CN117070538A - ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用 - Google Patents
ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117070538A CN117070538A CN202311032630.2A CN202311032630A CN117070538A CN 117070538 A CN117070538 A CN 117070538A CN 202311032630 A CN202311032630 A CN 202311032630A CN 117070538 A CN117070538 A CN 117070538A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- ppt1
- screening
- lysine
- gibberella
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101150087584 PPT1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 35
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 13
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 36
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 claims description 35
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 22
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 16
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 11
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 8
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 7
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 claims description 3
- 241000233732 Fusarium verticillioides Species 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 12
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101150094253 P450-3 gene Proteins 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 101100054624 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) acpS gene Proteins 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 3
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 2
- 229930001118 polyketide hybrid Natural products 0.000 description 2
- 125000003308 polyketide hybrid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241000751139 Beauveria bassiana Species 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000221778 Fusarium fujikuroi Species 0.000 description 1
- 101710160066 Mitochondrial holo-[acyl-carrier-protein] synthase Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010030975 Polyketide Synthases Proteins 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- XQGPKZUNMMFTAL-UHFFFAOYSA-L dipotassium;hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[K+].[K+].OP([O-])([O-])=O XQGPKZUNMMFTAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010081495 driselase Proteins 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000005261 phosphopantetheinylation Effects 0.000 description 1
