CN103468623B - 基因工程用工具菌及其应用 - Google Patents

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本申请涉及基因组中一个或多个重组酶基因被敲除的工程菌。所述工程菌尤其可用于克隆含有多个同源序列的基因或大片段DNA。

Description

基因工程用工具菌及其应用
本申请为申请日为2011年9月30日、申请号为201110300048.0、发明名称为“基因工程用工具菌及其应用”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及在分子克隆中可防止重复DNA序列重组的工具菌及其构建和应用。
背景技术
众所周知，含有同源序列的两个DNA序列之间可以发生交换重组，即同源重组。在基因工程领域，业已开发出多种同源重组技术以及许多工程菌用于各种各样的基因操作。
1.Red/ET同源重组
Red/ET重组是上个世纪末发明的一种新型的基因工程技术。在Redα/Redβ或RecE/RecT重组酶系统的相互配合作用下，两端带有短同源臂(35～50bp)的供体DNA分子能直接重组到靶标DNA分子上，实现对受体分子的取代、插入、缺失、突变等多种修饰。Red/ET重组对靶标DNA快速、精确、高效的修饰，同源臂短，不受内切酶位点和DNA片段大小限制的独特优势，给基因工程领域带来了又一场重大变革。该技术已经在大肠杆菌(E.coli)染色体修饰、基因簇的克隆与修饰、质粒的构建、基因打靶载体的构建等领域得到广泛应用。
2.通过Cre-LoxP重组酶系统实现的位点特异性重组
来源于P1噬菌体的Cre重组酶是属于位点特异性重组酶家族中的重要成员，它是一个大小为38KD的蛋白，能介导两个LoxP位点(序列)之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组[HamiltonDL等，JMolBiol.1984，Vol.178，No.2，p.481-6]。Cre-LoxP重组系统的一个最大优点是对于有效的重组作用不需要任何补充的辅助因子或者序列元件，以及不依赖细胞外环境。
3.大肠杆菌JM109野生型(WT)菌株
该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13噬菌体载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。该菌基因型为：recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，supE44，relA1，Δ(la-proAB)/F’[traD36，proAB，lacIq，lacZΔM15]。
4.大肠杆菌HS996、HS996-gyrA96和BG2005菌株
大肠杆菌HS996(GeneBridgesGmbH)在以往的BAC修饰和基因克隆中被用作宿主菌来使用。该菌基因型为：F-mcrA.(mrr-hsdRMS-mcrBC)lacX74recA1deoRaraD139.(ara-leu)7697galUgalKrpsL(StrR)endA1nupGfhuA::IS2(赋予噬菌体T1抗性)。
大肠杆菌HS996-gyrA96菌株由于gyrA96基因突变可以产生针对萘啶酸的抗性，所以它是带有萘啶酸抗性被优化了的基因工程用菌。该菌基因型为：F-mcrA.(mrr-hsdRMS-mcrBC)lacX74recA1gryAdeoRaraD139.(ara-leu)7697galUgalKrpsL(StrR)endA1nupGfhuA::IS2(赋予噬菌体T1抗性)。
大肠杆菌BG2005菌株是来源于经优化的HS996菌株，并且在此菌基础上通过将red-alpha和recT两个基因从基因组中缺失，从而被进一步优化了的基因工程用菌。它相对于HS996菌株具有非常明显提高的DNA稳定性的优势特性。该菌基因型为：F-mcrA.(mrr-hsdRMS-mcrBC) lacX74recA1deoRaraD139(ara-leu)7697galUgalKrpsL(StrR)endA1nupGfhuA::IS2(赋予噬菌体T1抗性)Δred-alphaΔrecT。
5.大肠杆菌BJ5183和DY380菌株
大肠杆菌BJ5183(源于Dr.DouglassHanahan)(TakahashiN等，Gene.2003，Vol.303，p.89-97)的基因型为：recBCsbcBCendAgalKmetthi-1bioThsdRStrR。
