutta Brendel et al.,A complex of Casproteins 5,6,and 7is required for the biogenesis and stability of clusteredregularly interspaced short palindromic repeats(crispr)-derived rnas(crrnas)in Haloferax volcanii,J Biol Chem.,2014,289(10):7164-77.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的沃氏富盐菌营养缺陷菌株H1424(Amy Stroud et al.,Geneticand Biochemical Identification of a Novel Single-Stranded DNA-Binding Complexin Haloferax volcanii,Front Microbiol.,2012，18；3:224..)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
西班牙盐盒菌(Haloarcula hispanica)ATCC 33960：ATCC产品，编号为ATCC33960。
实施例1、西班牙盐盒菌中RNA型毒素CreT的鉴定。
本实施例发现了来源于西班牙盐盒菌(Haloarcula hispanica)ATCC 33960的creT基因具有细胞毒性，而该毒性可以被同菌株来源的抗毒素基因creA基因抑制，creT基因的序列如序列表中SEQ ID No.1的第108-214位所示，creA基因的序列如序列表中SEQ IDNo.2的第226-315位所示，具体实验步骤如下：
一、西班牙盐盒菌ΔcreTA和ΔcreTAΔcas6菌株的构建
首先通过敲除西班牙盐盒菌DF60菌株中的基因，构建了creA基因与creT基因同时被敲除的西班牙盐盒菌ΔcreTA，以及creA基因、creT基因、cas6基因同时被敲除的西班牙盐盒菌ΔcreTAΔcas6菌株。
a)目的基因上下游同源臂的扩增
1)引物设计(酶切位点用下划线标记；粗体表示互补序列)
针对每个敲除目标基因设计上下游双交换同源臂的两对引物，creTA(即creA基因与creT基因)上下游序列的扩增引物为：
creTA-UF:5′-CGCGGATCCAACTGAACATCGGCGAAAT-3′；
creTA-DR:5′-ATAGGGTACCCCGGGCCATTGGTACT-3′。
creTA-cas6(即creA基因、creT基因与cas6基因)上下游序列的扩增引物为：
creTAcas6-UF:5′-CGCGGATCCCGAGCAAGGCGCAATAGAT-3′；
creTAcas6-DR:5′-ATAGGGTACCCATCACCGGACACGTCAA-3′。
2)提取西班牙盐盒菌ATCC 33960基因组DNA，使用高保真KOD Plus DNA聚合酶，以所得基因组DNA为模板，以creTA-UF/creTA-UR引物扩增creTA的上游同源臂序列557bp，以creTA-DF/creTA-DR引物扩增creTA的下游同源臂序列681bp；以creTAcas6-UF/creTAcas6-UR引物扩增creTA-cas6的上游同源臂序列587bp，以creTAcas6-DF/creTAcas6-DR引物扩增creTA-cas6的下游同源臂序列586bp。PCR扩增反应程序如下：95℃5min预变性；然后95℃30s、55℃30s、68℃45s进行30个循环；68℃8min。
3)将creTA的上、下游同源臂扩增产物混合并作为模板，使用creTA-UF和creTA-DR作为衔接PCR引物扩增出creTA的同源臂衔接片段1208bp；同样地，将creTA-cas6的上、下游同源臂扩增产物混合并作为模板，使用creTAcas6-UF和creTAcas6-DR作为衔接PCR引物扩增出creTA-cas6的同源臂衔接片段1143bp；PCR扩增反应程序如下：95℃5min预变性；然后95℃30s、55℃30s、68℃1min20s进行30个循环；68℃8min。
b)同源臂衔接片段与pHAR质粒的限制酶消化和连接
1)将上述步骤所得两种同源臂衔接片段使用琼脂糖凝胶进行电泳分析，并回收PCR产物。
2)将步骤1)所得两种PCR产物分别进行BamH I和Kpn I双酶切，将所得两个大片段分别与质粒pHAR经BamH I和Kpn I双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体分别记为pDTA(即含有creTA上下游的同源臂衔接片段的重组载体，用于敲除creTA)和pDTAC6(即含有creTA-cas6上下游的同源臂衔接片段的重组载体，用于敲除creTA-cas6)。
所得两种重组载体使用引物pHAR-seqF和pHAR-seqR(pHAR-seqF:5'-GACTCCGGTGACGCG TTCT-3'；pHAR-seqR:5'-ATTACGCCAGATATCAAATTAATAC-3')进行测序验证。
c)pDTA和pDTAC6转化西班牙盐盒菌DF60
1)从平板上用牙签挑取西班牙盐盒菌DF60菌株的单一克隆，接种于含50mg/L尿嘧啶的AS-168液体培养基中，37℃，200rpm培养到对数期，然后以1：20转接于新鲜培养基中，约生长20h，得到活化后的菌体，即可用于转化；其中，AS-168液体培养基制备方法如下：将200g NaCl，20g MgSO4·7H2O，2.0g KCl，5.0g酸水解酪素(casamino acids，美国BD公司(Becton,Dickinson and company)产品，货号为7241547)，5.0g酵母提取物(yeastextract，OXOID产品，货号LP0021)，1.0g谷氨酸钠(sodium glutamate)，3.0g柠檬酸钠，0.36g FeSO4·7H2O和0.36mg MnCl2·4H2O溶于蒸馏水中，用蒸馏水定容至1升，调整pH7.1-7.2；含50mg/L尿嘧啶的AS-168液体培养基为向AS-168液体培养基中添加尿嘧啶得到的尿嘧啶浓度为50mg/L的培养基；
2)步骤1)完成后，取1ml活化好的菌体于灭菌的离心管中，6,000rpm，离心3min；
3)步骤2)完成后，弃上清，用移液器吸尽残余的上清，然后加入200μl BSS-LS缓冲液，用移液器轻轻吹匀，6,000rpm，离心3min；BSS-LS缓冲液：将5.85g NaCl，0.201g KCl，15g蔗糖溶于蒸馏水中，用蒸馏水定容至95ml，115℃灭菌30min后，加入5ml灭菌的1M Tris-HCl(pH 8.2)；
4)步骤3)完成后，弃上清，用移液器吸尽残余的上清，然后加入100μl BSS-LS/+甘油缓冲液，用移液器轻轻吹匀；BSS-LS/+甘油缓冲液：将5.85g NaCl，0.201g KCl，15g蔗糖溶于蒸馏水中，加15ml甘油，用蒸馏水定容至95ml，115℃灭菌30min后，加入5ml灭菌的1MTris-HCl(pH 8.2)；
