CN1083524A - 作为霍乱疫苗缺失突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种不产毒遗传上稳定的霍乱弧 菌突变体菌株的特征，该菌株缺少任何机能attRS1 序列，可用作诱导抗霍乱的免疫保护的活口服疫苗， 本发明还描述了制造该菌株的方法。本发明还描述 了一种死的口服霍乱疫苗，该疫苗至少包括第一和第 二种霍乱弧菌菌株，其中该菌株中至少一种是不同的 血清型，并且该疫苗还含有该血清型中至少一种所产 生的霍乱毒素B亚单位。本发明还有一个特色是载 有异源抗原的霍乱弧菌疫苗。

Description

本发明的领域是霍乱弧菌疫苗。
在对霍乱研究100多年以后，仍然需要一种有效的霍乱疫苗。已经发生过六次由属于“典型的”纯系群的霍乱弧菌菌株引起的这一疾病的世界性流行。当前（第七次）流行的病原属于“ElTor”纯系群（Finkelstein，Crit.Rev.Microbiol  2∶553-623，1973，Wachsmuth  et  al.，The  Lancet  337∶1097-1098，1991）。当前，第七次大流行已蔓延到南非的新地域。始于1991年1月的在秘鲁、厄瓜多尔、哥伦比亚和智利流行的霍乱导致250000多个病例和2000人以上的死亡。在这次流行前，据估计每年主要在印度、孟加拉国、非洲和西亚发生200000以上霍乱病例（Tacket  et  al.，Cholera  Vaccines.In  Vaccines∶New  Approachestk  Immunological  Problems，Ellis，R.W.，editor，Butterworth-Heinemann，Boston，1992）。
在1992年11月，一种抗原上特殊的，非01型霍乱弧菌在印度和孟加接国出现并在八个月内造成估计500000个病例和6000例死亡。这种被命名为血清组0139，同物异名为“Bengal”的新菌株的大流行的潜势看来是肯定的。
这些新近的试验强调了需要抗由ElTor  01和非01血清型霍乱弧菌引起疾病的有效霍乱疫苗。
由于霍乱的自然感染及因霍乱恢复诱导出至少持续三年的免疫性（Tacket  et  al.，同上文;Levine  et  al.，J.Infect.Dis.143∶818-820，1981;Cash  et  al.，J.Infect.Dis.130∶325-333，1974），已进行了许多科研努力以制备活的、减毒的霍乱疫苗，这些疫苗在口服时在其免疫接种性能方面模拟该疾病，但不会在免疫个体中引起有害的症状或反应（即呈现低的基因活性）。这一类型的疫苗涉及缺失突变，这些突变使将霍乱毒素的A亚单位的基因，即一种造成在这一疾病中所见腹泻的主要原因的蛋白失活（Mekalanos  et  al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79∶151-155，1982;Mekalanos  et  al.，Nature  306∶551-557，1983;Kaper  et  al.，Nature  308∶655-658，1984;Kaper  et  al.，Biotechnology  2∶345，1984;Pierce  et  al.，Infect  Immun.55∶477-481，1987;Taylor  et  al.，Vaccine  6∶151-154，1988;Levine  et  al.，Infn.Immun.56∶161-167，1988;Herrington  et  al.，J.Exper.Med.168∶1487-1492，1988;Levine  et  al.，Lancet  11∶467-470，1988;Kapper  et  al.，Res.Microbiol.141∶901-906，1990;Pearson  et  al.，Res  Microbicl.141∶893-899;1990）。还可参看Mekalanos的美国专利5，098，998和4，882，278以及Kaper等人的美国专利4，935，364，这些专利经参阅已纳入本文。这些涉及霍乱疫苗的主要争论点是安全性、稳定性及它们抗原性的程度。
关于霍乱弧菌的毒素基因，Chen等人已测定了产毒和非产毒菌株中的遗传多样性（1991，Epidemiol.Infect.107∶225）。Mekalnos（1983，Cell  35∶253）就霍乱弧菌毒菌基因的复制和放大问题提出了报告，Miller等人（1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  81∶3471）讨论了该毒素基因的转汞调节。其产物是可以在这一生物的致病性方面起作用的其他霍乱弧菌基因包括毒素共调节菌毛基因（Shawet  al.，1990，Infect.Immun.58∶3042;Sharma  et  al.，1989，Vaccine，7∶451;Sun  et  al.，1990，J，Infect.Dis.161∶1231;Hall  et  al.，1991，Infect.Immun.59∶2508;Taylor  et  al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶2833），以及将肠集群因子编码的基因（Taylor  et  al.，1988，Vaccine  6∶151）。
本发明以一种不产毒的，遗传上稳定的霍乱弧菌突变体菌株为特征，该菌株作为诱导对霍乱免疫保护的活的、口服疫苗是有效的。该突变体菌株是一种缺少使机能ctxA亚单位的编码的DNA以及也缺少任何机能attRS1序列的遗传工程的突变体。attRS1序列是指在需要重组和放大CTX遗传要素的CTX遗传要素范围内所含的17个碱基对序列，或能足以使这样的重组和放大实现的该种序列。“缺少任何机能attRS1序列”的突变体是那些基本上不能经受与含attRS1载体有效的位点特定重组的突变体，因为野生型attRS1序列是完全缺失的或充分缺失或突变的从而阻碍这种重组。因此，本发明的霍乱弧菌菌株更为安全，因为它们不能与含有包括ctxA编码DNA的野生型attRS1载体重组。
本发明还以制备上述霍乱弧菌菌株的方法为特点。该方法包括将一种质粒引入野生型霍乱弧菌中，该质粒含有在ctxA和attRS1序列中包含着突变的霍乱弧菌DNA的片段。该霍乱弧菌DNA片段是能与野生型霍乱弧菌DNA在机体内重组而产生突变体菌株的。
尽管可使用任何血清型霍乱弧菌疫苗，但在较佳实施方案中，该霍乱弧菌突变体菌株属于El  Tor纯系群，更佳的是属于Inaba或Ogawa血清型或霍乱弧菌非01纯系群，较佳的是0139“Bangal”血清型。较佳的是，该突变体缺少全部CTX核心和at-tRS1序列，更佳的是，该突变体菌株是如下所述的Peru-2、Bang-2、Bah-2或Beng的减毒衍生物。
本发明的突变体菌株任选地可包括为改进疫苗的安全性和/或免疫原性而引入的另外突变。这些另外的突变包括，但不是限于，被该菌株编码的recA基因的失活，以及将补充基因引入霍乱弧菌染色体，较佳的是引入霍乱弧菌lacZ基因。这些补充基因包括将霍乱弧菌的B亚单位或任何异源抗原，如Shiga类毒素B亚单位编码的基因，或一种将E.coli  CFA抗原编码的基因。异源抗原是指通常不被霍乱弧菌所表达的任何抗原。例如，该异源抗原可以是Shiga类毒素、Shigella脂多糖（LPS）抗原、E.coli菌毛抗原，或可以在霍乱弧菌活疫苗中被表达的HIV抗原。后面提供了可用于构建异源疫苗的另外抗原的补充实施例。较佳的是，具有补充突变的该突变体菌株是Peru-3、Peru-4、Peru-5、Bang-3、Bang-5、Bah-3、Bah-4、Bah-5或Beng的一种减毒衍生物。
ctxA亚单位是指霍乱毒素的A亚单位，该毒素在作用时是造成许多霍乱症状（例如，恶心、腹泻等）的主要原因。最佳的是，这些菌株包括下文中更详细描述的所谓“核心遗传成分”完全缺失，这不仅包括ctxA/B，而且也包括公知为ICF和ZOT的区域。
另一方面，本发明描述了一种不产毒的，遗传上稳定的霍乱弧菌突变体菌株，该菌株用作诱导对霍乱免疫保护的活的，口服疫苗是有效的，该突变体菌株是一种缺少使机能ctxA亚单位编码的遗传工程突变体。该菌株也可是软琼脂穿透不良的。所谓软琼脂穿透不良指的是通过在0.25-0.4%之间的琼脂的琼脂培养基上或在其中游动作离体测量的穿透高粘度培养基的能力，较佳的菌株也可是丝状的，即在液体培养基中的平稳生长期内20%或更多的细胞长度大于10nm，或更佳的是大于20nm和/或40%以上的细胞长度大于10nm。在较佳实施方案中该菌株也是att-。
在较佳实施方案中，本发明包括一种至少含有两种不同霍乱弧菌菌株的疫苗，这些菌株是缺少使机能ctxA亚单位编码的DNA并且也是游动性缺乏的不产毒遗传上稳定的突变体。两种菌株之一由Peru菌株衍生而其他一种是由Beng菌株衍生的。本发明还包括这样一种疫苗，其中各个组分菌株为ctx-、att-和recA-。根据有关局部流行病学，该疫苗菌株可以以单一剂量一起地，或更佳的是分别地7-28天相隔服用。当只有一种血清型呈现疾病迹象，用仅含一种菌株的疫苗可能是较好的。
本发明还描述了一种至少含有第一和第二霍乱弧菌的死的、口服霍乱疫苗，其中至少两种菌株是不同血清型，而混合物中的全部菌株都缺少使机能ctxA亚单位编码的DNA。该疫苗还含有由至少一种血清型所产生的霍乱毒素B亚单位。较佳的是，该疫苗中此血清型之一是一种Ogawa血清型，而另一血清型是一种Inaba血清型，最佳的是，该死的口服疫苗包含下文所定义的Bah-3以及或Peru-3或Bang-3，或Peru-3、Bang-3两种。任何口服疫苗的结合也可以包括如下所定义的Bengal血清型细胞，这包括Bengal-2和Bengal-3。这些菌株可以单剂合在一起地或连续7-28天间隔地服用。
本发明还描述了一种制备死霍乱弧菌疫苗的方法。该方法包括生长至少第一和第二霍乱弧菌菌株，在该混合物中的每种菌株都缺少使机能ctxA亚单位编码的DNA。然后从菌种生长培养基中收集这些菌株并杀死细胞。由繁殖该菌株的培养基中得到至少由该菌株中的一种所产生的霍乱毒素B亚单位然后它被加入此死细胞中。然后将死细菌和霍乱毒素B亚单位的混合物悬浮在生理上容许的载体中。
上述的那些突变体作为霍乱疫苗是有用的而且与以前的疫苗相比在其遗传性能方面得到了改进。
由以下较佳实施方案以及由权利要求书的陈述，本发明的其他特色和优点将是显而易见的。
首先将简要地说明附图。
图1是产毒霍乱弧菌菌株P27459-Sm、C6709-Sm和E7946-Sm的CTX遗传成分示意图。在框中所填写的代表RS1序列。在各RS1序列之间是一个以开口框（称作核心区域）示出的区域，该区域包含ctxAB基因和使ZOt的编码的基因，肠集群因子（ICF）。在RS1序列的末端填入环中的代表使17个碱基以外的16个碱基与该17个碱基对序列attRS1（CCTAGTGCGCATTATGT）[SEQ.ID.NO∶1]相匹配的序列的复制。尽管这三种菌株的CTX成分在其结构上根据RS1的复制数目和核心区而改变，但应注意，这些成分被插入到霍乱弧菌所有El  Tor菌株的相同染色体位点。
图2（A）是含有来自具有示意性也示于图1中的CTX成分的菌株C6709-Sm的CTX区域的限制性染色体图。未示出的是菌株P27459-Sm和E7946-Sm的限制性染色体图，它们除了在如图1中示意性指明的CTX成分核心或RS1序列范围中所标定的位点中所观察到的变异外是相同的。图2（B）是相应于菌株Bang-1、Bah-1和Peru-1染色体区域的限制性图。
图3（A）是载有相应于含有来自具有如图1示意性所示的CTX成分的菌株P27459-Sm的CTX区域染色体的插入DNA片段的质粒pGP60的限制性图。在这下面两个标向箭头指出了在质粒pAR62中已缺失的DNA。图3（B）示出了菌株P27459-Sm  CTX区域的限制性染色体图，它包括了标在质粒pGP60上被克隆的区域之外的限制性位点。图3（C）展现了在质粒pAR62和产生类型-2缺失的该染色体之间的重组情况（虚线），这些重组情况分别在亲本菌株C6709-Sm、P27459-Sm和E7946-Sm中产生缺失突变体Peru-2、Bang-2和Bah-2。图3（D）是菌株Peru-2、Bang-2和Bah-2的限制性染色体图。
图4是质粒pGP52构成的图解表示。
图5是pJM84.1和pJM84.2产生的图解表示。由PCR产生了使无启动子的B亚单位编码的0.6Kb片段。这一DNA被连接pCR100中并用SpeI/EcoRI消化。生成的0.6Kb限制性片段被连接在消化过的pVC100和pRT41载体的EcoRI/XbaI中，结果分别得到pJM1001和pJM411。每种质粒用BamHI/EcoRI消化，用Klenow处理，与XbaI衔接物侧面相接，并用XbaI消化。纯化的片段被连接在消化过pGP84的XbaI上，从而产生pJM84.1和pJM84.2。
图6是将ctxB插入该染色体的图解表示。非复制的pJM84.1通过同源重组被整合成Peru-2、Bang-2和Bah-2。随后在含有链霉素而不含氨苄青霉素的培养基上平板大量培养抗氨苄青霉素重组体菌落，从而降低对氨苄青霉素抗性的选择压力。分离所得的氨苄青霉素敏感的菌落并将其选出以割除被同源recA  DNA序列侧接的DNA。
本发明描述了霍乱弧菌减毒菌株的特征，这些菌株是可以活的，或死的口服疫苗使用以保护个体抵抗霍乱和潜在的其他疾病。
由1991年秘鲁的霍乱病人分离的霍乱弧菌菌株C6709-Sm的减毒衍生物已被构成，它可用作活的口服霍乱疫苗。该衍生物Peru-1和Peru-2分别携载有小的类型-1（核心）和大的类型-2缺失，它们除使ZOt编码的DNA，一种与霍乱毒素无关的肠集群因子（ICF）还消除了使霍乱毒素编码的DNA。因为过量的肠集群可能是造成在服用早先原型活霍乱疫苗的人体中所见的有害副作用的原因，所以使Peru-1和Peru-2中霍乱毒素和ICF编码的基因缺失将使这些菌株在疫苗中变得基因反应减小，同时保持其致免疫并从而保持其保护性能。
在Peru-2中存在的较大类型-2缺失也消除一种称为RS1的插入状序列，该序列以称为CTX遗传成分的较大DNA碎片的部分在两或多次复制中存在。该RS1序列将位点特定重组体系编码，该体系与以高频率复制并造成将CTX成分在所谓attRSlr  17碱基对靶位点处插入霍乱弧菌染色体。
与attRS1几乎相同的序列（正如重组活性一样是显而易见的）存在于此RS1序列的末端。这些序列如下：
attRS1和侧接染色体序列：
5′-TAAACCTAGAGACAAAATGTTCCTAGTGCGCATTATGT
ATGTTATGTTAAAT-3′[SEQ.ID.NO∶2]
RS1和染色体接点的左侧：
5′-TAAACCTAGAGACAAAATGTTCCTAGTGCGC
ATTATGTGGCGCGGCAT…RS1…-3′[SEQ.ID.NO∶3]
RS1和染色体接点的右侧：
5′-AAACCCTAGATTCCGCCGCCTTAGTGCGC
ATTATGTATGTTATGTTAAAT-3′[SEQ.ID.NO∶4]
在RS1末端处存在的attRS1和类似的序列下面划了线。注意，侧接attRS1的此染色体序列存在于具有唯上重叠为17碱基对序列的RS1左和右侧，该序列与RS1和使17/18碱基对与attRS1匹配的18碱基对序列左端的attRS1相同。
基因工程活减毒霍乱疫苗理论上只有在它们不能复原，或换言之不能恢复产生霍乱毒素的能力时是安全的。载有单个复制attRS1序列的菌株通过由P因子连接或噬菌体转导的DNA转移可有效地得到一种新复制的CTX成分。因而，提供无RS1和attRS1序列的霍乱弧菌的缺失，可使疫苗菌株免于通过其本身的位点特定重组体系再获得天然的CTX遗传成分。这种缺失在菌株Peru-2和其衍生物中存在。
六种具有相似但不相同性能的霍乱弧菌突变体菌株已构成。在由孟加拉国（P27459-Sm）和巴林（E7946-Sm）的病人中分离出的霍乱弧菌菌株中构成了四种载有与菌株Peru-1和Peru-2相同的两种类型缺失（类型-1和类型-2）的菌株。这四种衍生物，Bang-1、Bang-2、Bah-1和Bah-2也是本发明的主题，因为它们在集群和/或其他性能（例如血清型）方面变化并因而潜在地比相应的Peru菌株更适于在世界的其他区域用作疫苗。
尽管在三种菌株Peru-1、Bang-1和Bah-1存在的较小类型-1缺失消除不了RS1的全部复制，但这一特殊的缺失对这些菌株中某些菌株的肠集群性能的影响比在Peru-2、Bang-2和Bah-2中存在的较大缺失的影响更为剧烈。
类型-2缺失突变的构建
类型-2缺失消除相应于CTX的遗传成分，这包括RS1序列的全部序列和全部复制的attRS1序列（图1）。如图3所示通过在霍乱弧菌染色体和在质粒pAR62上被克隆的质粒序列之间的重组构成了类型-2缺失。质粒pAR62是质粒pGP60的衍生物并载有类型-2缺失，其中缺失了示于图3的HindⅢ片段。通过将被20-30Kb  Sau  3A部分消化过的片段插入质粒pLAFR2的BamHI位点由首次产生的菌株P27459的基因库构成了质粒pGP60（Friedman  et  al.，1982，Gene  18∶289）。通过使用来自Ctx区域的探针杂交筛选菌落（Mekalanos，1983，Cell  35∶253）。将阳性菌落采集，而由此分离出的质粒被称为pGP60。这一质粒的限制性内切酶分析证实了它含有全部CTX成分序列和附加的侧接DNA。质粒pAR62编码了对四环素的抗性。通过接合或电穿孔，随后在含有3μg/ml四环素的培养基上选择，将这一质粒引入霍乱弧菌菌株。然后，通过按Goldberg和Mekalnos（J.Bacteri-ol.165∶723-731，1986）的叙述而制得的放射性L-3探针菌落杂交筛选出这种载有菌株的质粒。带有被插入该染色体的类型-2缺失共的菌落不与L-3探针杂交，但意外的是经常（即约1%筛选的菌落）出现。使用Southern印迹分析以证实这些菌株中预期缺失的存在。
核心（类型-1）缺失的构建
“核心缺失”仅消除相应于CTX成分核心的序列而留下在染色体上RS1成分的复制之后的部分（Goldberg  et  al.，J.Bacteriol.165∶723-731，1986）（图2）。这些缺失通过位于图2所示核心区右侧和左侧的RS1序列之间的同源重组自发产生。含有核心缺失的霍乱弧菌菌落可用两种方法鉴别。第一种，如果该菌株载有可选择的标记，如使在核心区插入的卡那霉素抗性编码的基因，则该核心缺失使这种菌株对卡那霉素变得敏感（Goldberg  et  al.，J.Bacteriol.165∶723-731，1986）。第二种，也可通过使用不与载有这一缺失的菌株杂交的放射性CT-1探针的菌落杂交来鉴别含有此核心缺失的菌落（Goldberg  et  al.，J.Bacteriol.165∶723-731，1986）。通过任一方法，载有这些缺失的菌落以约1/1000被筛选菌落的频率产生。然后使用由Southern印迹杂交进行的分析证实在这些菌株中预期的缺失。
对基于整合质粒pGP52的机能attRS1序列的测定
质粒pGP52是一种仅在E.col;菌株，如SM10λpri中才能够复制的自杀质粒（Pearson et al.，1990，Res.Microbiol.141∶893）。通过用ClaI和SphI第一次消化质粒pGP7（Mekalanos，1983，Cell 35∶253）构成了质粒pGP52。这一质粒含有自霍乱弧菌菌株E7946-Sm得到的两种RS1序列（术语RS1和RS2）。将含有RS1序列的DNA片段克隆入pBR322，得到的质粒命名为pGP20。然后用EcoRV（它在RS1序列范围内切割）消化这一质粒。当这一质粒被重新连接时，产生一种术语为pGP20R的新质粒，该质粒含有称为RS2＊的RS2杂交变种，其中杂种RS2序列被核心序列所侧接。然后将RS2的SspI-SphI片段亚克隆成已用NruI和SphI消化过的自杀质粒pJM703.1。Miller等人（Proc.Natl.Acad.Sci.USA81∶3471）公开了质粒pJM703.1。生成的质粒称为pGP52。图4示出了描绘pGP52构成的示意图。
当通过接合将pGP52转入含有attRs1序列的霍乱弧菌时，借助于在染色体上的attRS1序列和该质粒上存在的attRS1序列之间的位点特定重组现象，该质粒整合入霍乱弧菌染色体。象这样的整合现象可通过测定稳定地保持（即非选择的）氨苄青霉素抗性的菌落数目而定量，因为pGP52将对氨苄青霉素的抗性编码。在Southern印迹杂交试验中可得到整合的证实。如果待试验的霍乱弧菌具有机能attRS1序列，则在试验中将观察到整合。如果此菌株不含机能attRS1序列，则整合不会出现。
为了测定各种不同疫苗选择物作为pGP52受体的能力，进行了以下试验。将供体E.coli菌株SM10λpir pGP52与受体霍乱弧菌试验疫苗菌株在5ml Luria液体培养基中混合，浓度为每种培养物中有107个来自每种菌株的细胞。将该混合物在37℃培养5小时，此时将其液体以1∶100的比例稀释成含100μg/ml链霉素的新鲜Luria液体培养基。链霉素的目的是通过将其杀死而选择抗E.coli供体菌株。因而，只有抗链霉素的霍乱弧菌受体菌株能够生长。将这一培养物培养直到细胞的生产速率达到饱和。重新将这些培养物稀释并再次培养直至在没有任何对pGP52的正向选择时将每个细胞复制到总量为20倍。在后将这一培养物稀释并在两种分开的培养基组合物上平板培养以定量测定活菌落数。这些培养基之一是不含任何抗菌素的Luria液体培养基。在这些平板上呈现的菌落数代表该培养物中细胞的总数。另一培养基为含有氨苄霉素的Luria液体培养基。在这些平板上呈现的菌落数代表接合后发生的整合现象数。其结果以稳定整合现象活细胞总数比例表达并示于下表1。
表1  关于Peru疫苗菌株的有代表性整合数据
菌株  稳定整合现象/总活细胞数
Peru-1 5.2×10-5
Peru-2 未检出(<5×10-8)
Peru-3 未检出(<5×10-8)
Peru-4 未检出(<5×10-8)
Peru-5 未检出(<5×10-8)
根据这些数据明，含有两种复制attRS1序列的菌株Peru-1能够以至少比所有的缺少任何attRS1序列的任何的其他被试验菌株高出1000倍的频率将质粒pGP52整合入其染色体中。
疫苗菌株的血清学特征
根据其血清学和集群性能，进一步表征了疫苗菌株Peru-2、Bang-2和Bah-2。表2中列出的数据证明了各个衍生物在通过使用Difco霍乱弧菌01  Inaba或Ogawa分类血清的玻片凝集法检验新鲜收获的细菌细胞时保持了其预期的血清型（即相应亲本菌株各个突变体的血清型）。这一结果表明，这些菌株仍表达LPS抗原。其他试验表明，这些突变体菌株是游动的，原养的，并仍表达Tcp菌毛。因而，这些突变体表达了一系列使其可用作活疫苗菌株能力的重要性能。
疫苗菌株和核心缺失突变体的集群性能。
为了测试这些疫苗菌株的集群性能，使用了如Taylor等人所述的（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84∶2833-2837，1987）小鼠肠竞争试验，当随后在志愿者人体中测验时，该试验表明是精确地与突变体菌株的集群性能相关（Herrington  et  al.，J.Exper.Med.168∶1487-1492，1988）。该试验通过比较其与另一密切相关的或等基因的菌株生长和存活竞争能力测定出突变体菌株在集群方面的区别。在这一试验中，以约1∶1的比例将突变体和竞争菌株混合，然后将这一混合物的约1000000个细胞引入3-5天令CD-1乳鼠的胃中。24小时后，将该乳鼠杀死，将肠剖开，均匀化并在含有用以两种菌株选择的链霉素的细菌字培养基中平板培养。然后对过夜培养后生长的菌落作区别突变体和竞争菌株的附加标记（即对卡那霉素的抗性或与合适的放射性DNA探针杂交;参见表3的符号）测定。
如图3所示，Bang-2和Bah-2两者都呈现出弱的肠集群作用，在小鼠肠中生长24小时后该作用导致比突变体菌株约高4-13倍的等基因菌株的回收率。在表3中还示出了与核心缺失突变体菌株Peru-1、Bang-1和Bah-1有关竞争试验结果。象类型-2缺失菌株Bang-2和Bah-2一样，这些核心缺失突变体相对于等基因竞争菌株在集群在方面是不足的。因为核心缺失消除相应于CTX成分（图1和3）核心的序列，所以这些数据表明了CTX成分的核心将一种“肠集群因子，或ICF”编码。就其本身而言霍乱毒素不是ICF。如Goldberg和Mekalanos所述（J.Bacteriol、165∶723-731，1986）由于缺失Ctx基因和使卡那霉素抗性编码的基因插入而不产生霍乱毒素的菌株SM44和SM115使其在肠竞争试验中相应的突变体菌株（Bang-1、Bang-2和Bah-1、Bah-2）退出竞争。因而显而易见的是，SM44和SM115尽管它们不产生霍乱毒素，但制造ICF，这些突变体却不制造ICF。此外，由于CTX核心区是唯一缺失两种核心的DNA以及类型-2缺失和载有两种缺失类型的突变体在集群方面类似地不足，所以这也可总结为，图1所示的CTX成分核心区将ICF编码。
近来，已发现一种称为ZOT的新毒素被该核心区编码（Baudry  et  al.，1992，Infect.Immun.60∶428-434）。我们已证明，ZOT基因的突变不产生在类型-1或类型-2缺失突变体中所观察到的集群缺陷。因此，ICF被鉴定为与ZOT不同的独立和特殊性能。本文所述载有类型-1或类型-2缺失的疫苗菌株缺少ICF。
相反，菌株Peru-2相对于其竞争菌株C6709-Sm未呈现出任何肠集群缺陷（表2）。然而，在乳鼠中无论是菌株C6709-Sm抑或Peru-2的总细胞产量一般地比菌株SM44或SM115少10-100倍，这是暗示Peru菌株C6709-Sm和其衍生物Peru-2可能已经载有一种未确定的集群缺陷。由于全部或部分CTX成分的核心缺失不会引起菌株Peru-1或Peru-2的集群进一步的缺陷，这可总结为菌株C6709-Sm部分缺少ICF，尽管它已载有相应于CTX核心区的DNA序列。由菌株Peru-2、Bang-2和Bah-2中存在的类型-2突变所确定的完全CTX区域的缺失保证了ICF的基因不能复活而成为疫苗衍生物中的功能。ICF基因的类型-2缺失明显地造成适度的集群缺乏。这样可以用作霍乱疫苗开发中的减毒突变，因为野生型ICF可能是造成程度不合乎要求的毒性的主要原因。
表2  突变体菌株的性能
突变体菌株 亲本菌株*血清型 缺失类型
Peru-2  C6709-Sm  Inaba  类型-2
Bang-2  P27459-Sm  Ogawa  类型-2
Bah-2  E7946-Sm  Inaba  类型-2
＊注：在菌株名称后面的符号“Sm”是指链霉素抗性。这是抗100μg/ml链霉素的自然选择的菌株并且是核蛋白体蛋白基因中自然点突变的结果。这一抗性标记与质粒或转位子无关并因而对肠道菌丛无感染性。由于全部突变体菌株都来自所指定的亲本菌株，所以所有突变体菌株都是抗链霉素的。
表3 幼鼠集群竞争试验a
投入率  产出率
突变体菌株  竞争菌株
突变体/竞争菌种  突变体/竞争菌种
Bang-2 SM44b0.61 0.16
Bah-2 SM115c0.92 0.07
Peru-2 C6709-Smd0.74 0.65
Bang-1 SM44b0.85 0.05
Bah-1 SM115c0.61 0.04
Peru-1 C6709-Smd0.89 0.94
a按照Taylor等人所述的方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84∶2833-2837，1987）进行幼鼠集群试验。通过对抗菌素的差别敏感性或通过与下面附注中所述的合适探针菌落杂交测定菌株的比率。
b菌株SM44已由Goldberg和Mekalanos（J.Bacteriol.165∶723-731，1986）描述过并且是亲本菌株P27459-Sm的一种抗卡那霉素的衍生物。SM44中将卡那霉素抗性编码的基因被插在Ctx位置。由于Bang-1和Bang-2是P27459-Sm的衍生物，所以与SM44的竞争测定了集群的区别，这些区别可归因于类型-2的作用，而不是ctx的损失。在这些竞争试验中通过计算对30μg/ml卡那霉素抗性的菌落数，知菌株Bang-1和Bang-2对卡那霉素是敏感的并且与SM44区分。
