CN108929882A - 一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用，实现了基因敲除及基因敲入，属于基因工程领域。该方法首先借助温度敏感型质粒PNZT1为载体构建温敏敲除(入)质粒；然后将敲除(入)质粒转化地衣芽孢杆菌经过变温传代实现敲除(入)盒同源替换靶基因；最后导入FLP重组酶表达质粒介导抗性基因的回收。本发明首次在地衣芽孢杆菌基因编辑中运用FLP/FRT重组系统并实现了无标记基因敲除及基因敲入，为地衣芽孢杆菌的代谢工程改造提供了有效的技术手段。

Description

一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用。

背景技术

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，简称BL)是一种常见的革兰氏阳性细菌，具有耐热、酶系丰富、产酶量高和安全等诸多优良特性，是最具应用潜力和价值的芽孢杆菌之一。不同于绝大多数芽孢杆菌在生长过程中严格需氧，地衣芽孢杆菌属兼性厌氧菌，所以对生长和发酵条件的适应性更强。目前地衣芽孢杆菌被广泛用于蛋白质的胞外表达，产物包括α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、青霉素酶等，最高产量可达25g/L。地衣芽孢杆菌也被用于生产多肽类抗生素(如杆菌肽)、有机酸、高分子聚合物(如多聚谷氨酸)等产品，对现代工业生产具有重要意义。

当前以基因组序列信息为蓝图，基于人工设计的遗传扰动而进行的代谢工程已成为研究地衣芽孢杆菌复杂的代谢途径以及进行菌种改造构建需要表型的最有效策略。然而由于地衣芽孢杆菌遗传转化效率不高，几乎无法形成感受态(刘冰南.地衣芽孢杆菌转化薯渣与汁水效能及其代谢机理研究[D].哈尔滨工业大学,2015.)，导致其基因敲除存在一定困难，相关成功运用的例子也较少。

传统的转化敲除盒片段替换靶基因的方法是实现微生物基因敲除的经典策略，主要通过微生物本身的RecA重组系统(主要包括RecA和RecBCD等蛋白)发挥作用。但是受限于地衣芽孢杆菌遗传转化效率不高，且线性DNA在菌体内受到限制修饰系统的降解，导致该方法的阳性转化率很低，而且该方法还面临无法进行抗性标记回收问题。

华中农业大学的陈守文团队(Li K,Cai D,Wang Z,et al.Development of anEfficient Genome Editing Tool in Bacillus licheniformis Using CRISPR-Cas9Nickase.[J].Appl Environ Microbiol,2018,84(6):AEM.02608-17.)把近年来发现的CRISPR/Cas9系统运用到地衣芽孢杆菌中，实现了单基因敲除、双基因同时敲除以及片段整合等操作。虽然该方法的敲除效率较高，但是缺陷在于Cas9基因分子量过大，而且地衣芽孢杆菌不具备非同源末端结合功能(non-homologous end joining，NHEJ)，因此需要额外的同源修复片段(homology directed repair，HDR)，导致构建的敲除质粒过大(大于10Kbp)使得难以转化。另外CRISPR/Cas9系统还存在普遍的脱靶效应。

目前比较成功的地衣芽孢杆菌基因敲除策略是采用以温敏质粒为载体的同源双交换法，即获取目的基因上下游两段基因序列作为同源臂，构建穿梭载体或自杀载体并转化到目的菌株中，通过同源双交换实现靶基因的敲除。德国的Nahrstedt等人(NahrstedtH,Waldeck J,M,et al.Strain development in Bacillus licheniformis:Construction of biologically contained mutants deficient in sporulation andDNA repair[J].Journal of Biotechnology,2005,119(3):245-254.)通过使用温度敏感型质粒pE194为载体构建敲除质粒敲除了地衣芽孢杆菌DNA修复相关基因recA和芽孢形成关键基因spoIV。该方法的优点是可以克服地衣芽孢杆菌遗传转化效率低的问题，缺点是由于敲除盒上没有设计筛选标记，会造成筛选工作量极大，进而导致敲除效率非常低。

FLP/FRT重组系统是发现于酿酒酵母2μm环状质粒上的位点特异性重组系统(site-specific recombination)，通过FLP重组酶(flippase recombination enzyme)特异性识别FRT位点(FLP recombination target)可介导2个FRT位点之间DNA片段的删除、倒位与置换等。FLP/FRT重组系统由于具有较高的重组效率和靶向性，已经被广泛应用于细菌、HIV病毒等微生物以及拟南芥、水稻、小鼠、果蝇、线虫等高等真核模式生物的研究中，实现了基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等基因工程操作。

Tan等人(Tan X,Liang F,Cai K,et al.Application of the FLP/FRTrecombin-ation system in cyanobacteria for construction of markerlessmutants.[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2013,97(14):6373-6382.)应用FLP/FRT重组系统成功构建出无抗性标记的cyanobacteria phaAB敲除重组菌株；Sanchez-Martinez等人(Sánchez-Martínez C,Pérez-Martín J.Site-specific targeting ofexogenous DNA into the genome of,Candida albicans,using the FLP recombinase[J].Molecular Genetics&Genomics Mgg,2002,268(3):418.)应用FLP/FRT系统实现在Candida albicans中删除筛选标记基因URA3和插入外源基因。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用。本发明高效地实现了基因敲除及外源基因的敲入，为地衣芽孢杆菌的代谢工程改造提供了有效的技术手段。

本发明的技术方案如下：

一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法，包括由温敏基因敲除质粒、及温敏基因敲入质粒介导的基因敲除及敲入，以及由FLP/FRT系统介导的抗性回收；

所述由温敏基因敲除质粒、及温敏基因敲入质粒介导的基因敲除及敲入是指：温敏基因敲除及敲入质粒转化至地衣芽孢杆菌中，之后通过变温传代过程实现敲除盒及敲入盒同源替换靶基因，得到基因敲除菌株及基因敲入菌株；

所述由FLP/FRT系统介导的抗性回收是指：首先构建FLP重组酶表达质粒；构建的重组酶表达质粒转化至地衣芽孢杆菌的基因敲除菌株及基因敲入菌株中；质粒表达的FLP重组酶特异性识别FRT位点并介导2个FRT位点之间的抗性基因表达盒的删除，即转化至地衣芽孢杆菌中的FLP重组酶表达质粒在菌体中表达出FLP重组酶，FLP重组酶可以识别FRT位点，并且删除2个FRT位点之间的DNA片段(此处是指抗性基因表达盒)。

所述温敏基因敲除质粒是在温敏质粒PNZT1的基础上，插入四环素抗性基因表达盒以及敲除盒；

所述敲除盒按照基因敲除靶基因的方向依次包括以下核心元件：基因敲除靶基因上游同源臂、FRT位点、卡那霉素抗性基因表达盒、FRT位点、基因敲除靶基因下游同源臂。

所述温敏敲入质粒是在温敏质粒PNZT1的基础上，插入卡那霉素抗性基因表达盒以及敲入盒；

所述敲入盒按照基因敲入靶基因的方向依次包括以下核心元件：基因敲入靶基因上游同源臂、vgb基因表达盒、FRT位点、四环素抗性基因表达盒、FRT位点、基因敲入靶基因下游同源臂。