5)步骤4)完成后，加入10μl 0.5M pH 8.0的EDTA缓冲液，用手轻轻拍打离心管壁，混匀后室温下放置10min，得到原生质体溶液；0.5M pH 8.0的EDTA缓冲液：将18.612g EDTA于蒸馏水中，缓慢加入NaOH颗粒至EDTA溶解，用蒸馏水定容至100ml，调整pH 8.0；
6)预先将1μg质粒(pDTA或pDTAC6)用BSS-LS/+甘油缓冲液调整体积一致至10μl，然后加入到步骤5)所得原生质体溶液中，放置5min；
7)步骤6)完成后，向体系中加入120μl(与上面离心管中溶液等体积)60％的PEG600溶液(使用时用UBSS-LS缓冲液配置，即溶质为PEG 600，溶剂为UBSS-LS缓冲液)，迅速上下颠倒离心管多次，直到溶液变得透亮、均一，然后室温放置20min；
8)步骤7)完成后，加入1ml的复苏培养基(23％MGM+sucrose)，上下颠倒离心管混匀溶液，6,000rpm，离心4min；复苏培养基(23％MGM+sucrose)：将0.5g大豆蛋白胨(北京双旋微生物培养基制品厂产品，货号为CM：02-19)，0.1g酵母提取物，15g蔗糖溶于76.7ml30％人工盐水，用蒸馏水定容至100ml，调节pH 7.5；30％人工盐水制备方法如下：将240gNaCl，35g MgSO4·7H2O，30g MgCl2·6H2O，7g KCl，含有0.555g CaCl2的水溶液溶于蒸馏水中，用蒸馏水定容至1L；
9)步骤8)完成后，弃上清，用移液器吸尽残余的上清后，各EP管中加入600μl的复苏培养基悬浮菌体，37℃，200rpm摇床复苏12h。
10)步骤9)完成后，利用复苏培养基对所得培养液进行10倍梯度的连续稀释，将不同稀释梯度的菌液涂布到不含酵母提取物的AS-168固体培养基平板(含1.2％琼脂)上。
11)将涂好的平板放置于封口的塑料袋中，待液体被平板彻底吸收后，将平板倒置培养5-7天。
d)单交换克隆的筛选
1)挑选上述得到的pDTA和pDTAC6转化子单克隆在新的平板上进行划线，培养2-3天；
2)用枪尖挑取少量菌体作为PCR模板，使用衔接PCR扩增时用的引物对(creTA-UF/creTA-DR或creTAcas6-UF/creTAcas6-DR)进行菌落PCR；
3)使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，扩增出敲除条带和野生型条带两个条带的为目的单交换克隆。
e)双交换菌株的筛选
1)将筛选到的单交换克隆接种于含150mg/L的5-氟乳清酸和50mg/L尿嘧啶的AS-168液体培养基中培养，培养至对数中期后，以1:50再次转接新鲜培养基培养至对数中期；含150mg/L的5-氟乳清酸和50mg/L尿嘧啶的AS-168液体培养基为向AS-168液体培养基中添加5-氟乳清酸和尿嘧啶得到的5-氟乳清酸浓度为150mg/L、尿嘧啶浓度为50mg/L的培养基；
2)用无菌的牙签将培养菌液在含有150mg/L的5-氟乳清酸和50mg/L尿嘧啶的AS-168固体平板上划线，置于37℃培养大约一周时间生长出单克隆。
3)随后分别使用衔接PCR的引物对(creTA-UF/creTA-DR或creTAcas6-UF/creTAcas6-DR)进行菌落PCR检测；
4)使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，仅扩增出敲除条带的即为目的双交换克隆,从而得到敲除菌株—西班牙盐盒菌ΔcreTA和西班牙盐盒菌ΔcreTAΔcas6。
二、构建CreT表达质粒
a)creT基因序列和creTA序列的扩增；
1)引物设计(限制酶切位点用下划线标记):
creT-F:5′-ATAGGGTACCATAGTGACGTCTAATCGTA-3′；
creT-R:5′-CGCGGATCCATATATGATTGAGGGAGTTC-3′；
creTA-R:5′-CGCGGATCCTCTATTAAAATGAACTGGGAT-3′。
2)使用高保真KOD Plus DNA聚合酶，以西班牙盐盒菌ATCC 33960基因组DNA为模板，以creT-F和creT-R引物扩增creT基因序列(见图1中A)，以creT-F和creTA-R引物扩增creTA基因序列。PCR扩增反应程序如下：95℃5min预变性；然后95℃30s、55℃30s、68℃15s进行30个循环；68℃8min。
以creT-F和creT-R引物扩增到的PCR产物序列为序列表中SEQ ID No.1，该序列中，第5-10位为Kpn I酶切位点，第58-107位为启动子序列，第108-214位为creT基因，第207-214位为creT基因转录终止子，第215-210位为BamH I酶切位点。
SEQ ID No.1：
以creT-F和creTA-R引物扩增到的PCR产物序列为序列表中SEQ ID No.2，该序列中，第5-10位为Kpn I酶切位点，第58-107位为启动子序列，第108-214位为creT基因，第207-214位为creT基因转录终止子，第226-315位为creA基因，第308-315位为creA转录终止子，第322-327位为BamH I酶切位点。
SEQ ID No.2：
b)扩增片段和pWL502载体的限制酶消化和连接(如图1中B所示)
1)将上述PCR产物分别使用琼脂糖凝胶进行电泳分析，并回收PCR产物。
2)将回收的creT基因序列利用BamH I和Kpn I进行双酶切，将得到的大片段与质粒pWL502经BamH I和Kpn I进行双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为pTX；将回收的creTA基因序列利用BamH I和Kpn I进行双酶切，将得到的大片段与质粒pWL502经BamH I和Kpn I进行双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为pTA。
以creT-F和creT-R引物对pTX进行测序验证，以creT-F和creTA-R引物对pTA进行PCR检测，并进行测序验证。
具体的，pTX为将pWL502的BamH I和Kpn I间的识别序列替换为SEQ ID No.1的第11-214位得到的重组载体，pTX能转录SEQ ID No.7所示的creT的RNA，其RNA序列如下：
pTA为将pWL502的BamH I和Kpn I间的识别序列替换为SEQ ID No.2的第11-321位得到的重组载体，pTX能转录SEQ ID No.7所示的creT RNA与SEQ ID No.8所示的creA RNA：
ACAAUGUAGUUUUACUGGGUCGGGGACAUUCCAGAUGAACAAAGGUUGGGUUGAAGUCCUUGGGCUAUUGUCCCGAUCCCAGUUCAUUUU(SEQ ID No.8)。
三、CreT表达质粒pTX和pTA转化西班牙盐盒菌
a)pTX和pTA转化西班牙盐盒菌ΔcreTA和ΔcreTAΔcas6菌株
