CN111235185B - 一种基于lac4基因实现基因编辑筛选的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法，该方法为：步骤1，基因改造：通过基因改造使出发菌株染色体上LAC4基因无法表达正常功能的LAC4蛋白，得到LAC4基因缺陷的菌株，该LAC4基因缺陷的菌株在以乳糖为唯一碳源的培养基上无法正常生长；步骤2，基因恢复：将目标基因与正常的LAC4基因连接构成供体片段，将此供体片段转入前述LAC4基因缺陷的菌株，使LAC4基因恢复正常的表达功能；步骤3，基因恢复后的菌株在以乳糖为唯一碳源的培养基上进行培养，能够正常生长的菌株为LAC4基因恢复的菌株，也是目标基因正常插入的菌株。相比无筛选功能的CRISPR/Cas9系统，本系统通过筛选可剔除绝大部分基因编辑阴性的菌株，大大提高筛选阳性率，可基本无需PCR筛选，节省时间和成本。

Description

一种基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法
技术领域
本发明属于乳酸克鲁维酵母菌基因编辑筛选技术领域，具体涉及一种基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法。
背景技术
乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，以下简称K.lactis)是工业上广泛使用的酵母，与其他酵母相比，具有许多优点，如超强的分泌能力、良好的大规模发酵特性、较高的食品安全级别及具备蛋白翻译后修饰的能力等。因此如何提高K.lactis的蛋白表达能力成为研究的重点，而对菌株染色体进行基因编辑则是其中的一种有力手段。
CRISPR/Cas9系统是近年发展起来的强大的基因编辑工具，但它在K.lactis中的编辑效率并不是很高，给阳性菌株的筛选鉴定带来不便。酵母菌直接进行普通菌落PCR的效果不稳定，需要对单克隆进行预处理，步骤较为繁琐。而较低的编辑效率导致需要挑取更多数量的单克隆，进一步加剧了鉴定工作的工作量。
发明内容
本发明的目的是，提供一种基于LAC4基因实现K.lactis基因编辑筛选的方法。主要解决现有技术中CRISPR/Cas9系统作为基因编辑工具，阳性菌株的筛选鉴定较为繁琐的技术问题。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
一种基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法，该方法为：
步骤1，基因改造：通过基因改造使出发菌株染色体上的LAC4基因无法表达正常功能的LAC4蛋白，获得LAC4基因缺陷的菌株，所述LAC4基因缺陷的菌株在以乳糖为唯一碳源的培养基上无法正常生长；
步骤2，基因恢复：将目标基因与正常的LAC4基因连接构成供体片段，将此供体片段转入前述LAC4基因缺陷的菌株，使LAC4基因恢复正常的表达功能；
步骤3，基因恢复后的菌株在以乳糖为唯一碳源的培养基上进行培养，能够正常生长的菌株为LAC4基因恢复的菌株，也是目标基因正常插入的菌株。具体地，所述基因改造的出发菌株需满足的条件为：LAC4基因失活后，菌株无法在以乳糖为唯一碳源的培养基上正常生长。
具体地，所述出发菌株为以乳糖作为碳源的菌株。
作为优选实施方式，所述菌株为乳酸克鲁维酵母菌。
所述步骤1的LAC4基因缺陷菌株的获得方式采用以下其中之一：
外源基因片段同源替换LAC4基因使LAC4基因失活；
完全敲除或部分敲除LAC4基因使LAC4基因失活；
插入外源基因使LAC4基因失活。
作为优选实施方式，所述LAC4基因缺陷菌株的获得方式为：敲除LAC4基因5’端和启动子的一部分，使LAC4基因失活。
作为优选实施方式，所述LAC4基因缺陷菌株的获得方式为：敲除LAC4基因5’端的一部分和全部的启动子区域，使LAC4基因失活。
所述步骤1中基因改造的具体方法如下：
1)质粒构建及转化：LAC4gRNA1序列如SEQ ID NO.1所示，使用引物pCas9-LAC4-gRNA1-PF(序列如SEQ ID NO.2所示)和pCas9-LAC4-gRNA1-PR(序列如SEQ ID NO.3所示)，以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增；扩增产物转化到DH5α感受态细胞，在LB液体培养基中培养，然后涂布于Kan抗性LB固体培养，培养至单克隆长出；挑选其中的单克隆，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMCas9-LAC4-gRNA1；
2)构建供体质粒pKMD1-5ΔLAC4：以K.lactis基因组DNA为模板，用引物5ΔLAC4-HR1-PF(序列如SEQ ID NO.4所示)和5ΔLAC4-HR1-PR(序列如SEQ ID NO.5所示)进行PCR扩增，产物名为5ΔLAC4-HR1；以K.lactis基因组DNA为模板，用引物5ΔLAC4-HR2-PF(序列如SEQ ID NO.6所示)和5ΔLAC4-HR2-PR(序列如SEQ ID NO.7所示)进行PCR扩增，产物名为5ΔLAC4-HR2；将扩增产物5ΔLAC4-HR1和5ΔLAC4-HR2转化到Trans-T1感受态细胞，在LB液体培养基中培养，然后涂布于Amp抗性LB固体培养，培养至单克隆长出；挑选其中的单克隆，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-5ΔLAC4；
3)野生型乳酸克鲁维酵母的电转化：以质粒pKMD1-5ΔLAC4为模板，用引物LAC4H-PF-N1(序列如SEQ ID NO.8所示)和引物LAC4H-PR-N1(序列如SEQ ID NO.9所示)进行PCR扩增，扩增产物为5ΔLAC4片段；将野生型K.lactis菌株制作成电转化感受态，加入pKMCas9-LAC4-gRNA1质粒和5ΔLAC4片段，混匀后转入电击杯中，将电击杯放入电转仪中进行电击；电击结束后加入YPD培养基培养孵育，然后涂布于YPD平板，培养至单菌落出现；
4)5ΔLAC4菌株的筛选鉴定：挑取前述YPD平板上的菌落，分别一一对应地接种在以乳糖为唯一碳源的酵母培养基SC-lactose和YPD培养基平板上，菌落长出后，标记出SC-lactose平板上未正常生长的菌落在YPD平板上的对应克隆，并挑取YPD平板上的对应克隆，用菌落PCR的方法进行鉴定，鉴定结果显示为LAC4基因5’端敲除阳性；将获得的阳性菌株在YPD平板上划线传代，使胞内pCas9质粒自然丢失，获得的菌株命名为5ΔLAC4菌株，即为LAC4基因缺陷的菌株。
所述步骤2中基因恢复的具体方法如下：
1)质粒构建及转化：5ΔLAC4gRNA1序列如SEQ ID NO.12所示，5ΔLAC4gRNA2序列如SEQ ID NO.13所示；使用引物pCas9-5ΔLAC4-gRNA1-PF(序列如SEQ ID NO.14所示)和pCas9-5ΔLAC4-gRNA1-PR(序列如SEQ ID NO.15所示)；以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增；扩增产物转化到DH5α感受态细胞，在LB液体培养基中培养，然后涂布于Kan抗性LB固体培养，培养至单克隆长出；挑选其中的单克隆，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMCas9-5ΔLAC4-gRNA1；采用上述相同的方法，使用引物pCas9-5ΔLAC4-gRNA2-PF(序列如SEQ ID NO.16所示)和pCas9-5ΔLAC4-gRNA2-PR(序列如SEQ ID NO.17所示)，获得质粒pKMCas9-5ΔLAC4-gRNA2；