c菌株SM115已由Goldberg和Mekalanos（J.Bacteriol.165∶723-731，1986）叙述过并且是亲本菌株E7946-Sm的一种抗卡那霉素衍生物。在SM115中将卡那霉素抗性编码的基因被插在CTX位置。由于Bah-1和Bah-2是P27459-Sm的衍生物，所以与SM115的竞争测定了集群的区别，这些区别可归因于类型-2缺失的作用而不是Ctx的损失。在这些竞争试验中通过计数对30μg/ml卡那霉素抗性的菌落数，知菌株Bah-1和Bah-2对卡那霉素是敏感的并且与SM115区分。
d菌株C6709-Sm是Peru-1和Peru-2的亲本菌株。Peru-2载有类型-2缺失而Peru-1载有核心缺失。这两种缺失都消除Ctx基因并从而当用Goldberg和Mekalanos（J.Bacteriol.165∶723-731，1986）所述的CT-1探针探测时Peru-1和Peru-2两者在菌落杂交印迹中是阴性的，而使用相同的探针时菌株C6709-Sm是阳性的。从而，在这些竞争试验中通过计算与CT-1探针杂交的菌落数将Peru-1和Peru-2两者与C6709-Sm区分。
通过在每种菌株中形成额外的突变可进一步将所述的突变体菌株改进为疫苗选择物，它们将用来增强疫苗的安全性和免疫原性。
就安全性而论，可将第二种突变引入上述任何菌株的recA基因，该突变是被用来使recA基因失活的。从而这些双重突变体菌株在重组方面有缺陷，将不能在该环境中与野生型霍乱弧菌菌株重组。因此，它们将不能得到野生型毒素基因和表达CTX成分。
通过将额外的突变引入各菌株还可改进免疫原性，这将可使该菌株表达霍乱毒素相关抗原（例如霍乱毒性B亚单位）或其他异源抗原，例如Shiga类毒素的无毒B亚单位或产肠毒素E.coli菌株、Shiga毒素、炭疽病毒、假单胞菌属内毒素A、百日咳毒素、破伤风毒素的各种CFA抗原;来自疱疹病毒、风疹病毒、流感病毒、流行性腮炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒的抗原、来自HIV衣壳的抗原片段;和来自真核寄生虫引的疟疾、肺囊肿肺炎和弓形体病的致免疫多肽（Karjalainen  et  al.，1989，Infect.Immun.57∶1126;Perez-Casal  et  al.，1990，Infect.Immun.58∶3594）。
因而，一系列突变衍生物使菌株变得更安全，遗传上更稳定并更广泛地致免疫的各个结合的补充性能也可用于本发明。以下说明这些衍生物的构建。
recA/ctxB等位基因的构建
已知霍乱毒素B亚单位是一种无毒的，高度致免疫的分子，它能诱导出中和霍乱毒素的抗体。为了产生更为致免疫的疫苗菌株，将一种新复制的ctxB基因引入含有上述类型-2缺失的疫苗菌株中（因为类型-2缺失消除全部霍乱毒素B亚单位的编码序列）。这一过程以下述的一系列步骤完成。
首先，利用聚合酶链反应（PCR）构成ctxB基因的缺少启动子的复制。为了进行PCR，将下游引物设计成使得ctxB编码序列能以消除位于ctxB基因中的终止密码子正下游的attRS1位点这样的方式被合成。这一引物具有如下序列：
5′-GGGCTAAAGTTAAAAGACAAATATTTTCAGGC-
3′[SEQ.ID.NO∶5]。
将上游引物设计成使得只有A2亚单位的最后24羧基端氨基酸残基能被该反应产物所编码。这一引物具有如下序列：
5-′GGGTAGAAGTGAAACGGGGTTTACCG-3′[SEQ  ID  NO∶6]。在将A亚单位编码的此DNA中的全部其他核苷酸被排除在该反应之外。在最终产物中保留了将ctxA2羧基端氨基酸编码的DNA，以便进行ctxB基因表达的转译连接。由于与霍乱毒素相关的毒性是由ctxA1多肽产生的，所以将A1多肽编码的全部序列被排除在PCR反应之外。
用上述ctxB引物，利用来自秘鲁菌株，C6709-Sm（图5）的霍乱病毒DNA，进行PCR。该反应的产物，0.64碱基对片段，被克隆入质粒PCR100。然后将这一片段以0.6千碱基SpeI-EcoRI片段从该质粒截下并克隆入两种单独的受体质粒，XbaI-EcoRI片段从该质粒截下并克隆入两种单独的受体质粒，XbaI-EcoRI消化过的PRT41和XbaI-EcoRI消化过的pVC100。然后所得到的质粒pJM411和pJM1001各自分别在霍乱弧菌的ctX启动子（ctxP）或htpG启动子（hptP）控制下将复制的ctxB基因编码。然后将这些质粒转移到不产毒的霍乱弧菌菌株0395-NT（Mekalanos  et  al.，1983，Nature  306∶551  and  U.S.Patent  No.4，935，364），结果产生两种新的菌株，其学名为0395-NTpJM411和0395-NT  pJM1001。通过GMI  ELISA测定每种菌株产生的霍乱C亚单位量。在LB培养物上清液中，菌株0395-NT  pJM411产生30μg/ml，而菌株0395-NT  pJM1001产生100μg/ml/。这些结果证明，PCR的产物是一种将能够与神经节苷脂GMT结合的抗原霍乱B亚单位编码的机能ctxB基因并因而类似于由正常野生型霍乱弧菌所分泌的基因。
在下一步骤中，将表示启动子-ctxB结构的DNA的EcoRI-BamHI片段亚克隆入自杀recA质粒pGP84。这一质粒含有相应于侧接霍乱弧菌recA基因DNA的霍乱弧菌染色体DNA插入物（即一种recA的内缺失）。质粒pHP84是自杀质粒pJM703.1的一种衍生物（Miller  et  al.，1988，J.Bacteriol.170∶2575）并将相应于霍乱弧菌recA基因侧接区的序列编码（Goldberg  et  al.，1986，J.Bacteriol.165∶715），这包括在左侧的BgiⅡ-PvuⅡ片段和在右侧的XbaI-EcoRI片段。将卡那霉素抗性编码的1.3Kb片段位于这两种片段之间。质粒pGP84还含有将对链霉素敏感性编码的NruI-BamHI片段。这后一片段由质粒pN01523得到（Dean，1981，Gene  15∶99）。当pGP84用XbaI消化时，这1.3Kb的片段被去除，其他XbaI片段可被插入这一缺失recA区域。如下述完成该亚克隆：通过添加XbaI衔接物修饰表示该启动子-ctxB结构的两种EcoRI-BamHI片段中的每一种。它们单独地被连接到XbaI消化过的pGP84上，结果产生两种新的质粒pJM84.1和pJM84.2，其中的每一种都含有分别表示htpP-ctxB和ctxP-ctxB结构的DNA（图6）。
接着，将质粒pJM84.1和pJM84.2转移入霍乱弧菌菌株Peru-2、Bang-2和Bah-2中并选择抗氨苄青霉素的菌落。由于这些质粒不能在霍乱弧菌中复制，它们通过同源重组产生示于图6的结构整合入宿主细胞染色体中。两种质粒也将链霉素敏感性的基因编码，这便于对在抗链霉素的菌株中（即菌株Peru-2、Bang-2和Bah-2）的抗质粒整合情况的正向选择。因而，当具有整合入该染色体DNA质粒的菌株在含2mg/ml链霉素的培养基上生长时，已回复氨苄青霉素敏感性的菌落可被分离。然后在这些后一类菌株中选择以这种方法现已去除了整合质粒并与ctxB结构一起遗留在recA缺失突变之后的菌株。这些菌株由于具有下列性能而易于鉴别：
1.它们是氨苄青霉素敏感的。
2.它们在0.1ml甲基甲磺酸酯/ml LB，recA-细胞的特征表型存在时被杀死。
3.它们产生由GMI-ELISA所测定的霍乱B亚单位。
4.使用recA和ctxB探针的Southern印迹分析证明，它们含有与存在ctxB结构和缺失合适的recA序列相一致的DNA片段。
按上述步骤分离的细菌菌株如下：
菌株  基因型
Peru-3  attRS1缺失，recA∶∶htpP-ctxB，Str
Peru-4  attRS1缺失，recA∶∶ctxP-ctxB，Sre
Bang-3  attRS1缺失，recA∶∶htpP-ctxB，Str
Bah-3  attRS1缺失，recA∶∶htpP-ctxB，Str
Bah-4  attRS1缺失，recA∶∶ctxP-ctxB，Str
lacZ-ctxB等位基因的构建
上述疫苗菌株中所含的recA突变使这些菌株变得同源重组不足。为了制备仍能够同源重组的疫苗选择物，如下述所述将ctxB基因插入霍乱疫苗的lacZ基因中。
将霍乱弧菌lacZ基因编码的质粒pCG698在lacZ编码序列的中间含有独特的HpaI位点。质粒pCG698构成如下：由所述的（Mekalanos，1983，Cell  35∶253）菌株E7946而得的染色体DNA片段库中使霍乱弧菌的β-半乳糖苷酶克隆。已知该质粒将表达β-半乳糖苷酶并接着绘制限制性酶图后，还知其含有含在各自被2.1Kb  DNA分离的lacZ基因中的2个HpaI位点的6Kb插入物。这一质粒与HaaI联成直线，而XbaI衔接物连接在此末端。由如上所述的pJM411中去除含有ctxP-ctxB结构的EcoRI-BamHI片段，通过添加XbaI衔接物修饰该末端并将该片段连接到类似地修饰过的pCG698上。得到的质粒pJM6891，现在含有插入LacZ基因中间的ctxB-ctxB结构。将这一质粒转移入霍乱弧菌菌株Peru-2、Bang-2和Bah-2中并将每种得到的菌株筛选以便在X-gal存在下进行生长。收集并纯化含有失活lacZ基因的白色菌落。通过消除由在没有氨苄青霉素时生长的pJM6891的细菌得到含有整合入宿主细胞染色体复制的lacZ∶∶ctxP-ctxB的菌株。通过Southern印迹分析证实了该合适序列的存在，通过GMI-ELISA证实了这些细菌产生霍乱毒素B亚单位的能力。在这一步骤后分离出的细胞株如下：