1)从平板上用牙签挑取西班牙盐盒菌ΔcreTA菌株的单一克隆，接种于含50mg/L尿嘧啶的AS-168液体培养基中，37℃，200rpm培养到对数期，然后以1：20转接于新鲜培养基中，约生长20h，得到活化后的菌体，即可用于转化；
2)步骤1)完成后，取1ml活化好的菌体于灭菌的离心管中，6,000rpm，离心3min；
3)步骤2)完成后，弃上清，用移液器吸尽残余的上清，然后加入200μl BSS-LS缓冲液，用移液器轻轻吹匀，6,000rpm，离心3min；
4)步骤3)完成后，弃上清，用移液器吸尽残余的上清。然后加入100μl BSS-LS/+甘油缓冲液，用移液器轻轻吹匀；
5)步骤4)完成后，加入10μl 0.5M pH 8.0的EDTA缓冲液，用手轻轻拍打离心管壁，混匀后室温下放置10min，得到原生质体溶液；
6)预先将1μg或500ng重组载体pTX用BSS-LS/+甘油缓冲液调整体积一致至10μl，然后加入到步骤5)所得原生质体溶液中，放置5min；
7)步骤6)完成后，向体系中加入120μl(与上面离心管中溶液等体积)60％的PEG600溶液(使用时用UBSS-LS缓冲液配置)，迅速上下颠倒离心管多次，直到溶液变得透亮、均一，然后室温放置20min；
8)步骤7)完成后，加入1ml的复苏培养基(23％MGM+sucrose)，上下颠倒离心管混匀溶液，6,000rpm，离心4min；
9)步骤8)完成后，弃上清，用移液器吸尽残余的上清后，各EP管中加入600μl的复苏培养基悬浮菌体，37℃，200rpm摇床复苏12h。
10)步骤9)完成后，利用复苏培养基对上述培养液进行10倍梯度的连续稀释，将不同稀释梯度的菌液涂布到无yeast extract的AS-168平板上。
11)将涂好的平板放置于封口的塑料袋中，待液体被平板彻底吸收后，将平板倒置培养5-7天后进行克隆计数，计算转化效率，转化效率＝平板的克隆数×稀释倍数/转化用的重组载体质量，所得转化效率(三个生物学重复)为4、6、8CFU/μg(CFU,菌落形成单位)。
按照上述方法，将重组载体pTX替换为pTA，即利用pTA转化西班牙盐盒菌ΔcreTA菌株，其他步骤均不变，检测转化效率，所得转化效率(三个生物学重复)为676000、14000、80000CFU/μg。
按照上述方法，将重组载体pTX替换为空质粒(pWL502)，即利用pWL502转化西班牙盐盒菌ΔcreTA菌株，作为对照，所得转化效率(三个生物学重复)为236000、24000、60000CFU/μg。
按照上述方法，将重组载体pTX替换为pTA，将菌株替换为西班牙盐盒ΔcreTAΔcas6，即利用pTA转化西班牙盐盒菌ΔcreTAΔcas6菌株，其他步骤均不变，检测转化效率，所得转化效率(三个生物学重复)为198、12、6CFU/μg。
结果如图1中C和D所示，与空质粒(pWL502)相比，pTX转化ΔcreTA菌株的效率降低了103-104，证实了creT基因的细胞毒性，而pTA的转化效率与空质粒相当，表明抗毒素基因creA可以抑制该细胞毒性。另外，pTA质粒转化ΔcreTAΔcas6菌株时比转化ΔcreTA的效率也降低了103-104，说明creA的抗毒素作用过程需要Cas6蛋白的参与。
实施例2、CreT毒素关键元件的鉴定
一、CreT RNA序列分析；
a)CreT RNA二级结构预测：将creT基因的RNA序列提交至RNAfold网站服务器，分析其RNA二级结构，结果如图2中A所示。
b)CreT RNA与16S rRNA互作分析：将creT基因的RNA序列和16S rRNA基因提交至IntaRNA网站服务器，分析两者的RNA序列可能发生的碱基匹配，见图2中A中的SD(Shine-Dalgarno)序列(翻译起始过程中与16S rRNA 3′末端互补结合的关键翻译起始信号)。
二、CreT关键SD序列的突变分析；
a)SD序列突变引物设计(突变的碱基用粗体显示)：
b)衔接PCR引入SD序列突变；
1)使用高保真KOD Plus DNA聚合酶，以西班牙盐盒菌ATCC 33960基因组DNA为模板，以creT-F和SD-mut-R引物扩增creTA基因序列的一半，以SD-mut-F和creTA-R引物扩增creTA基因序列的另一半。
2)将上述步骤1)所得两种PCR产物混合并作为模板，使用creT-F和creTA-R作为衔接PCR引物扩增出含SD突变的creTA片段，所得PCR产物为将SEQ ID No.2的第114-117位突变为CCAC得到的DNA片段，其序列为序列表中SEQ ID No.3。
c)构建含有SD突变的pTA-m。
参照实施例1中操作，对含有SD突变的creTA片段的PCR产物进行凝胶回收、BamH I和Kpn I双酶切、连接预先消化的pWL502骨架、测序，将得到的序列正确的重组载体记为pTA-m，pTA-m为将pWL502的BamH I和Kpn I间的识别序列替换为SEQ ID No.3的第11-321位得到的重组载体。
SEQ ID No.3：
d)含有SD突变的质粒pTA-m转化西班牙盐盒菌：按照实施例1中步骤三步骤a)操作，所用重组载体为pTA-m，菌株为西班牙盐盒菌ΔcreTAΔcas6菌株，将pTA-m转化西班牙盐盒菌ΔcreTAΔcas6菌株，并以空质粒pWL502和pTA作为对照。
结果如图2中B所示，未突变的pTA转化ΔcreTAΔcas6菌株的效率比空质粒低103-104，但携带SD突变的pTA-m转化效率与空质粒相当，说明CreT RNA的毒性作用依赖于其SD序列。
具体的，三个质粒转化ΔcreTAΔcas6菌株的转化效率(各三个生物重复)依次为118000、84000、108000CFU/μg(空质粒pWL502)；20、10、50CFU/μg(pTA),和98000、176000、204000CFU/μg(pTA-m)。
三、CreT高效起始密码子AUG的突变分析；
a)起始密码子AUG突变引物设计(突变的碱基用粗体显示，B代表T/C/G，V代表A/C/G，D代表A/G/T，起始密码子的互补碱基用方框标记)：
AUG-mut-F:5′-AGAAGATGATACTCTGGCTGG-3′；
突变位置见图2中A，起始密码子用方框标记。
b)衔接PCR引入AUG密码子突变；
1)使用高保真KOD Plus DNA聚合酶，以西班牙盐盒菌ATCC 33960基因组DNA为模板，以creT-F和三条AUG-mut-R引物组成的三个引物对分别扩增creTA基因序列的前半段，以AUG-mut-F和creTA-R引物扩增creTA基因序列的后半段。
2)将三种前半段扩增产物分别与后半段产物混合，然后分别以所得三种混合物为模板使用creT-F和creTA-R作为衔接PCR引物扩增出含AUG各种突变的creTA全片段，所得PCR产物为将SEQ ID No.2的第123-125位突变为NNN得到的DNA片段，其序列为序列表中SEQID No.4。SEQ ID No.4中，NNN为TTG、CTG、GTG、ATA、ATT、ATC、AAG、ACG、AGG。
SEQ ID No.4：
c)构建含有AUG突变的pTA。