2)构建供体质粒pKMD1-LAC4H-Nluc：以K.lactis基因组DNA为模板，用引物LAC4H-HR1-D-PF(如SEQ ID NO.18所示)和LAC4H-HR1-PR(如SEQ ID NO.19所示)进行PCR扩增，产物名为LAC4H-HR1；以K.lactis基因组DNA为模板，用引物LAC4H-HR2-PF(如SEQ ID NO.20所示)和LAC4H-gRNA1-m-PR(如SEQ ID NO.21所示)进行PCR扩增，产物名为LAC4H-HR2-gRNAL；以K.lactis基因组DNA为模板，用引物LAC4H-gRNA1-m-PF(如SEQ ID NO.22所示)和LAC4H-HR2-D-PR(如SEQ ID NO.23所示)进行PCR扩增，产物名为LAC4H-HR2-gRNAR；基因合成目标基因Nluc(如SEQ ID NO.24所示)；
将扩增产物LAC4H-HR1、LAC4H-HR2-gRNAL、LAC4H-HR2-gRNAR、Nluc转化到Trans-T1感受态细胞，在LB液体培养基中培养，然后涂布于Amp抗性LB固体培养，培养至单克隆长出；挑选其中的单克隆，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-LAC4H-Nluc；
3)5ΔLAC4菌株的电转化：以质粒pKMD1-LAC4H-Nluc为模板，用引物LAC4H-PF-N1(序列如SEQ ID NO.8所示)和引物LAC4H-PR-N1(序列如SEQ ID NO.9所示)进行PCR扩增，扩增产物为LAC4H-Nluc片段；将第一重组得到的菌株5ΔLAC4制作成电转化感受态，加入pKMCas9-5ΔLAC4-gRNA1和pKMCas9-5ΔLAC4-gRNA2以及LAC4H-Nluc片段；混匀后转入电击杯中，将电击杯放入电转仪中进行电击；电击结束后加入YPD培养基培养孵育。
优选地，所述步骤3中以乳糖为唯一碳源的培养基的配制方法为：不含糖的SC培养基粉末溶解于水中，所述SC培养基为不含碳源的合成培养基，调节pH至5.6-6.4，加入琼脂糖，高压灭菌；将乳糖溶解于水中，过滤除菌备用；高压灭菌完毕后的SC培养基中加入过滤除菌的乳糖溶液，混匀导入无菌培养皿中，制得以乳糖为唯一碳源的培养基，命名为SC-lactose培养基。
优选地，所述步骤3的具体方法为：pKMCas9-5ΔLAC4-gRNA1和pKMCas9-5ΔLAC4-gRNA2以及LAC4H-Nluc片段电转化至5ΔLAC4菌株，加入YPD培养基培养孵育后，取菌液涂布于含G418抗性的SC-lactose平板上，25-35℃培养至单菌落出现，所出现的单菌落即为筛选获得的目标基因正常插入的菌株。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1，本发明公开了一种基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法，可直接通过表型筛选获得正确编辑的阳性克隆，有望免去大量繁琐的PCR鉴定工作，在扩大通量的同时节省时间和成本。LAC12基因编码的乳糖通透酶在K.lactis中负责摄取乳糖(lactose)进入细胞。之后，LAC4基因编码的半乳糖苷酶在K.lactis中负责将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，这是K.lactis分解利用乳糖的代谢过程第一步。因此，LAC4基因缺陷的菌株应基本无法在以乳糖为唯一碳源的培养基中正常生长。利用此原理我们可以将目的基因的编辑与LAC4基因的表型关联在一起，用以乳糖为唯一碳源的培养基，达到通过表型直接筛选基因型的目的。
根据本发明的筛选原理：具有LAC4基因，并且LAC4基因失活无法正常表达LAC4蛋白时，菌株无法在以乳糖为唯一碳源的培养基上正常生长。因此，只要微生物菌株具备该特性，均可以利用本发明的方法筛选阳性克隆。
2，相比无筛选功能的CRISPR/Cas9系统，本系统通过筛选可剔除绝大部分基因编辑阴性的菌株，大大提高筛选阳性率，可基本无需PCR筛选，节省时间和成本。
3，相比同样带有筛选功能的其他系统，比如利用抗性标签筛选的方法，本系统也具有以下明显优点：
在整个过程结束后，LAC4基因完全恢复原状，不留下任何“疤痕”，使得这个位点可以重复使用作为下一轮基因编辑的靶点。
LAC4基因的启动子与终止子区域研究较为透彻，可确保LAC4基因功能不受影响。
由于本系统只需要恢复LAC4基因被敲除的5’端一小部分序列，因此能够极大限度地避免因供体片段残留或随机整合而导致的假阳性。
对于基因的敲除或替换也是类似的原理，即第一步基因改造时完全敲除LAC4基因，第二步基因恢复时将原本的目标基因和正常的LAC4基因串联在一起构成新供体片段并进行转化，虽然不像基因插入那样便捷，但整个过程也同样可以进行循环。
附图说明
图1为本发明实施例1野生型菌株Y1140与ΔLAC4菌株在SC-lactose培养基上的生长情况，其中左图为野生型菌株Y1140，右图为ΔLAC4菌株。
图2为本发明实施例2中野生型菌株Y1140与ΔLAC4菌株10：1混合后在平板上长出的单菌落分别一一对应地在YPD培养基平板(左图)与SC-lactose培养基平板(右图)点样后的生长情况。
图3为本发明实施例2中将SC-lactose平板上直径小的菌落在板A上的对应克隆，挑选其中14个用PCR鉴定LAC4基因敲除的电泳结果；其中阴性条带为8438bp，阳性条带为2741bp。
图4为本发明实施例3中将野生型菌株Y1140与ΔLAC4菌株1：100混合后的菌液涂布于SC-lactose培养基上的生长情况。
图5为本发明实施例3中从SC-lactose平板上挑取的4个菌落用PCR鉴定LAC4基因恢复的电泳结果；其中阴性条带为2741bp，阳性条带为8438bp。
图6为本发明实施例4中pKMD1-5ΔLAC4质粒图谱；HR1和HR2分别为LAC4基因5’端被敲除部分上、下游各800bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图7为本发明实施例4中以5ΔLAC4作为供体的电转化生长出的菌落一一对应地点在SC-lactose/G418平板(左)与YPD/G418平板(右)上的生长情况。箭头指出的几个点为SC-lactose/G418平板上明显未能正常生长的单克隆。
图8为本发明实施例5中pKMD1-LAC4H-Nluc质粒图谱，质粒带有Amp筛选标记。
图9为本发明实施例5中以5ΔLAC4菌株作为背景菌株进行Nluc基因插入的CRISPR/Cas9操作，分别在SC-lactose/G418平板(左图)与YPD/G418平板(右图)上的生长情况。
图10为本发明实施例5中从YPD/G418平板上随机挑选的5个菌落与SC-lactose/G418平板上全部的5个菌落用PCR鉴定Nluc基因插入的结果；其中阳性条带为2243bp，背景菌株5ΔLAC4应无条带，NHEJ的发生可能导致其他大小的条带或无条带。