菌株  基因型
Peru-5  attRS1缺失，lacZ∶∶ctxP-ctxB，Str
Bang-5  attRS1缺失，lacZ∶∶ctxP-ctxB，Str
Bah-5  attRS1缺失，lacZ∶∶ctxP-ctxB，Str
为了表征这种与小鼠集群有关的某些载体霍乱疫苗选择物，使小鼠感染以下所列的菌株。菌株TCP2，一种含有TcpA缺失和不将人类志愿者肠集群的0395-N1的衍生物用作对照物。对每种菌株使用5只小鼠。在24小时感染后，由每只鼠中分离出上肠，均化并利用简易的平板试验测定霍乱弧菌存在数。结果列于下表。在感染TCP2的小鼠肠中基本上未测出任何TCP2细菌，因此以下所给出的数值代表在背景值0以上使小鼠肠集群的每种菌株的细菌数。
菌株 CFU/每小鼠a基因型／结构b
Peru-3 9.4×105attRS1缺失 ＃2， recA: htpG- ctxB
Peru-2 2.5×106attRS1缺失 ＃2
Peru-4 6.0×106attRS1缺失 ＃2， recA:: ctx- ctxB
Peru-5 6.6×106attRS1缺失 ＃2， lacZ:: ctx- ctxB
Bang-2 9.9×106attRS1缺失 ＃2，
Bang-3 2.7×107attRS1缺失 ＃2， recA:: htpG- ctxB
每只小鼠回收的菌落形成单位（5只小鼠平均）。
b结构attRS1缺失＃2是图3中所述用质粒pAR62构建的类型2缺失。
结构recA∶∶htpG-ctxB是在由霍乱弧菌的htpG产生的热休克启动子控制下recA基因的缺失和霍乱毒素B亚单位基因的插入。
结构recA∶∶htpG-ctxB是在由霍乱弧菌高产毒菌株5698的ctx基因产生的霍乱毒素启动子控制下recA基因的缺失和霍乱毒素B亚单位基因的插入。
结构1acZ∶∶ctx-ctxB是在由霍乱弧菌高产毒菌株5698的ctx基因产生的霍乱毒素启动子控制下由霍乱毒素B亚单位基因组成的霍乱弧菌lacZ基因的插入。
这些结果暗示recA∶∶htpP-ctxB等基因的存在起到了减低Peru衍生的菌株集群肠的能力（例如，Peru-3与Peru-2比较）。然而，这一结构对Bang衍生的菌株的集群作用较不明显（Bang-3与Bang-2比较）。通常，其中ctxB是在其本身的启动子控制下的该结构引入对集群只具有较小的作用，以致基本的这一结构处于热休克启动子控制之下。应注意，菌株Peru-2、Peru-3和Bang-3在其集群化性能方面的变化大于28倍范围。在工艺中较佳的是在上述程序以下后分离在其集群性能方面变化甚至更为广泛的另外的疫苗选择物。
上述步骤可被任何现有技术中普通技术人员应用于构成能够表达异或同源抗原的广泛变种，例如通常不在霍乱弧菌中表达的抗原的Peru-2、Bang-2和Bah-2衍生物。这些衍生物当用作活疫苗时，将被预期能诱导对霍乱弧菌抗原和它所编码的异种抗原的强免疫应答。很可能会诱导全身和局部两种免疫应答，因为接种其他原型霍乱弧菌疫苗导致了诱导对两种完全细胞抗原（例如LPS）以及独特蛋白，如霍乱毒素B亚单位特定的循环IgG和局部IgA抗体的引入（Herrington  et  al.，1988，J.Exp.Med.168∶1487-1492）。由霍乱弧菌所表达的异种抗原预期会诱发出类似于独特霍乱蛋白的免疫应答的免疫应答。
可用于将异源抗原引入霍乱弧菌的方法与上述将ctxB基因重新引入疫苗菌株Peru-3、Peru-4、Peru-5、Bang-3、Bah-3和Bah-4的那些方法相类似。实际上，利用这些方法可将任何异源抗原插入霍乱弧菌。
总之，资料证明了使用基因工程技术产生新的含有ctxB的霍乱弧菌菌株可行性，其中ctxB基因的表达处于两种霍乱弧菌启动子（ctxP和htpP）的任一种控制之下。经该工程处理的基因可重组入霍乱弧菌染色体进入靶基因如recA或1caZ以产生稳定地表达大量霍乱毒素B亚单位的菌株（例如，菌株Peru-3、Peru-4和Peru-5）。相同的程序可以用以构建实际上能够表达任何异源抗原或通常被任一细菌、病毒或寄生虫编码的抗原的Peru-2、Bang-2和Bah-2的衍生物。从而本发明所述的方法传授了一种多价霍乱弧菌疫苗“载体菌株”的产生，该菌株可被用以编码和表达其他抗原并可给人施用，以使他们不仅对霍乱，而且也对其他病原体免疫。
表达异源细菌抗原的霍乱弧菌疫苗的构建
霍乱弧菌/产肠毒素的E.coli疫苗
诱发对霍乱毒素（CT）抗体的霍乱弧菌疫苗已被证明对抗产生不耐热毒素（LT）的产肠毒素的E.coli（ETEC）菌株的人体疫苗提供了交叉保护（Svennerholm，J.Infect.Dis.，149∶884-893，1984）。然而，这些疫苗对产生热稳定毒素（ST）的ETEC菌株而言仍然是有缺点的。可使用一种霍乱弧菌的减毒菌株Peru-3作为保藏将集群因子抗原CFA/IV菌毛的主要亚单位的ETEC衍生的异种基因，和ST的遗传类毒素编码的疫苗载体。这种疫苗载体将诱发ⅰ）抗菌毛抗体，预防病原ETEC菌株与人体肠上皮结合，和ⅱ）抗ST抗体，消除ST的腹泻作用。结果是单剂量口服载有活减毒霉乱弧菌的ETEC疫苗。
该载有减毒活霍乱弧菌的ETEC疫苗可具有一种或多种如下优点：ⅰ）它能冷冻干燥以长期保存，ⅱ）它不需要任何冷链，ⅲ）它是口服的，ⅳ）它仅需要单一剂量，ⅴ）它的成本是可行的，以及ⅵ）它抗大多数ETEC菌株。
以将来自E.coli的抗原的编码入霍乱弧菌疫苗菌株遗传上设计的序列制得了直接抗肠道病原体，霍乱弧菌和产肠毒素的E.coli（ETEC）的单一剂量口服活疫苗。在构建这种疫苗菌株时，合乎要求的是中和集群和毒素产生两者。这可通过将上述霍乱弧菌Peru-3的减毒菌株修饰而达到。已表明Peru-3激发潜在的免疫应答（表4和5）并在人体研究中提供了对霍乱的保护（表6）。
表4
免疫接种Peru-3或Peru-5
（1992年7月）后杀弧菌滴定度
Figure 931095247_IMG1
连续地将热激活试样稀释入微滴井中，与对数相霍乱弧菌（最终浓度5×107）和豚鼠补体（最终浓度11%）混合并于37℃培养1小时。然后将脑心浸液液体培养基加在平板上并于37℃培养2.75小时。表中的数值代表相互滴定度，此时中间抗体杀死50%或更多的霍乱弧菌。
表5
免疫接种Peru-3或Peru-5
（1992年7月）后霍乱抗毒素滴定度
连续地将血清试验物稀释在被预处理过的神经节苷脂/霍乱毒素B亚单位覆盖的96井微滴定平板上并于37℃培养30分钟。在用PBS洗涤3次后加入山羊抗人体抗体碱性磷酸酯共轭物并于37℃培养30分钟。在用PBS洗涤3次后向每个井添加2mg/ml PNPP并培养15分钟。用0.1MK2PO4终止反应并于406nm光密度处读数。表中的数值代表与峰值滴定度比较的相互滴定度和第二天的增加。
表6
用2×106cfu霍乱弧菌（N16961）野生型
生物体（1992年11月）激惹志愿者的结果
＊接种后未集群或随后血清转化
+由于紧急情况两份液体粪便未称重
这一菌株已表达几乎与ETEC不耐热的毒素B亚单位相同的霍乱毒素单位，并诱发交叉保护抗体。可将该菌株修饰以表达ETEC的菌毛抗原以及霍乱毒素A亚单位的低聚区域组成的嵌合蛋白和ETEC不耐热毒素的突变体形式。这样的方法，可以实现对霍乱弧菌和E.coli两者免疫性的诱发。
通过利用微生物学和分子生物学中的普通技术可实现产生霍乱弧菌/ETEC疫苗菌株。可以用确立兔肠道感染模型来分析该菌株对动物集群和诱导免疫应答的能力。
菌毛抗原的克隆和表达
以已知为集群因子抗原（CFAs）和推断集群因子（PCFs）的血清学上独特的菌毛来传递ETEC对人体肠上皮集群的能力。CFA/4菌毛是在约1/4-1/3所有临床分离物中鉴别出的基本集群因子。将该族（CS6）原型成员的主要亚单位编码的基因已被其他基因克隆和定序。
通过电转化将在高复制数质粒上所载的该克隆的CS6基因引入Peru-3并被含有50μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bettani液体培养基中的培养物所保持。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和利用抗CS6多克隆兔血清的免疫印迹分析含有CS6序列的Peru-3的全部细胞溶胞产物对蛋白抗体的表达。利用抗兔IgG-碱性磷酸酶轭合物和BCIP将免疫印迹显示。当产生17千道尔顿蛋白时检测CS6基因的表达。因而，可以在Peru-3中表达CS6抗原以形成疫苗。
然而，为了产生疫苗菌株选择物，合乎要求的是使CS6基因在没有抗菌选择时稳定地保持并使其由被霍乱疫苗主动转录的启动子表达。最后，可使用聚合酶链式反应（PCR）特定地放大载在质粒上的CS6基因并在其末端造成唯一限制性核酸内切酶位点以随后克隆入可以整合在霍乱弧菌染色体上的抗氨苄青霉素的，链霉素敏感的“自杀”载体。特别是，PCR产生与5′PcaI位点和3′NotI位点侧接的CS6NA可与已用PacI和NotI消化过的pJM6891DNA连接，以将CS6基因处于霍乱毒素启动子控制之下。通过电转化可将该连接混合物引入E.coli菌株SM10pir中，该菌株提供为pJM6891进行复制所需的，已知为pi的特定转移作用蛋白。然而，当pJM6891及其衍生物被引入霍乱弧菌（该弧菌缺少pi蛋白）时，对50μg/ml氨苄青霉素的抗性选择要求该质粒整合化该染色体上。通过侧接CS6的霍乱弧菌lacZDNA序列的存在测定此整合位点，所述序列与在霍乱弧菌染色体上的序列相同并能发生同源重组。生成的子代是抗氨苄青霉素的并保藏了整合复制的质粒和被重复lacZ基因DNA序列所包围的CS6序列。
可将这些复制物分解以除去载体序列（包括氨苄青霉素抗性因子），使CS6基因处于该毒性启动子控制之下。这通过在有2mg/ml链霉素时培养该菌种，选择Peru-3天然的链霉素抗性等位基因和由该质粒引入的相反的链霉素敏感性等位基因而完成。在存在链霉素时过夜生长后，在含有100μg/ml链霉素的LB琼脂上平板培养该培养物的单一菌落，并计算对50μg/ml氨苄青霉素的敏感性。通过染色体DNA的Southern印迹来分析链霉素敏感的和抗氨苄青霉素的分离物，以确定是否发生了预计的整合和切割现象。
可使用免疫印迹技术分析这些分离物的抗原产生水平。可在已知影响霍乱毒素启动子转录的各种各样生长条件下测定CS6菌毛抗原的产生。培养基PH（6.5与8.0比较），温度（30℃与70℃比较）、NaCl浓度（50-500mM）和氨基酸浓度（0-25mM）对CS6表达水平的影响可被测定。
然后在兔模型中可使用选择疫苗菌株Peru-3/CS6以证实安全性和免疫原性。由于产生CFA抗原的ETEC人体临床分离物通常对实验室动物不致病，可以构建表达E.col;菌株RDEC-1AF/R1菌毛抗原的另一种Peru-3衍生物以证明安全性和免疫原性。这一抗原粘附性传递到肠上皮，引起兔的腹泻疾病。载在质粒PW1上的将AF/R1编码的基因可以对CS6的相同方式被PCR放大，克隆入pJM6891并被整合入该染色体。可通过免疫印迹评价AF/R1的表达水平。当这一水平不产生人体的疫苗选择物时，它可用作证明被修饰过的Peru-3菌株异源抗原表达和诱导对被异源生物体激惹保护的模型。
通过电转化将载在高复制数质粒上的克隆后AF/R1基因也引入Peru-3，并被培养物保持在含有50μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani液体培养基中。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和使用抗AF/R1多克隆兔血清的免疫印迹来分析全部含有AF/R1序列的Peru-3细胞溶胞产物对蛋白抗原的表达。使用抗兔IgG-碱性磷酸酶轭合物和BCIP显现这些免疫印迹。当产生约18千道尔顿蛋白时检测出AF/R1基因的表达。因而可在Peru-3中表达AF/R1抗原以形成疫苗。
采用类似的策略，可制成一种表达Shigella保护性抗原的疫苗菌株，如脂多糖（LPS）和质粒衍生的侵入蛋白，以防由Shigella的传染种属，如S.sonnei引起的感染性腹泻。
在S.sonnei中，仅有一种LPS的血清型，并且它是防护对此细菌的主要抗原因子。将使LPS操纵子编码的质粒克隆引入E.coli则导致了LPS的表达并足以在E.coli上提供被抗S.son-nei LPS抗体所凝集的能力。引入Peru-3缺失突变体菌株的相同质粒使其变得可凝集。该操纵子的进一步分析表明，亚克隆入pBR322的这一质粒的12千碱基EcoR1/BamH1片段仍提供凝集表型。然后这一片段可被引入上述霍乱弧菌lacZ基因上的染色体。
ST-CTA2融合的构建和安全性
ETEC通过两种特殊毒素的集群和产生引起腹泻。不耐热毒素（LT）在序列、结构和生物作用方面几乎与霍乱毒素（CT）相同。因而，由Peru-3的衍生物产生CT，足以诱导能中和两种毒素的抗体。然而，免疫接种CT不能提供对ETEC热稳定性毒素（ST）的防护，该毒素是一种由许多临床分离物所产生的非常小的（19氨基酸）多肽，该分离物中某些是不产生LT的。为了诱发对这一毒素的抗体，因而在选择物霍乱/ETEC疫苗中的临界成分是Peru-3中的ST序列的内含。
已产生了一系列没有毒素活性（STLoxoids）的充分确定的ST衍生物。这些衍生物一般是该毒素或在形成该蛋白的三种二硫化物键的关胱氨酸残基中取代突变的片段。可以构建由在残基5和10中的含半胱氨酸至氨酸突变的完全成熟的多肽组成的一种SToxoid以使毒性降至最低或消除。这种SToxoid可全由补偿性的，由一种DNA合成物所产生的低核苷酸制成。可通过唯一的限制性核酸内切酶位点侧接该合成的基因以便随后亚克隆入质粒载体。
ST（19个氨基酸）的尺寸给其一种固有的不良免疫原。如果整体ST或甚至小的肽片段用化学或遗传方法连接到其他较大的蛋白（一种载体）上，则ST合成为好得多的免疫原并可诱发中和抗体。所用的主要载体是LT或CT的B亚单位。因为与霍乱毒素A2亚单位（可以使A片段与B亚单位五聚物低聚的酶亚单位区域）融合的异种蛋白可结合到该五聚物上，并形成全毒素类配合物，这些嵌合配合是ⅰ）由霍乱弧菌所分泌的，ⅱ）能够结合神经节苷酯受体的，以及ⅲ）免疫反应的。
将SToxoid编码的此合成基因在读码中可与将CTA2编码的基因的5′端融合，而形成一种SToxoid-A2嵌合体。该基因融合结构可被整合在上述的Peru-3染色体上。当与CTB亚单位共表达时，这一蛋白可形成没有ST和CT两者生物活性并能够结合神经苷酯受体的全毒素类配合物。可通过使用抗ST抗血清的免疫印迹来分析表达SToxoid-A2嵌合蛋白的菌株，以确定取代变异是否生成抗原上相关的蛋白。也可在幼鼠试验中比较SToxoid的毒性。
此幼鼠试验如下进行：给2-3天龄的小鼠胃内注入由这些疫苗菌株得到的蛋白提取物（或作为对照物的是纯化的ST），在注入后3-4小时将其杀死并测定肠与身体重量比的增加。然后可分析证明最低毒性的选择物SToxoid-A2嵌合体在兔中的免疫原性。Peru-3/AF/R1的安全性、免疫原性和效能。
可在兔中进行表达AF/R1的Peru-3的最初试验。可给新西兰白兔以2×102、2×104、2×106和2×108剂量口服细菌。可收集粪便试样并在含100μg/ml链霉素的LB琼脂平板上培养以计算集群和分离的细菌。可在服用疫苗前以及给药后7、14、21和28天抽取血液。可制备血清并通过使用粘在微滴平板上的纯化AF/R1的酶连接免疫吸附试验（ELISA）来分析对AF/R1蛋白特定抗体的存在，以及凝集RDEC-1细菌的能力。
然后可用病原菌株RDEC-1激惹接受Peru-3/AF/R1菌株的动物。可给免疫过的和未免疫的兔口服2×106生物体的激惹剂量并对粪便试样作腹泻观察（被规定为疏松、分布在直肠区的湿粪便和大套笼底部的疏松粪便）。在未免疫的动物中，通常在3-4天内发生腹泻。为了测试集群，在乳糖MacConkey琼脂平板上培养直肠棉拭试样然后对在玻片凝集试验中对抗RDEC-1抗体呈阳性反应的乳糖阳性菌落计数。可按在第四天后抑制腹泻和细菌集群两者来确定保护
Peru-3/CS6和Peru-3/SToxoid的安全性和免疫原性。
可按如上所述方式进行表达CS6和SToxoid-A2的Peru-3菌株的最初试验。可制备血清并通过使用粘在微滴平板的纯化CS6或神经节苷酯的酶连接免疫吸附试验（ELISA）来分析对CS6或SToxoid-A2嵌合蛋白特定抗体的存在。也可对抗CS6血清作能够固定补体和溶解产生E.coli的CS6的抗体存在的分析。在这一试验中，将载有CS6的细菌与血清和豚鼠补体混合，添加LB液体培养基，并在LB琼脂上平板培养该细菌。细菌活性导致回收的活菌计数减少。最后，可对抗SToxoid-A2血清作在幼鼠毒性试验中作能中和ST活性的抗体测试。
表达作为重组体霍乱全类毒素的HIV-1抗原的减毒霍乱弧菌的构建
可使用类似于上述的一种方法以构建表达人体免疫缺乏病毒（HIV）抗原的霍乱弧菌菌株。
构建含有一种细菌转录单位，这包括热休克蛋白的启动子、htp，和霍乱CT-B基因的霍乱往复性质粒。该转录单位被由霍乱recA位置得到的DNA序列侧接以使CT-B基因及其启动子可通过在霍乱基因组的recA位置中和在该质粒上两处存在的DNA序列之间的同源重组被整合入该霍乱染色体。该往复性质粒还含有一种将氨苄青霉素抗性编码的基因和一种将链霉素敏感性编码的基因，它们作为选择标记。
HIV-1包膜蛋白可以作为由该细菌分泌的重组体霍乱弧菌全类毒素的一部分，以“夹层的”融合蛋白形式被表达，其中在HIV抗原之前的是CT-A多肽的信号序列，随后是CT-A2区域。CFA的信号序列及其上游的未转译区为在细菌中表达和分泌HIV-1抗原是需要的。与HIV-1抗原融合的CF-A2区域对于融合蛋白以集合CT-B蛋白而形成重组体霍乱全类毒素是需要的。可将上述质粒修饰，以使得含有Shine-Dalgano（SD）序列CT-A基因信号序列，以及插入HIV-1抗原的单一限制性核酸内切酶PmeI位点的PCR片段被插入其PacI位点。可进一步修饰该质粒，以使得含有CT-A2区域和CT-B基因两者的第二PCR片段置换此CT-B基因。通过DNA定序可确定DNA插入的取向和PCP片段的接点。
在这一研究中所用的HIV-1抗原是含有主要中和区域（PND）的HIV-1包膜糖蛋白的一部分。现有技术的研究证明了一族由PND得到的合成肽可诱发动物中的中和抗体。将由HIV-LAI包膜基因，包括PND，但没有信号序列和第一氨基酸，得到的DNA片段被克隆入上述质粒的PmeI位点，该质粒含有CT-A2区域和CT-B基因。通过DNA定序可证明读码中的HIV-1抗原和CT-A信号多肽以及CT-A2区域的融合。