参照实施例1中操作，对含有AUG各种突变的creTA片段进行凝胶回收、BamH I和Kpn I双酶切、连接预先消化的pWL502骨架、测序，将得到的序列正确的重组载体记为pTA-n，pTA-n为将pWL502的BamH I和Kpn I间的识别序列替换为SEQ ID No.4的第11-321位得到的重组载体。
所得pTA-n共有9种，分别记为pTA-1～pTA-9，这9种重组载体中突变后的核苷酸(即SEQ ID No.4的第123-125位)依次为TTG、CTG、GTG、ATA、ATT、ATC、AAG、ACG、AGG。
d)含有不同AUG突变的质粒pTA-n转化西班牙盐盒菌：参照实施例1中操作，按照实施例1中步骤三步骤a)操作，所用重组载体为9种pTA-n,菌株为西班牙盐盒菌ΔcreTAΔcas6菌株，将9种pTA-n分别转化西班牙盐盒菌ΔcreTAΔcas6菌株，并以空质粒pWL502和pTA作为对照。
结果如图2中B所示，未突变的pTA转化ΔcreTAΔcas6菌株的效率比空质粒低103-104，即表现出细胞毒性；当AUG突变为另一个高效起始密码子GUG时仍具有细胞毒性(大大降低转化效率)；而当AUG突变为低效的起始密码子UUG或CUG/AAG/ACG/AGG/AUA/AUC/AUU等其它密码子时，细胞毒性消失(转化效率与空质粒相当)。pTA-1～pTA-9的转化效率(各三个生物学重复)依次为92000、95000、106000CFU/μg(pTA-1,即UUG)；93000、109000、70500CFU/μg(pTA-2，即CUG)；10、10、1CFU/μg(pTA-3,即GUG)；104000、88000、79000CFU/μg(pTA-4,即AUA)；86000、89000、74500CFU/μg(pTA-5，即AUU)；78500、91500、84500CFU/μg(pTA-6,即AUC)；85000、91000、95500CFU/μg(pTA-7,即AAG)；96000、84500、101000CFU/μg(pTA-8，即ACG),和123000、96000、94000CFU/μg(pTA-9,即AGG)。
结合SD突变实验，上述结果表明，CreT RNA的毒性依赖于高效的翻译起始信号(包括一个高效的SD序列和一个高效的起始密码子)。
四、CreT连续稀有密码子的同义突变分析；
a)稀有密码子同义突变引物设计(突变的碱基用粗体显示，位于SEQ ID No.2的第126-131位(图3中A))：
AGA-AGG-F与AGA-AGG-R组成的引物用于构建pTA中将creTA基因的起始密码子后的AGGAGG突变为AGGAGG的重组载体pTA-AGG；
AGA-CGA-F与AGA-CGA-R组成的引物用于构建pTA中将creTA基因的起始密码子后的AGGAGG突变为CGACGA的重组载体pTA-CGA；
AGA-CGU-F与AGA-CGU-R组成的引物用于构建pTA中将creTA基因的起始密码子后的AGGAGG突变为CGTCGT的重组载体pTA-CGU；
AGA-CGC-F与AGA-CGC-R组成的引物用于构建pTA中将creTA基因的起始密码子后的AGGAGG突变为CGCCGC的重组载体pTA-CGC；
AGA-CGG-F与AGA-CGG-R组成的引物用于构建pTA中将creTA基因的起始密码子后的AGGAGG突变为CGGCGG的重组载体pTA-CGG。
b)衔接PCR引入稀有密码子同义突变；
1)使用高保真KOD Plus DNA聚合酶，以西班牙盐盒菌ATCC 33960基因组DNA为模板，以creT-F和上述每一对引物中标“R”的引物分别扩增creTA基因序列的前半段，以上述每一对引物中标“F”的引物和creTA-R引物扩增creTA基因序列的后半段。
2)将前半段扩增产物与各自对应的后半段产物混合并作为模板，使用creT-F和creTA-R作为衔接PCR引物扩增出含稀有密码子各种同义突变的creTA全片段，所得PCR产物为将SEQ ID No.2的第126-131位分别突变为AGGAGG、CGACGA、CGTCGT、CGCCGC和CGGCGG的5种DNA片段。
c)构建含有稀有密码子同义突变的pTA突变体。
参照实施例1中操作，对含有稀有密码子各种同义突变的creTA片段进行凝胶回收、BamH I和Kpn I双酶切、连接预先消化的pWL502骨架、测序，分别得到重组载体pTA-AGG、pTA-CGA、pTA-CGU、pTA-CGC和pTA-CGG。
d)含有稀有密码子同义突变的质粒转化西班牙盐盒菌：参照实施例1中操作，按照实施例1中步骤三步骤a)操作，所用重组载体为pTA-AGG、pTA-CGA、pTA-CGU、pTA-CGC和pTA-CGG中的任一种,菌株为西班牙盐盒菌ΔcreTAΔcas6菌株，将各重组载体分别转化西班牙盐盒菌ΔcreTAΔcas6菌株，并以空质粒pWL502和pTA作为对照。
结果如图3中B所示，未突变的pTA转化ΔcreTAΔcas6菌株的效率比空质粒低103-104，即表现出细胞毒性；当两个AGA同义突变为另一个稀有的精氨酸密码子AGG时仍具有细胞毒性(大大降低转化效率)；而当两个AGA同义突变为其它精氨酸密码子CGA/CGU/CGC/CGG时，细胞毒性消失(转化效率与空质粒相当)。该结果表明，CreT RNA通过消耗稀有精氨酸密码子对应的tRNA导致细胞毒性，而非通过编码蛋白质或小肽发挥作用。
具体的，各质粒转化ΔcreTAΔcas6菌株的转化效率(各三个生物学重复)依次为73500、102000、96500CFU/μg(空质粒pWL502)；10、50、1CFU/μg(pTA)；10、50、10CFU/μg(pTA-AGG)；58000、79500、42000CFU/μg(pTA-CGA)；86000、91500、64000CFU/μg(pTA-CGU)；42500、67000、79000CFU/μg(pTA-CGC)；和68500、83000、61000CFU/μg(pTA-CGG)。
发明人还将pTA的两个AGA同时突变为异亮氨酸的稀有密码子AUA，所得突变质粒仍然具有细胞毒性(三个生物学重复的转化效率分别为10，10，0CFU/μg)，因此，CreT也可以通过消耗其它稀有密码子对应的tRNA导致细胞毒性。
发明人还将pTA中连续稀有密码子的数目至5个(AGAAGAAGAAGAAGA)，所得突变质粒仍然具有细胞毒性(三个生物学重复的转化效率分别为10，0，0CFU/μg),因此稀有密码子数目的增多后CreT仍然具有细胞毒性。
五、CreT关键茎环结构的突变分析。
a)茎环结构突变(pIRm)和茎环结构恢复(pIRcm)的引物设计(突变的碱基用粗体显示)：
b)衔接PCR引入突变破坏CreT RNA茎环结构；
1)使用高保真KOD Plus DNA聚合酶，以西班牙盐盒菌ATCC 33960基因组DNA为模板，以creT-F和IRm-R引物扩增creTA基因序列的前半段，以IRm-F引物和creTA-R引物扩增creTA基因序列的后半段。
2)将上述前半段扩增产物与后半段产物混合并作为模板，使用creT-F和creTA-R作为衔接PCR引物扩增出creTA全片段，该片段转录的CreT RNA的茎环结构被破坏(图4中A)。
c)构建CreT茎环结构被破坏的pIRm质粒。