图11为本发明实施例6中pKMD1-P5ΔLAC4质粒图谱；其中gRNA4标注的是实施例7中P5ΔLAC4-gRNA4的序列，质粒带有Amp筛选标记。
图12为本发明实施例7中pKMD1-LAC4H-ORF质粒图谱；LAC4H-HR2包含了实施例6中被敲除的LAC4启动子部分，KlGAPDH1promoter和TEF terminator分别为被插入的ORF所共用的启动子和终止子，质粒带有Amp筛选标记。
图13为本发明基于LAC4的基因插入筛选方法原理图，其中P代表启动子，T代表终止子，纵向箭头代表一步同源重组，黑色交叉线代表同源重组时的同源区域。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
本发明的实施例仅以K.lactis菌株为例，但不限于K.lactis菌株。应当说明，凡是具有LAC4基因并且LAC4蛋白在利用乳糖作为碳源的过程中发挥决定性作用的任何菌株(也即当无法表达出正常功能LAC4蛋白时，菌株无法在以乳糖为唯一碳源培养基上正常生长)，都可以利用本发明的方法。
目的基因可以是任何为菌株改造而需要插入的外源基因及其组合，无特殊要求。
实施例1：验证LAC4基因敲除菌株在SC-lactose平板上的生长情况
1.1配制以乳糖为唯一碳源的酵母培养基SC-lactose
称取1.58g不含糖的SC培养基(合成培养基，不含碳源)粉末，溶解于180mL水中，调节pH至5.6-6.4，加入3g琼脂糖，115℃高压灭菌30min。将4g lactose溶解于20mL水中，用0.2μm滤膜过滤除菌备用。在高压灭菌完毕后的SC培养基中加入上述20mL过滤除菌后的2％的lactose溶液并混匀，待冷却至60℃左右时导入无菌培养皿中，配制成SC-lactose固体培养基。
1.2观察LAC4基因敲除菌株与野生型菌株在SC-lactose培养基上的生长差异情况
取野生型K.lactis菌株与ΔLAC4菌株(基因型为完全敲除LAC4基因的整个编码区序列，按照常规基因敲除方法即可获得ΔLAC4菌株)，用YPD培养基培养成菌液，分别划线在SC-lactose培养基上，30℃静置培养。约2-3天后，野生型菌株Y1140与ΔLAC4菌株在SC-lactose培养基上的生长情况如图1所示，其中左图为野生型菌株Y1140，右图为ΔLAC4菌株。可明显发现ΔLAC4菌株在SC-lactose平板上的生长速度与生长状态均远远不如野生型K.lactis菌株。
实施例2：模拟筛选LAC4基因敲除的菌株
将调整至大致相同OD600值(约5.0)的野生型K.lactis菌株与ΔLAC4菌株以10：1混合(该混合菌液为模拟在K.lactis菌株上敲除LAC4基因时的转化液)，106稀释后取30μL涂布于YPD平板上，30℃培养。
待长出菌落后，分别挑取66个单菌落同时点样在YPD平板(板A)和SC-lactose平板(板B)上，做到每个单菌落在板A和板B上一一对应。约一天后，板A和板B上的菌落生长情况如图2所示，其中左图是板A，右图是板B。根据图2可发现：在板A上生长的菌落直径基本一致，而板B上有些菌落直径明显比其他菌落小。
标记出板B这些较小菌落在板A上的对应克隆，挑取板A上这些被标记的克隆，用菌落PCR的方法进行鉴定。鉴定结果如图3所示，其中阴性条带为8438bp，阳性条带为2741bp。根据图3电泳结果可知：从66个单克隆中挑取的这14个克隆均为LAC4基因敲除阳性，筛选阳性率为100％，明显高于直接转化随机筛选克隆检测的阳性率1-10％，且筛选方法相较于PCR手段更为便捷稳定。
实施例3：模拟筛选含有LAC4基因的菌株
将调整至大致相同OD600值(约5.0)的野生型K.lactis菌株与ΔLAC4菌株以1：100混合(该混合菌液为模拟在ΔLAC4菌株上恢复LAC4基因时的转化液)，取30μL涂布于SC-lactose平板上，30℃培养。培养约16h后，SC-lactose平板上仅长出4个菌落，如图4所示，为野生型菌株Y1140与ΔLAC4菌株1：100混合后的菌液涂布于SC-lactose培养基上的生长情况。挑取这4个单克隆，用菌落PCR的方法进行鉴定。鉴定结果如图5所示，其中阴性条带为2741bp，阳性条带为8438bp，根据图5电泳结果可知：挑选的4个单克隆全部为含有LAC4基因的菌株，筛选阳性率100％。
实施例4：制备LAC4基因5’端缺陷菌株5ΔLAC4
考虑到基因的插入位置、第二步CRISPR(LAC4基因恢复)时供体片段的长度以及鉴定假阳性率，我们不敲除整个LAC4基因，而是只敲除LAC4基因的5’端和启动子的一小部分，并确保缺失和移码导致菌株无法表达出具有正常功能的LAC4蛋白。
4.1 CRISPR gRNA序列的确定
本实施例中gRNA选择的原则为：靠近LAC基因的5’端，GC含量适中(40％-60％)，避免poly T结构的存在。在本实施例中，LAC4gRNA1序列为GATTTACAGTGGGAGGATTT(如SEQ IDNO.1所示)。
质粒构建及转化方法如下：使用引物pCas9-LAC4-gRNA1-PF：GATTTACAGTGGGAGGATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(如SEQ ID NO.2所示)和pCas9-LAC4-gRNA1-PR：AAATCCTCCCACTGTAAATCGATTCGAACTGCCGAGAAAGTAAC(如SEQ ID NO.3所示)，以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增。取扩增产物17μL，加入1μL Dpn I，2μL 10×digestion buffer，混匀后37℃温浴3h。取Dpn I处理后产物10μL加入50μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取2个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMCas9-LAC4-gRNA1。
4.2构建供体质粒pKMD1-5ΔLAC4
以K.lactis基因组DNA为模板，用引物5ΔLAC4-HR1-PF：CAGGAAACAGCTATGACTACCCGGGGATCCTCTAGAGATGGACTGCGATTATTCGTGAG(如SEQ ID NO.4所示)和5ΔLAC4-HR1-PR：TCTAATTCAAAAGTTCTAGCATAAACATTGCCAAATTCTGCTCTTTC(如SEQ ID NO.5所示)进行PCR扩增，产物名为5ΔLAC4-HR1；以K.lactis基因组DNA为模板，用引物5ΔLAC4-HR2-PF：TTTAGGAAAGAGCAGAATTTGGCAATGTTTATGCTAGAACTTTTG(如SEQ ID NO.6所示)和5ΔLAC4-HR2-PR：GTAAAACGACGGCCAGTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATAGAATCAAGTCCCTAACAAC(如SEQ ID NO.7所示)进行PCR扩增，产物名为5ΔLAC4-HR2。
将扩增产物5ΔLAC4-HR1、5ΔLAC4-HR2、pMD18-T各1μL，加入3.5μL CloningMix与0.5μL水，混匀后50℃水浴1h。水浴结束后置于冰上2min，将7μL反应液全部加入50μLTrans-T1感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激30s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-5ΔLAC4。参见图6为pKMD1-5ΔLAC4质粒图谱，其中HR1和HR2分别为LAC4基因5’端被敲除部分上、下游各800bp左右的基因序列，且该质粒带有Amp筛选标记。
4.3野生型乳酸克鲁维酵母的电转化
将野生型K.lactis菌株制作成电转化感受态，加入400ng pKMCas9-LAC4-gRNA1质粒和1000ng 5ΔLAC4片段(以质粒pKMD1-5ΔLAC4为模板，用引物LAC4H-PF-N1：CCCATCATAACCTTGCATAG(如SEQ ID NO.8所示)与引物LAC4H-PR-N1：AAAGAGCTTGCATCGTAAAC(如SEQ ID NO.9所示)进行PCR扩增获得)，混匀后全部转入电击杯中，冰浴2min；将电击杯放入电转仪中进行电击(参数为1.5kV，200Ω，25μF)；电击结束后立即加入700μL YPD，30℃，200rpm摇床孵育3h；取100μL涂布于YPD(含G418抗性)平板，30℃培养1～2天至单菌落出现。
4.4 5ΔLAC4菌株的筛选鉴定
挑取该YPD平板上的菌落，分别一一对应地接种在SC-lactose(含G418抗性)和YPD(含G418抗性)平板上。约24h后两块板上的菌落生长情况如图7所示，其中左图为SC-lactose/G418平板生长菌落，右图为YPD/G418平板生长菌落。根据图7可看出：在YPD/G418平板上生长的菌落直径基本一致，而SC-lactose/G418平板上箭头所指的菌落直径明显比其他菌落小很多，为未能正常生长的单克隆菌落。
标记出SC-lactose平板上这些未正常生长的菌落在YPD/G418平板上的对应克隆，挑取YPD/G418上这些被标记的克隆，用菌落PCR的方法进行鉴定，鉴定引物为5ΔLAC4-CF：TAGGCAAGTACTGCTAGCAA(如SEQ ID NO.10所示)和5ΔLAC4-CR：ATGGCTCTTGAACACCATGA(如SEQ ID NO.11所示)。
鉴定结果显示，在随机挑选的77个单克隆中，经过上述方法筛选，我们鉴定了5个单克隆，全部为LAC4基因5’端敲除阳性，正确率100％。将获得的阳性菌株在YPD平板(不含G418)上划线传代，使胞内pCas9质粒自然丢失，该菌株命名为5ΔLAC4菌株。
实施例5：筛选LAC4基因5’端基因插入菌株LAC4H-Nluc
由于LAC4基因启动子覆盖区域的研究比较清楚，我们选择将外源基因插入在LAC4基因启动子的上游。为尽量增加发生HDR的概率，我们选择用2个gRNA进行切割。
5.1 CRISPR gRNA序列的确定
本实施例中2个gRNA选择的原则为：靠近5ΔLAC4菌株剩余启动子的两端，GC含量适中(40％-60％)，避免poly T结构的存在。在本实施例中，5ΔLAC4gRNA1序列为GTCCGATTCCACTTATATCG(如SEQ ID NO.12所示)，5ΔLAC4gRNA2的序列为ATGACGATACTAGTAACCAA(如SEQ ID NO.13所示)。
质粒构建及转化方法如下：使用引物pCas9-5ΔLAC4-gRNA1-PF：GTCCGATTCCACTTATATCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(如SEQ ID NO.14所示)和pCas9-5ΔLAC4-gRNA1-PR：CGATATAAGTGGAATCGGACGATTCGAACTGCCGAGAAAGTAAC(如SEQ ID NO.15所示)，以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增。取扩增产物17μL，加入1μL Dpn I，2μL 10×digestion buffer，混匀后37℃温浴3h。取Dpn I处理后产物10μL加入50μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取2个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMCas9-5ΔLAC4-gRNA1。同理，使用引物pCas9-5ΔLAC4-gRNA2-PF：ATGACGATACTAGTAACCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(如SEQ ID NO.16所示)和pCas9-5ΔLAC4-gRNA2-PR：TTGGTTACTAGTATCGTCATGATTCGAACTGCCGAGAAAGTAAC(如SEQID NO.17所示)，可获得质粒pKMCas9-5ΔLAC4-gRNA2。
5.2构建供体质粒pKMD1-LAC4H-Nluc
以K.lactis基因组DNA为模板，用引物LAC4H-HR1-D-PF：GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCCCATCATAACCTTGCATAG(如SEQ ID NO.18所示)和LAC4H-HR1-PR：TATCGTCATTTAATTTTTTTTGG(如SEQ ID NO.19所示)进行PCR扩增，产物名为LAC4H-HR1；以K.lactis基因组DNA为模板，用引物LAC4H-HR2-PF：CTAGTAACCAAAGGAAAGGA(如SEQ IDNO.20所示)和LAC4H-gRNA1-m-PR：TCTTGGTCtTCaATgTAgGTactgTCactCCACTTGAAAACCTTGACGAC(如SEQ ID NO.21所示)进行PCR扩增，产物名为LAC4H-HR2-gRNAL；以K.lactis基因组DNA为模板，用引物LAC4H-gRNA1-m-PF：TGGagtGAcagtACcTAcATtGAaGACCAAGATCAATGGTGGCTC(如SEQ ID NO.22所示)和LAC4H-HR2-D-PR：GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATAAAGAGCTTGCATCGTAAAC(如SEQ ID NO.23所示)进行PCR扩增，产物名为LAC4H-HR2-gRNAR；基因合成Nluc基因，全序列如下：atggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcgtaa(如SEQ ID NO.24所示)。以Nluc基因为模板，用引物LAC4H-HR1-Nluc-PF：atggtcttcacactcgaaga(如SEQ ID NO.25所示)和LAC4H-HR1-Nluc-PR：ttacgccagaatgcgttcgc(如SEQ ID NO.26所示)进行PCR扩增，产物名为Nluc。将扩增产物LAC4H-HR1、LAC4H-HR2-gRNAL、LAC4H-HR2-gRNAR、Nluc、pMD18-T各1μL，加入4μLCloningMix，混匀后50℃水浴1h。水浴结束后置于冰上2min，将8μL反应液全部加入50μLTrans-T1感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激30s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-LAC4H-Nluc。参见图8，为质粒pKMD1-LAC4H-Nluc的图谱，该质粒带有Amp筛选标记。
5.3 5ΔLAC4菌株的电转化
将菌株5ΔLAC4制作成电转化感受态，加入各200ng pKMCas9-5ΔLAC4-gRNA1和pKMCas9-5ΔLAC4-gRNA2质粒以及1000ng LAC4H-Nluc片段(以质粒pKMD1-LAC4H-Nluc为模板，用引物LAC4H-PF-N1：CCCATCATAACCTTGCATAG与引物LAC4H-PR-N1：AAAGAGCTTGCATCGTAAAC进行PCR扩增获得)；混匀后全部转入电击杯中，冰浴2min；将电击杯放入电转仪中进行电击(参数为1.5kV，200Ω，25μF)；电击结束后立即加入700μL YPD，30℃，200rpm摇床孵育3h；分别取100μL涂布于SC-lactose(含G418抗性)平板和YPD(含G418抗性)平板，30℃培养1～2天至单菌落出现。
5.4 LAC4H-Nluc菌株筛选阳性率评价
前述SC-lactose(含G418抗性)平板和YPD(含G418抗性)平板，30℃培养1～2天至单菌落出现，参见图9，为菌落在SC-lactose(含G418抗性)平板和YPD(含G418抗性)平板上的生长情况。根据图9可看出：SC-lactose平板上仅长出5个菌落，而YPD平板则长出了79个菌落；从YPD/G418平板上随机挑选5个菌落，以及SC-lactose/G418平板上全部的5个菌落，用菌落PCR的方法鉴定Nluc基因插入情况；参见图10，为菌落PCR鉴定结果；其中阳性条带为2243bp，背景菌株5ΔLAC4应无条带，NHEJ的发生可能导致其他大小的条带或无条带。
根据图10结果可知：SC-lactose平板上长出的5个菌落中，有4个鉴定阳性，另1个阴性结果被认为是两个gRNA切割造成的双链断裂切口直接进行非同源末端接合(NHEJ)；而YPD平板上随机挑选的5个菌落中，全部鉴定阴性，唯一1个PCR获得条带的菌株，其条带大小并不正确，原因可能是供体片段直接以非同源末端接合(NHEJ)的方式插入gRNA切割造成的双链断裂切口中。因此，利用本发明的方法筛选阳性率达到了80％。本实施例是将同一菌液用同一体积分别涂布在两种平板上，因此估测在YPD平板上长出的79个菌落中也有约4个菌落为阳性，则此实施例中随机挑选的阳性率可认为约4/79，其筛选阳性率为5.06％。因此，通过本发明筛选方法，将筛选阳性率提高了15.8倍。
实施例6：制备LAC4基因缺陷菌株P5ΔLAC4
本实施例与实施例4的区别主要有以下两点：
1、敲除LAC4基因的5’端一小部分和全部的启动子区域，这使得第二步CRISPR(LAC4基因恢复)时，启动子区域作为插入片段而非同源片段进行重组，可进一步降低这一步骤发生NHEJ的概率。
2、在本实施例的供体片段接口处设计了一个gRNA序列(由于本实施例的作用是造成LAC4基因的缺陷，所以在这里可以比较随意地设置序列，使得可以设计切割效率更高的gRNA序列，被改变的序列只需在实施例7中修复即可)。
6.1 CRISPR gRNA序列的确定
本实施例中gRNA选择的原则为：分别靠近LAC4启动子的5’端以及LAC基因的5’端，GC含量适中(40％-60％)，避免poly T结构的存在。在本实施例中，LAC4gRNA2序列为ATGACGATACTAGTAACCAA(如SEQ ID NO.27所示)，LAC4gRNA3序列为GTTCTAGCATAAACACCAGT(如SEQ ID NO.28所示)。
质粒构建及转化方法如下：使用引物pCas9-LAC4-gRNA2-PF：ATGACGATACTAGTAACCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(如SEQ ID NO.29所示)和pCas9-LAC4-gRNA2-PR：TTGGTTACTAGTATCGTCATGATTCGAACTGCCGAGAAAGTAAC(如SEQID NO.30所示)，以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增。取扩增产物17μL，加入1μL Dpn I，2μL 10×digestion buffer，混匀后37℃温浴3h。取Dpn I处理后产物10μL加入50μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取2个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMCas9-LAC4-gRNA2。
同理，使用引物pCas9-LAC4-gRNA3-PF：GTTCTAGCATAAACACCAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(如SEQ ID NO.31所示)和pCas9-LAC4-gRNA3-PR：ACTGGTGTTTATGCTAGAACGATTCGAACTGCCGAGAAAGTAAC(如SEQ ID NO.32所示)，按照同样的实验操作，获得质粒pKMCas9-LAC4-gRNA3。
6.2构建供体质粒pKMD1-P5ΔLAC4
以K.lactis基因组DNA为模板，用引物P5ΔLAC4-HR1-PF：CAGGAAACAGCTATGACTACCCGGGGATCCTCTAGAGATAAGCCCCATCATAACCTTGC(如SEQ ID NO.33所示)和P5ΔLAC4-HR1-PR：GTcCgccCcTAgcCATATCGTCATTTAATTTTTTTTGG(如SEQ ID NO.34所示)进行PCR扩增，产物名为P5ΔLAC4-HR1；以K.lactis基因组DNA为模板，用引物P5ΔLAC4-HR2-PF：TTAAATGACGATATGgcTAgGggcGgACTTTTGAATTAGATTCGAAATCG(如SEQ ID NO.35所示)和P5ΔLAC4-HR2-PR：GTAAAACGACGGCCAGTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATAGAATCAAGTCCCTAACAAC(如SEQ ID NO.36所示)进行PCR扩增，产物名为P5ΔLAC4-HR2。这里，引物P5ΔLAC4-HR1-PR和P5ΔLAC4-HR2-PF携带有设计的gRNA序列。
将扩增产物P5ΔLAC4-HR1、P5ΔLAC4-HR2、pMD18-T各1μL，加入3.5μL CloningMix与0.5μL水，混匀后50℃水浴1h。水浴结束后置于冰上2min，将7μL反应液全部加入50μLTrans-T1感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激30s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-P5ΔLAC4。
参见图11，为本实施例中pKMD1-P5ΔLAC4的质粒图谱；其中gRNA4标注的是实施例7中P5ΔLAC4-gRNA4的序列，质粒带有Amp筛选标记。
6.3野生型乳酸克鲁维酵母的电转化
将野生型K.lactis菌株制作成电转化感受态，加入400ng pKMCas9-LAC4-gRNA1质粒和1000ng P5ΔLAC4片段(以质粒pKMD1-P5ΔLAC4为模板，用引物LAC4H-PF-N2：AAGCCCCATCATAACCTTGC(如SEQ ID NO.37所示)与引物LAC4H-PR-N2：AGAATCAAGTCCCTAACAAC(如SEQ ID NO.38所示)进行PCR扩增获得)，混匀后全部转入电击杯中，冰浴2min；将电击杯放入电转仪中进行电击(参数为1.5kV，200Ω，25μF)；电击结束后立即加入700μL YPD，30℃，200rpm摇床孵育3h；取100μL涂布于YPD(含G418抗性)平板，30℃培养1～2天至单菌落出现。
6.4 P5ΔLAC4菌株的筛选鉴定
挑取该YPD平板上的菌落，分别一一对应地接种在SC-lactose(含G418抗性)和YPD(含G418抗性)平板上。约24h后，标记出SC-lactose平板上未正常生长的菌落在YPD/G418平板上的对应克隆，挑取YPD/G418上这些被标记的克隆，用菌落PCR的方法进行鉴定，鉴定引物为P5ΔLAC4-CF：TAAGTGCTAAAGGCAGCAAC(如SEQ ID NO.39所示)和P5ΔLAC4-CR：ATGGCTCTTGAACACCATGA(如SEQ ID NO.40所示)。
经过上述方法筛选，将获得的阳性菌株在YPD平板(不含G418)上划线传代，使胞内pCas9质粒自然丢失，该菌株命名为P5ΔLAC4菌株。
实施例7：筛选LAC4基因5’端基因插入菌株LAC4H-ORF
在本实施例中，分别在LAC4基因启动子的5’端分别插入多个基因的ORF作为平行实验。这些ORF所代表的基因的选择无特殊要求，分别以CAF20、DHH1、CDC48、lfh1、NPL3、PUF4、Rrn3、Scd6、VTS1共计9种为例(每一种基因的具体序列都可以在多个基因组在线网站或数据库查询得到)，下文中将统称为ORF。
7.1 CRISPR gRNA序列的确定
本实施例中选择的gRNA序列为实施例6中供体DNA上特别设置的序列AATGACGATATGgcTAgGgg(如SEQ ID NO.41所示)，命名为P5ΔLAC4-gRNA4。
质粒构建及转化方法如下：使用引物pCas9-5ΔLAC4-gRNA4-PF：AATGACGATATGgcTAgGggGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(如SEQ ID NO.42所示)和pCas9-P5ΔLAC4-gRNA4-PR：ccCcTAgcCATATCGTCATTGATTCGAACTGCCGAGAAAGTAAC(如SEQ ID NO.43所示)，以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增。取扩增产物17μL，加入1μL Dpn I，2μL 10×digestion buffer，混匀后37℃温浴3h。取Dpn I处理后产物10μL加入50μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取2个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMCas9-P5ΔLAC4-gRNA4。
7.2构建供体质粒pKMD1-LAC4H-ORF
以K.lactis基因组DNA为模板，用引物LAC4H-HR1-D-PF：GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCCCATCATAACCTTGCATAG(如SEQ ID NO.18所示)和LAC4H-HR1-PR：TATCGTCATTTAATTTTTTTTGG(如SEQ ID NO.19所示)进行PCR扩增，产物名为LAC4H-HR1；以K.lactis基因组DNA为模板，用引物LAC4H-HR2-PF：CTAGTAACCAAAGGAAAGGA(如SEQ IDNO.20所示)和LAC4H-HR2-D-PR：GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATAAAGAGCTTGCATCGTAAAC(如SEQ ID NO.23所示)进行PCR扩增，产物名为LAC4H-HR2；以K.lactis基因组DNA为模板，用ORF两端引物(正向引物的5’端加上5'-ATAGCAGTAAATTAAAAAAAACC-3'和反向引物的5'端加上5'-TCCTTTCCTTTGGTTACTAG-3'作为同源区)将这些ORF分别扩增得到，产物这里统称为LAC4H-ORF。将扩增产物LAC4H-HR1、LAC4H-HR2、LAC4H-ORF、pMD18-T各1μL，加入4μLCloningMix，混匀后50℃水浴1h。水浴结束后置于冰上2min，将8μL反应液全部加入50μLTrans-T1感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激30s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，分别命名为pKMD1-LAC4H-ORF。
参见图12，为本实施例中pKMD1-LAC4H-ORF质粒图谱；LAC4H-HR2包含了实施例6中被敲除的LAC4启动子部分，KlGAPDH1promoter和TEF terminator分别为被插入的ORF所共用的启动子和终止子，质粒带有Amp筛选标记。
7.3 P5ΔLAC4菌株的电转化与鉴定
将菌株P5ΔLAC4制作成电转化感受态，加入400ng pKMCas9-P5ΔLAC4-gRNA4质粒以及1000ng LAC4H-ORF片段(以质粒pKMD1-LAC4H-Nluc为模板，用引物LAC4H-PF-N1：CCCATCATAACCTTGCATAG与引物LAC4H-PR-N1：AAAGAGCTTGCATCGTAAAC进行PCR扩增获得)；混匀后全部转入电击杯中，冰浴2min；将电击杯放入电转仪中进行电击(参数为1.5kV，200Ω，25μF)；电击结束后立即加入700μL YPD，30℃，200rpm摇床孵育3h；分别取100μL涂布于SC-lactose(含G418抗性)平板和YPD(含G418抗性)平板，30℃培养1～2天至单菌落出现。挑取SC-lactose平板上长出的菌落进行PCR鉴定。
根据鉴定可知：SC-lactose平板上长出的全部菌落，鉴定均为阳性。因此，利用本发明的方法筛选阳性率达到了100％。与实施例5相比，敲除LAC4的全部启动子区域能够降低发生NHEJ的概率。
本发明设计了一种两步重组的编辑方法来筛选阳性克隆。以基因的插入为例，参见图13，为本发明基于LAC4的基因插入筛选方法原理图，其中P代表启动子，T代表终止子，纵向箭头代表一步同源重组，黑色交叉线代表同源重组时的同源区域；图中PLAC4表示LAC4基因的启动子，TLAC4表示LAC4基因的终止子，5ΔLAC4表示5’端缺陷的LAC4基因，Target表示目标基因，PTarget表示目标基因的启动子，TTarget表示目标基因的终止子。第一步重组时，使用缺陷的LAC4基因(5ΔLAC4)同源替换K.lactis染色体上正常的LAC4基因，使用实施例4或6中所述的方法方便地筛选得到LAC4基因缺陷的菌株。第二步重组时，将想要插入的目标基因(Target)与正常的LAC4基因顺次连接构成供体片段(donor)，利用此供体片段同源替换第一步重组时整合到染色体上的缺陷型LAC4基因，分别使用实施例5或7中所述的方法方便地筛选得到LAC4基因恢复的菌株，同时也是Target基因正确插入的菌株。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 康码(上海)生物科技有限公司
<120> 一种基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法
<141> 2018-11-28
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatttacagt gggaggattt 20
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatttacagt gggaggattt gttttagagc tagaaatagc 40
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaatcctccc actgtaaatc gattcgaact gccgagaaag taac 44
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggaaacag ctatgactac ccggggatcc tctagagatg gactgcgatt attcgtgag 59
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctaattcaa aagttctagc ataaacattg ccaaattctg ctctttc 47
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<212> DNA
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<400> 6
tttaggaaag agcagaattt ggcaatgttt atgctagaac ttttg 45
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<212> DNA
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gtaaaacgac ggccagttgc atgcctgcag gtcgacgata gaatcaagtc cctaacaac 59
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<212> DNA
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cccatcataa ccttgcatag 20
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<212> DNA
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taggcaagta ctgctagcaa 20
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<212> DNA
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<400> 14
gtccgattcc acttatatcg gttttagagc tagaaatagc 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgatataagt ggaatcggac gattcgaact gccgagaaag taac 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atgacgatac tagtaaccaa gttttagagc tagaaatagc 40
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttggttacta gtatcgtcat gattcgaact gccgagaaag taac 44
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<400> 18
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<400> 19
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ctagtaacca aaggaaagga 20
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcttggtctt caatgtaggt actgtcactc cacttgaaaa ccttgacgac 50
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tggagtgaca gtacctacat tgaagaccaa gatcaatggt ggctc 45
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gccaagcttg catgcctgca ggtcgacgat aaagagcttg catcgtaaac 50
<210> 24
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60
gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120
actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180
atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240
gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300
atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360
gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420
gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480
accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaa 516
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atggtcttca cactcgaaga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttacgccaga atgcgttcgc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atgacgatac tagtaaccaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gttctagcat aaacaccagt 20
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgacgatac tagtaaccaa gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 30
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttggttacta gtatcgtcat gattcgaact gccgagaaag taac 44
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gttctagcat aaacaccagt gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
actggtgttt atgctagaac gattcgaact gccgagaaag taac 44
<210> 33
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caggaaacag ctatgactac ccggggatcc tctagagata agccccatca taaccttgc 59
<210> 34
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gtccgcccct agccatatcg tcatttaatt ttttttgg 38
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ttaaatgacg atatggctag gggcggactt ttgaattaga ttcgaaatcg 50
<210> 36
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gtaaaacgac ggccagttgc atgcctgcag gtcgacgata gaatcaagtc cctaacaac 59
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aagccccatc ataaccttgc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
agaatcaagt ccctaacaac 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
taagtgctaa aggcagcaac 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atggctcttg aacaccatga 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aatgacgata tggctagggg 20
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
aatgacgata tggctagggg gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 43
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cccctagcca tatcgtcatt gattcgaact gccgagaaag taac 44

Claims (8)

1.一种基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法，该方法为：
步骤1，基因改造：通过gRNA参与的基因改造使乳酸克鲁维酵母出发菌株染色体上的LAC4基因与提供缺陷基因的供体重组，获得无法表达正常功能的LAC4蛋白的LAC4基因缺陷的菌株，所述LAC4基因缺陷的菌株在以乳糖为唯一碳源的培养基上无法正常生长；
步骤2，基因恢复：将目标基因与正常的LAC4基因连接构成供体片段，将此供体片段转入前述LAC4基因缺陷的菌株，使LAC4基因恢复正常的表达功能；
步骤3，基因恢复后的菌株在以乳糖为唯一碳源的培养基上进行培养，能够正常生长的菌株为LAC4基因恢复的菌株，也是目标基因正常插入的菌株;
所述步骤2，基因恢复时，LAC4基因启动子区域作为插入片段而非同源片段进行重组。
2.如权利要求1所述的基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法，其特征在于，所述基因改造的出发菌株需满足的条件为：LAC4基因失活后，菌株无法在以乳糖为唯一碳源的培养基上正常生长。
3.如权利要求1所述的基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法，其特征在于：所述出发菌株为以乳糖作为碳源的菌株。
4.如权利要求1所述的基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法，其特征在于步骤1选择切割效率高的gRNA，具体的是选择LAC4gRNA2序列为ATGACGATACTAGTAACCAA，或LAC4gRNA3序列为GTTCTAGCATAAACACCAGT。
5.如权利要求1所述的基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法，其特征在于步骤2选择gRNA是所述步骤1中供体片段接口处设计的一个gRNA序列。
6.如权利要求5所述的基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法，其特征在于步骤2选择gRNA是AATGACGATATGgcTAgGgg。
7.一种如权利要求5所述方法通过gRNA参与的基因改造的用于进行染色体克隆的乳酸克鲁维酵母，其特征是所述用于进行染色体克隆的乳酸克鲁维酵母具有作为克隆筛选生化标记的LAC缺陷，且权利要求5所述的gRNA位点。
8.如权利要求1所述的基于LAC4基因实现基因编辑筛选的方法，其特征在于，所述步骤3中以乳糖为唯一碳源的培养基的配制方法为：不含糖的SC培养基粉末溶解于水中，所述SC培养基为不含碳源的合成培养基，调节pH至5.6-6.4，加入琼脂糖，高压灭菌；将乳糖溶解于水中，过滤除菌备用；高压灭菌完毕后的SC培养基中加入过滤除菌的乳糖溶液，混匀导入无菌培养皿中，制得以乳糖为唯一碳源的培养基，命名为SC-lactose培养基。
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"A novel, lactase-based selection and strain improvement strategy for recombinant protein expression in Kluyveromyces lactis";Krijger 等;《Microbial Cell Factories》;20121231;第11卷(第112期);摘要，第5-6页，图1 *

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