所述基因敲除及敲入的具体步骤如下：

(1)把构建好的温敏基因敲除及敲入质粒通过电转的方法转入地衣芽孢杆菌细胞中，提质粒酶切验证；

(2)转化成功的含敲除及敲入质粒的转化子首先在30℃、200rpm下增值活化2代，形成足够的新鲜菌液；

(3)转接2％的菌液至15mL LB培养基，42℃、250rpm无抗传代2次；

(4)转接2％的步骤(3)得到的菌液至新的15mL LB培养基，30℃、200rpm无抗传代2次；

(5)最后用接菌环蘸取菌液在敲除盒及敲入盒抗性平板上划线挑菌落，平板置于37℃培养箱培养，12-20h长出单菌落，菌落PCR筛选得到双交换重组子。

所述FLP重组酶表达质粒构建方法如下：

(1)flp结构基因克隆自大肠杆菌质粒PCP20，NdeI&BamHI酶切后连接至大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PMA5；

(2)从PMA5上克隆出携带HpaII启动子的FLP重组酶表达盒，连接到温敏质粒PNZTT上得到基因敲除消抗质粒PNZTT-flp，连接到温敏质粒PNZTK上得到基因敲入消抗质粒PNZTK-flp。

所述FLP/FRT系统介导的抗性回收方法如下：转化FLP重组酶表达质粒，抗性回收时培养温度是30℃，抗性回收后培养温度提高至37℃无抗培养2代可消除质粒。

优选的，所述基因敲除靶基因是α-淀粉酶基因amyL，该基因序列如SEQ ID NO：1所示；所述FRT位点序列如SEQ ID NO：2所示；所述FLP重组酶表达盒序列如SEQ ID NO：3所示；所述基因敲入是指整合外源透明颤菌血红蛋白基因vgb到基因组的同时敲除pflB基因，pflB基因编码丙酮酸甲酸裂解酶，pflb基因序列如SEQ ID NO：4所示，vgb表达盒序列P43-vgb如SEQ ID NO：5所示；所述卡那霉素抗性基因表达盒序列如SEQ ID NO：6所示；所述四环素抗性基因表达盒序列如SEQ ID NO：7所示；所述温敏质粒PNZT1序列如SEQ ID NO：8所示。

优选的，所述温敏质粒PNZT1是一种大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒，含有温度敏感性复制子，在30℃及以下可稳定复制，37℃及以上丢失。

换句话说，本发明的基因编辑方法包括基因敲除及基因敲入；所述基因敲除实施流程为首先构建温敏敲除质粒，电转到地衣芽孢杆菌中通过变温传代过程得到敲除重组子，然后对敲除重组子转化FLP重组酶表达质粒介导选择标记卡那霉素抗性基因表达盒的删除；所述基因敲入实施流程为首先构建温敏敲入质粒，电转到地衣芽孢杆菌中通过变温传代过程得到敲入重组子，然后对敲入重组子转化FLP重组酶表达质粒介导选择标记四环素抗性基因表达盒的删除。

所述基因编辑方法包括基因敲除和基因敲入。

所述的基因敲除具体包括以下步骤：

(1)以温度敏感型(简称温敏)质粒PNZT1为载体，构建温敏敲除质粒PNZTT-AFKF，质粒上携带的敲除盒按照靶基因的方向依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、FRT位点、卡那霉素抗性基因表达盒、FRT位点、靶基因下游同源臂；

(2)以温敏质粒PNZT1为载体构建FLP重组酶表达质粒PNZTT-flp；

(3)敲除质粒PNZTT-AFKF电转化到地衣芽孢杆菌，经过变温传代得到靶基因敲除的重组子；

(4)对敲除重组子转化FLP重组酶表达质粒PNZTT-flp，介导抗性基因的切除。

所述的基因敲入具体包括以下步骤：

(1)以温敏质粒PNZT1为载体，构建温敏敲入质粒PNZTK-PFTF-vgb，质粒上携带的敲入盒按照靶基因的方向依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、vgb基因表达盒、FRT位点、四环素抗性基因表达盒、FRT位点、靶基因下游同源臂；

(2)以温敏质粒PNZT1为载体构建FLP重组酶表达质粒PNZTK-flp；

(3)敲入质粒PNZTK-PFTF-vgb电转化到地衣芽孢杆菌，经过变温传代得到vgb敲入的重组子；

(4)对敲入重组子转化FLP重组酶表达质粒PNZTK-flp，介导抗性基因的切除。

优选的，基因敲除步骤(1)所述的构建温敏敲除质粒PNZTT-AFKF由以下具体步骤得到：

(1)选择地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因amyL为敲除试验基因。以地衣芽孢杆菌基因组为模板，利用引物amy-XhoI-F&amy-HindIII-R克隆出α-淀粉酶结构基因，连接到PMD19T-simple上，构建质粒19T-amyL。19T-amyL经KpnI和SalI酶切胶回收大片段后待用；

(2)以质粒PMA5为模板，利用引物FRT-KpnI-Kan-F&FRT-SalI-Kan-R进行PCR扩增，得到两端含同向FRT位点的卡那霉素(Kanamycin，简称Kan)抗性基因表达盒，经KpnI和SalI双酶切后与上一步骤相同酶切的19T-amyL大片段连接，构建质粒19T-AFKF。至此，即在T载上构建好了敲除盒AFKF(amyL-FRT-Kan-FRT-amyL,简称AFKF)，上下游同源臂长分别为547bp和420bp；

(3)以PHY300-PLK质粒为模板，利用引物Tet-NotI-F&Tet-NotI-R克隆得到四环素(tetracycline，简称Tet)抗性基因表达盒，经NotI酶切后连接到相同酶切的PNZT1，构建质粒PNZTT；

(4)最后用XhoI和HindIII酶切19T-AFKF，胶回收敲除盒片段AFKF，连接到相同酶切的PNZTT质粒，构建得到温敏敲除质粒PNZTT-AFKF。

优选的，基因敲除步骤(2)FLP重组酶表达质粒PNZTT-flp由以下具体步骤得到：

flp结构基因克隆自大肠杆菌质粒PCP20，NdeI&BamHI酶切后连接至大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PMA5；从PMA5上克隆出携带HpaII启动子的flp表达盒，连接到温敏质粒PNZTT上得到基因敲除消抗质粒PNZTT-flp。

优选的，基因敲除步骤(3)由以下具体步骤得到：

基因敲除质粒PNZTT-AFKF通过电转的方法导入地衣芽孢杆菌中；BL/PNZTT-AFKF首先在30℃增值活化，形成足够的菌浓；然后转接至42℃无抗培养传代2次，发生第一次同源重组单交换；再转接至30℃无抗培养传代2次，发生第二次同源重组交换，敲除盒同源替换靶基因。最后用抗性平板筛选出Kan^R、Tet^S的转化子，转化子经诊断PCR验证后命名为BL△amyL::FKF。