参照实施例1中操作，对步骤b)所得PCR产物进行凝胶回收、BamH I和Kpn I双酶切、连接预先消化的pWL502骨架、测序，将得到的重组载体记为pIRm。
d)衔接PCR引入互补突变恢复CreT RNA茎环结构；
1)以pIRm质粒为模板，以creT-F和IRcm-R引物扩增creTA基因突变序列的前半段，以IRcm-F引物和creTA-R引物扩增creTA基因突变序列的后半段。
2)将上述前半段扩增产物与后半段产物混合并作为模板，使用creT-F和creTA-R作为衔接PCR引物扩增出creTA全片段，该片段转录的CreT RNA的茎环结构的破坏被恢复(图4中A)。
e)构建CreT茎环结构恢复的pIRcm质粒。
参照实施例1中操作，对步骤d)所得PCR产物进行凝胶回收、BamH I和Kpn I双酶切、连接预先消化的pWL502骨架、测序，将得到的重组载体记为pIRcm。
f)pIRm和pIRcm质粒转化西班牙盐盒菌：按照实施例1中步骤三步骤a)操作，所用重组载体为pIRm或pIRcm,菌株为西班牙盐盒菌ΔcreTAΔcas6菌株，将pIRm和pIRcm分别转化西班牙盐盒菌ΔcreTAΔcas6菌株，并以空质粒pWL502和pTA作为对照。
结果如图4中B所示，未突变的pTA转化ΔcreTAΔcas6菌株的效率比空质粒低103-104，即表现出细胞毒性；当CreT茎环结构被破坏时，pIRm转化效率与空质粒pWL502相当，表明毒性丧失；而当CreT茎环结构被再次恢复时，pIRcm重新表现出毒性(大大降低转化效率)。该结果表明，CreT RNA的毒性(或稳定性)依赖于其茎环结构。
具体的，空质粒pWL502、pTA、pIRm和pIRcm转化ΔcreTAΔcas6菌株的转化效率(各三个生物学重复)依次为38000、152000、512000CFU/μg(空质粒pWL502)；6、42、1CFU/μg(pTA)；98000、40000、374000CFU/μg(pIRm)；和1、3、3CFU/μg(pIRcm)。
另外，发明人还通过突变pTA删除了CreT茎环结构“环”上的18个碱基(SEQ IDNo.7的第43-60位)，突变质粒仍然具有细胞毒性(三个生物学重复的转化效率为10，10，20CFU/μg)，说明茎环结构“环”上的序列(SEQ ID No.7的第43-60位)对CreT的毒性功能不重要。
实施例3、CreT毒素在另一株模式古菌中的毒性及应用
一、CreT在沃氏富盐菌中的诱导表达和毒性分析。
a)人工合成SEQ ID No.5所示的DNA片段，合成序列如下(单下划线标记BamH I和Kpn I位点；色氨酸诱导型启动子p.tnaA序列用斜体显示，SEQ ID No.5的第11-233位；creT基因序列粗体显示，SEQ ID No.5的第234-311位，其中，方框为SD序列，阴影部分为翻译起始密码子和两个连续的精氨酸稀有密码子，双下划线部分为形成茎环结构的一对回文序列，终止子为第312-319所示的T8终止子)：
SEQ ID No.5：
b)利用BamH I和Kpn I对SEQ ID No.5所示的DNA片段进行双酶切，将得到的大片段与沃氏富盐菌的pTA1228载体经BamH I和Kpn I得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为pTA1228-creT(如图5中A所示)。pTA1228-creT能转录SEQ ID No.9所示的creT RNA：
c)pTA1228-creT质粒转化沃氏富盐菌；
1)配制YPC培养基，配方如下：
用2M NaOH溶液调整pH为7.5，固体培养基加1.2％的琼脂，灭菌。
培养沃氏富盐菌营养缺陷菌株H1424，还需要加入尿嘧啶(终浓度50μg/ml)和胸苷(终浓度40μg/ml)，记为YPC-UT培养基。
2)从YPC-UT平板上用牙签挑取沃氏富盐菌营养缺陷菌株H1424的单一克隆，接种于YPC-UT液体培养基中，37℃，200rpm培养到对数期，然后以1：20转接于新鲜培养基中，约生长20h，即可用于转化。
3)步骤2)完成后，取1ml活化好的菌体于灭菌的离心管中，6,000rpm，离心3min；弃上清，用移液器吸尽残余的上清，然后加入200μl BSS-LS缓冲液，用移液器轻轻吹匀，6,000rpm，离心3min；
4)步骤3)完成后，弃上清，用移液器吸尽残余的上清。然后加入100μl BSS-LS/+甘油缓冲液，用移液器轻轻吹匀；
5)步骤4)完成后，加入10μl 0.5M pH 8.0的EDTA缓冲液，用手轻轻拍打离心管壁，混匀后室温下放置10min，得到原生质体溶液；
6)预先将500ng质粒(pTA1228空质粒或pTA1228-creT)用BSS-LS/+甘油缓冲液调整体积一致至10μl，然后加入到步骤5)所得原生质体溶液中，放置5min；
7)步骤6)完成后，加入120μl(与上面离心管中溶液等体积)60％的PEG 600溶液(使用时用UBSS-LS缓冲液配置)，迅速上下颠倒离心管多次，直到溶液变得透亮、均一，然后室温放置20min；
8)步骤7)完成后，加入1ml的复苏培养基(23％MGM+sucrose)，上下颠倒离心管混匀溶液，6,000rpm，离心4min；弃上清，用移液器吸尽残余的上清后，各EP管中加入600μl的复苏培养基悬浮菌体，37℃，200rpm摇床复苏12h。
9)步骤8)完成后，将上述复苏培养基涂布到YPC培养基平板上，将涂好的平板放置于封口的塑料袋中，待液体被平板彻底吸收后，将平板倒置培养5-7天后获得转化子克隆。
d)沃氏富盐菌生长曲线测定；
1)分别挑取pTA1228空质粒和pTA1228-creT的转化子克隆，接种于10ml的YPC液体培养基中，培养至对数期后，转接于新鲜培养基，再次培养至对数期；
2)步骤1)完成后，测定pTA1228和pTA1228-creT的转化子菌液的OD600，分别向含有500μg/ml色氨酸的100ml YPC培养基和不含色氨酸的100ml YPC培养基中加入等量的(1OD)菌液。每个接种条件设置三个技术重复，总共12个样品。
3)接种完成后，37℃，200rpm摇床培养，每隔12小时取样测定每个样品的菌液OD600，绘制生长曲线(见图5中B)。
4)同时，每隔24小时从加色氨酸的六个样品中吸取100μl菌液，用900μl YPC培养基对其进行连续的梯度稀释，然后取5μl不同稀释度的菌液在不含色氨酸诱导物的YPC平板上点圈(如图5中C所示)，静置待平板上的菌液风干后，于37℃温箱培养3-4天后进行克隆计数，计算菌落形成单位(CFU)。
生长曲线如图5中B所示，在不添加色氨酸诱导物的YPC培养基中，pTA1228(空质粒)和pTA1228-creT(含creT质粒)转化子的生长曲线几乎一致；而在添加了色氨酸诱导物的YPC培养基中，pTA1228-creT转化子的生长受到明显抑制。
另外，通过梯度稀释涂板实验(图5中C)，可以看到pTA1228-creT转化子的CFU曲线几乎完全被抑制，表明菌体增殖几乎停滞(图5中B)。
这些结果表明，CreT RNA在其它古菌中也具有细胞毒性。
二、CreT作为反向筛选标记用于质粒消除。