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000830 polyketide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/77—Fusarium
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用。实验证明，在丝状真菌中敲除了ppt1基因后，菌株呈现出赖氨酸营养缺陷型，赖氨酸作为必需氨基酸，菌株在含有赖氨酸的培养基上生长，反之则不生长。以ppt1基因为营养缺陷型筛选标签在丝状真菌中进行基因改造，可以起到良好的筛选作用，且相对抗生素抗性标记的筛选过程，营养缺陷标记筛选条件更加温和，为丝状真菌基因工程后期的阳性筛选提供了一种新的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用。
背景技术
丝状真菌在真菌界中占据重要地位，广泛应用于工业、农业、医药以及基础生物学研究领域。一些重要的工业菌株用于生产酶、有机酸等物质，如黑曲霉、藤仓赤霉等。由于丝状真菌基因组相对简单、可操作性强，因此也常用于真核生物的一些生物学特性研究。基因工程技术是菌种改造和研究的有效方法。在基因工程操作过程中，筛选标记是筛选和获得正确改造菌株的一个重要手段，此类筛选标记主要包括抗生素抗性标记和营养缺陷标记。其中，营养缺陷标记筛选用到单一必需营养成分缺失的培养基，相对抗生素抗性标记在使用过程中需要用到抗生素筛选，筛选条件更加温和。同时，无论何种筛选标记，在基因工程操作时常常会碰到筛选标记缺乏的现象，尤其在需要对基因组多个位点进行突变的情况下。
通常，在一些模式菌种中，如酿酒酵母，由于科研关注度较高，通常会有较多的筛选标记可供选择。而在一些关注度较少的菌种中，如很多非模式丝状真菌中，上述的筛选标记十分缺乏。这些菌种往往伴随较高的抗生素耐受性，如球孢白僵菌，导致可用的抗生素筛选标记变得十分有限；而很多丝状真菌，至今没有可供使用的营养缺陷筛选标记，如藤仓赤霉菌。在丝状真菌中进行基因工程改造时，亟需强选择性、有效的筛选标签对改造后的菌株进行筛选。
发明内容
为了解决现有技术中丝状真菌在基因工程操作过程中缺乏营养缺陷筛选标记的问题，本发明提供了ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用。ppt1基因，即磷酸泛乙烯基转移酶编码基因，与真菌的赖氨酸代谢途径、聚酮类和非核糖体肽类物质等的翻译后修饰相关。实验证明，在丝状真菌中敲除了ppt1基因后，菌株呈现出赖氨酸营养缺陷型，赖氨酸作为必需氨基酸，菌株在含有赖氨酸的培养基上生长，反之则不生长。
本发明采用的技术方案是：ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用。Sfp型磷酸泛乙烯基转移酶(PPTase)可以对ACP结构域进行4’-磷酸泛乙烯基转移的翻译后修饰，即磷酸泛酰巯基乙胺基化。编码该酶的ppt1基因广泛存在于一些丝状真菌中，对多种初级代谢和次级代谢合成起着较为重要的调控作用，如对氨基酸合成酶、聚酮合酶、非核糖体多肽合酶的蛋白修饰，将辅酶A上的磷酸泛酰巯基乙胺基转移到上述蛋白的保守丝氨酸残基上，由此合成脂肪酸、聚酮、非核糖体肽。
具体地，所述ppt1基因作为丝状真菌的筛选标记。在丝状真菌基因组改造中，以缺失ppt1基因的菌株为出发菌株进行后期基因编辑操作，所述的营养缺陷型筛选标记ppt1基因可以作为一种有效的筛选标签。
具体地，所述营养缺陷包括赖氨酸营养缺陷。针对因ppt1功能缺失导致的赖氨酸营养缺陷菌株，以ppt1基因为筛选标记在丝状真菌中进行基因工程改造。例如利用缺失了ppt1基因的菌株作为出发菌株，以赖氨酸营养缺陷为筛选标记，在丝状真菌基因进行基因工程改造时，对目的基因进行敲除并利用ppt1基因供体片段进行替换，通过在不含赖氨酸的培养基上进行生长筛选，获得成功转化并携带有ppt1基因的改造菌株。
具体地，所述筛选标记包括ppt1基因的完整表达序列，所述完整表达序列包括启动子、ppt1基因的开放阅读框、终止子。
具体地，所述丝状真菌包括禾谷镰刀菌、串珠镰孢菌、藤仓赤霉菌。丝状真菌作为重要的模式生物，具有较短的世代时间、易于培养和遗传操作的特点，被广泛用于研究生物学基本过程。所述的ppt1基因在禾谷镰刀菌、串珠镰孢菌、藤仓赤霉菌等真菌中广泛存在，上述真菌已知可以引起植物赤霉病害。
具体地，所述应用的方法为：以敲除ppt1基因的基因工程菌为出发菌，以赖氨酸营养缺陷作为筛选标记，利用CRISPR/Cas9技术敲除目的基因并替换成ppt1基因，筛选得到在不含L-赖氨酸的培养基中正常生长的转化子。