优选的，基因敲除步骤(4)由以下具体步骤得到：

对BL△amyL::FKF导入消抗质粒PNZTT-flp，由于FLP重组酶的最适酶活温度是30℃，因此BL△amyL::FKF/PNZTT-flp在30℃下培养2代即可筛选得到卡那抗性基因回收的重组子，重组子命名为BL△amyL。

优选的，基因敲入步骤(1)所述的构建温敏敲入质粒PNZTK-PFTF-vgb由以下具体步骤得到：

(1)选择丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB为敲除基因，同时整合外源血红蛋白基因vgb到基因组。首先以地衣芽孢杆菌基因组为模板，利用引物pflB-SmaI-F&pflB-XhoI-R扩增得到pflB结构基因，连接到PMD19T-simple，构建质粒19T-pflB。以19T-pflB为模板，利用引物pflB-PstI-R&pflB-BamHI-F反向PCR，扩增产物经PstI和BamHI酶切后待用；

(2)以PHY300-PLK质粒为模板，利用引物FRT-BamHI-Tet-F&FRT-PstI-Tet-R扩增得到两端含同向FRT位点的四环素抗性基因表达盒，经BamHI和PstI酶切后与上面的反向PCR产物连接，构建质粒19T-PFTF；

(3)以pWB980-vgb为模板，利用引物vgb-BamHI-F和vgb-BamHI-R扩增得到含P43启动子的vgb表达盒，BamHI单酶切后连接到同样单酶切的19T-PFTF，构建质粒19T-PFTF-vgb。至此，即在T载上构建好了敲入盒PFTF-vgb(pflB-FRT-Tet-FRT-vgb-pflB，简称PFTF-vgb)，上下游同源臂长分别为935bp和1003bp；

(4)以PMA5质粒为模板，利用引物Kan-NotI-F&Kan-NotI-R克隆得到卡那霉素抗性基因表达盒，经NotI酶切后连接到相同酶切的PNZT1，构建质粒PNZTK；

(5)最后用SmaI和XhoI酶切19T-PFTF-vgb胶回收得到敲入盒PFTF-vgb，连接到相同酶切的PNZTK质粒，构建得到温敏敲入质粒PNZTK-PFTF-vgb。

优选的，基因敲入步骤(2)FLP重组酶表达质粒PNZTK-flp由以下具体步骤得到：

flp结构基因克隆自大肠杆菌质粒PCP20，NdeI&BamHI酶切后连接至大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PMA5；从PMA5上克隆出携带HpaII启动子的flp表达盒，连接到温敏质粒PNZTK上得到基因敲入消抗质粒PNZTK-flp。

优选的，基因敲入步骤(3)和步骤(4)的操作方法与基因敲除相同。

本发明有益的技术效果在于：

本发明使用的温度敏感型质粒PNZT1在30℃及以下培养条件下可稳定复制，37℃及以上质粒无法复制而丢失，因此对以温敏质粒PNZT1为载体构建的敲除(入)质粒和消抗质粒丢失问题可以很好的人为控制。

本发明对地衣芽孢杆菌amyL基因的敲除效率最高达100％，vgb基因的敲入效率最高达100％；抗性回收效率80％。

本发明使用了温度敏感型质粒PNZT1为载体构建基因敲除及基因敲入质粒，把基因敲除及敲入分成两个独立事件，即转化和重组，转化后首先对转化子进行大量繁殖扩增，之后再进行基因敲除及敲入，有效解决了地衣芽孢杆菌转化效率低导致敲除及敲入困难的问题。

本发明在构建敲除盒及敲入盒时在左右同源臂中间插入了抗性基因表达盒，可以减少筛选工作量，进而提高敲除及敲入效率。

本发明构建的FLP/FRT系统可以对敲除菌株及敲入菌株基因组上的抗性基因进行回收，使得抗性基因可以循环使用。

附图说明

图1温敏amyL敲除质粒PNZTT-AKF。

图2温敏vgb敲入质粒PNZTK-PFTF-vgb。

图3温敏敲除消抗质粒PNZTT-flp。

图4温敏敲入消抗质粒PNZTK-flp。

图5amyL敲除示意图。

图6vgb敲入示意图。

图7amyL敲除结果；其中，A：BL△amyL::Kan敲除验证引物菌落PCR。M：DNA Marker；0L-8L：验证引物amyL-F&amyL-M-R菌落PCR；0R-8R：验证引物amyL-M-F&amyL-R菌落PCR。0L和0R表示BL原始菌。PCR条带大小见图5。B：BL△amyL消抗验证引物amyL-F&amyL-R菌落PCR，1表示BL原始菌，1901bp；2表示BL△amyL::Kan，2603bp；3-4表示BL△amyL，1417bp。

图8vgb敲入结果；其中，A：BL△pflB::FTF:vgb敲入验证引物菌落PCR。M：DNAMarker；1L-8L：验证引物pflB-F&pflB-M-R菌落PCR；1R-8R：验证引物pflB-M-F&pflB-R菌落PCR。PCR条带大小见图6；B：BL△pflB::vgb消抗验证引物pflB-F&pflB-R菌落PCR，3525bp；C：BL△pflB::vgb基因组为模板PCR扩增vgb，441bp。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1：温敏敲除质粒及温敏敲入质粒的构建

温敏敲除质粒的构建：选择地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因amyL为敲除试验基因。以地衣芽孢杆菌基因组为模板，利用引物amy-XhoI-F&amy-HindIII-R克隆出α-淀粉酶结构基因，连接到PMD19T-simple上，构建质粒19T-amyL。以质粒PMA5为模板，利用引物FRT-KpnI-Kan-F&FRT-SalI-Kan-R进行PCR扩增，得到两端含同向FRT位点的卡那霉素(Kanamycin，简称Kan)抗性基因表达盒，经KpnI和SalI双酶切后与相同酶切的19T-amyL大片段连接，上下游同源臂长分别为547bp和420bp，构建质粒19T-AFKF。至此，即在T载上构建好了敲除盒AFKF(amyL-FRT-Kan-FRT-amyL,简称AFKF)。最后用XhoI和HindIII酶切19T-AFKF，胶回收敲除盒片段AFKF，连接到相同酶切的PNZTT质粒，构建得到温敏敲除重组质粒PNZTT-AFKF(图1)。

温敏敲入质粒的构建：选择丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB为敲除基因，同时整合外源血红蛋白基因vgb到基因组。首先以地衣芽孢杆菌基因组为模板，利用引物pflB-SmaI-F&pflB-XhoI-R扩增得到pflB结构基因，连接到PMD19T-simple，构建质粒19T-pflB。以19T-pflB为模板，利用引物pflB-PstI-R&pflB-BamHI-F反向PCR，形成上下游同源臂长分别为935bp和1003bp，扩增产物经PstI和BamHI酶切后待用；以PHY300-PLK质粒为模板，利用引物FRT-BamHI-Tet-F&FRT-PstI-Tet-R扩增得到两端含同向FRT位点的四环素(tetracycline，简称Tet)抗性基因表达盒，经BamHI和PstI酶切后与上面的反向PCR产物连接，构建质粒19T-PFTF。以pWB980-vgb为模板，利用引物vgb-BamHI-F和vgb-BamHI-R扩增得到含P43启动子的vgb表达盒，BamHI单酶切后连接到同样单酶切的19T-PFTF，构建质粒19T-PFTF-vgb。至此，即在T载上构建好了敲入盒PFTF-vgb(pflB-FRT-Tet-FRT-vgb-pflB,简称PFTF-vgb)。最后用SmaI和XhoI酶切19T-PFTF-vgb得到敲入盒PFTF-vgb，连接到相同酶切的PNZTK质粒，构建得到温敏敲入重组质粒PNZTK-PFTF-vgb(图2)。