a)反向筛选培养
1)将步骤一所得pTA1228空质粒和pTA1228-creT的转化子克隆分别接种至10ml的YPC液体培养基培养至稳定期。
2)将上述菌液分别以1:20转接至10ml新鲜的YPC培养基，培养至对数期，测定两者OD600。
3)如图6中A所示，用YPC培养基将上述两菌液调节至相同OD600，取50μl相同体积(相同细胞量)的菌液分别接种于10ml含有500μg/ml色氨酸的YPC-UT培养基，37℃，200rpm摇床培养3天。
b)梯度稀释涂板
1)将上述菌液进行OD600测定，然后用YPC培养基调整至相同OD600，并进行10倍的梯度稀释。
2)将不同稀释梯度的pTA1228和pTA1228-creT菌液，各取5μl分别在YPC(选择性培养基)和YPC-UT(非选择性培养基)的平板上进行点圈，静置晾干后，温箱37℃培养3-4天。
3)克隆计数。通过对非选择性培养基上的克隆计数，可以大致推算稀释前菌液中总细胞浓度，通过对选择性培养基上的克隆计数，可以大致推算稀释前菌液中未丢失质粒的细胞浓度。
结果如图6中B所示，携带空质粒pTA1228的菌液在选择性培养基和非选择性培养基上的CFU大致相同，表明绝大部分的细胞未丢失该质粒；而携带pTA1228-creT的菌液在选择性培养基上的CFU不到非选择性培养基上CFU的一半，说明一半以上的细胞丢失了该质粒，证实了CreT毒素的反向筛选作用。
实施例4、CreT毒素经改造应用于大肠杆菌中
为检验CreT能够应用大肠杆菌中，发明人将creT基因克隆至pET28a载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行IPTG诱导表达。由于CreT的毒性功能需要高效的翻译起始信号(包括SD序列和起始密码子AUG)，而细菌和古菌中具有不同SD序列，因此需要将CreT上原有的古菌SD序列换成pET28a上自带的大肠杆菌SD序列(图7中A)。
SEQ ID No.6：
SEQ ID No.6的第42-104位为CreT基因序列，方框为大肠杆菌SD序列，阴影部分为CreT的翻译起始密码子和两个连续的精氨酸稀有密码子，双下划线部分为形成茎环结构的一对回文序列。
a)pET28a-creT质粒的构建
1)引物设计(Xba I和BamH I酶切位点用下划线标记；粗体为互补序列)：
2)将上述两引物稀释至10μmol/L，各取1μL混合，用高保真KOD Plus DNA聚合酶进行常规PCR扩增，获得两者的衔接片段。
3)回收步骤2)所得衔接片段，然后用BamH I和Xba I分别双酶切该片段，得到大片段，将所得大片段与pET28a(+)载体经BamH I和Xba I双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为pET28a-creT。
pET28a-creT为将pET28a(+)载体的BamH I和Xba I识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.6的第7-104位所示的DNA片段得到的重组载体。pET28a-creT能转录SEQ ID No.10所示的creT RNA：
b)pET28a-creT转化大肠杆菌BL21(DE3)。
1)从-70℃冰箱中取出大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞悬液，在冰上融化，用冷却的无菌枪头吸取100ng pET28a(+)或pET28a-creT质粒加入感受态中，冰上静置30min；
2)42℃进行90s热激转化并用LB培养基复苏培养
3)步骤2)完成后，分别取5μL、100μL各自涂布于含有50ug/mL卡那霉素抗性的LB平板上及含有0.1mM IPTG和50ug/mL卡那霉素的LB固体平板上，于30℃静置培养至长出菌落(图7中C)。
c)转化效率统计，转化效率＝平板的克隆数×稀释倍数/转化用的重组载体质量。
如图7中B所示，在不含IPTG的卡那平板上，pET28a空质粒和pET28a-creT得到的转化子数量无明显差异；而在含有IPTG的卡那平板上，pET28a空质粒得到的转化子数量比pET28a-creT高出约104倍，pET28a和pET28a-creT的转化效率(各三个生物学重复)分别为634000、416000、884000CFU/μg和100、50、50CFU/μg。该结果表明，CreT在大肠杆菌中的诱导表达也可产生细胞毒性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种古菌和细菌中通用的RNA型毒素及其相关生物材料
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 223
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atagggtacc atagtgacgt ctaatcgtat attctgtcgc atcatatata gttctagggt 60
atagcacaag ggaaaatatt ttgtgagtgc cggttgaatg tgttgacaag aagggtgatc 120
acatgagaag atgatactct ggctggcatc tgtccttgga aacactcatg ccagccacga 180
tcaggagtat aggagaactc cctcaatcat atatggatcc gcg 223
<210> 2
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
atagggtacc atagtgacgt ctaatcgtat attctgtcgc atcatatata gttctagggt 60
atagcacaag ggaaaatatt ttgtgagtgc cggttgaatg tgttgacaag aagggtgatc 120
acatgagaag atgatactct ggctggcatc tgtccttgga aacactcatg ccagccacga 180
tcaggagtat aggagaactc cctcaatcat atatagctac ccgagacaat gtagttttac 240
tgggtcgggg acattccaga tgaacaaagg ttgggttgaa gtccttgggc tattgtcccg 300
atcccagttc attttaatag aggatccgcg 330
<210> 3
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atagggtacc atagtgacgt ctaatcgtat attctgtcgc atcatatata gttctagggt 60
atagcacaag ggaaaatatt ttgtgagtgc cggttgaatg tgttgacaag aagccacatc 120
acatgagaag atgatactct ggctggcatc tgtccttgga aacactcatg ccagccacga 180