进一步地，所述基因工程菌通过以下方法制备得到：将Pcas-ppt1载体和供体片段导入藤仓赤霉菌，利用CRISPR/Cas9技术对藤仓赤霉菌ppt1基因进行敲除，经菌落PCR验证筛选，得到基因工程菌。
进一步地，所述供体片段包括藤仓赤霉菌ppt1基因的上下游同源臂、抗性筛选基因。
优选地，所述藤仓赤霉菌ppt1基因的上下游同源臂的长度分别为500～520bp。
优选地，所述抗性筛选基因为潮霉素抗性基因Hygr。
优选地，通过PCR获得藤仓赤霉菌ppt1基因的上下游500bp左右的同源臂，以及潮霉素抗性基因Hygr，并对其进行融合PCR获得供体片段。
进一步地，所述Pcas-ppt1载体包括藤仓赤霉菌ppt1基因的gRNA、Cas9蛋白表达框。
优选地，所述藤仓赤霉菌ppt1基因的gRNA包括20bp的PAM序列。
优选地，所述藤仓赤霉菌ppt1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所涉及的丝状真菌为藤仓赤霉菌，藤仓赤霉菌的Sfp型ppt1基因序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种以ppt1基因作为筛选标记的丝状真菌的基因改造方法，所述方法包括：以敲除ppt1基因的基因工程菌为出发菌，以赖氨酸营养缺陷作为筛选标记，利用CRISPR/Cas9技术敲除目的基因并替换成ppt1基因，筛选得到在不含L-赖氨酸的培养基中正常生长的转化子。
本发明的有益效果：本发明提供了一种有效的营养缺陷型筛选标签，在丝状真菌中进行基因组改造时以ppt1基因作为赖氨酸营养缺陷型标签进行筛选。相对抗生素抗性标记的筛选过程，营养缺陷标记筛选条件更加温和。同时，在基因工程操作时常常会碰到筛选标记缺乏的现象，尤其在需要对基因组多个位点进行突变的情况下。因此，以ppt1基因为营养缺陷型筛选标签在丝状真菌中进行基因改造，可以起到良好的筛选作用，为丝状真菌基因工程后期的阳性筛选提供了一种新的途径。
附图说明
图1为实施例1中Pcas-ppt1载体构建示意图。
图2为实施例1中潮霉素抗性基因Hygr和藤仓赤霉菌ppt1基因上下游各500bp的同源臂的供体片段。
图3为实施例1中ppt1敲除菌Δppt1-m的PCR验证凝胶图。
图4为实施例1中菌株在CD平板上的生长情况；左侧CD平板添加终浓度为10mM赖氨酸，右侧为对照CD平板；在两块平板上，左数第一株菌为Δppt1-m，右数第一株菌为对照菌株。
图5为实施例1中菌株在PDA平板上的生长情况；左侧PDA平板上接种菌株Δppt1-m，右侧PDA平板上接种对照菌株。
图6为实施例2中藤仓赤霉菌ppt1基因和P450-3基因的上下游各500bp的同源臂替换供体片段的PCR验证凝胶图。
图7为实施例2中Δp450-3菌株的测序结果。
具体实施方式
以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
实施例1：基因工程菌Δppt1-m的构建
本实施例采用CRISPR-Cas系统作为基因编辑工具，以潮霉素抗性基因Hygr作为抗性筛选，对藤仓赤霉菌(fusarium fujikuroi 978#，浙江钱江生物化学股份有限公司提供)ppt1基因进行敲除。藤仓赤霉菌的ppt1基因序列在不同真菌中高度同源，活性相近，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
通过构建Pcas-ppt1载体，将Pcas-ppt1载体和供体片段导入藤仓赤霉菌原生质体，利用CRISPR/Cas9技术对藤仓赤霉菌ppt1基因进行敲除，经菌落PCR验证筛选，得到基因工程菌，具体操作过程如下：
Pcas-ppt1载体的构建：对ppt1基因进行选点设计gRNA后，将从南京工业大学获得的质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph用限制性内切酶EcoRI酶切，然后用一步克隆试剂盒将合成的gRNA片段(含20bp的PAM序列)与酶切后的质粒进行连接。将重组后的Pcas-ppt1载体质粒转入大肠杆菌DH5α中进行储存，以供后续使用。其中，大肠杆菌DH5α的转化方法如下：冰上解冻大肠感受态细胞DH5α；取10μL重组Pcas-ppt1载体质粒加入100μL感受态中，轻轻吹打混匀液体，冰浴静置30min；42℃水浴热激50s，置于冰上静置5min，促进细胞膜收缩；加入600uL LB培养基吹打混匀，37℃，200rpm培养1h。吸取200μL涂布于Amp抗性平板；倒置于37℃培养箱12～16h。Pcas-ppt1载体使用前，挑取大肠杆菌DH5α单菌落于装有10mL LB培养基的试管中，于30℃恒温摇床培养12～14h，再用质粒提取试剂盒提取Pcas-ppt1载体质粒。所述Pcas-ppt1载体如图1所示，包括藤仓赤霉菌ppt1基因的gRNA、Cas9蛋白表达框及潮霉素抗性基因Hygr等DNA元件。
供体片段的构建：利用三对上下游引物F1、R1，F2、R2，F3、R3分别扩增ppt1基因上游500bp同源区域，潮霉素抗性基因Hygr和ppt1基因下游500bp同源臂区域。将所得三个片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后用作模板，利用F1、R3引物对上述三个片段进行融合PCR获得供体片段。将融合得到的供体片段用Clean up试剂盒清洗，暂存在-20℃冰箱。所述供体片段如图2所示，包括藤仓赤霉菌ppt1基因的上下游500bp同源臂、潮霉素抗性基因Hygr。