本发明所用引物如表1所示。

表1

注：引物携带的酶切位点用下底横线标出。

实施例2：FLP重组酶表达质粒的构建

以质粒PCP20为模板，利用引物flp-SmaI-F&flp-SmaI-R扩增出FLP重组酶结构基因flp，扩增产物flp经SmaI单酶切后纯化待用。质粒PMA5经NdeI酶切纯化后用等量的2*pfuDNA聚合酶72℃孵育15min补平粘性末端，然后与扩增产物flp连接，构建中间质粒PMA5-flp。以PMA5-flp为模板，利用引物flp-PMA-SmaI-F&flp-PMA-XhoI-R扩增得到含HpaII启动子的flp表达盒，flp表达框与PNZTT经过相同的SmaI和XhoI酶切后连接得到PNZTT-flp，与PNZTK经相同的SmaI和XhoI酶切后连接得到PNZTK-flp。为行文方便，称PNZTT-flp为敲除消抗质粒(图3)，称PNZTK-flp为敲入消抗质粒(图4)。

实施例3：amyL基因敲除及抗性回收

把构建好的敲除质粒PNZTT-AFKF通过电转的方法转入地衣芽孢杆菌细胞中。经验证转化成功的含敲除质粒的转化子首先在30℃、200rpm下增值活化2代，形成足够的新鲜菌浓；转接2％的菌液至15mL LB培养基，42℃、250rpm无抗传代2次；再次转接2％的菌液至新鲜的15mL LB培养基，30℃、200rpm无抗传代2次；最后用接菌环蘸取菌液在卡那霉素抗性平板上划线单菌落，平板置于37℃培养箱培养，12-18h长出单菌落。挑取13株单菌落划线至卡那霉素抗性平板扩增，然后一一对应划线至四环素抗性平板，卡那霉素平板上长而四环素平板上不长的菌落符合敲除重组菌抗性特征。任意挑取8株用敲除验证引物amyL-F&amyL-M-R、amyL-M-F&amyL-R进行菌落PCR验证，结果如图7(A)，PCR条带均和理论相符，说明amyL基因被成功敲除，敲除效率高达100％。敲除重组菌命名为BL△amyL::Kan。

amyL敲除重组子BL△amyL::Kan基因组上携带了卡那霉素抗性基因，使得菌体自身带有抗性。消抗策略是向敲除重组子中导入敲除消抗质粒PNZTT-flp，利用FLP/FRT重组系统特异性删除卡那霉素抗性基因。由于FLP重组酶的最适温度是30℃，因此消抗培养条件为30℃、200rpm，传代2次，然后筛选卡那抗性丢失的单菌落。任意挑选一株BL△amyL::Kan进行抗性回收，在四环素抗性平板上挑选了30个单菌落，一一对应划线至卡那平板上筛选到24株卡那平板不长的单菌落，抗性回收效率达到80％。任意挑选2株对卡那霉素敏感的菌落用消抗验证引物amyL-F&amyL-R进行PCR验证，结果如图7(B)。抗性回收后的重组菌命名为BL△amyL。

实施例4：vgb基因敲入及抗性回收

把构建好的敲入质粒PNZTK-PFTF-vgb通过电转的方法转入地衣芽孢杆菌，然后通过与敲除相同的变温传代过程，抗性平板筛选出四环素平板长而卡那霉素平板不长的单菌落，任意挑选8株单菌落用敲入验证引物pflB-F&pflB-M-R、pflB-M-F&pflB-R进行菌落PCR验证，结果如图8(A)所示，8株菌均成功敲入，即pflB基因被敲除，同时vgb基因整合至pflB基因位置，敲入效率高达100％。vgb基因敲入重组菌株命名为BL△pflB::FTF:vgb。

任意挑选一株BL△pflB::FTF:vgb导入FLP敲入消抗质粒PNZTK-flp进行抗性回收，筛选出四环素敏感的单菌落，用引物pflB-F&pflB-R进行菌落PCR鉴定。结果如图8(B)所示，抗性回收前扩增产物长5101bp，回收后为3525bp，图8(B)条带略小于4000bp，表明抗性回收成功，抗性回收后的重组菌命名为BL△pflB::vgb。提取BL△pflB::vgb基因组为模板，PCR扩增vgb，结果如图8(C)，说明vgb整合至BL△pflB::vgb基因组。

本发明提供了一种基于FLP/FRT系统的地衣芽孢杆菌基因编辑方法，其特征在于借助温敏质粒PNZT1和利用FLP/FRT系统高效地实现了基因敲除及外源基因的敲入，为地衣芽孢杆菌的代谢工程改造提供了有效的技术手段。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用

<141> 2018-07-06

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1901

<212> DNA

<213> α-淀粉酶基因amyL（Gene of α-amylase,amyL)

<400> 1

ctgaaagcaa agggctatca attggtaact gtatctcagc ttgaagaagt gaagaagcag 60

agaggatatt gaataaatga gaagaaagcg ccatatcggc gcttttctgt tgcaagaaaa 120

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cttacaaaat gactcggcat atttggctga acacggtatt actgccgtct ggattccccc 420