tcaggagtat aggagaactc cctcaatcat atatagctac ccgagacaat gtagttttac 240
tgggtcgggg acattccaga tgaacaaagg ttgggttgaa gtccttgggc tattgtcccg 300
atcccagttc attttaatag aggatccgcg 330
<210> 4
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (123)..(125)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
atagggtacc atagtgacgt ctaatcgtat attctgtcgc atcatatata gttctagggt 60
atagcacaag ggaaaatatt ttgtgagtgc cggttgaatg tgttgacaag aagggtgatc 120
acnnnagaag atgatactct ggctggcatc tgtccttgga aacactcatg ccagccacga 180
tcaggagtat aggagaactc cctcaatcat atatagctac ccgagacaat gtagttttac 240
tgggtcgggg acattccaga tgaacaaagg ttgggttgaa gtccttgggc tattgtcccg 300
atcccagttc attttaatag aggatccgcg 330
<210> 5
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
atagggtacc gcccgttctc gtcgcgctct cgaagctgtt tctcgcgcgc tcgcgtcctc 60
gaaagtgaca tcgctcgacc ggtggtcgtc ggcggtcgct gaagtcggct cgtggcgaga 120
acggaacagc cggcgacacc gatgcacaca ccagtccacg agcgccgaaa accgggcgta 180
gcccctcgat tttccgcctg ccgattactt cacattcgcg gacctattgc gcaaagaagg 240
gtgatcacat gagaagatga tactctggct ggcatctgtc cttggaaaca ctcatgccag 300
ccacgatcag gttttttttg gatccgcg 328
<210> 6
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac catgagaaga tgatactctg 60
gctggcatct gtccttggaa acactcatgc cagccacgat caggggatcc 110
<210> 7
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
aagaagggug aucacaugag aagaugauac ucuggcuggc aucuguccuu ggaaacacuc 60
augccagcca cgaucaggag uauaggagaa cucccucaau cauauau 107
<210> 8
<211> 90
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
acaauguagu uuuacugggu cggggacauu ccagaugaac aaagguuggg uugaaguccu 60
ugggcuauug ucccgauccc aguucauuuu 90
<210> 9
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
aagaagggug aucacaugag aagaugauac ucuggcuggc aucuguccuu ggaaacacuc 60
augccagcca cgaucagguu uuuuuu 86
<210> 10
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
aaggagauau accaugagaa gaugauacuc uggcuggcau cuguccuugg aaacacucau 60
gccagccacg aucagg 76
Claims (10)
1.一种RNA分子，含有如下A1)-A12)中的任一种：
A1)RNA分子，其结构为：5′-SD片段-(N)n-AUG/GUG-rare codons-(N)m-stem-3′，其中SD片段可以是常见SD(Shine-Dalgarno)序列，例如可以是在细菌或古菌中常用的SD序列，例如GGGUGAUC和AAGGAG；SD片段与起始密码子AUG/GUG之间的短序列(N)n，可以取细菌或古菌中常见长度，本领域技术人员可以根据宿主细胞以及具体SD序列进行合理调整，其中常见长度是n取0-12之间的整数，最常见的长度n可以是2-10之间的自然数；AUG/GUG是起始密码子，可以选择AUG或GUG；起始密码子后面rare codons结构是由p个稀有的密码子(例如精氨酸的稀有密码子AGA或AGG，异亮氨酸的稀有密码子ATA)组成的串联结构，例如rarecodons结构可以是AGAAGA或AGGAGG或ATAATA或其它稀有密码子的串联，密码子的数目p可以根据需要调整，例如2-100或2-50或2-30或2-20或2-15或2-10或2-8或2-6或2-5等；rarecodons与stem结构之间的短序列(N)m，其长度m是本领域技术人员根据细菌以及古细菌实际情况和经验合理调整的，例如m可以是0-20之间的自然数，再例如可以是3-15，再例如可以是5-10,再例如可以是8；stem结构是单链RNA分子中由一对反向重复序列发生连续的碱基匹配而形成的双链“茎”结构，茎的长度(碱基对数目)可以适当调整，例如可以是4-100之间的自然数，再例如可以是4-50，再例如可以是4-20，再例如可以是10，两段反向重复序列之间可以通过其它片段连接，从而形成“茎环”结构；
A2)序列表中SEQ ID No.7的第6-78位所示的RNA分子；
A3)序列表中SEQ ID No.7的第1-78位所示的RNA分子；
A4)序列表中SEQ ID No.7的第6-107位所示的RNA分子；
A5)序列表中SEQ ID No.7的第1-107位所示的RNA分子；
A6)将A2)、A3)、A4)或A5)的除SD片段、片段1、片段2、片段3和片段4外的片段经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；所述SD片段的序列为SEQ ID No.7的第6-13位，所述片段1的序列为SEQ ID No.7的第16-18位，所述片段2的序列为SEQ ID No.7的第19-24位，所述片段3的序列为SEQ ID No.7的第33-42位，所述片段4的序列为SEQ ID No.7的第61-70位；
A7)将A2)、A3)、A4)或A5)的所述片段1的序列替换为GUG得到的RNA分子；
A8)将A2)、A3)、A4)或A5)的所述片段2的序列替换为p个连续稀有密码子得到的RNA分子，2≤p，所述稀有密码子为AGA或AGG或ATA或其他稀有密码子；
A9)将A2)、A3)、A4)或A5)的所述片段3和所述片段4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的所述片段3和所述片段4处仍然保持反向互补的RNA分子；
A10)将A2)、A3)、A4)或A5)的所述SD片段替换为非西班牙盐盒菌的SD片段得到的RNA分子；
A11)将A2)、A3)、A4)或A5)的所述片段3和所述片段4之间的片段进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的RNA分子；
A12)将A2)、A3)、A4)或A5)进行上述A6)、A7)、A8)、A9)、A10)和A11)中至少两种改造得到的RNA分子。
2.与权利要求1所述RNA分子相关的生物材料，为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)转录权利要求1所述RNA分子的DNA分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物，例如微生物可为古菌或细菌，再例如所述古菌可为西班牙盐盒菌或沃氏富盐菌，再例如所述细菌可为大肠杆菌、梭菌、芽孢杆菌、埃希氏菌、放线菌或乳酸菌。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述DNA分子为如下b1)-b6)中的任一种：
b1)序列表中SEQ ID No.2的第113-185位所示的DNA分子；
b2)序列表中SEQ ID No.2的第108-185位所示的DNA分子；
b3)序列表中SEQ ID No.2的第113-214位所示的DNA分子；
b4)序列表中SEQ ID No.2的第108-214位所示的DNA分子；
b5)与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且转录权利要求1所述RNA分子的DNA分子；
b6)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)或b5)限定的核苷酸序列杂交，且转录权利要求1所述RNA分子的DNA分子。
4.根据权利要求2或3所述的生物材料，其特征在于：B2)所述表达盒中，启动子的序列为SEQ ID No.2的第58-107位或SEQ ID No.5的第11-233位，或者B2)所述表达盒中，终止子的序列为SEQ ID No.2的第207-214位或SEQ ID No.5的第312-319位。
5.权利要求1所述RNA分子的下述任一应用：
X1、在作为毒素中的应用；
X2、在作为反向筛选标记中的应用；
X3、在作为原核生物毒素中的应用；
X4、在基因工程中的应用；
X5、在制备基因工程产品中的应用；
X6、在基因工程中作为毒素或反向筛选标记中的应用；
X7、在制备基因治疗产品中的应用；
X8、在基因治疗中作为毒素中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述原核生物为古细菌或细菌；
进一步，所述古菌可为西班牙盐盒菌或沃氏富盐菌；所述细菌可为大肠杆菌、梭菌、芽孢杆菌、埃希氏菌、放线菌或乳酸菌。
7.权利要求2-4中任一所述的生物材料的下述任一应用：
Y1、在制备权利要求1所述RNA分子中的应用；
Y2、在制备TA毒素中的应用；
Y3、在基因工程中的应用；
Y4、在制备基因工程产品中的应用；
Y5、在制备基因治疗产品中的应用。
8.一种组合物，由权利要求1所述RNA分子与creA RNA分子组成，所述creA RNA分子的序列为序列表中SEQ ID No.8。
9.生物材料组合，由权利要求2-4中任一所述的生物材料和与creA RNA分子相关的生物材料组成，所述与creA RNA分子相关的生物材料为下述C1)至C4)中的任一种：
C1)转录权利要求8中所述creA RNA分子的DNA分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物，进一步的，例如微生物可为古菌或细菌，再例如所述古菌可为西班牙盐盒菌或沃氏富盐菌，再例如所述细菌可为大肠杆菌、梭菌、芽孢杆菌、埃希氏菌、放线菌或乳酸菌。
10.权利要求8所述的组合物或者权利要求9所述的生物材料组合的如下之一应用：
X1、在基因工程中的应用；
X2、在制备基因工程产品中的应用；
X3、在基因工程中作为毒素或反向筛选标记中的应用；
X4、在制备基因治疗产品中的应用；
X5、在基因治疗中作为毒素中的应用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011320316.0A CN114457071A (zh) | 2020-11-23 | 2020-11-23 | 一种古菌和细菌中通用的rna型毒素及其相关生物材料 |
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|---|---|
| CN114457071A true CN114457071A (zh) | 2022-05-10 |
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114457071A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024032145A1 (zh) * | 2022-08-09 | 2024-02-15 | 中国科学院微生物研究所 | 一种偶联的crispr和毒素-抗毒素元件及其在消杀耐药细菌中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102164950A (zh) * | 2008-08-20 | 2011-08-24 | 新泽西内科与牙科大学 | 新型毒素-抗毒素系统 |
| CN102676414A (zh) * | 2011-03-08 | 2012-09-19 | 中国科学院微生物研究所 | 一种基于西班牙盐盒菌和pyrF基因的遗传操作系统及其应用 |
-
2020
- 2020-11-23 CN CN202011320316.0A patent/CN114457071A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102164950A (zh) * | 2008-08-20 | 2011-08-24 | 新泽西内科与牙科大学 | 新型毒素-抗毒素系统 |
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