F1：GTTCCATCCACTCAGATCCGG(SEQ ID NO.2)
R1：CAGGCTTTTTCATTTACTGCAACTATTGCCTTGGAAT(SEQ ID NO.3)
F2：GCAGTAAATGAAAAAGCCTGAACTCACCG(SEQ ID NO.4)
R2：TTCCTATTCCTTTGCCCTCGGACG(SEQ ID NO.5)
F3：CGAGGGCAAAGGAATAGGAATAATGAGAAACGCAAGCGC(SEQ ID NO.6)
R3：AGAAGTACAAGGTCTTCATCCCTGA(SEQ ID NO.7)
PCR反应条件：95℃10min(95℃30s，60℃30s，72℃60s，30个循环)，72℃延伸10min。
融合PCR反应条件：95℃10min(95℃30s，60℃30s，72℃130s，30个循环)，72℃延伸10min。
藤仓赤霉菌原生质体的制备：将藤仓赤霉菌用无菌牙签从PDA培养基中挖取拇指大小的菌斑到YEPD培养基(YEPD培养基：酵母粉30g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L)中培养2d。在超净工作台中将YEPD培养基中培养好的菌液倒入垫有双层滤纸的布氏漏斗中，抽滤至干燥，然后用0.8mol/L氯化钠溶液清洗3次，抽滤至菌体干燥。用无菌枪头刮下大概1g菌体至10mL的细胞壁酶解液(1％Driselase，2％Yatalase，1％Snailase，0.8M NaCl溶液配制)中，30℃、150rpm酶解2～3h，每隔半小时轻柔颠倒，混合均匀。将酶解完全的菌液用双层Miracloth过滤至灭菌的50mL离心管中，除去剩余菌体和不溶物。加入10mL 0.8mol/L氯化钠溶液，用去尖枪头吹打混合均匀，使原生质体充分悬浮，600×g，4℃离心10min，弃上清。此步骤重复两次。加入10mL STC溶液，用去尖枪头吹打混合均匀，使原生质体充分悬浮，900×g，4℃离心10min，弃上清。此步骤重复两次。加入2mL STC溶液，用去尖枪头吹打混合均匀，使原生质体充分悬浮并稀释至107个/mL，置于4℃冰箱备用。
将供体片段和Pcas-ppt1载体采用PEG介导的原生质体转化法导入藤仓赤霉菌原生质体中，转化方法如下：取150μL原生质体重悬液、90μL质粒和供体片段，60μL 60％PEG6000溶液于2mL离心管，混合均匀，质粒和供体片段需分别达到10μg；对照组：取150μL原生质体重悬液、90μL STC溶液和60μL 60％PEG6000溶液于2mL离心管，混合均匀；将以上混合均匀的2mL离心管置于冰上，每10min上下颠倒混匀一次，重复3次，加入1.5mL 60％PEG6000溶液，吹打混匀，室温静置25min。在50mL离心管中加入6mL含5mg/mL赖氨酸的软琼脂CD液体培养基，3mL预热的STC溶液和上述转化体系，摇晃混匀后倒板至相同赖氨酸浓度的CD硬琼脂培养基；将上述平板转移至28℃培养箱，正置培养4～5d，得到藤仓赤霉菌基因工程菌。
对藤仓赤霉菌基因工程菌进行PCR验证，如图3所示，成功将藤仓赤霉菌中的ppt1基因替换为潮霉素抗性基因Hygr，将其命名为Δppt1-m。
分别将Δppt1-m和对照菌株同时转接至含10mM赖氨酸的CD平板和不含赖氨酸的CD平板(CD培养基：葡萄糖20g/L，硝酸钠3g/L，氯化钾2g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，三水合磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，琼脂粉20g/L)上，以及PDA平板(PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L)上，观察菌株生长情况并进行横向对比，结果如图4和图5所示。
图4为菌株在CD平板上的生长情况；左侧CD平板添加终浓度为10mM赖氨酸，右侧为对照CD平板；在两块平板上，左数第一株菌为Δppt1-m，右数第一株菌为对照菌株。从平板上菌株的生长情况可以得知，当赖氨酸合成相关基因ppt1被敲除后，该敲除菌株只能在含有赖氨酸的培养基中生长，且生长情况十分受限。由于赖氨酸是菌株生长发育的必需氨基酸，当Δppt1-m菌株接种于不含有赖氨酸的培养基时，不能够生长。
图5为实施例1中菌株在PDA平板上的生长情况；左侧PDA平板上接种菌株Δppt1-m，右侧PDA平板上接种对照菌株。由图可见，Δppt1-m菌株在敲除了ppt1基因后即使在富营养培养基PDA中培养，其长势也远不如对照菌株。
实施例2：基因工程菌Δppt1-m以ppt1基因为筛选标签敲除P450-3基因