为了构建载有HIV-1抗原的遗传上减毒的霍乱苗株，Peru-2是所用的亲本菌株。可通过接合将含有HIV序列的质粒引入Peru-2菌株。制得了一种含有Ctx和recAloci的缺失并表达HIV-1抗原的无毒重组体融合蛋白的霍乱弧菌重组体菌株，并命名为Peru101。可使用Southern印迹分析以证明Peru101含有HIV-1抗原的DNA，以及可使用Western印迹分析以证明由重组体细菌表达HIV-A2融合蛋白。使用抗CT-B和抗HIV两种抗体的ELISA可测试重组体霍乱全毒素是否由该细菌所分泌。使用SHIV模型在灵长类中对口服HIV1疫苗的免疫原性和保护效能的基础评价
为了试验作为一种口服HIV-1预防疫苗的霍乱弧菌重组体Peru 101的免疫原性，可给每六头成年雌性猴（Macaca混血种）供给在30ml碳酸氢盐水中的2×106CFU新鲜制得的活细菌。可以给予相同年龄和性别组中的另两只动物相同剂量的Peru-2作为对照。在接种后两天可通过测定在LB链霉素平板上菌落形成单位来分析动物粪便试样，以检测肠中霍乱弧菌的增殖。可在接种两周后测定对HIV1和对CT-B特定的阴道、直肠、唾液和血清抗体，包括IgA和IgG。也可测定宿主动物的T细胞增殖和对输入HIV1抗原特定的CTL应答。根据接种动物最初的免疫应答的程度，可能需要一次或几次通过口服，或通过肌肉和静脉内注射纯化的HIV1抗原的增强。
如果Peru 101可以刺激动物产生抗HIV抗体或传递HIV1特定免疫应答的细胞，则可用活SHIV-LAI原种经由阴道注入将动物激惹来试验Peru 101作为HIV1疫苗的效能。可用2×VI-AID50剂量来激惹两只Peru2动物（接受Peru2菌株的猴）和六只中的两只Peru 101动物（接受Peru101的猴）。其余中的两只Peru101动物接受10×VI-AID50而剩下的Peru101猴接受最大量50×VI-AID50剂量。可在感染后每两周收集外周血液试样通过在培养的PBMC中检测病毒抗原以测定动物是否已被感染。如果该疫苗对动物有抗载有同源HIVI包膜基因的SHIV激惹具有预防效果，则可用含有同源HIV1包膜的SHIV-EI1来重新激惹这些动物。
自发软琼脂穿透不足的霍乱弧菌菌株分离
软琼脂穿透不足的霍乱弧菌突变体可用于生产疫苗。使用这些突变体的理由如下：被认为是粘的肠的粘膜层和软琼脂穿透不足的突变体可能是这一粘膜的穿透缺陷。尽管这些突变体穿透粘膜不足，但仍可以存在对派伊个氐淋巴集结的抗原，这些集结未被厚粘凝胶所复盖并包括为IgA抗体产生所专有的抗原抽样细胞。结果，预期这些穿透不足的突变体具有低的基因活性，此外还具有高的抗原活性，这些特征是合乎活疫苗要求的。尽管不游动突变体是一类软琼脂穿透不足的突变体，但其他类型的突变也可能产生软琼脂穿透不足的表型（即游动表型）并可以用于疫苗。与这一系列理由一致，完全不游动的突变体，即不能在无琼脂的培养基中游动的突变体，可能是有用的选择物疫苗。
为得到这些突变体，如下所述可使用软琼脂以评定细菌穿透高粘度培养基（0.25-0.4%琼脂的软琼脂培养基）的能力。一种具有高度治疗价值的这种软琼脂穿透不足疫苗是Peru-14。除了是软琼脂穿透不足外，50%以上的Peru-14细胞是丝状的，同时有螺旋状外观并且其细胞长度大于5个正常细胞长度（与野生型细胞长度5nm对照为25nm）。
分离三重缺失菌株（Peru-3）（ctx-、att-和recA-）的软琼穿透不足衍生物产生在以下（表7）所示的无副作用，但仍保持使接种疫苗者集群能力的疫苗菌株（Peru-14）。
表7
免疫接种新鲜收获的Peru-14霍乱疫苗的结果
＊免疫接种后72小时志愿者有无痛半固态粪便。粪便对Peru-14是培养物阳性的。
+在免疫接种后48小时志愿者有两次少量液体粪便。粪便对Peru-14是培养物阳性的。
按如下方法制备Peru-14软琼脂穿透不足菌株：在含有100μg硫酸链霉素的LB液体培养基中于30℃将Peru-3生长过夜。将培养物稀释至约2000cfu/ml将0.1ml涂在含有100μg链霉素的LB平板上。于30℃将该平板培养过夜后，用牙签收集约1000菌落于软琼脂板（LB液体培养基+0.45%Bacto琼脂）和于30℃培养过夜。将接种牙签仅插入软琼脂平板表面1-2mm。被收集的1000个菌落中的25个可视作非穿透的。非穿透的分离物以直径约2mm的菌落出现，而穿透的分离物在琼脂上和其中将琼脂群集成直径大于5mm。再次将这些菌落与已知的非穿透，不游动霍乱菌株和原始Peru-3菌株一起重新采集入软琼脂中。此25个菌落中的一个是非软琼穿透的（当与对照比较时）。命名为Peru-14的这一菌落对于凝集血清仍是Inaba阳性，并且在B亚单位ELISA中试验时产生与Peru-3相同水平的B亚单位毒素。上述方法可用于分离任何霍乱弧菌菌株的软琼脂穿透不足的突变体。使用上述方法可制得不可回复的，穿透不足的突变体，如隐藏基因缺失的那些突变体。
Beng菌株
最近已发现一种高度异常的非01至病性强的菌株是造成印度次大陆霍乱流行的原因。以前01流行的生存者免于这一菌株侵害。
这一菌株已保藏在Rockville，MD的American  Type  Culture  Collettion（ATCC）。如上述对其他菌株的，例如通过一种或多种如下变异：ctx-、att-、recA-或游动性不足的表型可使Beng减毒。这种减毒的Beng菌株可以与一种上述减毒的PERU菌株结合以提供一种双重霍乱疫苗。
活疫苗菌株的使用
上述霍乱弧菌变异体菌株Peru-1、Peru-2、Bang-1、Bang-2、Bah-1、Bah-2、Bengal-2、Bengal-3和补充的变异体当以活疫苗使用可用作抗霍乱和其他有关产毒疫病的免疫保护源。其他这些疾病包括，但不限于，由产肠毒素的E.coli和产生与霍乱B亚单位免疫方面交叉中和的毒素的其他细菌所诱导的那些疾病。
霍乱弧菌的突变体菌株当被接种入试验动物或人体的肠中时，将刺激和诱导抗所有细菌组分的强免疫应答，所述细菌组分是由这些菌株从简单成分合成的，这包括但不限于Ogwa和Inaba01LPS抗原、鞭节鞭毛抗原、Tcp  pili抗原区域，以及外膜蛋白。根据对其他原型霍乱疫苗的公开了的研究，在接种的动物或人体中将合成针对这些细菌组分的IgA和IgG两类抗体并接着将用来保护动物或人体免受霍乱弧菌有毒菌株的激惹。
剂量
合适剂量的确定以及这些疫苗的给药基本上如Herrington等人所述进行（1988，J，Exper.Med，168∶1487-1492）。通常，这些剂量是在，但不限于，每剂105-109活细菌之间。
疫苗菌株的生长
将被用作疫苗的细菌可在标准霍乱弧菌实验室培养基中生长。可收获此细胞然后以保存生活力的配方的形式（例如含有5mM CaCl2和10%（重量/体积）甘油的无菌脱脂乳或盐水）冷冻干燥。
服法
该疫苗的服法包括将两种外膜或小瓶的内容物结合，一种含有冷冻干燥的疫苗菌株，另一种含有水和足够的碳酸氢钠或可选择的中和胃酸的缓冲剂（约2克）。然后可将此疫苗被接种疫苗者吞咽。另一方面，可将此冷冻干燥的疫苗掺入药片中，药片可用耐酸“肠衣”包复。可以由几天至几周相隔的间距以一次或多次（至多三次）剂量给接种疫苗者服用这种形式的疫苗。当按“加强”疫苗使用时，也可以由几天至几周相隔的间距以一次或多次（至多三次）剂量给预先接种过的个体服用该疫苗。当服用两种或更多种菌种时，它们可以一起或以7-28天相隔的单独剂量提供。
改进的死口服霍乱疫苗
可由上述菌株制得改进的死口服霍乱疫苗制剂。当前可以购得的实验性霍乱苗疫含有约1011的与纯化霍乱毒素B亚单位福尔马林混合的加热杀死的霍乱弧菌细胞（Black et al.，Infect.Immun.55∶1116，1987）。在这一疫苗的细菌组分的制剂中所用的四种菌株产生活性霍乱毒素，在给接种疫苗者服用之前必须将这些毒素完全失活。上述的新菌株提供了一种比Black等人（同上文）的疫苗大大改进的疫苗，各种理由如下：
（1）由于得自并包括Peru-2、Bang-2和Bah-2的这些菌株仅产生霍乱毒素的无毒素B亚单位而不是有毒的A亚单位，因此这些菌株的培养物在给接种疫苗者服用之前仅需弱的失活，因此避免了更剧烈的变性处理，如福尔马林或加热。较弱处理的优点是抗原将保持其更高程度天然构形，结果他们将更为致免疫。避免化学上使细菌蛋白失活的温和的失活方法包括微波处理生物体、用另一种幅射源或温和有机溶剂或洗涤剂处理、或通过机械方法，如声处理或使用French  Press可将细胞溶解。
（2）在菌株Peru-3、Bang-3和Bah-3中，CtxB基因已置于htp启动子控制之下。结果，这些菌株在标准实验室培养基，如LB中合成大量霍乱B亚单位（大于10μg/ml培养物）。这有助于纯化大量霍乱B亚单位并从而这些菌种明显优于在约束生长条件下仅产生少量B亚单位的其他菌种。
（3）在现存的死霍乱疫苗的制备中，使用的细菌菌种以产生来自该菌株的，作为完全细胞抗原的B毒素亚单位。从而在制备B亚单位期间必需使用生物化学方法将B亚单位提纯，分离掉有毒的A亚单位。这种提纯招致少量A亚单位可能玷污B亚单位制剂的危险。使用上述菌株，可能由得到B亚单位制剂所用的相同的培养物中产生完全细胞抗原制剂。首先，现在不必纯化B亚单位，因为该菌株不产生A亚单位，从而减少了制备疫苗中涉及的时间和大量费用。其次，不存在于制剂中任何A亚单位玷污的危险，因为该细菌完全不将这一亚单位的基因编码，从而不会产生它。因此完全细胞制剂可用作对接种疫苗者具有最小危险的疫苗。
（4）本发明主题的细菌菌株是El  Tor纯系群霍乱弧菌的全部衍生物，更确切地是，在Peru-2、Peru-3和Peru-4的场合中，它们实际上是当前在拉丁美洲流行的病原体分离物的衍生物（C6709-Sm）。当存在有这一特定亲本菌株的单一的抗原时，则上述疫苗衍生物通常可在拉丁美洲并可能在世界其他地区提供抗El  Tor疾病的更好的保护。
一种改进的口服死霍乱疫苗可按如下所述制备。可在单独的培养物中生长最小限度的两种菌株，较佳的是选自Ogwa血清型（例如Bah-3）、Inaba血清型（例如Peru-3、Peru-14或Bang-3）、以及Beangal血清型（例如Bengal-2或Bengal-3）。现有技术的普通技术人员会知道，如何调节条件、培养基等以使细胞在37℃下最大限度生长。例如，可采用在培养基如CYE（Mekalanos  et  al.，1977，Infect，Immun.16∶789）或含有葡萄糖的基本培养基如AGM4（Van  de  Walle  et  al.，1990，Appl.Microbiol.Biofechnol.33∶389）中高度充气条件下的培养物生长。当细菌生长达到饱和时，可通过离心法由培养基中回收全部细胞，而在上清液部分中所含的蛋白（包括B亚单位）可通过超离心分离或沉淀得到。利用Black等人（Infect.Immun.55∶1116，1987）或通过较温和的方法（例如，微波、用α、β或γ射线幅照）、用有机溶剂，如乙醇或丙酮处理可使该细胞生活，或通过用洗涤剂或通过机械方法如声处理或通过使用French  Press将它们溶解。然后可将此失活的细胞与滤过的，浓缩的含有细菌蛋白（包括亚单位B）的上清液合并将可该混合物重新悬浮在适于口服的可药用溶液中（例如无菌盐水或2%碳酸氢钠）。
服法：
该疫苗可作为口服盐水溶液给接种疫苗者服用，该溶液被接种疫苗者在已摄取2g碳酸氢钠以后几分钟后吞咽。另一方面，可将该制剂冷冻干燥并压制成片，然后在向接种疫苗者给药之前用一种耐酸“肠衣”包复这些药片。这些药片也可用聚合物形成微囊体以使有助于通过肠肌肉组织吸收该制剂。
剂量：
单一剂量疫苗含有约1011细胞和约100-5000μg霍乱B亚单位。预期接种疫苗者将需要约两或更多周的间隔服用约两次或多次单独剂量的此疫苗。
保藏
根据Budapest  Treaty  on  the  International  Recognition  of  Deposit  of  Microoganisms  for  the  Purpose  of  Patent  Procedure的条款，已在Rockville，Maryland，USA的American  Typeculture  Collection（ATCC）进行了霍乱菌株C6709-Sm、P27459-Sm、E7946-Sm、Bengal-2、Bengal-3、M010和Peru-14的保藏，ATCC给予这些保藏物的保藏号为：ATCC55331（C6709-Sm）;ATCC55333（P27459-Sm）;ATCC55332（E7946-Sm）;ATCC55436（0139、Bengal-2）;ATCC55437（0139、Bengal-3）;ATCC55438（0139、M010）;以及-（Peru-14）。
申请人的代表，President  and  Fellows  of  Harvard  College指，ATCC是提供永久性保藏物的保藏中心并当专利被授予时，立即被公众得到。关于这样被保藏的材料的为公众可得到的一切限制在授予专利时将最后被取消。在专利申请的待批期间，将可得到该材料以便按37C.F.R1.14和35US.C.S122所授权的专员所单独检查。该保藏的材料将用经过对提供该保藏材料样品的最新要求后至少5年的期间，在在任何情况下，经过保藏日期后至少30年的期间或专利的实施期限（无论哪个期间是较长的）为使其保持存活并且不受污染所需的全部照料被保存。申请人代表确认，如果保藏中心由于保藏的条件，当需要时不能提供样品，则进行更换保藏的责任。
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What  is  claimed  is:

Claims (33)

1、一种不产毒遗传稳定的霍乱弧菌突变体菌株，所述菌株是缺少将机能ctxA亚单位编码的DNA的遗传工程缺失突变体，所述突变体还缺少任何机能attRS1序列。
2、一种制造缺少将机能ctxA亚单位编码的DNA并还缺少任何机能attRS1序列的遗传稳定的霍乱弧菌突变体菌株的方法，所述方法包括：
将一种含有在其ctxA和attRS1序列中突变的霍乱弧菌DNA的片段的质粒引入野生型霍乱弧菌，所述DNA是能在所述霍乱弧菌内部与野生型霍乱弧菌重组，导致产生所述的突变体菌株的。
3、权利要求1的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株是由属于E1Tor纯系群的亲本菌株产生的。
4、权利要求3的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株是由属于Inaba或Ogawa血清型的亲本菌株产生的。
5、权利要求4的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株是Peru-2、Bang-2或Bah-2。
6、权利要求1的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株是由非01血清型产生的。
7、权利要求1的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株缺少CTX核心序列并完全缺失所有所述attRS1。
8、权利要求1的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株还缺少机能recA基因。
9、权利要求1、7或8的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株还将霍毒素的B亚单位编码。
10、权利要求1、7或8的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株还将一种异源抗原编码。
11、权利要求10的霍乱弧菌菌株，其中所述异源抗原是一种Shiga类毒素或Shigella脂多糖抗原，或一种E.coli菌毛抗原或一种HIV抗原。
12、权利要求10的霍乱弧菌菌株，其中将所述异源抗原编码的DNA序列被插入霍乱弧菌的LacZ基因。
13、权利要求9的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株是Peru-3、Peru-4、Bang-3、Bah-3或Bah-4。
14、权利要求2的方法，其中所述霍乱弧菌是Peru-2、Bang-2或Bah-2。
15、权利要求2的方法，其中所述突变体菌株缺少CTX核心序列和全部attRS1序列。
16、权利要求2的方法，其中所述突变体菌株还缺少机能re-cA基因。
17、权利要求2的方法，其中所述突变体菌株还将一种异源抗原编码。
18、权利要求2的方法，其中所述方法还包括将一种将抗原编码的DNA片段引入所述突变体菌株的lacZ基因。
19、权利要求18的方法，其中所述突变体菌是Peru-5、Bang-5或Bah-5。
20、一种死的口服霍乱疫苗，所述疫苗至少包括悬浮在生理学上容许的载体中的第一和第二种霍乱弧菌菌株，其中每种菌株都缺少将机能ctxA亚单位编码的DNA，而且其中所述菌株中至少两种是不同的血清型，所述霍乱弧菌是非活的，所述疫苗还包括由所述霍弧菌的至少一种所述血清型所过量产生的霍乱弧菌毒素B单位。
21、权利要求20的疫苗，其中所述血清型之一是一种Ogawa血清型而所述血清型的另一种是一种Inaba血清型。
22、权利要求21的疫苗，其中所述疫苗包括Bah-2和Peru-3或Bang-3或Peru-3和Bang-3两者。
23、一种不产毒遗传稳定的霍乱弧菌突变体菌株，所述菌株是一种缺少将机能ctxA亚单位编码的DNA的遗传工程缺失突变体，所述菌株是软琼脂穿透不足的突变体。
24、权利要求23的一种至少包括两种不同霍弧菌菌株的疫苗，所述菌株中的一种是由Peru产生的而另一种是由Bengal产生的。
25、权利要求24的疫苗，其中每种所述的菌株是ctx-、att-和recA-。
26、权利要求23的疫苗，其中所述菌株是att-。
27、一种制造死坿乱弧菌疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
至少提供权利要求20的第一和第二种霍乱弧菌菌株，这些菌株是已被杀死的。
向所述死菌株中加入由至少所述菌株中的一种所产生的霍乱毒素B亚单位，其中所述毒素B亚单位由繁殖所述菌株的培养基得到，以及
将所述死菌株和所述毒素B亚单位悬浮在生理学上容许的载体中。
28、一种含有存在于生理学上容许的载体中的权利要求1的菌株的疫苗。
29、权利要求4的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株是Peru-14。
30、权利要求6的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株属于Bengal血清型族。
31、权利要求6的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株是Bengal-2或Bengal-3。
32、权利要求1的霍乱弧菌菌株，其中所述菌株是丝状的。
33、权利要求23的霍乱弧菌菌株，其中至少20%的所述菌株的细胞是在适当条件下能形成长度10nM或更长的丝状结构的。
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