ggcatataag ggaacgagtc aagacgatgt aggctacggc gcttacgatc tgtatgattt 480

aggggagttt catcaaaaag ggacggttcg gacaaagtac ggcacaaagg gagaactgca 540

atctgcgatc aacagtcttc attcccggga catcaacgtt tacggcgatg tagtcatcaa 600

ccacaaaggc ggcgctgatg cgaccgaata tgtaacggct gttgaagtcg atcccgccga 660

ccgcaaccgc gtaacatcag gagaacagcg aatcaaagcg tggacacatt ttcaattccc 720

ggggcgcggc agcacataca gcgatttcaa atggtattgg taccattttg acggaaccga 780

ttgggacgag tcccgaaagc tgaaccgcat ctataagttt caaggaaagg catgggattg 840

ggaagtttcc aatgaaaacg gcaactatga ttacttgatg tatgccgaca tcgattatga 900

tcatcctgat gtcacggcag aaataaagag atggggaacg tggtatgcca atgagctgca 960

attggacgga ttccgccttg atgccgtcaa acacattaaa ttttcttttt tgcgggattg 1020

ggtcaatcat gtcagggaaa aaacagggaa ggaaatgttt acggtagctg aatattggca 1080

gaatgactta ggtgcgctgg aaaactattt gaacaaaaca aactttaatc attcagtgtt 1140

tgacgtgccg cttcattacc agttccatgc tgcatcgaca cagggaggcg gctatgatat 1200

gaggaaattg ctgaacggaa cagtcgtttc caagcatcct gtgaaagcgg ttacgtttgt 1260

tgataaccat gatacacagc cggggcaatc gcttgagtcg actgtccaaa catggtttaa 1320

gccgctggct tacgctttta ttttgacaag agaagcaggc tacccgcaga ttttctacgg 1380

ggatatgtac gggacgaaag gagcctcgca gcgcgaaatt cctgccctga aacacaaaat 1440

cgaaccgatc ttaaaagcga gaaaacaata tgcgtacgga gcacagcatg attatttcga 1500

tcatcataac attgtcggct ggacgaggga aggcgacagc tcggttgcaa attctggttt 1560

ggcggcgtta ataacagacg gacccggcgg gacaaagcga atgtatgtcg gccggcaaaa 1620

cgccggtgag acatggcatg acatcaccgg aaaccgttcc gattctgttg tcatcaatgc 1680

agaaggctgg ggagagtttc acgtaaacgg cggatcggtt tcgatctatg ttcaaagata 1740

gaagaaaaga gtgataggac ggatttccta aaggaaatcc gtttttttat tttctccttc 1800

ttataaaatt tctttgattc catcttataa ttaattttaa caaggtgtca tcagccctca 1860

gaaaggacta gctgacagtt tgaatcgtat aggtaaggcg g 1901

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> FRT位点(FRT site)

<400> 2

gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttc 48

<210> 3

<211> 1764

<212> DNA

<213> FLP重组酶表达盒(FLP recombinase expression cassette)

<400> 3

cccgggggag gcaagggttt aaaggtggag attttttgag tgatcttctc aaaaaatact 60

acctgtccct tgctgatttt taaacgagca cgagagcaaa accccccttt gctgaggtgg 120

cagagggcag gtttttttgt ttcttttttc tcgtaaaaaa aagaaaggtc ttaaaggttt 180

tatggttttg gtcggcactg ccgacagcct cgcagagcac acactttatg aatataaagt 240

atagtgtgtt atactttact tggaagtggt tgccggaaag agcgaaaatg cctcacattt 300

gtgccaccta aaaaggagcg atttacatag ggatgccaca atttgatata ttatgtaaaa 360

caccacctaa ggtgcttgtt cgtcagtttg tggaaaggtt tgaaagacct tcaggtgaga 420

aaatagcatt atgtgctgct gaactaacct atttatgttg gatgattaca cataacggaa 480

cagcaatcaa gagagccaca ttcatgagct ataatactat cataagcaat tcgctgagtt 540

tcgatattgt caataaatca ctccagttta aatacaagac gcaaaaagca acaattctgg 600

aagcctcatt aaagaaattg attcctgctt gggaatttac aattattcct tactatggac 660

aaaaacatca atctgatatc actgatattg taagtagttt gcaattacag ttcgaatcat 720

cggaagaagc agataaggga aatagccaca gtaaaaaaat gcttaaagca cttctaagtg 780

agggtgaaag catctgggag atcactgaga aaatactaaa ttcgtttgag tatacttcga 840

gatttacaaa aacaaaaact ttataccaat tcctcttcct agctactttc atcaattgtg 900

gaagattcag cgatattaag aacgttgatc cgaaatcatt taaattagtc caaaataagt 960

atctgggagt aataatccag tgtttagtga cagagacaaa gacaagcgtt agtaggcaca 1020

tatacttctt tagcgcaagg ggtaggatcg atccacttgt atatttggat gaatttttga 1080

ggaattctga accagtccta aaacgagtaa ataggaccgg caattcttca agcaataaac 1140

aggaatacca attattaaaa gataacttag tcagatcgta caataaagct ttgaagaaaa 1200

atgcgcctta ttcaatcttt gctataaaaa atggcccaaa atctcacatt ggaagacatt 1260

tgatgacctc atttctttca atgaagggcc taacggagtt gactaatgtt gtgggaaatt 1320

ggagcgataa gcgtgcttct gccgtggcca ggacaacgta tactcatcag ataacagcaa 1380

tacctgatca ctacttcgca ctagtttctc ggtactatgc atatgatcca atatcaaagg 1440

aaatgatagc attgaaggat gagactaatc caattgagga gtggcagcat atagaacagc 1500

taaagggtag tgctgaagga agcatacgat accccgcatg gaatgggata atatcacagg 1560

aggtactaga ctacctttca tcctacataa atagacgcat ataaccctat gagttatgca 1620

gtttgtagaa tgcaaaaagt gaaatcaggg ggatcctcta gagtcgagct caagctagct 1680

tggtacgtac cagatctgag atcacgcgtt ctagaggtcg aaattcacct cgaaagcaag 1740

ctgataaacc gatacccgct cgag 1764

<210> 4

<211> 2585

<212> DNA

<213> 丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB(Gene of pyruvate formate-lyase,pflB)