在大肠杆菌BJ5183中recE和recT两个基因被整合到其基因组中并且产生它们的基因产物，recET蛋白对于DNA双链的修复起作用。另外，大肠杆菌BJ5183还携带一个编码内切酶I的endA基因的突变体，这个突变与recBC和sbcA的突变一同赋予对BJ5183菌株内部的DNA双链较高的修复活性(KobayashiI等，AdvBiophys.1992，Vol.28，p.81-133；TakahashiNK等，JBacteriol.1993，Vol.175，No.16，p.5176-85)。
大肠杆菌DY380(来自斯坦福大学)是通过缺陷型λ噬菌体整合到大肠杆菌的染色体组中产生的。该菌的重组系统依赖于来自λ噬菌体的Exo、Beta和Gamma重组蛋白，而不是依赖RecA蛋白。通过该重组系统，人们可以进行质粒、BAC和细菌染色体组的修饰。
尽管目前已有各种各样的用于分子克隆的工程菌，例如以上大肠杆菌菌株，然而对于带有多个同源序列的某些基因或者大片段的真核生物DNA片段，由于在进行分子克隆时这种基因或DNA片段中的同源序列间自发地发生重组，故用这些工程菌难以实现对这种基因或DNA片段的克隆。
因此，需要对这种带有多个重复的DNA序列的基因、特别是对大片段的真核生物的DNA序列稳定、能够对这些基因或大片段真换生物DNA序列进行克隆的工程菌。
发明内容
本发明提供一种新的基因工程用工具菌，该工程菌对带有多个重复的DNA序列的基因、特别是对大片段的真核生物DNA序列稳定，能够对这些基因或大片段真换生物DNA序列进行克隆。本发明的工程菌优选具有较高的质粒转化率。
具体而言，本发明涉及一种细菌，例如大肠杆菌，其优选来源于大肠杆菌JM109野生型菌株，其中一个或更多个重组酶基因被敲除。
在一个实施方案中，在所述细菌中，Redα、Redβ、RecE和RecT重组酶基因中的一个更多个被敲除。在一个优选实施方案中，RecE和RecT重组酶基因中的一个或两个被敲除。在进一步的实施方案中，RecE和RecT重组酶基因皆被敲除。
在一个优选实施方案，fhuA基因被进一步敲除。
在上述实施方案中，所述细菌可选地具有链霉素抗性。
本发明也提供一种多拷贝质粒，其含有一个第一抗性基因、一个第二抗性基因和两个缺失型第三抗性基因，其中第二抗性基因位于两个缺失型第三抗性基因之间，这两个缺失型第三抗性基因所缺失的部分不同，因此可通过同源重组产生完整的第三抗性基因。所述抗性例如为抗生素抗性。
在一个实施方案中，所述第一抗性基因为氨苄青霉素抗性(AmpR)基因，第二抗性基因为卡那霉素抗性(KmR)基因，第三抗性基因为氯霉素抗性(CmR)基因。在一个优选实施方案中，所述质粒为pUC-cm-repeats质粒。
本发明还提供检测细菌中DNA稳定性的方法，其包括将上述任一种的多拷贝质粒转化到所述细菌中，测定所述细菌是否能够在含有第三抗性所针对的抗生素如氯霉素的培养基中生长。如果细菌能够在含有该抗生素如氯霉素的培养基中生长，则表明在细菌中DNA的稳定性较差。
附图说明
图1是recET和fhuA基因之菌落PCR产物的限制性内切酶电泳图谱，其中：
泳道1，2，7，8：JM109(WT)；
泳道3，5：JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA
泳道4，6：JM109-StrR-ΔRecET；
泳道9，11：JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA；
泳道10，12：JM109-StrR-ΔRecET；
M为分子量标记。
图2a是通过GCK分子克隆软件显示recET的菌落PCR产物的限制性内切酶图谱模型。图2b是通过GCK分子克隆软件显示fhuA的菌落PCR产物的限制性内切酶图谱模型。
图3(左图)：经NcoI消化的pUC-cm-repeats的凝胶图谱。泳道1：分子量标记；泳道2-7：限制性内切酶NcoI消化后的质粒pUC-cm-repeats的凝胶电泳图谱。
图3(右图)：经NcoI消化的pUC-cm-repeats的GCK软件模拟图谱。
图4显示pUC-cm-repeats在不同大肠杆菌菌株中的转化效率。
图5显示pBAC-cm-repeats在不同大肠杆菌菌株中的重组率。
2#JM109：JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA；
4#JM109：JM109-StrR-ΔRecET。
图6显示pBAC-cm-repeats在不同大肠杆菌菌株中的DNA重组率。
2#JM109：JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA；
4#JM109：JM109-StrR-ΔRecET。
图7显示pUC-cm-repeats在不同大肠杆菌菌株中的DNA重组率。
2#JM109：JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA；
4#JM109：JM109-StrR-ΔRecET。