本实施例提供了ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用。以实施例1制备得到的藤仓赤霉菌基因工程菌Δppt1-m为出发菌，以ppt1基因敲除形成的赖氨酸营养缺陷特征作为筛选标签，敲除细胞色素P450-3基因，具体操作过程如下：
Pcas-P450-3载体的构建：对P450-3基因进行选点设计gRNA后，将从南京工业大学获得的质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph用限制性内切酶EcoRI酶切，然后用一步克隆试剂盒将合成的gRNA片段(含20bp的PAM序列)与酶切后的质粒进行连接。将重组后的Pcas-P450-3载体质粒转入大肠杆菌DH5α中进行储存，以供后续使用，使用方法同实施例1。其中，大肠杆菌DH5α的转化方法同实施例1。
替换供体片段的制备：利用三对上下游引物F4、R4，F5、R5，F6、R6分别扩增P450-3基因上游500bp同源区域，ppt1基因和P450-3基因下游500bp同源臂区域，PCR扩增条件同实施例1。将所得三个片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后用作模板，利用F4、R6引物对上述三个片段进行融合PCR获得替换供体片段，融合PCR条件同实施例1。对所述替换供体片段进行PCR验证，结果如图6所示。将融合得到的替换供体片段用Clean up试剂盒清洗，暂存在-20℃冰箱。
F4：GTCTGATACTGAGAGGGCAGCAT(SEQ ID NO.8)
R4：GCCCTACTCATATACAGTGGCGGTATGAAATGGG(SEQ ID NO.9)
F5：CAGAGAACGTTTTATCATAGTTAAAAGAAATTTTAGGATCGTACTGACGGAACGTCACAGAATCTCGA(SEQ ID NO.10)
R5：CCACTGTATATGAGTAGGGCCCAATCCTCACTATGATAAAACGTTCTCTGATC ATGGTTTG(SEQID NO.11)
F6：TCCCAATACAAGTGTAATGCTAGTGG(SEQ ID NO.12)
R6：AATTCACTGGCCGTCGTTTTA(SEQ ID NO.13)
基因工程菌Δppt1-m原生质体的制备：制备步骤同实施例1。
将替换供体片段和Pcas-P450-3载体质粒采用PEG介导的原生质体转化法导入基因工程菌Δppt1-m原生质体中，转化方法同实施例1。
选择缺失了ppt1基因导致的赖氨酸营养缺陷型菌株Δppt1-m为出发菌株，以ppt1基因作为筛选标签对P450-3基因进行替换，所得的转化子可以产生赖氨酸，因此能在不含有赖氨酸的培养基上生长，并从软琼脂培养基中挑出部分菌体，转接至PDA培养基倒置培养4天，形成生长状况较为良好的菌体。
对验证得到的转化子菌株进行测序，结果如图7所示，P450-3基因已经被替换成了ppt1基因，证明筛选出的转化子是P450-3基因敲除菌Δp450-3。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ppt1基因作为丝状真菌的筛选标记。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述营养缺陷包括赖氨酸营养缺陷。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述丝状真菌包括禾谷镰刀菌、串珠镰孢菌、藤仓赤霉菌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：以敲除ppt1基因的基因工程菌为出发菌，以赖氨酸营养缺陷作为筛选标记，利用CRISPR/Cas9技术敲除目的基因，并替换成ppt1基因，筛选得到在不含L-赖氨酸的培养基中正常生长的转化子。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌通过以下方法制备得到：将Pcas-ppt1载体和供体片段导入藤仓赤霉菌，利用CRISPR/Cas9技术对藤仓赤霉菌ppt1基因进行敲除，经菌落PCR验证筛选，得到基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述供体片段包括藤仓赤霉菌ppt1基因的上下游同源臂、抗性筛选基因。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述Pcas-ppt1载体包括藤仓赤霉菌ppt1基因的gRNA、Cas9蛋白表达框。
9.根据权利要求6～8任一所述的应用，其特征在于，所述藤仓赤霉菌ppt1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