<400> 4

cgcgatgttc aaagaacttt cttaaatttg ttaactattt cacaaaatat gtgattttta 60

tcacattcaa aactgttata ttaaacataa gatataaatg caacaactgt tatatcattt 120

caacttgaaa agagggggat ttaaatggaa caatggaaag gtttcaccac aaacgtttgg 180

caaaaagaag tcaatgtccg cgattttatt ctctcgaact ttgagccata tcaaggtgac 240

gaatcgtttc tcgaacctcc gacggaagct acatcggcat tatgggatca tgtaatggac 300

ttgacaaaaa aagagcgtga aaacggaggc gtcctcgata tggatacaga gatcgtctca 360

acgattacct cgcacggtcc cggctatttg gacaaagact tggaaaaagt cgtcggcgtt 420

caaaccgatg agccgtttaa acggtcgctt cagcctttcg gcggcattcg catggcgaaa 480

caagcatgtg aatcctatgg ttttgaattg aatgaagaag tggaaagaat ctttaccgat 540

taccgcaaaa cccataacca aggcgtgttt gacgcgtata cggacgaaat gaaactcgcc 600

cgaaaggtcg gaatcattac cggactgcct gatgcttacg ggcgcgggcg catcatcggc 660

gattaccgga gagtggcgct ttacggcgtg gacttcctga tcgatgaaaa gaaaaaagat 720

gcggccggca cctctcgcgt gatgtctgaa gaaaacatcc gcctgcgtga agaattgtca 780

gaacaaatcc gggcattgaa tgaacttaaa gcacttgcag caagttatgg ctttgacatt 840

tccgagcctg cggcgaatgc aagagaagca tttcaatggc tgtattttgc ctatttggct 900

gccattaaag agcaaaatgg agcagcaatg agccttggcc gcgtgtccac gttccttgat 960

atatacatcg aaagagattt gaaaacgggc gcattaacag aacaggaggc ccaagagctt 1020

gtcgaccatt ttgtcatgaa gctgcgcttg gtcaaatttg cacgcacacc tgactacaat 1080

gagctgttca gcggcgatcc gacgtgggtg acagaatcaa tcggcggaat agcgcacgac 1140

ggacgcgcac tcgtcacgaa aaactcgttc cgtttcctgc atacgcttga caatttaggt 1200

ccggcgccgg aaccaaattt aaccgtcctt tggtctgtca ggctgccgca aaagtttaaa 1260

aactactgtg ccaaaatgtc gattaaaacg agctcgattc aatacgaaaa tgacgatatc 1320

atgcgtcctg aatacgggga tgactacggc atcgcctgct gtgtatcggc aatggcaatc 1380

ggcaaacaaa tgcagttctt cggagcacgc gccaacttgg cgaaagcgct tttatatgcg 1440

attaatggcg gaaaagacga aaagcataaa atgcaagtcg gtccggaaat gcctccggtt 1500

gcttccgatg tgctggacta tgacgaggtc atgcataaat tcgatcagac gatggaatgg 1560

cttgcaggct tgtacatcaa tacgctcaat gtcattcact acatgcatga taaatattgc 1620

tatgaaagaa ttgaaatggc gctacacgac acggacattt tgcggacgat ggccaccggg 1680

atcgccggct tgagcgttgt ggccgattcg ttaagcgcta tcaaatatgc caaagtcaat 1740

gttgtccgcg atgaaaacgg cattgccgtc gattttgaaa cagaaggcga ctttcctaag 1800

tacggaaata atgatgaccg cgtcgacgcg atcgccgttg acattgtcaa gcgctttatg 1860

aaaaaactgc gcaagcacca gacatatcgc cagtctgttc ataccatgtc aattttaacg 1920

atcacgtcaa acgtcgttta cggcaagaaa accggaaata cgccggatgg acgccgggcg 1980

ggagaaccgt ttgctccagg cgcgaatccg atgcacggcc gcgatactaa aggaacgctt 2040

gcatcgctgt cttcagtggc aaagctgcct tacagctatg cgctcgacgg catatccaac 2100

accttttcga tcgtcccgaa agcgcttggc aaagacgaag agagccgcgc cgtcaattta 2160

tcaagcatcc ttgacggtta cgccgcaaaa acagggcatc acttaaatgt aaacgtattt 2220

aacagagaaa cattgctcga cgccatggaa catccggagg aatatccgca gttaacgatt 2280

cgcgtctcag gctatgcggt caactttatt aagctgacga aagaacagca gctagacgtt 2340

atcagccgta ccttccatga atcgatgtaa cgagcataaa gcggagcgcg gccgaggcgc 2400

tccgccccat aaaaagaggt gatcttcatc atggatggaa atattcattc gatcgaaaca 2460

ttcggcaccg ttgacggtcc gggcatcaga tatgtcgtct tcacacaagg ctgcctgatg 2520

cgctgtcaat tttgccataa tgctgataca tgggaaatcg gaaccggaaa acaaatgacg 2580

gtttc 2585

<210> 5

<211> 987

<212> DNA

<213> 透明颤菌血红蛋白基因vgb(Gene of Vitreoscilla hemoglobin,vgb)

<400> 5

cgggatccgc actgaattcg agctcagcat tattgagtgg atgattatat tccttttgat 60

aggtggtatg ttttcgcttg aacttttaaa tacagccatt gaacatacgg ttgatttaat 120

aactgacaaa catcaccctc ttgctaaagc ggccaaggac gctgccgccg gggctgtttg 180

cgtttttgcc gtgatttcgt gtatcattgg tttacttatt tttttgccaa agctgtaatg 240

gctgaaaatt cttacattta ttttacattt ttagaaatgg gcgtgaaaaa aagcgcgcga 300

ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc aggagggctg gaagaagcag accgctaaca 360

cagtacataa aaaaggagac atgaacgaag cttatgctgg accagcagac gatcaacatc 420

atcaaagcga cggttccggt cctgaaagaa catggagtca cgatcacgac gacgttctac 480

aaaaacctgt tcgcgaaaca tccggaagtc agaccgcttt ttgacatggg cagacaagaa 540

agcctggaac aaccgaaagc gcttgcaatg acagtcctgg cagcagcaca aaacatcgaa 600

aaccttccgg caattctgcc ggcagtcaaa aagatcgcgg tcaaacattg ccaagcagga 660

gttgcagcag cacattatcc gattgtcgga caagaactgc tgggagcgat caaagaagtc 720

cttggagatg cagcaacgga cgatatcttg gatgcttggg gaaaagcata cggagtcatt 780

gcagatgtct ttatccaggt cgaagcggat ctttacgcac aagcagtcga ataagctcta 840

gagtcgacct gcaggcatgc aagctagctt cagcacaatt ccaagaaaga cacgatttag 900

aacctaaaaa gaacgaattt gaactaactc ataaccgaga ggtaaaaaaa gaacgaagtc 960

gagatcaggg aatgagtttg gatcccg 987

<210> 6

<211> 1138

<212> DNA

<213> 卡那霉素抗性基因表达盒(Kanamycin cassette)

<400> 6

ggccagtttg ttgaagatta gatgctataa ttgttattaa aaggattgaa ggatgcttag 60

gaagacgagt tattaatagc tgaataagaa cggtgctctc caaatattct tatttagaaa 120

agcaaatcta aaattatctg aaaagggaat gagaatagtg aatggaccaa taataatgac 180

tagagaagaa agaatgaaga ttgttcatga aattaaggaa cgaatattgg ataaatatgg 240

ggatgatgtt aaggctattg gtgtttatgg ctctcttggt cgtcagactg atgggcccta 300

ttcggatatt gagatgatgt gtgtcatgtc aacagaggaa gcagagttca gccatgaatg 360

gacaaccggt gagtggaagg tggaagtgaa ttttgatagc gaagagattc tactagatta 420

tgcatctcag gtggaatcag attggccgct tacacatggt caatttttct ctattttgcc 480

gatttatgat tcaggtggat acttagagaa agtgtatcaa actgctaaat cggtagaagc 540

ccaaacgttc cacgatgcga tttgtgccct tatcgtagaa gagctgtttg aatatgcagg 600

caaatggcgt aatattcgtg tgcaaggacc gacaacattt ctaccatcct tgactgtaca 660

ggtagcaatg gcaggtgcca tgttgattgg tctgcatcat cgcatctgtt atacgacgag 720

cgcttcggtc ttaactgaag cagttaagca atcagatctt ccttcaggtt atgaccatct 780

gtgccagttc gtaatgtctg gtcaactttc cgactctgag aaacttctgg aatcgctaga 840

gaatttctgg aatgggattc aggagtggac agaacgacac ggatatatag tggatgtgtc 900

aaaacgcata ccattttgaa cgatgacctc taataattgt taatcatgtt ggttacgtat 960

ttattaactt ctcctagtat tagtaattat catggctgtc atggcgcatt aacggaataa 1020

agggtgtgct taaatcgggc cattttgcgt aataagaaaa aggattaatt atgagcgaat 1080

tgaattaata ataaggtaat agatttacat tagaaaatga aaggggattt tatgcgtg 1138

<210> 7

<211> 1616

<212> DNA

<213> 四环素抗性基因表达盒(Tetracycline cassette)

<400> 7

gggccatatt gttgtataag tgatgaaata ctgaatttaa aacttagttt atatgtggta 60

aaatgtttta atcaagttta ggaggaatta attatgaagt gtaatgaata atgaatgtaa 120

cagggttcaa ttaaaagagg gaagcgtatc attaacccta taaactacgt ctgccctcat 180

tattggaggg tgaaatgtga atacatccta ttcacaatcg aatttacgac acaaccaaat 240

tttaatttgg ctttgcattt tatctttttt tagcgtatta aatgaaatgg ttttgaacgt 300

ctcattacct gatattgcaa atgattttaa taaaccacct gcgagtacaa actgggtgaa 360

cacagccttt atgttaacct tttccattgg aacagctgta tatggaaagc tatctgatca 420

attaggcatc aaaaggttac tcctatttgg aattataata aattgtttcg ggtcggtaat 480

tgggtttgtt ggccattctt tcttttcctt acttattatg gctcgtttta ttcaaggggc 540

tggtgcagct gcatttccag cactcgtaat ggttgtagtt gcgcgctata ttccaaagga 600

aaataggggt aaagcatttg gtcttattgg atcgatagta gccatgggag aaggagtcgg 660

tccagcgatt ggtggaatga tagcccatta tattcattgg tcctatcttc tactcattcc 720

tatgataaca attatcactg ttccgtttct tatgaaatta ttaaagaaag aagtaaggat 780

aaaaggtcat tttgatatca aaggaattat actaatgtct gtaggcattg tattttttat 840

gttgtttaca acatcatata gcatttcttt tcttatcgtt agcgtgctgt cattcctgat 900

atttgtaaaa catatcagga aagtaacaga tccttttgtt gatcccggat tagggaaaaa 960

tatacctttt atgattggag ttctttgtgg gggaattata tttggaacag tagcagggtt 1020

tgtctctatg gttccttata tgatgaaaga tgttcaccag ctaagtactg ccgaaatcgg 1080

aagtgtaatt attttccctg gaacaatgag tgtcattatt ttcggctaca ttggtgggat 1140

acttgttgat agaagaggtc ctttatacgt gttaaacatc ggagttacat ttctttctgt 1200

tagcttttta actgcttcct ttcttttaga aacaacatca tggttcatga caattataat 1260

cgtatttgtt ttaggtgggc tttcgttcac caaaacagtt atatcaacaa ttgtttcaag 1320

tagcttgaaa cagcaggaag ctggtgctgg aatgagtttg cttaacttta ccagcttttt 1380

atcagaggga acaggtattg caattgtagg tggtttatta tccataccct tacttgatca 1440

aaggttgtta cctatggaag ttgatcagtc aacttatctg tatagtaatt tgttattact 1500

tttttcagga atcattgtca ttagttggct ggttaccttg aatgtatata aacattctca 1560

aagggatttc taaatcgtta agggatcaac tttgggagag agttcaaaat tgatcc 1616

<210> 8

<211> 4069

<212> DNA

<213> 温敏质粒PNZT1(Thermosensitive plasmid PNZT1)

<400> 8

ctagagcggc cgccaccgcg gtgggatcct ctagagtccg ctagggacct ctttagctcc 60

ttggaagctg tcagtagtat acctaataat ttatctacat tccctttagt aacgtgtaac 120

tttccaaatt tacaaaagcg actcatagaa ttatttcctc ccgttaaata atagataact 180

attaaaaata gacaatactt gctcataagt aacggtactt aaattgttta ctttggcgtg 240

tttcattgct tgatgaaact gatttttagt aaacagttga cgatattctc gattgaccca 300

ttttgaaaca aagtacgtat atagcttcca atatttatct ggaacatctg tggtatggcg 360

ggtaagtttt attaagacac tgtttacttt tggtttagga tgaaagcatt ccgctggcag 420

cttaagcaat tgctgaatcg agacttgagt gtgcaagagc aaccctagtg ttcggtgaat 480

atccaaggta cgcttgtaga atccttcttc aacaatcaga tagatgtcag acgcatggct 540

ttcaaaaacc acttttttaa taatttgtgt gcttaaatgg taaggaatac tcccaacaat 600

tttatacctc tgtttgttag ggaattgaaa ctgtagaata tcttggtgaa ttaaagtgac 660

acgagtattc agttttaatt tttctgacga taagttgaat agatgactgt ctaattcaat 720

agacgttacc tgtttactta ttttagccag tttcgtcgtt aaatgccctt tacctgttcc 780

aatttcgtaa acggtatcgg tttcttttaa attcaattgt tttattattt ggttgagtac 840

tttttcactc gttaaaaagt tttgagaata ttttatattt ttgttcatgt aatcactcct 900

tcttaattac aaatttttag catctaattt aacttcaatt cctattatac aaaattttaa 960

gatactgcac tatcaacaca ctcttaagtt tgcttctaag tcttatttcc ataacttctt 1020

ttacgtttcc gccattcttt gctgtttcga tttttatgat atggtgcaag tcagcacgaa 1080

cacgaaccgt cttatctccc attatatctt tttttgcact gattggtgta tcatttcgtt 1140

tttcttttgc gcgactctag aggatcctga taaatatgaa catgatgagt gatcgttaaa 1200

tttatactgc aatcggatgc gattattgaa taaaagatat gagagattta tctaatttct 1260

tttttcttgt aaaaaaagaa agttcttaaa ggttttatag ttttggtcgt agagcacacg 1320

gtttaacgac ttaattacga agtaaataag tctagtgtgt tagactttat gaaatctata 1380

tacgtttata tatatttatt atccgatttt ttattaaaac gtctcaaaat cgtttctgag 1440

acgttttagc gtttatttcg tttagttatc ggcataatcg ttaaaacagg cgttatcgta 1500

gcgtaaaagc ccttgagcgt agcgtggctt tgcagcgaag atgttgtctg ttagattatg 1560

aaagccgatg actgaatgaa ataataagcg cagcgccctt ctatttcggt tggaggaggc 1620

tcaagggagt atgagggaat gaaattccct catgggtttg attttaaaaa ttgcttgcaa 1680

ttttgccgag cggtagcgct ggaaaatttt tgaaaaaaat ttggaatttg gaaaaaaatg 1740

gggggaaagg aagcgaattt tgcttccgta ctacgacccc ccattaagtg ccgagtgcca 1800

atttttgtgc caaaaacgct ctatcccaac tggctcaagg gtttaagggg tttttcaatc 1860

gccaacgaat cgccaacgtt ttcgccaacg ttttttataa atctatattt aagtagcttt 1920

attgttgttt ttatgattac aaagtgatac actaacttta taaaattatt tgattggagt 1980

tttttaaatg gtgatttcag aatcgaaaaa aagagttatg atttctctga caaaagagca 2040

agataaaaaa ttaacagata tggcgaaaca aaaaggtttt tcaaaatctg cggttgcggc 2100

gttagctata gaagaatatg caagaaagga atcagaacaa aaaaaataag cgaaagctcg 2160

cgtttttaga aggatacgag ttttcgctac ttgtttttga taaggtaatt atatcatggc 2220

tattaaaaat actaaagcta gaaattttgg atttttatta tatcctgact caattcctaa 2280

tgattggaaa gaaaaattag agagtttggg cgtatctatg gctgtcagtc ctttacacga 2340

tatggacgaa aaaaaagata aagatacatg gaataatagt aatattatac aaaatggaaa 2400

gcactataaa aaaccacact atcacgttat atatattgca cgaaatcctg taacaataga 2460

aagcgttagg aacaagatta agcgaaaatt ggggaatagt tcagttgctc atgttgagat 2520

acttgattat atcaaaggtt catatgaata tttgactcat gaatcaaagg acgctattgc 2580

taagaataaa catatatacg acaaaaaaga tattttgaac attaatgatt ttgatattga 2640

ccgctatata acacttgatg aaagccaaaa aagagaattg aagaatttac ttttagatat 2700

agtggatgac tataatttgg taaatacaaa agatttaatg gcttttattc gccttagggg 2760

agcggagttt ggaattttaa atacgaatga tgtaaaagat attgtttcaa caaactctag 2820

cgcctttaga ttatggtttg agggcaatta tcagtgtgga tatagagcaa gttatgcaaa 2880

ggttcttgat gctgaaacgg gggaaataaa atgacaaaca aagaaaaaga gttatttgct 2940

gaaaatgagg aattaaaaaa agaaattaag gacttaaaag agcgtattga aagatacaga 3000

gaaatggaag ttgaattaag tacaacaata gatttattga gaggagggat tattgaataa 3060

ataaaagccc cctgacgaaa gtcgaagggg gtttttattt tggtttgatg ttgcgattaa 3120

tagcaataca attgcaataa acaaaatgat cttccttcag gttatgacca tctgtgccag 3180

ttcgtaatgt ctggtcaact ttccgactct gagaaacttc tggaatcgct agagaatttc 3240

tggaatggga ttcaggagtg gacagaacga cacggatata tagtggatgt gtcaaaacgc 3300

ataccatttt gaacgatgac ctctaataat tgttaatcat gttggttacg tatttattaa 3360

cttctcctag tattagtaat tatcatggct gtcatggcgc attaacggaa taaagggtgt 3420

gcttaaatcg ggccattttg cgtaataaga aaaaggatta attatgagcg aattgaatta 3480

ataataaggt aatagattta cattagaaaa tgaaagggga ttttatgcgt gagaatgtta 3540

cagtctatcc ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg 3600

gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag cgcgcgtaat acgactcact 3660

atagggcgaa ttgggtaccg ggccccccct cgaggtcgac ggtatcgata agctttttag 3720

acatctaaat ctaggtacta aaacaattca tccagtaaaa tataatattt tattttctcc 3780

caatcaggct tgatccccag taagtcaaaa aatagctcga catactgttc ttccccgata 3840

tcttctatat aaaagatata ttatcttatc agtattgtca atatattcaa ggcaatctgc 3900

ctcctcatcc tcttcatcct cttcgtcttg gtagcttttt aaatatggcg cttcatagag 3960

taattctgta aaggtccaat tctcgttttc atacctcggt ataatcttac ctatcacctc 4020

aaatggttcg ctgggtttat cgacctgcag cccgggggat ccactagtt 4069

Claims (8)

1.一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法，其特征在于：

包括由温敏基因敲除质粒、及温敏基因敲入质粒介导的基因敲除及敲入，以及由FLP/FRT系统介导的抗性回收；

所述由温敏基因敲除质粒、及温敏基因敲入质粒介导的基因敲除及敲入是指：温敏基因敲除及敲入质粒转化至地衣芽孢杆菌中，之后通过变温传代过程实现敲除盒及敲入盒同源替换靶基因，得到基因敲除菌株及基因敲入菌株；

所述由FLP/FRT系统介导的抗性回收是指：首先构建FLP重组酶表达质粒；构建的重组酶表达质粒转化至地衣芽孢杆菌的基因敲除菌株及基因敲入菌株中；质粒表达的FLP重组酶特异性识别FRT位点并介导2个FRT位点之间的抗性基因表达盒的删除。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述温敏基因敲除质粒是在温敏质粒PNZT1的基础上，插入四环素抗性基因表达盒以及敲除盒；

所述敲除盒按照基因敲除靶基因的方向依次包括以下核心元件：基因敲除靶基因上游同源臂、FRT位点、卡那霉素抗性基因表达盒、FRT位点、基因敲除靶基因下游同源臂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述温敏敲入质粒是在温敏质粒PNZT1的基础上，插入卡那霉素抗性基因表达盒以及敲入盒；

所述敲入盒按照基因敲入靶基因的方向依次包括以下核心元件：基因敲入靶基因上游同源臂、vgb基因表达盒、FRT位点、四环素抗性基因表达盒、FRT位点、基因敲入靶基因下游同源臂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基因敲除及敲入的具体步骤如下：

(1)把构建好的温敏基因敲除及敲入质粒通过电转的方法转入地衣芽孢杆菌细胞中，提质粒酶切验证；

(2)转化成功的含敲除及敲入质粒的转化子首先在30℃、200rpm下增值活化2代，形成足够的新鲜菌液；

(3)转接2％的菌液至15mL LB培养基，42℃、250rpm无抗传代2次；

(4)转接2％的步骤(3)得到的菌液至新的15mL LB培养基，30℃、200rpm 无抗传代2次；

(5)最后用接菌环蘸取菌液在敲除盒及敲入盒抗性平板上划线挑菌落，平板置于37℃培养箱培养，12-20h长出单菌落，菌落PCR筛选得到双交换重组子。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述FLP重组酶表达质粒构建方法如下：

(1)flp结构基因克隆自大肠杆菌质粒PCP20，NdeI&BamHI酶切后连接至大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PMA5；

(2)从PMA5上克隆出携带HpaII启动子的FLP重组酶表达盒，连接到温敏质粒PNZTT上得到基因敲除消抗质粒PNZTT-flp，连接到温敏质粒PNZTK上得到基因敲入消抗质粒PNZTK-flp。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：FLP/FRT系统介导的抗性回收方法如下：转化FLP重组酶表达质粒，抗性回收时培养温度是30℃，抗性回收后培养温度提高至37℃无抗培养2代可消除质粒。

7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于：

所述基因敲除靶基因是α-淀粉酶基因amyL，该基因序列如SEQ ID NO：1所示；

所述FRT位点序列如SEQ ID NO：2所示；

所述FLP重组酶表达盒序列如SEQ ID NO：3所示；

所述基因敲入是指整合外源透明颤菌血红蛋白基因vgb到基因组的同时敲除pflB基因，pflB基因编码丙酮酸甲酸裂解酶，pflb基因序列如SEQ ID NO：4所示，vgb表达盒序列P43-vgb如SEQ ID NO：5所示；

所述卡那霉素抗性基因表达盒序列如SEQ ID NO：6所示；

所述四环素抗性基因表达盒序列如SEQ ID NO：7所示；

所述温敏质粒PNZT1序列如SEQ ID NO：8所示。

8.根据权利要求1～7任一项所述方法，其特征在于：所述温敏质粒PNZT1是一种大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒，含有温度敏感性复制子，在30℃及以下可稳定复制，37℃及以上丢失。