图8显示pUC-cm-repeats在不同大肠杆菌菌株中的DNA重组率。
2#JM109：JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA；
4#JM109：JM109-StrR-ΔRecET。
图9显示Red/ET重组条件下pBAC-cm-repeats在不同大肠杆菌菌株中期望的DNA重组率。
2#JM109：JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA；
4#JM109：JM109-StrR-ΔRecET。
图10显示Red/ET重组条件下pBAC-cm-repeats在不同大肠杆菌菌株中不期望的DNA重组率。
2#JM109：JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA；
4#JM109：JM109-StrR-ΔRecET。
图11a和b显示LAWRIST-mTFIIA粘粒在不同菌株中转化和检测结果。其中M表示分子量标记。
2#JM109：2#JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA；
4#JM109：4#JM109-StrR-ΔRecET。
图12为LAWRIST7-mTFIIA粘粒的PstI酶切电泳图谱，其中泳道1为分子量标记，泳道2为LAWRIST7-mTFIIA粘粒样品。
具体实施方式
如上所述，当有待克隆的基因或DNA片段、尤其是大片段的真核生物DNA分子含有多个同源序列时，在分子克隆中其同源序列间会自发地发生重组，导致该基因或DNA片段的分子克隆无法实现。
小鼠胚胎肝细胞中的TFIIA基因(粘粒LAWRIST7-mTFIIA，(GeneBridgesGmbH))的产物是基因特异性转录因子IIA，该因子可以促进和调节DNA在体内与TBP(TATA盒结合蛋白)结合，并与启动子相结合参与转录的起始[LiuQ等，MolCellBiol.1999，Vol.19，No.12，p.8673-85]。由于TFIIA基因中包含有许多相当长度和相同序列的DNA同源片段[JamsaiD等，Genomics.2003，Vol.82，No.1，p.68-77]，所以在对该基因进行分子克隆时，其同源序列间自发地发生了重组作用，导致在克隆实验后，限制性内切酶消化后的电泳图谱的预期的理想结果与实际酶切结果往往是不一致的，即无法进行分子克隆。经过分析，发现其原因主要为外界环境不稳定，在这些重复序列之间发生了重组或者在不同粘粒中发生了同源序列之间的重组。
本发明人利用该TFIIA基因(Cosmids-LAWRIST7-mTFIIA)以及构建的多拷贝检测质粒pUC-cm-repeats，用不同的细菌菌株例如大肠杆菌菌株对DNA结构的稳定性进行了研究，意想不到地发现该基因和所述多拷贝检测质粒在大肠杆菌JM109野生型菌株中比较稳定，未发生重组，而在其它的大肠杆菌菌株中则十分不稳定。实验方法和结果见实施例3和5。
因此，本发明人选择大肠杆菌JM109野生型菌株，通过对其进行进一步的修饰，敲除其中的一个或多个重组酶基因，获得了显著提高对带有多个重复DNA序列，特别是对大片段的真核生物的DNA序列的稳定性的工程菌。
可以对本发明的工程菌做出进一步的修饰，例如引入抗性基因或敲除其fhuA基因，从而获得具有额外标记或提高质粒的转化效率的工程菌。
本申请中用于构建新型工程菌的方法也可用于其他细菌、真菌或动物细胞，以构建其他的基因工程用菌或细胞。
靶基因的敲除可以采用本领域已知的能够改变或破坏靶基因或其调控序列的结构、使靶基因功能完全丧失的任何技术，例如同源重组技术来实施。这些技术是本领域已知的。
本发明的工程菌可以用于克隆含有多个同源序列的基因或大片段真核生物DNA分子。由于本发明的工程菌的内部环境缺乏重组酶，因此当利用基因的同源序列进行分子克隆时，可以通过带有重组酶的质粒进行转化或共转化来实施同源重组。
本申请中各种操作可以用本领域技术人员已知的方法、例如以下文献中描述的方法和本申请中所述方法来实施：JosephSambrook，et.al.，MolecularClonning：ALaboratoryManual，3rded.ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001；和CarlW.Dieffenbach和GabrielaS.Dveksler，PCRprimer：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1995等。
实施例
1.使用的材料
1.1细菌
所使用的细菌包括大肠杆菌JM109野生型菌株(GeneBridgesGmbH)、HS996(Invitrogen)、HS996-gyrA96(GeneBridgesGmbH)、GB2005(GeneBridgesGmbH)、BJ5183(Dr.DouglassHanahan)、DY380(UniversityofStenford)菌株。
1.2引物
用来进行DNA扩增的引物1#-12#(SEQIDNO：1-12)都在SIGMA公司定制。
2.使用的方法
质粒的提取、DNA的分离与纯化、限制性内切酶的消化、琼脂糖凝胶电泳、感受态细胞的制备、质粒的电转化、菌落PCR反应、PCR扩增反应等操作按照本领域的标准技术，例如JosephSambrook等，MolecularClonning：ALaboratoryManual，3rded.ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001；和CarlW.Dieffenbach和GabrielaS.Dveksler，PCRprimer：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1995等中描述的方法来实施。
2.1细菌培养
细菌预培养：
取2-10ml已经高压灭菌的LB培养液到15ml试管中，再用消毒过的牙签挑取单克隆菌株到试管中，在37℃下、1025rpm条件下过夜培养。
细菌主培养：
按照1∶50-1∶100的比例从预培养的细菌培养液取菌液接种，进行大量培养，在37℃下、1025rpm摇床条件下培养。
2.2Red/ET重组
1.将pSC101-BAD-γβαA(GeneBridgesGmbH)通过电转化(1250V下电击转化)转化到细菌细胞中，然后将PCR产物和目标克隆分子共同电转化到该细菌细胞中；
2.紧接着将这些细菌转化子在带有不同抗生素筛选压力的LB平板培养皿表面涂平板，并且在30℃细菌培养箱中过夜培养；
3.第二天，用消毒的牙签在平板上挑取所选取的阳性克隆，随即将其移到1.5ml的Ependorf管中，将菌株浸没入其中的LB培养液中并多次旋转，使细菌充分溶解在其中并且在30℃、1050rpm条件下培养；
4.次日，将30μl过夜培养的菌液加入到1.4ml培养液中，并在30℃、1050×g条件下培养2小时，至OD值为0.2，然后向菌种加入20μl10％的L-阿拉伯糖，紧接着在37℃、1050rpm条件下培养40min；
5.两次在1200rpm，2℃，30秒离心，并用900μl冰水清洗，
6.1300rpm、2℃下离心30秒，去除上清液，然后向其中加入PCR产物和目标克隆质粒，并且混合；
7.将混合液加入到电转化杯中，并在1350V的电压下，进行电转化；
8.在电转化杯中加入900μl新鲜的LB培养液，然后将其全部移到1.5ml的新的Ependorf管中，并在37℃、1050rpm条件下培养1小时，然后在带有不同抗生素的平板上涂平板，在37℃培养箱中过夜培养。
2.3Cre重组酶重组
1.将pSC101-BAD-cre质粒(GeneBridgesGmbH)在1350V下电转化到大肠杆菌菌中；
2.电转化后在电转化杯中加入900μl新鲜的LB培养液，并在30℃下1050×rpm震荡培养90min；
3.将所培养的细菌在含有150μg/ml的氯霉素、氨苄青霉素和卡那霉素混合筛选压力的LB培养皿上涂平板；
4.在30℃细菌培养箱培养过夜培养；
5.挑选单克隆菌株到1ml含有150μg/ml氨苄青霉素的培养液中，并在30℃下培养2-3小时；
6.转换培养温度到37℃条件下过夜培养；
7.提取质粒DNA并酶切消化，再通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定检测。
实施例1.基因被敲除的大肠杆菌JM109(WT)的构建
使用因rpsL基因发生突变而具有链霉素抗性的大肠杆菌JM109野生型菌株(JM109-StrR，得自GeneBridgesGmbH)，构建rec/ET基因被敲除(JM109-StrR-ΔrecET，也称为4#JM109)以及fhuA基因被敲除(JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA，也称为2#JM109)的大肠杆菌菌株。为了从染色体组中将rec/ET基因敲除，通过引物1#和2#(AAATATTTCAAGTTGGCGGTGCATTACACCGCCAGGCTGAATACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGAAAGTTTCCATGGAAAAGAGAAG，SEQIDNO：1；和TGAACAAAACGAATTTTAATCTGAGTTGAGGTTAAAAAACATACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCACGCTGCCGCAAGCACTCAG，SEQIDNO：2)，以质粒pBeloBAC11-rpsL-neo-zeo(GeneBridges)为模板，通过PCR扩增获得含有卡那霉素抗性(neo基因)的rpsL-neo基因盒。按照上述的Red/ET重组的基本步骤，用rpsL-neo基因盒替换染色体组中的rec/ET基因；同样通过引物5#和6#(CTCGTTTACGTTATCATTCACTTTACATCAGAGATATACCATACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCACGCTGCCGCAAGCACTCA，SEQIDNO：5；和GAAGGTTGCGGTTGCAACGACCTGACGTTCTGCGCCCCAGAATACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG，SEQIDNO：6)，借助red/ET重组，用rpsL-neo基因盒进一步替换染色体组中的fhuA基因，得到具有卡那霉素抗性的菌株克隆。卡那霉素抗性克隆通过引物3#和4#(GCCAGAAATGGCAGGTATTCG，SEQIDNO：3；和TGGCTTTCACCGTTACTGATGG，SEQIDNO：4)以及PCR可以扩增得到长度约为1.7kb的DNA片段。按照2.3所述的方法通过Cre/loxP特异性重组，该rpsL-neo基因盒在Cre酶的作用下被去除，最终只是在染色体组中遗留一个loxP位点的序列，获得具有链霉素抗性的克隆-菌株JM109-StrR-ΔrecET和JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA。最终得到的克隆通过引物3#和4#及引物7#和8#(CTCGTTTACGTTATCATTCAC，SEQIDNO：7；和GCCAACCAGCGAGATAGCTTC，SEQIDNO：8)经PCR扩增测定，原来rec/ET和fhuA基因位点处的扩增片段大小为585bp和584bp(见图1和2)。与此相对比，以大肠杆菌JM109(WT)作为模板，通过引物3#和4#及引物7#和8#并通过菌落PCR，可以得到长度分别为3.9kb和2.7kb的rec/ET和fhuA基因的扩增片段。这表明，大肠杆菌JM109(WT)中的rec/ET(和fhuA)基因已被敲除。
实施例2.多拷贝质粒pUC-cm-repeats的构建
构建多拷贝质粒pUC-cm-repeats作为DNA稳定性的检测系统。该质粒含有一个氨苄青霉素抗性(AmpR)基因、一个卡那霉素抗性(KmR)基因和两个互不相连的缺失部分片段的氯霉素抗性(CmR)基因序列，其中卡那霉素抗性基因位于两个缺失型CmR基因之间。
pUC-cm-repeats质粒(6648bp)在发生重组之前和重组之后(得到具有氯霉素抗性的pUC-cm-amp质粒)，始终含有氨苄青霉素抗性(AmpR)，因此带有pUC-cm-repeats质粒或者pUC-cm-amp(3668bp)质粒的大肠杆菌菌株可以在含有氨苄青霉素的LB平板上生长，但只带有pUC-cm-amp质粒的大肠杆菌菌株由于两个缺失型CmR基因之间发生重组而获得完整的CmR基因，可以在含有氯霉素的LB的平板上存活。
该质粒如下制备。
首先将pSC101-BAD-γβαA质粒(GeneBridgesGmbH)通过于1250V下电转化转入BG2005菌株中。用引物11#和12#(CATGGAGCGGCGTAACCGTCGCACAGGAAGGACAGAGAAACATGATCGTGCTCCTGTCGTTG，SEQIDNO：11；和TTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTCTTTAGTGAGGGTTAATTGCG，SEQIDNO：12)，以pUC18-amp(GeneBridgesGmbH)作为模板进行PCR扩增，获得PCR产物。这些引物含有两段与pBAC-cm-repeats(即pBelo-BAC-rpsL-neo-new)质粒中被截短的(CmR)氯霉素抗性基因同源的序列，使得可将pBAC-cm-repeats中带有被截短的CmR和KmR的片段通过同源重组而被亚克隆到pUC18-amp上。将pUC18-amp的PCR产物和pBAC-cm-repeats质粒(GeneBridgesGmbH)通过电转化转化到已经带有pSC101-BAD-γβαA质粒的BG2005菌株中。在电转化之后随即发生Red/ET重组，得到质粒pUC-cm-repeats。带有pUC-cm-repeats质粒的目标克隆菌株可以在含有AmpR和KmR的LB细菌培养皿筛选得到。然后将这些目标克隆菌株进行质粒提取，并且用NcoI限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳，其结果见图3。
实施例3.通过pBAC-cm-repeats和pUC-cm-repeats质粒的检测系统进行DNA稳定性检测试验
在该试验中，将pBAC-cm-repeats和pUC-cm-repeats两种质粒分别被转化到8个不同的大肠杆菌菌株之中。经过预培养和主培养大肠杆菌菌株的数量达到其生长的饱和浓度(OD600值为3.0)时，可用于DNA稳定性试验。
对于携带pBAC-cm-repeats质粒的菌株，在预培养时使用新霉素和卡那霉素两种混合抗生素作为共同的筛选压力，而在主培养过程中，只使用新霉素作为筛选压力。这主要是为了有意去丢失Neo基因(卡那霉素抗性基因)，并诱导这两个缺失型氯霉素抗性基因片段的同源区域发生重组，从而形成一个完整的且有功能的氯霉素抗性基因(CmR)。然后，将达到饱和浓度的菌株分别取等量的体积，涂布在只含有新霉素或只含有氯霉素的LB平板上，并在37℃(DY380菌株在30℃条件下)细菌培养箱中培养。在只含有新霉素的LB平板上生长的菌落包括已经发生自发性同源重组的菌株和没有发生自发性同源重组的菌株。在只含有氯霉素的LB平板上生长的菌落表现的是pBAC-cm-repeats质粒的重组情况，这个重组发生在两个不完整的缺失少部分序列的CmR基因的同源片段之间，故DNA稳定性由在这两个含不同抗生素的LB平板上的菌落数的比值所指示。
在无抗生素的LB平板上生长的菌落及其数量表示的是已被转化的转化子菌落和未被转化的菌落的总数。而在带有新霉素的LB平板上生长的菌落数表现的是pBAC-cm-repeats和pUC-cm-repeats质粒在转化之后，成功发生转化的转化子的生长情况。转化效率由这两种平板上生长的菌落数的比值来指示。
对于多拷贝检测质粒pUC-cm-repeats来说，该质粒含有AmpR和KmR(卡那霉素抗性)基因，而且KmR基因位于两个不完整的缺失部分序列的CmR基因片段之间。与pBAC-cm-repeats质粒同样的原理，先在氨苄青霉素和卡那霉素共同存在并在37℃的条件下进行预培养，然后主培养在只有氨苄青霉素存在且于37℃的条件下进行至饱和浓度(DY380菌株在30℃条件下)。最后将等量体积的菌液100μl分别涂平板于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB平板上，在其表面上生长的菌落数之间的比值代表了其DNA的稳定性。
如上所述进行DNA稳定性检测。在表1和2及图5和6中可以清楚地看到，pBAC-cm-repeats的自发重组率在大肠杆菌JM109(WT)、JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA(2#JM109)JM109-StrR-ΔrecET(4#JM109)是最低的，并且在JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA(2#JM109)和JM109-StrR-ΔrecET(4#JM109)的自发重组率大约为在JM109(WT)中的一半。而BG2005菌株中的自发重组率是JM109(WT)的2倍；在BJ5183、HS996和HS996-gyrA96菌株中的自发重组率是在JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA(2#JM109)和JM109-StrR-ΔrecET(4#JM109)中的数倍；然而在DY380中的自发重组率最高，为0.19112％。
表1：检测系统pBAC-cm-repeats在不同菌株中DNA稳定性的原始数据
表2：检测系统pBAC-cm-repeats在不同菌株中的DNA稳定性比率
菌株 平均值 标准差
HS996 0.02536％ 0.00685％
HS996-gyrA96 0.01806％ 0.00359％
GB2005 0.01518％ 0.00147％
JM109(WT) 0.00800％ 0.00026％
JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA 0.00350％ 0.00004％
JM109-StrR-ΔRecET 0.00450％ 0.00003％
BJ5183 0.02846％ 0.00199％
DY380 0.19112％ 0.02194％
在表3和4以及图7和8中同样可以清楚的看到，多拷贝pUC-cm-repeats检测质粒的自发重组率在JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA(2#JM109)和JM109-StrR-ΔrecET(4#JM109)中的重组率是最低的，分别为0.0236％和0.0223％，是在JM109(WT)菌株中的一半；而自发重组率最高的则是在DY380菌株中，为2.8653％，约为在重组率最低的菌种中的100多倍。
表3：检测系统pUC-cm-repeats在不同菌株中DNA稳定性的原始数据
表4：检测系统pUC-cm-repeats在不同菌株中DNA稳定性比率
菌株 平均值(％) 标准差(％)
HS996 0.0883％ 0.0064％
HS996-gyrA96 0.0736％ 0.0119％
GB2005 0.0707％ 0.0184％
JM109(WT) 0.0406％ 0.0055％
JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA 0.0236％ 0.0089％
JM109-StrR-ΔRecET 0.0223％ 0.0042％
BJ5183 0.1043％ 0.0070％
DY380 2.8653％ 0.7576％
实施例4.Rec/ET重组条件下的DNA稳定性试验
在这个试验中，检测系统pBAC11-cm-repeats(pBeloBAC11-rpsL-neo-zeo)在RedET重组条件下被电转化到以下8种不同的大肠杆菌中，其中包括这两株被优化的JM109菌株。
首先将pSC01-BAD-βγαA电转化入这8种不同的大肠杆菌菌株中。用引物9#和10#(ATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAAGGTACCGGCCTGGTGATGATGG，SEQIDNO：9；和GTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTTTTGTTCAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGGGTATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG，SEQIDNO：10)从pBelo-BAC11-rpsL-lacZ-apra质粒(GeneBridgesGmbH)中经PCR扩增安普霉素(apramycin)抗性基因，该PCR产物的两侧含有与质粒pBAC11-cm-repeats中的新霉素抗性基因两侧同源的序列。然后将等量的10ng的pBAC11-cm-repeats和该PCR产物分别共转化到这8种不同的大肠杆菌菌株中。在电转化之后发生RedET重组，所得到的质粒pBeloBAC11-rpsL-neo-apra则携带这个安普霉素抗性基因。为了进行在RedET条件下的DNA稳定性试验，在电转化后将RedET重组产物分别在带有新霉素、带有安普霉素和卡那霉素、以及带有安普霉素和氯霉素的LB培养基上涂平板，并在37℃的条件下过夜培养。在带有安普霉素和卡那霉素的LB培养基上生长的大肠杆菌菌株数量与在只带有新霉素的LB培养基上生长的大肠杆菌菌株数量的比值代表了试验中“期望的重组率”；而在带有安普霉素和氯霉素的LB培养基上生长的大肠杆菌菌株数量与在只带有新霉素的LB培养基上生长的大肠杆菌菌株数量的比值则表示了试验中“不期望的重组率”。
期望的重组率：在表5和6及图9中可以清楚的看到，此重组率在大肠杆菌菌株BG2005、JM109(WT)、JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA(2#JM109)和JM109-StrR-ΔrecET(4#JM109)中没有很大的差异；而这个期望的重组率在DY380菌株中是最低的，只有上述四种菌株中的重组率的一半。
表5：Red/ET重组条件下期望的重组率的原始数据
表6：Red/ET重组条件下期望的重组率
菌株 平均值(％) 标准差(％)
GB2005 0.000534 0.0000689
JM109(WT) 0.000656 0.000264
JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA 0.000531 0.000163
JM109-StrR-ΔRecET 0.000572 0.0000808
DY380 0.000233 0.0000213
不期望的重组率：在表7和8及图10中可以清楚的看到，此重组率在大肠杆菌菌株BG2005、JM109(WT)、JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA(2#JM109)和JM109-StrR-ΔrecET(4#JM109)中是比较低的，并且在JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA(2#JM109)和JM109-StrR-ΔrecET(4#JM109)中是最低的，只有在JM109(WT)菌株中的一半。这种不期望的重组率在DY380菌株中是最高的。
表7：Red/ET重组条件下不同菌株中不期望的重组率的原始数据
表8：Red/ET重组条件下不同菌株中不期望的重组率
菌株 平均值(％) 标准差(％)
GB2005 0.0000108 0.00000355
JM109(WT) 0.0000156 0.00000702
JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA 0.0000089 0.00000396
JM109-StrR-ΔRecET 0.00000991 0.00000443
DY380 0.000123 0.0000345
实施例5.LAWRIST7-mTFIIA粘粒的转化和检测试验
LAWRIST7-mTFIIA粘粒(GeneBridgesGmbH)中的mTFIIA基因含有许多的重复序列。将该粘粒DNA经电转化转化到不同的大肠杆菌菌株中。由于不同的大肠杆菌菌株的内部条件是不同的，有的比较稳定，有的则不稳定，因此首先从转化菌株中提取粘粒DNA，然后使用PstI限制性内切酶进行消化，经过分析可以确定和比较何种菌株内部条件更为稳定，即对DNA的稳定性更高。
图11a和b显示经过PstI限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳后的LAWRIST7-mTFIIA粘粒的DNA条带。从中可以看出，在JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA(2#JM109)和JM109-StrR-ΔrecET(4#JM109)菌株中，DNA条带与图12所示的LAWRIST7-mTFIIA粘粒的DNA条带是一致的，没有发生DNA的减少和增加；而在HS996，HS996-gyrA96和JB5183中的DNA条带，由于发生了自发的重组，则表现出了明显的一个DNA的减少；而在将LAWRIST7-mTFIIA粘粒转化到DY380菌株中后，在带有卡那霉素的LB平板上，根本就没有发现菌落的生长。
实施例6.转化效率的检测
将pBAC-cm-repeats和pUC-cm-repeats质粒DNA2.0ng在1250V的电压下通过电转化转化入各种菌株中。由于pBAC-cm-repeats和pUC-cm-repeats质粒都含有新霉素抗性基因，所以它们的转化子可以在含有新霉素的LB平板上生长。取100μl菌液涂平板，并在37℃(DY380菌株在30℃条件下)细菌培养箱中过夜培养后，通过在含新霉素的LB平板上生长的菌株菌落数与在不含有任何抗生素的LB的平板上生长的菌落数的比值来确定表示该质粒的转化率。
单拷贝pBAC-cm-repeats检测系统的转化率在JM109(WT)以及JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA(2#JM109)和JM109-StrR-ΔrecET(4#JM109)两种菌株中表现出不明显的差异(0.061％-0.092％)；而在BG2005中的转化率最高，为0.29％，约为JM109(WT)、JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA(2#JM109)、JM109-StrR-ΔrecET(4#JM109)的3倍；而在BJ5183菌株中的转化率为最低0.024％。另外，在HS996、HS996-gyrA96和DY380中的转化率几乎差不多，约为0.139％。
对于多拷贝pUC-cm-repeats的检测系统，最高的转化率是在BG2005菌株中实现的，为24.92％；其大约为在JM109-StrR-ΔrecET-ΔfhuA(2#JM109)和JM109-StrR-ΔrecET(4#JM109)及HS996-gyrA96和DY380菌株中转化率的2倍，在JM109(WT)和HS996菌株中转化率的3倍；而在BJ5183菌株中的转化率最低，仅为1.53％(见表9、10和图4)。
表9：pUC-cm-repeats转化效率的原始数据
表10：pUC-cm-repeats的转化效率
菌株 平均值 标准差
HS996 7.00％ 2.76％
HS996-gyrA96 14.31％ 2.91％
GB2005 24.92％ 1.56％
JM109(WT) 8.07％ 0.60％
JM109-StrR-ΔRecET-ΔfhuA 14.06％ 3.78％
BJ5183 1.53％ 0.30％
DY380 13.08％ 1.03％

Claims (3)

1.一种细菌，其来源于大肠杆菌JM109野生型菌株，其中RecE和RecT重组酶基因中的一个被敲除。
2.权利要求1的细菌，其中fhuA基因被进一步敲除。
3.权利要求1或2的细菌，其具有链霉素抗性。
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