10.一种以ppt1基因作为筛选标记的丝状真菌的基因改造方法，其特征在于，所述方法包括：以敲除ppt1基因的基因工程菌为出发菌，以赖氨酸营养缺陷作为筛选标记，利用CRISPR/Cas9技术敲除目的基因并替换成ppt1基因，筛选得到在不含L-赖氨酸的培养基中正常生长的转化子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311032630.2A CN117070538A (zh) | 2023-08-16 | 2023-08-16 | ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311032630.2A CN117070538A (zh) | 2023-08-16 | 2023-08-16 | ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117070538A true CN117070538A (zh) | 2023-11-17 |
Family
ID=88716453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311032630.2A Pending CN117070538A (zh) | 2023-08-16 | 2023-08-16 | ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117070538A (zh) |
-
2023
- 2023-08-16 CN CN202311032630.2A patent/CN117070538A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107400677B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体及其制备方法 | |
| US20170088845A1 (en) | Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9 | |
| JPS62104585A (ja) | ピチア属酵母の部位選択的ゲノム修飾 | |
| JPH07163354A (ja) | 機能遺伝子を含むｄｎａ断片 | |
| JP7473137B2 (ja) | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 | |
| CN110157654B (zh) | 一种纳豆芽孢杆菌重组菌及其构建方法与应用 | |
| Pecota et al. | Sequential gene integration for the engineering of Kluyveromyces marxianus | |
| CN112553238B (zh) | 一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 | |
| JP6858191B2 (ja) | 酵母細胞の相同的組み換えノックアウトのための遺伝子カセット | |
| CN109628448B (zh) | 基于酿酒酵母crispr文库的工业酿酒酵母抗逆性改造 | |
| CN114456244B (zh) | 基因OsR498G1018986900.01及其编码的蛋白在调控水稻垩白中的应用 | |
| CN117070538A (zh) | ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用 | |
| CN113249241B (zh) | 一种酿酒酵母蛋白酶缺失菌株的构建及其应用 | |
| CN113122461A (zh) | 单细胞蛋白生产菌及其应用 | |
| CN108929882B (zh) | 一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用 | |
| CN105505933B (zh) | 新型节杆菌启动子序列及其应用 | |
| KR102613937B1 (ko) | 갈락토스 이용에 관여하는 모든 유전자가 결손된 효모 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산방법 | |
| CN114606170B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9的麦角硫因生物合成方法及应用 | |
| CN114774421B (zh) | 运动发酵单胞菌内源性启动子突变体 | |
| CN116555269B (zh) | 熊蜂生假丝酵母诱导型启动子及其应用 | |
| CN116769781B (zh) | 一种来源于粗壮脉纹孢菌的启动子及其应用 | |
| CN111235185B (zh) | 一种基于lac4基因实现基因编辑筛选的方法 | |
| CN116254286A (zh) | 氰胺诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法 | |
| CN117624378A (zh) | 一种融合蛋白、表达载体、构建方法及应用 | |
| CN117247882A (zh) | 一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株及其构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |